CN111961647A - 用于扩增细胞群的方法、试剂盒及装置 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及扩增细胞群诸如淋巴细胞的体外方法，其包括使包含细胞群的样品与多聚化剂接触。所述多聚化剂具有可逆固定(结合)于其上的、向细胞提供初级激活信号的第一试剂，以及任选地，具有提供共刺激信号的第二试剂。本发明还提供了用于扩增细胞的多聚化剂、试剂盒、排布和装置。

Description

用于扩增细胞群的方法、试剂盒及装置
相关申请的交叉引用
本发明要求于2014年4月16日向美国专利商标局提交的美国临时专 利申请61/980,506“用于扩增细胞群的方法、试剂盒及装置(Methods,Kits And Apparatus ForExpanding A Population Of Cells)”的优先权权益，其内容 特此出于所有目的通过引用整体并入本文。
发明领域
本发明涉及细胞群诸如淋巴细胞群的扩增(增殖)。本发明大体上提供了 一种用于细胞群扩增(增殖)的新方法及试剂，其需要受体结合分子(诸如文 本所述的第一试剂)与细胞表面的受体分子结合，从而向细胞提供初级激活 信号。本发明采用一种多聚化剂，其具有固定(结合)结合于其上的、向细胞 提供初级激活信号的第一试剂。这种初级激活信号可足以激活细胞以扩增/ 增殖。此种第一试剂能可逆或不可逆地与多聚化剂结合。该多聚化剂还可 以具有固定(结合)于其上的、刺激细胞表面辅助分子的第二试剂。该第二试剂当与细胞表面的辅助分子结合时，可由此刺激已激活的细胞扩增。此 外，第二试剂能可逆或不可逆地与多聚化剂结合。多聚化剂可以被固定在 固体载体上或是可溶的。一方面，本文所公开的方法是细胞群的连续扩 增，其中一个完整的淋巴细胞群被刺激/扩增，然后在适合的固定相中通过 层析除去扩增所必需的试剂，被扩增/刺激的细胞任选地用如T细胞受体或 嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)进行转染，并用与所引入的T细胞受体或嵌合抗原受体结合的不同刺激分子进行二次刺激扩增。本发明 还涉及一种用于选定细胞群扩增的装置。
背景技术
体外增殖T细胞群技术的发展对T细胞识别抗原和T细胞激活理解方 面的许多进展是至关重要的。用于人抗原特异性T细胞克隆繁殖的培养方 法的开发已经用于界定被T细胞识别的由病原体和肿瘤表达的抗原，从而 建立免疫疗法以治疗多种人类疾病。抗原特异性T细胞可在体外扩增用于 过继性细胞免疫疗法或癌症疗法，其中输注这样的T细胞已在荷瘤宿主中 显示出抗肿瘤活性。此外，过继性免疫疗法也被用于治疗免疫妥协个体的病毒感染。
近几年已建立的在缺乏外源性生长因子和佐细胞的情况下体外扩增人 T细胞的方法在美国专利US 6,352,694 B1和欧洲专利EP 0 700 430 B1中有 所描述。这些专利中公开了一种用于诱导T细胞群增殖的体外方法。该方 法包括使T细胞群与固体表面接触，所述固体表面具有直接固定于其上 的：(a)第一试剂，其向T细胞提供初级激活信号，从而激活T细胞；和(b) 第二试剂，其刺激T细胞表面的辅助分子，从而刺激已激活的T细胞。第 一试剂和第二试剂与T细胞的结合诱导T细胞增殖/扩增。在美国专利US 6,352,694 B1和欧洲专利EP 0 700 430 B1中所述的优选第一试剂是单克隆 抗CD3抗体，其在T细胞中与TCR/CD3(TCR＝T细胞受体(T cell receptor)) 复合物结合，从而刺激TCR/CD3复合物相关的信号。根据这两篇专利所述 的优选第二试剂是与T细胞呈递的辅助分子CD28结合的单克隆抗CD28抗 体。该第二试剂与CD28辅助分子的结合提供了对激活的T细胞扩增/增殖 所必需的必要共刺激。同时，市售的
Figure BDA0002497768740000021
CD3/CD28(Invitrogen)可 用于T细胞扩增。
Figure BDA0002497768740000022
CD3/CD28 CTSTM是均质的、4.5μm超顺磁 性无菌无热原的、涂覆有抗人T细胞的CD3和CD28细胞表面分子的经亲 和纯化的单克隆抗体混合物的聚苯乙烯珠。
然而，这种磁珠，例如，在临床试验或治疗目的所要求的条件下，难 以整合到扩增细胞的方法中，因为必须保证这些磁珠在向患者施用扩增的 T细胞于之前被完全去除。因此，本发明的目的在于为研究、诊断特别是 治疗的目的提供一种用于扩增细胞群诸如调节性T细胞或中枢记忆T细胞 的替代方法。理想地，这种新方法也应当适于整合到可用于快速简便扩增 为治疗应用所需的细胞群的自动化过程中。
这一目的是通过独立权利要求的主题，尤其是独立权利要求中所述的 方法、试剂盒、排布和装置实现的。
发明概述
本发明提供了用于体外扩增所需细胞群的方法、试剂盒、排布和装 置，所述细胞表面具有受体分子，其一旦与合适的试剂结合便会向细胞群 提供初级激活信号，并从而激活细胞群扩增(增殖)。因此，本发明的方法也 可用于诱导细胞群增殖。
第一方面，本发明提供了一种扩增细胞群的体外方法，其包括使包含 细胞群的样品与多聚化剂接触，
其中所述多聚化剂具有可逆固定(结合)于其上的、向细胞提供初级激活 信号的第一试剂；
其中所述多聚化剂包含至少一个结合位点Z1用于第一试剂的可逆结 合，
其中所述第一试剂包含至少一个结合配偶体C1，其中所述结合配偶体 C1能够可逆地与多聚化剂的结合位点Z1结合，其中所述第一试剂通过结 合配偶体C1和结合位点Z1之间形成的可逆键与多聚化剂相结合，以及
其中所述第一试剂与细胞表面的受体分子结合，由此向细胞提供初级 激活信号从而激活细胞。
第二方面，本发明提供了一种扩增细胞群的体外方法，其包括使包含 细胞群的样品与多聚化剂接触，
其中所述多聚化剂是可溶形式的，并且具有固定(结合)于其上的、向细 胞提供初级激活信号的第一试剂；
其中所述多聚化剂包含至少一个结合位点Z1用于第一试剂的结合，
其中所述第一试剂包含至少一个结合配偶体C1，其中所述结合配偶体 C1能够与多聚化剂的结合位点Z1结合，其中所述第一试剂通过结合配偶体 C1和结合位点Z1之间形成的键与多聚化剂相结合，以及
其中所述第一试剂与细胞表面的受体分子结合，由此向细胞提供初级 激活信号从而激活细胞。
第三方面，本发明提供了用于扩增细胞群的试剂盒，所述试剂盒包 括：
(i)多聚化剂，
其中，所述多聚化剂包含至少一个结合位点Z用于第一试剂的可逆结 合，
(ii)第一试剂，其与细胞表面受体分子结合，由此向细胞提供初级激活 信号从而激活细胞，
其中所述第一试剂包含至少一个结合配偶体C1，其中所述结合配偶体 C1能够可逆地与多聚化剂的结合位点Z1结合，其中所述第一试剂通过结 合配偶体C1和结合位点Z1之间形成的可逆键与多聚化剂相结合，以及
(iii)第二试剂，其刺激细胞表面的辅助分子，
其中所述第二试剂包含结合配偶体C2，其中所述结合配偶体C2能够 可逆地与多聚化剂的结合位点Z2结合，其中所述第二试剂通过结合配偶体 C2和结合位点Z2之间形成的键与多聚化剂相结合，
其中所述第二试剂与细胞表面的辅助分子结合，从而刺激已激活的细 胞。
第四方面，本发明提供了一种用于扩增细胞群的试剂盒，所述试剂盒 包括：
(i)多聚化剂，
其中所述多聚化剂是可溶形式的，并且包含至少一个结合位点Z用于 第一试剂的可逆结合,
(ii)第一试剂，其与细胞表面的受体分子结合，由此向细胞提供初级激 活信号从而激活细胞，
其中所述第一试剂包含至少一个结合配偶体C1，其中所述结合配偶体 C1能够与多聚化剂的结合位点Z1结合，其中所述第一试剂通过结合配偶 体C1和结合位点Z1之间形成的可逆键与多聚化剂相结合。
第五方面，本发明提供了一种连续扩增淋巴细胞群的体外方法，其中 所述淋巴细胞群包含T细胞，所述方法包括：
使含有包含T细胞的淋巴细胞群样品与多聚化剂接触，
其中所述多聚化剂是可溶形式，并且具有可逆固定于其上的(i)向T细 胞提供初级激活信号的第一试剂和(ii)刺激T细胞表面辅助分子的第二试 剂，
其中所述多聚化剂包含至少一个结合位点Z1用于第一试剂的可逆结合,
其中所述第一试剂包含至少一个结合配偶体C1，其中所述结合配偶体 C1能够可逆地与多聚化剂的结合位点Z1结合，其中所述第一试剂通过结 合配偶体C1和结合位点Z1之间形成的可逆键与多聚化剂相结合，
其中所述多聚化剂包含至少一个结合位点Z2用于第二试剂的可逆结合,
其中所述第二试剂包含至少一个结合配偶体C2，其中所述结合配偶体 C2能够可逆地与多聚化剂的结合位点Z2结合，其中所述第二试剂通过结 合配偶体C2和结合位点Z2之间形成的可逆键与多聚化剂相结合，
其中所述第一试剂与T细胞表面的受体分子结合，由此向细胞提供初 级激活信号从而激活T细胞，
其中所述第二试剂与T细胞表面的辅助分子结合，由此刺激已激活的 细胞，从而所述第一试剂和所述第二试剂一同诱导T细胞扩增。
第六方面，本发明提供了一种包含生物反应器和层析固定相的排布，
其中所述生物反应器适于细胞的扩增，
其中所述固定相适于细胞分离和试剂去除，所述固定相为凝胶过滤基 质和/或亲和层析基质，其中所述凝胶过滤和/或亲和层析基质包括亲和试 剂，其中所述亲和试剂包含与第一试剂中所含结合配偶体C1特异性结合的 结合位点Z1，和/或所述亲和试剂包含与第二试剂中所含结合配偶体C2特 异性结合的结合位点Z2，由此适于将第一试剂和/或第二试剂、第一结合配 偶体C1和/或游离的第二结合配偶体C2固定于固定相上，
其中，所述生物反应器和所述固定相是流体连接的。
第七方面，本发明提供了一种用于纯化和扩增细胞群的装置，所述装 置包含至少一个根据第六方面所述的包含生物反应器和层析固定相的排 布。
第八方面，本发明提供了一种能够扩增细胞群的多聚化剂，
其中所述多聚化剂是可溶形式的，并且包含至少一个结合位点Z1用于 向细胞提供初级激活信号的第一试剂的可逆结合，
其中所述多聚化剂具有可逆固定(结合)于其上的、向细胞提供初级激活 信号所述第一试剂，
其中所述第一试剂包含至少一个结合配偶体C1，其中所述结合配偶体 C1能够可逆地与多聚化剂的至少一个结合位点Z1结合，
其中所述第一试剂通过结合配偶体C1和结合位点Z1之间形成的可逆 键与多聚化剂相结合。
第九方面，本发明提供了一种能够扩增细胞群的组合物，所述组合物 包含：
(i)第一多聚化剂，
其中所述第一多聚化剂是可溶形式的，并且包含至少一个结合位点Z1 用于向细胞提供初级激活信号的第一试剂的可逆结合，
其中所述第一多聚化剂具有可逆固定(结合)于其上的、向细胞提供初级 激活信号所述第一试剂；
其中所述第一试剂包含至少一个结合配偶体C1，其中所述结合配偶体 C1能够可逆地与多聚化剂的至少一个结合位点Z1结合，其中所述第一试 剂通过结合配偶体C1和结合位点Z1之间形成的可逆键与多聚化剂相结 合，以及
(ii)第二多聚化剂，
其中所述第二多聚化剂是可溶形式的，并且包含至少一个结合位点Z2 用于对细胞表面辅助分子进行刺激的第二试剂的可逆结合，
其中所述多聚化剂具有可逆固定(结合)于其上的、刺激细胞表面辅助分 子的所述第二试剂，
其中所述第二试剂包含结合配偶体C2，其中所述结合配偶体C2能够 与多聚化剂的至少一个结合位点Z2结合，其中所述第二试剂通过结合配偶 体C2和结合位点Z2之间形成的键与多聚化剂相结合。
附图说明
参考以下详细描述并结合考虑非限制性实施例和附图，将能更好得理 解本发明。附图示出了本发明方法的具体实施方式。不希望受到理论的束 缚，附图包括了关于下述扩增机制的结论。所给出的结论仅用于说明的目 的，并仅仅用于使扩增方法在分子水平上可实现可视化。
图1示出了一种扩增细胞群的体外方法的实施方式，所述细胞群具有 细胞表面受体，其与第一试剂的结合可提供细胞扩增的激活信号。
如图1a所示，包含携带表面受体分子(30)的细胞群(2)的样品与多聚化 剂(4)接触。细胞群(2)是与其它缺乏表面受体分子(30)的细胞群(22)混合在一 起的。多聚化剂(4)具有可逆固定(结合)于其上的、向细胞提供初级激活信 号的第一试剂(6)。多聚化剂(4)包含至少一个结合位点Z1(42)用于第一试剂 (6)的可逆结合，而第一试剂(6)包含至少一个结合配偶体C1(6a)，其中，结 合配偶体C1(6a)能够可逆地与多聚化剂的结合位点Z1(44)结合。因此，为 了固定，第一试剂(6)通过结合配偶体C1(6a)和结合位点Z1(42)之间形成的可逆键与多聚化剂(4)相结合。在图1所示的实施例中，多聚化剂(4)具有该 实施例中未使用的第二结合位点Z2(44)。多聚化剂(4)本身被固定在固体载 体(10)上，例如磁珠、聚合珠、细胞培养板或反应器的表面。细胞群(2)例 如诸如B细胞群的淋巴细胞群可以通过CD40受体而被激活(参见例如 Carpenter等人，Journal of Translational Medicine 2009,7:93“Activation of human B cells by the agonist CD40 antibody CP-870,893andaugmentation with simultaneous toll-like receptor 9stimulation)。在这个示例中，细胞表面分子 (30)是CD40，第一试剂(6)可以是任何提供所需激活信号的CD40结合分 子，例如，单克隆抗体CP-870,893或其抗体结合片段，诸如单价Fab片 段。第一试剂(6)的结合配偶体C1可以是例如与例如抗体分子两条多肽链 (重链或轻链)其中一条的C端融合或缀合的任何亲和肽。结合配偶体C1(6a) 可以是例如，诸如肽Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:01)的链 霉亲和素结合肽，也称为美国专利US 5,506,121中所描述的“Strep标 记”
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或者例如，具有包含两个或多个单独结合模块的连续排布 的链霉亲和素结合肽，如国际专利公开WO 02/077018或美国专利US 7,981,632中所描述的。当使用链霉亲和素结合肽作为结合配偶体C1时， 多聚化剂(4)是与链霉亲和素肽(＝第一结合配偶体C1(6a))经由其(生物素)如 图示于图1的结合位点Z1(42)可逆结合的任意链霉亲和素突变蛋白。这种 多聚化剂可以是在野生型链霉亲和素序列位点第44至47位上包含氨基酸 序列Va144-Thr45-Ala46-Arg47(SEQ ID NO:02)的链霉亲和素突变蛋白(类似 物)，或者是在野生型链霉亲和素序列位点第44至47位上包含氨基酸序列 lle44-Gly45-Ala46-Arg47(SEQ ID NO:03)的链霉亲和素突变蛋白(类似物)，这 两者均在例如美国专利US 6,103,493中有所描述，并且可以商标Strep-
Figure BDA0002497768740000081
购得。在图1的实施例中，多聚化剂(4)可以进一步包括多聚钙调蛋 白或谷胱甘肽-S-转移酶，两者均与钙调蛋白结合肽或谷胱甘肽形成可逆 键。因此，结合位点Z2(44)可由钙调蛋白或谷胱甘肽-S-转移酶构成。这种 例如钙调蛋白与链霉亲和素突变蛋白形成的蛋白缀合物可通过标准蛋白质 化学制备，例如，通过使用双功能接头。
如图1b中所示，在使细胞群(2)与多聚化剂(4)接触并通常是用多聚化 剂(4)孵育细胞群后，细胞群(2)经由第一试剂(6)与多聚化剂形成复合物/相结 合。第一试剂与细胞表面受体分子诸如该实施例中的CD40特异性结合， 并提供例如B细胞扩增的细胞扩增激活信号。包含在初始样品中的、缺乏 特异性细胞表面分子(30)的其它细胞群(22)无法与多聚化剂结合。在这方 面，应当注意的是，细胞群(2)通常在其表面具有多个拷贝的细胞表面分子 (30)，并且这些多个重拷贝的结合通常是激活所需要的。因此，多聚化剂(4) 通常提供不止一个的结合位点Z1，这样使得多个第一试剂(6)可以可逆地结 合以实现第一试剂的“多聚化”，即意味着将足够密度的第一试剂呈现给细 胞群(2)(未在图1的图式中示出)。在这方面，应当注意的是，本文使用的 多聚化试剂本身可具有多个结合位点Z1，例如，链霉亲和素突变蛋白(为同 源四聚体)其天然态具有四个这样的结合位点Z1。然而也有可能是，多聚化 剂是基于一种本身仅有一个结合位点Z1用于结合配偶体C1可逆结合的化 合物。这样的实例是多聚钙调蛋白。钙调蛋白本身仅具有一个钙调蛋白结 合肽的结合位点。然而，钙调蛋白可以被生物素化，然后与链霉亲和素寡 聚物发生反应(也参见下文)，从而提供其中多个钙调蛋白分子在“支架 (scaffold)”上以高浓度呈现的多聚化剂，由此提供多聚钙调蛋白。
如图1c所示，孵育(通常进行一段适宜的时间以实现所需细胞群的扩增) 后，第一试剂(6)的结合配偶体C1(6a)和多聚化剂(4)的结合位点Z1之间的 结合通过破坏各自的可逆键而被破坏。可以通过向含有与多聚化剂结合的 细胞群(2)的孵育/反应混合物中加入竞争物来实现这种破坏。为了竞争性破 坏(可以理解为竞争性洗脱)第一试剂的结合配偶体C1(6a)和多聚化剂的结 合位点Z1(22)之间的可逆键，孵育混合物/细胞群可以与游离的第一结合配 偶体C1(20)或所述第一结合配偶体C的类似物接触，所述第一结合配偶体 C的类似物能够破坏第一结合配偶体C1(6a)和结合位点Z1(22)之间的键。 在结合配偶体C1为与链霉亲和素的生物素结合位点相结合的链霉亲和素结 合肽的实施例中，第一游离配偶体C1(20)可以是相应的游离链霉亲和素结 合肽或者是竞争性结合的类似物。这样的类似物可以是例如生物素或诸如 脱硫生物素的生物素衍生物。
如图1d所示，第一游离配偶体(20)或其类似物的加入导致结合配偶体 C1(6a)从多聚化剂(4)上被置换下来，由于结合配偶体C1被包含在第一试剂 (6)中，从而导致第一试剂(6)从多聚化剂(4)上被置换下来。第一试剂(6)的这 种置换转而导致第一试剂(6)从细胞表面受体(30)上解离，特别是，如果第 一试剂和细胞表面受体(30)之间的键的结合亲和力解离常数(Kd)在10-2M至 10-13M的范围内并因此也是可逆的。由于这种解离，细胞群(2)的刺激也被 终止。因此，本发明提供了这样的优势：细胞群的刺激或扩增的时间段可 被精确控制，因此细胞群的功能状态也可被严密控制。关于这点，应当注 意的是，抗体分子对其抗原(包括例如细胞表面受体分子，诸如该实施例中 的CD40)的结合亲和力通常处于Kd为10- 7M至10-13M的亲和力值范围 内。因此，常规的单克隆抗体可用作本发明中的第一试剂(当然也可用作如 下文所述的第二试剂)。为了避免导致更强结合的任何不期望的亲和作用， 单克隆抗体也可以以其单价抗体片段例如Fab片段或单链Fv片段的形式使 用。
此外，由于第一试剂从细胞表面分子(30)解离，本发明还具有附加的优 势：被刺激的细胞群在刺激期结束时不含刺激试剂和本方法中使用的所有 其它试剂，也就是说第一试剂(6)以及结合配偶体C1或其类似物的游离第一 配偶体(20)可通过国际专利申请WO2013/124474中所述的“去除筒(removal cartridge)”从被刺激的细胞群(2)上被轻易去除，而被固定于固体载体诸如生 物反应器表面或磁珠上的多聚化剂(4)被保留。因此，回到游离试剂(6)和游 离第一配偶体(20)的去除，依照WO 2013/124474中对“去除筒”的描述(参见 例如其中的图4)，本文图1d中获得的洗脱样品可上样到WO 2013/124474 中所述的第二层析柱上。该层析柱具有合适的固定相，其既是亲和层析基 质，同时也能作为凝胶渗透基质。该亲和层析基质具有固定于其上的亲和 试剂。在当前实施例中，该亲和试剂可以是例如链霉亲和素、链霉亲和素 突变蛋白、亲和素、亲和素突变蛋白或其混合物。第一试剂(6)、结合配偶 体C1的游离第一配偶体(20)(在此也被称为“竞争试剂”)与亲和试剂结合，由此被固定在层析基质上。结果，含有已分离的扩增细胞群(2)的洗脱样品 正耗尽第一试剂(6)和竞争试剂(20)。不含任何试剂的扩增的细胞群(2)此时 处于留待进一步使用的条件下，例如，用于诊断应用(例如，进一步的 FACSTM分选)或者用于任何基于细胞的治疗应用。
图2示出了本发明扩增方法的另一个实施方式。如图2a所示，样品包 含携带两个特异性细胞表面分子(30)和(32)的细胞群(2)。细胞表面分子(30) 参与向细胞群提供初级激活信号，而细胞表面分子(32)是参与向细胞提供刺 激的细胞表面的辅助分子。所述细胞群可以是，例如，细胞表面分子(30) 为TCR/CD3复合物且细胞表面分子(32)为辅助分子CD28的T细胞群。作 为初级激活信号的TCR/CD3复合物的结合和作为共刺激物的CD28的结合 对于T细胞的扩增/增殖是必要的。T细胞群(2)是与其它缺乏表面受体分子 (30)和(32)的细胞群(22)混合在一起的。另外，在本实施方式中，细胞群(2) 与多聚化剂(4)相接触。多聚化剂(4)具有可逆固定(结合)于其上的、向细胞 提供初级激活信号的第一试剂(6)。此外，多聚化剂具有可逆固定(结合)于 其上的、刺激作为细胞表面辅助分子的CD28的第二试剂(8)。
多聚化剂(4)包含至少一个结合位点Z1(42)用于第一试剂(6)的可逆结 合，并且第一试剂(6)包含至少一个结合配偶体C1(6a)，其中结合配偶体 C1(6a)能够可逆地与多聚化剂的结合位点Z1(44)结合。因此，为了固定， 第一试剂(6)通过结合配偶体C1(6a)和结合位点Z1(42)之间形成的可逆键与 多聚化剂(4)相结合。此外，在图2所述的实施例中，第二试剂(8)包含结合 配偶体C2(8a)，其中所述结合配偶体C2能够被可逆地与多聚化剂(4)的结 合位点Z2(44)结合。第二试剂(8)通过结合配偶体C2(8a)和结合位点Z2(44) 之间形成的可逆键与多聚化剂(4)相结合。在本实施例中，第一试剂(6)可能 是单克隆抗CD3抗体或其抗原结合片段如Fab片段。第二试剂(8)可能是单 克隆抗CD28抗体或其抗原结合片段如Fab片段。第一结合配偶体(6a)可能 是与抗CD3抗体或抗CD3抗体片段融合或缀合的链霉亲和素结合肽(6a)。 第二结合配偶体(8a)可能是也与CD28抗体或CD28结合抗体片段缀合或融 合的钙调蛋白结合肽。关于这点，应当注意的是，抗例如CD3或CD28的 单克隆抗体是众所周知的(参见例如，如上所述的美国专利US 6,352,694 B 或欧洲专利EP 0 700 430 B1)并且可购自许多供应商例如Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz,CA,USA)、LifeTechnologies(Carlsbad,CA, USA)、BD Biosciences(San Jose,CA,USA)、Biolegend(SanDiego,CA,USA) 或者Miltenyi Biotec(Bergisch Gladbach,Germany)，仅仅举几个例子。因 此，这种单克隆抗体可用作第一试剂和第二试剂，并且可以与例如结合配 偶体C1或C2化学偶联(缀合)。或者，也可以从杂交瘤细胞系克隆可变结 构域的基因或者使用氨基酸序列已知的抗体，重组产生各自的抗体片段例 如Fab片段或者Fv。当在关于产生单克隆抗CD3抗体的杂交瘤细胞系 OKT3(
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CRL-8001TM，如美国专利US 4,361,549所描述的)和抗CD28 抗体28.3(如Vanhove等人BLOOD,15July 2003，Vol.102,No.2,pages 564-570和基因库(GenBank)登录号AF451974.1中所描述)两者的实施例部分 中使用本文所述的这种方法时，通过用于重组生产的各自表达载体很方便 地提供结合配偶体C1和C2，这样抗体片段在轻链或重链的C端携带作为 融合肽的结合配偶体C1或C2(关于这点，如Arakawa等人J.Biochem.120, 657-662(1996)中所描述的抗体OKT3的重链可变结构域和轻链可变结构域 的氨基酸序列出于说明的目的以SEQ ID NO 17和18及所附序列表示出， 而如上述Vanhove等人中所描述的抗CD28抗体28.3的可变结构域的氨基 酸序列在所附序列表中以SEQ ID NO 19(VH)和20(VL)示出)。克隆抗体 分子的可变结构域并重组生产各自抗体片段的这种方法也是本领域技术人 员而言所熟知的，参见例如，Skerra,A.(1994)A generalvector,pASK84,for cloning,bacterial production,and single-step purificationof antibody Fab fragments.Gene 141,79-84,或者Skerra,A.(1993)Bacterialexpression of immunoglobulin fragments.Curr Opin Immunol.5,256-562。最后，如图2实 施例中所述，还可以通过下列众所周知的进化方法来产生具有抗给定靶物 诸如CD3或CD28的抗体样特性人工结合分子的抗体分子，诸如噬菌体展 示(例如，Kay,B.K.等人(1996)Phage Display of Peptides and Proteins–A Laboratory Manual,1st Ed.,Academic Press,New York NY；Lowman,H.B. (1997)Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.26,401–424，或者Rodi,D.J.和 Makowski,L.(1999)Curr.Opin.Biotechnol.10,87–93中所综述的)、核糖体 展示(Amstutz,P.等人(2001)Curr.Opin.Biotechnol.12,400-405中所综述的) 或者如Wilson,D.S.等人(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98,3750-3755中所 报道的mRNA展示。
在图2所示的实施例中，多聚化剂(4)具有两个不同的结合位点Z1(42) 和Z2(44)。当结合配偶体C1(6a)是链霉亲和素结合肽时，多聚化剂(4)的结 合位点Z1(42)由合适的与链霉亲和素肽(6a)可逆结合的链霉亲和素突变蛋 白提供。由于结合配偶体C2是钙调蛋白结合肽，多聚化剂(4)的结合位点 Z2(44)由多聚钙调蛋白提供。多聚化剂(4)可以是单个分子，例如多聚钙调 蛋白与链霉亲和素的缀合物(该替代选择可能通常是在可溶性多聚化的情况 下采用)，或者也可以由两个独立分子组成。当多聚化剂(44)被固定于如图2 所示的固体载体时，后一种选择是优选的。在这种情况下，链霉亲和素突 变蛋白和钙调蛋白的混合物被涂覆(固定)在固体载体上，例如，按结合位点 Z1和Z2为1:1的摩尔比。关于这点，应当注意的是，由于钙调蛋白固定在 固体载体上，无需再制备如上所述的多聚钙调蛋白，但是钙调蛋白固定在 表面上足以呈现足够高密度的钙调蛋白(如上所述，钙调蛋白仅有一个钙调 蛋白结合肽的结合位点)，以确保细胞群(2)的结合。例如，在这种情况下， 具有两个抗CD28结合位点的二价抗体片段或者自身具有两个相同结合位 点的完整抗体可以用作第二试剂(8)。
如图2b所示，在使T细胞群(2)与多聚化剂(4)接触并通常用多聚化剂(4) 孵育细胞群之后，T细胞群(2)经由第一试剂(6)和第二试剂(8)与多聚化剂形 成复合物/相结合。第一试剂(6)和第二试剂(8)与TCR/CD3复合物和辅助分 子CD28特异性结合，由此诱导T细胞增殖/扩增。
如图2c所示，在孵育(通常进行一段适宜的时间以实现所需细胞群的扩 增)之后，第一试剂(6)的结合配偶体C1(6a)和多聚化剂(4)的结合位点Z1之 间的结合通过破坏各自的可逆键而被破坏。同样地，第二试剂(8)的结合配 偶体C2(8a)和多聚化剂(4)的结合位点Z2之间的结合通过破坏各自的可逆 键而被破坏。第一试剂(6)的结合配偶体C1(6a)和结合位点Z1之间的可逆 键可被生物素(其充当游离的第一配偶体的类似物(20))破坏，而由于钙调蛋 白与钙调蛋白结合肽的结合是钙离子(Ca2+)依赖型，因此第二试剂(8)的结合 配偶体C2(8a)和结合位点Z2之间的可逆键可通过加入金属螯合剂(钙离子 螯合剂)诸如EDTA或EGTA(其充当游离的第二配偶体的类似物(20))而被破 坏。当然，这意味着与细胞群(2)的接触是在含Ca2+的缓冲液中进行。
如图2d所示，第一游离配偶体和第二游离配偶体的类似物(20)的加 入，分别导致结合配偶体C1(6a)和C2(8a)从多聚化剂(4)上被置换下来，因 而导致第一试剂(6)和第二试剂(8)从多聚化剂(4)上被置换下来。第一试剂(6) 和第二试剂(8)的这种置换转而导致第一试剂(6)和第二试剂(8)从TCR/CD3 复合物和辅助分子CD28上解离，由此终止细胞群(2)的刺激/扩增。因此， 如上所述，本发明提供了可精确控制T细胞群刺激或扩增的时间段从而严 密控制T细胞群功能状态的优势。在如图1d所示的洗脱细胞后，第一试剂 (6)、第二试剂(8)以及结合配偶体C1的游离第一配偶体和结合配偶体C2的 第二游离配偶体的类似物(20)可经由如国际专利申请WO 2013/124474中所 述的”去除筒”从被刺激过的细胞群(2)上被轻易地除去。此外，重要的是， 假使初始样品是例如由聚蔗糖(Ficoll)梯度得到的PMBC形式的淋巴细胞 群，那么T细胞群(2)此时便可用于如本文所定义的连续扩增。由于扩增的 细胞群(例如，通过CD3/CD28的初始刺激)在扩增期间可用例如T细胞受体 (TCR)或嵌合抗原受体(CAR，也被称为人造T细胞受体)转染，然后经基因 修饰的细胞可从初始刺激中释放出来，并随后被第二类刺激例如重新引入 的受体所刺激。这些第二刺激可以包括以肽/MHC分子形式存在的抗原刺激 物、遗传引入受体的同源(交联)配体(例如，CAR的天然配体)或在新受体的 框架内直接结合(例如，通过在受体内识别恒定区)的任意配体(例如抗体)。 因此，从这种连续扩增中获得的T细胞群可用于过继性细胞转移。
图3示出了本发明扩增方法的又一个实施方式。此外，该实施例所用 的样品包含携带两个特异性细胞表面分子(30)和(32)的T细胞群(2)，其中细 胞表面分子(30)是TCR/CD3复合物且细胞表面分子(32)是辅助分子CD28。 在图3a中，示出的是与多聚化剂(4)接触后的T细胞群(2)。此外，在该实 施例中，多聚化剂(4)具有可逆固定(结合)于其上作为第一试剂(6)的、向T 细胞提供初级激活信号的抗CD3抗体或其抗原结合片段，以及作为第二试剂(8)的、刺激辅助分子CD28的抗CD28抗体或其抗原结合片段。
图3实施例中所示的多聚化剂(4)仅包括一类结合位点Z1(42)用于第一 试剂(6)和第二试剂(8)两者的可逆结合。第一试剂(6)和第二试剂(8)两者都包 含至少一个结合配偶体C1(6a、8a)，其中结合配偶体C1(6a)和结合配偶体 (8a)两者都能够可逆地与多聚化剂的结合位点Z1(44)结合。因此，为了固 定，第一试剂(6)和第二试剂(8)通过结合配偶体C1(6a)和结合配偶体C2与 结合位点Z1(42)之间形成的可逆键分别与多聚化剂(4)相结合。结合配偶体 C1和C2可以是不同的或相同的。例如，结合配偶体C1可以是序列为Trp- Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys((SEQ ID NO:01)，“Strep标记
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”)的 链霉亲和素结合肽，而结合配偶体C2可以是序列为Trp-Ser-His-Pro-Gln- Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys((SEQ ID NO: 04)，也被称为“di-tag3”)或为Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys- (GlyGlyGlySer)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys((SEQ ID NO:05)，也被称 为“the di-tag2”)的链霉亲和素结合肽，如Junttila等人,Proteomics 5(2005), 1199-1203或美国专利7,981,632中所描述的。所有这些链霉亲和素结合肽 都与相同的结合位点相结合，即链霉亲和素的生物素结合位点。如果一个 或多个这种链霉亲和素结合肽用作结合配偶体C1和C2，那么多聚化剂(4) 是一种链霉亲和素突变蛋白。如图3所示，可溶性多聚化剂(4)被使用。在 链霉亲和素突变蛋白的情况下，这种可溶性多聚化剂可以是例如链霉亲和 素或亲和素的寡聚物或聚合物，或者链霉亲和素或亲和素的任意突变蛋白 (类似物)的寡聚物或聚合物。所述寡聚物可以包含三个或更多个链霉亲和 素、亲和素或其突变蛋白的单体。所述寡聚物或聚合物可通过多糖交联。 这种链霉亲和素或亲和素的寡聚物或聚合物、或链霉亲和素或亲和素突变 蛋白的寡聚物或聚合物可通过在第一步中将羧基残基引入多糖例如葡聚糖 来制备，基本上如“Noguchi,A.,Takahashi,T.,Yamaguchi,T.,Kitamura,K., Takakura,Y.,Hashida,M.&Sezaki,H,(1992).Preparation and properties of the immunoconjugate composed ofanti-human colon cancer monoclonal antibody and mitomycin C dextranconjugate.Bioconjugate Chemistry 3,132-137”中所 述。在第二步中，采用常规的碳二亚胺化学方法，链霉亲和素或亲和素或 其突变蛋白经由内部赖氨酸残基和/或游离N端的伯氨基基团与葡聚糖骨架 上的羧基基团偶联。可替代地，链霉亲和素或亲和素或任意链霉亲和素或 亲和素的突变蛋白的交联寡聚物或聚合物也可以经由双功能接头诸如戊二 醛通过交联或通过文献中所述的其它方法获得。
作为结合配偶体C1和C2使用，与多聚化剂的相同结合位点结合(42) 相结合的部分具有的优势在于，如图3b所示，(第一结合配偶体C1以及第 二结合配偶体C2的)相同游离配偶体或其类似物可用于终止T细胞群(2)的 扩增，并将T细胞群(2)从多聚化剂上释放出来。在图3的实施例中，第一 和第二配偶体C1和C2的类似物诸如生物素或生物素的衍生物(亚氨基生物 素或脱硫生物素)可方便地用于T细胞群(2)的扩增终止和洗脱。
如图3c所示，在如图1d所示洗脱细胞后，第一试剂(6)、第二试剂(8) 以及生物素作为结合配偶体C1的游离第一配偶体和结合配偶体C2的游离 第二配偶体的类似物，可以通过如国际专利申请WO 2013/124474中所述 的”去除筒”从被刺激的细胞群(2)上轻易地去除。此外，使用可溶性多聚化 剂(4)的实施方式具有另一个优点，即能够避开任何固体载体诸如磁珠。这 意味着将不存在已激活的T细胞被这种磁珠污染的风险。这也意味着符合GMP标准的过程与已知的方法相比更容易建立，诸如使用
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则 必须采用额外的措施以确保最终的扩增T细胞群不含磁珠。此外，可溶性 多聚化剂的使用使得其极易从已激活的细胞群(T细胞、B细胞或天然杀伤 细胞)中去除，因为细胞可通过离心简单沉淀，而含有可溶性多聚化剂的上 清液则可弃除。可替代地，可溶性多聚化剂可在国际专利申请WO2013/124474的去除筒的凝胶渗透基质中从已扩增的细胞群中被去除。由于 不存在固相(例如磁珠)，本发明还提供了一种用于细胞扩增的自动封闭系 统，其可整合到已知的细胞扩增系统中，诸如可购于GE Healthcare(Little Chalfont,Buckinghamshire,UnitedKingdom)的W25型Xuri细胞扩增系统 (Xuri Cell Expansion System W25)和WAVE生物反应器2/10系统(WAVE Bioreactor 2/10System)，或者可购于TerumoBCT Inc.(Lakewood,CO,USA) 的
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细胞扩增系统(
Figure BDA0002497768740000162
Cell Expansion System)。
图4示出了CD3+T应答细胞在体外用可逆固定于涂覆有链霉亲和素突 变蛋白
Figure BDA0002497768740000163
的磁珠上的αCD3和αCD28 Fab片段刺激后增殖的实验 结果。图4A是示出了被刺激细胞大小分布(前向散射)的直方图，图4B示 出了代表据每次细胞分裂时的细胞数所示的增殖程度的直方图，细胞分裂 次数如图4B顶部所标示(0代表未分裂的细胞；5代表经历了至少5次分裂 的细胞)，图4C示出了刺激4天后的培养皿照片。
图5示出了Jurkat细胞内不同的细胞内钙动员的结果，所述Jurkat细胞 是用αCD3抗体OKT3或用
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多聚化的OKT3的Fab片段(本文 中也称为Fab多聚体)标记的。图5A：Jurkat细胞与钙敏染料Indo-1-AM一 起上样，通过注入αCD3 mAb(黑色正方形)触发钙释放，或者在进行或不 进行预先D-生物素破坏(分别为深灰色三角形和浅灰色圆形)下通过注入 αCD3 OKT3 Fab多聚体(衍生自亲本细胞系OKT3)触发钙释放，与注入 PBS(白色倒三角形)相比较。离子霉素(ionomycine)的应用为阳性对照。基 于FL6/FL7比率的变化，通过流式细胞术来监控细胞内Ca2+浓度的时间分 辨变化。图5B：经Indo-1-AM标记的Jurkat细胞被如图4a所述的不同的 αCD3刺激所激活(OKT3：上方曲线图，αCD3 Fab多聚体：中间曲线图)， 随后(t＝140s)进行D-生物素介导的αCD3 Fab多聚体信号的破坏。注射PBS (下方曲线图)或离子霉素作为阴性或阳性对照。数据代表三个不同的实验。
图6示出了用抗CD3 OKT3 Fab多聚体对细胞进行可逆染色的结果。 新鲜分离的PBMC用单克隆抗体(左侧散点图，Fab多聚体的亲本克隆)或同 源的PE标记的Fab多聚体染色，并在用D-生物素处理之前(左二列)或之后 (中间列)进行分析。在后续的清洗步骤后，使用新鲜的PE标记的Strep-
Figure BDA0002497768740000171
(右二列)检测剩余的Fab单体。进行二次Fab多聚体染色的可逆染 色细胞作为对照(右列)。只有活(PI阴性)细胞才能显示出来。散点图中的数字表示栅极内的细胞百分比。
图7示出了通过抗CD28 Fab片段的可逆结合所分离的细胞，所述抗 CD28 Fab片段与
Figure BDA0002497768740000172
多聚化，并用荧光标记藻红蛋白进行标记。 CD28+细胞通过如国际专利申请WO2013/011011中所述的Fab多聚体磁性 细胞选择法从新鲜分离的PMBC中被选择/分离出来。在选择之前，用同源 的荧光αCD28多聚体(左侧散点图)或者用直接抗免疫球蛋白κ轻链的抗体 (左二散点图，α-IgκmAb)对细胞进行对照染色。在选择之后，用D-生物素 处理细胞，随后清洗去除磁珠和Fab单体。随后用CD28 Fab多聚体(右二 散点图)或用α-Igκ mAb(右散点图)对被释放的CD28+细胞进行(重新)染 色，以检测可能残余的Fab单体。只有活的(PI阴性)CD3+细胞才能显示出 来。散点图中的数字表示栅极内的细胞百分比。
图8示出了CD3+T应答细胞在体外用可逆固定于充当可溶性多聚化 剂的可溶性寡聚
Figure BDA0002497768740000173
上的可逆性αCD3/αCD28 Fab片段刺激后增殖 的实验结果。对于图8所示的实验结果，300.000个CD3+应答T细胞 (Tresp)用2μM羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(Carboxyfluorescein succinimidyl ester,CFSE)进行标记，并用不同量的固定有αCD3Fab片段和αCD28 Fab 组合的可溶性Streptactin寡聚物制剂进行刺激，所述αCD3 Fab片段和 αCD28 Fab两者均在重链上携带充当链霉亲和素结合肽的Strep标记的。 (“1x”对应于用0.5μgαCD3 Fab和0.5μgαCD28 Fab功能化的3μg多聚 Strep-tactin；数字表示“1x”的倍数)。剩余的未经刺激的或用空白Strep-tactin 多聚体(无Fab)进行刺激的Tresp细胞作为阴性对照。将Tresp细胞一式两 份连同300.000个CD3阴性自饲养细胞(经30Gy辐照)一起接种到48孔板 上1ml添加有20U/ml白细胞介素2(IL-2)的细胞培养基中。细胞在37℃ 下进行孵育，不更换培养基，5天后根据CFSE稀释法通过FACS分析对增 殖情况进行分析(图8B)。图8A示出了培养5天后细胞的大小分布。直方图 示出了活的CD3+细胞，而图8C示出培养后用1mM D-生物素处理并清洗 后由刺激试剂释放的细胞。通过使用荧光标记藻红蛋白标记的Strep-
Figure BDA0002497768740000181
(ST-PE)进行重新染色来分析单体Fab片段的解离和去除，并示出 了代表性直方图。图8D示出了使用Neubauer计数室计算出的5天后活(台 盼蓝阴性)细胞的绝对数，并按各自的刺激条件绘图。中位细胞数在图8D 中示出；误差线表示标准偏差(SD)。图8E示出了刺激5天后培养板的照 片。
图9示出了本发明的连续扩增方法的图解(图9a)，而图9b简单介绍了 连续扩增的一些特征和优势。
图10示出了可与本发明的扩增方法一同使用的本发明的一种排布。这 种排布(100)包括生物反应器(50)、第一“去除筒”(70)和第二“去除筒”(90)。 生物反应器(50)与第一去除筒(70)流体式连接，而第一去除筒与第二去除筒 (90)为流体连接。这种排布(100)可以是本文所述的自动化细胞扩增纯化设 备的一部分。
本文所述的扩增方法在生物反应器(50)中进行，例如，图3中所述的使 用可溶性多聚化剂的扩增方法。在这种情况下，在通过加入竞争物(20)(结 合配偶体C1的游离配偶体或其类似物)终止细胞群(2)的激活/扩增之后，从 生物反应器中释放的反应混合物包含扩增的细胞群(2)、第一试剂(6)、第二 试剂(8)以及可溶性多聚化剂(4)。在该实施例中，第一试剂(6)是包括作为结 合配偶体C1的链霉亲和素结合肽在内的CD3结合抗体片段，第二试剂(8) 是包括作为结合配偶体C1的链霉亲和素结合肽在内的CD28结合抗体片 段，以及竞争物(20)(结合配偶体C1的游离类似物)是生物素。这种反应混 合物被施加到去除筒(70)上。这种第一去除筒(70)是如国际专利申请WO 2013/124474所述的去除筒，其包括具有合适固定相的层析柱。所述固定相 可用作亲和层析基质，并且同时可用作凝胶渗透基质。这种亲和层析基质 具有固定于其上的亲和试剂。在本实施例中，所述亲和试剂可以是例如链 霉亲和素、链霉亲和素突变蛋白、亲和素、亲和素突变蛋白或其混合物。 因此，第一试剂(6)和第二试剂(8)通过其链霉亲和素结合肽与亲和试剂结 合。此外，生物素作为竞争物(20)与亲和试剂结合。因此，这三种试剂全部 被固定在第一去除筒的层析基质上，而扩增的细胞群(2)和可溶性多聚化剂 (4)通过固定相。然后这种“流经物”被施加到第二去除筒(90)上。此外，这种 第二去除筒(90)包括固定相。这种固定相其上包含能够与多聚化剂(4)的结 合位点Z1(42)结合的第二亲和试剂。这种亲和试剂可能是例如与固定相共 价结合的生物素。这种固定相可能是例如获自Affiland S.A.(Ans-Liege， Belgium)的D-生物素SepharoseTM琼脂糖凝胶。因此，可溶性多聚化剂(4)将 被结合(保留)在第二去除筒(90)的固定相上，而扩增的细胞群(2)通过固定相 且不含任何试剂。细胞群(2)此时处于留待进一步使用的状态下，例如，用 于诊断应用(例如，进一步FACSTM分选)或者用于任何基于细胞的治疗应 用。这里应当注意的是，改变排布(100)中第一“去除筒”(70)和第二“去除 筒”(90)的顺序当然也是可以的，这样，生物反应器(50)与第二去除筒(90) (直接)流体连接在，而将第一去除筒(70)安排在其后并与第二去除筒(90)流 体式连接。在此排布中，多聚化剂(4)将首先从细胞群(2)中去除，随后是第 一试剂(6)、第二试剂(8)和例如竞争物(20)被去除。这样的排布也被包含在 本发明中并且也可以是本文所述的自动化细胞扩增纯化设备的一部分。
图11示出了可与本发明的扩增方法一同使用的本发明排布的另一个实 施方式。这种排布(110)包括生物反应器(50)、第一“去除筒”(70)和第二“去 除筒”(90)。生物反应器(50)与第一去除筒(70)流体式连接，且第一去除筒与 第二去除筒(90)流体式连接。此外，第二去除筒(90)与生物反应器(50)流体 式连接。这种排布(110)也可以是本文所述的自动化细胞扩增纯化设备的一 部分。当例如与采用可溶性多聚化剂(4)的扩增方法一同使用时，经纯化的 扩增细胞群(2)以第二去除筒(90)的洗脱液获得。由于去除筒(90)与生物反应 器(50)流体式连接，因此细胞群(2)可转回至生物反应器(50)，例如进行本文 所述的连续克隆扩增，通过例如用T细胞受体基因对细胞群进行转染，随 后采用本发明的扩增方法进一步(二次)扩增。
图12示出了可与本发明的扩增方法一同使用的本发明的排布的又一个 实施方式。这种排布(120)包括生物反应器(50)、第一“去除筒”(70)和第二 “去除筒”(90)。生物反应器(50)与第一去除筒(70)流体式连接，并且第一去 除筒与第二去除筒(90)流体式连接。类似于图11中所示的实施方式，第二 去除筒(90)与生物反应器(50)流体式连接。然而，如国际专利申请WO 2013/124474中所述的“选择筒”(92)被排布在第二去除筒(90)和生物反应器(50)之间。因此，细胞群(2)中包含的细胞亚群(2a)可通过这种如WO 2013/124474中所述的“选择筒”(92)被选择/富集。这种细胞亚群(2a)可或被 转移至生物反应器(50)，例如以进行本文所述的连续扩增。作为替代地(未 示出)，这种细胞亚群(2a)可用于基于细胞的治疗。这里再次需要注意的 是，使用本文所述的可溶性多聚化剂得以设计出功能性封闭的、且由此不 易受污染的自动化细胞纯化扩增设备。此外，由于可溶性多聚化剂避免了 对固相材料诸如磁珠的需要，因此这种细胞纯化设备可设计为连续流动设 备。
图13示出了纯化的CD4+和CD8+T应答细胞(Tresp)在体外被可逆固 定于作为可溶性多聚化剂的两种可溶性寡聚
Figure BDA0002497768740000209
突变蛋白上的 αCD3/αCD28 Fab片段或αCD3/αCD28/αCD8刺激而增殖的扩增动力学。第 一种寡聚
Figure BDA0002497768740000201
是实施例5中获得的寡聚链霉亲和素突变蛋白(n≥3) 的一部分(也被称为“常规
Figure BDA0002497768740000202
骨架”，在图13中以尖端朝下的三角 形符号表示)，第二种用做可溶性多聚化剂的寡聚链霉亲和素突变蛋白是一种通过使可溶性寡聚链霉亲和素突变蛋白与生物素化的人血清白蛋白 (human serumalbumin,HSA)发生反应而得到寡聚物。这种基于HSA的可溶 性多聚化剂在本文中也被称为“大
Figure BDA0002497768740000203
骨架”。在图13的实验中，扩 增是在不更换培养基的情况下进行的。CD4+T应答细胞的结果在图13A中 示出，CD8+T应答细胞的结果在图13B中示出。关于这点，应当注意的 是，实验上使用的可溶性多聚化剂通过可逆地与第一试剂、任选地与第二 和第三试剂结合而被功能化，在图中被称为“
Figure BDA0002497768740000204
多聚体”。
图14示出了纯化的CD4+和CD8+T应答细胞(Tresp)在体外被可逆固 定于作为可溶性多聚化剂的两种可溶性寡聚
Figure BDA0002497768740000205
上的αCD3/αCD28 Fab片段刺激而增殖的扩增动力学。第一种寡聚
Figure BDA0002497768740000206
是实施例5中 获得的寡聚链霉亲和素突变蛋白(n≥3)的一部分(也被称为“常规
Figure BDA0002497768740000207
骨架”，在图14中以尖端朝上的三角形符号表示)，第二种用做可溶性多聚 化剂的寡聚链霉亲和素突变蛋白是基于HSA的可溶性多聚化剂(上述的“大
Figure BDA0002497768740000208
骨架”。在图14的实验中，扩增是在更换培养基的情况下进行 的。CD4+T应答细胞的结果在图14A中示出，CD8+T应答细胞的结果在 图14B中示出。
图15示出了图13和14中纯化的CD4+和CD8+T应答细胞增殖的扩 增动力学所得结果的综合数据，其中，图15A示出了CD4+T细胞的结 果，图15B示出了CD8+T细胞的结果。在第3天更换培养基的情况下的 培养用直线表示，而虚线示出了第3天不更换培养基的情况下的扩增程度 的值。图15中所示的数据用输入的细胞数归一化。只有用寡聚链霉亲和素 突变蛋白(n≥3)刺激的Tresp、用市售Dynabeads(阳性对照)刺激的Tresp以 及未经刺激的T细胞(阴性对照)的数据被示出，而具有“大
Figure BDA0002497768740000211
骨 架”的多聚化剂却没有数据。
图16示出了纯化的CD4+和CD8+T应答细胞在体外被可逆固定于如 实施例5中所述的可溶性寡聚链霉亲和素突变蛋白(n≥3)上的αCD3/αCD28 Fab片段刺激而激活后T细胞的早期群簇形成。图16A示出了CD4+T细胞 的结果，而图16B示出了CD8+T细胞的结果。用可溶性多聚化剂(寡聚链 霉亲和素突变蛋白)刺激的Tresp、用市售Dynabeads刺激的Tresp(阳性对 照)以及未经刺激的T细胞(阴性对照)的数据被示出。
图17示出了在体外被与实施例5中所述的可溶性寡聚链霉亲和素突变 蛋白(n≥3)可逆结合的αCD3/αCD28 Fab片段所多克隆刺激的CD3+中枢记忆 T细胞(Tcm)(CD3+CD62L+CD45RA-Tcm)的扩增动力学和表型。图17中示 出的曲线图代表了据每个时间点上收获的细胞数所示的增殖程度，其中， 图17A示出了只添加IL-2的培养基中的增殖，图17B示出了添加了IL-2和 IL-15的培养基中的增殖。图17C示出了在这些可变细胞因子环境中培养 14后CD62L和CD127的表面表达水平的流式细胞分析。
图18示出了从大量纯化的CD3+CD62L+CD45RA-Tcm应答细胞中进 行选择性抗原特异性(Ag特异性)扩增的动力学，其中，所述CD3+CD62L+ CD45RA-Tcm应答细胞在体外被肽:MHC分子复合物(充当向细胞提供初级 激活信号的第一试剂)和αCD28 Fab片段(充当与细胞表面辅助分子结合的第 二试剂)二者刺激，未刺激的T细胞(阴性对照)也被示出。抗原特异性肽与 MHC分子的复合物和αCD28 Fab片段两者可逆固定于同一种如实施例5中 所述的可溶性寡聚链霉亲和素突变蛋白(n≥3)。用于图18A中抗原特异性扩 增的肽为肽CRVLCCYVL(SEQ ID NO:06)和被HLA-C702 MHC分子(如 Ameres等人,PLOS Pathogens,May2013,vol.9,issue 5,e1003383所述)限制 的即刻早期1蛋白的第309-317位氨基酸，代表对巨细胞病毒 (cytomegalovirus,CMV)具有特异性的HLA-C7/IE-1抗原表位。呈递肽的MHC I分子在其重链C端携带链霉亲和素结合肽(SAWSHPQFEK(GGGS)2 GGSAWSHPQFEK(SEQID NO:07)，也就是从IBA GmbH(
Figure BDA0002497768740000223
Germany)购得的“双Strep标记
Figure BDA0002497768740000221
”。图18A示出了对用 肽:MHC-I复合物来增殖的部分Ag特异性细胞的示例性流式细胞分析，其 中所述肽:MHC-I复合物对HLA-C7/IE-1抗原表位具有特异性，并作为第一 试剂可逆固定于可溶性寡聚链霉亲和素突变蛋白，并向细胞提供初级激活 信号。图18B至图18E中的曲线图示说明了据每个时间点上收获的特异性 肽:MHCI多聚体-阳性细胞数所示的其他Ag特异性的扩增动力学，这与图 18A类似，即使用抗原特异性肽与MHCI分子的不同复合物作为可逆固定 于可溶性寡聚链霉亲和素突变蛋白上、向细胞提供初级激活信号的第一试 剂。更详细地，图18B示出了使用对CMV的pp65抗原表位有特异性的 肽:MHC-I复合物(被HLA-A2402限制的第341-350位氨基酸(QYDPVAALF, (SEQ ID NO:08)))进行扩增的Ag特异性细胞的扩增结果，图18C示出了使 用另一种对CMV的pp65抗原表位具有特异性的肽:MHC-I复合物(被HLA- B702限制的第265-274位氨基酸RPHERNGFTV,(SEQ IDNO:09))进行增 殖的Ag特异性细胞的扩增结果，图18D示出了使用对腺病毒的Hexon 5抗原表位具有特异性的肽:MHC-I复合物(被HLA-B702限制的第114-124位氨 基酸(CPYSGTAYNSL,(SEQ ID NO:10)))进行增殖的Ag特异性细胞的扩增 结果，图18E示出了使用对CMV的HLA-B7/IE-1309-317抗原表位具有特异 性的肽:MHC-I复合物进行增殖的Ag特异性细胞的扩增结果(示例性的 FACS数据可参见上图18A)。所有承载双
Figure BDA0002497768740000222
标记的肽:MHC分子均可 从IBA GmbH购得。关于这点，携带“双Strep标记
Figure BDA0002497768740000224
”作为其C端的HLA-A*2402、HLA-B*0702和HLA-C*0702分子的氨基酸序列在 所附序列表中的SEQID NO:21、22和23中示出，而β2微球蛋白的氨基酸 序列(其与α链一起形成，这意味着HLA编码相应的MHC I分子(HLA encoded molecules the respective MHC I molecule))在所附序列表中的SEQ ID NO:24中示出。此外，图18F示出了对来自图18D的、经HLA- B7/Hexon5114-124刺激/扩增的细胞进行培养14天后，CD62L和CD127表面 表达水平的示例性流式细胞分析。
图19示出了从纯化的CD3+CD62L+CD45RA-Tcm应答细胞中进行选 择性Ag特异性扩增的动力学，其中，所述CD3+CD62L+CD45RA-Tcm应 答细胞在体外被可逆固定于可溶性寡聚链霉亲和素突变蛋白上作为第一和 第二试剂的a)抗原特异性肽MHC I复合物和b)αCD28Fab片段刺激。为了 这个目的，使用3μl的被0.5μg配有链霉亲和素结合肽的肽:MHC I类复合 物(特异性肽表示被HLA-B0702限制的腺病毒的Hexon 5蛋白的第114-124 位氨基酸(CPYSGTAYNSL,SEQ ID NO:10)，见上文)和0.5μgαCD28 Fab 功能化的Streptactin多聚化剂制剂对500.000个CD3+CD62L+CD45RA-应 答Tcm细胞(Tresp)进行Ag特异性刺激。作为替代，4.5μl Streptactin多聚 化剂制剂负载有0.5μg肽:MHC I类复合物、0.5μgαCD8 Fab和0.5μg αCD28 Fab。为了比较，使用3μl负载有0.5μgαCD3 Fab和0.5μgαCD28 Fab组合的Streptactin多聚化剂制剂(1mg/ml)进行多克隆刺激。作为上述刺 激条件的另一种替代方案，使用了4.5μl负载有0.5μgαCD3 Fab、0.5μg αCD8 Fab和0.5μgαCD28 Fab的Streptactin多聚体制剂。未经处理(未经刺 激的)的Tresp细胞作为阴性对照，而经Dynabeads多克隆刺激的Tresp细胞 作为阳性对照。Tresp细胞被接种到48孔板上添加有30U/ml IL-2和5 ng/ml IL-15的1ml细胞培养基中。细胞在37℃下孵育，每3天更换一次培 养基，并于7天和14天后分析细胞计数。图19中所示的照片代表在Ag特 异性刺激第5天时群簇形成的程度，以腺病毒HLA-B7/Hexon 5抗原表位为 例证。
图20示出了纯化CD8+T应答细胞的扩增产量和表型，其中所述 CD8+T应答细胞在体外用可逆固定于两种起可溶性多聚化剂作用的可溶性 寡聚
Figure BDA0002497768740000231
上的αCD3/αCD28 Fab片段刺激。第一种寡聚Strep-
Figure BDA0002497768740000232
是实施例5中获得的寡聚链霉亲和素突变蛋白(常规骨架)的一部分， 第二种用作可溶性多聚化剂的寡聚链霉亲和素突变蛋白是上文所述的可溶 性寡聚物，在此被称为“大”
Figure BDA0002497768740000241
骨架。在这些实验中，寡聚常规链霉亲和素突变蛋白(n≥3)的一部分也被用作多聚化剂，其可被单一的Fab片段 (图20A和图20B中的第三根柱)或者αCD3和αCD28 Fab片段组合所功能 化。除了用αCD3/αCD28 Fab片段组合刺激之外，还有额外的αCD8 Fab片 段(从IBA GmbH购得，
Figure BDA0002497768740000242
Germany)被固定，以测试是否可能优先 刺激特定T细胞亚群。图20A示出了代表据第6天收获的细胞数所示的增 殖程度的柱状图，其中，所述细胞数与阴性对照(未经刺激的纯化CD8+T 应答细胞)相比较，并以阳性对照(用市售Dynabeads(其上不可逆固定有 αCD3和αCD28单克隆抗体的磁珠)刺激的纯化CD8+T应答细胞)进行归一 化。图20B示出了对细胞培养后CD8和T细胞表面分子CD45RO(这是T 细胞增殖和激活的指征)的表面表达水平的流式细胞分析。采用单因素方差分析法对各种刺激条件进行比较，并未检测到显著性差异(n.s.)。
图21示出了纯化的CD8+T应答细胞扩增的产量和表型，其中，所述 CD8+T应答细胞在体外被可逆固定于起可溶性多聚化剂作用的可溶性寡聚
Figure BDA0002497768740000243
上的αCD3/αCD28 Fab片段刺激，所述可溶性寡聚Strep-
Figure BDA0002497768740000244
被单一的Fab片段或Fab片段组合(上文已有描述)所功能化。在这些 实验中，CD8+T应答细胞被可溶性多聚化剂(实施例5中的可溶性寡聚
Figure BDA0002497768740000245
(1mg/ml))刺激，所述可溶性多聚化剂被不同量的αCD3和 αCD28Fab片段(任选地连同上述αCD8 Fab片段)所功能化。术语“1x”对应 于被0.5μg αCD3 Fab片段单独功能化的1.5μg多聚化Streptactin和被0.5 μg αCD28 Fab单独功能化的1.5μg多聚化Streptactin，或负载有0.5μg αCD3 Fab片段和0.5μg αCD28 Fab的3μl寡聚Streptactin制剂，或负载0.5 μg strep标记的αCD3、0.5μg strep标记的αCD8和0.5μg strep标记的 αCD28 Fab的4.5μl Streptactin多聚体制剂。相应地，术语“2x”对应于被1 μg αCD3 Fab片段单独功能化的3.0μg多聚化Streptactin和被1μg αCD28 Fab单独功能化的3.0μg多聚化Streptactin，这意味着使用了两倍于固定化 αCD3 Fab片段化的量。未经处理的Tresp细胞作为阴性对照，而经市售 Dynabeads(其上不可逆地固定有αCD3和αCD28单克隆抗体的磁珠)刺激的 纯化CD8+T应答细胞作为阳性对照。图21A示出了代表据第5天收获的 细胞数所示的增殖程度的柱状图，其中所述细胞数与阴性对照相比较，并 以阳性对照进行归一化。图21B示出了细胞培养后CD8和CD45RO表面表 达水平的FACS分析。
图22示出了转导的Jurkat细胞胞内信号级联的激活，其中所述转导的 Jurkat细胞被修饰以表达αCD19嵌合抗原受体(CAR)，并被实施例5中用作 可溶性多聚化剂的寡聚
Figure BDA0002497768740000251
刺激。CAR的特异性通常来源于由单 克隆抗体(mAb)抗原结合区组装的scFv部位，所述单克隆抗体(mAb)与靶物 /肿瘤相关抗原诸如CD19特异性结合，并使其与T细胞特异性信号相连(如 Hudecek等人,Clin Cancer Res.2013June 15；19(12):3153–3164所述)。在这 个实验中，含有αCD19 CAR天然配体的CD19胞外域(extracellular domain,ECD)以及识别αCD19-CAR中IgG4间隔区的多克隆αIgG F(ab)2片段(从 Jackson ImmunoResearch商购获得的驴抗人F(ab)2)也被用作向Jurkat细胞 提供初级激活信号的第一试剂。与可溶性寡聚链霉亲和素突变蛋白的可逆 固定由与CD19的ECD的C端融合的链霉亲和素肽SAWSHPQFEK (GGGS)2GGSAWSHPQFEK(SEQ ID NO:07)提供，或由生物素化的αIgG的(Fab)2片段提供(由于链霉亲和素突变蛋白“m2”以降低的亲和力与生物素结 合，这种结合是可逆的并且可例如被加入的过量的游离生物素所置换)。在 图22A的对照实验中，300.000个CD3+Jurkat应答细胞(Jresp)用不同量 的、被αCD3 Fab和αCD28 Fab功能化(“x1”对应于被0.5μg aCD3-和0.5μg aCD28 Fab功能化的3μg多聚化Streptactin——多克隆Streptamer多聚体) 的寡聚Streptactin(1mg/ml)制剂的混合物进行刺激。在图22B的实验中，3 μl寡聚Streptactin制剂被0.5μg(x1)或1μg(x2)的CD19胞外域(ECD)功能 化，或3μl寡聚Streptactin制剂负载有0.5μg(x1)或1μg(x2)识别IgG4间 隔区的αIgG(二者均为CAR特异性
Figure BDA0002497768740000252
多聚体)。经Dynabeads(其 上不可逆固定有αCD3和αCD28单克隆抗体的磁珠)或PMA和离子霉素刺 激的Jresp作为阳性对照。Jresp细胞被接种在1.5mlEppendorf管的200μl 添加有30U/ml IL-2的细胞培养基中。细胞在37℃下孵育，并在刺激0min 至20min后，置于冰上裂解。
图23示出了在体外被αCD3/αCD28 Fab片段刺激的纯化CD3+T应答 细胞的扩增，所述αCD3/αCD28 Fab片段可逆地固定于实施例5中被用作可 溶性多聚化剂的可溶性寡聚
Figure BDA0002497768740000261
上。在一项实验中，除 αCD3/αCD28 Fab片段以外，从IBA GmbH(
Figure BDA0002497768740000262
Germany)商购获得的 αCD8 Fab片段(目录编号6-8000-203)也被固定于链霉亲和素突变蛋白的可 溶性寡聚物，以测试是否可能用其上还可逆固定有αCD8 Fab片段的本发明 多聚化剂在体外优先刺激大量CD3+培养物中的CD8+T细胞亚群。更详细 地，使用负载有0.5μg αCD3和0.5μg αCD28 Fab组合的3μl寡聚链霉亲和 素制剂(1mg/ml)对500.000个纯化的CD3+应答T细胞(Tresp)进行刺激。作 为一种替代方法，4.5μl Streptactin寡聚物负载有如上所述的0.5μg αCD3、 0.5μg αCD8 Fab和0.5μg αCD28 Fab。未经刺激的Tresp细胞作为阴性对照，经Dynabeads(其上不可逆固定有αCD3和αCD28单克隆抗体的磁珠) 刺激的Tresp细胞作为阳性对照。
图24示出了产生可被用作本发明的可溶性多聚化剂的寡聚链霉亲和素 突变蛋白的示例性策略。图24A示出了，在第一步中，使用在野生型链霉 亲和素序列位点第44至47位上包含氨基酸序列lle44-Gly45-Ala46-Arg47(SEQ ID NO:03)的链霉亲和素突变蛋白“m2”(SAm2)用于产生具有“常规骨架”的 寡聚链霉亲和素突变蛋白。在第二步中，具有“大骨架”的寡聚可溶性链霉 亲和素突变蛋白可通过链霉亲和素突变蛋白与生物素化的载体蛋白诸如人 血清白蛋白(HSA)的偶联或通过链霉亲和素突变蛋白与合成载体诸如PEG 的偶联而产生。图24B：人血清白蛋白(HSA)的生物素化。
发明详述
本发明提供了用于扩增细胞群或用于诱导T细胞增殖的方法、试剂盒 和装置。
本文使用的术语“细胞群”包括所有可通过细胞表面受体与向细胞提供 初级激活信号的第一试剂结合而扩增的细胞。还可能的是，为了扩增细胞 群，可能需要第二试剂与第二细胞表面受体(辅助因子)结合以产生扩增细胞 所需的共刺激信号。在一些实施方式中，细胞群可以是淋巴细胞群，包括 但不限于B细胞群、T细胞群或天然杀伤细胞群。细胞群的示例性实例是 携带CD40或CD137的B细胞(这两种细胞群仅结合提供激活信号的第一试剂配体就可以进行增殖，例如4-1BB，或者αCD40抗体分子或者αCD137 抗体分子(参见例如Zhang等人,2010,J Immunol,184:787-795))。可用于B 细胞扩增的试剂(第一或第二试剂)的其他示例性实例是与IgG、CD19、 CD28或CD14，例如αCD19、αIgG、αCD28或αCD14抗体分子结合的试 剂。还可设想，用于B细胞扩增的第一或第二试剂可以包括toll样受体或 白细胞介素诸如IL-21的配体(参见例如Dienz O,等人2009.J.Exp.Med. 206:69)。应当注意的是，B细胞的脂多糖依赖性激活也包括在本发明中， 因为脂多糖也可用作第一试剂，并且可用如文本所述的结合配偶体C1装 配。合适细胞群的其它示例性实例包括T细胞，其通过第一试剂与 TCR/CD3的结合以及第二试剂与T细胞上的辅助分子诸如CD28的结合而 被激活后扩增。在这种情况下，第一试剂刺激T细胞中的TCR/CD3复合物 相关信号，而第二试剂通过与作为辅助因子的CD28结合而提供次级刺 激。可用于T细胞扩增的试剂可包括白细胞介素，诸如IL-2、IL-7、IL-15 或IL-21(参见例如Cornish等人2006,Blood.108(2):600-8、Bazdar和Sieg, 2007,Journal of Virology,2007,81(22):12670-12674、Battalia等人,2013, Immunology,139(1):109-120)。可用于T细胞扩增的试剂的其它示例性实例 为与CD8、CD45或CD90，诸如αCD8、αCD45或αCD90抗体结合的试 剂。T细胞群的示例性实例包括抗原特异性T细胞、辅助T细胞、细胞毒 性T细胞、记忆T细胞(记忆T细胞的一个示例性实例是CD62L+CD8+特异 性中枢记忆T细胞)或调节性T细胞(Treg的一个示例性实例是 CD4+CD25+CD45RA+Treg细胞)。本文使用的术语“T细胞(群)”也可以包括 含有嵌合抗原受体(CAR)的T细胞，嵌合抗原受体(CAR)又称为人造T细胞 受体或嵌合T细胞受体。因此，包含嵌合抗原受体的T细胞群也可以使用 本发明的方法、试剂及设备进行扩增。这一点也可参见实施例15，其中， 表达嵌合CD19特异性抗原受体(CAR)的JurkaT细胞通过使用本发明的可溶 性多聚化剂而被刺激。合适细胞群的另一个示例性实例包括天然杀伤细胞 (NK细胞)，其例如可使用与CD16或CD56，诸如αCD16或αCD56抗体相 结合的试剂进行扩增。这种αCD16抗体的示例性实例是具有SEQ ID NO: 25中所列的VH序列和SEQ ID NO:26中所列的VL序列的抗体3G8(参见 例如Hoshino等人,Blood.1991Dec 15；78(12):3232-40)。用于NK细胞扩增 的另一种试剂可以是IL-15(参见例如Vitale等人2002.The Anatomical Record.266:87-92)。合适细胞群的又一个示例性实例包括单核细胞，其可 以例如使用与CD14诸如αCD14抗体分子相结合的试剂进行扩增。细胞群 可以是任意哺乳动物来源，包括但不限于人、兔、豚鼠、松鼠、仓鼠、 猫、狗、狐猴、山羊、猪、马、恒河猴，猕猴或黑猩猩。
因此，根据上文所述，本发明涉及在缺乏外源性生长因子诸如淋巴因 子和佐细胞的情况下选择性诱导细胞群诸如B细胞、T细胞或天然杀伤细 胞的离体扩增方法。此外，这些细胞诸如B细胞或T细胞的增殖可在不需 要抗原的情况下进行诱导，由此提供了具有多克隆反应性的扩增细胞群诸 如T细胞群。本文公开的方法可以在延长的时间段内提供选定T细胞群例 如CD4+或CD8+T细胞的持续扩增，以产生这些细胞相对于初始T细胞群 的数量的成倍增长。一般而言，在如本文所述的淋巴细胞群的(克隆)扩增的 情况下，所有子代可以与被选定扩增的细胞群共享相同的抗原特异性。
同样，根据上文所述，本发明提供了用于抗原特异性T细胞群扩增的 方法。为了产生抗原特异性T细胞群，T细胞与适当形式的抗原相接触以 触发T细胞中的初级激活信号，即抗原被呈递到T细胞中以致于信号在T 细胞中经TCR/CD3复合物被触发。例如，抗原可通过抗原呈递细胞与 MHC分子一起被呈递到T细胞。抗原呈递细胞，诸如B细胞、巨噬细胞、 单核细胞、树突细胞、朗格汉斯细胞或其它可以向T细胞呈递抗原的细 胞，可与T细胞在抗原(例如可溶性抗原)存在下进行孵育，抗原这样抗原呈 递细胞将呈递至T细胞。可替代地，表达感兴趣抗原的相关的细胞可与T 细胞一起孵育。例如，表达肿瘤相关抗原的肿瘤细胞可与T细胞一起孵育 以诱导肿瘤特异性应答。类似地，被病原体例如病毒感染的、呈递病原体抗原的细胞可与T细胞一起孵育。在T细胞群的抗原特异性激活之后，可 依照本发明的方法扩增细胞。例如，在抗原特异性建立以后，T细胞可根 据本文所述的方法通过与抗CD3抗体(用作第一试剂)和抗CD28抗体(用作 第二试剂)一起培养而进行扩增。在另一个实施方式中，第一试剂可以是MHC I:肽复合物，其可与抗原特异性T细胞群结合。在这样一个实施方式 中，可以使用任何已知的且可与各自MHC I分子复合的抗原特异性肽。这 一点可参见实施例11和12，其中例证了针对四种不同的抗原特异性细胞， 从大量CD3+中枢记忆T细胞中选择性抗原特异性扩增Tcm应答细胞。或 者，触发细胞扩增的受体的天然配体也可以用作第一试剂。这一点可参见 实施例15，其中，CD19胞外域导致经改造得以表达嵌合CD19结合抗原受 体(CAR)的转导Jurkat细胞胞内信号级联激活。
细胞群样品可以来自任何合适的来源，通常可以是身体组织或者体液 诸如血液的全部样品。在后一种情况中，样品可以是例如外周血单核细胞 (peripheral bloodmononucleated cell，PBMC)群，其可通过标准分离方法如 血细胞的聚蔗糖梯度获得。然而，待扩增的细胞群也可以是纯化的形式， 并且可以使用如美国专利US 7,776,562、US 8,298,782、国际专利申请 WO02/054065或国际专利申请WO2013/011011中所述的可逆细胞染色/分 离技术进行分离。或者，细胞群也可以通过细胞分选经由负磁性免疫细胞 粘连获得，正如美国专利US 6,352,649 B1或欧洲专利EP 0 700 430 B1中所 述的。如果本文所述的分离方法用于基础研究，那么样品可以是体外细胞 培养实验的细胞。样品通常被制备成流体的形式，例如溶液或分散液。
根据上文所述，在一个实施方式中，本发明提供了一种扩增细胞群的 体外方法，其包括使含有细胞群的样品与多聚化剂接触。多聚化剂具有可 逆固定(结合)于其上的、向细胞提供初级激活信号的第一试剂，其中所述多 聚化剂包含至少一个结合位点Z1用于第一试剂的可逆结合。第一试剂包含 至少一个结合配偶体C1，其中所述结合配偶体C1能够与多聚化剂的结合 位点Z1可逆结合，其中所述第一试剂通过结合配偶体C1和结合位点Z1之间形成的可逆键与多聚化剂相结合。第一试剂与细胞表面的受体分子结 合，由此向细胞提供初级激活信号从而激活细胞。
在另一个实施方式中，本发明提供了一种方法，其中所述多聚化剂具 有可逆固定(结合)于其上的、刺激细胞表面辅助分子的第二试剂。第二试剂 包含结合配偶体C2，其中所述结合配偶体C2能够与多聚化剂的结合位点 Z2可逆结合，其中所述第二试剂通过结合配偶体C2和结合位点Z2之间形 成的可逆键与多聚化剂相结合。第二试剂与细胞表面辅助分子结合，由此 刺激已激活的细胞。在这个实施方式中，第一试剂可刺激T细胞中的 TCR/CD3复合物相关信号，并且可以是特异性结合CD3的结合剂。在这个 实施方式中，T细胞上的辅助分子可以是CD28，而与辅助分子结合的第二 试剂是特异性结合CD28的结合剂。在这种情况下，特异性结合CD3的第 一试剂可以选自抗CD3抗体、抗CD3抗体的二价抗体片段、抗CD3抗体 的单价抗体片段和具有抗体样结合特性的蛋白质CD3结合分子。此外，特 异性结合CD28的第二试剂可以选自抗CD28抗体、抗CD28抗体的二价抗 体片段、抗CD28抗体的单价抗体片段和具有抗体样结合特性的蛋白质 CD28结合分子。所述二价抗体片段可以是(Fab)2’片段，或二价单链Fv片 段，而单价抗体片段可以选自Fab片段、Fv片段和单链Fv片段(scFv)。具 有抗体样结合特性的蛋白质CD3或CD28结合分子可以是适体、基于脂质 运载蛋白(lipocalin)家族多肽的突变蛋白、glubody、基于锚蛋白支架的蛋 白、基于晶体支架的蛋白、adnectin和亲和多聚体(avimer)。
一般而言，本发明使用的第一和第二试剂可以是例如抗体、抗体片段 和具有抗体样功能的蛋白质结合分子。(重组)抗体片段的实例是Fab片段、 Fv片段、单链Fv片段(scFv)、二价抗体片段诸如(Fab)2'片段、双特异抗体 (diabody)、三链抗体(triabody)(Iliades,P.,等人,FEBS Lett(1997)409,437- 441)、十链抗体(decabody)(Stone,E.,等人,Journal of Immunological Methods (2007)318,88-94)以及其它结构域抗体(Holt,L.J.,等人,.Trends Biotechnol. (2003),21,11,484-490)。在一些实施方式中，第一或第二试剂的一个或多个 结合位点可以是二价蛋白质人造结合分子，诸如也称为“双运载蛋白(duocalin)”的二聚脂质运载蛋白突变蛋白。在一些实施方式中，受体结合剂 可以具有单个第二结合位点，即它可以是单价的。单价第一或第二试剂的 实例包括但不限于单价抗体片段、具有抗体样结合特性的蛋白质结合分子 或MHC分子。单价抗体片段的实例包括但不限于Fab片段、Fv和单链Fv 片段(scFv)片段，包括二价单链Fv片段。
如上所述，具有抗体样功能的蛋白质结合分子的实例是基于脂质运载 蛋白家族多肽的突变蛋白(参见例如，WO 03/029462、Beste等人,Proc.Natl. Acad.Sci.U.S.A.(1999)96,1898-1903)。脂质运载蛋白，诸如胆汁三烯结合 蛋白、人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白、人载脂蛋白D或人泪液脂 质运载蛋白具有的天然配体结合位点，其可被修饰以使它们与给定靶物结 合。可用作特异性结合受体分子的受体结合剂的、具有抗体样结合特性的 蛋白质结合分子的其他实例是包括但不限于所谓的glubody(参见例如，国 际专利申请WO 96/23879)、基于锚蛋白支架的蛋白(Mosavi,L.K.,等人, Protein Science(2004)13,6,1435-1448)或基于晶体支架的蛋白(例如，国际 专利申请WO 01/04144)、如Skerra,J.Mol.Recognit.(2000)13,167-187中所 述的蛋白、AdNectin、tetranectin和亲和多聚体(avimer)。亲和多聚体，包括 由人类受体结构域家族经外显子改组进化而来的多价亲和多聚体蛋白，包 含作为若干细胞表面受体多域串出现的所谓A结构域(Silverman,J.,等人, Nature Biotechnology(2005)23,1556-1561)。Adnectin，衍生自人纤连蛋白结构域，包含三个可被工程化成用于免疫球蛋白样结合至靶物的三个环状结 构(loop)(Gill,D.S.&Damle,N.K.,Current Opinion in Biotechnology(2006)17, 653-658)。Tetranectin，衍生自相应的人同源三聚体蛋白，同样在C型凝集 素结构域中包含可被工程化成用于所需结合的环状结构区域(出处同上)。可 作为蛋白质配体的类肽，是不同于多肽的寡聚(N-烷基)甘氨酸，其侧链与酰 胺氮连接而不是α碳原子。类肽通常对蛋白酶及其它修饰酶耐受，并且比 多肽具有高得多的细胞渗透性(参见例如，Kwon,Y.-U.和Kodadek,T.,J.Am. Chem.Soc.(2007)129,1508-1509)。合适的蛋白质结合分子的另外一些实例 是EGF样结构域、三环结构域(Kringle-domain)、I型纤连蛋白结构域、II型 纤连蛋白结构域、III型纤连蛋白结构域、PAN结构域、G1a结构域、 SRCR结构域、Kunitz/牛胰胰蛋白酶抑制剂结构域、淀粉酶抑肽 (tendamistat)、Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂结构域、三叶型(P型)结构域、 C型血管假性血友病因子(von Willebrand factor)结构域、过敏毒素样结构 域、CUB结构域、I型甲状腺球蛋白重复、A型LDL受体结构域、Sushi结 构域、Link结构域、I型血小板反应蛋白结构域、免疫球蛋白结构域或免疫 球蛋白样结构域(例如，结构域抗体或骆驼重链抗体)、C型凝集素结构域、 MAM结构域、A型血管假性血友病因子结构域、生长调节素B结构域、WAP型四二硫核心结构域、C型F5/8结构域、血液结合素结构域、SH2结 构域、SH3结构域、层粘连蛋白型EGF样结构域、C2结构域、“κ抗体 (Kappabody)”(参见Ill.等人,ProteinEng(1997)10,949-57)、所谓的“微抗体 (minibody)”(Martin等人,EMBO J(1994)13,5303-5309)、双特异抗体(参见 Holliger等人,PNAS USA(1993)90,6444-6448)、所谓的“Janusis”(参见 Traunecker等人,EMBO J(1991)10,3655-3659,或者Traunecker等人,IntJ Cancer(1992)Suppl 7,51-52)、纳米抗体(nanobody)、微体(microbody)、 affilin、亲和体(affibody)、打结素(knottin)、泛素、锌指蛋白、自体荧光蛋 白或富亮氨酸重复蛋白。具有抗体样功能的核酸分子的实例是适体。适体 折叠成确定的三维基序，并显示出对给定靶结构的高亲和性。
现在转向多聚化剂，多聚化剂的结合位点Z1和Z2可以是相同的(也可 参见图3的实施例3)。在这种情况下，可以使用单一的多聚化剂。
在使用可逆结合的第一试剂和任选第二试剂的实施方式中，多聚化剂 可以固定在固体表面上。任何固体表面(载体)可用于固定多聚化剂。可固定 多聚化剂的固体表面的示例性实例包括磁珠、聚合珠、细胞培养板、微量 滴定板、膜或中空纤维。中空纤维例如用作购自TerumoBCT Inc. (Lakewood,CO,USA)的
Figure BDA0002497768740000321
细胞扩增系统中的生物反应器。多聚化 剂通常与固体载体共价连接，但是如果需要，非共价相互作用也可用于固 定化，例如固定于塑料基质上。如下文更详细的说明，多聚化剂可以是例 如与链霉亲和素结合肽可逆结合的链霉亲和素或亲和素突变蛋白。这种链 霉亲和素突变蛋白可与任何表面共价连接，例如用于层析纯化树脂(珠)，并 且可以从IBA GmbH,
Figure BDA0002497768740000322
商业购得这种形式，例如，
Figure BDA0002497768740000323
琼 脂糖凝胶、
Figure BDA0002497768740000324
大容量
Figure BDA0002497768740000325
或
Figure BDA0002497768740000326
易商业购得的多聚化剂的其它示例性实例是固定 化金属离子亲和层析(immobilized metal affinitychromatography,IMAC)树 脂，诸如
Figure BDA0002497768740000327
树脂(Westburg,Leusden,TheNetherlands)，其一般可用 于可逆固定寡聚组氨酸标记的(his标记的)蛋白，在这里意指，用于携带第 一结合配偶体C1或第二结合配偶体C2的第一或第二试剂与低聚组氨酸标 记物诸如五组氨酸或六组氨酸标记物的可逆结合。多聚化剂的其它实例是 可购于GE LifeSciences钙调蛋白琼脂糖凝胶，其可与含有钙调蛋白结合肽 作为结合配偶体C1或C2或琼脂糖凝胶的第一或第二试剂一起使用，并与 谷胱甘肽偶联。在这种情况下，结合配偶体C1或C2是谷胱甘肽-S-转移 酶。
在本发明方法的其它实施方式中，多聚化剂可以是可溶形式。原则 上，可以使用与固定于固体载体上的多聚化剂相同的多聚化剂。可溶形式 的多聚化剂可以例如是链霉亲和素突变蛋白寡聚物、钙调蛋白寡聚物、提 供至少两个螯合基团K的化合物(寡聚物)，其中所述至少两个螯合基团能 够与过渡金属离子结合，由此使A部分能够与寡聚组氨酸亲和标记物、多 聚谷胱甘肽-S-转移酶或生物素化的载体蛋白结合。
如上所述，所述第一和第二试剂除具有能够与各自细胞表面受体分子 结合的结合位点以外，还具有结合配偶体C1或C2(为便于参考，以下将其 称为“结合配偶体C”)。此结合配偶体C能够与多聚化剂的结合位点Z结合 (Z表示多聚化剂的结合位点Z1或结合位点Z2)。包括在第一或第二试剂中 的结合配偶体C和多聚化剂的结合位点Z之间形成的非共价键可以具有任 何期望的强度和亲和力，只要其在进行本发明方法的条件下是可被破坏的或可逆的。包括在受体结合剂中的结合配偶体C和多聚化剂的结合位点Z 之间的结合力的解离常数(KD)可以是在约10-2M至约10-13M的范围内的 值。因此，这种可逆键KD值可以例如为约10-2M至约10-13M、或约10-3 M至约10-12M、或约10-4M至约10-11M、或约10-5M至约10-10M。这种 键的KD值以及受体结合剂的结合位点B和受体分子之间形成的键的KD、 koff和kon率可通过任何合适的手段确定，例如，通过荧光滴定、平衡透析 或表面等离子体共振。所述受体分子结合剂可以包括至少一个，包括两 个、三个或更多个第二结合配偶体C，所述亲和试剂可以包括至少两个， 诸如三个、四个、五个、六个、七个、八个或更多个针对受体分子结合剂中包括的结合配偶体的结合位点。如美国专利US 7,776,562、US 8,298,782 或国际专利申请WO 2002/054065中所述，可以选择结合配偶体C和具有一 个或更多相应结合位点Z的亲和试剂的任意组合，只要结合配偶体C和亲 和试剂的结合位点Z能够可逆地结合或多聚化成(多价)复合物，这通常伴随 着亲和力效应。
包括在第一或第二试剂中的结合配偶体可以是寡肽、多肽、蛋白质、 核酸、脂质、糖、寡糖或多糖。这样的结合配偶体对多聚化剂结合位点的 亲和力比其它物质高。各自结合配偶体的实例包括但不限于免疫球蛋白分 子及其片段和具有抗体样功能的蛋白质结合分子。
在一些实施方式中，包括在第一或第二试剂中的结合配偶体C包括生 物素，而亲和试剂包括与生物素可逆结合的链霉亲和素类似物或亲和素类 似物。
在一些实施方式中，包括在第一或第二试剂中的结合配偶体C包括与 链霉亲和素或亲和素可逆结合的生物素类似物，而亲和试剂包括包括与各 自生物素类似物可逆结合的链霉亲和素、亲和素、链霉亲和素类似物或亲 和素类似物。
在一些进一步的实施方式中，包括在第一或第二试剂中的结合配偶体 C包括链霉亲和素或亲和素结合肽，而亲和试剂包括包括与各自链霉亲和 素或亲和素结合肽可逆结合的链霉亲和素、亲和素、链霉亲和素类似物或 亲和素类似物。
在一些实施方式中，包括在第一或第二试剂中的结合配偶体可以包括 链霉亲和素结合肽Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:01)，而亲 和试剂可以包括在野生型链霉亲和素序列位点第44至47位上含有氨基酸 序列Va144-Thr45-Ala46-Arg47(SEQ IDNO:02)的链霉亲和素突变蛋白(类似 物)，或者在野生型链霉亲和素序列位点第44至47位上含有氨基酸序列 lle44-Gly45-Ala46-Arg47(SEQ ID NO:03)的链霉亲和素突变蛋白(类似物)，两 者均如例如美国专利US 6,103,493中所述，并且以商标名
Figure BDA0002497768740000341
可 商业购得。链霉亲和素结合肽可以例如是单一的肽，诸如如美国专利US 5,506,121中所述的“Strep标记
Figure BDA0002497768740000342
”，或者是具有两个或多个独立结 合分子连续排布的链霉亲和素结合肽，正如国际专利申请WO 02/077018或 美国专利US 7,981,632中所述的。
在一些实施方式中，第一或第二试剂的结合配偶体C包括技术人员已 知为亲和标记物的部分。在这样的实施方式中，亲和试剂包括已知能与亲 和标记物结合的相应结合配偶体，例如，抗体或抗体片段。作为已知亲和 标记物的一些示例性实例，包括在第一或第二试剂中的结合配偶体可以包 括寡聚组氨酸、免疫球蛋白结构域、麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽-S-转移酶 (GST)、甲壳质结合蛋白(chitin binding protein,CBP)或硫氧还蛋白、钙调蛋 白结合肽(CBP)、FLAG’肽、HA标记物(序列：Tyr-Pro-Tyr-Asp-Val-Pro- Asp-Tyr-Ala,(SEQ ID NO:11))、VSV-G标记物(序列：Tyr-Thr-Asp-Ile-Glu- Met-Asn-Arg-Leu-Gly-Lys,(SEQ ID NO:12))、HSV标记物(序列：Gln-Pro- Glu-Leu-Ala-Pro-Glu-Asp-Pro-Glu-Asp,(SEQ ID NO:13))、T7抗原表位(Ala- Ser-Met-Thr-Gly-Gly-Gln-Gln-Met-Gly,(SEQID NO:14))、麦芽糖结合蛋白 (MBP)、序列为Gln-Pro-Glu-Leu-Ala-Pro-Glu-Asp-Pro-Glu-Asp(SEQ ID NO: 13)的单纯疱疹病毒糖蛋白D的HSV抗原表位、序列为Glu-Gln-Lys-Leu- Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu(SEQ ID NO:15)的转录因子c-myc的“myc”抗原表 位、V5标记物(序列：Gly-Lys-Pro-Ile-Pro-Asn-Pro-Leu-Leu-Gly-Leu-Asp- Ser-Thr,SEQ IDNO:16)，或谷胱甘肽-S-转移酶(GST)。在这样的实施方式 中，多聚化剂的一个或多个结合位点(在这种情况下，是抗体或抗体片段)与 抗原形成的复合物可通过添加游离的抗原即游离肽(抗原表位标记物)或游离 的蛋白质(诸如MBP或CBP)而被竞争性破坏。亲和标记物也可以是寡核苷 酸标记物。这种寡核苷酸标记物可例如用于与连接至或包括在亲和试剂中 的、具有互补序列的寡核苷酸杂交。
在一些实施方式中，包括在第一或第二试剂的结合配偶体C和多聚化 剂的一个或多个结合位点之间的结合在二价、三价或四价阳离子存在时发 生。在这一点上，在一些实施方式中，多聚化剂包含通常借助于合适的螯 合剂容纳(例如，与之复合)的二价、三价或四价阳离子。在这样的实施方式 中，包括在受体结合剂中的结合配偶体可以包括含有(例如，复合有)二价、 三价或四价阳离子。各自金属螯合剂的实例包括但不限于乙二胺、乙二胺 四乙酸(EDTA)、乙二醇四乙酸(EGTA)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、N,N-双 (羧甲基)甘氨酸(也称为次氮基三乙酸，NTA)、或1,2-双(2-氨基苯氧基)乙烷 -N,N,N',N'-四乙酸(BAPTA)。作为一个实例，EDTA与大多数一价、二价、 三价和四价的金属离子形成复合物，诸如，钙(Ca2+)、锰(Mn2+)、铜(Cu2+)、 铁(Fe2+)、钴(Co3+)和锆(Zr4+)，而BAPTA对Ca2+有特异性。作为一个示例 性实例，本领域使用的标准方法是使寡聚组氨酸标记物与铜(Cu2+)、镍 (Ni2 +)、钴(Co2+)或锌(Zn2+)之间形成复合物，这通过螯合剂次氮基三乙酸 (NTA)实现。
在一些实施方式中，包括在第一或第二试剂中的结合配偶体C包括钙 调蛋白结合肽，而亲和试剂包括如美国专利US 5,985,658或者如本文参照 例如图2所述的多聚钙调蛋白。在一些实施方式中，包括在第一或第二试 剂中的结合配偶体C包括FLAG肽，而亲和试剂包括与FLAG肽结合的抗 体，例如，与如美国专利US 4,851,341中所述的单克隆抗体4E11结合的 FLAG肽。在一个实施方式中，包括在第一或第二试剂中结合配偶体C包 括寡聚组氨酸标记物，而亲和试剂包括与寡聚组氨酸标记物结合的抗体或 过渡金属离子。所有这些结合复合物的破坏可以通过金属离子螯合作用完 成，例如钙螯合，例如通过添加EDTA或EGTA(同上所述)完成。钙调蛋 白、抗体诸如4E11或螯合金属离子或游离螯合剂可通过常规方法进行多聚 化，例如，第一步，通过与链霉亲和素或亲和素或其聚合物的生物素化和 络合作用或者通过将羧基残基引入多糖例如葡聚糖，基本上如Noguchi,A, 等人BioconjugateChemistry(1992)3,132-137中所述；第二步，使用常规碳 二亚胺化学法，将钙调蛋白或抗体或螯合金属离子或游离螯合剂经由伯氨 基连接到多糖例如葡聚糖主链的羧基上。在这样的实施方式中，包括在第 一或第二试剂中的结合配偶体C与多聚化剂的一个或多个结合位点Z之间 的结合可通过金属离子螯合作用而破坏。金属螯合作用可例如通过添加 EGTA或EDTA而完成。
在一些实施方式中，尤其是，如果多聚化剂是可溶形式的并且是基于 链霉亲和素或亲和素的，那么它可以是链霉亲和素或亲和素的寡聚物或聚 合物或者链霉亲和素或亲和素的任意突变蛋白(类似物)的寡聚物或聚合物。 结合位点Z是亲和素或链霉亲和素的天然生物素结合。各自的寡聚物或聚 合物可以通过多糖交联。在一个实施方式中，在第一步中，通过将羧基残 基引入多糖例如葡聚糖中制备链霉亲和素的寡聚物或聚合物、或亲和素的 寡聚物或聚合物、或链霉亲和素类似物的寡聚物或聚合物、或亲和素类似 物的寡聚物或聚合物，基本上如Noguchi,A,等人,Bioconjugate Chemistry (1992)3,132-137中所述。然后在第二步中，使用常规碳二亚胺化学法，可 将链霉亲和素或亲和素或其类似物可以经由其内部的赖氨酸残基和/或游离 N端的伯氨基连接到葡聚糖主链的羧基上。此外，链霉亲和素或亲和素的 交联寡聚物或聚合物、或者链霉亲和素或亲和素的任意突变蛋白(类似物)的 交联寡聚物或聚合物也可以经由诸如戊二醛的双官能分子作为接头，通过 交联单独的链霉亲和素或亲和素分子(本文中链霉亲和素或亲和素的四聚同 源二聚物被称为“单独分子”或各自寡聚物或聚合物的最小结构单元)，或者 通过本领域的其它方法获得。例如，通过第一步将硫醇基引入链霉亲和素 突变蛋白(这可例如通过链霉亲和素突变蛋白和2-亚氨基噻吩(iminothiolane) (Trauts试剂)发生反应而实现)，并且在单独的反应中激活链霉亲和素突变蛋 白中可获得的氨基，可以产生链霉亲和素突变蛋白的寡聚物。氨基的激活 可通过链霉亲和素突变蛋白与市售异源双功能交联剂诸如磺基琥珀酰亚胺 基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(磺基SMCC)或琥珀酰亚胺基-6- [(β-马来酰亚胺丙酰氨基)己酸酯(SMPH)发生反应而实现。在第二步中，将 如此获得两个反应产物混合在一起，导致包含在一批经修饰的链霉亲和素 突变蛋白中的硫醇基与另一批经修饰的链霉亲和素突变蛋白中已激活的(通 过马来酰亚胺的功能)氨基发生反应。通过这个反应，链霉亲和素突变蛋白 的多聚物/寡聚物形成。这些寡聚物可以具有大于3的任何合适数目的“单独分子”或“链霉亲和素结构单元”，并且寡聚反应程度可根据反应条件变化(参 见图24)。这两批经修饰的链霉亲和素突变蛋白发生反应后，寡聚可溶性多 聚化剂通常通过体积排阻色谱法进行分离，并且任何所期望的部分都可用 作多聚化剂。通常，寡聚物不具有(且无需具有)单一的分子量，但它们通常 遵循统计重量分布诸如高斯分布。任何具有多于三个链霉亲和素同源四聚 体(结构单元；(n≥3))的寡聚物可用作可溶性多聚化剂。寡聚物可以具有例 如3至25个链霉亲和素突变蛋白同源四聚体。具有分子量为约50kDa的链 霉亲和素突变蛋白，诸如下文更详细描述的突变蛋白“m1”或“m2”，这些可 溶性寡聚物的分子量为约150kDa至约1250kDa。由于每个链霉亲和素分 子/突变蛋白具有四个生物素结合位点，因此这样的多聚化剂提供12至100 个如本文所述的结合位点Z1(和Z2)。
根据以上公开内容，除了这种只包含交联的链霉亲和素同源四聚体的 寡聚多聚化剂以外，可以使四聚链霉亲和素突变蛋白与载体发生反应而获 得本发明所用的多聚化剂。除了上述与多糖的反应以外，也可以使用生理 学上或药学上可接受的蛋白质诸如血清白蛋白(例如人血清白蛋白(HSA)或 牛血清白蛋白(BSA))作为载体蛋白。在这种情况下，链霉亲和素突变蛋白 (无论是单个同源四聚体，还是n≥3的寡聚物形式)可与载体蛋白经由非共价 相互作用偶联。为了这个目的，生物素化的BSA(其可购自多个供应商例如ThermoFisher Scientific、Sigma Aldrich或Vectorlabs，这里仅举几个例子)可 与链霉亲和素突变蛋白发生反应。当这样做时，一些链霉亲和素寡聚物将 会经由几个或多个生物素结合位点(Z1、Z2)与生物素化的载体蛋白非共价 结合，留下大部分寡聚物结合位点(Z1、Z2)可用于结合诸如第一试剂和任 选第二试剂以及任何如本文所述的另外的试剂。因此，通过这种方法，可 方便地制备具有多个结合位点Z1的可溶性多聚化剂(参见图24)。或者，链 霉亲和素突变蛋白(无论是单个同源四聚体，还是n≥3的寡聚物形式)可与合 成载体诸如聚乙二醇(PEG)分子共价偶联。任何适合的PEG分子均可用于 此目的，只要这些PEG分子和各自的多聚化剂是可溶的。通常，分子量高 达1000Da的PEG分子均可溶于水或本发明可用的培养基。这种基于PEG 的多聚化剂通过使用市售已激活的PEG分子(例如，可购自NOFNorth America Corporation,Irvine,California,USA的PEG-NHS衍生物，或可购自Creative PEGWorks,Chapel Hills,North Carolina,USA的已激活的PEG衍生 物)与链霉亲和素突变蛋白中的氨基可以很容易制备。
在链霉亲和素或野生型链霉亲和素(wt-链霉亲和素)中，Argarana等人, NucleicAcids Res.14(1986)1871-1882中所公开的氨基酸序列被提及。链霉 亲和素突变蛋白是通过一个或多个氨基酸的替换、缺失或添加而有别于野 生型链霉亲和素序列的多肽，但其保留了野生型链霉亲和素的结合特性。 链霉亲和素样多肽和链霉亲和素突变蛋白是与野生型链霉亲和素基本上免 疫学等同的多肽，并且特别能够以与野生型链霉亲和素相同或不同的亲和 力结合生物素、生物素衍生物或生物素类似物。链霉亲和素样多肽或链霉 亲和素突变蛋白可以含有不是野生型链霉亲和素一部分的氨基酸，或者其 可仅包括野生型链霉亲和素的一部分。链霉亲和素样多肽也可以是与野生 型链霉亲和素的多肽不完全相同的多肽，因为宿主不具有将宿主产生的多 肽转化成野生型链霉亲和素的结构所需的酶。术语“链霉亲和素”也包括链 霉亲和素四聚体和链霉亲和素二聚体，特别是链霉亲和素同源四聚体、链 霉亲和素同源二聚体、链霉亲和素异源四聚体和链霉亲和素异源二聚体。 每个亚基通常具有生物素或生物素类似物的结合位点，或者链霉亲和素结 合肽的结合位点。链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白的实例在例如WO 86/02077、DE 19641876 Al、US 6,022,951、WO 98/40396或WO 96/24606 中有所提及。
在一个优选的实施方式中，用作多聚化剂的链霉亲和素突变蛋白是那 些如美国专利US 6,103,493和德国专利DE 196 41 876.3中所述的链霉亲和 素突变蛋白。基于野生型链霉亲和素的氨基酸序列，这些链霉亲和素突变 蛋白在氨基酸位点第44至53位的区域内具有至少一个突变。最小链霉亲 和素的突变蛋白是优选的，其N端起始于野生型链霉亲和素第10至16位 氨基酸区域，C端终止于野生型链霉亲和素第133至142位氨基酸区域。这样的优选链霉亲和素突变蛋白的实例具有第44位的疏水性脂肪族氨基酸而 非Glu、第45位的任意氨基酸、第46位的疏水性脂肪族氨基酸或/和第47 位的碱性氨基酸而非Val。链霉亲和素突变蛋白可以是在野生型链霉亲和素 序列位点第44至47位上包含氨基酸序列Va144-Thr45-Ala46-Arg47(SEQ ID NO:02)的突变蛋白，或者是在野生型链霉亲和素序列位点第44至47位上 包含氨基酸序列lle44-Gly45-Ala46-Arg47(SEQ ID NO:03)的链霉亲和素突变蛋白(类似物)。这种突变蛋白在例如美国专利US 6,103,493中有所描述，并且 可以从IBAGmbH以突变蛋白“m1”和突变蛋白“m2”的形式商业购得，其商 标为
Figure BDA0002497768740000391
在一些实施例中，可以使用根据本发明的方法来排除先前用于细胞扩 增的试剂样品。第一或第二试剂以及各自的游离配偶体(竞争试剂)可以例如 存在于上述扩增方法的洗脱液中。使用本发明的方法，这样的试剂可被至 少基本上(包括完全地)从样品(例如从细胞群)中去除。作为一个示例性实 例，如上所定义的第一或第二试剂可从样品中排除至低于例如FACS或 Western Blot印迹法检出限的水平。竞争试剂(游离的第一或第二结合配偶 体或其类似物)可用于终止并控制扩增，将细胞群从多聚化剂中释放出来。 这种竞争试剂可以具有能够在WO 2013/124474中所述的“去除筒”中与亲 和试剂的结合位点Z特异性结合的结合位点。在这个实施方式中，本发明 的各方法也可用于排除第一和第二试剂以及竞争试剂，包括去除它们。
根据本发明所述的方法可在细胞群生存力至少基本不受影响的任何温 度下进行。当在本文中提及至少基本上无害或无毒或至少基本上不影响生 存力的条件时，是指这样的条件，即在其中进行扩增的、具有完全生存力 的细胞群百分比不低于至少70％，包括至少75％、至少80％、至少 85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％。在一些实施方式中，根据本发明所述的方法在约20℃ 或更高的温度下进行。根据待扩增的细胞群，合适的温度范围可以例如是 从约20℃至约45℃，包括从约25℃至约40℃，或从约32℃至 37℃。在一些实施方式中，根据本发明所述的方法在恒定的温度下进行， 或在选定的温度值上±约5℃、±约4℃、±约3℃、±约2℃、±约1℃ 或±约0.5℃。本领域的技术人员能够根据经验并考虑细胞特性和扩增条件 来确定合适的温度。通常人类细胞是在例如37℃温度下进行扩增。
在进一步的实施方式中，本发明提供了一种扩增细胞群的体外方法， 其包括使含有细胞群的样品与多聚化剂接触，其中所述多聚化剂是可溶形 式的，并且具有固定(结合)于其上的、向细胞提供初级激活信号的第一试 剂。多聚化剂包含至少一个结合位点Z1用于结合第一试剂，其中所述第一 试剂包含至少一个结合配偶体C1，其中所述结合配偶体C1能够与多聚化 剂的结合位点Z1结合。第一试剂通过结合配偶体C1和结合位点Z1之间形 成的键与多聚化剂相结合，并且第一试剂与细胞表面受体分子结合，由此 向细胞提供初级激活信号从而激活细胞。这里应明确指出的是，当使用可 溶性多聚化剂时，结合配偶体C1和结合位点Z1之间的键无需是可逆的。
在第二种方法的一个实施方式中，多聚化剂具有固定(结合)于其上 的、刺激细胞表面辅助分子的第二试剂，其中所述第二试剂包含结合配偶 体C2，其中所述结合配偶体C2能够与多聚化剂的结合位点Z2结合。第二 试剂通过结合配偶体C2和结合位点Z2之间形成的键与多聚化剂相结合， 其中所述第二试剂与细胞表面辅助分子结合，由此刺激已激活的细胞。
在第二种方法的一个实施方式中，结合配偶体C1和结合位点Z1之间 形成的键可以是不可逆的和/或结合配偶体C2和结合位点Z2之间形成的键 也可以是不可逆的。
在第二种方法的一个不同的实施方式中，结合配偶体C1和结合位点 Z1之间形成的键可以是可逆的。结合配偶体C2和结合位点Z2之间形成的 键也可以是可逆的。在这种情况下，所述结合位点Z1和所述结合配偶体 C1之间的可逆结合和/或所述结合位点Z2和所述结合配偶体C2之间的可 逆结合的解离常数(Kd)在10-2M至10-13M的范围内。
在基于可溶性多聚化剂的第二种方法中，第一和第二试剂、多聚化剂 和所有其它试剂以及细胞群也可以以与上述利用第一或第二试剂和多聚化 剂间可逆结合的方法相同的方式使用。
本发明进一步提供了用于扩增细胞群的试剂盒，所述试剂盒包括：
(i)多聚化剂，其中所述多聚化剂包含至少一个结合位点Z用于第一试 剂的可逆结合，
(ii)第一试剂，其与细胞表面受体分子结合，由此向细胞提供初级激活 信号从而激活细胞，其中所述第一试剂包含至少一个结合配偶体C1，其中 所述结合配偶体C1能够与多聚化剂的结合位点Z1可逆结合，其中所述第 一试剂通过结合配偶体C1和结合位点Z1之间形成的可逆键与多聚化剂相 结合，和
(iii)第二试剂，其刺激细胞表面辅助分子，其中所述第二试剂包含结合 配偶体C2，其中所述结合配偶体C2能够与多聚化剂的结合位点Z2可逆结 合，其中所述第二试剂通过结合配偶体C2和结合位点Z2之间形成的键与 多聚化剂相结合，其中所述第二试剂与细胞表面辅助分子结合从而刺激已 激活的细胞。
本发明还提供了用于扩增细胞群的试剂盒，所述试剂盒包括：
(i)多聚化剂，其中所述多聚化剂是可溶形式的并且包含至少一个结合 位点Z用于第一试剂的可逆结合，
(ii)第一试剂，其与细胞表面受体分子结合，由此向细胞提供初级激活 信号从而激活细胞，其中所述第一试剂包含至少一个结合配偶体C1，其中 所述结合配偶体C1能够与多聚化剂的结合位点Z1结合，其中所述第一试 剂通过结合配偶体C1和结合位点Z1之间形成的可逆键与多聚化剂相结 合。
这第二种试剂盒可以进一步包括：(iii)第二试剂，其刺激细胞表面辅助 分子，其中所述第二试剂包含结合配偶体C2，其中所述结合配偶体C2能 够与多聚化剂的结合位点Z2结合，其中所述第二试剂通过结合配偶体C2 和结合位点Z2之间形成的键与多聚化剂相结合。
本文所公开的试剂盒特别地用于当细胞群是淋巴细胞群时。
根据上文公开的内容，本发明还提供了新型多聚化剂和包含能够扩增 细胞群的多聚化剂的新型组合物。这种能够扩增细胞群的多聚化剂是可溶 形式的，并且包含至少一个结合位点Z1用于可逆结合向细胞提供初级激活 信号的第一试剂，其中所述多聚化剂具有可逆固定(结合)于其上的所述向细 胞提供初级激活信号的第一试剂；其中所述第一试剂包含至少一个结合配 偶体C1，其中所述结合配偶体C1能够与多聚化剂的至少一个结合位点Z1 可逆结合，其中所述第一试剂通过结合配偶体C1和结合位点Z1之间形成 的可逆键与多聚化剂相结合。这里应当注意的是，这种多聚化剂可以具有 固定于其上的本文所述的任何第一试剂。
本发明的多聚化剂可以进一步包含至少一个结合位点Z2用于可逆结合 刺激细胞表面辅助分子的第二试剂，其中，所述多聚化剂具有可逆固定(结 合)于其上的、刺激细胞表面辅助分子的第二试剂，其中所述第二试剂包含 结合配偶体C2，其中所述结合配偶体C2能够与多聚化剂的至少一个结合 位点Z2结合。在这个实施方式中，第二试剂通过结合配偶体C2和结合位 点Z2之间形成的键与多聚化剂相结合。
同样根据上方公开的内容，这种多聚化剂能够扩增淋巴细胞群或包含 在淋巴细胞群中的亚群。待扩增的淋巴细胞群可以是任何合适的细胞群， 例如，B细胞群、T细胞群或天然杀伤细胞群。T细胞群可以是抗原特异性T细胞群、辅助T细胞群、细胞毒性T细胞、记忆T细胞、调节性T细胞 群或天然杀伤T细胞群。因此，在这种多聚化剂的实施方式中，第一试剂能够刺激T细胞中的TCR/CD3复合物相关信号。因此，多聚化剂中存在的 第一试剂可以是与CD3特异性结合的结合剂，而与辅助分子结合的第二试 剂可以是与CD28或CD137特异性结合的结合剂。
在多聚化剂的实施方式中，与CD3特异性结合的第一试剂可以是抗 CD3抗体、抗CD3抗体的二价抗体片段、抗CD3抗体的单价抗体片段、和 /或具有抗体样结合特性的蛋白质CD3结合分子。在这些实施方式中，与 CD28或CD137特异性结合的第二试剂可以是抗CD28抗体、抗CD28抗体 的二价抗体片段、抗CD28抗体的单价抗体片段、具有抗体样结合特性的蛋白质CD28结合分子、抗CD137抗体、抗CD137抗体的二价抗体片段、 抗CD137抗体的单价抗体片段、具有抗体样结合特性的蛋白质CD137结合 分子、4-1BB配体及其任意混合物。因此，本发明的多聚化剂一般可具有 固定于其上的一种第一试剂和一种第二试剂混合物，例如，抗CD3抗体作 为第一试剂，以及例如，抗CD28抗体和4-1BB配体作为(联合)第二试剂。
如果多聚化剂被用于扩增B细胞，那么固定在多聚化剂上的第一试剂 可以是与CD40或CD137特异性结合的结合剂。根据本文公开的内容，在 这样的实施方式中，与CD40或CD137特异性结合的第一结合剂可选自抗 CD40抗体、抗CD40抗体的二价抗体片段、抗CD40抗体的单价抗体片段 和具有抗体样结合特性的蛋白质CD40结合分子，或者抗CD137抗体、抗 CD137抗体二价抗体片段、抗CD137抗体的单价抗体片段、具有抗体样结 合特性的蛋白质CD137结合分子和CD40配体(CD154)。
此外，根据本发明的大致公开内容，在如本文所述的多聚化剂中，多 聚化剂的结合位点Z1和Z2可以是完全相同的。如上所述，这样的多聚化 剂可以包括链霉亲和素的寡聚物或聚合物、亲和素的寡聚物或聚合物、可 逆结合生物素的链霉亲和素类似物的寡聚物或聚合物、可逆结合生物素的 亲和素类似物的寡聚物或聚合物、含有至少两个螯合基团K的试剂，其中 所述至少两个螯合基团能够与过渡金属离子结合，由此使所述试剂能够与 寡聚组氨酸亲和标记物、多聚谷胱甘肽-S-转移酶、多聚钙调蛋白和生物素 化的载体蛋白结合。
本文提供了一种能够扩增细胞群的新型组合物，其可包括：
(i)第一多聚化剂，其中所述第一多聚化剂是可溶形式的，并且包含至 少一个结合位点Z1用于向细胞提供初级激活信号的第一试剂的可逆结合， 其中所述第一多聚化剂具有可逆固定(结合)于其上的所述向细胞提供初级激 活信号的第一试剂，其中所述第一试剂包含至少一个结合配偶体C1，其中 所述结合配偶体C1能够与多聚化剂的至少一个结合位点Z1可逆结合，其 中所述第一试剂通过结合配偶体C1和结合位点Z1之间形成的可逆键与多 聚化剂相结合，和
(ii)第二多聚化剂，其中所述第二多聚化剂是可溶形式的，并且包含至 少一个结合位点Z2用于对细胞表面辅助分子进行刺激的第二试剂的可逆结 合，其中所述多聚化剂具有可逆固定(结合)于其上的所述刺激细胞表面辅助 分子的第二试剂，其中所述第二试剂包含结合配偶体C2，其中所述结合配 偶体C2能够与多聚化剂的至少一个结合位点Z2结合，其中所述第二试剂 通过结合配偶体C2和结合位点Z2之间形成的键与多聚化剂相结合。
这样的新型组合物是例如实施例13中使用的反应混合物，其中两种单 独的多聚化剂单独用αCD3 Fab片段或单独用αCD28 Fab片段功能化。关于 这点应注意的是，这样的组合物在实施例13中显示出具有与其上共同固定 有第一试剂和第二试剂两者的单一多聚化剂相同的扩增效率。因此，联合 使用两种或多种仅被一种试剂(例如，一种第一试剂或一种第二试剂)单独功 能化的多聚化剂与使用一种具有固定于其上的第一试剂和第二试剂两者的 联合多聚化剂在用于扩增上功能等同。关于这点，应当指出的是，本发明 的多聚化剂可被多种意在用于扩增选定细胞群的试剂(例如，一种、两种、 三种、四种或甚至更多种的试剂)所功能化。第三或第四试剂可以例如提供 用于扩增所期望细胞亚群的刺激。关于这点可参见例如实施例13，其中可 溶性多聚化剂被三种试剂可逆地功能化，即αCD3 Fab片段作为第一试剂、 αCD28 Fab片段作为第二试剂和αCD8 Fab片段作为第三试剂以富集在CD3+T细胞群(淋巴细胞)样品中的CD8+T细胞亚群。通过使用这种全都 可逆固定于同一个多聚化剂上的试剂组合，本发明允许存在从样品例如含 有多种不同细胞亚群的样品中优选扩增或选择性富集任何所期望的细胞(亚) 群的可能性。然而关于这点应当注意的是，出于此目的也可以使用三种不 同的多聚化剂，例如，仅被αCD3 Fab片段功能化的第一多聚化剂、被 αCD28 Fab片段功能化的第二多聚化剂和被αCD8 Fab。同样地，可以仅用 两种不同的多聚化剂，即仅被αCD3 Fab片段多功能化的第一多聚化剂和被 αCD28 Fab片段和αCD8Fab片段两者功能化的第二多聚化剂。因此，本发 明允许以模块化的方式设计任何种类的想要的扩增试剂。
本发明还提供了一种连续扩增淋巴细胞群的体外方法，其中所述淋巴 细胞群包括T细胞。这种方法包括：
使含有包含T细胞的淋巴细胞群样品与多聚化剂接触，
其中，所述多聚化剂是可溶形式的，并且具有可逆固定于其上的(i)向T 细胞提供初级激活信号的第一试剂和(ii)刺激T细胞表面辅助分子的第二试 剂，
其中，所述多聚化剂包含至少一个结合位点Z1用于第一试剂的可逆结 合，
其中，所述第一试剂包含至少一个结合配偶体C1，其中所述结合配偶 体C1能够与多聚化剂的结合位点Z1可逆结合，其中所述第一试剂通过结 合配偶体C1和结合位点Z1之间形成的可逆键与多聚化剂相结合，
其中，所述多聚化剂包括至少一个结合位点Z2用于第二试剂的可逆结 合，
其中，所述第二试剂包含至少一个结合配偶体C2，其中所述结合配偶 体C2能够与多聚化剂的结合位点Z2可逆结合，其中所述第一试剂通过结 合配偶体C2和结合位点Z2之间形成的可逆键与多聚化剂相结合，
其中，所述第一试剂与T细胞表面的受体分子结合，由此向细胞提供 初级激活信号从而激活细胞T细胞，
其中，所述第二试剂与T细胞表面的辅助分子结合，从而刺激已激活 的细胞，由此所述第一试剂和所述第二试剂一同诱导T细胞扩增。
在这个方法中，使含有淋巴细胞群进而包含T细胞的样品与具有固定 于其上的第一和第二试剂的可溶性多聚化剂接触，导致T细胞与多聚化剂 特异性结合。
含有包含T细胞的淋巴细胞群样品与多聚化剂的接触可在生物反应器 中进行，诸如中空纤维生物反应器(例如，
Figure BDA0002497768740000461
细胞扩增系统的中空 纤维生物反应器)或塑料袋生物反应器(例如，来自GE Healthcare的Xuri细 胞扩增系统W25中使用的
Figure BDA0002497768740000462
)。
这个方法进一步包括使淋巴细胞群(含有经由第一试剂和第二试剂与多 聚化剂结合的T细胞的反应混合物)与以下项接触：(i)能够破坏第一结合配 偶体C1和结合位点Z1间键的游离第一结合配偶体C1或其类似物和(ii)能 够破坏第二结合配偶体C2和结合位点Z2间键的游离第二结合配偶体C2或 其类似物。通过这样做，所述第一试剂结合配偶体C1和所述结合位点Z1 之间的可逆键以及所述第二试剂结合配偶体C2和所述多聚化剂结合位点Z2之间的可逆键被破坏，从而在洗脱液中释放经由第一试剂和第二试剂与 多聚化剂结合的T细胞并停止T细胞的扩增。
在这个方法中，含有扩增T细胞群的洗脱液(反应混合物，其中扩增反 应已通过加入游离第一配偶体或其类似物被终止)可在合适的(第一)固定相 上进行层析。所述(第一)固定相可以是如国际专利申请WO 2013/124474中 所述的凝胶过滤基质和/或亲和层析基质。这种凝胶过滤和/或亲和层析基质 包含亲和试剂，其中所述亲和试剂包含与第一试剂或第二试剂中所包含的 结合配偶体C1和/或C2特异性结合的结合位点Z1和/或Z2。通过这样做， 第一试剂、第二试剂、第一结合配偶体C1和/或游离第二结合配偶体C2被 固定在固定相上。在这种方法中，所述第一固定相与生物反应器流体式连 接。
在这种连续扩增的一个实施方式中，多聚化剂的结合位点Z1和Z2是 相同的。此外，可以使用单一的多聚化剂。当使用可溶性多聚化剂时，T 细胞群(或一般的扩增T细胞群)从可溶性多聚化剂中分离。分离/除去可以 利用第二固定相进行。为此，在施加到上述第一固定相之前或之后，含有 T细胞和可溶性多聚化剂的混合物在合适的固定相上进行层析。这种第二 固定相可以是凝胶过滤基质和/或亲和层析基质，其中所述凝胶过滤和/或亲和层析基质包含亲和试剂。包含在层析树脂上的亲和试剂包括与多聚化剂 的结合位点Z1和/或结合位点Z2(如果存在的话)(特异性地)结合的结合配 偶体D，从而将多聚化剂固定在固定相上。如果使用基于链霉亲和素的多 聚化剂并且第一和第二试剂两者都具有链霉亲和素结合肽作为结合配偶体 C1或C2，那么这种第二固定相上的亲和试剂中所包含的结合配偶体D可 以是生物素。用作多聚化剂的链霉亲和素的可溶性寡聚物或链霉亲和素突变蛋白的可溶性寡聚物然后和通常与层析基质共价偶联的生物素结合，诸 如市售的生物素琼脂糖凝胶(biotin-sepharoseTM)。
在这种连续扩增的方法中，第一试剂可以刺激T细胞中的TCR/CD3复 合物相关信号，并且第一试剂可以因此是与CD3特异性结合的结合剂。此 外，T细胞上的辅助分子可以是CD28。在这种情况下，与辅助分子结合的 第二试剂是与CD28特异性结合的结合剂。
在这种连续扩增的方法中，T细胞可以在扩增期间或者之后用例如T 细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR，也称为人造T细胞受体)进行转染。 这种用于引入所需受体基因的转染可以用例如任何合适的逆转录病毒载体 进行。经遗传修饰的细胞群然后从初始刺激物(例如，CD3/CD28刺激物)中 释放出来，随后被第二类的刺激物刺激，例如通过重新引入的受体。这种 第二类刺激物可以包括肽/MHC分子形式的抗原刺激物、经遗传引入的受体 的同源(交联)配体(例如，CAR的天然配体)、或在新受体的框架内直接结合 (例如，通过识别受体内的恒定区)的任意配体(诸如抗体)。这方面参阅 Cheadle等人的“Chimericantigen receptors for T-cell based therapy”Methods Mol Biol.2012；907:645-66或者Barrett等人的Chimeric Antigen Receptor Therapy for Cancer Annual Review ofMedicine Vol.65:333-347(2014).
在这种方法中，包含T细胞的淋巴细胞群可以是外周血单核细胞 (PBMC)群或经富集或经纯化的T细胞群。淋巴细胞群可以例如源自全血、 或源自非流动的血液分离产品或冷冻组织制品。
在这种基于可溶性多聚化剂的连续扩增方法中，第一和第二试剂、多 聚化剂以及所有其它试剂和细胞群也可以以与上述利用第一或第二试剂和 多聚化剂间可逆结合的方法相同的方式使用。
本发明进一步指向一种包含生物反应器和用于层析的第一固定相的排 布。生物反应器适用于细胞扩增，所述固定相适用于细胞分离和去除试 剂。第一固定相是凝胶过滤基质和/或亲和层析基质，其中所述凝胶过滤和/ 或亲和层析基质包含亲和试剂，其中所述亲和试剂包含与第一试剂中所含 的结合配偶体C1特异性结合的结合位点Z1，和/或所述亲和试剂包含与第 二试剂中所含的结合配偶体C2特异性结合的结合位点Z2。所述第一固定相由此适合于将第一试剂和/或第二试剂、第一结合配偶体C1和/或游离第 二结合配偶体C2固定于其上。此外，生物反应器和固定相是流体式连接 的。这种排布可用于上述连续扩增，并且可以整合到已知细胞扩增系统 中，诸如
Figure BDA0002497768740000481
细胞扩增系统或Xuri细胞扩增系统W25。
在这种排布中，第一固定相被包括在层析柱中或是平面固定相。这种 排布可以进一步包括与第一固定相流体式连接的第二固定相。第二固定相 可以是凝胶过滤基质和/或亲和层析基质，其中所述凝胶过滤和/或亲和层析 基质包含亲和试剂。这种亲和试剂可以包含与多聚化剂的结合位点Z1(特 异性地)结合的结合配偶体D，由此适于将多聚化剂固定在固定相上。
本发明进一步指向一种用于纯化和扩增细胞群的装置，所述装置包括 至少一个如上所定义的包含生物反应器和用于层析的第一固定相或第二固 定相的排布。
所述装置还可以进一步包括流体式连续连接的多个包含生物反应器的 装置和固定相的排布。
所述装置可以包括样品入口，其与包含生物反应器和层析固定相的排 布中的生物反应器流体式连接。所述装置还可以包括已纯化扩增的靶细胞 的样品出口，所述样品出口与至少一个包含生物反应器和层析固定相的排 布中最后一个排布的固定相流体式连接。
最后，所述装置可被设计成功能性封闭的系统。
本领域普通技术人员从本发明公开的内容将容易理解，同样可能根据 本发明利用目前存在或之后开发的、与本文所述的相应的示例性实施方式 发挥基本相同功能或取得基本相同结果的物质、手段、用途、方法或步骤 的其他组合。
实验实施例
实施例1：用可逆固定于涂覆有链霉亲和素突变蛋白
Figure BDA0002497768740000494
磁 珠上的αCD3/αCD28 Fab片段进行的CD3+T应答细胞的刺激/扩增。
用3μM CFSE对300.000个CD3+CD62L应答T细胞(Tresp，通过连续 磁富集从非流动供体血液分离产品中分离得到)进行标记，并用15μl
Figure BDA0002497768740000495
磁珠制剂(10mg磁性微粒/ml，负载有35μg
Figure BDA0002497768740000496
/mg磁 珠)中的5μl对细胞进行刺激，其中所述磁珠制剂负载有单独的0.5μg αCD3 Fab片段、单独的0.5μg αCD28 Fab片段、或0.5μg αCD3 Fab片段和0.5μg αCD28 Fab的混合物。
所用的αCD3 Fab片段来源于由杂交瘤细胞系OKT3产生的CD3结合 单克隆抗体。杂交瘤细胞系OKT3和OKT3抗体在美国专利US 4,361,549 中有所描述，细胞系以登录号
Figure BDA0002497768740000497
CRL-8001TM保藏。所用的CD28 Fab 来源于单克隆抗人CD28抗体CD28.3(Vanhove等人,BLOOD,15July 2003, Vol,102,No.2,pages 564-570)。这种抗体CD28.3可变结构域的核苷酸序列 以合成单链Fv构建抗人CD28抗体scFv28.3的形式保藏于基因库中，登录 号AF451974.1。
如国际专利申请WO2013/011011和WO 2013/124474中所述，两种Fab 片段在E.coli中重组生产，其携带IgG1保守序列作为恒定结构域(CH1和 Cκ)。两种Fab片段的重链在羧基端与两个链霉亲和素结合模块 (SAWSHPQFEK(GGGS)2GGSAWSHPQFEK(SEQ ID NO:07)，可以“双 Strep标记
Figure BDA0002497768740000492
”购于IBA GmbH,
Figure BDA0002497768740000493
Germany)的顺序排 列相融合。所述αCD3 Fab片段用作第一试剂，其具有用作结合配偶体C1 的链霉亲和素结合肽，而所述αCD28 Fab片段用作第二试剂，其具有用作 结合配偶体C2的链霉亲和素结合肽。所述(四聚)链霉亲和素突变蛋白
Figure BDA0002497768740000491
作为其上可逆固定有两种Fab片段多聚化剂。
在扩增实验中，以用空白磁珠(无Fab)刺激的Tresp细胞作为阴性对 照。将Tresp细胞连同300.000个CD3自饲养细胞(经30Gy辐照)一起一式 三份接种到48孔板上3ml添加有10U/ml白细胞介素2(IL-2)的完全细胞 培养基(RPMI(Gibco)，添加有10％(v/v)胎牛血清、L-谷氨酰胺、b-巯基乙 醇、HEPES、青霉素、链霉素和庆大霉素)中。细胞在37°下孵育，不更换 培养基，并在4天后通过FACS分析法进行分析。用100μM D-生物素孵育 10分钟后进行FACS染色和分析。每种情况的代表曲线在图4中示出。曲 线示出了活的CD3+细胞，其中CD3+细胞用碘化丙啶(PI)染色以区分活/ 死。图4A是示出了被刺激细胞大小分布(前向散射)的直方图。图4A示出 了，当在其上固定有0.5μgαCD3 Fab片段和0.5μgαCD28 Fab混合物的磁珠存在下进行孵育，并在体外被可逆固定于涂覆有链霉亲和素突变蛋白
Figure BDA0002497768740000501
的磁珠上的αCD3/αCD28 Fab片段刺激后，Tresp细胞的特定细 胞群被刺激和扩增(与未经刺激的“仅磁珠”对照相比较，其大小/数量增 加)。图4B示出了代表据每次细胞分裂的细胞数(如于图4B顶部所标识，0 代表未分裂的细胞；5代表经历了至少5次分裂的细胞)所示增殖程度的增 殖染料CFSE稀释度直方图。从图4B可以看出，被其上固定有0.5μg αCD3 Fab片段和0.5μg αCD28 Fab混合物的磁珠所刺激的T细胞群大多经 历了三次细胞分裂，并表现出比单独的单一刺激更为均匀的增殖模式(未分 裂的峰“0”内细胞数较少)。增加的增殖绝对数(更多的细胞在用αCD3和 αCD28功能化的磁珠刺激4天均匀增殖)也可以通过更多的培养基消耗示 出，如图4C所示，指示剂颜色变为黄色。
实施例2：对Jurkat细胞中不同的细胞内钙动员的分析
在此检测了用αCD3抗体克隆OKT3或与
Figure BDA0002497768740000502
多聚化的OKT3 的Fab片段标记的Jurkat细胞内诱发的不同的细胞内钙动员的实时流式细 胞分析(low-cytometricanalysis)。
为此，Jurkat细胞负载有钙敏染料Indo-1-AM，通过注射αCD3单克隆 抗体OKT3(由杂交瘤细胞系OKT3产生，见上文，黑色正方形)或αCD3 Fab片段(源自亲本细胞系OKT3)触发钙释放，其中，αCD3 Fab片段通过其 链霉亲和素结合肽与荧光缀合有藻红蛋白的可溶性Strep-Tactin的可逆结合 而多聚化。在完整的多聚OKT3 Fab-Strep-Tactin复合物的情况下，钙释放 触发持续一段与亲本抗体克隆(深灰色三角形)相同的时间。细胞的激活可以通过注射经的D-生物素处理的、预解离的Fab-Strep-Tactin复合物(浅灰色 圆形)而完全避免，等同于注射PBS阴性对照(白色倒三角形)。应用离子霉 素作为钙内流的阳性对照。基于FL6/FL7比率的变化，通过流式细胞术来 对细胞内Ca2+浓度的时间解析的变化进行监控。从图5A中可以看出，亲本 抗体OKT3以及OKT3的多聚单价Fab片段两者均影响钙释放，这意味着 OKT3的多聚单价Fab片段基本上具有与亲本抗体相同的功能。值得注意的 是，如果在加入Streptactin-OKT3 Fab片段之前，将生物素添加到固定有 OKT3 Fab片段的Strep-tactin中，那么多聚OKT3 Fab片段无法触发钙释 放。在这种情况下，生物素破坏了作为多聚化剂的Strep-tactin和OKT3 Fab 片段之间形成的可逆键。因此单价Fab片段从多聚化剂上被置换出来，并 且解离后其不能再通过与Jurkat细胞的CD3结合而触发钙释放。
在图5B所示的实验中，indo-1-AM标记的Jurkat细胞被源自OKT3的 αCD3 Fab-Strep-Tactin复合物所激活，如图5A中所示。注射完整的(上图) 或预解离的复合物(下图)分别作为阳性或阴性对照。此外，用完整的Fab- Strep-Tactin复合物刺激细胞后接着注射D-生物素(在t＝140s近激活峰处)， 导致αCD3 Fab多聚体信号传导的突然中断(中图)。将离子霉素注射入预解 离的Fab复合物群作为阳性对照。数据代表三不同的实验。重要的是，图 5B示出了加入样品中的D-生物素迅速将Fab片段从Strep-tactin多聚化剂中 置换出来，从而有效地终止钙释放，即便是在正在进行的钙刺激下，并且 证明了解离的OKT3 Fab片段不再具有生物学活性。同样地，在将 Streptactin-OKT3 Fab样品加入Jurkat细胞之前，将生物素添加到Strep- tactin-OKT3 Fab片段多聚体中，多聚OKT3 Fab片段也无法触发钙释放。
实施例3：经CD3 Fab多聚体进行的细胞可逆染色
本实施例检测了经CD3 Fab多聚体对细胞进行的可逆染色。新鲜分离 的PBMC用αCD3单克隆抗体克隆OKT3(左侧散点图，Fab多聚体的亲本 克隆)或同源藻红蛋白(PE)标记的OKT3 Fab多聚体进行染色，并在D-生物 素处理之前(左二列)或之后(中间列)进行分析。在后续的清洗步骤后，使用 新鲜PE标记的
Figure BDA0002497768740000511
(右二列)检测剩余的Fab单体。对经可逆染色 的细胞进行二次Fab多聚体染色作为对照(右列)。只有在用于区分活/死的碘化丙啶(propidium iodide PI)染色中为阴性的活CD3细胞在图6中示出。 散点图中的数字表示栅极内的细胞百分比。这个实验表明，用与多聚化剂 Streptactin多聚化的抗CD3Fab片段对CD3+PBMC进行的染色通过加入 D-生物素完全可逆，并且单独的单价Fab片段无法与存在于PBMC上的 CD3分子结合。
实施例4：通过CD28 Fab多聚体进行的细胞可逆分离
本实施例示出了通过与
Figure BDA0002497768740000524
磁性颗粒(磁性微粒购自IBA GmbH
Figure BDA0002497768740000525
Germany)多聚化的抗CD28 Fab片段的可逆结合进行细胞 分离。为此目的，使用了来源于上文实施例1所述的抗体CD28.3的Fab片 段。通过Fab多聚体磁性细胞选择法将CD28+细胞从新鲜分离的PMBC中 选择/分离出来，基本上正如国际专利申请WO2013/011011中所述。在选择 之前，用同源荧光αCD28多聚体(左侧散点图)或用直接抗免疫球蛋白κ轻链的抗体(左二散点图，α-Igκ mAb)对细胞进行对照染色作为染色对照。在 选择之后，细胞用D-生物素处理，随后清洗去除磁珠和Fab单体。被释放 CD28+细胞随后用CD28 Fab多聚体(右二散点图)或用α-Igκ mAb(右侧散点 图)(重新)进行染色，以检测可能残余的Fab单体。只有活的(PI阴性)CD3+细 胞被显示出来。散点图中的数字表示栅极内的细胞百分比。图7表明使用 这种多聚抗CD28 Fab片段可以将CD28+细胞能够从PMBC中分离出来， 并且所有分离试剂包括抗CD28 Fab单体可以在选择后被去除。
实施例5：用可逆固定于可溶性Strep-tactin上的αCD3/αCD28 Fab片 段刺激/扩增CD3+T应答细胞
在本实施例中，CD3+T应答细胞(通过磁性选择法从由聚蔗糖梯度得 到的新鲜PBMC样品中分离的)在体外被可逆固定于充当可溶性多聚化剂的 可溶性寡聚
Figure BDA0002497768740000521
上的αCD3/αCD28 Fab片段刺激后扩增。寡聚
Figure BDA0002497768740000522
是根据制造商(Thermo Scientific)的方法流程，通过使
Figure BDA0002497768740000526
Figure BDA0002497768740000523
与磺基SMCC(磺基琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧 酸酯，产品#22122，Thermo Scientific)与亚氨基噻吩(iminothiolane)(产品# 26101，Thermo Scientific)聚合而获得的。寡聚链霉亲和素可通过体积排阻 色谱法与单体(未反应的)和二聚链霉亲和素突变蛋白分离，并将如此得到的 寡聚链霉亲和素突变蛋白(n≥3)部分用作可溶性多聚化剂。
为了体外扩增，300.000个CD3+应答T细胞(Tresp)用2μM羟基荧光 素琥珀酰亚胺酯(Carboxyfluorescein succinimidyl ester,CFSE)标记，并用不 同量的可溶性
Figure BDA0002497768740000532
寡聚物制剂进行刺激，所述可溶性
Figure BDA0002497768740000536
寡聚物制剂上固定有上述αCD3 OKT3 Fab片段和抗体28.3的αCD28 Fab片 段(两者在重链上都携带上述作为链霉亲和素结合肽的双Strep标记
Figure BDA0002497768740000537
Figure BDA0002497768740000538
的组合(“1x”对应于被0.5μgαCD3-和0.5μgαCD28单体Fab片 段功能化的3μg多聚化Streptactin，数字“0.5x”、“2x”和“5x”表示分 别为“1x”的n倍量)。剩余的未被刺激的Tresp细胞或用空白Strep-tactin多 聚体(无Fab)刺激的Tresp细胞作为阴性对照。将Tresp细胞连同300.000个 CD3阴性自饲养细胞(经30Gy辐照)一式两份接种到48孔板上1ml添加有 20U/ml IL-2的细胞培养基中。细胞在37℃下孵育，不更换培养基，并在5 天后通过FACS分析法按照CFSE稀释度来对增殖情况进行分析。图8A示 出了在5天后与阴性对照相比培养物中增殖细胞的大小分布增加。图8B示 出了当与其上固定有αCD3 Fab和αCD28 Fab片段混合物的可溶性寡聚
Figure BDA0002497768740000533
(与图4中的固体Streptactin磁性颗粒相比)一起孵育时，CD3+ Tresp细胞被适当地刺激并剧增殖。图8A和图8B的结果表明，在这些体外 条件下，大多数CD3+T应答细胞在表面CD28和TCR/CD3复合物与可逆 固定于可溶性
Figure BDA0002497768740000534
寡聚物上的αCD3和αCD28 Fab片段结合之后进 行分裂(2至5次细胞分裂)。在体外扩增后，可溶性Fab-Strep-Tactin刺激试 剂在D-生物素处理后被解离并去除。通过用藻红蛋白标记的
Figure BDA0002497768740000539
Figure BDA0002497768740000535
(ST-PE)对细胞重新染色而对单体Fab片段的解离和去除进行流式细 胞分析。与适当的仅用ST-PE标记的阴性对照(浅灰色直方图)相比，代表性 的直方图(深灰色直方图)被示出。从图8C中可以看出，两种Fab片段都已 经完全地解离并已从扩增的细胞中完全去除。图8D示出了5天后活(台盼 蓝阴性)细胞的绝对数。该绝对数通过使用Neubauer计数室计数得到，并按 各自的刺激条件绘图。中位细胞数在图8D中示出；误差线表示标准偏差(SD)。图8D表明，所有固定于可溶性Strep-tactin多聚化剂上的αCD3 Fab 片段和αCD28 Fab片段的混合物在扩增CD3+细胞上同样有效，并导致绝 对细胞数的约4倍增长。
实施例6：在体外被可逆的aCD3/aCD28 Fab-Streptamer多聚体刺激 的纯化CD4+和CD8+T应答细胞增殖(不更换培养基)的动力学
本实施例中检测了在体外被可逆固定于可溶性寡聚链霉亲和素突变蛋 白上的αCD3/αCD28 Fab片段刺激的纯化CD4+和CD8+T应答细胞(Tresp) 增殖的扩增动力学。为此，两种不同大小的可溶性寡聚
Figure BDA0002497768740000541
突变蛋 白被用作可溶性多聚化剂。第一种寡聚
Figure BDA0002497768740000542
是在实施例5中获得的 寡聚链霉亲和素突变蛋白的一部分(n≥3)(也被称为“常规
Figure BDA0002497768740000543
骨 架”，如图13中尖端朝下的三角形符号所示)。用作可溶性多聚化剂第二种 寡聚链霉亲和素突变蛋白是与生物素化的人血清白蛋白反应的寡聚链霉亲 和素突变蛋白(n≥3)(也被称为“大
Figure BDA0002497768740000544
骨架”)。
在本实施例中，分别用如上所述的这两种不同的Streptamer多聚体， 即实施例5所述的Streptactin骨架(使用浓度为1mg寡聚链霉亲和素突变蛋 白/ml的溶液)或大Streptactin骨架(0.1mg/ml)刺激500.000个纯化的CD4+ 或CD8+应答T细胞(Tresp)。3μl两种不同的骨架都负载有前述实施例中使 用的0.5μgαCD3和0.5μgαCD28 Fab的组合，其在Fab片段重链的C端携 带链霉亲和素结合肽SAWSHPQFEK(GGGS)2GGSAWSHPQFEK(SEQ ID NO:07)。此外，4.5μl常规Streptactin骨架负载有0.5μg αCD3 Fab片段、 0.5μg αCD8 Fab片段(IBA GmbH
Figure BDA0002497768740000545
在其Fab片段的C端也携带有 链霉亲和素结合肽SAWSHPQFEK(GGGS)2GGSAWSHPQFEK(SEQ ID NO: 07))和0.5μgαCD28 Fab片段。未经处理的(未刺激的)Tresp细胞作为阴性对 照，经市售Dynabeads(其上不可逆固定有αCD3和αCD28单克隆抗体的磁 珠)刺激的Tresp细胞作为阳性对照。将Tresp细胞一式两份接种到48孔板 上1ml添加有30U/mlIL-2的细胞培养基(RPMI 1640(Gibco)，添加有10％ (v/v)胎牛血清、0.025％(w/v)L-谷氨酰胺、0.025％(w/v)L-精氨酸、0.1％ (w/v)HEPES、0.001％(w/v)庆大霉素、0.002％(w/v)链霉素、0.002％(w/v) 青霉素)中。细胞在37℃下孵育，不更换培养基，并在1、3和6天后进行 细胞计数分析。在图13的实验中，扩增在不更换培养基的情况下进行。 CD4+T应答细胞的结果在图13A中示出，CD8+T应答细胞的结果在图 13B中示出，其中曲线图代表据每个时间点收集的CD4+Tresp(图13A)和 CD8+Tresp(图13B)的细胞数所示的增殖程度。
从图13A中可以看出，所述其上可逆固定有αCD3和αCD28 Fab片段 的“较小”可溶性多聚化剂提供了与Dynabeads(其是目前为止用于扩增T细 胞的标准试剂)相同量的CD4+T细胞的扩增，而所述“较大”寡聚可溶性 Streptactin提供了与Dynabeads相比甚至更好的扩增。这种改善可能是由以 下导致的：可溶性“较大寡聚多聚化剂”能够同时结合比“较小”可溶性寡聚物 更多的T细胞，由此能够比“较小”寡聚物刺激更多的CD4+T细胞。
从图13B中可以明显看出，使用本发明的可溶性多聚化剂，CD8+T细 胞可以在最初的3天内至少与Dynabeads一样有效地扩增。值得注意的 是，在这个时间段中，使用了除αCD3和αCD28 Fab片段(作为第一和第二 试剂)以外还携带可逆固定于其上的αCD8 Fab片段的可溶性多聚化剂的扩 增实验在这些培养条件下显示出了最佳的扩增程度。这表明有可能通过使 用对特定亚细胞群具有特异性的刺激物(这里是αCD8 Fab片段)来提高或调 整扩增的选择性，从而能获得大量所需的(亚)细胞群。
因此，综上所述，实施例6表明本发明所用的可溶性多聚化剂的功能 就触发T细胞扩增而言，与用于此目的的、使用Dynabeads的现有标准方 法相当。然而，由于可通过加入竞争剂控制(并且终止，如果需要)刺激，诸 如在第一和第二试剂与多聚化剂之间基于链霉亲和素的可逆相互作用的情 况下加入生物素，因此本发明提供了显著优于Dynabeads技术的优势，因 为扩增条件可进行优化(例如可以在3天后停止图13B实验中的刺激)。此 外，由于可溶性多聚化剂可以很容易地从反应中去除(例如，在扩增反应 后，通过将试剂固定在生物素化的柱子上)，本发明的扩增方法可在封闭系 统中实施并自动化，而不必处理磁珠诸如Dynabeads的去除问题，该封闭 系统例如是用于治疗目的的细胞的GMP生产所需的。
实施例7：在体外被可逆的aCD3/aCD28 Fab-Streptamer多聚体刺激 的纯化CD4+和CD8+T应答细胞增殖(更换培养基)的动力学
本实施例中也检测了在体外被可逆固定于可溶性寡聚链霉亲和素突变 蛋白上的αCD3/αCD28 Fab片段刺激的纯化CD4+和CD8+T应答细胞 (Tresp)增殖的扩增动力学。为此，两种不同大小的可溶性寡聚
Figure BDA0002497768740000563
突变蛋白被用作可溶性多聚化剂。第一种寡聚
Figure BDA0002497768740000564
是在实施例5中 获得的寡聚链霉亲和素突变蛋白的一部分(n≥3)(也被称为“常规
Figure BDA0002497768740000562
骨架”，如图13中以尖端朝下的三角形符号所示)。被用作可溶性多聚化剂 的第二种寡聚链霉亲和素突变蛋白通过使实施例5中获得的寡聚Strep- tactin(n≥3)与生物素化的人血清白蛋白发生反应而获得。这种可溶性寡聚多 聚化剂也被称为“大
Figure BDA0002497768740000561
骨架”。
在本实施例中，分别用如上所述的这两种不同的Streptamer多聚体， 即用实施例5所述的Streptactin骨架(1.0mg/ml)或用大Streptactin骨架(0.1 mg/ml)刺激400.000个纯化的CD4+或CD8+应答T细胞(Tresp)。3μl两种 不同的骨架都负载有如上所述的0.5μg αCD3和0.5μg αCD28 Fab片段的组 合。此外，4.5μl实施例5所述的Streptactin骨架负载有0.5μg αCD3 Fab片 段、0.5μg αCD8 Fab片段和0.5μg αCD28 Fab片段，如上文所述。未经处理 的(未刺激的)Tresp细胞作为阴性对照，用Dynabeads(其上不可逆固定有 αCD3和αCD28单克隆抗体)刺激的Tresp细胞作为阳性对照。将Tresp细胞 一式两份接种到48孔板上1ml添加有30U/ml IL-2的细胞培养基中。细胞 在37℃下孵育，在第3天更换培养基，并在1、3和6天后进行细胞计数 分析。CD4+T应答细胞的结果在图14A中示出，CD8+T应答细胞的结果在图14B中示出，其中曲线图代表了据每个时间点收集的CD4+Tresp(图 14A)和CD8+Tresp(图14B)的细胞数所示的增殖程度。
从图14A中可以看出，本发明的其上可逆固定有αCD3和αCD28 Fab 片段的可溶性多聚化剂提供了比Dynabeads更好的CD4+T细胞的扩增。
从图14B中可以明显看出，使用本发明的可溶性多聚化剂，CD8+T细 胞可以在最初6天内至少与Dynabeads一样有效地扩增。值得注意的是， 在这个时间段中，使用携带有αCD3和αCD28 Fab片段(作为第一和第二试 剂)的较大可溶性多聚化剂的扩增实验在这些培养条件下显现出了最佳的扩 增程度。这可能也是由以下导致的：可溶性“较大寡聚多聚化剂”能够同时 结合比“较小”可溶性寡聚物更多的T细胞，由此能够比“较小”寡聚物刺激 更多的CD4+T细胞。
实施例8：更换或不更换培养基情况下纯化CD4+和CD8+T细胞培养 物的扩增动力学
在本实施例中，将实施例6和实施例7中关于“较小”可溶性多聚化剂以 及阳性和阴性对照的的综合数据用输入的细胞数归一化。并未获取关于“较 大”多聚化剂的归一化数据。如实施例6和实施例7中所释，400.000至 500.000个CD4+或CD8+应答T细胞(Tresp)被3μl的Streptactin多聚体制 剂(1mg/ml；其上固定有0.5μg αCD3 Fab片段和0.5μg αCD28Fab片段)刺 激。未经处理的(未刺激的)Tresp细胞作为阴性对照，经Dynabeads刺激的Tresp细胞作为阳性对照。将Tresp细胞一式两份接种到48孔板上1ml添 加有30U/ml IL-2的细胞培养基中。Tresp细胞被一式两份接种在48孔板中 1ml补充以30U/ml IL-2的细胞培养基上。细胞在37℃下孵育，在第3天更 换培养基(图15中的直线)或不更换培养基(图15中的虚线)，并在1、3和6 天后进行细胞计数分析。从图15A的归一化数据可以看出，可逆固定有 αCD3和αCD28 Fab片段的“较小”可溶性多聚化剂产生了约2.5倍的CD4+ T细胞扩增，而使用Dynabeads的扩增产生了约1.8倍的扩增率。因此，使 用本发明的可溶性多聚化剂甚至还提供了在CD4+T细胞扩增方面超过 Dynabeads的改善。类似地，图15B确认了通过使用本发明的可溶性多聚化 剂，CD8+T细胞可以在最初3天内至少与使用Dynabeads一样有效地扩增。
实施例9：在体外被可逆的aCD3/aCD28 Fab Streptamer多聚体刺激 的纯化CD4+和CD8+T应答细胞激活后的早期群簇形成
在本实施例中，用3μl负载有0.5μg αCD3-和0.5μg αCD28 Fab组合 的寡聚Streptactin多聚化剂制剂(1mg/ml)刺激400.000个CD4+或CD8+应 答T细胞(Tresp)。未经处理的(未刺激的)Tresp细胞作为阴性对照，经 Dynabeads刺激的Tresp细胞作为阳性对照。将Tresp细胞一式两份接种到 48孔板上1ml添加有30U/ml IL-2的细胞培养基中。细胞在37℃下孵育并 在1天和2天后通过显微镜进行分析。CD4+Tresp(图16A)和CD8+Tresp (图16B)针对Dynabeads(中间一行)和Streptamer多聚体(下边一行)的刺激被 分别示出。照片表示群簇形成的程度：为了更好的可视性，在图16A和图 16B中用圆圈标出了经可溶性链霉亲和素突变蛋白寡聚物刺激的示例性群 簇。Dynabeads刺激中的群簇经深色刺激颗粒的积聚变得明显易见。显然， 对于CD4+和CD8+T细胞两者而言，当使用本发明的采用可溶性寡聚多聚 化剂的扩增方法时，早期群簇形成。
实施例10：多克隆刺激/扩增的大量CD3+中枢记忆T细胞(Tcm)的扩 增动力学和表型
在本实施例中，用3μl负载有0.5μgαCD3和0.5μg αCD28 Fab组合的 如实施例5所述的可溶性寡聚Streptactin的制剂(1mg/ml)刺激500.000个 CD3+CD62L+CD45RA应答Tcm细胞(Tresp)。此外，使用4.5μl负载有0.5 μg αCD3、0.5μg αCD8 Fab和0.5μg αCD28 Fab的Streptactin多聚体制剂作 为额外的刺激条件。未经处理的(未刺激的)Tresp细胞作为阴性对照，经 Dynabeads(其上不可逆固定有αCD3和αCD28单克隆抗体)刺激的Tresp细 胞作为阳性对照。将Tresp细胞一式两份接种到48孔板上1ml仅添加有30 U/ml IL-2或添加有30U/ml IL-2和5ng/ml IL-15的细胞培养基上。细胞在 37℃下孵育，每3天更换一次培养基，并在7天和14天后进行细胞计数分 析。曲线图代表了据每个时间点收获的细胞数所示的扩增程度，图17A中 为仅添加有IL-2的培养基，图17B中为添加有IL-2和IL-15的培养基。在 图17A和图17B两图中可以看出，具有可逆结合于其上的CD3 Fab片段和 αCD28Fab片段的可溶性多聚化剂产生了比Dynabeads更好的细胞扩增。如 图17C中对在可变细胞因子环境中培养14天后的CD62L和CD127表面表 达水平进行的流式细胞分析进一步所示，使用本发明的可溶性多聚化剂的 实验方法，在此选择的两种条件下，保持着比使用Dynabeads的扩增更高 含量的CD127表达型长期存活的记忆T细胞。这阐明了本发明方法的又一 个优势。
实施例11：从大量CD3+中枢记忆T细胞中对Tcm应答细胞进行的选 择性抗原特异性扩增(动力学和表型)
本实施例中检测了从纯化的CD3+CD62L+CD45RA-Tcm应答细胞中进 行的选择性抗原特异性(Ag特异性)扩增的动力学和表型。
更详细地，在体外用肽:MHC分子复合物(作为向细胞提供初级激活信 号的第一试剂)和αCD28 Fab片段(作为刺激细胞表面辅助分子的第二试剂) 两者刺激CD3+CD62L+CD45RA-Tcm应答细胞。抗原特异性肽与MHC分 子的复合物和αCD28 Fab片段两者均被可逆地固定在实施例5所述的可溶 性寡聚链霉亲和素突变蛋白(n≥3)上。用于抗原特异性扩增的肽为肽 CRVLCCYVL(SEQ ID NO:06)，即刻早期蛋白1的第309-317位氨基酸(如 Ameres等人,PLOS Pathogens,May 2013,vol.9,issue 5,e1003383所述)，其 呈现对巨细胞病毒(CMV)具有特异性的HLA-C7/IE-1抗原表位。呈递所述 肽的MHC I分子在α链(重链)的C端携带链霉亲和素结合肽 (SAWSHPQFEK(GGGS)2GGSAWSHPQFEK,(SEQ ID NO:07),可以“双Strep标记
Figure BDA0002497768740000591
”购于IBA GmbH,
Figure BDA0002497768740000592
Germany)。
为此，使用3μl被0.5μg配有链霉亲和素结合肽的肽:MHC I类复合物 和0.5μg上述αCD28 Fab所功能化的可溶性寡聚Streptactin多聚化剂制剂 对500.000个CD3+CD62L+CD45RA应答Tcm细胞(Tresp)进行Ag特异性 刺激。作为替代，4.5μl Streptactin多聚化剂制剂负载有0.5μg这些 肽:MHC I类复合物、0.5μg CD8αFab和0.5μg αCD28 Fab。为了比较，使 用3μl负载有0.5μg αCD3 Fab和0.5μg αCD28 Fab组合的Streptactin多聚 化剂制剂(1mg/ml)进行多克隆刺激。同样作为上述刺激条件的替代，使用 4.5μl可逆负载有0.5μg αCD3 Fab、0.5μg αCD8 Fab和0.5μg αCD28 Fab 的Streptactin多聚化剂制剂。未经处理的(未刺激的)Tresp细胞作为阴性对 照，经Dynabeads(其上不可逆固定有αCD3和αCD28单克隆抗体的磁珠) 多克隆刺激的Tresp细胞作为阳性对照。将Tresp细胞接种到48孔板上1 ml添加有30U/ml IL-2和5ng/ml IL-15的细胞培养基中。细胞在37℃下孵 育，每3天更换一次培养基，并在7天和14天后进行细胞计数分析。对经 可溶性strept-tactin寡聚物刺激/扩增的Ag特异性细胞的一部分进行示例性 流式细胞分析(图18A)，其中所述可溶性strept-tactin寡聚物上固定有含 HLA-C7/IE-1抗原表位(针对CMV)的肽:MHC-I复合物，表明这些抗原特异 性T细胞被特异性扩增。图18B至图18E的曲线图(其代表据每个时间点收 获的肽:MHCI多聚体阳性细胞的细胞数所示的不同Ag特异性的扩增程度， 类似于图18A中所示的扩增实验)表明，使用相应Ag特异性肽和MHC I分 子复合物的多聚化剂提供了最多数目的扩增细胞(范围从对于识别被HLA- A2402限制的CMV的pp65抗原表位(第341-350位氨基酸(QYDPVAALF, (SEQ ID NO:08))的Ag特异性细胞的细胞数的20倍增长(参见图18B)到识别CMV的HLA-B7/IE-1309-317抗原表位(CRVLCCYVL(SEQ ID NO:06))的 Ag特异性细胞数的98倍增长(参见图18E))，由此表明本发明的扩增方法 完全适用于Ag特异性细胞的扩增。最后，图18F中示出了HLA- B7/Hexon5抗原表位(针对腺病毒)培养14天后对CD62L和CD127表面表达 水平进行的示例性流式细胞分析，其进一步确认了使用本发明可溶性多聚 化剂的实验方法，在多克隆且Ag特异性刺激的条件下，保持了更高含量的 CD127表达型长期存活的记忆T细胞。
实施例12：大量中枢记忆T细胞的选择性Ag特异性扩增动力学和表 型
本实施例检测了从使用可逆固定于可溶性寡聚链霉亲和素突变蛋白上 的、作为第一和第二试剂的a)抗原特异性肽MHC I复合物和b)αCD28 Fab 片段体外刺激的纯化CD3+CD62L+CD45RA-Tcm应答细胞中的选择性Ag 抗原特异性扩增的动力学。
为此，使用3μl被0.5μg配有链霉亲和素结合肽(该特异性肽代表被 HLA-B07限制的腺病毒Hexon 5蛋白的第114-124位氨基酸 (CPYSGTAYNSL,SEQ ID NO:10))的肽:MHC I类复合物和0.5μg αCD28 Fab所功能化的Streptactin多聚化剂制剂对500.000个CD3+CD62L+CD45RA应答Tcm细胞(Tresp)进行Ag特异性刺激。作为替 代，4.5μl Streptactin多聚化剂制剂负载有0.5μg这种肽:MHC I类复合物、 0.5μg αCD8 Fab和0.5μg αCD28 Fab。为了比较，使用3μl负载有0.5μg αCD3 Fab和0.5μg αCD28 Fab组合的Streptactin多聚化剂制剂(1mg/ml)进 行多克隆刺激。同样作为上述刺激条件的替代，使用4.5μl负载有0.5μg αCD3 Fab、0.5μg αCD8 Fab和0.5μg αCD28 Fab的Streptactin多聚化剂制 剂。未经处理的(未刺激的)Tresp细胞作为阴性对照，经Dynabeads多克隆 刺激的Tresp细胞作为阳性对照。将Tresp细胞接种到48孔板上1ml添加 有30U/ml IL-2和5ng/ml IL-15的细胞培养基中。细胞在37℃下孵育，每 3天更换一次培养基经历，并在7天和14天后进行细胞计数分析。图19中 示出的照片代表了在第5天时群簇形成的程度，示出了示例性的针对腺病 毒的HLA-B7/Hexon 5抗原表位的Ag特异性刺激。从图19中可以看出， 这样的腺病毒抗原特异性细胞可从最初的CD3+CD62L+CD45RA-Tcm应答 细胞群中被特异性地扩增出来。
实施例13：扩增的CD8+T细胞的产量和表型——可溶性多聚化剂的 大小变化和用于刺激的αCD8-Fab的加入
本实施例检测了在体外被可逆固定于可溶性寡聚链霉亲和素突变蛋白 上αCD3/αCD28 Fab片段刺激的纯化CD8+T应答细胞的扩增。此外，本实 施例还检测了多聚化剂中添加αCD8-Fab对提高CD8+T细胞扩增特异性的 影响。
为此，分别使用两种不同的基于Streptactin的多聚化剂，即实施例5所 述的小寡聚Streptactin多聚化剂(1mg/ml)或上述较大Streptactin寡聚物(0.1 mg/ml)刺激300.000个纯化的CD8+应答T细胞(Tresp)。3μl的两种不同的 多聚化剂(骨架)均负载有上述0.5μg αCD3和0.5μg αCD28 Fab片段组合。 此外，4.5μl较小Streptactin多聚化剂(骨架)负载有上述的0.5μg αCD3、0.5 μg αCD8 Fab和0.5μg αCD28 Fab片段。此外，使用3μl仅被0.5μg αCD3 Fab片段单独功能化或0.5μg αCD28 Fab片段单独功能化的“较 小”Streptactin多聚化剂(骨架)。未经刺激的Tresp细胞作为阴性对照，经Dynabeads刺激的Tresp作为阳性对照。将Tresp细胞一式两份接种到48孔 板上1ml添加有30U/ml IL-2的细胞培养基中。细胞在37℃下孵育，每3 天更换一次培养基，并在6天后进行分析。图20A示出了据第6天收获的 细胞数所示的增殖程度，其中所述细胞数与阴性对照相比较，并以阳性对 照进行归一化。图20A示出了使用本发明的可溶性多聚化剂的CD8+ T细 胞扩增比使用Dynabeads扩增产生了更高产量的CD8+ T细胞。在细胞培养 后CD8表面表达水平(图20B)和CD45RO表面表达水平(图20B)的FACS分 析表明，本发明的多聚化剂或Dynabeads扩增了相同表型的CD8+ T细胞 (使用单因素ANOVA分析对不同的刺激条件进行比较，并未检测到显著性 差异(n.s.))。与使用Dynabeads相比，使用本发明扩增方法的CD8+细胞产 量的提高可能是由于可溶性多聚化剂比固定在Dynabeads上的抗体可以更 好地接近其位于细胞表面的靶受体。当从初始样品中扩增稀少的细胞群 时，这种产量提高会变得十分有利。
此外，将使用其上联合固定有0.5μg αCD3和0.5μg αCD28 Fab片段两 者的多聚化剂所获得的扩增产量(图20B中的左二列)与使用两种仅被αCD3 Fab片段单独功能化或αCD28 Fab片段单独功能化的多聚化剂所获得的扩 增产量(图20B中左三列)进行比较，可以看出两个实验具有相同的扩增效 率。因此，这些实验表明使用一种其上联合固定有第一试剂和第二试剂两 者的多聚化剂在用于扩增的功能上等同于使用两种分别仅负载有第一试剂 或第二试剂的单独多聚化剂。
实施例14：扩增的CD8+T细胞的产量和表型——其上固定有不同比 例的αCD3-和αCD28 Fab片段的单独可溶性多聚化剂的滴定
本实施例中检测了在体外被片段以不同量可逆固定于可溶性寡聚链霉 亲和素突变蛋白上的αCD3/αCD28 Fab片段刺激的扩增CD8+T应答细胞 (Tresp)的产量和表型。
为此，使用不同量的被αCD3 Fab单独功能化或αCD28 Fab单独功能化 的“小”寡聚Streptactin多聚化剂制剂(1mg/ml)的混合物(“1x”对应于被0.5μg αCD3单独功能化的1.5μg Streptactin多聚化剂和被0.5μg αCD28 Fab片段 单独功能化的1.5μg多聚化Streptactin)、或3μl负载有0.5μg αCD3和0.5 μg αCD28 Fab的Streptactin多聚化剂制剂、或4.5μl负载有0.5μg αCD3、 0.5μg strep-标记的αCD8和0.5μg αCD28 Fab的Streptactin多聚化剂制剂对 300.000个CD8+应答T细胞(Tresp)进行刺激。未经处理的Tresp细胞作为 阴性对照，经Dynabeads刺激的Tresp作为阳性对照。将Tresp细胞接种到48孔板上1ml添加有30U/ml IL-2的细胞培养基中。细胞在37℃下孵育， 不更换培养基，并在5天后进行分析。图21A示出了据第6天收获的细胞 数所示的增殖程度，其中，所述细胞数与与阴性对照相比较，并以阳性对 照进行归一化。图21A表明使用本发明的不同可溶性多聚化剂的CD8+ T 细胞扩增比使用Dynabeads的扩增产生了更高产量的CD8+ T细胞(特别是5x条件中的累计试剂总量导致细胞的最佳扩增，特别是随着时间的推移， 或者随着由开始细胞分裂引起的细胞总数的增加)。在细胞培养后CD8表面 表达水平(图21B)和CD45RO表面表达水平(图21B)的FACS分析表明，本 发明的不同多聚化剂或市售Dynabeads扩增了相同表型的CD8+ T细胞。
实施例15：Streptamer多聚体刺激aCD19-CAR转导的Jurkat细胞后 胞内信号级联的激活
本实施例检测了转导的Jurkat细胞胞内信号级联的激活，所述Jurkat细 胞被修饰以表达肿瘤特异性嵌合抗原受体(CAR)即这里的CD19，并使用作 为可溶性多聚化剂的如实施例5所述的寡聚
Figure BDA0002497768740000631
进行刺激。
为此，用以下试剂对300.000个JurkaT应答细胞(Jresp)进行刺激：(A) 不同量的被本文所述的αCD3 Fab和αCD28 Fab片段功能化的Streptactin多 聚化剂制剂(1mg/ml)的混合物(“x1”对应于被0.5μg αCD3-和0.5μg αCD28 Fab功能化的3μg Streptactin多聚化剂——这提供了“基于Streptactin的多克 隆多聚化剂”)，或(B)3μl被0.5μg(x1)或1μg(x2)CD19胞外域(ECD)功能 化的Streptactin多聚化剂制剂(CD19胞外域是αCD19-CAR的天然配体—— 这提供了“基于Streptactin的CAR特异性多聚化剂”)，或3μl负载有0.5 μg(x1)或1μg(x2)αIgG的Streptactin多聚化剂制剂(αIgG识别αCD19-CAR 中的IgG4间隔区——这也提供了“基于链霉亲和素突变蛋白的CAR特异性 多聚化剂)。装配有六组氨酸标记物的CD19的ECD从Sino Biological/Life technologies(SEQ ID NO:27)获得，并通过将CD19的ECD与衔接分子 His-STREPPER(IBA GmbH,Germany,订单编号2-0920-005)按分子比率1:1 混合并于室温下孵育15分钟而被功能化成可与基于链霉亲和素的多聚化剂 结合。该His-STREPPER衔接分子含有与六组氨酸标记物结合的螯合部分 和链霉亲和素结合肽，从而临时性提供靶分子，在此CD19的ECD具有可 与基于链霉亲和素突变蛋白的多聚化剂可逆结合的链霉亲和素结合肽。用 Dynabeads(具有不可逆固定于其上的αCD3-和αCD28-单克隆抗体的磁珠) 或用PMA和离子霉素刺激的Jresp作为阳性对照。将Jresp细胞接种到1.5ml Eppendorf离心管的200μl添加有30U/ml IL-2的细胞培养基中。细胞在 37℃下孵育，并在刺激0至20分钟后置于冰上进行裂解。检测到磷酸化的 ERK表明MAPK信号传导活跃，对管家β-肌动蛋白的染色表明在每种条件 下和在每个时间点时上样的总蛋白量相同。图22A示出了Jurkat细胞经“多 克隆Streptactin多聚化剂”的激活情况，图22B示出了Jurkat细胞经两种“基 于Streptactin的CAR特异性多聚化剂”的激活情况，从图22A和图22B的 比较中可以看出，Jurkat细胞可以通过CD19胞外域与CD19特异性嵌合抗 原受体结合而被激活/扩增。由于对T细胞的基因下游加工几乎仅仅在预先 选定的细胞群中进行，因此，所引入的CAR经IgG4间隔区结构域(在各种 具有不同特异性的CAR内是保守的)发生交联引起的一般性激活拓宽了可 逆细胞刺激/扩增在这些体外细胞处理情况下的适用性。
因此，这个实验表明，原则上任何通过向细胞群提供初级激活信号的 试剂(配体)的结合而被激活的细胞群都可以使用如本文所述的可逆固定在多 聚化剂上的第一试剂进行扩增。
实施例16：加入αCD8-Fab刺激扩增的CD3+T细胞的产量和亚群组 成
本实验示出了纯化的CD3+T应答细胞在体外经可逆固定于实施例5 所述作为可溶性多聚化剂的可溶性寡聚
Figure BDA0002497768740000641
上的αCD3/αCD28 Fab 片段刺激的扩增情况。在一项实验中，除了αCD3/αCD28 Fab片段以外，从IBA GmbH,
Figure BDA0002497768740000651
Germany购得的αCD8Fab片段(目录编号6-8000-203) 可被固定在链霉亲和素突变蛋白的可溶性寡聚物上，以检测是否可能在体 外用可逆的αCD3/αCD28 Fab-Streptamer多聚体优先刺激特定的T细胞亚群。更详细地，用3μl负载有0.5μg αCD3和0.5μg αCD28 Fab组合的寡聚 链霉亲和素制剂(1mg/ml)对500.000个纯化的CD3+应答T细胞(Tresp)进行 刺激。作为一种替代的方法，4.5μl Streptactin寡聚物负载有0.5μg αCD3、 0.5μg strep-标记的αCD8 Fab和0.5μgstrep-标记的αCD28 Fab。未经刺激 的Tresp细胞作为阴性对照，经Dynabeads(其上不可逆固定有αCD3和 αCD28单克隆抗体的磁珠)刺激的Tresp细胞作为阳性对照。从图23A中可 以看出，可逆负载有αCD3 Fab片段、αCD28 Fab片段以及还有αCD8 Fab 片段的多聚化剂提供了最高数量的扩增CD3+T细胞。扩增细胞数为 1.1x106的产量比使用市售Dynabeads对这些T细胞进行扩增高约30％。此 外更重要的是，如图23B所示，与使用Dynabeads或本发明的如本文所述 仅携带αCD3 Fab片段和αCD28 Fab作为第一和第二试剂的可溶性多聚化剂 进行的两种扩增相比，使用携带αCD3 Fab片段、αCD28 Fab片段和αCD8 Fab片段的多聚化剂的CD8+T细胞量是最高的。因此，本实验还表明了本 发明的优势在于除了向所期望的细胞群提供初级激活信号的第一试剂以及 可选地提供共刺激信号的第二试剂以外，另一种用于特异性激活所期望细 胞群的试剂也可以固定在多聚化剂上。因此，通过这样做，本发明提供了 从例如包含各种不同亚群的样品中优先扩增或选择性富集任何所期望的(亚) 细胞群的可能性。
实施例17：从单个细胞池中对Tcm应答细胞进行的平行抗原特异性扩 增
本实施例检测了从在体外经多种可逆的肽:MHC/αCH28 Fab Streptamer 多聚体刺激的T应答细胞单个细胞中进行的平行抗原特异性(Ag特异性)扩 增的动力学。
使用3μl被相应的携带有链霉亲和素结合肽的肽:MHC I类复合物以及 0.5μg也携带有链霉亲和素结合肽的αCD28 Fab所功能化的Streptactin多聚 体，对500.000个CD3+CD62L+CD45RA应答Tcm细胞(Tresp)同时进行用 于每种特异性的多重特异性的刺激。作为一种替代方法，对每种特异性使 用4.5μl被如本文所述的0.5μg携带有链霉亲和素结合肽的肽:MHC I、0.5 μg αCD8 Fab和0.5μg αCD28 Fab所功能化的基于Streptactin的多聚化剂。 为了比较，使用3μl可逆负载有0.5μg αCD3 Fab和0.5μg αCD28 Fab组合 的基于Streptactin的多聚化剂制剂(1mg/ml)进行多克隆刺激。同样，作为上 述刺激条件的替代，可以使用4.5μl可逆负载有0.5μg αCD3 Fab、0.5μg αCD8 Fab和0.5μg αCD28 Fab(其中每以个都携带有链霉亲和素结合肽)的 基于Streptactin的多聚化剂制剂。未经处理的(未刺激的)Tresp细胞作为阴 性对照，经Dynabeads(涂覆有αCD3-和αCD28-mAb的磁珠)多克隆刺激的 Tresp细胞作为阳性对照。将Tresp细胞接种到48孔板上1ml添加有30 U/ml IL-2和5ng/ml IL-15的细胞培养基中。细胞在37℃下孵育，每3天 更换一次培养基，并在7天和14天后进行细胞计数分析。
实施例18：在体外用被αCD3/αCD8/αCD28 Fab片段可逆功能化的基 于链霉亲和素的多聚化剂所刺激的CD3+T应答细胞中优选扩增CD8+T 细胞
使用以下试剂对300.000个CD3+应答T细胞(Tresp)进行刺激：3μl负 载有0.5μg αCD3和0.5μg αCD28 Fab组合的多聚化Streptactin制剂(1 mg/ml)或使用大Streptactin骨架的多聚化剂制剂，或者4.5μl负载有0.5μg αCD3、0.5μg αCD8 Fab和0.5μg αCD28 Fab的基于Streptactin的多聚化剂 制剂，或者3μl仅具有0.5μg αCD3 Fab或仅具有0.5μg αCD28Fab的基于 Streptactin的多聚化剂制剂的混合物(各Fab片段也携带链霉亲和素结合肽)。未经处理的Tresp细胞作为阴性对照，经Dynabeads(涂覆有αCD3-和 αCD28-mAb的磁珠)刺激的Tresp作为阳性对照。将Tresp细胞一式两份接 种到48孔板上1ml添加有30U/mlIL-2的细胞培养基中。细胞在37℃下 孵育，3天后更换培养基，6天后进行分析。
实施例19：在体外用被αCD3和αCD28 Fab片段可逆功能化的基于链 霉亲和素的多聚化剂所刺激的CD3+T应答细胞中优选扩增CD8+T细胞
使用以下试剂对300.000个CD3+应答T细胞(Tresp)进行刺激：不同量 的被αCD3Fab片段单独功能化和被αCD28 Fab片段单独功能化的基于 Streptactin的多聚化剂制剂(1mg/ml)的混合物(1.5μg基于Streptactin的多聚 化剂被0.5μg αCD3 Fab单独功能化，1.5μg基于Streptactin的多聚化剂被 0.5μg αCD28 Fab片段单独功能化)，或者不同量的被αCD3 Fab片段和 αCD28 Fab片段具有或不具有αCD8 Fab片段(各Fab片段也携带有链霉亲和 素结合肽)功能化的基于Streptactin的多聚化剂制剂的混合物(3μg基于Streptactin的多聚化剂被0.5μg αCD3-和0.5μg αCD28 Fab片段功能化—— 无αCD8 Fab片段)，或者4.5μl负载有0.5μg αCD3 Fab片段、0.5μg αCD8 Fab片段和0.5μg αCD28 Fab片段(其中Fab片段也携带有链霉亲和素结合 肽)的Streptactin多聚化剂制剂。未经处理的Tresp细胞作为阴性对照，经 Dynabeads(涂覆有αCD3-和αCD28-mAb的磁珠)刺激的Tresp作为阳性对 照。将Tresp细胞接种到48孔板上1ml添加有30U/ml IL-2的细胞培养基 中。细胞在37℃下孵育，3天后更换培养基，并在6天后进行分析。
在本说明书中列举或讨论在先出版的文献不应当地被视为承认该文献 是现有技术的一部分或是公知常识。
本文示例性描述的本发明以适当地在缺乏本文未具体公开的任何一个 或多个元件、一个或多个限制的情况下实施。因此，例如，术语“包括”、 “包含”、“含有”等应该在广义上理解且没有限制。此外，本文使用的术语和 表述被用作描述而非限制，并且在使用这些术语和表述时，没有意图排除 所示和所述特征或其部分的任何等同物，而应认识到各种修改均可能在发 明要求保护的范围内。因此，应当理解，尽管已经通过示例性实施方案和 可选特征具体公开了本发明，但是本领域技术人员可以寻求对本文所公开 和体现的本发明做出修改和变化，这样的修改和变化被认为在本发明的范 围内。
本文已经全面且一般性地描述了本发明。属于一般公开内容中的每个 更窄的种类和亚属组也构成本发明的一部分。这包括本发明的一般性描 述，其具有从该属中去除任何主题的附带条件或否定限制，无论所排除的 材料是否在本文有具体描述。
其他实施方权利要求范围内。此外，在本发明的特征或方面以马库什 组的方式进行描述时，本领域技术人员将认识到本发明也由此以马库什组 的任何个体成员或成员亚组的形式进行描述。
序列表
<110> 朱诺治疗有限公司
<120> 用于扩增细胞群的方法、试剂盒及装置
<130> LC16310021P-D
<150> US 61/980,506
<151> 2014-04-16
<160> 27
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工(artificial)
<220>
<223> Strep-标记
<400> 1
Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
1 5
<210> 2
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工(artificial)
<220>
<223> 链霉亲和素突变蛋白 (类似物) 1
<400> 2
Val Thr Ala Arg
1
<210> 3
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工(artificial)
<220>
<223> 链霉亲和素突变蛋白 (类似物) 2
<400> 3
Ile Gly Ala Arg
1
<210> 4
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工(artificial)
<220>
<223> di-标记3
<400> 4
Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
20 25
<210> 5
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工(artificial)
<220>
<223> di-标记2
<400> 5
Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
20
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工(artificial)
<220>
<223> 即刻早期1蛋白 (第309-317位氨基酸)
<400> 6
Cys Arg Val Leu Cys Cys Tyr Val Leu
1 5
<210> 7
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工(artificial)
<220>
<223> 双Strep-标记
<400> 7
Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
20 25 30
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工(artificial)
<220>
<223> CMV的pp65抗原表位 (第341-350位氨基酸)
<400> 8
Gln Tyr Asp Pro Val Ala Ala Leu Phe
1 5
<210> 9
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工(artificial)
<220>
<223> CMV的pp65抗原表位 (第265-274位氨基酸)
<400> 9
Arg Pro His Glu Arg Asn Gly Phe Thr Val Leu
1 5 10
<210> 10
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工(artificial)
<220>
<223> 腺病毒的hexon5抗原表位 (第114-124位氨基酸)
<400> 10
Lys Pro Tyr Ser Gly Thr Ala Tyr Asn Ala Leu
1 5 10
<210> 11
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工(artificial)
<220>
<223> HA-标记
<400> 11
Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
1 5
<210> 12
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工(artificial)
<220>
<223> VSV-G-标记
<400> 12
Tyr Thr Asp Ile Glu Met Asn Arg Leu Gly Lys
1 5 10
<210> 13
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工(artificial)
<220>
<223> HSV-标记
<400> 13
Gln Pro Glu Leu Ala Pro Glu Asp Pro Glu Asp
1 5 10
<210> 14
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工(artificial)
<220>
<223> T7 抗原表位
<400> 14
Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly
1 5 10
<210> 15
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工(artificial)
<220>
<223> myc 抗原表位
<400> 15
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
1 5 10
<210> 16
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工(artificial)
<220>
<223> V5-标记
<400> 16
Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp Ser Thr
1 5 10
<210> 17
<211> 119
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 17
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 18
<211> 106
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 18
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala His Phe Arg Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gly Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr
85 90 95
Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn
100 105
<210> 19
<211> 116
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 19
Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Arg
1 5 10 15
Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr Ile Ile His
20 25 30
Trp Ile Lys Leu Arg Ser Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Trp Phe
35 40 45
Tyr Pro Gly Ser Asn Asp Ile Gln Tyr Asn Ala Lys Phe Lys Gly Lys
50 55 60
Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu
65 70 75 80
Thr Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Arg
85 90 95
Asp Asp Phe Ser Gly Tyr Asp Ala Leu Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Met Val Thr Val
115
<210> 20
<211> 108
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 20
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Asn Glu Asn Ile Tyr Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Thr His Leu Val Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Thr Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Asn Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Cys
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 21
<211> 314
<212> PRT
<213> 人工(artificial)
<220>
<223> HLA-A*2402
<400> 21
Met Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Ser Thr Ser Val Ser Arg Pro
1 5 10 15
Gly Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr
20 25 30
Gln Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Gln Arg Met Glu Pro
35 40 45
Arg Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp Glu Glu
50 55 60
Thr Gly Lys Val Lys Ala His Ser Gln Thr Asp Arg Glu Asn Leu Arg
65 70 75 80
Ile Ala Leu Arg Tyr Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser His Thr Leu
85 90 95
Gln Met Met Phe Gly Cys Asp Val Gly Ser Asp Gly Arg Phe Leu Arg
100 105 110
Gly Tyr His Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Lys
115 120 125
Glu Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Met Ala Ala Gln Ile Thr
130 135 140
Lys Arg Lys Trp Glu Ala Ala His Val Ala Glu Gln Gln Arg Ala Tyr
145 150 155 160
Leu Glu Gly Thr Cys Val Asp Gly Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly
165 170 175
Lys Glu Thr Leu Gln Arg Thr Asp Pro Pro Lys Thr His Met Thr His
180 185 190
His Pro Ile Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly
195 200 205
Phe Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp
210 215 220
Gln Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly
225 230 235 240
Thr Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Glu Glu Gln
245 250 255
Arg Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr
260 265 270
Leu Arg Trp Glu Pro Pro Pro Ser Gly Ser Ser Ala Trp Ser His Pro
275 280 285
Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
290 295 300
Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
305 310
<210> 22
<211> 314
<212> PRT
<213> 人工(artificial)
<220>
<223> HLA-B*0702
<400> 22
Met Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Tyr Thr Ser Val Ser Arg Pro
1 5 10 15
Gly Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ser Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr
20 25 30
Gln Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Pro Arg Glu Glu Pro
35 40 45
Arg Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp Arg Asn
50 55 60
Thr Gln Ile Tyr Lys Ala Gln Ala Gln Thr Asp Arg Glu Ser Leu Arg
65 70 75 80
Asn Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser His Thr Leu
85 90 95
Gln Ser Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Pro Asp Gly Arg Leu Leu Arg
100 105 110
Gly His Asp Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Asn
115 120 125
Glu Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ala Gln Ile Thr
130 135 140
Gln Arg Lys Trp Glu Ala Ala Arg Glu Ala Glu Gln Arg Arg Ala Tyr
145 150 155 160
Leu Glu Gly Glu Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly
165 170 175
Lys Asp Lys Leu Glu Arg Ala Asp Pro Pro Lys Thr His Val Thr His
180 185 190
His Pro Ile Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly
195 200 205
Phe Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp
210 215 220
Gln Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Arg
225 230 235 240
Thr Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Glu Glu Gln
245 250 255
Arg Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr
260 265 270
Leu Arg Trp Glu Pro Pro Pro Ser Gly Ser Ser Ala Trp Ser His Pro
275 280 285
Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
290 295 300
Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
305 310
<210> 23
<211> 321
<212> PRT
<213> 人工(artificial)
<220>
<223> HLA-C*0702
<400> 23
Met Ala Leu Thr Glu Thr Trp Ala Cys Ser His Ser Met Arg Tyr Phe
1 5 10 15
Asp Thr Ala Val Ser Arg Pro Gly Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ser
20 25 30
Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala
35 40 45
Ala Ser Pro Arg Gly Glu Pro Arg Ala Pro Trp Val Glu Gln Glu Gly
50 55 60
Pro Glu Tyr Trp Asp Arg Glu Thr Gln Lys Tyr Lys Arg Gln Ala Gln
65 70 75 80
Ala Asp Arg Val Ser Leu Arg Asn Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser
85 90 95
Glu Asp Gly Ser His Thr Leu Gln Arg Met Ser Gly Cys Asp Leu Gly
100 105 110
Pro Asp Gly Arg Leu Leu Arg Gly Tyr Asp Gln Ser Ala Tyr Asp Gly
115 120 125
Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Asn Glu Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala
130 135 140
Asp Thr Ala Ala Gln Ile Thr Gln Arg Lys Leu Glu Ala Ala Arg Ala
145 150 155 160
Ala Glu Gln Leu Arg Ala Tyr Leu Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu
165 170 175
Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys Glu Thr Leu Gln Arg Ala Glu Pro
180 185 190
Pro Lys Thr His Val Thr His His Pro Leu Ser Asp His Glu Ala Thr
195 200 205
Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr
210 215 220
Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu
225 230 235 240
Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val
245 250 255
Val Pro Ser Gly Gln Glu Gln Arg Tyr Thr Cys His Met Gln His Glu
260 265 270
Gly Leu Gln Glu Pro Leu Thr Leu Ser Trp Glu Pro Ser Ser Gln Pro
275 280 285
Thr Ile Gly Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly
290 295 300
Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu
305 310 315 320
Lys
<210> 24
<211> 100
<212> PRT
<213> 人
<400> 24
Met Ile Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg His Pro Ala
1 5 10 15
Glu Asn Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser Gly Phe His
20 25 30
Pro Ser Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu
35 40 45
Lys Val Glu His Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr
50 55 60
Leu Leu Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala
65 70 75 80
Cys Arg Val Asn His Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile Val Lys Trp
85 90 95
Asp Arg Asp Met
100
<210> 25
<211> 118
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 25
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Arg Thr Ser
20 25 30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ala
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Ser Asn Gln Val
65 70 75 80
Phe Leu Lys Ile Ala Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Gln Ile Asn Pro Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 26
<211> 111
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 26
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Phe Asp
20 25 30
Gly Asp Ser Phe Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Thr Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Ala Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 27
<211> 283
<212> PRT
<213> 人工(artificial)
<220>
<223> 具有His-标记的人CD19胞外域
<400> 27
Pro Glu Glu Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp Asn Ala Val
1 5 10 15
Leu Gln Cys Leu Lys Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln Gln Leu Thr
20 25 30
Trp Ser Arg Glu Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys Leu Ser Leu Gly
35 40 45
Leu Pro Gly Leu Gly Ile His Met Arg Pro Leu Ala Ile Trp Leu Phe
50 55 60
Ile Phe Asn Val Ser Gln Gln Met Gly Gly Phe Tyr Leu Cys Gln Pro
65 70 75 80
Gly Pro Pro Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr Val Asn Val
85 90 95
Glu Gly Ser Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser Asp Leu Gly Gly
100 105 110
Leu Gly Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro Ser Ser Pro
115 120 125
Ser Gly Lys Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val Trp Ala Lys Asp Arg
130 135 140
Pro Glu Ile Trp Glu Gly Glu Pro Pro Cys Leu Pro Pro Arg Asp Ser
145 150 155 160
Leu Asn Gln Ser Leu Ser Gln Asp Leu Thr Met Ala Pro Gly Ser Thr
165 170 175
Leu Trp Leu Ser Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser Val Ser Arg Gly Pro
180 185 190
Leu Ser Trp Thr His Val His Pro Lys Gly Pro Lys Ser Leu Leu Ser
195 200 205
Leu Glu Leu Lys Asp Asp Arg Pro Ala Arg Asp Met Trp Val Met Glu
210 215 220
Thr Gly Leu Leu Leu Pro Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala Gly Lys Tyr
225 230 235 240
Tyr Cys His Arg Gly Asn Leu Thr Met Ser Phe His Leu Glu Ile Thr
245 250 255
Ala Arg Pro Val Leu Trp His Trp Leu Leu Arg Thr Gly Gly Trp Lys
260 265 270
Ala His His His His His His His His His His
275 280

Claims (148)

1.一种扩增细胞群的体外方法，其包括使包含细胞群的样品与多聚化剂接触，
其中，所述多聚化剂具有可逆固定(结合)于其上的、向细胞提供初级激活信号的第一试剂；
其中，所述多聚化剂包含至少一个结合位点Z1用于第一试剂的可逆结合，
其中，所述第一试剂包含至少一个结合配偶体C1，其中所述结合配偶体C1能够与多聚化剂的结合位点Z1可逆结合，其中所述第一试剂通过结合配偶体C1和结合位点Z1之间形成的可逆键与多聚化剂相结合，以及
其中，所述第一试剂与细胞表面的受体分子结合，由此向细胞提供初级激活信号从而激活细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多聚化剂具有可逆固定(结合)于其上的、刺激细胞表面辅助分子的第二试剂，
其中，所述第二试剂包含结合配偶体C2，其中所述结合配偶体C2能够与多聚化剂的结合位点Z2可逆结合，其中所述第二试剂通过结合配偶体C2与结合位点Z2之间形成的可逆键与多聚化剂相结合，
其中，所述第二试剂与细胞表面辅助分子结合，由此刺激已激活的细胞。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述细胞群是淋巴细胞群。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述淋巴细胞群是B细胞群、T细胞群、天然杀伤细胞群或其混合物。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述T细胞群是抗原特异性T细胞群、辅助T细胞群、细胞毒性T细胞、记忆T细胞、调节性T细胞群或天然杀伤T细胞群。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述第一试剂包括MHC I:肽复合物，或者，其特征在于，所述第一试剂刺激T细胞中的TCR/CD3复合物相关信号。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述第一试剂是与CD3特异性结合的结合剂。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述T细胞上的辅助分子是CD28或者CD137。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述与辅助分子的结合第二试剂是与CD28或CD137特异性结合的结合剂，或者，其特征在于，所述第二试剂是两种均能与CD28或CD137特异性结合的不同结合剂的混合物。
10.根据权利要求7至9中任一项所述的方法，其特征在于，
所述与CD3特异性结合的第一试剂选自抗CD3抗体、抗CD3抗体的二价抗体片段、抗CD3抗体的单价抗体片段和具有抗体样结合特性的蛋白质CD3结合分子，和/或，其特征在于，
所述与CD28特异性结合的第二试剂选自抗CD28抗体、抗CD28抗体的二价抗体片段、抗CD28抗体的单价抗体片段、具有抗体样结合特性的蛋白质CD28结合分子、抗CD137抗体、抗CD137抗体的二价抗体片段、抗CD137抗体的单价抗体片段、具有抗体样结合特性的蛋白质CD137结合分子、4-1BB配体及其任意混合物。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述二价抗体片段是(Fab)2’片段或二价单链Fv片段。
12.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述单价抗体片段选自Fab片段、Fv片段和单链Fv片段(scFv)。
13.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述具有抗体样结合特性的蛋白质CD3、CD28或CD137结合分子选自适体、基于脂质运载蛋白家族多肽的突变蛋白、glubody、基于锚蛋白支架的蛋白质、基于晶体支架的蛋白质、adnectin和亲和多聚体(avimer)。
14.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述细胞群是B细胞群，以及所述第一试剂是与CD40或CD137特异性结合的结合剂。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述与CD40或CD137特异性结合的第一结合剂选自抗CD40抗体、抗CD40抗体的二价抗体片段、抗CD40抗体的单价抗体片段和具有抗体样结合特性的蛋白质CD40结合分子，或者抗CD137抗体、抗CD137抗体二价抗体片段、抗CD137抗体的单价抗体片段、具有抗体样结合特性的蛋白质CD137结合分子和CD40配体(CD154)。
16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述二价抗体片段是(Fab)2’片段或二价单链Fv片段。
17.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述单价抗体片段选自Fab片段、Fv片段和单链Fv片段(scFv)。
18.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述具有抗体样结合特性的蛋白质CD40结合分子或蛋白质CD137结合分子选自适体、基于脂质运载蛋白家族多肽的突变蛋白、glubody、基于锚蛋白支架的蛋白质、基于晶体支架的蛋白质、adnectin和亲和多聚体。
19.根据权利要求3以及14至18中的任一项所述的方法，其特征在于，所述B细胞上的辅助分子是CD40。
20.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述第二试剂是CD40配体(CD154)或CD137。
21.根据权利要求2至20中任一项所述的方法，其特征在于，所述多聚化剂的结合位点Z1和Z2是相同的。
22.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，使用的是单一多聚化剂。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的方法，其特征在于，所述多聚化剂被固定在固体表面上。
24.根据权利要求23所述的方法，其特征在于，所述固体表面选自磁珠、聚合珠、细胞培养板、微量滴定板、膜、中空纤维及其混合物。
25.根据权利要求24所述的方法，其特征在于，所述多聚化剂选自链霉亲和素、亲和素、与生物素可逆结合的链霉亲和素类似物、与生物素可逆结合的亲和素类似物、包含至少两个螯合基团K的试剂，其中所述至少两个螯合基团能够与过渡金属离子结合，由此使A部分能够与寡聚组氨酸亲和标记物、多聚谷胱甘肽-S-转移酶、多聚钙调蛋白和生物素化的载体蛋白结合。
26.根据权利要求1至22中任一项所述的方法，其特征在于，所述多聚化剂是可溶形式的。
27.根据权利要求26所述的方法，其特征在于，所述多聚化剂包括链霉亲和素的寡聚物或聚合物、亲和素的寡聚物或聚合物、与生物素可逆结合的链霉亲和素类似物的寡聚物或聚合物、与生物素可逆结合的亲和素类似物的寡聚物或聚合物、包含至少两个螯合基团K的试剂，其中所述至少两个螯合基团能够与过渡金属离子结合，由此使所述试剂能够与寡聚组氨酸亲和标记物、多聚谷胱甘肽-S-转移酶、多聚钙调蛋白和生物素化的载体蛋白结合。
28.根据权利要求27所述的方法，其特征在于，所述链霉亲和素、亲和素、或与生物素可逆结合的链霉亲和素类似物或与生物素可逆结合的亲和素类似物通过多糖相交联，或者，其特征在于，所述链霉亲和素、亲和素的交联寡聚物或聚合物的交联寡聚物或聚合物、或所述与生物素可逆结合的链霉亲和素类似物或亲和素类似物的交联寡聚物或聚合物经由双功能接头通过交联获得。
29.根据权利要求27或28所述的方法，其特征在于，所述链霉亲和素或亲和素的交联寡聚物或聚合物、或所述与生物素可逆结合的链霉亲和素类似物或亲和素类似物的交联寡聚物或聚合物包括三个或更多个链霉亲和素单体。
30.根据权利要求1至29中任一项所述的方法，其特征在于，
(a)所述结合配偶体C1和C2相互独立地包括生物素，并且所述多聚化剂包含与生物素可逆结合的链霉亲和素类似物或亲和素类似物，
(b)所述结合配偶体C1和C2相互独立地包括与链霉亲和素或亲和素可逆结合的生物素类似物，并且所述多聚化剂包括链霉亲和素、或亲和素、或与所述生物素似物可逆结合的链霉亲和素类似物或亲和素类似物，或者
(c)所述结合配偶体C1和C2相互独立地包括链霉亲和素或亲和素结合肽，并且所述多聚化剂包括链霉亲和素、或亲和素、或与所述链霉亲和素或亲和素结合肽可逆结合的链霉亲和素类似物或亲和素类似物。
31.根据权利要求30所述的方法，其特征在于，所述结合配偶体C1和C2相互独立地包括链霉亲和素结合肽Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys，并且所述多聚化剂包括在野生型链霉亲和素序列位点第44至47位上包含氨基酸序列Va144-Thr45-Ala46-Arg47的链霉亲和素类似物，或者在野生型链霉亲和素序列位点第44至47位上包含氨基酸序列lle44-Gly45-Ala46-Arg47的链霉亲和素类似物。
32.根据权利要求1至31中任一项所述的方法，其特征在于，所述结合配偶体C1和结合配偶体C2分别与所述多聚化剂分别的结合位点Z1和Z2之间的结合在二价阳离子存在下发生。
33.根据权利要求32所述的方法，
其特征在于，所述结合配偶体C1和结合配偶体C2相互独立地包括钙调蛋白结合肽，并且所述多聚化剂包括钙调蛋白，或者
其特征在于，所述结合配偶体C包括FLAG肽，并且所述多聚化剂包括与FLAG肽结合的抗体，或者
其特征在于，所述第一结合配偶体C包括寡聚组氨酸标记物，并且所述多聚化剂包括与寡聚组氨酸标记物结合的抗体；
根据权利要求11或12所述的方法，其特征在于，所述结合配偶体C与所述多聚化剂的所述结合位点Z之间的结合被金属离子螯合作用破坏。
34.根据权利要求33所述的方法，其特征在于，所述金属鳌合作用通过加入EDTA或EGTA完成。
35.根据权利要求2至30中任一项所述的方法，其特征在于，所述结合配偶体C1和C2是不同的。
36.根据权利要求2至30中任一项所述的方法，其特征在于，所述结合配偶体C1和C2是相同的。
37.根据任一前述权利要求所述的方法，其进一步包括破坏所述第一试剂的结合配偶体C1和/或所述第二试剂的结合配偶体C2和所述多聚化剂的结合位点Z1和/或Z2之间的结合。
38.根据权利要求37所述的方法，其特征在于，破坏所述第一试剂的结合配偶体C1和/或所述第二试剂的结合配偶体C2和所述多聚化剂的所述结合位点Z1和/或Z2之间的结合导致细胞刺激的终止。
39.根据权利要求1至38中任一项所述的方法，其特征在于，所述结合位点Z1和所述结合配偶体C1之间的可逆结合和/或所述结合位点Z2和所述结合配偶体C2之间的可逆结合的解离常数(Kd)在10-2M至10-13M的范围内。
40.根据权利要求1至39中任一项所述的方法，其特征在于，所述第一试剂的结合配偶体C1和/或所述第二试剂的结合配偶体C2与所述多聚化剂的所述结合位点Z1和/或结合位点Z2之间的可逆键通过使所述细胞群与以下项接触而被破坏：游离第一结合配偶体C1或能够破坏第一结合配偶体C1和结合位点Z1之间的键的所述第一结合配偶体C1类似物，和/或所述第二结合配偶体C2的游离配偶体或能够破坏第二结合配偶体C2和结合位点Z2之间的键的所述第二结合配偶体C2类似物。
41.根据权利要求40所述的方法，其特征在于，所述第一游离配偶体和/或第二游离配偶体是对细胞无害的化合物。
42.根据权利要求25至41中任一项所述的方法，其特征在于，所述可逆键通过使细胞与生物素或生物素类似物接触而被破坏，当
(a)所述结合配偶体C1和C2相互独立地包括生物素，并且所述多聚化剂包括与生物素可逆结合的链霉亲和素类似物或亲和素类似物，
(b)所述结合配偶体C1和C2相互独立地包括与链霉亲和素或亲和素可逆结合的生物素类似物，并且所述多聚化剂包括链霉亲和素、或亲和素、或与所述生物素类似物可逆结合的链霉亲和素类似物或亲和素类似物，或者
(c)所述结合配偶体C1和C2相互独立地包括链霉亲和素或亲和素结合肽，并且所述多聚化剂包括链霉亲和素、或亲和素、或与所述链霉亲和素或亲和素结合肽可逆结合的链霉亲和素类似物或亲和素类似物。
43.根据权利要求25至39中任一项所述的方法，其特征在于，当所述结合配偶体C1和结合配偶体C2分别与所述多聚化剂分别的结合位点Z1和Z2之间的结合在二价阳离子存在下发生时，所述可逆键通过使细胞与金属螯合剂接触而被破坏。
44.一种扩增细胞群的体外方法，其包括使包含细胞群的样品与多聚化剂接触，
其中，所述多聚化剂是可溶形式的，并且具有固定(结合)于其上的、向细胞提供初级激活信号的第一试剂；
其中，所述多聚化剂包含至少一个结合位点Z1用于第一试剂的可逆结合，
其中，所述第一试剂包含至少一个结合配偶体C1，其中所述结合配偶体C1能够与多聚化剂的结合位点Z1结合，其中，所述第一试剂通过结合配偶体C1和结合位点Z1之间形成的键与多聚化剂相结合，以及
其中，所述第一试剂与细胞表面的受体分子结合，由此向细胞提供初级激活信号从而激活细胞。
45.根据权利要求44所述的方法，其特征在于，所述多聚化剂具有固定(结合)于其上的、刺激细胞表面辅助分子的第二试剂，
其中，所述第二试剂包含结合配偶体C2，其中所述结合配偶体C2能够与多聚化剂的结合位点Z2结合，其中，所述第二试剂通过结合配偶体C2与结合位点Z2之间形成的键与多聚化剂相结合，
其中，所述第二试剂与细胞表面辅助分子结合，由此刺激已激活的细胞。
46.根据权利要求44或45所述的方法去，其特征在于，所述结合配偶体C1和结合位点Z1之间形成的键是不可逆的和/或所述结合配偶体C2和结合位点Z2之间形成的键是不可逆的。
47.根据权利要求44或45所述的方法去，其特征在于，所述结合配偶体C1和结合位点Z1之间形成的键是可逆的和/或所述结合配偶体C2和结合位点Z21之间形成的键是可逆的。
48.根据权利要求47所述的方法，其特征在于，所述结合位点Z1和所述结合配偶体C1间的可逆结合和/或所述结合位点Z2和所述结合配偶体C2间的可逆结合的解离常数(Kd)在10-2M至10-13M的范围内。
49.根据权利要求44至48中任一项所述的方法去，其特征在于，所述细胞群是淋巴细胞群。
50.根据权利要求49所述的方法，其特征在于，所述淋巴细胞群是B细胞群、T细胞群或天然杀伤细胞群。
51.根据权利要求50所述的方法，其特征在于，所述T细胞群是抗原特异性T细胞群、辅助T细胞群、细胞毒性T细胞、记忆T细胞、调节性T细胞或天然杀伤T细胞。
52.根据权利要求51所述的方法，其特征在于，所述第一试剂包括MHC I:肽复合物，或者，其特征在于，所述第一试剂刺激T细胞中的TCR/CD3复合物相关信号。
53.根据权利要求52所述的方法，其特征在于，所述第一试剂是与CD3特异性结合的结合剂。
54.根据权利要求52或53所述的方法，其特征在于，所述T细胞上的辅助分子是CD28。
55.根据权利要求54所述的方法，其特征在于，所述与辅助分子结合的第二试剂是与CD28特异性结合的结合剂。
56.根据权利要求53至55中任一项所述的方法，其特征在于，
所述与CD3特异性结合的第一结合剂选自抗CD3抗体、抗CD3抗体的二价抗体片段、抗CD3抗体的单价抗体片段和具有抗体样结合特性的蛋白质CD3结合分子，和/或，其特征在于，
所述与CD28特异性结合的第二试剂选自抗CD28抗体、抗CD28抗体的二价抗体片段、抗CD28抗体的单价抗体片段和具有抗体样结合特性的蛋白质CD28结合分子。
57.根据权利要求56所述的方法，其特征在于，所述二价抗体片段是(Fab)2’片段或二价单链Fv片段。
58.根据权利要求56所述的方法，其特征在于，所述单价抗体片段选自Fab片段、Fv片段和单链Fv片段(scFv)。
59.根据权利要求58所述的方法，其特征在于，所述具有抗体样结合特性的蛋白质CD3或CD28结合分子选自适体、基于脂质运载蛋白家族多肽的突变蛋白、glubody、基于锚蛋白支架的蛋白质、基于晶体支架的蛋白质、adnectin和亲和多聚体。
60.根据权利要求50所述的方法，其特征在于，所述第一试剂是与CD40或CD137特异性结合的结合剂。
61.根据权利要求60所述的方法，其特征在于，所述与CD40或CD137特异性结合的第一结合剂选自抗CD40抗体、抗CD40抗体的二价抗体片段、抗CD40抗体的单价抗体片段和具有抗体样结合特性的蛋白质CD40结合分子，或者抗CD137抗体、抗CD137抗体的二价抗体片段、抗CD137抗体的单价抗体片段、具有抗体样结合特性的蛋白质CD137结合分子。
62.根据权利要求61所述的方法，其特征在于，所述二价抗体片段是(Fab)2’片段或二价单链Fv片段。
63.根据权利要求61所述的方法，其特征在于，所述单价抗体片段选自Fab片段、Fv片段和单链Fv片段(scFv)。
64.根据权利要求61所述的方法，其特征在于，所述具有抗体样结合特性的蛋白质CD40结合分子或蛋白质CD137结合分子选自适体、基于脂质运载蛋白家族多肽的突变蛋白、glubody、基于锚蛋白支架的蛋白质、基于晶体支架的蛋白质、adnectin、和亲和多聚体。
65.根据权利要求50以及60至64中任一项所述的方法去，其特征在于，所述B细胞上的辅助分子是CD40。
66.根据权利要求65所述的方法去，其特征在于，所述第二试剂是CD40配体(CD154)或CD137。
67.一种用于扩增细胞群的试剂盒，所述试剂盒包括
(i)多聚化剂，
其中，所述多聚化剂包含至少一个结合位点Z用于第一试剂的可逆结合，
(ii)第一试剂，所述第一试剂与细胞表面受体分子结合，由此向细胞提供初级激活信号从而激活细胞，
其中，所述第一试剂包含至少一个结合配偶体C1，其中所述结合配偶体C1能够与多聚化剂的结合位点Z1可逆结合，其中所述第一试剂通过结合配偶体C1和结合位点Z1之间形成的可逆键与多聚化剂相结合，以及
(iii)第二试剂，所述第二试剂刺激细胞表面辅助分子，
其中，所述第二试剂包含结合配偶体C2，其中所述结合配偶体C2能够与多聚化剂的结合位点Z2可逆结合，其中所述第二试剂通过结合配偶体C2和结合位点Z2之间形成的键与多聚化剂相结合，
其中，所述第二试剂与细胞表面辅助分子结合，从而刺激已激活的细胞。
68.一种用于扩增细胞群的试剂盒，所述试剂盒包括
(i)多聚化剂，
其中，所述多聚化剂是可溶形式的，并且包含至少一个结合位点Z用于第一试剂的可逆结合，
(ii)第一试剂，所述第一试剂与细胞表面受体分子结合，由此向细胞提供初级激活信号从而激活细胞，
其中，所述第一试剂包含至少一个结合配偶体C1，其中所述结合配偶体C1能够与多聚化剂的结合位点Z1结合，其中所述第一试剂通过结合配偶体C1和结合位点Z1之间形成的可逆键与多聚化剂相结合。
69.根据权利要求68所述的试剂盒，其进一步包括
(iii)第二试剂，所述第二试剂刺激细胞表面辅助分子，
其中，所述第二试剂包含结合配偶体C2，其中所述结合配偶体C2能够与多聚化剂的结合位点Z2结合，其中所述第二试剂通过结合配偶体C2和结合位点Z2之间形成的键与多聚化剂相结合。
70.根据权利要求67至69中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述细胞群是淋巴细胞群。
71.根据权利要求70所述的试剂盒，其特征在于，所述淋巴细胞群是B细胞群、T细胞群或天然杀伤细胞群。
72.根据权利要求71所述的试剂盒，其特征在于，所述T细胞群是抗原特异性T细胞群、辅助T细胞群、细胞毒性T细胞，记忆T细胞、调节性T细胞或天然杀伤T细胞。
73.根据权利要求67至72所述的试剂盒，其特征在于，所述第一试剂包括MHC I:肽复合物，或者，其特征在于，所述第一试剂刺激T细胞中的TCR/CD3复合物相关信号。
74.根据权利要求73所述的试剂盒，其特征在于，所述第一试剂是与CD3特异性结合的结合剂。
75.根据权利要求72至74中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述T细胞上的辅助分子是CD28。
76.根据权利要求75所述的试剂盒，其特征在于，所述结合辅助分子的第二试剂是与CD28特异性结合的结合剂。
77.根据权利要求74至76中任一项所述的试剂盒，其特征在于，
所述与CD3特异性结合的第一结合剂选自抗CD3抗体、抗CD3抗体的二价抗体片段、抗CD3抗体的单价抗体片段和具有抗体样结合特性的蛋白质CD3结合分子，和/或，其特征在于，
所述与CD28特异性结合的第二试剂选自抗CD28抗体、抗CD28抗体的二价抗体片段、抗CD28抗体的单价抗体片段和具有抗体样结合特性的蛋白质CD28结合分子。
78.根据权利要求67所述的试剂盒，其特征在于，所述多聚化剂被固定在固体表面上。
79.根据权利要求78所述的试剂盒，其特征在于，所述固体表面选自磁珠、聚合珠、细胞培养板、微量滴定板、膜、中空纤维及其混合物。
80.根据权利要求79所述的试剂盒，其特征在于，所述多聚化剂选自链霉亲和素、亲和素、与生物素可逆结合的链霉亲和素类似物、与生物素可逆结合的亲和素类似物、包含至少两个螯合基团K的试剂，其中所述至少两个螯合基团能够与过渡金属离子结合，由此使A部分能够与寡聚组氨酸亲和标记物、多聚谷胱甘肽-s-转移酶、多聚钙调蛋白和生物素化的载体蛋白结合。
81.根据权利要求67所述的试剂盒，其特征在于，所述多聚化剂是可溶形式的。
82.根据权利要求68至78或权利要求81中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述多聚化剂选自链霉亲和素、亲和素、与生物素可逆结合的链霉亲和素类似物、与生物素可逆结合的亲和素类似物、包含至少两个螯合基团K的试剂，其中所述至少两个螯合基团能够与过渡金属离子结合，由此使所述试剂能够与寡聚组氨酸亲和标记物、多聚谷胱甘肽-S-转移酶、多聚钙调蛋白和生物素化的载体蛋白相结合。
83.根据权利要求82所述的试剂盒，其特征在于，所述链霉亲和素、亲和素、或与生物素可逆结合的链霉亲和素类似物或与生物素可逆结合的亲和素类似物通过多糖交联，或者，其特征在于，所述链霉亲和素或亲和素的交联寡聚物或聚合物、或所述与生物素可逆结合的链霉亲和素类似物或亲和素类似物的交联寡聚物或聚合物经由双功能接头通过交联获得。
84.一种用于连续扩增淋巴细胞群的体外方法，其特征在于，所述淋巴细胞群包含T细胞，所述方法包括：
使含有包含T细胞的淋巴细胞群样品与多聚化剂接触，
其中，所述多聚化剂是可溶形式的，并且具有可逆固定于其上的(i)向T细胞提供初级激活信号的第一试剂和(ii)刺激T细胞表面辅助分子的第二试剂，
其中，所述多聚化剂包含至少一个结合位点Z1用于第一试剂的可逆结合，
其中，所述第一试剂包含至少一个结合配偶体C1，其中所述结合配偶体C1能够与多聚化剂的结合位点Z1可逆结合，其中所述第一试剂通过结合配偶体C1和结合位点Z1之间形成的可逆键与多聚化剂相结合，
其中，所述多聚化剂包含至少一个结合位点Z2用于第二试剂的可逆结合，
其中，所述第二试剂包含至少一个结合配偶体C2，其中所述结合配偶体C2能够与多聚化剂的结合位点Z2可逆结合，其中所述第一试剂通过结合配偶体C2和结合位点Z2之间形成的可逆键与多聚化剂相结合，
其中，所述第一试剂与T细胞表面的受体分子结合，由此向细胞提供初级激活信号从而激活细胞T细胞，
其中，所述第二试剂与T细胞表面的辅助分子结合，由此刺激已激活的细胞，从而所述第一试剂和所述第二试剂一同诱导T细胞扩增。
85.根据权利要求84所述的方法，其特征在于，使所述含有包含T细胞的淋巴细胞群样品与所述具有固定于其上的第一和第二试剂的多聚化剂接触，导致T细胞与多聚化剂特异性结合。
86.根据权利要求84或85所述的方法，其进一步包括将所述与多聚化剂结合的T细胞与淋巴细胞群中未结合的细胞分离。
87.根据权利要求84至86中任一项所述的方法，其特征在于，使所述含有包含T细胞的淋巴细胞群样品与所述具有固定于其上的第一和第二试剂的多聚化剂的接触在生物反应器上进行，诸如培养板、中空纤维生物反应器或塑料袋生物反应器。
88.根据权利要求84至88中任一项所述的方法，其进一步包括使所述淋巴细胞群(含有经由第一试剂和第二试剂与多聚化剂结合的T细胞的反应混合物)与(i)能够破坏第一结合配偶体C1和结合位点Z1之间的键的游离第一结合配偶体C1或其类似物，和(ii)能够破坏第二结合配偶体C2和结合位点Z2之间的键的游离第二结合配偶体C2或其类似物接触，其中所述第一试剂的结合配偶体C1和结合位点Z1之间的可逆键以及所述第二试剂的结合配偶体C2和所述多聚化剂的结合位点Z2之间的可逆键被破坏，从而将T细胞从可溶性多聚化剂中释放出来，并从第一试剂和第二试剂释放出来，并使T细胞扩增停止。
89.根据权利要求88所述的方法，其包括收集包含已释放的T细胞、可溶性多聚化剂、第一试剂和/或第二试剂、游离结合配偶体C1或其类似物以及游离结合配偶体C2或其类似物的洗脱液。
90.根据权利要求84至89中任一项所述的方法，其特征在于，所述多聚化剂的结合位点Z1和Z2是相同的。
91.根据权利要求90所述的方法，其特征在于，使用的是单一的多聚化剂。
92.根据权利要求89至91中任一项所述的方法，其进一步包括在合适的固定相上对洗脱液进行层析，所述固定相是凝胶过滤基质和/或亲和层析基质，其中所述凝胶过滤和/或亲和层析基质包含亲和试剂，其中所述亲和试剂包含与第一试剂或第二试剂中所含的结合配偶体C1和/或C2特异性结合的结合位点Z1和/或Z2，从而使第一试剂、第二试剂、第一结合配偶体C1或其类似物和/或游离第二结合配偶体C2或其类似物固定在固定相上。
93.根据权利要求88至92中任一项所述的方法去，其特征在于，所述固定相与生物反应器流体式连接。
94.根据权利要求93所述的方法，其特征在于，所述T细胞从可溶性多聚化剂中分离出来。
95.根据权利要求93所述的方法去，其特征在于，在合适的固定相上对所述包含T细胞和多聚化剂的混合物进行层析，所述固定相是凝胶过滤基质和/或亲和层析基质，其中所述凝胶过滤和/或亲和层析基质包含亲和试剂，其中所述亲和试剂包含与所述多聚化剂结合位点Z1(特异性地)结合的结合配偶体D，由此使所述多聚化剂固定在固定相上。
96.根据权利要求84至95中任一项所述的方法，其特征在于，所述第一试剂刺激T细胞中的TCR/CD3复合物相关信号。
97.根据权利要求96所述的方法，其特征在于，所述第一试剂是与CD3特异性结合的结合剂。
98.根据权利要求84至97中任一项所述的方法去，其特征在于，所述T细胞上的辅助分子是CD28。
99.根据权利要求98所述的方法，其特征在于，所述与辅助分子结合的第二试剂是与CD28特异性结合的结合剂。
100.根据权利要求97至99中任一项所述的方法，其特征在于，
所述与CD3特异性结合的第一试剂选自抗CD3抗体、抗CD3抗体的二价抗体片段、抗CD3抗体的单价抗体片段和具有抗体样结合特性的蛋白质CD3结合分子，和/或，其特征在于，
所述与CD28特异性结合的第二试剂选自抗CD28抗体、抗CD28抗体的二价抗体片段、抗CD28抗体的单价抗体片段和具有抗体样结合特性的蛋白质CD28结合分子。
101.根据权利要求100所述的方法，其特征在于，所述二价抗体片段是(Fab)2’片段或二价单链Fv片段。
102.根据权利要求101所述的方法，其特征在于，所述单价抗体片段选自Fab片段、Fv片段和单链Fv片段(scFv)。
103.根据权利要求84至102中任一项所述的方法，其特征在于，所述多聚化剂包括链霉亲和素的寡聚物或聚合物、亲和素的寡聚物或聚合物、与生物素可逆结合的链霉亲和素类似物的寡聚物或聚合物、与生物素可逆结合的亲和素类似物的寡聚物或聚合物。
104.根据权利要求103所述的方法，其特征在于，所述链霉亲和素、亲和素、或与生物素可逆结合的链霉亲和素类似物或亲和素类似物通过多糖交联，或者，其特征在于，所述链霉亲和素或亲和素的交联寡聚物或聚合物、或与生物素可逆结合的链霉亲和素类似物或亲和素类似物的交联寡聚物或聚合物经由双功能接头通过交联获得。
105.根据权利要求103或104所述的方法，其特征在于，所述链霉亲和素或亲和素的交联寡聚物或聚合物、或与生物素可逆结合的链霉亲和素类似物或亲和素类似物的交联寡聚物或聚合物包括三个或更多个链霉亲和素单体。
106.根据权利要求84至105中任一项所述的方法，其特征在于，
(a)所述结合配偶体C1和C2相互独立地包括生物素，并且所述多聚化剂包括与生物素可逆结合的链霉亲和素类似物或亲和素类似物，
(b)所述结合配偶体C1和C2相互独立地包括与链霉亲和素或亲和素可逆结合的生物素类似物，并且所述多聚化剂包括链霉亲和素、或亲和素、或与所述生物素似物可逆结合的链霉亲和素类似物或亲和素类似物，或者
(c)所述结合配偶体C1和C2相互独立地包括链霉亲和素或亲和素结合肽，并且所述多聚化剂包括链霉亲和素、或亲和素、或与所述链霉亲和素或亲和素结合肽可逆结合的链霉亲和素类似物或亲和素类似物。
107.根据权利要求106所述的方法，其特征在于，所述结合配偶体C包括链霉亲和素结合肽Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys，并且所述多聚化剂包括在野生型链霉亲和素序列位点第44至47位上包含氨基酸序列Va144-Thr45-Ala46-Arg47的链霉亲和素类似物，或在野生型链霉亲和素序列位点第44至47位上包含氨基酸序列lle44-Gly45-Ala46-Arg47的链霉亲和素类似物。
108.根据权利要求84至107中任一项所述的方法，其特征在于，所述结合位点Z1和所述结合配偶体C1之间的可逆结合和/或所述结合位点Z2和所述结合配偶体C2之间的可逆结合的解离常数(Kd)在10-2M至10-13M的范围内。
109.根据权利要求89至108中任一项所述的方法，其特征在于，所述第一游离配偶体和/或第二游离配偶体是对细胞无害的化合物。
110.根据权利要求109所述的方法，其特征在于，所述可逆键通过使细胞与生物素或生物素类似物接触而被破坏。
111.根据权利要求92至101中任一项所述的方法，其特征在于，T细胞受体或嵌合抗原受体在扩增期间或之后被引入T细胞。
112.根据权利要求111所述的方法，其特征在于，所述T细胞被与所引入的T细胞受体或嵌合抗原受体结合的第三试剂刺激。
113.根据权利要求84至112中任一项所述的方法，其特征在于，所述包含T细胞的淋巴细胞群是外周血单核细胞(PBMC)群或经富集或经纯化的T细胞群。
114.一种包含生物反应器和(第一)层析固定相的排布，
其中，所述生物反应器适用于细胞扩增，
其中，所述(第一)固定相适用于细胞分离和去除试剂，
所述固定相是凝胶过滤基质和/或亲和层析基质，其中所述凝胶过滤和/或亲和层析基质包含亲和试剂，其中所述亲和试剂包括与第一试剂所含的结合配偶体C1特异性结合的结合位点Z1，和/或所述亲和试剂包括与第二试剂所含的结合配偶体C2特异性结合的结合位点Z2，从而适于使第一试剂和/或第二试剂、第一结合配偶体C1和/或游离第二结合配偶体C2固定在所述固定相上，
其中，所述生物反应器和所述固定相流体式连接。
115.根据权利要求114所述的排布，其特征在于，所述第一固定相被包含在层析柱上或是平面固定相。
116.根据权利要求115所述的排布，其进一步包含与所述第一固定相流体式连接的第二固定相。
117.根据权利要求116所述的排布，其特征在于，第二固定相是凝胶过滤基质和/或亲和层析基质，其中所述凝胶过滤和/或亲和层析基质包含亲和试剂，其中所述亲和试剂包含与多聚化剂的结合位点Z1(特异性地)结合的结合配偶体D，从而适于使多聚化剂固定在固定相上。
118.根据权利要求117所述的排布，其特征在于，所述第二固定相和生物反应器彼此流体式连接。
119.一种用于靶细胞纯化和扩增的装置，所述装置包含至少一个如权利要求114至118中所限定的、包含生物反应器和至少一种层析固定相的排布。
120.根据权利要求119所述的装置，其包括样品入口，所述样品入口与所述包含生物反应器和至少一种层析固定相的排布中的生物反应器流体式连接。
121.根据权利要求119或120所述的装置，其包括经纯化且经扩增的靶细胞的样品出口，所述样品出口与所述包含生物反应器和至少一种层析固定相的排布中的固定相流体式连接。
122.根据权利要求119至121中任一项所述的装置，其特征在于，所述装置是功能性封闭系统。
123.一种能够扩增细胞群的多聚化剂，
其中，所述多聚化剂是可溶形式的，并且包含至少一个结合位点Z1用于第一试剂的可逆结合，所述第一试剂向细胞提供初级激活信号，
其中，所述多聚化剂具有可逆固定(结合)于其上的、所述向细胞提供初级激活信号的第一试剂；
其中，所述第一试剂包含至少一个结合配偶体C1，其中所述结合配偶体C1能够与多聚化剂的至少一个结合位点Z1可逆结合，其中所述第一试剂通过结合配偶体C1与结合位点Z1之间形成的可逆键与多聚化剂相结合。
124.根据权利要求123所述的多聚化剂，
其中，所述多聚化剂进一步包含至少一个结合位点Z2用于第二试剂的可逆结合，所述第二试剂剂刺激细胞表面辅助分子，
其中，所述多聚化剂具有可逆固定(结合)于其上的、所述刺激细胞表面辅助分子的第二试剂，
其中，所述第二试剂包含结合配偶体C2，其中所述结合配偶体C2能够与多聚化剂的至少一个结合位点Z2结合，其中所述第二试剂通过结合配偶体C2与结合位点Z2之间形成的键与多聚化剂相结合。
125.根据权利要求123或124所述的多聚化剂，其特征在于，所述多聚化剂能够扩增淋巴细胞群。
126.根据权利要求125所述的多聚化剂，其特征在于，所述被扩增的淋巴细胞群是B细胞群、T细胞群或天然杀伤细胞群。
127.根据权利要求126所述的多聚化剂，其特征在于，所述T细胞群是抗原特异性T细胞群、辅助T细胞群、细胞毒性T细胞、记忆T细胞、调节性T细胞群或天然杀伤T细胞群。
128.根据权利要求127所述的多聚化剂，其特征在于，所述第一试剂包括MHC I:肽复合物或刺激T细胞中的TCR/CD3复合物相关信号。
129.根据权利要求128所述的多聚化剂，其特征在于，所述第一试剂是与CD3特异性结合的结合剂。
130.根据权利要求124至129中任一项所述的多聚化剂，其特征在于，所述与辅助分子结合的第二试剂是与CD28或CD137特异性结合的结合剂。
131.根据权利要求128至130中任一项所述的多聚化剂，其特征在于，
所述与CD3特异性结合的第一试剂选自抗CD3抗体、抗CD3抗体的二价抗体片段、抗CD3抗体的单价抗体片段和具有抗体样结合特性的蛋白质CD3结合分子，以及，其特征在于，
所述与CD28或CD137特异性结合的第二试剂选自抗CD28抗体、抗CD28抗体的二价抗体片段、抗CD28抗体的单价抗体片段、具有抗体样结合特性的蛋白质CD28结合分子、抗CD137抗体、抗CD137抗体的二价抗体片段、抗CD137抗体的单价抗体片段、具有抗体样结合特性的蛋白质CD137结合分子、4-1BB配体及其任意混合物。
132.根据权利要求131所述的多聚化剂，其特征在于，所述二价抗体片段是(Fab)2’片段或二价单链Fv片段。
133.根据权利要求131所述的多聚化剂，其特征在于，所述单价抗体片段选自Fab片段、Fv片段和单链Fv片段(scFv)。
134.根据权利要求133所述的多聚化剂，其特征在于，所述具有抗体样结合特性的蛋白质CD3、CD28或CD137结合分子选自适体、基于脂质运载蛋白家族多肽的突变蛋白、glubody、基于锚蛋白支架的蛋白质、基于晶体支架的蛋白质、adnectin和亲和多聚体。
135.根据权利要求126所述的多聚化剂，其特征在于，所述第一试剂是与CD40或CD137特异性结合的结合剂，其中所述细胞群是B细胞群。
136.根据权利要求135所述的多聚化剂，其特征在于，所述与CD40或CD137特异性结合的第一结合剂选自抗CD40抗体、抗CD40抗体的二价抗体片段、抗CD40抗体的单价抗体片段和具有抗体样结合特性的蛋白质CD40结合分子，或者抗CD137抗体、抗CD137抗体的二价抗体片段、抗CD137抗体的单价抗体片段、具有抗体样结合特性的蛋白质CD137结合分子和CD40配体(CD154)。
137.根据权利要求136所述的多聚化剂，其特征在于，所述二价抗体片段是(Fab)2’片段或二价单链Fv片段。
138.根据权利要求136所述的多聚化剂，其特征在于，所述单价抗体片段选自Fab片段、Fv片段和单链Fv片段(scFv)。
139.根据权利要求136所述的多聚化剂，其特征在于，所述具有抗体样结合特性的蛋白质CD40结合分子或蛋白质CD137结合分子选自适体、基于脂质运载蛋白家族多肽的突变蛋白、glubody、基于锚蛋白支架的蛋白质、基于晶体支架的蛋白质、adnectin以及亲和多聚体。
140.根据权利要求126所述的多聚化剂，其特征在于，所述B细胞上的辅助分子是CD40或CD137或其混合物。
141.根据权利要求140所述的多聚化剂，其特征在于，所述第二试剂是CD40配体(CD154)或CD137或其混合物，所述细胞群是B细胞群。
142.根据权利要求124至141中任一项所述的多聚化剂，其特征在于，所述多聚化剂的结合位点Z1和Z2是相同的。
143.根据权利要求124至142中任一项所述的多聚化剂，其特征在于，所述多聚化剂包括链霉亲和素的寡聚物或聚合物、亲和素的寡聚物或聚合物、与生物素可逆结合的链霉亲和素类似物的寡聚物或聚合物、与生物素可逆结合的亲和素类似物的寡聚物或聚合物、包含至少两个螯合基团K的试剂，其中所述至少两个螯合基团能够与过渡金属离子结合，由此使所述试剂能够与寡聚组氨酸亲和标记物、多聚谷胱甘肽-S-转移酶、多聚钙调蛋白和生物素化的载体蛋白结合。
144.根据权利要求143所述的多聚化剂，其特征在于，所述链霉亲和素、亲和素、或与生物素可逆结合的链霉亲和素类似物或亲和素类似物通过多糖交联，或者，其特征在于，所述链霉亲和素或亲和素的交联寡聚物或聚合物、或与生物素可逆结合的链霉亲和素类似物或亲和素类似物的交联寡聚物或聚合物经由双功能接头通过交联获得。
145.根据权利要求143或144所述的多聚化剂，其特征在于，所述链霉亲和素或亲和素的交联寡聚物或聚合物、或与生物素可逆结合的链霉亲和素类似物或亲和素类似物的交联寡聚物或聚合物包括三个或更多个链霉亲和素单体。
146.根据权利要求123至145中任一项所述的多聚化剂，其特征在于，
(a)所述结合配偶体C1和C2相互独立地包括生物素，并且所述多聚化剂包括与生物素可逆结合的链霉亲和素类似物或亲和素类似物，
(b)所述结合配偶体C1和C2相互独立地包括与链霉亲和素或亲和素可逆结合的生物素类似物，并且所述多聚化剂包括链霉亲和素、或亲和素、或其与所述生物素似物可逆结合的链霉亲和素类似物或亲和素类似物，或者
(c)所述结合配偶体C1和C2相互独立地包括链霉亲和素或亲和素结合肽，并且所述多聚化剂包括链霉亲和素、或亲和素、或与所述链霉亲和素或亲和素结合肽可逆结合的链霉亲和素类似物或亲和素类似物。
147.根据权利要求146所述的多聚化剂，其特征在于，所述结合配偶体C1和C2相互独立地包括链霉亲和素结合肽Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys，并且所述多聚化剂包括在野生型链霉亲和素序列位点第44至47位上包含氨基酸序列Va144-Thr45-Ala46-Arg47的链霉亲和素类似物，或在野生型链霉亲和素序列位点第44至47位上包含氨基酸序列lle44-Gly45-Ala46-Arg47的链霉亲和素类似物。
148.一种能够扩增细胞群的组合物，其包含
(i)第一多聚化剂，
其中，所述第一多聚化剂是可溶形式的，并且包含至少一个结合位点Z1用于第一试剂的可逆结合，所述第一试剂向细胞提供初级激活信号，
其中，所述第一多聚化剂具有可逆固定(结合)于其上的、所述向细胞提供初级激活信号的第一试剂；
其中，所述第一试剂包含至少一个结合配偶体C1，其中所述结合配偶体C1能够包括与多聚化剂的至少一个结合位点Z1可逆结合，其中所述第一试剂通过结合配偶体C1和结合位点Z1之间形成的可逆键与多聚化剂相结合，以及
(ii)第二多聚化剂，
其中，所述第二多聚化剂是可溶形式的、并且包含至少一个结合位点Z2用于第二试剂的可逆结合，所述第二试剂刺激细胞表面辅助分子，
其中，所述多聚化剂具有可逆固定(结合)于其上的、所述刺激细胞表面辅助分子的第二试剂，
其中，所述第二试剂包含结合配偶体C2，其中所述结合配偶体C2能够与多聚化剂的至少一个结合位点Z2结合，其中所述第二试剂通过结合配偶体C2和结合位点Z2之间形成的键与多聚化剂相结合。
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