CN1073158C

CN1073158C - 抗表皮生长因子受体的单链可变区片段和抗体

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Publication number: CN1073158C
Application number: CN95190191A
Authority: CN
Inventors: A·C·科特勒布罗格; M·M·本笛格; K·H·安瑟尔; D·圭叟; J·阿丹; F·密特简斯; E·卢塞尔; F·布拉斯库; J·皮拉特斯
Original assignee: Merck Patent GmbH
Current assignee: Merck Patent GmbH
Priority date: 1994-03-17
Filing date: 1995-03-16
Publication date: 2001-10-17
Anticipated expiration: 2015-03-16
Also published as: CN1124501A; ZA952174B

Abstract

本发明涉及新的抗ECFR抗体和抗体片段，其可从由免疫哺乳动物(优选小鼠)细胞构建的噬菌体抗体文库获得。从噬菌体抗体文库分离到的两个单链Fv可用基因工程方法产生部分人源化的完全抗体分子。这些嵌合的抗ECFR抗体含有人免疫球蛋白的恒定区，它们及其片段可用作诊断和治疗人肿瘤的试剂。

Description

抗表皮生长因子受体的单链可变区片段和抗体

本发明涉及新的抗EGFR抗体和抗体片段，优选可从由免疫哺乳动物(优选小鼠)细胞构建的噬菌体抗体文库获得的单链可变区片段(scFv)。从噬菌体抗体文库分离到的抗体片段可用基因工程方法产生部分人源化的完全抗体分子。这些嵌合的抗EGFR抗体含有人免疫球蛋白的恒定区，它们及其片段可用作诊断和治疗人肿瘤的试剂。

另外，本发明证明噬菌体抗体文库与标准杂交瘤技术相比，是一种从免疫哺乳动物分离抗体的更通用的替代方法。

本发明还涉及用于治疗诸如黑素瘤、神经胶质瘤或癌的肿瘤的含有所述抗体或片段的药物组合物。所述抗体或片段还可用于所述肿瘤的体外或体内定位和评估的诊断应用。

本说明书涉及的几种技术术语定义如下：

“FR”(框架区)指支持三个CDR的轻链或重链可变区的四个亚区。

“CDR”(互补性决定区)指具有高变序列并形成环形结构的轻链或重链可变区的三个亚区，主要负责与抗原直接接触。

“嵌合的”或部分人源化抗体指含有来自人的恒定区和来自非人(如鼠)的可变区(包括CDR)的抗体。

“人源化”或完全人源化抗体指含有来自人的恒定区和FR，而含有非人源的CDR的抗体。

“EGF”和“EGFR”指表皮生长因子和其受体。

“PCR”指聚合酶链反应。

“scFv”指作为一种抗体片段的单链可变区片段。

“V_L”指轻链可变区。

“V_K”指K轻链可变区。

“V_H”指重链可变区。

PBS指磷酸盐缓冲的盐水

FCS指胎牛血清

HBSS指Hanks平衡盐溶液

FITC指异硫氰酸荧光素

MTC指混合细胞培养

表皮生长因子(EGF)是一种促表皮和上皮细胞有丝分裂的多肽激素。当EGF与敏感细胞作用时，其与膜受体(EGFR)结合。EGFR是一种约170KD的跨膜糖蛋白，是C-erb-B原-致癌基因的基因产物。

MAb 425是针对熟知的人A431癌细胞系(ATCC CRL 1555)产生的鼠单克隆抗体，其与人EGFR外部功能区的多肽表位(抗原决定簇)结合，抑制EGF的结合。发现MAb 425(ATCC HB9629)体外介导肿瘤细胞毒性，抑制类表皮的结肠直肠癌衍生的细胞系体外肿瘤细胞生长(Rodeck等，Cancer Res.1987,47:3692)。WO 92/15683中公开了MAb 425的人源化和嵌合抗体的形式。

近几年来，已描述了可在原核宿主细胞如大肠杆菌中产生功能性抗体片段的方法(Skerra and Pluckthun,Science 1988,240:1038；Better等，Science 1988.240:1041)。这包括Fv片段和Fab片段，其中Fv片段特别有意义。还描述了单链Fv(其中V_L和V_H链连接在一起)(Bird等，Science 1988,242:423；Hltston等，ProcNatl,Acad Sci USA 1988,85:5879)。

噬菌体抗体文库提供了从免疫动物分离抗体的对杂交瘤技术的一种替代技术。杂交瘤技术是使产生抗体的细胞无限增殖化。噬菌体抗体技术是使编码抗体的基因无限增殖化(Winter,G，和Milstein C.,Nature 1991,349:293)。在噬菌体抗体技术中，PCR扩增抗体重链可变区(V_H)和轻链可变区(V_L)基因，可变区随机组合并在噬菌体颗粒的表面表达为抗体片段，然后从噬菌体抗体文库筛选与目标抗原结合的抗体。

当可能在动物的脾脏造成强免疫应答时，杂交瘤技术分离鼠单克隆抗体是非常成功的。例如，用人A431肿瘤细胞腹膜内免疫小鼠，从其脾中分离到了抗人表皮生长因子受体(EGFR)的鼠MAb(Marthy等，Arch,Biochem,Biopbys,1987,252:549)。噬菌体抗体技术比杂交瘤技术的潜在优势是可使用几乎任何来源的抗体表达细胞作为起始材料，可迅速筛选出大量不同抗体。噬菌体抗体技术的另一优点是已克隆了目标抗体可变区的编码基因，随时可进行进一步的遗传操作。

曾报导将从噬菌体抗体文库分离的抗破伤风类毒素Fab片段转化为全抗体分子(Berder等，Hum.Antibod.Hybridornas 1993,4:74)。

近十年中，已使用体外免疫作为主动免疫的一种替代技术来产生人和鼠系统的大量不同抗原的单克隆抗体(mAb)(如Vanx,D.J,T；Helenius,A，和Mellman,I；Nature,1988,336:36；Gathtt-ru,J.K等；J.Immunol.Methods,1991,137:95；Borrebaeck,C.A.K；Immunol,Today,1988,9:355)。该方法的优点是只需要少量的抗原，并且此方法可用于产生杂交瘤。但体外免疫后产生弱亲和力IgM抗体及难于使人淋巴细胞无限增殖化成为此技术的一直存在的问题。

获得抗体的一种新途径是：PCR扩增重链(V_H)和轻链(V_L)可变区基因的全部，然后将其随机重组并表达为噬菌体显示文库(7-9)。克隆抗体可变区基因并与小包衣蛋白(基因3)融合成为单链Fυ片段(scFv)(10)。噬菌体颗粒在其表面显示抗体片段，可用抗体结合特性淘选来选择。该技术的优点在于V基因的随机重组可产生具有新特异性和亲和性的新配对，这种特异性和亲和性在天然过程中可能无法选出。另外，这种方法使得可能使用鼠或人源天然或体外免疫淋巴细胞。

以前用鼠B细胞体外免疫和杂交瘤技术产生抗EGFR的mAb的努力，只得到了低亲和力的交叉反应性抗体。为了克服这些障碍，开展了体外免疫后结合PCR克隆技术。

因此，本发明的目的是提供与EGF受体具有高亲和力的抗体和抗体片段，其可通过上文和下文描述的有利方法获得。

本发明将从三种不同噬菌体抗体文库分离到的鼠抗EGFR抗体与按标准杂交瘤技术分离的鼠mAb(425)(Marthy等，Arch,Biochem,Biophys,1987,252:549；Kettleborough等，Protein Eng,1991,4:773)进行了比较。不仅从免疫鼠的脾脏而且从免疫鼠的引流淋巴结和体外免疫鼠细胞制备文库。从文库中分离的两个单链Fv(scFv)进行基因操作，将鼠可变区连接于人恒定区以产生嵌合的完全抗体分子。

详细讲，本发明涉及可从噬菌体抗体文库获得的抗FGFR单链Fv，所述文库是从优选免疫哺乳动物的脾或引流淋巴结细胞或体外免疫细胞构建的。原则上讲，本发明不限于scFv而且还延及其它抗EGFR抗体片段如Fab或F(ab＇)₂。

本发明的一些scFv的DNA和氨基酸序列已被确定。因此，本发明的另一目的是一种单链Fv片段，其中重链和轻链的可变区含有选自SEQ ID NO.1-32中，优选图5-8中给出的重链和轻链序列之一的DNA和/或氨基酸序列。

因为许多情形下只有功能完全的全抗体才能用于诊断和治疗目的，所以本发明的兴趣还在于将来自单链Fv的可变区与人免疫球蛋白的恒定区连接，形成完全的部分人源化的抗EGFR抗体。

因此，本发明的目的之一是提供从如上文，下文所定义或如权利要求中所定义的抗体片段的DNA序列，和人免疫球蛋白恒定区的DNA序列构建的抗EGFR完全抗体，其中作为一个优选实施方案，重链包含γ-1链的氨基酸序列，轻链包含K-链的氨基酸序列。

本发明的抗EGFR scFv是用噬菌体抗体文库技术分离的。因此，本发明涉及制备抗EGFR的单链Fv的方法，包括下列步骤：(ⅰ)从免疫哺乳动物细胞，优选鼠细胞分离RNA，(ⅱ)合成第一股cDNA，(ⅲ)扩增来自免疫细胞的cDNA中V_H和V_K基因，(ⅳ)将所述基因一起以适当限制位点克隆到噬菌粒载体中，(ⅴ)用此连接混合物转化原核细胞，(ⅵ)用纯化EGFR在噬菌体文库中筛选针对EGFR的噬菌体抗体，及(ⅶ)在原核宿主细胞如大肠杆菌中产生所需单链Fv。

另外，本发明的目的之一是提供一种制备抗EGFR完全抗体的方法，包括将如上所述或如权利要求中所定义的方法产生的抗EGFR抗体片段的可变区编码DNA克隆到至少一种真核表达载体中，该载体含有编码人免疫球蛋白恒定区的基因组DNA，用所述载体转化真核细胞，表达并分离抗体。

抗EGFR scFv和首要的抗EGFR完全抗体可用于诊断和治疗人肿瘤。因此本发明涉及含有如上所定义或如权利要求中所定义的抗EGFR单链Fv或抗EGFR完全抗体的药物组合物。

本发明的结果和优点综合如下：

从噬菌体抗体文库分离了新的鼠抗EGFR抗体。该新抗体至少有四种不同的V_H亚组和四种不同的V_K亚组(Kabat等，Sequencesof proteins of immunological interest,5th Eds.,U.S.Dept,ofHealth and Human Services,Bethesda 1991)。它们显示的配对和序列与用杂交瘤技术分离的鼠MAb所用的配对和序列不同。鼠425MAb有一V_H2b和V_K4配对，而在噬菌体抗体中没有观察到。scFvL311D的V_H与425V_H具有最高的一致率(84.9％)。主要差别在CDR中。scFv S4 2D与425 V_K具有最高一致性(83.2％)。主要差别也在CDR中，特别是CDR3。本发明中，从噬菌体抗体文库中分离了许多不同的新的抗EGFR抗体，这些抗体都与425MAb不同，至少两个scFv识别与425 MAb所识别的不同的EGFR表位。这与以前的报导不同，后者报导说从组合文库中分离的抗体与杂交瘤技术分离的抗体非常相似(Caton and Koprowski,Proc Nail Acad Sci USA1990,87:6450)。

三个噬菌体抗体文库中，从得到高亲和力抗体所需要的选择步骤数目和分离到高亲和力抗体的多样性来看，最好的文库是从分流淋巴结产生的文库。选择淋巴结作为构建噬菌体抗体的RNA源有两个原因。首先，以前的工作已说明经脚垫免疫接种后从腘淋巴结比经腹膜免疫接种后从脾能获得更高比例的产生高亲和力IgG抗体的B细胞(Venn和Dresser,J.Immttnol.Methods 1987.102:95)。第二，分流淋巴结被认为是分离人抗肿瘤抗体的良好来源。因此，从免疫接种小鼠的腘淋巴结分离鼠抗EGFR抗体是从乳腺癌病人腋窝淋巴结分离人抗EGFR抗体的模型。证明了从少量淋巴结材料制备适当大小的文库再从文库中分离高亲和力抗体的可行性。

虽然从三个噬菌体抗体文库中都分离了鼠抗EGFR抗体，但不清楚哪些新分离的抗体的亲和力高于用杂交瘤技术分离的鼠425MAb。在第一种分析中，噬菌体抗体产生的scFv与EGFR的结合看来好于从425MAb构建的scFv(图2)。在用嵌合的全抗体分子的另一些实验中，一种嵌合抗体(S4 2D)显示EGFR亲和力与嵌合的425抗体的亲和力相等。第二个嵌合抗体(L3 11D)的亲和力低于嵌合的425抗体的亲和力4倍(图4)。用scFv获得的结合数据令人误解，可能因为scFv制剂可含有单体和二聚体的混合物(Grif-fiths等，EMBO J.1993,12:725)。而嵌合IgG抗体按理不会形成二聚体，已证明嵌合的L3 11D和S4 2D抗体具有二价单体IgG嵌合抗体的适当大小。但对425,L3 11D和S4 2D scFv亲和纯化制剂的分析表明，这些制剂确实含有单体、二聚体和其它多聚体形式。另外，每个scFv的单体和多聚体形式的相对比例不同。425 scFv的二聚体形式的百分比最低。如所预想的那样，二聚体和特别是更高的多聚体形式显示与纯化EGFR的结合比单体形式强。425 scFv似乎比新分离的scFv的二聚化倾向要弱。

虽然抗体片段在噬菌体颗粒表面的表达形成了迅速筛选具有目标特性之抗体的有力方法的基础，但噬菌体抗体和抗体片段本身(scFv或Fab)都不可能是目标终产品。接下来说明从噬菌体文库分离的鼠scFv如何迅速转化成完全的抗体分子。这可以将鼠的可变区与人的恒定区结合，以形成部分人源化的嵌合抗体。

这些结果表明可能利用噬菌体抗体技术从免疫小鼠中分离到各种抗EGFR抗体片段。然后可从这些抗体片段构建带有适当恒定区的完全抗体分子。某些情形下，杂交瘤技术仍是从小鼠分离单克隆抗体的一种供选择的方法。如果有高免疫原性抗原可利用，并且如果产生一种或几种不同抗抗原抗体的少数杂交瘤细胞系就足够用的话，可能就没有什么理由考虑噬菌体抗体技术。但如果特殊免疫接种方法如脚垫注射对产生高亲和力抗体有利，或如果要求抗某种抗原的各种不同表位的多种抗体，或要求针对非常隐蔽的表位和免疫原性可能较弱的表位的抗体，则可选择噬体抗体技术。另外，如果希望对抗体进行进一步的遗传操作，则噬菌体抗体技术是有利的，因为已克隆了抗体基因。

这种用颗粒抗原体外免疫和PCR-克隆技术结合的途径产生了与EGFR反应而不与其它抗原交叉反应的scFv片段。这里报导的免疫程序取决于抗原呈递(它不是可溶的而为膜泡囊制剂)和培养基自身(不含FCS)。据报导这两种方法都是通过将抗原提供给抗原递呈细胞而增加体外免疫效力的方法(如Brams,P等；J.Im-munol,Methods,1987,98:11)。

用MTC获得的结果与先有的报导一致(如Borrebacck,G.A.K和Mller,S.A；J.Immunol.,1986,136:3710；Mller S,A和Borrebaeck,C.A K,在Borrebaeck,C.A.K(编)的In VitroImmunization in Hybridoma Tcchnotogy,Elsevier Science Pub-lishers B.v.,Amsterdam 1988,P3中所述)，这些文献建议使用MTC上清作为改进体外免疫方法的淋巴因子的来源。膜泡囊制剂应被看作多抗原，因为在这种泡囊中存在许多不同抗原决定簇。因此，它们似乎应诱导一定水平的多克隆激活。我们已将此排除，因为抗EGFR特异反应与标准多克隆激活物得到的反应明显不同。

体外免疫后我们不是去将B细胞无限增殖化，而是使用了分子战略将抗体V_H和V_L基因无限增殖化。这些单克隆抗体片段在细菌中表达并产生。噬菌体显示系统是分离抗特异抗原的抗体片段的有利方法。在抗体片段和g3p包被蛋白间存在终止密码子使得在表面显示和用含抑制基因或不含抑制基因的菌株分泌可溶性scFv片段之间转换(Hoogenboon等，Mucl Acids Res 1991 19:4133)。

由于特异反应和体外抗原刺激的B细胞中mRNA水平的提高，体外免疫对分离抗原的高特异性抗体片段有贡献。经两轮选择后，100％的克隆对EGFR结合为阳性。相反，体内免疫接种方法产生的克隆只有在四轮选择后才为100％阳性(Kettleporough等，EP94104160和Eur.J.Immunol 1994,24:952)。

利用天然抗体基因的噬菌体显示文库可使得在不进行免疫接种或在体外免疫后制得特异人抗体片段。抗体片段可直接产于细菌中，因此是一种简单、快速且经济的方法。生物材料和一般方法

本申请中提及的微生物、细胞系、质粒、噬菌粒、启动子、抗性标记、复制起始区和载体的其它片段有商品供应或以别的途径能为公众所得。只要在此申请中没有其它信息，它们仅用作举例，对本发明不是必需的，可分别用其它适合的工具和生物材料来代替。

优选使用细菌宿主克隆scFv并产生scFv蛋白。这些宿主的实例为大肠杆菌或芽胞杆菌。

根据本发明，为了产生完全的抗EGFR抗体，优选用真核宿主如COS、CHO或酵母。

在说明书中详细描述了本发明必需的技术。其它没有详细描述的技术相应于本领域技术人员熟知的标准方法，或为在所引述的文献和专利申请及标准文献中更详细描述的方法。

附图的简要说明

图1．从噬菌体抗体文库中分离的scFv的氨基酸序列。(A)来自淋巴结文库的scFv。(B)来自脾文库的scFv。指明了互补决定区(CDR)和框架区(FR)。

图2．scFv与EGFR的结合。估测了细菌上清液中scFv的浓度，用ELISA测定了scFv与纯化EGFR的结合。(A)．来自淋巴结文库的scFv。(B)．来自脾文库的scFv。P1(阳性对照)为来自MAb425的scFv。L1和S1(阴性对照)为来自选择前的淋巴结和脾文库的非结合性scFv。

图3．用于构建可变区的哺乳动物细胞中表达的中间载体。(A)V_H载体。(B)V_K载体。

图4．嵌合全抗体与EGFR的结合。用ELISA测定了COS细胞上清液中的抗体浓度，用ELISA测试了抗体与纯化EGFR的结合。

图5．scFv No.L2 11C的DNA和氨基酸序列。

(A)：轻链；(B)：重链。

氨基酸位置：

(A)FR-1:1-23,CDR-1:24-34＇

FR-2:35-49,CDR-2:50-56,

FR-3:57-88,CDR-3:89-97,

FR-4:98-109.

(B)FR-1:1-30,CDR-1:31-35,

FR-2:36-49,CDR-2:50-66,

FR-3:67-98,CDR-3:99-108,

FR-4:109-119.图6．scFv No.L2 12B的DNA和氨基酸序列。(A)：轻链；(B)重链。氨基酸位置：

(A)FR-1:1-23,CDR-1:24-38,

FR-2:39-49,CDR-2:50-56,

FR-3:57-88,CDR-3:89-97,

FR-4:98-109.

(B)FR-1:1-30,CDR-1:31-35,

FR-2:36-49,CDR-2:50-66,

FR-3:67-98,CDR-3:99-108,

FR-4:109-119.

图7．scFv NO.L3 11D的DNA和氨基酸序列。(A)轻链；(B)：重链。

FR和CDR的氨基酸位置相应于图6中给出的那些。

图8．scFv NO.S4 2D的DNA和氨基酸序列。(A)：轻链；(B)：重链。氨基酸位置：

(A)FR-1:1-23,CDR-1:24-35,

FR-2:36-50,CDR-2:51-57,

FR-3:58-89,CDR-3:90-98,

FR-4:99-110

(B)FR-1:1-30,CDR-1:31-35,

FR-2:36-49,CDR-2:50-66,

FR-3:67-98,CDR-3:99-107,

FR-4:108-118.

图5-8的序列也在所附序列表中给出，该序列表是本发明公开的一部分。(1)噬菌体抗体文库的构建和筛选

构建了三个噬菌体文库，一个来自用人癌细胞系A431(8.8×10⁵个)免疫的鼠脾脏，一个来自用纯化EGFR(6.5×10⁶个)脚垫免疫的鼠胴淋巴结，一个来自用A431泡囊(1.1×10⁵个)体外免疫的鼠淋巴细胞(A431泡囊的详细构建和体外免疫见实施例1,2)。选择前，每个文库中至少46个克隆均用BstNⅠ酶作指纹法分析(Clackson等，Nature 1991,352:624)以确定所有组成成分(repertoires)的多样性。观察到了多种不同的消化图谱。在选择前还用ELISA法测试了每个文库中96个克隆的scFv与EGFR的结合。来自脾和淋巴结文库的scFv没有一个与EGFR结合。体外免疫文库的一个scFv与EGFR结合。用EGFR包被的免疫管(im-munotabes)进行一轮选择后，观察到淋巴结文库和体外免疫文库中EGFR结合性scFv有明显富集。需要第二轮选择才能从腺文库中检测到任何EGFR结合性scFv。第三轮选择后，淋巴结文库和体外免疫文库中大部分scFv的EGFR结合为阳性。第4轮选择后，脾文库中大部分scFv的EGFR结合为阳性(表1)。

表1：每轮选择后存在的EGFR结合性克隆数(％)

	淋巴结文库	脾文库	体外免疫细胞文库
	淋巴结文库	脾文库	体外免疫细胞文库	选择前	0	0	1
第1轮	77	0	84	选择前	0	0	1
第1轮	77	0	84	第2轮	86	26	100
第3轮	90	77	100	第2轮	86	26	100
第3轮	90	77	100	第4轮	未测定	97	未测定

(2)EGFR结合性克隆的序列分析

每轮选择后，用BstNⅠ指纹法(Clackson等，Nature 1991,352:624)分析了插入EGFR结合性克隆中的scFv。已显示某些消化图谱的富集。为了V_H和V_K的测序，从淋巴结文库的第二和第三轮选择和脾文库的第三和第四轮选择选出了具有不同BstNⅠ指纹的克隆。分析后几轮选择的克隆是因为预期较高亲和性的抗体在于后几轮选择中(Clackson等，Natare 1991,352:624)。

对淋巴结文库的16个克隆进行了测序，获得六种不同的scFv(图1)。其中五种是具有独特的V_H和V_K配对。第六种是以前存在的VH的变异体，其中有6个氨基酸变化，5个是在框架区(FR)1内。这种变化中两个可归因于简并的VH1BACKSFI引物的应用(Hoogenboon等，Nucl.Acids Res.1991,19:4133)。其它的可能是PCR错误的结果。V_H被分为两个亚组：V_H2b和V_H3d，而V_K分为四个亚组：V_K3、V_K4、V_K5和V_K6(Kabat等，Sequences of proteins ofimmunological interest,5th Eds.,U.S.Dept.of Health and Hu-man Services,Bethesda 1991)。对脾文库的10个单一克隆进行了测序，发现4种不同的scFv。其中三种为独特的V_H和V_K配对，而第四种与已有配对之一相似，仅在V_H有两个氨基酸差异，其中之一在互补决定区(CDR)2；在V_K中有两个氨基酸差异。V_H亚组分类为V_H2a、V_H2c和V_H3d,V_K分为V_K3和V_K4亚组。比较从淋巴结和脾文库中获得的scFv，发现只有一种scFv是两个文库中共有的：scFvL3 10A/scFv S4 10H(图1)。当用ELISA检测时该克隆表现与EGFR强结合。尽管非常小心以消除两种文库的交叉污染，但难以排除少量强EGFR结合性克隆的污染。但考虑到Balb/c小鼠的近交性，从两个不同文库中独立地产生同一scFv是可能的。(3)与EGFR结合的亲和性和特异性的分析

基于对抗原的良好结合和DNA序列的多样性，选择来自淋巴结和脾文库的几种scFv进行进一步分析。用ELISA分析这些scFv与纯化的EGFR的结合，与不相关抗原的结合，和与不表达EGFR的肿瘤细胞系的结合。作为阳性对照的scFv从鼠425 MAb制得(P1)。作为阴性对照的scFv从由选择前的淋巴结和脾文库分离的噬菌体抗体制得(分别为L1和S1)。比较要检测的scFv的稀释度与Western印迹中已知浓度的纯化scFv的稀释度，确定scFv的浓度。

用ELISA测定scFv与纯化EGFR的结合，并绘出结果(图2)。按照它们与EGFR的结合将scFv分级是可能的。这些分级在多次实验中有可重复性。与EGFR结合最强的scFv是来自淋巴结文库的L2 1C和L3 10A和来自脾文库的S4 10H。如前所述，scFv L3 10A和S4 10H具有相同的DNA序列。在V_H和V_K区各有两个氨基酸变化的与scfv S4 10H非常相似的一种scFv(S45A)始终比S4 10H较低级。相反，L2 12B和L3 11D之间观察到的序列差异则没有显示对结合的显著影响。所分离的scFv中，只有四种，L2 8G和L2 11C显示结合性比scFv 425差。

用ELISA测试了这些scFv与塑料和一系列标准不相关蛋白(卵白蛋白、鸡蛋水解酶、细胞色素C、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、CBA白蛋白和BSA)的结合。没有一种scFv给出基线以上的信号。

用ELISA测试了这些scFv与三种肿瘤细胞系的结合。细胞系A431和MDA MB 468是分别从阴门和乳房分离到的含EGFR的肿瘤细胞。细胞系SK-MEL-23是一种含神经节苷脂的黑素瘤细胞系，在此作为阴性对照。在测试的十种scFv中，仅有四种既与纯化EGFR也与带EGFR的肿瘤细胞结合(L2 12B,L3 11D,L2 11C和S4 2D，图5-8)。没有检测到与SK-MEL-23的结合。对这种意外结果有几种可能的解释。一种是用于免疫接种、选择、和ELISA的EGFR是分泌的EGFR相关蛋白(Weber等，Science1984,224:294)。这种蛋白在C-末端多出17个氨基酸(Gunther等，J.Biol.Chem.1990,265:22082)。用ELISA测试了scFv与这种17个氨基酸的肽的结合，没有观察到任何结合。分泌的EGFR相关蛋白可能与肿瘤细胞表面的EGFR在构象或糖基化上有差别。

为了进一步研究与肿瘤细胞的结合，纯化了三种scFv(L2 11A、L3 11D和S4 2D)，并用流式细胞仪分析了与A431肿瘤细胞的结合。425 scFv用作阳性对照。受试的三种scFv中，只有L3 11D和S4 2D与A431细胞结合。这两种scFv与scFv425具有相似的结合特性。

从与EGFR和含EGFR的肿瘤细胞(L3 11D和S4 2D)都结合的两种分离物制备的纯化scFv，在与鼠425 MAb的竞争结合实验中进行了测试。纯化的scFv425在一定浓度内能够抑制鼠425MAb与EGFR的结合，而scFv L3 11D和S4 2D在这些浓度下不能抑制鼠425 MAb与EGFR的结合。这两种scFv所识别的EGFR上的表位似乎与鼠425 MAb所识别的不同。(4)从scFv得到的嵌合完全抗体

选择了两种scFv(L3 11D和S4 2D)来转变为完全抗体分子。将编码鼠V_H和V_K的DNA克隆到中间载体中，此中间载体含有编码免疫球蛋白先导序列的DNA序列和剪接供体信号(图3)。V_H中间载体中克隆位点的定位意味着V_H的第一残基由无冬氨酸变为谷氨酸。从此中间载体，含有V_H和V_K并与先导序列及剪接供体序列连接的DNA片段被克隆到含有编码人γ-1恒定区域人K恒定区之DNA的哺乳动物细胞表达载体中(Maeda等，Hum,Antibod.Hybridomas 1991,2:124)。对每种嵌合抗体，用重链和轻链表达载体共转染COS细胞。作为阳性对照，也用编码425嵌合抗体的重链和轻链表达载体共转染细胞(Kettleporough等，Protein Eng.1991,4:773)。收集细胞培养液，用ELISA分析以测定存在的抗体浓度和抗体与EGFR结合的能力(图4)。当比较达到与抗原结合的半数最大值所需要的抗体浓度时，嵌合S4 2D抗体和425嵌合抗体与EGFR的结合一样好。但L3 11D嵌合抗体与GEFR的结合比425嵌合抗体的低4倍。已用竞争抑制分析测得425嵌合抗体的亲和力为1.9×10⁸M^-1。这些结果出人意料，因为以前的scFv分析数据已表明scFv S4 2D和L3 11D与EGFR的结合均比scFv425好(图2)。经蛋白-A纯化的L3 11D和S4 2D嵌合抗体样品在还原和非还原条件下进行SDS-PAGE分析。还用流式细胞仪测试了L311D和S4 2D嵌合抗体与A431和SK-MEL-23细胞的结合。两种嵌合抗体都与EGFR表达性A431细胞结合良好，而不与EGFR阴性的SK-MEL-23细胞结合。(5)治疗和诊断应用

本发明的抗体片段和完全抗体可给予病人进行治疗。因此，本发明的一个目的是提供含有至少一种在上文和权利要求中所定义的抗体或抗体片段作为活性成分的药物组合物，其中结合有一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。

本发明的抗体应作静脉内或肠外注射，一般地讲，抗体的给药剂量范围应足够大以产生所希望的肿瘤抑制和肿瘤化解的效果。剂量将取决于病人的年龄、性别和疾病的程度，变化范围为0.1mg/kg到200mg/kg，优选0.1mg/kg到100mg/kg/次，每天一次或多次，持续数天。

肠外给药制剂包括无菌水溶液或非水溶液、悬浮液和乳液。非水溶剂的实例为丙二醇、聚乙二醇、植物油和橄榄油、可注射的有机酯如油酸乙酯和本领域中已知适于这些目的的其它溶剂。本发明的抗体可用于含有生理可接受载体的组合物中。这种适当载体的实例有盐水、PBS、Ringers溶液、或乳酸化Ringers溶液。药物制剂中还可存在防腐剂和其它添加剂如抗生素、抗氧剂和螫合剂。

这种抗体(片段)还可以按已知方法与细胞因子如IL-2偶合以支持其细胞毒性。

本发明的药物制剂适于各种肿瘤，包括黑素瘤、神经胶质瘤和癌，以及循环系统的肿瘤和实体瘤。

为诊断目的，抗体可与例如不透射线染料偶联或做放射标记。优选的标记方法是Lodogen方法。抗体优选以F(ab＇)₂或scFv片段形式给药用于诊断目的。这提供了更佳的结果，使得没有必要减去背景。

实施例1：A431泡囊

对Cohen等描述的方法(J.Biol Chem,1982,257:1523；Yeaton等，J.Biol,Chem,1983,258:9254)进行某些修正，制取脱膜的泡囊制剂。长满A431细胞的烧瓶用含钙和镁的PBC洗涤。加入低渗PBS并振动烧瓶15分钟，然后用泡囊化缓冲液(100mMNaCl,50mMNa₂HPO₄,5mM KCl,0.5mM MgSO₄,pH8.5)洗涤细胞。加入泡囊化缓冲液，在室温及37℃下搅拌。然后通过金属网将缓冲液滗入冰中的50ml管中，150Xg、4℃离心5分钟。弃去沉淀，上清液以39000rpm超速离心90分钟。最终的沉淀重悬于10mM Hepes缓冲液(pH7.4)中。为分析来自泡囊的EGFR，样品用9体积乙醇沉淀，用0.08M Tris(pH6.8)重悬，用MAb425作为标准进行SDS-PAGE分析。

用改进的考马斯蓝方法对这些制备物的蛋白含量进行定量，用BSA作标准，在595nm读数。为分析来自泡囊的EGFR，样品用9体积乙醇沉淀(4℃过夜)。将沉淀用Tris(0.08M,pH6.8)重悬，然后进行SDS-PAGE电泳(5％积层凝胶；1小时，35mA；10％电泳胶；2.5小时；40mA)。样品和标准品均为双份。其中之一用考马斯蓝染色，另一个转印在硝基纤维素片上(12V；4℃16小时)并用鼠mAb 425(抗EGFR)和与碱性磷酸酶偶合的抗鼠IgG抗体处理。

三种培养基用于体外免疫接种。培养基-1(M1)、培养基-2(M2)和混合胸腺细胞培养基(MTC)。M1由补有50mM 2-巯基乙醇和2mM L-谷氨酰胺(Gibco)的HL1(Ventrex Laboratories，USA)组成。M2由补有50mM 2-巯基乙醇；40U/ml IL-2(Gen-zyme)；20mg/ml佐剂肽(sigma)；2mML-谷氨酰胺；100U/ml青毒素(Gibco)；100mg/ml链霉素(Gibco)的HL1组成。向M2中加入4％或20％的FCS(BiologicalIndustries)。如Uaux(1)描述的方法制备MTC。要点为：将胸腺压过一无菌的50目筛制备三周龄Balb/c和C57/BL-1小鼠胸腺的单细胞悬液。收集细胞悬液，用HBSS洗两次，用苔盼蓝排阻测定活细胞的数目。然后以每毫升2.5×10⁶每株胸腺细胞的密度在含有4％FCS、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100mg./ml链霉素的HL1培养基中培养胸腺细胞。48小时后，回收上清液，滤过一0.22mm的滤器，于-70℃下保存。

如所述胸腺细胞的制备方法，从非免疫的八周龄BALB/G小鼠获得脾细胞悬液。用苔盼蓝排阻法测定生存力。实施例2：体外免疫和筛选

三种培养基用于体外免疫接种。培养基-1(M1)、培养基-2(M2)和混合胸腺细胞培养基(MTC)。M1由补有50mM 2-巯基乙醇和2mM L-谷氨酰胺(Gibco)的HL1(Ventrex Laboratories,USA)组成。M2由补有50mM 2-巯基乙醇；40U/ml IL-2(Gen-zyme)；20mg/ml佐剂肽(sigma)；2mML谷氨酰胺；100U/ml青毒素(Gibco)；100mg/ml链霉素(Gibco)的HL1组成。向M2中加入4％或20％的FCS(Biological Industries)。如Uaux(1)描述的方法制备MTC。要点为：将胸腺压过一无菌的50目筛制备三周龄Balb/c和C57/BL-1小鼠胸腺的单细胞悬液。收集细胞悬液，用HBSS洗两次，用苔盼蓝排阻测定活细胞的数目。然后以每毫升2.5×10⁶每株胸腺细胞的密度在含有4％FCS、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100mg./ml链霉素的HL1培养基中培养胸腺细胞。48小时后，回收上清液，滤过一0.22mm的滤器，于-70℃下保存。

如所述胸腺细胞的制备制备方法，从非免疫的八周龄BALB/c小鼠获得脾细胞悬液。用苔盼蓝排阻法测定生存力。

将胸腺压过一无菌的50目筛制备三周龄Balb/c和C57/BL-1小鼠胸腺的单细胞悬液。收集细胞悬液，用HBSS洗两次，用苔盼蓝排阻测定活细胞的数目。然后以每毫升2.5×10⁶每株胸腺细胞的密度在含有4％FCS、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素的HL1培养其中培养胸腺细胞。48小时后，回收上清液，过滤并保存。如所述胸腺细胞的方法，从非免疫的八周龄BALB/c小鼠获得脾细胞悬液。用苔盼蓝排阻法测定生存力。

在一6孔板(Costar)上进行体外免疫。含有3.5mt M1-培养基(由补有50μm 2-巯基乙醇和2mM L-谷氨酰胺(Gibco)的HL 1-培养基组成)中的107脾细胞的孔与适当浓度的带EGFR的泡囊一起孵育(37℃,5％CO₂)。加入来自不表达EGFR的细胞的泡囊或PBS作为对照孔。几小时后，向每孔中加入3.5ml含4％或10％FCS(Biologocal Lndusrties)的M2-培养基(由补有50μM 2-巯基乙醇、40U/ml IL-2(Genzyme)、20μg/ml佐剂肽(Sigma)、2mML-谷氨酰胺、100U/ml青霉素(Gibco)、100μg/ml链霉素(Gibeo)的HL1组成)。在一些实验中，用补有佐剂肽(20μg/ml)和IL-2(40U/ml)的MTC培养基(混合胸腺细胞培养基(Vaax等，Nature 1988,336:36))代替M2(注意培养物中FCS,IL-2和佐剂肽的终浓度减低了50％)。在相同条件下培养细胞72、96、120或144小时，最后检测细胞是否存在特异免疫球蛋白或进行RNA分离。

用纯化抗原或A431固定化细胞进行筛选。操作步骤基本如前所述(Carroll等，Hybridoma 1990,9:81)，但有些修改。简言之，无菌的96孔板(Nunc,Maxisorb)用PBS中的EGFR(2.5μg/ml)、GD₃神经节苷脂(2μg/ml)或RNakse(10μg/ml)包被过夜。当A431细胞用作抗原时，在96孔板中培养细胞至汇合生长，再用0.1％戊二醛固定。体外免疫的淋巴细胞冲洗并重悬于补以2％FCS和2mM L-葡糖胺的HL1培养基中，密度为5×10⁵细胞/ml，向每孔中加入1×10⁵个细胞，孵育48小时(37℃,5％CO₂)。每组做16份。将淋巴细胞在含0.1％Tween-20的PBS中冲洗5次去除。用过氧化物酶标记的兔抗鼠免疫球蛋白(Dako)检测特异免疫球蛋白(1小时，37℃)。柠檬酸-磷酸缓冲液中的2,2′-连氮基-二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸-二铵盐(ABTS)(Sigma)作为底物。

实施例3：文库构建

从由腹膜内A431细胞免疫的鼠脾(Murthy等，Arch,Biochem,Biophys,1987,252:549)、由用纯化EGFR脚垫免疫的鼠腘淋巴结和由用A431泡囊体外免疫的鼠细胞制得的RNA，构建了三种文库。合成了第一股cDNA。PCR扩增并组装VH和VK基因(Clackson等，Natare 1991,352:624)。通过PCR，加入了Notl和Sfil限制位点，将scFv克隆到噬菌粒载体pHEN1中(Hoogen-boom等，Nucl.Acids Res.1991,19:4133)。将连接混合物电穿孔至大肠杆菌细胞中，形成的菌落刮到培养基中以产生文库原种(Marks等，J.Mol.Biol,1991,222:581)。

实施例4：文库筛选

用M13KO7辅助噬菌体(Promega,Madison,WI)从文库中拯救噬菌体抗体(Marks等，J.Mol.Biol 1991.222:581)。免疫管(Nunc,Life Sciences,Paisley,UK)用4ml PBS中的2.5μg/mlEGFR包被过夜。用PBS洗涤三次后，该管在含2％奶粉的PBS(PBSM)中37℃孵育至少1小时。将噬菌体(10¹²-10¹³)重悬于4ml PBSM中，在EGFR包被的管中室温孵育1小时。用PBS,0.1％Tween洗管20次，再用PBS洗20次。在1ml 0.1M三乙胺中倒置混合培养10分钟后，洗脱结合的噬菌体。洗脱的噬菌体中加入0.5ml 1M Tris-HCl,pH 7.5中和，用于感染大肠杆菌TG1细胞。将感染细胞涂板，挑出个体菌落用于小量诱导ScFv。将其余菌落刮到培养基中，一份用于制备下一次筛选的噬菌体。实施例5：scFv的产生和分析

按已有的描述(如，Kettleleborough等，I.C.)在大肠杆菌HB2151中产生可溶性scFv。用已知浓度的纯化scFv制剂作为标准，评估了细菌上清液中scFv的浓度。过滤上清液，加入叠氮化钠至0.1％。将此上清液和标准品的系列稀释液用96孔岐管点在Immobilon-PVDF滤膜(Millipore,Watford,UK)上。如Western印迹法(Towbin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1979,76:4350)处理此滤膜。用针对C-末端尾的抗体(9E10)(Munro and Pelham,Cell 1986,46:291)，和过氧化物酶偶联的羊抗鼠IgG和IgM抗体(Jackson Immuno Research Lab Inc,West Grove,PA)检测scFv。用ECL系统进行这些反应(Amersham,Aylesbury,UK)。闪光前的放射自显影图用光密度计扫描。做标准曲线并用于估价上清液中的scFv浓度。

用EGFRyy包被的板(2.5μg/ml)进行抗原结合性的ELISA检测。含scFv的上清液用PBSM稀释，并加至板上。用如上所述的9E10抗体检测结合的scFv。还测试了上清液与一系列标准不相关蛋白和塑料的结合。ELISA板用卵白蛋白、鸡蛋水解酶、细胞色素C、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、鼠白蛋白(CBA品种)和BSA以100μg/ml包被过夜。向包被板中加入含2％奶粉的未稀释上清液(两套)，并按上述方法检测结合的scFv。

用肿瘤细胞系A431(ATCC CRL 1555)、MDA MB 468(ATCC HTB 132)和SK-MEL-23(阴性对照)进行细胞结合性的ELISA检测。细胞在聚-D-赖氨酸处理的96-孔组织培养皿(Nunc)中生长至汇合。这些细胞用DMEM冲洗，用含2.5％BSA的PBS 37℃封闭2小时。吸出后，向每孔中加入上清液和等体积的含4％奶粉的2XYT培养基，4℃培养1小时。如上所述进行结合scFv的检测。

按如下方法进行竞争性ELISA用EGFR包被的ELISA板和50μl纯化scFv(100μg/ml)预培养，计10分钟，然后加入鼠MAb425(50μl)达3.13-200.ng/ml的浓度。孵育并冲洗后，用过氧化物酶偶联的羊抗鼠IgG和IgM抗体检测结合的鼠MAb 425。

实施例6：DNA分析

为了进行BstNⅠ指纹分析，将来自单个克隆的scFv插入序列进行PCR扩增，产物用BstNⅠ消化(Clackson等，Nature 1991,3S2:624)。用测序酶试剂盒(United States Biochemical,Cleveland,OH)进行DNA测序。

实施例7：scFv的纯化

离心并滤过0.2μm滤膜使细菌上清液澄清，然后加样于一1ml装有纯化的EGFR(5mg)与溴化氰活化的Sepharose 4B偶联(Pharmacia,Uppsala,Sweden)的柱上。该柱用30ml PBS再用5ml 0.2M甘氨酸(pH 5.0)冲洗。用0.2M甘氨酸/HCl(pH 2.8)洗脱scFv。洗脱液10X PBS中和。收集含蛋白的流份，经超滤(Am-icon,Stonehouse,UK)将缓冲液换成含1％BSA和0.05％叠氮化钠的PBS。实施例8：纯化scFv的FACS分析

A431细胞用胰蛋白酶消化并在含10％FCS的DMEM中培养。细胞用冷DMEM冲洗两次，滤过一45μm的筛。在冰上，细胞(10⁶)在50μl含1％BSA的PBS中与纯化scFv孵育30分钟。用冷PBS冲洗两次后，用50μl FITC偶合的9E 10抗体(100μg/ml)检测结合的scFv。冰上30分钟后，细胞用PBS冲洗一次，在含1％甲醛的PBS中固定，用FACSCAN(Becton-Dickinson,Cow-ley,UK)分析。实施例9：嵌合的完全抗体的构建、分析和表达

利用PstⅠ和BstEⅡ位点，将所选择的scFv VH的编码DNA亚克隆到一中间V_H载体中，该载体含有来自人抗体HG3 CL的真核先导序列(Rechavi等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1983,80:855)和剪接供体位点(图3)。利用能在5＇和3＇末端引入XhoⅠ和SstⅠ位点的PCR引物将V_K的编码DNA插入中间V_K载体中

(VkFor:5＇-CCG TTT CAG CTC GAG CTT GGT CCC-3＇,

VkBack:5＇-GAC ATT GAG CTC ACC CAG TCT CCA-3＇).将Sstl-XhoⅠ片段克隆到含有真核先导序列和剪接供体位点的中间V_K载体中，其中真核先导序列来自重构人CAMPATH-1轻链(Riechmann等，Nature 1988,332:21)。将编码可变区加真核侧翼区的DNA以HindⅢ-BamHⅠ片段克隆到含有编码人γ-1恒定区或人K恒定区的基因组DNA的哺乳动物细胞表达载体中(Maeda等，Hum.Antibod.Hyridomas 1991 2:124)。将重链和轻链表达载体电穿孔到COS细胞中。72小时后，收集培养液，并用ELISA分析嵌合的抗EGFR抗体(Kettleborough等，Protein Eng1991,4:773)。实施例10：从体外免疫细胞中产生scFv

以下公开的方法仅对上述方法稍加修饰。免疫、文库构建和筛选如实施例1-4中所述。下面详细描述接下来的步骤：

筛选初始文库和三轮淘选后的克隆，选出了一些单氨苄青霉素抗性菌落。碱性裂解制备噬菌粒DNA，并用以热激转染E.Coli HB2151，后者是一不含抑制基因菌株。将菌落接种到2xTY-Amp-Glu中，30℃生长过夜。将5ml等份接种到含100mg氨苄青霉素/ml和0.1％葡萄糖的2xTY培养液中，30℃振摇培养1小时(到对数期)。收集细胞，加入异丙基β-D-硫代半乳吡喃糖苷(IPTG)达终浓度1mm以诱异可溶性scFv的表达(Be Bellis,D.和Schwartz,I.；Nucleic Acids Res；1990,18:1311)。培养物在30℃振摇生长过夜。取出含scFv的上清液，离心并滤过0.22mm的滤膜使澄清，然后检测。按已有的描述(Kettleborough等，EP94104160和Eur.J.Immunol,1994,24:952)，用ELISA测试细菌上清液与EGFR的结合。利用以各种与EGFR相关和不相关的蛋白包被的培养板以及其它抗原和塑料，用ECISA检查选出的scFv片段的特异性。所用抗原是：RNase、BSA、OVA、GD₃神经节苷脂、玻连蛋白受体(VNR)、血小板糖蛋白ⅡbⅢa(GPⅡbⅢa)和disialyl-lacto-N-四糖(DSLNT)。在每种抗原的最佳浓度下包被过夜。包被的ELISA培养板用1.5％PBS中的脱脂奶粉(w/v)37℃封闭1小时。冲洗后，向微滴定孔中加入100ml scFv上清液，37℃培养2小时。用抗-C-myc抗体9E 10(MyC 1-9E10.2杂交体培养液)和碱性磷酸酶偶合的兔抗鼠抗体(Dako)检测结合的scFv。

三种含EGFR的肿瘤细胞系A431、MDA MB231人乳腺癌(ATCC,HTB26)和HT 29人结肠腺癌(ATCC,HTB 38)，和一种不表达EGFR的细胞系WM164用于测试scFv与细胞上EGFR的结合能力，用FACS分析和未固定细胞的免疫荧光进行测试。为进行间接免疫荧光分析，将细胞铺在Terasaki板上(2×104细胞/孔)并培养24小时。然后细胞与含有scFv片段的20ml粗细菌上清液室温培养90分钟。第一抗体 (抗-G-myc)和第二抗体的孵肓在室温进行60分钟。第二抗体-FICT偶合的兔抗鼠抗体(DaKo)按1∶20稀释。

为进行FACS分析，5×10⁵个细胞用含有1％BSA和0.1％叠氮化钠的PBS(PBS-BSA)冲洗三次，用50ml粗的细菌上清液4℃培养20分钟。用冷的PBS-BSA洗两次后，用1:25稀释于PBS-BSA中的抗-C-myc抗体和FITC偶合的羊抗鼠抗体(Becton Pickinson)检测结合的scFv。加入碘化丙锭(PI)达终浓度5mg/ml。在备有空气冷却的氩激光器的EPICS ProfileⅡ中进行流式细胞计数分析。用488nm的光线(15mV)激发。530nm的带通滤波器用于收集FITC发射光，625nm的带通滤波器用于收集PI发射光。在前侧方散射器上设置一数码变换器并排除PI染色细胞来选择活细胞。

通过克隆化片段的PCR扩增(Güssow,D,Clackson,T；Nu-cleic Acids Res,1989,17:4000)和BstNI消化图谱(8)的分析测定了原始文库和选择后文库的多样性。用测序酶(Sequenase)试剂盒(USB)以双脱氧链终止法对一些克隆测序(Sanger,F等；Proc,Nat,Acad,Sci,U.S.A 1977,74:5463)。

粗细菌上清液(10nd)用12.5％凝胶进行SDS-PAGE。基本按Towbin所述方法(Towbin等，J.Proc.Nat.Acad.Sci.,U.S.A,1979,76:4350)进行Western印迹。通过电印迹将蛋白转移到Immobilon-P(Millipore)上或硝基纤维素(Bio-Rad)上。用含有2％脱脂牛奶(w/v)的PBS封闭印迹。用抗-C-myc抗体(9E10)、过氧化物酶偶合的抗鼠抗体(Jackson)和增强化学发光系统(ECL,Amersham)检测scFv片段。

脱膜泡囊的定量分析表明蛋白总浓度为2.5mg/ml，其中只有10-14％，相当于EGFR(Sato等，J.Natl.Cancer Inst,1989,21:1601；Yeaton,R等，J.Biol Chem.,1983,258:9254)含量约为250-350ng/ml。用PAGE-SDS电泳分析然后考马斯蓝染色，表明泡囊含有相当复杂的蛋白混合物。没有检测到蛋白降解。Western印迹分析表明在我们的实验条件下，在膜泡囊制剂中存在EGF受体的完全分子。

为了确定对FCS和淋巴因子是否需要，比较了含2％或4％FCS的MTC和M2。含EGFR的泡囊和PBS分别用作抗原和对照。脾细胞在有或无抗原的16孔板上于M1(无血清)中孵育3小时。然后加入MTC或M2,72、96、120或144小时后用A43l固定化细胞进行筛选。在所有实验中，所记录的活细胞数在20-40％之间，与文献结果相符(Gavilondo-Cowley,J.等；In Vitro Immuniza-tion in Hybridoma Technology。Elsevier Science Publishers B.V.,Amsterdam,P131)。用MTC时在第4天获得最大特异性应答；而用含4％或20％PCS(终浓度为2％或10％)的M2时，最大应答延迟至第6天(表2)。但MTC和10％FCS可能通过多克隆活化激起非特异性应答，这可从用特异非特异应答比率表示的结果看出。所以以后的实验我们决定使用的是以4％FCS补充的M2培养6天。

在泡囊表面存在EGFR大大增强了对此抗原的应答。按与上述相似的实验方法，比较了来自表达或不表达EGFR的细胞系的泡囊。淋巴细胞与泡囊在M1中培养3小时，然后加入含4％FCS的M2。6天后每组的淋巴细胞在用EGFR、A431-固定细胞、RNase或GD3包被的96孔板中培养48小时。如所期望的那样，这些实验的结果显示应答的多特异性模式(表3)。当表达EGFR的泡囊用作抗原时，用光密度表示的与EGFR的反应性明显提高。

综上所述，这些结果提示(虽然还不成熟)：体外免疫后存在可测量的抗原依赖性应答，这种体外免疫产生数群适于可变区PCR克隆的抗EGFR免疫淋巴细胞。

将来自体外免疫的scFv片段克隆到pHEN1噬菌粒中后获得了1.1×10⁵个克隆的文库。该文库是与另两个进行体内免疫产生的文库平行产生的。这些噬菌体文库的构建以前已有描述(Kettleborough等，EP 94104160和Eur.J.Immund,1994,24:952)。

为了选择与EGFR结合的scFv片段，用EGFR包被的免疫管淘选噬菌体。洗脱的噬菌体用于再感染大肠杆菌SupE株。共进行三轮选择。每轮中有一无抗原的试管进行平行实验以计算背景。在第一次淘选中，向免疫管中加入1.5×10¹⁰个噬菌体颗粒，从包被的免疫管洗脱出了6.6×10⁴个；而从背景噬菌体群中仅得到200个克隆。第三次淘选后，加入1×10¹¹个噬菌体，洗脱出5.6×10¹⁰个。

为了进一步鉴定scFv片段，在选择前和每轮选择后，我们共从噬菌体群中选出22个克隆。用克隆化片段的BstNⅠ酶切图谱来分析文库的多样性。选择前的文库表现差异极大。第一轮选择后的结合克隆的指纹显示有几组的限制性图谱相同。

基于它们的酶切图谱，从不同轮次选择中选择克隆。DNA测序表明在大部分所选克隆中存在不同的序列。克隆10D2、5D3、10E2、1B3、4B3和5E2的互补决定区(CDR)的长度和组成不同。最大的变化见于V_H和V_L序列的CDR3区。克隆5D3和1E3来自第三轮选择。ELISA和流式细胞仪分析表明它们与EGFR的结合极强，并具有相同的序列。

通过不合抑制基因的大肠杆菌菌株HB2151在IPTG存在下生长，获得可溶性scFv片段。

为了证实scFv的产生，凝胶电泳分析个体克隆的细菌培养液。Western印迹分析显示一条35,000KD左右的清楚的带。

通过ELISA鉴定具有EGFR结合活性的克隆。为了检查所选克隆的交叉反应性，用不同抗原进行ELISA分析。抗原(EGFR,RNase,BSA,KLH,OVA,GD₃神经节苷脂、玻连蛋白受体、血小板糖蛋白ⅡbⅢa，和disalyl-lacto-N-四糖)以最佳浓度包被在ELISA板中(表4)。没有检测到与非EGFR抗原的结合。还测试了scFv与三种含EGFR的肿瘤细胞系(人表皮样癌A431，人乳腺癌MDA MB 231和人结肠腺癌HT 29)的结合。不表达EGFR的人黑素瘤细胞WM 164用作阴性对照。通过用非固定化细胞进行间接免疫荧光分析测试与肿瘤细胞结合的克隆，并用FAGS分析进行定量。使用非固定化细胞保证了膜受体的天然构象。阳性克隆用A431细胞显示明显的荧光。与其它含EGFR的肿瘤细胞系的荧光弱。没有检测到与阴性细胞系的结合。流式细胞计数分析证实了这些结果。用流式细胞计数法分析了17个阳性克隆和3个阴性克隆与A431、MDA MB 231和HT 29细胞的结合。WM 164用作阴性细胞系。425 scFv(P1克隆)用作阳性对照，克隆载体(HEN)作为阴性对照。结果综合在表5中。与ELISA分析相同，4B2和5E2两个克隆与EGFR结合呈阳性，但与表达EGFR的肿瘤细胞系的结合呈阴性。

表2：不同培养基对体外免疫^a)的影响

		对A431筛选的时间
		对A431筛选的时间				第3天	第4天	第5天	第6天
		实验	抗原	O.D.^c) ^d)	O.D.	第3天	第4天	第5天	第6天	U.D.	O.D.比率
1	泡囊PBS	实验	抗原	O.D.^c) ^d)	O.D.	0.393 2.110.186	0.801 3.760.213	0.784 3.900.201	0.951 10.30.092	U.D.	O.D.比率
1	泡囊PBS	2	泡囊PBS	0.527 2.500.210	0.852 1.760.482	0.393 2.110.186	0.801 3.760.213	0.784 3.900.201	0.951 10.30.092	0.863 2.750.313	1.168 3.940.296
3	泡囊PBS	2	泡囊PBS	0.527 2.500.210	0.852 1.760.482	0.763 1.480.513	1.169 2.010.581	1.089 2.070.525	1.115 1.910.581	0.863 2.750.313	1.168 3.940.296

实验1：M1加M₂,4％FCS(FCS的终浓度：2％)

实验2：M1加M₂,20％FCS(FCS的终浓度：10％)

实验3：A培养基加MTC,4％FCS(FCS的终浓度：2％)

a)BALB/c小鼠脾细胞(10⁷)在六孔板的孔中与A431细胞的泡囊或PBS在3.5ml M1中孵育。然后加入3.5ml含4％或20％FCS的MTC或M2，并孵育。在第3,4,5或6天，从培养基中取出体外免疫淋巴细胞，在HBSS中冲洗去除泡囊并种在用固定化A431细胞包被的96孔板中，再孵育48小时(见方法部分)。

b)培养基中FCS的终浓度。

c)O.D.是在405nm处的光密度读数。它代表16个孔的平均值。

d)特异应答(泡囊作抗原)/非特异性应答(PBS作抗原)的比率。

表3：体外免疫后应答的多特异性^a)

筛选
筛选							抗原组	A431 CELLS	EGFR	GD3	RNase
实验1	EGFR+EGFR-	0.512^(b)0.427	0.3260.070	0.1400.123	0.2490.304		抗原组	A431 CELLS	EGFR	GD3	RNase
实验1	EGFR+EGFR-	0.512^(b)0.427	0.3260.070	0.1400.123	0.2490.304	实验2	EGFR+EGFR-	1.4300.789	0.7300.195	0.2330.118	0.6700.561

a)淋巴细胞用表达EGFR的泡囊(EGFR⁺)或不表达EGFR的泡囊(EGFR^-)体外免疫。孵育6天后，从培养物中去除细胞并对上述抗原进行筛选。

b)应答用光密度(405nm)表达。

表4：所选scFv片段对几种抗原的交叉反应性(a)

抗原(b)	包被量[mg/ml]	结果
抗原(b)	包被量[mg/ml]	结果	EGFRRNaseBSAKLHOVAGD₃神经节苷脂VNRGPⅡbⅢaDSLNT	25101010102115	+--------

a)如上所述进行ELISA分析。

b)玻连蛋白受体(VNR)；血小板糖蛋白ⅡbⅢa(GPⅡbⅢa)；disialyl-lacto-N-四糖(DSLNT)。

表5抗EGFR的scFv克隆的反应性。使用纯化可溶性抗原的ELISA方法与细胞系的细胞计数分析之间的比较结果。

克隆	肿瘤细胞系的细胞计数分析^(a)经验荧光单位的平均值				ELISA(O.D.)
克隆	肿瘤细胞系的细胞计数分析^(a)经验荧光单位的平均值				ELISA(O.D.)	阳性	WM164	A431	MDAAMB231	HT29	EGFR
7H14B210D212D2SE28E25F211H21B34B33D35D34F3	1.51.21.51.81.41.51.31.90.60.51.20.50.4	112.95.3145.312952.5134.5146.3152.2105.17894.3112110.3	16.44.236.329.37.147.740.625.336.415.825.122.232.3	2.60 64.85.70.55.15.725.22.34.85.56.2	1.22221.81.91.91.9＞221.9＞2＞2	阳性	WM164	A431	MDAAMB231	HT29	EGFR
7H14B210D212D2SE28E25F211H21B34B33D35D34F3	1.51.21.51.81.41.51.31.90.60.51.20.50.4	112.95.3145.312952.5134.5146.3152.2105.17894.3112110.3	16.44.236.329.37.147.740.625.336.415.825.122.232.3	2.60 64.85.70.55.15.725.22.34.85.56.2	1.22221.81.91.91.9＞221.9＞2＞2	4G31E33H3	0.40.40.6	76.5118.376.5	20.433.833.7	25.14.2	＞22＞2

表5(续)

阴性5F17G11II1	2.41.40.5	2.310.25	3 644	1.82.80.75	0.20.20 2
阴性5F17G11II1	2.41.40.5	2.310.25	3 644	1.82.80.75	0.20.20 2	对照(b)HENP1	0.40.6	4.185.5	3.721.3	12.5	0.21.9

a)三种带EGFR的细胞系(A431,MDAAMB 231和HT 29)和一种不表达EGFR的细胞系(WM 164)用于所述细胞计数分析，检测scFv与肿瘤细胞的结合能力。

b)无片段的载体(HEN)和来自425mAb(P1)的scFv片段分别作作阴性和阳性对照。

序列表(1)一般信息：

(ⅰ)申请人：

(A)名称：Merck Patent GmbH

(B)街道：Frankfurter str 255

(C)城市：Darmstadt

(E)国家：德国

(F)邮编：64271

(G)电话：49-6151-727022

(H)传真：49-6151-727191

(ⅱ)发明题目：抗表皮生长因子受体的单链可变区片段和抗体(ⅲ)序列数：32

(ⅳ)计算机可读形式：

(A)媒体类型：软盘

(B)计算机：IBM PC兼容

(G)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

(D)软件：Patent In Release#1.0,Version#1.30(EPO)(2)SEQ ID NO:1的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：327个碱基对

(B)类型：核酸

(G)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：CDNA

(ⅲ)假设：无

(ⅳ)反义：无

(ⅴ)片段类型：N-末端

(ⅵ)原始来源：

(A)生物：小鼠

(B)品系：Balb/c

(D)生长期：成年

(F)组织类型；淋巴结

(ⅶ)直接来源：

(B)克隆：L2 11C(轻链)

(ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：CDS

(B)位置：1..327

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:1GAC ATT GAG CTC ACC CAG TCT CCA GCC TCC CTG GCT GCA TCT GTG GGA 48Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Ala Ser Val Gly1 5 10 15GAA ACT GTC ACC ATC ACA TGT CGA GCA AGT GAG AAC ATT TAC TAT AGT 96Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Tyr Ser

20 25 30TTA GCA TGG TAT CAG CAG AAG CAA GGG AAA TCT CCT CAG CTC CTG ATC 144Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile

35 40 45TAT AGT GCA AGC GcC TTG GAA GAT GGT GTC CCA TCG AGG TTC AGT GGC 192Tyr Ser Ala Ser Ala Leu Glu Asp Gly Val pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60AGT GGA TCT GGG ACA CAG TAT TCT TTA AAG ATC AAC AAC ATG CAG CCT 240Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Asn Met Gln Pro65 70 75 80GAA GAT ACC GCT ACT TAC TTC TGT AAA CAG ACT TAT GAC GTT CCG TGG 288Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Lys Gln Thr Tyr Asp Val Pro Trp

85 90 95ACG TTC GGT GGA GGG ACC AAG CTG GAA ATA AAA CGG GCG 327Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala

100 105(2)SEQ ID NO:2的信息

(ⅰ)序列特性：

(A)长度：109个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白质

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:2:Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Ala Ser Val Gly1 5 10 15Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Tyr Ser

20 25 30Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile

35 40 45Tyr Ser Ala Ser Ala Leu Glu Asp GLy Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

5O 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Asn Met Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Lys Gln Thr Tyr Asp Val Pro Trp

85 90 95Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala

100 105(2)SEQ ID NO:3的信息

(ⅰ)序列特性：

(A)长度：357个碱器对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：cDNA

(ⅲ)假设：无

(ⅳ)反义：无

(ⅴ)片段类型：N-末端

(ⅵ)原始来源：

(A)生物：小鼠

(B)品系：Balb/c

(C)生长期：成年

(F)组织类型：淋巴结

(ⅶ)直接来源

(B)克隆：L2 11C(重链)

(ⅰⅹ)特征：

(A)名称/关键词：CDS

(B)位置：1..357

(ⅹⅰ,SEQUENCE DESCRIPTION:SEQ ID NO:3:CAG GTG CAA CTG CAG GAG TCA GGG CCT GAG CTG GTG AGG CCT GGG GCT 48Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala110 115 120 125TCA GTG AAG ATG TCC TGC AAG GCT TCA GGC TAT ACC TTC ACT ACC TAC 96Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

130 135 140TGG ATA CAC TGG ATG AAA CAG AGG CCT GGA CAA GGC CTT CAG TGG ATT 144Trp Ile His Trp Met Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Gln Trp Ile

145 150 155GGC ATG ATT GAT CCT TCC AAT AGT GAA ACT AGG TTA AAT CAG AAT TTC 192Gly Met Ile Asp Pro Ser Asn Ser Glu Thr Arg Leu Asn Gln Asn Phe

160 165 170AGG GAC AAG GCC ACA TTG AGT GTA GAC AAA TCC TCC AAT AAA GCC TAC 240Arg Asp Lys Ala Thr Leu Ser Val Asp Lys Ser Ser Asn Lys Ala Tyr

175 180 185ATG CAG CTC AGC AGC CTG ACA TCT GAG GAC TCT GCA ATC TAT TAC TGT 288Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys190 195 200 205GCA AGA TGG GAC TAC GGT AGT GGC CAC TTT GAC TAC TGG GGC CAA GGG 336Ala Arg Trp Asp Tyr Gly Ser Gly His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

210 215 220ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA 357Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

225(2)SEQ ID NO:4的信息

(ⅰ)序列特性：

(A)长度：119个碱基

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白质

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:4:Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30Trp Ile His Trp Met Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Gln Trp Ile

35 40 45Gly Met Ile Asp Pro Ser Asn Ser Glu Thr Arg Leu Asn Gln Asn Phe

50 55 60Arg Asp Lys Ala Thr Leu Ser Val Asp Lys Ser Ser Asn Lys Ala Tyr65 70 75 80Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95Ala Arg Trp Asp Tyr Gly Ser Gly His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115

SEQ ID NO:5的信息

(ⅰ)序列特性：

(A)长度：339个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：cDNA

(ⅲ)假设：无

(ⅳ)反义：无

(ⅴ)片段类型：N-末端

(ⅳ)原始来源：

(A)生物：小鼠

(B)品系：Balb/c

(C)生长期：成年

(F)组织类型：淋巴结

(ⅶ)直接来源

(B)克隆：L2 11B(轻链)

(ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：CDS

(B)位置：L..339

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:5:GAC ATT GAG CTC ACC CAG TCT CCA GCT TCT TTG GCT GTG TCT CTA GGG 48Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly120 125 130 135CAG AGG GCC ACC ATC TCC TGC AGA GCC AGC GAA AGT GTT GAT AAT TTT 96Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Phe

140 145 150GGC ATT AGT TTT ATG AAC TGG TTC CAA CAG AAA CCA GGA CAG CCA CCC 144Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

155 160 165AAA CTC CTC ATC TAT GGT GCA TCC AAC CAA GGA TCC GGG GTC CCT GCC 192Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ala

170 175 180AGG TTT AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACA GAC TTC AGC CTC AAC ATC CAT 240Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His

185 190 195CCT CTG GAG GAG GAT GAT ACT GCA ATG TAT TTC TGT CAG CAA AGT AAG 288Pro Leu Glu Glu Asp Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys200 205 210 215GAG GTT CCG CTC ACG TTC GGT GCT GGG ACC AAG CTG GAA ATA AAA CGG 336Glu Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

220 225 230GCG 339Ala(2)SEQ ID NO:6的信息

(ⅰ)序列特性：

(A)长度：113个碱基对

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白质

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:6:Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly1 5 10 15Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Phe

20 25 30Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His65 70 75 80Pro Leu Glu Glu Asp Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys

85 90 95Glu Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110Ala(2)SEQ ID NO:7的信息

(ⅰ)序列特性：

(A)长度：357个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：cDNA

(ⅲ)假设：无

(ⅳ)反义：无

(ⅳ)片段类型：N-末端

(ⅵ)原始来源：

(A)生物：小鼠

(B)品系：Balb/c

(C)生长期：成年

(F)组织类型：淋巴结

(ⅶ)直接来源

(B)克隆：L2 11 B(重链)

(ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：CDS

(B)位置：1..357

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:7:CAG GTG CAG CTG CAG GAG TCT GGA CCT GAG CTG GTG AAG CCT GGG GCT 48Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

115 120 125TTA GTG AAG ATA TCC TGC AAG GCT TCT GGT TAC ACC TTC ACC AGC TAC 96Leu Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr130 135 140 145TGG ATG CAC TGG GTG AAG CAG AGG CCT GGA CAA GGC CTT GAG TGG ATC 144Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

150 155 160GGA GAG ATT GAT CCT TCT GAT AGT TAT ACT AAC TAC AAT CAA AAG TTC 192Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Ash Gln Lys Phe

165 170 175AAG GGC AAG GCC ACA TTG ACT GTA GAC AAA TCC TCC AAC ACA GCC TAC 240Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

180 185 190ATG CAG CTC AGC AGC CTG ACA TCT GAG GAC TCT GCG GTC TAT TAC TGT 288Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

195 200 205GCA AGA TCG GAC TAC GGT AGT AGC CAC TTT GAC TAC TGG GGC CAA GGG 336Ala Arg Ser Asp Tyr Gly Ser Ser His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly210 215 220 225ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA 357Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

230(2)SEQ ID NO:8的信息

(ⅰ)序列特性：

(A)长度：119个碱基对

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白质

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:8:Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala1 5 10 15Leu Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95Ala Arg Ser Asp Tyr Gly Ser Ser His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115SEQ ID NO:9的信息

(ⅰ)序列特性：

(A)长度：339个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：cDNA

(ⅲ)假设：无

(ⅳ)反义：无

(ⅴ)片段类型：N-末端

(ⅵ)原始来源：

(A)生物：小鼠

(B)品系：Balb/c

(C)生长期：成年

(F)组织类型：淋巴结

(ⅶ)直接来源

(B)克隆：L3 11D(轻链)

(ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：CDS

(B)位置：L.339

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:9:GAC ATT GAG CTC ACC CAG TCT CCA GCT TCT TTG GCT GTG TCT CTA GGG 48ASp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly120 125 130 135CAG AGG GCC ACC ATC TCC TGC CGA GCC AGC GAA AGT GTT GAT AAT TTT 96Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Phe

185 190 195CCT TTG GAG GAG GAT GAT ACT GCA ATG TAT TTC TGT CAG CAA AGT AAG 288Pro Leu Glu Glu Asp Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys200 205 210 215GAG GTT CCG CTC ACG TTC GGT GCT GGG ACC AAG CTG GAG CTG AAA CGG 336Glu Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg

220 225 230GCG 339Ala(2)SEQ ID NO:10的信息

(ⅰ)序列特性：

(A)长度：113个碱基对

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白质

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:10:Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly1 5 10 15Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Phe

20 25 30Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

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50 55 60Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His65 70 75 80pro Leu Glu Glu Asp Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lye

85 90 95Glu Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg

100 105 110Ala(2)SEQ ID NO:11的信息

(ⅰ)序列特性：

(A)长度：357个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

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(ⅵ)原始来源：

(A)生物：小鼠

(B)品系：Balb/c

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(ⅶ)直接来源

(B)克隆：L3 11D(重链)

(ⅰⅹ)特征：

(A)名称/关键词：CDS

(B)位置：1..357

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150 155 160GGA GAG ATT GAT CCT TCT GAT AGT TAT ACT AAC TAC AAT CAA AAG TTC 192Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

165 170 175AAG GGC AAG GCC ACA TTG ACT GTA GAC AAA TCC TCC AGC ACA GCC TAC 240Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

230(2)SEQ ID NO:12的信息

(ⅰ)序列特性：

(A)长度：119个碱基对

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白质

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:12:Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

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85 90 95Ala Arg Ser Asp Tyr Gly Ser Ser His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115(2)SEQ ID NO:13的信息

(ⅰ)序列特性:

(A)长度：327个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：cDNA

(ⅲ)假设：无

(ⅳ)反义：无

(ⅴ)片段类型：N-末端

(ⅵ)原始来源：

(A)生物：小鼠

(B)品系：Balb/c

(C)生长期：成年

(F)组织类型：淋巴结

(ⅶ)直接来源

(B)克隆：S4 2D(轻链)

(ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：CDS

(B)位置：1..327

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:13:GAC ATT GAG CTC ACC CAG TCT CCA ACC ACC ATG GCT GCA TCT CCC GGG 48Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Thr Thr Met Ala Ala Ser Pro Gly120 125 130 135GAG AAG ATC ACT ATC ACC TGC AGT GCC AGC TCA AGT ATA AGT TCC AAT 96Glu Lys Ile Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Ser Asn

140 145 150TAC TTG CAT TGG TAT CAG CAG AAG CCA GGA TTC TCC CCT AAA CTC TTG 144Tyr Leu Mis Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Phe Ser Pro Lys Leu Leu

155 160 165ATT TAT AGG ACA TCC AAT CTG GCT TCT GGA GTC CCA GCT CGC TTC AGT 192Ile Tyr Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser

170 175 180GGC AGT GGG TCT GGG ACC TCT TAC TCT CTC ACA ATT GGC ACC ATG GAG 240Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Gly Thr Met Glu

185 190 195GCT GAA GAT GTT GCC ACT TAC TAC TGC CAG CAG GGT AGT AGT ATA CCA 288Ala Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ser Ser Ile Pro200 205 210 215CGC ACG TTC GGA GGG GGC ACC AAG CTG GAA ATC AAA CGG 327Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

220 225(2)SEQ ID NO:14的信息

(ⅰ)序列特性：

(A)长度：109个碱基对

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白质

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:14:Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Thr Thr Met Ala Ala Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Lys Ile Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Ser Asn

20 25 30Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Phe Ser Pro Lys Leu Leu

35 40 45Ile Tyr Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser

50 55 60Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Gly Thr Met Glu65 70 75 80Ala Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ser Ser Ile Pro

85 90 95Arg Thr Phe Gly GLy Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105(2)SEQ ID NO:15的信息

(ⅰ)序列特性：

(A)长度：354个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：cDNA

(ⅲ)假设：无

(ⅳ)反义：无

(ⅴ)片段类型：N-末端

(ⅵ)原始来源：

(A)生物：小鼠

(B)品系：Balb/c

(C)生长期：成年

(F)组织类型：淋巴结

(ⅶ)直接来源

(B)克隆：S4 2D(重链)

(ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：CDS

(B)位置：1..354

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:15:GAG GTC AAG CTG CAG CAG TCA GGA CCT GAG CTG GTA AAG CCT GGG GCT 48Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala110 115 120 125TCA GTG AAG ATG TCC TGC AAG GCT TCT GGA TAC GCA TTC ATA AGT TTT 96Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ile Ser Phe

130 135 140GTT ATG CAC TGG GTG AAG CAG AAG CCT GGG CAG GGC CTT GAG TGG ATT 144Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

145 150 155GGA TTT ATT AAT CCT TAC AAT GAT GGT ACT AAG TAC AAT GAG AAG TTC 192Gly Phe Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

160 165 170AAA GAC AAG GCC ACA CTG ACT TCA GAC AAA TCC TCC AGC ACA GCC TAC 240Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

175 180 185ATG GAG CTC AGC AGC CTG ACC TCT GAG GAC TCT GCG GTC TAT TAC TGT 288Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys190 195 200 205GCA AGT GGG GAT TAC GAC AGG GCT ATG GAC TAC TGG GGC CAA GGG ACC 336Ala Ser Gly Asp Tyr Asp Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

210 215 220ACG GTC ACC GTC TCC TCA 354Thr Val Thr Val Ser Ser

225(2)SEQ ID NO:16的信息

(ⅰ)序列特性：

(A)长度：118个碱基对

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白质

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:16:Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ile Ser Phe

20 25 30Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45Gly Phe Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95Ala Ser Gly Asp Tyr Asp Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110Thr Val Thr Val Ser Ser

115(2)SEQ ID NO:17的信息

(ⅰ)序列特性：

(A)长度：717个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：cDNA

(ⅲ)假设：无

(ⅳ)反义：无

(ⅴ)片段类型：N-末端

(ⅵ)原始来源：

(A)生物：小鼠

(B)品系：Balb/c

(C)生长期：成年

(F)组织类型：脾细胞

(ⅶ)直接来源

(B)克隆：4B2

(ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：CDS

(B)位置：1..717

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:17:GAG GTG AAG CTG CAG GAG TCT GGG GGA GAC TTA GTG AAG CCT GGA GGG 48GIu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly

120 125 130TCC CTG AAA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACT TTC AGT AGC TAT 96Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr135 140 145 150GGC ATG TCT TGG GTT CGG CAG ACT CCA GAC AAG AGG CTG GAG TCT GTC 144Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Ser Val

155 160 165GCA ACC ATT AGT AGT GGT GGT GCT TAC ATC TAC TAT CCA GAC AGT GTG 192Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ala Tyr Ile Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

170 175 180AAG GGG CGA TTC ACC ATC TCC AGA GAC AAT GCC AAG AAC ACC CTG TAC 240Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

185 190 195CTG CAA ATG AGC AGT CTG AAG TCT GAG GAC ACA GCC ATG TAT TAC TGT 288Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

200 205 210GCA AGA CTT GAA ACC GGG GAC TAT GCT TTG GAC TAC TGG GGC CAA GGG 336Ala Arg Leu Glu Thr Gly Asp Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly215 220 225 230ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA GGT GGC GGT GGC TCG GGC GGT GGT GGG 384Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

235 240 245TCG GGT GGC GGC GGA TCT GAC ATT GAG CTC ACC CAG TCT CCA GCT TCT 432Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser

250 255 260TTG GCT GTC TCT CTA GGG CAG AGG GCC ACC ATA TTC TGC AAG GAC AGC 480Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Phe cys Lys Asp Ser

265 270 275CAA AGT GTT GAT TAT GAT GGT GAT AGT TAT ATG AAC TGG TAC CAA CAG 528Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln

280 285 290AAA CCA GGA CAG CCA CCC AAA CTC CTC ATC TAT GCT CGA TCC AAT CTA 576Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Arg Ser Asn Leu295 300 305 310GAA TCT GGG GTC CCT GCC AGG TTT AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACA GAC 624Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp

315 320 325TTC AGC CTC AAC ATC CAT CCT GTG GAG GAG GAT GAT ATT GCA ATG TAT 672Phe Ser Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Asp Asp Ile Ala Met Tyr

330 335 340TTC TGT CAG CAA AGT AGG AAG GTT CCG TGG TCG TTC GGT GGA GGG 717Phe Cys Gln Gln Ser Arg Lys Val Pro Trp Ser Phe Gly Gly Gly

345 350 355(2)SEQ ID NO:18的信息

(ⅰ)序列特性：

(A)长度：239个碱基对

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白质

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:18:Glu Val Lys Leu Gln Glu ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Ser Val

35 40 45Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ala Tyr Ile Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95Ala Arg Leu Glu Thr Gly Asp Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser

130 135 140Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Phe Cys Lys Asp Ser145 150 155 160Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln

165 170 175Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Arg Ser Asn Leu

180 185 190Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp

195 200 205Phe Ser Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Asp Asp Ile Ala Met Tyr

210 215 220Phe Cys Gln Gln Ser Arg Lys Val Pro Trp Ser Phe Gly Gly Gly225 230 235(2)SEQ ID NO:19的信息

(ⅰ)序列特性：

(A)长度：732个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：cDNA

(ⅲ)假设：无

(ⅳ)反义：无

(ⅵ)原始来源：

(A)生物：小鼠

(B)品系：Balb/c

(F)组织类型：脾细胞

(ⅶ)直接来源

(B)克隆：10D2(单链FV，重链，轻键加接头)

(ⅸ)特征：(A)名称/关键词：CDS

(B)位置：1..732

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:19:GAG GTG CAG CTG CAG CAG TCT GGG GCT GAA CTG GTG AAG CCT GGG GCT 48Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala240 245 250 255TCA GTG AAG TTG TCC TGC AAG GCT TCC GGC TAC ACC TTC ACC AGC CAC 96Ser Val Lye Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser His

260 265 270TGG ATG CAC TGG GTG AAG CAG AGG GCT GGA CAA GGC CTT GAG TGG ATC 144Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Ala Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

275 280 285GGA GAG TTT AAT CCC AGC AAC GGC CGT ACT AAC TAC AAT GAG AAA TTC 192Gly Glu Phe Asn Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

290 295 300AAG AGC AAG GCC ACA CTG ACT GTA GAC AAA TCC TCC AGC ACA GCC TAC 240Lys Ser Lye Ala Thr Leu Thr Val Asp Lye Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

305 310 315ATG CAA CTC AGC AGC CTG ACA TCT GAG GAC TCT GCG GTC TAT TAC TGT 288Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys320 325 330 335GCC AGT CGG GAC TAT GAT TAC GAC GGA CGG TAC TTT GAC TAC TGG GGC 336Ala Ser Arg Asp Tyr Asp Tyr Asp Gly Arg Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly

340 345 350CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA GGT GGC GGT GGC TCG GGC GGT 384Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

355 360 365GGT GGG TCG GGT GGC GGC GGA TCT GAC ATT GAG CTC ACC CAG TCT CCA 432Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro

370 375 380GCA ATC ATG TCT GCA TCT CCA GGG GAG AAG GTC ACC ATG ACC TGC AGT 480Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser

385 390 395GCC AGC TCA AGT GTA AGT TAC ATG TAC TGG TAC CAG CAG AAA CCA GGA 528Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly400 405 410 415TCC TCC CCC AGA CTC CTG ATT TAT GAC ACA TCC AAC CTG GCT TCT GGA 576Ser Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly

420 425 430GTC CCT GTT CGC TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACC TCT TAC TCT CTC 624Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu

435 440 445ACA ATC AGC CGA ATG GAG GCT GAA GAT GCT GCC ACT TAT TAC TGC CAG 672Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln

450 455 460CAG TGG AGT AGT TAC CCA CCC ATG TAC ACG TTC GGA GGG GGG ACC AAG 720Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Pro Met Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys

465 470 475CTG GAA ATA AAA 732Leu Glu Ile Lys480(2)SEQ ID NO:20的信息

(ⅰ)序列特性：

(A)长度：244个碱基对

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白质

(ⅹⅰ)序列描述：SIQ ID NO:20:Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser His

20 25 30Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Ala Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45Gly Glu Phe Asn Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95Ala Ser Arg Asp Tyr Asp Tyr Asp Gly Arg Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro

130 135 140Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser145 150 155 160Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly

165 170 175Ser Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly

180 185 190Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu

195 200 205Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln

210 2l5 220Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Pro Met Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys225 230 235 240Leu Glu Ile Lys(2)SEQ ID NO:21的信息

(ⅰ)序列特性：

(A)长度：732个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：cDNA

(ⅲ)假设：无

(ⅳ)反义：无

(ⅴ)片段类型：N-末端

(ⅵ)原始来源：

(A)生物：小鼠

(B)品系：Balb/c

(F)组织类型：脾细胞

(ⅶ)直接来源

(B)克隆：3D3(单链FV，重链,轻键加接头)

(ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：CDS

(B)位置：1..732

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:21:GAG GTC CAA CTG CAG CAG TCA GGG GCT GAA CTG GTG AAG CCT GGG GCT 48Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala245 250 255 260TCA GTG AAG TTG TCC TGC AAG GCT TCC GGC TAC ACC TTC ACC AGC CAC 96Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser His

265 270 275TGG ATG CAC TGG GTG AAG CAG AGG GCT GGA CAA GGC CTT GAG TGG ATC 144Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Ala Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

280 285 290GGA GAG TTT AAT CCC AGC AAC GGC CGT ACT AAC TAC AAT GAG AAA ATC 192Gly Glu Phe Asn Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Ile

295 300 305AAG AGC AAG GCC ACA CTG ACT GTA GAC AAA TCC TCC AGC ACA GCC TAC 240Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

310 315 320ATG CAA CTC AGC AGC CTG ACA TCT GAG GAC TCT GCG GTC TAT TAC TGT 288Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys325 330 335 340GCC AGT CGG GAC TAT GAT TAC GAC GGA CGG TAC TTT GAC TAC TGG GGC 336Ala Ser Arg Asp Tyr Asp Tyr Asp Gly Arg Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly345 350 355CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA GGT GGC GGT GGC TCG GGC GGT 384Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

360 365 370GGT GGG TCG GGT GGCGGC GGA TCT GAC ATT GAG CTC ACC CAG TCT CCA 432Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro

375 380 385ACA ATC ATG TCT GCA TCT CCA GGG GAG AAG GTC ACC ATG ACC TGC AGT 480Thr Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser

390 395 400GAC AGC TCA AGT GTA AGT TAC ATG TAC TGG TAC CAG CAG AAG ACA GGA 528Asp Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Thr Gly405 410 415 420TCC TCC CCC AGA CTC CTG ATT TAT GAC ACA TCC AAC CTG GCT TCT GGA 576Ser Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly

425 430 435GTC CCT GTT CGC TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACC TCT TAC TCT CTC 624Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu

440 445 450ACA ATC AGC CGA ATG GAG GCT GAA GAT GCT GCC ACT TAT TAC TGC CAG 672Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln

455 460 465CAG TGG AGT AGT TAC CCA CCC ATG TAC ACG TTC GGA GGG GGG ACC AAG 720Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Pro Met Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys

470 475 480CTG GAA ATA AAA 732Leu Glu Ile Lys485(2)SEQ ID NO:22的信息

(ⅰ)序列特性：

(A)长度：244个碱基对

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白质

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:22:Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser His

20 25 30Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Ala Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45Gly Glu Phe Asn Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Ile

85 90 95Ala Ser Arg Asp Tyr Asp Tyr Asp Gly Arg Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro

130 135 140Thr Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser145 150 155 160Asp Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Thr Gly

165 170 175Ser Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly

180 185 190Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu

195 200 205Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln

210 215 220Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Pro Met Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys225 230 235 240Leu Glu Ile Lys(2)SEQ ID NO:23的信息

(ⅰ)序列特性：

(A)长度：738个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：cDNA

(ⅲ)假设：无

(ⅳ)反义：无

(ⅳ)片段类型：N-末端

(ⅵ)原始来源：

(A)生物：小鼠

(B)品系：Balb/c

(F)组织类型：脾细胞

(ⅶ)直接来源

(B)克隆：1E3(单链FV，重链，轻键加接头)

(ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：CDS

(B)位置：1..738

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:23:GAG GTG CAG CTG CAG CAG TCT GGG GCT GAA CTG GTG AAG CCT GGG GCT 48Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala245 250 255 260TCA GTG AAG TTG TGC TGC AAG GCT TCC GGC TAC ACC TTC ACC AGC CAC 96Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser His

280 285 290GGA GAG TTT AAT CCC AGC AAC GGC CGT ACT AAC TAC AAT GAG AAA TTC 192Gly Glu Phe Asn Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

295 300 305AAG AGC AAG GCC ACA CTG ACT GTA GAC AAA TCC TCC AGC ACA GCT TAC 240Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

310 315 320ATG CAA CTC AGC AGC CTG ACA TCT GAG GAC TCT GCG GTC TAT TAC TGT 288Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys325 330 335 340GCC AGT CGG GAC TAT GAT TAC GAC GGA CGG TAC TTT GAC TAC TGG GGC 336Ala Ser Arg Asp Tyr Asp Tyr Asp Gly Arg Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly

345 350 355CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA GGT GGC GGT GGC TCG GGC GGT 384Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

360 365 370GGT GGG TCG GGT GGC GGC GGA TCT GGA TCT GAC ATT GAG CTC ACC CAG 432Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln

375 380 385TCT CCA ACA ATC ATG TCT GCA TCT CCA GGG GAG AAG GTC ACC ATG ACC 480Ser Pro Thr Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr

390 395 400TGC AGT GAC AGC TCA AGT GTA AGT TAC ATG TAC TGG TAC CAG CAG AAG 528Cys Ser Asp Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys405 410 415 420CCA CCA TCC TCC CCC AGA CTC CTG ATT TAT GAC ACA TCC AAC CTG GCT 576Pro Gly Ser Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Asn Leu Ala

425 430 435TCT GGA GTC CCT GTT CGC TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACC TCT TAC 624Ser Gly Va1 Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr

440 445 450TCT CTC ACA ATC AGC CGA ATG GAG GCT GAA GAT GCT GCC ACT TAT TAC 672Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr

455 460 465TGC CAG CAG TGG AGT AGT TAC CCA CCC ATG TAC ACG TTC GGA GGG GGG 720Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Pro Met Tyr Thr Phe Gly Gly Gly

470 475 480ACC AAG CTG GAA ATA AAA 738Thr Lys Leu Glu Ile Lys485 490(2)SEQ ID NO:24的信息

(ⅰ)序列特性：

(A)长度:246个碱基对

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白质

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:24:Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser His

20 25 30Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Ala Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45Gly Glu Phe Asn Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

85 90 95Ala Ser Arg Asp Tyr Asp Tyr Asp Gly Arg Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln

130 135 140Ser Pro Thr Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr145 150 155 160Cys Ser Asp Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys

165 170 175Pro Gly Ser Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Asn Leu Ala

180 185 190Ser Gly Val Pro Val Arg phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr

195 200 205Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr

210 215 220Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Pro Met Tyr Thr Phe Gly Gly Gly225 230 235 240Thr Lys Leu Glu Ile Lys

245(2)SEQ ID NO:25的信息

(ⅰ)序列特性：

(A)长度：726个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：cDNA

(ⅲ)假设：无

(ⅳ)反义：无

(ⅴ)片段类型：N-末端

(ⅵ)原始来源：

(A)生物：小鼠

(B)品系：Balb/c

(F)组织类型：脾细胞

(ⅶ)直接来源

(B)克隆：5F1(单链FV，重链，轻键加接头)

(ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：CDS

(B)位置：1..726

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:25:CAG GTG AAA CTG CAG GAG TCT CAG GCT GAA CTG GTG AAG CCT GGG GGT 48Gln Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

250 255 260TCA GTG AAG TTG TCC TGC AAG GCT TCC GGC TAC ACC TTC ACC AGC CAC 96Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser His

265 270 275TGG ATG CAC TGG GTQ AAG CAG AGG GCT GGA CAA GGC CTT GAG TGG ATC 144Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Ala Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

280 285 290GGA GAG ATT AAT CCC AGA ACG GCG CCT ACT AAC TAC AAT GAG AAA TTC 192Gly Glu Ile Ash Pro Arg Thr Ala Pro Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe295 300 305 310AAG AGC AAG GCC ACA CTG ACT GTA GAC AAA TCC TCC AGC ACA GCC TAC 240Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

315 320 325ATG CAA CTC AGC AGC CTG ACA TCT GAG GAC TCT GCG GTC TAT TAC TGT 288Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

330 335 340GCC AGT CGG GAC TAT GAT TAC GAC GGA CGG TAC TTT GAC TAC TGG GGC 336Ala Ser Arg Asp Tyr Asp Tyr Asp Gly Arg Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly

345 350 355CAA GGG ACA ACG GTC ACC GTC TCC TCA GGT GGC GGT GGC TCG GGC GGT 384Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

360 365 370GGT GGG TCG GGT GGC GGC GGA TCT GAC ATT GAG CTC ACC CAG TCT CCA 432Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro375 380 385 390ACA ATC ATG TCT GCA TCT CCA GGG GAG AAG GTC ACC ATG ACC TGC AGT 480Thr Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser

395 400 405GAC AGC TCA AGT GTA AGT TAC ACG TAC TGG TAC CAG CAG AAG ACA GGA 528Asp Ser Ser Ser Val Ser Tyr Thr Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Thr Gly

410 415 420TCC TCC CCC AGA CTC CTG ATT TAT GAC ACA TCC AAC CTG GCT TCT GGA 576Ser Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly

440 445 450ACA ATC AGC CGA ATG GAG GCT GAA GAT GCT GCC ACT TAT TAC TGC CAG 672Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln455 460 465 470CAG TGG AGT AGT TAC CCG CTC ACG TTC GGT GCT GGG ACC AAG CTG GAA 720Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu

475 480 485ATA AAA 726Ile Lys(2)SEQ ID NO:26的信息

(ⅰ)序列特性：

(A)长度：242个碱基对

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白质

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:26:Gln Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser His

20 25 30Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Ala Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45Gly Glu Ile Asn Pro Arg Thr Ala Pro Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

85 90 95Ala Ser Arg Asp Tyr Asp Tyr Asp Gly Arg Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro130 135 140Thr Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser145 150 155 160Asp Ser Ser Ser Val Ser Tyr Thr Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Thr Gly

165 170 175Ser Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly

180 185 190Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu

195 200 205Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln

210 215 220Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu225 230 235 240Ile Lys(2)SEQ ID NO:27的信息

(ⅰ)序列特性：

(A)长度：726个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：cDNA

(ⅲ)假设：无

(ⅳ)反义：无

(ⅴ)片段类型：N-末端

(ⅳ)原始来源：

(A)生物：小鼠

(B)品系：Balb/c

(F)组织类型：脾细胞

(ⅶ)直接来源

(B)文库：7Gl(单链FV，重链，轻键加接头)

(ⅰⅹ)特征：

(A)名称/关键词：CDS

(B)位置：1..726

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:27:GAG GTC AAG CTG CAG CAG TCA GGG GCT GAA CTG GTG AAG CCT GGG GCT 48Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

245 250 255TCA GTG AAG TTG TCC TGC AAG GCT TCC GGC TAC ACC TTC ACC AGC CAC 96Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser His

260 265 270TTG GAT CAC TGG GTG AAG CAG AGG GGC TGG CAA GGC CTT GAG TGG ATC 144Leu Asp His Trp Val Lye Gln Arg Gly Trp Gln Gly Leu Glu Trp Ile275 280 285 290GGA CAG TTT AAT CCC AGC AAC GGC CGT ACT AAC TAC AAT GAG AAA TTC 192Gly Gln Phe Asn Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

310 315 320ATC GAA CTC AGC AGC CTG ACA TCT GAG GAC TGC TCG GTC TAT TAC TGT 288Ile Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Cys Ser Val Tyr Tyr Cys

325 330 335GCC AGT CGG GAC TAT GAT TAC GAC GGA CGG TAC TTT GAC TAC TGG GGC 336Ala Ser Arg Asp Tyr Asp Tyr Asp Gly Arg Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly

340 345 350CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA GGT GGC GGT GGC TCG GGC GGT 384Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly355 360 365 370GGT GGG TCG GGT GGC GGC GGA TCT GAC ATT GAG CTC ACC CAG TCT CCA 432Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro

390 395 400GAC AGC TCA AGT GTA AGT TAC ATG TAC TGG TAC CAG CAG AAG ACA GGA 528Asp Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Thr Gly

405 410 415TCC TCC CCC AGA CTT CTG ATT TAT GAC ACA TCC AAC CTG GCT TCT GGA 576Ser Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly420 425 430GTC CCT GTT CGC TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACC TCT TAC TCT CTC 624Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu435 440 445 450ACA ATC AGC CGA ATG GAG GCT GAA GAT GCT GCC ACT TAT TAC TGC CAG 672Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln

455 460 465CAG TGG AGT AGT TAC CCG CTC ACG TTC GGT GCT GGG ACC AAG CTG GAA 720Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu

470 475 480ATA AAA 726Ile Lys(2)SEQ ID NO:28的信息

(ⅰ)序列特性：

(A)长度：242个碱基对

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白质

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:28:Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Leu Ser Cys Lye Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser His

20 25 30Leu Asp His Trp Val Lys Gln Arg Gly Trp Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45Gly Gln Phe Asn Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Ile Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Cys Ser Val Tyr Tyr Cys

85 90 95Ala Ser Arg Asp Tyr Asp Tyr Asp Gly Arg Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro

165 170 175Ser Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly

180 185 190Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu

195 200 205Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln

210 215 220Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu225 230 235 240Ile Lye(2)SEQ ID NO:29的信息

(ⅰ)序列特性：

(A)长度：726个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：cDNA

(ⅲ)假设：无

(ⅳ)反义：无

(ⅴ)片段类型：N-末端

(ⅳ)原始来源：

(A)生物：小鼠

(B)品系：Balb/c

(C)生长期：成年

(F)组织类型：脾细胞

(ⅶ)直接来源

(B)克隆：11H1(单链FV，重链，轻键加接头)

(ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：CDS

(B)位置：1..726

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:29:GAG GTC AAG CTG CAG CAG TCA GGG GCT GAA CTG GTG AAG CCT GGG GCT 48Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

260 265 270TGG ATG CAC TGG GTG AAG CAG AGG GCT GGA CAA GGC TTG GAG TGG ATC 144Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Ala Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile275 280 285 290GGA GAG TTT AAT CCC AGC AAC GGC CGT ACT AAC TAC AAT GAG AAA TTC 192Gly Glu Phe Asn Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

310 315 320ATG CAA CTC AGC AGC CTG ACA TCT GAG GAC TCT GCG GTC TAT TAC TGT 288Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

375 380 385TCA ATC ATG TCT GCA TCT CCA GGG GAG AAG GTC ACC ATG ACC TGC AGT 480Ser Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lye Val Thr Met Thr Cys Ser

405 410 415TCC TCC CCC AGA CTC CTG ATT TAT GAC ACA TCC AAC CTG GCT TCT GGA 576Ser Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly

420 425 430GTC CCT GTT CGC TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACC TCT TAC TCT CTC 624Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu435 440 445 450ACA ATC AGC CGA ATG GAG GCT GAA GAT GCT GCC ACT TAT TAC TGC CAG 672Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln

455 460 465CAG TGG AGT AGT TAC CCA CAC ACG TTC GGT GCT GGG ACC AAG CTG GAA 720Gln Trp Ser Ser Tyr Pro His Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu

470 475 480ATA AAA 726Ile Lys(2)SEQ ID No:30的信息

(ⅰ)序列特性：

(A)长度：242个碱基对

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白质

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID No:30:Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser His

20 25 30Trp Met His Trp Val Lyg Gln Arg Ala Gly Gln GIy Leu Glu Trp Ile

35 40 45Gly Glu Phe Asn Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

85 90 95Ala Ser Arg Asp Tyr Asp Tyr Asp Gly Arg Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro

130 135 140Ser Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser145 150 155 160Asp Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Thr Gly

165 170 175Ser Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly

180 185 190Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu

195 200 205Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln

210 215 220Gln Trp Ser Ser Tyr Pro His Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu225 230 235 240Ile Lys(2)SEQ ID No:31的信息

(ⅰ)序列特性：

(A)长度：732个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：cDNA

(ⅲ)假设：无

(ⅳ)反义：无

(ⅴ)片段类型：N-末端

(ⅵ)原始来源：

(A)生物：小鼠

(B)品系：Balb/c

(F)组织类型：脾细胞

(ⅶ)直接来源

(B)克隆：1Al(单链FV，重链，轻键加接头)

(ⅰⅹ)特征：

(A)名称/关键词：CDS

(B)位置：1..732

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:31:GAG GTG CAG CTG CAG CAG TCT GGG GCT GAA CTG GTG AAG CCT GGG GCT 48Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

260 265 270TGG ATG CAC TGG GTG AAG CAG AGG GCT GGA CAA GGC CTT GAG TGG ATC 144Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Ala Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile275 280 285 290GGA GAG TTT AAT CCC AGC AAC GGC CGT ACT AAC TAC AAT GAG AAA TTC 192Gly Glu Phe Asn Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

375 380 385ACA ATC ATG TCT GCA TCT CCA GGG GAG AAG GTC ACC ATG ACC TGC AGT 480Thr Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lye Val Thr Met Thr Cys Ser

455 460 465CAG TGG AGT AGT TAC CCA CCC ATG TAC ACG TTC GGA GGG GGG ACA AAG 720Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Pro Met Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys

470 475 480TTG GAA ATA AAA 732Leu Glu Ile Lys

485(2)SEQ ID No:32的信息

(ⅰ)序列特性：

(A)长度:244个碱基对

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白质

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:32:Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser His

20 25 30Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Ala Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45Gly Glu Phe Asn Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

85 90 95Ala Ser Arg Asp Tyr Asp Tyr Asp Gly Arg Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro

165 170 175Ser Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly

180 185 190Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu

195 200 205Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln

210 215 220Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Pro Met Tyr Thr Phc Gly Gly Gly Thr Lys225 230 235 240Leu Glu Ile Lys

Claims

1．抗EGFR单链Fv，其可从由免疫哺乳动物细胞构建的噬茵体抗体文库中获得，其中单链Fv的可变区包含选自SEQ IDNo.4、8、12、16、18、20、22、24、26、28、30和32给出的重链氨基酸序列和选自SEQ ID No.2、6、10、14、18、20、22、24、26、28、30和32给出的轻链氨基酸序列。

2．权利要求1的抗EGFR单链Fv，其中所述文库是由免疫小鼠的细胞构建的。

3．权利要求1或2的抗EGFR单链Fv，其中所述文库是由淋巴结、脾或体外免疫细胞构建的。

4．包含具有权利要求1的重链轻链氨基酸序列的可变区和人免疫球蛋白恒定区的嵌合抗EGFR抗体。

5．权利要求4的嵌合抗EGFR抗体，其中所述恒定区由人γ-1重链恒定区和人k轻链恒定区组成。

6．编码嵌合抗EGFR抗体的DNA分子，其包含选自SEQ IDNo.1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29和31所给出序列的编码重链轻链可变区氨基酸序列的DNA序列和编码人免疫球蛋白恒定区的DNA序列。

7．一种制备嵌合抗EGFR抗体的方法，包括

(ⅰ)将编码一抗EGFR单链Fv重链和轻链可变区的DNA克隆到含编码人免疫球蛋白恒定区的基因组DNA的真核表达载体中，所述第一种DNA选自SEQ ID No.1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29和31中给出的序列；

(ⅱ)用所述载体转化真核细胞，及

(ⅲ)表达并分离所述嵌合抗体。

8．用于治疗肿瘤的药物组合物，其包含权利要求1-3任一项的抗EGFR单链Fv或权利要求4-5任一项的嵌合抗EGFR抗体。

9．用于肿瘤诊断定位或评价肿瘤生长的工具，其为权利要求1-3任一项的抗EGFR单链Fv或权利要求4-5任一项的嵌合抗EGFR抗体。