CN107557341A

CN107557341A - 一种抗wt1增强型嵌合抗原受体修饰的免疫细胞及其应用

Info

Publication number: CN107557341A
Application number: CN201710916237.8A
Authority: CN
Inventors: 刘明录; 韩国英; 王立新; 强邦明; 马洪华; 金海锋; 刘敏; 王亮; 韩庆梅; 卢永灿
Original assignee: Jinan Xingyi Medical Technology Co Ltd
Current assignee: Shanghai Xingrui Yida Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2017-09-30
Filing date: 2017-09-30
Publication date: 2018-01-09
Anticipated expiration: 2037-09-30
Also published as: CN107557341B

Abstract

本发明公开了一种抗WT1增强型嵌合抗原受体修饰的免疫细胞及其应用，免疫细胞经抗WT1增强型嵌合受体修饰得到抗WT1嵌合抗原受体修饰的免疫细胞，所述抗WT1增强型嵌合抗原受体包括，CD8 leader、WT1结合区、CD3结合区、CD8的铰链区，跨膜‑刺激结构域、CD3ζ刺激信号传导区，该发明在空间上拉近了肿瘤细胞和效应T细胞的距离，在数量上增加了效应T细胞密度。因此，本发明提供方法增强了T细胞对肿瘤细胞的杀伤效应。

Description

一种抗WT1增强型嵌合抗原受体修饰的免疫细胞及其应用

技术领域

本发明涉及生物基因领域，更具体的说，是一种抗WT1增强型嵌合抗原受体修饰的免疫细胞及其应用。

背景技术

WT1(Wilms’tumor gene 1)是最早发现与Wilms’肿瘤发生发展有关的基因，在成人正常组织中含量非常低，但在急、慢性白血病和一些实体瘤中高表达，包括肺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌等，其在90％的乳腺癌和卵巢癌中高表达，并与疾病的不良预后有相关性。反义寡核苷酸抑制WT1表达，致使白血病细胞及实体瘤细胞生长停止，以及WT1能诱导特异性的细胞毒性T淋巴细胞反应均提示WT1可作为广谱性免疫治疗的理想胞内靶抗原。

免疫治疗是肿瘤治疗的重要手段之一，其中嵌合抗原受体(chimeric antigenreceptor，CAR)修饰的T细胞免疫治疗(CAR-T)备受关注。CAR-T细胞技术可以特异性杀伤肿瘤细胞，不会引起移植物抗宿主反应，不良反应小，患者耐受性好。因此，成为目前研究的焦点。

对于胞内抗原WT1，通过组织融合性复合体(MHC)通路被切成分子量较小的多肽，然后跟MHC结合表达到肿瘤细胞表面，且WT1的MHC-多肽复合物在一些肿瘤细胞表面拷贝数可达几千。免疫细胞通过CAR识别WT1的MHC-多肽复合物，从而杀伤WT1阳性肿瘤细胞。采用此思路开发WT1特异性嵌合抗原受体为基础的细胞免疫治疗新策略会给肿瘤患者带来新的希望。但由于肿瘤微环境的抑制作用，提高CAR-T细胞治疗效能仍然是一个艰巨的任务。

发明内容

为了弥补以上不足，本发明提供了一种抗WT1增强型嵌合抗原受体修饰的免疫细胞及其应用。

本发明的方案是：

一种抗WT1增强型嵌合抗原受体修饰的免疫细胞，免疫细胞经抗WT1增强型嵌合受体修饰得到抗WT1嵌合抗原受体修饰的免疫细胞，所述抗WT1增强型嵌合抗原受体包括，CD8leader、WT1结合区、CD3结合区、CD8的铰链区，跨膜-刺激结构域、CD3ζ刺激信号传导区。

作为优选的技术方案，所述跨膜-刺激结构域选自CD8、CD27、CD28、CD137/4-1BB、CD134/OX40、ICOS分子其中之一的全部或部分片段。

作为优选的技术方案，本发明抗WT1增强型嵌合抗原受体修饰的免疫细胞选自自体的或转基因的T细胞、NK细胞、细胞毒性T淋巴细胞或调节T细胞，记忆性T细胞、双特异性T细胞、CIK细胞。

作为优选的技术方案，所述抗WT1增强型嵌合抗原受体的融合基因片段为Leader-scFv(WT1)-Linker-scFv(CD3)-CD8-CD137-CD3ζ融合基因片段。

作为优选的技术方案，所述Leader-scFv(WT1)-Linker-scFv(CD3)-CD8-CD137-CD3ζ融合基因片段为序列表SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

本发明还公开了一种治疗癌症的药物，含有所述WT1增强型嵌合抗原受体修饰的免疫细胞。

所述的抗WT1增强型嵌合抗原受体修饰的免疫细胞用于制备治疗恶性肿瘤与白血病的药物的用途。

优选的技术方案，所述恶性肿瘤为间皮癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌等，所述白血病包括急、慢性白血病。

由于采用了上述技术方案，一种抗WT1增强型嵌合抗原受体修饰的免疫细胞，免疫细胞经抗WT1增强型嵌合受体修饰得到抗WT1嵌合抗原受体修饰的免疫细胞，所述抗WT1增强型嵌合抗原受体包括，CD8leader、WT1结合区、CD3结合区、CD8的铰链区，跨膜-刺激结构域、CD3ζ刺激信号传导。

该发明优点：

本发明CD3结合区的加入构建成双特异性嵌合抗原受体。CD3是效应T细胞的表面蛋白可以刺激T细胞的增殖和分化。双特异性嵌合抗原受体不但可以识别肿瘤细胞，而且可以识别效应T细胞。在空间上拉近了肿瘤细胞和效应T细胞的距离，在数量上增加了效应T细胞密度。因此，本发明提供方法增强了T细胞对肿瘤细胞的杀伤效应。

附图说明

图1为本发明所述的嵌合抗原受体Leader-scFv(WT1)-Linker-scFv(CD3)-CD8-CD137-CD3ζ的融合基因片段的设计图。

图2为本发明所述的慢病毒Leader-scFv(WT1)-Linker-scFv(CD3)-CD8-CD137-CD3ζ表达质粒的示意图。

图3为本发明WT1特异性CIK细胞的表达CAR的效率图，其表达效率为22.3％。

图4为运用MS磁珠分选后WT1特异性CIK细胞的表达CAR的效率图，其表达效率为94.8％。

图5为本发明WT1特异性CIK细胞体外杀伤能力结果图，WT1特异性CIK细胞对WT1多肽加载的乳腺癌细胞株4T1产生明显的杀伤效应；已分选的WT1特异性CIK细胞对4T1细胞杀伤率高于未分选的WT1特异性CIK；双靶点WT1特异性CIK细胞对4T1细胞杀伤率高于单靶点WT1特异性CIK细胞和CIK细胞。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

实施例1表达本发明核酸编码的嵌合抗原受体蛋白的慢病毒质粒的构建及病毒包装

1.将融合基因片Leader-scFv(WT1)-Linker-scFv(CD3)-CD8-CD137-CD3ζ插入慢病毒表达载体pLent-C-GFP。

Anti-WT1的CAR模块示意见图1(完整核酸序列见附录SEQ ID NO.1)。

Anti-WT1的CAR各模块序列

(1)导引子Leader核酸人工序列(SEQ ID NO.2)

(2)Anti-WT1single chain Fv antibody(scFv)核酸人工序列(SEQ ID NO.3)

(3)Linker核酸人工序列(SEQ ID NO.4)

(4)Anti-CD3single chain Fv antibody(scFv)核酸人工序列(SEQ ID NO.5)

(5)CD8Hinge区核酸人工序列(SEQ ID NO.6)

(6)CD8跨膜区核酸人工序列(SEQ ID NO.7)

(7)CD137胞内区核酸人工序列(SEQ ID NO.8)

(8)CD3ζ胞内区核酸人工序列(SEQ ID NO.9)

分别按导引子Leader的核酸人工序列、Anti-WT1的核酸人工序列、Linker核酸人工序列、Anti-CD3的核酸人工序列、CD8Hinge区核酸人工序列、CD8跨膜区的核酸人工序列、CD137的核酸人工序列、CD3ζ的核酸人工序列委托生工生物工程(上海)有限公司合成其整个表达框，插入pLent-C-GFP载体(Invitrogen)NotI-AsiSI位点(见图2)，转化到E.coli(DH5α)，经测序正确后，使用Qiagen公司的质粒纯化试剂盒提取并纯化质粒，获得重组表达载体的高品质质粒。

2.慢病毒包装，滴度检测

将慢病毒包装细胞系293T接种于含有DMEM+10％FBS 10cm培养皿中，37℃，5％的CO₂条件下培养，贴壁率为70％-80％后进行转染。重组质粒和空载质粒分别与慢病毒包装质粒采用磷酸钙转染法共转染293T细胞，具体方法参考分子克隆。转染后24h后，细胞明显增大、呈球形，细胞核变大，变圆，贴壁能力下降而易脱落。48h后在倒置荧光显微镜下观察到细胞内有绿色荧光蛋白表达。72h后，收集上清，过滤除菌，在-80℃低温冰箱中保存备用。根据Lenti-X^TMGo Stix^TM试剂盒(北京华夏远洋科技有限公司产品)测定病毒滴度，结果表明，重组慢病毒的滴度2.43×10⁶pfu/mL。

实施例2慢病毒感染CIK细胞

1.CIK细胞的制备

取75ml患者自体外周血，用TBD样本密度分离液(购自天津灏洋华科生物)，分离外周血单个核细胞。用含有1000IU/ml的重组干扰素α2a(购自沈阳三生制药)的培养基(购自CORNING公司，88-551-CM)诱导培养24小时后，加入1000IU/ml的重组白细胞介素2(购自沈阳三生制药)、50ng/ml的OKT-3和5％的患者自体血浆诱导继续培养24小时。每隔两天倍比加液，培养至第14天，流式细胞术检测CIK细胞中的CD3+、CD56+的阳性表达率(CD3-FITC，CD16/CD56-PE抗体购自BECKMAN公司，A07735)。CD3+阳性率>80％，CD3+CD56+双阳性率>20％，视为CIK诱导成功，并留取该CIK待病毒感染。

2.慢病毒感染CIK细胞及感染后CIK细胞的扩增培养

以MOI＝5用上述重组和空载慢病毒分别感染CIK细胞。感染后的细胞37℃，5％CO₂培养箱中培养8小时后，收集细胞，重新加入病毒液，1000g，32℃，再次离心90分钟后，37℃，5％CO₂培养箱中继续培养，如此反复进行多重感染，提高CIK细胞的感染效率。吸弃2ml培养上清，加入2ml的新鲜CORNING培养基，继续扩大培养，培养17天至细胞扩增至足够的用量。通过FC500流式细胞仪(购自BECKMAN公司)FL1通道检测CIK细胞的阳性率(图3)。以未感染的CIK淋巴细胞作为阴性对照，重组慢病毒感染CIK细胞其阳性率22.3％。

实施例3运用MS磁珠分选WT1特异性CIK细胞

连锁状多聚体试剂：包括IS缓冲液、连锁状多聚体磁珠、WT1连锁状多聚体MHC等购自德国IBA公司。

WT1/MHC连锁状多聚体磁珠的制备：将50μL连锁状多聚体磁珠、2μg WT1/MHC和90μL IS缓冲液，在避光条件下，4℃孵育45min后加入1mL IS缓冲液。将MS磁柱置于磁场中，用2mL IS缓冲液冲洗，将上述孵育后的液体注入磁柱分选，洗脱未与WT1磁珠结合的连锁状多聚体MHC。将MS磁柱移离磁场，加入250μL IS缓冲液洗脱并收集WT1连锁状多聚体磁珠复合物。

WT1特异性CIK细胞的纯化：将上述WT1连锁状多聚体磁珠复合物与2×10⁷的单核细胞在避光条件下和4℃外周血孵育45min，将MS磁柱放入磁场，用1mL IS缓冲液冲洗3次，未结合的细胞可通过磁柱。将磁柱移离磁场，用1mL IS缓冲液冲洗3次，洗出WT1特异性CIK细胞，收集备用。

WT1特异性CIK细胞的浓度的测定：通过FC500流式细胞仪FL1通道检测CIK细胞的阳性率(图4)。以未感染的CIK淋巴细胞作为阴性对照，重组慢病毒感染CIK细胞其阳性率94.8％。

抗WT1增强型嵌合抗原受体修饰的免疫细胞采用WT1/MHC连锁状多聚体磁珠进行分选，其浓度明显增加至94.8％。

实施例4：WT1特异性CIK细胞杀伤活性研究

WT1特异性CIK细胞特异性杀伤负载WT1多肽的乳腺癌细胞毒性试验采用羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(carboxyfluorescein succinimidyl amino ester，CFSE)/碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)试验测定。CFSE和PI试剂购自上海BestBio公司

具体方法是：计量乳腺癌4T1细胞后，分组进行试验：

A组为试验一组：靶细胞为加载WT1多肽4T1细胞且效应细胞为CIK细胞；

B组为试验二组：靶细胞为加载WT1多肽4T1细胞且效应细胞为未分选的单靶点WT1特异性CIK细胞(不含有CD3靶点)；

C组为试验三组：靶细胞为加载WT1多肽4T1细胞且效应细胞为未分选的双靶点WT1特异性CIK细胞(含有CD3靶点)；

D组为试验四组：靶细胞为加载WT1多肽4T1细胞且效应细胞为已分选的双靶点WT1特异性CIK细胞(含有CD3靶点)；

E组为试验五组：靶细胞为未加载WT1多肽4T1细胞且效应细胞为已分选的双靶点WT1特异性CIK细胞(含有CD3靶点)；

A组-D组加入WT1多肽共培养2h，之后分别加入CFSE，使CFSE终浓度达到2μmol/L，37℃染色30min，PBS洗3次。再与WT1特异性CIK细胞特异性混合培养，37℃作用4～6h，E∶T分别为1∶1、5∶1、10∶1、20∶1。然后，洗涤2次，PI工作液5μL，避光30min后上流式细胞仪检测。CFSE、PI双阳性的细胞为被杀伤的靶细胞，除以靶细胞总数，即为杀伤率，结果见图5。

WT1特异性CIK细胞对WT1多肽加载的乳腺癌细胞株4T1产生明显的杀伤效应，而对WT1多肽未加载的乳腺癌细胞株4T1的细胞毒效应不明显；已分选的WT1特异性CIK细胞对4T1细胞杀伤率高于未分选的WT1特异性CIK；双靶点WT1特异性CIK细胞对4T1细胞杀伤率高于单靶点WT1特异性CIK细胞和CIK细胞。结论本发明设计的双靶点WT1特异性CIK细胞提高了CIK免疫细胞对肿瘤细胞杀伤作用。

实施例5：取5×10⁵个WT1特异性CIK细胞，连续三天静脉注射到WT1阳性的乳腺癌小鼠体内，治疗一个月后进行分析

初步检测免疫组化检测WT1特异性CIK注射到小鼠体内的归巢情况，活检出现在肿瘤组织中的CD3、WT1双阳性免疫细胞，初步表明WT1特异性CIK细胞能够归巢到病灶部位发挥杀伤作用。CT检测WT1特异性CIK细胞对WT1恶性肿瘤患者的初步治疗效果，肿瘤缩小。初步表明WT1特异性CIK细胞治疗后小鼠的肿瘤增速较前明显减慢，并于治疗2-3周后，肿瘤开始自行消退。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界。

序列表

<110> 山东兴瑞生物科技有限公司

<120> 一种抗WT增强型嵌合抗原受体修饰的免疫细胞及其应用

<130> 2017

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2365

<212> DNA

<213> 人种(Homo sapiens)

<400> 1

ggatccgcga tcgcatggcc ctgcctgtga cagccctgct gctgcctctg gctctgctgc 60

tgcatgccgc tagaccccag atgcagctgg tgcagtccgg agcagaggtg aaagagcccg 120

gggagtctct gaggatctcc tgtaagggtt ctggatacag cttcaccaac ttctggatca 180

gctgggtgcg ccagatgccc gggaaaggcc tggagtggat ggggagggtt gatcctggct 240

actcttatag cacctacagc ccgtccttcc aaggccacgt caccatctca gctgacaagt 300

ctaccagcac tgcctacctg cagtggaaca gcctgaaggc ctcggacacc gccatgtatt 360

actgtgcgag agtacaatat agtggctact atgactggtt cgacccctgg ggccagggaa 420

ccctggtcac cgtctcctca ggaggaggag gaagcggagg aggaggaagc ggaggaggag 480

gaagccaggc tgtggtgact cagccaccct cagcgtctgg gacccccggg cagagggtca 540

ccatctcttg ttctggaagc agctccaaca tcggaagtaa tactgtaaac tggtaccagc 600

aggtcccagg aacggccccc aaactcctca tctatagtaa taatcagcgg ccctcagggg 660

tccctgaccg attctctggc tccaagtctg gcacctcagc ctccctggcc atcagtgggc 720

tccagtctga ggatgaggct gattattact gtgcagcatg ggatgacagc ctgaatggtt 780

gggtgttcgg cggagggacc aagctgaccg tcctaggtgg aggaggagga agcggaggag 840

gaggaagcgg aggaggagga agcggaggag gaggaagcgg aggaggagga agcggaggag 900

gaggaagcgg aggaggagga agcggaggag gaggaagcgg aggaggagga agcgagctgc 960

agctggtcga gtctggggga ggcttggtac agcctggggg gtccctgaga ctctcctgtg 1020

cagcctctgg attcaccttt agcagctatg ccatgggctg ggtccgccag gctccaggga 1080

aggggctgga gtgggtctca gctgttagtg gtagtggtgg tagcacatac tacgcagact 1140

ccgtgaaggg ccggttcacc atctccagag acaattccaa gaacacgctg tatctgcaaa 1200

tgaacagcct gagagccgag gacacggccg tatattactg tgcgaaagcc aaattcctgg 1260

gccactacta cggtatggac gtctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc tcctcaggag 1320

gaggaggaag cggaggagga ggaagcggag gaggaggaag cgagctccag atgacccagt 1380

ctccatcctc cctgtctgca tctgtaggag acagagtcac catcacttgc cgggcaagtc 1440

agagcattag cagctattta aattggtatc agcagaaacc agggaaagcc cctaagctcc 1500

tgatctatgc tgcatccagt ttgcaaagtg gagtcccatc aaggttcagc ggcagtggat 1560

ctgggacaga gttcactctc acaatcagca gcctgcagcc tgaagatttt gcaacttatt 1620

actgtcttca gcataatgct tacccgtaca ctttcggcca ggggaccaag gtggaaatca 1680

aaaccacgac gccagcgccg cgaccaccaa caccggcgcc caccatcgcg tcgcagcccc 1740

tgtccctgcg cccagaggcg tgccggccag cggcgggggg cgcagtgcac acgagggggc 1800

tggacttcgc ctgtgatatc tacatctggg cgcccttggc cgggacttgt ggggtccttc 1860

tcctgtcact ggttatcacc ctttactgca aacggggcag aaagaaactc ctgtatatat 1920

tcaaacaacc atttatgaga ccagtacaaa ctactcaaga ggaagatggc tgtagctgcc 1980

gatttccaga agaagaagaa ggaggatgtg aactgagagt gaagttcagc aggagcgcag 2040

acgcccccgc gtacaagcag ggccagaacc agctctataa cgagctcaat ctaggacgaa 2100

gagaggagta cgatgttttg gacaagagac gtggccggga ccctgagatg gggggaaagc 2160

cgagaaggaa gaaccctcag gaaggcctgt acaatgaact gcagaaagat aagatggcgg 2220

aggcctacag tgagattggg atgaaaggcg agcgccggag gggcaagggg cacgatggcc 2280

tttaccaggg tctcagtaca gccaccaagg acacctacga cgcccttcac atgcaggccc 2340

tgccccctcg cgcggccgcc tcgag 2365

<210> 2

<211> 63

<212> DNA

<213> 人种 (Homo sapiens)

<400> 2

atggccctgc ctgtgacagc cctgctgctg cctctggctc tgctgctgca tgccgctaga 60

ccc 63

<210> 3

<211> 741

<212> DNA

<213> 人种 (Homo sapiens)

<400> 3

cagatgcagc tggtgcagtc cggagcagag gtgaaagagc ccggggagtc tctgaggatc 60

tcctgtaagg gttctggata cagcttcacc aacttctgga tcagctgggt gcgccagatg 120

cccgggaaag gcctggagtg gatggggagg gttgatcctg gctactctta tagcacctac 180

agcccgtcct tccaaggcca cgtcaccatc tcagctgaca agtctaccag cactgcctac 240

ctgcagtgga acagcctgaa ggcctcggac accgccatgt attactgtgc gagagtacaa 300

tatagtggct actatgactg gttcgacccc tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc 360

tcaggaggag gaggaagcgg aggaggagga agcggaggag gaggaagcca ggctgtggtg 420

actcagccac cctcagcgtc tgggaccccc gggcagaggg tcaccatctc ttgttctgga 480

agcagctcca acatcggaag taatactgta aactggtacc agcaggtccc aggaacggcc 540

cccaaactcc tcatctatag taataatcag cggccctcag gggtccctga ccgattctct 600

ggctccaagt ctggcacctc agcctccctg gccatcagtg ggctccagtc tgaggatgag 660

gctgattatt actgtgcagc atgggatgac agcctgaatg gttgggtgtt cggcggaggg 720

accaagctga ccgtcctagg t 741

<210> 4

<211> 54

<212> DNA

<213> 人种(Homo sapiens)

<400> 4

agcggaggag gatccggaag cggaggagga tccggaagcg gaggaggatc cgga 54

<210> 5

<211> 729

<212> DNA

<213> 人种(Homo sapiens)

<400> 5

gagctgcagc tggtcgagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgggctgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct gttagtggta gtggtggtag cacatactac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagccaaa 300

ttcctgggcc actactacgg tatggacgtc tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc 360

tcaggaggag gaggaagcgg aggaggagga agcggaggag gaggaagcga gctccagatg 420

acccagtctc catcctccct gtctgcatct gtaggagaca gagtcaccat cacttgccgg 480

gcaagtcaga gcattagcag ctatttaaat tggtatcagc agaaaccagg gaaagcccct 540

aagctcctga tctatgctgc atccagtttg caaagtggag tcccatcaag gttcagcggc 600

agtggatctg ggacagagtt cactctcaca atcagcagcc tgcagcctga agattttgca 660

acttattact gtcttcagca taatgcttac ccgtacactt tcggccaggg gaccaaggtg 720

gaaatcaaa 729

<210> 6

<211> 135

<212> DNA

<213> 人种(Homo sapiens)

<400> 6

accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60

tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120

gacttcgcct gtgat 135

<210> 7

<211> 72

<212> DNA

<213> 人种(Homo sapiens)

<400> 7

atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 60

accctttact gc 72

<210> 8

<211> 126

<212> DNA

<213> 人种(Homo sapiens)

<400> 8

aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60

actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120

gaactg 126

<210> 10

<211> 336

<212> DNA

<213> 人种(Homo sapiens)

<400> 10

agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc 60

tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120

cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180

gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240

cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300

tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336

Claims

1.一种抗WT1增强型嵌合抗原受体修饰的免疫细胞，其特征在于：免疫细胞经抗WT1增强型嵌合受体修饰得到抗WT1嵌合抗原受体修饰的免疫细胞，所述抗WT1增强型嵌合抗原受体包括，CD8leader、WT1结合区、CD3结合区、CD8的铰链区，跨膜-刺激结构域、CD3ζ刺激信号传导区。

2.如权利要求1所述的一种抗WT1增强型嵌合抗原受体修饰的免疫细胞，其特征在于：所述跨膜-刺激结构域选自CD8、CD27、CD28、CD137/4-1BB、CD134/OX40、ICOS分子其中之一的全部或部分片段。

3.如权利要求1所述的一种抗WT1增强型嵌合抗原受体修饰的免疫细胞，其特征在于：所述免疫细胞选自自体的或转基因的T细胞、NK细胞、细胞毒性T淋巴细胞或调节T细胞，记忆性T细胞、双特异性T细胞、CIK细胞其中的一种。

4.如权利要求1所述的一种抗WT1增强型嵌合抗原受体修饰的免疫细胞，其特征在于：所述抗WT1增强型嵌合抗原受体的融合基因片段为Leader-scFv(WT1)-Linker-scFv(CD3)-CD8-CD137-CD3ζ融合基因片段。

5.如权利要求1所述的一种抗WT1增强型嵌合抗原受体修饰的免疫细胞，其特征在于：所述Leader-scFv(WT1)-Linker-scFv(CD3)-CD8-CD137-CD3ζ融合基因片段为序列表SEQID NO.1所示的核苷酸序列。

6.一种治疗癌症的药物，其特征在于：含有权利要求1中所述的WT1增强型嵌合抗原受体修饰的免疫细胞。

7.权利要求1所述的抗WT1增强型嵌合抗原受体修饰的免疫细胞用于制备治疗恶性肿瘤与白血病的药物的用途。

8.如权利要求9所述的制备治疗恶性肿瘤与白血病的药物的用途，其特征在于：所述恶性肿瘤为间皮癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌等，所述白血病包括急、慢性白血病。