BR112020016030A2

BR112020016030A2 - Células t car e doenças autoimunes

Info

Publication number: BR112020016030A2
Application number: BR112020016030-0A
Authority: BR
Inventors: Jeffrey A. Bluestone; Caroline Raffin
Original assignee: The Regents Of The University Of California
Priority date: 2018-02-11
Filing date: 2019-02-11
Publication date: 2020-12-08
Also published as: CN111954684A; CA3090891A1; SG11202007370RA; JP7475686B2; CN111954684B; EP3749778A1; EP3749778A4; EA202091918A1; WO2019157461A1; IL276445A; JP2021513337A; CL2020002066A1; US20200399355A1; JP2024038225A; MX2020008287A; AU2019216989A1; KR20200130292A

Abstract

a presente invenção refere-se a tregs que expressam receptores quiméricos de antígeno (car) têm como alvo específico um antígeno presente na articulação de pacientes com ra para induzir uma resposta a imunossupressores localizada e eficaz.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "CÉLU- LAS T CAR E DOENÇAS AUTOIMUNES".

[001] Este pedido reivindica o benefício da prioridade em 35 U.S.C. § 119 (e) do Pedido Provisório US No. 62/629.103, depositado em 11 de fevereiro de 2018, que é incorporado aqui por referência em sua totalidade.

[002] As modalidades da invenção são direcionadas a receptores quiméricos de antígeno (CAR), células T de receptores quiméricos de antígeno (CAR-T) e usadas no tratamento de doenças, tal como doen- ças autoimunes.

[003] Tradicionalmente, as células T antígeno-específicas são geradas por expansão seletiva de células T do sangue periférico nati- vamente específicas para o antígeno-alvo. No entanto, é difícil e mui- tas vezes impossível selecionar e expandir um grande número de célu- las T específicas para a maioria dos cânceres e autoantígenos. A tera- pia gênica com vetores integradores fornece uma solução para esse problema, pois a expressão transgênica do Receptor Quimérico de An- tígeno (CAR) permite a geração de um grande número de células T específicas para qualquer antígeno de superfície por transdução de vetor viral ex vivo de uma população de células T do sangue periférico.

[004] As modalidades da invenção são direcionadas, em parte, a receptores quiméricos de antígeno (CAR) que reconhecem especifi- camente antígenos associados a doenças autoimunes. Em particular, o CAR é específico para antígenos pós-traducionalmente modificados. Os CARs são transduzidos em células T, tal como células T regulado- ras, que suprimem a resposta autoimune ou células T citotóxicas.

[005] Consequentemente, em um aspecto da presente invenção, é fornecido um receptor quimérico de antígeno (CAR) compreendendo um domínio de ligação antígeno-específico, um domínio de dobradiça, um domínio transmembrana, um domínio coestimulador, e um domínio de sinalização CD3, em que o domínio de ligação antígeno-específico se liga especificamente a polipeptídeos modificados ou peptídeos dos mesmos, incluindo proteínas citrulinadas, tal como proteínas da matriz extracelular citrulinada e proteínas da superfície celular citrulinadas.

[006] Em um segundo aspecto da presente invenção, é fornecido um receptor quimérico de antígeno (CAR) compreendendo um domínio de ligação antígeno-específico, um domínio de dobradiça, um domínio transmembrana, um domínio coestimulador, e um domínio de sinaliza- ção CD3, em que o domínio de ligação antígeno-específico liga-se especificamente aos polipeptídeos de vimentina citrulinada (CV) ou seus peptídeos.

[007] Em um terceiro aspecto, a presente invenção fornece uma célula T isolada que é modificada para expressar: um receptor quimé- rico de antígeno (CAR) compreendendo um domínio de ligação ao an- tígeno ligado a pelo menos um domínio coestimulador e domínio de sinalização CD3, em que o domínio de ligação ao antígeno compre- ende um fragmento variável de cadeia simples (scFv) que se liga es- pecificamente à vimentina citrulinada (CV). Em certas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno compreende um anticorpo, fragmento de anticorpo, nanocorpo de camelídeo, ou aptâmero.

[008] Em certas modalidades, o domínio de dobradiça é codifica- do por uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 50% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8; o domínio transmem- brana é codificado por uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 50% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 9; o domí- nio de sinalização CD3 é codificado por uma sequência de ácidos nu- cleicos tendo pelo menos 50% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 10; e / ou; o domínio coestimulador CD28 é codificado por uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 50% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 11.

[009] Em certas modalidades, o domínio de dobradiça é codifica- do por uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 75% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8; o domínio transmem- brana é codificado por uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 75% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 9; o domí- nio de sinalização CD3 é codificado por uma sequência de ácidos nu- cleicos tendo pelo menos 75% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 10; e / ou; o domínio coestimulador CD28 é codificado por uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 75% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 11.

[0010] Em certas modalidades, o domínio de dobradiça é codifica- do por uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8; o domínio transmem- brana é codificado por uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 9; o domí- nio de sinalização CD3 é codificado por uma sequência de ácidos nu- cleicos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 10; e / ou; o domínio coestimulador CD28 é codificado por uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 11.

[0011] Em certas modalidades, o domínio de dobradiça é codifica- do pela sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 8; o domínio transmembrana é codificado pela sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 9; o domínio de sinalização CD3 é codificado pela se- quência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 10; e / ou; o domínio co- estimulador CD28 é codificado pela sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 11.

[0012] Em certas modalidades, o domínio de dobradiça é codifica- do por uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 50% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8; o domínio transmem-

brana é codificado por uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 50% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 9; o domí- nio de sinalização CD3 é codificado por uma sequência de ácidos nu- cleicos tendo pelo menos 50% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 10; e / ou; o domínio coestimulador 41BB é codificado por uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 50% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 12.

[0013] Em certas modalidades, o domínio de dobradiça é codifica- do por uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 75% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8; o domínio transmem- brana é codificado por uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 75% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 9; o domí- nio de sinalização CD3 é codificado por uma sequência de ácidos nu- cleicos tendo pelo menos 75% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 10; e / ou; o domínio coestimulador 41BB é codificado por uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 75% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 12.

[0014] Em certas modalidades, o domínio de dobradiça é codifica- do por uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8; o domínio transmem- brana é codificado por uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 9; o domí- nio de sinalização CD3 é codificado por uma sequência de ácidos nu- cleicos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 10; e / ou; o domínio coestimulador 41BB é codificado por uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 12.

[0015] Em certas modalidades, o domínio de dobradiça é codifica- do pela sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 8; o domínio transmembrana é codificado pela sequência de ácidos nucleicos da

SEQ ID NO: 9; o domínio de sinalização CD3 é codificado pela se- quência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 10; e / ou; o domínio co- estimulador 41BB é codificado pela sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 12.

[0016] Em certas modalidades, o CV-CAR liga-se especificamente a um peptídeo CV tendo pelo menos uma identidade de sequência de 50% com a SEQ ID NO: 3 ou 4. Em certas modalidades, o CV-CAR liga-se especificamente a um peptídeo CV tendo pelo menos pelo me- nos uma identidade de sequência de 75% com a SEQ ID NO: 3 ou 4.

[0017] Em certas modalidades, o CV-CAR liga-se especificamente a um peptídeo CV tendo pelo menos uma identidade de sequência de 95% com a SEQ ID NO: 3 ou 4.

[0018] Em certas modalidades, o CV-CAR liga-se especificamente a um peptídeo CV compreendendo SEQ ID NO: 3 ou 4.

[0019] Em certas modalidades, o CV-CAR liga-se especificamente a um peptídeo CV tendo pelo menos uma identidade de sequência de 50% com a SEQ ID NO: 21 ou 22. Em certas modalidades, o CV-CAR liga-se especificamente a um peptídeo CV tendo pelo menos pelo me- nos uma identidade de sequência de 75% com a SEQ ID NO: 21 ou

22.

[0020] Em certas modalidades, o CV-CAR liga-se especificamente a um peptídeo CV tendo pelo menos uma identidade de sequência de 95% com a SEQ ID NO: 21 ou 22.

[0021] Em certas modalidades, o CV-CAR liga-se especificamente a um peptídeo CV compreendendo SEQ ID NO: 21 ou 22.

[0022] Em um quarto aspecto, a presente invenção fornece uma célula T isolada que é modificada para expressar: um receptor quimé- rico de antígeno (CAR) compreendendo um domínio de ligação ao an- tígeno ligado a pelo menos um domínio coestimulador e um domínio de sinalização CD3, em que o domínio de ligação ao antígeno com-

preende um fragmento variável de cadeia simples (scFv) que se liga especificamente à vimentina citrulinada (CV). Em certas modalidades, o domínio coestimulador compreende um polipeptídeo CD28 ou 41BB.

Em certas modalidades, o CAR compreende um domínio de dobradiça codificado por uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 50% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8; o CAR com- preende um domínio transmembrana codificado por uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 50% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 9; o domínio de sinalização CD3 é codificado por uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 50% de identi- dade de sequência com a SEQ ID NO: 10; e / ou; o domínio coestimu- lador CD28 é codificado por uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 50% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 11. Em certas modalidades, o CAR compreende um domínio de dobradiça codificado por uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 75% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8; o CAR com- preende um domínio transmembrana codificado por uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 75% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 9; o domínio de sinalização CD3 é codificado por uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 75% de identi- dade de sequência com a SEQ ID NO: 10; e / ou; o domínio coestimu- lador CD28 é codificado por uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 75% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 11. Em certas modalidades, o CAR compreende um domínio de dobradiça codificado por uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8; o CAR com- preende um domínio transmembrana codificado por uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 9; o domínio de sinalização CD3 é codificado por uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 95% de identi-

dade de sequência com a SEQ ID NO: 10; e / ou; o domínio coestimu- lador CD28 é codificado por uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 11. Em certas modalidades, o CAR compreende um domínio de dobradiça codificado pela sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 8; o CAR compreende um domínio transmembrana codificado pela se- quência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 9; o domínio de sinaliza- ção CD3 é codificado pela sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 10; e / ou; o domínio coestimulador CD28 é codificado pela se- quência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 11. Em certas modalida- des, o CAR compreende um domínio de dobradiça codificado por uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 50% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8; o CAR compreende um domínio transmembrana codificado por uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 50% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 9; o domínio de sinalização CD3 é codificado por uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 50% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 10; e / ou; o domínio coestimulador 41BB é codifi- cado por uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 50% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 12. Em certas modali- dades, o CAR compreende um domínio de dobradiça codificado por uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 75% de identi- dade de sequência com a SEQ ID NO: 8; o CAR compreende um do- mínio transmembrana codificado por uma sequência de ácidos nuclei- cos tendo pelo menos 75% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 9; o domínio de sinalização CD3 é codificado por uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 75% de identidade de sequên- cia com a SEQ ID NO: 10; e / ou; o domínio coestimulador 41BB é co- dificado por uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 75% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 12. Em certas modalidades, o CAR compreende um domínio de dobradiça codificado por uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência a SEQ ID NO: 8; o CAR compreende um do- mínio transmembrana codificado por uma sequência de ácidos nuclei- cos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 9; o domínio de sinalização CD3 é codificado por uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 95% de identidade de sequên- cia com a SEQ ID NO: 10; e / ou; o domínio coestimulador 41BB é co- dificado por uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 12. Em certas modalidades, o CAR compreende um domínio de dobradiça codificado pela sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 8; o CAR compre- ende um domínio transmembrana codificado pela sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 9; o domínio de sinalização CD3 é codifica- do pela sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 10; e / ou; o domínio coestimulador 41BB é codificado pela sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 12.

[0023] Em certas modalidades, a célula T é uma célula T regulado- ra de mamífero (Treg). Em certas modalidades, a célula Treg é CD4+ CD25+ CD127-, FOXP3+.

[0024] Em certas modalidades, um vetor de expressão codifica um receptor quimérico de antígeno (CAR).

[0025] Em um quinto aspecto, a presente invenção fornece uma composição farmacêutica que compreende um receptor quimérico de antígeno (CAR), um vetor de expressão que codifica um receptor qui- mérico de antígeno (CAR) ou uma célula T isolada que é modificada para expressar um receptor quimérico de antígeno (CAR).

[0026] Em um sexto aspecto, a presente invenção fornece um mé- todo de tratamento de um indivíduo diagnosticado com artrite reumató- ide, compreendendo administrar uma célula T isolada que é modifica-

da para expressar um receptor quimérico de antígeno (CAR), em que o CAR se liga especificamente a um antígeno vimentina citrulinada (CV). Em certos aspectos, agentes anti-inflamatórios e / ou agentes terapêuticos também são administrados ao indivíduo.

Em certas moda- lidades, um método de tratamento de um indivíduo diagnosticado com artrite reumatoide compreende isolar linfócitos T a partir de uma amos- tra biológica obtida do indivíduo; separar células reguladoras T (Treg) CD4+ das células T convencionais (Tconv), em que as células Treg são CD4+ CD25+ CD127- e as Tconv são CD4+ CD25- CD127+; trans- duzir as células Treg com um vetor de expressão que codifica um re- ceptor quimérico de antígeno (CAR) que se liga especificamente a um antígeno vimentina citrulinada (CV); expandir a Treg transduzida com microesferas anti-CD3 / CD28 pelo menos uma vez ex vivo para obter células Treg expandidas específicas para o antígeno CV; e reinfundir a Treg no indivíduo, tratando assim o indivíduo.

Em certas modalidades, o CAR compreende um domínio de ligação ao antígeno ligado a pelo menos um domínio coestimulador e um domínio de sinalização CD3, em que o domínio de ligação ao antígeno compreende um fragmento variável de cadeia simples (scFv) que se liga especificamente à vimen- tina citrulinada (CV). Em certas modalidades, o domínio coestimulador compreende um polipeptídeo CD28 ou 41BB.

Em certas modalidades, o CAR compreende um domínio de dobradiça codificado por uma se- quência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 50% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8; o CAR compreende um domínio transmembrana codificado por uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 50% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 9; o domínio de sinalização CD3 é codificado por uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 50% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 10; e / ou; o domínio coestimulador CD28 é codifi- cado por uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 50%

de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 11. Em certas modali- dades, o CAR compreende um domínio de dobradiça codificado por uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 50% de identi- dade de sequência a SEQ ID NO: 8; o CAR compreende um domínio transmembrana codificado por uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 50% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 9; o domínio de sinalização CD3 é codificado por uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 50% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 10; e / ou; o domínio coestimulador 41BB é codifi- cado por uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 50% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 12.

[0027] Em um sétimo aspecto, a presente invenção fornece recep- tores quiméricos de antígeno (CARs) em que os CARs são transduzi- dos em vários tipos de células, incluindo células T, tal como células T reguladoras (Treg), células T citotóxicas (CTL), células T convencio- nais (Tconv); outros tipos de células do sistema imunológico, tal como células exterminadoras naturais (NK); células-tronco, linhagens celula- res e similares. Os CARs compreendem domínios de ligação ao antí- geno gerados para antígenos-alvo específicos de doença, tal como antígenos extracelulares, antígenos da superfície celular, antígenos virais, antígenos pós-traducionalmente modificados, e similares.

[0028] Outros aspectos são descritos abaixo.

DEFINIÇÕES

[0029] A menos que definido de outra forma, todos os termos (in- cluindo termos técnicos e científicos) aqui utilizados têm o mesmo sig- nificado que é comumente entendido por um versado na técnica ao qual esta invenção pertence. Será entendido ainda que termos, como os definidos em dicionários comumente usados, devem ser interpreta- dos como tendo um significado consistente com seu significado no contexto da técnica relevante e não serão interpretados em um sentido idealizado ou excessivamente formal, a menos que expressamente assim definido aqui.

[0030] Como usadas neste documento, as formas singulares "um", "uma" e "o", "a" também pretendem incluir as formas plurais, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Além disso, na medida em que os termos "incluindo", "inclui", "tendo", "tem", "com" ou varian- tes dos mesmos são usados na descrição detalhada e / ou nas reivin- dicações, esses termos devem ser inclusivos de maneira semelhante ao termo "compreendendo".

[0031] O termo "cerca de" ou "aproximadamente" significa dentro de uma faixa de erro aceitável para o valor específico, conforme de- terminado por um versado na técnica, que dependerá em parte de co- mo o valor é medido ou determinado, ou seja, as limitações do sistema de medição. Por exemplo, "cerca de" pode significar dentro de 1 ou mais de 1 desvio-padrão, de acordo com a prática na técnica. Alterna- tivamente, "cerca de" pode significar uma faixa de até 20%, até 10%, até 5% ou até 1% de um determinado valor ou faixa. Alternativamente, particularmente no que diz respeito a sistemas ou processos biológi- cos, o termo pode significar dentro de uma ordem de grandeza dentro de 5 vezes, e também dentro de 2 vezes, de um valor. Quando valores específicos são descritos no pedido e nas reivindicações, a menos que indicado de outra forma, o termo "cerca de" significa uma faixa aceitá- vel de erro para o valor específico

[0032] Como usado aqui, o termo "afinidade" é entendido como uma medida da força de ligação. Sem estar vinculada à teoria, a afini- dade depende da proximidade do ajuste estereoquímico entre os sítios de combinação de anticorpos e os determinantes do antígeno, do ta- manho da área de contato entre eles, e da distribuição de grupos car- regados e hidrofóbicos. Afinidade também inclui o termo "avidez", que se refere à força da ligação antígeno – anticorpo após a formação de complexos reversíveis. Os métodos para calcular a afinidade de um anticorpo com um antígeno são conhecidos na técnica, incluindo o uso de experimentos de ligação para calcular a afinidade. A atividade do anticorpo em ensaios funcionais (por exemplo, ensaio de citometria de fluxo) também reflete a afinidade do anticorpo. Os anticorpos e afini- dades podem ser caracterizados fenotipicamente e comparados utili- zando ensaios funcionais (por exemplo, ensaio de citometria de fluxo).

[0033] Como usado aqui, o termo "agente" deve abranger qual- quer molécula, entidade química, composição, fármaco, agente tera- pêutico, agente quimioterápico ou agente biológico capaz de prevenir, melhorar ou tratar uma doença ou outra condição médica. O termo in- clui compostos de moléculas pequenas, oligonucleotídeos antissenso, reagentes de siRNA, anticorpos, fragmentos de anticorpos portadores de sítios de reconhecimento de epítopo, tal como fragmentos Fab, Fab’, F(ab’)2, fragmentos Fv, anticorpos de cadeia simples, miméticos de anticorpos (tal como DARPins, moléculas de affibody, afilinas, afiti- nas, anticalinas, avímeros, fynomers, peptídeos de domínio Kunitz e monocorpos), peptoides, aptâmeros; enzimas, moléculas orgânicas ou inorgânicas de peptídeos, compostos naturais ou sintéticos e similares. Um agente pode ser testado de acordo com os métodos da invenção em qualquer estágio durante os ensaios clínicos, durante os ensaios pré-teste ou após a aprovação da FDA.

[0034] Por "melhorar" entende-se diminuir, suprimir, atenuar, redu- zir, interromper ou estabilizar o desenvolvimento ou progressão de uma doença.

[0035] Como usado aqui, o termo "anticorpo" significa não apenas moléculas de anticorpo intactas, mas também fragmentos de molécu- las de anticorpo que retêm a capacidade de ligação ao imunogene. Tais fragmentos também são bem conhecidos na técnica e são em- pregados regularmente tanto in vitro quanto in vivo. Por conseguinte,

como aqui utilizado, o termo "anticorpo" significa não apenas molécu- las de imunoglobulina intactas, mas também os fragmentos ativos bem conhecidos F(ab’)2 e Fab. Os fragmentos F(ab’)2 e Fab que não têm o fragmento Fc do anticorpo intacto, desaparecem mais rapidamente da circulação, e podem ter menos ligação não específica ao tecido de um anticorpo intacto (Wahl e outros, J. Nucl. Med 24: 316 a 325 (1983). Os anticorpos da invenção compreendem anticorpos nativos inteiros, anticorpos biespecíficos; anticorpos quiméricos; Fab, Fab’, fragmentos da região V de cadeia simples (scFv), polipeptídeos de fusão, e anti- corpos não convencionais.

[0036] Conforme usado neste relatório e nas reivindicações em anexo, o termo "ou" é geralmente empregado em seu sentido, incluin- do "e / ou", a menos que o conteúdo indique claramente o contrário.

[0037] O termo "receptor quimérico de antígeno" ou "CAR", con- forme aqui utilizado, refere-se a um domínio de ligação ao antígeno que é fusionado a um domínio de sinalização intracelular capaz de ati- var ou estimular uma célula imune e, em certas modalidades, o CAR também compreende um domínio transmembrana. Em certas modali- dades, o domínio de ligação ao antígeno extracelular do CAR é com- posto por um fragmento variável de cadeia simples (scFv) derivado da fusão das regiões pesada e leve variáveis de um anticorpo monoclonal murino ou humanizado. Alternativamente, podem ser utilizados scFvs derivados de Fab (em vez de um anticorpo, por exemplo, obtido a par- tir de bibliotecas de Fab). Em várias modalidades, o scFv é fusionado ao domínio transmembrana e depois ao domínio de sinalização intra- celular. Os CARs de "primeira geração" incluem aqueles que fornecem apenas sinais de CD3 na ligação ao antígeno, os CARs de "segunda geração" incluem aqueles que fornecem coestimulação (por exemplo, CD28 ou CD137) e ativação (CD3). Os CARs de "terceira geração" incluem aqueles que fornecem coestimulação múltipla (por exemplo,

CD28 e CD137) e ativação (CD3). Uma quarta geração de CARs foi descrita, as células T CAR redirecionadas para a morte de citocinas (TRUCKS), onde o vetor contendo o construto de CAR tem um casse- te de citocinas. Quando o CAR é ligado, a célula CAR-T deposita uma citocina pró-inflamatória na lesão tumoral. Uma célula CAR-T é uma célula T que expressa um receptor quimérico de antígeno. A frase "re- ceptor quimérico de antígeno (CAR)", conforme usada aqui e geral- mente usada na técnica, refere-se a uma proteína de fusão recombi- nante que tem um domínio extracelular antígeno-específico acoplado a um domínio intracelular que direciona a célula para desempenhar uma função especializada mediante ligação de um antígeno ao domínio ex- tracelular. Os termos "receptor de células T artificial", "receptor de cé- lulas T quimérico" e "imunorreceptor quimérico" podem ser usados de forma intercambiável neste documento com o termo "receptor quiméri- co de antígeno".

[0038] Como aqui utilizados, os termos "compreendendo", "com- preendem" ou "compreendidos" e suas variações, em referência a elementos definidos ou descritos de um item, composição, aparelho, método, processo, sistema, etc., significam ser inclusivos ou abertos, permitindo elementos adicionais, indicando assim que o item, compo- sição, aparelho, método, processo, sistema etc. definido ou descrito inclui os elementos especificados – ou, se apropriado, seus equivalen- tes – e que outros elementos podem ser incluídos e ainda se enqua- dram dentro do escopo / definição do item, composição, aparelho, mé- todo, processo, sistema, etc. definido.

[0039] "Diagnóstico" ou "diagnosticado" significa identificar a pre- sença ou natureza de uma condição patológica. Os métodos de diag- nóstico diferem em sensibilidade e especificidade. A "sensibilidade" de um ensaio de diagnóstico é a porcentagem de indivíduos doentes que testam positivo (porcentagem de "verdadeiros positivos"). Os indiví-

duos doentes não detectados pelo ensaio são "falsos negativos". Os indivíduos que não estão doentes e que são negativos no teste são denominados "verdadeiros negativos". A "especificidade" de um ensaio de diagnóstico é de 1 menos a taxa de falso positivo, onde a taxa de "falso positivo" é definida como a proporção daqueles sem a doença que testam positivo. Embora um método de diagnóstico específico possa não fornecer um diagnóstico definitivo de uma condição, basta que o método forneça uma indicação positiva que ajude no diagnósti- co.

[0040] Uma "doença" é um estado de saúde de um animal em que o animal não pode manter a homeostase, e em que se a doença não é melhorada, a saúde do animal continua a deteriorar-se. Exemplos de doenças incluem doenças autoimunes, tal como artrite reumatoide (RA), doença inflamatória intestinal (DII), doença de Crohn (DC), es- pondilite anquilosante (EA), e similares.

[0041] O termo "dobradiça" ou "região de dobradiça" refere-se a uma região de conexão flexível, por exemplo, polipeptídeos naturais ou sintéticos, ou qualquer outro tipo de molécula, fornecendo flexibili- dade estrutural e espaçamento para as regiões polipeptídicas flanque- adoras.

[0042] Um "lentivírus", conforme aqui utilizado, refere-se a um gê- nero da família Retroviridae. Os lentivírus são únicos entre os retroví- rus por serem capazes de infectar células que não se dividem; eles podem fornecer uma quantidade significativa de informação genética ao DNA da célula hospedeira, portanto, são um dos métodos mais efi- cientes de um vetor de entrega de genes. HIV, SIV e FIV são todos exemplos de lentivírus.

[0043] O termo "ligante", também conhecido como "espaçador" ou "domínio espaçador", conforme usado aqui, refere-se a um aminoácido ou sequência de aminoácidos que está opcionalmente localizado entre duas sequências de aminoácidos em uma proteína de fusão da inven- ção.

[0044] A administração "parentérica" de uma composição imuno- gênica inclui, por exemplo, subcutânea (s.c.), intravenosa (i.v.), intra- muscular (i.m.) ou injeção intraesternal, ou técnicas de infusão.

[0045] Os termos "paciente" ou "indivíduo" ou "sujeito" são usados aqui de forma intercambiável e se referem a um mamífero a ser trata- do, sendo preferenciais pacientes humanos. Em alguns casos, os mé- todos da invenção encontram uso em animais experimentais, em apli- cações veterinárias, e no desenvolvimento de modelos animais para doenças, incluindo, entre outros, roedores que incluem camundongos, ratos e hamsters, e primatas.

[0046] Como aqui utilizado, o termo "fragmento variável de cadeia simples" ou "scFv" é uma proteína de fusão das regiões variáveis das cadeias pesada (VH) e leve (VL) de uma imunoglobulina. As cadeias pesada (VH) e leve (VL) são unidas diretamente ou unidas por um li- gante de codificação de peptídeo (por exemplo, 10, 15, 20, 25 aminoá- cidos), que conecta o N terminal da VH com o C terminal da VL, ou o C terminal da VH com o N terminal da VL. O ligante é geralmente rico em glicina para flexibilidade, bem como serina ou treonina para solubi- lidade. Apesar da remoção das regiões constantes e da introdução de um ligante, as proteínas scFv mantêm a especificidade da imunoglobu- lina original. Os anticorpos polipeptídicos Fv de cadeia simples podem ser expressos a partir de um ácido nucleico incluindo sequências codi- ficadoras de VH e VL, como descrito por Huston e outros (Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85: 5879 a 5883, 1988). Ver também as Patentes US

5.091.513, 5.132.405 e 4.956.778; e Publicações de Patente US Nos. 20050196754 e 20050196754. Os scFv antagonistas com atividade inibidora foram descritos (ver, por exemplo, Zhao e outros, Hyrbidoma (Larchmt) 2008 27 (6): 455-51; Peter e outros, J Cachexia Sarcopenia

Muscle, 12 de agosto 2012; Shieh e outros, J Imunol 2009 183 (4): 2277-85; Giomarelli e outros, Thromb Haemost 2007 97 (6): 955-63; Fife e outros, J Clin Invst 2006 116 (8): 2252-61; Brocks e outros, Immunotechnology 1997 3 (3): 173-84; Moosmayer e outros, Ther Immunol 1995 2 (10: 31 a 40). Os scFvs agonistas com atividade esti- mulante foram descritos (ver, por exemplo, Peter e outros, J Bioi Chem 2003 25278 (38): 36740-7; Xie e outros, Nat Biotech 1997 15 (8): 768- 71; Ledbetter e outros, Crit Rev Immunol l997 17 (5 a 6): 427-55; Ho e outros, BioChim Biophys Acta 2003 1638 (3): 257-66).

[0047] Como usado aqui, os termos "tratar", "tratando", "tratamen- to" e similares se referem a reduzir ou melhorar um distúrbio e / ou sin- tomas associados a ele. Será apreciado que, embora não seja impedi- do, o tratamento de um distúrbio ou condição não requer que o distúr- bio, condição ou sintomas associados a ele sejam completamente eli- minados.

[0048] Um "vetor" é uma composição de matéria que compreende um ácido nucleico isolado e que pode ser usada para entregar o ácido nucleico isolado ao interior de uma célula. Exemplos de vetores inclu- em, mas não estão limitados a, polinucleotídeos lineares, polinucleotí- deos associados a compostos iônicos ou anfifílicos, plasmídeos, e ví- rus. Assim, o termo "vetor" inclui um plasmídeo de replicação autôno- ma ou um vírus. O termo também é construído para incluir compostos não plasmídeos e não virais que facilitam a transferência de ácido nu- cleico para as células, tal como, por exemplo, compostos de polilisina, lipossomas e similares. Exemplos de vetores virais incluem, mas não estão limitados a, vetores adenovirais, vetores de vírus adenoassocia- dos, vetores retrovirais, e similares.

[0049] Todos os genes, nomes de genes, e produtos gênicos des- critos neste documento pretendem corresponder a homólogos de qualquer espécie para as quais as composições e métodos aqui des-

critos são aplicáveis. Assim, os termos incluem, entre outros, genes e produtos gênicos de humanos e camundongos. Entende-se que quan- do um gene ou produto gênico de uma espécie específica é descrito, esta descrição pretende ser apenas exemplificativa e não deve ser in- terpretada como uma limitação, a menos que o contexto em que ele apareça indique claramente. Assim, por exemplo, para os genes ou produtos gênicos aqui descritos, que em algumas modalidades se re- ferem a sequências de ácidos nucleicos e aminoácidos de mamíferos, pretendem abranger genes homólogos e / ou ortólogos e produtos gê- nicos de outros animais, incluindo, mas não limitados a, outros mamí- feros, peixes, anfíbios, répteis e pássaros. Em modalidades preferen- ciais, os genes, sequências de ácidos nucleicos, sequências de ami- noácidos, peptídeos, polipeptídeos e proteínas são humanos. O termo "gene" também se destina a incluir variantes.

[0050] As faixas aqui fornecidas são entendidas como atalhos para todos os valores dentro da faixa. Por exemplo, entende-se que uma faixa de 1 a 50 inclui qualquer número, combinação de números ou subfaixa do grupo que consiste em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou

50.

[0051] A prática da presente invenção emprega, a menos que indi- cado ao contrário, técnicas convencionais de química, biologia molecu- lar, microbiologia, DNA recombinante, genética, imunologia, biologia celular, cultura de células e biologia transgênica, que estão dentro do conhecimento da técnica. Ver, por exemplo, Maniatis e outros, 1982, Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.); Sambrook e outros, 1989, Molecular Cloning, 2ª Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Ior- que); Sambrook e Russell, 2001, Molecular Cloning, 3ª Ed. (Cold

Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova York); Au- subel e outros, 1992), Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, incluindo atualizações periódicas); Glover, 1985, DNA Cloning (IRL Press, Oxford); Anand, 1992; Guthrie e Fink, 1991; Har- low e Lane, 1988, Antibodies, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova York); Jakoby e Pastan, 1979; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymology (Aca- demic Press, Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller e M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, Vols. 154 e 155 (Wu e outros, eds.), Immu- nochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer e Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir e C. C. Blackwell, eds., 1986); Riott, Essential Immunology, 6th Edition, Blackwell Scientific Publica- tions, Oxford, 1988; Hogan e outros, Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986); Westerfield, M., The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio), (4ª Ed., Univ. of Oregon Press, Eugene, 2000).

[0052] A Figura 1 é um diagrama esquemático que ilustra proces- sos implementados de acordo com algumas modalidades.

[0053] A Figura 2 é um diagrama esquemático que ilustra proces- sos implementados de acordo com algumas modalidades para gerar Tregs (CV)-CAR.

[0054] A Figura 3 é um diagrama esquemático que ilustra Tregs CV-CAR direcionadas a antígenos em um paciente.

[0055] A Figura 4 mostra a avaliação da especificidade e afinidade para CV do fragmento variável de cadeia simples (scFv) sintetizado a partir de anticorpo BVCA1. Amostras humanas e murinas foram avali- adas. Foi utilizado o ensaio imunossorvente ligado à enzima (ELISA). Os resultados mostram que, como anticorpo BVCA1 (descrito na Figu- ra 7), o BVCA1 scFv é específico para vimentina citrulinada.

[0056] As Figuras 5A, 5B mostram a avaliação da especificidade e afinidade para CV do fragmento variável de cadeia simples (scFv) sin- tetizado a partir de anticorpo BVCA1. A constante de dissociação (KD) foi medida usando ressonância plasmônica de superfície (sistema Bia- core). Os resultados mostram que (Figura 5A) KD entre o IgG totalmen- te humano BVG1 e o peptídeo CV humano é de 10 nM, e que (Figura 5B) KD entre o BVCA1 scf e o peptídeo CV humano é de 198 nM. Os resultados mostram que, como anticorpo BVCA1, o BVCA1 scFv é es- pecífico para vimentina citrulinada.

[0057] A Figura 6 mostra a comparação de sequências do peptí- deo humano e murino vimentina 60-75, mostrando que as sequências são altamente semelhantes e que os três aminoácidos arginina (abre- viados como R), que são modificados para citrulina após citrulinação, estão em localizações idênticas em ambas as espécies.

[0058] A Figura 7 mostra a avaliação da especificidade e afinidade para CV pelo anticorpo BVCA1. Foi utilizado o ensaio imunossorvente ligado à enzima (ELISA). Os resultados mostram que os anticorpos BVCA1 humanos e murinos são específicos para a vimentina citrulina- da humana e murina.

[0059] A Figura 8A mostra a representação esquemática de CV- CAR, mostrando os domínios de CV-CAR.

[0060] A Figura 8B mostra a representação esquemática de um exemplo de certos domínios de CV-CAR criados de acordo com algu- mas modalidades. CV-CAR inclui αCV scFv, a região de dobradiça e o motivo transmembrana (TM), um domínio coestimulador (ou CD28 (CV.28z-CAR) ou 41BB (CV.41BBz-CAR)), CD3. A porção TM nativa de CD28 é usada; uma versão truncada do receptor do fator de cres- cimento epidérmico (EGFRt) está no C terminal para ser usada como repórter e é separada da sequência CAR por um peptídeo T2A, permi- tindo a clivagem do repórter EGFRt.

[0061] A Figura 9 ilustra um exemplo de uma linha do tempo para geração, expansão e avaliação in vitro de CAR CV-específico introdu- zido nas Tregs.

[0062] As Figuras 10A-10B mostram a análise de dobradiças de diferentes comprimentos de construtos de CAR. No dia 5 após a transdução, as Tregs CV-CAR+ foram classificadas por citometria de fluxo com base na expressão de EGFRt. As Tregs CV-CAR classifica- das foram então reestimuladas na presença ou ausência de microesfe- ras anti-CD3 / CD28 ou microesferas de peptídeo CV / estreptavidina (CV-pep-SA). A Figura 10A mostra a análise da expressão dos marca- dores de ativação CD71 e CD25 no dia 3 após reestimulação. A Figura 10B mostra a análise da expansão celular no dia 5 após reestimula- ção.

[0063] As Figuras 11A-11D mostram a análise comparativa de construtos de CV-CAR com diferentes versões de BVCA1 scFv. As células Tconv e Treg foram transduzidas com diferentes versões do construto CV-CAR no dia 2 após a estimulação. A eficiência da trans- dução foi avaliada por citometria de fluxo. São mostradas as porcenta- gens de células que expressam o gene repórter de CAR (Figura 11A) e o CV-CAR (Figura 11B) na superfície celular. Dois dias após uma segunda rodada de estimulação na presença de diferentes condições estimuladoras (apenas IL-2, microesferas anti-CD3 / CD28 e microes- feras de CV-SA), a expressão dos marcadores de ativação CD69 e CD71 foi analisada por citometria de fluxo (Figuras 11C e 11D);

[0064] As Figuras 12A-12C mostram a avaliação da expressão su- perficial do repórter EGFRt em Tregs e Tconv. A Figura 12A mostra a avaliação da expressão superficial do repórter EGFRt em Tregs e Tconv por citometria de fluxo no dia 4 após a transdução com os dife- rentes construtos de CAR. Resumo dos dados para todos os doadores (n = 4). A Figura 12B mostra os gráficos de pontos representativos da expressão da superfície do repórter EGFRt em Tregs e Tconv por ci- tometria de fluxo no dia 4 após a transdução com os diferentes cons- trutos de CAR. A Figura 12C mostra a representação esquemática de um complexo peptídeo CV biotinilado (pep) / SA-FITC. A Figura 12D mostra a avaliação da expressão superficial do repórter EGFRt e CV- CAR em Tregs. As células Treg foram coradas para o CV-CAR usando um peptídeo CV biotinilado / tetrâmero estreptavidina conjugado com FITC (CVpep-SA-FITC) e anticorpo EGFRt no dia 5 após a transdu- ção. Os gráficos de pontos são representativos de 4 experimentos in- dependentes.

[0065] A Figura 13 é uma representação esquemática de uma mi- croesfera de CV-pep-SA biotinilada formada a partir de um SA DYNA- BEAD® revestido com peptídeo CV biotinilado.

[0066] As Figuras 14A-14C mostram a avaliação da capacidade do sinal mediado pelo CV-CAR para ativar as Tregs CV-CAR geradas. Após enriquecimento das Tregs CAR+ específicas para CV por citome- tria de fluxo, as células foram reestimuladas na presença ou na ausên- cia de microesferas anti-CD3 / CD28 ou microesferas de CV biotinila- das (CV-pep-SA). A Figura 14A mostra a avaliação do aglomerado de células no dia 1. A Figura 14B mostra a avaliação da expressão dos marcadores de ativação CD71 e CD25 no dia 3. A Figura 14C mostra a avaliação da dobra de expansão das diferentes populações de Treg CAR em todas as condições medidas no dia 5 após reestimulação.

[0067] As Figuras 15A-15C mostram a avaliação do fenótipo e es-

tabilidade das Tregs CV-CAR após expansão in vitro. As Tregs não transduzidas e Tregs CV-CAR foram submetidas a duas rodadas de estimulação, com uma segunda rodada de ativação sendo com micro- esferas anti-CD3 / CD28 ou microesferas de CV-SA. A Figura 15A mostra a avaliação das células por citometria de fluxo para expressão da superfície de CD25 e CD127, no dia 18. A Figura 15B mostra a avaliação das células por citometria de fluxo para expressão intranu- clear de FOXP3 e Helios, no dia 18. A Figura 15C mostra a avaliação do perfil de produção de citocinas das Tregs expandidas após as célu- las terem sido estimuladas com PMA / ionomicina por 4 horas, nas úl- timas 2 horas na presença de brefeldina A. As células foram então fi- xadas e coradas com anticorpos direcionados a IFN-g, IL-2, IL-10 e IL-

17.

[0068] As Figuras 16A-16B mostram a avaliação da capacidade das células CV-CAR de serem ativadas na presença de fluido sinovial coletado da articulação de pacientes com artrite reumatoide (RA). Tregs expandidas que expressam vários construtos de CAR, bem co- mo Tregs não transduzidas, foram colocadas em cultura na presença de IL-2 com ou sem microesferas de CV-SA ou fluido sinovial do paci- ente com RA. A expressão de CD71 foi avaliada por citometria de fluxo após 3,5 dias de cultura. A Figura 16A mostra a avaliação da expres- são de CD71 e EGFRt (gráficos de pontos). Os números em vermelho (no canto superior direito de cada gráfico) representam a porcentagem de células CD71+ entre a fração EGFRt+. A Figura 16B mostra as por- centagens de células CD71+ entre as frações EGFRt- e EGFRt+ nas diferentes populações de Treg CAR.

[0069] As Figuras 17A-17B mostram a avaliação da capacidade de CAR CV-específica de ser expresso na superfície das Tregs após transdução lentiviral. Tanto o CAR (usando um anticorpo IgG anti- humano (H + L)) quanto o receptor do fator de crescimento epidérmico

(EGFRt) foram detectados por citometria de fluxo. A Figura 17A mostra a avaliação da expressão de CAR e EGFRt na superfície de Tregs não transduzidas, CV / CD28 CAR+ Tregs e CV / 41BB CAR+ Tregs. Fi- gura 17B. Porcentagem de células CAR+ em várias experiências;

[0070] As Figuras 18A-18C mostram a avaliação da capacidade das células T CV-CAR de serem ativadas na presença de fluido sino- vial colhido da articulação de pacientes com artrite reumatoide (RA). As Tregs expandidas que expressam vários construtos de CAR (19,28-CAR Tregs, 19,41BB-CAR Tregs, CV.28-CAR Tregs e 19,41BB-CAR Tregs), bem como Tregs não transduzidas (UTD), fo- ram colocadas em cultura na presença de IL-2 com ou sem microesfe- ras de CV-SA ou fluido sinovial (SF) de 3 pacientes diferentes com RA ou SF de um paciente com gota de controle. A expressão do marcador de ativação CD71 foi avaliada por citometria de fluxo após 3,5 dias de cultura. A Figura 18A mostra a expressão de CD71 e EGFRt na popu- lação de CV.28-CAR Treg após co-cultura em várias condições. A Figura 18B mostra gráficos de pontos representativos mostrando a ex- pressão de CD71 contra EGFRt em 19,28-CAR Tregs e CV.28-CAR Tregs na presença de SF do paciente com gota de controle negativo ou RA SF. A Figura 18C mostra o resumo das porcentagens de células CD71+ entre as frações EGFRt- e EGFRt+ nas diferentes populações de Treg CAR após a co-cultura na presença de SF de pacientes com RA n = 4.

[0071] A Figura 19 mostra a avaliação da expressão de EGFRt em células HEK 293T por citometria de fluxo três dias após a transfecção. O construto CV-CAR é eficientemente expresso na superfície celular das células HEK 293T após a transfecção.

[0072] As Figuras 20A e 20B mostram a avaliação da expressão de vimentina citrulinada na linhagem de células tumorais SKNBE2c após transdução com um plasmídeo lentiviral PAD2-GFP. O gene da enzima humana peptidil arginina desaminase (PAD2) foi inserido em um vetor lentiviral com um repórter GFP e depois transduzido para cé- lulas SKNBE2c, uma linhagem de células tumorais conhecida por ex- pressar a proteína vimentina na superfície celular. A Figura 20A mos- tra, três dias após a transdução, que a expressão de GFP em células SKNBE2C foi avaliada por citometria de fluxo. A Figura 20B mostra que a presença de vimentina citrulinada em células SKNBE2C de ocorrência natural (WT) e transduzidas por PAD2-GFP foi avaliada por coloração por imunofluorescência.

[0073] A Figura 21 mostra a detecção de vimentina citrulinada em fluidos sinoviais por ELISA direto. A presença de vimentina citrulinada foi avaliada por ELISA em fluidos sinoviais de pacientes com RA e pa- cientes com gota de controle negativo. As proteínas vimentina citruli- nadas e não citrulinadas foram usadas como controle positivo e nega- tivo, respectivamente.

[0074] As Figuras 22A-22B mostram a avaliação da estimulação mediada por CAR em Tregs CAR CV-específicas na presença de flui- do sinovial sem células de pacientes com RA. A Figura 22A mostra gráficos de pontos representativos exibindo a expressão de CD71 con- tra EGFRt após 3 dias de cultura na presença de sobrenadante de flu- ido sinovial integral ou livre de células de paciente com RA. A Figura 22B mostra porcentagens de células CD71+ entre as frações EGFRt- e EGFRt+ em CV.28z-CAR Tregs após co-cultura com fluidos sinoviais integrais ou sem células de pacientes com RA.

[0075] As Figuras 23A-23B mostram a geração de células TCRKO CV.28z-CAR+Treg. A Figura 23A mostra a representação esquemática do protocolo para gerar TCRKO CV.28z-CAR+ Tregs. A Figura 23B mostra a pureza das células CV.28z-CAR+ Treg após enriquecimento por citometria de fluxo no dia 9. O gráfico de pontos superior mostra células que não sofreram nocaute CRISPR / Cas9 TCR no dia 0, en-

quanto as células no gráfico de pontos inferior sofreram.

[0076] As Figuras 24A-24B mostram a avaliação da função su- pressora de Tregs CV-CAR após estimulação mediada por CAR. A Figura 24A mostra que as TCRKO CV.28z-CAR+ Tregs foram co- cultivadas com células T CD4+ respondedoras na relação indicada de células respondedoras para supressoras na presença de anticorpo an- ti-CD3 ligado à placa e microesferas CV-pep-SA (CVb). Foi adicionada 3H-timidina no dia 3. Os resultados são mostrados como porcentagem de supressão calculada com base na contagem média por minuto (CPM), medida pela incorporação de 3H timidina, obtida em co-cultura de respondedores e células Treg e a obtida apenas nos respondedo- res da condição (o experimento foi realizado em duplicado). A Figura 24B mostra que TCRKO CV.28z-CAR+ Tregs foram células T CD4+ res- pondedoras na relação de 2:1 (respondedoras:Tregs) na presença de anticorpo anti-CD3 ligado à placa e microesferas de CVb ou Vimenti- na. 19,28z-CAR+ Tregs foram co-cultivadas com células T CD4+ res- pondedoras marcadas com CFSE na relação 2:1 (respondedo- ras:Tregs) na presença de anticorpo anti-CD3 ligado à placa e CVb. Os dados foram analisados como na Figura 24A.

[0077] Existe uma necessidade não atendida de fornecer terapias para doenças autoimunes. Por exemplo, ainda não foi descoberto ne- nhum tratamento para curar a artrite reumatoide. Os pacientes com RA passam por tratamento ao longo da vida com todos os custos associa- dos, potencial de efeitos adversos e inconvenientes. Esta primeira ne- cessidade não atendida é abordada pelas invenções aqui incorpora- das, para curar pacientes com RA, restaurando uma tolerância imuno- lógica apropriada. De um modo mais geral, embora o uso de células T CAR em câncer seja intensamente estudado e tenha mostrado resul- tados muito promissores em ensaios clínicos, o uso de células T CAR ainda não foi testado em distúrbios autoimunes, nem em outros esta-

dos de doenças tal como tumores ou doenças pulmonares obstrutivas crônicas (DPOC), onde a vimentina citrulinada (CV) desempenha um papel. Assim, a segunda necessidade não atendida pela invenção aqui incorporada é a aplicação de terapia com células T CAR para o trata- mento de doenças autoimunes usando Tregs em vez de células T efe- toras.

[0078] Consequentemente, conforme descrito em detalhes na se- ção Exemplos a seguir, um receptor quimérico de antígeno (CAR) foi projetado para atingir especificamente uma proteína pós- traducionalmente modificada chamada vimentina citrulinada (CV) que é expressa na matriz extracelular das articulações inflamadas em pa- cientes com artrite reumatoide (RA) e em algumas células tumorais. A parte variável do fragmento de cadeia simples (scFv) do CV-CAR foi obtida a partir de um anticorpo altamente específico para a proteína CV isolada do sangue periférico de um paciente com RA. A cadeia scFv CV-específica foi inserida em um construto de CAR de segunda geração clonado em um vetor lentiviral. Este construto de CAR foi in- troduzido nas células T efetoras e nas células T reguladoras. As Tregs CV-CAR foram capazes de reconhecer especificamente seu antígeno- alvo na presença de tetrâmeros de peptídeos CV e quando co- cultivados com fluido sinovial de pacientes com RA. Após o reconhe- cimento do antígeno, as Tregs CAR-CV foram ativadas e expandidas, mantendo um fenótipo de Treg. Receptores Quiméricos de Antígeno e Células T

[0079] Os receptores quiméricos de antígeno (CARs) são proteí- nas quiméricas transmembrana projetadas para atribuir especificidade de antígeno às células T. Eles são receptores recombinantes compre- endendo uma região de ligação ao antígeno, uma região transmem- brana e uma região de sinalização intracelular.

[0080] Em geral, as Tregs CV-CAR foram geradas para serem uti-

lizadas no desenvolvimento de uma terapia celular para pacientes com RA. Ver, por exemplo, a Figura 2. A abordagem terapêutica adotada é usar as Tregs do paciente (autólogas), isolando as células de uma amostra de sangue. Em seguida, as Tregs isoladas são manipuladas geneticamente usando o vetor lentiviral portando o transgene CV-CAR. As Tregs CV-CAR passam por duas rodadas de expansão in vitro e são infundidas no paciente em combinação, ou não, com tratamento anti-TNF para otimizar a eficiência das Tregs nos sítios da doença. Ver, por exemplo, a Figura 1.

[0081] O antígeno direcionado pelo CV-CAR é um antígeno pós- traducionalmente modificado e liga a versão citrulinada da proteína, mas não a sua forma nativa. O CV-CAR é o primeiro CAR desenvolvi- do para um antígeno citrulinado. Os resultados descritos na seção Exemplos mostram que o CAR direcionado a um antígeno pós- traducionalmente modificado pode reconhecer com êxito seu alvo e ativar as células, fornecendo evidências de que antígenos pós- traducionalmente modificados representam ferramentas terapêuticas muito interessantes no desenvolvimento de novas estratégias terapêu- ticas em distúrbios autoimunes e mesmo em alguns tipos de câncer. Além disso, este CAR tem como alvo uma proteína da matriz extrace- lular secretada por algumas células em um complexo multimérico que pode representar um novo uso de CARs. A vimentina citrulinada (CV) está presente na matriz extracelular das articulações inflamadas em pacientes com artrite reumatoide (RA) e expressa em algumas células tumorais. A vimentina é uma proteína de filamento intermediário tipo III e sua forma citrulinada está abundantemente presente no microambi- ente articular. A expressão de CV é limitada ao baço humano, placenta em indivíduo saudável. 50% dos pacientes com RA apresentam CV altamente presente no tecido sinovial. Ver, por exemplo, a Figura 3.

[0082] Consequentemente, em certas modalidades, um receptor quimérico de antígeno (CAR) compreende um domínio de ligação an- tígeno-específico, um domínio de dobradiça, um domínio transmem- brana, domínio coestimulador, e um domínio de sinalização CD3, em que o domínio de ligação antígeno-específico se liga especificamente polipeptídeos vimentina citrulinada (CV) ou seus peptídeos. Os poli- peptídeos CV ou seus peptídeos são pós-traducionalmente modifica- dos. Em certas modalidades, o domínio coestimulador compreende um polipeptídeo CD28 ou 41BB. Em certas modalidades, o domínio de ligação antígeno-específico compreende um anticorpo, fragmento de anticorpo ou aptâmero. Em certas modalidades, o fragmento de anti- corpo é um fragmento de cadeia simples. Por exemplo, o fragmento de cadeia simples é um fragmento variável de cadeia simples (scFv).

[0083] Em certas modalidades, um receptor quimérico de antígeno específico para polipeptídeos ou peptídeos de vimentina citrulinada (CV) compreende SEQ ID NO: 1 ou 2.

[0084] Em certas modalidades, um receptor quimérico de antígeno compreendendo um domínio coestimulador CD28 é codificado por uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 50% de iden- tidade de sequência com uma sequência de ácidos nucleicos definida como SEQ ID NO: 1. Em certas modalidades, um receptor quimérico de antígeno compreendendo um domínio coestimulador CD28 é codifi- cado por uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 75% de identidade de sequência com uma sequência de ácidos nucleicos definida como SEQ ID NO: 1. Em certas modalidades, um receptor quimérico de antígeno compreendendo um domínio coestimulador CD28 é codificado por uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com uma sequência de ácidos nucleicos apresentada como SEQ ID NO: 1. Em certas modalidades, o receptor quimérico de antígeno compreendendo o domínio coestimu- lador CD28 é codificado por uma sequência de ácidos nucleicos com-

preendendo SEQ ID NO: 1.

[0085] Em algumas modalidades, o receptor quimérico de antíge- no que compreende o domínio coestimulador CD28 tem uma sequên- cia que tem pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86 %, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1.

[0086] Em outras modalidades, o receptor quimérico de antígeno compreendendo o domínio coestimulador 41BB é codificado por uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 50% de identidade de sequência com uma sequência de ácidos nucleicos definida como SEQ ID NO: 2. Em certas modalidades, o receptor quimérico de antí- geno que compreende o domínio coestimulador 41BB é codificado por uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 75% de identi- dade de sequência com uma sequência de ácidos nucleicos definida como SEQ ID NO: 2. Em certas modalidades, o receptor quimérico de antígeno compreendendo o domínio coestimulador 41BB é codificado por uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com uma sequência de ácidos nucleicos apresentada como SEQ ID NO: 2. Em certas modalidades, o receptor quimérico de antígeno compreendendo o domínio coestimulador 41BB é codificado por uma sequência de ácidos nucleicos compreendendo SEQ ID NO: 2.

[0087] Em algumas modalidades, o receptor quimérico de antíge- no compreendendo o domínio coestimulador 41BB tem uma sequência que tem pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86 %, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2.

[0088] Em certas modalidades, um receptor quimérico de antígeno específico para polipeptídeos ou peptídeos de vimentina citrulinada (CV) compreende um ou mais componentes do receptor quimérico de antígeno (por exemplo, um domínio de ligação CV-específico, um do- mínio de dobradiça, um domínio transmembrana, um domínio coesti- mulador e / ou um domínio de sinalização CD3) codificado pela SEQ ID NO: 1 ou 2 ou variantes da mesma tendo pelo menos cerca de 70% (tal como pelo menos cerca de 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais) de identidade de sequên- cia.

Por exemplo, em algumas modalidades, o receptor quimérico de antígeno compreende um scFv anti-CV codificado por SEQ ID NO: 1 ou 2, tal como um scFv codificado pela sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 7 ou uma variante da mesma tendo pelo menos cerca de 70% (tal como pelo menos cerca de 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais) de identidade de sequência.

Em algumas modalidades, o receptor quimérico de antí- geno compreende um domínio espaçador CD28 humano codificado por SEQ ID NO: 1 ou 2, tal como um domínio espaçador CD28 huma- no codificado pela sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 8 ou uma variante da mesma tendo pelo menos cerca de 70% (tal como pelo menos cerca de 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais) de identidade de sequência.

Em algumas modalidades, o receptor quimérico de antígeno compreende um domínio transmembrana CD28 codificado por SEQ ID NO: 1 ou 2, tal como um domínio transmembrana CD28 codificado pela sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 9 ou uma variante da mesma ten- do pelo menos cerca de 70% (tal como pelo menos cerca de 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98%, 99% ou mais) de identidade de sequência.

Em algumas modalidades, o receptor quimérico de antígeno compreende um domínio de sinaliza- ção CD3 codificado por SEQ ID NO: 1 ou 2, como um domínio de si- nalização CD3 codificado pela sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 10 ou uma variante da mesma tendo pelo menos cerca de 70%

(tal como pelo menos cerca de 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98%, 99% ou mais) de identidade de se- quência. Em algumas modalidades, o receptor quimérico de antígeno compreende um domínio coestimulador codificado pela SEQ ID NO: 1 ou 2, tal como um domínio coestimulador codificado pela sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 11 ou 12 ou uma variante da mesma tendo em pelo menos cerca de 70% (tal como pelo menos cerca de 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 97%, 98%, 99% ou mais) de identidade de sequência.

[0089] Em certas modalidades, um receptor quimérico de antígeno compreendendo um domínio coestimulador CD28 é codificado por uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 50% de iden- tidade de sequência com uma sequência de ácidos nucleicos apresen- tada na SEQ ID NO: 1, tal como a sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 5. Assim, em algumas modalidades, o receptor quimérico de antígeno é codificado por uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 50% (tal como pelo menos cerca de 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 99 % ou mais) de identidade de se- quência com a SEQ ID NO: 5. Em certas modalidades, um receptor quimérico de antígeno compreendendo um domínio coestimulador CD28 é codificado por uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 75% de identidade de sequência uma sequência de ácidos nucleicos apresentada como SEQ ID NO: 5. Em certas modalidades, um receptor quimérico de antígeno compreendendo um domínio coes- timulador CD28 é codificado por uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com uma se- quência de ácidos nucleicos apresentada como SEQ ID NO: 5. Em certas modalidades, o receptor quimérico de antígeno compreendendo o domínio coestimulador CD28 é codificado por uma sequência de ácidos nucleicos compreendendo SEQ ID NO: 5.

[0090] Em algumas modalidades, o receptor quimérico de antíge- no que compreende o domínio coestimulador CD28 é codificado por uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de se- quência com a SEQ ID NO: 5.

[0091] Em certas modalidades, um receptor quimérico de antígeno compreendendo um domínio coestimulador CD28 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos cerca de 70% (tal como pelo menos cerca de 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais) de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 13. Em algumas modalidades, o receptor quimérico de antígeno compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo me- nos cerca de 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 13. Em algumas modalidades, o receptor quimérico de antígeno compre- ende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 13. Em algumas moda- lidades, o receptor quimérico de antígeno compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos cerca de 95% de identidade de se- quência com a SEQ ID NO: 13. Em algumas modalidades, o receptor quimérico de antígeno compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13.

[0092] Em outras modalidades, o receptor quimérico de antígeno compreendendo o domínio coestimulador 41BB é codificado por uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 50% de identidade de sequência com uma sequência de ácidos nucleicos apresentada em SEQ ID NO: 2, tal como a sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 6. Assim, em algumas modalidades, o receptor quimérico de antígeno é codificado por uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 50% (tal como pelo menos cerca de 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 99 % ou mais) de identidade de se- quência com a SEQ ID NO: 6. Em certas modalidades, o receptor qui- mérico de antígeno compreendendo o domínio coestimulador 41BB é codificado por uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 75% de identidade de sequência com uma sequência de ácido nuclei- co apresentada como SEQ ID NO: 6. Em certas modalidades, o recep- tor quimérico de antígeno compreendendo o domínio coestimulador 41BB é codificado por uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com uma sequência de ácidos nucleicos apresentada como SEQ ID NO: 6. Em certas modali- dades, o receptor quimérico de antígeno compreendendo o domínio coestimulador 41BB é codificado por uma sequência de ácidos nuclei- cos compreendendo a SEQ ID NO: 6.

[0093] Em algumas modalidades, o receptor quimérico de antíge- no que compreende o domínio coestimulador 41BB é codificado por uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de se- quência com a SEQ ID NO: 6.

[0094] Em certas modalidades, um receptor quimérico de antígeno compreendendo um domínio coestimulador 41BB compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos cerca de 70% (tal como pelo menos cerca de 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais) de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 14. Em algumas modalidades, o receptor quimérico de antígeno compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo me- nos cerca de 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 14. Em algumas modalidades, o receptor quimérico de antígeno compre-

ende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 14. Em algumas moda- lidades, o receptor quimérico de antígeno compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos cerca de 95% de identidade de se- quência com a SEQ ID NO: 14. Em algumas modalidades, o receptor quimérico de antígeno compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14.

[0095] Em certas modalidades, o CAR compreende um ou mais domínios coestimuladores compreendendo: CD28, ICOS, OX-40 ou 41BB. A região de sinalização intracelular de um CAR ou célula da in- venção pode compreender regiões de sinalização de uma, duas, três, quatro ou todas as cinco dessas proteínas, além das outras regiões aqui especificadas. Em algumas modalidades, o domínio coestimula- dor CD28 é codificado pela sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 11 ou uma variante da mesma tendo pelo menos cerca de 50% (tal como pelo menos cerca de 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais) de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, o domínio coestimulador CD28 tem a se- quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19 ou uma variante da mes- ma tendo pelo menos cerca de 70% (tal como pelo menos cerca de 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais) de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 19. Em algumas modalidades, o domínio coestimulador 41BB é codificado pe- la sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 12 ou uma variante da mesma tendo pelo menos cerca de 50% (tal como pelo menos cer- ca de 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97 %, 98%, 99% ou mais) de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 12. Em algumas modali- dades, o domínio coestimulador 41BB tem a sequência de aminoáci-

dos da SEQ ID NO: 20 ou uma variante da mesma tendo pelo menos cerca de 70% (tal como pelo menos cerca de 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais) de identi- dade de sequência com a SEQ ID NO: 20.

[0096] Os domínios coestimuladores de um CAR ou célula da in- venção podem compreender domínios coestimuladores 41BB e CD28. O domínio coestimulador 41BB pode estar a jusante dos domínios co- estimuladores CD28.

[0097] Em certas modalidades, o CAR compreende um domínio de sinalização CD3. Em algumas modalidades, o domínio de sinalização CD3 é codificado pela sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 10 ou uma variante da mesma tendo pelo menos cerca de 50% (tal como pelo menos cerca de 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 10. Em algumas modalidades, o domínio de sinalização CD3 tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18 ou uma variante da mesma tendo pelo menos cerca de 70% (tal como pelo menos cerca de 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais) de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 18.

[0098] Em certas modalidades, o CAR compreende um domínio transmembrana CD28. Em algumas modalidades, o domínio trans- membrana CD28 é codificado pela sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 9 ou uma variante da mesma que tem pelo menos cerca de 50% (tal como pelo menos cerca de 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 99 %, ou mais) de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 9. Em algumas modalidades, o domínio transmembrana CD28 tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 17 ou uma va- riante da mesma tendo pelo menos cerca de 70% (tal como pelo me-

nos cerca de 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais) de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 17.

[0099] O CAR também pode compreender uma região espaçadora ou de dobradiça situada entre a região de ligação ao antígeno e a membrana plasmática das células T. Geralmente, um espaçador ou dobradiça é uma sequência derivada da subclasse de IgG lgG1, lgG4, IgD ou CD8. Em certas modalidades, a região de dobradiça compre- ende um motivo CD28. A região da dobradiça pode ter qualquer com- primento. Em algumas modalidades, a região de dobradiça compreen- de 1 aminoácido ou 10 aminoácidos ou 20 aminoácidos ou 50 aminoá- cidos ou 60 aminoácidos ou 70 aminoácidos ou 80 aminoácidos ou 100 aminoácidos ou 120 aminoácidos ou 140 aminoácidos ou 140 aminoácidos ou 160 aminoácidos ou 180 aminoácidos ou 200 aminoá- cidos ou 250 aminoácidos ou 300 aminoácidos ou qualquer número entre eles. Em algumas modalidades, o espaçador é codificado pela sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 8 ou uma variante da mesma tendo pelo menos cerca de 50% (tal como pelo menos cerca de 55%, 60%, 65%, 70%, 75 %, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais) de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8. Em algumas modalidades, o espaçador tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 16 ou uma variante da mesma tendo pelo menos cerca de 70% (tal como pelo menos cerca de 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais) de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 16.

[00100] Um CAR pode ainda compreender uma região ligante. Essa pode ser rica em glicina para flexibilidade. A região ligante pode ser rica em serina e treonina para solubilidade. A região ligante pode co- nectar-se ao N terminal da cadeia variável pesada (VH) com o C ter-

minal da cadeia variável leve (VL) ou vice-versa.

[00101] Domínio de Ligação ao Antígeno

[00102] Em certas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno é ou compreende um anticorpo ou fragmento de anticorpo. Em certas modalidades, os anticorpos são anticorpos humanos, incluindo qual- quer um conhecido por se ligar a uma molécula alvo. O termo "anticor- po" aqui é usado no sentido mais amplo e inclui anticorpos policlonais e monoclonais, incluindo anticorpos intactos e fragmentos de anticor- pos funcionais (ligação ao antígeno), incluindo fragmentos de ligação ao antígeno (Fab), fragmentos F(ab’)2, fragmentos Fab’, fragmentos Fv, fragmentos de IgG recombinante (rlgG), regiões variáveis de ca- deia pesada (VH) capazes de se ligar especificamente ao antígeno, fragmentos de anticorpo de cadeia simples, incluindo fragmentos vari- áveis de cadeia simples (scFv), e anticorpos de domínio único (por exemplo, sdAb, sdFv, nanocorpo, nanocorpo de camelídeo) ou frag- mentos. O termo abrange formas de imunoglobulinas geneticamente modificadas e / ou modificadas de outra forma, tal como intracorpos, pepticorpos, anticorpos quiméricos, anticorpos totalmente humanos, anticorpos humanizados e anticorpos heteroconjugados, multiespecífi- cos, por exemplo, biespecíficos, anticorpos, diacorpos, triacorpos e tetrocorpos, di-scFv tandem, tri-scFv tandem. A menos que indicado ao contrário, o termo "anticorpo" deve ser entendido como abrangendo fragmentos funcionais de anticorpos. O termo também abrange anti- corpos intactos ou de comprimento total, incluindo anticorpos de qual- quer classe ou subclasse, incluindo IgG e suas subclasses, IgM, IgE, IgA e IgD.

[00103] Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antíge- no é um anticorpo humanizado de seus fragmentos. Um anticorpo "humanizado" é um anticorpo no qual todos ou substancialmente todos os resíduos de aminoácidos de CDR são derivados de CDRs não hu-

manas e todos ou substancialmente todos os resíduos de aminoácidos de FR são derivados de FRs humanas. Um anticorpo humanizado po- de opcionalmente incluir pelo menos uma porção de uma região cons- tante de anticorpo derivada de um anticorpo humano. Uma "forma hu- manizada" de um anticorpo não humano refere-se a uma variante do anticorpo não humano que foi submetida à humanização, tipicamente para reduzir a imunogenicidade para seres humanos, mantendo a es- pecificidade e a afinidade do anticorpo não humano parental. Em al- gumas modalidades, alguns resíduos de FR em um anticorpo humani- zado são substituídos por resíduos correspondentes de um anticorpo não humano (por exemplo, o anticorpo do qual os resíduos CDR são derivados), por exemplo, para restaurar ou melhorar a especificidade ou a afinidade de anticorpos.

[00104] Em algumas modalidades, as cadeias pesada e leve de um anticorpo podem ser de comprimento total ou podem ser uma porção de ligação ao antígeno (Fab, F(ab’)2, Fv ou um fragmento Fv de cadeia simples (scFv)). Em outras modalidades, a região constante da cadeia pesada do anticorpo é escolhida a partir, por exemplo, de IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgAl, IgA2, IgD e IgE, particularmente escolhida a par- tir, por exemplo, de IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4, mais particularmente, IgGl (por exemplo, IgGl humana). Em outra modalidade, a região cons- tante da cadeia leve do anticorpo é escolhida a partir, por exemplo, de kappa ou lambda, particularmente kappa.

[00105] Entre os anticorpos fornecidos estão fragmentos de anti- corpos. Um "fragmento de anticorpo" refere-se a uma molécula que não um anticorpo intacto que compreende uma porção de um anticor- po intacto que se liga o antígeno ao qual o anticorpo intacto se liga. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem, mas não estão limita- dos a, Fv, Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)2; diacorpos; anticorpos lineares; regiões variáveis de cadeia pesada (VH), moléculas de anticorpo de cadeia simples tal como scFvs e anticorpos únicos de VH de domínio único; e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpos. Em modalidades particulares, os anticorpos são frag- mentos de anticorpo de cadeia simples compreendendo uma região variável de cadeia pesada e / ou uma região variável de cadeia leve, tal como scFvs.

[00106] O termo "região variável" ou "domínio variável", quando usado em referência a um anticorpo, tal como um fragmento de anti- corpo, refere-se ao domínio de uma cadeia pesada ou leve de um an- ticorpo que está envolvida na ligação do anticorpo ao antígeno. Os domínios variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve (VH e VL, res- pectivamente) de um anticorpo nativo geralmente têm estruturas se- melhantes, com cada domínio compreendendo quatro regiões estrutu- rais conservadas (FRs) e três CDRs. (Ver, por exemplo, Kindt e outros Kuby Immunology, 6ª ed., WH Freeman and Co., página 91 (2007). Um único domínio VH ou VL pode ser suficiente para conferir especifi- cidade de ligação ao antígeno. Além disso, anticorpos que ligam a um antígeno específico podem ser isolados usando um domínio VH ou VL de um anticorpo que se liga ao antígeno para triar uma biblioteca de domínios VL ou VH complementares, respectivamente. Ver, por exem- plo, Portolano e outros, J. Immunol. 150: 880 a 887 (1993); Clarkson e outros, Nature 352: 624 a 628 (1991).

[00107] Anticorpos de domínio único são fragmentos de anticorpo que compreendem todo ou uma porção do domínio variável da cadeia pesada ou todo ou uma porção do domínio variável da cadeia leve de um anticorpo. Em certas modalidades, um anticorpo de domínio único é um anticorpo de domínio único humano.

[00108] Os fragmentos de anticorpos podem ser produzidos por vá- rias técnicas, incluindo, entre outras, a digestão proteolítica de um an- ticorpo intacto, bem como a produção por células hospedeiras recom-

binantes. Em algumas modalidades, os anticorpos são fragmentos produzidos de forma recombinante, tal como fragmentos compreen- dendo arranjos que não ocorrem naturalmente, como aqueles com du- as ou mais regiões ou cadeias de anticorpos unidas por ligantes sinté- ticos, por exemplo, ligantes peptídicos e / ou que podem não ser pro- duzidos pela digestão enzimática de um anticorpo intacto de ocorrên- cia natural. Em alguns aspectos, os fragmentos de anticorpo são scFvs.

[00109] Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmentos de anti- corpo do CAR têm alta afinidade de ligação a um antígeno-alvo espe- cífico ou a antígenos-alvo pós-traducionalmente modificados. Nas mo- dalidades, a afinidade de ligação aumentada é maior do que a efetua- da por um antígeno de referência.

[00110] Em certas modalidades, o antígeno quimérico se liga espe- cificamente a um peptídeo CV tendo pelo menos 50% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3 ou 4. Em certas modalidades, o antí- geno quimérico se liga especificamente a um peptídeo CV tendo pelo menos 75% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3 ou 4. Em certas modalidades, o antígeno quimérico se liga especificamente a um peptídeo CV tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3 ou 4.

[00111] Em certas modalidades, o antígeno quimérico se liga espe- cificamente a um peptídeo CV tendo pelo menos 50% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 21 ou 22. Em certas modalidades, o an- tígeno quimérico se liga especificamente a um peptídeo CV tendo pelo menos 75% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 21 ou 22. Em certas modalidades, o antígeno quimérico se liga especificamente a um peptídeo CV tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 21 ou 22.

[00112] Em certas modalidades, o antígeno quimérico se liga espe-

cificamente a um peptídeo CV.

[00113] Células T: As células T reguladoras (Tregs) são importantes na manutenção da homeostase das células imunes, como evidenciado pelas consequências catastróficas da ablação genética ou física da população de Treg. Especificamente, as células Treg mantêm a ordem no sistema imunológico, impondo uma regulação negativa dominante em outras células imunes. Amplamente classificadas em Tregs natu- rais ou adaptativas (induzidas); as Tregs naturais são células T CD4+ CD25+ que se desenvolvem e emigram do timo para desempenhar seu papel fundamental na homeostase imune. As Tregs adaptativas são células T CD4+ não reguladoras que adquirem expressão de CD25 (IL- 2R alfa) fora do timo e são normalmente induzidas por processos de inflamação e doença, tal como autoimunidade e câncer.

[00114] Há evidências crescentes de que as Tregs manifestam sua função por meio de uma infinidade de mecanismos que incluem a se- creção de fatores solúveis imunossupressores, tal como IL-9, IL-10 e TGF beta, regulação mediada por contato celular através de TCR de alta afinidade e outras moléculas coestimuladoras tal como CTLA-4, GITR, e atividade citolítica. Sob a influência de TGF beta, as células Treg adaptativas amadurecem em sítios periféricos, incluindo tecido linfoide associado à mucosa (MALT), a partir de precursores de CD4+ Treg, onde adquirem a expressão de marcadores típicos de Tregs, in- cluindo CD25, CTLA4 e GITR / AITR. Após a indução do fator de transcrição Foxp3, as células Treg começam seu efeito supressor. Isso inclui a secreção de citocinas, incluindo IL-10 e TGF beta, que podem induzir a parada do ciclo celular ou apoptose em células T efetoras, e podem bloquear a coestimulação e a maturação das células dendríti- cas. Isolamento de Células Treg Viáveis

[00115] Os procedimentos utilizados para isolar as células Treg são fornecidos em detalhes na seção Exemplos a seguir.

[00116] Em geral, as células reguladoras T foram originalmente identificadas como uma população de células T CD4+ CD25+ com ca- pacidade de suprimir uma resposta imune. A identificação de Foxp3 como o "principal regulador" das Tregs foi uma etapa crucial na defini- ção das Tregs como uma linhagem de células T distinta. A identifica- ção de marcadores antigênicos adicionais na superfície das Tregs permitiu a identificação e a classificação FACS de Tregs viáveis com maior pureza, resultando em uma população de Tregs mais altamente enriquecida e supressora. Além de CD4 e CD25, sabe-se agora que Tregs de camundongos e seres humanos expressam GITR / AITR, CTLA-4, mas expressam apenas baixos níveis de CD127 (IL-7Ra). Além disso, as Tregs podem existir em diferentes estados, que podem ser identificados com base na sua expressão de marcadores de super- fície. As Tregs que se desenvolvem no timo a partir dos timócitos CD4+ são conhecidas como Tregs "naturais", no entanto, as Tregs também podem ser induzidas na periferia a partir de células T CD4+ virgens em resposta a baixas doses de TCR, TGF beta e IL-2. Essas Tregs "indu- zidas" secretam a citocina imunossupressora IL-10. O fenótipo das Tregs muda novamente à medida que elas são ativadas, e marcadores incluindo GARP em camundongos e seres humanos, e CD103 em ca- mundongos demonstraram ser úteis para a identificação de Tregs ati- vadas. CD45RO e CD45RA são expressos exclusivamente por sub- conjuntos distintos de células CD4 humanas, e podem ser usados para dividir células T CD4+ FoxP3+ humanas em três subpopulações fenoti- picamente e funcionalmente distintas: células Treg em repouso CD45RA+ CD25+ FoxP3low e células Treg ativadas CD45RO+ CD25high FoxP3high, ambas eram supressoras in vitro, e células T efetoras não supressoras (Teffs) produtoras de citocinas pró-inflamatórias CD45RO+ CD25+ FoxP3low.

[00117] Consequentemente, em certas modalidades, uma célula T isolada é modificada para expressar: um receptor quimérico de antíge- no (CAR) compreendendo um domínio de ligação ao antígeno ligado a pelo menos um domínio coestimulador e domínio de sinalização CD3, em que o domínio de ligação ao antígeno compreende um fragmento variável de cadeia simples (scFv) que se liga especificamente à vimen- tina citrulinada (CV). Em certas modalidades, o domínio coestimulador compreende um polipeptídeo CD28 ou 41BB.

Em certas modalidades, o receptor quimérico de antígeno que compreende o domínio coesti- mulador CD28 tem uma sequência que tem pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87 %, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidade de se- quência com a SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o receptor quimérico de antígeno compreendendo o domínio coestimulador 41BB tem uma sequência que tem pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2. Em certas modalidades, o receptor quimérico de antí- geno compreendendo o domínio coestimulador CD28 compreende um ou mais componentes CAR (por exemplo, um domínio de ligação CV- específico, um domínio de dobradiça, um domínio transmembrana, um domínio coestimulador e / ou um domínio de sinalização CD3) codifi- cado por uma sequência de ácido nucleico que tem pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identi- dade de sequência com a SEQ ID NO: 5. Em certas modalidades, o receptor quimérico de antígeno compreendendo o domínio coestimu- lador CD28 compreende um ou mais componentes CAR (por exemplo, um domínio de ligação CV-específico, um domínio de dobradiça, um domínio transmembrana, um domínio coestimulador, e / ou um domí-

nio de sinalização CD3) selecionado a partir de uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 70% (tal como pelo menos cerca de 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais) de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 13. Em algumas modalidades, o receptor quimérico de antígeno compreen- dendo o domínio coestimulador 41BB compreende um ou mais com- ponentes CAR (por exemplo, um domínio de ligação CV-específico, um domínio de dobradiça, um domínio transmembrana, um domínio coestimulador e / ou um domínio de sinalização CD3) codificado por uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 50%, 55%, 60%, 65 %, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 6. Em algumas modalidades, o receptor quimérico de antígeno compreendendo o domínio coestimulador 41BB compreende um ou mais componentes CAR (por exemplo, um domínio de ligação CV-específico, um domínio de dobradiça, um domínio transmembrana, um domínio coestimulador e / ou um domínio de sina- lização CD3) selecionado a partir de uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 70% (tal como pelo menos cerca de 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais) de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 14. Em certas modalidades, o receptor quimérico de antígeno que compreende o domínio coestimulador CD28 é codificado por uma sequência de áci- dos nucleicos que tem pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 5 Em certas modalidades, o receptor quimérico de antígeno que com- preende o domínio coestimulador CD28 compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 70% (tal como pelo menos cerca de 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%,

98%, 99% ou mais) de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 13. Em algumas modalidades, o receptor quimérico de antígeno que com- preende o domínio coestimulador 41BB é codificado por uma sequên- cia de ácidos nucleicos que tem pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 6. Em algumas modalidades, o receptor quimérico de antígeno compreendendo o domínio coestimulador 41BB compre- ende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 70% (tal como pelo menos cerca de 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 99 % ou mais) de identidade de se- quência com a SEQ ID NO: 14.

[00118] Em certas modalidades, a célula T é uma célula T regulado- ra (Treg) de mamífero, em que a célula Treg é CD4+, CD25+, CD127-, FOXP3+ e / ou Helios+/-. Em outras modalidades, a célula T é uma cé- lula T reguladora (Treg) de mamífero, em que a célula Treg é CD4+, CD25+, CD127- e / ou FOXP3+. Métodos para Isolamento de Células

[00119] Qualquer número de métodos conhecidos na técnica pode ser usado para isolar células, tal como Tregs, ou qualquer outro tipo de célula que possa ser utilizado na realização do tratamento de um indi- víduo. Assim, também são fornecidas várias outras células genetica- mente modificadas que expressam os receptores quiméricos de antí- geno, por exemplo, CARs. As células geralmente são células eucarió- ticas, tal como células de mamíferos, e tipicamente são células huma- nas. Em algumas modalidades, as células são derivadas do sangue, medula óssea, linfa ou órgãos linfoides, são células do sistema imuno- lógico, tal como células da imunidade inata ou adaptativa, por exem- plo, células mieloides ou linfoides, incluindo linfócitos, tipicamente cé- lulas T e / ou células NK. Outras células exemplificativas incluem célu-

las-tronco, tal como células-tronco multipotentes e pluripotentes, inclu- indo células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs). As células são ti- picamente células primárias, tal como aquelas isoladas diretamente de um indivíduo e / ou isoladas de um indivíduo e congeladas. Em algu- mas modalidades, as células incluem um ou mais subconjuntos de cé- lulas T ou outros tipos de células, tal como populações integrais de células T, células CD4+, células CD8+ e subpopulações das mesmas, tal como as definidas por função, estado de ativação, maturidade, po- tencial para capacidades de diferenciação, expansão, recirculação, localização e / ou persistência, especificidade de antígeno, tipo de re- ceptor de antígeno, presença em um órgão ou compartimento especí- fico, perfil de secreção de marcador ou citocina, e / ou grau de diferen- ciação. Com referência ao indivíduo a ser tratado, as células podem ser alogênicas e / ou autólogas. Entre os métodos incluem métodos disponíveis no mercado. Em alguns aspectos, tal como em tecnologias disponíveis no mercado, as células são pluripotentes e / ou multipoten- tes, tal como células-tronco, tal como células-tronco pluripotentes in- duzidas (iPSCs). Em algumas modalidades, os métodos incluem isolar células do indivíduo, preparar, processar, cultivar e / ou manipulá-las, como descrito aqui, e reintroduzi-las no mesmo paciente, antes ou de- pois da criopreservação.

[00120] Entre os subtipos e subpopulações de células T e / ou CD4+ e / ou CD8+, estão células T virgens (TN), células T efetoras (TEFF), cé- lulas T de memória e seus subtipos, tal como memória de células T de memória de células-tronco (células T de memória central TSCMX (célu- las T efetoras de memória TCM (TEM), ou células T de memória efetora terminalmente diferenciada, linfócitos infiltrantes de tumor (TIL), célu- las T imaturas, células T maduras, células T auxiliares, células T cito- tóxicas, células T invariantes associadas à mucosa (MAIT), células T reguladoras adaptativas e de ocorrência natural (Treg), células T auxi-

liares, tal como células TH1, células TH 2, células TH 3, células TH 17, células TH 17, células TH 9, células TH 22, células T auxiliares folicula- res, células T alfa / beta, e células T delta / gama.

[00121] Em algumas modalidades, as células são células extermi- nadoras naturais (NK). Em algumas modalidades, as células são mo- nócitos ou granulócitos, por exemplo, células mieloides, macrófagos, neutrófilos, células dendríticas, mastócitos, eosinófilos e / ou basófilos.

[00122] Em algumas modalidades, as células incluem um ou mais ácidos nucleicos introduzidos por engenharia genética e, assim, ex- pressam produtos recombinantes ou geneticamente modificados por esses ácidos nucleicos. Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos são heterólogos, ou seja, normalmente não estão presentes em uma célula ou amostra obtida da célula, tal como uma obtida de outro orga- nismo ou célula, que, por exemplo, normalmente não é encontrado na célula que está sendo manipulada e / ou um organismo do qual essa célula é derivada. Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos não ocorrem naturalmente, tal como um ácido nucleico não encontrado na natureza, incluindo um que compreende combinações quiméricas de ácidos nucleicos que codificam vários domínios de vários tipos de cé- lulas diferentes.

[00123] Métodos exemplificativos de isolar células e manipular es- sas células com um CAR são descritos na seção Exemplos a seguir.

[00124] Em algumas modalidades, a preparação das células mani- puladas inclui uma ou mais etapas de cultura e / ou preparação. As células para introdução do CAR, podem ser isoladas de uma amostra, tal como uma amostra biológica, por exemplo, uma obtida ou derivada de um indivíduo. Em algumas modalidades, o indivíduo do qual a célu- la é isolada é aquele que tem a doença ou condição ou precisa de uma terapia celular ou ao qual a terapia celular será administrada. O indivíduo em algumas modalidades é um ser humano que precisa de uma intervenção terapêutica específica, tal como a terapia celular ado- tiva para a qual as células estão sendo isoladas, processadas e / ou manipuladas.

[00125] Consequentemente, as células em algumas modalidades são células primárias, por exemplo, células humanas primárias. As amostras incluem tecido, fluido e outras amostras colhidas diretamente do indivíduo, bem como amostras resultantes de uma ou mais etapas de processamento, tal como separação, centrifugação, engenharia ge- nética (por exemplo, transdução com vetor viral), lavagem e / ou incu- bação. A amostra biológica pode ser uma amostra obtida diretamente de uma fonte biológica ou de uma amostra que é processada. As amostras biológicas incluem, mas não estão limitadas a, fluidos corpo- rais, tal como sangue, plasma, soro, líquido cefalorraquidiano, fluido sinovial, urina e suor, amostras de tecidos e órgãos, incluindo amos- tras processadas delas derivadas.

[00126] Em alguns aspectos, a amostra da qual as células são deri- vadas ou isoladas é sangue ou uma amostra derivada de sangue, ou é derivada de um produto de aférese ou leucaférese. Amostras exempli- ficativas incluem sangue integral, células mononucleares do sangue periférico (PBMCs), leucócitos, medula óssea, timo, biópsia de tecido, tumor, leucemia, linfoma, linfonodo, tecido linfoide associado ao intes- tino, tecido linfoide associado à mucosa, baço, outros tecidos linfoides, fígado, pulmão, estômago, intestino, cólon, rim, pâncreas, mama, os- so, próstata, colo do útero, testículos, ovários, amídalas ou outro órgão e / ou células deles derivadas. As amostras incluem, no contexto da terapia celular, por exemplo, terapia celular adotiva, amostras de fon- tes autólogas e alogênicas.

[00127] Em algumas modalidades, as células são derivadas de li- nhagens de células, por exemplo, linhagens de células T. As células em algumas modalidades são obtidas a partir de uma fonte xenogêni-

ca, por exemplo, de camundongo, rato, primata não humano ou porco.

[00128] Em algumas modalidades, o isolamento das células inclui uma ou mais etapas de preparação e / ou separação por células não baseadas em afinidade. Em alguns exemplos, as células são lavadas, centrifugadas e / ou incubadas na presença de um ou mais reagentes, por exemplo, para remover componentes indesejados, enriquecer para componentes desejados, lisar ou remover células sensíveis a reagen- tes específicos. Em alguns exemplos, as células são separadas com base em uma ou mais propriedades, tal como densidade, propriedades aderentes, tamanho, sensibilidade e / ou resistência a componentes específicos.

[00129] Em alguns exemplos, as células do sangue circulante de um indivíduo são obtidas, por exemplo, por aférese ou leucaférese. As amostras, em alguns aspectos, contêm linfócitos, incluindo células T, monócitos, granulócitos, células B, outros glóbulos brancos nucleados, glóbulos vermelhos e / ou plaquetas e, em alguns aspectos, contêm outras células que não glóbulos vermelhos e plaquetas.

[00130] Em algumas modalidades, as células do sangue coletadas do indivíduo são lavadas, por exemplo, para remover a fração plasmá- tica e colocar as células em um tampão ou meio apropriado para as subsequentes etapas de processamento. Em algumas modalidades, as células são lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS). Em algumas modalidades, a solução de lavagem carece de cálcio e / ou magnésio e / ou muitos ou todos os cátions divalentes. Em alguns aspectos, uma etapa de lavagem é realizada por uma cen- trífuga semiautomatizada de fluxo contínuo (por exemplo, o processa- dor de células Cobe 2991, Baxter), de acordo com as instruções do fabricante. Em alguns aspectos, uma etapa de lavagem é realizada por filtração de fluxo tangencial (TFF) de acordo com as instruções do fa- bricante. Em algumas modalidades, as células são ressuspensas em uma variedade de tampões biocompatíveis após a lavagem, tal como, por exemplo, PBS livre de Ca++ / Mg++. Em certas modalidades, os componentes de uma amostra de células do sangue são removidos e as células ressuspensas diretamente nos meios de cultura.

[00131] Em algumas modalidades, os métodos incluem métodos de separação de células com base na densidade, tal como a preparação de glóbulos brancos a partir de sangue periférico através da lise dos glóbulos vermelhos e centrifugação através de um gradiente de Percoll ou Ficoll.

[00132] Em algumas modalidades, os métodos de isolamento inclu- em a separação de diferentes tipos de células com base na expressão ou presença na célula de uma ou mais moléculas específicas, tal como marcadores de superfície, por exemplo, proteínas de superfície, mar- cadores intracelulares, ou ácido nucleico. Em algumas modalidades, qualquer método conhecido para separação com base em tais marca- dores pode ser usado. Em algumas modalidades, a separação é uma separação baseada em afinidade ou imunoafinidade. Por exemplo, o isolamento, em alguns aspectos, inclui a separação de células e popu- lações de células com base na expressão ou nível de expressão das células de um ou mais marcadores, tipicamente marcadores de super- fície celular, por exemplo, por incubação com um anticorpo ou parceiro de ligação que se liga especificamente a tais marcadores, seguidos geralmente por etapas de lavagem e separação de células que se liga- ram ao anticorpo ou parceiro de ligação, daquelas células que não se ligaram ao anticorpo ou parceiro de ligação.

[00133] Tais etapas de separação podem ser baseadas na seleção positiva, na qual as células que ligaram os reagentes são retidas para uso posterior, e / ou seleção negativa na qual as células que não se ligam ao anticorpo ou parceiro de ligação são retidas. Em alguns exemplos, ambas as frações são retidas para uso posterior. Em alguns aspectos, a seleção negativa pode ser particularmente útil quando não está disponível um anticorpo que identifique especificamente um tipo de célula em uma população heterogênea, de modo que a separação seja realizada melhor com base em marcadores expressos por células que não a população desejada.

[00134] A separação não precisa resultar em 100% de enriqueci- mento ou remoção de uma população de células específica ou células que expressam um marcador específico. Por exemplo, seleção positi- va ou enriquecimento para células de um tipo específico, tal como aquelas que expressam um marcador, refere-se ao aumento do núme- ro ou porcentagem dessas células, mas não precisa resultar em uma ausência completa de células que não expressam o marcador. Da mesma forma, seleção negativa, remoção ou depleção de células de um tipo específico, como aquelas que expressam um marcador, refe- re-se à diminuição do número ou da porcentagem dessas células, mas não precisa resultar na remoção completa de todas essas células.

[00135] Em alguns exemplos, múltiplas rodadas de etapas de sepa- ração são realizadas, onde a fração selecionada positiva ou negativa- mente de uma etapa é submetida a outra etapa de separação, tal co- mo uma subsequente seleção positiva ou negativa. Em alguns exem- plos, uma única etapa de separação pode esgotar as células que ex- pressam vários marcadores simultaneamente, tal como incubando cé- lulas com uma pluralidade de anticorpos ou parceiros de ligação, cada um específico para um marcador direcionado para seleção negativa. Da mesma forma, vários tipos de células podem ser simultaneamente selecionados positivamente incubando células com uma pluralidade de anticorpos ou parceiros de ligação expressos nos vários tipos de célu- las. Por exemplo, em alguns aspectos, subpopulações específicas de células T, tal como células positivas ou expressando um ou mais mar- cadores, por exemplo, CD4+, CD25+, CD127-, FOXP3+ e / ou Helios+.

[00136] As células T são isoladas por técnicas de seleção positiva ou negativa. Por exemplo, as células T CD3+, CD28+ podem ser sele- cionadas positivamente usando microesferas magnéticas conjugadas anti-CD3 / anti-CD28 (por exemplo, expansor de células T CD3 / CD28 DYNABEADS® M-450).

[00137] Em algumas modalidades, o isolamento é realizado por en- riquecimento para uma população de células específica por seleção positiva, ou depleção de uma população de células específica, por se- leção negativa. Em algumas modalidades, a seleção positiva ou nega- tiva é realizada incubando-se as células com um ou mais anticorpos ou outro agente de ligação que se liga especificamente a um ou mais marcadores de superfície expressos ou expressos (marcador "1") em um nível relativamente mais alto (marcador "1"high) nas células selecio- nadas positiva ou negativamente, respectivamente.

[00138] Em algumas modalidades, as células T são separadas de uma amostra de PBMC por seleção negativa de marcadores expres- sos em células não-T, tal como células B, monócitos ou outros glóbu- los brancos, tal como CD 14. Em alguns aspectos, uma etapa de sele- ção de CD4+ ou CD8+ é usada para separar as células T citotóxicas auxiliares CD4+ e CD8+. Tais populações de CD4+ e CD8+ podem ser ainda classificadas em subpopulações por seleção positiva ou negati- va para marcadores expressos ou expressos em um grau relativamen- te mais alto em uma ou mais subpopulações de células T virgens, de memória e / ou efetoras.

[00139] Em algumas modalidades, as células CD8+ são ainda enri- quecidas ou depletadas de células-tronco virgens, de memória central, de memória efetora e / ou de células-tronco da memória central, tal como por seleção positiva ou negativa com base em antígenos de su- perfície associados à respectiva subpopulação. Em algumas modali- dades, o enriquecimento das células T de memória central (TCM) é rea-

lizado para aumentar a eficácia, tal como para melhorar a sobrevida a longo prazo, a expansão e / ou o enxerto após a administração, o que em alguns aspectos é particularmente robusto nessas subpopulações. Ver Terakura e outros (2012) Blood.1: 72 a 82; Wang e outros (2012) J. Immunother. 35 (9): 689 a 701. Em algumas modalidades, a combi- nação de células T CD8+ enriquecidas com TCM e células T CD4+ me- lhora ainda mais a eficácia.

[00140] Em algumas modalidades, o enriquecimento para células T de memória central (TCM) é baseado na expressão superficial positiva ou alta de CD45RO, CD62L, CCR7, CD28, CD3 e / ou CD127; em al- guns aspectos, é baseado na seleção negativa para células que ex- pressam ou que expressam altamente CD45RA e / ou granzima B.

[00141] Em alguns aspectos, uma etapa de seleção baseada em expressão de CD4 é usada para gerar a população ou subpopulação de células CD4+, de modo que as frações positiva e negativa da sepa- ração baseada em CD4 sejam retidas e usadas nas etapas subse- quentes dos métodos, seguindo opcionalmente uma ou mais etapas de seleção positiva ou negativa.

[00142] Em um exemplo, uma amostra de PBMCs ou outra amostra de glóbulos brancos é submetida à seleção de células CD4+, onde são mantidas as frações negativa e positiva. A fração negativa é então submetida à seleção negativa com base na expressão, por exemplo, de CD14 e CD45RA, e seleção positiva com base em um marcador característico das células T de memória central, tal como CD62L ou CCR7, onde as seleções positiva e negativa são realizadas em qual- quer ordem.

[00143] As células T auxiliares CD4+ são classificadas em células virgens, de memória central e efetoras, identificando populações de células que têm antígenos de superfície celular. Os linfócitos CD4+ po- dem ser obtidos por métodos-padrão. Em algumas modalidades, os linfócitos T CD4+ virgens são células CD45RO+, CD45RA+, CD62L+, CD4+. Em algumas modalidades, as células CD4+ da memória central são CD62L+ e CD45RO+.

[00144] Em um exemplo, para enriquecer células CD4+ por seleção negativa, um coquetel de anticorpos monoclonais normalmente inclui anticorpos para CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR e CD8. Em al- gumas modalidades, o anticorpo ou parceiro de ligação está ligado a um suporte ou matriz sólida, tal como uma microesfera magnética ou microesfera paramagnética, para permitir a separação de células para seleção positiva e / ou negativa. Por exemplo, em algumas modalida- des, as células e as populações de células são separadas ou isoladas usando técnicas de separação imunomagnética (ou magnética de afi- nidade) (revisadas em Methods in Molecular Medicine, vol. 58: Metas- tasis Research Protocols, Vol. 2: Cell Behavior In Vitro and In Vivo, pág. 17 a 25 Editado por: SA Brooks e U. Schumacher © Humana Press Inc., Totowa, NJ).

[00145] Em alguns aspectos, a amostra ou composição de células a serem separadas é incubada com material pequeno, magnetizável ou responsivo magneticamente, tal como partículas ou micropartículas responsivas magneticamente, tal como microesferas paramagnéticas (por exemplo, microesferas Dynabeads ou MACS). O material respon- sivo magneticamente, por exemplo, partícula, geralmente é direta ou indiretamente ligado a um parceiro de ligação, por exemplo, um anti- corpo que se liga especificamente a uma molécula, por exemplo, mar- cador de superfície, presente na célula, células ou população de célu- las de que ele se deseja separar, por exemplo, que se deseja selecio- nar negativa ou positivamente.

[00146] Em algumas modalidades, a partícula ou microesfera mag- nética compreende um material responsivo magneticamente ligado a um elemento de ligação específico, tal como um anticorpo ou outro parceiro de ligação. Existem muitos materiais responsivos magnetica- mente conhecidos usados em métodos de separação magnética. Par- tículas magnéticas adequadas incluem as descritas por Molday, Paten- te US. No. 4.452.773, e na Especificação de Patente Europeia EP 452342 B, que são aqui incorporadas por referência. Partículas de ta- manho coloidal, tal como as descritas por Owen na Patente US. No.

4.795.698, e Liberti e outros, Patente US. No. 5.200.084 são outros exemplos.

[00147] A incubação geralmente é realizada sob condições pelas quais os anticorpos ou parceiros de ligação, ou moléculas, tal como anticorpos secundários ou outros reagentes, que se ligam especifica- mente a esses anticorpos ou parceiros de ligação, que estão ligados à partícula ou microesfera magnética, especificamente ligam-se às mo- léculas da superfície celular, se presentes nas células dentro da amos- tra.

[00148] Em alguns aspectos, a amostra é colocada em um campo magnético, e as células que têm partículas magneticamente responsi- vas ou magnetizáveis ligadas a elas serão atraídas para o ímã e sepa- radas das células não marcadas. Para seleção positiva, as células atraídas pelo ímã são retidas; para seleção negativa, as células que não são atraídas (células não marcadas) são retidas. Em alguns as- pectos, uma combinação de seleção positiva e negativa é realizada durante a mesma etapa de seleção, onde as frações positiva e negati- va são retidas e processadas posteriormente ou submetidas a etapas de separação adicionais.

[00149] Em certas modalidades, as partículas magneticamente res- ponsivas são revestidas em anticorpos primários ou outros parceiros de ligação, anticorpos secundários, lectinas, enzimas ou estreptavidi- na. Em certas modalidades, as partículas magnéticas são ligadas às células por meio de um revestimento de anticorpos primários específi-

cos para um ou mais marcadores. Em certas modalidades, as células, em vez das microesferas, são marcadas com um anticorpo primário ou parceiro de ligação e, em seguida, são adicionadas partículas magné- ticas revestidas com anticorpo secundário específico do tipo de célula ou outro parceiro de ligação (por exemplo, estreptavidina). Em certas modalidades, partículas magnéticas revestidas com estreptavidina são usadas em conjunto com anticorpos primários ou secundários biotini- lados ou peptídeos biotinilados.

[00150] Em algumas modalidades, as partículas magneticamente responsivas são deixadas anexadas às células que devem ser subse- quentemente incubadas, cultivadas e / ou manipuladas; em alguns as- pectos, as partículas são deixadas anexadas às células para adminis- tração a um paciente. Em algumas modalidades, as partículas magne- tizáveis ou magneticamente responsivas são removidas das células. Os métodos para remover partículas magnetizáveis das células são conhecidos e incluem, por exemplo, o uso de anticorpos não marcados concorrentes, partículas magnetizáveis ou anticorpos conjugados com ligantes cliváveis, etc. Em algumas modalidades, as partículas magne- tizáveis são biodegradáveis.

[00151] Em algumas modalidades, a seleção baseada em afinidade é via classificação celular ativada magneticamente (MACS) (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Os sistemas de Classificação Celular Magneti- camente Ativada (MACS) são capazes de seleção de alta pureza de células com partículas magnetizadas ligadas a eles. Em certas moda- lidades, o MACS opera em um modo em que as espécies não-alvo e alvo são sequencialmente eluídas após a aplicação do campo magné- tico externo. Ou seja, as células ligadas às partículas magnetizadas são mantidas no lugar enquanto as espécies não acopladas são eluí- das. Então, após a conclusão desta primeira etapa de eluição, as es- pécies que foram capturadas no campo magnético e foram impedidas de serem eluídas são libertadas de alguma maneira para que possam ser eluídas e recuperadas. Em certas modalidades, as células não al- vo são marcadas e depletadas da população heterogênea de células.

[00152] Em certas modalidades, o isolamento ou a separação é realizado usando um sistema, dispositivo ou aparelho que realiza uma ou mais das etapas de isolamento, preparação celular, separação, processamento, incubação, cultura e / ou formulação das métodos. Em alguns aspectos, o sistema é usado para executar cada uma dessas etapas em um ambiente fechado ou estéril, por exemplo, para minimi- zar erros, manipulação do usuário e / ou contaminação. Em um exem- plo, o sistema é um sistema conforme descrito no Pedido de Patente Internacional, Número da Publicação WO2009 / 072003 ou US 20110003380 Al.

[00153] Em algumas modalidades, o sistema ou aparelho executa uma ou mais, por exemplo, todas as etapas de isolamento, processa- mento, manipulação e formulação em um sistema integrado ou inde- pendente, e / ou de maneira automatizada ou programável. Em alguns aspectos, o sistema ou aparelho inclui um computador e / ou programa de computador em comunicação com o sistema ou aparelho, que per- mite ao usuário programar, controlar, avaliar o resultado e / ou ajustar vários aspectos das etapas de processamento, isolamento, manipula- ção e formulação.

[00154] Em alguns aspectos, a separação e / ou outras etapas são realizadas usando o sistema CliniMACS (Miltenyi Biotec), por exemplo, para separação automatizada de células em nível de escala clínica em um sistema fechado e estéril. Os componentes podem incluir um mi- crocomputador integrado, unidade de separação magnética, bomba peristáltica, e várias válvulas de manga flexível. O computador inte- grado em alguns aspectos controla todos os componentes do instru- mento e direciona o sistema para executar procedimentos repetidos em uma sequência padronizada. A unidade de separação magnética, em alguns aspectos, inclui um ímã permanente móvel e um suporte para a coluna de seleção. A bomba peristáltica controla a vazão em todo o conjunto de tubulação e, juntamente com as válvulas de manga flexível, garante o fluxo controlado de tampão através do sistema e a suspensão contínua das células.

[00155] O sistema CliniMACS, em alguns aspectos, usa partículas magnetizáveis acopladas a anticorpos que são fornecidas em uma so- lução estéril e não pirogênica. Em algumas modalidades, após a mar- cação das células com partículas magnéticas, as células são lavadas para remover o excesso de partículas. Uma bolsa de preparação de células é então conectada ao conjunto de tubos, que, por sua vez, é conectado a uma bolsa contendo tampão e uma bolsa de coleta de células. O conjunto de tubos consiste em tubos estéreis pré-montados, incluindo uma pré-coluna e uma coluna de separação, e são apenas para uso único. Após o início do programa de separação, o sistema aplica automaticamente a amostra de células na coluna de separação. As células marcadas são retidas dentro da coluna, enquanto as células não marcadas são removidas por uma série de etapas de lavagem. Em algumas modalidades, as populações de células para uso com os métodos aqui descritos não são marcadas e não são retidas na colu- na. Em algumas modalidades, as populações de células para uso com os métodos aqui descritos são marcadas e retidas na coluna. Em al- gumas modalidades, as populações de células para uso com os méto- dos aqui descritos são eluídas da coluna após a remoção do campo magnético, e são coletadas dentro da bolsa de coleta de células.

[00156] Em certas modalidades, a separação e / ou outras etapas são realizadas usando o sistema CliniMACS Prodigy (Miltenyi Biotec). O sistema CliniMACS Prodigy, em alguns aspectos, é equipado com uma unidade de processamento celular que permite a lavagem e o fra-

cionamento automatizados de células por centrifugação. O sistema CliniMACS Prodigy também pode incluir uma câmera integrada e um software de reconhecimento de imagem que determina o ponto final ideal de fracionamento da célula, discernindo as camadas macroscó- picas do produto da célula de origem. Por exemplo, o sangue periféri- co pode ser automaticamente separado em eritrócitos, glóbulos bran- cos e camadas de plasma. O sistema CliniMACS Prodigy também po- de incluir uma câmara de cultivo celular integrada que realiza protoco- los de cultura celular, tal como, por exemplo, diferenciação e expansão celular, carregamento de antígeno, e cultura celular a longo prazo. As portas de entrada podem permitir a remoção estéril e a reposição de meio e as células podem ser monitoradas usando um microscópio in- tegrado. Ver, por exemplo, Klebanoff e outros (2012) J. Immunother. 35 (9): 651 a 660, Terakura e outros (2012) Blood. 1: 72 a 82, e Wang e outros (2012) Immunother. 35 (9): 689 a 701.

[00157] Em algumas modalidades, uma população de células aqui descrita é coletada e enriquecida (ou depletada) por citometria de flu- xo, na qual as células coradas por vários marcadores de superfície ce- lular são transportadas em uma corrente fluídica. Em algumas modali- dades, uma população de células aqui descrita é coletada e enriqueci- da (ou depletada) por meio de classificação em escala preparativa (FACS). Em certas modalidades, uma população de células aqui des- crita é coletada e enriquecida (ou depletada) pelo uso de chips de sis- temas microeletromecânicos (MEMS) em combinação com um sistema de detecção baseado em FACS (ver, por exemplo, WO 2010/033140, Cho e outros (2010) Lab Chip 10, 1567 a 1573; e Godin e outros (2008) J. Biophoton. 1 (5): 355 a 376. Nos dois casos, as células po- dem ser marcadas com vários marcadores, permitindo o isolamento de subconjuntos de células T bem definidos com alta pureza.

[00158] Em algumas modalidades, os anticorpos ou parceiros de ligação são marcados com um ou mais marcadores detectáveis, para facilitar a separação para seleção positiva e / ou negativa. Por exem- plo, a separação pode ser baseada na ligação a anticorpos marcados com fluorescência. Em alguns exemplos, a separação de células com base na ligação de anticorpos ou outros parceiros de ligação específi- cos para um ou mais marcadores de superfície celular é realizada em um fluxo fluídico, tal como por classificação celular ativada por fluores- cência (FACS), incluindo escala preparativa (FACS) e / ou chips de sistemas microeletromecânicos (MEMS), por exemplo, em combinação com um sistema de detecção de citometria de fluxo. Tais métodos permitem a seleção positiva e negativa com base em vários marcado- res simultaneamente.

[00159] Em algumas modalidades, os métodos de preparação in- cluem etapas para congelamento, por exemplo, criopreservação, as células, antes ou após o isolamento, incubação e / ou manipulação. Em algumas modalidades, a etapa de congelamento e descongela- mento subsequente remove granulócitos e, até certo ponto, monócitos na população celular. Em algumas modalidades, as células são sus- pensas em uma solução de congelamento, por exemplo, após uma etapa de lavagem para remover o plasma e as plaquetas. Qualquer uma de uma variedade de soluções e parâmetros de congelamento conhecidos em alguns aspectos pode ser usada. Um exemplo envolve o uso de PBS contendo 20% de DMSO e 8% de albumina sérica hu- mana (HSA) ou outro meio de congelamento celular adequado. Este é então diluído 1:1 com meio, de modo que a concentração final de DMSO e HSA seja 10% e 4%, respectivamente. As células são então congeladas a -80° C a uma taxa de 1° por minuto e armazenadas na fase de vapor de um tanque de armazenamento de nitrogênio líquido.

[00160] Em algumas modalidades, os métodos fornecidos incluem etapas de cultivo, incubação, cultura e / ou engenharia genética. Por exemplo, em algumas modalidades, são fornecidos métodos para in- cubar e / ou manipular as populações celulares depletadas e as com- posições de iniciação de cultura.

[00161] Assim, em algumas modalidades, as populações de células são incubadas em uma composição de iniciação de cultura. A incuba- ção e / ou manipulação pode ser realizada em um recipiente de cultu- ra, tal como uma unidade, câmara, poço, coluna, tubo, conjunto de tu- bos, válvula, frasco, prato de cultura, bolsa ou outro recipiente para cultura ou cultivo de células.

[00162] Em algumas modalidades, as células são incubadas e / ou cultivadas antes ou em conjunto com engenharia genética. As etapas de incubação podem incluir cultura, cultivo, estimulação, ativação e / ou propagação. Em algumas modalidades, as composições ou células são incubadas na presença de condições estimulantes ou de um agen- te estimulador. Tais condições incluem aquelas projetadas para induzir proliferação, expansão, ativação e / ou sobrevida de células na popu- lação, para imitar a exposição ao antígeno e / ou preparar as células para engenharia genética, tal como para a introdução de um receptor de antígeno recombinante.

[00163] As condições podem incluir um ou mais meios específicos, temperatura, teor de oxigênio, teor de dióxido de carbono, tempo, agentes, por exemplo, nutrientes, aminoácidos, antibióticos, íons e / ou fatores estimulantes, tal como citocinas, quimiocinas, antígenos, par- ceiros de ligação, proteínas de fusão, receptores solúveis recombinan- tes, e quaisquer outros agentes projetados para ativar as células.

[00164] Em algumas modalidades, as condições ou agentes estimu- lantes incluem um ou mais agentes, por exemplo, ligante, que é capaz de ativar um domínio de sinalização intracelular de um complexo TCR. Em alguns aspectos, o agente liga ou inicia a cascata de sinalização intracelular do TCR / CD3 em uma célula T. Tais agentes podem inclu-

ir anticorpos, tal como aqueles específicos para um TCR, por exemplo, anti-CD3. Em algumas modalidades, as condições estimulantes inclu- em um ou mais agentes, por exemplo, ligando, que é capaz de estimu- lar um receptor coestimulador, por exemplo, anti-CD28. Em algumas modalidades, esses agentes e / ou ligandos podem estar ligados a um suporte sólido, tal como uma microesfera, e / ou uma ou mais citoci- nas. Opcionalmente, o método de expansão pode ainda compreender a etapa de adição de anticorpo anti-CD3 e / ou anti CD28 ao meio de cultura (por exemplo, a uma concentração de pelo menos cerca de 0,5 ng / ml). Em algumas modalidades, os agentes estimulantes incluem IL-2, IL-15 e / ou IL-7. Em alguns aspectos, a concentração de IL-2 é de pelo menos cerca de 10 unidades / mL.

[00165] Em alguns aspectos, a incubação é realizada de acordo com técnicas como as descritas na Patente US No. 6.040.177 de Rid- dell e outros; Klebanoff e outros (2012) J. Immunother. 35 (9): 651 a 660, Terakura e outros (2012) Blood. 1: 72 a 82, e / ou Wang e outros (2012) J. Immunother. 35 (9): 689 a 701.

[00166] Em algumas modalidades, as células T são expandidas adicionando às células alimentadoras da composição de iniciação de cultura, tal como células mononucleares do sangue periférico (PBMC) não divididas (por exemplo, de modo que a população resultante de células contenha pelo menos cerca de 5, 10, 20 ou 40 ou mais células alimentadoras de PBMC para cada linfócito T na população inicial a ser expandida); e incubar a cultura (por exemplo, por um tempo sufici- ente para expandir o número de células T). Em alguns aspectos, as células alimentadoras não divididas podem compreender células ali- mentadoras de PBMC irradiadas com gama. Em algumas modalida- des, as PBMCs são irradiadas com raios gama na faixa de cerca de 3000 a 3600 rads para impedir a divisão celular. Em alguns aspectos, as células alimentadoras são adicionadas ao meio de cultura antes da adição das populações de células T.

[00167] Em algumas modalidades, as condições estimulantes inclu- em temperatura adequada para o crescimento de linfócitos T huma- nos, por exemplo, pelo menos cerca de 25 graus Celsius, geralmente pelo menos 30 graus e geralmente em ou cerca de 37 graus Celsius. Opcionalmente, a incubação pode ainda compreender a adição de cé- lulas linfoblastoides transformadas por EBV não divididas (LCL) como células alimentadoras. As LCLs podem ser irradiadas com raios gama na faixa de cerca de 6000 a 10.000 rads. As células alimentadoras de LCL em alguns aspectos são fornecidas em qualquer quantidade ade- quada, tal como uma relação de células alimentadoras de LCL para linfócitos T iniciais de pelo menos cerca de 10:1. Métodos de Tratamento

[00168] Em certas modalidades, um método de tratamento de um indivíduo diagnosticado com artrite reumatoide compreende isolar lin- fócitos T de uma amostra biológica obtida do indivíduo; separar células T reguladoras (Treg) CD4+ das células T convencionais (Tconv), em que as células Treg são CD4+ CD25+ CD127- e as Tconv são CD4+ CD25-CD127+; transduzir as células Treg com um vetor de expressão que codifica um receptor quimérico de antígeno (CAR) que se liga es- pecificamente a um antígeno vimentina citrulinada (CV); estimular as Treg transduzidas com o antígeno CV pelo menos uma vez ex vivo para obter células Treg específicas para o antígeno CV; e reinfundir as Treg no indivíduo, tratando assim o indivíduo. Em certas modalidades, as células Treg são células autólogas. As células T CAR podem ser geradas a partir de qualquer fonte adequada de células T conhecida na técnica, incluindo, mas não limitada a, células T coletadas de um indivíduo. O indivíduo pode ser um paciente com uma doença autoi- mune, tal como artrite reumatoide, em necessidade de terapia com cé- lulas T CAR ou um indivíduo da mesma espécie que o indivíduo com a doença autoimune em necessidade de terapia com células T CAR. As células T coletadas podem ser expandidas ex vivo usando métodos comumente conhecidos na técnica antes da transdução com um CAR para gerar uma célula T CAR.

[00169] O antígeno vimentina citrulinada (CV) também está associ- ado a tumores e DPOC, portanto, em certas modalidades, os métodos de tratamento de um tumor ou doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC) compreendem isolar linfócitos T de uma amostra biológica ob- tida do indivíduo; separar células T reguladoras (Treg) CD4+ das célu- las T convencionais (Tconv), em que as células Treg são CD4+ CD25+ CD127- e as Tconv são CD4+ CD25-CD127+; transduzir as células Treg com um vetor de expressão que codifica um receptor quimérico de an- tígeno (CAR) que se liga especificamente a um antígeno vimentina ci- trulinada (CV); estimular as Treg transduzidas com o antígeno CV pelo menos uma vez ex vivo para obter células Treg específicas para o an- tígeno CV; e reinfundir as Treg no indivíduo, tratando assim o indiví- duo. Em certas modalidades, as células Treg são células autólogas. As células T CAR podem ser geradas a partir de qualquer fonte ade- quada de células T conhecida na técnica, incluindo, mas não limitada a, células T coletadas de um indivíduo.

[00170] Os métodos para design, entrega e expressão de CAR em células T e a fabricação de populações de células T CAR de grau clí- nico são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Lee e outros, Clin. Cancer Res. 2012, 18 (10): 2780-90, aqui incorporado por referência em sua totalidade. Por exemplo, os CARs manipulados podem ser in- troduzidos nas células T usando retrovírus, que integram de maneira eficiente e estável uma sequência de ácidos nucleicos que codifica o receptor quimérico de antígeno no genoma da célula alvo. Um método exemplificativo usando vetores lentivirais é descrito na seção Exem- plos a seguir.

[00171] Os CARs podem ser codificados por um vetor e / ou englo- bados em um ou mais veículos e formulações de entrega, conforme descrito em detalhes abaixo.

[00172] Outros métodos conhecidos na técnica incluem, entre ou- tros, transdução lentiviral, sistemas baseados em transposons, trans- fecção direta de RNA, e sistemas CRISPR / Cas (por exemplo, siste- mas tipo I, tipo II ou tipo III usando um sistema adequado de Proteína Cas, tal como Cas3, Cas4, Cas5, Cas5e (ou CasD), Cas6, Cas6e, Cas6f, Cas7, Cas8a1, Cas8a2, Cas8b, Cas8c, Cas9, Cas9, Cas10, Casl Od, CasF, CasG, CasH, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1 (ou CasA), Cse2 (ou CasB), Cse3 (ou CasE), Cse4 (ou CasC), Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csz1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4 e Cu1966, etc.).

[00173] Os vetores podem incluir, por exemplo, origens de replica- ção, regiões de conexão de arcabouços (SARs) e / ou marcadores. Um gene marcador pode conferir um fenótipo selecionável em uma célula hospedeira. Por exemplo, um marcador pode conferir resistên- cia a biocidas, tal como resistência a um antibiótico (por exemplo, ca- namicina, G418, bleomicina ou higromicina). Um vetor de expressão pode incluir uma sequência de marcadores projetada para facilitar a manipulação ou detecção (por exemplo, purificação ou localização) do polipeptídeo expresso. As sequências de marcadores, tal como a pro- teína verde fluorescente (GFP), glutationa S-transferase (GST), poli- histidina, c-myc, hemaglutinina ou sequências de marcador FLAGTM (Kodak, New Haven, CT) normalmente são expressas como uma fu- são com o polipeptídeo codificado. Tais marcadores podem ser inseri- dos em qualquer lugar dentro do polipeptídeo, inclusive no carboxil ou amino terminal. Outro exemplo é o repórter de EGFRt e a sequência de T2A auto-clivável que é clivada para produzir um CAR sem a prote-

ína EGFRt. Em algumas modalidades, o EGFRt não é necessário.

[00174] Os vetores de expressão adicionais também podem incluir, por exemplo, segmentos de sequências de DNA cromossômicas, não cromossômicas e sintéticas. Os vetores adequados incluem derivados de SV40 e plasmídeos bacterianos conhecidos, por exemplo, plasmí- deos de E. coli col El, pCR1, pBR322, pMal-C2, pET, pGEX, pMB9 e seus derivados, plasmídeos tal como RP4; DNAs de fago, por exem- plo, os numerosos derivados do fago 1, por exemplo, NM989, e outro DNA de fago, por exemplo, M13 e DNA de fago filamentoso de fita simples; plasmídeos de levedura, tal como o plasmídeo 2µ ou seus derivados, vetores úteis em células eucarióticas, tal como vetores úteis em células de insetos ou mamíferos; vetores derivados de combina- ções de plasmídeos e DNAs de fago, tal como plasmídeos que foram modificados para empregar DNA de fago ou outras sequências de con- trole de expressão.

[00175] Vários métodos de entrega podem ser utilizados em conjun- to com as sequências isoladas de ácido nucleico para sistemas in vitro (culturas de células) e in vivo (animais e pacientes). Em uma modali- dade, um sistema de entrega de gene lentiviral pode ser utilizado. Es- se sistema oferece presença estável e a longo prazo do gene em célu- las que se dividem e que não se dividem, com amplo tropismo e capa- cidade para grandes inserções de DNA. (Dull e outros, J Virol, 72: 8463 a 8471 1998). Em uma modalidade, o vírus adenoassociado (AAV) pode ser utilizado como um método de entrega. O AAV é um vírus de DNA de cadeia simples, não patogênico, que foi empregado ativamente nos últimos anos para fornecer genes terapêuticos em sis- temas in vitro e in vivo (Choi e outros, Curr Gene Ther, 5: 299 a 310, 2005). Os AAV incluem os sorotipos 1 a 9. Um exemplo de método de entrega não viral pode utilizar a tecnologia de nanopartículas. Esta pla- taforma demonstrou utilidade como um produto farmacêutico in vivo. A nanotecnologia melhorou a transcitose de fármacos através de barrei- ras epiteliais e endoteliais estreitas. Oferece entrega direcionada de sua carga útil a células e tecidos de uma maneira específica (Allen e Cullis, Science, 303: 1818 a 1822, 1998).

[00176] O vetor também pode incluir uma região reguladora. O ter- mo "região reguladora" refere-se a sequências de nucleotídeos que influenciam o início e a taxa de transcrição ou tradução, e a estabilida- de e / ou mobilidade de um produto de transcrição ou tradução. As re- giões reguladoras incluem, sem limitação, sequências promotoras, se- quências potenciadoras, elementos de resposta, sítios de reconheci- mento de proteínas, elementos induzíveis, sequências de ligação a proteínas, regiões não traduzidas (UTRs) 5’ e 3’, sítios de início de transcrição, sequências de terminação, sequências de poliadenilação, sinais de localização nuclear, e íntrons.

[00177] O termo "operacionalmente ligado" refere-se ao posiciona- mento de uma região reguladora e de uma sequência a ser transcrita em um ácido nucleico, de modo a influenciar a transcrição ou tradução de tal sequência. Por exemplo, para colocar uma sequência de codifi- cação sob o controle de um promotor, o sítio de início de tradução do quadro de leitura de tradução do polipeptídeo é tipicamente posiciona- do entre um e cerca de cinquenta nucleotídeos a jusante do promotor. Um promotor pode, no entanto, ser posicionado até cerca de 5.000 nucleotídeos a montante do sítio de início de tradução ou cerca de

2.000 nucleotídeos a montante do sítio de início de transcrição. Um promotor compreende tipicamente pelo menos um promotor principal (basal). Um promotor também pode incluir pelo menos um elemento de controle, tal como uma sequência potenciadora, um elemento a montante ou uma região de ativação a montante (UAR). A escolha dos promotores a serem incluídos depende de vários fatores, incluindo, entre outros, eficiência, selecionabilidade, indutibilidade, nível de ex-

pressão desejado, e expressão preferencial de célula ou tecido. É um assunto de rotina para um versado na técnica modular a expressão de uma sequência de codificação selecionando e posicionando adequa- damente promotores e outras regiões reguladoras em relação à se- quência de codificação.

[00178] Os vetores incluem, por exemplo, vetores virais (tal como adenovírus Ad, AAV, lentivírus e vírus da estomatite vesicular (VSV) e retrovírus), lipossomas e outros complexos contendo lipídios, e outros complexos macromoleculares capazes de mediar a entrega de um po- linucleotídeo para uma célula hospedeira. Os vetores também podem compreender outros componentes ou funcionalidades que modulam ainda mais a entrega gênica e / ou a expressão gênica, ou que de ou- tro modo fornecem propriedades benéficas às células-alvo. Como des- crito e ilustrado em mais detalhes abaixo, esses outros componentes incluem, por exemplo, componentes que influenciam a ligação ou o direcionamento para as células (incluindo componentes que medeiam a ligação célula- ou tecido-específica); componentes que influenciam a captação do ácido nucleico do vetor pela célula; componentes que in- fluenciam a localização do polinucleotídeo dentro da célula após a captação (tal como agentes mediadores da localização nuclear); e componentes que influenciam a expressão do polinucleotídeo. Tais componentes também podem incluir marcadores, tal como marcadores detectáveis e / ou selecionáveis que podem ser usados para detectar ou selecionar células que foram captadas e estão expressando o ácido nucleico entregue pelo vetor. Tais componentes podem ser fornecidos como uma característica natural do vetor (tal como o uso de certos ve- tores virais que têm componentes ou funcionalidades que medeiam a ligação e a captação), ou os vetores podem ser modificados para for- necer tais funcionalidades. Outros vetores incluem aqueles descritos por Chen e outros; BioTechniques, 34: 167 a 171 (2003). Uma grande variedade de tais vetores é conhecida na técnica e geralmente está disponível. Um "vetor viral recombinante" refere-se a um vetor viral compreendendo um ou mais produtos ou sequências de genes heteró- logos. Uma vez que muitos vetores virais exibem restrições de tama- nho associadas ao empacotamento, os produtos ou sequências de genes heterólogos são tipicamente introduzidos substituindo uma ou mais porções do genoma viral. Tais vírus podem se tornar de replica- ção defeituosa, exigindo que as funções deletadas sejam fornecidas em trans durante a replicação e encapsidação viral (usando, por exemplo, um vírus auxiliar ou uma linhagem de células de empacota- mento carregando produtos gênicos necessários para a replicação e / ou encapsidação). Vetores virais modificados nos quais um polinucleo- tídeo a ser entregue é carregado no exterior da partícula viral também foram descritos (ver, por exemplo, Curiel, TD, e outros PNAS 88: 8850 a 8854, 1991).

[00179] Vetores adicionais incluem vetores virais, proteínas de fu- são e conjugados químicos. Os vetores retrovirais incluem vírus da leucemia murina de Moloney e vírus baseados em HIV. Um vetor viral baseado em HIV compreende pelo menos dois vetores em que os ge- nes gag e pol são de um genoma de HIV e o gene env é de outro ví- rus. Os vetores virais de DNA incluem vetores pox, tal como vetores ortopox ou avipox, vetores de herpes vírus, tal como um vetor de vírus herpes simplex I (HSV) [Geller, A.I. e outros, J. Neurochem, 64: 487 (1995); Lim, F., e outros, em DNA Cloning: Mammalian Systems, D. Glover, Ed. (Oxford Univ. Press, Oxford Inglaterra) (1995); Geller, A.I. e outros, Proc Natl. Acad. Sci.: U.S.A.: 90 7603 (1993); Geller, A.I. e outros, Proc Natl. Acad. Sci USA: 87: 1149 (1990)], Adenovirus Vec- tors [LeGal LaSalle e outros, Science, 259: 988 (1993); Davidson e ou- tros, Nat. Genet. 3: 219 (1993); Yang e outros, J. Virol. 69: 2004 (1995)] e Adeno-associated Virus Vectors [Kaplitt, M.G., e outros, Nat.

Genet. 8: 148 (1994)].

[00180] Os polinucleotídeos aqui incorporados podem ser utilizados com um veículo de microentrega, tal como lipossomas catiônicos e ve- tores adenovirais. Para uma revisão dos procedimentos para a prepa- ração de lipossomas, direcionamento e entrega de conteúdo, ver Man- nino e Gould-Fogerite, BioTechniques, 6: 682 (1988). Ver também Fel- gner e Holm, Bethesda Res. Lab. Focus, 11 (2): 21 (1989) e Maurer, R.A., Bethesda Res. Lab. Focus, 11 (2): 25 (1989).

[00181] Os vetores adenovirais recombinantes com defeito de repli- cação podem ser produzidos de acordo com técnicas conhecidas. Ver Quantin e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 2581 a 2584 (1992); Stratford-Perricadet e outros, J. Clin. Invest. 90: 626 a 630 (1992); e Rosenfeld e outros, Cell, 68: 143 a 155 (1992).

[00182] Outro método é usar vetores produtores de DNA de fita simples que podem produzir os produtos expressos intracelularmente. Ver, por exemplo, Chen e outros, BioTechniques, 34: 167 a 171 (2003), que é aqui incorporado, por referência, em sua totalidade.

[00183] As sequências de ácidos nucleicos da invenção podem ser entregues a uma célula apropriada de um indivíduo. Isso pode ser al- cançado, por exemplo, pelo uso de um veículo de entrega de micro- partículas ou microcápsulas poliméricas biodegradáveis, dimensionado para otimizar a fagocitose por células fagocíticas, tal como macrófa- gos. Por exemplo, micropartículas de PLGA (poli-lacto-co-glicolídeo) com aproximadamente 1 a 10 µm de diâmetro podem ser usadas. O polinucleotídeo é encapsulado nessas micropartículas, que são absor- vidas por macrófagos e gradualmente biodegradadas dentro da célula, liberando assim o polinucleotídeo. Uma vez liberado, o DNA é expres- so dentro da célula. Um segundo tipo de micropartícula não deve ser absorvido diretamente pelas células, mas sim servir principalmente como um reservatório de liberação lenta de ácido nucleico que é ab-

sorvido pelas células apenas após a liberação da micropartícula atra- vés de biodegradação. Estas partículas poliméricas devem, portanto, ser suficientemente grandes para impedir a fagocitose (isto é, maiores que 5 µm e preferencialmente maiores que 20 µm). Outra maneira de conseguir a absorção do ácido nucleico é usar lipossomas, preparados por métodos padrão. Os ácidos nucleicos podem ser incorporados iso- ladamente nesses veículos de entrega ou co-incorporados com anti- corpos célula- ou tecido-específicos, por exemplo, específicos para células Treg ou entregues para células tumorais como um alvo. Alter- nativamente, pode-se preparar um complexo molecular composto por um plasmídeo ou outro vetor ligado à poli-L-lisina por forças eletrostá- ticas ou covalentes. A poli-L-lisina se liga a um ligante que pode se ligar a um receptor nas células alvo. A entrega de "DNA nu" (isto é, sem um veículo de entrega) a um sítio intramuscular, intradérmico ou subcutâneo, é outro meio para alcançar a expressão in vivo. Nos poli- nucleotídeos relevantes (por exemplo, vetores de expressão), a se- quência de ácidos nucleicos que codifica uma sequência isolada de ácido nucleico compreende uma sequência que codifica um CAR, co- mo descrito acima.

[00184] Em algumas modalidades, as composições da invenção podem ser formuladas como nanopartículas, por exemplo, nanopartí- culas compostas por um núcleo de polietilenimina linear de alto peso molecular (LPEI) complexado com DNA e rodeado por uma concha de polietileno glicol modificado (PEGuilado) de baixo peso molecular LPEI. Os ácidos nucleicos e vetores também podem ser aplicados a uma superfície de um dispositivo (por exemplo, um cateter) ou conti- dos dentro de uma bomba, emplastro ou outro dispositivo de entrega de fármacos. Os ácidos nucleicos e vetores aqui descritos podem ser administrados isoladamente ou em uma mistura, na presença de um excipiente ou carreador farmaceuticamente aceitável (por exemplo,

solução salina fisiológica). O excipiente ou carreador é selecionado com base no modo e na via de administração. Os carreadores farma- cêuticos adequados, bem como as necessidades farmacêuticas para uso em formulações farmacêuticas, são descritos em Remington’s Pharmaceutical Sciences (E. W. Martin), um texto de referência bem conhecido nesse campo, e na USP / NF (Farmacopeia dos Estados Unidos e Formulário Nacional).

[00185] Em algumas modalidades, as composições podem ser for- muladas como uma nanopartícula que encapsula as composições aqui incorporadas.

[00186] Independentemente de as composições serem administra- das como ácidos nucleicos ou polipeptídeos, elas são formuladas de forma a promover a absorção pela célula de mamífero. Sistemas e formulações vetoriais úteis são descritos acima. Em algumas modali- dades, o vetor pode entregar as composições para um tipo de célula específico. A invenção não é assim limitada, no entanto, e outros mé- todos de entrega de DNA, tal como transfecção química, usando, por exemplo, fosfato de cálcio, DEAE dextrano, lipossomas, lipoplexos, tensoativos e líquidos químicos perfluoro também são considerados, bem como métodos de entrega física, tal como eletroporação, micro injeção, partículas balísticas, e sistemas de "pistola de genes".

[00187] Em outras modalidades, as composições compreendem uma célula que foi transformada ou transfectada com um ou mais veto- res ou ácidos nucleicos que codificam um ou mais CARs. Em algumas modalidades, os métodos da invenção podem ser aplicados ex vivo. Isto é, as células de um indivíduo podem ser removidas do corpo e transduzidas com as composições em cultura com um antígeno-alvo desejado, expandir as células T específicas do antígeno-alvo, e as cé- lulas expandidas retornadas para o corpo do indivíduo. A célula pode ser a célula do indivíduo ou pode corresponder ao haplótipo ou a uma linhagem celular. As células podem ser irradiadas para impedir a repli- cação. Em algumas modalidades, as células são correspondentes ao antígeno leucocitário humano (HLA), autólogas, linhagens celulares, ou combinações das mesmas. Em outras modalidades, as células po- dem ser uma célula-tronco. Por exemplo, uma célula-tronco embrioná- ria ou uma célula-tronco pluripotente artificial (célula-tronco pluripoten- te induzida (célula iPS)). As células-tronco embrionárias (células ES) e células-tronco pluripotentes artificiais (células-tronco pluripotentes in- duzidas, células iPS) foram apresentadas a partir de muitas espécies animais, incluindo seres humanos. Esses tipos de células-tronco pluri- potentes seriam a fonte mais útil de células para a medicina regenera- tiva, porque essas células são capazes de se diferenciar em quase todos os órgãos por indução apropriada de sua diferenciação, man- tendo sua capacidade de se dividir ativamente enquanto mantém sua pluripotência. As células iPS, em particular, podem ser apresentadas a partir de células somáticas autoderivadas e, portanto, provavelmente não causam problemas éticos e sociais, em comparação com as célu- las ES, produzidas pela destruição de embriões. Além disso, as célu- las iPS, que são células autoderivadas, tornam possível evitar reações de rejeição, que são o maior obstáculo à medicina regenerativa ou à terapia de transplante.

[00188] Os CARs podem ser facilmente entregues a um indivíduo por métodos conhecidos na técnica, por exemplo, métodos que entre- gam siRNA. Assim, as moléculas de CAR podem ser usadas clinica- mente, de maneira semelhante às abordagens adotadas pela terapia genética atual. Em particular, uma célula-tronco de expressão estável de CAR ou células iPS para terapia de transplante de células, bem como vacinação, pode ser desenvolvida para uso em indivíduos.

[00189] As células T CAR, uma vez expandidas ex vivo, podem ser reinfundidas no indivíduo em uma quantidade terapeuticamente eficaz.

Em uma modalidade, as células T CAR são estimuladas usando mi- croesferas anti-CD3 / CD28 para sua expansão in vitro. As células T CAR podem ser usadas em resposta a um antígeno de doença autoi- mune (por exemplo, vimentina citrulinada (CV)). O termo "quantidade terapeuticamente eficaz", conforme usado aqui, significa que a quanti- dade de células T CAR quando administrada a um mamífero, em parti- cular um ser humano, em necessidade de tal tratamento, é suficiente para tratar doenças autoimunes, tal como artrite reumatoide.

[00190] A quantidade precisa de células T CAR a serem adminis- tradas pode ser determinada por um médico, considerando as diferen- ças individuais em idade, peso, extensão da doença e condição do in- divíduo.

[00191] Tipicamente, a administração de terapias com células T é definida pelo número de células por quilograma de peso corporal. No entanto, como as células T se replicam e se expandem após a transfe- rência, a dose de célula administrada não se parecerá com o número final de células no estado estacionário.

[00192] Em uma modalidade, uma composição farmacêutica com- preendendo as células T CAR da presente invenção pode ser adminis- trada em uma dosagem de 104 a 109 células / kg de peso corporal. Em outra modalidade, uma composição farmacêutica compreendendo as células T CAR da presente invenção pode ser administrada em uma dosagem de 105 a 106 células / kg de peso corporal, incluindo todos os valores inteiros dentro desses intervalos.

[00193] As composições compreendendo as células T CAR da pre- sente invenção também podem ser administradas várias vezes nessas dosagens. As células podem ser administradas usando técnicas de infusão conhecidas (ver, por exemplo, Rosenberg e outros, 1988, New England Journal of Medicine, 319: 1676). O regime ideal de dosagem e tratamento para um indivíduo em particular pode ser facilmente de-

terminado por um versado na técnica, monitorando o paciente quanto a sinais de doença e ajustando o tratamento consequentemente.

[00194] Em certas modalidades, a administração de qualquer uma das composições incorporadas neste documento, por exemplo, uma célula T CV-CAR, para o tratamento de uma doença autoimune, pode ser combinada com outras terapias baseadas em células, por exem- plo, células-tronco, células apresentadoras de antígenos, etc.

[00195] A composição da presente invenção pode ser preparada de uma maneira conhecida na técnica e são aquelas adequadas para administração parentérica a mamíferos, particularmente humanos, compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz da composi- ção isoladamente, com um ou mais carreadores farmaceuticamente aceitáveis ou diluentes.

[00196] O termo "carreador farmaceuticamente aceitável", conforme aqui utilizado, significa quaisquer carreadores, diluentes ou excipientes adequados. Estes incluem todas as soluções de injeção estéreis isotô- nicas aquosas e não aquosas que podem conter antioxidantes, tam- pões e solutos, que tornam a composição isotônica com o sangue do destinatário pretendido; suspensões estéreis aquosas e não aquosas, que podem incluir agentes de suspensão e agentes espessantes, mei- os de dispersão, agentes antifúngicos e antibacterianos, agentes iso- tônicos e de absorção e similares. Será entendido que as composições da invenção também podem incluir outros agentes fisiologicamente ativos suplementares.

[00197] O carreador deve ser farmaceuticamente "aceitável" no sentido de ser compatível com os outros ingredientes da composição e não prejudicial ao indivíduo. As composições incluem aquelas ade- quadas para administração parentérica, incluindo administração sub- cutânea, intramuscular, intra-articular, intravenosa e intradérmica. As composições podem ser convenientemente apresentadas na forma de dosagem unitária e podem ser preparadas por qualquer método bem conhecido na técnica de farmácia. Tais métodos incluem a preparação do carreador para associação com as células T CAR. Em geral, as composições são preparadas por associação uniforme e íntima de quaisquer ingredientes ativos com carreadores líquidos.

[00198] Em uma modalidade, a composição é adequada para ad- ministração parentérica. Em outra modalidade, a composição é ade- quada para administração intravenosa. Em outra modalidade, a com- posição é adequada para administração intra-articular.

[00199] As composições adequadas para administração parentérica incluem soluções de injeção estéreis isotônicas aquosas e não aquo- sas que podem conter antioxidantes, tampões, bactericidas e solutos, que tornam a composição isotônica com o sangue do destinatário pre- tendido; e suspensões estéreis aquosas e não aquosas que podem incluir agentes de suspensão e agentes espessantes.

[00200] A invenção também considera a combinação da composi- ção da presente invenção com outros fármacos e / ou em adição a ou- tros regimes de tratamento ou modalidades, tal como cirurgia. Quando a composição da presente invenção é usada em combinação com agentes terapêuticos conhecidos, a combinação pode ser administrada em sequência (continuamente ou interrompida por períodos sem tra- tamento) ou simultaneamente ou como uma mistura. No caso de do- enças autoimunes, por exemplo, artrite reumatoide, o tratamento com- preende administrar ao indivíduo as composições aqui incorporadas, por exemplo, células T autólogas transduzidas com CAR específico para vimentina citrulinada (CV) e um ou mais agentes anti- inflamatórios e / ou agentes terapêuticos. Os agentes anti-inflamatórios compreendem um ou mais anticorpos que se ligam especificamente a citocinas pró-inflamatórias, por exemplo, citocinas pró-inflamatórias, tal como IL-1, TNF, IL-6, GM-CSF e IFN-. Em certas modalidades, os anticorpos são anti-TNFα, anti-IL-6 ou combinações dos mesmos. Em certas modalidades, um ou mais agentes, exceto anticorpos, podem ser administrados, o que diminui as citocinas pró-inflamatórias, por exemplo, anti-inflamatórios não esteroides (NSAIDs). Qualquer combi- nação de anticorpos e um ou mais agentes pode ser administrada, o que diminui as citocinas pró-inflamatórias.

[00201] O tratamento em combinação também é considerado para abranger o tratamento ou com a composição da invenção seguida de um tratamento conhecido ou com um agente conhecido seguido de tratamento com a composição da invenção, por exemplo, como terapia de manutenção. Por exemplo, no tratamento de doenças autoimunes, a ativação excessiva e prolongada de células imunes, tal como linfóci- tos T e B, e a superexpressão do principal fator de necrose tumoral (TNF) pró-inflamatória das citocinas alfa, juntamente com outros medi- adores tal como a interleucina-6 (IL-6), interlucina-1 (IL-1) e interferon gama (IFN-), desempenham um papel central na patogênese das respostas inflamatórias autoimunes na artrite reumatoide (RA), doença inflamatória intestinal (DII), Doença de Crohn (DC), e espondilite an- quilosante (EA).

[00202] Os fármacos anti-inflamatórios não esteroides (AINEs), gli- cocorticoides, fármacos antirreumáticos modificadores de doença (DMARDs) são tradicionalmente usados no tratamento de doenças inflamatórias autoimunes. Os NSAIDs e glicocorticoides são eficazes no alívio da dor e inibição da inflamação, enquanto os DMARDs têm a capacidade de reduzir os danos nos tecidos e órgãos causados por respostas inflamatórias. Mais recentemente, o tratamento da RA e de outras doenças autoimunes foi revolucionado com a descoberta de que o TNF é extremamente importante no desenvolvimento das doen- ças. Os produtos biológicos anti-TNF (tal como infliximab, adalimumab, etanercept, golimumab, e certolizumab pepol) melhoraram significati-

vamente o resultado do tratamento de doenças inflamatórias autoimu- nes.

[00203] Os fármacos anti-inflamatórios não esteroides têm o efeito analgésico, antipirético e anti-inflamatório, frequentemente usados para o tratamento de condições tal como artrite e dores de cabeça. Os NSAIDs aliviam a dor através do bloqueio das enzimas ciclo-oxigenase (COX). A COX promove a produção de prostaglandinas, um mediador que causa inflamação e dor. Embora os NSAIDs tenham estruturas químicas diferentes, todos eles têm o efeito terapêutico semelhante, por exemplo, inibição de respostas inflamatórias autoimunes. Em ge- ral, os NSAIDs podem ser divididos em duas grandes categorias: NSAIDs não seletivos tradicionais e inibidores seletivos da ciclo- oxigenase-2 (COX-2) (para uma revisão, ver P. Li e outros, Front Pharmacol. 2017; 8: 460).

[00204] Além dos agentes anti-TNF, os produtos biológicos direcio- nados a outras citocinas pró-inflamatórias ou moléculas imunologica- mente competentes também foram extensivamente estudados e de- senvolvidos ativamente. Por exemplo, o abatacept, uma proteína de fusão totalmente humanizada do domínio extracelular de CTLA-4 e da fração Fc de IgG1, foi aprovada para pacientes com RA com resposta inadequada à terapia anti-TNF. O principal mecanismo imunológico do abatacept é a inibição seletiva da via de coestimulação (CD80 e CD86) e a ativação das células T. O tocilizumab, um anticorpo monoclonal humanizado anti-IL-6 foi aprovado para pacientes com RA intolerantes a DMARDs e / ou biológicos anti-TNF. Este mAb terapêutico bloqueia a sinalização transmembrana de IL-6 através da ligação com formas solúveis e de membrana do receptor de IL-6. Os fármacos biológicos direcionados a IL-1 (anakinra), respostas imunes de Th1 (IL-12 / IL-23, ustekinumab), respostas imunes de Th17 (IL-17, secukinumab) e CD20 (rituximab) também foram aprovadas para o tratamento de do-

enças autoimunes (Para uma revisão, ver P. Li e outros, Front Phar- macol. 2017; 8: 460).

[00205] Embora métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos aqui descritos possam ser utilizados na prática ou no teste da pre- sente invenção, métodos e materiais adequados são descritos abaixo. Todas as publicações, pedidos de patentes, patentes e outras referên- cias mencionadas aqui são incorporadas por referência na sua totali- dade. Em caso de conflito, a presente especificação, incluindo defini- ções, prevalecerá. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não são destinados a ser limitantes.

EXEMPLOS Exemplo 1: Geração de vetores lentivirais que expressam CV-CAR.

[00206] Diferentes elementos que desempenham um papel impor- tante na eficácia do CAR foram avaliados. Assim, em algumas modali- dades, três versões diferentes do scFv foram comparadas, dois com- primentos de uma dobradiça foram avaliados, e dois domínios coesti- muladores diferentes foram analisados. Em cada uma dessas etapas, um dos candidatos a CV-CAR, que forneceu o melhor perfil de ativa- ção de células T, foi selecionado.

[00207] Geração de scFv CV-específico: As regiões variáveis da cadeia pesada e leve do anticorpo BVCA1 foram sequenciadas e usa- das para gerar o gene scFv CV-específico em um formato VH-ligante- VL. A proteína scFv foi produzida inserindo a sequência em um plas- mídeo pSYN e inoculada em células competentes de E. coli DH5-alfa. Uma única colônia foi cultivada em 5 ml de meio 2YT suplementado com glicose a 2% e 100 µg / ml de ampicilina durante a noite a 30° C em um agitador. Os 5 mL de cultura O / N foram inoculados em 500 ml de meio 2YT fresco (com 0,1% de glicose e 100 µg / ml de ampicilina) e incubados a 37° C por 2,5 horas até OD600 = 0,9. A expressão do scFv foi induzida pela adição de 250 µl de isopropil--d-

tiogalactopiranosídeo (IPTG) e depois incubada a 30° C por 4 horas com agitação. Após 20 min de centrifugação a 5000 rpm, o pelete bac- teriano foi ressuspenso com 12,5 ml de tampão de extração periplas- mático gelado (PPB, 200 g / L de sacarose, 30 mM de Tris-HCl, pH 8,0) e mantido em gelo O / N. No dia seguinte, as bactérias foram cen- trifugadas a 10.000 rpm por 30 min, o sobrenadante foi mantido, e o pelete ressuspenso com 12,5 ml de Mg2SO4 a 5mM gelado e mantido em gelo por 30 minutos para induzir um choque osmótico. As bactérias lisadas foram centrifugadas a 10.000 rpm por 30 min e o sobrenadante foi combinado com o anterior. O scFv CV-específico foi então purifica- do por cromatografia Ni-NTA.

[00208] Avaliação da especificidade de ligação e afinidade de anti- corpos BVCA1 e scFv com o peptídeo CV: A especificidade de ligação de BVCA1 IgG e scFv foi avaliada por ELISA. Placas ELISA de 96 po- ços foram revestidas com O / N a 4° C com 50 µl de estreptavidina a 10 µg / ml. Os poços foram lavados três vezes e bloqueados com 200 µl de 1X PBS 1% de BSA por 1 h em temperatura ambiente e lavados novamente. Foram adicionados 100 µL de peptídeos biotinilados a 10 µg / ml diluídos em PBS 1% de BSA e incubados por 1 h em tempera- tura ambiente. Os poços foram então lavados três vezes. 100 µL de BVCA1 IgG ou scFv ou controle de isotipo foram adicionados em vá- rias concentrações (diluição em série). Após 1,5 h de incubação em RT, os poços foram lavados três vezes e o anticorpo secundário apro- priado - conjugado à fosfatase alcalina (AP) foi adicionado aos poços: para BVCA1 IgG totalmente humano, um anticorpo IgG humano Ab - AP de cabra (Life Technologies) # 62-8422) foi usado na diluição 1/5000; para a versão quimérica do BVCA1 Ab com domínios IgG2a CH2 e CH3 de camundongo, foi utilizado um IgG de cabra anti- camundongo (molécula integral) Ab - AP (Sigma # A3562) na diluição 1/10000, para o scFv de BVCA1, foi utilizada anti-c-Myc Ab (clone

9E10, IgG1 de camundongo; Santa Cruz Biotech, sc-40) na diluição 1/200 seguida de uma IgG - AP anti-camundongo (Sigma, A3562) com diluição 1/10.000. Os poços foram lavados três vezes e foram adicio- nados 100 µL da solução de substrato Step pNPP. A reação foi parada com 50 µL de NaOH a 3M após 15 a 30 min e a absorbância foi lida em um leitor de microplacas a 405 nm. A cinética e as afinidades do BVCA1 Ig e de scFv com o peptídeo CV foram analisadas por resso- nância plasmônica de superfície usando Biacore T100 (GE Healthca- re). O peptídeo CV biotinilado foi imobilizado em um chip sensor reves- tido com estreptavidina (CM5). Concentrações variáveis de anticorpos foram injetadas a uma taxa de fluxo de 30 µl / min.

[00209] Geração de construtos de CAR CV-específicos: Usando o método de montagem Gibson (Gibson Assembly Master Mix, BioLabs, de acordo com as instruções do fabricante), a sequência de scFv anti- CD19 foi substituída pela sequência de scFv CV-específica nos 19 construtos de CAR já existentes clonados no plasmídeo lentiviral p10001 com domínios intracelulares bastante CD28z ou 41BBz segui- dos por um domínio CD3, e uma versão truncada de EGFR (EGFRt) usada como receptor e separada do CAR por um domínio T2A (os construtos de CAR foram fornecidos por Juno Therapeutics). Essrs construtos de CAR eram ambos com uma dobradiça curta (IgG4 - 36bp), de modo que o método de montagem de Gibson foi novamente utilizado para substituir a dobradiça curta por uma dobradiça longa (117bp do domínio extracelular da sequência de CD28 humana). As- sim, múltiplos construtos de CAR CV-específicos foram gerados com uma dobradiça curta ou longa e domínios coestimuladores de 41BB ou CD28.

[00210] Transfecção de células HEK 293T e titulação de partículas lentivirais: células HEK 293T foram plaqueadas a 800.000 células por poço em uma placa de 6 poços com 2 ml de meio DMEM de alto teor de glicose suplementado com 10% de FBS (sem antibióticos) e colo- cadas a 37° C em CO2 a 5% durante a noite. A 80% da confluência nos poços, uma mistura de 1,5 ug de CV-CAR p10001 com 1,33 ug do vetor de empacotamento p8.91, 0,168 μg do vetor de envelope VSV pMD2.G e 9 µg de Reagente de Transfecção FuGENE HD (Promega) foram suavemente adicionados por gotejamento a cada poço. Para melhorar a eficiência da produção de partículas virais, o meio foi subs- tituído após 14 horas por meio FBS-DMEM a 10% fresco com alto teor de glicose suplementado com Reagente ViralBoost (diluído a 1/500; VC-100, Alstem). O sobrenadante do vírus foi colhido 2 dias depois e concentrado 100 vezes usando uma solução de precipitação lentiviral (VP100, Alstem, instruções do fabricante foram seguidas). A eficiência da transfecção das células HEK 293T foi avaliada por citometria de fluxo utilizando um anti-EGFRt Ab (Erbitux, Juno Therapeutics). Para titular as partículas lentivirais, células Jurkat (10.000 / poço em placa de 96 poços) foram colocadas em cultura com uma diluição em série do vírus por 4 dias, depois coradas com anti-EGFRt Ab e analisadas por citometria de fluxo (LSR II; BD Biosciences). As diluições produ- zindo 1% a 20% de células positivas foram usadas para determinar a titulação do vírus seguindo esta equação: [número de células alvo x (% de células EGFRt+ / 100)] / Volume de sobrenadante (ml).

[00211] A Figura 19 mostra a avaliação da expressão de CAR CV- específica na superfície celular das células HEK 293T no dia 3 após a transfecção. As técnicas que foram usadas para transfecção de célu- las HEK 293T e titulação de partículas lentivirais são descritas acima. Exemplo 2: Geração de vetores lentivirais expressando CV-CAR

[00212] Geração de construto de CV-CAR: para gerar um construto CV-CAR expresso em um vetor lentiviral, um fragmento variável de cadeia simples (scFv) de um construto de CD19-CAR presente em um plasmídeo lentiviral p10001 (disponível a partir de Juno Therapeutics,

Inc.) foi substituído por um BVCA1 scFv usando o método de monta- gem Gibson (Figuras 8A e 8B). Como apenas algumas diferenças são observadas entre as sequências de aminoácidos da vimentina humana e murina, o anticorpo anti-CV mostra alta especificidade para peptí- deos humanos e murinos. Isso permite realizar a avaliação em amos- tras humanas in vitro e em um modelo de camundongo RA in vivo. A Figura 6, ilustrando o alinhamento de porções do peptídeo vimentina humana e peptídeo vimentina murina, explica por que o anticorpo mo- noclonal BVCA1 é específico para a vimentina citrulinada humana e murina. A Figura 7 demonstra a avaliação da especificidade do anti- corpo anti-CV (BVCA1). A Figura 4 mostra a avaliação da especifici- dade e da afinidade para CV do fragmento variável de cadeia simples (scFv) sintetizado a partir de anticorpo BVCA1. A Figura 5 mostra que (Figura 5A) a constante de dissociação (KD) entre o IgG totalmente humano BVCA1 e o peptídeo CV humano é de cerca de 10 nM, e que (Figura 5B) KD entre o BVCA1 scFv e o peptídeo CV humano é de cer- ca de 198 nM. Os resultados mostram que, como anticorpo BVCA1, o BVCA1 scFv é específico para vimentina citrulinada.

[00213] Como mostrado na Figura 8B, foram criadas duas versões de CAR CV-específico, cada uma contendo domínios CD3 mais ou CD28 (CV.28z-CAR) ou 41BB (CV.41BBz-CAR). O construto de CV- CAR de acordo com as modalidades descritas pode ter qualquer ti- po(s) adequado(s) de domínios coestimuladores. Uma versão truncada do gene EGFR separada do CAR por um peptídeo T2A foi usada co- mo gene repórter. As partículas lentivirais foram produzidas por trans- fecção de células T HEK 293. O sobrenadante foi coletado no dia 3 e as partículas virais foram precipitadas para serem enriquecidas.

[00214] A Figura 9 ilustra um exemplo de uma linha do tempo de geração de construtos de CV-CAR e avaliação subsequente dos cons- trutos gerados. Detalhes e exemplos das várias etapas da geração e avaliação do construto são descritos ao longo desta descrição.

[00215] Avaliação das dobradiças de construto de CV-CAR de dife- rentes comprimentos: Foram comparados os construtos com dobradi- ças de dois comprimentos diferentes: (1) uma dobradiça curta derivada do motivo IgG4 e (2) uma dobradiça longa que é uma parte do domínio extracelular de CD28 humano. Observou-se que, tanto para CV.28z- CAR quanto para CV.41BBz-CAR, a presença da dobradiça longa in- duziu uma ativação mais eficiente das células T CV-CAR. Dependendo do antígeno-alvo do construto de CAR, o comprimento ideal da dobra- diça pode ser determinado para permitir uma ligação adequada ao an- tígeno. Para avaliar qual comprimento da dobradiça era ideal para a ativação de Treg CAR CV-específico, duas dobradiças diferentes fo- ram comparadas - uma dobradiça curta, IgG4 (36bp) e uma dobradiça longa criada usando uma porção do domínio extracelular de CD28 humano (117bp). Para estudar essas duas dobradiças diferentes, tanto no CV-CAR com domínio intracelular CD28z quanto no CV-CAR com domínio intracelular de 41BBz, foram geradas quatro versões do cons- truto de CV-CAR: duas com a dobradiça curta (CV-IgG4-28z e CV- IgG4 -41BBz) e duas com a dobradiça longa (CV-CD28-28z e CV- CD28-41BBz). A expressão destes diferentes construtos de CV-CAR em Tregs foi induzida por transdução lentiviral e o perfil de ativação das Tregs CV-CAR após serem reestimuladas na presença de micro- esferas de CV-SA foi analisado. Como mostrado na Figura 10A, no dia 3, uma porcentagem maior de células expressou o marcador de ativa- ção CD71 nas populações de Tregs CV-CAR que expressam um cons- truto de CAR com a dobradiça longa em comparação com as de do- bradiça curta. A mesma observação pode ser feita ao avaliar a intensi- dade média de fluorescência (MFI) de CD25 no dia 3. Além disso, as Tregs CV-CAR com a dobradiça longa se expandiram com mais efici- ência do que aquelas com a dobradiça curta (Figura 10B).

[00216] Avaliação de diferentes versões do scFv: Os inventores de- senvolveram um novo scFv, BVCA1, que se liga especificamente à proteína vimentina citrulinada. A maioria dos anticorpos direcionados às proteínas citrulinadas encontrados em pacientes com RA é menos específica e reage de maneira cruzada com uma infinidade de proteí- nas citrulinadas. Assim, a análise posterior utilizou o BVCA1. No en- tanto, a partir dessa IgG única, foram geradas três versões de scFv: (1) uma com as cadeias VL e VH com a sequência de nucleotídeos de origem com um ligante de 24 aminoácidos (scFv # 1), (2) uma com a sequência de nucleotídeos de origem e um ligante (GGGGS)3 (scFv # 2) e (3) uma terceira com uma sequência de cadeias VL e VH códon- otimizadas com um ligante (GGGGS)3 (scFv # 3).

[00217] Como mostrado nas Figuras 11A-11D, apenas o CV-CAR com o scFv # 1 foi expresso de maneira eficiente na superfície das cé- lulas Tregs e Tconv no dia 3 após a transdução, enquanto a expressão do gene repórter sugeriu uma eficácia de transdução comparável entre os 3 diferentes construtos de CAR (Figuras 11A e 11B). No dia 2 após a reestimulação na presença de microesferas de CV-pep-SA (microes- feras CV), foi observada uma porcentagem mais alta de células ex- pressando os marcadores de ativação CD71 e CD69 na população de Treg previamente transduzida com o CV-CAR scFv # 1, em compara- ção com os outros dois grupos de Tregs CV-CAR (Figuras 11C e 11D). Com base nesses resultados, o construto de CV-CAR com o scFv # 1 foi selecionada para continuar o desenvolvimento dos construtos de CV-CAR. Exemplo 3: Geração de Tregs e Tconv humanas transduzidas em CV-

CAR

[00218] Amostras, classificação de células e estimulação in vitro: Foram obtidas unidades de sangue integral frescas de doadores de sangue saudáveis recrutados a partir da população geral da Universi-

dade da Califórnia, San Francisco ou fornecidas pela StemCell Technologies. As PBMCs foram isoladas por sedimentação com gradi- ente de densidade usando meio Ficoll Paque (GE Healthcare). As cé- lulas T CD4+ foram enriquecidas por seleção positiva de PBMCs por classificação magnética de células (Miltenyi Biotec). As células T CD4+ foram então coradas com mAb marcado com fluorocromo específico para CD4, CD25 e CD127 e separadas por citometria de fluxo (FACSAria; BD Biosciences) em dois subconjuntos: CD4+ CD25+ CD127- (células T reguladoras CD4; Tregs) e CD4+ CD25- CD127+ (cé- lulas T convencionais CD4+; Tconv) com uma pureza superior a 97%. As populações de células classificadas foram então estimuladas com Dynabeads revestidas com anti-CD3 / anti-CD28 (ThermoFisher Scien- tific) na relação de 1:1 para Tconv e 1 célula para 2 microesferas para Tregs na presença de interleucina-2 (IL-2; Proleukin, Prometheus La- boratories; 100 U / ml para Tconv e 300 U / ml para Tregs) em meio de células T: meio RPMI 1640 suplementado com 5 mM de HEPES, 2 mM de L-glutamina, 50 mg / ml cada penicilina / estreptomicina (Invi- trogen, Carlsbad, CA), 5 mM de aminoácidos não essenciais, 5 mM de piruvato de sódio (Mediatech) e 10% de FBS (Invitrogen). Meios fres- cos contendo IL-2 foram adicionados a cada 2 dias e as células foram divididas quando necessário.

[00219] Transdução lentiviral das populações de Tconv e Treg e avaliação da eficiência da transdução: No dia 2 após a estimulação das populações de CD4+ classificadas, as células foram contadas e semeadas em 250.000 a 500.000 células por poço em uma placa de 24 poços e colocadas a 37° C por pelo menos 1 hora na incubadora. Uma mistura de partículas virais e sulfato de protamina (100 µg / ml) foi então adicionada aos poços para alcançar uma multiplicidade de infecção (MOI) de 1 partícula por célula. As células foram então centri- fugadas por 30 minutos a 1200xg a 32° C. A placa foi então colocada de volta a 37° C por 90 minutos. As células foram centrifugadas por 5 min e o meio do inóculo foi substituído por um novo contendo IL-2. Três dias depois, a eficiência da transdução foi determinada por cito- metria de fluxo utilizando o anti-EGFRt Ab. Para confirmar que a por- centagem de células EGFRt+ era representativa da expressão do CAR na superfície celular dessas células, as células foram co-coradas com conjugado EGFRt Ab com APC ou PE e um tetrâmero CV- estreptavidina (SA)-AF488, incubados por 2 horas a 4° C sob agitação e analisados por citometria de fluxo no dia 4 após a transdução. O complexo CV-SA-AF488 foi produzido imediatamente antes da colora- ção celular, co-incubando o peptídeo CV biotinilado (Innovagen) com o conjugado SA-AF488 (Life Technologies) na relação de 1 proteína SA para 4 peptídeos biotinilados por 15 min a 4° C sob agitação e girando o tubo em alta velocidade de 14000xg por 5 min. Resultados

[00220] Utilizando os vetores lentivirais CV-CAR, células T regula- doras (Tregs) CD4+ humanas e células convencionais (Tconv) foram transduzidas na relação de 1 vírus para 1 célula. Essas células foram isoladas do sangue periférico de doadores saudáveis (HD), classifica- das por citometria de fluxo com base na expressão de CD4, CD25 e CD127 (Tregs: CD4+ CD25+ CD127-; Tconv: CD4+ CD25- CD127+) e estimuladas por 2 dias com microesferas anti-CD3 / CD28 antes da transdução. As células também foram transduzidas com CD19.28z- CAR e CD19.41BBz-CAR para serem usadas como controle.

[00221] No dia 4 após a transdução, a porcentagem de células EG- FRt+ foi determinada usando um anticorpo anti-EGFRt. Os dados mos- traram que a transdução com CV-CAR e CD19-CAR resultou em por- centagens semelhantes de EGFRt+ entre populações de Tregs e popu- lações de Tconv (Figura 12A). Além disso, foi observado, com todos os CARs testados, que as Tregs foram transduzidas com mais eficiên-

cia do que as Tconv. Assim, em um experimento, de cerca de 74% a cerca de 80% das Tregs eram EGFRt+, dependendo do construto de CAR, em comparação com cerca de 53 a cerca de 59% nas popula- ções de Tconv (Figura 12A). A intensidade de fluorescência média (MFI) também foi maior em Tregs EGFRt+ em comparação com Tconv EGFRt+, como mostrado no exemplo da Figura 12B.

[00222] Para validar que a expressão de EGFRt era representativa da expressão de CAR na superfície celular e para avaliar a capacidade dos construtos de CV-CAR de se ligarem ao antígeno-alvo, as células foram coradas com um peptídeo CV biotinilado / tetrâmero de estrep- tavidina conjugado com FITC (CVpep-SA-FITC) ilustrado na Figura 12C e EGFRt. Os dados confirmaram que a expressão de EGFRt es- tava correlacionada com a expressão de CV-CAR na superfície das Tregs e provaram que a capacidade do BVCA1 scFv de se ligar a CV foi preservada após inserção no construto de CV-CAR (Figura 12D). Resultados semelhantes foram obtidos com células Tconv. Os resulta- dos demonstram que os CARs CV-específicos expressos na superfície de Tregs se ligam especificamente ao peptídeo CV. Exemplo 4: Análise do efeito da sinalização de CV-CAR na ativação e expansão de Tregs in vitro

[00223] Preparação das células para uma segunda rodada de esti- mulação: Para evitar qualquer ativação residual das células devido à presença de Dynabeads revestidas com anti-CD3 / anti-CD28, essas microesferas foram removidas das culturas de células no dia 7 usando um ímã (ThermoFisher Scientific, de acordo com as instruções do fa- bricante). Além disso, quando indicado, as populações de Treg CAR+ e Tconv foram classificadas com base na expressão de EGFRt por cito- metria de fluxo no dia 7.

[00224] Re-estimulação das células T CV-CAR: No dia 9 ou 10 após a primeira estimulação, as células T CAR+ foram estimuladas no-

vamente. Diferentes condições de estimulação foram usadas para comparar os perfis de ativação das células T CV-CAR quando estimu- ladas através do CAR ou através de seu TCR endógeno. As microes- feras que apresentam peptídeos CV foram geradas acoplando peptí- deos CV biotinilados (Innovagen) com estreptavidina Dynabeads M- 280 (Invitrogen, de acordo com as instruções do fabricante), denomi- nadas microsferas de CV-SA. As células foram reestimuladas na pre- sença de IL-2 (100 U / ml para Tconv e 300 U / ml para Tregs) na au- sência ou na presença de Dynabeads revestidas com anti-CD3 / anti- CD28 na relação de 1:1 ou microesferas de CV-SA na relação de 2 microesferas para 1 célula. Meios frescos contendo IL-2 foram adicio- nados a cada 2 dias e as células foram divididas quando necessário.

[00225] Estudo do perfil de ativação e expansão das células T CV- CAR após a segunda rodada de estimulação: No primeiro dia após a reestimulação das células, aglomerados de células foram visualizados usando um microscópio de campo claro. Nos dias 2 e 3, uma pequena fração das células de cada condição de estimulação foi colhida e cora- da com anticorpos contra CD4, CD25, CD69, CD71, EGFRt e coradas com azul fixável LIVE / DEAD (Invitrogen) e incubadas 20 minutos a 4° C. As células foram analisadas por citometria de fluxo, bloqueando as células LIVE CD4+. Para medir a expansão das Tregs CV-CAR após reestimulação, as células CV-CAR+ foram enriquecidas por citometria de fluxo antes da segunda rodada de estimulação (no dia 7 após a primeira estimulação). Essas Tregs CV-CAR+ classificadas foram con- tadas no dia 5 após reestimulação e a expansão foi calculada (número de células no dia 5 / número de células no dia 0).

[00226] Foi avaliada a capacidade do sinal mediado através do CAR das Tregs CV-CAR geradas para ativar as células. As microesfe- ras anti-CD3 / CD28 foram removidas 5 dias após a transdução e as Tregs transduzidas foram deixadas em cultura por 2 dias na presença de apenas IL-2 para permitir que descansassem e, assim, evitar qual- quer sinal residual de ativação. As diferentes populações de Tregs CAR foram então reestimuladas na presença de apenas IL-2 (controle negativo) ou Il-2 combinadas com microesferas anti-CD3 / CD28 (con- trole positivo) ou SA Dynabeads® revestidas com peptídeo CV biotini- lado (microesferas de CV-SA, Figura 13).

[00227] No dia 1 após a reestimulação, a presença de aglomerados nos poços foi avaliada, como uma indicação de interações entre as células e as microesferas. Como mostrado na Figura 14A, os aglome- rados estavam ausentes em todos os poços, independentemente da especificidade do CAR transduzido, na condição de IL-2 única (sem microesfera). Como também mostrado na Figura 14A, na condição de microesfera anti-CD3 / CD28, foram observados aglomerados em to- das as populações de Treg. Neste exemplo, os aglomerados eram vi- síveis apenas nos poços de Treg CV-CAR quando as células foram cultivadas na presença de microesferas de CV-SA, o que pode ser uma indicação de que os CV-CARs interagiram especificamente com as microesferas de CV-SA.

[00228] A expressão dos marcadores de ativação CD71 e CD25 na superfície celular das células no dia 3 foi avaliada por citometria de fluxo. Enquanto em IL-2 apenas as células de condição não expres- sando CD71 e CD25 MFI era baixa, a estimulação com microesferas anti-CD3 / CD28 induziu a expressão de CD71 na grande maioria das Tregs CAR (CD19 e CV-específicas), bem como um forte aumento de MFI de CD25 (Figura 14B). Uma indução da expressão de CD71 foi observada em Tregs CV-CAR apenas na condição de microesfera CV- SA. A percentagem de células CD71+ foi inferior à observada com as microesferas anti-CD3 / CD28, em particular com as Tregs CV.41BBz- CAR. Da mesma forma, a MFI de CD25 foi um aumento na condição de microesfera CV-SA apenas em Tregs CV-CAR com uma MFI ligei-

ramente maior em Tregs CV.28z-CAR (Figura 14C).

[00229] As Figuras 14A-14C mostram que apenas Tregs que ex- pressam CARs CV-específicos exibiram sinais de ativação quando es- timulados na presença de microesferas de CV-SA.

[00230] Foi então avaliado se a estimulação mediada por CAR CV- específico induzida na presença de microesferas de CV-SA era sufici- ente para desencadear a expansão das células. A expansão das dife- rentes populações de Treg CAR em todas as condições foi medida no dia 5 após reestimulação (Figura 14C). Os dados resultantes mostra- ram que, mesmo que a expansão induzida pelas microesferas de CV- SA fosse menor do que a observada na presença de microesferas an- ti-CD3 / CD28, as Tregs CV-CAR proliferaram eficientemente após a estimulação mediada pelo CAR CV-específico. Em coerência com os dados mostrados na Figura 14B, Tregs CV.41BBz-CAR pareciam ex- pandir menos eficientemente do que Tregs CV.28z-CAR, sugerindo que a sinalização de CV.28z-CAR poderia ser mais potente na ativa- ção das células. Esses experimentos também foram realizados em cé- lulas Tconv e forneceram resultados semelhantes.

[00231] Além disso, para validar que a ativação induzida usando microesferas de CV-SA foi devido à presença de peptídeos CV60-75, microesferas de peptídeo-SA de Arginina-Vimentina60-75 (ArgVim) e microesferas de peptídeo-SA de cadeia beta36-52 de fibrinogênio citruli- nado (CitFib) também foram geradas. Quando as Tregs CV-CAR fo- ram co-cultivadas na presença de microesferas de SA não revestidas, microesferas de ArgVim SA ou microesferas de CitFib SA, nenhum sinal de ativação foi observado. Exemplo 5: Avaliação do fenótipo e estabilidade das Tregs CV-CAR após expansão in vitro

[00232] Análise fenotípica e avaliação da produção de citocinas em Tregs CV-CAR expandidas: No dia 18, no final da segunda rodada de estimulação, uma fração das diferentes populações de Treg foi corada com Abs marcado com fluorocromo específico para CD4, CD25, CD127, EGFRt e azul fixável LIVE / DEAD por 20 min a 4° C. Parale- lamente, outra amostra das células foi corada com CD4, CD127, EG- FRt e azul fixável LIVE / DEAD, seguido de uma coloração intranuclear de FOXP3 e Helios usando o conjunto de tampões de coloração Foxp3 (eBioscience), de acordo com as instruções do fabricante. Para a ava- liação da produção de citocinas, as células foram estimuladas com PMA (100 ng / ml) e ionomicina (1 µg / ml) durante 4 h, e foi adiciona- da brefeldina A (1X, Invitrogen) 2 horas após o início da incubação. As células foram então coradas com azul fixável LIVE / DEAD e Abs anti- CD4, -CD127, -EGFRt, fixadas com paraformaldeído a 1% (PFA) em 1X PBS com D-glicose a 2%, permeabilizadas com saponina a 0,1% em PBS 5% FBS e coradas com Abs específico para IFN-, IL-2, IL-17 e IL-10. As células foram analisadas por citometria de fluxo (LSR II; BD Biosciences).

[00233] Para avaliar a estabilidade fenotípica das Tregs CV-CAR após duas rodadas de expansão, o perfil de expressão dos principais marcadores de superfície de Treg (CD25, CD127) e os fatores de transcrição (FOXP3 e Helios), bem como a produção de citocinas no dia 18 foram examinados. As Tregs CV-CAR não transduzidas foram submetidos a duas rodadas de estimulação com uma segunda rodada de ativação com microesferas anti-CD3 / CD28 ou microesferas de CV-SA. No dia 18, as células foram avaliadas por citometria de fluxo quanto à expressão na superfície de CD25 e CD127 (Figura 15A) e expressão intranuclear de FOXP3 e Helios (Figura 15B). Como mos- trado nas Figuras 17A e 15B, as Tregs CV-CAR mantêm seu fenótipo de Treg após duas rodadas de estimulação in vitro.

[00234] Para avaliar o perfil de produção de citocinas dessas Tregs expandidas, as células foram estimuladas com PMA / ionomicina por 4 horas, nas últimas 2 horas na presença de brefeldina A. As células fo- ram fixadas e coradas com anticorpos direcionados a IFN-g, IL- 2, IL- 10 e IL-17 (Figura 15C).

[00235] Os três subconjuntos: Tregs não transduzidas, Tregs CV.28z-CAR e Tregs CV.41BBz-CAR mantiveram um fenótipo de Treg (isto é, CD25+ CD127-, FOXP3+), como mostrado nas Figuras 15A e 15B. Observou-se que nenhuma das Tregs expressou IL-2 ou citoci- nas inflamatórias, INF-g e IL-17 após expansão (Figura 15C). Não foi observada diferença entre Tregs não transduzidas e Tregs CV-CAR. Duas condições de reestimulação foram avaliadas na segunda rodada: microesferas anti-CD3 / CD28 ou microesferas de CV-SA. Perfis se- melhantes foram obtidos em ambas as condições que suportam o conceito de que as Tregs mantêm seu fenótipo após a ativação medi- ada por CV-CAR. Exemplo 6: Desenvolvimento de ensaios in vitro para avaliar o poten- cial terapêutico de Tregs CV-CAR em RA

[00236] Co-cultura das Tregs CV-CAR com fluido sinovial de paci- ente com RA: Amostras de fluido sinovial (SF) de pacientes com RA fornecidas por Jonathan Graf foram usadas para avaliar a capacidade das Tregs CV-CAR de serem ativadas através do CAR usando uma fonte mais relacionada à doença de vimentina citrulinada. No dia 9 após a primeira rodada de estimulação, amostras de fluido sinovial (frescas ou descongeladas) foram misturadas com meio de célula T suplementado com IL-2 na relação de 1:8, 1:16 ou 1:32 (SF: meio ce- lular). As células T CAR foram semeadas em placa de 96 poços a

50.000 células por poço e 200 µl da mistura de meios de cultura de células SF e T foram adicionados a cada poço. Após três dias, as célu- las foram coradas com anticorpos específicos para CD4, CD71, CD25 e azul fixável LIVE / DEAD, como descrito anteriormente. A porcenta- gem de células que expressam CD71 e a MFI de CD25 foi obtida por citometria de fluxo, através do bloqueio da população LIVE CD4+.

[00237] Geração de uma linhagem de células tumorais que expres- sa vimentina citrulinada e caracterização: SKNBE2c é uma linhagem de células tumorais de neuroblastoma conhecida por expressar vimen- tina na superfície celular. As células SKNBE2c (da ATCC) foram des- congeladas e cultivadas em RPMI com Glutamax, FBS a 10%, HEPES e P/S. Utilizando o método de montagem de Gibson (Gibson Assembly Master Mix, BioLabs), o gene da enzima humana peptidil arginina de- saminase 2 (PAD2) foi inserido em um vetor lentiviral pCDH-EF1-T2A- GFP (Addgene). As partículas de vírus foram produzidas por transfec- ção de células HEK 293T e SKNBE2c foram transduzidas a um MOI de 1 partícula por célula. A eficiência de transfecção e transdução foi avaliada através da detecção da expressão de GFP por citometria de fluxo. Para determinar se a indução artificial da expressão da enzima PAD2, envolvida no processo de citrulinação, desencadeou a produ- ção de proteína vimentina citrulinada em SKNBE2C, foi realizada uma coloração por imunofluorescência. Resumidamente, as linhagens de células SKNBE2C de ocorrência natural (WT) e transduzidas por PAD- GFP foram semeadas em lâmina de borossilicato de 8 poços (Lab- Tek). Quando a confluência foi alcançada, as células foram fixadas com PFA a 2% em PBS 1X frio por 30 min, bloqueadas com BSA a 2% em PBS 1X por 30 min em temperatura ambiente, incubadas durante a noite com anticorpo primário (BVCA1 Ab quimérico com IgG2a de ca- mundongo, Ab anti-Vimentina, ou controle de isotipo) a 4° C. Anticor- pos secundários foram então adicionados por 1 hora em RT no escuro e as células foram contrastadas com DAPI por 10 min. As células fo- ram visualizadas usando um microscópio de fluorescência (série BZ- X700, Keyence). Os resultados são mostrados nas Figuras 20A e 20B.

[00238] Co-cultura das Tregs CV-CAR com linhagens de células PAD2-GFP SKNBE2C: as células WT e PAD2-GFP SKNBE2C foram semeadas na placa de 96 poços de fundo plano. Uma vez atingida a confluência, as Tregs não transduzidas, Tregs CD19-CAR e Tregs CV- CAR no dia 10 de sua primeira rodada de estimulação foram adiciona- dos ao poço na presença de meios de células T complementados com IL-2 a 300U / ml. Após três dias de co-cultura, as células foram colhi- das e coradas com anticorpos específicos para a coloração com CD4, CD71, CD25 e azul fixável LIVE / DEAD, como descrito anteriormente. As porcentagens de células que expressam CD71 e a MFI de CD25 foram medidas por citometria de fluxo por meio de bloqueio na popula- ção LIVE CD4+.

[00239] Várias abordagens in vitro foram usadas para demonstrar a capacidade das células T CV-CAR de serem ativadas usando uma fonte mais relacionada à doença de vimentina citrulinada. Os dados obtidos usando fluido sinovial de pacientes com RA ou linhagens de células tumorais que expressam CV como uma fonte de CV mostraram que as Tregs transduzidas por CV.41BBz-CAR não foram ativadas nessas condições, enquanto as Tregs transduzidas por CV.28z-CAR foram ativadas eficientemente. Isso demonstra que, mesmo que am- bos os construtos CV-CAR estejam desencadeando um sinal de ativa- ção eficiente para a célula T que expressa CAR, na presença de mi- croesferas de CV-SA (apresentação artificial do antígeno-alvo), ape- nas CV.28z-CAR ativa a célula em um contexto mais fisiológico.

[00240] Uma das abordagens in vitro foi a co-cultura de Tregs CV- CAR na presença de fluido sinovial colhido da articulação de pacientes com RA que se sabe ser enriquecidos em neutrófilos e armadilhas ex- tracelulares de neutrófilos (NETs), uma das principais fontes de vimen- tina citrulinada em RA. Tregs expandidas que expressam vários cons- trutos de CAR, bem como Tregs não transduzidas, foram colocadas em cultura na presença de IL-2 com ou sem microesferas de CV-SA ou fluido sinovial do paciente com RA. A expressão de CD71 foi avali-

ada por citometria de fluxo após 3,5 dias de cultura (Figura 16A). A Figura 16B mostra porcentagens de células CD71+ entre as frações de EGFRt- e EGFRt+ nas diferentes populações de Treg CAR.

[00241] Ao corar as células com CD71 Ab após 3,5 dias de co- cultura na presença de fluido sinovial de RA, observou-se que apenas a fração de EGFRt+ das Tregs CV.28z-CAR expressou altas porcenta- gens de marcador de ativação de CD71 (Figuras 16A e 16B). As Figu- ras 16B são um resumo dos dados obtidos com SF de 4 pacientes com RA diferentes, Tregs não transduzidas, Tregs CD19.28z-CAR e CD19.41BBz não mostraram nenhum sinal de ativação na presença de fluido sinovial. Esse experimento também foi realizado em células Tconv e resultados semelhantes foram produzidos (dados não mostra- dos). Três amostras de fluido sinovial de diferentes pacientes com RA foram testadas e todas elas induziram especificamente a expressão de CD71 em Tregs EGFRt+ CV.28z-CAR (Figura 18A) e Tconv (dados não mostrados). Esses dados sugerem que essa ativação mediada por fluido sinovial in vitro depende de CV-CAR. De forma importante, ape- nas uma expressão fraca de CD71 foi induzida na superfície de EG- FRt+ CV.41BBz-CAR no dia 3,5 (Figura 16B). Esta observação pode estar ligada ao fato de que o sinal mediado por CV.41BBz-CAR é me- nos capaz de ativar as células do que o induzido por CV.28z-CAR, como mostrado nas Figuras 14A-14C. Exemplo 7: Tratando um indivíduo humano com Tregs CV-CAR em RA

[00242] Voltando à Figura 1, as Tregs CV-CAR foram geradas de acordo com as técnicas descritas para serem utilizadas no desenvol- vimento de uma terapia celular para pacientes com artrite reumatoide. Essa abordagem terapêutica envolve o uso das Tregs do próprio paci- ente (autólogo), isolando as células da amostra de sangue do pacien- te. As Tregs isoladas são manipuladas geneticamente usando o vetor lentiviral que transporta o transgene de CV-CAR. As Tregs CV-CAR passam por duas rodadas de expansão in vitro e são infusionadas no paciente. Isso pode ser feito em combinação com o tratamento anti- TNF para otimizar a eficiência das Tregs nos sítios da doença.

[00243] Consequentemente, em algumas modalidades, é fornecido um método de tratamento de um indivíduo diagnosticado com artrite reumatoide que inclui isolar linfócitos T de uma amostra biológica obti- da do indivíduo, separar células T reguladoras (Treg) CD4+ das células T convencionais (Tconv), em que as células Treg são CD4+ CD25+ CD127- e as Tconv são CD4+ CD25- CD127+, transduzir as células Treg com um vetor de expressão que codifica um receptor quimérico de antígeno (CAR) que se liga especificamente a um antígeno vimen- tina citrulinada (CV), estimulando com microesferas anti-CD3 / anti- CD28 as células Treg transduzidas pelo menos uma vez ex vivo para obter um número suficiente de células Treg específicas para o antíge- no CV e reinfundindo as Treg no indivíduo, tratando assim o indivíduo. Exemplo 8: Expressão na superfície de CV-CAR

[00244] Em algumas modalidades, a capacidade do CAR CV- específico de ser expresso na superfície das Tregs foi avaliada, como mostrado nas Figuras 17A-17B usando um IgG anti-humano (H + L) Ab. Isso foi feito após a transdução lentiviral. Tanto o CAR quanto o receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFRt) foram detectados por citometria de fluxo. A Figura 17A mostra a avaliação da expressão de CAR e EGFRt na superfície de Tregs não transduzidas, Tregs CV / CD28 CAR+ e Tregs CV / 41BB CAR+. A Figura 17B mostra a por- centagem de células CAR+ em vários experimentos. Exemplo 9: Tregs CV.28z-CAR são ativadas na presença de fluido si- novial de pacientes com RA.

[00245] Para demonstrar a capacidade das Tregs expressando CV- CAR em reconhecer e sinalizar na presença de uma fonte clinicamente relevante de vimentina citrulinada, co-cultivou-se Tregs CV-CAR na presença de fluido sinovial colhido da articulação de pacientes com RA conhecido por ser enriquecido em neutrófilos e armadilhas extracelula- res de neutrófilos (NETs), um dos principais produtores de CV em RA. Após 3 dias de co-cultura com fluido sinovial de pacientes com RA ou gota, sendo o último usado como controle negativo, a expressão de CD71 foi analisada entre as células Treg. Na presença do fluido sino- vial do paciente com gota, a indução da expressão de CD71 não foi observada em nenhum dos subconjuntos de Treg (Figura 18B). No en- tanto, quando co-culturas com fluidos sinoviais de pacientes com RA, Tregs CV.28z-CAR EGFRt+ expressam altas porcentagens do marca- dor de ativação CD71, enquanto Tregs EGFRt- está presente no mesmo poço ou Tregs CD19.28z-CAR e Tregs CD19.41BBz-CAR não mostraram nenhum sinal de ativação (Figura 18B e Figura 18C). De acordo com esses dados, a vimentina citrulinada foi detectada nos flu- idos sinoviais dos pacientes com RA, mas não no fluido do paciente com gota (Figura 21). Exemplo 10: Tregs CV.28z-CAR são ativadas na presença de fluido sinovial sem células de pacientes com RA.

[00246] A vimentina citrulinada foi descrita como estando presente principalmente na matriz extracelular na articulação inflamada, suge- rindo que a interação célula a célula pode não ser necessária para que as Tregs CV.28z-CAR sejam capazes de se ligar de maneira eficiente ao antígeno-alvo. Para verificar essa hipótese, comparou-se o perfil de ativação das Tregs CV.28z-CAR após a co-cultura na presença de flu- ido sinovial total ou fluido sinovial sem células de pacientes com RA, usando a camada superior obtida após a centrifugação do gradiente de densidade. Esses dados revelaram que uma porcentagem seme- lhante de Tregs CV.28z-CAR estava expressando CD71 em resposta à co-cultura com fluido sinovial de pacientes com RA na presença ou ausência de células no fluido (Figura 22A e Figura 22B). Juntos, esses dados suportam fortemente o conceito de que as Tregs que expres- sam CV.28z-CAR serão capazes de se ligar a seu antígeno-alvo na matriz extracelular localizada na articulação inflamada dos pacientes com RA. Exemplo 11: Função supressora de células Treg CV.28z-CAR após estimulação mediada por CAR

[00247] Para avaliar as capacidades supressoras das células Treg CV.28z-CAR após estimulação mediada por CAR, a tecnologia CRISPR / Cas9 foi usada para realizar nocaute de TCR endógeno em Tregs para gerar Tregs TCRKO CV.28z-CAR+ (Figura 23A e Figura 23B). Foi realizado um ensaio de supressão utilizando células efetoras T CD4+ estimuladas com anticorpos anti-CD3 ligados à placa como respondedores. A capacidade das Tregs TCRKO CV.28z-CAR+ de su- primir essas células T respondedoras estimuladas por TCR na presen- ça de microesferas de CV-pep-SA (CVb) (Figura 24A e Figura 24B) ou microesferas de Vimentina (Figura 24B) foi avaliada em diferentes re- lações de células respondedoras - supressoras. Esses dados mostram que Tregs TCRKO CV.28z-CAR+ são supressoras após estimulação mediada por CAR na presença de microesferas de CV-SA, enquanto as Tregs TCRKO CD19.28z-CAR+ não eram supressores na presença de microesferas de CV-SA. Exemplo 12: Materiais e Métodos

[00248] Co-cultura das Tregs CV-CAR com fluido sinovial de paci- ente com RA: Amostras de fluido sinovial (SF) de pacientes com RA ou paciente com gota de controle negativo fornecidas por Jonathan Graf foram usadas para avaliar a capacidade das Tregs CV-CAR de serem ativadas através do CAR usando uma fonte mais relacionada à doença de vimentina citrulinada. Quando as amostras de fluido sinovial estavam em quantidade suficiente, parte do fluido foi diluída com 1X PBS e processada por centrifugação em gradiente de densidade. A camada superior (sem células) foi coletada após centrifugação e ar- mazenada a -80 graus. No dia 9 após a primeira rodada de estimula- ção, amostras inteiras de fluido sinovial e amostras de fluido sinovial sem células foram descongeladas e misturadas com meios de células T suplementados com IL-2 em diferentes relações. As células T CAR foram semeadas em uma placa de 96 poços a 50.000 células por poço e 200 µl da mistura de meios de cultura de células SF e T foram adici- onados a cada poço. Após três dias, as células foram coradas com anticorpos específicos para CD4, CD71, CD25 e azul fixável LIVE / DEAD, como descrito anteriormente. A porcentagem de células que expressam CD71 e a MFI de CD25 foram obtidas por citometria de flu- xo, através do bloqueio da população LIVE CD4+.

[00249] Detecção da presença de vimentina citrulinada no fluido sinovial por ELISA direto: Placas ELISA de 96 poços foram revestidas com O / N a 4° C com Ab anti-vimentina de frango a 10 µg / ml. Os po- ços foram lavados três vezes e bloqueados com 200 µl de 1X PBS 1% de BSA por 1 h em temperatura ambiente e lavados novamente. Dife- rentes amostras de sobrenadantes de fluido sinovial diluídos em PBS 1% BSA a 0,1% Tween 20 foram adicionadas e incubadas por 1,5 h em temperatura ambiente. Em alguns outros poços, proteínas vimenti- na e proteínas vimentina citrulinada foram adicionadas em vez de flui- do sinovial para serem usadas como controle negativo e positivo, res- pectivamente. Os poços foram lavados três vezes. Foram adicionados 100 µL de BVCA1 IgG quimérica de camundongo (com domínios CH2 e CH3 de camundongo) a 10 µg / ml ou controle de isotipo. Após 1 h de incubação em temperatura ambiente, os poços foram lavados três vezes e um conjugado Ab-AP secundário de IgG2a de cabra anti- camundongo (Abcam, ab98695) foi adicionado ao poço com diluição de 1/1000. Os poços foram lavados três vezes e foram adicionados 100 µL da solução de substrato Step pNPP. A reação foi parada com

50 µL de NaOH a 3M após 45 min e a absorbância foi lida em um leitor de microplacas a 405 nm.

[00250] Geração de células Treg CV-CAR+ nocaute para TCR usando a tecnologia CRISPR / Cas9. As células Treg foram isoladas de PBMCs frescas por citometria de fluxo, como descrito no Exemplo 3, centrifugadas por 10 min a 90 g e ressuspensas no tampão de ele- troporação Lonza P3 usando 20 μl de tampão por 1 milhão de células. As células Treg foram então eletroporadas com complexos de ribonu- cleoproteína CRISPR-Cas9 (RNP) usando um sistema de eletropora- ção Lonza 4D com 96 poços e código de pulso EH115. Imediatamente após a eletroporação, 80 μl de meio pré-aquecido foram adicionados a cada poço, e as células foram colocadas em repouso por 15 min a 37° C. As células Treg foram então estimuladas com microesferas anti- CD3 / CD28 na relação de 1:1 na presença de 300 UI de IL-2 por ml, como detalhado no Exemplo 3. Dois dias após a classificação e eletro- poração, as células Treg foram transduzidas com diferentes construtos de CAR, como descrito no Exemplo 3. Sete (7) dias depois, as células foram classificadas com base na expressão de EGFRt e CD3 em po- pulações de TCRKO CAR+ ou TCR + CAR+. As células foram então re- estimuladas com microesferas anti-CD3 / CD28 na relação de 1:1 na presença de 300 UI de IL-2 por ml por 5 a 6 dias.

[00251] Ensaio de supressão com Tregs TCRKO CAR+. A supressão de Treg foi avaliada medindo-se a proliferação com base na incorpora- ção de [3H] timidina. Após 12 dias de expansão, as microesferas anti- CD3 / CD28 foram removidas das culturas de Treg TCRKO CV.28z- CAR+ e Treg TCRKO 19.28z-CAR+. As células foram repousadas du- rante 2 dias antes do ensaio de supressão. No dia anterior ao ensaio, as células T efetoras CD4+ (células respondedoras) foram desconge- ladas e mantidas a 37° C de CO2 a 5% durante a noite na presença de 30 UI / ml de IL-2. As placas de 96 poços de fundo redondo foram re-

vestidas com anticorpo anti-CD3 a 5 mg / ml durante a noite e lavadas com 1X PBS. No dia do ensaio, as populações de Treg TCRKO CAR+ e as células respondedoras foram lavadas duas vezes para remover IL-2 residual do meio. As células foram então plaqueadas em poços reves- tidos com Ab anti-CD3 a 50.000 células respondedoras por cavidade e Tregs TCRKO CAR+ foram adicionadas em diferentes relações de res- pondedoras: Treg (de 2:1 a 64:1) na presença de microesfera de Vi- mentin-SA, microesfera de CV-SA, microesferas de CD19 ou sem mi- croesferas. Três (3) dias depois, 20 µl de [3H] timidina (1 µCi) foram adicionados a cada poço. 16 horas depois, as placas foram congela- das a -20 graus. As placas foram colhidas em um Packard FilterMate Harvester e a contagem por minuto (CPM) para cada poço foi lida em um contador de cintilação e luminescência Packard TopCount (Perkin Elmer, Waltham, MA). Para ambos os ensaios, a porcentagem de su- pressão foi calculada da seguinte forma: % de supressão = 1 - [CPM médio (Treg + Respondedora) / CPM médio (respondedora isolada- mente)] x 100%. Listagem de Sequências SEQ ID Sequência Descrição

NO 1 gttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgc Vetor de ttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgt expressão gtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctct Anti-CV CAR- agcagtggcgcccgaacagggacttgaaagcgaaagggaaaccagagg CD28z agctctctcgacgcaggactcggcttgctgaagcgcgcacggcaagaggcg aggggcggcgactggtgagtacgccaaaaattttgactagcggaggctaga aggagagagatgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagat cgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaatta aaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctg gcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaac catcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataatacagtagca accctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagcttt agacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaaaaaagcacagc aagcagcagctgacacaggacacagcaatcaggtcagccaaaattaccct atagtgcagaacatccaggggcaaatggtacatcaggccatatcacctaga actttaaatgcatgggtaaaagtagtagaagagaaggctttcagcccagaag

SEQ ID Sequência Descrição

NO tgatacccatgttttcagcattatcagaaggagccaccccacaagatttaaaca ccatgctaaacacagtggggggacatcaagcagccatgcaaatgttaaaag agaccatcaatgaggaagctgcaggcaaagagaagagtggtgcagagag aaaaaagagcagtgggaataggagctttgttccttgggttcttgggagcagca ggaagcactatgggcgcagcgtcaatgacgctgacggtacaggccagaca attattgtctggtatagtgcagcagcagaacaatttgctgagggctattgaggcg caacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaagcagctccaggcaa gaatcctggctgtggaaagatacctaaaggatcaacagctcctggggatttgg ggttgctctggaaaactcatttgcaccactgctgtgccttggatctacaaatggc agtattcatccacaattttaaaagaaaaggggggattggggggtacagtgca ggggaaagaatagtagacataatagcaacagacatacaaactaaagaatt acaaaaacaaattacaaaaattcaaaattttcgggtttattacagggacagca gagatccagtttggggatcaattgcatgaagaatctgcttagggttaggcgtttt gcgctgcttcgcgaggatctgcgatcgctccggtgcccgtcagtgggcagag cgcacatcgcccacagtccccgagaagttggggggaggggtcggcaattga accggtgcctagagaaggtggcgcggggtaaactgggaaagtgatgtcgtgt actggctccgcctttttcccgagggtgggggagaaccgtatataagtgcagta gtcgccgtgaacgttctttttcgcaacgggtttgccgccagaacacagctgaag cttcgaggggctcgcatctctccttcacgcgcccgccgccctacctgaggccg ccatccacgccggttgagtcgcgttctgccgcctcccgcctgtggtgcctcctga actgcgtccgccgtctaggtaagtttaaagctcaggtcgagaccgggcctttgt ccggcgctcccttggagcctacctagactcagccggctctccacgctttgcctg accctgcttgctcaactctacgtctttgtttcgttttctgttctgcgccgttacagatcc aagctgtgaccggcgcctacggctagcgccgccaccatgctgctgctggtga ccagcctgctgctgtgcgagctgccccaccccgcctttctgctgatccccGAG

GTGAAACTAATAGAATCTGGGGGAGGCTTGGTTGAG CCAGGGCGGTCTCTGAGACTCGCGTGTACAACGTCT GGATTCACCTTTGCCGACTACGGTTTGTCCTGGTTCC GCCAGGGTCCCGGCAAGGGCCTTGAATGGGTAGGTT TCACTGGACCGAAACACCTCGGTGAGACAACAGAAT GCGCCCCGTCTGTGGAAGACAGATGCACCATCTCAA GAGATGATTCCAAAAGCACCGTCTATCTGCAGATGCA CAGGCTCCAACACGAAGACACAGCCGTGTACTTCTG TGTTGGACCTTGGTTCGGCGACTTATTAATGTGGGGC CAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCTCC GGAGGCTCAACTTCTGGCTCCGGTAAGCCAGGCAGC GGAGAAGGTAGTAGTGGATCCGCGCGCGCCATCCA GATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTT GGAGACAGAGTCTCCATCACTTGCCGGGCAACTCAG GACATCAGCACATCTTTAGGCTGGTATCACCAGAGAC CCGGGAAAGCCCCGAGGCTCCTGATCTATGGTGCTT CGAAGGTACAAACTGGGGTCCCATCACGATTCAGCG

SEQ ID Sequência Descrição

NO GCAATGGGTCTGGCACAGAGTTCACTCTCACCATCA GCAGCCTGCAGCCTGAAGATATAGGGACTTATTATTG TCTACAAGATGATGGTTTCCCGTTCACTGTTGGCCAG GGCACCAAGCTGGACATCAAACGCGCGGCCGCAATT GAAGTTATGTATCCTCCTCCTTACCTAGACAATGAGA AGAGCAATGGAACCATTATCCATGTGAAAGGGAAACA

CCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAG CCCttctgggtgctggtggtggtcggaggcgtgctggcctgctacagcctgct ggtcaccgtggccttcatcatcttttgggtgaggagtaagaggagcaggctcct gcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaa gcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctcccggg tgaagttcagcagaagcgccgacgcccctgcctaccagcagggccagaatc agctgtacaacgagctgaacctgggcagaagggaagagtacgacgtcctg gataagcggagaggccgggaccctgagatgggcggcaagcctcggcgga agaacccccaggaaggcctgtataacgaactgcagaaagacaagatggcc gaggcctacagcgagatcggcatgaagggcgagcggaggcggggcaag ggccacgacggcctgtatcagggcctgtccaccgccaccaaggatacctac gacgccctgcacatgcaggccctgcccccaaggctcgagggcggcggaga gggcagaggaagtcttctaacatgcggtgacgtggaggagaatcccggccc taggatgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagca ttcctcctgatcccacgcaaagtgtgtaacggaataggtattggtgaatttaaag actcactctccataaatgctacgaatattaaacacttcaaaaactgcacctcca tcagtggcgatctccacatcctgccggtggcatttaggggtgactccttcacac atactcctcctctggatccacaggaactggatattctgaaaaccgtaaaggaa atcacagggtttttgctgattcaggcttggcctgaaaacaggacggacctccat gcctttgagaacctagaaatcatacgcggcaggaccaagcaacatggtcagt tttctcttgcagtcgtcagcctgaacataacatccttgggattacgctccctcaag gagataagtgatggagatgtgataatttcaggaaacaaaaatttgtgctatgca aatacaataaactggaaaaaactgtttgggacctccggtcagaaaaccaaa attataagcaacagaggtgaaaacagctgcaaggccacaggccaggtctg ccatgccttgtgctcccccgagggctgctggggcccggagcccagggactgc gtctcttgccggaatgtcagccgaggcagggaatgcgtggacaagtgcaacc ttctggagggtgagccaagggagtttgtggagaactctgagtgcatacagtgc cacccagagtgcctgcctcaggccatgaacatcacctgcacaggacgggga ccagacaactgtatccagtgtgcccactacattgacggcccccactgcgtcaa gacctgcccggcaggagtcatgggagaaaacaacaccctggtctggaagta cgcagacgccggccatgtgtgccacctgtgccatccaaactgcacctacgga tgcactgggccaggtcttgaaggctgtccaacgaatgggcctaagatcccgtc catcgccactgggatggtgggggccctcctcttgctgctggtggtggccctggg gatcggcctcttcatgtgagcggccgctctagacccgggctgcaggaattcga tatcaagcttatcgataatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactg gtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgt

SEQ ID Sequência Descrição

NO atcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgct gtctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcact gtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctc ctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgc ctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgt ggtgttgtcggggaaatcatcgtcctttccttggctgctcgcctgtgttgccacctg gattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcgga ccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttc gccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcatcgataccgtc gactagccgtacctttaagaccaatgacttacaaggcagctgtagatcttagcc actttttaaaagaaaaggggggactggaagggctaattcactcccaaagaag acaagatctgctttttgcctgtactgggtctctctggttagaccagatctgagcctg ggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgc cttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagat ccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagaattcgatatcaagc ttatcgataccgtcgacctcgagggggggcccggtacccaattcgccctatag tgagtcgtattacaattcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaac cctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggc gtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcct gaatggcgaatggaaattgtaagcgttaatattttgttaaaattcgcgttaaattttt gttaaatcagctcattttttaaccaataggccgaaatcggcaaaatcccttataa atcaaaagaatagaccgagatagggttgagtgttgttccagtttggaacaaga gtccactattaaagaacgtggactccaacgtcaaagggcgaaaaaccgtcta tcagggcgatggcccactacgtgaaccatcaccctaatcaagttttttggggtc gaggtgccgtaaagcactaaatcggaaccctaaagggagcccccgatttag agcttgacggggaaagccggcgaacgtggcgagaaaggaagggaagaa agcgaaaggagcgggcgctagggcgctggcaagtgtagcggtcacgctgc gcgtaaccaccacacccgccgcgcttaatgcgccgctacagggcgcgtcag gtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatac attcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataata ttgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattccctttttt gcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaag atgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaac agcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagc acttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaag agcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcac cagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcag tgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgat cggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgta actcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacg agcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactatt aactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatgga

SEQ ID Sequência Descrição

NO ggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtt tattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagc actggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacgggga gtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctc actgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattga tttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctca tgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtag aaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgc aaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagct accaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaata ctgttcttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcacc gcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgat aagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgca gcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaac gacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccac gcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcg gaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatcttt atagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtc aggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttc ctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtgg ataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacg accgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcccaatac gcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgac aggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagtt agctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgt gtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgat tacgccaagctcgaaattaaccctcactaaagggaacaaaagctggagctc caccgcggtggcggcctcgaggtcgagatccggtcgaccagcaaccatagt cccgcccctaactccgcccatcccgcccctaactccgcccagttccgcccatt ctccgccccatggctgactaattttttttatttatgcagaggccgaggccgcctcg gcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttg caaaaagcttcgacggtatcgattggctcatgtccaacattaccgccatgttga cattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcc catatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgac cgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagta acgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaact gcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgac gtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgg gactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatg cggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttc caagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaac gggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggt

SEQ ID Sequência Descrição

NO aggcgtgtacggaattcggagtggcgagccctcagatcctgcatataagcag ctgctttttgcctgtactgggtctctctg 2 gttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgc Vetor de ttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgt expressão gtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctct Anti-CV CAR- agcagtggcgcccgaacagggacttgaaagcgaaagggaaaccagagg 41BBz agctctctcgacgcaggactcggcttgctgaagcgcgcacggcaagaggcg aggggcggcgactggtgagtacgccaaaaattttgactagcggaggctaga aggagagagatgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagat cgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaatta aaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctg gcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaac catcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataatacagtagca accctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagcttt agacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaaaaaagcacagc aagcagcagctgacacaggacacagcaatcaggtcagccaaaattaccct atagtgcagaacatccaggggcaaatggtacatcaggccatatcacctaga actttaaatgcatgggtaaaagtagtagaagagaaggctttcagcccagaag tgatacccatgttttcagcattatcagaaggagccaccccacaagatttaaaca ccatgctaaacacagtggggggacatcaagcagccatgcaaatgttaaaag agaccatcaatgaggaagctgcaggcaaagagaagagtggtgcagagag aaaaaagagcagtgggaataggagctttgttccttgggttcttgggagcagca ggaagcactatgggcgcagcgtcaatgacgctgacggtacaggccagaca attattgtctggtatagtgcagcagcagaacaatttgctgagggctattgaggcg caacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaagcagctccaggcaa gaatcctggctgtggaaagatacctaaaggatcaacagctcctggggatttgg ggttgctctggaaaactcatttgcaccactgctgtgccttggatctacaaatggc agtattcatccacaattttaaaagaaaaggggggattggggggtacagtgca ggggaaagaatagtagacataatagcaacagacatacaaactaaagaatt acaaaaacaaattacaaaaattcaaaattttcgggtttattacagggacagca gagatccagtttggggatcaattgcatgaagaatctgcttagggttaggcgtttt gcgctgcttcgcgaggatctgcgatcgctccggtgcccgtcagtgggcagag cgcacatcgcccacagtccccgagaagttggggggaggggtcggcaattga accggtgcctagagaaggtggcgcggggtaaactgggaaagtgatgtcgtgt actggctccgcctttttcccgagggtgggggagaaccgtatataagtgcagta gtcgccgtgaacgttctttttcgcaacgggtttgccgccagaacacagctgaag cttcgaggggctcgcatctctccttcacgcgcccgccgccctacctgaggccg ccatccacgccggttgagtcgcgttctgccgcctcccgcctgtggtgcctcctga actgcgtccgccgtctaggtaagtttaaagctcaggtcgagaccgggcctttgt ccggcgctcccttggagcctacctagactcagccggctctccacgctttgcctg accctgcttgctcaactctacgtctttgtttcgttttctgttctgcgccgttacagatcc aagctgtgaccggcgcctacggctagcgccgccaccatgctgctgctggtga

SEQ ID Sequência Descrição

NO ccagcctgctgctgtgcgagctgccccaccccgcctttctgctgatccccGAG

GTGAAACTAATAGAATCTGGGGGAGGCTTGGTTGAG CCAGGGCGGTCTCTGAGACTCGCGTGTACAACGTCT GGATTCACCTTTGCCGACTACGGTTTGTCCTGGTTCC GCCAGGGTCCCGGCAAGGGCCTTGAATGGGTAGGTT TCACTGGACCGAAACACCTCGGTGAGACAACAGAAT GCGCCCCGTCTGTGGAAGACAGATGCACCATCTCAA GAGATGATTCCAAAAGCACCGTCTATCTGCAGATGCA CAGGCTCCAACACGAAGACACAGCCGTGTACTTCTG TGTTGGACCTTGGTTCGGCGACTTATTAATGTGGGGC CAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCTCC GGAGGCTCAACTTCTGGCTCCGGTAAGCCAGGCAGC GGAGAAGGTAGTAGTGGATCCGCGCGCGCCATCCA GATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTT GGAGACAGAGTCTCCATCACTTGCCGGGCAACTCAG GACATCAGCACATCTTTAGGCTGGTATCACCAGAGAC CCGGGAAAGCCCCGAGGCTCCTGATCTATGGTGCTT CGAAGGTACAAACTGGGGTCCCATCACGATTCAGCG GCAATGGGTCTGGCACAGAGTTCACTCTCACCATCA GCAGCCTGCAGCCTGAAGATATAGGGACTTATTATTG TCTACAAGATGATGGTTTCCCGTTCACTGTTGGCCAG GGCACCAAGCTGGACATCAAACGCGCGGCCGCAATT GAAGTTATGTATCCTCCTCCTTACCTAGACAATGAGA AGAGCAATGGAACCATTATCCATGTGAAAGGGAAACA

CCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAG CCCttctgggtgctggtggtggtcggaggcgtgctggcctgctacagcctgct ggtcaccgtggccttcatcatcttttgggtgaaacggggcagaaagaaactcct gtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaag atggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgcg ggtgaagttcagcagaagcgccgacgcccctgcctaccagcagggccaga atcagctgtacaacgagctgaacctgggcagaagggaagagtacgacgtc ctggataagcggagaggccgggaccctgagatgggcggcaagcctcggcg gaagaacccccaggaaggcctgtataacgaactgcagaaagacaagatg gccgaggcctacagcgagatcggcatgaagggcgagcggaggcggggc aagggccacgacggcctgtatcagggcctgtccaccgccaccaaggatacc tacgacgccctgcacatgcaggccctgcccccaaggctcgagggcggcgg agagggcagaggaagtcttctaacatgcggtgacgtggaggagaatcccgg ccctaggatgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacaccca gcattcctcctgatcccacgcaaagtgtgtaacggaataggtattggtgaattta aagactcactctccataaatgctacgaatattaaacacttcaaaaactgcacct ccatcagtggcgatctccacatcctgccggtggcatttaggggtgactccttcac acatactcctcctctggatccacaggaactggatattctgaaaaccgtaaagg

SEQ ID Sequência Descrição

NO aaatcacagggtttttgctgattcaggcttggcctgaaaacaggacggacctcc atgcctttgagaacctagaaatcatacgcggcaggaccaagcaacatggtca gttttctcttgcagtcgtcagcctgaacataacatccttgggattacgctccctca aggagataagtgatggagatgtgataatttcaggaaacaaaaatttgtgctatg caaatacaataaactggaaaaaactgtttgggacctccggtcagaaaacca aaattataagcaacagaggtgaaaacagctgcaaggccacaggccaggtc tgccatgccttgtgctcccccgagggctgctggggcccggagcccagggact gcgtctcttgccggaatgtcagccgaggcagggaatgcgtggacaagtgca accttctggagggtgagccaagggagtttgtggagaactctgagtgcatacag tgccacccagagtgcctgcctcaggccatgaacatcacctgcacaggacgg ggaccagacaactgtatccagtgtgcccactacattgacggcccccactgcgt caagacctgcccggcaggagtcatgggagaaaacaacaccctggtctgga agtacgcagacgccggccatgtgtgccacctgtgccatccaaactgcaccta cggatgcactgggccaggtcttgaaggctgtccaacgaatgggcctaagatc ccgtccatcgccactgggatggtgggggccctcctcttgctgctggtggtggcc ctggggatcggcctcttcatgtgagcggccgctctagacccgggctgcagga attcgatatcaagcttatcgataatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagat tgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatg cctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcct ggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtg tgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacctgtc agctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatc gccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaa ttccgtggtgttgtcggggaaatcatcgtcctttccttggctgctcgcctgtgttgcc acctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccag cggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcg ccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcatcgata ccgtcgactagccgtacctttaagaccaatgacttacaaggcagctgtagatct tagccactttttaaaagaaaaggggggactggaagggctaattcactcccaa agaagacaagatctgctttttgcctgtactgggtctctctggttagaccagatctg agcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaa gcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaact agagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagaattcgat atcaagcttatcgataccgtcgacctcgagggggggcccggtacccaattcg ccctatagtgagtcgtattacaattcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactg ggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgc cagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttg cgcagcctgaatggcgaatggaaattgtaagcgttaatattttgttaaaattcgc gttaaatttttgttaaatcagctcattttttaaccaataggccgaaatcggcaaaat cccttataaatcaaaagaatagaccgagatagggttgagtgttgttccagtttgg aacaagagtccactattaaagaacgtggactccaacgtcaaagggcgaaa aaccgtctatcagggcgatggcccactacgtgaaccatcaccctaatcaagtt

SEQ ID Sequência Descrição

NO ttttggggtcgaggtgccgtaaagcactaaatcggaaccctaaagggagccc ccgatttagagcttgacggggaaagccggcgaacgtggcgagaaaggaag ggaagaaagcgaaaggagcgggcgctagggcgctggcaagtgtagcggt cacgctgcgcgtaaccaccacacccgccgcgcttaatgcgccgctacaggg cgcgtcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttattttt ctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgctt caataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgccctta ttcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaa gtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactgg atctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaat gatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccg ggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagt actcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaatt atgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgac aacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggat catgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaa cgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaa actattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactgg atggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctgg ctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattg cagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacg gggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggt gcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatacttta gattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgata atctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccc cgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctg cttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaag agctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagatacca aatactgttcttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagc accgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggc gataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggc gcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcg aacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgc cacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagg gtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggt atctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgc tcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttac ggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattc tgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccg aacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgccc aatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggc acgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatg

SEQ ID Sequência Descrição

NO tgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgt atgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgac catgattacgccaagctcgaaattaaccctcactaaagggaacaaaagctgg agctccaccgcggtggcggcctcgaggtcgagatccggtcgaccagcaacc atagtcccgcccctaactccgcccatcccgcccctaactccgcccagttccgc ccattctccgccccatggctgactaattttttttatttatgcagaggccgaggccg cctcggcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttggaggcctag gcttttgcaaaaagcttcgacggtatcgattggctcatgtccaacattaccgcca tgttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttc atagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctg gctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttccc atagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggt aaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccct attgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgac cttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatg gtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacgg ggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaa atcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatg ggcggtaggcgtgtacggaattcggagtggcgagccctcagatcctgcatat aagcagctgctttttgcctgtactgggtctctctg 3 VYATRSSAVRLRSSVP Peptídeo vimentina humana 60- 75 4 AYVTRSSAVRLRSSVP Peptídeo vimentina murina 60-75 5 gaggtgaaactaatagaatctgggggaggcttggttgagccagggcggtctct Anti-CV CAR- gagactcgcgtgtacaacgtctggattcacctttgccgactacggtttgtcctggt CD28z, tccgccagggtcccggcaagggccttgaatgggtaggtttcactggaccgaa nucleotídeo acacctcggtgagacaacagaatgcgccccgtctgtggaagacagatgcac catctcaagagatgattccaaaagcaccgtctatctgcagatgcacaggctcc aacacgaagacacagccgtgtacttctgtgttggaccttggttcggcgacttatt aatgtggggccagggaaccctggtcaccgtctcctcagctagctccggaggc tcaacttctggctccggtaagccaggcagcggagaaggtagtagtggatccg cgcgcgccatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgttggag acagagtctccatcacttgccgggcaactcaggacatcagcacatctttaggc tggtatcaccagagacccgggaaagccccgaggctcctgatctatggtgcttc gaaggtacaaactggggtcccatcacgattcagcggcaatgggtctggcaca gagttcactctcaccatcagcagcctgcagcctgaagatatagggacttattatt gtctacaagatgatggtttcccgttcactgttggccagggcaccaagctggaca tcaaacgcgcggccgcaattgaagttatgtatcctcctccttacctagacaatg

SEQ ID Sequência Descrição

NO agaagagcaatggaaccattatccatgtgaaagggaaacacctttgtccaag tcccctatttcccggaccttctaagcccttctgggtgctggtggtggtcggaggc gtgctggcctgctacagcctgctggtcaccgtggccttcatcatcttttgggtgag gagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccg ccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcg acttcgcagcctatcgctcccgggtgaagttcagcagaagcgccgacgcccc tgcctaccagcagggccagaatcagctgtacaacgagctgaacctgggcag aagggaagagtacgacgtcctggataagcggagaggccgggaccctgag atgggcggcaagcctcggcggaagaacccccaggaaggcctgtataacga actgcagaaagacaagatggccgaggcctacagcgagatcggcatgaag ggcgagcggaggcggggcaagggccacgacggcctgtatcagggcctgtc caccgccaccaaggatacctacgacgccctgcacatgcaggccctgccccc aagg 6 gaggtgaaactaatagaatctgggggaggcttggttgagccagggcggtctct Anti-CV CAR- gagactcgcgtgtacaacgtctggattcacctttgccgactacggtttgtcctggt 41BBz, tccgccagggtcccggcaagggccttgaatgggtaggtttcactggaccgaa nucleotídeo acacctcggtgagacaacagaatgcgccccgtctgtggaagacagatgcac catctcaagagatgattccaaaagcaccgtctatctgcagatgcacaggctcc aacacgaagacacagccgtgtacttctgtgttggaccttggttcggcgacttatt aatgtggggccagggaaccctggtcaccgtctcctcagctagctccggaggc tcaacttctggctccggtaagccaggcagcggagaaggtagtagtggatccg cgcgcgccatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgttggag acagagtctccatcacttgccgggcaactcaggacatcagcacatctttaggc tggtatcaccagagacccgggaaagccccgaggctcctgatctatggtgcttc gaaggtacaaactggggtcccatcacgattcagcggcaatgggtctggcaca gagttcactctcaccatcagcagcctgcagcctgaagatatagggacttattatt gtctacaagatgatggtttcccgttcactgttggccagggcaccaagctggaca tcaaacgcgcggccgcaattgaagttatgtatcctcctccttacctagacaatg agaagagcaatggaaccattatccatgtgaaagggaaacacctttgtccaag tcccctatttcccggaccttctaagcccttctgggtgctggtggtggtcggaggc gtgctggcctgctacagcctgctggtcaccgtggccttcatcatcttttgggtgaa acggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagacca gtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaag aagaaggaggatgtgaactgcgggtgaagttcagcagaagcgccgacgcc cctgcctaccagcagggccagaatcagctgtacaacgagctgaacctgggc agaagggaagagtacgacgtcctggataagcggagaggccgggaccctg agatgggcggcaagcctcggcggaagaacccccaggaaggcctgtataac gaactgcagaaagacaagatggccgaggcctacagcgagatcggcatga agggcgagcggaggcggggcaagggccacgacggcctgtatcagggcct gtccaccgccaccaaggatacctacgacgccctgcacatgcaggccctgcc cccaagg 7 gaggtgaaactaatagaatctgggggaggcttggttgagccagggcggtctct anti-CV scFv,

SEQ ID Sequência Descrição

NO gagactcgcgtgtacaacgtctggattcacctttgccgactacggtttgtcctggt nucleotídeo tccgccagggtcccggcaagggccttgaatgggtaggtttcactggaccgaa acacctcggtgagacaacagaatgcgccccgtctgtggaagacagatgcac catctcaagagatgattccaaaagcaccgtctatctgcagatgcacaggctcc aacacgaagacacagccgtgtacttctgtgttggaccttggttcggcgacttatt aatgtggggccagggaaccctggtcaccgtctcctcagctagctccggaggc tcaacttctggctccggtaagccaggcagcggagaaggtagtagtggatccg cgcgcgccatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgttggag acagagtctccatcacttgccgggcaactcaggacatcagcacatctttaggc tggtatcaccagagacccgggaaagccccgaggctcctgatctatggtgcttc gaaggtacaaactggggtcccatcacgattcagcggcaatgggtctggcaca gagttcactctcaccatcagcagcctgcagcctgaagatatagggacttattatt gtctacaagatgatggtttcccgttcactgttggccagggcaccaagctggaca tcaaacgcgcggccgca 8 attgaagttatgtatcctcctccttacctagacaatgagaagagcaatggaacc Espaçador attatccatgtgaaagggaaacacctttgtccaagtcccctatttcccggacctt hCD28, ctaagccc nucleotídeo 9 ttctgggtgctggtggtggtcggaggcgtgctggcctgctacagcctgctggtca Domínio ccgtggccttcatcatcttttgggtg CD28 TM, nucleotídeo 10 cgggtgaagttcagcagaagcgccgacgcccctgcctaccagcagggcca Domínio gaatcagctgtacaacgagctgaacctgggcagaagggaagagtacgacg intracelular tcctggataagcggagaggccgggaccctgagatgggcggcaagcctcgg CD3, cggaagaacccccaggaaggcctgtataacgaactgcagaaagacaaga nucleotídeo tggccgaggcctacagcgagatcggcatgaagggcgagcggaggcgggg caagggccacgacggcctgtatcagggcctgtccaccgccaccaaggatac ctacgacgccctgcacatgcaggccctgcccccaagg 11 aggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccc Domínio cgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgc intracelular gacttcgcagcctatcgctcc CD28, nucleotídeo 12 aaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagac Domínio cagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaaga intracelular agaagaaggaggatgtgaactg 41BB, nucleotídeo 13 EVKLIESGGGLVEPGRSLRLACTTSGFTFADYGLSWFR Anti-CV CAR- QGPGKGLEWVGFTGPKHLGETTECAPSVEDRCTISRD CD28z, DSKSTVYLQMHRLQHEDTAVYFCVGPWFGDLLMWGQ aminoácido

GTLVTVSSASSGGSTSGSGKPGSGEGSSGSARAIQMT QSPSSLSASVGDRVSITCRATQDISTSLGWYHQRPGKA PRLLIYGASKVQTGVPSRFSGNGSGTEFTLTISSLQPED

SEQ ID Sequência Descrição

NO IGTYYCLQDDGFPFTVGQGTKLDIKRAAAIEVMYPPPYL DNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGG VLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPG PTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQ NQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKN PQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLY

QGLSTATKDTYDALHMQALPPR 14 EVKLIESGGGLVEPGRSLRLACTTSGFTFADYGLSWFR Anti-CV CAR- QGPGKGLEWVGFTGPKHLGETTECAPSVEDRCTISRD 41BBz, DSKSTVYLQMHRLQHEDTAVYFCVGPWFGDLLMWGQ aminoácido

GTLVTVSSASSGGSTSGSGKPGSGEGSSGSARAIQMT QSPSSLSASVGDRVSITCRATQDISTSLGWYHQRPGKA PRLLIYGASKVQTGVPSRFSGNGSGTEFTLTISSLQPED IGTYYCLQDDGFPFTVGQGTKLDIKRAAAIEVMYPPPYL DNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGG VLACYSLLVTVAFIIFWVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTT QEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQG QNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRK NPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGL

YQGLSTATKDTYDALHMQALPPR 15 EVKLIESGGGLVEPGRSLRLACTTSGFTFADYGLSWFR anti-CV scFv, QGPGKGLEWVGFTGPKHLGETTECAPSVEDRCTISRD aminoácido

DSKSTVYLQMHRLQHEDTAVYFCVGPWFGDLLMWGQ GTLVTVSSASSGGSTSGSGKPGSGEGSSGSARAIQMT QSPSSLSASVGDRVSITCRATQDISTSLGWYHQRPGKA PRLLIYGASKVQTGVPSRFSGNGSGTEFTLTISSLQPED

IGTYYCLQDDGFPFTVGQGTKLDIKRAAA 16 IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP Espaçador hCD28, aminoácido 17 FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV Domínio CD28 TM, aminoácido 18 RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDK Domínio RRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEI intracelular GMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPP CD3, R aminoácido 19 RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFA Domínio AYRS intracelular CD28, aminoácido

SEQ ID Sequência Descrição

NO 20 KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEG Domínio GCEL intracelular 41BB, aminoácido 21 ValTyrAlaThrCitSerSerAlaValCitLeuCitSerSerValPro Peptídeo CV Cit = citrulline humano 60- 75 22 AlaTyrValThrCitSerSerAlaValCitLeuCitSerSerValPro Peptídeo CV Cit = citrulline murino 60-75

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Receptor quimérico de antígeno (CAR) caracterizado pe- lo fato de que compreende um domínio de ligação antígeno-específico, um domínio de dobradiça, um domínio transmembrana, um domínio coestimulador, e um domínio de sinalização CD3, em que o domínio de ligação antígeno-específico se liga especificamente a antígenos que compreendem polipeptídeos vimentina ou peptídeos dos mesmos.

2. Receptor quimérico de antígeno, de acordo com a reivin- dicação 1, caracterizado pelo fato de que os polipeptídeos vimentina ou peptídeos dos mesmos são pós-traducionalmente modificados, compreendendo polipeptídeos vimentina citrulinada (CV) ou peptídeos dos mesmos.

3. Receptor quimérico de antígeno, de acordo com a reivin- dicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação antígeno-específico compreende um anticorpo, fragmento de anticor- po, um nanocorpo de camelídeo, ou aptâmero.

4. Receptor quimérico de antígeno, de acordo com a reivin- dicação 3, caracterizado pelo fato de que o fragmento de anticorpo é um fragmento de cadeia simples.

5. Receptor quimérico de antígeno, de acordo com a reivin- dicação 4, caracterizado pelo fato de que o fragmento de cadeia sim- ples é um fragmento variável de cadeia simples (scFv).

6. Receptor quimérico de antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o domí- nio coestimulador compreende um polipeptídeo CD28 ou 41BB.

7. Receptor quimérico de antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que: a) o domínio de dobradiça é codificado por uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 50% de identidade de sequên- cia com a SEQ ID NO: 8;

b) o domínio transmembrana é codificado por uma sequên- cia de ácidos nucleicos tendo pelo menos 50% de identidade de se- quência com a SEQ ID NO: 9; c) o domínio de sinalização CD3 é codificado por uma se- quência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 50% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 10; e/ou; d) o domínio coestimulador CD28 é codificado por uma se- quência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 50% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 11.

8. Receptor quimérico de antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que: a) o domínio de dobradiça é codificado por uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 75% de identidade de sequên- cia com a SEQ ID NO: 8; b) o domínio transmembrana é codificado por uma sequên- cia de ácidos nucleicos tendo pelo menos 75% de identidade de se- quência com a SEQ ID NO: 9; c) o domínio de sinalização CD3 é codificado por uma se- quência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 75% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 10; e/ou; d) o domínio coestimulador CD28 é codificado por uma se- quência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 75% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 11.

9. Receptor quimérico de antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que: a) o domínio de dobradiça é codificado por uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 95% de identidade de sequên- cia com a SEQ ID NO: 8; b) o domínio transmembrana é codificado por uma sequên- cia de ácidos nucleicos tendo pelo menos 95% de identidade de se-

quência com a SEQ ID NO: 9; c) o domínio de sinalização CD3 é codificado por uma se- quência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 10; e/ou; d) o domínio coestimulador CD28 é codificado por uma se- quência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 11.

10. Receptor quimérico de antígeno, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que: a) o domínio de dobradiça é codificado pela sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 8; b) o domínio transmembrana é codificado pela sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 9; c) o domínio de sinalização CD3 é codificado pela se- quência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 10; e/ou; d) o domínio coestimulador CD28 é codificado pela se- quência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 11.

11. Receptor quimérico de antígeno, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que: a) o domínio de dobradiça é codificado por uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 50% de identidade de sequên- cia com a SEQ ID NO: 8; b) o domínio transmembrana é codificado por uma sequên- cia de ácidos nucleicos tendo pelo menos 50% de identidade de se- quência com a SEQ ID NO: 9; c) o domínio de sinalização CD3 é codificado por uma se- quência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 50% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 10; e/ou; d) o domínio coestimulador 41BB é codificado por uma se- quência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 50% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 12.

12. Receptor quimérico de antígeno, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que: a) o domínio de dobradiça é codificado por uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 75% de identidade de sequên- cia com a SEQ ID NO: 8; b) o domínio transmembrana é codificado por uma sequên- cia de ácidos nucleicos tendo pelo menos 75% de identidade de se- quência com a SEQ ID NO: 9; c) o domínio de sinalização CD3 é codificado por uma se- quência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 75% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 10; e/ou; d) o domínio coestimulador 41BB é codificado por uma se- quência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 75% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 12.

13. Receptor quimérico de antígeno, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que: a) o domínio de dobradiça é codificado por uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 95% de identidade de sequên- cia com a SEQ ID NO: 8; b) o domínio transmembrana é codificado por uma sequên- cia de ácidos nucleicos tendo pelo menos 95% de identidade de se- quência com a SEQ ID NO: 9; c) o domínio de sinalização CD3 é codificado por uma se- quência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 10; e/ou; d) o domínio coestimulador 41BB é codificado por uma se- quência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 12.

14. Receptor quimérico de antígeno, de acordo com qual-

quer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que: a) o domínio de dobradiça é codificado pela sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 8; b) o domínio transmembrana é codificado pela sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 9; c) o domínio de sinalização CD3 é codificado pela se- quência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 10; e/ou; d) o domínio coestimulador 41BB é codificado pela sequên- cia de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 12.

15. Receptor quimérico de antígeno, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que o CV-CAR se liga especificamente a um peptídeo CV tendo pelo menos 50% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 21 ou 22.

16. Receptor quimérico de antígeno, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que o CV-CAR se liga especificamente a um peptídeo CV tendo pelo menos 75% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 21 ou 22.

17. Receptor quimérico de antígeno, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que o CV-CAR se liga especificamente a um peptídeo CV tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 21 ou 22.

18. Receptor quimérico de antígeno, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que o CV-CAR se liga especificamente a um peptídeo CV compreendendo SEQ ID NO: 21 ou 22.

19. Célula T isolada caracterizada pelo fato de que é modi- ficada para expressar: um receptor quimérico de antígeno (CAR) com- preendendo um domínio de ligação ao antígeno ligado a pelo menos um domínio coestimulador e um domínio de sinalização CD3, em que o domínio de ligação ao antígeno compreende um fragmento variável de cadeia simples (scFv) que se liga especificamente à vimentina citru- linada (CV).

20. Célula T isolada, de acordo com a reivindicação 19, ca- racterizada pelo fato de que o domínio coestimulador compreende um polipeptídeo CD28 ou 41BB.

21. Célula T isolada, de acordo com a reivindicação 19 ou 20, caracterizada pelo fato de que: a) o CAR compreende um domínio de dobradiça codificado por uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 50% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8; b) o CAR compreende um domínio transmembrana codifi- cado por uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 50% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 9; c) o domínio de sinalização CD3 é codificado por uma se- quência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 50% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 10; e/ou; d) o domínio coestimulador CD28 é codificado por uma se- quência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 50% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 11.

22. Célula T isolada, de acordo com a reivindicação 19 ou 20, caracterizada pelo fato de que: a) o CAR compreende um domínio de dobradiça codificado por uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 75% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8; b) o CAR compreende um domínio transmembrana codifi- cado por uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 75% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 9; c) o domínio de sinalização CD3 é codificado por uma se- quência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 75% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 10; e/ou;

d) o domínio coestimulador CD28 é codificado por uma se- quência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 75% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 11.

23. Célula T isolada, de acordo com a reivindicação 19 ou 20, caracterizada pelo fato de que: a) o CAR compreende um domínio de dobradiça codificado por uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8; b) o CAR compreende um domínio transmembrana codifi- cado por uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 9; c) o domínio de sinalização CD3 é codificado por uma se- quência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 10; e/ou; d) o domínio coestimulador CD28 é codificado por uma se- quência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 11.

24. Célula T isolada, de acordo com a reivindicação 19 ou 20, caracterizada pelo fato de que: a) o CAR compreende um domínio de dobradiça codificado pela sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 8; b) o CAR compreende um domínio transmembrana codifi- cado pela sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 9; c) o domínio de sinalização CD3 é codificado pela se- quência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 10; e/ou; d) o domínio coestimulador CD28 é codificado pela se- quência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 11.

25. Célula T isolada, de acordo com a reivindicação 19 ou 20, caracterizada pelo fato de que: a) o CAR compreende um domínio de dobradiça codificado por uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 50% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8; b) o CAR compreende um domínio transmembrana codifi- cado por uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 50% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 9; c) o domínio de sinalização CD3 é codificado por uma se- quência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 50% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 10; e/ou; d) o domínio coestimulador 41BB é codificado por uma se- quência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 50% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 12.

26. Célula T isolada, de acordo com a reivindicação 19 ou 20, caracterizada pelo fato de que: a) o CAR compreende um domínio de dobradiça codificado por uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 75% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8; b) o CAR compreende um domínio transmembrana codifi- cado por uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 75% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 9; c) o domínio de sinalização CD3 é codificado por uma se- quência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 75% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 10; e/ou; d) o domínio coestimulador 41BB é codificado por uma se- quência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 75% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 12.

27. Célula T isolada, de acordo com a reivindicação 19 ou 20, caracterizada pelo fato de que: a) o CAR compreende um domínio de dobradiça codificado por uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8;

b) o CAR compreende um domínio transmembrana codifi- cado por uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 9; c) o domínio de sinalização CD3 é codificado por uma se- quência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 10; e/ou; d) o domínio coestimulador 41BB é codificado por uma se- quência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 12.

28. Célula T isolada, de acordo com a reivindicação 19 ou 20, caracterizada pelo fato de que: a) o CAR compreende um domínio de dobradiça codificado pela sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 8; b) o CAR compreende um domínio transmembrana codifi- cado pela sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 9; c) o domínio de sinalização CD3 é codificado pela se- quência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 10; e/ou; d) o domínio coestimulador 41BB é codificado pela sequên- cia de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 12.

29. Célula T isolada, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 19 a 28, caracterizada pelo fato de que a célula T é uma célula T reguladora (Treg) de mamífero.

30. Célula T isolada, de acordo com a reivindicação 29, ca- racterizada pelo fato de que a célula Treg é CD4+ CD25+ CD127- FOXP3+.

31. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que co- difica o receptor quimérico de antígeno (CAR) como definido em qual- quer uma das reivindicações 1 a 18.

32. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que com- preende o vetor de expressão como definido na reivindicação 31.

33. Método para tratar um indivíduo diagnosticado com ar- trite reumatoide, caracterizado pelo fato de que compreende: isolar linfócitos T de uma amostra biológica obtida do indi- víduo; separar células T reguladoras (Treg) CD4+ das células T convencionais (Tconv), em que as células Treg são CD4+ CD25+ CD127- e as Tconv são CD4+ CD25- CD127+; transduzir as células Treg com um vetor de expressão que codifica um receptor quimérico de antígeno (CAR) que se liga especifi- camente a um antígeno vimentina citrulinada (CV); expandir as Treg transduzidas com microesferas anti-CD3 / CD28 pelo menos uma vez ex vivo para obter células Treg expandidas específicas para o antígeno CV; e reinfundir as Treg no indivíduo, tratando assim o indivíduo.

34. Método, de acordo com a reivindicação 33, caracteriza- do pelo fato de que as células Treg são células autólogas.

35. Método, de acordo com a reivindicação 33 ou 34, carac- terizado pelo fato de que o CAR compreende um domínio de ligação ao antígeno ligado a pelo menos um domínio coestimulador e um do- mínio de sinalização CD3, em que o domínio de ligação ao antígeno compreende um fragmento variável de cadeia simples (scFv) que se liga especificamente à vimentina citrulinada (CV).

36. Método, de acordo com a reivindicação 35, caracteriza- do pelo fato de que o domínio coestimulador compreende um polipep- tídeo CD28 ou 41BB.

37. Método, de acordo com a reivindicação 35 ou 36, carac- terizado pelo fato de que: a) o CAR compreende um domínio de dobradiça codificado por uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 50% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8;

b) o CAR compreende um domínio transmembrana codifi- cado por uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 50% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 9; c) o domínio de sinalização CD3 é codificado por uma se- quência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 50% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 10; e/ou; d) o domínio coestimulador CD28 é codificado por uma se- quência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 50% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 11.

38. Método, de acordo com a reivindicação 35 ou 36, carac- terizado pelo fato de que: a) o CAR compreende um domínio de dobradiça codificado por uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 75% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8; b) o CAR compreende um domínio transmembrana codifi- cado por uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 75% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 9; c) o domínio de sinalização CD3 é codificado por uma se- quência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 75% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 10; e/ou; d) o domínio coestimulador CD28 é codificado por uma se- quência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 75% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 11.

39. Método, de acordo com a reivindicação 35 ou 36, carac- terizado pelo fato de que: a) o CAR compreende um domínio de dobradiça codificado por uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8; b) o CAR compreende um domínio transmembrana codifi- cado por uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 95%

de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 9; c) o domínio de sinalização CD3 é codificado por uma se- quência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 10; e/ou; d) o domínio coestimulador CD28 é codificado por uma se- quência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 11.

40. Método, de acordo com a reivindicação 35 ou 36, carac- terizado pelo fato de que: a) o CAR compreende um domínio de dobradiça codificado pela sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 8; b) o CAR compreende um domínio transmembrana codifi- cado pela sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 9; c) o domínio de sinalização CD3 é codificado pela se- quência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 10; e/ou; d) o domínio coestimulador CD28 é codificado pela se- quência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 11.

41. Método, de acordo com a reivindicação 35 ou 36, carac- terizado pelo fato de que: a) o CAR compreende um domínio de dobradiça codificado por uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 50% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8; b) o CAR compreende um domínio transmembrana codifi- cado por uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 50% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 9; c) o domínio de sinalização CD3 é codificado por uma se- quência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 50% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 10; e/ou; d) o domínio coestimulador 41BB é codificado por uma se- quência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 50% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 12.

42. Método, de acordo com a reivindicação 35 ou 36, carac- terizado pelo fato de que: a) o CAR compreende um domínio de dobradiça codificado por uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 75% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8; b) o CAR compreende um domínio transmembrana codifi- cado por uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 75% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 9; c) o domínio de sinalização CD3 é codificado por uma se- quência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 75% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 10; e/ou; d) o domínio coestimulador 41BB é codificado por uma se- quência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 75% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 12.

43. Método, de acordo com a reivindicação 35 ou 36, carac- terizado pelo fato de que: a) o CAR compreende um domínio de dobradiça codificado por uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8; b) o CAR compreende um domínio transmembrana codifi- cado por uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 9; c) o domínio de sinalização CD3 é codificado por uma se- quência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 10; e/ou; d) o domínio coestimulador 41BB é codificado por uma se- quência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 12.

44. Método, de acordo com a reivindicação 35 ou 36, carac-

terizado pelo fato de que: a) o CAR compreende um domínio de dobradiça codificado pela sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 8; b) o CAR compreende um domínio transmembrana codifi- cado pela sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 9; c) o domínio de sinalização CD3 é codificado pela se- quência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 10; e/ou; d) o domínio coestimulador 41BB é codificado pela sequên- cia de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 12.

45. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 33 a 44, caracterizado pelo fato de que compreende adicional- mente administrar ao indivíduo um ou mais agentes anti-inflamatórios e/ou agentes terapêuticos.

46. Método, de acordo com a reivindicação 45, caracteriza- do pelo fato de que os agentes anti-inflamatórios compreendem um ou mais anticorpos que se ligam especificamente a citocinas pró- inflamatórias.

47. Método, de acordo com a reivindicação 46, caracteriza- do pelo fato de que os anticorpos são anti-TNFα, anti-IL-6 ou combina- ções dos mesmos.

48. Receptor quimérico de antígeno (CAR) caracterizado pelo fato de que compreende um domínio de ligação ao antígeno, um domínio de dobradiça, um domínio transmembrana, domínio coestimulador, e um domínio de sinalização CD3, em que o domínio antígeno-específico compreende um anticorpo ou fragmento de anti- corpo.

49. Receptor quimérico de antígeno, de acordo com a rei- vindicação 48, caracterizado pelo fato de que o fragmento de anticorpo é um fragmento variável de cadeia simples (scFv) que se liga especifi- camente a antígenos pós-traducionalmente modificados.

50. Receptor quimérico de antígeno, de acordo com a rei- vindicação 48 ou 49, caracterizado pelo fato de que o domínio coesti- mulador compreende um polipeptídeo CD28 ou 41BB.

51. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o receptor quimérico de antígeno (CAR) como defini- do em qualquer uma das reivindicações 1 a 18 e 48 a 50, célula T iso- lada como definida em qualquer uma das reivindicações 19 a 30, vetor de expressão como definido na reivindicação 31 ou célula hospedeira como definida na reivindicação 32.

52. Método ex vivo, caracterizado pelo fato de que compre- ende: isolar linfócitos T de uma amostra biológica; separar células T reguladoras (Treg) CD4+ das células T convencionais (Tconv), em que as células Treg são CD4+ CD25+ CD127- e as Tconv são CD4+ CD25- CD127+; transduzir as células Treg com um vetor de expressão que codifica um receptor quimérico de antígeno (CAR) que se liga especifi- camente a um antígeno vimentina citrulinada (CV); e expandir as Treg transduzidas com microesferas anti-CD3 / CD28 pelo menos uma vez ex vivo para obter células Treg expandidas específicas para o antígeno CV.

53. Uso de receptor quimérico de antígeno (CAR) como de- finido em qualquer uma das reivindicações 1 a 18 e 48 a 50, célula T isolada como definida em qualquer uma das reivindicações 19 a 30, vetor de expressão como definido na reivindicação 31 e/ou célula hos- pedeira como definida na reivindicação 32 , caracterizado pelo fato de que é na preparação de uma composição para tratar uma doença.

54. Invenção, caracterizada em quaisquer formas de suas concretizações ou em qualquer categoria aplicável de reivindicação, por exemplo, de produto ou de processo ou uso ou qualquer outro tipo de reivindicação englobada pela matéria inicialmente descrita, revela- da ou ilustrada no pedido de patente.

Citrulinação de vimentina

Petição 870200098429, de 06/08/2020, pág. 138/224 Inibidores de TNF

Infusão Isolamento de Treg de PBMCs do paciente

Tregs CAR CV-específicas Paciente com AR 1/25

Expansão de Treg CAR

Vetor lentiviral

CAR CV-específico Transdução do CAR em Tregs

Identificação de Transfecção do um Ab anti-CV construto de CAR CV-específico em células HEK 293T

Petição 870200098429, de 06/08/2020, pág. 139/224 Geração de um 2/25 scFv anti-CV

Transdução de CAR CV-específico em células Tregs

Inserção do scFV anti-CV em um construto de DNA de CAR

Vetor lentiviral Construto de CAR

Neutrófilo

Petição 870200098429, de 06/08/2020, pág. 140/224 CV de superfície 3/25

Osteoclasto Célula B

CV: vimentina citrulinada

Valor U Hvimentina (60 – 75)

Tempo (s) Valor U Tempo (s)

Resposta (RU)

Peptídeo vimentina humana 60-75

Peptídeo vimentina murina 60-75

Petição 870200098429, de 06/08/2020, pág. 142/224 Ab totalmente humano anti-CV Ab quimérico anti-CV (com um Fc de camundongo) 5/25

Hvimentina (60 – 75)

scFv anti-CV

Petição 870200098429, de 06/08/2020, pág. 143/224 Dobradiça Domínio transmembrana (CD28 humano)

Domínio coestimulador

Domínio de sinalização intracelular (CD3z humano) 6/25

Dobradiça

CD28 ou 41BB

Petição 870200098429, de 06/08/2020, pág. 144/224 Transdução das Tregs Purificação de células Treg CAR+ por Ensaios fenotípicos e funcionais com CAR codificando vetores lentivirais citometria de fluxo

Dias 7/25

Classificação de Treg a partir de PBMCs frescas Avaliação da eficiência Reestimulação de Treg de transdução de CAR CAR+ com microesferas Ativação de Treg (300 UI / e ensaio de especificidade anti-CD3 / CD28 ou microesferas mL de IL-2, microesferas de antígeno de CV na presença de IL-2 anti-CD3 / CD28 em relação de 2 microesferas por célula)

Expressão de CD71 (% de células positivas) Expressão de CD25 (MFI)

Espaçador: IgG4 (curto) Espaçador: CD28 (longo) Espaçador: IgG4 (curto) Espaçador: CD28 (longo)

Petição 870200098429, de 06/08/2020, pág. 145/224 Domínios intra: Domínios intra:

Domínios intra: Domínios intra: 8/25

I.

IL-2 isoladamente II.

Microesferas anti-CD3 / CD28 III.

Microesferas de CV-SA

IL-2 isoladamente

Microesferas anti-CD3 / CD28

Expansão no dia 5 Microesferas de CV-SA

Petição 870200098429, de 06/08/2020, pág. 146/224 IL-2 isola- Microesferas anti-CD3 / CD28 Microesferas de CV damente

% de Tregs CD69+ Nenhuma Nenhuma

% de célula expressando gene repórter 9/25

% de Tregs CD71+

% de células CV-CAR+ Nenhuma Nenhuma

Nenhum Nenhum Contagem Nenhum m hu en

N Células CAR+ um h en

N % de células EGFRT+

Sem Microesferas Microesferas microesferas de CD3 / CD28 de CV-SA

Petição 870200098429, de 06/08/2020, pág. 148/224 Domínio coestimu- lador CD28

Domínio coestimu- lador 41BB

Tregs CAR+ CD19-específicas 11/25

Domínio coestimu- lador CD28

Domínio coestimu- Tregs CAR+ CV-específicas lador 41BB

Petição 870200098429, de 06/08/2020, pág. 149/224 Não estimuladas 12/25

Expansão de Treg no dia 5 após reestimulação

Expansão de dobra Nenhuma

Reestimulação: microesferas anti-3 / 28 Reestimulação: microesferas de CV-SA

Tregs não transduzidas

Petição 870200098429, de 06/08/2020, pág. 150/224 13/25

Petição 870200098429, de 06/08/2020, pág. 151/224 Tregs não transduzidas 14/25

Não transduzidas

IL-2

Petição 870200098429, de 06/08/2020, pág. 152/224 isolada- mente

Microesferas de CV-SA 15/25

Fluido sinovial

Microesferas de CV

Petição 870200098429, de 06/08/2020, pág. 153/224 % de células CD71+ Nenhuma

Fluido sinovial de paciente com AR 16/25

% de células CD71+ Nenhuma

Petição 870200098429, de 06/08/2020, pág. 154/224 Tregs não transduzidas

% de células CAR+ 17/25

Coestimulador:

Especificidade de CAR:

IL-2 isoladamente

% de células CD71+ SF de controle

Não transduzidas

Contagem

Aumento: x20

Contagem le ro nt co de

SF a m nhu e

N

SF sem células SF integral

% de células CD71+ SF sem células SF integral

Petição 870200098429, de 06/08/2020, pág. 161/224 Eletroporação Expansão de células Formação de CAS9 / gRNA Dia 0 Dia 2 Dia 9 24/25

Nocaute da estimulação por Transdução de Análise fenotípica TCR com anti-CD3 / CD28b lentivírus do CAR Enriquecimento de células por citometria de fluxo

Petição 870200098429, de 06/08/2020, pág. 162/224 % de supressão 25/25

% de supressão 2 para 1 4 para 1 8 para 1 16 para 1 32 para 1 64 para 1

Relação respondedoras:Treg