CH653364A5

CH653364A5 - Procede pour la production du facteur de croissance epidermique humain.

Info

Publication number: CH653364A5
Application number: CH7856/81A
Authority: CH
Inventors: Kaname Sugimoto
Original assignee: Hayashibara Biochem Lab
Priority date: 1980-12-11
Filing date: 1981-12-09
Publication date: 1985-12-31
Also published as: KR830007084A; IT8149821A0; KR860001588B1; GB2092155A; US4621052A; JPS609795B2; GB2092155B; IT1142950B; JPS57105191A; FR2495937B1; FR2495937A1

Description

La présente invention concerne un procédé selon le préambule de la revendication 1, à savoir un procédé pour la production du facteur de croissance épidermique, humain, c'est-à-dire durogastrone, désigné ci-après par l'abréviation hEGF.

Comme décrit par M. H.F. Friedman dans «Vitamines and Hormones», vol. 9, pp. 313-353 (1951), l'hEGF est une substance à activité biologique, découverte dans l'urine humaine et classée dans la famille des «gastrones»; elle inhibe la sécrétion des sucs gastriques par le système digestif. Depuis la découverte de ses puissantes activités antiulcéreuse et stimulatrice de la croissance dans divers tissus, en plus de la propriété susmentionnée, la production abondante d'une quantité d'hEGF suffisante pour les applications médicales est devenue très souhaitable. Bien que les procédés classiques, tels que la récupération à partir de l'urine humaine, en des stades très compliqués, soient connus, ils ne permettent pas de disposer d'une quantité suffisante d'hEGF homogène, de qualité bien définie, pour les essais cliniques pratiques.

La titulaire a étudié des procédés pour la production en masse de l'hEGF, pour obtenir un produit homogène et à titre élevé, utilisable dans les essais cliniques. Ces efforts ont conduit à la découverte inattendue que l'on peut obtenir une quantité importante d'hEGF par multiplication de certaines cellules humaines, capables de produire ce facteur, en utilisant une culture tissulaire in vitro, ou un animal à sang chaud, et une culture in vitro de cellules humaines multipliées, pour produire ladite substance.

Le procédé est donc caractérisé selon l'invention par la partie caractérisante de la revendication 1.

L'invention concerne en plus un procédé selon le préambule de la revendication. Ce procédé est caractérisé conformément à l'invention par la partie caractérisante de cette revendication.

Comme cellules humaines utilisables, on peut employer toute cellule humaine produisant de l'hEGF, transplantable dans un milieu nutritif in vitro ou dans l'organisme d'un animal à sang chaud et capable de s'y multiplier. De préférence, les cellules humaines sont des cellules de glande sous-maxillaire, de la thyroïde, de la rate, du rein, du duodénum ou du jéjunum; on peut prendre aussi de telles cellules, transformées par un virus ou un agent carcinogène ou par des radiations, des cellules tumorales, provenant d'un malade atteint d'une tumeur des glandes sous-maxillaires, d'un carcinome pulmonaire ou d'un carcinome de la vessie; et également des lignées cellulaires établies des cellules ci-dessus.

L'emploi de lignées lymphoblastoïdes humaines, faciles à entretenir, dans lesquels on a introduit les sites génétiques commandant la production de l'hEGF des cellules décrites plus haut, selon une technique de recombinaison génétique utilisant l'ADN-ligase, une nu-cléase de l'ADN-polymérase, ou par fusion cellulaire avec du poly-éthylèneglycol ou le virus Sendaï permet d'obtenir une production supérieure d'environ 2 à 10 fois ou plus d'hEGF par cellule, ainsi qu'une multiplication cellulaire extrêmement accrue. De plus, comme l'emploi de telles lignées lymphoblastoïdes humaines provoque la formation d'une tumeur massive, facile à désagréger lors de la transplantation des lignées dans l'organisme d'un animal, on peut facilement récolter les cellules lymphoblastoïdes humaines, vivantes, multipliées.

On peut utiliser dans l'invention deux procédés de multiplication cellulaire; l'un est le procédé de culture tissulaire m vitro, dans lequel on ensemence un milieu nutritif avec les cellules humaines, capables de produire l'hEGF, et on les y fait se multiplier; l'autre est un procédé in vivo, dans lequel on transplante les cellules humaines dans l'organisme d'un animal à sang chaud, ou on les met en suspension dans un dispositif fournissant aux cellules un liquide nutritif de l'organisme d'un animal à sang chaud et l'on fait multiplier les cellules.

Le premier procédé de multiplication in vitro est exposé en détail cj.-après.

Comme milieux nutritifs utilisables, on peut choisir tout milieu dans lequel les cellules humaines se multiplient. Les milieux préférables sont ceux qui contiennent généralement de la L-arginine, L-histidine, L-lysine, L-tyrosine, L-méthionine, L-sérine, L-glycine, cystéine ou du L-tryptophase comme source d'azote, des hydrates de carbone tels que glucose, inositol, ribose ou désoxyribose, et des éléments minéraux essentiels à la croissance cellulaire, notamment Na+, K+, Cl", Fe++, Fe+++, Co++, Ca++, Po4" et autres. Si nécessaire, on peut additionner les milieux nutritifs d'autres facteurs de croissance, tels qu'hormones et/ou vitamines. Egalement, on peut utiliser divers milieux nutritifs classiques. Un de ces milieux classiques est le RPMI 1640 qui peut, de plus, être additionné de vitamines, d'éléments minéraux, d'hydrates de carbone, d'amino-acides, et d'environ 0,5 à 20% en volume de sérum de mammifère, avant l'emploi.

Dans ce procédé, on peut appliquer tout mode de culture in vitro conduisant à la multiplication des cellules humaines, avec lesquelles

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le milieu a été ensemencé. Le récipient de culture cellulaire, convenant à cette culture, est généralement une jarre de fermentation, un flacon, un ballon ou un réservoir en acier inoxydable, auxquels si nécessaire est associé un agitateur à va-et-vient et/ou un agitateur rotatif. Les cultures en couche monocellulaire peuvent être effectuées sur des supports inertes et insolubles dans l'eau, tels que perles ou tiges de verre, ou des billes d'un métal tel que titane, polymère synthétique, gel de dextran ou céramique, qui accroissent la surface de développement des cellules humaines, pour qu'elles forment des colonies. Dans le cas d'une culture en suspension, on doit poursuivre la culture jusqu'à l'obtention de la densité cellulaire maximale en conditions aérobies et avec agitation.

Toutes conditions d'inoculation et de multiplication des cellules conviennent, si elles permettent aux cellules humaines de se multiplier: par exemple la température est d'environ 20 à 40° C, de préférence d'environ 35 à 38°C; l'inoculum, exprimée par le nombre de cellules par millilitre de milieu, qui permet d'obtenir la croissance cellulaire maximale en environ 1 sem après l'ensemencement par les cellules, est de préférence d'environ 104 à 106 cellules par millilitre de milieu.

On doit faire se multiplier les cellules humaines, implantées dans le milieu nutritif par incubation à la température appropriée, pendant environ 5 à 10 d, en remplaçant périodiquement le milieu par du milieu frais, pour fournir suffisamment de substances nutritives aux cellules, et pour diluer et éliminer les métabolites cellulaires. Comme, lors de la multiplication cellulaire, une petite quantité d'hEGF peut être libérée dans le milieu, on peut la récolter lors du remplacement de celui-ci.

Le procédé de multiplication in vivo peut être pratiqué de la façon suivante.

Comme les cellules humaines, capables de produire de l'hEGF, peuvent se multiplier facilement, en utilisant le liquide nutritif de l'organisme, fourni par un animal à sang chaud, par suite de la transplantation de ces cellules dans l'organisme d'un animal, ou de la mise en suspension de ces cellules dans une chambre de diffusion classique, conçue pour recevoir le liquide nutritif de l'organisme, tandis qu'on alimente l'animal de façon habituelle, on peut facilement obtenir une grande quantité d'hEGF, sans ou avec beaucoup moins de milieu nutritif contenant du sérum coûteux, pour effectuer la multiplication cellulaire, que dans le cas d'une culture tissulaire in vitro. Ce procédé est caractérisé par une multiplication cellulaire plus stable et plus abondante, une production d'hEGF par cellule accrue, ainsi qu'un maintien plus facile de l'équilibre du milieu de culture, pendant la multiplication cellulaire.

Comme animaux à sang chaud, utilisables dans le procédé, on peut prendre tout animal, pourvu que les cellules humaines se développent dans son organisme. Par exemple, on peut employer avantageusement des volailles, telles que poulets ou pigeons, et des mammifères comme chien, chat, singe, chèvre, porc, vache, cheval, lapin, cobaye, rat, hamster, souris ou souris nue. Comme la transplantation des cellules humaines à l'animal provoque une réaction immunitaire indésirable, l'emploi d'un animal très jeune, nouveau-né ou au stade le plus précoce possible, par exemple d'œuf, d'embryon ou de fœtus, est souhaitable. Pour réduire autant que possible la réaction immunitaire, on peut traiter l'animal, avant la transplantation cellulaire, par irradiation avec des rayons X ou y à raison d'environ 200 à 600 rems/d, ou par injection d'un antisérum ou d'un agent immuno-suppresseur préparé selon un procédé classique. Comme la souris nue, lorsqu'on l'utilise comme animal hôte, présente une réaction immunitaire plus faible même à l'état adulte, on peut de façon pratique lui transplanter des lignées cellulaires humaines quelconques, pour qu'elles se multiplient rapidement, sans qu'un prétraitement soit nécessaire.

On peut effectuer la multiplication cellulaire, stabilisée, et l'accroissement de la production d'hEGF par transplantation répétée avec une ou plusieurs combinaisons d'animaux à sang chaud différents; on peut atteindre les objectifs visés, en implantant les cellules à des hamsters, pour qu'elles se multiplient, puis en les réimplantant

à des souris nues. La transplantation répétée peut avoir lieu avec des animaux de la même classe, du même groupe, de la même espèce ou du même genre. -

On peut implanter les cellules humaines en un site quelconque de l'animal, pourvu qu'elles s'y multiplient: par exemple, on peut effectuer l'implantation dans la cavité allantoïque, par voie intraveineuse, intrapéritonéale ou sous-cutanée.

En dehors de la transplantation cellulaire directe, décrite, on peut faire se multiplier facilement des lignées cellulaires humaines, classiques, quelconques, capables de produire l'hEGF, en utilisant le liquide nutritif fourni par l'organisme de l'animal, par inclusion, par exemple par voie intrapéritonéale, dans l'organisme de cet animal, d'une chambre de diffusion classique, de forme et de taille appropriées, munie d'une membrane filtrante poreuse, d'un ultrafiltre ou de fibres creuses ayant des pores d'environ 10~7 à 10~5 m de diamètre empêchant la contamination de la chambre par les cellules de l'animal hôte et permettant l'apport du liquide nutritif de l'organisme de l'animal aux cellules. De plus, la chambre de diffusion peut, s'il le faut, être conçue pour être placée par exemple sur le corps de l'animal hôte, rendre possible la circulation du liquide de l'organisme de l'animal dans la chambre et permettre l'observation de la suspension cellulaire contenue dans la chambre par une ou plusieurs fenêtres latérales, transparentes, dont sont munies une ou plusieurs parois de la chambre; il est bon de prévoir également le remplacement et l'échange avec une chambre neuve; la production cellulaire par hôte peut ainsi être accrue pendant la durée de vie de l'animal, sans qu'il soit nécessaire de sacrifier celui-ci. De plus, par l'utilisation d'une telle chambre de diffusion, l'absence de contact direct des cellules humaines avec les cellules de l'animal hôte a pour résultat de ne provoquer qu'une faible réaction immunitaire, si bien que l'on peut employer divers animaux à sang chaud, comme hôtes, sans avoir à effectuer un prétraitement pour réduire leurs réactions immunitaires.

On peut alimenter l'animal hôte de façon classique, même après la transplantation cellulaire, et aucun soin particulier n'est nécessaire.

La multiplication des cellules atteint généralement un maximum 1 à 20 sem après la transplantation. Lorsque la lignée de cellules humaines, transplantées à l'animal hôte, est une lignée de cellules tumorales ou lymphoblastoïdes, on peut obtenir la multiplication cellulaire maximale 1 à 5 sem après la transplantation, par suite de la multiplication extrêmement intense de ces cellules.

Le nombre de cellules humaines, obtenues par hôte, peut être d'environ 107 à 1012 ou plus. En d'autres termes, le nombre de cellules humaines, transplantées à l'animal, s'accroît d'environ 102 à 107 fois ou plus: cela représente environ 10 à 106 fois plus par rapport à ce que l'on obtient par la méthode de culture in vitro utilisant un milieu nutritif. Les cellules humaines multipliées peuvent donc être avantageusement utilisées pour la production en masse d'hEGF.

Pour laisser les cellules humaines, multipliées comme susindiqué, libérer l'hEGF, on peut appliquer tout procédé conduisant à la libération de cette substance par les cellules. Par exemple, on met en suspension des cellules humaines, obtenues par culture in vitro, en couche monocellulaire, ou par culture en suspension, par multiplication en suspension dans le liquide d'ascite et récolte dans ce liquide, ou par extraction d'une tumeur massive, formée sous la peau, puis on récolte après désagrégation de la tumeur, pour obtenir une concentration cellulaire d'environ 104 à 108 cellules par millilitre, dans un milieu nutritif préchauffé à une température d'environ 20 à 40°C; on incube ensuite à cette température, pendant plusieurs heures ou plusieurs jours, pour produire de l'hEGF.

On peut facilement recueillir l'hEGF, ainsi obtenu, selon des techniques de purification et de séparation utilisant des opérations classiques, telles que relargage, dialyse, filtration, centrifugation, concentration et lyophilisation. Si l'on désire une préparation plus purifiée, on peut y arriver en combinant les opérations précitées avec une ou plusieurs autres, telles qu'adsorption et désorption, avec échange d'ions, fractionnement selon masses moléculaires, chroma-

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tographie d'affinité, fractionnement au point isoélectrique et électro-phorèse.

La préparation d'hEGF, ainsi obtenue, est identique du point de vue immunologique à celles que l'on obtient à partir de l'urine humaine par des procédés classiques; elle n'est pas contaminée par le virus de l'hépatite ou des pyrogènes. Donc on peut utiliser la préparation de façon avantageuse, isolément ou en combinaison avec un ou plusieurs agents, par injection, par voie externe ou interne, ou dans un but de diagnostic dans la prévention et le traitement de diverses maladies humaines.

Dans la présente description, la production d'hEGF est déterminée par une méthode à radiorécepteur, comme décrit par Roger L. Ladda et coll. dans «Analytical Chemistry», vol. 93, pp. 286-294 (1979) et exprimée en poids.

Des modes de réalisation de l'invention sont décrits ci-après.

Exemple 1:

On ensemence des cellules humaines de tumeur de la glande sous-maxillaire désagrégée, obtenues par extraction d'un malade atteint d'une tumeur de la glande sous-maxillaire. Cette extraction est effectuée après hachage, dans un milieu 199 de Earle (pH 7,4) additionné de 10% en volume de sérum de veau fœtal, pour obtenir une concentration cellulaire d'environ 1 x 105 cellules par millilitre. Ensuite on incube dans un récipient fermé, à 37° C, pendant 1 sem, en remplaçant périodiquement le milieu par du milieu frais. Après avoir atteint la confluence on lave la couche monocellulaire avec une solution salée, physiologique, contenant de la trypsine et du phosphate. Les cellules trypsinées sont remises en suspension à une concentration cellulaire d'environ 1 x 10s cellules par millilitre, dans une préparation fraîche du même milieu, la suspension cellulaire est incubée à 37° C et à pH 7,4, pendant 1 sem.

Ensuite, on soumet les cellules à un traitement par les ultrasons et on détermine l'hEGF dans le surnageant obtenu. La production d'hEGF est d'environ 1,3 ng/ml de suspension cellulaire.

Exemple 2:

On met en suspension ensemble des cellules humaines de tumeur de glande sous-maxillaire et des cellules de la lignée lymphoblastoïde leucémique, humaine, Namalwa, dans un récipient avec une solution salée 140 mM en NaCl, 54 mM en KCl, 1 mM en NaH2P04 et 2 mM en CaCl2 pour obtenir une concentration de chaque type de cellules d'environ 1 x 104 cellules par millilitre. On mélange la suspension cellulaire, en refroidissant par la glace, avec une préparation fraîche de la même solution salée contenant du virus Sendaï préalablement inactivé par irradiation par les ultraviolets; on transfère dans une étuve à 37° C pour 5 min, après le mélange, et on agite pendant 30 min, pour effectuer la fusion cellulaire et introduire la capacité de production de hEGF des cellules humaines de tumeur de glande sous-maxillaire dans les cellules de la lignée lymphoblastoïde leucémique, humaine. Après clonage par procédé classique de la souche de cellules d'hybridome capable de produire l'hEGF, on fait se multiplier la souche de cellules d'hybridome comme dans l'exemple 1, et on traite les cellules d'hybridome multipliées, comme dans ce même exemple, pour produire de l'hEGF. Cette production est d'environ 5,8 (im/ml de suspension cellulaire.

Exemple 3:

On implante sous la peau de souris nues audltes des cellules humaines de tumeur de la glande sous-maxillaire obtenues comme dans l'exemple 1 et on alimente les animaux de façon habituelle pendant 4 sem. On extrait les tumeurs massives formées sous la peau et pesant environ 10 g chacune et on les désagrège par hachage et mise en suspension dans une solution salée, physiologique, contenant de la trypsine. Après lavage des cellules trypsinées avec du milieu 199 de Earle (pH 7,4) additionné de 10% en volume de sérum de veau fœtal, on remet les cellules en suspension pour obtenir une concentration cellulaire d'environ 1 x 105 cellules par millilitre dans une préparation fraîche du même milieu, puis on incube à 37° C pendant 7 d, pour produire de l'hEGF. Ensuite, on traite les cellules par les ultrasons et on détermine l'hEGF dans le surnageant obtenu. La production d'hEGF est d'environ 23 ng/ml de suspension cellulaire.

Exemple 4:

On implante par voie intrapéritonéale à des souris nues, adultes, des cellules de la lignée lymphoblastoïde leucémique, humaine, Namalwa, auxquelles on a conféré, comme dans l'exemple 2, la capacité de production de l'hEGF des cellules humaines de tumeur de la glande sous-maxillaire, puis on alimente les animaux de façon habituelle pendant 5 sem. On traite comme dans l'exemple 3 les tumeurs massives, obtenues, pesant environ 15 g chacune, pour produire l'hEGF. La production d'hEGF est d'environ 320 |ig/ml de suspension cellulaire.

Exemple 5:

Après avoir injecté à des hamsters nouveau-nés un antisérum préparé à partir du lapin selon un procédé classique, pour réduire leur réaction immunitaire, on implante aux animaux, par voie sous-cutanée, des cellules de la lignée lymphoblastoïde leucémique, humaine, Namalwa, auxquelles on a conféré, comme dans l'exemple 2, la capacité de production de l'hEGF de la lignée de cellules humaines de carcinome pulmonaire A-549, puis on alimente les animaux de façon habituelle pendant 3 sem. On extrait et on traite, comme dans l'exemple 3, les tumeurs massives, formées sous la peau et pesant environ 10 g chacune, pour produire de l'hEGF. La production d'hEGF est d'enviorn 250 (J.g/ml de suspension cellulaire.

Exemple 6:

On implante par voie intraveineuse à des rats nouveau-nés des cellules de la lignée lymphoblastoïde leucémique, humaine, Ball-1, auxquelles on a conféré, comme dans l'exemple 2, la capacité de production de l'hEGF de cellules humaines de carcinome de la vessie, provenant d'un malade atteint de carcinome de la vessie, puis on alimente les animaux de façon habituelle pendant 4 sem. Pour produire de l'hEGF, on extrait les tumeurs massives pesant environ 30 g chacune et on les traite comme dans l'exemple 3, si ce n'est que l'on remplace le milieu 199 de Earle par du milieu RPMI 1640. La production de l'hEGF est d'environ 170 |ig/ml de suspension cellulaire.

Exemple 7:

Après avoir irradié des souris adultes avec un équivalent de dose de rayons X d'environ 400 rems pour réduire leurs réactions immunitaires, on implante aux animaux, par voie sous-cutanée, des cellules humaines de tumeur de glande sous-maxillaire obtenues comme dans l'exemple 1, puis on alimente les animaux de façon habituelle pendant 4 sem. On extrait les tumeurs massives, formées sous la peau, pesant environ 15 g chacune, et on les traite comme dans l'exemple 3 pour produire de l'hEGF. La production d'hEGF est d'environ 35 ng/ml de suspension cellulaire.

Exemple 8:

On met en suspension dans une solution salée, physiologique, des cellules de la lignée lymphoblastoïde leucémique, humaine, Ball-1, auxquelles on a conféré la capacité de production de l'hEGF de cellules humaines de carcinome de la vessie comme dans l'exemple 6, et on transfère la suspension cellulaire obtenue dans une chambre de diffusion cylindrique, en matière plastique, ayant un volume intérieur d'environ 10 ml et munie d'une membrane filtrante ayant des pores d'environ 0,5 |im de diamètre. Après inclusion intrapéritonéale de la chambre à un rat adulte, on alimente l'animal de façon habituelle pendant 4 sem puis on retire la chambre. La densité des cellules humaines dans la chambre obtenue dans l'opération ci-dessus est d'enviorn 2x10® cellules par millilitre ce qui est environ 103 fois ou plus supérieur à ce que l'on obtient par culture in vitro avec un incubateur à C02.

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On traite les cellules humaines multipliées comme dans l'exemple 6 pour produire de l'hEGF. La production d'hEGF est d'environ 220 ng/ml de suspension cellulaire.

Exemple 9:

On implante dans les cavités allantoïques d'œufs embryonnés que l'on a préincubés à 37° C pendant 5 d des cellules de la lignée lymphoblastoïde leucémique humaine JBL auxquelles on a conféré comme dans l'exemple 5 la capacité de production de l'hEGF de la lignée de cellules humaines de carcinome pulmonaire A-549. Après incubation des œufs à cette température pendant encore 1 sem, on s récotle les cellules humaines multipliées. On traite les cellules humaines ainsi obtenues comme dans l'exemple 1 pour produire de l'hEGF. La production d'hEGF est d'environ 130 |ig/ml de suspension cellulaire.

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Claims

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1. Procédé pour la production du facteur de croissance épider-mique humain hEGF, caractérisé en ce que l'on multiplie des cellules humaines capables de produire de l'hEGF et on laisse les cellules humaines multipliées libérer l'hEGF.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on multiplie lesdites cellules humaines par transplantation dans l'organisme d'un animal à sang chaud qui est alimenté de façon habituelle.

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REVENDICATIONS

3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on multiplie lesdites cellules humaines par mise en suspension dans un dispositif fournissant aux cellules un liquide nutritif de l'organisme d'un animal à sang chaud, qui est alimenté de façon habituelle.

4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que ledit dispositif est une chambre de diffusion.

5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on multiplie lesdites cellules humaines par ensemencement d'un milieu contenant les substances nutritives essentielles à la croissance cellulaire et par l'incubation du milieu.

6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que le milieu nutritif est le milieu RPMI 1640 ou le milieu 199 de Earle.

7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'animal à sang chaud est un poulet, pigeon, chien, chat, singe, chèvre, porc, vache, cheval, cobaye, rat, hamster, souris ou souris nue.

8. Procédé de préparation des cellules humaines utilisées dans le procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que lesdites cellules humaines sont obtenues comme hybridomes par fusion cellulaire d'une lignée lymphoblastoïde humaine et de cellules humaines capables de produire l'hEGF.

9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que ladite lignée lymphoblastoïde humaine est une ligne lymphoblastoïde leucémique humaine.

10. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que ladite lignée lymphoblastoïde humaine est la ligneé Namalwa, Ball-1 ou JBL.

11. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que lesdites cellules d'hybridome sont obtenues par fusion cellulaire avec le virus de Sendaï.

12. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que lesdites cellules humaines sont obtenues par fusion de cellules d'une lignée lymphoblastoïde humaine avec des cellules humaines de tumeur de la glande sous-maxillaire.

13. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que lesdites cellules humaines sont obtenues par fusion de cellules d'une lignée lymphoblastoïde humaine avec des cellules humaines de carcinome du poumon.

14. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que lesdites cellules humaines sont obtenues par fusion des cellules d'une lignée lymphoblastoïde humaine et de cellules humaines de carcinome de la vessie.