JPH028709B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ヒトカリクレインの製造方法に関す
る。

カリクレイン（EC3.4.21.8）は、血漿中のキニ
ノーゲンから活性ペプチドであるキニンを生成す
る酵素で、血管拡張作用、血圧降下作用などの薬
理作用を示すことから、脳血管障害、冠動脈性心
臓疾患、高血圧症など循環器系疾患の治療剤とし
て広く利用されるようになり、その需要は急増し
ている。

カリクレインは、哺乳動物の膵臓、肝臓、唾液
腺などの臓器、血液、尿などの体液から製造でき
ることが知られている。

しかしながら、例えば、特開昭52−102495号公
報、特開昭55−167228号公報などにも見られるよ
うに、従来は主として豚由来の臓器から製造され
ているだけであり、その生産量も不充分であつ
た。

また、ヒトの治療に供するには、ヒトの生細胞
由来であることが抗原抗体反応の懸念もなく、治
療上安全であり、優れている。

本発明者は、ヒトカリクレインを大量安価に供
給しうる製造方法を鋭意検討した。

その結果、ヒトカリクレイン産生能を有するヒ
ト由来の細胞をヒト以外の温血動物を利用して増
殖させて得た細胞は、インビトロでの組織培養で
得られる細胞よりもヒトカリクレイン産生が著し
く高いことを見いだし、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、ヒトカリクレイン産生能
を有するヒト由来の細胞をヒト以外の温血動物体
内に移植、またはその温血動物の体液の供給を受
けながら増殖させ、得られる細胞からヒトカリク
レインを産生させることを特徴とするヒトカリク
レインの製造方法に関するものである。

本発明の方法は、従来のインビトロで組織培養
する場合と比較して、大量のヒトカリクレインを
生成できるだけでなく、高価な血清などを含む栄
養培地が不要、または大幅に節約でき、更に細胞
増殖中の維持管理も極めて容易である。すなわ
ち、ヒトカリクレイン産生能を有するヒト由来細
胞をヒト以外の温血動物体内に移植し、またはそ
の動物の体液の供給を受けることのできるチヤン
バーに収容し、通常の飼育をすれば、温血動物体
から供給される栄養物を含有する体液を利用して
その細胞が容易に増殖しうるのである。更に、イ
ンビトロで組織培養する場合と比較して、細胞の
増殖が安定していること、その増殖速度が大きい
こと、大量の細胞が得られること、更には細胞当
りのヒトカリクレイン産生量が大きいことが特徴
である。

本発明で使用するヒト由来の細胞は、ヒトカリ
クレイン産生能を有し、かつヒト以外の温血動物
の体内に移植して容易に増殖するものであればよ
い。例えば、ヒト膵臓細胞、ヒト唾液腺細胞、ヒ
ト肝蔵細胞、ヒト腎臓細胞、ヒト肺線維芽細胞ま
たはこれを各種ウイルスや放射線などで腫瘍化さ
せた細胞、或いは、ヒト膵癌細胞、ヒト唾液腺腫
細胞、ヒト肝癌細胞、ヒト腎癌細胞、ヒト膀胱癌
細胞、更には、これら細胞を培養株化させたもの
などが好適である。

また、これら細胞のヒトカリクレイン産生能を
持つ遺伝子を例えば、ポリエチレングリコールや
センダイウイルスなどを利用する細胞融合の手段
や、DNAリガーゼ、制限酵素（ヌクレアーゼ）、
DNAポリメラーゼなどの酸素を利用する遺伝子
組み換えの手段などによつて、より容易に継代培
養しうる培養株化されたヒトリンパ芽球様細胞に
導入して使用することは、その増殖速度が大きい
だけでなく、細胞当りのヒトカリクレイン産生能
が約２〜10倍、またはそれ以上にも高まるので特
に好都合である。

また、培養株化されたヒトリンパ芽球様細胞を
利用すれば、ヒト以外の温血動物に移植する際、
その宿主動物の細胞と混りにくい軟腫瘤を形成し
易く、摘出後の分散も容易なので、ヒトリンパ芽
球様生細胞だけを採取するのにきわめて有利であ
る。

このようなヒトリンパ芽球様細胞には、ヒト白
血病もしくはヒト悪性リンパ腫由来の細胞株が適
しており、例えばナマルバ（Namalva）細胞、
BALL−１細胞、NALL−１細胞、TALL−１細
胞、JBL細胞などの公知ヒト由来細胞株が、特に
有利に使用しうる。

本発明のヒトカリクレインの製造方法に使用す
る温血動物は、ヒトカリクレイン産生能を有する
ヒト由来の細胞が増殖しうるものであればよく、
例えば、ニワトリ、ハトなどの鳥類、イヌ、ネ
コ、サル、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、ウサギ、モ
ルモツト、ラツト、ヌードラツト、ハムスター、
普通マウス、ヌードマウスなどの哺乳類などが使
用できる。

これら動物にヒト由来の細胞を移植すると、好
ましくない免疫反応を起すおそれがあるので、そ
の反応をできるだけおさえるために、使用する動
物は、できるだけ幼若な状態、すなわち卵、胚、
胎児、または新生期、幼少期のものの方が好まし
い。

また、これら動物に例えば、約200〜600レムの
エツクス線若しくはガンマ線を照射するか、また
は抗血清若しくは免疫抑制剤などを注射するなど
の前処置をほどこして、免疫反応を弱めて移植し
てもよい。使用する動物がヌードマウスやヌード
ラツトの場合には、成長したものであつても免疫
反応が弱いので、これらの前処置を必要とするこ
となく、培養株化されたヒト由来の細胞が移植で
き、急速に増殖できるので特に好都合である。

また、ヒト由来の細胞を、例えば先ずハムスタ
ーに移植し増植させた後、この細胞を更にヌード
マウスに移植するなどのように、ヒト以外の温血
動物間で移植して、ヒト由来の細胞の増殖をより
安定化したり、更にそれらから生成されるヒトカ
リクレイン量を増加させることも自由である。こ
の場合、同種間、同属間は勿論のこと同綱間、同
門間移植であつてもよい。

ヒト由来の細胞を移植する動物体内の部位は、
移植した細胞が増殖し得る部位であればよく、例
えば尿液腔、静脈、腹腔、皮下など自由に選ばれ
る。

また、直接動物体内にヒト由来の細胞を移植す
ることなく、動物細胞の通過を阻止し得る多孔性
の濾過膜、例えば孔径約10^-7〜10^-5ｍを有するメ
ンブランフイルター、限外濾過膜またはホローフ
アイバーなどを設けた公知の各種形状、大きさの
拡散チヤンバーを動物体内、例えば腹腔内に埋設
して、動物体からの栄養物を含む体液の供給を受
けつつ、そのチヤンバー内で公知の培養株化され
たヒト由来の細胞を何れも増殖させることができ
る。

また、必要に応じて、この拡散チヤンバー内の
栄養物を含む体液を動物体内のそれと接続し潅流
させるようにした拡散チヤンバーを、例えば動物
体表に取付け、拡散チヤンバー内のヒト由来の細
胞の増殖状態を透視できるようにすることも、ま
た、この拡散チヤンバー部分のみを着脱交換でき
るようにして動物を屠殺せずに寿命一杯細胞を増
殖させて、動物個体当りの細胞生産量を更に高め
ることもできる。

これらの拡散チヤンバーを利用する方法は、ヒ
ト由来の細胞が動物細胞と直接接触しないので、
ヒト由来の細胞のみが容易に採取できるだけでな
く、好ましくない免疫反応を起す心配も少ないの
で、免疫反応を抑制する前処置の必要もなく、各
種温血動物を自由に利用できる特徴を有してい
る。

移植した動物の維持管理は、その動物の通常の
飼育を続ければよく、移殖後と言えども特別の取
扱いは何ら必要としないので好都合である。ヒト
由来の細胞を増殖させるための期間は通常１〜20
週である。移殖する培養株化された細胞が腫瘍細
胞であるかリンパ芽球様細胞である場合には、そ
の増殖速度が特に大であり、通常１〜５週の期間
で目的を達成することができる。このようにして
得られるヒト由来の細胞数は、動物個体当り約
10⁷〜10¹²、またはそれ以上に達することも見い
出した。

換言すれば、本発明で使用するヒトカリクレイ
ンの製造方法により増殖させたヒト由来の細胞数
は、動物個体当り移殖した細胞数の約10²〜10⁷
倍、またはそれ以上にも達し、インビトロで栄養
培地に接種して増殖させる場合の約10¹〜10⁶倍、
またはそれ以上にも達して、ヒトカリクレインの
製造にはきわめて好都合である。増殖ヒト由来細
胞は、ヒトカリクレイン産生に供する前に、イン
ビトロの栄養培地で適当期間、、通常１〜４日培
養し、細胞代謝を整えてもよい。

このようにして増殖させたヒト由来の生細胞か
らヒトカリクレインを産生させる方法は自由であ
る。

例えば、腹腔内の腹水に浮遊状で増殖したヒト
由来の細胞を採取し、または皮下で増殖した腫瘤
を摘出し、分散させた後採取し、この細胞を約20
〜40℃に保つた栄養培地に細胞濃度が約10⁴〜
10⁸／mlになるように浮遊させてヒトカリクレイ
ンを産生させればよい。この際、必要ならばカリ
クレイン誘導剤を作用させてもよい。カリクレイ
ン誘導剤は、温血動物を利用して増殖させて得ら
れるヒト由来細胞からヒトカリクレインを誘導生
成できる物質であれば何でもよく、例えば、グリ
シン、フエニルアラニンなどのアミノ酸類、カゼ
インなどの蛋白質、グルコース、イノシトール、
リボース、デオキシリボースなどの糖類、アドレ
ナリンなどのホルモン類などから適宜利用するこ
とができる。また必要に応じて、ヒトカリクレイ
ン産生の際に、カリクレイン安定化剤を添加し、
生成したヒトカリクレインの安定化を計ること
も、トリプシン（EC3.4.21.4）や各種アルカロイ
ドなどのカリクレイン増収剤を添加して更にヒト
カリクレインの収量を高めることも自由である。

このようにして産生されたヒトカリクレイン
は、公知の精製分離法、例えば、塩析、透析、濾
過、遠心分離、濃縮、凍結乾燥などを行なうこと
によつて容易に精製分離し、採取することができ
る。更に、高度の精製を必要とする場合には、例
えば、イオン交換体への吸着・脱着、ゲル濾過お
よびアフイニテイクロマトグラフイー、等電点分
画、電気泳動などの公知の方法を更に組み合わせ
ればよく、最高純度のヒトカリクレインを採取す
ることも可能である。

本発明により製造したヒトカリクレインは、従
来公知の人尿より採取したヒトカリクレインと免
疫学的に差異がないことはもとより、発熱性物質
が肝炎ウイルスの混入もない。従つて、ヒトカリ
クレイン単独で、またはこれにステロイドホルモ
ン、抗凝血薬、抗癌剤などその他の一種もしくは
二種以上の物質を含有せしめ、内服薬、注射薬な
どとしてヒト疾病の予防や治療に有利に利用でき
る。

なお明細書を通じてヒトカリクレインの力価
は、守屋らの方法（J.Biochemistry Vol.58、201
（1965年））に準じて、犬の血圧低下を測定する生
物的カリクレイン単位（KU）で示した。

以下２〜３の実施例で本発明を説明する。

実施例 １ 成長したヌードマウスの皮下に、培養株化され
たヒト膵臓腫細胞COLO357を移殖した後、通常
の方法で４週間飼育した。皮下に生じた腫瘤約10
ｇを摘出して細切した後、トリプシン含有生理食
塩水に懸濁した細胞を分散させた。

この細胞を、牛胎児血清10v／ｖ％を、捕足し
たEarle199培地（PH7.2）で洗浄した後、カゼイ
ンを濃度約１mg／ml存在せしめた同培地に細胞濃
度約１×10⁵／mlになるように浮遊させ、37℃で
10日間保つてヒトカリクレインを生成させた。そ
の後、細胞を超音波処理して得られる上清中のカ
リクレイン力価を測定したところ、浮遊液ml当り
約600KUのカリクレイン産生量であつた。

これに対して、同じ腫瘍細胞を牛胎児血清
10v／ｖ％を補足したParkers199培地（PH7.2）、
37℃でインビトロにて組織培養して得た対照の細
胞を用いて前記同様にヒトカリクレインを生成さ
せたところ、そのカリクレイン産生量は、浮遊液
ml当り僅か20KUに過ぎなかつた。

実施例 ２ 実施例１で使用したものと同じ培養株化された
ヒト腫瘍細胞とリンパ芽球様ナマルバ細胞
（Namalva cell）とを140ｍＭ NaCl、54ｍＭ
KCl、１ｍＭ NaH₂PO₄、２ｍＭ CaCl₂を含有
する塩類溶液にそれぞれ約10³／mlになるように
浮遊させ、これに予め紫外線で不活化したセンダ
イウイルスを含有する前記塩類溶液を、氷冷下で
混合し、約５分後に37℃恒温水槽に移して、約30
分間撹拌しつつ細胞融合を起させ、リンパ芽球様
ナマルバ細胞にヒトカリクレイン産生能を導入し
た。このリンパ芽球様ナマルバ細胞を成長したヌ
ードマウスの腹腔内に移植した後、通常の方法で
５週間飼育した。

生じた腫瘤約15ｇを摘出し、次いで、カゼイン
の代りにフエニルアラニン0.1w／ｖ％およびグ
ルコールを0.1w／ｖ％添加したこと以外は実施
例１と同様にしてヒトカリクレインを生成させ
た。浮遊液ml当りのカリクレイン産生量は約
1300KUであつた。

対照として細胞融合させたリンパ芽球様ナマル
バ細胞を実施例１と同様にインビトロで組織培養
しヒトカリクレインを生成させたところ、そのカ
リクレイン産生量は、浮遊液ml当り僅か100KU
にすぎなかつた。

実施例 ３ 腎腫瘍患者から摘出、細切、分散させて得たヒ
ト腎腫瘍細胞とリンパ芽球様BALL−１細胞とを
140ｍＭ NaCl、54ｍＭ KCl、１ｍＭ
NaH₂PO₄、２ｍＭ CaCl₂を含有する塩類溶液
にそれぞれ約10³／mlになるようにフラスコ中に
浮遊させ、これに予め紫外線で不活性化したセン
ダイウイルスを含有する前記塩類溶液を氷冷下で
混合し、約５分後に37℃恒温水槽に移して、約30
分間撹拌しつつ細胞融合を起させ、ヒトカリクレ
イン産生能を導入したリンパ芽球様BALL−１細
胞を得た。このリンパ芽球様BALL−１細胞を、
新生児のハムスターにウサギから公知の方法で調
製した抗血清を予め注射したハムスターの免疫反
応を弱めその皮下に移植し、その後通常の方法で
３週間飼育した。生じた腫瘤約10ｇを摘出し、実
施例１と同様に処理してヒトカリクレインを生成
させた。浮遊液ml当りのカリクレイン産生量は、
約2100KUであつた。

対照として細胞融合させたリンパ芽球様BALL
−１細胞を実施例１と同様にインビドロンで組織
培養してヒトカリクレインを生成させたたとこ
ろ、浮遊液ml当り僅か200KUのカリクレイン産
生量であつた。

実施例 ４ 新生児ラツトの静脈内で、実施例２の方法でヒ
トカリクレイン産生能を導入したリンパ芽球様ナ
マルバ細胞を移植した後、通常の方法で４週間飼
育した。

生じた腫瘤約40ｇを摘出し、実施例２と同様に
処理してヒトカリクレインを生成させた。浮遊液
ml当りのカリクレイン産生量は約1400KUであつ
た。

実施例 ５ 成長した普通マウスに、約400レムのエツクス
線を照射してマウスの免疫反応を弱めた後、その
皮下に実施例１と同じ培養株化されたヒト腫瘍細
胞を移植した。その後、通常の方法で４週間飼育
し、皮下に生じた腫瘤約15ｇを摘出し、実施例１
と同様に処理してヒトカリクレインを生成させ
た。浮遊液ml当りのカリクレイン産生量は約
900KUであつた。

実施例 ６ 孔径約0.5ミクロンのメンブランフイルターを
設けた内容量約10mlのプラスチツク製円筒型拡散
チヤンバー内に、実施例３の方法でヒトカリクレ
イン産生能を導入したリンパ芽球様BALL−１細
胞を生理食塩水で浮遊させ、これを成長したラツ
トの腹腔内に理設した。

このラツトを通常の方法で４週間飼育した後、
この拡散チヤンバーを取り出した。これにより得
られたヒト由来の細胞濃度は、約２×10⁹／mlで
あつて、インビトロでの炭酸ガスインキユベータ
ー中で培養する場合の約10³倍以上にも達するこ
とがわかつた。本細胞を実施例２と同様に浮遊液
として処理しヒトカリクレインを生成させた。浮
遊液ml当りのカリクレイン産生量は約1800KUで
あつた。

実施例 ７ 37℃で５日間保つたニワトリの受精卵に実施例
３の方法でヒトカリクレイン産生能を導入したリ
ンパ芽球様BALL−１細胞を移植した後、37℃で
１週間保つた。

この卵を割卵した後、、増殖細胞を採取し、実
施例２と同様に処理してヒトカリクレインを生成
させた。浮遊液ml当りのカリクレイン産生量は約
1200KUであつた。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ ヒトカリクレイン産生能を有するヒト由来の
   細胞をヒト以外の温血動物体内に移植し、または
   その温血動物の体液の供給を受けながら増殖し、
   得られる細胞からヒトカリクレインを産生せしめ
   ることを特徴とするヒトカリクレインの製造方
   法。