ES2666667T3 - Identificación de células T CD8+ que son CD161 hi y/o IL-18R (alfa) hi y tienen una capacidad de evacuación rápida de fármacos - Google Patents

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Abstract

Una población aislada de células T CD8+ humanas de memoria de larga duración que tienen una alta expresión en su superficie de CD161 e IL-18Rα, en donde la población (a) prolifera en respuesta a IL-7, IL-15 o ambas, (b) evacúa rápidamente la Rh123 y (c) comprende células T de memoria central y/o células T de memoria efectora.

Description

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DESCRIPCION
identificación de células T CD8+ que son CD161 hi y/o IL-18R (alfa) hi y tienen una capacidad de evacuación rápida de fármacos
Campo de la invención
La presente invención se refiere a la utilización de la alta expresión de CD161 e IL-18a para identificar la supuesta evacuación de rodamina 123 de células T CD8+ de memoria central (CM) de vida larga y efectores (EM). La invención puede tener adoptivas en inmunoterapia adoptiva con células T para el cáncer y enfermedades infecciosas, suministro genético, inmunoterapia de ablación dirigida y composiciones útiles para ello.
Antecedentes de la invención
La capacidad para reconocer específicamente, controlar y eliminar las infecciones y el cáncer es uno de los distintivos de la inmunidad humana. El sistema inmunitario se puede dividir en 1) el sistema 'innato' no específico, con respuestas mediadas por los macrófagos, células dendríticas, células citolíticas naturales y neutrófilos y que reconocen un prelativamente pequeño número de patrones moleculares asociados a patógenos, y 2) el sistema inmunitario 'adaptativo' mediado por células T CD8+ y CD4+ altamente específicas, que potencialmente reconocen millones de diferentes antígenos peptídicos.
El reconocimiento de los antígenos específicos por las células T CD8+ del sistema inmunitario adaptativo está mediado por receptores de células T (TcR) enormemente diversos. Las células T que albergan un único TcR que reconocen un antígeno peptídico específico que se presenta por una molécula apropiada del MHC, da como resultado una respuesta inmunitaria 'adaptativa' con especificidad para el antígeno peptídico presentado. La respuesta inmunitaria 'adaptativa' de las células T CD8+ a antígenos 'extraños' está bien caracterizada en la infección vírica, pero se pueden encontrar células T CD8+ específicas para 'auto' antígenos mutados o no mutados en otras condiciones tales como el cáncer y enfermedades autoinmunitarias (1-7).
En la infección vírica aguda, los antígenos derivados de antígeno se procesan y se presentan por células presentadoras de antígenos (APC) a las células T intactas que expresan TcR capaces de reconocer el antígeno vírico y en seres humanos se caracterizan por la expresión en superficie de CD45RA y CD62L y la ausencia de expresión de CD95. Las células T intactas específicas de antígeno activadas proliferan entonces rápidamente y se diferencian en una población de células T efectoras. La inmensa mayoría de las células T efectoras mueren posteriormente, pero una pequeña fracción sobreviven y se convierten en células T de memoria (8,9). En un redesafío con el virus, la población superviviente de células T de memoria tiene la capacidad de proliferar rápidamente y diferenciarse en una población efectora para contener rápidamente la infección y proteger al huésped. Se ha descrito que las células T CD8+ de memoria específicas de antígeno persisten durante hasta 75 años, incluso en ausencia de un re-desafío con el antígeno - proporcionando esencialmente la inmunidad contra ese antígeno durante la vida del huésped (10).
La población superviviente de células T de memoria es altamente heterogénea y comprende tres subconjuntos principales en los seres humanos que se denominan memoria central (CM) memoria efectora (EM) y memoria efectora RA+ (EMra). Estos subconjuntos, y las subpoblaciones de los mismos, se diferencian en el fenotipo, ontogenia, migración dirigida, capacidad proliferativa y secreción de citocinas, y pueden tener distintos papeles en el mantenimiento de la memoria inmunitaria (11-13). La distribución de los subconjuntos de memoria puede estar afectada por la variación en las condiciones de sensibilización tales como la naturaleza de las APC y antígeno, la densidad de antígeno y la presencia de citocinas, las moléculas co-estimulantes y los mediadores inflamatorios ((). Una vez establecidas, las células T CD8+ de memoria pueden persistir en ausencia de antígeno (14,15). Las poblaciones de células T CD8+ de memoria se someten a la proliferación homeostática (estado estable) y los diferentes subconjuntos parecen tener diferentes tasas de recambio in vivo (16). La interleucina (IL)-15 es un mediador crítico de la proliferación homeostática y la IL-7 es importante para la supervivencia de respuestas de memoria establecidas (17-22). A pesar de los avances en el entendimiento de la respuesta efectora aguda contra la infección vírica y la transición a una respuesta de memoria estable, los mecanismos por los que se establece y se mantiene la memoria de CD8+ no se ha aclarado.
Takahashi et al, The Journal of Immunology, vol. 176, páginas 211-216 (2006) describe subconjuntos de células T CD4 y CD8 humanas definidas por la expresión de CD161, con diferentes actividades funcionales.
Se ha hecho la hipótesis de que una población de células T tipo 'células madre' con la capacidad de auto-renovación y diferenciación en efectoras puede proporcionar el mantenimiento de la memoria inmunológica (23). Se ha identificado recientemente una supuesta células madre de memoria en un modelo murino de enfermedad del injerto contra el huésped (GVHD) (24). Después ^ de la segunda transferencia desde los ratones con GVHD, solamente las células de memoria CD8+/CD44lo/CD62Lhi/Sca-1hi post-mitóticas eran capaces de iniciar la GVDH, dando lugar a la memoria (CM y EM) y los subconjuntos efectores, y mantienen el potencial de replicación. Otro estudio en ratones demostró la división celular asimétrica, un mecanismo de auto-renovación característica de las células madre,
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después del primer encuentro de las células T intactas con antígeno (25). Después de la primera división, la progenie ‘distal' y 'proximal' de la sinapsis inmunológica se programaron con un fenotipo de memoria y efectora, respectivamente. Estos estudios sugieren que las células T CD8+ de memoria específicos del antígeno se pueden mantener mediante una población de larga vida con características de células madre y la capacidad de auto- renovación. Hasta la fecha, no se ha identificado ninguna población candidata en el ser humano.
La identificación del fenotipo de las células T CD8+ de memoria de larga duración o células madre de memoria tendrá profundas implicaciones en la investigación y terapia de infecciones, cáncer y enfermedades autoinmunitarias. Los inventores han utilizado citometría de flujo multiparamétrica para identificar las poblaciones de células T CD8+ de memoria en seres humanos con características consistentes con el comportamiento de células madre y larga supervivencia. Una característica de las células madre hematopoyéticas y del cáncer es la capacidad de evacuar los fármacos quimioterápicos y los colorantes fluorescentes (26-30). Los presentes inventores descubrieron que las subpoblaciones de células T CD8+ CM y EM también tenían la capacidad de evacuar rápidamente colorantes fluorescentes y fármacos quimioterápicos y los presentes inventores han hecho la hipótesis de que estas células podrían ser responsables de la quimiorresistencia de células T CD8+ de memoria después de incluso quimioterapia mielosupresora. Los estudios in vitro demostraron que los subconjuntos de CM y eM con la capacidad para evacuar rápidamente rodamina 123 (Rh123) (a los que se hace referencia como CMhi y EMhi, respectivamente por la alta capacidad de evacuación) eran más resistentes a la apoptosis que sus equivalentes no evacuantes en respuesta a quimioterapia citotóxica y que la quimiorresistencia se atenuaba por bloqueo de los canales de evacuación del casete co-transportador de unión a aTp.
Los estudios del perfil de expresión genética muestran que las células T CD8+ CMhi y EMhi comprenden subconjuntos similares, aunque distintos. Además, tienen perfiles de expresión genéticas que son únicos y distintos de otras poblaciones de células T CD8+ de memoria o intactas. Estudios adicionales demostraban que el inmunofenotipo de las poblaciones de memoria que evacuaban la Rh123 era similar a las ‘células madre de memoria' en ratones y las ‘células de memoria derivadas del polo distal' después de la división asimétrica de células T CD8+ murinas nativas. Las poblaciones de células T CD8+ que albergan CMhi y EMhi expresan un repertorio de TcR policlonal y las células T CD8+ específicas de antígeno de CMV, EBV y gripe se pueden identificar en estos subconjuntos.
Las células T CD8+ CMhi y EMhi son refractarias a la estimulación policlonal con OKT3, que demuestran una proliferación y secreción de citocinas reducida, en comparación con las células T CD8+ de no evacuación. También presentan una evacuación intracelular de calcio baja en respuesta a la estimulación con ionomicina. La proliferación y secreción de citocinas reducidas se puede rescatar parcialmente con la co-estimulación y citocinas inflamatorias. A pesar de la reducción de la secreción de muchas citocinas inflamatorias, las CMhi y EMhi secretaban IL-17 en respuesta a la estimulación con PMA-ionomicina al contrario que otros subconjuntos de células T CD8+ de memoria.
La naturaleza refractaria de CMhi y EMhi puede permitirlas que permanezcan en un estado inactivo, permitiendo la diferenciación en respuesta a la estimulación antigénica en todas excepto en condiciones inflamatorias. Las observaciones de que las CMhi muestran una alta captación de 3H-timidina y dilución de CFSE en respuesta a las citocinas homeostáticas, IL-7 e IL-15, sugiere que estas células quimiorresistentes pueden proliferar durante el punto más bajo después de la quimioterapia mielosupresora cuando los niveles de IL-7 e IL-15 están elevados, y potencialmente repueblan el compartimento de células T CD8+ de memoria.
Las CMhi y EMhi se encuentran en un número muy bajo en la sangre del cordón umbilical. Se encuentran en un número alto en la juventud y disminuyen con la edad avanzada. Una población que aparece después de la exposición al antígeno al inicio de la vida y que se agota gradualmente con estímulos antigénicos inflamatorios repetidos en la madurez sería consistente con una supuesta célula madre de memoria. Esto sería también consistente con la disminución de eficacia reconocida de la vacunación en sujeto ancianos.
La identificación de CMhi y EMhi se puede conseguir in vitro fácilmente utilizando ensayos de evacuación de Rh123; sin embargo, el uso de Rh123 en los estudios funcionales o de asilamiento en grado clínico es problemático. Por lo tanto, los inventores utilizaron una citometría de flujo paramétrica para buscar los marcadores de superficie celular que pueden distinguir este subconjunto de células en muestras de sangre humana. Los presentes inventores descubrieron que la alta expresión de CD161 y/o IL-18Ra identifica subconjuntos que están enriquecidos en CMhi y EMhi, facilitando la identificación y aislamiento de estas células en ausencia de cultivo in vitro o exposición de las células a la toxicidad de la Rh123.
Existen muchas pruebas que sugieren que las células T CD8+ de memoria tiene un papel en la prevención, control y terapia de las infecciones, el cáncer y las enfermedades autoinmunitarias (1-7). Los estudios de transferencia adoptiva de células T CD8+ en melanoma en estadio IV daba como resultado hasta un 51 % de CR/PR y demostraba que la persistencia de las células T específicas de tumor transferidas era crítica para la eficacia (31, 32). Los hallazgos en los estudios de transferencia adoptiva específica de CMV también demostraban la necesidad de la persistencia, apoyando fuertemente la hipótesis de que el establecimiento de respuestas de memoria a largo plazo puede ser esencial para el control y la protección satisfactorios contra los tumores y la infección por la transferencia adoptiva de células T (33). Estos estudios se complementan con el trabajo en ratones, demostrando el papel crítico
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de células T CD8+ de memoria en la eliminación clínicamente aparente del cáncer y estableciendo un equilibrio saludable en el cáncer oculto (4).
A pesar de las pruebas de que las perturbaciones en las células T CD8+ de memoria son importantes en los procesos patológicos, los intentos para suprimir, aumentar específicamente o transferir memoria inmunitaria específica de antígeno han tenido un éxito limitado. Las respuestas clínicas después de la transferencia de líneas o clones de CD8+ se han presentado previamente, pero han sido esporádicos, en relación con su persistencia in vivo imprevisible (32). Estudios recientes en primates no humanos han demostrado clones CD8+ derivados de CM que pueden persistir hasta un año después de la infusión, mientras que los clones derivados de EM mueren rápidamente por apoptosis, a pesar del hecho de que ambas poblaciones comparten un fenotipo efector antes de la transferencia (34). Esto sugiere que las células T CD8+ efectoras pueden mantener un programa intrínseco, derivado de su célula de origen, que determina su supervivencia in vivo después de la estimulación y la expansión clónica. La implicación es que los clones o líneas tienen que generarse a partir de subconjuntos programados apropiadamente si las células T CD8+ de memoria transferidas son para que persistan in vivo. CMhi y EMhi son subconjuntos con características que sugieren que se programan para una larga supervivencia.
La identificación de los subconjuntos de células T CD8+ de memoria con la programación apropiada para la persistencia facilitará la transferencia de inmunidad mediada por las células T cD8+ contra antígenos específicos. Las células T CD8+ con programación para la persistencia y la supervivencia a largo plazo también pueden ser útiles como vehículos para genes terapéuticos. Además de ser apropiado para el mantenimiento al largo plazo de la inmunidad terapéutica o suministro de genes después de la transferencia adoptiva, las células de memoria de vida larga CMhi y EMhi pueden actuar como dianas para la inmunosupresión por la eliminación de respuestas de memoria específicas de antígeno mediante el uso de CD161 conjugado con toxinas y/o anticuerpos monoclonales IL-18Ra. Esta forma de terapia puede tener un papel en enfermedades autoinmunitarias y enfermedad de injerto contra el huésped.
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Breve sumario de la invención
La identificación de células de memoria de larga duración en seres humanos no ha sido posible hasta la fecha. Los presentes inventores demostraron que la alta expresión de CD161 e IL-18Ra se puede utilizar para identificar las células humanas de memoria de larga duración que evacúan Rh123 en los compartimentos de células T CD8+ CM y/o EM. Estas poblaciones pueden ser útiles como una fuente de células T para la inmunoterapia adoptiva, suministro de genes o como dianas para la supresión de afecciones autoinmunes u otras inmunopatológicas.
La presente invención proporciona métodos para la identificación y aislamiento de supuestos subconjuntos de células T CD8+ de memoria específicas de antígeno viables (CMhi y EMhi) con una alta expresión de superficie de CD161 e IL-18Ra y la capacidad para la evacuación rápida del colorante fluorescente Rh123.
Los presentes inventores proponen que las células CMhi y EMhi se programan para la supervivencia in vivo de larga duración y la quimiorresistencia, consistentes con sus características compartidas con las poblaciones de células madre en otros tejidos. La identificación de un fenotipo distinguible, que incluye la alta expresión en su superficie de CD161 e IL-18Ra que hace posible el aislamiento y la manipulación in vitro de estos subconjuntos de células T. La
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capacidad para aislar y transferir adoptivamente las células T de larga vida en un entorno autólogo, alogénico o Singénico puede hacer posible la transferencia de inmunidad específica de antígeno persistente. Esto puede ser importante en varias aplicaciones, incluyendo, pero sin limitarse a la prevención, control o eliminación del cáncer o la infección. De manera alternativa la supresión de las poblaciones de CMhi y EMhi puede dar como resultado una inmunosupresión potente y el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias o enfermedad del injerto contra el huésped. También se pueden explorar terapias inmunomoduladoras candidatas, tales como vacunas o fármacos inmunosupresores, en ensayos in vitro de alto rendimiento utilizando la invención. La población celular también se puede utilizar como un vehículo de suministro in vivo para los genes terapéuticos.
Establecido de otra manera, un primer aspecto de la invención es una población aislada de células T CD8+ humanas de vida larga que tienen una alta expresión en su superficie de CD161 e IL-18Ra, en el que la población (d) prolifera en respuesta a IL-7, IL-15 o ambas, (b) rápidamente evacúan la Rh123 y (c) comprende células T de memoria central y/o células T efectoras de memoria.
En algunas realizaciones, la población de linfocitos es TcRap+, TcRy5', CD8ahi/int, CD8phi/int/neg, CD45RAint/neg, CD45ROint/hi, CD95int/hi, CD25int/neg, CD27+, CD28+, CD57-, CD127+ CD103-, PD-1neg, bcl-2hi, bcl-xLhi, perforinaint, granzima Aint, granzima Bint/neg y NKG2Dint.
En algunas realizaciones, la población de linfocitos tiene una alta expresión del ARNm de MDR-1.
En algunas realizaciones, la población de linfocitos tiene la capacidad de evacuar activamente el fármaco quimioterápico fluorescente, daunorrubicina.
En algunas realizaciones, la población de linfocitos es resistente a la apoptosis después del cultivo con 0,03-0,3 mM de daunorrubicina y dicha resistencia se suprime por el inhibidor de evacuación PK11195.
Población
En algunas realizaciones, la población de linfocitos demuestra una proliferación ausente o menor en respuesta a la estimulación con 250-1000 ng/ml de OKT3 unido a la placa que es un linfocito T equivalente no evacuante. La proliferación reducida puede recuperarse parcialmente mediante co-estimulación con el anticuerpo anti-CD28 unido a la placa y/o la adición de citocinas que incluyen, pero no se limitan a, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18 e IL-23 o combinaciones de las mismas.
En algunas realizaciones, la población de linfocitos tiene una secreción reducida de IFN-y, IL-2, IL-4, IL-5, IL-8, IL-10 y MIP-1a en comparación con sus equivalentes no evacuantes en respuesta a la estimulación con PMA/ionomicina u OKT3 en combinación con anticuerpo anti-CD28 o citocinas.
En algunas realizaciones, la población de linfocitos tiene una baja, pero heterogénea, evacuación de calcio después de la estimulación con ionomicina.
En algunas realizaciones, la población de linfocitos comprende una célula T de memoria central CD62L+.
En algunas realizaciones, la población de linfocitos presenta una alta captación de 3H-timidina en respuesta a 4 días de cultivo con 0,5-2,0 ng/ml de IL-7 y una mayor dilución de CFSE en respuesta a 8-11 días de cultivo con 0,5-2,0 ng/ml de IL-7, en comparación con su linfocito T equivalente no evacuante.
En algunas realizaciones, la población de linfocitos comprende una célula T de memoria efectora CD62L.
Un aspecto adicional de la invención es la población de linfocitos como se describe en el presente documento para su uso en inmunoterapia, inmunoterapia adoptiva o terapia genética. Un aspecto adicional de la invención es la población celular o la composición de la invención para su uso en un método de transferencia de inmunidad específica de antígeno para el tratamiento del cáncer, una enfermedad infecciosa, o inmunodeficiencia iatrogénica o congénita.
Un aspecto adicional de la invención es una composición que comprende, consiste de o consiste esencialmente en la población de linfocitos que se describe en el presente documento en un vehículo farmacéuticamente aceptable.
También se describe en el presente documento un método de tratamiento de un sujeto humano que necesita el mismo, que comprende la administración de linfocitos como se ha descrito en el presente documento al dicho sujeto en una cantidad de tratamiento eficaz. Los linfocitos pueden ser células autólogas, alogénicas, o singénicas. El método se puede llevar a cabo para inmunoterapia o inmunoterapia adoptiva; el método se puede llevar a cabo cuando el sujeto padece al menos uno de; cáncer, enfermedad infecciosa, o inmunodeficiencia iatrogénica o congénita; el método se puede llevar a cabo para terapia genética; el método se puede llevar a cabo cuando el sujeto padece uno de: un trastorno genético congénito, cáncer, enfermedad infecciosa, o inmunodeficiencia iatrogénica o congénita. Un ejemplo típico del uso en inmunoterapia adoptiva sería el tratamiento en un cuadro de
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trasplante de células madre hematopoyéticas (HSTC) alogénicas o autólogas. En el cuadro de inmunosupresión grave, los pacientes con HSTC autólogas o alogénicas tienen un gran riesgo de contraer infecciones oportunistas. La invención se puede utilizar para transferir memoria inmunitaria al receptor para protegerle contra una infección que potencialmente ponga en peligro su vida. Las células CMhi y EMhi se pueden aislar del donante del trasplante (en el caso de HSTC alogénicas) o el paciente (en el caso de HSTC autólogas), se seleccionan o modifican para su especificidad para antígenos asociados a la infección, expandidas o no, y devueltas al paciente en el cuadro posttrasplante. Los subconjuntos proliferarían con o sin diferenciación en el ambiente linfopénico post-trasplante y reconstituir la memoria inmunitaria. La selección de CMhi y EMhi específicas para las infecciones permitiría la reconstitución de inmunidad sin producir una enfermedad del injerto contra el huésped.
También se describe en el presente documento un método de tratamiento de un sujeto humano necesita el mismo, que comprende la supresión de la evacuación rápidamente y/o los linfocitos CD161 y/o IL-18Rahi en dicho sujeto mediante una cantidad de tratamiento eficaz. La etapa de supresión se puede llevar a cabo in vivo o in vitro. En algunas realizaciones, el sujeto padece o tiene el riesgo de al menos uno de entre: enfermedad autoinmunitaria, enfermedad del injerto contra el huésped o rechazo de un injerto trasplantado. En algunas realizaciones la etapa de supresión se lleva a cabo in vivo por tratamiento directo del paciente; en algunas realizaciones, la etapa de se lleva a cabo ex vivo por agotamiento de células de entre un producto celular o circulación extracorpórea; en algunas realizaciones, la etapa de supresión se lleva a cabo se lleva a cabo suprimiendo dichas células a partir de un injerto de trasplante antes del trasplante. En algunas realizaciones, la etapa de supresión se lleva a cabo administrando anticuerpos policlonales o monoclonales anti-CD161 y/o anti-IL-18Ra, conjugados o no con grupos tóxicos o radioisótopos, tratamiento farmacológico linfotóxico con inhibición de bombas de evacuación, o combinaciones de los mismos.
Un aspecto adicional de la invención es un kit para la identificación o aislamiento de una población celular como se ha descrito en el presente documento, de acuerdo con las reivindicaciones. El kit puede comprender (a) una combinación de anticuerpos conjugados con fluorocromo para permitir la identificación de células T CD8+ de memora efectora o central; (b) anticuerpos conjugados con fluorocromo contra CD161 e IL-18Ra y el isotipo de control apropiado; y opcionalmente (c) Rh123 y un antagonista control negativo de evacuación de Rh123; (d) medio de ensayo apropiado; y (e) instrucciones y envase. Un aspecto adicional es un método para la identificación/enriquecimiento y/o aislamiento de una población de células T CD8+ de memoria humanas de vida larga como se expone en las reivindicaciones.
Los anteriores y otros objetivos y aspectos de la presente invención se explican con mayor detalle en los dibujos del presente documento y la memoria descriptiva posterior.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1: Las poblaciones CM y EM contienen subconjuntos que evacúan rápidamente Rh123 y son CD161hi e IL-18Rahi como se describe en el Ejemplo 1.
Figura 2: Los subconjuntos de CMhi y EMhi son TcRap+ y TcRyó'. No hay restricción a Va24. Son predominantemente CD45RAint/neg, CD45ROint/hi, CD95+, CD8a+, CD8p+/neg, CD27+, CD28+, CD122+, perforinaint/l°, granzima Aint/lo, granzima Bneg, Ki67neg, bcl-xLint/hi y bcl-2int/hi, como se describe en el Ejemplo 2.
Figura 3: CMhi y EMhi tiene un fenotipo de superficie que sugiere una posible derivación desde el polo distal de una célula T CD8+ intacta dividida asimétricamente, como se describe en el Ejemplo 3.
Figura 4: CMhi y EMhi expresan cantidades mayores de ARNm de MDR-1 que sus equivalentes no evacuantes y evacúan activamente la quimioterapia farmacológica fluorescente, daunorrubicina, como se describe en el Ejemplo 4.
Figura 5: CMhi y EMhi son resistentes a la apoptosis inducida por daunorrubicina in vitro, como se describe en el Ejemplo 5.
Figura 6: CMhi y EMhi se dividen en respuesta a las citocinas homeostáticas, IL-7 e IL-15, y tienen una alta viabilidad después del cultivo en ausencia de citocinas suplementarias, como se describe en el Ejemplo 6.
Figura 7: CMhi y EMhi muestran una captación de 3H-timidina reducida en respuesta a la estimulación con TcR policlonal con OKT3, en comparación con sus equivalentes no evacuantes, como se describe en el Ejemplo 7. La captación de 3H-timidina aumenta después de la co-estimulación como se indica en la Figura.
Figura 8: CMhi y EMhi tienen un perfil de secreción de citocinas diferente en comparación con sus equivalentes no evacuantes, como se describe en el Ejemplo 8.
Figura 9: CMhi y EMhi tiene un flujo de calcio disminuido en respuesta a la ionomicina, en comparación con sus equivalentes no evacuantes, como se describe en el Ejemplo 9.
Figura 10: Los subconjuntos CMhi y EMhi comprenden repertorios de TcR policlonales por tipaje espectral molecular, como se describe en el Ejemplo 10.
Figura 11: Las células positivas al antígeno vírico tetramérico se pueden identificar en los subconjuntos CMhi y EMhi y se pueden generar respuestas de CTL específicas de CMV, EBV y gripe a partir de subconjuntos de CMhi y EMhi clasificados, como se describe en el Ejemplo 11.
Figura 12: Los subconjuntos CMhi y EMhi tienen perfiles de expresión genética distintos y únicos como se muestra por el gráfico de componentes principal y como se describe en el Ejemplo 12.
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Figura 13: CMhi y EMhi son raras en el cordón umbilical, tienen un pico en la juventud y se encuentran con una frecuencia descendente con el avance de la edad, como se describe en el Ejemplo 13.
La presente invención se explica con mayor detalle a continuación.
Descripción detallada de las realizaciones preferidas
I. Definiciones
“Células T o “linfocitos T como se utiliza en el presente documento son de seres humanos. En algunas realizaciones las células T son autólogas (el donante y el receptor son el mismo individuo); en algunas realizaciones las células T son alogénicos (el donante y el receptor/es son individuos genéticamente diferentes); en algunas realizaciones, las células T son singénicas (el donante y el receptor/es son individuos diferentes que son genéticamente idénticos).
“Linfocito T citotóxico" (CTL) como se utiliza en el presente documento se refiere a un linfocito T que expresa CD8 en la superficie del mismo (es decir, una célula T cD8+).
Célula T de “memoria central’ (o “CM”) como se utiliza en el presente documento se refiere a un CTL que se ha expuesto anteriormente a un antígeno (un “CTL de memoria”) y es CD62L+, CD4SRAint/neg/CD45ROint/hi y cD9Sint/hi.
Célula T de “memoria efectora" (o “EM”) como se utiliza en el presente documento se refiere a un CTL que se ha expuesto anteriormente a un antígeno (un “CTL de memoria”) que es CD62L-, CD4SRAint/neg/CD4SROint/hi y
CD9Sint/hi.
Los “linfocitos T rápidamente evacuantes" se encuentran entre las poblaciones de células T CD8+ CM y EM (CMhi y EMhi, respectivamente) con algunas o todas las siguientes características de identificación: (a) activa y rápidamente evacúan el colorante Rh123 en el cultivo durante un tiempo de 30 minutos a una temperatura de 37 °C; (b) la expresión alta en superficie de CD161 (CD161hi) y/o IL-18Ra (IL-18Rahi). Dichas células incluyen normalmente, pero no se limitan a, las siguientes características: (a) la alta expresión en superficie de CD137, CD38; (b) normalmente, pero no constantemente, la expresión de marcadores que sugieren la derivación del complejo del polo distal o urópodo de las células T CD8+ mitóticas (expresión de superficie más alta de CD43, CD44, Cd46, Cd148 y CD162 que los subconjuntos no evacuantes; menor expresión de superficie de CD8, CD11a y CD50 que los subconjuntos no evacuantes); (c) CD3+/ TcRap+ / TcRyó'; (d) sin expresión de superficie o baja de CD25, cD57, PD-1, CD103 y CD69; (e) expresión de superficie menor de NKG2D que los subconjuntos no evacuantes; (f) expresión intermedia/alta de CD45RO, expresión intermedia/negativa de CD45RA y expresión de CD95; (g) normalmente, pero no constante mente una expresión mayor de bcl-2 y bcl-xL que sus equivalentes no evacuantes; (h) expresión negativa de granzima B, expresión intermedia de granzima A y expresión baja/intermedia de perforina; (i) expresión normal o baja de CD8a y expresión normal, baja o ausente de CD8p; (j) expresión mayor del ARNm de MDR-1 que en sus equivalentes no evacuantes; (k) menor porcentaje de expresión de Ki67 que sus equivalentes no evacuantes en un individuo sano. Opcionalmente, en algunas realizaciones, los linfocitos evacuantes rápidamente se caracterizan por la expresión en superficie positiva de CD122. Nótese también que la expresión de CD62L es variable y define la presencia de estas células en los subconjuntos de CM o EM. Dichas células también incluyen normalmente, pero no se limitan a, las siguientes características funcionales: (a) baja proliferación en comparación con los subconjuntos no evacuantes en respuesta a la estimulación con OKT3 unido a la placa, que puede aumentar después de la co-estimulación con un anticuerpo anti-CD28 o citocinas; (b) contienen clones específicos de virus, que se evidencian por la unión tetramérica y la capacidad para identificar las células T CD8+ específicas de antígeno después de la expansión in vitro de los subconjuntos clasificados; (c) resistencia a la apoptosis durante el cultivo in vitro en la presencia o ausencia de agentes quimioterápicos; (d) secreción reducida de IFN-y, IL-2, IL-4, IL-5, IL-8, IL-10 y MIP-1a en comparación con sus equivalentes no evacuantes en respuesta a la estimulación con PMA/ionomicina u OKT3 en combinación con anticuerpos anti-CD28 o citocinas; (e) capacidad de evacuación activa del fármaco quimioterápico fluorescente, daunorrubicina; (f) baja salida de calcio, pero heterogénea después de la estimulación con ionomicina; (g) las células CMhi tienen normalmente un aumento de captación de timidina tritiada (3H-timidina) y aumento de la dilución de CFSE en comparación con sus equivalentes no evacuantes en respuesta a IL-7.
“Bloqueadores de evacuación’’ como se utiliza en el presente documento incluye, pero no se limita a, PK11195, ciclosporina A, PSC833, verapamilo.
“Fármaco evacuado” como se utiliza en el presente documento incluye, pero no se limita a, doxorrubicina, daunorrubicina, epirrubicina, metotrexato, mitoxantrona, vinblastina, vincristina, dexametasona y derivados, etopósido y taxanos.
“Antígeno" como se utiliza en el presente documento se refiere a una proteína o péptido que puede ser reconocido por el sistema inmunitario.
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“Específico de antígeno’’ como se utiliza en el presente documento se refiere a la naturaleza del reconocimiento altamente específico por el sistema inmunitario adaptativo de fragmentos peptídicos que se presentan en el contexto de una molécula del MHC.
“Anticuerpo" como se utiliza en el presente documento se refiere a todos los tipos de inmunoglobulinas, incluyendo IgG, IgM, IgA, IgD, e IgE y todos los isotipos de los mismos. De las inmunoglobulinas, IgM e IgG se prefieren particularmente. Los anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales y pueden ser de cualquier especie de origen, incluyendo (por ejemplo) el ratón, rata, conejo, caballo, o humano, o pueden ser anticuerpos quiméricos. Véase, por ejemplo, M. Walker et al., Molec. Immunol. 26, 403-11 (1989). Los anticuerpos pueden ser anticuerpos monoclonales recombinantes producidos de acuerdo con los métodos desvelados en la Patente de EE. UU. N.° 4.474.893 de Reading, o Cabilly et al., Patente de EE. UU. N.° 4.816.567. Los anticuerpos se pueden construir también químicamente mediante anticuerpos específicos fabricados de acuerdo con el método desvelado en SegAl et al., Patente de EE. UU. N.° 4.676.980.
“Enfermedad autoinmunitaria" como se utiliza en el presente documento puede ser cualquier enfermedad autoinmunitaria, incluyendo pero sin limitarse a: lupus eritematoso sistémico, enfermedad de Hashimoto, artritis reumatoide enfermedad de injerto contra el huésped, síndrome de Sjogren, anemia perniciosa, enfermedad de Addison, escleroderma, síndrome de Goodpasture, enfermedad de Crohn, anemia hemolítica autoinmunitaria, esterilidad, miastenia gravis, esclerosis múltiple, enfermedad de Basedow, púrpura trombocitopénica trombótica, púrpura trombocitopénica inmunitaria, diabetes mellitus dependiente de insulina, alergia, asma, enfermedad atópica, arteriosclerosis, miocarditis, cardiomiopatía, nefritis, y anemia hipoplásica. Véase, por ejemplo, la Patente de EE. UU. N.° 7.279.160.
“Cáncer’ como se utiliza en el presente documento puede incluir, pero no se limita a cualquier variación patológica de: cáncer de próstata, mama, vejiga, estómago, orofaringe, nasofaringe, esófago, estómago, páncreas, hígado, riñones, colon, recto, ano, pulmón, tiroides, cerebro, sistema hematopoyético (incluyendo, pero sin limitarse a linfoma de Hodgkin o no Hodgkin, leucemias mieloides y linfoides agudas y crónicas) y piel (incluyendo pero sin limitarse a, carcinoma de células basales, carcinoma de células escamosas y melanoma).
“Donante” como se utiliza en el presente documento se refiere al individuo del que se obtienen los linfocitos T evacuantes rápidamente u otros productos celulares.
“Receptor’ como se utiliza en el presente documento se refiere al individuo que recibe los linfocitos T evacuantes rápidamente u otro tratamiento.
“Enriquecido" como se utiliza en el presente documento para describir las cantidades de tipos celulares en una mezcla se refiere a someter la mezcla de células de un procedimiento o etapa física, que da como resultado un aumento del número del tipo “enriquecido”, en comparación con la misma mezcla antes del proceso o etapa física. Para los tipos celulares que están en una cantidad baja, las células se pueden enriquecer cinco, diez, veinte, treinta, cuarenta, o cincuenta dobles (veces) (por ejemplo, las células enriquecidas estarán en al menos un 1, 5, 10, 20, o 30 por ciento del número total de células T en la preparación, o más, hasta el 40 o 50 por ciento del total de las células de la preparación o más). En otras realizaciones, las células “enriquecidas” pueden enriquecerse hasta un punto en el que lleguen a estar al menos en un 40, 50, 60, 70, u 80 por ciento del total de células en la preparación, o más, hasta el 90, 95, o 99 por ciento del total de las células en la preparación o más).
“Agente tóxico’’ como se utiliza en el presente documento incluye, pero no se limita a, radioisótopos, fármacos terapéuticos, y toxinas o citotoxinas, véase, por ejemplo, la Patente de EE. UU. N.° 6.274.118.
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“Radioisótopo" como se utiliza en el presente documento incluye, pero no se limita a, Ac, At, Sa, Br, Cd,
51Cr, 67Cu, 165Dy, 155Eu, 153Gd, 198Au, 166Ho, 113mIn, 115mIn, 123I, 125I, 123I, 189Ir, 191Ir, 192Ir 194Ir, 52Fe, 55Fe, 59Fe, 177Lu,
109Pd, 32P, 226Ra, 186Re, 188Re, 153Sm, 46Sc, 47Sc, 72Se, 75Se, 105Ag, 89Sr, 35S, 177Ta, 117mSn, 121Sn, 166Yb, 169Yb, 90Y,
212Bi, 119Sb, 197Hg, 97Ru, 100Pd, 101mRh, y 212Pb.
“Fármaco terapéutico’’ como se utiliza en el presente documento incluye, pero no se limita a Adriamicina, Clorambucilo, Daunorrubicina, Leucovorina, ácido folínico, metrotexato, mitomicina C, neocarzinostatina, Melfalan, Vinblastina, Mitocina, mecloretamina, fluorouracilo, floxuridina, idarrubicina, doxorrubicina, Epirrubicina, cisplatino, canustina, ciclofosfamida, bleomicina, vincristina, y citarabina.
“Toxina" o “citotoxina" como se utiliza en el presente documento incluye, pero no se limita a toxina diftérica, toxina de ricino, monensina, verrucarina A, abrina, saporina, alcaloides de la vinca, tricotecenes y endotoxina A de Pseudomonas, y proteína del virus del ombú. Véase, por ejemplo, la Patente de EE. UU. N.° 6.630.576.
“Farmacéuticamente aceptable" como se utiliza en el presente documento significa que el compuesto o composición son adecuados para la administración a un sujeto para conseguir los tratamientos descritos en el presente documento, sin efectos perjudiciales no deseados a la luz de la gravedad de la enfermedad y la necesidad del tratamiento.
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II. Identificación
Identificación de las poblaciones de CM y EM evacuantes de Rh123. Se pueden recolectar las PBMC o linfocitos T de cualquier tejido de acuerdo con técnicas conocidas y cargarse con Rh123 (u otro colorante fluorescente alternativo evacuado de manera similar) con 5-10 mg/ml en RPMI 1640/10 % de BSA (tampón de evacuación) sobre hielo durante 30 minutos, se lava tres veces y se cultiva en el tampón de evacuación durante 30 minutos a 37 °C. Se puede utilizar una muestra de control cultivada en presencia de vinblastina (un antagonista competitivo de la evacuación de Rh123) para establecer un regulador de evacuación activa de Rh123. Las PBMC se pueden marcar en superficie con anticuerpos conjugados con fluorocromo (por ejemplo, contra CD4, CD16, TCRyó, Va24, CD8a, CD95, y CD62L), permitiendo la identificación de poblaciones de CM o EM Rh123l° evacuantes mediante un análisis de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS).
Identificación de poblaciones CM y EM CD161hi y/o IL-18Rahi. La alta expresión de CD161 y/o IL-18Ra en las poblaciones de CM y EM se pueden utilizar como un marcador sustituto de la capacidad para evacuar rápidamente la Rh123 en un cultivo in vitro. Los linfocitos T se pueden recolectar con técnicas conocidas a partir de cualquier tejido y marcarse con anticuerpo conjugados con un fluorocromo contra CD161 y/o IL-18Ra, y otros marcadores (por ejemplo, contra CD4, CD16, TcRyó', Va24, CD8a, CD95 y CD62L), permitiendo la identificación de poblaciones CM(CMhi) o EM (EMhi) CD161hi y/o IL-18Rahi evacuantes mediante un análisis de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS).
III. Aislamiento
Aislamiento de poblaciones CM y EM que evacúan Rh123. Se pueden recolectar PBMC o linfocitos T a partir de cualquier tejido de acuerdo con técnicas conocidas y enriquecerse o agotarse por técnicas conocidas tales como unión por afinidad a anticuerpos tales como en la citometría de flujo, separación inmunomagnética y/o unión por afinidad. Por ejemplo, los cTl CD8+ se pueden aislar por separación inmunomagnética positiva. La fracción de células T CD8+ seleccionadas positivamente se puede cargar con Rh123 (o un colorante fluorescente alternativo evacuado de manera similar) a 5-10 mg/ml en RPMI 1640/10 % de BSA (tampón de evacuación) en hielo durante 30 minutos, se lava tres veces y se cultiva en el tampón de evacuación durante 30 minutos a 37 °C. Se puede utilizar una muestra de control cultivada en presencia de vinblastina (un antagonista competitivo de la evacuación de Rh123) para establecer y regular la evacuación activa de Rh123. Las PBMC se pueden marcar entonces en superficie con anticuerpos conjugados con un fluorocromo (por ejemplo, contra CD4, CD16, TcRyó, Va24, CD8a, cD95 y CD62L), permitiendo la identificación y aislamiento de poblaciones de CMhi CD4/CD167TcRY57Va24/ CD8a+/CD95+/CD62L+/Rh123l° evacuantes o EMhi CD47CD167TcRY57Va247CD8a+/CD95+/CD62L7Rh123l° evacuantes mediante el análisis de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS).
Aislamiento de poblaciones de CM y EM CD161hi y/o IL-18Rahi. La alta expresión de CD161 y/o IL-18Ra en poblaciones de CM y EM se pueden utilizar como un marcador sustituto para la capacidad de evacuación rápida de Rh123 en un cultivo in vitro. Se pueden recolectar los linfocitos T de cualquier tejido de acuerdo con técnicas conocidas y enriquecerlos o agotarlos por técnicas conocidas tales como unión por afinidad a anticuerpos tales como en citometría de flujo, separación inmunomagnética y/o unión por afinidad. Por ejemplo, los CTL CD8+ se pueden aislar por separación inmunomagnética positiva, La fracción de células T CD8+ seleccionadas positivamente se puede marcar con anticuerpos (por ejemplo, contra CD4, CD16, TcRyó, Va24, CD8a, CD95 y CD62L y CD161 y/o IL-18Ra), permitiendo la identificación y aislamiento de CMhi CD4"/CD16"/TcRY5"/Va24"/CD8a+/cD95+/CD62L" /CD161hi o CD47CD167TcRY57Va247CD8a+/CD95+/CD62L7IL-18Rahi evacuantes o EMhi CD47CD167TcRY57Va24‘ /CD8a+/CD95+/CD62L"/CD161hi o CD47CD167TcRY57Va247CD8a+/CD95+/CD62L7 IL-18Rahi evacuantes mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS).
IV. Kits
Los kits útiles para llevar a cabo todo o partes de los métodos de la invención (particularmente las etapas de identificación o aislamiento de poblaciones celulares) pueden tener cualquiera de una variedad de formas. Normalmente, los kits incluirían los anticuerpos o conjugados de anticuerpos necesarios para el procedimiento. El aislamiento de estas células es un procedimiento multietapa. Son posibles muchas combinaciones de kits, dependiendo del producto deseado (células CMhi CD8+ puras, células EMhi CD8+ puras o células CMhi y EMhi CD8+ enriquecidas) y el método de identificación de CMhi y EMhi (evacuantes de Rh123 y/o CD161hi y/o IL-18Rahi). El kit se puede utilizar para la identificación y análisis, aislamiento de grado no clínico o grado clínico de la evacuación de Rh123 o poblaciones no evacuantes. El kit se puede empaquetar en cualquier recipiente adecuado y opcionalmente incluye instrucciones para llevar a cabo todos o partes de los métodos descritos en el presente documento. Por lo tanto, un kit podría incluir, pero no se limita a, cualquiera de los componentes necesarios para cualquier combinación de las siguientes etapas:
i) Identificación inicial, enriquecimiento y/o aislamiento de células T CD8+ de memoria (selección
inmunomagnética positiva o negativa o clasificación celular).
ii) Eliminación de células contaminantes después de la separación inmunomagnética (por ejemplo, anticuerpos
contra células T CD8+, conjugados de fluorocromo estreptavidina, conjugados de cabra anti-ratón con
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fluorocromo).
iii) identificación, enriquecimiento y/o aislamiento de subconjuntos CM o EM (por ejemplo, CD95 y CD62L conjugados con fluorocromo).
iv) Identificación, enriquecimiento y/o aislamiento de evacuantes (Rh123/tampón de evacuación/agentes de bloqueo de evacuación) o poblaciones de CD161hi y/o IL-18Rahi.
V. Composiciones y métodos para la terapia
Las células CMhi y EMhi se pueden utilizar en un cuadro autólogo, alogénico o singénico. Las poblaciones de CMhi y EMhi se pueden utilizar o dirigir para, pero sin limitación, las siguientes indicaciones:
a) para la transferencia de inmunidad específica de antígeno en el cáncer, enfermedades infecciosas o inmunodeficiencia
b) para la supresión dirigida de inmunidad en enfermedades autoinmunitarias, enfermedad del injerto contra el huésped o rechazo de injertos
c) para suministro genético terapéutico
VI. Transferencia de inmunidad específica del antígeno
En algunas realizaciones, los linfocitos de la invención se pueden utilizar para conferir inmunidad a los individuos. Por “inmunidad” se quiere decir un aumento de uno o más factores asociados con una respuesta a la infección por un patógeno, o contra un tumor, a que se dirige la respuesta linfocítica.
Los sujetos que se pueden tratar mediante la presente invención son los seres humanos. Los sujetos pueden ser masculinos o femeninos y pueden ser de cualquiera edad adecuada, incluyendo sujetos infantiles, juveniles, adultos y geriátricos.
Los sujetos que se pueden tratar incluyen los sujetos que padecen cáncer, incluyendo, pero sin limitarse a canceres hematopoyéticos, cánceres del colon, pulmón, hígado, mama, próstata, ovario, piel (incluyendo melanoma), hueso, y cerebro, etc. En algunas realizaciones, se conocen los antígenos asociados a tumores, incluyendo, pero sin limitarse a melanoma, cáncer de mama, carcinoma de células escamosas, cáncer de colon, leucemia, mieloma y cáncer de próstata (en estas realizaciones las células T de memoria se pueden aislar o modificar introduciendo los genes del receptor de células T). En otras realizaciones, se pueden direccionar los antígenos asociados al tumor con células T modificadas genéticamente que expresan un inmunorreceptor modificado. Ejemplos incluyen, pero no se limitan a linfoma de células B, cáncer de mama, cáncer de próstata, y leucemia.
Los sujetos que se pueden tratar también incluyen sujetos que padecen, o tienen el riesgo de desarrollar, una enfermedad infecciosa, incluyendo, pero sin limitarse a infecciones víricas, bacterianas, y protozoarias.
Los sujetos que se pueden tratar incluyen pacientes inmunodeficientes, que incluyen, pero no se limitan a pacientes trasplantados, que padecen una infección vírica. Dichas infecciones víricas pueden incluir, pero no se limitan a, citomegalovirus (CMV), virus de Epstein Barr (EBV), adenovirus, gripe o parainfluenza, varicela, virus del herpes humano tipo 6 (HHV6) o HHV7, virus respiratorio sincitial (RSV) o infecciones por poliomavirus BK.
Las células preparadas como se ha descrito anteriormente se pueden utilizar en métodos y composiciones para inmunoterapia adoptiva de acuerdo con técnicas conocidas, o variaciones de las mismas que serán evidentes para los expertos en la técnica basándose en la presente divulgación (véase, por ejemplo, la Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU. N.° 4.690.915 de Rosenberg; véase también la Patente de EE. UU. N.° 6.040.177 de Riddell).
Se pueden utilizar CMhi y EMhi para la terapia de receptores autólogos, alogénicos o singénicos y se pueden recolectar en presencia o ausencia de estimulación in vivo, y se administran con o sin modificación in vitro o estimulación in vivo después de la administración.
La estimulación in vivo antes de la recolección de CMhi y/o EMhi puede implicar, pero no se limita a, el uso de fármacos, vacunas o citocinas. La modificación in vitro puede implicar, pero no se limita a, por cultivo u otros métodos, cualquier combinación de enriquecimiento de subconjuntos, enriquecimiento específico de antígenos, expansión, tratamiento con células alimentadoras (por ejemplo, LCL o PBMC radiados), tratamiento con citocinas, tratamiento con anticuerpos, tratamiento con pequeñas moléculas o transducción con genes de TcR específicos de antígenos u otros genes terapéuticos, suicidas y/o inactivados. La estimulación in vivo puede implicar, pero no se limita a, vacunación con vacunas comerciales o investigación de reactivos celulares o no celulares, administración de citocinas o administración de fármacos.
Las células CMhi o EMhi se pueden infundir con o sin aislamiento y enriquecimiento. El uso y método de enriquecimiento o aislamiento reflejará las necesidades del producto. En algunas realizaciones, las células se formulan cultivándolas primero a partir del donante o su medio de cultivo, y después lavando y concentrando las células en un medio y sistema de envase adecuado para la su administración (un vehículo “farmacéuticamente
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aceptable”) en una cantidad de tratamiento eficaz. El medio de infusión adecuado puede ser una formulación de medio isotónico, tal como solución salina normal, Normosol R (Abbott), Plasma-Lyte A (Baxter), 5 % de dextrosa en agua o lactato de Ringer. El medio de infusión se puede suplementar con seroalbúmina humana, suero humano u otros nutrientes.
La cantidad de células que se van a infundir es variable y puede variar desde <10 células específicas de antígeno en ausencia de enriquecimiento o expansión in vitro hasta más de 1012 células después del enriquecimiento y la expansión in vitro (véase, por ejemplo, la Patente de EE. UU. N.° 6.040.177 de Riddell et al. en la columna 17). Las células se pueden administrar por una única infusión o mediante múltiples infusiones durante un intervalo de tiempo. Sin embargo, como se espera que los diferentes individuos varían en su respuesta, el tipo y cantidad de células infundidas, la vía de administración, el número de infusiones y el periodo de tiempo en el que se dan las múltiples infusiones se determinan por el medico encargado según dicten las circunstancias y el examen físico y de laboratorio.
Un ejemplo típico del uso de la invención en la inmunoterapia adoptiva sería el tratamiento en el cuadro de trasplante de células madre hematopoyéticas (HSCT) alogénicas o autólogas. En el cuadro de inmunosupresión severa, los pacientes con HSCT alogénicas y autólogas tienen un gran riesgo de contraer infecciones oportunistas. La invención se puede utilizar para transferir la memoria inmunitaria al receptor para protegerle contra una infección que potencialmente ponga en peligro su vida. Las células CMhi y EMhi pueden aislarse del donante del trasplante (en el caso de HSCT alogénicas) o del paciente (en el caso de HSCT autólogas), seleccionadas o modificadas para que tengan especificidad para los antígenos asociados con la infección, expandidas o no, y devolverse al paciente en el cuadro después del trasplante. Los subconjuntos que proliferarían con o sin la diferenciación en el ambiente linfopénico después del trasplante, y reconstituir la memoria inmunitaria. La selección de CMhi y EMhi específicas de las infecciones permitiría la reconstitución de la inmunidad sin producir una enfermedad del injerto contra el huésped.
VII. Supresión dirigida
También se describe en el presente documento un método de supresión de las células T CD8+ de memoria de vida larga en un sujeto humano agotando selectivamente activamente las células CMhi y/o EMhi evacuantes en el sujeto como tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria o enfermedad del injerto contra el huésped. El agotamiento selectivo se puede llevar a cabo mediante cualquier técnica adecuada, tal como por administración al sujeto de un anticuerpo que se une selectivamente a CD161 y/o IL-18Ra en una cantidad eficaz para tratar la enfermedad o administrando inhibidores de la evacuación farmacológica en combinación con fármacos citotóxicos.
El anticuerpo, sea monoclonal o policlonal de cualquier isotipo, o la composición farmacéutica que contiene el mismo, se puede formular en múltiples vehículos diferentes, o conjugarse con muchas toxinas posibles, incluyendo, pero sin limitarse a radioisótopos, toxina de ricino o diftérica, como se conoce en la técnica. El anticuerpo se podría administrar por distintas vías incluyendo, pero sin limitarse a, la vía intravenosa, intraperitoneal, intracisternal. Un anticuerpo terapéutico de la invención se administra en una cantidad eficaz para tratar la enfermedad, con una programación adecuada, aunque puede variar de alguna manera con la enfermedad en particular, la formulación, la vía de administración, y la afección del sujeto, como se conoce en la técnica.
Las CMhi y EMhi se pueden suprimir mediante la administración de fármacos citotóxicos en combinación con inhibidores de la evacuación farmacológica. Los estudios in vitro muestran que CMhi y EMhi se protegen de la apoptosis inducida por quimioterapia y esta protección se pierde en presencia de la inhibición del co-transportador ABC (bomba de evacuación farmacológica). La prevención de la evacuación del fármaco citotóxico desde CMhi y EMhi puede utilizarse para reducir o suprimir estas poblaciones celulares in vivo. Los fármacos citotóxicos y los inhibidores de la evacuación farmacológica se pueden administrar en protocolos reconocidos o nuevos como se conoce en la técnica.
VIII. Suministro de genes terapéuticos
En algunas realizaciones, los linfocitos de la invención se pueden utilizar para suministrar genes terapéuticos a los individuos. Los genes terapéuticos podrían incluir, por no se limitan a, genes que codifican moléculas coestimulantes (por ejemplo, CD80) o inhibidoras (PD-L1), citocinas (por ejemplo, IL-7), señales inductoras de apoptosis o genes anormales (por ejemplo, el gen del Factor VIII en hemofilia grave). El suministro de células T transfectadas con los genes que codifican TcR específicos de antígeno se ha expuesto anteriormente en “Transferencia de inmunidad específica de antígeno”.
El aislamiento, modificación in vitro, formulación y administración del suministro genético terapéutico engloba consideraciones similares a las expuestas anteriormente en “transferencia de inmunidad específica de antígeno”. El suministro genético a las células T aisladas sería probablemente llevada a cabo in vitro, per o puede incluir métodos para dirigir células de memoria de larga duración in vivo. La utilización de particular víricas infecciosas recombinantes para el suministro genético es una estrategia preferida para la transducción de linfocitos T de la presente invención. Los vectores víricos que se han utilizado de esta manera incluyen vectores víricos derivados del
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virus 40 del simio, adenovirus, virus adeno-asociados (AAV), retrovirus y lentivirus y modificaciones de los mismas. Por lo tanto, los métodos de transferencia genética y expresión son numerosos por funcionan esencialmente para introducir y expresar material genético en células de mamífero. Varias de las técnicas anteriores, entre otras, se han utilizado para transducir células hematopoyéticas o linfoides, incluyendo la transfección en fosfato de calcio, fusión de protoplastos, electroporación, e infección con vectores de adenovirus, virus adeno asociados y retrovirus recombinantes. Los linfocitos T primarios se han transducido satisfactoriamente por electroporación, infección retrovírica e infección lentivírica.
Experimentación
Ejemplo 1: Las poblaciones de CM y EM contienen subconjuntos que evacúan rápidamente Rh123 y son CD161hly IL-18Rahi
Las PBMC se separaron de la sangre periférica reciente por centrifugación en gradiente de densidad, se lavaron en RPMI 1640/un 10 % de seroalbúmina bovina (conocido en el presente documento como tampón de evacuación) y se resuspendieron a 1 x 106/ml en tampón de evacuación frío en hielo con 10 mg/ml de Rh123. Las PBMC se incubaron durante 30 minutos en hielo antes de lavarlas tres veces en tampón de evacuación enfriado en hielo y se resuspendieron en tampón de evacuación pre-calentado, con o sin vinblastina, durante 30 minutos a 37 °C. A los 30 minutos, las PBMC se lavaron una vez en PBS/0,2 % de BSA enfriado en hielo (tampón FACS) y se marcaron con anticuerpo contra CD4, CD16, TcRyó, Va24, CD3, CD8a, CD95, CD62L, CD161 e lL-18Ra durante 20 minutos en hielo. Después del lavado en tampón FACS enfriado en hielo, las muestras se analizan en un citómetro de flujo BD FacsARIA.
Se identificaron los subconjuntos CM y EM como eventos CD62L+ o CD62L-, respectivamente, en la población CD4- /CD16'/TcRY57Va247CD3+/CD8+/CD95+. La fluorescencia de Rh123 se identificó con la compensación apropiada y un filtro de emisión 530/30 después de una excitación de láser a 488 nm. Los eventos de evacuación de Rh123 se definieron como los de una fluorescencia menor de la intensidad fluorescente media identificada después del cultivo en presencia de un bloqueo de evacuación de vinblastina.
Los resultados de la Figura 1 demuestran que muchos linfocitos tienen la capacidad de evacuar Rh123; sin embargo, solo los pequeños subconjuntos de linfocitos T CD8+ CM y EM tienen la capacidad de evacuar rápidamente Rh123 durante un periodo de 30 min. La evacuación se bloquea por la vinblastina, un sustrato no fluorescente para MDR-1 y MRP-1, demostrando una especificidad por la Rh123. Las células CM y EM que evacúan rápidamente la Rh123 expresan altos niveles de IL-18Ra y CD161.
Ejemplo 2: Subconjuntos de CMhi y EMhi son TcRafi y TcRy5. No hay restricción para Va24. Son predominantemente CD45RAint/neg, CD45ROint/hi CD95+, CD8a+, CD8@+/neg CD25neg, CD27+, CD56pos/neg, CD57neg, CD28hi, CD122+, CD127hi, PD-1neg, CD103neg, NKG2Dint/l°, perforinalo/int, granzima Aint, granzima Bneg, Ki67neg, bcl-xLhi y bcl-2hi.
Las PBMC se separaron de la sangre periférica reciente por centrifugación en gradiente de densidad y se resuspendieron en PBS. Se llevó a cabo el marcado con anticuerpos contra CD4, CD16, TcRyó, Va24, CD3, CD8a, CD95, CD62L, CD161 y otros anticuerpos como se indica durante 20 minutos en hielo. Después del lavado en PBS frío, se analizaron las muestras marcadas en su superficie en un citómetro de flujo BD LSR-2. Las muestras para la tinción intracelular se fijaron en BD Cytofix antes del lavado, la permeabilización y el marcado con el tampón BD Perm/wash, entonces se analizó como anteriormente.
Los subconjuntos de CMhi y EMhi se identificaron como eventos CD62L+/CD161hi o CD62L'/CD161hi, respectivamente, en las poblaciones CD47CD167TcRYÓ7Va247CD3+/CD8+ y CD95+.
Los resultados de las Figuras 2a-c) demuestran el fenotipo único de los subconjuntos de CMhi y EMhi de células T CD8+ TcRap+. El fenotipo es consistente con una población de memoria y es similar a las células madre de memoria murinas como las descritas por Zhang et al (Nat Med, 2005). El fenotipo es diferente del esperado para otras poblaciones linfoides caracterizadas, tales como las células NK y células NKT invariantes. Las CMhi y EMhi tienen un fenotipo similar, pero se pueden diferenciar inmunofenotípicamente por la expresión de CD62L. Solamente el fenotipo de EMhi se muestra por claridad en las Figuras 2a) y b). La Figura 2c) se muestra para ilustrar la alta expresión de bcl-2 y bcl-xl y una menor expresión de Ki67 en CMhi y EMhi en comparación con CMlo y EMlo a partir de todos los donantes ensayados.
Ejemplo 3: Las CMhi y EMhi tienen un fenotipo de superficie que sugiere una derivación desde el polo distal de una célula T CD8+ que se divide asimétricamente o urópodo de una célula T CD8+ polarizada.
Las PBMC se separaron de la sangre periférica reciente por centrifugación en gradiente de densidad, se lavaron en tampón de evacuación y se resuspendieron a 1 x 106/ml en tampón de evacuación enfriado en hielo con 5 mg/ml de rodamina123. Las PBMC se incubaron durante 30 minutos en hielo antes de lavarlas tres veces en tampón de evacuación enfriado en hielo y se resuspendieron en tampón de evacuación pre-calentado durante 30 minutos a 37
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°C. A los 30 minutos, las PBMC se lavaron una vez con PBS/un 0,2 % de BSA (tampón FACS) enfriado en hielo y se marcaron con anticuerpos contra CD3, CD4, CD8, CD45a, CD45RA, CD45RO, CD62L, cD161 y o bien CD11a, CD43, CD44, CD46, CD148 o CD162 durante 20 minutos en hielo. Después de lavarlas en tampón FACS enfriado en hielo, se analizaron las muestras en un citómetro de flujo FacsARIA BD. Los subconjuntos de CM y EM se identificaron como eventos CD62L+ o CD62L-, respectivamente, en la población CD4-/CD16-/CD3+/CD8+/ CD45RAint/neg/CD45RO+. El establecimiento de la evacuación rápida se llevó a cabo como se describe en el Ejemplo 1.
La Figura 3 indica que CMhi tiene un fenotipo consistente con una derivación del polo distal de 'memoria' de una célula T CD8+ o urópodo de una célula T CD8+ polarizada. El fenotipo de CMhi es similar la fenotipo de EMhi - solo los perfiles de FACS modulan las células T cD8+ CM y se muestran por claridad. Los MFI de las poblaciones de CMhi y CMlo se muestran en rojo. Después de la señalización con TcR en presencia de la co-estimulación apropiada y/o moléculas de adhesión, se forma una sinapsis inmunitaria entre el ApC y la célula T. El CD8 y CD11a (entre otras proteínas de la superficie celular) localizan activamente la sinapsis inmunitaria (“Marcadores proximales”) y el CD43, CD44, CD46, CD148 y CD162 se excluyen de la sinapsis y forman el complejo del polo distal (“Marcadores distales”). Una estructura similar al complejo del polo distal, el urópodo, también se forma con la estimulación de algunas células T con quimiocinas y tiene un patrón de expresión celular similar de los marcadores de superficie celular. Se desconoce si estas moléculas de superficie se mantienen localizadas en o fuera de la sinapsis inmunitaria o urópodo hasta o más allá de la primera división celular; sin embargo, el fenotipo de CMhi y EMhi, aunque de manera variable, podrían ser consistentes con poblaciones celulares que se derivan del polo distal de una célula de memoria en división o el urópodo.
Ejemplo 4: Las CMhi y EMhi expresan niveles más altos de ARNm de MDR-1 que sus equivalentes no evacuantes y evacúan activamente el fármaco quimioterápico, daunorrubicina
En la Figura 4a), CMhi y EMhi y sus equivalentes IL-18Ralo/neg no evacuantes (CMlo y EMlo) se aislaron utilizando una selección inmunomagnética negativa de células T CD8+, CD95, CD62L e IL-18Ra y se clasifican en un clasificador de flujo FacsARIA BD. Las células T CD8+ CM y EM se definieron como estreptavidina-/CD95+/CD62L+ o estreptavidina-/cD95+/CD62L-, respectivamente. Las CMhi y EMhi se definieron por la alta expresión de IL-18Ra. La expresión de mdr1 en subconjuntos CMhi, CMlo, EMhi y EMlo aislados se determinó por una reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa, utilizando los siguientes cebadores y sondas: MDR1 directo - GGA AGC CAA TGC CTA TGA CTT TA; MDR1 inverso - GAA CCA CTG CTT CGC TTT CTG; MDR1 sonda -6FAM-TGA AAC TGC CTC ATA AAT TTG ACA CCC TGG-TAMRA. Los resultados que se muestran se normalizaron respecto a la expresión de GAPDH. Se muestra la media/EE de 3 donantes normales.
En La Figura 4b), las PBMC se suspendieron a 1 x 106/ml en tampón de evacuación y se cargaron con el fármaco quimioterápico fluorescente, daunorrubicina, a 2,5 mM durante 20 minutos a 37 °C, antes de lavar tres veces y evacuar con o sin vinblastina 25 mM durante 1 hora a 37 °C. Las PBMC se lavaron entonces una vez con PBS/un 0.2 % de BSA (tampón FACS) enfriado en hielo y se marcaron con los anticuerpos contra CD16, CD3, CD8a, CD95, CD62L y CD161 o IL-18Ra durante 20 minutos en hielo. Después de lavarlas en tampón FACS enfriada en hielo, las muestras se analizaron en un citómetro de flujo BD LSR-2.
Los datos indican que CMhi y EMhi expresan altos niveles de ARNm de MDR-1, el casete de unión a ATP (ABC) co- transportador responsable de la evacuación específica y activa de Rh123 y daunorrubicina. La capacidad de CMhi y EMhi (definidos por alta expresión de IL-18Ra o CD161) para evacuar activa y específicamente un fármaco quimioterápico se muestra por la inhibición de evacuación en presencia de un agonista competitivo de la proteína MDR-1, la vinblastina. La inhibición se conseguía también con otros dos bloqueadores del canal de mDR-1, el PK11195 y ciclosporina A (datos no mostrados).
Ejemplo 5: Las CMhi y EMhi son resistentes a la apoptosis inducida por la daunorrubicina in vitro
CMhi y EMhi y sus equivalentes IL-18Ralo/neg no evacuantes (CMlo y EMlo) se aislaron utilizando una selección inmunomagnética de células T CD8+ con anticuerpos biotinilados contra células T no CD8+, seguido por marcado de superficie con estreptavidina conjugada con fluorocromo para identificar células T no CD8+, CD95, CD62L y IL-18Ra y se clasificaron en un clasificador de flujo FacsARIA BD. Las células T CD8+ CM y EM se definieron como estreptavidina- /CD95+/CD62L+ o estreptavidina-CD95+/CD62L-, respectivamente. Las CMhi y EMhi se definieron por la alta expresión de IL-18Ra. Los subconjuntos CM y EM se cultivaron durante 44 horas en presencia o ausencia de daunorrubicina (un agente quimioterápico de las antraciclinas, evacuado por el co-transportador ABC-B1, MDR-1), con o sin bloqueo de MDR-1 con el antagonista del receptor de benzodiacepina periférico, PK11195 Los cultivos se recolectaron, se lavaron dos veces con PBS frío y se tiñeron con Anexina V y DAPl antes del análisis.
Los resultados de la Figura 5 indica que los subconjuntos CMhi y EMhi son resistentes a la apoptosis inducida por el cultivo con daunorrubicina a concentraciones farmacológicas (0,1 uM). La quimiorresistencia está medida por bombas de evacuación ya que la inhibición de MDR-1 con PK11195 da como resultado un aumento de la muerte celular. El cultivo con PK11195 solo no altera la viabilidad.
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Ejemplo 6: Las CMhi y EMhi se dividen en respuesta a las citocinas homeostáticas, IL-7 e IL-15, y tienen alta viabilidad después del cultivo en ausencia de citocinas suplementarias
En las Figuras 6a-c), las PBMC se separaron de la sangre periférica reciente por centrifugación en gradiente de densidad. Las células T CD8+ se seleccionaron positivamente utilizando Microperlas CD8 (Miltenyi) y se resuspendieron a 1 x 106/ml en tampón de evacuación enfriado en hielo con 10 mg/ml de Rh123. Las células T CD8+ se incubaron durante 30 minutos en hielo antes de lavarlas tres veces en tampón de evacuación enfriado en hielo y se resuspendieron en tampón pre-calentado durante 30 minutos a 37 °C. Se añadió vinblastina a las muestras de control para establecer la presencia de la evacuación. Las células T CD8+ se lavaron entonces una vez en PBS/un 0,2 % de BSA (tampón FACS) enfriado en hielo y se marcó con anticuerpos conjugados con fluorocromo contra CD4, CD16, TcRyó, Va24, CD8a, CD95, CD62L y CD161. Los subconjuntos de CMhi y EMhi se identificaron como eventos CD62L+/Rh123lo/CD161hi o CD62L-/ Rh123lo/CD161hi, respectivamente, en la población CD47CD16-/ TcRyó' / Va24-/CD8+. Los subconjuntos CMlo y EMlo se identificaron como eventos CD62L+/Rh123hi/CD161int/neg o CD62L- /Rh123hi/CD161int/neg, respectivamente, en la población CD4-/CD167TcRY57Va247CD8+/CD95+. La estrategia de regulación se muestra en la Figura 6a). Los subconjuntos se aislaron utilizando un clasificador de flujo BD FacsARIA y la proliferación en repuesta a IL-7 se determinaron por la captación de 3H-timidina o ensayos de dilución CFSE. La proliferación en respuesta a IL-15 se determinó por el ensayo de dilución de CFSE. El ensayo de proliferación con 3H-timidina se llevaron a cabo recolectando y contando. El ensayo de dilución CFSE se llevó a cabo cargando las células con CFSE y cultivándolas durante 10 días, antes del marcado de viabilidad con DAPI y el análisis en un citómetro de flujo BD LSR2.
En la Figura 6d), las PBMC de los donantes sanos no linfopénicos (n = 8) o pacientes de leucemia mieloide aguda linfopénicos (n = 6) en el declive (día 11 a día 22) de la terapia de inducción se analizaron en cuanto a la expresión de Ki67 nen los subconjuntos de memoria como se describe en el Ejemplo 2. Se representan las veces de cambio del porcentaje de la expresión de Ki67 en los subconjuntos de células T CD8+ entre los donantes sanos no linfopénicos y pacientes linfopénicos.
Los resultados indican que los subconjuntos CMhi y EMhi tienen la capacidad de entrar en el ciclo celular y someterse a división en respuesta a la estimulación con IL-7 (Figura 6b) y IL-15 (Figura 6c) Las CMhi y EMhi también se reclutan más eficazmente en el ciclo celular que las CMlo y EMlo en pacientes con quimioterapia linfopénica (Figura 6d), sugiriendo la alta sensibilidad a la proliferación mediada por IL-7 e IL-15 inducidas por la linfopenia. Además, las CMhi y EMhi mantiene una viabilidad mayor en cultivo en ausencia de citocinas suplementarias que sus equivalentes no evacuantes (Figura 6b). La IL-7 e IL-15 son críticas para el mantenimiento a largo plazo de la memoria y la supervivencia de las células T de memoria y los subconjuntos de CMhi y EMhi son sensibles a la señalización por IL-7 e IL-15.
Ejemplo 7: Las CMhi y EMhi muestran una captación reducida de 3H-timidina, en comparación con sus equivalentes no evacuantes, en respuesta a la estimulación del TcR policlonal con OKT3 y se puede rescatar después de la coestimulación como se indica en la Figura 7.
Se aislaron las CMhi, CMlo, EMhi y EMlo como se describe en el Ejemplo 6. Las PBMC se separaron de la sangre periférica reciente por centrifugación en gradiente de densidad. Las células T CD8+ se seleccionaron positivamente utilizando perlas paramagnéticas CD8 y se resuspendieron a 1 x 106/ml en tampón de evacuación enfriado en hielo con 10 pg/ml de Rh123. Las células T CD8+ se incubaron durante 30 minutos en hielo antes de lavarlas tres veces en tampón de evacuación enfriado en hielo y se resuspendieron en tampón de evacuación pre-calentado, con o sin vinblastina, durante 30 minutos a 37 DC. A los 30 minutos, las células T CD8+ se lavaron una vez en PBS/0,2 % de BSA (tampón FACS) enfriado en hielo y se marcaron con anticuerpos conjugados con fluorocromo contra CD4, CD16, TcRyó, Va24, CD8a, CD95 y CD62L y CD161. Los subconjuntos de CMhi y EMhi se identificaron por los eventos CD62L+/Rh123lo/CD161hi o CD62L7 Rh123lo/CD161hi, respectivamente, en la población CD47CD167 TcRyó ' / Va247CD8+. Los subconjuntos CMlo y EMlo se identificaron como eventos CD62L+/Rh123hi/CD161hi/CD161int/neg o CD62L- /Rh123hi/CD161in'/neg, respectivamente, en la población CD47CD167 TcRy57 Va247CD8+/CD95+. Los subconjuntos se asilaron utilizando un clasificador de flujo BD FacsARIA y se cultivaron en placas de 96 pocillos a 10.000-30.000 por pocillo en 200 pl de CTL en las condiciones indicadas. Se unió OKT3 a la placa incubándolo a 1000 ng/ml en 100 pl de PBS por pocillo durante 6 horas a 4 DC, entonces se lavaron dos veces con 200 ul de PBS frío antes de colocar en placas los subconjuntos clasificados. El anti-CD28 se unió a la placa junto con el OKT3 (a 5 pg/ml), como anteriormente. Las concentraciones de citocinas eran las siguientes: IL-7, 2 ng/ml; IL-12, 10 ng/ml; IL- 15, 1 ng/ml, IL-18, 80 ng/ml; IL-23, 10 ng/ml. El cultivo con citocinas en ausencia de co-estimulación de citocinas daba como resultado una proliferación mínima. Los datos para la proliferación del subconjunto CMhi con IL-12 sola o OKT3/IL-12 no está disponible.
Ejemplo 8: CMhi y EMhi tienen un perfil de secreción de citocinas diferente en comparación con sus equivalentes no evacuantes
Se aislaron las CMhi, CMlo, EMhi y EMlo como se describe en el Ejemplo 6. Las PBMC se separaron de la sangre periférica reciente por centrifugación en gradiente de densidad. Las células T CD8+ se seleccionaron positivamente utilizando perlas paramagnéticas CD8 y se resuspendieron a 1 x 106/ml en tampón de evacuación enfriado en hielo
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con 10 |jg/ml de Rh123. Las células T CD8+ se incubaron durante 30 minutos en hielo antes de lavarlas tres veces en tampón de evacuación enfriado en hielo y se resuspendieron en tampón de evacuación pre-calentado, con o sin vinblastina, durante 30 minutos a 37 DC. A los 30 minutos, las células T CD8+ se lavaron una vez en PBS/0,2 % de BSA (tampón FACS) enfriado en hielo y se marcaron con anticuerpos conjugados con fluorocromo contra CD4, CD16, TcRy5, Va24, CD8a, CD95 y CD62L y CD161. Los subconjuntos de CMhi y EMhi se identificaron por los eventos CD62L+/Rh123lo/CD161hi o CD62L"/ Rh123lo/CD161hi, respectivamente, en la población CD47CD167 TcRyS ' / Va24"/CD8+. Los subconjuntos CMlo y EMlo se identificaron como eventos CD62L+/Rh123hi/CD161hi/CD161int/neg o CD62L" /Rh123hi/CD161in'/neg, respectivamente, en la población CD47CD167 TcRy57 Va247CD8+/CD95+. Los subconjuntos se asilaron utilizando un clasificador de flujo BD FacsARIA y se colocaron en placas en 200 jl de medio CTL a 60.000 células por pocillo. La estimulación policlonal se llevó a cabo cultivando subconjuntos aislados con PMA (5 ng/ml)/ionomicina (1 jg/ml) u OKT3/anti-CD28 unidos a la placa (preparados como se describe en el Ejemplo 7) durante 20 horas. La secreción de citocinas se detectó en el sobrenadante del cultivo utilizando un ensayo Luminex Cytokine Array.
Estos experimentos muestran que CMhi y EMhi secretan menos IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IFN-y y MIP-1a y más IL- 17 que sus equivalentes no evacuantes en respuesta a la estimulación policlonal.
Ejemplo 9: CMhi y EMhi tienen una salida de calcio disminuida en respuesta a ionomicina, en comparación con sus equivalentes no evacuantes
Las PBMC se separaron de la sangre periférica reciente por centrifugación en gradiente de densidad a temperatura ambiente y se incubaron a 1 x 107/ml en medio CTL suplementado con Indo-1AM (Sigma), 10 jM y probenecid 4 mM durante 30 minutos a 37 DC. Las PBMC se lavaron una vez en medio CTL a 25 DC. Se llevó a cabo el marcado en superficie en medio CTL con los anticuerpos contra CD4, CD16, TcRy5, Va24, CD8a, CD62L y CD161 durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después del lavado con medio CTL a temperatura ambiente, se calentaron las muestras marcadas en su superficie a 37 DC durante 4 minutos antes de la adquisición a alta velocidad en un citómetro de flujo BD LSR-2 equipado con láseres UV, violeta, azul, verde y rojo. Después de los 30 segundos de adquisición, la muestra se retiró del puerto de adquisición, se añadió ionomicina a una concentración final de 5 jg/ml, se devolvió la muestra y se continuó la adquisición a 20.000 eventos/segundos. Los subconjuntos CMhi y EMhi se identificaron como eventos CD62L+/CD161hi o CD62L"/CD161hi, respectivamente, en las poblaciones CD4" /CD167TcRy5 7Va24 7CD8+/CD95+. Los subconjuntos CMlo y EMlo se identificaron como eventos CD62L+/CD161 int/neg o CD62L7CD161 int/neg, respectivamente, en las poblaciones CD47CD167 TcRy57 Va247CD8+/CD95+. Se midió la concentración intracelular relativa de calcio como la relación de fluorescencia Indo-1AM en los detectores UV violeta (405 nm): UV azul (505 nm) y se representó como la relación media frente al tiempo (segundos) para los subconjuntos regulados apropiadamente.
Este experimento demuestra que los subconjuntos CMhi y EMhi tienen una capacidad diferente para la salida del calcio en respuesta al ionóforo del calcio, ionomicina, en comparación con sus equivalentes no evacuantes. La salida de calcio es un evento de señalización proximal corriente arriba de la unión del TcR específico de antígeno.
Ejemplo 10: Los subconjuntos CMhi y EMhi comprenden repertorios de TcR policlonales por espectrotipaje como se describe en el Ejemplo 10
Se aislaron CMhi, CMlo, EMhi y EMlo como se describe en el Ejemplo 6. Se separaron las PBMC de la sangre periférica reciente por centrifugación en gradiente de densidad. Las células T CD8+ se seleccionaron positivamente utilizando perlas paramagnéticas CD8 y se resuspendieron a 1 x 106/ml en tampón de evacuación enfriado en hielo con 10 jg/ml de Rh123. Las células T CD8+ se incubaron durante 30 minutos en hielo antes de lavarlas tres veces en tampón de evacuación enfriado en hielo y se resuspendieron en tampón de evacuación pre-calentado, con o sin vinblastina, durante 30 minutos a 37 DC. A los 30 minutos, las células T CD8+ se lavaron una vez en PBS/un 0,2 % de BSA (tampón FACS) enfriado en hielo y se marcaron con anticuerpos conjugados con un fluorocromo contra CD4, CD16, TcRy5, Va24, CD8a, CD95 y Cd62L y CD161. Los subconjuntos CMhi y EMhi se identificaron como eventos CD62L+/Rh123lo/CD161hi o CD62L7 Rh123lo/CD161hi, respectivamente en la población CD47CD167TcRy5 ' /Va24"/CD8+. Los subconjuntos CMlo y EMlo se identificaron como eventos CD62L+/Rh123hi/CD161int/neg o CD62L" /Rh123hi/CD161 int/neg, respectivamente, en la población CD47CD167TcRY57Va247CD8+/CD95+. Las células T CD8+ intactas se identificaron como eventos CD47CD167TcRY5-/Va247CD8+/CD95- /CD62L+. Los subconjuntos se aislaron utilizando un clasificador de flujo BD FacsARIA.
El espectrotipaje Vp molecular se llevó a cabo sobre los subconjuntos aislados y las células T CD8+ intactas por RT- PCR múltiple y análisis Genescan sobre los fragmentos Vp.
Estos experimentos demuestran la utilización del TcR Vp policlonal en los subconjuntos CMhi y EMhi evacuantes, demostrando que las células T CD8+ de los subconjuntos CMhi y EMhi expresan TcR diversos que son potencialmente específicos para un amplio intervalo de antígenos.
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Ejemplo 11: Las células positivas al antígeno vírico tetramérico se pueden identificar en los subconjuntos CMhi y EMhi y se pueden generar respuestas de CTL específicas de CMV, EBV y gripe a partir de los subconjuntos CMhi y EMhi clasificados, como se describe en el Ejemplo 11.
Se separaron las PBMC de la sangre periférica reciente por centrifugación en gradiente de densidad y se resuspendieron en PBS. Se llevó a cabo el marcado de superficie con los anticuerpos contra CD4, CD16, TcRyó, CD8a, CD95, CD62L, CD161 y una APC marcada con el péptido tetramérico HLA-A*0201;NLV para permitir la identificación de las células T CD8+ específicas del péptido NLV del antígeno pp65 de CMV. Después del lavado en PBS frio, las muestras marcadas en superficie se analizaron en un citómetro de flujo BD LSR-2. Los subconjuntos CMhi y EMhi se identificaron como eventos CD62L+/CD161hi o CD62L-/CD161hi, respectivamente, en las poblaciones CD4-/Cd16-/ TcRy57CD8+/CD95+. Los datos se muestran en la Figura 11a).
Para demostrar que los raros eventos positivos al tetrámero que se ven en los subconjuntos CMhi y EMhi ex vivo eran CTL específicos de antígeno vírico, los inventores expandieron los CTL específicos de antígeno in vitro a partir de los subconjuntos CMhi y EMhi mediante el cultivo con DC derivadas de monocitos pulsados con el péptido activado autólogo (MoDC). Se aislaron CMhi, CMlo, EMhi y EMlo como se describe en el Ejemplo 6. Las MoDC se generaron cultivando monocitos CD14+, se asilaron utilizando perlas paramagnéticas específicas de CD14, con GM- CSF (800 U/ml) e IL-4 (1000 U/ml) durante 5 días. Las MoDC maduras se generaron mediante el cultivo hasta el día 7 con GM-CSF adicional (800 U/ml)/IL-4 (1000 U/ml) e IL-1 p (2 ng/ml), IL-6 (1000 U/ml), PGE2 (1000 ng/ml) y TNFa (10 ng/ml). Las MoDC se pulsaron en RPMI 1640 (Gibco) durante 2 horas a temperatura ambiente con 1 pg/ml de los péptidos NLVPMVATV, GLCTLVAML o GILGFVFTL restringidos a HLA-A*0201, derivados de CMV, EBV o gripe, respectivamente. Las MoDC se lavaron tres veces en RPMI 1640 y se radiaron (3500 cGy) antes de su uso.
Los subconjuntos CMhi, CMlo, EMhi y EMlo se colocaron en placas de 96 pocillos con los MoDC radiadas, activadas, pulsadas con los péptidos con una relación T:DC de 4:1 en 200 ml de medio de CTL suplementado con IL-2 (10 U/ml), IL-7 (1 ng/ml) e IL-15 (100 pg/ml). Se llevaron a cabo intercambios de citocinas y la mitad del medio los días 4 y 7 y se llevó a cabo el análisis por CD8, DAPI y tinción del tetrámero el día 10. Los datos se muestran en la Figura 11b).
Este experimento demuestra que las células T CD8+ positivas al tetrámero específico de virus se pueden identificar en las poblaciones de CMhi y EMhi de evacuación rápida ex vivo y las raras células T CD8+ específicas del antígeno vírico se pueden identificar después de la estimulación in vitro de los subconjuntos CMhi y EMhi evacuantes aislados. A pesar del hecho de que las CMhi y EMhi evacuantes son refractarias a la estimulación con OKT3 (Ejemplo 7). Se puede rescatar la proliferación cultivando con citocinas. El uso de MoDC activadas y suplementación de citocinas del Ejemplo 11 permite la expansión de CTL específicos de antígeno a partir de los subconjuntos evacuantes in vitro.
Ejemplo 12: Los subconjuntos CMhi y EMhi tienen perfiles de expresión genética únicos y distintos
Se aislaron CMhi, CMlo, EMhi y EMlo como se describe en el Ejemplo 6. Se separaron las PBMC de la sangre periférica reciente por centrifugación en gradiente de densidad. Las células T CD8 se seleccionaron positivamente utilizando perlas paramagnéticas específicas de CD8 y se resuspendieron a 1 x 106/ml en tampón de evacuación enfriado en hielo con 10 pg/ml de Rh123. Las células T CD8+ se incubaron durante 30 minutos en hielo antes de lavarlas tres veces en tampón de evacuación enfriado en hielo y se resuspendieron en tampón de evacuación precalentado, con o sin vinblastina, durante 30 minutos a 37 DC. A los 30 minutos, las células T CD8+ se lavaron una vez en PBS/un 0,2 % de BSA (tampón FACS) enfriado en hielo y se marcaron con anticuerpos conjugados con un fluorocromo contra CD4, CD16, TcRyó, Va24, CD8a, CD95 y cD62L y CD161. Los subconjuntos CMhi y EMhi se identificaron como eventos CD62L+/Rh123lo/CD161hi o CD62L7 Rh123lo/CD161hi, respectivamente en la población CD47CD16TTcRy5 '/Va24'/CD8+. Los subconjuntos CMlo y EMlo se identificaron como eventos
CD62L+/Rh123hi/CD161int/neg o CD62L7Rh123hi/CD161 int/neg, respectivamente, en la población CD47CD167TcRy5‘ /Va247CD8+/CD95+. Los subconjuntos se aislaron utilizando un clasificador de flujo BD FacsARIA.
Se generó el ARNc a partir de los subconjuntos aislados y se llevaron a cabo los estudios de matriz de expresión genética, utilizando la matriz de expresión en beadchip Human WG-6 de Illumina. Los datos se representan en un gráfico de componentes principales para ilustrar las relaciones de expresión genética de CMhi y EMhi en relación con los subconjuntos de células T CD8+ no evacuantes. Los datos muestran que los subconjuntos evacuantes rápidamente (CMhi y EMhi) tienen perfiles de expresión genética que son distintos de los de las células T CD8+ intactas o de memoria no evacuantes (CMlo y EMlo). Además, la separación de los agrupamientos de CMhi y EMhi sugieren que, a pesar de su fenotipo similar, las células T CD8+ CD62L+ (CMhi) y CD62L- (CMlo) evacuantes tienen diferentes perfiles de expresión genética.
Ejemplo 13: Las CMhi y EMhi son raras en la sangre del cordón umbilical, tienen un pico en la juventud y se encuentra con una frecuencia descendente al avanzar la edad
Las PBMC se separaron de la sangre periférica o la sangre del cordón umbilical recientes por centrifugación en gradiente de densidad. Las células T CD8+ se seleccionaron positivamente utilizando Microperlas CD8 (Miltenyi) y se
resuspendieron a 1 x 106/ml en tampón de evacuación enfriado en hielo con 10 pg/ml de Rh123. Las células T CD8+ se incubaron durante 30 minutos en hielo antes de lavarlas tres veces en tampón de evacuación enfriado en hielo y se resuspendieron en tampón de evacuación pre-calentado durante 30 minutos a 37 °C. Se añadió vinblastina a las muestras de control para establecer la presencia de evacuación. Las células T CD8+ se lavaron entonces una vez en 5 PBS/un 0,2 % de BSA (tampón FACS) enfriado en hielo y se marcaron con anticuerpos conjugados con fluorocromo contra CD4, CD16, TcRyó, Va24, CD8a, CD95 y CD62L y CD161. Los subconjuntos CMhi y EMhi se identificaron como eventos CD62L+/Rh123lo/CD161hi o CD62L-/ Rh1231°/CD161hi, respectivamente, en la población CD4-/CD16- /TcRyó -/Va24-/CD8+. Los subconjuntos CMlo y EMlo se identificaron como eventos CD62L+/Rh123hi/CD161int/neg o CD62L-/Rh123hi/CD161 int/neg, respectivamente, en la población CD4-/CD167TcRY57Vap247CD8+/CD95+. La
10 estrategia de regulación se muestra en la Figura 6a). Las muestras se ensayaron utilizando un citómetro de flujo BD FacsARIA. Se muestra la frecuencia de células de fenotipo CMhi y EMhi como un porcentaje de células T CD8+ en la sangre del cordón umbilical en comparación con la sangre periférica de adulto en la Figura 13a). Se muestra el porcentaje de evacuación (arriba) y las células no evacuantes (abajo) en los compartimentos CM y EM en la Figura 13b). Cada punto representa un único donante sano.
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Lo anterior es ilustrativo de la presente invención, y no se considera como limitante de la misma. La invención se define mediante las siguientes reivindicaciones.

Claims (14)

  1. 5
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    REIVINDICACIONES
    1. Una población aislada de células T CD8+ humanas de memoria de larga duración que tienen una alta expresión en su superficie de CD161 e IL-18Ra, en donde la población (a) prolifera en respuesta a IL-7, IL-15 o ambas, (b) evacúa rápidamente la Rh123 y (c) comprende células T de memoria central y/o células T de memoria efectora.
  2. 2. La población de células T CD8+ humanas de memoria de larga duración de la reivindicación 1, en donde la población de células T CD8+ expresa altos niveles de ARNm de MDR-1 en comparación con la población de células T CD8+ humanas de memoria con baja o ninguna expresión en su superficie de IL-18Ra.
  3. 3. La población de células T CD8+ humanas de memoria de larga duración de las reivindicaciones 1 o 2, en donde la población tiene un aumento de expresión CD43, CD44, CD46, CD148 y CD162 en comparación con una población de células T CD8+ humanas de memoria con baja o ninguna expresión en su superficie de IL-18Ra.
  4. 4. La población de células T CD8+ humanas de memoria de larga duración de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la población tiene un aumento de la expresión de CD122 en comparación con una población de células T CD8+ humanas de memoria con baja o ninguna expresión en su superficie de IL-18Ra.
  5. 5. La población de células T CD8+ humanas de memoria de larga duración de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la población tiene una baja expresión de CD25, CD57, PD-1, CD103 y CD69, o carece de ella, en comparación con una población de células T CD8+ humanas de memoria con baja o ninguna expresión en su superficie de IL-18Ra.
  6. 6. La población de células T CD8+ humanas de memoria de larga duración de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que las células T CD8+ de memoria comprenden células de memoria efectora CD95int/hi, CD62L", CD45RAint/neg, CD45ROint/hi.
  7. 7. La población de células T CD8+ humanas de memoria de larga duración de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que las células T CD8+ de memoria comprende células de memoria central CD95int/hi, CD62L+, CD45RAint/neg, CD45ROint/hi.
  8. 8. La población de células T CD8+ humanas de memoria de larga duración de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en la que las células T CD8+ de memoria de larga duración aisladas son CD45RAint/neg, CD45ROint/hi, CD95+, CD127+, CD28+, CD25int/neg, bcl-2hi, perforinaint, granzima Aint, granzima Bint/neg y NKG2Dint/neg.
  9. 9. Una composición que comprende la población celular de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 en un vehículo farmacéuticamente aceptable.
  10. 10. La población celular de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o la composición de la reivindicación 9 para su uso en inmunoterapia, terapia inmunoadoptiva o terapia genética.
  11. 11. La población celular de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o la composición de la reivindicación 9 para su uso en un método de transferencia de inmunidad específica de antígeno para el tratamiento del cáncer, enfermedades infecciosas o inmunodeficiencia iatrogénica o congénita.
  12. 12. Un kit para la identificación o el aislamiento de una población celular de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende un anticuerpo o un conjugado de anticuerpos contra CD161, un anticuerpo o un conjugado de anticuerpos contra IL-18Ra, un isotipo de control apropiado y una combinación de anticuerpos o de conjugado de anticuerpos que permite la identificación o el aislamiento de células T CD8+ de memoria central, opcionalmente en combinación con una o más de:
    (a) Rh123 y un control negativo antagonista de la evacuación de Rh123;
    (b) un medio de ensayo apropiado; y
    (c) instrucciones y envase.
  13. 13. El kit para la identificación o el aislamiento de una población celular de la reivindicación 12, en el que los conjugados de anticuerpos son anticuerpos inmunomagnéticos o conjugados con un fluorocromo.
  14. 14. Un método para la identificación, el enriquecimiento y/o el aislamiento de una población de células T CD8+ humanas de memoria de larga duración de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1 a 8, que comprende la identificación de células T CD8+ con alta expresión en su superficie de CD161 e IL-18Ra.
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