ES2892927T3 - Métodos, kits y aparatos para expandir una población de células - Google Patents

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Abstract

Un método in vitro para expandir una población de células, el método comprendiendo incubar una muestra que comprende una población de células en presencia de un reactivo de multimerización que se une reversiblemente a un primer agente y un segundo agente, en donde el primer agente se une a una molécula receptora en la superficie de células en la población, y es capaz de proporciona una señal de activación primaria a las células, y en donde el segundo agente se une a una molécula accesoria en la superficie de las células en la población, y es capaz de estimular las células, en donde el primer agente (i) comprende por lo menos un compañero de unión C1 capaz de unirse reversiblemente a un sitio de unión Z1 del reactivo de multimerización para formar una unión reversible entre el compañero de unión C1 y el sitio de unión Z1, y en donde el segundo agente (i) comprende por lo menos un compañero de unión C2 que es capaz de unirse reversiblemente a un sitio de unión Z2 del reactivo de multimerización para formar una unión reversible entre el compañero de unión C2 y el sitio de unión Z2.

Description

DESCRIPCIÓN
Métodos, kits y aparatos para expandir una población de células
REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS
La presente invención reivindica el beneficio de prioridad de la solicitud de patente provisional de Estados Unidos 61/980.506 "Methods, Kits And Apparatus For Expanding A Population Of Cells" presentada ante la Oficina de Patentes y Marcas de Estados Unidos el 16 de abril de 2014.
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a la expansión (proliferación) de una población de células como una población de linfocitos. La invención en general proporciona métodos y reactivos novedosos para la expansión (proliferación) de poblaciones de células que requieren la unión de una molécula de unión al receptor (como un primer agente como se describe en la presente) a una molécula receptora en la superficie de las células, proporcionando de este modo una señal de activación primaria a las células. También se divulga un reactivo de multimerización que ha inmovilizado sobre el mismo (unido al mismo) un primer agente que proporciona una señal de activación primaria a las células. Esta señal de activación primaria puede ser suficiente como tal para activar la expansión/proliferación de las células. Este primer agente puede unirse reversiblemente o también irreversible al reactivo de multimerización. El reactivo de multimerización puede haber inmovilizado sobre el mismo (unido al mismo) también un segundo agente que estimula una molécula accesoria en la superficie de las células. El segundo agente, cuando se une a la molécula accesoria en la superficie de las células, puede estimular de este modo la expansión de las células activadas. Además, este segundo agente puede o unirse reversiblemente o también irreversible al reactivo de multimerización. El agente de multimerización puede o inmovilizarse sobre un soporte sólido o ser soluble. En un aspecto, el método divulgado en la presente es una expansión en serie de una población de células en la que se estimula/expande una población completa de linfocitos, los reactivos necesarios para la expansión se eliminan luego por cromatografía en una fase estacionaria adecuada y las células expandidas/estimuladas se transfectan opcionalmente con, por ejemplo, un receptor de células T o un receptor de antígeno quimérico (CAR) y se somete a una segunda expansión de estimulación con una molécula estimuladora diferente que se une al receptor de células T introducido o al receptor de antígeno quimérico. La divulgación también se refiere a un aparato para la expansión de la población celular seleccionada. Stemberger et al. PLoS ONE, vol.7(4) p. e35798 (2012) divulga métodos de enriquecimiento positivos en serie que permiten la clasificación celular multiparámetro clínica. La WO 2013/011011 divulga métodos para teñir reversiblemente una célula objetivo. Knabel et al. Nature Medicine vol. 8(6) p. 631-637 (2013), WO 02/054065 y Schmitt et al. Transfusion vol. 51(3) p. 591-599 (2010) divulgan tinción de multímero de MHC reversible para el aislamiento funcional de poblaciones de células T y la transferencia adoptiva eficaz.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
El desarrollo de técnicas para propagar poblaciones de células T in vitro ha sido crucial para muchos de los avances en la comprensión del reconocimiento de células T de antígeno y activación de células T. El desarrollo de métodos de cultivo para la generación de clones de células T específicos de antígenos humanos ha sido útil para definir antígenos expresados por patógenos y tumores que son reconocidos por células T para establecer métodos de inmunoterapia para tratar una variedad de enfermedades humanas. Las células T específicas de antígeno pueden expandirse in vitro para su uso en inmunoterapia celular adoptiva o terapia contra el cáncer en la que se ha demostrado que las infusiones de tales células T tienen reactividad antitumoral en un huésped que lleva tumores. Además, la inmunoterapia adoptiva también se ha usado para tratar infecciones virales en individuos inmunodeprimidos.
En la Patente de Estados Unidos N° 6.352.694 B1 y la Patente Europea EP 0700430 B1 se describe un método para expandir células T humanas in vitro en ausencia de factor de crecimiento exógeno y células accesorias que se han establecido en años recientes. En estas patentes se divulga un método in vitro para inducir la proliferación de una población de células T. El método comprende poner en contacto una población de células T con una superficie de fase sólida que tiene inmovilizado directamente sobre ella: (a) un primer agente que proporciona una señal de activación primaria a las células T, activando de este modo las células T; y (b) un segundo agente que estimula una molécula accesoria en la superficie de las células T, estimulando de este modo las células T activadas. La unión del primer agente y el segundo agente a las células T induce a las células T a proliferar/expandirse. El primer agente preferido descrito en la Patente de Estados Unidos 6.352.694 B1 y la Patente Europea EP 0700430 B1 es un anticuerpo anti-CD3 monoclonal que se une al complejo TCR/CD3 (TCR = receptor de células T) y de este modo estimula la señal asociada al complejo TCR/CD3 en las células T. El segundo agente preferido de acuerdo con estas dos patentes es un anticuerpo monoclonal anti-CD28 que se une a la molécula accesoria CD28 que está presente en las células T. La unión de este segundo agente a la molécula accesoria CD28 proporciona el coestímulo necesario que es necesario para la expansión/proliferación de las células T activadas. Por otra parte, Dynabeads® CD3/CD28 (Invitrogen) están disponibles comercialmente para la expansión de células T. Las Dynabeads® CD3/CD28 CTS™ son perlas de poliestireno no pirogénicas, estériles, superparamagnéticas de 4,5 pm, uniformes recubiertas con una mezcla de anticuerpos monoclonales purificados por afinidad contra las moléculas de la superficie celular CD3 y CD28 en células T humanas.
Sin embargo, tales perlas magnéticas son, por ejemplo, difíciles de integrar en un método para expandir células en las condiciones requeridas para ensayos clínicos o con propósitos terapéuticos, ya que hay que asegurarse que estas perlas magnéticas se eliminen por completo antes de administrar las células T expandidas a un paciente. Por tanto, la presente invención se dirige a proporcionar un método alternativo para expandir poblaciones de células como células T reguladoras o células T de memoria central para propósitos de investigación, diagnóstico y especialmente terapéuticos. Idealmente, este nuevo método también debería ser compatible con la integración en un proceso automatizado que pueda usarse para una expansión rápida y fácil de la población de células deseada para aplicaciones terapéuticas.
Este objeto se resuelve mediante el objeto de las reivindicaciones independientes, entre otros, los métodos, kits, disposiciones y aparatos que se enumeran en las reivindicaciones independientes.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
La invención proporciona un método in vitro para expandir una población de células, el método comprendiendo incubar una muestra que comprende una población de células en presencia de un reactivo de multimerización que se une reversiblemente a un primer agente y un segundo agente, en donde el primer agente se une a una molécula receptora en la superficie de células en la población, y es capaz de proporciona una señal de activación primaria a las células, y
en donde el segundo agente se une a una molécula accesoria en la superficie de las células en la población, y es capaz de estimular las células,
en donde el primer agente (i) comprende por lo menos un compañero de unión C1 capaz de unirse reversiblemente a un sitio de unión Z1 del reactivo de multimerización para formar una unión reversible entre el compañero de unión C1 y el sitio de unión Z1, y
en donde el segundo agente (i) comprende por lo menos un compañero de unión C2 que es capaz de unirse reversiblemente a un sitio de unión Z2 del reactivo de multimerización para formar una unión reversible entre el compañero de unión C2 y el sitio de unión Z2.
Las realizaciones de la invención se describen en algunos de los casos siguientes.
La presente divulgación describe métodos, kits, disposiciones y aparatos para la expansión in vitro de una población celular deseada, que tiene una molécula receptora en su superficie que puede proporcionar tras la unión de un agente adecuado una señal de activación primaria a la población de células y activar de este modo la población de células para su expansión (proliferación). Por tanto, los métodos de la divulgación también se usan para inducir la proliferación de una población de células.
De acuerdo con un primer aspecto, la divulgación describe un método in vitro para expandir una población de células, que comprende poner en contacto una muestra que comprende la población de células con un reactivo de multimerización,
en donde el reactivo de multimerización comprende por lo menos un sitio de unión Z1 para la unión reversible del primer agente,
en donde el primer agente comprende por lo menos un compañero de unión C1, en donde el compañero de unión C1 es capaz de unirse reversiblemente al sitio de unión Z1 del reactivo de multimerización, en donde el primer agente se une al reactivo de multimerización mediante la unión reversible formada entre el compañero de unión C1 y el sitio de unión Z1, y
en donde el primer agente se une a una molécula receptora en la superficie de las células, proporcionando de este modo una señal de activación primaria a las células y activando de este modo las células.
De acuerdo con un segundo aspecto la divulgación describe un método in vitro parra expandir una población de células que comprende poner en contacto una muestra que comprende la población de células con un reactivo de multimerización,
en donde el reactivo de multimerización está en una forma soluble y tiene inmovilizado sobre el mismo (unido al mismo) un primer agente que proporciona una señal de activación primaria a las células;
en donde el reactivo de multimerización comprende por lo menos un sitio de unión Z1 para la unión del primer agente,
en donde el primer agente comprende por lo menos un compañero de unión C1, en donde el compañero de unión C1 es capaz de unirse al sitio de unión Z1 del reactivo de multimerización, en donde el primer agente se une al reactivo de multimerización a través del enlace formado entre el compañero de unión C1 y el sitio de unión Z1, y en donde el primer agente se une a una molécula receptora en la superficie de las células, proporcionando de este modo una señal de activación primaria a las células y activando de este modo las células.
De acuerdo con un tercer aspecto, la divulgación divulga un kit de reactivos para expandir una población de células, el kit comprendiendo
(i) un reactivo de multimerización,
en donde el reactivo de multimerización comprende por lo menos un sitio de unión Z para la unión reversible de un primer agente,
(ii) un primer agente que se une a una molécula receptora en la superficie de las células, proporcionando de este modo una señal de activación primaria a las células y activando de este modo las células,
en donde el primer agente comprende por lo menos un compañero de unión C1, en donde el compañero de unión C1 es capaz de unirse reversiblemente a un sitio de unión Z1 del reactivo de multimerización, en donde el primer agente se une al reactivo de multimerización a través de la unión reversible formada entre el compañero de unión C1 y el sitio de unión Z1, y
(iii) un segundo agente que estimula una molécula accesoria en la superficie de las células,
en donde el segundo agente comprende un compañero de unión C2, en donde el compañero de unión C2 es capaz de unirse reversiblemente a un sitio de unión Z2 del reactivo de multimerización, en donde el segundo agente se une al reactivo de multimerización a través del enlace formado entre el compañero de unión C2 y el sitio de unión Z2,
en donde el segundo agente se une a la molécula accesoria en la superficie de la superficie de las células, estimulando de este modo las células activadas.
De acuerdo con un cuarto aspecto, la divulgación divulga un kit de reactivos para expandir una población de células, el kit comprendiendo
(i) un reactivo de multimerización,
en donde el reactivo de multimerización está en forma soluble y comprende por lo menos un sitio de unión Z para la unión reversible de un primer agente,
(ii) un primer agente que se une a una molécula receptora en la superficie de las células, proporcionando de este modo una señal de activación primaria a las células y activando de este modo las células,
en donde el primer agente comprende por lo menos un compañero de unión C1, en donde el compañero de unión C1 es capaz de unirse a un sitio de unión Z1 del reactivo de multimerización, en donde el primer agente se une al reactivo de multimerización a través de la unión reversible formada entre el compañero de unión C1 y el sitio de unión Z1.
De acuerdo con un quinto aspecto, la divulgación proporciona un método in vitro para expandir en serie una población de linfocitos, en donde la población de linfocitos comprende células T, el método comprendiendo poner en contacto una muestra que comprende las células T que comprende la población de linfocitos con un reactivo de multimerización,
en donde el reactivo de multimerización está en forma soluble y se ha inmovilizado reversiblemente sobre el mismo (i) un primer agente que proporciona una señal de activación primaria a las células T y (ii) un segundo agente que estimula una molécula accesoria en la superficie de las células T,
en donde el reactivo de multimerización comprende por lo menos un sitio de unión Z1 para la unión reversible del primer agente,
en donde el primer agente comprende por lo menos un compañero de unión C1, en donde el compañero de unión C1 es capaz de unirse reversiblemente al sitio de unión Z1 del reactivo de multimerización, en donde el primer agente se une al reactivo de multimerización a través de la unión reversible formada entre el compañero de unión C1 y el sitio de unión Z1,
en donde el reactivo de multimerización comprende por lo menos un sitio de unión Z2 para la unión reversible del segundo agente,
en donde el segundo agente comprende por lo menos un compañero de unión C2, en donde el compañero de unión C2 es capaz de unirse reversiblemente al sitio de unión Z2 del reactivo de multimerización, en donde el primer agente se une al reactivo de multimerización a través de la unión reversible formada entre el compañero de unión C2 y el sitio de unión Z2,
en donde el primer agente se une a una molécula receptora en la superficie de las células T, proporcionando de este modo una señal de activación primaria a las células y activando de este modo las células T,
en donde el segundo agente se une a la molécula accesoria en la superficie de las células T, estimulando de este modo las células activadas, el primer agente y el segundo agente inducen juntos de este modo la expansión de las células T.
De acuerdo con un sexto aspecto, la divulgación divulga una disposición de un biorreactor y una fase estacionaria para cromatografía,
en donde el biorreactor es adecuado para la expansión de las células,
en donde la fase estacionaria es adecuada para la separación celular y la eliminación de reactivos, la fase estacionaria siendo una matriz de filtración en gel y/o una matriz de cromatografía de afinidad, en donde la matriz de filtración en gel y/o la cromatografía de afinidad comprende un reactivo de afinidad, en donde el reactivo de afinidad comprende un sitio de unión Z1 que se une específicamente a un compañero de unión C1 comprendido en un primer agente y/o el reactivo de afinidad comprende un sitio de unión Z2 que se une específicamente a un compañero de unión C2 comprendido en un segundo agente, por lo que es adecuado para inmovilizar en la fase estacionaria el primer agente y/o el segundo agente, el primer compañero de unión C1 y/o el segundo compañero de unión libre C2, en donde el biorreactor y la fase estacionaria están conectados de manera fluida.
De acuerdo con un séptimo aspecto, la divulgación divulga un aparato para la purificación y expansión de una población de células, el aparato comprendiendo por lo menos una disposición de un biorreactor y una fase estacionaria para cromatografía de acuerdo con el sexto aspecto.
De acuerdo con un octavo aspecto, la divulgación divulga un reactivo de multimerización capaz de expandir una población de células,
en donde el reactivo de multimerización está en forma soluble y comprende por lo menos un sitio de unión Z1 para la unión reversible de un primer agente que proporciona una señal de activación primaria a las células,
en donde el reactivo de multimerización ha inmovilizado reversiblemente sobre el mismo (unido al mismo) dicho primer agente que proporciona una señal de activación primaria a las células;
en donde el primer agente comprende por lo menos un compañero de unión C1, en donde el compañero de unión C1 es capaz de unirse reversiblemente al por lo menos un sitio de unión Z1 del reactivo de multimerización, en donde el primer agente se une al reactivo de multimerización a través de la unión reversible formada entre el compañero de unión C1 y el sitio de unión Z1,
De acuerdo con un noveno aspecto, la divulgación describe una composición capaz de expandir una población de células, la composición comprendiendo
(1) un primer reactivo de multimerización,
en donde el primer reactivo de multimerización está en forma soluble y comprende por lo menos un sitio de unión Z1 para la unión reversible de un primer agente que proporciona una señal de activación primaria a las células, en donde el primer reactivo de multimerización ha inmovilizado reversiblemente sobre el mismo (unido al mismo) dicho primer agente que proporciona una señal de activación primaria a las células;
en donde el primer agente comprende por lo menos un compañero de unión C1, en donde el compañero de unión C1 es capaz de unirse reversiblemente al por lo menos un sitio de unión Z1 del reactivo de multimerización, en donde el primer agente se une al reactivo de multimerización a través de la unión reversible formada entre el compañero de unión C1 y el sitio de unión Z1, y
(ii) un segundo reactivo de multimerización,
en donde el segundo reactivo de multimerización está en forma soluble y comprende por lo menos un sitio de unión Z2 para la unión reversible de un segundo agente que estimula una molécula accesoria en la superficie de las células,
en donde el reactivo de multimerización ha inmovilizado reversiblemente sobre el mismo (unido al mismo) dicho segundo agente que estimula una molécula accesoria en la superficie de las células,
en donde el segundo agente comprende un compañero de unión C2, en donde el compañero de unión C2 es capaz de unirse al por lo menos un sitio de unión Z2 del reactivo de multimerización, en donde el segundo agente se une al reactivo de multimerización a través del enlace formado entre el compañero de unión C2 y el sitio de unión Z2.
DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La divulgación se entenderá mejor con referencia a la descripción detallada cuando se considere junto con los ejemplos no limitativos y los dibujos acompañantes. Las figuras ilustran casos de métodos de la divulgación. Sin querer estar limitados por la teoría, las figuras incluyen conclusiones con respecto al mecanismo de expansión subyacente. Las conclusiones se dan sólo con propósitos ilustrativos y sirven simplemente para permitir una visualización del método de expansión que puede lograrse a nivel molecular.
La Figura 1 representa un caso de un método in vitro para expandir una población de células que tiene un receptor de superficie celular cuya unión mediante un primer agente puede proporcionar una señal de activación para que las células se expandan.
Como se muestra en la Fig. 1a una muestra que comprende la población de células (2) que portan una molécula receptora de superficie (30) se pone en contacto con un reactivo de multimerización (4). La población de células (2) está mezclada con otras poblaciones de células (22) que carecen de la molécula receptora de superficie (30). El reactivo de multimerización (4) ha inmovilizado reversiblemente sobre el mismo (unido al mismo) un primer agente (6) que proporciona una señal de activación primaria a las células. El reactivo de multimerización (4) comprende por lo menos un sitio de unión Z1 (42) para la unión reversible del primer agente (6) y el primer agente (6) comprende por lo menos un compañero de unión C1 (6a), en donde el compañero de unión C1 (6a) es capaz de unirse reversiblemente al sitio de unión Z1 (44) del reactivo de multimerización. Por tanto, para la inmovilización, el primer agente (6) está unido al reactivo de multimerización (4) a través de la unión reversible formada entre el compañero de unión C1 (6a) y el sitio de unión Z1 (42). En el ejemplo mostrado en la Fig. 1 el reactivo de multimerización (4) tiene un segundo sitio de unión Z2 (44) que no se usa en este ejemplo. El reactivo de multimerización (4) está inmovilizado él mismo sobre un soporte sólido (10) como una perla magnética, una perla polimérica de una superficie de una placa o reactor de cultivo celular. La población de células (2) puede ser, por ejemplo, una población de células de linfocitos como una población de células B que pueden activarse a través del receptor CD40 (ver, por ejemplo, Carpenter et al, Journal of Translational Medicine 2009, 7:93 "Activation of human B cells by the agonist CD40 antibody CP-870,893 and augmentation with simultaneous tolllike receptor 9 stimulation). En este caso, la molécula de la superficie celular (30) es CD40 y el primer reactivo (6) puede ser cualquier molécula de unión a CD40 que proporcione la señal de activación deseada, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal CP-870,893 o un fragmento de unión de anticuerpo del mismo como un fragmento Fab monovalente. El compañero de unión C1 del primer agente (6) puede ser, por ejemplo, cualquier péptido de afinidad que esté fusionado o conjugado con, por ejemplo, el extremo C-terminal de una de las dos cadenas polipeptídicas (cadena pesada o ligera) de la molécula de anticuerpo. El compañero de unión C1 (6a) puede ser, por ejemplo, un péptido de unión a estreptavidina como el péptido Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 01), también conocido como "Strep-tag®") que se describe en la Patente de Estados Unidos 5.506.121, por ejemplo, o péptidos de unión a estreptavidina que tienen una disposición secuencial de dos o más módulos de unión individuales como se describe en la Publicación de Patente Internacional WO 02/077018 o la Patente de Estados Unidos 7.981.632. Cuando se usa un péptido de unión a estreptavidina como compañero de unión C1, el reactivo de multimerización (4) será cualquier muteína de estreptavidina a la que se una reversiblemente el péptido de estreptavidina (= primer compañero de unión C1 (6a)) a través de sus sitios de unión (biotina) Z1 (42) mostrado esquemáticamente en la Fig. 1. Dicho reactivo de multimerización puede ser una muteína de estreptavidina (analógico) que comprende la secuencia de aminoácidos Val44-Thr45-Ala46-Arg47 (SEQ ID NO: 02) en las posiciones de secuencia 44 a 47 de estreptavidina de tipo salvaje o una muteína de estreptavidina (análogo) que comprende la secuencia de aminoácidos Ile44-Gly45-Ala46-Arg47 (SEQ ID NO: 03) en las posiciones de secuencia 44 a 47 de estreptavidina de tipo salvaje, ambas descritas en la Patente de Estados Unidos 6.103.493, por ejemplo, y están comercialmente disponibles con la marca comercial Strep-Tactin®. En el ejemplo de la Fig. 1, el reactivo de multimerización (4) podría incluir además calmodulina multimérica o glutatión-S-transferasa, ambas de las cuales forman uniones reversibles con péptidos de unión a calmodulina o glutatión. Por tanto, el sitio de unión Z2 (44) puede estar formado por calmodulina o glutatión-S-transferasa. Un conjugado de proteína de este tipo de, por ejemplo, calmodulina con una muteína de estreptavidina puede elaborarse mediante química de proteínas estándar, por ejemplo, usando conectores bifuncionales.
Como se muestra en la Fig. 1b, después de poner en contacto la población de células (2) con el reactivo de multimerización (4) y habitualmente de incubar la población de células con el reactivo de multimerización (4), la población de células (2) forma complejos/se une al agente de multimerización a través del primer agente (6). El primer agente se une específicamente a la molécula receptora de la superficie celular como CD40 en este Ejemplo y proporciona la señal de activación para la expansión celular, por ejemplo, de células B. Las otras poblaciones de células (22) contenidas en la muestra inicial que carecen de la molécula de superficie celular específica (30) no se unen al reactivo de multimerización. A este respecto, se observa que la población de células (2) habitualmente tiene múltiples copias de la molécula de la superficie celular (30) en su superficie y la unión de estas múltiples copias es típicamente necesaria para la activación. Por tanto, el agente de multimerización (4) proporciona típicamente más de un sitio de unión Z1 de tal manera que múltiples primeros agentes (6) pueden unirse reversiblemente para lograr la "multimerización" del primer agente, lo que significa presentar el primer agente en una densidad suficiente para la población de células (2) (no se muestra en el esquema de la Fig. 1). A este respecto, se observa que un agente de multimerización como se usa en la presente puede tener como tal múltiples sitios de unión Z1, por ejemplo, una muteína de estreptavidina (que es un homo-tetrámero) en su estado nativo tiene cuatro de tales sitios de unión Z1. Sin embargo, también es posible que el reactivo de multimerización se base en un compuesto que tiene como tal sólo un sitio de unión Z1 para la unión reversible de un compañero de unión C1. Un ejemplo de este tipo es la calmodulina multimérica. La calcodulina como tal tiene un solo sitio de unión para los péptidos de unión a la calmodulina. Sin embargo, la calmodulina puede biotinilarse y luego hacerse reaccionar con oligómeros de estreptavidina (ver también a continuación), proporcionando de este modo un reactivo de multimerización en el que múltiples moléculas de calmodulina se presentan en alta densidad en un "andamiaje", proporcionando de este modo calmodulina multimérica.
Como se muestra en la Fig. 1c, después de la incubación (que habitualmente se lleva a cabo durante un período de tiempo adecuado para lograr la expansión de la población de células deseada), la unión entre el compañero de unión C1 (6a) del primer agente (6) y el sitio de unión Z1 del reactivo multimerización (4) se interrumpe interrumpiendo la unión reversible respectiva. La interrupción puede lograrse añadiendo un competidor a la mezcla de incubación/reacción que contiene la población de células (2) que se unen al reactivo de multimerización. Para la interrupción competitiva (que puede entenderse como una elución competitiva) de la unión reversible entre el compañero de unión C1 (6a) del primer agente y el sitio de unión Z1 (22) del reactivo de multimerización, la mezcla de incubación/población de células puede ponerse en contacto con un primer compañero de unión libre C1 (20) o un análogo de dicho primer compañero de unión C que sea capaz de interrumpir la unión entre el primer compañero de unión C1 (6a) y el sitio de unión Z1 (22). En el ejemplo del compañero de unión C1 que es un péptido de unión de estreptavidina que se une al sitio de unión de biotina de la estreptavidina, el primer compañero libre C1 (20) puede ser el péptido de unión a estreptavidina libre correspondiente o un análogo que se une competitivamente. Tal análogo puede ser, por ejemplo, biotina o un derivado de biotina como destiobiotina.
Como se muestra en la Fig. 1d, la adición del primer compañero libre (20) o el análogo del mismo da como resultado el desplazamiento del compañero de unión C1 (6a) del reactivo de multimerización (4) y, por tanto, como el compañero de unión C1 está comprendido en el primer agente (6), desplazamiento del primer agente (6) del reactivo de multimerización (4). Este desplazamiento del primer agente (6) a su vez da como resultado una disociación del primer agente (6) del receptor de superficie celular (30), en particular si la afinidad de unión del enlace entre el primer agente y el receptor de superficie celular (30) tiene una constante de disociación (Kd) en el intervalo de 10-2 M a 10-13 M y, por tanto, también es reversible. Debido a esta disociación, también se termina la estimulación de la población celular (2). Por tanto, la presente invención proporciona la ventaja de que el período de tiempo de estimulación o expansión de la población celular puede controlarse exactamente y, por tanto, también puede controlarse estrechamente el estado funcional de la población celular. En este contexto, se observa que la afinidad de unión de las moléculas de anticuerpo hacia su antígeno, incluyendo por ejemplo, una molécula receptora de la superficie celular como CD40 en este Ejemplo, habitualmente se encuentra en el intervalo de afinidad de la Kd de 10-7 M a 10-13M. Por tanto, en la presente invención pueden usarse anticuerpos monoclonales convencionales como primer agente (y también, por supuesto, segundo agente como se explica a continuación). Para evitar cualquier efecto de avidez no deseado que lleve a una unión más fuerte, también pueden usarse anticuerpos monoclonales en forma de sus fragmentos de anticuerpos monovalentes, como fragmentos Fab o fragmentos Fv de cadena sencilla.
Además, debido a la disociación del primer agente de la molécula de superficie celular (30), la presente invención tiene la ventaja adicional de que la población de células estimuladas está libre de agentes estimuladores al final del período de estimulación y que todos los demás reactivos usados en el método, concretamente el primer agente (6) así como el primer compañero libre (20) del compañero de unión C1 o el análogo del mismo pueden eliminarse fácilmente de la población de células estimuladas (2) mediante un "cartucho de extracción" descrito en la Solicitud de patente internacional WO 2013/124474 mientras que el reactivo de multimerización (4) que se inmoviliza sobre un soporte sólido, como la superficie de un biorreactor o una perla magnética, se retiene. Por tanto, revirtiendo la eliminación del agente libre (6) y el primer compañero libre (20), de acuerdo con la descripción del "cartucho de extracción" en la WO 2013/124474 (ver con referencia a la Fig. 4 del mismo, por ejemplo), la muestra de elución obtenida en la Fig. 1d aquí puede cargarse en la segunda columna de cromatografía de la WO 2013/124474. Esta columna de cromatografía tiene una fase estacionaria adecuada que es tanto una matriz de cromatografía de afinidad y, al mismo tiempo, puede actuar como matriz de permeación en gel. Esta matriz de cromatografía de afinidad tiene un reactivo de afinidad inmovilizado sobre ella. El reactivo de afinidad puede, en el caso del ejemplo actual, por ejemplo, ser estreptavidina, una muteína de estreptavidina, avidina, una muteína de avidina o una mezcla de las mismas. El primer agente (6), el primer compañero libre (20) del compañero de unión C1 (que también se denomina "reactivo de competición" en la presente) se une al reactivo de afinidad, quedando inmovilizado de este modo en la matriz cromatográfica. Como resultado, la muestra de elución que contiene la población de células aislada y expandida (2) se está reduciendo del primer agente (6) y el reactivo de competición (20). La población de células expandida (2), al estar libre de cualquier reactivo, está ahora en condiciones de uso adicional, por ejemplo, para aplicaciones de diagnóstico (por ejemplo, clasificación FACS ™ adicional) o para cualquier aplicación terapéutica basada en células.
La Fig. 2 muestra un caso adicional de un método de expansión de la divulgación. Como se muestra en la Fig. 2a una muestra comprende una población de células (2) que llevan dos moléculas específicas de la superficie celular (30) y (32). La molécula de la superficie celular (30) está implicada en una señal de activación primaria para la población celular, mientras que la molécula de la superficie celular (32) es una molécula accesoria en la superficie celular que está implicada en proporcionar un estímulo a las células. La población de células puede ser, por ejemplo, una población de células T en la que la molécula de la superficie celular (30) es un complejo TCR/CD3 y la molécula de la superficie celular (32) es la molécula accesoria CD28. La unión tanto del complejo TCR/CD3 como la señal de activación primaria como de CD28 como coestimulador es necesaria para la expansión/proliferación de las células T. La población de células T (2) está mezclada con otras poblaciones de células (22) que carecen de las moléculas receptoras de superficie (30) y (32). También en este caso, la población de células (2) se pone en contacto con un reactivo de multimerización (4). El reactivo de multimerización (4) ha inmovilizado reversiblemente sobre el mismo (unido al mismo) un primer agente (6) que proporciona una señal de activación primaria a las células. Además, el agente de multimerización ha inmovilizado reversiblemente sobre el mismo (unido al mismo) un segundo agente (8) que estimula el CD28 como molécula accesoria en la superficie de las células.
El reactivo de multimerización (4) comprende por lo menos un sitio de unión Z1 (42) para la unión reversible del primer agente (6) y el primer agente (6) comprende por lo menos un compañero de unión C1 (6a), en donde el compañero de unión C1 (6a) es capaz de unirse reversiblemente al sitio de unión Z1 (44) del reactivo de multimerización. Por tanto, para la inmovilización, el primer agente (6) se une al reactivo de multimerización (4) a través de la unión reversible formada entre el compañero de unión C1 (6a) y el sitio de unión Z1 (42). Además, en el ejemplo ilustrado en la Fig. 2, el segundo agente (8) comprende un compañero de unión C2 (8a), en donde el compañero de unión C2 es capaz de unirse reversiblemente a un sitio de unión Z2 (44) del reactivo de multimerización (4). El segundo agente (8) se une al reactivo de multimerización (4) a través de la unión reversible formada entre el compañero de unión C2 (8a) y el sitio de unión Z2 (44). En este ejemplo, el primer agente (6) podría ser un anticuerpo anti-CD3 monoclonal o un fragmento de unión a antígeno del mismo como un fragmento Fab. El segundo agente (8) podría ser un anticuerpo anti-CD28 monoclonal o un fragmento de unión a antígeno del mismo como un fragmento Fab. El primer compañero de unión (6a) podría ser un péptido de unión a estreptavidina (6a) que está fusionado o conjugado con el anticuerpo anti-CD3 o el fragmento de anticuerpo anti-CD3. El segundo compañero de unión (8a) podría ser un péptido de unión a calmodulina que también está conjugado o fusionado al anticuerpo de CD28 o al fragmento de anticuerpo de unión a CD28. En este contexto, se observa que los anticuerpos monoclonales contra, por ejemplo, CD3 o CD28 son bien conocidos (ver, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos 6.352.694 B o la Patente Europea EP 0 700 430 B1 analizadas anteriormente) y están disponibles comercialmente. de numerosos proveedores como Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, Ca , USA), Life Technologies, (Carlsbad, CA, USA), BD Biosciences (San Jose, CA, USA), Biolegend (San Diego, CA, USA) o Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Alemania), por nombrar unos pocos. Por consiguiente, tales anticuerpos monoclonales pueden usarse como primer y segundo agente y pueden, por ejemplo, acoplarse (conjugarse) químicamente con un compañero de unión C1 o C2. Alternativamente, también es posible o clonar los genes de los dominios variables de la línea celular de hidridoma o usar un anticuerpo cuya secuencia de aminoácidos sea conocida y producir un fragmento de anticuerpo respectivo como un fragmento Fab o un Fv de manera recombinante. Cuando se usa un enfoque como el que se describe en la presente en la sección de Ejemplos tanto para la línea celular de hibridoma OKT3 (ATCC® CRL-8001®, descrita en la Patente de Estados Unidos 4.361.549) que produce un anticuerpo monoclonal anti-CD3) como para el anti-CD28 anticuerpo 28.3 descrito por Vanhove et al, BLOOD, 15 de julio de 2003, vol. 102, N° 2, páginas 564-570 y número de registro de GenBank AF451974.1, los compañeros de unión C1 y C2 se proporcionan convenientemente por el vector de expresión respectivo usado para la producción recombinante de tal manera que el fragmento de anticuerpo porta el compañero de unión C1 o C2 como un péptido de fusión como el extremo C-terminal de cualquiera de la cadena ligera o pesada (En este contexto, se muestran con propósitos de ilustración la secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena pesada y del dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo OKT3 que se describen en Arakawa et al J. Biochem. 120, 657-662 (1996) como las SEQ ID NO: 17 y 18 y en el Listado de Secuencias acompañante, mientras que la secuencia de aminoácidos del dominio variable del anticuerpo anti-CD2828.3 descrito en Vanhove et al, más arriba, se muestra como las SEQ ID NO 19 (VH) y 20 (VL) en los Listados de Secuencias acompañantes). También esta metodología de clonar los dominios variables de una molécula de anticuerpo y producir recombinantemente un fragmento de anticuerpo respectivo es bien conocida por los expertos en la técnica, ver por ejemplo Skerra, A. (1994) A general vector, pASK84, for cloning, bacterial production, and single-step purification of antibody Fab fragments. Gene 141, 79­ 84, or Skerra, A. (1993) Bacterial expression of immunoglobulin fragments. Curr Opin Immunol. 5, 256-562). Finalmente también es posible generar moléculas de anticuerpos de moléculas de unión artificiales con propiedades similares a anticuerpo contra un objetivo dado como CD3 o CD28 como en el Ejemplo de la Fig. 2 mediante métodos evolutivos bien conocidos como presentación de fagos (revisado, por ejemplo, en Kay, B.K. et al. (1996) Phage Display of Peptides and Proteins - A Laboratory Manual, 1a Ed., Academic Press, New York NY; Lowman, H.B. (1997) Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26, 401-424, o Rodi, D.J., y Makowski, L. (1999) Curr. Opin. Biotechnol. 10, 87-93), presentación de ribosomas (revisado en Amstutz, P. et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12, 400-405) o presentación de ARNm como se informa en Wilson, D.S. et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 3750-3755.
En el caso del ejemplo mostrado en la Fig. 2, el reactivo de multimerización (4) tiene dos sitios de unión diferentes Z1 (42) y Z2 (44). Siendo el compañero de unión C1 (6a) un péptido de unión a estreptavidina, el sitio de unión Z1 (42) del reactivo de multimerización (4) es proporcionado por una muteína de estreptavidina adecuada a la que se une reversiblemente el péptido de estreptavidina (6a). Como el C2 de unión es un péptido de unión a calmodulina, el sitio de unión Z2 (44) del reactivo de multimerización (4) es proporcionado por la calmodulina multimérica. El reactivo de multimerización (4) puede ser una molécula individual, por ejemplo un conjugado de calmodulina multimérica con estreptavidina (esta alternativa se usaría habitualmente en caso de multimerización soluble) o también puede consistir de dos moléculas independientes. Cuando el reactivo de multimerización (44) está inmovilizado sobre un soporte sólido como se muestra en la Fig. 2 se prefiere la última opción. En este caso, puede recubrirse (inmovilizarse) una mezcla de una muteína de estreptavidina y calmodulina sobre el soporte sólido, por ejemplo, en una relación molar 1:1 con respecto a los sitios de unión Z1 y Z2. En este contexto, se observa que, debido a la inmovilización de calmodulina sobre la superficie del soporte sólido, no es necesario preparar calmodulina multimérica como se ha explicado anteriormente, pero la inmovilización de la calmodulina sobre la superficie es suficiente para presentar calmodulina (que, como se ha mencionado anteriormente, tiene un solo sitio de unión para los péptidos de unión a calmodulina, en una densidad lo suficientemente alta para asegurar la unión de la población celular (2). Por ejemplo, en este caso, podría usarse como segundo reactivo (8) un fragmento de anticuerpo bivalente que tiene dos sitios de unión contra CD28 o un anticuerpo intacto que tiene per se dos sitios de unión idénticos.
Como se muestra en la Fig. 2b, después de poner en contacto la población de células T (2) con el reactivo de multimerización (4) y habitualmente de incubar la población de células con el reactivo de multimerización (4), la población de células T (2) forma complejos/se une al agente de multimerización a través del primer agente (6) y segundo agente (8). El primer agente (6) y el segundo agente (8) se unen específicamente al complejo TCR/CD3 y la molécula accesoria CD28, induciendo de este modo la proliferación/expansión de las células T.
Como se muestra en la Fig. 2c, después de la incubación (que se lleva a cabo habitualmente durante un período de tiempo adecuado para lograr la expansión de la población celular deseada) la unión entre el compañero de unión C1 (6a) del primer agente (6) y el sitio de unión de Z1 de la multimerización el reactivo (4) se interrumpe interrumpiendo la unión reversible respectiva. De igual manera, la unión entre el compañero de unión C2 (8a) del segundo agente (8) y el sitio de unión Z2 del reactivo de multimerización (4) se interrumpe interrumpiendo la respectiva unión reversible. La unión reversible entre el compañero de unión C1 (6a) del primer agente (6) y el sitio de unión Z1 puede interrumpirse por biotina (que actúa como un análogo (20) del primer compañero libre) mientras que la unión reversible entre el compañero de unión C2 (8a) del primer agente (8) y el sitio de unión Z2 puede interrumpirse mediante la adición de un quelante de metales (quelante de calcio) como EDTA o EGTA (que actúa como un análogo (20) del segundo compañero libre) ya que la unión de calmodulina a péptidos de unión a calmodulina es el ion calcio (Ca2+) dependiente). Por supuesto, esto significa que el contacto de la población celular (2) se lleva a cabo en un tampón que contiene Ca2+.
Como se muestra en la Fig. 2d, la adición del análogo (20) del primer compañero libre y el segundo compañero libre, respectivamente, da como resultado el desplazamiento de los compañeros de unión C1 (6a) y C2 (8a) del reactivo de multimerización (4) y, por lo tanto, el desplazamiento del primer agente (6) y el segundo agente (8) del reactivo de multimerización (4). Este desplazamiento del primer agente (6) y el segundo agente (8) a su vez da como resultado una disociación del primer agente (6) y el segundo agente (8) del complejo TCR/CD3 y la molécula accesoria CD28, terminando de este modo la estimulación/expansión de la población celular (2). Por tanto, como se ha mencionado anteriormente, la presente invención proporciona la ventaja de que el período de tiempo de estimulación o expansión de una población de células T puede controlarse exactamente y, por lo tanto, también puede controlarse estrechamente el estado funcional de la población de células T. Después de la elución de las células como se ilustra en la Fig. 1d, el primer agente (6), el segundo reactivo (8) así como el análogo (20) del primer compañero libre del compañero de unión C1 y el segundo compañero libre del compañero de unión C2 pueden eliminarse fácilmente de la población de células estimulada (2) a través de un "cartucho de extracción" descrito en la solicitud de patente internacional WO 2013/124474. Además, y lo que es más importante, en caso de que la muestra inicial fuera una población de linfocitos, por ejemplo, en forma de PMBC obtenidas de un gradiente de Ficoll, la población de células T (2) ahora está disponible para la expansión en serie como se define aquí. Como la población de células expandida (por ejemplo, mediante una estimulación inicial a través de CD3/CD28) puede transfectarse durante la expansión, por ejemplo, con un receptor de células T (TCR) o un receptor de antígeno quimérico (CAR, también conocido como receptor de células T artificial), las células modificadas genéticamente pueden luego liberarse del estímulo inicial y posteriormente estimularse con un segundo tipo de estímulo, por ejemplo, a través del receptor introducido de novo. Estos segundos estímulos pueden comprender un estímulo antigénico en forma de péptido/molécula MHC, el ligando cognado (reticulación) del receptor introducido genéticamente (por ejemplo, ligando natural de un CAR) o cualquier ligando (como un anticuerpo) que se una directamente dentro del marco del nuevo receptor (por ejemplo, reconociendo regiones constantes dentro del receptor). Por tanto, la población de células T obtenida de esta expansión en serie puede usarse para transferencia celular adoptiva.
La Fig. 3 muestra un caso adicional de un método de expansión de la divulgación. Además, la muestra usada en este ejemplo comprende una población de células T (2) que llevan dos moléculas específicas de la superficie celular (30) y (32), siendo la molécula de la superficie celular (30) un complejo TCR/CD3 y la molécula de la superficie celular (32) siendo la molécula accesoria CD28. En la Fig. 3a la población de células T (2) se muestra después de haberse puesto en contacto con un reactivo de multimerización (4). También en este Ejemplo, el reactivo de multimerización (4) tiene inmovilizado reversiblemente sobre el mismo (unido al mismo) como primer agente (6) un anticuerpo anti-CD3 o un fragmento de unión a antígeno del mismo que proporciona una señal de activación primaria a las células T y como segundo agente (8) un anticuerpo anti-CD28 o un fragmento de unión a antígeno del mismo que estimula a CD28 como molécula accesoria.
El reactivo de multimerización (4) mostrado el ejemplo de la Fig. 3 comprende solo un tipo de sitio de unión Z1 (42) para la unión reversible tanto del primer agente (6) como del segundo agente (8). Tanto el primer agente (6) como el segundo agente (8) comprenden por lo menos un compañero de unión C1 (6a, 8a), en donde tanto el compañero de unión C1 (6a) como el compañero de unión (8a) son capaces de unión reversible al sitio de unión Z1 (44) del reactivo de multimerización. Por tanto para la inmovilización, el primer agente (6) y el segundo agente (8), se unen respectivamente al reactivo de multimerización (4) a través de la unión reversible formada entre el compañero de unión C1 (6a) y el compañero de unión C2 y el sitio de unión Z1 (42). Los compañeros de unión C1 y C2 pueden ser diferentes o idénticos. Por ejemplo, el compañero de unión C1 puede ser un péptido de unión a estreptavidina de las secuencias Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys ((SEQ ID NO: 01), el "Strep-tag®") mientras que el compañero de unión C2 puede ser el péptido de unión a estreptavidina de la secuencia Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys ((SeQ ID NO: 04), también conocida como "di-tag3")) o de la secuencia Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys ((SEQ ID NO: 05), también conocida como "di-tag2"), descrito por Junttila et al., Proteomics 5 (2005), 1199 -1203 o la Patente de Estados Unidos 7.981.632). Todos estos péptidos de unión a estreptavidina se unen al mismo sitio de unión, concretamente el sitio de unión a biotina de la estreptavidina. Si uno o más de tales péptidos de unión a estreptavidina se usa como compañero de unión C1 y C2, el reactivo de multimerización (4) es una muteína de estreptavidina. Como se muestra en la Fig. 3, se usa un reactivo de multimerización soluble (4). En el caso de una muteína de estreptavidina, este reactivo de multimerización soluble puede ser, por ejemplo, un oligómero o un polímero de estreptavidina o avidina o de cualquier muteína (análogo) de estreptavidina o avidina. El oligómero puede comprender tres o más monómeros de estreptavidina, avidina o una muteína de los mismos. El oligómero o polímero puede estar reticulado por un polisacárido. Tales oligómeros o polímeros de estreptavidina o de avidina o de muteínas de estreptavidina o de avidina pueden prepararse en un primer paso mediante la introducción de residuos carboxilo en un polisacárido, por ejemplo dextrano, esencialmente como se describe en >Noguchi, A., Takahashi, T., Yamaguchi, T., Kitamura, K., Takakura, Y., Hashida, M. & Sezaki, H. (1992). Preparation and properties of the immunoconjugate composed of anti-human colon cancer monoclonal antibody and mitomycin C dextran conjugate. Bioconjugate Chemistry 3,132-137". En un segundo paso, la estreptavidina o avidina o muteínas de las mismas se acoplan mediante grupos amino primarios del residuo de lisina interno y/o el extremo N-terminal libre a los grupos carboxilo en la estructura principal de dextrano usando química de carbodiimida convencional. Alternativamente, también pueden obtenerse oligómeros o polímeros reticulados de estreptavidina o avidina o de cualquier muteína de estreptavidina o avidina mediante reticulación mediante conectores bifuncionales como glutardialdehído o mediante otros métodos descritos en la bibliografía.
Usar como compañeros de unión C1 y C2, las fracciones que se unen al mismo sitio de unión (42) del agente de multimerización tiene la ventaja de que, como se muestra en la Fig. 3b, el mismo compañero libre (del primer compañero de unión C1 y también del segundo compañero de unión C2) o análogo del mismo puede usarse para terminar la expansión de la población de células T (2) y para liberar esta población de células T (2) del agente de multimerización. En el ejemplo de la Fig. 3, puede usarse convenientemente un análogo del primer y segundo compañero C1 y C2 como biotina o un derivado de biotina (iminobiotina o destiobiotina) para la terminación de la expansión y la elución de la población de células T (2).
Como se muestra en la Fig. 3c, después de la elución de las células como se ilustra en la Fig. 1d, el primer agente (6), el segundo reactivo (8) así como la biotina como análogo (20) del primer compañero libre del compañero de unión C1 y el segundo compañero libre del compañero de unión C2 pueden eliminarse fácilmente de la población de células estimulada (2) a través de un "cartucho de extracción" descrito en la solicitud de patente internacional WO 2013/124474. Además, el caso de usar un reactivo de multimerización soluble (4) tiene la ventaja adicional de poder evitar cualquier soporte sólido, como perlas magnéticas. Esto significa que no hay riesgo de contaminación de las células T activadas por tales perlas magnéticas. Esto también significa que un proceso que cumple con los estándares GMP puede establecerse mucho más fácilmente en comparación con el método conocido, como el uso de Dynabeads®, en el que deben tomarse medidas adicionales para garantizar que la población final de células T expandida esté libre de partículas magnéticas. Además, el uso de un agente de multimerización soluble hace que sea mucho más fácil eliminarlo de la población de células activadas (células T, células B o también células asesinas naturales) ya que las células pueden sedimentarse simplemente por centrifugación y el sobrenadante que incluye el agente de multimerización soluble puede descartarse. Alternativamente, el agente de multimerización soluble puede eliminarse de la población celular expandida en una matriz de permeación de gel del cartucho de extracción de la Solicitud de Patente Internacional WO 2013/124474. Como no hay fase sólida (por ejemplo, perlas magnéticas), la presente invención también proporciona un sistema cerrado automatizado para la expansión de las células que puede integrarse en sistemas de expansión celular conocidos como el sistema de expansión celular Xuri W25 y el sistema WAVE Bioreactor 2/10, disponible en GE Healthcare (Little Chalfont, Buckinghamshire, Reino Unido) o el sistema de expansión celular Quantum®, disponible de TerumoBCT Inc. (Lakewood, CO, USA).
La Fig. 4 muestra los resultados de un experimento en el que se proliferaron células respondedoras T CD3+ después de ser estimuladas in vitro con fragmentos Fab aCD3 y aCD28 que se inmovilizaron reversiblemente en perlas recubiertas con la muteína de estreptavidina Strep-tactin®. La Fig. 4A en un histograma que muestra la distribución de tamaño (dispersión hacia adelante) de las células estimuladas, la Fig. 4B representa histogramas que representan el grado de proliferación de acuerdo con el número de células por división celular que se indican en la parte superior de la Fig. 4b (0 representa células no divididas; 5 representa células que han pasado por al menos 5 divisiones), y la Fig. 4C muestra una imagen de la placa de cultivo después de 4 días de estimulación.
La Fig. 5 muestra los resultados de la movilización diferencial de calcio intracelular en células Jurkat que están o marcadas con el anticuerpo aCD3 OKT3 o con fragmentos Fab de OKT3 multimerizados con Strep-tactin® (también referidos en la presente como multímeros Fab). Fig. 5A : las células Jurkat se cargaron con el colorante sensible al calcio Indo-1-AM y la liberación de calcio se desencadenó mediante la inyección de mAb aCD3 (cuadrados negros) o multímeros Fab de aCD3 OKT3 (derivados de la línea celular original OKT3) con o sin interrupción de D-biotina previa (triángulos de color gris oscuro y círculos de color gris claro, respectivamente) en comparación con la inyección de PBS (triángulos blancos invertidos). La aplicación de ionomicina sirvió como control positivo. Los cambios resueltos en el tiempo en la concentración de Ca2+ intracelular se monitorizaron mediante citometría de flujo en base al cambio en la relación de FL6/FL7. Fig. 5B : Las células Jurkat marcadas con Indo-1-AM fueron activadas por diferentes estímulos de aCD3 como se describe en la Fig. 4a; OKT3: gráfico superior y Fab-multímero de aCD3: gráfico central) seguido de la interrupción posterior (t=140 s) mediada por D-biotina de la señalización del multímero Fab de aCD3. La inyección de PBS (gráfico inferior) e ionomicina sirvió como control negativo o positivo. Los datos son representativos de tres experimentos diferentes.
La Fig. 6 muestra el resultado de la tinción reversible de células mediante multímeros Fab anti CD3 OKT3. Las PBMC recién aisladas se tiñeron o con un anticuerpo monoclonal (gráfico de puntos izquierdo, clon parental para los multímeros Fab) o multímeros Fab marcados con PE cognados y se analizaron antes (segunda columna izquierda) o después del tratamiento con D-biotina (columna central). A continuación, se detectaron los monómeros Fab restantes después de los pasos de lavado posteriores usando Strep-Tactin® marcado con PE nuevo (segunda columna derecha). La tinción secundaria de Fab-multímero de células teñidas reversiblemente sirvió como control (columna de la derecha). Solo se muestran las células vivas (PInegativa). |_os números en los gráficos de puntos indican el porcentaje de células dentro de las puertas.
La Fig. 7 muestra el aislamiento de células por unión reversible de fragmentos Fab anti-CD28 multimerizados con Strep-Tactin® marcados con ficoeritrina como marcador fluorescente. Las células CD28+ se seleccionaron/aislaron mediante selección celular magnética Fab-multímero de PMBC recién aisladas como se describe en la Solicitud de Patente Internacional WO2013/011011. Antes de la selección, las células se tiñeron de control con los multímeros aCD28 fluorescentes cognados (gráfico de puntos de la izquierda) o con un anticuerpo dirigido contra la cadena ligera kappa de inmunoglobulina (segundo gráfico de puntos de la izquierda, mAb kappa de a-Ig). Después de la selección, las células se trataron con D-biotina y posteriormente se lavaron para eliminar las perlas magnéticas y los monómeros Fab. Las células CD28+ liberadas fueron posteriormente (re-)teñidas con multímeros Fab CD28 (segundo gráfico de puntos a la derecha) o con el mAb kappa de a-Ig (gráfico de puntos a la derecha) para detectar los monómeros Fab potencialmente restantes. Solo se muestran las células CD3+ vivas (PInegativo). Los números en los gráficos de puntos indican el porcentaje de células dentro de las puertas.
La Fig. 8 muestra los resultados de un experimento en el que se proliferaron células respondedoras T CD3+ después de ser estimuladas in vitro con fragmentos Fab de aCD3/aCD28 reversibles que se inmovilizaron reversiblemente en Strep-tactin® oligomérico soluble que actúa como un reactivo de multimerización soluble. Para los experimentos cuyos resultados se muestran en la Fig. 8 , se marcaron 300.000 células respondedoras T CD3+ (Tresp) con 2gM de carboxifluoresceína succinimidil éster (CFSE) y se estimularon con cantidades variables de una preparación de oligómeros de estreptactina solubles en los que se inmovilizó una combinación de fragmento Fab de aCD3 y Fab de aCD28, llevando ambos una etiqueta de estreptavidina como péptido de unión a estreptavidina en la cadena pesada. (“1x” corresponde a 3 |ug de Strep-tactin multimerizado funcionalizado con 0,5 |ug de aCD3- y 0,5 |ug de Fab de aCD28; los números indican la cantidad de veces de “1x”). Las células Tresp se dejaron sin estimular o se estimularon con multímeros de Strep-tactin en blanco (sin Fab) que sirvieron como control negativo. Se sembraron células Tresp por duplicado en placas de 48 pocillos junto con 300.000 células alimentadoras autólogas CD3 negativas (irradiadas con 30Gy) en 1 ml de medio de cultivo celular suplementado con 20 U/ml de interleucina 2 (IL-2). Las células se incubaron a 37° C sin intercambio de medio y se analizó la proliferación de acuerdo con dilución de CFSE después de 5 días mediante análisis FACS (Fig. 8B). La Fig. 8A muestra la distribución del tamaño de las células después de 5 días en cultivo. Los histogramas muestran células CD3+ vivas, mientras que la Fig. 8C muestra células después de cultivo que fueron liberadas por reactivos de estimulación después de tratarse con D-biotina 1 mM y lavarse. La disociación y eliminación de los fragmentos Fab monoméricos se analizó mediante la retinción con Strep-Tactin® marcado con ficoeritrina (ST-PE) como marca fluorescente y se muestra un histograma representativo. La Fig. 8D muestra el número absoluto de células vivas (azul tripán negativo) contado después de 5 días usando una cámara de recuento Neubauer y se representó frente a la condición de estimulación respectiva. Los números medianos de células se muestran en la Fig. 8D; las barras de error indican la desviación estándar (SD). La FIG.
8E muestra una imagen de la placa de cultivo después de 5 días de estimulación.
La Fig. 9 representa una ilustración del método de expansión en serie de la presente divulgación (Fig. 9a) mientras que la Fig. 9b describe brevemente algunas características y ventajas de la expansión en serie.
La Fig. 10 muestra una disposición de la divulgación que puede usarse junto con los métodos de expansión de la divulgación. Esta disposición (100) incluye un biorreactor (50), un primer "cartucho de extracción" (70) y un segundo "cartucho de extracción" (90). El biorreactor (50) está conectado de manera fluida al primer cartucho de extracción (70), y el primer cartucho de extracción está conectado de manera fluida al segundo cartucho de extracción (90). Esta disposición (100) puede ser parte de un dispositivo para la expansión y purificación celular automatizadas como se describe aquí.
En el biorreactor (50) se lleva a cabo un método de expansión como se describe en la presente, por ejemplo, un método de expansión ilustrado en la Fig. 3 que hace uso de un reactivo de multimerización soluble. En este caso, después de la terminación de la activación/expansión de la población celular (2) mediante la adición de un competidor (20) (compañero libre del compañero de unión C1 o un análogo del mismo), las mezclas de reacción que se liberan del biorreactor contienen la población expandida de células (2), el primer agente (6), el segundo agente (8) así como el reactivo de multimerización soluble (4). En este ejemplo, el primer agente (6) es un fragmento de anticuerpo de unión a CD3 que incluye un péptido de unión a estreptavidina como compañero de unión C1, el segundo agente (8) es un fragmento de anticuerpo de unión a CD28 que incluye un péptido de unión a estreptavidina como compañero de unión C1 y el competidor (20) (análogo libre del compañero de unión C1) es biotina. Esta mezcla de reacción se aplica sobre el primer cartucho de extracción (70). Este primer cartucho de extracción (70) es un cartucho de extracción como se describe en la Solicitud de patente internacional WO 2013/124474 que incluye una columna de cromatografía con una fase estacionaria adecuada. La fase estacionaria puede servir tanto como matriz de cromatografía de afinidad como, al mismo tiempo, puede actuar como matriz de permeación de gel. Esta matriz de cromatografía de afinidad tiene un reactivo de afinidad inmovilizado sobre ella. El reactivo de afinidad puede, en el caso del Ejemplo actual, por ejemplo, ser estreptavidina, una muteína de estreptavidina, avidina, una muteína de avidina o una mezcla de las mismas. Por tanto, el primer agente (6) y el segundo agente (8) se unen al reactivo de afinidad a través de su péptido de unión a estreptavidina. También la biotina como competidor (20) se une al reactivo de afinidad. Por tanto, estos tres reactivos se inmovilizan todos en la matriz cromatográfica del primer cartucho de extracción mientras la población de células expandida (2) y el reactivo de multimerización soluble (4) pasan a través de la fase estacionaria. Este "flujo a través" se aplica luego al segundo cartucho de extracción (90). Además, este segundo cartucho de extracción (90) comprende una fase estacionaria. Esta fase estacionaria comprende un segundo reactivo de afinidad sobre la misma que es capaz de unirse al sitio de unión Z1 (42) del reactivo de multimerización (4). Este reactivo de afinidad puede ser, por ejemplo, biotina que está unida covalentemente a la fase estacionaria. Tal fase estacionaria puede ser, por ejemplo, d-biotina Sepharose™ que puede obtenerse de Affiland S.A. (Ans-Liege, Bélgica). Por tanto, el reactivo de multimerización soluble (4) se unirá (retendrá) en la fase estacionaria del segundo cartucho de extracción (90) mientras que la población de células expandida (2) pasa a través de la fase estacionaria y se libera de cualquier reactivo. La población de células (2) está ahora en una condición para cualquier uso adicional, por ejemplo, para aplicaciones de diagnóstico (por ejemplo, clasificación FACS™ adicional) o para cualquier aplicación terapéutica basada en células. Se observa aquí que, por supuesto, también es posible cambiar el orden del primer "cartucho de extracción" (70) y el segundo "cartucho de extracción" (90) en una disposición (100), de tal manera que el biorreactor (50) esté (directamente) conectado de manera fluida al segundo cartucho extraíble (90), y el primer cartucho de extracción (70) está dispuesto después y conectado de manera fluida al segundo cartucho de extracción (90). En esta disposición, el reactivo de multimerización (4) se eliminará primero de la población de células (2) y posteriormente se eliminarán el primer agente (6), el segundo (8) y, por ejemplo, el competidor (20). Tal disposición también está incluida en la presente divulgación y también puede ser parte de un dispositivo para la expansión y purificación celular automatizadas como se describe aquí.
La Fig. 11 muestra un caso adicional de una disposición de la divulgación que puede usarse junto con los métodos de expansión de la divulgación. Esta disposición (110) incluye un biorreactor (50), un primer "cartucho de extracción" (70) y un segundo "cartucho de extracción" (90). El biorreactor (50) está conectado de manera fluida al primer cartucho extraíble (70), y el primer cartucho de extracción está conectado de manera fluida al segundo cartucho de extracción (90). Además, el segundo cartucho de extracción (110) está conectado de manera fluida al biorreactor (50). Esta disposición (110) también puede ser parte de un dispositivo para la purificación y expansión celular automatizada como se describe aquí. Cuando se usa, por ejemplo, junto con un método de expansión que emplea un reactivo de multimerización soluble (4), se obtiene una población de células expandida purificada (2) como eluido del segundo cartucho de extracción (90). Como el cartucho de extracción (90) está conectado de manera fluida al biorreactor (50), la población de células (2) puede transferirse de vuelta al biorreactor (50), por ejemplo, a la expansión clonal en serie como se describe aquí, transfectando la población de células, por ejemplo, con el gen de un receptor de células T y posterior expansión adicional (segunda) usando un método de expansión de la divulgación.
La Fig. 12 muestra un caso adicional de una disposición de la divulgación que puede usarse junto con los métodos de expansión de la divulgación. Esta disposición (120) incluye un biorreactor (50), un primer "cartucho de extracción" (70) y un segundo "cartucho de extracción" (90). El biorreactor (50) está conectado de manera fluida al primer cartucho extraíble (70), y el primer cartucho de extracción está conectado de manera fluida al segundo cartucho de extracción (90). Similar al caso mostrado en la Fig. 11, el segundo cartucho de extracción (110) está conectado de manera fluida al biorreactor (50). Sin embargo, un "cartucho de selección" (92) como se describe en la Solicitud de Patente Internacional WO 2013/124474 está dispuesto entre el segundo cartucho de extracción (90) y el biorreactor (50). Por tanto, una subpoblación de células (2a) que está comprendida en la población de células (2) puede seleccionarse/enriquecerse mediante este "cartucho de selección" (92) como se describe en la WO 2013/124474. Esta subpoblación de células (2a) puede transferirse al biorreactor (50), por ejemplo, para someterla a una expansión en serie como se describe aquí. Alternativamente (no mostrado), esta subpoblación de células (2a) puede usarse para terapia basada en células. Se observa de nuevo aquí que el uso de un reactivo de multimerización soluble como se describe aquí permite el diseño de dispositivos de expansión y purificación celular automatizados que están funcionalmente cerrados y, por tanto, no son propensos a la contaminación. Además, como el reactivo de multimerización soluble evita la necesidad de materiales en fase sólida como perlas magnéticas, tales dispositivos de purificación de células pueden diseñarse como dispositivos de flujo continuo.
La Fig. 13 muestra la cinética de expansión de la proliferación de células T respondedores CD4+ y CD8+ purificadas (Tresp) que fueron estimuladas in vitro o con fragmentos Fab de aCD3/aCD28 o con aCD3/aCD28/aCD8 que fueron inmovilizadas reversiblemente en dos tipos de muteína Strep-tactin® oligomérica soluble que actúa como reactivo de multimerización soluble. El primer tipo de Strep-tactin® oligomérica fue la fracción de la muteína de estreptavidina oligomérica (n>3) obtenida en el Ejemplo 5 (también referida en la presente como "estructura principal convencional de Streptactin®", ilustrada por el símbolo del triángulo con la punta hacia abajo en la Fig. 13), el segundo tipo de esta muteína de estreptavidina oligomérica usada como reactivo de multimerización soluble fue un oligómero que se obtuvo haciendo reaccionar la muteína de estreptavidina oligomérica soluble con albúmina de suero humano biotinilada (HSA). A este reactivo de multimerización soluble basado en HSA también se hace referencia en la presente como “estructura principal de Streptacin® grande. En los experimentos de la Fig. 13 la expansión se llevó a cabo sin intercambio de medios. Los resultados para las células T respondedores CD4+ se muestran en la Fig. 13A, los resultados para las células T respondedores CD8+ se muestran en la Fig. 13B. En este contexto, se observa que a los reactivos de multimerización solubles usados experimentalmente que se funcionalizaron mediante la unión reversible de los primeros agentes y, opcionalmente, los segundos y terceros agentes se hace referencia en las figuras como "multímeros de Streptamer®".
La Fig. 14 muestra la cinética de expansión de la proliferación de células T respondedores CD4+ y CD8+ purificadas (Tresp) que fueron estimuladas in vitro con fragmentos Fab de aCD3/aCD28 que eran fragmentos inmovilizados reversiblemente que se inmovilizaron reversiblemente con dos tipos de Strep-tactin® oligomérica soluble que actúa como reactivo de multimerización soluble. El primer tipo de Strep-tactin® oligomérico fue la fracción de la muteína de estreptavidina oligomérica (n>3) obtenida en el Ejemplo 5 (también referida en la presente como "estructura principal de Streptactin® convencional", ilustrada por el símbolo del triángulo con la punta en la parte superior en la Fig. 14), el segundo tipo de esta muteína de estreptavidina oligomérica usada como reactivo de multimerización soluble fue el agente de multimerización soluble basado en HSA, la "estructura principal de Streptactin® grande" mencionada anteriormente). En los experimentos de la Fig. 14 la expansión se llevó a cabo con intercambio de medio. Los resultados para las células T respondedores CD4+ se muestran en la Fig. 14, los resultados para las células T respondedores CD8+ se muestran en la Fig. 14B.
La Fig. 15 muestra los datos combinados de los resultados obtenidos en las Figs. 13 y 14 para la cinética de expansión de la proliferación de células T respondedores CD4+ y CD8+ purificadas, con la Fig. 15A representado los resultados de las células T CD4+ y la Fig. 15B representando los resultados de las células T CD8+. Se usan líneas rectas para el cultivo con intercambio de medio el día 3, mientras que las líneas discontinuas representan los valores obtenidos para el grado de expansión sin intercambio de medio el día 3. Los datos mostrados en la Fig. 15 se normalizan en el número de célula de entrada. Solo se muestran los datos de Tresp estimulado con la muteína de estreptavidina oligomérica (n>3), el Tresp estimulado con las Dynabeads disponibles comercialmente (control positivo) y las células T no estimuladas (control negativo), pero no se muestran datos sobre el reactivo de multimerización con la “estructura principal de Streptactin® grande”.
La Fig. 16 muestra la formación de grupos tempranos de células T después de la activación de células T respondedores CD4+ y CD8+ purificadas estimuladas in vitro con fragmentos Fab de aCD3/aCD28 que se inmovilizaron reversiblemente en la muteína de estreptavidina oligomérica soluble (n>3) descrita en el Ejemplo 5. La Fig. 16A representa los resultados de las células T CD4+ y la Fig. 16B representa los resultados de las células T CD8+. Se muestran los datos para el Tresp estimulado con el reactivo de multimerización soluble (la muteína de estreptavidina oligomérica), el Tresp estimulado con las Dynabeads disponibles comercialmente (control positivo) y las células T no estimuladas (control negativo).
La Fig. 17 muestra la cinética de expansión y el fenotipo de las células T de memoria central (Tcm) CD3+ (CD3+CD62L+CD45RA-Tcm) estimuladas policlonalmente in vitro con fragmentos Fab de aCD3/aCD28 que se inmovilizaron reversiblemente en la muteína de estreptavidina oligomérica soluble (con n>3) descrita en el Ejemplo 5. Los gráficos que se muestran en la Fig. 17 representan el grado de proliferación de acuerdo con el número de células recogidas por punto temporal, con la Fig. 17A mostrando la proliferación sólo en medios suplementados con IL-2 y en la Fig. 17B mostrando la proliferación en medios suplementados con IL-2 e IL-15. La Fig. 17C muestra un análisis de citometría de flujo de la expresión de superficie de CD62L y CD127 después de 14 días de cultivo en estos medios de citoquinas variables.
La Fig. 18 muestra la cinética de la expansión selectiva específica de antígeno (específica de Ag) a partir de una población en masa de células respondedoras CD3+CD62L+CD45RA-Tcm purificadas que se estimularon in vitro con tanto un complejo de péptido:molécula de MHC (que actúa como primer agente que proporciona una señal de activación primaria a las células) como el fragmento Fab de aCD28 (que actúa como segundo agente que une la molécula accesoria en la superficie de las células) y las células T no estimuladas (control negativo). Tanto el complejo de péptido específico de antígeno con la molécula de MHC como el fragmento Fab de aCD28 se inmovilizaron reversiblemente en la misma muteína de estreptavidina oligomérica soluble (con n>3) descrita en el Ejemplo 5. El péptido usado para la expansión específica de antígeno en la Fig. 18A fue el péptido CRVLCCYVL (SEQ ID NO: 06), aminoácidos 309-317 de la proteína 1 inmediata-temprana restringida por la molécula MHC HLA-C702 (descrita en Ameres et al, PLOS Pathogens, mayo de 2013, vol. 9, número 5, e1003383) que representa un epítopo de HLA-C7/IE-1 que es específico del citomegalovirus (CMV). La molécula MHC I que presenta el péptido lleva en su extremo C-terminal de la cadena pesada el péptido de unión a estreptavidina (SAWSHPQFEK(GGGS)2GGSAWSHPQFEK (SEQ ID NO: 07), que está disponible comercialmente como "Twin-Strep-tag®" de IBA GmbH, Gottingen, Alemania). La Fig. 18A muestra un análisis de citometría de flujo ejemplar para la fracción de células específicas de Ag que proliferaron usando el complejo péptido:MHC-I específico para este epítopo de HLA-C7/IE-1 como primer agente que proporciona una señal de activación primaria a las células reversiblemente inmovilizado en la muteína de estreptavidina oligomérica soluble. Los gráficos en las Fig. 18B a Fig. 18E ilustran la cinética de expansión de otras especificidades de Ag de acuerdo con el número de péptidos específicos: células positivas para el multímero MHCI recogidas por punto de tiempo en analogía con la Fig. 18A usando distintos complejos de un péptido específico de antígeno con la molécula MHC I como primer agente que proporciona una señal de activación primaria a las células inmovilizadas reversiblemente en la muteína de estreptavidina oligomérica soluble. Con más detalle, la Fig. 18B muestra la expansión de células específicas de Ag que se expandieron usando el complejo péptido:MHC-I específico para el epítopo pp65 de CMV (aminoácidos 341-350 (QYDPVAALF, (SEQ ID NO: 08)) restringido por HLA-A2402), La Fig. 18C muestra la expansión de células específicas de Ag que se expandieron usando otro complejo péptido: MHC-I específico para el epítopo pp65 de CMV (aminoácidos 265-274 RPHERNGFTV, (SEQ ID NO: 09)) restringido por HLA-B702), La Fig. 18D muestra la expansión de células específicas de Ag que proliferaron usando el complejo péptido:MHC-I específico para el epítopo hexon 5 de adenovirus (aminoácidos 114-124 (CPYSGTAYNSL, (SEQ iD No : 10)) restringido por HLA-B702), La Fig. 18E muestra la expansión de células específicas de Ag que proliferaron usando el complejo péptido:MHC-I específico para el epítopo HLA-B7/IE-1309-317 de CMV (datos de FACS ejemplares ver arriba la Fig. 18A). Todas las moléculas de péptido: MHC que llevan Twin Strep®-Tag están disponibles comercialmente en IbaGmbH. En este contexto, las secuencias de aminoácidos de las moléculas HLA-A*2402, HLA-B*0702 y HLA-C*0702 que llevan el "Twin-Strep-tag®" como su extremo C-terminal se muestran como SEQ ID NO: 21, 22 y 23 en las listas de secuencias acompañantes, mientras que la secuencia de aminoácidos de la microglobulina P2 (que se forma junto con la cadena a, es decir, las moléculas codificadas por HLA, la molécula de MHC I respectiva) se muestra como SEQ ID NO: 24 en el listado de secuencias acompañante. Además, la Fig. 18F muestra un análisis de citometría de flujo ejemplar de la expresión de superficie de CD62L y CD127 después de 14 días de cultivo para las células estimuladas/expandidas HLA-B7/Hexon5m -124 de la Fig. 18D.
La Fig. 19 muestra la cinética de la expansión selectiva específica de Ag a partir de células CD3+CD62L+CD45RA-Tcm respondedores purificadas que se estimularon in vitro con a) complejos de péptido MHC I específicos de antígeno y b) fragmentos Fab de aCD28 que se inmovilizaron reversiblemente como primer y segundo agente sobre muteínas de estreptavidina oligoméricas solubles. Para este propósito, se estimularon con Ag específicamente 500.000 células Tcm CD3+CD62L+CD45RA- respondedoras (Tresp) usando 3 pl de una preparación de reactivo de multimerización de estreptactina funcionalizado con 0,5 pg de complejos péptido:MHC clase I equipados con un péptido de unión a estreptavidina (el péptido específico representa los aminoácidos 114-124 (CPYSGTAYNSL, SEQ ID NO: 10) de la proteína Hexon 5 del adenovirus restringido por HLA-B0702, ver más arriba) y 0,5 pg de Fab aCD28. Como alternativa, 4,5 pl de una preparación de reactivo de multimerización de estreptactina cargado con 0,5 pg de este complejo péptido: MHC de clase I, 0,5 pg de Fab aCD8 y 0,5 pg de Fab aCD28. A modo de comparación, se realizó estimulación policlonal, usando 3 pl de una preparación de reactivo de multimerización de estreptactina (1 mg/ml) o bien cargado con una combinación de 0,5 pg de Fab de aCD3 y 0,5 pg de Fab de aCD28. De nuevo, como condición de estimulación alternativa descrita anteriormente, se usaron 4,5 pl de una preparación de multímeros de estreptactina cargados con 0,5 pg de Fab aCD3, 0,5 pg de Fab aCD8 y 0,5 pg de Fab aCD28. Las células Tresp no tratadas (no estimuladas) sirvieron como control negativo y las células Tresp policlonales estimuladas con Dynabeads como control positivo. Se sembraron células Tresp en placas de 48 pocillos en 1 ml de medio de cultivo celular suplementado con 30 U/ml de IL-2 y 5 ng/ml de IL-15. Las células se incubaron a 37° C. con intercambio de medio cada 3 días y se analizó el recuento celular a los 7 y 14 días. Las fotografías mostradas en la Fig. 19 representan el grado de formación de grupos en el día 5 para la estimulación específica de Ag como se ejemplifica para el epítopo HLA-B7/Hexon 5 de adenovirus.
La Fig. 20 muestra el rendimiento y el fenotipo de expansión de células respondedoras T CD8+ purificadas estimuladas in vitro con fragmentos Fab aCD3/aCD28 que se inmovilizaron reversiblemente en dos tipos de Strep-tactin® oligomérico soluble que actúa como reactivo de multimerización soluble. El primer tipo de Streptactin® oligomérico fue la fracción de la muteína de estreptavidina oligomérica (nmerico obtenida en el Ejemplo 5 (estructura principal convencional), el segundo tipo de esta muteína de estreptavidina oligomérica usada como reactivo de multimerización soluble fue el oligómero soluble descrito anteriormente y al que se hace referencia aquí como estructura principal de Streptactin® "grande". En estos experimentos, la fracción de la muteína de estreptavidina convencional oligomérica (n>3) también se usó como reactivo de multimerización que se funcionalizó con fragmentos Fab individuales (tercera barra en la Fig. 20A y la Fig. 20B) o con una combinación de fragmentos Fab de aCD3 y aCD28. Además de la estimulación combinada con fragmentos Fab de aCD3/aCD28, también se inmovilizó un fragmento Fab de aCD8 adicional (disponible comercialmente de IBA GmbH, Gottingen, Alemania) para probar si es posible estimular preferentemente una subpoblación de células T específica. La Fig. 20A muestra un gráfico de barras que representan el grado de proliferación de acuerdo con el número de células recogidas el día 6 en comparación con los controles negativos (células T CD8+ respondedoras purificadas no estimuladas) y normalizadas al control positivo (respondedora T CD8+ purificada estimulada con Dynabeads disponibles comercialmente (perlas en las que los anticuerpos monoclonales de aCD3 y aCD28 están inmovilizados de irreversiblemente). La Fig. 20B muestra un análisis de citometría de flujo de la expresión de superficie de CD8 y la molécula de superficie de células T CD45RO (que es indicativa de la proliferación y activación de células T) después del cultivo celular. Las varias condiciones de estimulación se compararon usando ANOVA de una vía y no se detectó ninguna diferencia significativa (n.s.).
La Fig. 21 muestra el rendimiento y el fenotipo para la expansión de células respondedoras T CD8+ purificadas estimuladas in vitro con fragmentos Fab de aCD3/aCD28 que se inmovilizaron reversiblemente en Strep-tactin® oligomérico soluble que actúa como un reactivo de multimerización soluble que se funcionalizó con fragmentos Fab únicos o con una combinación de fragmentos Fab (como ya se ha descrito anteriormente). En estos experimentos, las células respondedoras T CD8+ se estimularon con el reactivo de multimerización soluble (el Strep-tactin® oligomérico soluble (1 mg/ml) del Ejemplo 5) que se funcionalizó con cantidades variables de fragmentos Fab de aCD3 y aCD28, opcionalmente junto con el fragmento Fab de aCD8 descrito anteriormente. El término “1 x” corresponde a 1,5 gg de estreptactina multimerizada funcionalizada con 0,5 gg de fragmento Fab de aCD3 solo y 1,5 gg de estreptactina multimerizada funcionalizada con 0,5 gg de Fab de aCD28 solo) o 3 gl de una preparación de estreptactina oligomérica cargada con 0,5 gg de fragmento Fab de aCD3 y 0,5 gg de Fab de aCD28, o 4,5 gl de una preparación de multímeros de estreptactina cargados con 0,5 gg de aCD3 marcado con estreptococos, 0,5 gg de aCD8 marcado con estreptococos y 0,5 gg de Fab de aCD28 marcado con estreptococos. Por consiguiente, el término "2x" corresponde a 3,0 gg de estreptactina multimerizada funcionalizada con 1 gg de fragmento Fab de aCD3 solo y 3,0 gg de estreptactina multimerizada funcionalizada con 1 gg de Fab de aCD28 solo, lo que significa que se usó el doble de la cantidad de fragmento Fab de aCD3 inmovilizado. Las células Tresp no tratadas sirvieron como control negativo y las respondedoras T CD8+ purificadas estimuladas con Dynabeads disponibles comercialmente (perlas en las que los anticuerpos monoclonales aCD3 y aCD28 están inmovilizados irreversiblemente) como control positivo. La Fig. 21A muestra un gráfico en el que las barras representan el grado de proliferación de acuerdo con el número de células recogidas el día 5 en comparación con los controles negativos y normalizadas al control positivo. La Fig. 21B muestra el análisis FACS de la expresión de superficie de CD8 y CD45RO después del cultivo celular.
La Fig. 22 muestra la activación de cascadas de señalización intracelular de células Jurkat transducidas que han sido modificadas para expresar un receptor de antígeno quimérico (CAR) de aCD19, y que se estimularon usando el Strep-tactin® oligomérico del Ejemplo 5 como reactivo de multimerización soluble. La especificidad de un CAR se deriva típicamente de una región scFv ensamblada a partir de la región de unión al antígeno de un anticuerpo monoclonal (mAb) que se une específicamente a un antígeno asociado al objetivo/tumor como CD19 y lo enlaza a la señalización específica de las células T (descrita en Hudecek et al, Clin Cancer Res. 15 de junio de 2013; 19(12):3153-3164. En los experimentos, también se usaron en este experimento el dominio extracelular (ECD) de CD19, que contiene el ligando natural del CAR de aCD19 así como el fragmento F(ab)2 de algG policlonal que reconoce el espaciador de IgG4 (F(ab)2 de burro-anti-humano está disponible comercialmente de Jackson Immuno Research) dentro del aCD19-CAR como primer agente que proporciona una señal de activación primaria a las células jurkat. La inmovilización reversible a la muteína de estreptavidina oligomérica soluble fue proporcionada por el péptido de estreptavidina SAWSHPQFEK(GGGS)2GGSAWSHPQFEK (SEQ ID NO: 07) que se fusionó al extremo C-terminal del ECD de CD19 o por el fragmento (Fab)2 biotinilado de la algG (como la muteína de estreptavidina "m2" se une a la biotina con afinidad reducida, esta unión es reversible y puede, por ejemplo, desplazarse mediante la adición de un exceso de biotina libre). En el experimento de control de la Fig. 22A se estimularon 300.000 células respondedoras Jurkat CD3+ (Jresp) con cantidades variables de una mezcla de preparaciones de estreptactina oligomérica (1 mg/ml) que se funcionalizó con el Fab de aCD3 y el Fab de aCD28 ("x 1" corresponde a 3 gg de estreptactina multimerizada funcionalizada con 0,5 gg de multímero de estreptamero policlonal de Fab de aCD3 y 0,5 gg de aCD28). En el experimento de la Fig. 22B se funcionalizaron 3 gl de una preparación de estreptactina oligomérica con 0,5 gg (x1) o 1 gg (x2) del dominio extracelular (ECD) de CD19 o con 3 gl de una preparación de estreptactina oligomérica cargada con 0,5 gg (x1) o 1 gg (x2) de algG que reconoce el espaciador de IgG4 (que son ambos multímeros de Streptamer® específicos de CAR). Jresp estimulado con Dynabeads (perlas en las que los anticuerpos monoclonales aCD3 y aCD28 están inmovilizados irreversiblemente) o PMA e ionomicina sirvieron como controles positivos. Se sembraron células Jresp en tubos Eppendorf de 1,5 ml en 200 gl de medio de cultivo celular suplementado con 30 U/ml de IL-2. Las células se incubaron a 37°C y se pusieron en hielo y se lisaron después de 0 min a 20 min de estimulación.
La Fig. 23 muestra la expansión de células respondedoras T CD3+ purificadas estimuladas in vitro con fragmentos Fab de aCD3/aCD28 que se inmovilizaron reversiblemente en el Strep-tactin® oligomérico soluble del Ejemplo 5 que sirvió como reactivo de multimerización soluble. En un experimento, además de los fragmentos Fab de aCD3/aCD28, también se inmovilizó un fragmento Fab de aCD8 disponible comercialmente en IBA GmbH, Gottingen, Alemania (número de catálogo 6-8000-203) en el oligómero soluble de la muteína de estreptavidina para probar si es posible estimular preferentemente in vitro la subpoblación de células T CD8+ dentro del cultivo CD3+ a granel con un reactivo de multimerización de la divulgación que tiene inmovilizado reversiblemente en el mismo también un fragmento Fab de aCD8. Más detalladamente, se estimularon 500.000 células respondedoras T CD3+ purificadas (Tresp) con 3 gl de una preparación de estreptavidina oligomérica (1 mg/ml) cargada con una combinación de 0,5 gg de Fab de aCD3 y 0,5 gg de aCD28. Como enfoque alternativo, se cargaron 4,5 gl del oligómero de estreptactina con 0,5 gg de Fab de aCD3, 0,5 gg de aCD8 y 0,5 gg de Fab de aCD28 descritos anteriormente. Las células Tresp no estimuladas sirvieron como control negativo y Tresp estimuladas con Dynabeads (perlas en las que los anticuerpos monoclonales aCD3 y aCD28 están inmovilizados irreversiblemente) sirvieron como control positivo.
La Fig. 24 representa estrategias ejemplares para la generación de muteínas de estreptavidina oligoméricas que pueden usarse como reactivo de multimerización soluble de la divulgación. La Fig. 24A muestra que en un primer paso, se usa la muteína de estreptavidina "m2" (SAm2) que comprende la secuencia de aminoácidos Ile44-Gly45-Ala46-Arg47 (SEQ ID NO: 03) en las posiciones de secuencia 44 a 47 de estreptavidina de tipo salvaje para la generación de muteínas de estreptavidina oligoméricas que tienen un "estructura principal convencional". En un segundo paso, pueden generarse muteínas de estreptavidina oligoméricas solubles que tienen una "cadena principal grande" o mediante el acoplamiento de la muteína de estreptavidina con una proteína portadora biotinilada como la albúmina de suero humano (HSA) o mediante el acoplamiento de las muteínas de estreptavidina con portadores sintéticos como el PEG. Fig. 24B: Biotinilación de albúmina de suero humano (HSA).
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La presente divulgación describe métodos, kits y un aparato para expandir una población de células o para inducir la proliferación de una población de células T.
El término "población de células" como se usa en la presente abarca todas las células que pueden expandirse mediante la unión a un receptor de la superficie celular un primer agente que proporciona una señal de activación primaria a las células. También es posible que para la expansión de la población de células, se necesite la unión del segundo agente a un segundo receptor de la superficie celular (molécula accesoria) para producir una señal coestimuladora requerida para la expansión de las células. En algunos casos, la población de células puede ser una población de linfocitos que incluye, pero no se limita a una población de células B, una población de células T o una población de células asesinas naturales. Ejemplos ilustrativos de poblaciones de células son células B que llevan CD40 o CD137 (ambas poblaciones de células pueden proliferarse tras la unión de solo un primer agente que proporciona una señal de activación, por ejemplo, ligando 4-1BB; o una molécula de anticuerpo aCD40 o una molécula de anticuerpo aCD137 (ver, por ejemplo, Zhang et al., 2010, J Immunol, 184:787-795)). Otros ejemplos ilustrativos de agentes (ya sea primero o segundo) que pueden usarse para la expansión de células B son agentes que se unen a IgG, c D19, CD28 o CD14, por ejemplo, moléculas de anticuerpo aCD19, aIgG, aCD28 o aCD14. También se prevé que los primeros o segundos agentes para la expansión de células B puedan comprender ligandos para receptores de tipo toll o interleucinas, como IL-21 (ver, por ejemplo, Dienz O, et al. 2009. J. Exp. Med.
206:69). Se observa que la activación dependiente de lipopolisacáridos de las células B también está incluida en la presente divulgación, ya que también puede usarse un lipopolisacárido como primer agente y puede equiparse con un compañero de unión C1 como se usa en la presente. Otros ejemplos ilustrativos de poblaciones de células adecuadas incluyen poblaciones de células T que se expanden después de ser activadas mediante la unión de un primer agente a TCR/CD3 y la unión de un segundo agente a una molécula accesoria en la célula T como CD28. En este caso, el primer agente estimula una señal asociada al complejo TCR/CD3 en las células T y el segundo agente proporciona un estímulo secundario al unirse a CD28 como molécula accesoria. Los agentes que pueden usarse para la expansión de las células T también pueden incluir interleucinas, como IL-2, IL-7, IL-15 o IL-21 (ver, por ejemplo, Cornish et al. 2006, Blood. 108(2):600-8, Bazdar y Sieg, 2007, Journal of Virology, 2007, 81(22): 12670­ 12674, Battalia et al, 2013, Immunology, 139(1): 109-120). Otros ejemplos ilustrativos de agentes que pueden usarse para la expansión de células T son agentes que se unen a CD8, CD45 o CD90, como anticuerpos aCD8, aCD45 o aCD90. Ejemplos ilustrativos de población de células T que incluyen células T específicas de antígeno, células T auxiliares, células T citotóxicas, células T de memoria (un ejemplo ilustrativo de células T de memoria son células T de memoria central específicas de CD62L+CD8+) o células T reguladoras (un ejemplo ilustrativo de Treg son células Treg CD4+CD25+ CD45RA+). El término "célula T (población)" como se usa en la presente también incluye células T que comprenden un receptor de antígeno quimérico (CAR) que también se conoce como receptores de células T artificiales o receptores de células T quiméricos. Por tanto, una población de células T que comprende un receptor de antígeno quimérico también puede expandirse usando los métodos, reactivos y dispositivos de la presente divulgación. Ver también a este respecto el Ejemplo 15 en el que se estimularon células Jurkat que expresan un receptor de antígeno específico (CAR) de CD19 quimérico usando un reactivo de multimerización soluble de la presente divulgación. Otro ejemplo ilustrativo de una población celular adecuada incluye células asesinas naturales (células NK) que pueden, por ejemplo, expandirse con agentes que se unen a CD16 o CD56, como por ejemplo anticuerpos aCD16 o aCD56. En un ejemplo ilustrativo de tal anticuerpo aCD16 está el anticuerpo 3G8 con una secuencia VH indicada en la SEQ ID NO: 25 y una secuencia VL indicada en la SEQ ID NO: 26 (ver por ejemplo Hoshino et al, Blood. 15 de diciembre de 1991; 78(12):3232-40.). Otro agente que puede usarse para la expansión de células NK puede ser IL-15 (ver, por ejemplo, Vitale et al. 2002. The Anatomical Record. 266:87-92). Otro ejemplo ilustrativo más de una población celular adecuada incluye monocitos, que pueden, por ejemplo, expandirse usando un agente que se une a CD14, como una molécula de anticuerpo aCD14. La población celular puede ser de cualquier origen mamífero, incluyendo pero no limitado a, humano, conejo, cobaya, ardilla, hámster, gato, perro, lémur, cabra, cerdo, caballo, mono rhesus, macaco o chimpancé.
Por tanto, de acuerdo con lo anterior, esta divulgación se refiere a métodos para inducir selectivamente la expansión ex vivo de una población de células como células B, células T o células asesinas naturales en ausencia de factores de crecimiento exógenos, como linfocinas y células accesorias. Además, la proliferación de estas células, como las células B o las células T, puede inducirse sin necesidad de antígeno, proporcionando de este modo una población de células expandida, como una población de células T, que es policlonal con respecto a la reactividad del antígeno. Los métodos divulgados en la presente pueden proporcionar la proliferación sostenida de una población seleccionada de células T como células T CD4+ o CD8+ durante un período prolongado de tiempo para producir un aumento de múltiples veces en el número de estas células con respecto a la población de células T original. En general, en caso de una expansión (clonal) de una población de linfocitos como se describe en la presente, toda la progenie puede compartir la misma especificidad de antígeno que la población de células que se seleccionó para expansión.
También en línea con lo anterior, esta divulgación proporciona métodos para expandir una población de células T específicas de antígeno. Para producir una población de células T específicas de antígeno, las células T se ponen en contacto con un antígeno en una forma adecuada para desencadenar una señal de activación primaria en el linfocito T, es decir, el antígeno se presenta al linfocito T de tal manera que se desencadena una señal en la célula T a través del complejo TCR/CD3. Por ejemplo, el antígeno puede presentarse a la célula T por una célula presentadora de antígeno junto con una molécula de MHC. Una célula presentadora de antígeno, como una célula B, macrófago, monocito, célula dendrítica, célula de Langerhans u otra célula que pueda presentar antígeno a una célula T, puede incubarse con la célula T en presencia del antígeno (por ejemplo, un antígeno soluble) de tal manera que la célula presentadora de antígeno presente el antígeno a la célula T. Alternativamente, una célula que expresa un antígeno de interés puede incubarse con la célula T. Por ejemplo, una célula tumoral que expresa antígenos asociados a tumores puede incubarse con una célula T juntas para inducir una respuesta específica de tumor. De manera similar, una célula infectada con un patógeno, por ejemplo, un virus, que presenta antígenos del patógeno puede incubarse con una célula T. Después de la activación específica de antígeno de una población de células T, las células pueden expandirse de acuerdo con los métodos de la divulgación. Por ejemplo, después de que se haya establecido la especificidad del antígeno, las células T pueden expandirse mediante cultivo con un anticuerpo anti-CD3 (usado como primer agente) y un anticuerpo anti-CD28 (usado como segundo agente) de acuerdo con los métodos descritos en la presente. En otro caso, el primer agente puede ser un complejo MHC I: péptido, que se une a una población de células T específicas de antígeno. En tal caso, puede usarse cualquier péptido específico de antígeno que se conozca y que pueda formar complejos con la molécula de MHC I respectiva. Ver a este respecto los Ejemplos 11 y 12 en los que se ejemplificó la expansión selectiva específica de antígeno de células respondedoras a Tcm a partir de células T de memoria central CD3+ a granel para cuatro células específicas de antígeno diferentes. Alternativamente, también es posible usar como primer agente el ligando natural de un receptor que desencadena la expansión celular. Ver a este respecto el Ejemplo 15 en el que el dominio extracelular de CD19 provocó la activación de cascadas de señalización intracelular de células Jurkat transducidas que se modificaron para expresar el receptor de antígeno de unión a CD19 quimérico (CAR).
La muestra de la población celular puede ser de cualquier fuente adecuada, típicamente toda la muestra de un tejido corporal o un fluido corporal como la sangre. En el último caso, la muestra podría ser, por ejemplo, una población de células mononucleadas de sangre periférica (PBMC) que puede obtenerse mediante métodos de aislamiento estándar, como un gradiente de ficoll de células sanguíneas. Sin embargo, la población de células a expandir también puede estar en forma purificada y podría haberse aislado usando una tecnología de tinción/aislamiento celular reversible como se describe en la Patente de Estados Unidos 7.776.562, la Patente de Estados Unidos 8.298.782, la Solicitud de Patente Internacional WO02/054065 o la Solicitud de Patente Internacional WO2013/011011. Alternativamente, la población de células también puede obtenerse mediante clasificación celular mediante inmunoadherencia magnética negativa como se describe en la Patente de Estados Unidos 6.352.694 B1 o la Patente Europea EP 0700430 B1. Si un método de aislamiento descrito aquí se usa en investigación básica, la muestra podría ser de células de experimentos de cultivo celular in vitro. La muestra se habrá preparado típicamente en forma de un fluido, como una solución o dispersión.
De acuerdo con lo anterior, en un caso la divulgación proporciona un método in vitro para expandir una población de células, que comprende poner en contacto una muestra que comprende una población de células con un reactivo de multimerización. El reactivo de multimerización ha inmovilizado reversiblemente sobre el mismo (unido al mismo) un primer agente que proporciona una señal de activación primaria a las células, en donde el reactivo de multimerización comprende por lo menos un sitio de unión Z1 para la unión reversible del primer agente. El primer agente comprende por lo menos un compañero de unión C1, en donde el compañero de unión C1 puede unirse reversiblemente al sitio de unión Z1 del reactivo de multimerización, en donde el primer agente se une al reactivo de multimerización a través de la unión reversible formada entre el compañero de unión. C1 y el sitio de unión Z1. El primer agente se une a la molécula receptora en la superficie de las células, proporcionado de este modo una señal de activación primaria a las células y activando de este modo las células.
En otro caso, la divulgación proporciona un método, en donde el agente de multimerización ha inmovilizado reversiblemente sobre el mismo (unido al mismo) un segundo agente que estimula una molécula accesoria en la superficie de las células. El segundo agente comprende un compañero de unión C2, en donde el compañero de unión C2 puede unirse reversiblemente a un sitio de unión Z2 del reactivo de multimerización, en donde el segundo agente se une al reactivo de multimerización a través de la unión reversible formada entre el compañero de unión C2 y el sitio de unión Z2. El segundo agente se une a la molécula accesoria en la superficie de la superficie de las células, estimulando de este modo las células activadas. En este caso, el primer agente puede estimular una señal asociada al complejo TCR/CD3 en las células T y puede ser un agente de unión que se une específicamente a CD3. En este caso, la molécula accesoria de la célula T puede ser CD28 y el segundo agente que se une a la molécula accesoria es un reactivo de unión que se une específicamente a CD28. En este caso, el primer agente que se une específicamente a CD3 puede seleccionarse del grupo que consiste de un anticuerpo anti-CD3, un fragmento de anticuerpo divalente de un anticuerpo anti-CD3, un fragmento de anticuerpo monovalente de un anticuerpo anti-CD3, y una molécula de unión a CD3 proteica con propiedades de unión similares a anticuerpos. Además, el segundo agente que se une específicamente a CD28 puede seleccionarse del grupo que consiste de un anticuerpo anti-CD28, un fragmento de anticuerpo divalente de un anticuerpo anti-CD28, un fragmento de anticuerpo monovalente de un anticuerpo anti-CD28 y una molécula de unión de CD28 proteica con propiedades de unión similares a anticuerpos. El fragmento de anticuerpo divalente puede ser un fragmento (Fab)2', o un fragmento Fv de cadena sencilla divalente, mientras que el fragmento de anticuerpo monovalente puede seleccionarse del grupo que consiste de un fragmento Fab, un fragmento Fv y un fragmento Fv de cadena sencilla (scFv). Una molécula de unión a CD3 o CD28 proteica con propiedades de unión similares a anticuerpos puede ser un aptámero, una muteína basada en un polipéptido de la familia de las lipocalinas, un glucuerpo, una proteína basada en el andamiaje de anquirina, una proteína basada en el andamiaje cristalino, una adnectina y un avimero.
En general, el primer y segundo agente que se usa en la presente divulgación puede ser, por ejemplo, un anticuerpo, un fragmento del mismo y una molécula de unión proteica con funciones similares a anticuerpos. Ejemplos de fragmentos de anticuerpos (recombinantes) son fragmentos Fab, fragmentos Fv, fragmentos Fv de cadena sencilla (scFv), un fragmento de anticuerpo divalente como un fragmento (Fab)2', diacuerpos, triacuerpos (Iliades, P., et al., FEBS Lett (1997) 409, 437-441), decacuerpos (Stone, E., et al., Journal of Immunological Methods (2007) 318, 88-94) y otros anticuerpos de dominio (Holt, L.J., et al., Trends Biotechnol. (2003), 21, 11, 484-490). En algunos casos, uno o más sitios de unión del primer o segundo agente pueden ser una molécula de unión artificial proteica bivalente como una muteína de lipocalina dimérica que también se conoce como "duocalina". En algunos casos, el reactivo de unión al receptor puede tener un único segundo sitio de unión, es decir, puede ser monovalente. Los ejemplos del primer o segundo agente monovalente incluyen, pero no se limitan a, un fragmento de anticuerpo monovalente, una molécula de unión proteica con propiedades de unión similares a anticuerpos o una molécula de MHC. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos monovalentes incluyen, pero no se limitan a, un fragmento Fab, un fragmento Fv y un fragmento Fv de cadena sencilla (scFv), que incluye un fragmento Fv de cadena sencilla divalente.
Como se ha mencionado anteriormente, un ejemplo de una molécula de unión proteica con funciones similares a anticuerpos es una muteína basada en un polipéptido de la familia de las lipocalinas (ver, por ejemplo, la WO 03/029462, Beste et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1999) 96, 1898-1903). Las lipocalinas, como la proteína de unión a bilina, la lipocalina asociada a la gelatinasa de neutrófilos humanos, la apolipoproteína D humana o la lipocalina lagrimal humana poseen sitios de unión de ligandos naturales que pueden modificarse para que se unan a un objetivo determinado. Ejemplos adicionales de una molécula de unión proteica con propiedades de unión similares a anticuerpos que pueden usarse como reactivo de unión al receptor que se une específicamente a la molécula receptora incluyen, pero no se limitan a, los denomindos glucuerpos (ver, por ejemplo, la solicitud de patente internacional WO 96/23879), proteínas basadas en el andamiaje de anquirina (Mosavi, L.K., et al., Protein Science (2004) 13, 6, 1435-1448) o andamiaje cristalino (por ejemplo, solicitud de patente internacional WO 01/04144) las proteínas descritas en Skerra, J. Mol. Recognit. (2000) 13, 167-187, AdNectinas, tetranectinas y avímeros. Los avímeros, incluyendo las proteínas de avímeros multivalentes desarrolladas por la trasposición de exones de una familia de dominios de receptores humanos, contienen los denominados dominios A que se producen como cadenas de múltiples dominios en varios receptores de la superficie celular (Silverman, J., et al., Nature Biotechnology (2005) 23, 1556-1561). Las adnectinas, derivadas de un dominio de la fibronectina humana, contienen tres giros que pueden modificarse para que se unan de manera similar a las inmunoglobulinas a los objetivos (Gill, D.S. & Damle, N.K., Current Opinion in Biotechnology (2006) 17, 653-658). Las tetranectinas, derivadas de la proteína homotrimérica humana respectiva, contienen de igual manera regiones de giro en un dominio de lectina de tipo C que pueden modificarse para la unión deseada (ibid.). Los peptoides, que pueden actuar como ligandos de proteínas, son oligo(N-alquil) glicinas que se diferencian de los péptidos en que la cadena lateral está conectada al nitrógeno de la amida en lugar del átomo de carbono a. Los peptoides son típicamente resistentes a las proteasas y otras enzimas modificantes y pueden tener una permeabilidad celular mucho mayor que los péptidos (ver, por ejemplo, Kwon, Y.-U., and Kodadek, T., J. Am. Chem. Soc. (2007) 129, 1508-1509). Otros ejemplos más de moléculas de unión proteicas adecuadas son un dominio de tipo EGF, un dominio de Kringle, un dominio de fibronectina de tipo I, un dominio de fibronectina de tipo II, un dominio de fibronectina de tipo III, un dominio de PAN, un dominio de G1a, un dominio de SRCR, un dominio inhibidor de tripsina pancreática de Kunitz/bovino, tendamistat, un dominio inhibidor de serina proteasa de tipo Kazal, un dominio de Trefoil (tipo P), un dominio de factor de von Willebrand tipo C, un dominio similar a anafilatoxina, un dominio CUB, una repetición de tipo I de tiroglobulina, dominio de clase A del receptor de LDL, dominio Sushi, dominio Link, un dominio de trombospondina tipo I, un dominio de inmunoglobulina o un dominio similar a inmunoglobulina (por ejemplo, anticuerpos de dominio o anticuerpos de cadena pesada de camello), un dominio de lectina de tipo C, un dominio de MAM, un dominio de tipo A de factor de von Willebrand, un dominio de Somatomedina B, un dominio de núcleo de cuatro disulfuros de tipo WAP, un dominio tipo C de F5/8, un dominio de hemopexina, un dominio SH2, un dominio SH3, un dominio dimilar a EGF de tipo laminina, un dominio C2, “Kappacuerpos” (cf. Ill. et al., Protein Eng (1997) 10, 949-57, un llamado "minicuerpo" (Martin et al., EMBO J (1994) 13, 5303-5309), un diacuerpo (cf. Holliger et al., PnAS uSa (1993)90, 6444-6448), un llamado "Janusis” (cf. Traunecker et al., eMbO J (1991) 10, 3655-3659, o Traunecker et al., Int J Cáncer (1992) Suppl 7, 51-52), un nanocuerpo, un microcuerpo, una affilina, un aficuerpo, una knottin, ubiquitin, una proteína con dedos de zinc, una proteína autofluorescente o una proteína de repetición rica en leucina. Un ejemplo de una molécula de ácido nucleico con funciones similares a las de un anticuerpo es un aptámero. Un aptámero se pliega en un motivo tridimensional definido y muestra una alta afinidad por una estructura objetivo dada.
Pasando ahora al reactivo de multimerización, los sitios de unión Z1 y Z2 del agente de multimerización pueden ser idénticos (ver también el Ejemplo de la Fig. 3). En este caso, puede usarse un único agente de multimerización.
En la caso en el que se usa un primer agente de unión reversible y, opcionalmente, un segundo agente, el reactivo de multimerización puede inmovilizarse sobre una superficie sólida. Puede usarse cualquier superficie sólida (soporte) para la inmovilización del reactivo de multimerización. Los ejemplos ilustrativos de superficies sólidas en las que puede inmovilizarse el reactivo de multimerización incluyen una perla magnética, una perla polimérica, una placa de cultivo celular, una placa de microtitulación, una membrana o una fibra hueca. Las fibras huecas se usan, por ejemplo, como biorreactor en el sistema de expansión celular Quantum®, disponible de TerumoBCT Inc. (Lakewood, CO, USA). El reactivo de multimerización habitualmente se une covalentemente al soporte sólido, sin embargo, también pueden usarse interacciones no covalentes para la inmovilización, por ejemplo, sobre sustratos plásticos, si se desea. Como también se explica con más detalle a continuación, el reactivo de multimerización puede ser, por ejemplo, una muteína de estreptavidina o avidina que se une reversiblemente a un péptido de unión a estreptavidina. Tales muteínas de estreptavidina pueden unirse covalentemente a cualquier superficie, por ejemplo, resina (perlas) usada para la purificación por cromatografía y están disponibles comercialmente en dicha forma de IBA GmbH, Gottingen, por ejemplo, como Strep-Tactin® Sepharose, Strep-Tactin® Superflow®, Strep-Tactin® Superflow® de alta capacidad o Strep-Tactin® MacroPrep®. Otros ejemplos ilustrativos de reactivos de multimerización que están fácilmente disponibles comercialmente son las resinas de cromatografía de afinidad de metales inmovilizados (IMAC) como las resinas TALON® (Westburg, Leusden, Países Bajos) que pueden usarse para la inmovilización reversible de proteínas marcadas con oligohistidina (marcadas con his) en general, lo que significa aquí, para la unión reversible de un primer o segundo agente que lleva como primer compañero de unión C1 o segundo compañero de unión C2 una etiqueta de oligohistidina como una etiqueta de penta- o hexa-histidina. Otros ejemplos de reactivos de multimerización son calmodulina sefarosa disponible de GE Life Sciences que puede usarse junto con un primer o segundo agente que comprende un péptido de unión a calmodulina como compañero de unión C1 o C2 o sefarosa, al que se acopla glutatión. En el caso, el compañero de unión C1 o C2 es glutatión-S-transferasa.
En otros casos del método de la divulgación, el reactivo de multimerización puede estar en forma soluble. En principio, pueden usarse los mismos agentes de multimerización que en el caso de un reactivo de multimerización que se inmoviliza sobre un soporte sólido. El reactivo de multimerización de forma soluble, puede ser, por ejemplo, un oligómero de muteína de estreptavidina, un oligómero de calmodulina, un compuesto (oligómero) que proporciona por lo menos dos grupos quelantes K, en donde los por lo menos dos grupos quelantes son capaces de unirse a un ion de metal de transición, haciendo de este modo que la fracción A sea capaz de unirse a una etiqueta de afinidad de oligohistidina, glutatión-S-transferasa multimérica o una proteína portadora biotinilada.
Como se ha explicado anteriormente, el primer y el segundo agente tienen, además del sitio de unión que es capaz de unirse a la molécula receptora de la superficie celular respectiva, un compañero de unión C1 o C2 (al que se hará referencia como "compañero de unión C" en lo sucesivo para facilitar la referencia). Este compañero de unión C es capaz de unirse a un sitio de unión Z del reactivo de multimerización (Z significa o sitio de unión Z1 o sitio de unión Z2 del reactivo de multimerización) C. El enlace no covalente que se forma entre el compañero de unión C que está incluido en el primer o segundo agente y el sitio o sitios de unión Z del reactivo de multimerización puede ser de cualquier potencia y afinidad deseadas, siempre que pueda interrumpirse o sea reversible en las condiciones bajo las cuales en las que se realiza el método de la divulgación. La constante de disociación (Kd) de la unión entre el compañero de unión C que está incluido en el reactivo de unión al receptor y el sitio de unión Z del reactivo de multimerización puede tener un valor en el intervalo de aproximadamente 10-2 M a aproximadamente 10-13 M. Por tanto, esta unión reversible puede, por ejemplo, tener una Kd de aproximadamente 10-2 M a aproximadamente 10-13 M, o de aproximadamente 10-3 M a aproximadamente 10-12 M o de aproximadamente 10-4 M a aproximadamente 10­ 11 M, o de aproximadamente 10-5 M a aproximadamente 10-10 M. La Kd de este enlace, así como la constante de Kd, koff y kon del enlace formado entre el sitio de unión B del reactivo de unión al receptor y la molécula receptora puede determinarse mediante cualquier medio adecuado, por ejemplo, mediante titulación por fluorescencia, diálisis de equilibrio o resonancia de plasmón superficial. El reactivo de unión a la molécula receptora puede incluir por lo menos uno, incluyendo dos, tres o más, segundos compañeros de unión C y el reactivo de afinidad puede incluir por lo menos dos, como tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o más sitios de unión para el compañero de unión que se incluye en el reactivo de unión de la molécula receptora. Como se describe en la Patente de Estados Unidos 7.776.562, la Patente de Estados Unidos 8.298.782 o la Solicitud de Patente Internacional WO 2002/054065 puede elegirse cualquier combinación de un compañero de unión C y un agente de afinidad con uno o más sitios de unión Z correspondientes, siempre que el compañero de unión C y el sitio de unión Z del agente de afinidad sean capaces de unirse reversiblemente o multimerizar en un complejo (multivalente), que típicamente va acompañado de un efecto de avidez.
El compañero de unión incluido en el primer o segundo agente puede ser un oligopéptido, un polipéptido, una proteína, un ácido nucleico, un lípido, un sacárido, un oligosacárido o un polisacárido. Tal compañero de unión tiene una afinidad más alta por el sitio de unión del reactivo de multimerización que por otras materias. Los ejemplos de un compañero de unión respectivo incluyen, pero no se limitan a, una molécula de inmunoglobulina, un fragmento de la misma y una molécula de unión proteica con funciones similares a anticuerpos.
En algunos casos, el compañero de unión C que se incluye en el primer o segundo agente incluye biotina y el reactivo de afinidad incluye un análogo de estreptavidina o un análogo de avidina que se une reversiblemente a biotina.
En algunos casos, el compañero de unión C que se incluye en el primer o segundo agente incluye un análogo de biotina que se une reversiblemente a estreptavidina o avidina, y el reactivo de afinidad incluye estreptavidina, avidina, un análogo de estreptavidina o un análogo de avidina que se une reversiblemente al análogo de biotina respectivo.
En algunos casos adicionales, el compañero de unión C que se incluye en el primer o segundo agente incluye un péptido de unión a estreptavidina o a avidina y el reactivo de afinidad incluye estreptavidina, avidina, un análogo de estreptavidina o un análogo de avidina que se une reversiblemente al péptido de unión a estreptavidina o avidina respectivo.
En algunos casos, el compañero de unión que se incluye en el primer o segundo agente puede incluir un péptido de unión a estreptavidina Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 01) y el reactivo de afinidad puede incluir una muteína de estreptavidina (análogo) que comprende la secuencia de aminoácidos Val44-Thr45-Ala46-Arg47 (SEQ ID NO: 02) en las posiciones de secuencia 44 a 47 de la estreptavidina de tipo salvaje o la muteína de estreptavidina (análogo) que comprende la secuencia de aminoácidos Ile44-Gly45-Ala46-Arg47(SEQ ID NO: 03) en ls posiciones de secuencias 44 a 47 de estreptavidina de tipo salvaje, ambas descritas en la Patente de Estados Unidos 6.103.493, por ejemplo, y están comercialmente disponibles con la marca comercial Strep-Tactin®. Los péptidos de unión a estreptavidina podrían ser, por ejemplo, péptidos individuales como el "Strep-tag®" descrito en la Patente de Estados Unidos 5.506.121, por ejemplo, o péptidos de unión a estreptavidina que tienen una disposición secuencial de dos o más módulos de unión individuales como se describe en la Publicación de Patente Internacional WO 02/077018 o la Patente de Estados Unidos 7.981.632.
En algún caso, el compañero de unión C del primer o segundo agente incluye una fracción conocida por el experto en la técnica como una etiqueta de afinidad. En tal caso, el reactivo de afinidad incluye un compañero de unión correspondiente, por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo, que se sabe que se une a la etiqueta de afinidad. Como algunos ejemplos ilustrativos de etiquetas de afinidad conocidas, el compañero de unión que se incluye en el primer o segundo agente puede incluir una oligohistidina, un dominio de inmunoglobulina, proteína de unión a maltosa, glutatión-S-transferasa (GST), proteína de unión a quitina (CBP) o tiorredoxina, péptido de unión a calmodulina (CBP), péptido FLAG', la etiqueta HA (secuencia: Tyr-Pro-Tyr-Asp-Val-Pro-Asp-Tyr-Ala, (SEQ ID NO: 11)), la etiqueta VsV-G (secuencia: Tyr-Thr-Asp-Ile-Glu-Met-Asn-Arg-Leu-Gly-Lys, (SEQ ID NO: 12)), la etiqueta HSV (secuencia: Gln-Pro-Glu-Leu-Ala-Pro-Glu-Asp-Pro-Glu-Asp, (SEQ ID NO: 13)), el epítopo T7 (Ala-Ser-Met-Thr-Gly-Gly-Gln-Gln -Met-Gly, (SEQ ID NO: 14)), proteína de unión a maltosa (MBP), el epítopo de HSV de la secuencia Gln-Pro-Glu-Leu-Ala-Pro-Glu-Asp-Pro-Glu-Asp (SEQ ID NO: 13) de la glicoproteína D del virus del herpes simple, el epítopo "myc" del factor de transcripción c-myc de la secuencia Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu (SeQ ID NO: 15), la etiqueta V5 (secuencia: Gly-Lys-Pro-Ile-Pro-Asn-Pro-Leu-Leu-Gly-Leu-Asp-Ser-Thr, SEQ ID NO: 16), o glutatión-S -transferasa (GST). En tal caso, el complejo formado entre el uno o más sitios de unión del reactivo de multimerización, en este caso un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, y el antígeno puede interrumpirse competitivamente añadiendo el antígeno libre, es decir el péptido libre (etiqueta de epítopo) o la proteína libre (como MBP o CBP). La etiqueta de afinidad también podría ser una etiqueta de oligonucleótidos. Tal etiqueta de oligonucleótidos puede usarse, por ejemplo, para hibridar con un oligonucleótido con una secuencia complementaria, enlazada o incluida en el reactivo de afinidad.
En algunos casos, la unión entre el compañero de unión C que está incluido en el primer o segundo agente y uno o más sitios de unión del reactivo de multimerización se produce en presencia de un catión divalente, trivalente o tetravalente. A este respecto, en algunos casos, el reactivo de multimerización incluye un catión divalente, trivalente o tetravalente, típicamente mantenido, por ejemplo, formando complejo, por medio de un quelante adecuado. El compañero de unión que se incluye en el reactivo de unión al receptor puede incluir en tal caso una fracción que incluye, por ejemplo, complejos, un catión divalente, trivalente o tetravalente. Los ejemplos de un quelante de metales respectivo incluyen, pero no se limitan a, etilendiamina, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido etilenglicol tetraacético (EGTA), ácido dietilentriaminapentaacético (DTPA), N,N-bis(carboximetil)glicina (también llamado ácido nitrilotriacético, NTA) o ácido 1,2-bis(o-amino-fenoxi)etano-N,N,N',N'-tetraacético (BAPTA). Como ejemplo, el EDTA forma un complejo con la mayoría de los iones metálicos monovalentes, divalentes, trivalentes y tetravalentes, como por ejemplo calcio (Ca2+), manganeso (Mn2+), cobre (Cu2+), hierro (Fe2+), cobalto (Co3+) y circonio (Zr4+), mientras que el BAPTA es específico para el Ca2+. Como ejemplo ilustrativo, un método estándar usado en la técnica es la formación de un complejo entre una etiqueta de oligohistidina e iones de cobre (Cu2+), níquel (Ni2+), cobalto (Co2+) o zinc (Zn2+), que se presentan mediante el quelante ácido nitrilotriacético (NTA).
En algunos casos, el compañero de unión C que se incluye en el primer o segundo agente incluye un péptido de unión a calmodulina y el reactivo de afinidad incluye calmodulina multimérica como se describe en la Patente de Estados Unidos 5.985.658 o como se describe en la presente con referencia a la Figura 2, por ejemplo. En algunos casos, el compañero de unión C que se incluye en el primer o el segundo agente incluye un péptido FLAG y el reactivo de afinidad incluye un anticuerpo que se une al péptido FLAG, por ejemplo, el péptido FLAG, que se une al anticuerpo monoclonal 4E11 como se describe en la Patente de Estados Unidos 4.851.341. En un caso, el compañero de unión C que se incluye en el primer o el segundo agente incluye una etiqueta de oligohistidina y el reactivo de afinidad incluye un anticuerpo o un ion de metal de transición que se une a la etiqueta de oligohistidina. La interrupción de todos estos complejos de unión puede lograrse mediante quelación de iones metálicos, por ejemplo, quelación de calcio, por ejemplo, añadiendo EDTA o EGTA (supra). La calmodulina, los anticuerpos como 4E11 o los iones metálicos quelados o los quelantes libres pueden multimerizarse mediante métodos convencionales, por ejemplo mediante biotinilación y formación de complejos con estreptavidina o avidina o multímeros de los mismos o mediante la introducción de residuos de carboxilo en un polisacárido, por ejemplo, dextrano, esencialmente como se describe en Noguchi, A, et al. Bioconjugate Chemistry (1992) 3, 132-137 en un primer paso y enlazando calmodulina o anticuerpos o iones metálicos quelados o quelantes libres a través de grupos amino primarios a los grupos carboxilo en la estructura principal de polisacárido, por ejemplo, dextrano, usando química de carbodiimida convencional en un segundo paso. En tales casos, la unión entre el compañero de unión C que está incluido en el primer o segundo agente y uno o más sitios de unión Z del reactivo de multimerización puede interrumpirse por quelación de iones metálicos. La quelación de metales puede conseguirse, por ejemplo, mediante la adición de Eg tA o EDTA.
En algunos casos, en particular, si el reactivo de multimerización está en forma soluble y se basa en estreptavidina o avidina, es un oligómero o un polímero de estreptavidina o avidina o de cualquier muteína (análogo) de estreptavidina o avidina. El sitio de unión Z es la unión de biotina natural de avidina o estreptavidina. El oligómero o polímero respectivo puede estar reticulado por un polisacárido. En un caso, los oligómeros o polímeros de estreptavidina o de avidina o de muteínas (análogos) de estreptavidina o de avidina se preparan mediante la introducción de residuos de carboxilo en un polisacárido, por ejemplo dextrano, esencialmente como se describe en Noguchi, A, et al., Bioconjugate. Chemistry (1992) 3,132-137 en un primer paso. Luego, la estreptavidina o avidina o análogos de las mismas pueden enlazarse mediante grupos amino primarios del residuo de lisina interno y/o el extremo N-terminal libre a los grupos carboxilo en la estructura principal de dextrano usando química de carbodiimida convencional en un segundo paso. Además, también pueden obtenerse oligómeros o polímeros reticulados de estreptavidina o avidina o de cualquier muteína (análogo) de estreptavidina o avidina reticulando moléculas de estreptavidina o avidina individuales (al homodímero tetramérico de estreptavidina o avidina se hace referencia en la presente como una "molécula individual” o el bloque de construcción más pequeño de un oligómero o polímero respectivo) a través de moléculas bifuncionales, que sirven como conector, como glutardialdehído o por otros métodos descritos en la técnica. Es posible, por ejemplo, generar oligómeros de muteínas de estreptavidina introduciendo, en un primer paso, grupos tiol en la muteína de estreptavidina (esto puede realizarse, por ejemplo, mediante reacción de 2-iminotiolan de muteína de estreptavidina (reactivo de Trauts) y activando, en un grupo amino de reacción separada disponible en la muteína de estreptavidina. Esta activación de los grupos amino puede lograrse mediante reacción de la muteína de estreptavidina con un reticulador heterobifuncional comercialmente disponible como sulfosuccinimidil 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato (sulfo SMCC) o Succinimidil-6-[(pmaleimidopropionamido)hexanoato (SMPH). En un segundo paso, los dos productos de la reacción obtenidos de este modo se mezclan entre sí, llevando a la reacción de los grupos tiol contenidos en el lote uno de muteína de estreptavidina modificada con los aminoácidos activados (por funciones de maleimida) del otro lote de la muteína de estreptavidina modificada. Mediante esta reacción, se forman multímeros/oligómeros de la muteína de estreptavidina. Estos oligómeros pueden tener cualquier número adecuado de "molécula individual" o “bloque de construcción de estreptavidina" superior a 3 y el grado de oligomerización puede variardr de acuerdo con las condiciones de reacción (ver Fig. 24). Después de hacer reaccionar estos dos lotes de la muteína de estreptavidina modificada, el reactivo de multimerización soluble oligmérico se aísla típicamente mediante cromatografía de exclusión por tamaño y puede usarse cualquier fracción deseada como reactivo de multimerización. Típicamente, los oligómeros no tienen (y no necesitan tener) un solo peso molecular, pero habitualmente observan una distribución de peso estadística como la distribución gaussiana. Puede usarse cualquier oligómero con más de tres homotetrámeros de estreptavidina (bloques de construcción; (n>3)) como reactivo de multimerización soluble. Los oligómeros podrían tener, por ejemplo, de 3 a 25 homotetrámeros de muteína de steptavidina. Con un peso molecular de aproximadamente 50 kDa para las muteínas de estreptavidina como la muteína “m1” o “m2” descritas con más detalle a continuación, estos oligómeros solubles tienen un peso molecular de aproximadamente 150 kDa a aproximadamente 1250 kDa. Como cada molécula/muteína de estreptavidina tiene cuatro sitios de unión de biotina tal reactivo de multimerización proporciona de 12 a 100 sitios de unión Z1 (y Z2) como se describe en la presente.
De acuerdo con la divulgación anterior, además de tales reactivos de multimerización oligoméricos que solo contienen homotetrámeros de estreptavidina reticulados, es posible hacer reaccionar muteínas de estreptavidina tetraméricas con un portador para obtener los reactivos de multimerización que se usan en la presente divulgación. Además de la reacción descrita anteriormente con un polisacárido, también es posible usar proteínas fisiológica o farmacéuticamente aceptables como la albúmina de suero (por ejemplo, albúmina de suero humano (HSA) o albúmina de suero bovino (BSA) como proteína portadora. En tal caso, la muteína de estreptavidina (ya sea como homo-tetrámero individual o también en forma de oligómeros con n>3) puede acoplarse a la proteína portadora mediante interacción no covalente. Para este propósitos, la BSA biotinilada (que está disponible comercialmente de varios proveedores como ThermoFisher Scientific, Sigma Aldrich o Vectorlabs, por nombrar unos pocos) puede hacerse reaccionar con la muteína de estreptavidina. Al hacerlo, algunos de los oligómeros de estreptavidina se unirán de manera no covalente a través de uno o más sitios de unión de biotina (Z1, Z2) a la proteína portadora biotinilada, dejando la mayoría de los sitios de unión (Z1, Z2) del oligómero disponibles para la unión de los agentes como el primer agente y opcionalmente el segundo agente y cualquier agente adicional como se describe en la presente. Por tanto, mediante un enfoque de este tipo, puede prepararse convenientemente un reactivo de multimerización soluble con una multitud de sitios de unión Z1 (ver la Fig. 24). Alternativamente, una muteína de estreptavidina (ya sea como homo-tetrámero individual o también en forma de oligómeros con n 3) puede acoplarse covalentemente a un portador sintético como una molécula de polietilenglicol (PEG). Puede usarse cualquier molécula de PEG adecuada para este propósito, siempre que la molécula de PEG y el reactivo de multimerización respectivo sean solubles. Típicamente, las moléculas de PEG hasta un peso molecular de 1000 Da son todas solubles en agua o en los medios de cultivo que pueden usarse en la presente divulgación. Tal reactivo de multimerización basado en PEG puede prepararse fácilmente usando moléculas de PEG activadas disponibles comercialmente (por ejemplo, derivados de PEG-NHS disponibles de NOF North America Corporation, Irvine, California, USA, o derivados de PEG activados disponibles de Creative PEGWorks, Chape1Hills, North Carolina, USA) con grupos amino de la muteína de estreptavidina.
Bajo estreptavidina o estreptavidina de tipo salvaje (estreptavidina wt), se hace referencia a la secuencia de aminoácidos divulgada por Argarana et al., Nucleic Acids Res. 14 (1986) 1871-1882. Las muteínas de estreptavidina son polipéptidos que se distinguen de la secuencia de estreptavidina de tipo salvaje por una o más sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos y que retienen las propiedades de unión de la estreptavidina wt. Los polipéptidos similares a estreptavidina y las muteínas de estreptavidina son polipéptidos que son esencialmente inmunológicamente equivalentes a la estreptavidina de tipo salvaje y son capaces en particular de unirse a biotina, derivado de biotina o análogos de biotina con la misma o diferente afinidad que la estreptavidina wt. Los polipéptidos similares a estreptavidina o las muteínas de estreptavidina pueden contener aminoácidos que no forman parte de la estreptavidina de tipo salvaje o pueden incluir solo una parte de la estreptavidina de tipo salvaje. Los polipéptidos similares a estreptavidina también son polipéptidos que no son idénticos a la estreptavidina de tipo salvaje, ya que el huésped no tiene las enzimas necesarias para transformar el polipéptido producido por el huésped en la estructura de estreptavidina de tipo salvaje. El término "estreptavidina" también incluye tetrámeros de estreptavidina y dímeros de estreptavidina, en particular homotetrámeros de estreptavidina, homodímeros de estreptavidina, heterotetrámeros de estreptavidina y heterodímeros de estreptavidina. Cada subunidad tiene normalmente un sitio de unión para la biotina o análogos de biotina o para péptidos de unión a estreptavidina. Ejemplos de estreptavidinas o muteínas de estreptavidina se mencionan, por ejemplo, en la WO 86/02077, DE 19641876 A1, US 6.022.951, WO 98/40396 o WO 96/24606.
En un caso preferido, las muteínas de estreptavidina que se usan como reactivo de multimerización son las muteínas de estreptavidina que se describen en la Patente de Estados Unidos 6.103.493 y también en la DE 19641 876.3. Estas muteínas de estreptavidina tienen por lo menos una mutación dentro de la región de las posiciones de aminoácidos 44 a 53, en base a la secuencia de aminoácidos de la estreptavidina de tipo salvaje. Se da preferencia a las muteínas de una estreptavidina mínima, que comienzan N-terminalmente en la región de los aminoácidos 10 a 16 de la estreptavidina de tipo salvaje y terminan C-terminalmente en la región de los aminoácidos 133 a 142 de la estreptavidina de tipo salvaje. Los ejemplos de tales muteínas de estreptavidina preferidas tienen un aminoácido alifático hidrófobo en lugar de Glu en la posición 44, cualquier aminoácido en la posición 45, un aminoácido alifático hidrófobo en la posición 46 o/y un aminoácido básico en lugar de Val en la posición 47. La muteína de estreptavidina puede ser una muteína que comprende la secuencia de aminoácidos Val44-Thr45-Ala46-Arg47 (SEQ ID NO: 02) en las posiciones de secuencias 44 a 47 o la muteína de estreptavidina (análogo) que comprende la secuencia de aminoácidos Ile44-Gly45-Ala46-Arg47 (SEQ ID NO: 03) en las posiciones de secuencia 44 a 47 de estreptavidina de tipo salvaje. Tales muteínas se describen en la Patente de Estados Unidos 6.103.493, por ejemplo, y están comercialmente disponibles de IBA GmbH en forma de muteína “m1” y muteína “m2” bajo la marca comercial Strep-Tactin®.
Un método de acuerdo con la presente divulgación puede usarse en algunos casos para reducir una muestra de reactivos que se han usado previamente en la expansión celular. El primer o segundo agente y el compañero libre respectivo (el agente de competición) pueden estar presentes, por ejemplo, incluidos en el eluido de un método de expansión como se ha descrito anteriormente. Usando un método de acuerdo con la divulgación, tales reactivos pueden ser por lo menos esencialmente, incluyendo completamente, eliminados de una muestra, por ejemplo, de una población celular. Como ejemplo ilustrativo, un primer o segundo agente como se ha definido anteriormente puede reducirse de una muestra a niveles que están por debajo del límite de detección de, por ejemplo, FACS o transferencia Western. Puede haberse usado un reactivo de competición (primer o segundo compañero de unión libre o análogo del mismo) para terminar y controlar la expansión y liberar la población celular del agente de multimerización. Este reactivo de competición puede tener un sitio de unión que es capaz de unirse específicamente al sitio de unión Z del reactivo de afinidad en un "cartucho de extracción" de la WO 2013/124474. En tal caso, el método respectivo de la divulgación también puede servir para reducir el primer y el segundo agente y el reactivo de competición, incluyendo la eliminación de los mismos.
Un método de acuerdo con la presente divulgación puede llevarse a cabo a cualquier temperatura a la que la viabilidad de la población celular no se vea comprometida por lo menos esencialmente. Cuando se hace referencia en la presente a condiciones que son por lo menos esencialmente no dañinas, no perjudiciales o por lo menos que no comprometen esencialmente la viabilidad, se hace referencia a condiciones en las que el porcentaje de la población de células que se va a expandir con plena viabilidad es de por lo menos el 70%, incluyendo por lo menos el 75%, por lo menos el 80%, por lo menos el 85%, por lo menos el 90%, por lo menos el 92%, por lo menos el 95%, por lo menos el 97%, por lo menos el 98%, por lo menos el 99% o por lo menos 99,5%. En algunos casos, un método de acuerdo con la divulgación se lleva a cabo a una temperatura de aproximadamente 20° C o más. Dependiendo de la población de células a expandir, un intervalo de temperatura adecuado puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 20° C a aproximadamente 45° C, incluyendo de aproximadamente 25° C a aproximadamente 40° C, o de aproximadamente 32° C a 37° C. En algunos casos, un método de acuerdo con la divulgación se lleva a cabo a un valor de temperatura constante, o a un valor de temperatura seleccionado ± aproximadamente 5° C, ± aproximadamente 4° C, ± aproximadamente 3° C, ± aproximadamente 2° C, ± aproximadamente 1° C o ± aproximadamente 0,5° C. El experto en la técnica es capaz de determinar empíricamente una temperatura adecuada, teniendo en cuenta la naturaleza de las células y las condiciones de expansión. Típicamente, las células humanas se expanden a una temperatura de 37° C.
En un caso adicional, la divulgación proporciona un método in vitro para expandir una población de células, que comprende poner en contacto una muestra que comprende una población de células con un reactivo de multimerización, en donde el reactivo de multimerización está en una forma soluble y se ha inmovilizado sobre el mismo (unido al mismo) un primer agente que proporciona una señal de activación primaria a las células. El reactivo de multimerización comprende por lo menos un sitio de unión Z1 para la unión del primer agente, en donde el primer agente comprende por lo menos un compañero de unión C1, en donde el compañero de unión C1 es capaz de unirse al sitio de unión Z1 del reactivo de multimerización. El primer agente se une al reactivo de multimerización a través del enlace formado entre el compañero de unión C1 y el sitio de unión Z1, y el primer agente se une a una molécula receptora en la superficie de las células, proporcionando de este modo una señal de activación primaria a las células y activando de este modo las células. Se indica expresamente aquí que cuando se usa un agente de multimerización soluble, el enlace entre la parte de unión C1 y el sitio de unión Z1 no necesita ser reversible.
En un caso de este segundo, el agente de multimerización ha inmovilizado sobre el mismo (unido al mismo) un segundo agente que estimula una molécula accesoria en la superficie de las células, en donde el segundo agente comprende un compañero de unión C2, en donde el compañero de unión C2 es capaz de ser unido a un sitio de unión Z2 del reactivo de multimerización. El segundo agente se une al reactivo de multimerización a través del enlace formado entre el compañero de unión C2 y el sitio de unión Z2, en donde el segundo agente se une a la molécula accesoria en la superficie de la superficie de las células, estimulando de este modo las células activadas.
En un caso de este segundo método, el enlace formado entre el compañero de unión C1 y el sitio de unión Z1 puede ser irreversible y/o también el enlace formado entre el compañero de unión C2 y el sitio de unión Z2 puede ser irreversible.
En un caso diferente de este segundo método, el enlace formado entre el compañero de unión C1 y el sitio de unión Z1 puede ser reversible. Además, el enlace formado entre el compañero de unión C2 y el sitio de unión Z2 puede ser reversible. En este caso, la constante de disociación (Kd) para la unión reversible entre dicho sitio de unión Z1 y dicho compañero de unión C1 y/o para la unión reversible entre dicho sitio de unión Z2 y dicho compañero de unión C2 puede estar en el intervalo de 10'2 M a 10'13 M.
En este segundo método que se basa en un reactivo de multimerización soluble, el primer y el segundo reactivo, así como el reactivo de multimerización y todos los demás reactivos y poblaciones de células pueden usarse por lo demás de la misma manera que se ha divulgado anteriormente para el método que hace uso de reversible entre el primer o segundo agente y el reactivo de multimerización.
La divulgación divulga además un kit de reactivos para expandir una población de células, el kit comprendiendo
(i) un reactivo de multimerización, en donde el reactivo de multimerización comprende por lo menos un sitio de unión Z para la unión reversible de un primer agente,
(ii) un primer agente que se une a una molécula receptora en la superficie de las células, proporcionando de este modo una señal de activación primaria a las células y activando de este modo las células, en donde el primer agente comprende por lo menos un compañero de unión C1, en donde el compañero de unión C1 es capaz de unirse reversiblemente a un sitio de unión Z1 del reactivo de multimerización, en donde el primer agente se une al reactivo de multimerización a través de la unión reversible formada entre el compañero de unión C1 y el sitio de unión Z1, y
(iii) un segundo agente que estimula una molécula accesoria en la superficie de las células, en donde el segundo agente comprende un compañero de unión C2, en donde el compañero de unión C2 es capaz de unirse reversiblemente a un sitio de unión Z2 del reactivo de multimerización, en donde el segundo agente se une al reactivo de multimerización a través del enlace formado entre el compañero de unión C2 y el sitio de unión Z2, en donde el segundo agente se une a la molécula accesoria en la superficie de la superficie de las células, estimulando de este modo las células activadas.
La divulgación también divulga un kit de reactivos para expandir una población de células, el kit comprendiendo
(i) un reactivo de multimerización, en donde el reactivo de multimerización está en forma soluble y comprende por lo menos un sitio de unión Z para la unión reversible de un primer agente,
(ii) un primer agente que se une a una molécula receptora en la superficie de las células, proporcionando de este modo una señal de activación primaria a las células y activando de este modo las células, en donde el primer agente comprende por lo menos un compañero de unión C1, en donde el compañero de unión C1 es capaz de unirse a un sitio de unión Z1 del reactivo de multimerización, en donde el primer agente se une al reactivo de multimerización a través de la unión reversible formada entre el compañero de unión C1 y el sitio de unión Z1.
Este segundo kit de reactivos puede comprender además (iii) un segundo agente que estimula una molécula accesoria en la superficie de las células, en donde el segundo agente comprende un compañero de unión C2, en donde el compañero de unión C2 es capaz de unirse a un sitio de unión Z2 del reactivo de multimerización, en donde el segundo agente se une al reactivo de multimerización a través del enlace formado entre el compañero de unión C2 y el sitio de unión Z2.
Un kit como se divulga en la presente se usa en particular cuando la población de células es una población de linfocitos.
De acuerdo con la divulgación anterior, la divulgación también proporciona nuevos reactivos de multimerización y una nueva composición que comprende reactivos de multimerización que son capaces de expandir una población de células. Dicho reactivo de multimerización que es capaz de expandir una población de células es un reactivo de multimerización que está en forma soluble y comprende por lo menos un sitio de unión Z1 para la unión reversible de un primer agente que proporciona una señal de activación primaria a las células, en donde la el reactivo de multimerización ha inmovilizado reversiblemente sobre el mismo (unido al mismo) dicho primer agente que proporciona una señal de activación primaria a las células; en donde el primer agente comprende por lo menos un compañero de unión C1, en donde el compañero de unión C1 es capaz de unirse reversiblemente al por lo menos un sitio de unión Z1 del reactivo de multimerización, en donde el primer agente se une al reactivo de multimerización a través de la unión reversible formada entre el compañero de unión C1 y el sitio de unión Z1. Cabe señalar aquí que tal agente de multimerización puede haber inmovilizado sobre el mismo cualquiera de los primeros agentes que se describen en la presente.
Un reactivo de multimerización de la divulgación puede comprender además por lo menos un sitio de unión Z2 para la unión reversible de un segundo agente que estimula una molécula accesoria en la superficie de las células, en donde el reactivo de multimerización ha inmovilizado reversiblemente sobre el mismo (unido al mismo) al segundo agente que estimula una molécula accesoria en la superficie de las células, en donde el segundo agente comprende un compañero de unión C2, en donde el compañero de unión C2 es capaz de unirse al por lo menos un sitio de unión Z2 del reactivo de multimerización. En este caso, el segundo agente se une al reactivo de multimerización a través del enlace formado entre el compañero de unión C2 y el sitio de unión Z2.
También de acuerdo con la divulgación proporcionada anteriormente, tal reactivo de multimerización es capaz de expandir una población de linfocitos o una subpoblación contenida en la población de linfocitos. La población de linfocitos que se va a expandir puede ser cualquier población adecuada, por ejemplo, una población de células B, una población de células T o una población de células asesinas naturales. La población de células T puede ser una población de células T específicas de antígeno, una población de células T auxiliares, una célula T citotóxica, una célula T de memoria, una célula T reguladora o una población de células T asesinas naturales. Por consiguiente, en tales casos del reactivo de multimerización, el primer agente es capaz de estimular una señal asociada al complejo TCR/CD3 en las células T. Por tanto, el primer agente presente en el reactivo de multimerización puede ser un reactivo de unión que se una específicamente a CD3, mientras que el segundo agente que se une a la molécula accesoria puede ser un agente de unión que se une específicamente a CD28 o CD137.
En casos del reactivo de multimerización, el primer agente que se une específicamente a CD3 puede ser un anticuerpo anti-CD3, un fragmento de anticuerpo divalente de un anticuerpo anti-CD3, un fragmento de anticuerpo monovalente de un anticuerpo anti-CD3 y/o una molécula de unión a CD3 proteica con propiedades de unión similares a anticuerpos. En estos casos, el segundo agente que se une específicamente a CD28 o CD137 puede ser un anticuerpo anti-CD28, un fragmento de anticuerpo divalente de un anticuerpo anti-CD28, un fragmento de anticuerpo monovalente de un anticuerpo anti-CD28, una molécula de unión a CD28 proteica con propiedades de unión similares a anticuerpos, un anticuerpo anti-CD137, un fragmento de anticuerpo divalente de un anticuerpo anti-CD137, un fragmento de anticuerpo monovalente de un anticuerpo anti-CD137, una molécula de unión a CD137 proteica con propiedades de unión similares a anticuerpos, ligando 4-1BB, y cualquier mezcla de los mismos. Por tanto, un reactivo de multimerización de la divulgación generalmente puede tener inmovilizado sobre el mismo un tipo de primer agente y una mezcla de segundos agentes, por ejemplo, un anticuerpo anti-CD3 como primer agente y por ejemplo, un anticuerpo anti-CD28 y ligando 4-1BB como segundos agentes (juntos).
Si el reactivo de multimerización se va a usar para la expansión de células B, el primer agente inmovilizado en el reactivo de multimerización puede ser un reactivo de unión que se una específicamente a CD40 o CD137. De acuerdo con la divulgación dada en la presente, en tales casos, el primer reactivo de unión que se une específicamente a CD40 o CD137 puede seleccionarse de un anticuerpo anti-CD40, un fragmento de anticuerpo divalente de un anticuerpo anti-CD40, un fragmento de anticuerpo monovalente de un anticuerpo anti-CD40, y una molécula de unión a CD40 proteica con propiedades de unión similares a anticuerpos o un anticuerpo anti-CD137, un fragmento de anticuerpo divalente de un anticuerpo anti-CD137, un fragmento de anticuerpo monovalente de un anticuerpo anti-CD137, una molécula de unión aCD137 proteica con propiedades de unión similares a anticuerpos y ligando de CD40 (CD154).
También de acuerdo con la divulgación general de la presente divulgación, en el reactivo de multimerización como se describe en la presente, los sitios de unión Z1 y Z2 del reactivo de multimerización pueden ser idénticos. Como se ha descrito anteriormente, dicho reactivo de multimerización puede comprender un oligómero o un polímero de estreptavidina, un oligómero o un polímero de avidina, un oligómero o un polímero de un análogo de estreptavidina que se une reversiblemente a biotina, un oligómero o un polímero de un análogo de avidina que se unen reversiblemente a biotina, un reactivo que comprende por lo menos dos grupos quelantes K, en donde los por lo menos dos grupos quelantes son capaces de unirse a un ion de metal de transición, haciendo de este modo que el reactivo sea capaz de unirse a una etiqueta de afinidad de oligohistidina, glutatión-S-transferasa multimérica, calmodulina multimérica y una proteína portadora biotinilada.
Una nueva composición divulgada en la presente que es capaz de expandir una población de células puede comprender
(i) un primer reactivo de multimerización, en donde el primer reactivo de multimerización está en forma soluble y comprende por lo menos un sitio de unión Z1 para la unión reversible de un primer agente que proporciona una señal de activación primaria a las células, en donde el primer reactivo de multimerización tiene reversiblemente inmovilizado sobre el mismo (unido al mismo) dicho primer agente que proporciona una señal de activación primaria a las células, en donde el primer agente comprende por lo menos un compañero de unión C1, en donde el compañero de unión C1 es capaz de unirse reversiblemente al por lo menos un sitio de unión Z1 del reactivo de multimerización, en donde el primer agente se une al reactivo de multimerización a través de la unión reversible formada entre el compañero de unión C1 y el sitio de unión Z1, y
(ii) un segundo reactivo de multimerización, en donde el segundo reactivo de multimerización está en forma soluble y comprende por lo menos un sitio de unión Z2 para la unión reversible de un segundo agente que estimula una molécula accesoria en la superficie de las células, en donde el reactivo de multimerización tiene inmovilizado reversiblemente sobre el mismo (unido al mismo) dicho segundo agente que estimula una molécula accesoria en la superficie de las células, en donde el segundo agente comprende un compañero de unión C2, en donde el compañero de unión C2 es capaz de unirse al por lo menos un sitio de unión Z2 del reactivo de multimerización, en donde el segundo agente se une al reactivo de multimerización a través del enlace formado entre el compañero de unión C2 y el sitio de unión Z2.
Tal composición novedosa es, por ejemplo, la mezcla de reacción usada en el Ejemplo 13, en la que dos reactivos de multimerización separados se funcionalizaron con un fragmento Fab de aCD3 solo o con un fragmento Fab de aCD28 solo. Se observa en este contexto que en el Ejemplo 13 se demostró que tal composición tiene la misma eficacia de expansión que un único reactivo de multimerización en el que tanto el primer agente como el segundo agente están inmovilizados conjuntamente. Por tanto, el uso combinado de dos o más reactivos de multimerización que se funcionalizan individualmente con un solo tipo de reactivo (por ejemplo, un primer o un segundo agente) es funcionalmente equivalente a usar para la expansión un reactivo de multimerización conjunto que tenga inmovilizado en el mismo un primer agente y un segundo agente. En este contexto, también se observa que un reactivo de multimerización de la presente divulgación puede funcionalizarse con tantos agentes (por ejemplo, uno, dos, tres, cuatro o incluso más agentes) como se pretenda usar para la expansión de una población de células seleccionada. Un tercer o cuarto agente puede, por ejemplo, proporcionar un estímulo para la expansión de una subpoblación de células deseada. Ver en este contexto, por ejemplo, el Ejemplo 13 en el que se funcionalizó reversiblemente un reactivo de multimerización soluble con tres reactivos, concretamente, un fragmento Fab de aCD3 como primer reactivo, un fragmento Fab de aCD28 como segundo reactivo y un fragmento Fab de aCD8 como tercer reactivo para enriquecer el subpoblación de células T CD8+ en una muestra de una población de células T CD3+ (linfocitos). Usando tales combinaciones de agentes que pueden inmovilizarse reversiblemente en el mismo reactivo de multimerización, la presente divulgación permite la posibilidad de expandir preferentemente o enriquecer selectivamente cualquier (sub)población celular deseada a partir de una muestra que, por ejemplo, comprende una variedad de subpoblaciones diferentes. En este contexto, se observa que, sin embargo, también es posible usar para este propósito tres reactivos de multimerización diferentes, por ejemplo, un primer reactivo de multimerización que se funcionaliza solo con un fragmento Fab de aCD3, un segundo reactivo de multimerización que se funcionaliza con un fragmento Fab de aCD28 y un tercer reactivo de multimerización que se funcionaliza con un fragmento Fab de aCD8. De igual manera, es posible usar solo dos reactivos de multimerización diferentes, un primer reactivo de multimerización que se funcionaliza con solo un fragmento Fab de aCD3 y un segundo reactivo de multimerización que se funcionaliza tanto con un fragmento Fab de aCD28 como con un fragmento Fab de aCD8. Por consiguiente, la presente divulgación permite diseñar cualquier tipo de reactivo de expansión deseado de forma modular.
La divulgación también proporciona un método in vitro para expandir en serie una población de linfocitos, en donde la población de linfocitos comprende células T. Este método comprende
poner en contacto una muestra que comprende la población de linfocitos T que comprende las células T con un reactivo de multimerización,
en donde el reactivo de multimerización está en forma soluble y se ha inmovilizado reversiblemente sobre el mismo (i) un primer agente que proporciona una señal de activación primaria a las células T y (ii) un segundo agente que estimula una molécula accesoria en la superficie de las células T,
en donde el reactivo de multimerización comprende por lo menos un sitio de unión Z1 para la unión reversible del primer agente,
en donde el primer agente comprende por lo menos un compañero de unión C1, en donde el compañero de unión C1 es capaz de unirse reversiblemente al sitio de unión Z1 del reactivo de multimerización, en donde el primer agente se une al reactivo de multimerización a través de la unión reversible formada entre el compañero de unión C1 y el sitio de unión Z1,
en donde el reactivo de multimerización comprende por lo menos un sitio de unión Z2 para la unión reversible del segundo agente,
en donde el segundo agente comprende por lo menos un compañero de unión C2, en donde el compañero de unión C2 es capaz de unirse reversiblemente al sitio de unión Z2 del reactivo de multimerización, en donde el primer agente se une al reactivo de multimerización a través de la unión reversible formada entre el compañero de unión C2 y el sitio de unión Z2,
en donde el primer agente se une a una molécula receptora en la superficie de las células T, proporcionando de este modo una señal de activación primaria a las células y activando de este modo las células T,
en donde el segundo agente se une a la molécula accesoria en la superficie de las células T, estimulando de este modo las células activadas, el primer agente y el segundo agente induciendo juntos de este modo la expansión de las células T.
En este método, poner en contacto la muestra que contiene la población de linfocitos que a su vez contiene la población de células T con el reactivo de multimerización soluble que tiene inmovilizado sobre ella el primer y el segundo agente da como resultado la unión específica de las células T al reactivo de multimerización.
La puesta en contacto de la muestra que comprende la población de linfocitos que comprende las células T con el reactivo de multimerización puede llevarse a cabo en un biorreactor como un biorreactor de fibra hueca (por ejemplo, biorreactor de fibra hueca del sistema de expansión celular Quantum®) o un biorreactor de bolsa de plástico (por ejemplo, Cellbag® usado en el sistema de expansión celular Xuri W25 de GE Healthcare).
Este método comprende además poner en contacto la población de linfocitos (mezcla de reacción que contiene las células T unidas al reactivo de multimerización a través del primer agente y el segundo agente) con (i) un primer compañero de unión libre C1 o un análogo del mismo capaz de interrumpir el enlace entre el primer compañero de unión C1 y el sitio de unión Z1 y (ii) un segundo compañero de unión libre C2 o un análogo del mismo, capaz de interrumpir el enlace entre el segundo compañero de unión C2 y el sitio de unión Z2. De esta manera, se interrumpe la unión reversible entre dicho compañero de unión C1 del primer agente y dichos sitios de unión Z1, así como la unión reversible entre dicho compañero de unión C2 del segundo agente y dicho sitio de unión Z2 de dicho reactivo de multimerización, liberando de este modo en un eluido de células T unidas al reactivo de multimerización a través del primer agente y el segundo agente y deteniendo la expansión de las células T.
En este método, el eluido (la mezcla de reacción en la que la reacción de expansión se ha terminado mediante la adición del primer compañero o compañeros libres o análogo o análogos del mismo) que contiene la población de células T expandidas puede exponerse a cromatografía en una fase estacionaria (primera) adecuada. La (primera) fase estacionaria puede ser una matriz de filtración en gel y/o una matriz de cromatografía de afinidad como se describe en la Solicitud de patente internacional WO 2013/124474. Esta matriz de filtración en gel y/o de cromatografía de afinidad comprende un reactivo de afinidad, en donde el reactivo de afinidad comprende un sitio de unión Z1 y/o Z2 que se une específicamente al compañero de unión C1 y/o C2 comprendido en el primer agente o el segundo agente. De este modo, el primer agente, el segundo agente, el primer compañero de unión C1 y/o el segundo compañero de unión libre C2 se inmovilizan en la fase estacionaria. En este método, la primera fase estacionaria está conectada de manera fluida al biorreactor.
En uno de los casos de esta expansión en serie, los sitios de unión Z1 y Z2 del agente de multimerización son idénticos. Además, puede usarse un único agente de multimerización. Cuando se usa un agente de multimerización soluble, la población de células T (o la población de células expandida en general) se separa del reactivo de multimerización soluble. La separación/eliminación podría llevarse a cabo usando una segunda fase estacionaria. Para este propósito, se expone una mezcla que comprende las células T y el reactivo de multimerización soluble, antes o después de su aplicación sobre la primera fase estacionaria descrita anteriormente, a cromatografía en una segunda fase estacionaria adecuada. Esta fase estacionaria secundaria puede ser una matriz de filtración en gel y/o una matriz de cromatografía de afinidad, en donde la matriz de filtración en gel y/o de cromatografía de afinidad comprende un reactivo de afinidad. El reactivo de afinidad comprendido en la resina de cromatografía incluye un compañero de unión D que se une (específicamente) al sitio de unión Z1 y/o al sitio de unión Z2, si está presente, del reactivo de multimerización, inmovilizando de este modo el reactivo de multimerización en la fase estacionaria. Si se usa un agente de multimerización basado en estreptavidina y tanto el primer como el segundo agente tienen un péptido de unión a estreptavidina como compañero de unión C1 o C2, el compañero de unión D que está comprendido en el reactivo de afinidad de esta segunda fase estacionaria puede ser biotina. El oligómero soluble de estreptavidina o de una muteína de estreptavidina que se usa como agente de multimerización se une entonces a la biotina que habitualmente se acopla de manera covalente a una matriz de cromatografía como biotina-sefarosa™ que está disponible comercialmente.
En este método de expansión en serie, el primer agente puede estimular una señal asociada al complejo TCR/CD3 en las células T y, por tanto, el primer agente puede ser por tanto un reactivo de unión que se une específicamente a CD3. Además, la molécula accesoria de la célula T puede ser CD28. En este caso, el segundo agente que se une a la molécula accesoria es un reactivo de unión que se une específicamente a CD28.
En este método de expansión en serie, las células T pueden transfectarse durante o después de la expansión, por ejemplo, con un receptor de células T (TCR) o un receptor de antígeno quimérico (CAR, también conocido como receptor de células T artificial). Esta transfección para la introducción del gen del receptor deseado puede llevarse a cabo con cualquier vector retroviral adecuado, por ejemplo. Luego, la población de células modificadas genéticamente puede liberarse del estímulo inicial (el estímulo de CD3/CD28, por ejemplo) y posteriormente estimularse con un segundo tipo de estímulo, por ejemplo, a través del receptor introducido de novo). Este segundo tipo de estímulo puede comprender un estímulo antigénico en forma de péptido/molécula MHC, el ligando cognado (reticulación) del receptor introducido genéticamente (por ejemplo ligando natural de un CAR) o cualquier ligando (como un anticuerpo) que se una directamente dentro del marco del nuevo receptor (por ejemplo, reconociendo las regiones constantes dentro del receptor). Consultar. a este respecto, Cheadle et al, "Chimeric antigen receptors for T-cell based therapy" Methods Mol Biol. 2012; 907:645-66 o Barrett et al., Chimeric Antigen Receptor Therapy for Cancer Annual Review of Medicine Vol. 65: 333-347 (2014).
En este método, la población de linfocitos que comprende células T puede ser una población de células mononucleadas de sangre periférica (PBMC) o una población de células T enriquecidas o purificadas. La población de linfocitos puede, por ejemplo, derivarse de sangre completa o de un producto de aféresis no movilizado o de una preparación de tejido congelado.
En este método de expansión en serie que se basa en un reactivo de multimerización soluble, el primer y segundo reactivos, así como el reactivo de multimerización y todos los otros reactivos y poblaciones de células pueden usar sede la misma manera que se ha divulgado anteriormente para el método que hace uso de reversibilidad entre el primer o segundo agente y el reactivo de multimerización.
La divulgación se dirige además a una disposición de un biorreactor y una primera fase estacionaria para cromatografía. El biorreactor es adecuado para la expansión celular y la fase estacionaria es adecuada para la separación celular y la eliminación de reactivos. La primera fase estacionaria es una matriz de filtración en gel y/o una matriz de cromatografía de afinidad, en donde la matriz de filtración en gel y/o de cromatografía de afinidad comprende un reactivo de afinidad, en donde el reactivo de afinidad comprende un sitio de unión Z1 que se une específicamente a un compañero de unión C1 comprendido en un el primer agente y/o el reactivo de afinidad comprende un sitio de unión Z2 que se une específicamente a un compañero de unión C2 comprendido en un segundo agente. La primera fase estacionaria es, de este modo, adecuada para inmovilizar sobre ella el primer agente y/o el segundo agente, el primer compañero de unión C1 y/o el segundo compañero de unión libre C2. Además, el biorreactor y la fase estacionaria están conectados de manera fluida. Esta disposición puede usarse en la expansión en serie como se ha explicado anteriormente y puede integrarse en sistemas de expansión celular conocidos como el sistema de expansión celular Quantum® o el sistema de expansión celular Xuri W25.
En esta disposición, la primera fase estacionaria está comprendida o en una columna de cromatografía o es una fase estacionaria plana. La disposición puede comprender además una segunda fase estacionaria que está conectada de manera fluida con la primera fase estacionaria. La fase estacionaria secundaria puede ser una matriz de filtración en gel y/o una matriz de cromatografía de afinidad, en donde la matriz de filtración en gel y/o de cromatografía de afinidad comprende un reactivo de afinidad. Este reactivo de afinidad puede comprender un compañero de unión D que se une (específicamente) al sitio de unión Z1 del reactivo de multimerización, por lo que es adecuado para inmovilizar el reactivo de multimerización en la fase estacionaria.
La divulgación se dirige además a un aparato para la purificación y expansión de una población de células, el aparato comprendiendo por lo menos una disposición de un biorreactor y una primera fase estacionaria o una segunda fase estacionaria para cromatografía como se ha definido anteriormente.
El aparato puede comprender además una pluralidad de disposiciones de un biorreactor y una fase estacionaria que están conectados de manera fluida en serie.
El aparato puede comprender una entrada de muestra que está conectada de manera fluida con el biorreactor de la disposición de un biorreactor y la fase estacionaria para cromatografía. El aparato también puede comprender una salida de muestra para células objetivo purificadas y expandidas, la salida de muestra estando conectada de manera fluida a la fase estacionaria de la última de por lo menos una disposición de un biorreactor y la fase estacionaria para cromatografía.
Finalmente, el aparato puede diseñarse como un sistema funcionalmente cerrado.
Como apreciará fácilmente un experto en la técnica a partir de la divulgación de la presente divulgación, también puede utilizarse de acuerdo con la presente divulgación otras composiciones de materiales, medios, usos, métodos o etapas, que existen actualmente o que se desarrollarán posteriormente, que realizan sustancialmente la misma función o logran sustancialmente los mismos resultados que las casos ejemplares correspondientes descritos en la presente.
Ejemplos experimentales
Ejemplo 1: Estimulación/expansión de células T CD3+ respondedoras con fragmentos Fab de aCD3/aCD28 que fueron inmovilizados reversiblemente en perlas recubiertas con la muteína de estreptavidina Streptactin®
Se marcaron 300.000 células respondedoras T CD3+CD62L- (Tresp, aisladas por enriquecimiento magnético en serie de un producto de aféresis de donante no movilizado) con CFSE 3 pM y se estimularon con 5 pl de una preparación de 15 pl de perlas de Streptactin® (10 mg de partículas magnéticas/ml, cargadas con 35 pg de Streptactin®/mg de perlas) o se cargarons con 0,5 pg de fragmento Fab de aCD3 solo, 0,5 pg de fragmento Fab de aCD28 solo o una mezcla de 0,5 pg de fragmento Fab de aCD3 y 0,5 pg de Fab de aCD28.
El fragmento Fab de aCD3 usado se derivó del anticuerpo monoclonal de unión a CD3 producido por la línea celular de hibridoma OKT3. La línea celular de hibridoma OKT3 y el anticuerpo de OKT3 se describen en la Patente de Estados Unidos 4.361.549, la línea celular se ha depositado con el número de acceso ATCC® CRL-8001™). El Fab de CD28 usado se derivó del anticuerpo monoclonal anti-CD28 humano CD28.3 (Vanhove et al, BLOOD, 15 de julio de 2003, Vol. 102, N° 2, páginas 564-570). La secuencia de nucleótidos de los dominios variables de este anticuerpo CD28.3 se ha depositado en GenBank en forma de un anticuerpo anti-CD28 humano de constructo Fv sintético de cadena sencilla scFv28.3 con el número de registro de GenBank AF451974.1).
Ambos fragmentos Fab se produjeron recombinantente en E. coli como se describe en las solicitudes de patente internacional WO2013/011011 y Wo 2013/124474 que llevan como dominios constantes (CH1 y Ckappa) una secuencia consenso de IgG1. La cadena pesada de ambos fragmentos Fab se fusionó en el extremo erminal carboxi con una disposición secuencial de dos módulos de unión a estreptavidina (SAWSHPQFEK(GGGS)2GGSAWSHPQFEK, (SEQ ID NO: 07)), que está disponible comercialmente como “Twin-Strep-tag® de IBA GmbH, Gottingen, Alemania). El fragmento Fab de aCD3 se usó como primer agente con el péptido de unión a estreptavidina sirviendo como compañero de unión C1 y el fragmento Fab de aCD28 se usó como segundo agente con el péptido de unión de treptavidina sirviendo como compañero de unión C2. La muteína de estreptavidina (tetramérica) “Strep-tactin®” sirve como reactivo de multimerización en el que se inmovilizaron reversiblemente ambos fragmentos Fab.
En el experimento de expansión, las células Tresp estimuladas con perlas en blanco (sin Fab) sirvieron como control negativo. Las células Tresp se sembraron en tripletes en placas de 48 pocillos junto con 300.000 células alimentadoras autólogas de células CD3 (irradiadas con 30 Gy) en 3 ml de medio de cultivo celular completo (RPMI (Gibco) suplementado con suero de ternera fetal al 10% (v/v), L-glutamina, b-mercapto etanol, HEPES, penicilina, estreptomicina y gentamicina) suplementado con 10 U/ml de interleucina 2 (IL-2). Las células se incubaron a 37° C sin intercambio de medio y se analizaron después de 4 días mediante análisis FACS. La tinción y el análisis FACS se realizaron después de 10 min de incubación con D-biotina 100 pM. En la Fig. 4 se muestra un gráfico representativo para cada condición. Los gráficos muestran células CD3+ vivas que se tiñeron con yoduro de propidio (PI) para la discriminación de vivas/muertas. La Fig. 4a es un histograma que muestra la distribución de tamaños (dispersión directa) de las células estimuladas. La Fig. 4a muestra que una población celular específica de células Tresp se estimuló y expandió (aumento de tamaño/número en comparación con el control de "solo perlas" no estimulado) cuando se incubó en presencia de perlas en las que se inmovilizó una mezcla de 0,5 pg de fragmento Fab de aCD3 y 0,5 pg de Fab de aCD28, después de ser estimulada in vitro con fragmentos Fab de aCD3/aCD28 que se habían inmovilizado reversiblemente en perlas recubiertas con la muteína de estreptavidina Strep-tactin®. La Fig. 4B representa histogramas de la dilución del colorante de proliferación CFSE que representa el grado de proliferación de acuerdo con el número de células por división celular (indicado en la parte superior de la Fig. 4B, 0 representa células no divididas; 5 representa células que han pasado por al menos 5 divisiones). En la Fig. 4B puede verse que la población de células T estimuladas con las perlas en las que se inmovilizó una mezcla de 0,5 pg de fragmento Fab de aCD3 y 0,5 pg de Fab de aCD28 han pasado en su mayoría por tres divisiones celulares y representan un patrón de proliferación más uniforme que con un único estímulo solo (número pequeño de células dentro del pico no dividido "0"). La cantidad absoluta aumentada de proliferación (más células han proliferado uniformemente después de la estimulación 4d con perlas funcionalizadas con aCD3 y aCD28) también está representada por un consumo más intenso de medios, como se representa por un cambio de color indicador a amarillo en la Fig. 4C.
Ejemplo 2: Análisis de la movilización diferencial intracelular de calcio en células Jurkat
Aquí se examinó el análisis de citometría baja en tiempo real de la movilización diferencial de calcio intracelular inducida en células Jurkat que o están marcadas con el clon de anticuerpo para aCD3 OKT3 o con fragmentos Fab de OKT3 multimerizados con Strep-tactin®.
Para este propósito, las células Jurkat se cargaron con el colorante sensible al calcio Indo-1-AM y se desencadenó la liberación de calcio mediante la inyección de anticuerpo monoclonal de aCD3 OKT3 (producido por la línea celular de hibridoma OKT3, ver arriba, cuadrados negros) o fragmentos Fab de aCD3 (derivados de la línea celular original OKT3) que fueron multimerizados por unión reversible de su péptido de unión a estreptavidina a Strep-Tactin soluble conjugada de manera fluorescente con ficoeritrina. En el caso de los complejos multiméricos OKT3 Fab-Strep-Tactin intactos, la liberación de calcio se desencadenó durante un período de tiempo idéntico al del clon del anticuerpo original (triángulos gris oscuro). La activación de las células podría evitarse por completo mediante la inyección de D-biotina tratada, complejos de Fab-Strep-Tactin predisociados (círculos de color gris claro) idénticos a la inyección del control negativo de PBS (triángulos blancos invertidos). La aplicación de ionomicina sirvió como control positivo para la afluencia de calcio. Los Cambios en el concentración de Ca2+ intracelular resueltos en el tiempo se monitorizaron mediante citometría de flujo en base al cambio en la relación de FL6/FL7. En la Fig. 5A puede verse que tanto el anticuerpo original OKT3 como el fragmento Fab monovalente multimerizado de OKT3 efectuaron la liberación de calcio, lo que significa que el fragmento Fab monovalente multimerizado de OKT3 es esencialmente tan funcional como el anticuerpo original. En particular, el fragmento Fab de OKT3 multimérico no fue capaz de desencadenar la liberación de calcio si se añadió biotina a la Strep-tactin en la que se inmovilizó el fragmento Fab de OKT3 antes de la adición del fragmento Fab de Estreptactina-OKT3. En este caso, la biotina interrumpió la unión reversible formada entre Strep-tactin como agente de multimerización y el fragmento Fab de OKT3. Por lo tanto, el fragmento Fab monovalente se desplazó del agente de multimerización y, después de la disociación, no fue capaz de desencadenar la liberación de calcio mediante la unión a CD3 de las células Jurkat.
En los experimentos mostrados en la Fig. 5B las células Jurkat marcadas con indo-1-AM se activaron mediante complejos Fab-Strep-Tactina de aCD3 derivados de OKT3 como se describe en la Fig. 5a. La inyección de complejos intactos (gráfico superior) o predisociados (gráfico inferior) sirvió como control positivo o negativo, respectivamente. Además, la estimulación de células con complejos de Fab-Strep Tactin intactos seguido de la inyección posterior de D-biotina (cerca del pico de activación en t=140s) dio como resultado una interrupción abrupta de la señalización del multímero Fab de aCD3 (gráfico central). La inyección de ionomicina en el grupo del complejo Fab predisociado sirvió como control positivo. Los datos son representativos de tres experimentos diferentes. Lo que es más importante, la Fig. 5B muestra que la adición de D-biotina a la muestra desplaza rápidamente el fragmento Fab del agente de multimerización Strep-tactin, terminando de este modo eficazmente la liberación de calcio incluso bajo la estimulación de calcio en curso y demostrando que el fragmento Fab de OKT3 disociado ya no es biológicamente activo. De igual manera, el fragmento Fab de OKT3 multimérico tampoco fue capaz de desencadenar la liberación de calcio cuando se añadió biotina al multímero del fragmento Fab de Strep-tactin-OKT3 antes de la adición de la muestra Fab de Estreptactina-OKT3 a las células Jurkat.
Ejemplo 3: Tinción reversible de células mediante multímeros Fab de CD3
Este ejemplo examina la tinción reversible de células mediante multímeros Fab de CD3. Las PBMC recién aisladas se tiñeron o con el clon OKT3 de anticuerpo monoclonal de aCD3 (gráfico de puntos izquierdo, clon original para los multímeros Fab) o con multímeros Fab de OKT3 marcados con ficoeritrina cognada (PE) y se analizaron o antes (segunda columna izquierda) o después del tratamiento con D-biotina (columna central). Luego, se detectaron los monómeros Fab restantes después de los pasos de lavado posteriores usando Strep-Tactin® marcada con PE nueva (segunda columna derecha). La tinción secundaria de multímero Fab de células teñidas reversiblemente sirvió como control (columna de la derecha). En la Fig. 6 se muestran solo las células CD3 vivas que son negativas en tinción con yoduro de propidio (PI) para discriminación de vivas/muertas. Los números en los gráficos de puntos indican el porcentaje de células dentro de las puertas. Este experimento muestra que la tinción de PBMC CD3+ con un fragmento Fab anti-CD3 multimerizado con Estreptactina como reactivo de multerización es completamente reversible mediante la adición de D-biotina y que el fragmento Fab monovalente solo no se une a la molécula CD3 presente en las PBMC.
Ejemplo 4: Aislamiento reversible de células mediante multímeros Fab de CD28
Este ejemplo muestra el aislamiento de células mediante unión reversible de fragmentos Fab anti-CD28 multimerizados con partículas magnéticas Strep-Tactin® (las partículas magnéticas están disponibles de IBA GmbH Gottingen, Alemania). Para este propósito se usaron los fragmentos Fab derivados del anticuerpo CD28.3 descritos en el Ejemplo 1 anterior. Las células CD28+ se seleccionaron/aislaron mediante selección de células magnéticas de multímeros Fab de PMBC recién aisladas esencialmente como se describe en la Solicitud de Patente Internacional WO2013/011011. Antes de la selección, las células se tiñeron de control con los multímeros de aCD28 fluorescentescognados (gráfico de puntos de la izquierda) o con un anticuerpo dirigido contra la cadena ligera kappa de inmunoglobulina (segundo gráfico de puntos de la izquierda, mAb kappa de a-Ig) como tinción de control. Después de la selección, las células CD28+ se trataron con D-biotina y posteriormente se lavaron para eliminar las perlas magnéticas y los monómeros Fab. Las células CD28+ liberadas se volvieron a teñir posteriormente con multímeros Fab de CD28 (segundo gráfico de puntos a la derecha) o con el mAb kappa a-Ig (gráfico de puntos a la derecha) para detectar los monómeros Fab potencialmente restantes. Solo se muestran las células CD3+ vivas (PInegativo). Los números en los gráficos de puntos indican el porcentaje de células dentro de las puertas. La Fig. 7 muestra que las células CD28+ pueden aislarse de PMBC usando tal fragmento Fab anti-CD28 multimerizado y que todos los reactivos de aislamiento, incluidos los monómeros Fab anti CD28, pueden eliminarse después de la selección.
Ejemplo 5: Estimulación/expansión de células respondedoras T CD3+ con fragmentos Fab de aCD3/aCD28 que se inmovilizaron reversiblemente con Strep-tactin soluble
En este ejemplo, las células respondedoras T CD3+ (aisladas por selección magnética de una muestra de PBMC nuevas obtenidas de un gradiente de Ficoll) se expandieron después de la estimulación in vitro con fragmentos Fab de aCD3/aCD28 que se inmovilizaron reversiblemente en Strep-tactin® oligomérico soluble que actúa como un reactivo de multimerización soluble. El Strep-tactin® oligomérico se obtuvo polimerizando Streptactin® con sulfo SMCC (sulfosuccinimidil 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato, producto N° 22122 Thermo Scientific) e iminotiolan (producto N° 26101 Thermo Scientific) de acuerdo con el protocolo del fabricante (Thermo Scientific). La estreptavidina oligomérica se separó de la muteína de estreptavidina monomérica (no reaccionada) y dimérica mediante cromatografía de exclusión por tamaño y la fracción obtenida de este modo de la muteína de estreptavidina oligomérica (n> 3) se usó como reactivo de multimerización soluble-
Para la expansión in vitro, se marcaron 300.000 células respondedoras T CD3+ (Tresp) con éster succinimidílico de carboxifluoresceína 2 pM (CFSE) y se estimularon con cantidades variables de una preparación de oligómeros de Strep-tactin® solubles en los que se inmovilizaron una combinación del fragmento Fab de aCD3 OKT3 y el fragmento Fab de aCD28 del anticuerpo 28.3 descritos anteriormente (llevando ambos el Twin-Strep-tag® mencionado anteriormente como péptido de unión a estreptavidina en la cadena pesada). ("1x" corresponde a 3 pg de Estreptactina multimerizada funcionalizada con 0,5 pg del fragmento Fab monomérico de aCD3 y 0,5 pg de aCD28, los números "0,5x", "2x" y "5x" indican la cantidad de n veces respectiva de "1x"). Las células Tresp se dejaron sin estimular o se estimularon con multímeros de Strep-tactin en blanco (sin Fab) que sirvieron como controles negativos. Se sembraron células Tresp por duplicado en placas de 48 pocillos junto con 300.000 células alimentadoras autólogas negativas para CD3 (irradiadas con 30 Gy) en 1 ml de medio de cultivo celular suplementado con 20 U/ml de IL-2. Las células se incubaron a 37° C sin intercambio de medios y la proliferación se analizó de acuerdo con la dilución de CFSE después de 5 días mediante análisis FACS. La Fig. 8A muestra el aumento en la distribución del tamaño de las células en proliferación después de 5 días en cultivo en comparación con los controles negativos. La Fig. 8B muestra que las células CD3+ Tresp se estimularon apropiadamente y proliferaron vigorosamente cuando se incubaron con Strep-tactin® oligomérico soluble (en comparación con las partículas magnéticas sólidas de Estreptactina en la Fig. 4) en el que se inmovilizó una mezcla de fragmentos Fab de aCD3 y Fab de aCD28. Los resultados en las Fig. 8a y 8b indican que, en estas condiciones in vitro, se dividieron la mayoría de las células respondedoras T CD3+ (de 2 a 5 divisiones celulares) después del acoplamiento del complejo CD28 y TCR/CD3 de superficie con los fragmentos Fab de aCD3 y de aCD28 que se habían inmovilizado reversiblemente en oligómeros de Strep-tactin® solubles. Después de la expansión in vitro, los reactivos de estimulación de Fab-Strep-Tactin solubles se disociaron y eliminaron después del tratamiento con D-biotina. La disociación y eliminación de los fragmentos Fab monoméricos se analizó mediante citometría de flujo volviendo a teñir las células con el marcador de ficoeritrina Strep-Tactin®) (ST-PE). Se muestra un histograma representativo (histograma gris oscuro) en comparación con el control negativo solo de ST-PE apropiado (histograma gris claro). En la fig. 8C puede verse que ambos fragmentos Fab se habían disociado completamente y se habían eliminado por completo de las células expandidas. La Fig. 8D muestra el número absoluto de células vivas (negativas con azul tripán) después de 5 días. El número se contó usando una cámara de recuento Neubauer y se representó frente a la condición de estimulación respectiva. En la Fig. 8D se muestran los números medianos de células; las barras de error indican la desviación estándar (SD). La Fig. 8D muestra que todas las mezclas de fragmentos Fab de aCD3 y fragmentos Fab de aCD28 que se habían inmovilizado en un reactivo de multimerización de Strep-tactin soluble fueron igualmente efectivas en la expansión de las células CD3+ y dieron como resultado un aumento de aproximadamente 4 veces del número absoluto de células.
Ejemplo 6: Cinética de proliferación de células respondedoras T CD4+ y CD8+ purificadas estimuladas in vitro con multímeros De Fab de aCD3/aCD28-estreptámero reversibles sin intercambio de medios
En este ejemplo, se examinó la cinética de expansión de la proliferación de células T respondedores CD4+ y CD8+ purificadas (Tresp) que fueron estimuladas in vitro con fragmentos Fab de aCD3/aCD28 que eran muteínas de estreptavidina oligoméricas solubles inmovilizadas reversiblemente. Para este propósito, la muteína Strep-tactin® oligomérica soluble de dos tamaños diferentes sirvió como reactivo de multimerización soluble. El primer tipo de Strep-tactin® oligomérico fue la fracción de la muteína de estreptavidina oligomérica (n>3) obtenida en el Ejemplo 5 (a la que también se hace referencia en la presente como "estructura principal convencional de Streptactin®", ilustrado por el símbolo del triángulo con la punta en la parte superior en la Fig. 13). El segundo tipo de esta muteína de estreptavidina oligomérica usada como reactivo de multimerización soluble fue una muteína de estreptavidina oligomérica (n>3) que se hizo reaccionar con albúmina de suero humano biotinilada (a la que también se ha ce referencia en la presente como "estructura principal de Streptactin® grande).
En este ejemplo, se estimularon por separado 500.000 células respondedoras T CD4+ o CD8+ purificadas (Tresp) con estos dos multímeros de Estreptámero diferentes como se ha explicado anteriormente, es decir, con la estructura principal de Estreptactina del Ejemplo 5 (usando una solución con una concentración de 1 mg de muteína de estreptavidina oligomérica/ml)) o con las estructuras principales de Estreptactina grandes (0,1 mg/ml). Se cargaron 3 gl de ambas estructuras principales diferentes con una combinación de 0,5 gg de Fab de aCD3 y 0,5 gg de aCD28 usado en los ejemplos anteriores que portaban un péptido de unión a estreptavidina SAWSHPQFEK(GGGS)2GGSAWSHPQFEK (SEQ ID NO: 07) en el extremo C-terminal de la cadena pesada del fragmento Fab. Además, se cargaron 4,5 gl de la estructura principal de Estreptactina convencional con 0,5 gg de fragmento Fab de aCD3, 0,5 gg de fragmento Fab de aCD8 (IBA GmbH Gottingen, que también lleva en el extremo C terminal del fragmento Fab el péptido de unión a estreptavidina SAWSHPQFEK(g Gg S)2GGSAWSHPQFEK (SEQ ID NO: 07) y 0,5 gg de fragmento Fab de aCD28. Las células Tresp no tratadas (no estimuladas) sirvieron como control negativo y las células Tresp estimuladas con Dynabeads disponibles comercialmente (perlas en las que los anticuerpos monoclonales de aCD3 y aCD28 están inmovilizados irreversiblemente) como control positivo. Las células Tresp se sembraron por duplicado en placas de 48 pocillos en 1 ml de medio de cultivo celular (RPMI 1640 (Gibco) suplementado con suero de ternero fetal al 10% (v/v, 0,025% (p/v) de L-glutamina, 0,025% (p/v) de L-arginina, 0,1% (p/v) de HEPES, 0,001% (p/v) de gentamicina, 0,002% (p/v) de estreptomicina, 0,002% (p/v) de penicilina) suplementado con 30 U/ml de IL-2. Las células se incubaron a 37° C sin intercambio de medios y el recuento celular se analizó después de 1, 3 y 6 días. En los experimentos de la Fig. 13 la expansión se llevó a cabo sin intercambio de medios. Los resultados para las células T respondedores CD4+ se muestran en la Fig. 13A, los resultados para las células T respondedores CD8+ se muestran en la Fig. 13B, con los gráficos representando el grado de proliferación de acuerdo con el número de células recogidas por punto temporal para CD4+ Tresp (Fig. 13A) y para CD8+ Tresp en la Fig. 13B.
Como puede verse en la Fig. 13A el reactivo de multimerización soluble "más pequeño" en el que se inmovilizaron reversiblemente los fragmentos Fab de aCD3 y aCD28 proporcionó la misma cantidad de expansión de células T CD4+ que las Dynabeads (que hasta ahora son el reactivo estándar para la expansión de las células T), mientras que la estreptactina soluble oligomérica “más grande” proporcionó una expansión incluso mejor en comparación con Dynabead. Esta mejora podría deberse a que el "reactivo de multimerización oligomérico más grande" soluble puede unirse a más células T al mismo tiempo que el oligómero soluble "más pequeño", pudiendo de este modo estimular más células T CD4+ que el oligómero "más pequeño".
Como resulta evidente de la Fig. 13B, usando los reactivos de multimerización solubles de la presente divulgación, las células T CD8+ podrían expandirse en el plazo de los primeros 3 días por lo menos tan eficientemente como con Dynabeads. En particular, en este período de tiempo, el experimento de expansión que usó un reactivo de multimerización soluble que, además de los fragmentos Fab de aCD3 y aCD28 (como primer y segundo agente) llevaba inmovilizado reversiblemente sobre el mismos fragmento Fab de aCD8, mostró el mejor grado de expansión en estas condiciones de cultivo. Esto indica que es posible mediante el uso de un estímulo que sea específico para una subpoblación particular de células (aquí el fragmento Fab de aCD8) aumentar o modular la selectividad de la expansión, pudiendo de este modo obtener mayores cantidades de una (sub)-población celular deseada.
Por tanto, resumiendo lo anterior, el Ejemplo 6 muestra que la funcionalidad del reactivo de multimerización soluble usado en la presente divulgación en términos de desencadenar la expansión de células T es comparable a la metodología estándar actual de usar Dynabeads para este propósito. Sin embargo, como la estimulación puede controlarse (y finalizarse, si se desea) añadiendo un competidor como biotina en el caso de una interacción reversible basada en estreptavidina entre el primer y el segundo agente y el reactivo de multimerización, la presente divulgación proporciona una ventaja significativa sobre la tecnología Dynabeads, ya que pueden optimizarse las condiciones de expansión (por ejemplo, sería posible detener la estimulación en el experimento de la Fig. 13B después de 3 días). Además, como el reactivo de multimerización soluble puede eliminarse fácilmente de la reacción (por ejemplo, inmovilizando el reactivo en una columna biotinilada después de la reacción de expansión), el método de expansión de la divulgación puede llevarse a cabo y automatizarse en sistemas cerrados que son, por ejemplo, necesarios para la producción de GMP de células con propósitos terapéuticos, sin tener que lidiar con la eliminación de perlas como Dynabeads.
Ejemplo 7: Cinética de proliferación de células T respondedores CD4+ y CD8+ purificadas estimuladas in vitro con multímeros De Fab de aCD3/aCD28-estreptámero reversibles con intercambio de medios
También en este ejemplo se examinó la cinética de expansión de la proliferación de células respondedoras T CD4+ y CD8+ purificadas (Tresp) que se estimularon in vitro con fragmentos Fab de aCD3/aCD28 que se inmovilizaron reversiblemente en muteínas de estreptavidina oligoméricas solubles. Para este propósito, la muteína Strep-tactin® oligomérica soluble de dos tamaños diferentes sirvió como reactivo de multimerización soluble. El primer tipo de Strep-tactin® oligomérica fue la fracción de la muteína de estreptavidina oligomérica (n>3) obtenida en el Ejemplo 5 (a la que también se hace referencia en la presente como "estructura principal convencional de Streptactin®", ilustrada por el símbolo del triángulo con la punta hacia abajo en la Fig. 13). El segundo tipo de esta muteína de estreptavidina oligomérica usada como reactivo de multimerización soluble se obtuvo haciendo reaccionar la Estreptactina oligomérica (n>3) obtenida en el Ejemplo 5 con albúmina sérica humana biotinilada. A este reactivo de multimerización oligomérico soluble también se hacer referencia en la presente como "estructura principal de Streptactin® grande".
En este ejemplo, se estimularon por separado 400.000 células respondedoras T CD4+ o CD8+ purificadas (Tresp) con estos dos multímeros de estreptámero diferentes como se ha explicado anteriormente, es decir, o con la estructura principal de estreptactina del Ejemplo 5 (1,0 mg/ml) o con las estructuras principales de estreptactina grandes (0,1 mg/ml). Se cargaron 3 pl de ambas estructurs principales diferentes con una combinación de 0,5 pg de fragmentos Fab de aCD3 y 0,5 pg de aCD28 descritos anteriormente. Además, se cargaron 4,5 pl de la estructura principal de estreptactina del Ejemplo 5 con 0,5 pg de Fab de aCD3, 0,5 pg de aCD8 y 0,5 pg de fragmento Fab de aCD28 como se ha descrito anteriormente. Las células Tresp no tratadas (no estimuladas) sirvieron como control negativo y las células Tresp estimuladas con Dynabeads (en las que los anticuerpos monoclonales de aCD3 y aCD28 están inmovilizados irreversiblemente) como control positivo. Se sembraron células Tresp por duplicado en placas de 48 pocillos en 1 ml de medio de cultivo celular suplementado con 30 U/ml de IL-2. Las células se incubaron a 37° C con intercambio de medios el día 3 y se analizó el recuento de células después de 1, 3 y 6 días. Los resultados para las células T respondedores CD4+ se muestran en la Fig. 14A, los resultados para las células respondedoras T CD8+ se muestran en la Fig. 14B, con los gráficos representando el grado de proliferación de acuerdo con el número de células recogidas por punto temporal para CD4+ Tresp (Fig. 14A) y para CD8+ Tresp en la Fig. 14B.
Como puede verse en la Fig. 14A los reactivos de multimerización solubles de la presente divulgación en los que se inmovilizaron reversiblemente los fragmentos Fab de aCD3 y aCD28 proporcionaron una mejor expansión de las células T CD4+ que las Dynabeads.
Como resulta evidente en la Fig. 14B, usando los reactivos de multimerización solubles de la presente divulgación, las células T CD8+ podrían expandirse en el plazo de los primeros 6 días por lo menos tan eficientemente como con Dynabeads. En particular, en este período de tiempo, el experimento de expansión que usó el reactivo de multimerización soluble más grande que portaba fragmentos Fab de aCD3 y aCD28 (como primer y segundo agente) mostró el mejor grado de expansión en estas condiciones de cultivo. Esto podría deberse de nuevo a que el "reactivo de multimerización oligomérico más grande" soluble es capaza de unirse a más células T al mismo tiempo que el oligómero soluble "más pequeño", pudiendo de este modo estimular más células T CD4+ que el oligómero "más pequeño".
Ejemplo 8 : Cinética de expansión de cultivos de células T CD4+ y CD8+ purificadas con o sin intercambio de medios
En este ejemplo, los datos combinados de los Ejemplos 6 y 7 se normalizaron en el número de células de entrada para el reactivo de multimerización soluble "más pequeño" y el control positivo y negativo. No se obtuvieron datos de normalización en el reactivo de multimerización "más grande". Como se explica en los Ejemplos 6 y 7, se estimularon de 400.000 a 500.000 células T respondedores CD4+ o CD8+ (Tresp) con 3 pl de una preparación de multímeros de estreptactina (1 mg/ml; en los cuales se inmovilizaron 0,5 pg de fragmento Fab de aCD3 y 0,5 pg de fragmento Fab de aCD28. Las células Tresp no tratadas (no estimuladas) sirvieron como control negativo y las células Tresp estimuladas con Dynabeads como control positivo. Las células Tresp se sembraron por duplicado en placas de 48 pocillos en 1 ml de medio de cultivo celular suplementado con 30 U/ml de IL-2. Se sembraron células Tresp por duplicado en placas de 48 pocillos en 1 ml de medio de cultivo celular suplementado con 30 U/ml de IL-2. Las células se incubaron a 37° C con intercambio de medios (líneas rectas en la Fig. 15) o sin intercambio de medios (líneas discontinuas en la Fig. 15) el día 3 y se analizó el recuento de células después de 1, 3 y 6 días.
Como resulta evidente a partir de los datos normalizados de la Fig. 15A, el reactivo de multimerización soluble "más pequeño" en el que se inmovilizaron reversiblemente los fragmentos Fab de aCD3 y aCD28 produjo una expansión de aproximadamente 2,5 veces de células T CD4+, mientras que la expansión usando Dynabeads produjo una tasa de expansión de aproximadamente 1,8 veces. Por tanto, el uso de un reactivo de multimerización soluble de la divulgación incluso proporciona una mejora en la expansión de las células T CD4+ sobre Dynabeads. De manera similar, la Fig. 15B, confirma que usando los reactivos de multimerización solubles de la presente divulgación, las células T CD8+ podrían expandirse en el plazo de los primeros 3 días por lo menos tan eficientemente como con Dynabeads.
Ejemplo 9: Formación de grupos precoz después de la activación de células respondedoras T CD4+ y CD8+ purificadas estimuladas in vitro con multímeros de Fab de aCD3/aCD28-estreptámero reversibles
En este ejemplo, se estimularon 400.000 células respondedoras T CD4+ o CD8+ (Tresp) con 3 pl de una preparación de reactivo de multimerización de estreptactina oligomérica (1 mg/ml) cargado con una combinación de 0,5 pg de Fab de aCD3 y 0,5 pg de aCD28. Las células Tresp no tratadas (no estimuladas) sirvieron como control negativo y las células Tresp estimuladas con Dynabeads como control positivo. Se sembraron células Tresp por duplicado en placas de 48 pocillos en 1 ml de medio de cultivo celular suplementado con 30 U/ml de IL-2. Las células se incubaron a 37° C y se analizaron microscópicamente después de 1 y 2 días. Se muestra la estimulación de CD4+ Tresp (Fig. 16A) y CD8+ Tresp (Fig. 16B) para los multímeros de Dynabeads (fila central) y estreptámero (fila inferior) respectivamente. Las fotografías representan el grado de formación de grupos: Para una mejor visibilidad, los grupos ejemplares están indicados por círculos para la estimulación con oligómeros de muteína de estreptavidina solubles en las Fig. 16A y Fig. 16B. Los grupos dentro de la estimulación Dynabead son fácilmente visibles por la acumulación de partículas estimuladoras oscuras. Como es evidente, tanto para las células T CD4+ como para las CD8+ se forman grupos precoces cuando se usa el método de expansión de la divulgación que emplea un reactivo de multimerización oligomérico soluble.
Ejemplo 10: Cinética de expansión y fenotipo de células T de memoria central (Tcm) CD3+ policlonales activadas/expandidas a granel
En este ejemplo, se estimularon 500.000 células Tcm respondedoras CD3+CD62L+CD45RA (Tresp) con 3 pl de una preparación de la estreptactina oligomérica soluble del Ejemplo 5 (1 mg/ml) que o se cargó con una combinación de 0,5 pg de Fab de aCD3 y 0,5 pg de aCD28. Además, se usaron 4,5 pl de una preparación de multímeros de estreptactina cargados con 0,5 pg de Fab de aCD3, 0,5 pg de aCD8 y 0,5 pg de Fab de aCD28 como condición de estimulación adicional. Las células Tresp no tratadas (no estimuladas) sirvieron como control negativo y las células Tresp estimuladas con Dynabeads (en las que los anticuerpos monoclonales de aCD3 y aCD28 están inmovilizados irreversiblemente) como control positivo. Se sembraron células Tresp en placas de 48 pocillos en 1 ml de medio de cultivo celular suplementado con 30 U/ml de IL-2 solamente o 30 U/ml de IL-2 y 5 ng/ml de IL-15. Las células se incubaron a 37° C con intercambio de medios cada 3 días y se analizó el recuento celular a los 7 y 14 días. Los gráficos representan el grado de proliferación de acuerdo con el número de células recogidas por punto temporal, en la Fig. 17A sólo medios suplementados con IL-2 y en la Fig. 17A medios suplementados con IL-2 e IL-15. Como puede verse en ambas Fig. 17A y 17B, el reactivo de multimerización soluble que se ha unido reversiblemente al fragmento Fab de CD3 y al fragmento Fab de aCD28 produce una mejor expansión celular que las Dynabeads. Como se muestra además por el análisis de citometría de flujo de la expresión de superficie de CD62L y CD127 después de 14 días de cultivo en entornos de citoquinas variable de la Fig. 17C, los enfoques experimentales que usan reactivos de multimerización solubles de la presente divulgación retienen, en las dos condiciones elegidas aquí, un contenido más alto de células T de memoria de larga duración que expresan CD127 que la expansión con Dynabeads. Esto ilustra una ventaja adicional de los métodos de la presente divulgación.
Ejemplo 11: Expansión de antígenos específicos selectiva de las células respondendoras Tcm fuera de las células T de memoria central CD3+ a granel (cinética y fenotipo)
En este ejemplo, se examinaron la cinética y el fenotipo de la expansión selectiva específica de antígeno (específica de Ag) a partir de células respondedoras CD3+CD62L+CD45RA-Tcm purificadas
Más detalladamente, las células respondedoras CD3+CD62L+CD45RA-Tcm se estimularon in vitro tanto con un complejo de péptido: molécula de MHC (que actúa como primer agente que proporciona una señal de activación primaria a las células) como un fragmento Fab de aCD28 (que actúa como segundo reactivo que estimula una molécula accesoria en la superficie de las células). Tanto el complejo de péptido específico de antígeno con la molécula de MHC como el fragmento Fab de aCD28 se inmovilizaron reversiblemente en la muteína de estreptavidina oligomérica soluble (con n>3) descrita en el Ejemplo 5. El péptido que se usó para la expansión específica de antígeno fue el péptido CRVLCCYVL (SEQ iD NO: 06), aminoácidos 309-317 de la proteína 1 temprana inmediata (descrita en Ameres et al, PLOS Pathogens, mayo de 2013, vol. 9, número 5, e1003383) que representa un epítopo HLA-C7/IE-1 específico del citomegalovirus (CMV). La molécula de MHC I que representa el péptido lleva en el extremo C-terminal de la cadena a (cadena pesada) el péptido de unión a estreptavidina (SAWSHPQFEK(GGGS)2GGSAWSHPQFEK, (SEQ ID NO: 07) que está disponible comercialmente como “TwinStrep-tag®” de IBA GmbH, Gottingen, Alemania).
Para este propósitos, se estimularon específicamente para Ag 500.000 células Tcm respondedoras CD3+CD62L+CD45RA-(Tresp) usando 3 gl de una preparación de reactivo de multimerización de estreptactina oligomérico soluble funcionalizado con 0,5 gg de los complejos péptido: MHC clase I equipados con el péptido de unión a estreptavidina y con 0,5 gg del Fab de aCD28 descrito anteriormente. Como alternativa, se cargaron 4,5 gl de una preparación del reactivo de multimerización de estreptactina con 0,5 gg de estos complejos de péptido: MHC de clase I, 0,5 gg de Fab de aCD8 y 0,5 gg de Fab de aCD28. A modo de comparación, se realizó estimulación policlonal, usando 3 gl de una preparación de reactivo de multimerización de estreptactina (1 mg/ml) o bien cargado con una combinación de 0,5 gg de Fab de aCD3 y 0,5 gg de Fab de aCD28. De nuevo, como condición de estimulación alternativa descrita anteriormente, se usaron 4,5 gl de una preparación de reactivo de multimerización de estreptactina cargado reversiblemente con 0,5 gg de Fab de aCD3, 0,5 gg de Fab de aCD8 y 0,5 gg de Fab de aCD28. Las células Tresp no tratadas (no estimuladas) sirvieron como control negativo y las células Tresp policlonales estimuladas con Dynabeads (perlas en las que los anticuerpos monoclonales aCD3 y aCD28 están inmovilizados irreversiblemente) como control positivo. Se sembraron células Tresp en placas de 48 pocillos en 1 ml de medio de cultivo celular suplementado con 30 U/ml de IL-2 y 5 ng/ml de IL-15. Las células se incubaron a 37° C con intercambio de medios cada 3 días y se analizó el recuento celular después de 7 y 14 días. El análisis de citometría de flujo ejemplar para la fracción de células específicas de Ag que se estimuló/expandió a través del oligómero de estreptococo soluble en el que se encontró el complejo péptido: MHC-I para un epítopo HLA-C7/IE-1 (para CMV) inmovilizado Se utilizaron 5 gg de Fab de aCD8 y 0,5 gg de Fab de aCD28. Las células Tresp no tratadas (no estimuladas) sirvieron como control negativo y las células Tresp policlonales estimuladas con Dynabeads (perlas en las que los anticuerpos monoclonales aCD3 y aCD28 están inmovilizados irreversiblemente) como control positivo. Se sembraron células Tresp en placas de 48 pocillos en 1 ml de medio de cultivo celular suplementado con 30 U/ml de IL-2 y 5 ng/ml de IL-15. Las células se incubaron a 37°C con intercambio de medios cada 3 días y se analizó el recuento celular después de 7 y 14 días. El análisis de citometría de flujo ejemplar para la fracción de células específicas para Ag que se estimuló/expandió a través del oligómero de estreptactina soluble en el que se inmovilizó el complejo péptido: MHC-I para un epítopo HLA-C7/IE-1 (para CMV) (Fig. 18A) muestra que estas células específicas del antígeno se expandieron específicamente. Los gráficos de la Fig. 18B a la Fig. 18E (que representan el grado de expansión de distintas especificidades para Ag de acuerdo con el número de células positivas para el multímero péptido: MHCI recogidas por punto temporal en analogía con el experimento de expansión mostrado en la Fig. 18A (muestran que el reactivo de multerimerización que usa el complejo respectivo del péptido específico para Ag y la molécula de MHC 1 proporcionó el mayor número de células expandidas (que van desde un aumento de veinte veces en el número de células para las células específicas para Ag que reconocen el epítopo pp65 de CMV (aminoácidos 341-350 (QYDPVAALF, (SEQ ID NO: 08)) restringido por HLA-A2402) (ver Fig. 18B) a un aumento de 98 veces en el número de células específicas para Ag que reconocen el epítopo HLA-B7/IE-1309-317 (CRVLCCYVL (SEQ ID NO: 06)) de CMV (ver la Fig. 18E), mostrando de este modo que el método de expansión de la presente divulgación es totalmente aplicable a la expansión de células específicas para Ag. Finalmente, el análisis de citometría de flujo ejemplar de la expresión de superficie de CD62L y CD127 después de 14 días de cultivo para el epítopo HLA-B7/Hexon5 (para adenovirus) mostrado en la Fig. 18F confirma además que los enfoques experimentales que usan los reactivos de multimerización solubles de la presente divulgación retienen un contenido más alto de células T de memoria de larga duración que expresan CD127 en condiciones estimuladoras policlonales y específicas para Ag.
Ejemplo 12: Cinética de expansión y fenotipo específica para Ag selectivos de células T de memoria central a granel
Este ejemplo examina la cinética de la expansión selectiva específica de Ag a partir de células respondedoras CD3+CD62L+CD45RA-Tcm purificadas que fueron estimuladas in vitro con a) complejos de péptido MHC I específico de antígeno y b) fragmentos Fab de aCD28 que se inmovilizaron reversiblemente como primer y segundo agente sobre muteínas de estreptavidina oligoméricas solubles.
Para este propósito, se estimularon con específicamente para Ag 500.000 células Tcm respondedoras CD3+CD62L+CD45RA-(Tresp) usando 3 gl de una preparación de reactivo de multimerización de estreptactina funcionalizado con 0,5 gg de complejos péptido: MHC de clase I equipados con un péptido de unión a estreptavidina (el péptido específico representa los aminoácidos 114-124 (CPYSGTAYNSL, SEQ ID NO: 10) de la proteína Hexon 5 de adenovirus) restringido por HLA-B07) y 0,5 gg de Fab de aCD28. Como alternativa, 4,5 gl de una preparación de reactivo de multimerización de estreptactina cargado con 0,5 gg de este complejo péptido: MHC de clase I, 0,5 gg de Fab de aCD8 y 0,5 gg de Fab de aCD28. A modo de comparación, se realizó estimulación policlonal, usando 3 gl de una preparación de reactivo de multimerización de estreptactina (1 mg/ml) o cargado con una combinación de 0,5 gg de Fab de aCD3 y 0,5 gg de Fab de aCD28. De nuevo, como condición de estimulación alternativa descrita anteriormente, se usaron 4,5 gl de una preparación de multímeros de estreptactina cargados con 0,5 gg de Fab de aCD3, 0,5 gg de Fab de aCD8 y 0,5 gg de Fab de aCD28. Las células Tresp no tratadas (no estimuladas) sirvieron como control negativo y las células Tresp policlonales estimuladas con Dynabeads como control positivo. Se sembraron células Tresp en placas de 48 pocillos en 1 ml de medio de cultivo celular suplementado con 30 U/ml de IL-2 y 5 ng/ml de IL-15. Las células se incubaron a 37° C con intercambio de medios cada 3 días y se analizó el recuento celular después de 7 y 14 días. Las imágenes que se muestran en la Fig. 19 representan el grado de formación de grupos en el día 5, se ilustra una estimulación específica para Ag ejemplar para el epítopo HLA-B7/Hexon 5 de adenovirus. Como puede verse en la Fig. 19, tales células específicas de antígeno de adenovirus podrían expandirse específicamente a partir de la población respondedora CD3+CD62L+CD45RA-Tcm original.
Ejemplo 13: Rendimiento y fenotipo de células T CD8+ expandidas - variación del tamaño del reactivo de multimerización soluble y adición de aCD8-Fab para la estimulación
En este ejemplo, se examinó la expansión de células respondedoras T CD8+ purificadas estimuladas in vitro con fragmentos Fab de aCD3/aCD28 que eran muteínas de estreptavidina oligoméricas solubles inmovilizadas reversiblemente. Además, se examinó el efecto de añadir Fab de aCD8 al reactivo de multimerización para aumentar la especificidad de la expansión para las células T CD8+.
Para este propósito, se estimularon por separado 300.000 células respondedoras T CD8+ purificadas (Tresp) con dos reactivos de multimerización basados en estreptactina diferentes, concretamente el reactivo de multimerización oligomérico pequeño de estreptactina del Ejemplo 5 (1 mg/ml) o los oligómeros de estreptactina más grandes descritos anteriormente (0,1 mg)./ml). Se cargaron 3 pl de ambos reactivos de multimerización diferentes (estructuras principales) con una combinación de 0,5 pg de fragmentos Fab de aCD3 y 0,5 pg de aCD28 descritos anteriormente. Además, se cargaron 4,5 pl del reactivo de multimerización de estreptactina más pequeño (estructura principal) con 0,5 pg de los fragmentos Fab de aCD3, 0,5 pg de aCD8 y 0,5 pg de Fab de aCD28 descritos anteriormente. Además, se usaron 3 pl del reactivo de multimerización de estreptactina "más pequeño" (estructura principal) solo funcionalizado con 0,5 pg de fragmento Fab de aCD3 solo o 0,5 pg de fragmento Fab de aCD28 solo. Las células Tresp no estimuladas sirvieron como control negativo y Tresp estimuladas con Dynabeads sirvieron como control positivo. Se sembraron células Tresp por duplicado en placas de 48 pocillos en 1 ml de medio de cultivo celular suplementado con 30 U/ml de IL-2. Las células se incubaron a 37° C con intercambio de medios después de 3 días y se analizaron después de 6 días. la Fig. 20A representa el grado de proliferación de acuerdo con el número de células recogidas en el día 6 en comparación con los controles negativos y normalizadas al control positivo. La Fig. 20A muestra que la expansión de las células T CD8+ usando los reactivos de multimerización solubles de la divulgación da como resultado rendimientos más altos de las células T CD8+ que la expansión usando dynabeads. El análisis FACS de la expresión de superficie de CD8 (Fig. 20B) y la expresión de superficie de CD45RO (Fig. 20C) después de que el cultivo celular muestra que se expandió el mismo fenotipo de células T CD8+ mediante los reactivos de multimerización de la divulgación o Dynabeads (las diversas condiciones de estimulación se compararon usando ANOVA de una vía y no se detectaron diferencias significativas (ns)). El rendimiento mejorado de las células CD8+ usando los métodos de expansión de la invención en comparación con las Dynabeads podría deberse al hecho de que el reactivo de multimerización soluble puede acceder a sus receptores objetivo en la superficie celular mejor que los anticuerpos que están inmovilizados en las Dynabeads. Este rendimiento mejorado podría resultar muy ventajoso al expandir una población rara de células a partir de una muestra inicial.
Además, comparando el rendimiento de la expansión lograda con el agente de multimerización en el que se inmovilizaron conjuntamente los fragmentos Fab de 0,5 pg de aCD3 y de 0,5 pg de aCD28 (segunda columna de la izquierda en la Fig. 20B) con el rendimiento usando dos reactivos de multimerización que se funcionalizaron solo con el fragmento Fab de aCD3 solo o el fragmento Fab de aCD28 solo (tercera columna de la izquierda en la Fig. 20B), puede verse que ambos experimentos tuvieron la misma eficiencia de expansión. Por tanto, estos experimentos muestran que usar un reactivo de multimerización en el que tanto el primer agente como el segundo agente están inmovilizados conjuntamente es funcionalmente equivalente a usar para la expansión dos reactivos de multimerización separados que están cargados con solo el primer agente y el segundo agente, respectivamente.
Ejemplo 14: Rendimiento y fenotipo de células T CD8+ expandidas - titulación de reactivos de multimerización solubles separados con diferentes proporciones de fragmentos Fab de aCD3 y de aCD28 inmovilizados sobre ellos
En este Ejemplo, se examinaron el rendimiento y el fenotipo de células respondedoras T CD8+ expandidas (Tresp) que fueron estimuladas in vitro con fragmentos Fab de aCD3/aCD28 que fueron inmovilizados reversiblemente en diferentes cantidades en muteínas de estreptavidina oligoméricas solubles.
Para este propósito, se estimularon 300.000 células respondedoras T CD8+ (Tresp) con cantidades variables de una mezcla de preparaciones del reactivo de multimerización de estreptactina oligomérico “pequeño” (1 mg/ml) funcionalizado con Fab de aCD3 solo y Fab de aCD28 solo (“1x” corresponde a 1,5 pg de reactivo de multimerización de estreptactina funcionalizado con 0,5 pg de aCD3 solo y 1,5 pg de estreptactina multimerizada funcionalizado con 0,5 pg de fragmento Fab de aCD28 solo), o 3 pl de una preparación del reactivo de multimerización de estreptactina cargado con 0,5 pg de aCD3 y a0,5 pg de Fab de CD28, o 4,5 pl de una preparación del reactivo de multimerización de estreptactina cargado con 0,5 pg de aCD3, 0,5 pg de aCD8 marcado con strep y 0,5 pg de Fab de aCD28. Las células Tresp no tratadas sirvieron como control negativo y Tresp estimuladas con Dynabeads como control positivo. Se sembraron células Tresp en placas de 48 pocillos en 1 ml de medio de cultivo celular suplementado con 30 U/ml de IL-2. Las células se incubaron a 37° C sin intercambio de medios y se analizaron después de 5 días. La Fig. 21A representa el grado de proliferación de acuerdo con el número de células recogidas en el día 5 en comparación con los controles negativos y normalizadas al control positivo. La Fig. 21A muestra que la expansión de las células T CD8+ usando los varios reactivos de multimerización solubles de la divulgación da como resultado rendimientos más altos de las células T CD8+ que la expansión usando dynabeads (especialmente la cantidad total acumulada de reactivo de la condición 5x resultó en una expansión óptima de las células especialmente con el tiempo/aumento en el total de células al comenzar la división celular). El análisis FACS de la expresión de superficie de CD8 (Fig. 21B) y expresión de superficie de CD45RO (Fig. 21C) después del cultivo celular muestra que el mismo fenotipo de células T CD8+ se expandió mediante los varios reactivos de multimerización de la divulgación o mediante las Dynabeads disponibles comercialmente.
Ejemplo 15: Activación de cascadas de señalización intracelular después de la estimulación de multímeros de estreptámeros de células Jurkat transducidas con aCD19-CAR
En este Ejemplo, se examinó la activación de las cascadas de señalización intracelular de células Jurkat transducidas que han sido modificadas para expresar un receptor de antígeno quimérico (CAR) específico de tumor, concretamente, aquí CD19 y que fueron estimuladas usando el Strep-tactin® oligomérico del Ejemplo 5 como reactivo de multimerización soluble.
Para este propósito se estimularon 300.000 células respondedoras Jurkat (Jresp) con (A) cantidades variables de una mezcla de preparaciones de reactivo de multimerización de estreptactina (1mg/ml) funcionalizadas con fragmentos Fab de aCD3 y Fab aCD28 descritos aquí (x1 ’’ corresponde a 3 gg de reactivo de multimerización de estreptactina funcionalizado con 0,5 gg de Fab de aCD3 y 0,5 gg de Fab de aCD28, esto proporciona un “reactivo de multimerización a base de estreptactina policlonal”) o (B) 3 gl de una preparación de reactivo de multimerización de estreptactina funcionalizado con 0,5 gg (x1) o 1 gg (x2) del dominio extracelular (ECD) de CD19 (el liganod natural para el aCD19-CAR, esto proporciona un “reactivo de multimerización a base de estreptactina específico de CAR”), o 3 gl de una preparación de reactivo de multimerización de estreptactina cargado con 0,5 gg (x1) o 1 gg (x2) de algG que reconocen el espaciador de IgG4 dentro del aCD19-CAR, esto también proporciona un “reactivo de multimerización a base de muteína de estreptavidina específico de CAR). El ECD de CD19 equipado con una etiqueta de hexahistidina se obtuvo de Sino Biological/Life Technologies (SEQ ID NO: 27) y se funcionalizó para unirse al reactivo de multimerización a base de estreptavidina mezclando el ECD de CD19 con la molécula adaptadora His-STREPPER (IBA GmbH, Alemania, número de pedido 2-0920-005) a una proporción molecular de 1:1 e incubando durante 15 min a temperatura ambiente. La molécula adaptadora His-STREPPER contiene una porción quelante que se une a la etiqueta de hexahistidina y un péptido de unión a estreptavidina, proporcionando de este modo temporalmente la molécula objetivo, aquí el ECD de CD19 con un péptido de unión a estreptavidina que puede unirse reversiblemente a un reactivo de multimerización basado en muteína de estreptavidina. Jresp estimulado con Dynabeads (perlas que tienen anticuerpos monoclonales de aCD3 y aCD28 inmovilizados irreversiblemente) o PMA e lonomicina sirvieron como controles positivos. Se sembraron células Jresp en tubos Eppendorf de 1,5 ml en 200 gl de medio de cultivo celular suplementado con 30 U/ml de IL-2. Las células se incubaron a 37° C y se pusieron en hielo y se lisaron después de 0 min a 20 min de estimulación. La detección de ERK fosforilada indica señalización de MAPK activa, la tinción de la p-actina interna indica la carga de cantidades iguales de proteína total por condición y punto temporal. Como puede verse en la comparación de la Fig. 22A que muestra la activación de las células Jurkat a través del "reactivo de multimerización de estreptactina policlonal" y la Fig. 22B que muestra la activación de las células Jurkat a través de los dos "reactivos de multimerización basados en estreptactina específicos de CAR", las células Jurkat pueden activarse/expandirse mediante la unión del dominio extracelular CD19 al receptor de antígeno quimérico específico de CD19. Como el procesamiento genético en sentido descendente de las células T se realiza casi exclusivamente en poblaciones de células preseleccionadas, una activación genérica a través de la reticulación de los CAR introducidos a través del dominio espaciador de IgG4 (esto se conserva dentro de varios CAR con diferentes especificidades) amplía la aplicabilidad para la estimulación/expansión celular reversible en estas situaciones de procesamiento celular in vitro.
Por tanto, este experimento muestra que, en principio, cualquier población celular que se activa mediante la unión de un agente (ligando) que proporciona una señal de activación primaria a la población celular puede expandirse usando un primer agente inmovilizado reversiblemente en un reactivo de multimerización como se describe aquí.
Ejemplo 16: Rendimiento y composición de subconjuntos de células T CD3+ expandidas con adición de Fab de aCD8 para estimulación
El experimento muestra la expansión de células respondedoras T CD3+ purificadas estimuladas in vitro con fragmentos Fab de aCD3/aCD28 que se inmovilizaron reversiblemente en el Strep-tactin® oligomérico soluble del Ejemplo 5 que sirvió como reactivo de multimerización soluble. En un experimento, además de los fragmentos Fab de aCD3/aCD28, también se inmovilizó un fragmento Fab de aCD8 disponible comercialmente de IBA GmbH, Gottingen, Alemania (número de catálogo 6-8000-203) en el oligómero soluble de la muteína de estreptavidina para probar si es posible estimular preferentemente una subpoblación de células T específica in vitro con los multímeros reversibles de Estreptámero/Fab de aCD3/aCD28. Más detalladamente, 500.000 células respondedoras T CD3+ purificadas (Tresp) se estimularon con 3 pl de una preparación de estreptavidina oligomérica (1 mg/ml) cargada con una combinación de 0,5 pg de aCD3 y 0,5 pg de Fab de aCD28. Como enfoque alternativo, se cargaron 4,5 pl del oligómero de estreptactina con 0,5 pg de Fab de aCD3, 0,5 pg de Fab de aCD8 marcado con strep y 0,5 pg de Fab de aCD28 marcado con strep. Las células Tresp no estimuladas sirvieron como control negativo y las Tresp estimuladas con Dynabeads (perlas en las que los anticuerpos monoclonales aCD3 y aCD28 están inmovilizados irreversiblemente) sirvieron como control positivo. Como puede verse en la Fig. 23A, el reactivo de multimerización que se carga reversiblemente con el fragmento Fab de aCD3, el fragmento Fab de aCD28 y también el fragmento Fab de aCD8 proporcionaron el mayor número de células T CD3+ expandidas. Con IxI x 106 el número de células expandidas, el rendimiento fue aproximadamente un 30% más alto que para la expansión de estas células T usando Dynabeads disponibles comercialmente. Además y más importante, como se muestra en la Fig. 23B con este reactivo de multimerización que lleva el fragmento Fab de aCD3, el fragmento Fab de aCD28 y el fragmento Fab de aCD8, la cantidad de células T CD8+ fue la más alta, en comparación tanto con la expansión con Dynabeads como con un reactivo de multimerización soluble de la divulgación que lleva solo el Fragmento Fab de aCD3 y el fragmento Fab de aCD28 como primer y segundo agente como se describe en la presente. Por tanto, también este experimento muestra la ventaja de la presente divulgación de que, además de un primer agente que proporciona una señal de activación primaria a la población celular deseada y, opcionalmente, un segundo agente que proporciona una señal coestimuladora, un agente adicional que es específico para la activación de la población celular deseada puede inmovilizarse en el reactivo de multimerización. Por tanto, de este modo, la presente divulgación proporciona la posibilidad de expandir preferencialmente o enriquecer selectivamente cualquier (sub)población de células deseada de una muestra que, por ejemplo, comprende una variedad de diferentes subpoblaciones.
Ejemplo 17: Expansión paralela específica de antígenos de las células respondedoras Tcm a partir de un único grupo
En este ejemplo, se examina la cinética de la expansión paralela específica de antígeno (específica de Ag) a partir de un único grupo de células T respondedoras estimuladas in vitro con múltiples multímeros de péptido:MHC/Fab de aCH28-estreptámero reversibles.
Se estimulan simultáneamente 500.000 células respondedoras Tcm CD3+CD62L+CD45RA- (Tresp) para múltiples especificidades de Ag usando para cada especificidad, 3 pl de multímeros de estreptactina funcionalizados con 0,5 pg de los complejos péptido: MHC de clase I respectivos que portan un péptido de unión a estreptavidina y 0,5 pg de Fab de aCD28 que también lleva un péptido de unión a estreptavidina. Como enfoque alternativo, se usan 4,5 pl de reactivo de multimerización basado en estreptactina funcionalizado con 0,5 pg de complejos péptido: MHC de clase I que llevan un péptido de unión a estreptavidina, 0,5 pg de Fab de aCD8 y 0,5 pg de Fab de aCD28 como se describe aquí para cada especificidad. Para comparación, se realiza la estimulación policlonal usando 3 pl de una preparación de reactivo de multimerización basado en estreptactina (1 mg/ml) o cargado reversiblemente con una combinación de 0,5 pg de Fab de aCD3 y 0,5 pg de Fab de aCD28. De nuevo como la condición de estimulación alternativa descrita anteriormente, pueden usarse 4,5 pl de una preparación de reactivo de multimerización a base de estreptactina cargado reversiblemente con 0,5mg de Fab de aCD3, 0,5mg de Fab de aCD8 y 0,5mg de Fab de aCD28 (Cada uno de los cuales lleva un péptido de unión a estreptavidina). Las células Tresp no tratadas (no estimuladas) sirven como control negativo y las células Tresp estimuladas policlonales con Dynabeads (perlas recubiertas con MAb de aCD3 y aCD28) como control positivo. Las células Tresp se siembran en placas de 48 pocillos en 1 ml de medio de cultivo celular suplementado con 30 U/ml de IL-2 y 5 ng/ml de IL-15. Las células se incuban a 37° C con intercambio de medios cada 3 días y el recuento celular se analiza después de 7 y 14 días.
Ejemplo 18: Proliferación preferencial de células T CD8+ entre células respondedoras T CD3+ estimuladas in vitro con reactivos de multimerización basados en estreptavidina funcionalizados reversiblemente con fragmentos Fab de oCD3/oCD8/oCD28
Se estimulan 300.000 células respondedoras T CD3+ (Tresp) con 3pl de una preparación de multimerización de estreptactina (1 mg/ml) o una preparación de un reactivo de multimerización usando la estructura principal de estreptactina grande (0,1 mg/ml) o cargada con una combinación de 0,5 pg de Fab de aCD3 y 0,5 pg de Fab de aCD28, o 4,5 pl de una preparación de reactivo de multimerización a base de estreptactina cargado con 0,5 pg de Fab de aCD3, 0,5 pg de Fab de aCD8 y 0,5 pg de Fab de aCD28, o 3 pl de una mezcla de preparaciones de reactivo de multimerización a base de estreptactina con 0,5 pg de Fab de aCD3 solo y 0,5 pg de Fab de aCD28 solo (cada fragmento Fab lleva de nuevo un péptido de unión a estreptavidina). Las células Tresp no tratadas sirven como control negativo y las Tresp estimuladas con Dynabeads (perlas recubiertas con mAb de aCD3 y aCD28) como control positivo. Las células Tresp se siembran por duplicado en placas de 48 pocillos en 1 ml de medio de cultivo celular suplementado con 30 U/ml de IL-2. Las células se incuban a 37° C con intercambio de medios después de 3 días y se analizan después de 6 días.
Ejemplo 19: Proliferación preferencial de células T CD8+ entre células respondedoras T CD3+ estimuladas in vitro con reactivos de multimerización basados en estreptavidina funcionalizados reversiblemente con fragmentos Fab de aCD3 y aCD28

Claims (16)

REIVINDICACIONES
1. Un método in vitro para expandir una población de células, el método comprendiendo incubar una muestra que comprende una población de células en presencia de un reactivo de multimerización que se une reversiblemente a un primer agente y un segundo agente,
en donde el primer agente se une a una molécula receptora en la superficie de células en la población, y es capaz de proporciona una señal de activación primaria a las células, y
en donde el segundo agente se une a una molécula accesoria en la superficie de las células en la población, y es capaz de estimular las células,
en donde el primer agente (i) comprende por lo menos un compañero de unión C1 capaz de unirse reversiblemente a un sitio de unión Z1 del reactivo de multimerización para formar una unión reversible entre el compañero de unión C1 y el sitio de unión Z1, y
en donde el segundo agente (i) comprende por lo menos un compañero de unión C2 que es capaz de unirse reversiblemente a un sitio de unión Z2 del reactivo de multimerización para formar una unión reversible entre el compañero de unión C2 y el sitio de unión Z2.
2. El método de la reivindicación 1, en donde la población de células es una población de linfocitos.
3. El método de la reivindicación 2, en donde la población de linfocitos es una población de células B, una población de células T, una población de células asesinas naturales o una mezcla de las mismas.
4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el primer agente proporciona una señal primaria a las células.
5. El método de la reivindicación 3, en donde:
la población de células comprende una población de células T y el primer agente comprende un complejo péptido: MHC I o estimula una señal asociada al complejo TCR/CD3 en las células T y/o comprende un reactivo de unión que se une a CD3.
6. El método de la reivindicación 3, en donde:
la población de células comprende una población de células B y la molécula receptora es CD40 o CD137 y/o el primer agente comprende un reactivo de unión que se une a CD40 o CD137.
7. El método de la reivindicación 5, en donde la población de células comprende células T y la molécula accesoria es CD28 o CD137 y/o el segundo agente comprende un reactivo de unión que se une a CD28 o CD137 o es una mezcla de dos reactivos de unión diferentes que se unen ambos específicamente a CD28 o CD137.
8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el reactivo de multimerización está inmovilizado en una superficie sólida.
9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el reactivo de multimerización se selecciona del grupo que consiste de estreptavidina, avidina, un análogo de la estreptavidina que se une reversiblemente a la biotina, un análogo de la avidina que se une reversiblemente a la biotina, un reactivo que comprende por lo menos dos grupos quelantes K, en donde los por lo menos dos grupos quelantes son capaces de unirse a un ion de metal de transición, haciendo de este modo que la fracción A sea capaz de unirse a una etiqueta de afinidad de oligohistidina, glutatión-S-transferasa multimérica, calmodulina multimérica y una proteína portadora biotinilada.
10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el reactivo de multimerización está en una forma soluble.
11. El método de la reivindicación 10, en donde el reactivo de multimerización comprende un oligómero o un polímero de estreptavidina, un oligómero o un polímero de avidina, un oligómero o un polímero de un análogo de estreptavidina que se une reversiblemente a biotina, un oligómero o un polímero de un análogo de avidina que se une reversiblemente a biotina, un reactivo que comprende por lo menos dos grupos quelantes K, en donde los por lo menos dos grupos quelantes son capaces de unirse a un ion de metal de transición, haciendo de este modo que el reactivo sea capaz de unirse a una etiqueta de afinidad de oligohistidina, glutatión-S-transferasa multimérica, calmodulina multimérica y una proteína portadora biotinilada.
12. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde
(a) dicho compañero de unión C1 y/o dicho compañero de unión C2 comprende biotina y dicho reactivo de multimerización comprende un análogo de estreptavidina o un análogo de avidina que se une reversiblemente a biotina;
(b) dicho compañero de unión C1 y/o dicho compañero de unión C2 comprende un análogo de biotina que se une reversiblemente a estreptavidina o avidina y dicho reactivo de multimerización comprende estreptavidina, o avidina, o un análogo de estreptavidina, o un análogo de avidina que se une reversiblemente a dicho análogo de biotina; o
(c) dicho compañero de unión C1 y/o dicho compañero de unión C2 comprende un péptido de unión a estreptavidina o avidina y dicho reactivo de multimerización comprende estreptavidina, o avidina, o un análogo de estreptavidina, o un análogo de avidina que se une reversiblemente a dicho péptido de unión a estreptavidina o avidina.
13. El método de la reivindicación 12, en donde dicho compañero de unión C1 y/o dicho compañero de unión C2 comprende el péptido de unión a estreptavidina Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys y dicho reactivo de multimerización comprende un análogo de estreptavidina que comprende la secuencia de aminoácidos Val 44-Thr45-Ala46-Arg47 en las posiciones de secuencia 44 a 47 de la estreptavidina de tipo salvaje o un análogo de estreptavidina que comprende la secuencia de aminoácidos lle44-Gly45-Ala46-Arg47 en las posiciones de secuencia 44 a 47 de la estreptavidina de tipo salvaje.
14. El método de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 13, en donde los compañeros de unión C1 y C2 son idénticos o diferentes.
15. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-14, que comprende además interrumpir la unión entre dicho compañero de unión C1 del primer agente y/o dicho compañero de unión C2 del segundo agente y dichos sitios de unión Z1 y/o Z2 de dicho reactivo de multimerización, opcionalmente en donde dicha interrupción provoca la finalización de la estimulación de las células.
16. El método de la reivindicación 15, en donde la unión reversible es interrumpido por la puesta en contacto de las células con biotina o un análogo de biotina, cuando
(a) dicho compañero de unión C1 y C2 comprende independientemente uno de otro otra biotina y dicho reactivo de multimerización comprende un análogo de estreptavidina o un análogo de avidina que se une reversiblemente a biotina,
(b) dicho compañero de unión C1 y C2 comprende independientemente uno de otro un análogo de biotina que se une reversiblemente a estreptavidina o avidina y dicho reactivo de multimerización comprende estreptavidina, o avidina, o un análogo de estreptavidina o un análogo de avidina que se une reversiblemente a biotina, o (c) dicho compañero de unión C1 y C2 comprende independientemente uno de otro un péptido de unión a estreptavidina o avidina y dicho reactivo de multimerización comprende estreptavidina, o avidina, o un análogo de estreptavidina, o un análogo de avidina que se une reversiblemente a dicho péptido de unión a estreptavidina o avidina.
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