JP4523169B2 - 造血幹細胞および/または前駆細胞を維持および増加するための方法および装置 - Google Patents
造血幹細胞および/または前駆細胞を維持および増加するための方法および装置 Download PDFInfo
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Description
技術分野および背景技術
本発明は、造血幹細胞を維持および増加するための方法および装置に関する。より詳しくは、本発明は、造血幹細胞を維持および/または増加、および/または、造血幹細胞を維持および/または増加させるための馴化培地(conditioned medium)を作製するための3次元の間質細胞栓流バイオリアクター(plug flow bioreactor)に関する。
【0002】
哺乳動物の造血系は、機能において、限定的な増殖能力しかない成熟細胞から旺盛な増殖能力、分化能力および自己複製能力をもつ多能性幹細胞までにわたる、不均一な細胞集団からなる(1〜3)。造血幹細胞(HSC)は、移植後の造血系再構成に専ら必要とされ、また、遺伝子治療の一次的な標的となる。幹細胞は、造血系維持に決定的な役割を果たしているにも拘わらず、造血組織における出現頻度が非常に低く、また、未分化の幹細胞を生体外で長時間にわたって維持または増加させにくいことは、肝心の臨床応用にこれらの細胞を用いる上での相変わらずの大きな欠点であるだけでなく、新規の幹細胞制御因子が現在まで利用できず、またそれらを必要としていることを反映している。
【0003】
幹細胞が生体内で骨髄の中に離れたニッチをもち(4〜6)、それが、細胞−細胞間連絡または短距離の相互作用によって集団的にそれらの分化と自己複製をもたらす分子シグナルを提供することと密接に関連していると広く認められている(7)。これらのニッチは、「造血誘導微小環境」(HIM)の一部であり、例えば、マクロファージ、線維芽細胞、脂肪細胞、および上皮細胞(8)などの骨髄間質細胞からなる。骨髄間質細胞は、細胞−細胞間連絡を促す細胞外マトリックス(ECM)タンパク質および基底膜成分を提供することによってHIMの機能的な完全性を維持する(9〜11)。制御された造血細胞分化と増殖に必要なさまざまな可溶性または常在性のサイトカインも提供する(12〜14)。
【0004】
上記の点から考えると、ヒトHSCを長期間にわたって維持するための培養システムを開発するための努力が、主に、予め樹立された初代骨髄間質細胞の単層を使用することに集中したのは驚きではない。これらには、非照射ヒト初代骨髄間質細胞(Dexter培養細胞、15)または照射後初代骨髄間質細胞(16〜19)の長期培養、およびヒトまたはマウスの間質細胞株(16、19〜24)が含まれ、外部からサイトカインを加えたものや加えなかったものがある。HSCの出力アッセイ法は、このような幹細胞を長時間(5〜7週間)培養した後、これらの細胞が骨髄細胞の後代(長時間培養開始細胞(long−term culture initiating cells);LTC−IC)を産生するか、敷石状の形態をもつコロニー(敷石状領域形成細胞(cobblestone area forming cells; CAFC))を形成する能力に依存する(16、17)。しかし、LTC−ICアッセイ法およびCAFCアッセイ法が広範に使用されているにもかかわらず、これらのアッセイ法は、本当に再増殖した造血幹細胞(25、26)よりも非常に原始的な前駆細胞を検出することが次第に明らかになってきている。
【0005】
最近開発されたヒト幹細胞アッセイ法は、ヒトの骨髄球系、リンパ球系、赤血球系、およびCD34+の前駆細胞集団を生じさせる、非肥満−糖尿病(NOD)/SCIDマウス(27)の骨髄細胞に存在するSCID再増殖細胞(SRC)を検出する(28〜30)。SRCは、専ら、CD34+38−表面抗原(31)を発現する造血細胞画分に見られ、CB(1/3×105細胞)におけるその頻度は、BM(1/9×105細胞)または動員されたPB(1/6×106細胞)と比較すると高くなっている(32)。つい最近の研究で、SRCは、CD34+/38−/CXCR4+細胞の亜集団の中に存在することが示された(33)。ケモカイン間質細胞由来因子1(SDF−1、34)の表面レセプターであるCXCR4は、明らかに、NOD/SCIDの骨髄におけるヒト造血幹細胞のホーミングおよび移植に必須である(33)。
【0006】
間質細胞培養上でのヒトHSCの長期間の維持/増加をめざした研究は、エンドポイント法として、主に、CAFC、LTC−ICまたはCD34+38−表現型に基づいていた(16、19〜24)。間質細胞培養においてSRCが維持/増加されたという稀少な報告も、長期間にわたる有意な支持を示せないでいる。例えば、同種異系のヒト骨髄間質は、長期間(7日間)のSRC維持を誘導し、その後急速に(6倍)活性が低下することが分かった(26)。間質細胞層上の移植可能なヒト幹細胞の長期間にわたる維持/増加を支持できないのは、これらの細胞のインビトロ培養に関連するいくつかの要素によるものであろう。それらの一つには、骨髄の自然な3次元構造中における生体内増殖条件を反映していない間質細胞単層を使用することが含まれる。このような条件だと、最適で適切な支持的な微小環境を提供するという間質細胞の能力が失われると同時に、特異的なニッチに局在して、間質細胞およびその産物と物理的に相互作用するという幹細胞の能力も失われるであろう。実際、造血前駆細胞の生物活性に対する3次元(3D)構造の重要性に関する証拠は、ヒト造血細胞株を3Dコラーゲンマトリックス中の間質細胞上に播くと、この細胞の単層上に播いたときよりも優れた増殖を示すことから明らかである(35)。より重要なのは、3Dのタンタル被覆多孔性生物素材が、細胞のみ、または骨髄間質細胞単層上で培養した場合に較べると、マカク類LTCICまたはCD34+38−細胞の短期間の維持を促進することが最近分かったことである(36)。しかしながら、間質細胞で被覆された3D担体の効果は、まだ調べられていない。
【0007】
最近の研究によって、ヒトCB SRC(37)の2〜3週間の生存と維持(ただし、増加はなし)を支持するには、ヒト間質細胞よりもマウスAFT024細胞株の方が優れている。この細胞株では、膜結合タンパク質(21、38、39)をコードする新規のHIM遺伝子がいくつか発現しているのが見られるが、それらが、幹細胞の生理に必須の役割をもつのかもしれない。これらまたはその他の遺伝子が、間質細胞の3D骨髄微小環境をより正確に模倣した条件下では、間質細胞によって発現され、それによって間質細胞が最適な生理学的機能活性をもつようになるという可能性はまだ結論づけられていない。
【0008】
活発な研究によって、間質非接触培養(19、21、22、40、41)または間質馴化培地(SCM)(21、42〜44)は、それだけで、またはサイトカインとともに、原始的な造血前駆細胞の生体外での維持または増加を支持することができることが分かった。また、SCMが、これらの細胞の回収効率および形質転換効率を向上させることも分かっている(45、46)。これらの知見は、再び、可溶性間質細胞因子重要性を強調しているが、それらのアッセイ法におけるLTC−IC、CAFC、またはCD34+38−のエンドポイントの使用は、移植可能なHSCの維持/増加に対するSCMの効果を反映させることができない。さらに、間質細胞の単層培養から得られたSCMが、実際に、ヒトHSCの生理現象に関与する間質細胞関連遺伝子産物のすべてを含んでいるか否かは分かっていない。
【0009】
移植可能な造血幹細胞の生体外での増加を目的とする最近の努力は、サイトカイン添加懸濁培養の樹立に集中している(47〜53)。これらの研究は、本プロセスにおける主要関連サイトカイン、例えば、幹細胞因子(SCF)、FLT3リガンド、および血小板産生因子(TPO)のような早期作用因子の同定に役立ってきた。それにもかかわらず、さまざまな結果が得られていて、短期間での消失(48、49)、維持(50〜52)を示しているが、2〜4週間培養した後にSRCが増加したという稀な例もある(47、53)。これらのサイトカインと間質細胞の、3D増殖条件下における、SRCの維持/増殖を支える相互作用能力については、まだ明らかにされていない。
【0010】
このように、移植可能な造血幹細胞の生体外での増加および/または維持を行うための方法および装置で、上記の制約をもたず、先行技術に記載された結果と比較して優れた結果を示すものに対する需要が広く認められており、また、それらがあれば非常に有益であろう。
【0011】
発明の概要
本発明を実施するにあたり、3D骨髄微小環境を正確に模倣し、間質細胞の増殖と長期間の維持を支持することのできる栓流バイオリアクター装置を開発した。間質細胞を、ポリエステル製不織繊維マトリックス(54)でできた多孔性有機担体上に播き、比較的少量で細胞数が多くなるような増殖を可能にした。担体の構造と充填が、局所的濃度と間質細胞産物(例えば、ECMタンパク質、サイトカイン等、55)の遊離だけでなく、酸素と栄養分の移転に主な影響を与える。さらに、この装置で培養された間質細胞の、直接的な細胞−細胞接触によって、移植可能なヒト造血幹細胞の維持/増加を促進する能力は、先行技術による方法よりも遙かに優れていることが測定されている。さらに、本システムで培養された馴化培地の、そこに含まれている新規の間質細胞関連幹細胞因子によって、移植可能なヒト造血幹細胞の維持/増加を促進する能力は、先行技術による方法よりも遙かに優れていることが測定されている。
【0012】
本発明の態様の一つによって、未分化の造血幹細胞または前駆細胞を増加/維持する方法において、(a)未分化の造血幹細胞または前駆細胞を得る工程、および、(b)上記未分化の造血幹細胞または前駆細胞を、生理学的に許容できる3次元の繊維ネットワークを形成している不織繊維マトリックスを含むシート状担体の上に3次元の間質細胞培養が予め樹立されている固定相栓流バイオリアクターの中に播いて、未分化の造血幹細胞または前駆細胞を増加/維持する工程を含む方法が提供される。
【0013】
好適な態様の記載中のさらなる特徴によれば、本方法は、さらに、未分化の造血幹細胞または前駆細胞を単離する工程を含む。
【0014】
本発明の別の態様によって、未分化の造血幹細胞または前駆細胞を増加/維持する方法において、(a)未分化の造血幹細胞または前駆細胞を得る工程、および(b)上記未分化の造血幹細胞または前駆細胞を、生理学的に許容できる3次元の繊維ネットワークを形成している不織繊維マトリックスを含むシート状担体の上に3次元の間質細胞培養が予め樹立されている固定相栓流バイオリアクターの中で培養して、未分化の造血幹細胞または前駆細胞を増加/維持する工程を含む方法が提供される。
【0015】
本発明の別の態様によって、未分化の造血幹細胞または前駆細胞を増加/維持する上で有用な間質細胞馴化培地を調製する方法において、(a)固定相栓流バイオリアクターの中で、生理学的に許容できる3次元の繊維ネットワークを形成している不織繊維マトリックスを含むシート状担体の上に間質細胞培養を樹立して、未分化の造血幹細胞または前駆細胞を増加/維持する工程、および(b)所望の間質細胞密度に達したら、該固定相栓流バイオリアクターから培地を回収して、未分化の造血幹細胞または前駆細胞を増加/維持する上で有用な間質細胞馴化培地を得る工程を含む方法が提供される。
【0016】
本発明のさらに別の態様によって、未分化の造血幹細胞または前駆細胞をレシピエントに移植する方法において、(a)(i)未分化の造血幹細胞または前駆細胞を得る工程、および(ii)上記未分化の造血幹細胞または前駆細胞を、生理学的に許容できる3次元の繊維ネットワークを形成している不織繊維マトリックスを含むシート状担体の上に3次元の間質細胞培養が予め樹立されている固定相栓流バイオリアクターの中に播いて、未分化の造血幹細胞または前駆細胞を増加/維持する工程によって、未分化の造血幹細胞または前駆細胞を増加/維持する工程、および、(b)工程(a)で得られた未分化の造血幹細胞または前駆細胞をレシピエントに移植する工程を含む方法が提供される。
【0017】
好適な態様の記載中のさらなる特徴によれば、本方法は、さらに、工程(b)の前に未分化の造血幹細胞または前駆細胞を単離する工程を含む。
【0018】
本発明のさらに別の態様によって、未分化の造血幹細胞または前駆細胞をレシピエントに移植する方法において、(a)(i)未分化の造血幹細胞または前駆細胞を得る工程、および(ii)上記未分化の造血幹細胞または前駆細胞を、生理学的に許容できる3次元の繊維ネットワークを形成している不織繊維マトリックスを含むシート状担体の上に3次元の間質細胞培養が予め樹立されている固定相栓流バイオリアクターから得られた間質細胞馴化培地を含む培地の中で培養して、未分化の造血幹細胞または前駆細胞を増加/維持する工程によって、未分化の造血幹細胞または前駆細胞を増加/維持する工程を含む方法が提供される。
【0019】
本発明のさらに別の態様によって、入り口と出口をもつ容器で、その中に生理学的に許容できる3次元の繊維ネットワークを形成している不織繊維マトリックスを含み、担体1立方センチメートルあたり少なくとも5×106個の間質細胞を支持しているシート状担体を含む容器を含むバイオリアクタープラグが提供される。
本発明のさらに別の態様によって、上記バイオリアクタープラグを含む栓流バイオリアクターが提供される。
【0020】
後述する本発明の好適な態様の記載中のさらなる特徴によれば、未分化の造血幹細胞または前駆細胞は、臍帯血、動員された末梢血、および骨髄からなるグループより選択された組織から単離される細胞である。
【0021】
好適な態様の記載中のさらなる特徴によれば、未分化の造血幹細胞または前駆細胞、および間質細胞培養の間質細胞は共通のHLA抗原をもつ。
【0022】
好適な態様の記載中のさらなる特徴によれば、未分化の造血幹細胞または前駆細胞、および間質細胞培養の間質細胞は単一個体に由来する。
【0023】
好適な態様の記載中のさらなる特徴によれば、未分化の造血幹細胞または前駆細胞、および間質細胞培養の間質細胞は異なった個体に由来する。
【0024】
好適な態様の記載中のさらなる特徴によれば、未分化の造血幹細胞または前駆細胞、および間質細胞培養の間質細胞は同一種に由来する。
【0025】
好適な態様の記載中のさらなる特徴によれば、未分化の造血幹細胞または前駆細胞、および間質細胞培養の間質細胞は異種に由来する。
【0026】
好適な態様の記載中のさらなる特徴によれば、未分化の造血幹細胞または前駆細胞、および間質細胞培養の間質細胞は、担体1立方センチメートルあたり少なくとも5×106細胞という密度にまで増殖している。
【0027】
好適な態様の記載中のさらなる特徴によれば、未分化の造血幹細胞または前駆細胞、および間質細胞培養の間質細胞は、担体1立方センチメートルあたり少なくとも107細胞という密度にまで増殖している。
【0028】
好適な態様の記載中のさらなる特徴によれば、固定相栓流バイオリアクターの中に未分化の造血幹細胞または前駆細胞を播く工程が行われてから少なくとも10時間該バイオリアクターの中の流れが停止される。
【0029】
好適な態様の記載中のさらなる特徴によれば、繊維の孔は、全容量に対する割合にして40%から95%を構成し、孔の大きさが10ミクロンから100ミクロンである。
【0030】
好適な態様の記載中のさらなる特徴によれば、マトリックスは、直径または幅が0.5ミクロンから50ミクロンである、へん平繊維、非丸形繊維、中空繊維、およびそれらの混合繊維からなるグループより選択された繊維からできている。
【0031】
好適な態様の記載中のさらなる特徴によれば、マトリックスは、幅2ミクロンからであるリボン状繊維から構成されている。好適な態様の記載中のさらなる特徴によれば、繊維の厚さに対する幅の割合が少なくとも2:1である。
【0032】
好適な態様の記載中のさらなる特徴によれば、マトリックスは、全容量に対する割合が60%から95%の孔容量をもつ。
【0033】
好適な態様の記載中のさらなる特徴によれば、マトリックスの高さは50〜1000μmである。
【0034】
好適な態様の記載中のさらなる特徴によれば、マトリックスの材料は、ポリエステル、ポリアルキレン、ポリフルオロクロロエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリスルホン、酢酸セルロース、ガラスファイバー、および不活性金属繊維からなるグループより選択される。
【0035】
好適な態様の記載中のさらなる特徴によれば、マトリックスは、四角形、リング形、円盤形、および十字形からなるグループより選択される。
【0036】
好適な態様の記載中のさらなる特徴によれば、マトリックスはポリ−D−リジンで被覆されている。
【0037】
本発明は、未分化の造血幹細胞を増加/維持するためのより有効な手段を提供することによって、現在知られている構成の短所に対処することに成功している。
【0038】
本発明に係る方法およびバイオリアクターを実施するには、手動、自動、またはそれらを併用して、選択された作業または工程を実施または完遂することが含まれるかもしれない。その上、本発明に係る方法およびバイオリアクターの好適な態様である実際の機器および装置によっては、選択された工程のいくつかは、ハードウエア、または何らかのファームウエアのオペレーティングシステム上のソフトウエア、またはそれらの併用によって実施することができるかもしれない。例えば、ハードウエアとして、選択された本発明の工程をチップまたは回路として行なうことができるかもしれない。ソフトウエアとして、選択された本発明の工程を、何らかの適当なオペレーティングシステムを用いてコンピュータが実行するソフトウエアによる複数の命令として実施することができる。いずれの場合にも、本発明に係る方法およびバイオリアクターの選択された工程は、複数の命令を実行するためのコンピュータ用プラットホームなどのデータプロセッサによって実行されるものとして説明することもできよう。
ここで、添付の図面を参照しながら、実施例のみによって本発明を説明する。以下では図面を説明しながら具体的に説明してゆくが、示された各図面は、具体例を示すことによって、本発明の好適な態様を具体的に検討する目的のためだけのものであり、最も有用、かつ容易に理解できると考える、発明の原理および概念的態様に関する記載を提供するために提示されたものであることをここで強調しておく。この点で、図面とともに説明を読めば、当業者は、発明のいくつかの形を実際に具体化する方法が明らかになるという程度に発明を基本的に理解する以上には、発明の構成の詳細を詳述する意図はない。
図面において、
図1は、本発明を実施するときに役立つよう、栓流バイオリアクター20の例を図解したものである。1−培地貯蔵容器;2−気体混合用容器;3−気体濾過装置;4−注入ポイント;5−栓流バイオリアクター20のプラグまたは容器;6−液流監視装置;6a−液流バルブ;7−馴化培地回収/分離用容器;8−培地交換用容器;9−蠕動ポンプ;10−サンプリングポイント;11−培地交換用容器;12−O2モニター;14−ステアリング装置;PH−pH測定針。
図2は、14F1.1細胞によるCAFC維持を示している。臍帯血CD34+細胞を、限界稀釈して、照射済みの14F1.1または初代ヒト骨髄間質細胞上に播いた。5週間後に敷石形成を測定した。結果は、2回の独立実験による平均値±SDを表す。
図3は、14F1.1細胞によるLTC−IC維持を示している。臍帯血CD34+細胞を、限界稀釈して、照射済みの14F1.1または初代ヒト骨髄間質細胞上に播いた。7週間後にミエロイドコロニー形成を測定した。FLT3リガンド(300ng/ml)、TPO(300ng/ml)およびSCF(100ng/ml)を毎週培地を交換するときに添加した。結果は、2回の実験による平均値±SDを表す。
図4は、14F1.1および初代ヒト骨髄間質細胞上でのCD34+38−細胞の増加を示している。CD34+細胞を、14F1.1または70CD34+38−における初代ヒト骨髄間質細胞上に播いた。サイトカインを毎週添加した。7〜21日後に培養細胞をトリプシン処理した。FACS解析によってCD34+CD38−を測定した。結果は、2回の実験による平均値±SDを表す。
図5a〜bは、14F1.1間質細胞株を播いた担体の10日後(図5a)または40日後(図b)の走査式電子顕微鏡写真(SEM)である。倍率:×150。
図6a〜bは、CD34+38−の増加に対する3D対2Dの14F1.1馴化培地の効果を示している。14F1.1および初代ヒト骨髄間質細胞に由来する、さまざまな濃度の馴化培地存在下で、CD34+細胞を懸濁培地に播いた。FACS解析によってCD34+CD38−細胞数を測定した。結果は、2回の実験による平均値±SDを表す。
図7は、間質細胞被覆担体上でのCD34+38−細胞の維持を示している。間質細胞被覆担体は、3D装置から取りだして、シリコン被覆した96穴プレートに移し、1.5×104のCD34+細胞を加えた。対照は、担体のみを含むものと、担体と同じ数の単層(2D)増殖させた14F1.1細胞を含むものであった。一定の時点で細胞を回収して、FACSによって解析した。結果は、2回の独立実験による平均値±SDを表す。
【0039】
好適な実施態様の説明
本発明は、レシピエントへの移植に用いるか、以下でさらに詳述するような目的に使用することのできる造血幹細胞を増加/維持する方法およびバイオリアクターに関するものである。具体的には、本発明は、さまざまな応用に用いることのできる、造血幹細胞を維持および/または増加、および/または、造血幹細胞を維持および/または増加させるための馴化培地を作製するための3次元の間質細胞栓流バイオリアクターである。
【0040】
本発明の原理と操作は、添付された図面および明細書を参照すれば、よりよく理解できよう。
【0041】
少なくとも一つの本発明の実施態様を説明する前に、本発明は、その応用が、以下の説明で示されるか、図面に描かれた要素の詳しい構成および配置に限定されないことを理解されるべきである。本発明は、他の実施態様をとることができ、または、さまざまな方法で実施することができる。また、ここで使用する語句および用語は、説明のためのものであって、限定的なものではないことも理解されるべきである。
【0042】
移植可能なヒト造血幹細胞(HSC)を長期間生体外で維持または増加することを目的とする現在の方法は、今までのところ、限定的な成功しか収めていない。骨髄の微小環境を正確に模倣して、骨髄の間質細胞の増殖を支持し、長期間維持することができる新規の3次元(3D)栓流バイオリアクターをここで説明する。間質細胞を、ポリエステル製の不織繊維マトリックスでできた多孔性の担体に播くと、比較的少量で多数の細胞を増殖させることが可能になる。次の実施例の項で提示されている実例では、バイオリアクターにマウス14F1.1間質細胞株を播くか、あるいは、初代ヒト骨髄間質細胞を播いた。細胞を播いてから40日後までに、担体は、100倍の細胞密度をもつようになった。さまざまなレベルのカラムで密度は同一であり、このことは、酸素と栄養分が均一に細胞まで移動したことを示している。ヒト臍帯血(CB)CD34+38−細胞の長期間維持を支持するには、間質細胞によって馴化された、バイオリアクター内の培地(3D SCM)の方が、間質細胞の単層(2D)SCMよりも優れていた。また、3D SCMは、SCID/NOD再増殖細胞(SRC)を代表するCD34+38−CXCR4+細胞の増加を支持することもできた。サイトカイン(FLT3リガンドとTPO)存在下では、3D SCMは、幹細胞の自己複製を促進し、分化を抑制したが、2D SCM+サイトカインによって、これと反対の効果が誘導された。また、3次元の間質−幹細胞培養は、単層の間質細胞上で培養したときよりも優れたCD34+38−細胞維持を示した。これらの知見は、3D栓流バイオリアクターが、優れた間質細胞−幹細胞接触によって、そして、おそらく、既知および/または新規の幹細胞制御因子によって、ヒトHSCを生体外で維持/増加するのに適した装置を提供することを示している。
【0043】
ヒトHSCは、移植および遺伝子治療にとって重要な標的である。HSCの頻度が非常に減少すること、および、最終分化がないときに、幹細胞の自己複製を誘導することができる増殖因子を今の所利用できないことが、相変わらず、このような方法を実施したり、HSC「バンク」を大規模に準備する上での主な障害となっている。
【0044】
未分化のヒトHSCの長期間維持/増加をめざす現在の方法は、今までのところ、限定的にしか成功していない。サイトカイン添加懸濁培養を用いた最近の研究では、いくらかのSRC増加が示されたが、この処理過程は、初期造血前駆細胞の大量の増加もともなっていた(53、62)。このことは、幹細胞の分化がかなりの程度起こっていることを示すものである。理想的な装置は、例えば、、SRCが増加しても、LTC−ICは少ない数のままでいるようなものである。
【0045】
造血細胞増加のために今ある装置は、灌流させた造血細胞の懸濁培養を単独で(米国特許第5,646,043号参照)、または間質細胞単層(米国特許第5,605,822号参照)上に播いて用いる。前者の装置では、関係する前駆細胞の膨大な産生が起こるが、後者では、単層の間質細胞−幹細胞相互作用という非生理学的な性質が問題となる。幹細胞を増加させるための別の装置では、間質細胞馴化培地の使用が記載されている(米国特許第4,536,151号、および第5,437,994号)。しかし、後者は、間質細胞単層から得られたものであり、本明細書において、3D SCMと比較して幹細胞活性化能力が劣り、また異なっていると明示されている(実施例の項の表3を参照)。最近になって、間質細胞被覆ガラスビーズを用いた固定相バイオリアクターが記述されている(米国特許第5,906,940号)が、このビーズは、生理学的な3D構造を提供しておらず、本発明を実施したときに用いる担体と比較すると、間質細胞を1mlあたり10倍少ない数しか増殖させることができない。3D由来のSCM、または3D間質細胞培養が優れたCD34+38−細胞維持能力をもつという、ここで示された知見によって、単層間質細胞培養に対する3Dの利点が明確になる(図6と7参照)。3D SCMの優れた効果は、既知のサイトカインまたは新規の幹細胞制御因子の量が上昇したためであろう。
【0046】
3D SCMとさまざまなサイトカイン(SCF、FLT3リガンド、TPO等)を組み合わせたときのCD34+38−CXCR4+(またはSRC)の維持/増加に対する効果を評価するための実験(表3)は、FLT3リガンドおよびTPOが存在するときには3D SCMの有利な効果が示されたが、SCFでは示されなかった。これら知見は、幹細胞分化に対する3D SCMの相対的な阻害効果によるものかもしれない。これらの知見は、3D条件下では、それ自体は活性が低いが、こうしたサイトカインと協働的に作用する新規の間質細胞関連因子が産生されたことを強く示している。CD34+の出力に加えて、LTC−ICおよび関連前駆細胞(GM−CFU)出力値を使用することによって、幹細胞分化をテストできるようになる。
【0047】
ここで説明するバイオリアクターは、3D間質細胞培養を連続的な流動装置と組み合わせた点でユニークである。連続的な培地の流動のない3D間質細胞−造血細胞システムについては最近の記述が見られる(米国特許第5,541,107号)が、本明細書で説明する知見(例えば、図7参照)によれば、連続的に流動させない場合には、単層と比較した場合の3D間質細胞培養の利点は減少することが明らかになっている。
【0048】
ここで説明する3D栓流バイオリアクターは、間質細胞株、および初代骨髄間質細胞の長期増殖を支持することができる。バイオリアクターにおける間質細胞の使用は、優れた間質細胞−幹細胞の接触(ユニークな「ニッチ」、および細胞−細胞、細胞−ECM相互作用による)を確保するために必須であるだけでなく、間質細胞による既知または新規の可溶性膜結合サイトカインの産生にも必須である。遺伝子工学的に作製されたサイトカイン産生変異株を用いることによって、間質細胞は、このようなバイオリアクターに適当なサイトカインを補充するのを容易にすることができる。
【0049】
バイオリアクターの間質細胞は、バイオリアクターそのもの中でレトロウイルスパッケージング用細胞株となって、幹細胞の中に遺伝物質を効率よく導入することができるように改造することができる。また、バイオリアクターの中でさまざまな幹細胞を使用することによって、間質細胞に接着する能力が低いことで知られているPh陽性幹細胞(63)を排除するのに最も適した担体を選択できるかもしれない。初代間質細胞には、「自家性」の間質細胞−幹細胞バイオリアクターで、自家性の幹細胞または臍帯血幹細胞でさえも増加することができ、移植する前に間質細胞を除去する必要がないというバイオリアクターを樹立できるという利点がある。
【0050】
バイオリアクターへの初回播種実験では、担体内でのCD34+38−細胞の収率はどちらかといえば低かったが、細胞を播いた後の培地の流速と、最初にバイオリアクターの中に播くCD34+細胞の数は容易に最適化することができる。細胞を播いた後の早い時点(1〜4日後)でのCD34+38−CXCR4+解析が、このような最適化には必須である。
【0051】
先行技術の方法と明確に異なり、本発明のバイオリアクターは、骨髄の機械的な構造基盤を模倣するよう、間質細胞を接着させるために利用できる接着表面がかなり増加している増殖用マトリックスを使用する。例えば、0.5mmの高さの増殖用マトリックスでは、増殖用マトリックスの基盤からの突起から計算すると、少なくとも5〜30倍増加している。約5〜30倍という、このような増加は、層単位あたりであり、積み重なっていようと、スペーサーなどによって離れていようと、このような層が複数用いられていれば、このような構造物の一枚あたりについて、5〜30倍という係数が適用される。マトリックスが、好ましくは、不織繊維シートである、シートという形、または開孔発泡ポリマーのシートにして用いるときは好適な厚さは約50〜1000μm以上で、細胞の侵入、栄養分の侵入に適し、また、排出産物をシートから除去するのに適した孔が提供される。好適な実施態様によれば、孔の効果的な直径は10μmから100μmである。このようなシートは、さまざまな厚さの繊維から調製することができ、好ましい繊維の厚さまたは繊維の直径は約0.5μmから20μmの範囲であり、さらにより好ましい繊維は、直径が約10μmから15μmの範囲である。
【0052】
本発明の構造物は、寸法安定性と物理的強度を持たせるための多孔性支持シートまたはスクリーンによって支持されるか、さらによいのは、それに結合することができる。
【0053】
また、このようなマトリックスシートは、切ったり、穴を開けたり、切り刻んだりして、約0.2mm2から約10mm2までの突起領域をもち、同じ範囲の厚さ(約50から1000μm)をもつ粒子を提供することができる。
【0054】
製造法に関する詳細については、本発明を実施したときに用いた増殖用マトリックスの使用および/または長所が、米国特許第5,168,085号と、特に、第5,266,476号に記載されており、これらは両方とも、ここにおいて参照として組み込まれる。
【0055】
当業者には容易に理解できるように、本発明は、以下のような、しかし、これらには限定されない、さまざまな応用場面に用いることができる、増大した未分化造血幹細胞の集団を提供する:(i)移植前に間質細胞−幹細胞を分離する必要のない、レシピエントの間質上でのヒト幹細胞(自家性または臍帯血由来)の増加、(ii)自家環境における、間質細胞−幹細胞相互作用によるPh+CML幹細胞の枯渇、(iii)バイオリアクター内にあるか、またはバイオリアクターから回収してからの自己複製幹細胞の中への遺伝子移入;(iv)未分化造血幹細胞を生体外で維持/増加させるための、懸濁培養または幹細胞バイオリアクターにおける、3D間質細胞馴化培地(SCM)の生産;(v)分化のない状態で幹細胞の自己複製を誘導する新規タンパク質、および、さらに別の生物学的機能をもつタンパク質の単離;(vi)新規の間質細胞関連幹細胞制御因子、および、さらに別の生物学的機能をもつ幹細胞遺伝子産物をクローニングするための3D幹細胞RNAの単離。
【0056】
本発明の一つの態様によれば、未分化の造血幹細胞または前駆細胞を増加/維持する方法が提供される。本発明の本態様による方法は、以下の方法工程を踏むことによってもたらされる。まず、未分化造血幹細胞または前駆細胞を得る。次に、この未分化造血幹細胞または前駆細胞を、図1に、その実例が参照用の番号とともに図示されている固定相栓流バイオリアクターの中に播くが、その中では、生理学的に許容できる3次元の繊維ネットワークを形成している不織繊維マトリックスを含むシート状担体の上に、間質細胞株または初代間質細胞培養のいずれかの3次元の間質細胞培養が予め樹立されている。こうして、さらに上述され、また、次の実施例の項で例示されているように、未分化造血幹細胞または前駆細胞が増加/維持される。
【0057】
本明細書およびそれに続く請求の範囲の項で用いられるとき、「未分化の造血幹細胞」という語句は、まだ特定化されていない造血細胞を意味する。
【0058】
本明細書およびそれに続く請求の範囲の項で用いられるとき、「前駆細胞」という語句は、特定化されているが、未成熟の造血細胞を意味する。
【0059】
未分化造血幹細胞も前駆細胞もCD34+細胞である。したがって、「未分化の造血幹細胞または前駆細胞を得ること」という語句、およびそれと同義の「未分化の造血幹細胞または前駆細胞が得られる」という語句は、どちらも、単離された未分化の造血幹細胞および/または前駆細胞、または、未分化の造血幹細胞および前駆細胞を含むCD34+細胞の集団を取得することを意味する。
【0060】
本明細書およびそれに続く請求の範囲の項で用いられるとき、「増加させること」および「増加」という語は、実質的に分化のない細胞増殖、すなわち、細胞の増加に伴う分化なしに細胞集団が増加することを意味する。
【0061】
ここで、「維持すること」および「維持」という語は、実質的に分化のない細胞の自己複製、すなわち、細胞の定常化に伴う分化のない実質的に定常的な細胞集団を意味する。
【0062】
ここで、「分化」という語は、発生の過程で、相対的に一般的な種類から特異的な種類に変化することを意味する。さまざまな細胞系譜の細胞分化は、充分に記述されているプロセスであるから、ここでさらに記述する必要はない。
【0063】
ここで、「生体外」という語は、生体から取り出された細胞で、生体の外部(例えば、試験管)で増殖される細胞を意味する。
【0064】
増加後、例えば、そのとき増加した未分化の造血幹細胞または前駆細胞を、蛍光活性化細胞選別、および親和性基質による親和分離法などであるが、これらに限定されない、さまざまな親和分離/標識技術によって単離することができる。このような単離法を実施するために使用できる親和性分子には、例えば、CD34+細胞に結合する抗CD34抗体などがある。
【0065】
本発明の別の態様によれば、未分化の造血幹細胞または前駆細胞を増加/維持するもう一つの方法が提供される。本発明の本態様による方法は、以下の方法工程を踏むことによってもたらされる。まず、未分化造血幹細胞または前駆細胞を得る。次に、この未分化造血幹細胞または前駆細胞を全成分または添加成分として間質細胞馴化培地を含む培地の中で培養するが、この間質細胞馴化培地は、生理学的に許容できる3次元の繊維ネットワークを形成している不織繊維マトリックスを含むシート状担体の上に、間質細胞株または初代間質細胞培養のいずれかの3次元の間質細胞培養が予め樹立されている固定相栓流バイオリアクターから得られるものであり、これによって、さらに上述され、また、次の実施例の項で例示されているように、未分化の造血幹細胞または前駆細胞が増加し/維持される。
【0066】
本発明のさらに別の態様によれば、未分化の造血幹細胞または前駆細胞を増加/維持する上で有用な間質細胞馴化培地を調製する方法が提供される。本発明の本態様による方法は、以下の方法工程を踏むことによってもたらされる。まず、固定相栓流バイオリアクターの中で、生理学的に許容できる3次元の繊維ネットワークを形成している不織繊維マトリックスを含むシート状担体の上に間質細胞株または初代間質細胞培養のいずれかの間質細胞培養を樹立して、未分化の造血幹細胞または前駆細胞を増加/維持する。次に、所望の間質細胞密度すなわち、例えば、マトリックス1立方センチメートルあたり約5×106または107を超える密度に達したら、固定相栓流バイオリアクターから培地を回収すると、さらに上述され、また、次の実施例の項で例示されているように、未分化の造血幹細胞または前駆細胞を増加/維持する上で有用な間質細胞馴化培地が得られる。
【0067】
本発明のさらに別の態様によれば、未分化の造血幹細胞または前駆細胞をレシピエントに移植する方法が提供される。本発明の本態様による方法は、以下の方法工程を踏むことによってもたらされる。まず、上記の方法のいずれかによって、未分化の造血幹細胞または前駆細胞を増加/維持する。次に、最初の工程で得られた未分化の造血幹細胞または前駆細胞をレシピエントに移植する。
【0068】
図1に示すように、本発明のさらに別の態様によれば、容器5を含むバイオリアクタープラグで、典型的にはカラムの形をしており、入り口と出口をもち、また、その中に、生理学的に許容できる3次元の繊維ネットワークを形成している不織繊維マトリックスを含み、担体1立方センチメートルあたり、間質細胞株または初代間質細胞培養のいずれかの少なくとも5×106個、好ましくは、少なくとも107個の間質細胞を支持するシート状担体を含むものが提供される。
【0069】
本発明のさらに別の態様によって、上記バイオリアクタープラグを含む栓流バイオリアクターが提供される。
【0070】
この点に関して、担体が、理論的には、1立方センチメートルあたり5×107個の細胞を支持できることが理解されよう。十分な細胞が担体上に蓄積したところで、照射などの手段を用いて、さらなる細胞増殖を中断させて、担体によって支持される細胞の正確な数を調節する。
【0071】
本発明に係る方法を実施する際に、このような細胞の供給源として用いられる未分化の造血幹細胞または前駆細胞は、臍帯血、サイトカインにより動員された末梢血(例えば、白血球搬出によって回収されたもの)、および骨髄など、そのすべてが未分化の造血幹細胞または前駆細胞を含むことが知られている組織で、しかもこれらに限定されない組織から精製または単離することができる。このような分離を行なう方法は、当技術分野において公知であるが、もっともよく用いられるのは、フルオロフォアによる親和標識でまず細胞を標識してから回収する蛍光活性化細胞選別法である。
【0072】
本発明の好適な態様によれば、未分化の造血幹細胞または前駆細胞、および間質細胞培養の間質細胞は、共通のHLA抗原をもつ。本発明の別の好適な態様によれば、未分化の造血幹細胞または前駆細胞、および間質細胞培養の間質細胞は、単一個体に由来する。したがって、それをレシピエントに移植する場合には細胞を分離する必要はない。
【0073】
本発明のさらに別の好適な態様によれば、未分化の造血幹細胞または前駆細胞、および間質細胞培養の間質細胞は、異なった個体に由来する。例えば、未分化の造血幹細胞または前駆細胞、および間質細胞の将来のレシピエントを間質細胞を提供するために用いることもできるが、このような細胞をレシピエントに提供するため、HLA適合性によって選択されたドナーから未分化の造血幹細胞または前駆細胞、および間質細胞を得ることもできる。したがって、ここでも、移植前に細胞を分離する必要はない。
【0074】
本発明のさらに別の好適な態様によれば、未分化の造血幹細胞または前駆細胞、および間質細胞培養の間質細胞は、同一種に由来する。しかし、本発明のさらに別の好適な態様によれば、未分化の造血幹細胞または前駆細胞、および間質細胞培養の間質細胞は、異種に由来する。
【0075】
本発明の現在の好適な態様によれば、固定相栓流バイオリアクターの中に未分化の造血幹細胞または前駆細胞を播く工程が行われてから少なくとも10時間バイオリアクターの中の流れが停止され、それによって、細胞を間質細胞で被覆されたマトリックスに固定することができる。
【0076】
以下の記載では、本発明を実施する際に用いられる好適な担体に関する考察を行なう。
【0077】
すなわち、実施態様の一つによれば、担体の繊維は、全容量に対する割合にして40%から95%が孔を形成し、孔の大きさは10ミクロンから100ミクロンである。別の態様によれば、担体を作るマトリックスは、へん平繊維、非丸形繊維、中空繊維、およびそれらの混合繊維からなるグループより選択された繊維でできており、繊維の直径または幅は0.5ミクロンから50ミクロンである。さらに別の態様によれば、マトリックスは、幅2ミクロンからの幅をもつ繊維から形成されたリボンから構成される。さらなる態様によれば、繊維の厚さに対する幅の割合は少なくとも2:1である。さらに別の態様によれば、担体を作るマトリックスは、全容量に対する割合で60%から95%の孔容量をもつ。さらに別の態様によれば、マトリックスの高さは50〜1000μmであるが、ただし、それらを積み重ねたものを用いることができる。さらに別の態様によれば、担体を作るマトリックスの材料は、ポリエステル、ポリアルキレン、ポリフルオロクロロエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリスルホン、酢酸セルロース、ガラスファイバー、および不活性金属繊維からなるグループより選択される。さらに別の態様によれば、マトリックスは、四角形、リング形、円盤形、および十字形からなるグループより選択された形である。さらに別の態様によれば、マトリックスはポリ−D−リジンで被覆されている。
【0078】
本発明のさらに別の目的、利点、および新規の特徴は、以下の実施例を調べれば、当業者に明らかとなろうが、実施例は、制限を意図したものではない。さらに、上記で概略され、後述する請求の範囲の項で請求されている、本発明のさまざまな実施態様および態様はそれぞれ、以下の実施例で実験的に裏付けられていることが分かる。
【0079】
実施例
ここで、以下の実施例を説明するが、これらは、上記の説明と合わせて、発明を非限定的な方法で具体的に示すものである。
【0080】
一般的に、ここで用いられる命名法、および本発明において利用される実験手順には、分子的、生化学的、微生物学的、および組換えDNAによる技術などがある。このような技術は、文献中で詳細に説明されている。例えば、「分子クロニーング:実験マニュアル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)」、Sambrookら、(1989);「分子生物学の最新プロトコール(Current Protocols in Molecular Biology)」第IからIII巻、Ausubel, R. M.編(1994); Ausubelら、「分子生物学の最新プロトコール(Current Protocols in Molecular Biology)」、メリーランド州ボルティモア(Baltimore, Maryland)にあるジョンワイリーアンドサンズ社(John Wiley and Sons)(1989);Perbal、「分子クロニーングの実践的手引き(A Practical Guide to Molecular Cloning)」ニューヨークにあるジョンワイリーアンドサンズ社(John Wiley & Sons)(1988);Watsonら、「組換えDNA(Recombinant DNA)」、ニューヨークにあるサイエンティフックアメリカンブックス社(Scientific American Books);Birrenら、(編)「ゲノム解析:実験マニュアルシリーズ(Genome Analysis: A Laboratory Manual Series)」、第1〜4巻、ニューヨークにあるコールドスプリングハーバーラボラトリープレス社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)(1998);米国特許第4,666,828号、第4,683,202号、第4,801,531号、第5,192,659号および第5,272,057号で開示されている方法;「細胞生物学:実験室ハンドブック(Cell Biology: A Laboratory Handbook)」、第IからIII巻、Cellis, J.E.,編(1994);「免疫学の最新プロトコール(Current Protocols in Immunology)」第IからIII巻、Coligan, J. E.,編(1994);Stitesら、(編)「基礎および臨床免疫学(Basic and Clinical Immunology)」(第8版)、コネティカット州ノーウォーク(Norwalk, CT)にあるアップルトンアンドラング社(Appleton & Lange)(1994);Mishell and Shiigi(編)「細胞免疫学の精選された方法(Selected Methods in Cellular Immunology)」、ニューヨークにあるW.H.フリーマン社(W.H. Freeman and Co.)(1980);利用可能な免疫アッセイ法が、特許文献および科学論文で広範に記載されている。例えば、米国特許第3,791,932号、第3,839,153号、第3,850,752号、第3,850,578号、第3,853,987号、第3,867,517号、第3,879,262号、第3,901,654号、第3,935,074号、第3,984,533号、第3,996,345号、第4,034,074号、第4,098,876号、第4,879,219号、第5,011,771号、第5,281,521号を参照;「オリゴヌクレオチド合成(Oligonucleotide Synthesis)」、Gait, M.J. ら、(1984);「核酸ハイブリダイゼーション(Nucleic Acid Hybridization)」、Hames, B.D. and Hggins S. J.編(1985);「転写と翻訳(Transcription and Translation)」、Hames, B.D. and Hggins S. J.編(1984);「動物細胞培養(Animal Cell Culture)」、Freshney, R. I.,編(1986);「固定化細胞および酵素(Immobilized Cells and Enzymes)」、IRLプレス社(IRL Press)、(1986);「分子クロニーングの実践的手引き(A Practical Guide to Molecular Cloning)」、Perbal, B., (1984)および「酵素学における方法(Methods in Enzymology)」1〜317巻、アカデミックプレス社(Academic Press);「PCRプロトコール:方法と応用への手引き(PCR Protocols; A Guide To Methods And Applications)」、カリフォルニア州サンディエゴ(San Diego, CA)にあるアカデミックプレス社(Academic Press)(1990);Marshakら、「タンパク質精製と特徴付けの方法:実験コースマニュアル(Strategies for Protein Purification and Characterization−A Laboratory Course Manual)」、CSHLプレス(CSHL Press)(1996)を参照のこと。そして、これらはすべて、本明細書において完全に開示されているものとして、参照して本明細書に組み入れられる。その他の一般的な参考文献は、本書類全部にわたって提示されている。それらに含まれている情報はすべて、参照してここに組み込まれる。
【0081】
材料と実験方法
バイオリアクター: 本発明の記載に従って使用されるバイオリアクターが、図1に記載の設計にしたがって構築された。ガラス用具は、テクニオン社(Technion)(イスラエル)で設計製造され、シリコンチューブ(デガニア社(Degania)、イスラエル)で接続した。担体を、Ca+2とMg+2を含まないリン酸緩衝食塩水(PBS;ベイトハエメックインダストリー社(Beit Ha'Emek Industries)、イスラエル)の中で一晩回転させて、その後、PBSと遊離した残渣を除去した。各カラムに10mlのパックされた担体を入れた。バイオリアクターをPBS−Ca−Mgで満たし、出口をすべて密封し、この装置をオートクレーブした(120℃、30分間)。容器[8]を通してPBSを取り除いてから、37℃の保温器の中で、10%の熱で不活化したウシ胎児血清(FCS;ベイトハエメックインダストリー社(Beit Ha'Emek Industries)、イスラエル)、およびPen−Strep−Nystatin混合液(100U/ml:100μg/ml:1.25μn/ml;ベイトハエメックインダストリー社(Beit Ha'Emek))を含む300mlのダルベッコの高グルコース培地(DMEM;ギブコBRL社(GIBCO BRL))で48時間にわたってバイオリアクターを循環させた。循環している培地を、上記+2mML−グルタミンを含む新鮮なDMEM(ベイトハエメックインダストリー社(Beit Ha'Emek))と交換した。
【0082】
幹細胞: 幹細胞株は、十分に湿度が高い5%CO2インキュベーターの中で、10%FCSを添加したDMEMに入れて37℃で維持した。細胞は、組織培養用フラスコ(コーニング社(Corning))の中で増殖させ、コンフルエントな状態になったところでトリプシン処理をして分割した。初代ヒト骨髄間質細胞培養は、開心術を受けている血液学的には正常なドナーの吸引胸骨髄から樹立した。簡単に説明すると、骨髄吸引物をハンクス平衡塩溶液(HBSS;ギブコBRL社(GIBCO BRL))で3倍に稀釈して、フィコール−ハイペーク(Ficoll−Hypaque)(カリフォルニア州サニーベール(Sunnyvale, CA)にあるリボンズサイエンティフィック社(Ribbons Scientific Corp.))密度勾配遠心にかけた。骨髄の単核細胞(<1.077gr/cm3)を回収して、HBSSで3回洗浄してから、12.5%FCS、12.5%ウマ血清(ベイトハエメックインダストリー社(Beit Ha'Emek))、10−4Mのβ−メルカプトエタノール(メルク社(Merk))、および10〜6mol/Lのハイドロコルトワゾン(hydrocortwasone)コハク酸ナトリウム(シグマ社(Sigma))を添加したDMEMからなる長期培養用(LTC)培地に再懸濁した。細胞を25mlの組織培養用フラスコ(コーニング社(Corning))に入れて、37℃で3日間(5%CO2)インキュベートしてから、毎週培地を交換しながら33℃(同様)でインキュベートした。個別のドナーからの間質細胞が各バイオリアクターに対して用いられた。3Dおよび単層を実験するために、初代間質細胞培養を10日毎にトリプシン処理(0.25%トリプシンおよびEDTAを含むパックス食塩水(Puck's Saline);(ベイトハエメックインダストリー社(Beit Ha'Emek))して分割して、間質細胞を十分に増加させた。LTC−ICおよびCAFC(下記参照)については、137Cs線源を用いて間質細胞を照射(1500cGy)してから、培養物をLTC培地中33℃で維持した。
【0083】
間質細胞の播種: 間質細胞株のコンフルエントな培養細胞、または5週目の初代骨髄間質細胞をトリプシン処理し、HBSSで3回洗浄してから、バイオリアクター用培地に再懸濁し(上記参照)、細胞数を数えて、106細胞/mlの細胞10mlを注射ポイント([4]、図1)を通して、バイオリアクターのガラスカラムの中の担体10mlの上に播種した。播種直後から16時間循環を停止して、細胞を担体上に定着させた。担体を取り出して、MTT法(56)で細胞数を数えることによって、バイオリアクター内での間質細胞の増殖を監視した。間質細胞細胞がコンフルエントになったら、さらに実験を続ける(SCMの調製、幹細胞の播種など)ために、培地をLTC培地と交換した。
【0084】
間質細胞馴化培地(SCM)の調製: 同等の細胞密度で、単層およびバイオリアクターの間質細胞に新鮮なLTC培養培地を補充した。細胞を一晩インキュベートした後SCMを回収した。このために、3D培養の培地の流れを16時間停止して、循環を再開する前にカラムから直接取り出した。SRCの間質細胞産生に与えるCD34+細胞の効果を解析するために、3D装置にCD34+を播いた後さまざまな時間(2〜7日間)を置いて循環を停止し、上記したようにして、カラムから培地を回収した。SCMを回転させ(1000×g、10分間)、濾過してから−20℃に保存した。バイオリアクター中の無血清培地の中でも間質細胞を増殖させて、SCMを回収し、それによって、不確定の変数を除去した。
【0085】
CD34+細胞の単離: 運搬中無菌状態で運ばれてきた臍帯血サンプルを、フィコール−ハイペーク(Ficoll−Hypaque)上で分画して、浮遊性(<1.077gr/cm3)の単核細胞を回収した。各CBサンプルから得られた細胞をプールして、抗CD34抗体とともにインキュベートし、ミディMACS(ミルテニルバイオテック社(Miltenyl Biotech))によって単離した。
【0086】
CD34+細胞の懸濁培養: 0.5mlの0〜100%SCMに、それぞれ300ng/mlのFLT3リガンド、SCFまたはTPOを単独で、または組み合わせて添加するか、または全く添加しないものを24穴プレート(TPP、スイス)に入れ、その中でCB CD34+細胞(5×105/ウエル)をインキュベートした。対照は、LTC培地にサイトカインを加えたものか加えないものであった。細胞は、空気中5% CO2、37℃でインキュベートした。培養培地は毎週交換した。播種前のさまざまな時点(1〜3週間)で細胞を回収し、CD34+/38−/CXCR4+をフローサイトメトリーによって数を数えて測定した。出力アッセイ法は、SRC、CAFCおよびLTC−ICを含むこともある。
【0087】
間質−幹細胞培養: 単離・プールしたCB CD34+細胞を同じくらいの数(約5×105)になるよう、単層上、または、コンフルエントな間質細胞と同じくらいの密度状態のバイオリアクターに播いた。バイオリアクターに添加するときには、間質細胞と接触できるよう、培地の流れを16時間停止した後、1分間あたり0.1〜1.0mlという速さで再開した。対照実験のため、培地交換をしないで、CD34+細胞を播いた間質細胞担体を取り出した。サイトカイン入りか、サイトカインなしのLTC培地中で同時培養を続けた。さまざまな時点(4週間後まで)で、非接着細胞を、単層の上清から、または循環している培養培地から容器([8]、図1)を通して回収した。連続的にトリプシン処理を行ない、さらに、EDTAを主成分とする解離用バッファー(ギブコBRL社)に曝した後、ゆっくりと細胞をピペッティングして、接着細胞を回収した。こうして得られた懸濁液の中に間質細胞が混じらないようにするため、細胞をHBSS+10%FCSに再懸濁し、プラスチック製の培養皿(コーニング社)に入れて、37℃で60分間接着処理を行なった。循環する造血細胞と担体に単離された造血細胞を洗って、別々に、フローサイトメトリーによって、CD34+/38−/CXCR4+を数えて測定した。出力アッセイ法は、SRC、CAFCおよびLTC−ICを含むこともある。
【0088】
フローサイトメトリー: 飽和濃度のモノクローナル抗−CD34+PerCP抗体(ベクトン−ディキンソン社(Beckton−Dickinson))、抗−CXCR4−フルオロセインイソチオシアネート抗体(FITC、R&Dシステムズ社(R&D Systems))、およびフィコエリトリン抗体(PE、ベクトン−ディキンソン社)とともに細胞を4℃で30分間インキュベートした。5%熱不活性化FCSを含む氷冷PBSで細胞を2回洗浄してから、FACSscan(ベクトン−ディキンソン社)上で3色フローサイトメトリーを行なうために再懸濁した。
【0089】
LTC−ICアッセイ法およびCAFCアッセイ法: 以前の記載(16、17)にしたがって、単離したばかりのCD34+細胞、間質細胞との同時培養か懸濁培養から単離した細胞を、LTC−ICとCAFCについて測定した。コンフルエントな初代骨髄間質細胞をトリプシン処理してから照射し(1500cGy)、96穴プレート(コーニング社)0.1mlの中に1.5×104/ウエルになるよう播いた。24反復用ウエル/グループを樹立した。間質細胞の上をCD34+細胞の連続稀釈(500〜5細胞/ウエル)を含むLTC培地0.1ml、またはさまざまなアッセイから回収した細胞の連続稀釈液で覆った。培養液はそのまま、毎週半分の培地を交換しながら、33℃で5週間インキュベートした。プレートを1000rpmで10分間スピンダウンし、培養上清を取り除き、以前の記載(57)にしたがって、メチルセルロース培養液、および骨髄前駆細胞アッセイを行うためのサイトカインをオーバーレイした。14日後にコロニー数を数え、37%の陰性培養になる被験細胞の濃度の逆数によって(16)LTC−ICの頻度を決定した。CAFCアッセイ法は、メチルセルロースおよびサイトカインをオーバーレイしない点を除いて、基本的には上記と同様に行なった。被験細胞懸濁液を連続稀釈して播いてから6週間後に、間質細胞層の下にある少なくとも5個の細胞(敷石領域)のうち少なくとも位相が濃い造血細胞クローンが一つあるウエルを判定した。
【0090】
実験結果
本発明を実施する際に用いたバイオリアクター装置を図1に示す。これは、4本の平行栓流バイオリアクターユニット[5]を含んでいた。各バイオリアクターユニットには、ポリエステルの不織繊維マトリックス(58)でできた1 gの多孔性担体が入っていた(直径4mm)。これらの担体は、比較的小さい容量で多数の細胞を増殖させることができる。担体の構造と詰め方が、酸素と栄養分の移動、また、局所的な濃度および遊離した間質細胞産物(例えば、ECMタンパク質、サイトカインなど、59)に主要な影響を与える。バイオリアクターは、インキュベーターにおいて37℃で維持した。
【0091】
各バイオリアクターの流れを監視し[6]、バルブ[6a]によって調節した。各バイオリアクターは、サンプリングポイントと注入ポイント[4]をもっていて、間質細胞と造血細胞を連続的に播種できるようになっている。培養培地は、貯蔵容器[1]からpH7.0で供給された[13]。貯蔵容器には、カラムからの出口で5〜40%の溶解酸素が維持できるよう、バイオリアクター内の細胞密度に応じて決まるさまざまなな空気/CO2/O2[2]の割合を含む濾過混合気体[3]を供給した。監視装置[12]によって測定したところ、O2の割合は、バイオリアクターの出口の所で溶解しているO2レベルに適合していた。混合気体は、シリコンチューブを経由して貯蔵用容器に送られる。培養培地は、循環する非接着細胞を回収することのできる別の容器[7]を通って来る。培地の循環は、0.1〜3ml/分という速度で動く蠕動ポンプ[9]という手段によって得られた。バイオリアクターユニットは、さらに、サンプリングポイント[10]と、10〜50ml/日の速度で連続的に培地を交換するための2つの容器[8、11]を備えていた。4本平行になったバイオリアクターユニットを使用することによって、細胞の取り出し、走査式電子顕微鏡、組織学法、免疫組織化学法、RNA抽出等の目的で、周期的に取り外すことが可能になっている。
【0092】
実験の一つにおいて、マウス14F1.1間質細胞株(24、60、61)を含むバイオリアクター装置で、分化を開始したヒト骨髄前駆細胞の増殖を支持することが以前示されているバイオリアクター(24)を確立した。この細胞株は、初代ヒト骨髄間質細胞だけでなく、ヒトCB CAFC(図2)、LTC−IC(図3)、およびCD34+38−細胞(図4)も同様に支持することができる。また、これらの図に示された結果は、FLT3リガンド+TPOをこれらの培養細胞に添加したとき、LTC−ICには効果を与えなかったが、CAFCおよびCD34+38−細胞の出力を有意に促進したことを示している。これに対して、SCFは、LTC−ICとCAFCの両方で減少を招いた。培養容量10mlあたり1.5×106個の細胞をバイオリアクターに播種すると、14F1.1細胞が増殖して、担体上に広がった(図5)。播種後40日目までに、担体の細胞密度は100倍、すなわち、約1.5×106細胞/担体、1.5×107細胞/mlという密度まで増加した(表1)。
【表1】
【0093】
さまざまなレベルのカラムで担体上の細胞密度は同じであったが、このことは、細胞への酸素と栄養分の移動が均一であったことを示している。これらの細胞について培養条件を最適化させると、培養培地(ダルベッコの高グルコース培地+10%ウシ胎児血清)、流速(1ml/分)、培地交換頻度(週に1回)、初回播種濃度(上記の通り)となった。コラーゲンまたはポリL−リジンによる担体被覆には、14F1.1細胞の増殖率と最終濃度に有利な効果がないことが分かった。初代ヒト骨髄間質細胞による予備的知見(表1)は、14F1.1と初代間質細胞が、それぞれ播種後10日目と14日目で同じ密度になることを明らかにした。
【0094】
バイオリアクター内での間質細胞の機能活性を測定するために、ヒトCB CD34+細胞を播種した懸濁培養におけるCD34+38−細胞に対する、バイオリアクターカラム(3D SCM)から得られた間質細胞馴化培地(SCM)の効果を判定した。活性を同じ濃度の間質細胞を含む単層培養(2D SCM)から得られたSCMと比較した。図6に示したように、14F1.1細胞からのSCMは、初代骨髄間質細胞からのSCMと同等またはそれ以上にヒトCB CD34+38−細胞の維持を支持できることが分かった。14F1.1 SCMの最大効果は、常に、初代骨髄SCMよりも低い濃度で見られた。さらに、3D SCMは、ヒトCB CD34+38−細胞の増加を支持する上で、どちらの細胞型の2D SCMよりも優れていることが分かった。2Dと3D SCMの間における活性の違いは、培養期間が長いほど(14日対21日)はっきりした。14F1.1 3D SCMをヒトCB CD34+細胞に加えても、培地のみを含む対照培養と較べると、CD34+38−CXCR4+細胞が維持される結果になった(表2)。
【表2】
【0095】
表3は、2D対3D SCMを含むCD34+懸濁培養における、サイトカインの効果を示している。この結果は、CD34+38−、およびより重要なことには、CD34+38−CXCR4+(SRC)サブセットの両方を維持する上で、3D SCMが2D SCMよりも優れていることを示している。
【表3】
【0096】
このことは、CD34+細胞を回収して検出したところ、2D SCMの方が細胞分化に対する効果が強かったことと関連するのかもしれない。TPO+FLT3リガンドは、2D SCM存在下ではCD34+38−/CD34+38−CXCR4+の収率を低下させたが、3D SCMを添加した培地での収率を上昇させた。CD34+表面マーカーによって測定したところ、これもまた、3D装置における分化の程度が低いことに起因するのかもしれない。2D SCMおよび3D SCMの両培養において、SCFは、幹細胞分化の顕著な増加と、CD34+38−/CD34+38−CXCR4+の収量の顕著な低下を引き起こした。
【0097】
本発明者らのバイオリアクターにおける間質細胞と幹細胞の相互作用を測定するため、間質細胞(14F1.1)で被覆した担体上でのCD34+38−細胞の維持/増加を最初に評価した。担体をバイオリアクターから取り出して、シリコン被覆した96穴プレートに入れ、CD34+細胞を加えた。対照は、担体のみを含み、担体と同数の単層14F1.1細胞を含んでいた。図7に示すように、CD34+38−細胞の生存は、担体のみの存在下で促進され、3D構造物が、初期前駆細胞(36)の生存/維持に有益な効果を与えることが確認された。間質細胞で被覆された担体は、CD34+38−細胞の7日後の生存/維持を促進するときに、担体のみ、または単層14F1.1細胞よりも優れていた。長期培養(14日目)は、14F1.1単層と14F1.1被覆担体の両培養において、CD34+38−数の増加をもたらした。
【0098】
その後の実験では、非照射14F1.1被覆担体の4本のカラムを含むバイオリアクター中の、350mlの循環する培養培地に、6×106個のプールしたCB CD34+(3×105のCD34+38−)を播種した。16時間培地の流れを停止させ、その後、正常な速さ(1ml/分)で培養を続けた。培養4日目に、回収した生細胞をFACS解析したところ、循環培地には、最初に播種したCD34+38−細胞の10%が含まれていた。培養18日目には、循環培地には、CD34+38−細胞の0.4%が含まれていたが、担体に接着した細胞は、最初に播種したCD34+38−集団の3%を含んでいた。
【0099】
本発明を具体的な実施態様とともに説明してきたが、多くの代替、改変、変更が可能であることは当業者にとって明らかなことである。したがって、本明細書に添付した請求の範囲の精神と広範な範囲に含まれる限り、そのような代替、改変、変更も本発明に含まれるものである。本明細書で引用した刊行物のすべてを、全文、参照して組み込む。本願で引用または確認した参考文献を、それらの文献が、本発明の先行技術として利用できるものとして許可していると解してはならない。
【参考文献】
【図面の簡単な説明】
【図1】 本発明を実施するときに役立つよう、栓流バイオリアクター20の例を図解したものである。
【図2】 14F1.1細胞によるCAFC維持を示している。
【図3】 14F1.1細胞によるLTC−IC維持を示している。
【図4】 14F1.1および初代ヒト骨髄間質細胞上でのCD34+38−細胞の増加を示している。
【図5】 14F1.1間質細胞株を播いた担体の10日後(図5a)または40日後(図b)の走査式電子顕微鏡写真(SEM)である。
【図6】 CD34+38−の増加に対する3D対2Dの14F1.1馴化培地の効果を示している。
【図7】 間質細胞被覆担体上でのCD34+38−細胞の維持を示している。
Claims (50)
- 未分化の造血幹細胞または造血前駆細胞を増加/維持する方法において、
(a)初代間質細胞を含む間質細胞培養を、固定相栓流バイオリアクターの中で、生理学的に許容できる3次元の繊維ネットワークを形成している不織繊維マトリックスを含むシート状担体の上で、培養培地の連続流下で、コンフルエントになるまで培養し、コンフルエントな3次元間質細胞培養を作り出す工程、および
(b)上記未分化の造血幹細胞または造血前駆細胞を、前記コンフルエントな3次元間質細胞培養を含みかつ前記培養培地の前記連続流下にある前記固定相栓流バイオリアクターの中に播いて、単離された未分化の造血幹細胞または造血前駆細胞を生体外で増加/維持する工程を含む方法。 - 未分化の造血幹細胞または造血前駆細胞が、臍帯血、動員された末梢血、および骨髄からなるグループより選択された組織から単離された細胞である、請求項1に記載の方法。
- 未分化の造血幹細胞または造血前駆細胞、および間質細胞培養の間質細胞が、共通のHLA抗原をもつ、請求項1に記載の方法。
- 未分化の造血幹細胞または造血前駆細胞、および間質細胞培養の間質細胞が、単一個体に由来する、請求項1に記載の方法。
- 未分化の造血幹細胞または造血前駆細胞、および間質細胞培養の間質細胞が、異なった個体に由来する、請求項1に記載の方法。
- 未分化の造血幹細胞または造血前駆細胞、および間質細胞培養の間質細胞が、同一種に由来する、請求項1に記載の方法。
- 未分化の造血幹細胞または造血前駆細胞、および間質細胞培養の間質細胞が、異種に由来する、請求項1に記載の方法。
- 間質細胞培養の間質細胞が、担体1立方センチメートルあたり少なくとも5×106細胞という密度にまで増殖している、請求項1に記載の方法。
- 間質細胞培養の間質細胞が、担体1立方センチメートルあたり少なくとも107細胞という密度にまで増殖している、請求項1に記載の方法。
- 固定相栓流バイオリアクターの中に未分化の造血幹細胞または造血前駆細胞を播く工程が行われてから少なくとも10時間該バイオリアクターの中の流れが停止される、請求項1に記載の方法。
- 繊維の孔が、全容量に対する割合にして40%から95%を構成し、孔の大きさが10ミクロンから100ミクロンである、請求項1に記載の方法。
- マトリックスが、直径または幅が0.5ミクロンから50ミクロンである、へん平繊維、非丸形繊維、中空繊維、およびそれらの混合繊維からなるグループより選択された繊維からできている、請求項1に記載の方法。
- マトリックスが、幅2ミクロンから20ミクロン、繊維の厚さに対する幅の割合が少なくとも2:1であるリボン状繊維から構成されている、請求項1に記載の方法。
- マトリックスが、全容量に対する割合が60%から95%の孔容量をもつ、請求項1に記載の方法。
- マトリックスの厚さが50〜1000μmである、請求項1に記載の方法。
- マトリックスの材料が、ポリエステル、ポリアルキレン、ポリフルオロクロロエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリスルホン、酢酸セルロース、ガラスファイバー、および不活性金属繊維からなるグループより選択される、請求項1に記載の方法。
- マトリックスが、四角形、リング形、円盤形、および十字形からなるグループより選択される、請求項1に記載の方法。
- マトリックスが円盤の形をしている、請求項1に記載の方法。
- マトリックスがポリ−D−リジンで被覆されている、請求項1に記載の方法。
- さらに、未分化の造血幹細胞または造血前駆細胞を単離する工程を含む、請求項1に記載の方法。
- 未分化の造血幹細胞または造血前駆細胞を増加/維持する方法において、
(a)初代間質細胞を含む間質細胞を、固定相栓流バイオリアクターの中で、生理学的に許容できる3次元のネットワークを形成している不織繊維マトリックスを含むシート状担体の上で、培地の連続流下で、コンフルエントになるまで培養し、コンフルエントな固定相3次元間質細胞培養を得る工程、
(b)前記コンフルエントな固定相間質細胞培養から間質細胞馴化培地を分離して回収し、コンフルエントな間質細胞培養から馴化培地を得る工程、および
(c)上記未分化の造血幹細胞または造血前駆細胞を、前記コンフルエントな間質細胞培養から得られた馴化培地の中で培養する工程を含む方法。 - 未分化の造血幹細胞または造血前駆細胞が、臍帯血、動員された末梢血、および骨髄からなるグループより選択された組織から単離された細胞である、請求項21に記載の方法。
- 未分化の造血幹細胞または造血前駆細胞、および間質細胞培養の間質細胞が、共通のHLA抗原をもつ、請求項21に記載の方法。
- 未分化の造血幹細胞または造血前駆細胞、および間質細胞培養の間質細胞が、単一個体に由来する、請求項21に記載の方法。
- 未分化の造血幹細胞または造血前駆細胞、および間質細胞培養の間質細胞が、異なった個体に由来する、請求項21に記載の方法。
- 未分化の造血幹細胞または造血前駆細胞、および間質細胞培養の間質細胞が、同種に由来する、請求項21に記載の方法。
- 未分化の造血幹細胞または造血前駆細胞、および間質細胞培養の間質細胞が、異種に由来する、請求項21に記載の方法。
- 間質細胞培養の間質細胞が、担体1立方センチメートルあたり少なくとも5×106細胞という密度にまで増殖している、請求項21に記載の方法。
- 間質細胞培養の間質細胞が、担体1立方センチメートルあたり少なくとも107細胞という密度にまで増殖している、請求項21に記載の方法。
- 繊維の孔が、全容量に対する割合にして40%から95%を構成し、孔の大きさが10ミクロンから100ミクロンである、請求項21に記載の方法。
- マトリックスが、直径または幅が0.5ミクロンから50ミクロンである、へん平繊維、非丸形繊維、中空繊維、およびそれらの混合繊維からなるグループより選択された繊維からできている、請求項21に記載の方法。
- マトリックスが、幅2ミクロンから20ミクロン、繊維の厚さに対する幅の割合が少なくとも2:1であるリボン状繊維から構成されている、請求項21に記載の方法。
- マトリックスが、全容量に対する割合が60%から95%の孔容量をもつ、請求項21に記載の方法。
- マトリックスの厚さが50〜1000μmである、請求項21に記載の方法。
- マトリックスの材料が、ポリエステル、ポリアルキレン、ポリフルオロクロロエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリスルホン、酢酸セルロース、ガラスファイバー、および不活性金属繊維からなるグループより選択される、請求項21に記載の方法。
- マトリックスが、四角形、リング形、円盤形、および十字形からなるグループより選択される、請求項21に記載の方法。
- マトリックスが円盤の形をしている、請求項21に記載の方法。
- マトリックスがポリ−D−リジンで被覆されている、請求項21に記載の方法。
- 未分化の造血幹細胞または造血前駆細胞を増加/維持する上で有用な間質細胞馴化培地を調製する方法において、
(a)初代間質細胞を含む間質細胞を、固定相栓流バイオリアクターの中で、生理学的に許容できる3次元のネットワークを形成している不織繊維マトリックスを含むシート状担体の上で、培地の連続流下で、コンフルエントになるまで培養し、コンフルエントな固定相3次元間質細胞培養を得る工程、ただし、前記間質細胞培養は、前記担体1立方センチメートルあたり少なくとも5×106細胞という密度にまで増殖している、および
(b)前記コンフルエントな固定相間質細胞培養から間質細胞馴化培地を分離して回収し、コンフルエントな間質細胞培養から馴化培地を作る工程、ただし、前記培地は、未分化の造血幹細胞培養を増加させて未分化の造血幹細胞の数を増大させる上で有用である、を含む方法。 - 間質細胞培養の間質細胞が、担体1立方センチメートルあたり少なくとも5×106細胞という密度にまで増殖している、請求項39に記載の方法。
- 間質細胞培養の間質細胞が、担体1立方センチメートルあたり少なくとも107細胞という密度にまで増殖している、請求項39に記載の方法。
- 繊維の孔が、全容量に対する割合にして40%から95%を構成し、孔の大きさが10ミクロンから100ミクロンである、請求項39に記載の方法。
- マトリックスが、直径または幅が0.5ミクロンから50ミクロンである、へん平繊維、非丸形繊維、中空繊維、およびそれらの混合繊維からなるグループより選択された繊維からできている、請求項39に記載の方法。
- マトリックスが、幅2ミクロンから20ミクロン、繊維の厚さに対する幅の割合が少なくとも2:1であるリボン状繊維から構成されている、請求項39に記載の方法。
- マトリックスが、全容量に対する割合が60%から95%の孔容量をもつ、請求項39に記載の方法。
- マトリックスの厚さが50〜1000μmである、請求項39に記載の方法。
- マトリックスの材料が、ポリエステル、ポリアルキレン、ポリフルオロクロロエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリスルホン、酢酸セルロース、ガラスファイバー、および不活性金属繊維からなるグループより選択される、請求項39に記載の方法。
- マトリックスが、四角形、リング形、円盤形、および十字形からなるグループより選択される、請求項39に記載の方法。
- マトリックスが円盤の形をしている、請求項39に記載の方法。
- マトリックスがポリ−D−リジンで被覆されている、請求項39に記載の方法。
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