CN115361955A

CN115361955A - 针对bcma的嵌合抗原受体t细胞组合物及其方法和用途

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Publication number: CN115361955A
Application number: CN202180027123.2A
Authority: CN
Inventors: M·韦斯特比; A·W·布里格斯; D·G·库格勒; R·G·卡斯帕里; C·陈; D·瓦伦; L·杰美罗; C·斯坦伯格; M·P·波尔托拉克; K·巴舒尔; O·巴图尔维奇; N·基拉武兹; K·黑格; M·伯吉斯; K·吴; R·A·赛尔门
Original assignee: Juno Therapeutics Inc
Current assignee: Juno Therapeutics Inc
Priority date: 2020-02-12
Filing date: 2021-02-11
Publication date: 2022-11-18
Also published as: EP4103203A1; JP2023519099A; US20230087953A1; KR20220152227A; IL295381A; WO2021163389A1; CA3170153A1; AU2021219764A1; BR112022015968A2; MX2022009830A

Abstract

在一些方面，提供了用于治疗患有诸如多发性骨髓瘤(MM)等疾病和病症的受试者的细胞组合物，以及相关方法、组合物、用途和制品。在一些实施方案中，所述疾病或病症是复发性或难治性多发性骨髓瘤(r/r MM)。所述细胞通常表达重组受体，诸如靶向在骨髓瘤细胞上的抗原诸如BCMA的嵌合抗原受体(CAR)。

Description

针对BCMA的嵌合抗原受体T细胞组合物及其方法和用途

相关申请的交叉引用

本申请要求2020年2月12日提交的标题为“针对BCMA的嵌合抗原受体T细胞组合物及其方法和用途(BCMA-DIRECTED CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR T CELL COMPOSITIONSAND METHODS AND USES THEREOF)”的美国临时申请号62/975,731的优先权，将其内容通过引用以其整体并入。

通过引用并入序列表

本申请是与电子格式的序列表一起提交的。序列表以2021年2月10日创建、大小为184千字节的名为735042023540SEQLIST.txt的文件提供。将在电子格式的序列表中的信息通过引用以其整体并入。

技术领域

本公开文本在一些方面涉及过继细胞疗法，所述过继细胞疗法涉及施用细胞组合物以用于治疗患有诸如多发性骨髓瘤(MM)等疾病和病症的受试者；以及相关方法、组合物、用途和制品。

背景技术

多种免疫疗法和/或细胞疗法可用于治疗疾病和病症。例如，过继细胞疗法(包括涉及施用表达对目的疾病或障碍所特有的嵌合受体(诸如嵌合抗原受体(CAR))和/或其他重组抗原受体的细胞的那些过继细胞疗法，以及其他过继免疫细胞和过继T细胞疗法)在癌症或者其他疾病或障碍的治疗中可能是有益的。对改进的方法存在需求。提供了满足此类需求的方法、用途和制品。

发明内容

在一个方面，本文提供了一种治疗多发性骨髓瘤(MM)的方法，所述方法包括向患有或怀疑患有MM的受试者施用组合物，所述组合物包含表达靶向B细胞成熟抗原(BCMA)的嵌合抗原受体(CAR)的工程化T细胞，其中：所述组合物包含表达所述CAR的CD4⁺T细胞和表达所述CAR的CD8⁺T细胞；所述组合物包含在为或约5×10⁶个CAR表达T细胞与为或约200×10⁶个之间的CAR表达T细胞，包含端值；并且所述组合物中至少或至少约80％的细胞是CD3⁺细胞。

在一个方面，本文提供了一种治疗多发性骨髓瘤(MM)的方法，所述方法包括向患有或怀疑患有MM的受试者施用组合物，所述组合物包含表达靶向B细胞成熟抗原(BCMA)的嵌合抗原受体(CAR)的工程化T细胞，其中：所述组合物包含在约1:2.5与约5:1之间的比率的表达所述CAR的CD4⁺T细胞和表达所述CAR的CD8⁺T细胞；所述组合物包含在为或约5×10⁶个CAR表达T细胞与为或约200×10⁶个之间的CAR表达T细胞，包含端值；并且所述组合物中至少或至少约90％的细胞是CD3⁺细胞。

在一个方面，本文提供了一种治疗多发性骨髓瘤(MM)的方法，所述方法包括向患有或怀疑患有MM的受试者施用组合物，所述组合物包含表达靶向B细胞成熟抗原(BCMA)的嵌合抗原受体(CAR)的工程化T细胞，其中：所述组合物包含表达所述CAR的CD8⁺T细胞和表达所述CAR的CD4⁺T细胞；所述组合物包含在为或约5×10⁶个CAR表达T细胞与为或约200×10⁶个之间的CAR表达T细胞，包含端值；所述组合物中至少或至少约80％的细胞是CD3⁺细胞；并且所述组合物中至少或至少约80％的CAR⁺T细胞具有幼稚样或中枢记忆表型。

在一个方面，本文提供了一种治疗多发性骨髓瘤(MM)的方法，所述方法包括向患有或怀疑患有MM的受试者施用组合物，所述组合物包含表达靶向B细胞成熟抗原(BCMA)的嵌合抗原受体(CAR)的工程化T细胞，其中：所述组合物包含表达所述CAR的CD8⁺T细胞和表达所述CAR的CD4⁺T细胞；所述组合物包含在为或约5×10⁶个CAR表达T细胞与为或约200×10⁶个之间的CAR表达T细胞，包含端值；所述组合物中至少或至少约80％的细胞是CD3⁺细胞；并且所述组合物中至少或至少约50％的CD4⁺CAR⁺T细胞为CD27⁺CCR7⁺的和/或所述组合物中至少或至少约50％的CD8⁺CAR⁺T细胞为CD27⁺CCR7⁺的。

在一个方面，本文提供了一种治疗多发性骨髓瘤(MM)的方法，所述方法包括向患有或怀疑患有MM的受试者施用组合物，所述组合物包含表达靶向B细胞成熟抗原(BCMA)的嵌合抗原受体(CAR)的工程化T细胞，其中：所述组合物包含表达所述CAR的CD8⁺T细胞和表达所述CAR的CD4⁺T细胞；所述组合物包含在为或约5×10⁶个CAR表达T细胞与为或约200×10⁶个之间的CAR表达T细胞，包含端值；所述组合物中至少或至少约80％的细胞是CD3⁺细胞；并且所述组合物中的所述CAR⁺T细胞中的整合载体拷贝数(iVCN)与总VCN的分数平均小于或小于约0.9。

在一个方面，本文提供了一种治疗多发性骨髓瘤(MM)的方法，所述方法包括向患有或怀疑患有MM的受试者施用组合物，所述组合物包含表达靶向B细胞成熟抗原(BCMA)的嵌合抗原受体(CAR)的工程化T细胞，其中：所述组合物包含表达所述CAR的CD8⁺T细胞和表达所述CAR的CD4⁺T细胞；所述组合物包含在为或约5×10⁶个CAR表达T细胞与为或约200×10⁶个之间的CAR表达T细胞，包含端值；所述组合物中至少或至少约80％的细胞是CD3⁺细胞；并且所述组合物中的所述CAR⁺T细胞的整合载体拷贝数(iVCN)平均在或在约每个二倍体基因组0.4个拷贝与每个二倍体基因组2.0个拷贝之间，包含端值。

在一些任何实施方案中，所述组合物包含在为或约50×10⁶个CAR表达T细胞与为或约200×10⁶个之间的CAR表达T细胞，包含端值。在一些任何实施方案中，所述组合物包含在为或约70×10⁶个CAR表达T细胞与为或约200×10⁶个之间的CAR表达T细胞，包含端值。在一些任何实施方案中，所述组合物包含在为或约80×10⁶个CAR表达T细胞与为或约200×10⁶个之间的CAR表达T细胞，包含端值。在一些任何实施方案中，所述组合物包含在为或约80×10⁶个CAR表达T细胞与为或约160×10⁶个之间的CAR表达T细胞，包含端值。

在一个方面，本文提供了一种治疗多发性骨髓瘤(MM)的方法，所述方法包括向患有或怀疑患有MM的受试者施用组合物，所述组合物包含表达靶向B细胞成熟抗原(BCMA)的嵌合抗原受体(CAR)的工程化T细胞，其中所述组合物包含表达所述CAR的CD4⁺T细胞和表达所述CAR的CD8⁺T细胞；所述组合物包含在为或约5×10⁶个CAR表达T细胞与为或约40×10⁶个之间的CAR表达T细胞，包含端值；并且所述组合物中至少或至少约80％的细胞是CD3⁺细胞。

在一个方面，本文提供了一种治疗多发性骨髓瘤(MM)的方法，所述方法包括向患有或怀疑患有MM的受试者施用组合物，所述组合物包含表达靶向B细胞成熟抗原(BCMA)的嵌合抗原受体(CAR)的工程化T细胞，其中：所述组合物包含在约1:2.5与约5:1之间的比率的表达所述CAR的CD4⁺T细胞和表达所述CAR的CD8⁺T细胞；所述组合物包含在为或约5×10⁶个CAR表达T细胞与为或约80×10⁶个之间的CAR表达T细胞，包含端值；所述组合物中至少或至少约90％的细胞是CD3⁺细胞。

在一个方面，本文提供了一种治疗多发性骨髓瘤(MM)的方法，所述方法包括向患有或怀疑患有MM的受试者施用组合物，所述组合物包含表达靶向B细胞成熟抗原(BCMA)的嵌合抗原受体(CAR)的工程化T细胞，其中所述组合物包含表达所述CAR的CD4⁺T细胞和表达所述CAR的CD8⁺T细胞；所述组合物包含在为或约5×10⁶个CAR表达T细胞与为或约10×10⁶个之间的CAR表达T细胞，包含端值；并且所述组合物中至少或至少约80％的细胞是CD3⁺细胞。

在一个方面，本文提供了一种治疗多发性骨髓瘤(MM)的方法，所述方法包括向患有或怀疑患有MM的受试者施用组合物，所述组合物包含表达靶向B细胞成熟抗原(BCMA)的嵌合抗原受体(CAR)的工程化T细胞，其中：所述组合物包含表达所述CAR的CD8⁺T细胞和表达所述CAR的CD4⁺T细胞；所述组合物包含在为或约5×10⁶个CAR表达T细胞与为或约80×10⁶个之间的CAR表达T细胞，包含端值；所述组合物中至少或至少约80％的细胞是CD3⁺细胞；并且所述组合物中至少或至少约80％的CAR⁺T细胞具有幼稚样或中枢记忆表型。

在一个方面，本文提供了一种治疗多发性骨髓瘤(MM)的方法，所述方法包括向患有或怀疑患有MM的受试者施用组合物，所述组合物包含表达靶向B细胞成熟抗原(BCMA)的嵌合抗原受体(CAR)的工程化T细胞，其中：所述组合物包含表达所述CAR的CD8⁺T细胞和表达所述CAR的CD4⁺T细胞；所述组合物包含在为或约5×10⁶个CAR表达T细胞与为或约100×10⁶个之间的CAR表达T细胞，包含端值；所述组合物中至少或至少约80％的细胞是CD3⁺细胞；并且所述组合物中至少或至少约50％的CD4⁺CAR⁺T细胞为CD27⁺CCR7⁺的和/或所述组合物中至少或至少约50％的CD8⁺CAR⁺T细胞为CD27⁺CCR7⁺的。

在一个方面，本文提供了一种治疗多发性骨髓瘤(MM)的方法，所述方法包括向患有或怀疑患有MM的受试者施用组合物，所述组合物包含表达靶向B细胞成熟抗原(BCMA)的嵌合抗原受体(CAR)的工程化T细胞，其中：所述组合物包含表达所述CAR的CD8⁺T细胞和表达所述CAR的CD4⁺T细胞；所述组合物包含在为或约5×10⁶个CAR表达T细胞与为或约20×10⁶个之间的CAR表达T细胞，包含端值；所述组合物中至少或至少约80％的细胞是CD3⁺细胞；并且所述组合物中至少或至少约80％的CAR⁺T细胞具有幼稚样或中枢记忆表型。

在一个方面，本文提供了一种治疗多发性骨髓瘤(MM)的方法，所述方法包括向患有或怀疑患有MM的受试者施用组合物，所述组合物包含表达靶向B细胞成熟抗原(BCMA)的嵌合抗原受体(CAR)的工程化T细胞，其中所述组合物包含表达所述CAR的CD8⁺T细胞和表达所述CAR的CD4⁺T细胞；所述组合物包含在为或约5×10⁶个CAR表达T细胞与为或约80×10⁶个之间的CAR表达T细胞，包含端值；所述组合物中至少或至少约80％的细胞是CD3⁺细胞；并且所述组合物中的所述CAR⁺T细胞中的整合载体拷贝数(iVCN)与总VCN的分数平均小于或小于约0.9。

在一个方面，本文提供了一种治疗多发性骨髓瘤(MM)的方法，所述方法包括向患有或怀疑患有MM的受试者施用组合物，所述组合物包含表达靶向B细胞成熟抗原(BCMA)的嵌合抗原受体(CAR)的工程化T细胞，其中所述组合物包含表达所述CAR的CD8⁺T细胞和表达所述CAR的CD4⁺T细胞；所述组合物包含在为或约5×10⁶个CAR表达T细胞与为或约80×10⁶个之间的CAR表达T细胞，包含端值；所述组合物中至少或至少约80％的细胞是CD3⁺细胞；并且所述组合物中的所述CAR⁺T细胞的整合载体拷贝数(iVCN)平均在或在约每个二倍体基因组0.4个拷贝与每个二倍体基因组2.0个拷贝之间，包含端值。

在一些任何实施方案中，所述组合物包含在约1:2.5与约5:1之间的比率的表达所述CAR的CD4⁺T细胞和表达所述CAR的CD8⁺T细胞；在一些任何实施方案中，所述组合物包含在为或约5×10⁶个CAR表达T细胞与为或约80×10⁶个之间的CAR表达T细胞，包含端值。在一些任何实施方案中，所述组合物包含在为或约5×10⁶个CAR表达T细胞与为或约40×10⁶个之间的CAR表达T细胞，包含端值。在一些任何实施方案中，所述组合物包含在为或约5×10⁶个CAR表达T细胞与为或约20×10⁶个之间的CAR表达T细胞，包含端值。

在一些任何实施方案中，所述组合物可以包含在约1:2与约4:1之间、在约1:1.5与约2:1之间或为或为约1:1的比率的表达所述CAR的CD4⁺T细胞和表达所述CAR的CD8⁺T细胞。在一些任何实施方案中，所述组合物可以包含在约5:1与约2:1之间、在约4:1与约2:1之间、在约3:1与约2:1之间、为或为约5:1、为或为约4:1、为或为约3:1或为或为约2:1的比率的表达所述CAR的CD4⁺T细胞和表达所述CAR的CD8⁺T细胞。在一些任何实施方案中，所述组合物可以包含在为或约5×10⁶个CAR表达T细胞与为或约10×10⁶个之间的CAR表达T细胞，包含端值。在一些任何实施方案中，所述组合物可以包含在为或约10×10⁶个CAR表达T细胞与为或约20×10⁶个之间的CAR表达T细胞，包含端值。在一些任何实施方案中，所述组合物可以包含为或约20×10⁶个CAR表达T细胞。在一些任何实施方案中，所述组合物可以包含为或约30×10⁶个CAR表达T细胞。在一些任何实施方案中，所述组合物可以包含为或约40×10⁶个CAR表达T细胞。在一些任何实施方案中，所述组合物可以包含为或约10×10⁶CAR表达T细胞。在一些任何实施方案中，所述组合物可以包含为或约60×10⁶个CAR表达T细胞。在一些任何实施方案中，所述组合物可以包含为或约80×10⁶个CAR表达T细胞。在一些任何实施方案中，所述组合物可以包含为或约160×10⁶个CAR表达T细胞。

在一些任何实施方案中，所述组合物中至少或至少约90％的细胞是CD3⁺细胞。

在一些任何实施方案中，所述组合物中至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、或至少或至少约96％的细胞是CD3⁺细胞。在一些任何实施方案中，所述组合物中在为或约2％与为或约30％之间的CAR⁺T细胞表达凋亡标记，任选地膜联蛋白V或活性半胱天冬酶3。在一些任何实施方案中，所述组合物中在为或约5％与为或约10％之间的CAR⁺T细胞表达凋亡标记，任选地膜联蛋白V或活性半胱天冬酶3。在一些任何实施方案中，所述组合物中在为或约10％与为或约15％之间的CAR⁺T细胞表达凋亡标记，任选地膜联蛋白V或活性半胱天冬酶3。在一些任何实施方案中，所述组合物中在为或约15％与为或约20％之间的CAR⁺T细胞表达凋亡标记，任选地膜联蛋白V或活性半胱天冬酶3。在一些任何实施方案中，所述组合物中在为或约20％与为或约30％之间的CAR⁺T细胞表达凋亡标记，任选地膜联蛋白V或活性半胱天冬酶3。在一些任何实施方案中，所述组合物中为或约5％、为或约10％、为或约15％、为或约20％、为或约25％、或为或约30％的CAR⁺T细胞表达凋亡标记，任选地膜联蛋白V或活性半胱天冬酶3。在一些实施方案中，所述凋亡标记是膜联蛋白V。在一些实施方案中，所述凋亡标记是活性半胱天冬酶3。

在一些任何实施方案中，所述组合物中至少或至少约80％的CAR⁺T细胞具有幼稚样或中枢记忆表型。

在一些任何实施方案中，所述组合物中在为或约80％与为或约85％之间的CAR⁺T细胞具有幼稚样或中枢记忆表型。在一些任何实施方案中，所述组合物中在为或约85％与为或约90％之间的CAR⁺T细胞具有幼稚样或中枢记忆表型。在一些任何实施方案中，所述组合物中在为或约90％与为或约95％之间的CAR⁺T细胞具有幼稚样或中枢记忆表型。在一些任何实施方案中，所述组合物中在为或约95％与为或约99％之间的CAR⁺T细胞具有幼稚样或中枢记忆表型。在一些任何实施方案中，所述组合物中为或约85％、为或约90％、为或约95％、或为或约99％的CAR⁺T细胞具有幼稚样或中枢记忆表型。

在一些任何实施方案中，所述组合物中具有幼稚样或中枢记忆表型的至少或至少约80％的CAR⁺T细胞对在幼稚样或中枢记忆T细胞上表达的标记呈表面阳性。在一些任何实施方案中，在幼稚样或中枢记忆T细胞上表达的标记选自CD45RA、CD27、CD28和CCR7。

在一些任何实施方案中，所述组合物中具有幼稚样或中枢记忆表型的至少或至少约80％的CAR⁺T细胞具有选自CCR7⁺CD45RA⁺、CD27⁺CCR7⁺或CD62L^-CCR7⁺的表型。在一些任何实施方案中，所述组合物中在为或约80％与为或约85％之间、在为或约85％与为或约90％之间、在为或约90％与为或约95％之间、在为或约95％与为或约99％之间的CAR⁺T细胞具有选自CCR7⁺CD45RA⁺、CD27⁺CCR7⁺或CD62L^-CCR7⁺的幼稚样或中枢记忆表型。在一些任何实施方案中，所述组合物中为或约80％、为或约85％、为或约90％、为或约95％、或为或约99％的CAR⁺T细胞具有选自CCR7⁺CD45RA⁺、CD27⁺CCR7⁺或CD62L^-CCR7⁺的幼稚样或中枢记忆表型。在一些任何实施方案中，所述组合物中为或约80％、为或约85％、为或约90％、为或约95％、或为或约99％的CAR⁺T细胞具有为CD27⁺CCR7⁺的幼稚样或中枢记忆表型。

在一些任何实施方案中，所述组合物中至少或至少约50％的CD4⁺CAR⁺T细胞具有为CCR7⁺CD45RA⁺或CCR7⁺CD45RA^-的幼稚样或中枢记忆表型。在一些任何实施方案中，所述组合物中至少或至少约60％的CD4⁺CAR⁺T细胞具有为CCR7⁺CD45RA⁺或CCR7⁺CD45RA^-的幼稚样或中枢记忆表型。在一些任何实施方案中，所述组合物中至少或至少约70％的CD4⁺CAR⁺T细胞具有为CCR7⁺CD45RA⁺或CCR7⁺CD45RA^-的幼稚样或中枢记忆表型。在一些任何实施方案中，所述组合物中至少或至少约80％的CD4⁺CAR⁺T细胞具有为CCR7⁺CD45RA⁺或CCR7⁺CD45RA^-的幼稚样或中枢记忆表型。在一些任何实施方案中，所述组合物中至少或至少约85％的CD4⁺CAR⁺T细胞具有为CCR7⁺CD45RA⁺或CCR7⁺CD45RA^-的幼稚样或中枢记忆表型。

在一些任何实施方案中，所述组合物中至少或至少约50％的CD4⁺CAR⁺T细胞具有为CD27⁺CCR7⁺的幼稚样或中枢记忆表型。在一些任何实施方案中，所述组合物中至少或至少约60％的CD4⁺CAR⁺T细胞具有为CD27⁺CCR7⁺的幼稚样或中枢记忆表型。在一些任何实施方案中，所述组合物中至少或至少约70％的CD4⁺CAR⁺T细胞具有为CD27⁺CCR7⁺的幼稚样或中枢记忆表型。在一些任何实施方案中，所述组合物中至少或至少约80％的CD4⁺CAR⁺T细胞具有为CD27⁺CCR7⁺的幼稚样或中枢记忆表型。在一些任何实施方案中，所述组合物中至少或至少约85％的CD4⁺CAR⁺T细胞具有为CD27⁺CCR7⁺的幼稚样或中枢记忆表型。

在一些任何实施方案中，所述组合物中至少或至少约50％的CD8⁺CAR⁺T细胞具有为CCR7⁺CD45RA⁺或CCR7⁺CD45RA^-的幼稚样或中枢记忆表型。在一些任何实施方案中，所述组合物中至少或至少约60％的CD8⁺CAR⁺T细胞具有为CCR7⁺CD45RA⁺或CCR7⁺CD45RA^-的幼稚样或中枢记忆表型。在一些任何实施方案中，所述组合物中至少或至少约70％的CD8⁺CAR⁺T细胞具有为CCR7⁺CD45RA⁺或CCR7⁺CD45RA^-的幼稚样或中枢记忆表型。在一些任何实施方案中，所述组合物中至少或至少约80％的CD8⁺CAR⁺T细胞具有为CCR7⁺CD45RA⁺或CCR7⁺CD45RA^-的幼稚样或中枢记忆表型。在一些任何实施方案中，所述组合物中至少或至少约85％的CD8⁺CAR⁺T细胞具有为CCR7⁺CD45RA⁺或CCR7⁺CD45RA^-的幼稚样或中枢记忆表型。

在一些任何实施方案中，所述组合物中至少或至少约50％的CD8⁺CAR⁺T细胞具有为CD27⁺CCR7⁺的幼稚样或中枢记忆表型。在一些任何实施方案中，所述组合物中至少或至少约60％的CD8⁺CAR⁺T细胞具有为CD27⁺CCR7⁺的幼稚样或中枢记忆表型。在一些任何实施方案中，所述组合物中至少或至少约70％的CD8⁺CAR⁺T细胞具有为CD27⁺CCR7⁺的幼稚样或中枢记忆表型。在一些任何实施方案中，所述组合物中至少或至少约80％的CD8⁺CAR⁺T细胞具有为CD27⁺CCR7⁺的幼稚样或中枢记忆表型。在一些任何实施方案中，所述组合物中至少或至少约85％的CD8⁺CAR⁺T细胞具有为CD27⁺CCR7⁺的幼稚样或中枢记忆表型。

在一些任何实施方案中，所述组合物中至少或至少约80％的CAR⁺T细胞对在幼稚样或中枢记忆T细胞上表达的标记呈表面阳性。在一些任何实施方案中，在幼稚样或中枢记忆T细胞上表达的标记选自CD45RA、CD27、CD28和CCR7。在一些任何实施方案中，所述组合物中至少或至少约80％的CAR⁺T细胞为CCR7⁺CD45RA⁺、CD27⁺CCR7⁺和/或CD62L^-CCR7⁺的。在一些任何实施方案中，所述组合物中在为或约80％与为或约85％之间、在为或约85％与为或约90％之间、在为或约90％与为或约95％之间、在为或约95％与为或约99％之间的CAR⁺T细胞为CCR7⁺CD45RA⁺、CD27⁺CCR7⁺和/或CD62L^-CCR7⁺的。在一些任何实施方案中，所述组合物中为或约80％、为或约85％、为或约90％、为或约95％、或为或约99％的CAR⁺T细胞为CCR7⁺CD45RA⁺、CD27⁺CCR7⁺和/或CD62L^-CCR7⁺的。在一些任何实施方案中，所述组合物中为或约80％、为或约85％、为或约90％、为或约95％、或为或约99％的CAR⁺T细胞为CD27⁺CCR7⁺的。在一些任何实施方案中，所述组合物中至少或至少约50％的CD4⁺CAR⁺T细胞为CCR7⁺CD45RA⁺或CCR7⁺CD45RA^-的。在一些任何实施方案中，所述组合物中至少或至少约60％的CD4⁺CAR⁺T细胞为CCR7⁺CD45RA⁺或CCR7⁺CD45RA^-的。

在一些任何实施方案中，所述组合物中至少或至少约70％的CD4⁺CAR⁺T细胞为CCR7⁺CD45RA⁺或CCR7⁺CD45RA^-的。在一些任何实施方案中，所述组合物中至少或至少约80％的CD4⁺CAR⁺T细胞为CCR7⁺CD45RA⁺或CCR7⁺CD45RA^-的。在一些任何实施方案中，所述组合物中至少或至少约85％的CD4⁺CAR⁺T细胞为CCR7⁺CD45RA⁺或CCR7⁺CD45RA^-的。在一些任何实施方案中，所述组合物中至少或至少约50％的CD4⁺CAR⁺T细胞为CD27⁺CCR7⁺的。在一些任何实施方案中，所述组合物中至少或至少约60％的CD4⁺CAR⁺T细胞为CD27⁺CCR7⁺的。在一些任何实施方案中，所述组合物中至少或至少约70％的CD4⁺CAR⁺T细胞为CD27⁺CCR7⁺的。在一些任何实施方案中，所述组合物中至少或至少约80％的CD4⁺CAR⁺T细胞为CD27⁺CCR7⁺的。在一些任何实施方案中，所述组合物中至少或至少约85％的CD4⁺CAR⁺T细胞为CD27⁺CCR7⁺的。在一些任何实施方案中，所述组合物中至少或至少约50％的CD8⁺CAR⁺T细胞为CCR7⁺CD45RA⁺或CCR7⁺CD45RA^-的。在一些任何实施方案中，所述组合物中至少或至少约60％的CD8⁺CAR⁺T细胞为CCR7⁺CD45RA⁺或CCR7⁺CD45RA^-的。在一些任何实施方案中，所述组合物中至少或至少约70％的CD8⁺CAR⁺T细胞为CCR7⁺CD45RA⁺或CCR7⁺CD45RA^-的。在一些任何实施方案中，所述组合物中至少或至少约80％的CD8⁺CAR⁺T细胞为CCR7⁺CD45RA⁺或CCR7⁺CD45RA^-的。在一些任何实施方案中，所述组合物中至少或至少约85％的CD8⁺CAR⁺T细胞为CCR7⁺CD45RA⁺或CCR7⁺CD45RA^-的。在一些任何实施方案中，所述组合物中至少或至少约50％的CD8⁺CAR⁺T细胞为CD27⁺CCR7⁺的。在一些任何实施方案中，所述组合物中至少或至少约60％的CD8⁺CAR⁺T细胞为CD27⁺CCR7⁺的。

在一些任何实施方案中，所述组合物中至少或至少约70％的CD8⁺CAR⁺T细胞为CD27⁺CCR7⁺的。在一些任何实施方案中，所述组合物中至少或至少约80％的CD8⁺CAR⁺T细胞为CD27⁺CCR7⁺的。在一些任何实施方案中，所述组合物中至少或至少约85％的CD8⁺CAR⁺T细胞为CD27⁺CCR7⁺的。

在一些任何实施方案中，所述组合物中的所述CAR⁺T细胞中的整合载体拷贝数(iVCN)与总VCN的分数平均小于或小于约0.9。

在一些任何实施方案中，所述组合物中的所述CAR⁺T细胞中的整合载体拷贝数(iVCN)与总VCN的分数平均在为或约0.9与为或约0.8之间。在一些任何实施方案中，所述组合物中的所述CAR⁺T细胞中的整合载体拷贝数(iVCN)与总VCN的分数平均小于或小于约0.8。在一些任何实施方案中，所述组合物中的所述CAR⁺T细胞中的整合载体拷贝数(iVCN)与总VCN的分数平均在为或约0.8与为或约0.7之间。在一些任何实施方案中，所述组合物中的所述CAR⁺T细胞中的整合载体拷贝数(iVCN)与总VCN的分数平均在为或约0.7与为或约0.6之间。在一些任何实施方案中，所述组合物中的所述CAR⁺T细胞中的整合载体拷贝数(iVCN)与总VCN的分数平均在为或约0.6与为或约0.5之间。在一些任何实施方案中，所述组合物中的所述CAR⁺T细胞中的整合载体拷贝数(iVCN)与总VCN的分数平均在为或约0.5与为或约0.4之间。

在一些任何实施方案中，所述组合物中的所述CAR⁺T细胞的整合载体拷贝数(iVCN)平均在或在约每个二倍体基因组0.4个拷贝与每个二倍体基因组2.0个拷贝之间，包含端值。

在一些任何实施方案中，所述组合物中的所述CAR⁺T细胞的整合载体拷贝数(iVCN)平均在或在约每个二倍体基因组0.8个拷贝与每个二倍体基因组2.0个拷贝之间，包含端值。在一些任何实施方案中，所述组合物中的所述CAR⁺T细胞的整合载体拷贝数(iVCN)平均在或在约每个二倍体基因组0.8个拷贝与每个二倍体基因组1.0个拷贝之间，包含端值。在一些任何实施方案中，所述组合物中的所述CAR⁺T细胞的整合载体拷贝数(iVCN)平均在或在约每个二倍体基因组1.0个拷贝与每个二倍体基因组1.5个拷贝之间，包含端值。在一些任何实施方案中，所述组合物中的所述CAR⁺T细胞的整合载体拷贝数(iVCN)平均在或在约每个二倍体基因组1.5个拷贝与每个二倍体基因组2.0个拷贝之间，包含端值。

在一些任何实施方案中，在施用工程化T细胞组合物时或之前，受试者已接受过至少3种先前抗骨髓瘤治疗方案。在一些任何实施方案中，在施用工程化T细胞组合物时或之前，受试者已接受过选自自体干细胞移植(ASCT)、免疫调节剂、蛋白酶体抑制剂和抗CD38剂中的三种或更多种疗法，任选地四种或更多种先前疗法，除非受试者不是一种或多种所述疗法的候选者或对其有禁忌。在一些任何实施方案中，在施用工程化T细胞组合物时或之前，受试者已接受过任选地选自自体干细胞移植(ASCT)、单独的或组合的免疫调节剂和蛋白酶体抑制剂、以及抗CD38剂中的三种或更多种疗法，任选地四种或更多种先前疗法。在一些任何实施方案中，在施用工程化T细胞组合物时或之前，受试者已接受过所有三种以下疗法，包括自体干细胞移植(ASCT)、包含免疫调节剂和蛋白酶体抑制剂的方案以及抗CD38剂。

在一些任何实施方案中，在施用包含工程化T细胞的组合物时或之前，受试者已接受过所有三种以下抗骨髓瘤治疗方案：自体干细胞移植(ASCT)、单独的或组合的免疫调节剂和/或蛋白酶体抑制剂以及抗CD38剂。在一些任何实施方案中，有或没有骨髓移植以及有或没有维持疗法的诱导被认为是一种方案，目的是确定先前抗骨髓瘤治疗方案的数目。

在一些任何实施方案中，在施用包含工程化T细胞的组合物时或之前，受试者对最后一种抗骨髓瘤治疗方案是难治的。在一些任何实施方案中，难治性骨髓瘤被定义为在用最后一种抗骨髓瘤治疗方案治疗期间或从最后一个剂量起测量的在完成最后一种抗骨髓瘤治疗方案的治疗的12个月内有记录在案的疾病进展。在一些任何实施方案中，难治性骨髓瘤被定义为在用最后一种抗骨髓瘤治疗方案治疗期间或从最后一个剂量起测量的在完成最后一种抗骨髓瘤治疗方案的治疗60天内有记录在案的疾病进展。

在一些任何实施方案中，所述免疫调节剂选自单独或组合的沙利度胺、来那度胺和泊马度胺。在一些任何实施方案中，所述蛋白酶体抑制剂选自单独或组合的硼替佐米、卡非佐米和伊沙佐米。

在一些任何实施方案中，所述受试者已经历过至少一个完整周期的抗骨髓瘤治疗方案治疗，除非疾病进展是对所述抗骨髓瘤治疗方案的最佳反应，所述抗骨髓瘤治疗方案包含免疫调节剂和/或蛋白酶体抑制剂。在一些任何实施方案中，所述受试者已经历过至少连续两个周期的抗骨髓瘤治疗方案治疗，除非疾病进展是对所述抗骨髓瘤治疗方案的最佳反应，所述抗骨髓瘤治疗方案包含免疫调节剂和/或蛋白酶体抑制剂。

在一些任何实施方案中，抗CD38剂是抗CD38抗体。在一些任何实施方案中，抗CD38剂是或包含达雷木单抗。在一些任何实施方案中，抗CD38剂被用作组合方案的一部分或用作单一疗法。

在一些任何实施方案中，在施用包含工程化T细胞的组合物时，受试者没有活动性浆细胞白血病(PCL)或没有PCL病史。在一些任何实施方案中，在施用时，受试者在至少3种或至少4种先前抗骨髓瘤治疗方案后已经复发或是难治的。在一些任何实施方案中，在施用时，受试者从诊断多发性骨髓瘤起有大约4年或在2年与15年之间或在2年与12年之间的时间。在一些任何实施方案中，在施用时，受试者已接受过约10种或在3种与15种之间或在4种与15种之间的先前抗骨髓瘤治疗方案。在一些任何实施方案中，在施用时，受试者已经对硼替佐米、卡非佐米、来那度胺、泊马度胺和/或抗CD38单克隆抗体是难治的或无反应。在一些任何实施方案中，在施用时，受试者已接受过先前自体干细胞移植。在一些任何实施方案中，在施用时，受试者没有接受过先前自体干细胞移植(ASCT)，因为其没资格进行ASCT，任选地因为年龄或其他记录在案的原因而没资格。在一些任何实施方案中，在施用时，受试者具有IMWG高风险细胞遗传学。在一些任何实施方案中，受试者没有MM的中枢神经系统受累、浆细胞白血病、华氏巨球蛋白血症(Waldenstrom’s macroglobulinemia)、POEMS(多神经病、器官巨大症、内分泌病、单克隆蛋白质、皮肤变化)综合征和/或临床意义的淀粉样变性。在一些任何实施方案中，受试者尚未接受过先前的CAR T细胞或遗传修饰的T细胞疗法。在一些任何实施方案中，受试者尚未接受过靶向BCMA的先前疗法，诸如抗BCMA单克隆抗体或双特异性抗体。

在一些任何实施方案中，所述方法还包括从受试者中获得用于制造包含工程化T细胞的组合物的白细胞单采术样品。

在一些任何实施方案中，受试者尚未接受过治疗剂量的皮质类固醇，任选地在白细胞单采术之前的为或约14天内。在一些任何实施方案中，受试者在白细胞单采术的4周内尚未接受过免疫抑制疗法，任选地其中所述免疫抑制疗法包括钙神经素抑制剂、甲氨蝶呤或其他化学治疗剂、麦考酚酯、雷帕霉素、免疫抑制抗体(诸如抗TNF、抗IL6或抗IL6R)。在一些任何实施方案中，受试者在白细胞单采术之前的为或约6个月内尚未接受过自体干细胞移植。

在一些任何实施方案中，受试者尚未响应于先前疗法实现完全缓解(CR)。在一些任何实施方案中，受试者尚未实现对先前疗法的客观反应(部分反应(PR)或更好)。在一些任何实施方案中，受试者被鉴定为或已经被鉴定为东部肿瘤协作组体能状态(ECOG PS)为0或1。

在一些任何实施方案中，CAR可以包含细胞外抗原结合结构域，所述细胞外抗原结合结构域包括包含在SEQ ID NO:116所示的序列中所含的重链互补决定区1(CDR-H1)、重链互补决定区2(CDR-H2)和重链互补决定区3(CDR-H3)的可变重链(V_H)以及包含在SEQ IDNO:119所示的序列中所含的轻链互补决定区1(CDR-L1)、轻链互补决定区2(CDR-L2)和轻链互补决定区3(CDR-L3)的可变轻链(V_L)；包含分别如SEQ ID NO:97、101和103所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的V_H以及包含分别如SEQ ID NO:105、107和108所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的V_L；包含分别如SEQ ID NO:96、100和103所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的V_H以及包含分别如SEQ ID NO:105、107和108所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的V_L；包含分别如SEQ ID NO:95、99和103所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的V_H以及包含分别如SEQ ID NO:105、107和108所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的V_L；包含分别如SEQ ID NO:94、98和102所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的V_H以及包含分别如SEQ IDNO:104、106和108所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的V_L；或包含SEQ ID NO:116的氨基酸序列的V_H和包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列的V_L；以及包含IgG4/2嵌合铰链或经修饰的IgG4铰链的间隔子；IgG2/4嵌合C_H2区；和IgG4 C_H3区，任选地其长度为约228个氨基酸；任选地其中所述间隔子如SEQ ID NO:174所示；和跨膜结构域，任选地来自人CD28的跨膜结构域；以及细胞内信号传导区，所述细胞内信号传导区包括CD3-zeta(CD3ζ)链的胞质信号传导结构域和共刺激信号传导区，所述共刺激信号传导区包含T细胞共刺激分子的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。在一些实施方案中，所述间隔子是如SEQ ID NO:174所示的间隔子。

在一些任何实施方案中，所述V_H是或可以包含SEQ ID NO:116的氨基酸序列；并且所述V_L是或包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列。在一些任何实施方案中，所述细胞外抗原结合结构域可以包含scFv。在一些任何实施方案中，所述V_H和所述V_L通过柔性接头连接。在一些任何实施方案中，所述scFv可以包含接头，所述接头包含氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:1)。在一些任何实施方案中，所述V_H位于所述V_L的羧基末端。在一些任何实施方案中，所述scFv包含含有氨基酸序列SRGGGGSGGGGSGGGGSLEMA(SEQ ID NO:255)的接头。

在一些任何实施方案中，所述细胞外抗原结合结构域可以包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列或与SEQ ID NO:114的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些任何实施方案中，所述细胞外抗原结合结构域可以包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列。

在一些任何实施方案中，编码细胞外抗原结合结构域的核酸可以包含SEQ ID NO:113的核苷酸序列；与其具有至少90％序列同一性的核苷酸序列；或任一个前述序列的简并序列。在一些任何实施方案中，编码细胞外抗原结合结构域的核酸可以包含SEQ ID NO:115的核苷酸序列。在一些任何实施方案中，所述V_H位于所述V_L的氨基末端。

在一些任何实施方案中，所述胞质信号传导结构域是或可以包含SEQ ID NO:143所示的序列或与SEQ ID NO:143具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些任何实施方案中，所述共刺激信号传导区可以包含CD28、4-1BB或ICOS的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。在一些任何实施方案中，所述共刺激信号传导区可以包含4-1BB、任选人4-1BB的细胞内信号传导结构域。在一些任何实施方案中，所述共刺激信号传导区是或可以包含SEQ ID NO:4所示的序列或与SEQ ID NO:4所示的序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些任何实施方案中，所述共刺激信号传导区位于所述跨膜结构域与所述CD3-zeta(CD3ζ)链的胞质信号传导结构域之间。

在一些任何实施方案中，所述跨膜结构域是或可以包含来自人CD28的跨膜结构域。在一些任何实施方案中，所述跨膜结构域是或可以包含SEQ ID NO:138所示的序列或与SEQ ID NO:138具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

在一些任何实施方案中，所述CAR从其N末端到C末端依次可以包含：细胞外抗原结合结构域、间隔子、跨膜结构域和细胞内信号传导区。在一些任何实施方案中，所述CAR可以包含细胞外抗原结合结构域，所述细胞外抗原结合结构域包括包含在SEQ ID NO:116所示的序列中所含的重链互补决定区1(CDR-H1)、重链互补决定区2(CDR-H2)和重链互补决定区3(CDR-H3)的可变重链(V_H)以及包含在SEQ ID NO:119所示的序列中所含的轻链互补决定区1(CDR-L1)、轻链互补决定区2(CDR-L2)和轻链互补决定区3(CDR-L3)的可变轻链(V_L)；包括经修饰的IgG4铰链的间隔子；IgG2/4嵌合C_H2区；和IgG4 C_H3区，其长度为约228个氨基酸；来自人CD28的跨膜结构域；以及细胞内信号传导区，所述细胞内信号传导区包括CD3-zeta(CD3ζ)链的胞质信号传导结构域和包含4-1BB的细胞内信号传导结构域的共刺激信号传导区。

在一些任何实施方案中，所述CAR可以包含细胞外抗原结合结构域，所述细胞外抗原结合结构域包含SEQ ID NO:114所示的序列或与SEQ ID NO:114的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；间隔子，所述间隔子包含SEQ ID NO:174所示的序列或与SEQ ID NO:174具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；跨膜结构域，所述跨膜结构域包含SEQ ID NO:138所示的序列或与SEQ ID NO:138具有至少90％序列同一性的序列；以及细胞内信号传导区，所述细胞内信号传导区包括包含SEQ ID NO:143所示的序列或与SEQ IDNO:143具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的胞质信号传导结构域以及包含SEQ IDNO:4所示的序列或与SEQ ID NO:4所示的序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的共刺激信号传导区。

在一些任何实施方案中，所述CAR可以包含细胞外抗原结合结构域，所述细胞外抗原结合结构域包含SEQ ID NO:114所示的序列；间隔子，所述间隔子包含SEQ ID NO:174所示的序列；跨膜结构域，所述跨膜结构域包含SEQ ID NO:138所示的序列；以及细胞内信号传导区，所述细胞内信号传导区包含含有SEQ ID NO:143所示的序列的胞质信号传导结构域和含有SEQ ID NO:4所示的序列的共刺激信号传导区。在一些任何实施方案中，所述CAR可以包含SEQ ID NO:114所示的细胞外抗原结合结构域；SEQ ID NO:174所示的间隔子；SEQID NO:138所示的跨膜结构域；以及细胞内信号传导区，所述细胞内信号传导区包含SEQ IDNO:143所示的胞质信号传导和SEQ ID NO:4所示的共刺激信号传导区。在一些任何实施方案中，所述CAR可以包含SEQ ID NO:19所示的序列。在一些任何实施方案中，所述CAR的序列如SEQ ID NO:19所示。

在一些任何实施方案中，在人细胞(任选地人T细胞)中表达编码所述CAR的多核苷酸后，从所述多核苷酸转录的RNA(任选地信使RNA(mRNA))展现出至少70％、75％、80％、85％、90％或95％的RNA同质性。在一些任何实施方案中，所述CAR由以下多核苷酸序列编码，所述多核苷酸序列包含SEQ ID NO:13所示的序列或与其展现出至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。在一些任何实施方案中，所述CAR由包含SEQ ID NO:13所示的序列的多核苷酸序列编码。

在一些任何实施方案中，在存在可溶性或脱落形式的BCMA的情况下，在暴露于表达表面BCMA的细胞后，所述细胞外抗原结合结构域和/或所述CAR的结合或指示所述CAR的功能或活性的量度未被降低或阻断或未被明显降低或阻断。在一些任何实施方案中，所述可溶性或脱落形式的BCMA的浓度或量对应于所述受试者或多发性骨髓瘤患者的血清或血液或血浆中存在的浓度或量，或者多发性骨髓瘤患者群体中的平均浓度或平均量；或者为一定浓度或量的所述可溶性或脱落BCMA，在所述浓度或量下在相同测定中对于表达参考抗BCMA重组受体、任选参考抗BCMA CAR的细胞，所述结合或量度被降低或阻断或者被明显降低或阻断。

在一些任何实施方案中，在施用之前，受试者已接受过淋巴细胞清除疗法，所述淋巴细胞清除疗法包括每天施用为或约20-40mg/m²受试者体表面积(任选地为或约30mg/m²)的氟达拉滨，持续2-4天，和/或每天施用为或约200-400mg/m²受试者体表面积(任选地为或约300mg/m²)的环磷酰胺，持续2-4天。在一些任何实施方案中，在施用之前，受试者已接受过淋巴细胞清除疗法，所述淋巴细胞清除疗法包括每天施用为或约20-40mg/m²受试者体表面积(任选地为或约30mg/m²)的氟达拉滨，持续2-4天。在一些任何实施方案中，在施用之前，受试者已接受过淋巴细胞清除疗法，所述淋巴细胞清除疗法包括每天施用为或约200-400mg/m²受试者体表面积(任选地为或约300mg/m²)的环磷酰胺，持续2-4天。在一些任何实施方案中，受试者已接受过淋巴细胞清除疗法，所述淋巴细胞清除疗法包括每天施用为或约30mg/m²受试者体表面积的氟达拉滨以及每天施用为或约300mg/m²受试者体表面积的环磷酰胺，各持续3天。

在一些任何实施方案中，所述方法能够在患有所述MM的受试者群组中的至少一名受试者中或至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的受试者中任选地在开始所述施用后的指定时间点实现规定的反应或结局，其中：所述反应选自客观反应(OR)、完全反应(CR)、严格的完全反应(sCR)、非常好的部分反应(VGPR)、部分反应(PR)和最小反应(MR)；所述反应或结局是或包括OR；和/或所述反应或结局是或包括CR。

在一些任何实施方案中，受试者群组具有与通过所述方法治疗的受试者至少相同的先前疗法数量、预后或预后因素、亚型、二次受累或其他一种或多种规定的患者特征。在一些任何实施方案中，所述反应或结局可持续大于或大于约3、6、9或12个月。在一些任何实施方案中，与在所述指定时间点确定的反应或结局相比，在所述指定时间点之后为或约3、6、9或12个月时确定的反应或结局是相等的或改善的。

在一些任何实施方案中，所述反应或结局是或包括或还包括不存在神经毒性、不存在细胞因子释放综合征(CRS)和/或不存在巨噬细胞激活综合征/噬血细胞性淋巴组织细胞增多症(MAS/HLH)。在一些任何实施方案中，在患有所述MM的所述受试者群组中的至少一名受试者中或至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的受试者中，所述方法任选地在开始所述施用后的指定时间点不导致规定的毒性结局。

在一些任何实施方案中，所述规定的毒性结局是神经毒性、细胞因子释放综合征(CRS)和/或巨噬细胞激活综合征/噬血细胞性淋巴组织细胞增多症(MAS/HLH)。在一些任何实施方案中，所述规定的毒性结局是神经毒性，并且在患有所述MM的所述受试者群组中的至少60％、70％或80％的受试者中未导致神经毒性。在一些任何实施方案中，所述规定的毒性结局是3级或更高级别或4级或更高级别的神经毒性。在一些任何实施方案中，所述规定的毒性结局是3级或更高级别的神经毒性，并且在患有所述MM的所述受试者群组中的至少80％、85％、90％或95％的受试者中未导致3级或更高级别的神经毒性。在一些任何实施方案中，所述规定的毒性结局是细胞因子释放综合征(CRS)，任选地3级或更高级别或4级或更高级别的细胞因子释放综合征(CRS)。在一些任何实施方案中，在患有所述MM的所述受试者群组中的至少15％、20％、25％或30％的受试者中未导致CRS。在一些任何实施方案中，所述指定时间点是在开始施用后的以下时间、约以下时间或以下时间内：3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、12天、13天、14天或15天。在一些任何实施方案中，所述指定时间点是在开始施用后的为或约1个月、3个月、6个月、9个月或12个月。

在一些任何实施方案中，所述方法不会导致在患有所述MM的所述受试者群组中的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的受试者中的任何细胞因子释放综合征(CRS)。在一些任何实施方案中，所述方法不会导致在患有所述MM的所述受试者群组中的至少至少至少80％、至少90％或至少95％的受试者中的重度细胞因子释放综合征(CRS)。在一些任何实施方案中，所述方法不会导致在患有所述MM的所述受试者群组中的至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的受试者中的任何神经毒性。在一些任何实施方案中，所述方法不会导致在患有所述MM的所述受试者群组中的至少至少至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的受试者中的重度神经毒性。在一些任何实施方案中，所述方法不会导致在患有所述MM的所述受试者群组中的至少至少至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的受试者中的重度CRS和重度神经毒性。在一些任何实施方案中，所述方法不会导致在患有所述MM的所述受试者群组中的至少80％、至少90％或至少95％的受试者中的重度CRS和重度神经毒性。在任何此类实施方案中，所述重度CRS是3级或更高级别、4级或更高级别或5级CRS。在任何此类实施方案中，所述重度神经毒性是3级或更高级别、4级或更高级别或5级CRS。

在一些任何实施方案中，所述组合物的施用是在门诊基础上进行的，任选地除非或直到受试者展现出持续发热或在用退热药治疗后未降低或尚未降低或未降低超过1℃的发热。在一些任何实施方案中，所述组合物的施用在不使受试者入院的情况下和/或不在医院过夜停留的情况下进行的，任选地除非或直到受试者展现出持续发热或在用退热药治疗后未降低或尚未降低或未降低超过1℃的发热。在一些任何实施方案中，所述组合物的施用在不需要入院或在医院过夜停留的情况下进行的，任选地除非或直到受试者展现出持续发热或在用退热药治疗后未降低或尚未降低或未降低超过1℃的发热。

在一些任何实施方案中，包含工程化T细胞的组合物是肠胃外施用的，任选地静脉内施用的。在一些任何实施方案中，所述受试者是人受试者。

在一些任何实施方案中，包含工程化T细胞的组合物通过包含以下步骤的制造过程产生：(i)在刺激T细胞的条件下将包含原代T细胞的输入组合物暴露于包含含有多个链霉亲和素突变蛋白分子的寡聚颗粒试剂的刺激试剂，从而产生受刺激的群体，其中：所述寡聚颗粒试剂包含含有抗CD3抗体或其抗原结合片段的第一药剂以及含有抗CD28抗体或其抗原结合片段的第二药剂；(ii)将编码靶向BCMA的CAR的异源多核苷酸引入所述受刺激群体的T细胞中，从而产生转化细胞群；(iii)将转化细胞群孵育长达96小时；以及(iv)收获转化细胞群的T细胞，从而产生工程化细胞组合物，其中所述收获是在开始暴露于刺激试剂后的24小时与120小时之间(包含端值)的时候进行的。在一些实施方案中，输入组合物自体T细胞从受试者选择，诸如通过从受试者的血液或单采术(例如白细胞单采术)样品中基于免疫亲和力选择CD3 T细胞或CD4和CD8 T细胞来富集。

在一些任何实施方案中，所述组合物可以包含通过如下制造过程产生的工程化T细胞，所述制造过程包括将包含原代T细胞的输入组合物在刺激T细胞的条件下暴露于包含具有多个抗生物素蛋白、链霉亲和素、抗生物素蛋白突变蛋白或链霉亲和素突变蛋白分子的寡聚颗粒试剂的刺激试剂，从而产生受刺激的群体，其中所述刺激试剂能够激活TCR复合物的一种或多种组分的一个或多个细胞内信号传导结构域和一种或多种共刺激分子的一个或多个细胞内信号传导结构域。在一些任何实施方案中，所述制造过程可能还包括将编码靶向BCMA的CAR的异源多核苷酸引入所述受刺激群体的T细胞中，从而产生转化细胞群。在一些任何实施方案中，所述制造过程可能还包括将转化细胞群孵育长达96小时。在一些任何实施方案中，所述孵育在缺乏一种或多种重组细胞因子的基础培养基中进行。

在一些任何实施方案中，所述寡聚颗粒试剂包含含有抗CD3抗体或其抗原结合片段的第一药剂和含有抗CD28抗体或其抗原结合片段的第二药剂。在一些任何实施方案中，所述抗CD3抗体或抗原结合片段是Fab，并且所述抗CD28抗体或抗原结合片段是Fab。在一些任何实施方案中，所述第一药剂和所述第二药剂各自包含使所述第一药剂和所述第二药剂与寡聚颗粒试剂可逆地结合的链霉亲和素结合肽，任选地其中所述链霉亲和素结合肽包含SEQ ID NO:266-270中任一个所示的氨基酸序列。在一些任何实施方案中，链霉亲和素突变蛋白分子是包含氨基酸残基Val44-Thr45-Ala46-Arg47或Ile44-Gly45-Ala46-Arg47的链霉亲和素突变蛋白的四聚体，任选地其中所述链霉亲和素突变蛋白包含SEQ ID NO:257、272、275、277、279、273或276中任一个所示的序列。在一些任何实施方案中，所述寡聚颗粒试剂包含1,000个与5,000个之间的链霉亲和素突变蛋白四聚体(包含端值)。在一些任何实施方案中，所述方法还包括在收获细胞之前，在孵育后或期间添加生物素或生物素类似物。

在一些任何实施方案中，所述制造过程还包括收获转化群体的T细胞，从而产生工程化细胞组合物。在一些任何实施方案中，所述收获在开始暴露于刺激试剂后的24小时与120小时之间且包含端值的时候进行。在一些任何实施方案中，所述收获在开始暴露于刺激试剂后的48小时与120小时之间且包含端值的时候进行。在一些任何实施方案中，所述收获在基因组中检测到整合载体的时候但在达到每个二倍体基因组的稳定整合载体拷贝数(iVCN)之前进行。在一些任何实施方案中，所述收获在收获时活细胞总数大于或大于约三倍受刺激群体的活细胞总数之前的时候进行。在一些任何实施方案中，所述收获在收获时活细胞总数是受刺激群体活细胞总数的为或约三倍、为或约两倍、或与之相同或大致相同的时候进行。在一些任何实施方案中，所述收获在群体中的总T细胞、群体中的总CD3⁺T细胞、群体中的总CD4⁺T细胞、或群体中的总CD8⁺T细胞或其CAR表达细胞中的CD27⁺CCR7⁺细胞的百分比大于或大于约50％的时候进行。在一些任何实施方案中，所述收获在群体中的总T细胞、群体中的总CD3⁺T细胞、群体中的总CD4⁺T细胞、或群体中的总CD8⁺T细胞或其CAR表达细胞中的CD45RA⁺CCR7⁺和CD45RA^-CCR7⁺细胞的百分比大于或大于约60％的时候进行。

在一些任何实施方案中，所施用的组合物中的细胞通过产生展现出预定特征的输出组合物的制造过程产生，其中当在多名不同的单独受试者中进行时，所述制造过程的迭代任选地从人生物样品中产生多种所述输出组合物，其中在所述多种输出组合物中的输出组合物的预定特征选自在所述多种所述输出组合物中具有记忆表型的细胞的平均百分比在约40％与约65％之间、在约40％与约45％之间、在约45％与约50％之间、在约50％与约55％之间、在约55％与约60％之间、或在约60％与约65％之间；在所述多种所述输出组合物中具有中枢记忆表型的细胞的平均百分比在约40％与约65％之间、在约40％与约45％之间、在约45％与约50％之间、在约50％与约55％之间、在约55％与约60％之间、或在约60％与约65％之间；在所述多种所述输出组合物中为CD27+、CD28+、CCR7+、CD45RA-、CD45RO+、CD62L+、CD3+、CD95+、颗粒酶B-和/或CD127+的细胞的平均百分比在约40％与约65％之间、在约40％与约45％之间、在约45％与约50％之间、在约50％与约55％之间、在约55％与约60％之间、或在约60％与约65％之间；在所述多种所述输出组合物中为CCR7+/CD45RA-或CCR7+/CD45RO+的细胞的平均百分比在约40％与约65％之间、在约40％与约45％之间、在约45％与约50％之间、在约50％与约55％之间、在约55％与约60％之间、或在约60％与约65％之间；所述多种所述输出组合物的工程化CD4+T细胞(任选地CAR+CD4+T细胞)中的中枢记忆CD4+T细胞的平均百分比在约40％与约65％之间、在约40％与约45％之间、在约45％与约50％之间、在约50％与约55％之间、在约55％与约60％之间、或在约60％与约65％之间；所述多种所述输出组合物的工程化CD8+T细胞(任选地CAR+CD8+T细胞)中的中枢记忆CD8+T细胞的平均百分比在约40％与约65％之间、在约40％与约45％之间、在约45％与约50％之间、在约50％与约55％之间、在约55％与约60％之间、或在约60％与约65％之间；和/或所述多种所述输出组合物的工程化T细胞(任选地CAR+T细胞)中的中枢记忆T细胞(任选地CD4+中枢记忆T细胞和CD8+中枢记忆T细胞)的平均百分比在约40％与约65％之间、在约40％与约45％之间、在约45％与约50％之间、在约50％与约55％之间、在约55％与约60％之间、或在约60％与约65％之间。

在一些任何实施方案中，所施用的组合物通过在至少约80％、约90％、约95％、约97％、约99％、约100％或为100％的人生物样品中产生输出组合物的制造过程产生，所述输出组合物展现出预定特征、任选地在所述输出组合物中有阈值数量的表达所述CAR的细胞，其中所述制造过程在多名不同的单独受试者中进行。在一些任何实施方案中，所述包含基因工程化细胞的组合物不含有来自所述制造过程的残留珠。

在一些任何实施方案中，所述MM是复发性和/或难治性多发性骨髓瘤(r/r MM)。

本文还提供了制品，所述制品包含含有表达靶向BCMA的嵌合抗原受体(CAR)的基因工程化细胞的组合物，以及根据任何本文所提供方法的方法施用所述细胞组合物的说明书。

附图说明

图1示出了通过流式细胞术确定的从使用不同供体类型(参考、患者)的非扩增工程化过程产生的T细胞组合物的细胞纯度的示例性定量。将细胞工程化以表达抗BCMA CAR(BCMA)，或者进行模拟转导(模拟)。确定了活CD45+细胞的CD3+细胞百分比(左图)、活CD45+细胞的NK细胞百分比(中图)以及活CD45+细胞的CD19+细胞百分比(右图)。

图2-图3示出了对于使用不同供体类型(参考、患者)的扩增和非扩增工程化过程，通过流式细胞术确定的细胞表型的示例性定量。将细胞工程化以表达抗BCMA CAR(BCMA)，或者进行模拟转导(模拟)。图2示出了活CD45+细胞的CD3+CD8+和CD3+CD4+细胞百分比(左图)、以及活CD45+细胞的CD8+CAR+和CD4+CAR+细胞百分比(右图)。图3示出了CD4+细胞与CD8+细胞的比率和CD4+CAR+细胞与CD8+CAR+细胞的比率。

图4示出了通过流式细胞术确定的从使用不同供体类型(参考、患者)的非扩增工程化过程产生的T细胞组合物的细胞活力的示例性定量。将细胞工程化以表达抗BCMA CAR(BCMA)，或者进行模拟转导(模拟)。确定了CD3+细胞的aCas3+细胞百分比。

图5A示出了在使用扩增过程(○)或非扩增过程(●)从已经被工程化以表达CAR的来自不同人供体的原代T细胞产生的细胞组合物中，如通过标准VCN(未进行PFGE)与iVCN(进行PFGE)所评估的在总细胞中每个细胞的拷贝数之间的示例性关系。图5B-图5C示出了如通过标准VCN(图5B)或iVCN(图5C)所评估的在细胞组合物中每个细胞的拷贝数与如由通过流式细胞术评估的活CD45+细胞中CAR表达CD3+细胞的百分比(CD3+CAR+％)所指示的CAR表面表达之间的关系。

图6A-图6B示出了由使用不同供体类型(参考、患者)的扩增和非扩增工程化过程产生的细胞表型的示例性百分比。将细胞工程化以表达抗BCMA CAR(BCMA)，或者进行模拟转导(模拟)。图6A示出了aCas-CD8+CAR+和aCas-CD4+CAR+细胞的CD45RA+CCR7+细胞(左上图)、aCas-CD8+CAR+和aCas-CD4+CAR+细胞的CD45RA-CCR7+细胞(右上图)、aCas-CD8+CAR+和aCas-CD4+CAR+细胞的CD45RA-CCR7-细胞(左下图)以及aCas-CD8+CAR+和aCas-CD4+CAR+细胞的CD45RA+CCR7-细胞(右下图)的示例性百分比。图6B示出了aCas-CD8+CAR+和aCas-CD4+CAR+细胞的CD27+CCR7+细胞的示例性百分比。

图7示出了由CD45RA和CCR7在从供体匹配的非扩增过程产物和扩增过程产物来源的CAR T细胞上的表面表达定义的T细胞记忆表型的示例性比例。CAR T细胞由来自一名健康供体(HD1)或3位多发性骨髓瘤患者(MM1、MM2或MM3)的CD4+和CD8+T细胞产生。

图8A-图8C示出了在用激动性抗体进行长期抗BCMA CAR依赖性刺激后从非扩增和扩增过程产生的细胞的示例性体外增殖能力。CAR T细胞由来自一名健康供体(HD1)或3位多发性骨髓瘤患者(MM1、MM2、MM3)的CD4+和CD8+T细胞产生，并且在用包被有激动性抗体的微粒刺激后每2天确定总活细胞的数量，持续10天。图8A示出了通过将每日计数除以起始细胞数计算的扩增倍数变化。图8B示出了CAR T细胞计数转换为AUC以在产物(非扩增过程产物；扩增过程产物；模拟)或供体之间进行比较。通过曼-惠特尼(Mann-Whitney)检验确定统计显著性；*p<0.05。图8C示出了通过将非扩增过程产物组中的每日扩增倍数除以供体匹配的扩增过程产物值计算的每名供体的扩增倍数。

图9A-图9E示出了来自从供体匹配的非扩增过程产物和扩增过程产物来源的抗BCMA CAR T细胞的通过流式细胞术测量的细胞内IL-2、IFNγ或TNF细胞因子产生(图9A-图9D)和分泌的细胞因子(图9E)的示例性定量。在将细胞与激动性抗体一起培养5小时之后从一位多发性骨髓瘤患者或从2名健康供体来源的CAR T细胞。示出了在CD4+CAR+或CD8+CAR+群体内表达单细胞因子的CAR阳性细胞(图9A-图9C)或布尔(Boolean)逻辑门控三阳性细胞(图9D)的频率。在将细胞与MM.1S BCMA阳性靶细胞一起培养24小时之后通过对分泌的细胞因子浓度的多重免疫测定定量测量细胞因子蛋白分泌(图9E，示出了在培养上清液中测量的总蛋白质分泌)。通过曼-惠特尼评估统计显著性；*p<0.05。

图10A示出了以不同的效应物与靶标比率通过非扩增或扩增过程工程化的抗BCMACAR T细胞的示例性细胞溶解潜力。针对单独的组(图10B的左图)或按制造过程(图10B的右图，通过曼-惠特尼检验确定统计显著性；*p<0.05)比较了曲线下面积(AUC)值。

图11A-图11B示出了在用从非扩增过程和供体匹配的扩增工程化过程产生的抗BCMA CAR-T细胞组合物治疗后随着时间的推移在OPM-2骨髓瘤模型中的示例性肿瘤负荷和循环CAR-T细胞。从第-1天(治疗前)到治疗后约第53天的肿瘤生长以BLI(光子/秒；y轴)示出(图11A)或从每个组的BLI的曲线下面积(AUC)进行计算(图11B)。使用曼-惠特尼U检验比较差异；*p<0.05。

图12A-图12B示出了在用从非扩增和扩增供体匹配的工程化过程产生的抗BCMACAR-T细胞组合物治疗后随着时间的推移在OPM-2骨髓瘤模型中的示例性CAR T动力学和循环CAR-T细胞数。图12A示出了每个组的治疗后每1μl血液的循环抗BCMA CAR-T细胞计数。图12B示出了每个组(非扩增，NE；扩增，E)在治疗后的指定时间点的每1μl血液的循环抗BCMACAR-T细胞计数。使用曼-惠特尼U检验比较差异；*p<0.05。

具体实施方式

本文提供了表达抗BCMA重组受体(例如，CAR)的工程化细胞及其药物组合物和配制品诸如在治疗表达BCMA的疾病、病症和障碍(尤其是作为多发性骨髓瘤(MM)的血液恶性肿瘤)中的使用方法和用途。在所提供方法的实施方案中，将含有工程化细胞的治疗性T细胞组合物施用于患有MM的受试者，例如经由过继细胞疗法，诸如过继T细胞疗法。在任何所提供方法的特定实施方案中，将T细胞用针对BCMA的CAR进行工程化。在一些方面，如与某些替代性方法相比，例如，在所治疗受试者的特定组中，所述方法和用途提供或实现改善的反应和/或更持久的反应或功效和/或降低的毒性或其他副作用风险。在一些实施方案中，所述方法的优点在于：施用规定数量或相对数量的工程化细胞，施用具有预定特征(例如，特定类型的细胞的比率)的细胞组合物、施用具有特别高百分比的分化程度较低的细胞(例如，幼稚样或中枢记忆细胞或早期分化状态的细胞，诸如CCR7+CD27+细胞)的细胞组合物、对特定患者群体(诸如具有特定风险概况、分期和/或先前治疗史的患者群体)进行治疗和/或其组合。

在一些实施方案中，所述方法和用途包括在过继细胞疗法中向所述受试者施用表达基因工程化(重组)细胞表面受体的T细胞，所述基因工程化(重组)细胞表面受体通常是嵌合受体(诸如嵌合抗原受体(CAR))，识别由MM和/或其衍生细胞类型表达、与MM和/或其衍生细胞类型相关和/或对MM和/或其衍生细胞类型所特有的BCMA。所述细胞通常以配制用于施用的组合物施用；所述方法通常涉及将一个或多个剂量的细胞施用于受试者，所述一个或多个剂量可以包含特定数量或相对数量的细胞或工程化细胞。在一些情况下，所述组合物中的针对BCMA的CAR+工程化细胞包括组合物内限定比率或组成的两个或更多个亚型，诸如CD4与CD8 T细胞。在特定实施方案中，在所提供的方法中用于使用或施用的细胞组合物包含被工程化以表达针对BCMA的CAR的原代T细胞，所述原代T细胞(i)含有低百分比(例如，小于40％、小于30％、小于20％或小于10％)的耗竭细胞和/或显示与耗竭相关的标记或表型的细胞；和/或(ii)含有相对高百分比(例如大于50％、大于60％、大于70％、大于80％或大于90％)的记忆样T细胞，诸如幼稚样T细胞、中枢记忆T细胞或长期记忆T细胞。在所提供的实施方案中，与涉及施用含有较高百分比的耗竭细胞和/或较高数量的显示出与耗竭相关的表型和/或含有较低百分比的某些T细胞(诸如幼稚样T细胞、中枢记忆T细胞或长期记忆T细胞)的细胞的其他针对BCMA的CAR T细胞疗法的方法相比，所述组合物和所提供方法的特征导致改善或增强的存活、扩增、持久性和/或抗肿瘤活性。在所提供的实施方案中，与涉及施用含有较高百分比的耗竭细胞和/或较高数量的显示出与耗竭相关的表型和/或含有较低百分比的某些T细胞(诸如幼稚样T细胞、中枢记忆T细胞或长期记忆T细胞)的细胞的其他针对BCMA的CAR T细胞疗法的方法相比，所述组合物和所提供方法的特征导致改善的治疗功效，例如实现完全反应(CR)的患者的百分比增加。在所提供的实施方案中，与涉及施用含有较高百分比的耗竭细胞和/或较高数量的显示出与耗竭相关的表型和/或含有较低百分比的记忆样T细胞(诸如幼稚样T细胞、中枢记忆T细胞或长期记忆T细胞)的细胞的其他针对BCMA的CAR T细胞疗法的方法相比，所述组合物和所提供方法的特征导致治疗反应(诸如CR)的改善的临床耐久性(例如，反应从疗法开始时持续到一个时间段之后)。在特定实施方案中，在所提供的方法中使用或施用所提供的针对BCMA的CAR T细胞组合物可以通过使用比参考针对BCMA的CAR T细胞组合物(例如，用相同或相似CAR(诸如用相同的抗原结合结构域)工程化的)的剂量低超过2倍(诸如5倍或10倍)的细胞剂量来实现，但其中所述参考针对BCMA的CAR T细胞组合物含有较高百分比的耗竭细胞和/或较高数量的显示出与耗竭相关的表型和/或含有较低百分比的记忆样T细胞(诸如幼稚样T细胞、中枢记忆T细胞或长期记忆T细胞)的细胞。在一些实施方案中，所述参考针对BCMA的CAR T细胞组合物是通过涉及在扩增条件下培养细胞的步骤的过程离体产生的组合物，所述步骤诸如导致在产生所述细胞的过程期间细胞的增殖或细胞的群体加倍(例如，与过程的开始相比群体中的细胞的2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多倍加倍)。

在一些实施方案中，用于所提供的方法和用途中的针对BCMA的CAR T细胞组合物通过相对短的过程产生，所述相对短的过程不包括在设计用于扩增或增殖细胞的扩增条件下培养细胞的步骤。不同的过程可用于产生含有基因工程化T细胞群体的组合物，包括用于产生表达CAR的工程化T细胞，其通常包括设计用于或目的在于培养细胞以扩增或增加细胞增殖的步骤。然而，在特定方面，这些过程中的一些可能需要长或相对长的时间量来产生所述工程化细胞。另外，在各个方面，一些现有过程成功产生适合于细胞疗法的工程化T细胞所需的时间量可能变化，从而使得其难以协调细胞疗法的那种施用。在某些方面，这些过程中的一些所产生的细胞群可能包括相对高百分比或量的耗竭细胞、分化细胞或具有低效力的细胞。用于所提供的方法中的所提供的针对BCMA的CAR T细胞组合物解决了这些问题中的一个或多个。

在特定实施方案中，所提供的方法与有效地产生或生成适合于细胞疗法的工程化细胞的过程结合使用。在一些实施方案中，所提供的含有针对BCMA的CAR工程化T细胞的组合物通过如下过程来产生，所述过程不需要用于扩增细胞的任何另外的步骤，例如，无需扩增单元操作和/或无需旨在引起细胞扩增的步骤。在用于产生针对BCMA的CAR T细胞组合物的过程的方面中，所述过程包括用于刺激和基因工程化(例如，转化、转导或转染)T细胞以产生工程化T细胞的群体的一个或多个步骤，所述工程化T细胞的群体可以被收集或配制用作用于细胞疗法的组合物。在特定实施方案中，所述过程包括用含有编码针对BCMA的CAR的核酸的病毒载体(例如，慢病毒载体)转导细胞的步骤。在一些方面，所提供的过程导致(从病毒载体表达的)异源核酸稳定地整合到细胞的基因组中。在一些方面，如与从替代性过程(诸如涉及扩增细胞的那些过程)产生的工程化T细胞组合物相比，所提供的过程产生的针对BCMA的工程化CAR T细胞具有增强的效力。

在特定方面，用于产生所提供的组合物的过程的持续时间可以从输入细胞群或输入组合物的细胞(例如，T细胞)首次接触或暴露于刺激条件(例如，如本文诸如在章节II-C中所述)时(此时在本文中称为刺激(stimulation或stimulating)开始并且本文中也称为暴露于刺激试剂(例如，如在开始暴露于刺激试剂时中))起测量。在一些实施方案中，所述收获或收集含有工程化细胞的输出群体(本文中也称为输出组合物或称为工程化细胞(例如工程化T细胞)的组合物)所需时间的持续时间是从开始刺激起测量。在特定实施方案中，所述过程的持续时间为、为约或小于120小时、108小时、96小时、84小时、72小时、60小时、48小时、36小时或30小时。在特定实施方案中，所述过程的持续时间为、为约或小于5天、4天、3天、2天或一天。在特定实施方案中，所述工程化细胞，例如，输出组合物或群体的细胞比通过需要更长时间量的过程工程化的细胞更强效、更持久或更多幼稚样。在一些方面，所提供的过程的持续时间，例如，生成或产生T细胞的工程化群体所需的时间量比一些现有过程的持续时间短、短约或短至少2天、3天、4天、5天、6天、7天或超过7天。在一些实施方案中，所提供的过程的持续时间是替代性或现有过程的为、约或小于75％、60％、50％、40％、30％、25％、15％或10％。

在某些实施方案中，对从生物样品分离、富集或选择的细胞(例如，CD3+、CD4+和/或CD8+T细胞)的群体执行所提供的过程。在一些方面，所提供的方法可以从自受试者收集生物样品时起，在如与其他方法或过程相比缩短的时间量内，产生或生成工程化T细胞的组合物。在一些实施方案中，所提供的方法可以产生或生成工程化T细胞，包括从自受试者收集生物样品时到收集、收获或配制工程化T细胞(例如，用于冷冻保存或施用)时在或在约10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天、3天或2天内或者在或在约120小时、96小时、72小时或48小时内对生物样品或者所富集、分离或选择的细胞进行冷冻保存和储存的任何或所有时间。

在特定实施方案中，用于产生或工程化T细胞群体的过程包括刺激细胞的步骤，诸如在用病毒载体转导之前。在所提供的过程的方面中，用在其上固定或附着有刺激结合剂(例如抗CD3/抗CD28)的寡聚刺激试剂(诸如链霉亲和素突变蛋白寡聚物)进行刺激。用于在体外(诸如在外源生长因子不存在或外源生长因子量低的情况下)刺激T细胞的现有试剂是已知的(参见例如美国专利6,352,694B1和欧洲专利EP 0 700 430B1)。通常，此类试剂可以采用直径大于1μm的珠(例如，磁珠)将各种结合剂(例如抗CD3抗体和/或抗CD28抗体)固定在所述珠上。然而，在一些情况下，此类磁珠例如难以整合到用于在临床试验或治疗目的所需的条件下刺激细胞的方法中，因为必须确保在将所扩增的T细胞施用于受试者之前完全去除这些磁珠。在一些方面，诸如通过将细胞暴露于磁场进行的这种去除可能降低可用于细胞疗法的活细胞的产率。在某些情况下，必须将此类试剂(例如，含有磁珠的刺激试剂)与细胞一起孵育最短时间量，以允许T细胞从刺激试剂充分脱离。

所提供的利用寡聚刺激试剂(例如链霉亲和素突变蛋白聚合物)的过程克服了此类潜在的局限性。例如，在一些实施方案中，所提供的过程避免或降低在通过所述过程生成或产生的输出细胞中残留刺激试剂(例如，含有磁珠的试剂)的风险。在一些实施方案中，这也意味着，符合GMP标准的过程与其他方法(诸如其中必须进行另外的措施以确保最终工程化T细胞群不含珠的那些方法)相比更易于建立。在一些实施方案中，这在当前实施方案中可以通过以下方式容易地实现：添加物质，例如，竞争试剂，所述物质例如通过简单冲洗或洗涤细胞(例如通过离心)将寡聚刺激试剂从细胞解离。因此，在一些方面，如与基于珠的刺激试剂的去除或分离相比，诸如通过添加物质或竞争试剂将寡聚刺激试剂从细胞中去除或分离几乎不导致或不导致细胞损失。在一些方面，寡聚刺激试剂去除或分离的时间安排不受限制或者所受限制小于基于珠的刺激试剂的去除或分离。因此，在一些方面，可以在所提供的过程期间的任何时间或阶段从细胞中去除或分离寡聚刺激试剂。

在一些方面，与替代性刺激试剂(诸如抗CD3/抗CD28顺磁珠)相比，使用寡聚刺激试剂(例如抗CD3/抗CD28链霉亲和素突变蛋白寡聚物)可能导致总体降低的刺激信号。可能涉及更弱或减少的刺激的所提供的过程可以产生与通过涉及更强的刺激条件或更大量或浓度的刺激试剂的过程产生的CAR+T细胞同样或甚至更加有效力、有持久性或有功效的工程化CAR+T细胞，诸如可能发生在用抗CD3/抗CD28顺磁珠刺激后。此外，在一些实施方案中，如与使用更大量的寡聚刺激试剂的过程相比，用较低量或相对低的量的寡聚刺激试剂刺激细胞可以增加所得工程化细胞群的效力、功效或持久性。此类实施方案考虑，即使在足够低至足以在所述过程期间和之后降低激活标记的表达或对激活标记呈阳性的细胞的份额的剂量下，此类作用也可以持续存在。

在某些实施方案中，通过所提供的过程产生或生成的工程化T细胞，例如，含有表达重组受体诸如嵌合抗原受体的T细胞的T细胞的输出组合物或群体，在用作用于细胞疗法的细胞时特别有效或有效力。例如，在一些方面，从所提供的过程产生的含有工程化T细胞(例如，CAR+T细胞)的输出组合物具有比通过替代性现有过程生成或产生的工程化T细胞显著更高程度的效力和/或增殖能力。在一些方面，通过所提供的过程产生的含有工程化T细胞(例如，CAR+T细胞)的输出组合物具有比通过替代性或现有过程产生的工程化T细胞(例如，CAR+T细胞)增强的抗肿瘤或抗癌细胞活性。

在特定实施方案中，用于产生所提供的针对BCMA的T细胞组合物的过程不包含将细胞扩增到阈值量或浓度的步骤，这具有进一步的优势。在一些方面，不依赖于扩增细胞以增加来自起始细胞群(例如，输入群体)的细胞的数量或浓度的方案不需要在细胞群之间可能变化的孵育或培育。例如，一些实施方案考虑了从不同受试者获得的细胞群可能以不同的速率分裂或扩增，所述受试者诸如患有不同疾病或疾病亚型的受试者，尤其是患有MM(包括高风险、侵袭性和/或R/R MM)的患者就是这种情况。在某些方面，消除需要细胞扩增的潜在多变的步骤允许严格控制整个过程的持续时间。在某些实施方案中，过程持续时间的可变性被降低或消除，这在一些方面可能允许改进对医生、患者与技术人员之间的安排和治疗的协调，以有利于自体细胞疗法。

在一些实施方案中，所提供的方法涉及治疗特定组或亚组的受试者，例如被鉴定为患有高风险疾病(例如，高风险血液恶性肿瘤或高风险MM)的受试者。在一些方面，所述方法治疗患有某种形式的不良预后MM(诸如对于标准疗法是复发性或难治性(R/R)的且具有不良预后的MM)的受试者。在一些方面，所述方法治疗患有对于标准疗法是复发性或是难治性(R/R)的MM的受试者。在特定方面，工程化细胞对受试者是自体的，并且在通过与现有方法相比缩短的离体过程产生后被施用，所述离体过程不包括或涉及在产生工程化细胞的方法期间用于扩增细胞的培养步骤和/或能够产生分化程度较低的CAR工程化T细胞组合物，从而允许较低剂量的施用。结果，与现有方法相比，所提供的方法是有利的，因为它们可以缩短直到工程化T细胞疗法可用于患者(尤其是在需要治疗的患者中，诸如在一种或多种用于治疗所述疾病或病症的其他先前疗法后对于治疗是复发性或难治性的受试者)的时间。在一些方面，所提供的方法、组合物、用途和制品实现改善的且更好的对可用疗法的反应。在一些实施方案中，所述改善的或优异的反应是针对当前护理标准(SOC)。

多发性骨髓瘤(MM)是血液恶性肿瘤，其特征是骨髓中恶性浆细胞的克隆增殖和积累以及溶骨性病变的发展(Palumbo等人,N Engl J Med.2011；364(11):1046-60)。其占所有血液恶性肿瘤的大约10％。据估计，在2019年在美国(US)有大约32,110例新的诊断病例并有12,960例死于MM(Siegel等人,CA Cancer J Clin.2019；69(1):7-34)。

在诊断时的中值年龄为69岁，并且小于15％的那些新诊断病例年龄在55岁以下(SEER癌症统计事实：骨髓瘤网站(SEER Cancer Stat Facts:Myeloma Web site)：https://seer.cancer.gov/statfacts/html/mulmy.html.，2019年3月8日访问)。所谓的“CRAB标准”总结了症状性疾病的临床特征，所述CRAB标准包括钙升高、肾功能不全、贫血和溶骨性病变或骨质疏松症(Palumbo等人,N Engl J Med.2011；364(11):1046-60)。多发性骨髓瘤是一种在分子、生物学和临床上异质的疾病，其中一些患者尽管进行了治疗仍迅速进展，而另一些患者若干年都不需要疗法。总生存期(OS)(中值)为5至6年(Nandakumar等人,JCO 2019；37:15_增刊:8039)。

单独或与常规疗法组合使用的新型药剂(即免疫调节药物、蛋白酶体抑制剂、抗CD38或针对SLAMF7的单克隆抗体)已经导致MM患者的临床结局显著改善。然而，尽管有了最近这些进步，但随着耐药性克隆的出现，MM仍然是一种无法治愈的疾病，伴有多次复发和高死亡率(Cho等人,Front Immunol.2018；9:1821；Cornell等人,Bone Marrow Transplant2016；51(4):479-91)。对于可用疗法是复发性和/或难治性(R/R)的MM患者的中值总生存期(OS)不佳。因此，需要更新的治疗方法来克服MM患者的复发并改善生存结局。

B细胞成熟抗原(BCMA)是肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族的成员，是一种参与调节B细胞成熟并分化为浆细胞的在浆细胞上表达的细胞表面蛋白。其在浆细胞分化期间与B细胞激活因子相关受体(BAFF-R)的表达丧失平行被诱导。BCMA与其配体B细胞激活因子(BAFF)和增殖诱导配体(APRIL)的结合导致浆细胞的存活，从而导致增强的体液免疫。

BCMA是有吸引力的治疗靶标，因为BCMA在MM细胞系上和MM患者的细胞上高度表达，并且其表达似乎随着疾病进展而增加(Tai等人,Immunotherapy 2015；7(11):1187-99)。重要的是，BCMA蛋白在造血干细胞、幼稚B细胞或正常的非造血组织中不表达(Carpenter等人,Clin Cancer Res.2013；19(8):2048-60；Tai等人,Immunotherapy 2015；7(11):1187-99)。因此，靶向BCMA的药剂会降低与脱靶效应(on-target/off-tumor)相互作用相关的毒性。

CAR T细胞开发的挑战是产生一种在输注后始终扩增、持续和介导持久的抗肿瘤反应的产品。正在评估用于治疗MM的靶向BCMA的CAR T细胞。在临床前研究中，用靶向BCMA的嵌合抗原受体(CAR)构建体转导的T细胞在用表达BCMA的靶细胞刺激后产生高水平的细胞因子(例如，干扰素γ[IFN-γ]、TNFα、白介素2[IL-2])并增殖。此外，靶向BCMA的CAR T细胞在小鼠异种移植模型中杀死表达BCMA的MM细胞并且清除表达BCMA的肿瘤(Carpenter等人,Clin Cancer Res.2013；19(8):2048-60)。在施用针对BCMA的CAR T细胞后，CAR工程化T细胞的持久性以及多发性骨髓瘤患者的反应的耐久性是一个挑战。

在特定实施方案中，本文提供的方法是基于施用针对BCMA的CAR T细胞疗法，其中CAR含有针对BCMA的scFv抗原结合结构域。所述CAR还含有一个包含来自CD3ζ的信号传导结构域的细胞内信号传导结构域，并且还并入了4-1BB的共刺激结构域。

所提供的方法是基于以下发现，即过继转移T细胞的较低分化状态可以影响这些细胞持续存在并促进持久的抗肿瘤免疫的能力。在一些实施方案中，所提供的针对BCMA的CAR+工程化T细胞组合物通过其中不在扩增条件下培养细胞的方法来产生，从而限制或减少最终工程化输出组合物的群体倍增的次数并产生分化程度较低的产物。然而，所提供的组合物也通过以下过程来产生，所述过程导致稳定整合的载体拷贝数(iVCN)以确保CAR的一致和可靠表达，从而产生一致的细胞产物用于施用于受试者以及在施用剂量中的CAR表达细胞之间的可变性低。相比之下，大多数T细胞工程化方案通常将T细胞离体扩增9至14天或更长时间。本文例示的所提供数据支持一种模型，其中分化程度较低的记忆T细胞组分增加的CAR T细胞产物可能展现出增强的持久抗肿瘤活性。这些发现揭示了旨在最大程度地减少CAR T细胞产物的效应子分化的策略可能会导致改善的临床功效。本文提供了可以满足此类目标的实施方案。

本文中的观察结果支持根据所提供的方法用针对BCMA的CAR T细胞疗法治疗患有高风险疾病的受试者。例如，可以根据所提供的方法治疗患有MM的受试者，包括患有高风险MM的患者，诸如患有复发性/难治性(R/R)MM的那些患者。在一些实施方案中，所提供的方法可以用于治疗已经(例如用一种、两种、三种、四种或更多种用于治疗疾病的先前疗法)进行深度预治疗的受试者。

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本文使用的章节标题仅用于组织目的，而不应解释为限制所描述的主题。

I.靶向BCMA的细胞疗法在多发性骨髓瘤中的方法和用途

本文提供了治疗方法，其涉及施用工程化细胞(诸如工程化T细胞)或含有工程化细胞的组合物。还提供了所提供的针对BCMA的CAR工程化细胞(例如T细胞)和/或其组合物的方法和用途，包括涉及施用工程化细胞及其组合物的用于治疗患有多发性骨髓瘤(MM)(包括高风险MM，诸如R/R MM)的受试者的方法。在一些实施方案中，所提供的针对BCMA的CAR工程化细胞(例如T细胞)和/或其组合物的方法和用途，包括用于治疗对至少两种或更多种先前疗法失败的患有R/R MM受试者的方法。在特定实施方案中，所述方法包括向受试者施用包含CD4+和CD8+T细胞的T细胞剂量，其中所述T细胞包含特异性地结合BCMA的嵌合抗原受体(CAR)。

在一些实施方案中，所述方法和用途包括在过继细胞疗法中向所述受试者施用表达基因工程化(重组)细胞表面受体的细胞，所述基因工程化(重组)细胞表面受体通常是嵌合受体(诸如嵌合抗原受体(CAR))，识别由MM和/或其衍生细胞类型表达、与MM和/或其衍生细胞类型相关和/或对于MM和/或其衍生细胞类型所特有的BCMA。所述细胞通常以配制用于施用的组合物施用。在一些实施方案中，在治疗前从受试者中收集细胞，目的是用针对BCMA的重组受体(例如CAR)对细胞进行工程化。在一些实施方案中，通过白细胞单采术收集细胞。在一些方面，细胞通过不涉及培养细胞进行扩增的离体方法(以下也简称为非扩增过程)进行工程化。章节II.C中描述了用于工程化所提供的表达CAR的治疗组合物的示例性非扩增过程。

在一些实施方案中，待治疗的疾病或病症是高风险多发性骨髓瘤(MM)。在一些实施方案中，所述受试者患有可测量的疾病，如由以下所指示：如通过血清蛋白电泳(SPEP)所确定的，血清M蛋白水平大于或等于0.5g/dL；如通过尿蛋白电泳(UPEP)所确定的，尿M蛋白水平大于或等于200mg/24小时；涉及的无血清轻链(SFLC)水平大于或等于10mg/dL，具有异常的κ/λ比率；或任何前述项的任何组合。在一些实施方案中，在白细胞单采术前受试者患有可测量的疾病，如由以下所指示：血清M蛋白水平小于0.5g/dL；尿M蛋白水平小于200mg/24小时；和SFLC水平大于或等于10mg/dL，具有异常的κ/λ比率。

在一些实施方案中，在白细胞单采术之前受试者具有东部肿瘤协作组(ECOG)体能状态0或1(参见例如，Oken等人,(1982)Am J Clin Oncol.5:649-655)。在一些实施方案中，东部肿瘤协作组(ECOG)体能状态指示物可以用于评估或选择用于治疗的受试者，例如，因先前疗法而具有较差体能的受试者(参见例如，Oken等人(1982)Am J Clin Oncol.5:649-655)。ECOG体能状态量表描述患者在其自理能力、日常活动和体能(例如，步行、工作等)方面的机能水平。在一些实施方案中，ECOG体能状态为0指示受试者可以进行正常活动。在一些方面，ECOG体能状态为1的受试者展现出体力活动的一些限制，但是所述受试者完全能走动。在一些方面，ECOG体能状态为2的患者能走动超过50％。在一些情况下，ECOG体能状态为2的受试者也可能能够自理；参见例如

等人,(1993)Br J Cancer 67(4)773-775。反映ECOG体能状态的标准描述于下表1中：

在一些实施方案中，在施用所提供的针对BCMA的CAR T细胞组合物之前(诸如的时候)，所述受试者在用一线或多线针对MM的先前疗法治疗后缓解后已复发，或者变得对一线或多线针对MM的先前疗法是难治的。在任何实施方案中，在白细胞单采术结合对针对BCMA的CAR T细胞组合物进行工程化之前的某个时候，所述受试者在用一线或多线治疗MM的先前疗法治疗后缓解后已复发，或者变得对一线或多线治疗MM的先前疗法是难治的。因此，在特定实施方案中，在治疗的时候之前，诸如在白细胞单采术之前，受试者患有R/R MM。在一些实施方案中，在在一些实施方案中，所述受试者先前已用造血干细胞移植(HSCT)(例如，同种异体HSCT或自体HSCT)进行治疗。在一些实施方案中，所述受试者在用标准疗法治疗后具有不良预后和/或对一线或多线先前治疗已失败。在一些实施方案中，所述受试者已经进行治疗或者先前已经接受至少或至少约或约1种、2种、3种、4种或更多种其他用于治疗MM(诸如高风险MM)的疗法。在一些实施方案中，所述受试者已经进行治疗或者先前已经接受包括CD38靶向剂(例如抗CD38抗体)的疗法。在一些方面，所述受试者在对先前疗法的完全反应(CR)或部分反应(PR)的最初反应后已经复发。在一些实施方案中，所述受试者对至少一种或多种先前疗法的治疗是难治的，并且难治性治疗是在先前疗法之后疾病稳定(SD)或疾病进展(PD)的最佳反应。

在一些实施方案中，所述受试者已经在用一线或多线针对疾病或病症的先前疗法治疗后缓解后复发，或变得对一线或多线针对疾病或病症的先前疗法是难治的。在一些实施方案中，如果在完成最后一剂某个线的疗法的60天期间或之内有记录在案的疾病进展，则所述受试者被认为对所述线的疗法是难治的。在一些实施方案中，所述受试者在完成最后一剂所述线的疗法的60天期间或之内有记录在案的疾病进展。在一些实施方案中，所述受试者在完成最后一剂所述线的疗法的12个月期间或之内有记录在案的疾病进展。在一些实施方案中，所述受试者在施用工程化T细胞组合物之前的六个月期间或之内有记录在案的疾病进展，并且所述受试者对其最近线的治疗MM的疗法是难治的或无反应。

在一些实施方案中，所述受试者已经在用至少两线针对疾病或病症的先前疗法治疗后缓解后复发，或变得对至少两线针对疾病或病症的先前疗法是难治的。在一些实施方案中，所述受试者已经在用至少三线针对疾病或病症的先前疗法治疗后缓解后复发，或变得对至少三线针对疾病或病症的先前疗法是难治的。

在一些实施方案中，所述受试者已经在用自体干细胞移植(ASCT)治疗后缓解后复发或变得对自体干细胞移植(ASCT)是难治的。在一些实施方案中，由于年龄或其他因素，所述受试者尚未在白细胞单采术之前接受过ASCT。

在一些实施方案中，所述受试者已经在至少一个周期的免疫调节剂治疗后缓解后复发，或变得对至少一个周期的免疫调节剂治疗是难治的。示例性免疫调节剂包括但不限于沙利度胺、来那度胺和泊马度胺。在一些实施方案中，所述受试者已经在至少两个连续周期的免疫调节剂治疗后缓解后复发，或变得对至少连续两个周期的免疫调节剂治疗是难治的。在一些实施方案中，所述受试者已经在至少一个完整周期的免疫调节剂治疗后缓解后复发，或变得对至少一个完整周期的免疫调节剂治疗是难治的。

在一些实施方案中，所述免疫调节剂是免疫检查点抑制剂。在一些实施方案中，所述免疫调节剂是免疫调节抗体。示例性免疫检查点抑制剂包括曲美目单抗(CTLA-4阻断抗体，也称为替西木单抗、CP-675,206)、抗OX40、PD-L1单克隆抗体(抗B7-H1；MEDI4736)、MK-3475(PD-1阻断剂)、纳武单抗(抗PD-1抗体)、CT-011(抗PD-1抗体)、BY55单克隆抗体、AMP224(抗PD-L1抗体)、BMS-936559(抗PD-L1抗体)、MPLDL3280A(抗PD-L1抗体)、MSB0010718C(抗PD-L1抗体)和伊匹单抗(抗CTLA-4抗体，也称为

MDX-010和MDX-101)。示例性免疫调节抗体包括但不限于达珠单抗(Daclizumab)(Zenapax)、贝伐单抗

巴利昔单抗(Basiliximab)、伊匹单抗、纳武单抗、派姆单抗、MPDL3280A、匹地利珠单抗(CT-011)、MK-3475、BMS-936559、MPDL3280A(阿特珠单抗)、曲美目单抗、IMP321、BMS-986016、LAG525、乌瑞鲁单抗(urelumab)、PF-05082566、TRX518、MK-4166、达西珠单抗(SGN-40)、鲁卡木单抗(lucatumumab)(HCD122)、SEA-CD40、CP-870、CP-893、MEDI6469、MEDI6383、MOXR0916、AMP-224、MSB0010718C(阿维鲁单抗)、MEDI4736、PDR001、rHIgM12B7、乌洛鲁单抗(Ulocuplumab)、BKT140、伐立鲁单抗(Varlilumab)(CDX-1127)、ARGX-110、MGA271、利瑞鲁单抗(lirilumab)(BMS-986015、IPH2101)、IPH2201、ARGX-115、艾马珠单抗(Emactuzumab)、CC-90002和MNRP1685A或其抗体结合片段。其他示例性免疫调节剂包括例如阿夫土珠单抗(afutuzumab)(可以从

获得)；培非司亭

来那度胺(CC-5013，

)；沙利度胺(thalidomide)

actimid(CC4047)；和IRX-2(人细胞因子的混合物，包括白介素1、白介素2和干扰素γ，CAS 951209-71-5，可从IRXTherapeutics获得)。

在一些实施方案中，所述受试者已经在至少一个周期的蛋白酶体抑制剂治疗后缓解后复发，或变得对至少一个周期的蛋白酶体抑制剂治疗是难治的。示例性蛋白酶体抑制剂包括但不限于硼替佐米、卡非佐米和伊沙佐米。在一些实施方案中，所述受试者已经在至少连续两个周期的蛋白酶体抑制剂治疗后缓解后复发，或变得对至少两个连续周期的蛋白酶体抑制剂治疗是难治的。

在一些实施方案中，所述受试者已经在至少连续两个周期的单独的免疫调节剂治疗和至少连续两个周期的单独的蛋白酶体抑制剂治疗后缓解后复发，或变得对至少连续两个周期的单独的免疫调节剂治疗和至少连续两个周期的单独的蛋白酶体抑制剂治疗是难治的。在一些实施方案中，所述受试者已经在至少连续两个周期的免疫调节剂和蛋白酶体抑制剂组合治疗后缓解后复发，或变得对至少连续两个周期的免疫调节剂和蛋白酶体抑制剂组合治疗是难治的。

在一些实施方案中，所述受试者已经在抗CD38抗体治疗后缓解后复发，或变得对抗CD38抗体治疗是难治的。示例性抗CD38抗体包括但不限于达雷木单抗。在一些实施方案中，抗CD38抗体治疗是单一疗法。在一些实施方案中，抗CD38抗体治疗是组合疗法的一部分。

在一些实施方案中，所述受试者已经在以下治疗中的每一种后缓解后复发，或变得对以下治疗中的每一种是难治的：(1)ASCT，如果有资格接受ASCT的话；(2)至少连续两个周期的单独的免疫调节剂治疗和至少连续两个周期的单独的蛋白酶体抑制剂治疗；和(3)抗CD38抗体治疗。在一些实施方案中，所述受试者已经在以下治疗中的每一种后缓解后复发，或变得对以下治疗中的每一种是难治的：(1)ASCT，如果有资格接受ASCT的话；(2)至少连续两个周期的免疫调节剂和蛋白酶体抑制剂组合治疗；和(3)抗CD38抗体治疗。

在一些实施方案中，所述受试者对在白细胞单采术之前施用的最后一线先前疗法是难治的。

在一些实施方案中，在白细胞单采术之前受试者没有MM的活动性中枢神经系统(CNS)受累。在一些实施方案中，在白细胞单采术之前受试者没有MM的CNS受累史。

在一些实施方案中，在白细胞单采术之前受试者没有活动性浆细胞白血病；华氏巨球蛋白血症；多神经病、器官巨大症、内分泌病、单克隆蛋白质、皮肤变化(POEMS)综合征；任何具有临床意义的淀粉样变性；或任何前述疾病的任何组合。在一些实施方案中，在白细胞单采术之前受试者没有以下疾病的病史：浆细胞白血病、华氏巨球蛋白血症、POEMS综合征、任何具有临床意义的淀粉样变性、或任何前述疾病的任何组合。在一些实施方案中，在施用工程化细胞之前或直到施用工程化细胞受试者没有活动性浆细胞白血病、华氏巨球蛋白血症、POEMS综合征、任何具有临床意义的淀粉样变性、或任何前述疾病的任何组合。

在一些实施方案中，在根据所提供的方法施用针对BCMA的工程化CAR T细胞之前，所述受试者先前尚未接受过CAR T细胞疗法。在一些实施方案中，在白细胞单采术之前，受试者尚未接受过遗传修饰的T细胞疗法。在一些实施方案中，在白细胞单采术之前，受试者尚未接受过靶向BCMA的疗法。靶向BCMA的示例性疗法包括但不限于双特异性T细胞接合的抗体或分子、抗体-药物缀合物(BCMA-ADC)和针对BCMA的T细胞疗法(例如，BCMA嵌合抗原受体T细胞)。在一些实施方案中，所述受试者对氟达拉滨和/或环磷酰胺没有超敏反应。在一些实施方案中，所述受试者没有需要免疫抑制疗法的活动性自身免疫性疾病。

在一些实施方案中，所述受试者在白细胞单采术前小于14天尚未接受过治疗剂量的皮质类固醇。在一些实施方案中，所述皮质类固醇的治疗剂量被定义为大于20mg/天的泼尼松或等效物。在一些实施方案中，所述受试者在白细胞单采术前小于14天尚未接受过抗MM抗体。在一些实施方案中，所述受试者在白细胞单采术前小于14天尚未接受过任何其他批准的系统性抗MM疗法。在一些实施方案中，所述受试者在白细胞单采术治疗前小于14天(对于生物制剂)或5个半衰期(对于小分子)尚未接受过任何实验疗法。在一些实施方案中，所述受试者在白细胞移植前小于6个月尚未接受过自体干细胞移植(SCT)。在一些实施方案中，所述受试者在白细胞单采术前小于6个月尚未接受过同种异体SCT。在一些实施方案中，所述受试者在白细胞单采术前小于6周尚未接受过供体淋巴细胞输注。在一些实施方案中，所述受试者在白细胞单采术前小于4周尚未接受过免疫抑制疗法。示例性免疫抑制疗法包括但不限于钙神经素抑制剂、甲氨蝶呤或其他化学治疗剂、麦考酚酯、雷帕霉素和免疫抑制抗体(诸如抗TNF、抗IL6或抗IL6R)。在一些实施方案中，所述受试者在白细胞单采术前小于14天尚未经历血浆单采术。在一些实施方案中，所述受试者在白细胞单采术前小于6周尚未接受过靶向包括大的骨髓场(field)(例如骨盆或胸骨)在内的区域的放射疗法。在一些实施方案中，所述受试者在白细胞单采术前小于14天尚未接受过针对单个病变的放射疗法。

在一些实施方案中，在白细胞单采术之前确定了受试者进行涉及施用工程化细胞的治疗的资格。在一些实施方案中，在白细胞单采术之前受试者具有足够的用于白细胞单采术的血管可及性。在一些实施方案中，在白细胞单采术之前受试者具有东部肿瘤协作组(ECOG)体能状态0或1(参见例如，Oken等人,(1982)Am J Clin Oncol.5:649-655)。在一些实施方案中，在白细胞单采术之前受试者已经在先前疗法后从任何非血液毒性中恢复到小于或等于1级。在一些实施方案中，在白细胞单采术之前受试者已经在先前疗法后从任何非血液毒性中恢复到基线。

在一些实施方案中，在白细胞单采术之前受试者具有足够的器官功能。在一些实施方案中，除其他因素以外，足够的器官功能由以下来指示：在确定资格的7天内绝对中性粒细胞计数(ANC)大于或等于1.0×10⁹个细胞/L而无需生长因子支持；如果先前施用过培非司亭，则在确定资格的14天内ANC大于或等于1.0×10⁹个细胞/L而无需生长因子支持；在确定资格的21天内血红蛋白水平大于或等于8g/dL而无需红细胞(RBC)输注；在确定资格的7天内血小板计数大于50×10⁹个细胞/L而无需输注支持；在确定资格的3天内计算的肌酐清除率(血清CrCl，Cockcroft-Gault式)大于或等于60mL/min而无需水合支持；天冬氨酸氨基转移酶(AST)水平小于或等于3.0倍正常上限(ULN)；丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平小于或等于3.0倍ULN；总胆红素水平小于1.5倍ULN；在吉尔伯特综合征的情况下，直接胆红素水平小于1.5倍ULN；国际比率(INR)小于或等于1.5倍ULN；部分促凝血酶原时间(PTT)小于或等于1.5倍ULN；足够的肺功能，例如小于或等于CTCAE 1级呼吸困难和/或在室内空气中饱和氧(SaO₂大于92％)；足够的心脏功能，例如左心室射血分数(LVEF)大于或等于40％，如通过在确定资格的8周内进行的超声心动图(ECHO)或多次吸收闸门控测(MUGA)扫描所评估的；或任何前述项的任何组合。除其他因素以外，足够的器官功能还可以由以下来指示：计算的肌酐清除率(CrCl)大于或等于60mL/min，如在确定资格的3天内在24小时尿液收集中所测量的，而无需水合支持；和/或凝血酶原时间(PT)小于或等于1.5倍ULN。

在特定实施方案中，在施用针对BCMA的工程化CAR T细胞的剂量之前，受试者被施用或接受过淋巴细胞清除化疗。

淋巴细胞清除可以通过稳态细胞因子、CD4+CD25+调节性T细胞的减少、骨髓微环境内SDF-1的增加和对抗原呈递细胞的刺激作用改善CAR T细胞的植入和活性(Grossman等人,Nat Rev Immunol.2004；4(5):387-395；Stachel等人,Pediatr Blood Cancer 2004；43(6):644-50；Pinthus等人,J Clin Invest 2004；114(12):1774-81；Turk等人,J Exp Med2004；200(6):771-82)。此外，LD化疗还可以减少受试者的肿瘤负荷并潜在地降低细胞因子释放综合征(CRS)的风险和严重程度。

因此，在一些实施方案中，所述方法包括在施用工程化细胞之前将预调理剂施用于受试者，所述预调理剂诸如淋巴细胞清除剂或化学治疗剂，诸如环磷酰胺、氟达拉滨或其组合。例如，可以在施用工程化细胞之前至少2天(诸如之前至少3、4、5、6、7、8或9天)将所述预调理剂施用于受试者。在一些实施方案中，在施用工程化细胞之前不超过9天(诸如之前不超过8、7、6、5、4、3或2天)将所述预调理剂施用于受试者。

在一些实施方案中，用环磷酰胺以在或在约20mg/kg与100mg/kg受试者体重之间(诸如在或在约40mg/kg与80mg/kg之间)的剂量对受试者进行预调理。在一些方面，用或用约60mg/kg的环磷酰胺预调理受试者或施用于受试者。在一些实施方案中，可以将环磷酰胺按单剂量施用或者可以按多个剂量施用，诸如每日、每隔一天或每三天给予。在一些实施方案中，每天施用一次环磷酰胺，持续一天或两天。在一些实施方案中，在淋巴细胞清除剂包含环磷酰胺的情况下，以在或在约100mg/m²与500mg/m²受试者体表面积之间(诸如在或在约200mg/m²与400mg/m²之间、或250mg/m²与350mg/m²之间(包含端值))的剂量向受试者施用环磷酰胺。在一些情形中，向受试者施用约100mg/m²的环磷酰胺。在一些情形中，向受试者施用约150mg/m²的环磷酰胺。在一些情形中，向受试者施用约200mg/m²的环磷酰胺。在一些情形中，向受试者施用约250mg/m²的环磷酰胺。在一些情形中，向受试者施用约300mg/m²的环磷酰胺。在一些实施方案中，可以将环磷酰胺按单剂量施用或者可以按多个剂量施用，诸如每日、每隔一天或每三天给予。在一些实施方案中，每天施用环磷酰胺，诸如持续1-5天，例如持续3至5天。在一些情形中，在开始细胞疗法之前，向受试者每天施用约300mg/m²受试者体表面积的环磷酰胺，持续3天。在一些实施方案中，在开始细胞疗法之前，向受试者施用总计为或约300mg/m²、400mg/m²、500mg/m²、600mg/m²、700mg/m²、800mg/m²、900mg/m²、1000mg/m²、1200mg/m²，1500mg/m²、1800mg/m²、2000mg/m²、2500mg/m²、2700mg/m²、3000mg/m²、3300mg/m²、3600mg/m²、4000mg/m²或5000mg/m²的环磷酰胺或任何前述值限定的范围内的环磷酰胺。

在一些实施方案中，在淋巴细胞清除剂包含氟达拉滨的情况下，以在为或约1mg/m²与为或约100mg/m²之间，诸如在为或约10mg/m²与为或约75mg/m²之间、为或约15mg/m²与为或约50mg/m²之间、为或约20mg/m²与为或约40mg/m²之间、为或约24mg/m²与为或约35mg/m²之间(包含端值)的剂量向受试者施用氟达拉滨。在一些情形中，向受试者施用为或为或约10mg/m²的氟达拉滨。在一些情形中，向受试者施用为或约15mg/m²的氟达拉滨。在一些情形中，向受试者施用为或约20mg/m²的氟达拉滨。在一些情形中，向受试者施用为或约25mg/m²的氟达拉滨。在一些情形中，向受试者施用为或约30mg/m²的氟达拉滨。在一些实施方案中，可以将氟达拉滨按单剂量施用或者可以按多个剂量施用，诸如每日、每隔一天或每三天给予。在一些实施方案中，每天施用氟达拉滨，诸如持续1-5天，例如持续3至5天。在一些情形中，在开始细胞疗法之前，向受试者每天施用为或约30mg/m²受试者体表面积的氟达拉滨，持续3天。在一些实施方案中，在开始细胞疗法之前，向受试者施用总计为或约10mg/m²、20mg/m²、25mg/m²、30mg/m²、40mg/m²、50mg/m²、60mg/m²、70mg/m²、80mg/m²，90mg/m²、100mg/m²、120mg/m²、150mg/m²、180mg/m²、200mg/m²、250mg/m²、270mg/m²、300mg/m²、330mg/m²、360mg/m²、400mg/m²或500mg/m²的环磷酰胺或由任何前述值限定的范围内的环磷酰胺。

在一些实施方案中，淋巴细胞清除剂包含单一药剂，诸如环磷酰胺或氟达拉滨。在一些实施方案中，向受试者仅施用环磷酰胺，而不施用氟达拉滨或其他淋巴细胞清除剂。在一些实施方案中，在施用之前，受试者已接受过淋巴细胞清除疗法，所述淋巴细胞清除疗法包括每天施用为或约200-400mg/m²受试者体表面积、任选地为或约300mg/m²的环磷酰胺，持续2-4天。在一些实施方案中，向受试者仅施用氟达拉滨，例如不施用环磷酰胺或其他淋巴细胞清除剂。在一些实施方案中，在施用之前，受试者已经接受淋巴细胞清除疗法，所述淋巴细胞清除疗法包括每天施用为或约20-40mg/m²受试者体表面积、任选地为或约30mg/m²的氟达拉滨，持续2-4天。

在一些实施方案中，淋巴细胞清除剂包含药剂的组合，诸如环磷酰胺和氟达拉滨的组合。因此，药剂的组合可以包括任何剂量或给药时间表(诸如上述那些)下的环磷酰胺以及任何剂量或给药时间表(诸如上述那些)下的氟达拉滨。例如，在一些方面，在第一剂量或后续剂量之前，向受试者施用为或约60mg/kg(约2g/m²)的环磷酰胺和3至5个剂量的25mg/m²氟达拉滨。在一些中，在施用细胞之前，向受试者同时静脉内施用氟达拉滨(30mg/m²/天，持续3天)和环磷酰胺(300mg/m²/天，持续3天)(flu/cy)。在一些实施方案中，向受试者施用减少的、延迟的或消除的剂量的一个或多个剂量的一种或多种淋巴细胞清除剂。

在一些实施方案中，在从受试者中收集细胞之后和在施用淋巴细胞清除(LD)化疗之前，受试者可以接受桥接疗法进行疾病控制。可以基于熟练执业医生对于治疗特定疾病或病症的判断，包括基于诸如患者年龄、疾病的严重性或程度、副作用的可能性、在LD化疗之前施用的时间安排、先前疗法和其他因素等多种因素来施用多种疗法中的任一种作为桥接疗法的一部分。在一些实施方案中，将桥接疗法施用不超过四周。可以在LD疗法之前作为桥接疗法给予的示例性疗法包括但不限于地塞米松、环磷酰胺、依托泊苷和顺铂(DCEP)；硼替佐米、地塞米松、顺铂、多柔比星、环磷酰胺和依托泊苷(VD-PACE)；环磷酰胺、长春新碱、多柔比星和地塞米松(CVAD)；脉冲地塞米松；以及经批准的含达雷木单抗的方案。在一些实施方案中，在LD疗法前至少14天停止桥接疗法。在一些实施方案中，桥接疗法在淋巴细胞清除之前1天、2天、3天、4天、5天、7天、10天、14天、21天、28天、45天或60天停止。在一些实施方案中，在LD化疗之前，受试者必须从与桥接疗法相关的毒性中恢复至2级或更低级别。

在一些实施方案中，对受试者进行前驱用药，例如以使输注反应的风险降至最低。在一些方面，前驱用药包括施用镇痛药和/或抗组胺药。在一些实施方案中，前驱用药包括施用对乙酰氨基酚和/或苯海拉明或另一种H1-抗组胺药。在一些实施方案中，在用细胞疗法治疗之前为或约30至60分钟，向患者施用对乙酰氨基酚(例如，650mg口服)和苯海拉明(例如，25-50mg，IV或口服)或另一种H1-抗组胺药。

在一些实施方案中，所述受试者的年龄为至少18岁。在任何所提供方法的实施方案中，所述受试者是人受试者。

A.给药

在一些实施方案中，根据所提供的方法和/或根据所提供的制品或组合物，向受试者施用一定剂量的工程化细胞。在一些实施方案中，根据受试者的特定疾病或病症来确定剂量的大小或时间安排。在一些情况下，可以根据所提供的描述凭经验确定用于特定疾病的剂量的大小或时间安排。

在一些实施方案中，所述治疗不诱导受试者对疗法的免疫应答，和/或诱导这样的应答没有达到阻止疾病或病症的有效治疗的程度。在一些方面，免疫原性和/或移植物抗宿主应答的程度小于用不同但可比较的治疗所观察到的程度。例如，与包含结合至类似的(例如重叠的)表位和/或与所述抗体竞争结合BCMA的不同抗体(诸如小鼠或猴或兔或人源化抗体)的CAR相比，在使用表达包含所提供的抗BCMA抗体的CAR的细胞的过继细胞疗法的情况下，在一些实施方案中免疫原性的程度降低。

在一些实施方案中，所述方法包括过继细胞疗法，由此将表达包含BCMA结合分子的所提供的重组受体(例如，包含抗BCMA抗体或其抗原结合片段的CAR)的基因工程化细胞施用于受试者。这种施用能以靶向BCMA的方式促进细胞激活(例如，T细胞激活)，使得疾病或障碍的细胞被靶向进行破坏。

因此，所提供的方法和用途包括用于过继细胞疗法的方法和用途。在一些实施方案中，所述方法包括将细胞或含有所述细胞的组合物施用于受试者、组织或细胞，例如患有、有风险患上或怀疑患有疾病、病症或障碍的受试者、组织或细胞。在一些实施方案中，将所述细胞、群体和组合物施用于患有将要例如通过过继细胞疗法(诸如过继T细胞疗法)治疗的特定疾病或病症的受试者。在一些实施方案中，将细胞或组合物施用于受试者，诸如患有或有风险患上疾病或病症的受试者。在一些方面，所述方法由此治疗所述疾病或病症(例如，改善所述疾病或病症的一种或多种症状)，诸如通过减轻表达BCMA的癌症中的肿瘤负荷。

用于过继细胞疗法的细胞的施用方法是已知的，并且可以与所提供的方法和组合物结合使用。例如，过继T细胞治疗方法描述于例如授予Gruenberg等人的美国专利申请公开号2003/0170238；授予Rosenberg的美国专利号4,690,915；Rosenberg(2011)Nat RevClin Oncol.8(10):577-85)。参见例如，Themeli等人(2013)Nat Biotechnol.31(10):928-933；Tsukahara等人(2013)Biochem Biophys Res Commun 438(1):84-9；Davila等人(2013)PLoS ONE 8(4):e61338。

在一些实施方案中，所述细胞疗法(例如过继细胞疗法，例如过继T细胞疗法)通过自体转移进行，其中从要接受所述细胞疗法的受试者或从源自这样的受试者的样品中分离和/或以其他方式制备所述细胞。因此，在一些方面，所述细胞源自需要治疗的受试者(例如患者)，并且在分离和处理后向同一受试者施用所述细胞。

在一些实施方案中，所述细胞疗法(例如过继细胞疗法，例如过继T细胞疗法)通过同种异体转移进行，其中从除了将要接受或最终接受所述细胞疗法的受试者以外的受试者(例如第一受试者)分离和/或以其他方式制备细胞。在此类实施方案中，然后将所述细胞施用于同一物种的不同受试者，例如第二受试者。在一些实施方案中，所述第一受试者和第二受试者在遗传上是相同的。在一些实施方案中，所述第一受试者和第二受试者在遗传上是相似的。在一些实施方案中，所述第二受试者与所述第一受试者表达相同的HLA类别或超类型。

在一些实施方案中，被施用所述细胞、细胞群或组合物的受试者是灵长类动物，诸如人。在一些实施方案中，被施用所述细胞、细胞群或组合物的受试者是非人灵长类动物。在一些实施方案中，所述非人灵长类动物是猴(例如食蟹猴)或猿。所述受试者可以是雄性或雌性，并且可以处于任何合适的年龄，包括婴儿、幼年、青春期、成年和老年受试者。在一些实施方案中，所述受试者是非灵长类哺乳动物，诸如啮齿动物(例如小鼠、大鼠等)。在一些例子中，所述患者或受试者是用于疾病、过继细胞疗法和/或用于评估毒性结局(诸如细胞因子释放综合征(CRS))的经验证的动物模型。

所述BCMA结合分子(诸如重组受体(例如CAR))和表达BCMA结合分子的细胞可以通过任何合适的方式施用，例如通过注射，例如静脉内或皮下注射、眼内注射、眼周注射、视网膜下注射、玻璃体内注射、经中隔注射、巩膜下注射、脉络膜内注射、前房内注射、结膜下注射(subconjunctival injection，subconjunctival injection)、眼球筋膜下(sub-Tenon)注射、眼球后注射、眼球周注射或后近巩膜(posterior juxtascleral)递送。在一些实施方案中，将它们通过肠胃外、肺内和鼻内以及(如果需要进行局部治疗的话)病灶内施用来施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内、颅内、胸腔内或皮下施用。给药和施用可以部分取决于施用是短期的还是长期的。各种给药时间表包括但不限于在不同时间点的单次或多次施用、推注施用和脉冲输注。

为了预防或治疗疾病，所述结合分子、重组受体或细胞的适当剂量可以取决于待治疗的疾病类型、结合分子或重组受体的类型、疾病的严重程度和病程、施用结合分子或重组受体是出于预防目的还是治疗目的、先前的疗法、患者的临床病史和对重组受体或细胞的反应以及主治医师的决断。在一些实施方案中，所述组合物和分子和细胞适合地一次性或在一系列治疗中施用于患者。

在一些实施方案中，所述方法包括施用一定剂量的所述工程化细胞或包含一定剂量的所述工程化细胞的组合物。在一些实施方案中，所述工程化细胞或包含工程化细胞的组合物可用于治疗方案中，其中所述治疗方案包括施用一定剂量的所述工程化细胞或包含一定剂量的所述工程化细胞的组合物。在一些实施方案中，所述剂量可以包含例如特定数量或范围的重组受体表达T细胞、总T细胞或总外周血单核细胞(PBMC)，诸如本文所述的任何数量的此类细胞。在一些实施方案中，可以施用含有一定剂量的所述细胞的组合物。在一些方面，细胞群或细胞组合物中表达CAR(CAR+)的细胞的数量、量或比例可以通过检测替代性标记(例如，通过流式细胞术或其他手段)或者通过检测可以与本文提供的结合分子或受体特异性地结合的标记的分子(诸如标记的抗原)的结合来评估。

在一些任何所提供的实施方案中，T细胞(诸如表达针对BCMA的CAR的工程化T细胞)的剂量包括、富集或包含以下细胞组合物或细胞群，所述细胞组合物或细胞群富集CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞或CD4+T细胞和CD8+T细胞。在一些任何此类实施方案中，T细胞剂量中大于或大于约70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％的细胞是CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞或CD4+T细胞和CD8+T细胞。在一些任何此类实施方案中，T细胞剂量中大于或大于约70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％的细胞是CD3+T细胞。在一些任何所提供的实施方案中，T细胞的剂量包含CD4+细胞和CD8+细胞两者。在一些任何此类实施方案中，T细胞剂量中大于或大于约70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％的细胞是CD4+T细胞和CD8+T细胞。

在一些实施方案中，细胞的剂量包含在为或约0.1x10⁵个针对BCMA的CAR工程化细胞/公斤受试者体重(细胞/kg)与为或约2x10⁶个细胞/kg之间，诸如在为或约0.1x10⁵个细胞/kg与为或约0.5x10⁵个细胞/kg之间、在为或约0.5x10⁵个细胞/kg与为或约1x10⁵个细胞/kg之间、在为或约1x10⁵个细胞/kg与为或约1.5x10⁵个细胞/kg之间、在为或约1.5x10⁵个细胞/kg与为或约2x10⁵个细胞/kg之间、在为或约2x10⁵个细胞/kg与为或约2.5x10⁵个细胞/kg之间、在为或约2.5x10⁵个细胞/kg与为或约3x10⁵个细胞/kg之间、在为或约3x10⁵个细胞/kg与为或约3.5x10⁵个细胞/kg之间、在为或约3.5x10⁵个细胞/kg与为或约4x10⁵个细胞/kg之间、在为或约4x10⁵个细胞/kg与为或约4.5x10⁵个细胞/kg之间、在为或约4.5x10⁵个细胞/kg与为或约5x10⁵个细胞/kg之间、在为或约5x10⁵个细胞/kg与为或约5.5x10⁵个细胞/kg之间、在为或约5.5x10⁵个细胞/kg与为或约6x10⁵个细胞/kg之间、在为或约6x10⁵个细胞/kg与为或约6.5x10⁵个细胞/kg之间、在为或约6.5x10⁵个细胞/kg与为或约7x10⁵个细胞/kg之间、在为或约7x10⁵个细胞/kg与为或约7.5x10⁵个细胞/kg之间、在为或约7.5x10⁵个细胞/kg与为或约8x10⁵个细胞/kg之间、或在为或约8x10⁵个细胞/kg与为或约10x10⁵个细胞/kg之间。在一些实施方案中，细胞的剂量包含不超过2x10⁵个针对BCMA的CAR工程化细胞/千克受试者体重(细胞/kg)，诸如不超过或不超过约3x10⁵个细胞/kg、不超过或不超过约4x10⁵个细胞/kg、不超过或不超过约5x10⁵个细胞/kg、不超过或不超过约6x10⁵个细胞/kg、不超过或不超过约7x10⁵个细胞/kg、不超过或不超过约8x10⁵个细胞/kg、不超过或不超过约9x10⁵个细胞/kg、不超过或不超过约1x10⁶个细胞/kg、或不超过或不超过约2x10⁶个细胞/kg。在一些实施方案中，细胞的剂量包含至少或至少约或为或约0.1x10⁵个针对BCMA的CAR工程化细胞/公斤受试者体重(细胞/kg)，诸如至少或至少约或为或约0.2x10⁵个细胞/kg、至少或至少约或为或约0.3x10⁵个细胞/kg、至少或至少约或为或约0.4x10⁵个细胞/kg、至少或至少约或为或约0.5x10⁵个细胞/kg、至少或至少约或为或约0.6x10⁵个细胞/kg、至少或至少约或为或约0.7x10⁵个细胞/kg、至少或至少约或为或约0.8x10⁵个细胞/kg、至少或至少约或为或约0.9x10⁵个细胞/kg、至少或至少约或为或约0.1x10⁶个细胞/kg、或至少或至少约或为或约0.2x10⁶个细胞/kg。在一些实施方案中，细胞的数量是作为活细胞的此类细胞(例如，活T细胞，诸如表达针对BCMA的CAR的活CD3+细胞)的数量。

在某些实施方案中，将细胞或细胞亚型的单独群体按以下施用于受试者：在为或约10万至为或约1000亿个细胞的范围和/或每公斤受试者体重该量的细胞，如例如为或约10万至为或约500亿个细胞(例如，为或约500万个细胞、为或约2500万个细胞、为或约5亿个细胞、为或约10亿个细胞、为或约50亿个细胞、为或约200亿个细胞、为或约300亿个细胞、为或约400亿个细胞或由任两个前述值限定的范围)、为或约100万至为或约500亿个细胞(例如，为或约500万个细胞、为或约2500万个细胞、为或约5亿个细胞、为或约10亿个细胞、为或约50亿个细胞、为或约200亿个细胞、为或约300亿个细胞、为或约400亿个细胞或由任两个前述值限定的范围)，如为或约1000万至为或约1000亿个细胞(例如，为或约2000万个细胞、为或约3000万个细胞、为或约4000万个细胞、为或约6000万个细胞、为或约7000万个细胞、为或约8000万个细胞、为或约9000万个细胞、为或约100亿个细胞、为或约250亿个细胞、为或约500亿个细胞、为或约750亿个细胞、为或约900亿个细胞或由任两个前述值限定的范围)，并且在一些情况下，为或约1亿个细胞至为或约500亿个细胞(例如，为或约1.2亿个细胞、为或约2.5亿个细胞、为或约3.5亿个细胞、为或约6.5亿个细胞、为或约8亿个细胞、为或约9亿个细胞、为或约30亿个细胞、为或约300亿个细胞、为或约450亿个细胞)或在这些范围和/或每公斤受试者体重的这些范围之间的任何值。剂量可能取决于对于疾病或障碍和/或患者和/或其他治疗所特有的属性。在一些实施方案中，此类值是指重组受体表达细胞的数量；在其他实施方案中，它们是指所施用的组合物中的T细胞或总细胞的数量。在一些实施方案中，细胞数量是作为活细胞的此类细胞的数量。

在一些实施方案中，细胞的剂量是细胞的平剂量或细胞的固定剂量，使得细胞的剂量与受试者的体表面积或体重无关或不基于受试者的体表面积或体重。

在一些实施方案中，基因工程化细胞的剂量包含从为或约1x10⁵个至为或约2.4x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约1x10⁵个至为或约2.2x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约1x10⁵个至为或约2.0x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约1x10⁵个至为或约1.8x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约1x10⁵个至为或约1.6x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约1x10⁵个至为或约1.4x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约1x10⁵个至为或约1.2x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约1x10⁵个至为或约1.0x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约1x10⁶个至为或约2.4x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约1x10⁶个至为或约2.2x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约1x10⁶个至为或约2.0x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约1x10⁶个至为或约1.8x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约1x10⁶个至为或约1.6x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约1x10⁶个至为或约1.4x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约1x10⁶个至为或约1.2x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约1x10⁶个至为或约1.0x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约5x10⁶个至为或约2.4x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约5x10⁶个至为或约2.2x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约5x10⁶个至为或约2.0x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约5x10⁶个至为或约1.8x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约5x10⁶个至为或约1.6x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约5x10⁶个至为或约1.4x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约5x10⁶个至为或约1.2x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约5x10⁶个至为或约1.0x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约1x10⁷个至为或约2.4x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约1x10⁷个至为或约2.2x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约1x10⁷个至为或约2.0x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约1x10⁷个至为或约1.8x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约1x10⁷个至为或约1.6x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约1x10⁷个至为或约1.4x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约1x10⁷个至为或约1.2x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约1x10⁷个至为或约1.0x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约1.5x10⁷个至为或约2.4x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约1.5x10⁷个至为或约2.2x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约1.5x10⁷个至为或约2.0x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约1.5x10⁷个至为或约1.8x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约1.5x10⁷个至为或约1.6x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约1.5x10⁷个至为或约1.4x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约1.5x10⁷个至为或约1.2x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约1.5x10⁷个至为或约1.0x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约2x10⁷个至为或约2.4x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约2x10⁷个至为或约2.2x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约2x10⁷个至为或约2.0x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约2x10⁷个至为或约1.8x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约2x10⁷个至为或约1.6x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约2x10⁷个至为或约1.4x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约2x10⁷个至为或约1.2x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约2x10⁷个至为或约1.0x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约2.5x10⁷个至为或约2.4x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约2.5x10⁷个至为或约2.2x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约2.5x10⁷个至为或约2.0x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约2.5x10⁷个至为或约1.8x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约2.5x10⁷个至为或约1.6x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约2.5x10⁷个至为或约1.4x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约2.5x10⁷个至为或约1.2x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约2.5x10⁷个至为或约1.0x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约3x10⁷个至为或约2.4x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约3x10⁷个至为或约2.2x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约3x10⁷个至为或约2.0x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约3x10⁷个至为或约1.8x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约3x10⁷个至为或约1.6x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约3x10⁷个至为或约1.4x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约3x10⁷个至为或约1.2x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约3x10⁷个至为或约1.0x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约3.5x10⁷个至为或约2.4x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约3.5x10⁷个至为或约2.2x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约3.5x10⁷个至为或约2.0x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约3.5x10⁷个至为或约1.8x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约3.5x10⁷个至为或约1.6x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约3.5x10⁷个至为或约1.4x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约3.5x10⁷个至为或约1.2x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约3.5x10⁷个至为或约1.0x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约4x10⁷个至为或约2.4x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约4x10⁷个至为或约2.2x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约4x10⁷个至为或约2.0x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约4x10⁷个至为或约1.8x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约4x10⁷个至为或约1.6x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约4x10⁷个至为或约1.4x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约4x10⁷个至为或约1.2x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约4x10⁷个至为或约1.0x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约4.5x10⁷个至为或约2.4x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约4.5x10⁷个至为或约2.2x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约4.5x10⁷个至为或约2.0x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约4.5x10⁷个至为或约1.8x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约4.5x10⁷个至为或约1.6x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约4.5x10⁷个至为或约1.4x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约4.5x10⁷个至为或约1.2x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约4.5x10⁷个至为或约1.0x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约5x10⁷个至为或约2.4x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约5x10⁷个至为或约2.2x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约5x10⁷个至为或约2.0x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约5x10⁷个至为或约1.8x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约5x10⁷个至为或约1.6x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约5x10⁷个至为或约1.4x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约5x10⁷个至为或约1.2x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约5x10⁷个至为或约1.0x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约5.5x10⁷个至为或约2.4x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约5.5x10⁷个至为或约2.2x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约5.5x10⁷个至为或约2.0x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约5.5x10⁷个至为或约1.8x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约5.5x10⁷个至为或约1.6x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约5.5x10⁷个至为或约1.4x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约5.5x10⁷个至为或约1.2x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约5.5x10⁷个至为或约1.0x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约6x10⁷个至为或约2.4x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约6x10⁷个至为或约2.2x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约6x10⁷个至为或约2.0x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约6x10⁷个至为或约1.8x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约6x10⁷个至为或约1.6x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约6x10⁷个至为或约1.4x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约6x10⁷个至为或约1.2x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约6x10⁷个至为或约1.0x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约6.5x10⁷个至为或约2.4x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约6.5x10⁷个至为或约2.2x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约6.5x10⁷个至为或约2.0x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约6.5x10⁷个至为或约1.8x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约6.5x10⁷个至为或约1.6x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约6.5x10⁷个至为或约1.4x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约6.5x10⁷个至为或约1.2x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约6.5x10⁷个至为或约1.0x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约7x10⁷个至为或约2.4x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约7x10⁷个至为或约2.2x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约7x10⁷个至为或约2.0x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约7x10⁷个至为或约1.8x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约7x10⁷个至为或约1.6x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约7x10⁷个至为或约1.4x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约7x10⁷个至为或约1.2x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约7x10⁷个至为或约1.0x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约7.5x10⁷个至为或约2.4x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约7.5x10⁷个至为或约2.2x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约7.5x10⁷个至为或约2.0x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约7.5x10⁷个至为或约1.8x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约7.5x10⁷个至为或约1.6x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约7.5x10⁷个至为或约1.4x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约7.5x10⁷个至为或约1.2x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约7.5x10⁷个至为或约1.0x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约8x10⁷个至为或约2.4x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约8x10⁷个至为或约2.2x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约8x10⁷个至为或约2.0x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约8x10⁷个至为或约1.8x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约8x10⁷个至为或约1.6x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约8x10⁷个至为或约1.4x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约8x10⁷个至为或约1.2x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约8x10⁷个至为或约1.0x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约8.5x10⁷个至为或约2.4x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约8.5x10⁷个至为或约2.2x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约8.5x10⁷个至为或约2.0x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约8.5x10⁷个至为或约1.8x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约8.5x10⁷个至为或约1.6x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约8.5x10⁷个至为或约1.4x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约8.5x10⁷个至为或约1.2x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约8.5x10⁷个至为或约1.0x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约9x10⁷个至为或约2.4x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约9x10⁷个至为或约2.2x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约9x10⁷个至为或约2.0x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约9x10⁷个至为或约1.8x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约9x10⁷个至为或约1.6x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约9x10⁷个至为或约1.4x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约9x10⁷个至为或约1.2x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约9x10⁷个至为或约1.0x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约9.5x10⁷个至为或约2.4x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约9.5x10⁷个至为或约2.2x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约9.5x10⁷个至为或约2.0x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约9.5x10⁷个至为或约1.8x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约9.5x10⁷个至为或约1.6x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约9.5x10⁷个至为或约1.4x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约9.5x10⁷个至为或约1.2x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、或从为或约9.5x10⁷个至为或约1.0x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞。在一些实施方案中，细胞的数量是作为活细胞(诸如活T细胞)的此类细胞的数量。在一些实施方案中，细胞数量是作为CD3+细胞的此类细胞的数量。在一些实施方案中，细胞数量是作为CD4+或CD8+细胞的此类细胞的数量。

在一些实施方案中，基因工程化细胞的剂量包含从为或约1x10⁵个至为或约2.4x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞。在一些实施方案中，基因工程化细胞的剂量包含从为或约5x10⁵个至为或约2.4x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞。在一些实施方案中，基因工程化细胞的剂量包含从为或约1x10⁶个至为或约2.4x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞。在一些实施方案中，基因工程化细胞的剂量包含从为或约5x10⁶个至为或约2.4x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞。在一些实施方案中，基因工程化细胞的剂量包含从为或约1x10⁷个至为或约2.4x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞。在一些实施方案中，基因工程化细胞的剂量包含从为或约1.5x10⁷个至为或约2.4x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞。在一些实施方案中，基因工程化细胞的剂量包含从为或约2x10⁷个至为或约2.4x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞。在一些实施方案中，基因工程化细胞的剂量包含从为或约2.5x10⁷个至为或约2.4x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞。在一些实施方案中，基因工程化细胞的剂量包含从为或约3x10⁷个至为或约2.4x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞。在一些实施方案中，基因工程化细胞的剂量包含从为或约3.5x10⁷个至为或约2.4x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞。在一些实施方案中，基因工程化细胞的剂量包含从为或约4.5x10⁷个至为或约2.4x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞。在一些实施方案中，基因工程化细胞的剂量包含从为或约5.5x10⁷个至为或约2.4x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞。在一些实施方案中，基因工程化细胞的剂量包含从为或约6x10⁷个至为或约2.4x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞。在一些实施方案中，基因工程化细胞的剂量包含从为或约6.5x10⁷个至为或约2.4x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞。在一些实施方案中，基因工程化细胞的剂量包含从为或约7x10⁷个至为或约2.4x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞。在一些实施方案中，基因工程化细胞的剂量包含从为或约7.5x10⁷个至为或约2.4x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞。在一些实施方案中，基因工程化细胞的剂量包含从为或约8x10⁷个至为或约2.4x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞。在一些实施方案中，细胞的数量是作为活细胞(诸如活T细胞)的此类细胞的数量。在一些实施方案中，细胞数量是作为CD3+细胞的此类细胞的数量。在一些实施方案中，细胞数量是作为CD4+或CD8+细胞的此类细胞的数量。

在一些实施方案中，基因工程化细胞的剂量包含从为或约1x10⁵个至为或约1x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约1x10⁵个至为或约0.8x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约1x10⁵个至为或约0.6x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约1x10⁵个至为或约0.4x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约1x10⁵个至为或约0.2x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约1x10⁵个至为或约1.0x10⁷个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约1x10⁵个至为或约0.8x10⁷个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约1x10⁵个至为或约0.6x10⁷个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约1x10⁵个至为或约0.4x10⁷个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约1x10⁵个至为或约0.2x10⁷个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约1x10⁵个至为或约1.0x10⁶个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约1x10⁶个至为或约1.0x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约1x10⁶个至为或约0.8x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约1x10⁶个至为或约0.6x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约1x10⁶个至为或约0.4x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约1x10⁶个至为或约0.2x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约1x10⁶个至为或约1.0x10⁷个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约1x10⁶个至为或约0.8x10⁷个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约1x10⁶个至为或约0.6x10⁷个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约1x10⁶个至为或约0.4x10⁷个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约1x10⁶个至为或约0.2x10⁷个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约5x10⁶个至为或约1.0x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约5x10⁶个至为或约0.8x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约5x10⁶个至为或约0.6x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约5x10⁶个至为或约0.4x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约5x10⁶个至为或约0.2x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约5x10⁶个至为或约1.0x10⁷个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约5x10⁶个至为或约0.8x10⁷个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约5x10⁶个至为或约0.6x10⁷个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约10x10⁶个至为或约1.0x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约10x10⁶个至为或约0.9x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约10x10⁶个至为或约0.8x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约10x10⁶个至为或约0.7x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约10x10⁶个至为或约0.6x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约10x10⁶个至为或约0.5x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约10x10⁶个至为或约0.4x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约10x10⁶个至为或约0.3x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约10x10⁶个至为或约0.2x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约10x10⁶个至为或约15x10⁶个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约15x10⁶个至为或约1.0x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约15x10⁶个至为或约0.9x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约15x10⁶个至为或约0.8x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约15x10⁶个至为或约0.7x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约15x10⁶个至为或约0.6x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约15x10⁶个至为或约0.5x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约15x10⁶个至为或约0.4x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约15x10⁶个至为或约0.3x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约15x10⁶个至为或约0.2x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约20x10⁶个至为或约1.0x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约20x10⁶个至为或约0.9x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约20x10⁶个至为或约0.8x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约20x10⁶个至为或约0.7x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约20x10⁶个至为或约0.6x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约20x10⁶个至为或约0.5x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约20x10⁶个至为或约0.4x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约20x10⁶个至为或约0.3x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约20x10⁶个至为或约25x10⁶个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约25x10⁶个至为或约1.0x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约25x10⁶个至为或约0.9x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约25x10⁶个至为或约0.8x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约25x10⁶个至为或约0.7x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约25x10⁶个至为或约0.6x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约25x10⁶个至为或约0.5x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约25x10⁶个至为或约0.4x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约25x10⁶个至为或约0.3x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约30x10⁶个至为或约1.0x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约30x10⁶个至为或约0.9x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约30x10⁶个至为或约0.8x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约30x10⁶个至为或约0.7x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约30x10⁶个至为或约0.6x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约30x10⁶个至为或约0.5x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约30x10⁶个至为或约0.4x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约30x10⁶个至为或约35x10⁶个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约35x10⁶个至为或约1.0x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约35x10⁶个至为或约0.9x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约35x10⁶个至为或约0.8x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约35x10⁶个至为或约0.7x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约35x10⁶个至为或约0.6x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约35x10⁶个至为或约0.5x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约35x10⁶个至为或约0.4x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约40x10⁶个至为或约1.0x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约40x10⁶个至为或约0.9x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约40x10⁶个至为或约0.8x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约40x10⁶个至为或约0.7x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约40x10⁶个至为或约0.6x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、从为或约40x10⁶个至为或约0.5x10⁸个表达针对BCMA的CAR的总T细胞、或从为或约40x10⁶个至为或约45x10⁶个表达针对BCMA的CAR的总T细胞。在一些实施方案中，细胞的数量是作为活细胞(诸如活T细胞)的此类细胞的数量。

在一些实施方案中，基因工程化细胞的剂量包含至少或至少约1x10⁵个表达针对BCMA的CAR的T细胞、至少或至少约2.5x10⁵个表达针对BCMA的CAR的T细胞、至少或至少约5x10⁵个表达针对BCMA的CAR的T细胞、至少或至少约1x10⁶个表达针对BCMA的CAR的T细胞、至少或至少约2.5x10⁶个表达针对BCMA的CAR的T细胞、至少或至少约5x10⁶个表达针对BCMA的CAR的T细胞、至少或至少约1x10⁷个表达针对BCMA的CAR的T细胞、至少或至少约2.5x10⁷个表达针对BCMA的CAR的T细胞、或至少或至少约5x10⁷个表达针对BCMA的CAR的T细胞。在一些实施方案中，细胞的数量是作为活细胞(诸如活T细胞)的此类细胞的数量。

在一些实施方案中，基因工程化细胞的剂量包含小于或小于约1x10⁵个表达针对BCMA的CAR的T细胞、小于或小于约2.5x10⁵个表达针对BCMA的CAR的T细胞、小于或小于约5x10⁵个表达针对BCMA的CAR的T细胞、小于或小于约1x10⁶个表达针对BCMA的CAR的T细胞、小于或小于约2.5x10⁶个表达针对BCMA的CAR的T细胞、小于或小于约5x10⁶个表达针对BCMA的CAR的T细胞、小于或小于约1x10⁷个表达针对BCMA的CAR的T细胞、小于或小于约1.5x10⁷个表达针对BCMA的CAR的T细胞、小于或小于约2x10⁷个表达针对BCMA的CAR的T细胞、小于或小于约2.5x10⁷个表达针对BCMA的CAR的T细胞、小于或小于约3x10⁷个表达针对BCMA的CAR的T细胞、小于或小于约3.5x10⁷个表达针对BCMA的CAR的T细胞、小于或小于约4x10⁷个表达针对BCMA的CAR的T细胞、小于或小于约4.5x10⁷个表达针对BCMA的CAR的T细胞、或小于或小于约5x10⁷个表达针对BCMA的CAR的T细胞。在一些实施方案中，细胞的数量是作为活细胞(诸如活T细胞)的此类细胞的数量。

在一些实施方案中，细胞疗法包括施用一定剂量，所述剂量包含以下数量的细胞：从或从约1x10⁵至或至约1x10⁸个总重组受体表达细胞或总T细胞、从或从约5x10⁵至或至约5x10⁷个总重组受体表达细胞或总T细胞、或从或从约1x10⁶至或至约1x10⁷个总重组受体表达细胞或总T细胞，每个都包含端值。在一些实施方案中，细胞疗法包括施用一定剂量，所述剂量包含以下数量的细胞：从或从约1x10⁵至或至约1x10⁸个总重组受体表达细胞或总T细胞、从或从约5x10⁵至或至约1x10⁸个总重组受体表达细胞或总T细胞、从或从约1x10⁶至或至约50x10⁶个总重组受体表达细胞或总T细胞、从或从约5x10⁶至或至约45x10⁶个总重组受体表达细胞或总T细胞、或从或从约10x10⁶至或至约25x10⁶个总重组受体表达细胞或总T细胞，每个都包含端值。在一些实施方案中，细胞疗法包括施用一定剂量的细胞，所述剂量包含以下数量的细胞：至少或至少约1x10⁵个总重组受体表达细胞或总T细胞，如至少或至少1x10⁶个、至少或至少约1x10⁷个、至少或至少约1x10⁸个此类细胞。在一些实施方案中，细胞的数量是作为活细胞(诸如活T细胞)的此类细胞的数量。

在一些实施方案中，例如，在受试者是人的情况下，所述剂量包含大于或大于约5×10⁶个总CAR表达(CAR+)细胞、T细胞或外周血单核细胞(PBMC)且少于或少于约100×10⁶个总CAR表达细胞、T细胞或PBMC。在一些实施方案中，基因工程化细胞的剂量包含从为或约5×10⁶个至为或约10×10⁶个总CAR表达(CAR+)T细胞、从为或约10×10⁶个至为或约15×10⁶个CAR+T细胞、从为或约15×10⁶个至为或约20×10⁶个CAR+T细胞、从为或约20×10⁶个至为或约25×10⁶个CAR+T细胞、从为或约25×10⁶个至为或约30×10⁶个CAR+T细胞、从为或约30×10⁶个至为或约35×10⁶个CAR+T细胞、从为或约35×10⁶个至为或约40×10⁶个CAR+T细胞、从为或约40×10⁶个至为或约45×10⁶个CAR+T细胞、从为或约45×10⁶个至为或约50×10⁶个CAR+T细胞、从为或约50×10⁶个至为或约55×10⁶个CAR+T细胞、从为或约55×10⁶个至为或约60×10⁶个CAR+T细胞、从为或约60×10⁶个至为或约65×10⁶个CAR+T细胞、从为或约65×10⁶个至为或约70×10⁶个CAR+T细胞、从为或约70×10⁶个至为或约75×10⁶个CAR+T细胞、从为或约75×10⁶个至为或约80×10⁶个CAR+T细胞、从为或约80×10⁶个至为或约85×10⁶个CAR+T细胞、从为或约85×10⁶个至为或约90×10⁶个CAR+T细胞、从为或约90×10⁶个至为或约95×10⁶个CAR+T细胞、或从为或约95×10⁶个至为或约100×10⁶个CAR+T细胞，每个都包含端值。在任何前述实施方案中，CAR+T细胞表达靶向BCMA的CAR，诸如衍生自BCMA-55的CAR。

在一些实施方案中，例如，在受试者是人的情况下，所述剂量包含为或约5×10⁶个总重组受体(例如，CAR)表达细胞、T细胞或外周血单核细胞(PBMC)。在一些实施方案中，例如，在受试者是人的情况下，所述剂量包含为或约10×10⁶个总重组受体(例如，CAR)表达细胞、T细胞或外周血单核细胞(PBMC)。在一些实施方案中，例如，在受试者是人的情况下，所述剂量包含为或约20×10⁶个总重组受体(例如，CAR)表达细胞、T细胞或外周血单核细胞(PBMC)。在一些实施方案中，例如，在受试者是人的情况下，所述剂量包含为或约30×10⁶个总重组受体(例如，CAR)表达细胞、T细胞或外周血单核细胞(PBMC)。在一些实施方案中，例如，在受试者是人的情况下，所述剂量包含为或约40×10⁶个总重组受体(例如，CAR)表达细胞、T细胞或外周血单核细胞(PBMC)。在一些实施方案中，例如，在受试者是人的情况下，所述剂量包含为或约60×10⁶个总重组受体(例如，CAR)表达细胞、T细胞或外周血单核细胞(PBMC)。在一些实施方案中，例如，在受试者是人的情况下，所述剂量包含为或约80×10⁶个总重组受体(例如，CAR)表达细胞、T细胞或外周血单核细胞(PBMC)。

在一些实施方案中，所述数量参考CD3+或CD8+的总数，在一些情况下，也参考CAR表达(CAR+)细胞。在一些实施方案中，基因工程化细胞的剂量包含从为或约1x10⁷个至为或约1.5x10⁷个CD3+或CD8+总T细胞或CD3+或CD8+CAR表达细胞、从为或约1.5x10⁷个至为或约2x10⁷个CD3+或CD8+总T细胞或CD3+或CD8+CAR表达细胞、从为或约2x10⁷个至为或约2.5x10⁷个CD3+或CD8+总T细胞或CD3+或CD8+CAR表达细胞、从为或约2.5x10⁷个至为或约3x10⁷个CD3+或CD8+总T细胞或CD3+或CD8+CAR表达细胞、从为或约3x10⁷个至为或约3.5x10⁷个CD3+或CD8+总T细胞或CD3+或CD8+CAR表达细胞、从为或约3.5x10⁷个至为或约4x10⁷个CD3+或CD8+总T细胞或CD3+或CD8+CAR表达细胞、从为或约4x10⁷个至为或约4.5x10⁷个CD3+或CD8+总T细胞或CD3+或CD8+CAR表达细胞、从为或约4.5x10⁷个至为或约5x10⁷个CD3+或CD8+总T细胞或CD3+或CD8+CAR表达细胞、从为或约5x10⁷个至为或约5.5x10⁷个CD3+或CD8+总T细胞或CD3+或CD8+CAR表达细胞、从为或约5.5x10⁷个至为或约6x10⁷个CD3+或CD8+总T细胞或CD3+或CD8+CAR表达细胞、从为或约6x10⁷个至为或约6.5x10⁷个CD3+或CD8+总T细胞或CD3+或CD8+CAR表达细胞、从为或约6.5x10⁷个至为或约7.5x10⁷个CD3+或CD8+总T细胞或CD3+或CD8+CAR表达细胞,或从为或约7.5x10⁷个至为或约8x10⁷个CD3+或CD8+总T细胞或CD3+或CD8+CAR表达细胞，每个都包含端值。

在一些实施方案中，基因工程化细胞的剂量参考CD3+CAR表达(CAR+)细胞或CD4+/CD8+CAR表达(CAR+)细胞的总数。在一些实施方案中，基因工程化细胞的剂量包含从为或约1x10⁷个至为或约1.5x10⁷个CD3+或CD4+/CD8+总T细胞或CD3+或CD4+/CD8+CAR表达细胞、从为或约1.5x10⁷个至为或约2x10⁷个CD3+或CD4+/CD8+总T细胞或CD3+或CD4+/CD8+CAR表达细胞、从为或约2x10⁷个至为或约2.5x10⁷个CD3+或CD4+/CD8+总T细胞或CD3+或CD4+/CD8+CAR表达细胞、从为或约2.5x10⁷个至为或约3x10⁷个CD3+或CD4+/CD8+总T细胞或CD3+或CD4+/CD8+CAR表达细胞、从为或约3x10⁷个至为或约3.5x10⁷个CD3+或CD4+/CD8+总T细胞或CD3+或CD4+/CD8+CAR表达细胞、从为或约3.5x10⁷个至为或约4x10⁷个CD3+或CD4+/CD8+总T细胞或CD3+或CD4+/CD8+CAR表达细胞、从为或约4x10⁷个至为或约4.5x10⁷个CD3+或CD4+/CD8+总T细胞或CD3+或CD4+/CD8+CAR表达细胞、从为或约4.5x10⁷个至为或约5x10⁷个CD3+或CD4+/CD8+总T细胞或CD3+或CD4+/CD8+CAR表达细胞、从为或约5x10⁷个至为或约5.5x10⁷个CD3+或CD4+/CD8+总T细胞或CD3+或CD4+/CD8+CAR表达细胞、从为或约5.5x10⁷个至为或约6x10⁷个CD3+或CD4+/CD8+总T细胞或CD3+或CD4+/CD8+CAR表达细胞、从为或约6x10⁷个至为或约6.5x10⁷个CD3+或CD4+/CD8+总T细胞或CD3+或CD4+/CD8+CAR表达细胞、从为或约6.5x10⁷个至为或约7.5x10⁷个CD3+或CD4+/CD8+总T细胞或CD3+或CD4+/CD8+CAR表达细胞,或从为或约7.5x10⁷个至为或约8x10⁷个CD3+或CD4+/CD8+总T细胞或CD3+或CD4+/CD8+CAR表达细胞，每个都包含端值。

在一些实施方案中，所述剂量包含为或约1.0x10⁷个、2.0x10⁷个、3.0x10⁷个、4.0x10⁷个、6.0x10⁷个或8.0x10⁷个CD3+或CD4+/CD8+总T细胞或CD3+CAR表达细胞或CD4+/CD8+CAR表达细胞。在一些实施方案中，所述剂量包含为或约1.0x10⁷个、2.0x10⁷个、3.0x10⁷个、4.0x10⁷个、6.0x10⁷个或8.0x10⁷个CD3+CAR表达细胞。在一些实施方案中，所述剂量包含为或约1.0x10⁷个、2.0x10⁷个、3.0x10⁷个、4.0x10⁷个、6.0x10⁷个或8.0x10⁷个CD4+/CD8+CAR表达细胞。

在一些实施方案中，所述剂量在为或约0.5x10⁷个CD3+CAR表达细胞与为或约1.5x10⁷个CD3+CAR表达细胞之间。在一些实施方案中，所述剂量在为或约1.5x10⁷个CD3+CAR表达细胞与为或约2.5x10⁷个CD3+CAR表达细胞之间。在一些实施方案中，所述剂量在为或约2.5x10⁷个CD3+CAR表达细胞与为或约3.5x10⁷个CD3+CAR表达细胞之间。在一些实施方案中，所述剂量在为或约3.5x10⁷个CD3+CAR表达细胞与为或约4.5x10⁷个CD3+CAR表达细胞之间。在一些实施方案中，所述剂量在为或约4.5x10⁷个CD3+CAR表达细胞与为或约5.5x10⁷个CD3+CAR表达细胞之间。在一些实施方案中，所述剂量在为或约5.5x10⁷个CD3+CAR表达细胞与为或约6.5x10⁷个CD3+CAR表达细胞之间。在一些实施方案中，所述剂量在为或约6.5x10⁷个CD3+CAR表达细胞与为或约7.5x10⁷个CD3+CAR表达细胞之间。在一些实施方案中，所述剂量在为或约7.5x10⁷个CD3+CAR表达细胞与为或约8.5x10⁷个CD3+CAR表达细胞之间。在一些实施方案中，所述剂量在为或约8.5x10⁷个CD3+CAR表达细胞与为或约9.5x10⁷个CD3+CAR表达细胞之间。在一些实施方案中，所述剂量在为或约9.5x10⁷个CD3+CAR表达细胞与为或约10.5x10⁷个CD3+CAR表达细胞之间。在一些实施方案中，所述剂量在为或约10.5x10⁷个CD3+CAR表达细胞与为或约11.5x10⁷个CD3+CAR表达细胞之间。在一些实施方案中，所述剂量在为或约11.5x10⁷个CD3+CAR表达细胞与为或约12.5x10⁷个CD3+CAR表达细胞之间。在一些实施方案中，所述剂量在为或约12.5x10⁷个CD3+CAR表达细胞与为或约13.5x10⁷个CD3+CAR表达细胞之间。在一些实施方案中，所述剂量在为或约13.5x10⁷个CD3+CAR表达细胞与为或约14.5x10⁷个CD3+CAR表达细胞之间。在一些实施方案中，所述剂量在为或约14.5x10⁷个CD3+CAR表达细胞与为或约15.5x10⁷个CD3+CAR表达细胞之间。在一些实施方案中，所述剂量在为或约15.5x10⁷个CD3+CAR表达细胞与为或约16.5x10⁷个CD3+CAR表达细胞之间。在一些实施方案中，所述剂量在为或约16.5x10⁷个CD3+CAR表达细胞与为或约17.5x10⁷个CD3+CAR表达细胞之间。在一些实施方案中，所述剂量在为或约17.5x10⁷个CD3+CAR表达细胞与为或约18.5x10⁷个CD3+CAR表达细胞之间。在一些实施方案中，所述剂量在为或约18.5x10⁷个CD3+CAR表达细胞与为或约19.5x10⁷个CD3+CAR表达细胞之间。在一些实施方案中，所述剂量在为或约19.5x10⁷个CD3+CAR表达细胞与为或约20.5x10⁷个CD3+CAR表达细胞之间。在一些实施方案中，所述剂量在为或约20.5x10⁷个CD3+CAR表达细胞与为或约21.5x10⁷个CD3+CAR表达细胞之间。在一些实施方案中，所述剂量在为或约21.5x10⁷个CD3+CAR表达细胞与为或约22.5x10⁷个CD3+CAR表达细胞之间。在一些实施方案中，所述剂量在为或约22.5x10⁷个CD3+CAR表达细胞与为或约23.5x10⁷个CD3+CAR表达细胞之间。

在一些实施方案中，所述剂量是为或约1.0x10⁷个CD3+CAR表达细胞、为或约2.0x10⁷个CD3+CAR表达细胞、为或约3.0x10⁷个CD3+CAR表达细胞、为或约4.0x10⁷个CD3+CAR表达细胞、为或约5.0x10⁷个CD3+CAR表达细胞、为或约6.0x10⁷个CD3+CAR表达细胞、为或约7.0x10⁷个CD3+CAR表达细胞、为或约8.0x10⁷个CD3+CAR表达细胞、为或约9.0x10⁷个CD3+CAR表达细胞、为或约10.0x10⁷个CD3+CAR表达细胞、为或约11.0x10⁷个CD3+CAR表达细胞、为或约12.0x10⁷个CD3+CAR表达细胞、为或约13.0x10⁷个CD3+CAR表达细胞、为或约14.0x10⁷个CD3+CAR表达细胞、为或约15.0x10⁷个CD3+CAR表达细胞、为或约16.0x10⁷个CD3+CAR表达细胞、为或约17.0x10⁷个CD3+CAR表达细胞、为或约18.0x10⁷个CD3+CAR表达细胞、为或约19.0x10⁷个CD3+CAR表达细胞、为或约20.0x10⁷个CD3+CAR表达细胞、为或约21.0x10⁷个CD3+CAR表达细胞、为或约22.0x10⁷个CD3+CAR表达细胞、为或约23.0x10⁷个CD3+CAR表达细胞、或为或约24.0x10⁷CD3+CAR表达细胞。

在一些实施方案中，所述剂量是为或约1.0x10⁷个CD3+CAR表达细胞。在一些实施方案中，所述剂量是为或约2.0x10⁷个CD3+CAR表达细胞。在一些实施方案中，所述剂量是为或约3.0x10⁷个CD3+CAR表达细胞。在一些实施方案中，所述剂量是为或约4.0x10⁷个CD3+CAR表达细胞。在一些实施方案中，所述剂量是为或约6.0x10⁷个CD3+CAR表达细胞。在一些实施方案中，所述剂量是为或约8.0x10⁸个CD3+CAR表达细胞。

在一些实施方案中，所述剂量是为或约8.0x10⁷个CD3+CAR表达细胞。在一些实施方案中，所述剂量是为或约16.0x10⁷个CD3+CAR表达细胞。

在一些实施方案中，所述剂量是为或约1.0x10⁷个CD4+/CD8+CAR表达细胞。在一些实施方案中，所述剂量是为或约2.0x10⁷个CD4+/CD8+CAR表达细胞。在一些实施方案中，所述剂量是为或约3.0x10⁷个CD4+/CD8+CAR表达细胞。在一些实施方案中，所述剂量是为或约4.0x10⁷个CD4+/CD8+CAR表达细胞。在一些实施方案中，所述剂量是为或约6.0x10⁷个CD4+/CD8+CAR表达细胞。在一些实施方案中，所述剂量是为或约8.0x10⁸个CD4+/CD8+CAR表达细胞。

在一些实施方案中，所述剂量是为或约8.0x10⁷个CD4+/CD8+CAR表达细胞。在一些实施方案中，所述剂量是为或约16.0x10⁷个CD4+/CD8+CAR表达细胞.。

在一些实施方案中，将细胞(例如重组受体表达T细胞)的剂量作为单剂量施用于受试者，或者在两周、一个月、三个月、六个月、1年或更长时间的时间段内仅施用一次。在一些实施方案中，向患者施用多个剂量，并且每个剂量或总剂量可以在任何前述值内。

在一些实施方案中，用于施用的工程化细胞或用于施用的工程化细胞的组合物展现出指示细胞健康或与细胞健康一致的特性。在一些实施方案中，这种剂量的为或约或至少或至少约70％、75％、80％、85％或90％的CAR+细胞展现出指示细胞健康或生物活性CAR细胞的一种或多种特性或表型，诸如不存在凋亡标记的表达。

在特定实施方案中，所述表型是或包括凋亡的不存在和/或细胞正在经历凋亡过程的指征。凋亡是程序性细胞死亡的过程，其包括一系列刻板的形态和生化事件，所述事件导致特征性的细胞变化和死亡，包括起泡、细胞收缩、核分裂、染色质凝聚、染色体DNA片段化和整体mRNA衰变。在一些方面，凋亡的早期阶段可以由某些半胱天冬酶(例如2、8、9和10)的激活来指示。在一些方面，凋亡的中期至晚期阶段的特征在于膜完整性的进一步丧失、染色质浓缩和DNA片段化，包括生物化学事件诸如半胱天冬酶3、6和7的激活。

在特定实施方案中，所述表型是与程序性细胞死亡相关的一种或多种因子的阴性表达，所述一种或多种因子例如已知启动凋亡的促凋亡因子，例如死亡受体途径的成员、线粒体(固有)途径的激活成员，诸如Bcl-2家族成员(例如Bax、Bad和Bid)以及半胱天冬酶。在某些实施方案中，所述表型是不存在指示物(例如膜联蛋白V分子或通过TUNEL染色)，其当与细胞组合物一起孵育或接触细胞组合物时优先结合经历凋亡的细胞。在一些实施方案中，所述表型是或包括细胞中指示凋亡状态的一种或多种标记的表达。在一些实施方案中，所述表型是缺乏半胱天冬酶(诸如半胱天冬酶3)的表达和/或激活。在一些方面，半胱天冬酶-3的激活指示凋亡的增加或恢复。在某些实施方案中，半胱天冬酶激活可以通过已知方法检测。在一些实施方案中，与激活的半胱天冬酶特异性结合(即，与切割过的多肽特异性结合)的抗体可以用于检测半胱天冬酶激活。在特定实施方案中，所述表型是或包括活性半胱天冬酶3-。在一些实施方案中，所述凋亡标记是检测细胞中与凋亡相关的特征的试剂。在某些实施方案中，所述试剂是膜联蛋白V分子。

在一些实施方案中，用于施用的含有工程化细胞的组合物包含一定数量或量的细胞，所述细胞展现出指示细胞健康或与细胞健康一致的表型。在一些实施方案中，在所述剂量的工程化T细胞中小于约25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的CAR表达T细胞表达凋亡标记、任选地膜联蛋白V或活性半胱天冬酶3。在一些实施方案中，在所述剂量的工程化T细胞中小于5％、4％、3％、2％或1％的CAR表达T细胞表达膜联蛋白V或活性半胱天冬酶3。

在一些实施方案中，将所述细胞、结合分子或重组受体作为组合治疗的一部分施用，诸如与另一种治疗性干预诸如另一种抗体或工程化细胞或受体或药剂(诸如细胞毒性剂或治疗剂)同时施用或以任何顺序依序施用。

在一些实施方案中，所述细胞、结合分子和/或重组受体是与一种或多种另外的治疗剂或结合另一种治疗性干预同时或以任何顺序依序共施用。在一些情境下，将所述细胞与另一种疗法在时间上足够接近地共同施用，使得所述细胞群增强一种或多种另外的治疗剂的效果，或反之亦然。在一些实施方案中，在所述一种或多种另外的治疗剂之前施用所述细胞、结合分子和/或重组受体。在一些实施方案中，在所述一种或多种另外的治疗剂之后施用所述细胞、结合分子和/或重组受体。

B.反应、功效和存活

在一些实施方案中，所施用的剂量和/或频率基于功效和/或反应来确定。在一些实施方案中，通过评价疾病状态来确定功效。用于评估疾病状态的示例性方法包括：通过电泳和免疫固定测量生物液体(诸如血液和/或尿液)中的M蛋白；血液中sFLC(κ和λ)的定量；骨骼检查；并通过正电子发射断层扫描(PET)/计算机断层扫描(CT)对患有髓外疾病的受试者进行成像。在一些实施方案中，可以通过骨髓检查来评价疾病状态。在一些例子中，所施用的剂量和/或频率通过血液和/或骨髓中重组受体或细胞的扩增和持久性来确定。在一些实施方案中，所施用的剂量和/或频率基于重组受体或工程化细胞的抗肿瘤活性来确定。在一些实施方案中，抗肿瘤活性通过总反应率(ORR)和/或国际骨髓瘤工作组(IMWG)统一反应标准来确定(参见Kumar等人(2016)Lancet Oncol17(8):e328-346)。在一些实施方案中，使用微小残留病(MRD)评估来评价反应。在一些实施方案中，MRD可以通过诸如流式细胞术和高通量测序(例如，深度测序)的方法来评估。在一些方面，患有MRD阴性疾病的受试者包括那些在骨髓抽吸物中展现出不存在异常克隆浆细胞的受试者，其通过最低灵敏度为10⁵有核细胞中的1个有核细胞或更高(即10^-5灵敏度)的测定(诸如流式细胞术(下一代流式细胞术；NGF)或高通量测序，例如深度测序或下一代测序(NGS))被排除。

在一些方面，持续的MRD阴性包括在骨髓中(NGF或NGS、或两者)并且通过以下定义的成像展现出MRD阴性的受试者，确认间隔最少1年。后续评价可以用于进一步指定阴性持续时间(例如，5年时MRD阴性)。在一些方面，流式MRD阴性包括使用在多发性骨髓瘤中的MRD检测的EuroFlow标准操作程序(或经过验证的等效方法)在骨髓抽吸物中通过NGF展现出不存在表型异常克隆浆细胞的受试者，其中最低灵敏度为在10⁵个有核细胞中的1个有核细胞或更高。在一些方面，测序MRD阴性包括在骨髓抽吸物中通过NGS展现出不存在克隆浆细胞的受试者，其中克隆的存在被定义为使用LymphoSIGHT平台对骨髓抽吸物进行DNA测序(或经验证的等效方法)后获得的少于两个相同的测序读段，其中最低灵敏度为10⁵个有核细胞中的1个有核细胞或更高。在一些方面，成像加MRD阴性包括展现出如通过NGF或NGS评估的MRD阴性以及在基线或先前的PET/CT时发现的示踪剂摄取增加的每个区域的消失或减少至较小的纵隔血池SUV或减少至小于周围正常组织的受试者(参见Kumar等人(2016)LancetOncol 17(8):e328-346)。

在一些实施方案中，基于施用重组受体或细胞后的反应的持续时间来评价反应。在一些例子中，施用的剂量和/或频率可以基于毒性。在一些实施方案中，可以基于施用重组受体和/或细胞的受试者的健康相关生活质量(HRQoL)来确定剂量和/或频率。在一些实施方案中，施用的剂量和/或频率可以基于上述标准中的任一个来改变，即增加或减少。

在一些方面，评估受试者的存活、特定时间段内的存活、存活程度、无事件或无症状存活的存在或持续时间或无复发存活。在一些实施方案中，评估疾病或病症的任何症状。在一些实施方案中，规定肿瘤负荷的量度。在一些实施方案中，用于确定的示例性参数包括指示肿瘤的改良或改善的特定临床结局。此类参数包括：疾病控制的持续时间，所述疾病控制包括客观反应(OR)、完全反应(CR)、严格的完全反应(sCR)、非常好的部分反应(VGPR)、部分反应(PR)、最小反应(MR)、疾病稳定(SD)、疾病进展(PD)或复发(参见例如，国际骨髓瘤工作组(IMWG)统一反应标准；参见Kumar等人(2016)Lancet Oncol 17(8):e328-346)、客观反应率(ORR)、无进展生存期(PFS)和总生存期(OS)。在一些实施方案中，使用微小残留病(MRD)评估来评价反应。可以设定参数的具体阈值以确定本文提供的方法的功效。在一些实施方案中，待治疗的疾病或障碍是多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，多发性骨髓瘤的可测量疾病标准可以包括：(1)血清M蛋白1g/dL或更高；(2)尿M蛋白200mg或更高/24小时；(3)涉及的血清游离轻链(sFLC)水平10mg/dL或更高，具有异常的κ与λ比率。在一些情况下，轻链疾病仅适用于血清或尿液中没有可测量疾病的受试者。

在一些方面，例如，根据所提供的实施方案，对所述疗法的反应可以在开始施用所述细胞疗法之后的指定时间点测量。在一些实施方案中，所述指定时间点是在开始所述施用后为或约1、2、3、6、9、12、18、24、30或36个月或者在任何前述值限定的范围内。在一些实施方案中，所述指定时间点是在开始所述施用后4、8、12、16、20、24、28、32、36、48或52周月或者在任何前述值限定的范围内。在一些实施方案中，所述指定时间点是在开始所述施用后为或约1个月。在一些实施方案中，所述指定时间点是在开始所述施用后为或约3个月。在一些实施方案中，所述指定时间点是在开始所述施用后为或约6个月。在一些实施方案中，所述指定时间点是在开始所述施用后为或约9个月。在一些实施方案中，所述指定时间点是在开始所述施用后为或约12个月。

在一些实施方案中，与在所述指定时间点测定的反应或结局相比，在初始指定时间点之后为或约3、6、9或12个月时测定的反应或结局是相等的或改善的。例如，在一些方面，如果在初始指定时间点确定的反应或结局是疾病稳定(SD)、疾病进展(PD)或复发，则根据所提供的实施方案治疗的受试者可以在随后的时间点、在初次指定时间点之后的3、6、9或12个月之后显示相等或改善的反应或结局(例如，根据国际骨髓瘤工作组(IMWG)统一反应标准展现出更好的反应结局；参见Kumar等人(2016)Lancet Oncol 17(8):e328-346)，其等于在初始指定时间点的反应或结局或者作为客观反应(OR)、完全反应(CR)、严格的完全反应(sCR)、非常好的部分反应(VGPR)或部分反应(PR)的反应或结局。在一些方面，根据所提供的实施方案治疗的受试者可以在两个确定时间点之间显示改善的反应或结局。在一些方面，所述受试者可以在用于评估的初始指定时间点(例如，在施用开始后4周)展现出PR或VGPR，然后在稍后的时间点(例如，开始施用后12周)展现出改善的反应，诸如CR或sCR。在一些方面，无进展生存期(PFS)被描述为在疾病(诸如癌症)治疗期间和之后受试者带病生存但所述疾病不恶化的时间长度。在一些方面，客观反应(OR)被描述为可测量的反应。在一些方面，客观反应率(ORR；在一些情况下也称为总反应率)被描述为实现CR或PR的患者的比例。在一些方面，总生存期(OS)被描述为从诊断日期或疾病(诸如癌症)治疗开始日期起，被诊断患有所述疾病的受试者仍然存活的时间长度。在一些方面，无事件生存期(EFS)被描述为在癌症治疗结束后，受试者保持没有所述治疗意图预防或延迟的某些并发症或事件的时间长度。这些事件可以包括癌症的复发或某些症状的发作，诸如已经扩散到骨骼的癌症引起的骨痛，或死亡。

在一些实施方案中，反应持续时间(DOR)的量度包括从记录到肿瘤反应至疾病进展的时间。在一些实施方案中，用于评估反应的参数可以包括持久反应，例如，从开始疗法起一段时间之后持续存在的反应。在一些实施方案中，持久反应是由在开始疗法之后大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18或24个月的反应率来指示。在一些实施方案中，所述反应或结局可持续大于或大于约3、6、9或12个月。

在一些实施方案中，东部肿瘤协作组(ECOG)体能状态指示物可以用于评估或选择用于治疗的受试者，例如，因先前疗法而具有较差体能的受试者(参见例如，Oken等人(1982)Am J Clin Oncol.5:649-655)。ECOG体能状态量表描述患者在其自理能力、日常活动和体能(例如，步行、工作等)方面的机能水平。在一些实施方案中，ECOG体能状态为0指示受试者可以进行正常活动。在一些方面，ECOG体能状态为1的受试者展现出体力活动的一些限制，但是所述受试者完全能走动。在一些方面，ECOG体能状态为2的患者能走动超过50％。在一些情况下，ECOG体能状态为2的受试者也可能能够自理；参见例如，

等人,(1993)Br J Cancer 67(4)773-775。在一些实施方案中，将根据本文提供的方法或治疗方案施用的受试者包括ECOG体能状态为0或1的受试者。

在一些实施方案中，尽管受试者已经对另一种疗法产生耐药性，但根据所提供的方法的施用有效地治疗了所述受试者。在一些实施方案中，当根据本文所述的实施方案施用于受试者时，所述剂量或所述组合物能够在至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％被施用的受试者中实现客观反应(OR)。在一些实施方案中，OR包括实现严格的完全反应(sCR)、完全反应(CR)、非常好的部分反应(VGPR)、部分反应(PR)和最小反应(MR)的受试者。在一些实施方案中，当根据本文所述的实施方案施用于受试者时，所述剂量或所述组合物能够在至少50％、60％、70％、80％或85％被施用的受试者中实现严格的完全反应(sCR)、完全反应(CR)、非常好的部分反应(VGPR)或部分反应(PR)。在一些实施方案中，当根据本文所述的实施方案施用于受试者时，所述剂量或组合物能够在至少20％、30％、40％、50％、60％或70％被施用的受试者中实现严格的完全反应(sCR)或完全反应(CR)。在一些方面，对例如根据本文提供的方法的治疗的特定反应可以基于国际骨髓瘤工作组(IMWG)统一反应标准来评估(参见Kumar等人(2016)Lancet Oncol 17(8):e328-346)。

在一些实施方案中，尽管受试者已经对另一种疗法产生耐药性，但根据所提供的方法的施用有效地治疗了所述受试者。在一些实施方案中，至少30％、至少35％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％或至少80％的根据所述方法治疗的受试者实现了完全缓解(CR)。在一些实施方案中，至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少80％或至少90％的根据所述方法治疗的受试者实现了客观反应(OR)。在一些实施方案中，至少或至少约50％的根据所述方法治疗的受试者、至少或至少约60％的受试者、至少或至少约70％的受试者、至少或至少约80％的受试者或者至少或至少约90％的受试者实现了CR和/或实现了客观反应(OR)。在一些实施方案中，评估有效治疗的标准包括总反应率(ORR；在一些情况下也称为客观反应率)、完全反应(CR；在一些情况下也称为完全缓解)、反应持续时间(DOR)、无进展生存期(PFS)和/或总生存期(OS)。

在一些实施方案中，至少40％或至少50％的根据本文所提供的方法治疗的受试者实现了完全缓解(CR；在一些情况下也称为完全反应)，展现出大于或大于约3个月、6个月或12个月或大于13个月或大约14个月的无进展生存期(PFS)和/或总生存期(OS)；平均而言，根据所述方法治疗的受试者展现出大于或大于约6个月、12个月或18个月的中值PFS或OS；和/或所述受试者在疗法后展现出至少或至少约6、12、18或更多个月或更长时间的PFS或OS。

在一些实施方案中，根据所提供的方法治疗的受试者展现出至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的CRR。在一些实施方案中，将完全反应率(CRR)计算为具有长达12个月、长达18个月、长达24个月、长达36个月或更长时间的最佳总体反应(BOR)的受试者的百分比。

C.毒性

在一些实施方案中，例如，与施用替代性细胞疗法(诸如替代性CAR⁺T细胞组合物)和/或细胞的替代性给药(例如，不以限定比率施用的细胞给药)相比，所提供的方法被设计为或包括多个特征，所述特征导致较低比率和/或较低程度的毒性、毒性结局或症状、促进毒性的概况、因子或特性，诸如与细胞因子释放综合征(CRS)或神经毒性(NT)相关或指示细胞因子释放综合征(CRS)或神经毒性(NT)的症状或结局。可以根据美国移植和细胞疗法学会(ASTCT)共识分级系统对细胞因子释放综合征(CRS)和神经毒性进行分级(参见例如Lee等人Biol Blood Marrow Transplant.2019年4月；25(4):625-38)。

在一些方面，尽管作为本文所提供方法的一部分施用的工程化T细胞的分化状态较低(例如，较高比例的具有幼稚样或中枢记忆表型的工程化T细胞，诸如选自CCR7⁺CD45RA⁺、CD27⁺CCR7⁺或CD62L^-CCR7⁺的表型)预期比分化程度更高的细胞具有更多活性，但是发现表明可以成功管理细胞疗法的安全性。在一些方面，诸如与通过细胞具有更高分化的过程(诸如包括细胞扩增的过程)产生的细胞组合物相比，提供较低剂量的组合物可以实现稳健的功效和高安全性。在一些方面，发现可以在维持较低程度的毒性(诸如重度细胞因子释放综合征(CRS)或重度神经毒性的同时施用甚至更高剂量的所提供抗BCMA CAR组合物的细胞。因此，在一些实施方案中，与包括施用替代性细胞疗法(诸如具有比本文施用的那些分化程度更高的工程性T细胞的替代性CAR⁺T细胞组合物)的方法相比，所提供的方法包括施用较高剂量的工程化T细胞(例如，大于50×10⁶个CAR表达T细胞，诸如为或约100×10⁶个CAR表达T细胞、160×10⁶个CAR表达T细胞或200×10⁶个CAR表达T细胞)。

在一些实施方案中，诸如与某些其他细胞疗法相比，所提供的方法不导致高比率或可能性的毒性或毒性结局，或者降低毒性或毒性结局(诸如神经毒性(NT)、细胞因子释放综合征(CRS))的比率或可能性。在一些实施方案中，所述方法不导致以下事件或不增加以下事件的风险：重度NT(sNT)、重度CRS(sCRS)、巨噬细胞激活综合征、肿瘤溶解综合征、至少或至少约38摄氏度发热三天或更多天、以及至少或至少约20mg/dL的血浆CRP水平。在一些实施方案中，大于或大于约30％、35％、40％、50％、55％、60％或更多的根据所提供的方法治疗的受试者不展现任何级别的CRS或任何级别的神经毒性。在一些实施方案中，不超过50％的所治疗受试者(例如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多的所治疗受试者)展现出大于2级的细胞因子释放综合征(CRS)和/或大于2级的神经毒性。在一些实施方案中，至少50％的根据所述方法治疗的受试者(例如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多的所治疗受试者)不展现严重毒性结局(例如重度CRS或重度神经毒性)，诸如不展现3级或更高级别神经毒性和/或不展现重度CRS，或者在所述治疗后的某个时间段内(诸如在所述细胞施用的一周、两周或一个月内)未展现上述情况。在一些实施方案中，被评估以确定某些毒性的参数包括不良事件(AE)、剂量限制性毒性(DLT)、CRS和NT。

施用过继T细胞疗法诸如用表达嵌合抗原受体的T细胞进行的治疗可以诱导毒性作用或结局，诸如细胞因子释放综合征和神经毒性。在一些例子中，此类效果或结局与高水平的循环细胞因子并行，高水平的循环细胞因子可能是观察到的毒性的基础。

在一些方面，毒性结局是细胞因子释放综合征(CRS)或重度CRS(sCRS)，或与细胞因子释放综合征(CRS)或重度CRS(sCRS)相关，或指示细胞因子释放综合征(CRS)或重度CRS(sCRS)。在一些情况下，在过继T细胞疗法和向受试者施用其他生物制品后可发生CRS，例如sCRS。参见Davila等人,Sci Transl Med 6,224ra25(2014)；Brentjens等人,Sci.Transl.Med.5,177ra38(2013)；Grupp等人,N.Engl.J.Med.368,1509-1518(2013)；和Kochenderfer等人,Blood 119,2709-2720(2012)；Xu等人,Cancer Letters 343(2014)172-78。

通常，CRS由例如通过T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞和/或巨噬细胞介导的过度的全身免疫应答引起。此类细胞可以释放大量炎性介质，诸如细胞因子和趋化因子。细胞因子可能引发急性炎症反应和/或诱导内皮器官损伤，所述内皮器官损伤可能导致微血管渗漏、心力衰竭或死亡。重度的危及生命的CRS可能导致肺浸润和肺损伤、肾衰竭或弥散性血管内凝血。其他重度的危及生命的毒性可以包括心脏毒性、呼吸窘迫、神经毒性和/或肝衰竭。在一些方面，发热、特别是高热(≥38.5℃或≥101.3°F)与CRS或其风险相关。在一些情况下，CRS的特征或症状类似于感染。在一些实施方案中，在呈现CRS症状的受试者中也考虑感染，并且可以施用通过培养监测和经验性抗生素疗法。与CRS相关的其他症状可以包括心功能障碍、成人呼吸窘迫综合征、肾和/或肝衰竭、凝血障碍、弥散性血管内凝血和毛细血管渗漏综合征。

可以使用抗炎疗法(诸如抗IL-6疗法，例如，抗IL-6抗体，例如，托珠单抗)或抗生素或如所述的其他药剂治疗CRS。CRS的结局、体征和症状是已知的，并且包括本文所述的那些。在一些实施方案中，在特定剂量方案或施用实现或不实现给定的CRS相关结局、体征或症状的情况下，可以指定特定结局、体征和症状和/或其量或程度。

在施用CAR表达细胞的情况下，CRS通常发生在输注表达CAR的细胞后6-20天时。参见Xu等人,Cancer Letters 343(2014)172-78。在一些情况下，CRS在CAR T细胞输注后少于6天或超过20天时发生。CRS的发生率和时机可能与在输注时的基线细胞因子水平或肿瘤负荷有关。通常，CRS包括干扰素(IFN)-γ、肿瘤坏死因子(TNF)-α和/或白介素(IL)-2的血清水平升高。可在CRS中快速诱导的其他细胞因子是IL-1β、IL-6、IL-8和IL-10。

与CRS相关的示例性结局包括发热、僵直、寒战、低血压、呼吸困难、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、脑病、ALT/AST升高、肾衰竭、心脏病、缺氧、神经紊乱和死亡。神经系统并发症包括谵妄、癫痫发作样活动、意识错乱、找词困难、失语和/或变得迟钝。与CRS相关的其他结局包括疲劳、恶心、头痛、癫痫发作、心动过速、肌痛、皮疹、急性血管渗漏综合征、肝功能损害和肾衰竭。在一些方面，CRS与一种或多种因子(诸如血清铁蛋白、d-二聚体、转氨酶、乳酸脱氢酶和甘油三酯)的增加相关，或与低纤维蛋白原血或肝脾肿大相关。与CRS相关的其他示例性体征或症状包括血流动力学不稳定、发热型嗜中性粒细胞减少症、血清C反应蛋白(CRP)增加、凝血参数(例如，国际标准化比率(INR)、凝血酶原时间(PTI)和/或纤维蛋白原)变化、心脏和其他器官功能的变化、和/或绝对嗜中性粒细胞计数(ANC)。

在一些实施方案中，与CRS相关的结局包括以下中的一种或多种：持续发热，例如指定温度(例如大于或大于约38摄氏度)的发热持续两天或更多天，例如三天或更多天，例如四天或更多天或持续至少连续三天；大于或大于约38摄氏度的发热；细胞因子的升高，诸如至少两种细胞因子(例如，下组中的至少两种：干扰素γ(IFNγ)、GM-CSF、IL-6、IL-10、Flt-3L、分形趋化因子(fracktalkine)和IL-5和/或肿瘤坏死因子α(TNFα))与治疗前水平相比例如至少或至少约75倍的最大倍数变化，或此类细胞因子中至少一种的例如至少或至少约250倍的最大倍数变化；和/或至少一种毒性临床体征，诸如低血压(例如，如通过至少一种静脉内血管活性加压药所测量)；缺氧(例如，血浆氧(PO₂)水平低于或低于约90％)；和/或一种或多种神经病学障碍(包括精神状态变化、迟钝和癫痫发作)。在一些实施方案中，可以与CRS同时观察到神经毒性(NT)。

示例性CRS相关结局包括增加的或高的一种或多种因子(包括细胞因子和趋化因子和与CRS相关的其他因子)的血清水平。示例性结局还包括一种或多种此类因子的合成或分泌的增加。这种合成或分泌可以由T细胞或与T细胞相互作用的细胞(诸如先天免疫细胞或B细胞)进行。

在一些实施方案中，CRS相关的血清因子或CRS相关的结局包括炎性细胞因子和/或趋化因子，包括干扰素γ(IFN-γ)、TNF-a、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、sIL-2Ra、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞炎性蛋白(MIP)-1、肿瘤坏死因子α(TNFα)、IL-6和IL-10、IL-1β、IL-8、IL-2、MIP-1、Flt-3L、分形趋化因子和/或IL-5。在一些实施方案中，所述因子或结局包括C反应蛋白(CRP)。除了作为CRS的早期且易于测量的风险因子外，CRP也是细胞扩增的标记。在一些实施方案中，被测量为具有高水平CRP(诸如≥15mg/dL)的受试者患有CRS。在一些实施方案中，被测量为具有高CRP水平的受试者未患CRS。在一些实施方案中，CRS的量度包括CRP的量度和指示CRS的另一因子。

在一些实施方案中，在CAR治疗之前、期间或之后监测一种或多种炎性细胞因子或趋化因子。在一些方面，所述一种或多种细胞因子或趋化因子包括IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-1β、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、sIL-2Rα、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)或巨噬细胞炎性蛋白(MIP)。在一些实施方案中，监测IFN-γ、TNF-α和IL-6。

已经研发出CRS标准，其显现出与CRS的发作相关联，以预测哪些患者更可能有发生sCRS的风险(参见Davilla等人Science translational medicine.2014；6(224):224ra25)。因素包括发热、缺氧、低血压、神经系统改变、升高的炎性细胞因子的血清水平，所述炎性细胞因子诸如一组七种细胞因子(IFNγ、IL-5、IL-6、IL-10、Flt-3L、分形趋化因子和GM-CSF)，它们的治疗诱导的升高可能与治疗前肿瘤负荷和sCRS症状二者密切相关。关于CRS的诊断和管理的其他指南是已知的(参见例如，Lee等人,Blood.2014；124(2):188-95；Lee等人,Biol Blood Marrow Transplant 2019；25(4):625-38)。

在一些实施方案中，反映CRS级别的标准是下表2中详述的那些标准。

在一些实施方案中，反映CRS等级的标准是下表3中详述的那些。

在一些实施方案中，高剂量血管加压药疗法包括下表4中所述的那些。

在一些实施方案中，毒性结局是重度CRS。在一些实施方案中，毒性结局是不存在重度CRS(例如中度或轻度CRS)。在一些实施方案中，如果在施用后受试者展示以下各项，则认为所述受试者响应于或继发于细胞疗法或其细胞剂量的施用而发生“重度CRS”(“sCRS”)：(1)至少38摄氏度发热持续至少三天；(2)细胞因子升高，其包括(a)与刚刚施用后的水平相比，以下七种细胞因子的组中至少两种的至少75倍的最大倍数变化：干扰素γ(IFNγ)、GM-CSF、IL-6、IL-10、Flt-3L、分形趋化因子和IL-5，和/或(b)与刚刚施用后的水平相比，以下七种细胞因子的组中至少一种的至少250倍的最大倍数变化：干扰素γ(IFNγ)、GM-CSF、IL-6、IL-10、Flt-3L、分形趋化因子和IL-5；和(c)至少一种毒性临床体征，诸如低血压(需要至少一种静脉内血管活性加压药)或缺氧(PO₂<90％)或一种或多种神经病学障碍(包括精神状态变化、迟钝和/或癫痫发作)。在一些实施方案中，重度CRS包括3级或更高级别的CRS，诸如表2和表3中所示。

在一些实施方案中，通过ELISA测量毒性结局(例如，CRS相关结局)的水平(例如CRS指示物的血清水平)。在一些实施方案中，可以测量发热和/或C反应蛋白(CRP)的水平。在一些实施方案中，患有发热且CRP≥15mg/dL的受试者可以被认为具有高风险发生重度CRS。在一些实施方案中，CRS相关血清因子或CRS相关结局包括炎性细胞因子和/或趋化因子的水平和/或浓度的增加，所述炎性细胞因子和/或趋化因子包括Flt-3L、分形趋化因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素1β(IL-1β)、IL-2、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、干扰素γ(IFN-γ)、巨噬细胞炎性蛋白(MIP)-1、MIP-1、sIL-2Rα或肿瘤坏死因子α(TNFα)。在一些实施方案中，所述因子或结局包括C反应蛋白(CRP)。除了作为CRS的早期且易于测量的风险因子外，CRP也是细胞扩增的标记。在一些实施方案中，被测量为具有高水平CRP(诸如≥15mg/dL)的受试者患有CRS。在一些实施方案中，被测量为具有高CRP水平的受试者未患有CRS。在一些实施方案中，CRS的量度包括CRP的量度和指示CRS的另一种因子。

在一些实施方案中，与重度CRS或3级CRS或更高级别(诸如4级或更高级别)相关的结局包括以下中的一种或多种：持续发热，例如指定温度(例如，高于或高于约38摄氏度)的发热持续两天或更多天，例如三天或更多天，例如四天或更多天或持续至少连续三天；高于或高于约38摄氏度的发热；细胞因子的升高，诸如至少两种细胞因子(例如，下组中的至少两种：干扰素γ(IFNγ)、GM-CSF、IL-6、IL-10、Flt-3L、分形趋化因子和IL-5和/或肿瘤坏死因子α(TNFα))与治疗前水平相比的最大倍数变化(例如至少或至少约75倍)，或此类细胞因子中至少一种的最大倍数变化(例如至少或至少约250倍)；和/或至少一种毒性临床体征，诸如低血压(例如，如通过至少一种静脉内血管活性加压药所测量)；缺氧(例如，血浆氧(PO₂)水平低于或低于约90％)；和/或一种或多种神经病学障碍(包括精神状态变化、迟钝和癫痫发作)。在一些实施方案中，重度CRS包括需要在重症监护病房(ICU)中进行管理或护理的CRS。

在一些实施方案中，CRS(诸如重度CRS)包括以下的组合：(1)持续发热(至少38摄氏度的发热至少三天)和(2)至少或至少约20mg/dL的血清CRP水平。在一些实施方案中，CRS涵盖需要使用两种或更多种血管加压药的低血压或需要机械通气的呼吸衰竭。在一些实施方案中，在第二次或后续施用中增加血管加压药的剂量。

在一些实施方案中，重度CRS或3级CRS涵盖丙氨酸转氨酶的增加、天冬氨酸转氨酶的增加、寒战、发热性嗜中性粒细胞减少症、头痛、左心室功能不全、脑病、脑积水和/或震颤。

可以指定测量或检测各种结局的方法。

在一些方面，毒性结局是神经毒性或与神经毒性相关。在一些实施方案中，与神经毒性的临床风险相关的症状包括意识错乱、谵妄、失语、表达性失语、迟钝、肌阵挛、嗜睡、精神状态改变、惊厥、癫痫样活动、癫痫发作(任选地如通过脑电图(EEG)证实)、升高的β淀粉样蛋白(Aβ)水平，升高的谷氨酸水平和升高的氧自由基水平。在一些实施方案中，例如使用1-5级量表基于严重程度对神经毒性进行分级(参见例如，Guido Cavaletti和PaolaMarmiroli Nature Reviews Neurology 6,657-666(2010年12月)；美国国家癌症研究所—常见毒性标准第4.03版(NCI-CTCAE v4.03))。

在一些情形中，神经症状可能是sCRS的最早症状。在一些实施方案中，观察到神经病学症状在细胞疗法输注后5至7天开始。在一些实施方案中，神经病学变化的持续时间可能在3至19天的范围内。在一些情况下，神经病学变化的恢复是在sCRS的其他症状消退后发生。在一些实施方案中，用抗IL-6和/或一种或多种类固醇治疗不会加速神经病学变化消退的时间或程度。

在一些实施方案中，认为受试者响应于或继发于细胞疗法或其细胞剂量的施用而发生“重度神经毒性”，条件是在施用后所述受试者展示以下中的限制自理(例如洗澡、穿衣和脱衣、进食、如厕、服药)的症状：1)外周运动神经病的症状，包括外周运动神经的炎症或退化；2)外周感觉神经病的症状，包括外周感觉神经的炎症或退化、感觉迟钝(诸如感官知觉失真，导致异常和不适感)、神经痛(诸如沿神经或一组神经的剧烈疼痛感)和/或感觉异常(诸如感觉神经元的功能紊乱，导致在不存在刺激物的情况下刺痛、麻木、压迫、冷和暖的异常皮肤感觉)。在一些实施方案中，重度神经毒性包括3级或更高级别神经毒性，诸如表5所示。

在一些实施方案中，与其他方法相比，所述方法减轻与CRS或神经毒性相关的症状。在一些方面，与其他方法相比，所提供的方法减轻与CRS相关的症状、结局或因素，包括与重度CRS或3级或更高级别的CRS相关的症状、结局或因素。例如，根据本发明方法治疗的受试者可能缺乏可检测的CRS(例如，重度CRS或3级或更高级别的CRS)的症状、结局或因素和/或具有减少的所述症状、结局或因素，诸如任何所述的(例如表2和表3中所示的)症状、结局或因素。在一些实施方案中，与通过其他方法治疗的受试者相比，根据本方法治疗的受试者可能具有减轻的神经毒性症状，诸如四肢无力或麻木、记忆、视力和/或智力受损、无法控制的强迫性和/或强制性行为、妄想、头痛、认知和行为问题(包括丧失运动控制、认知退化和自主神经系统功能障碍)以及性功能障碍。在一些实施方案中，根据本方法治疗的受试者可具有减轻的与外周运动神经病、外周感觉神经病、感觉迟钝、神经痛或感觉异常相关的症状。

在一些实施方案中，所述方法减轻与神经毒性相关的结局，包括对神经系统和/或脑的损伤，诸如神经元的死亡。在一些方面，所述方法降低与神经毒性相关的因子(诸如β淀粉样蛋白(Aβ)、谷氨酸和氧自由基)的水平。

在一些实施方案中，所述毒性结局是剂量限制性毒性(DLT)。在一些实施方案中，所述毒性结局是剂量限制性毒性。在一些实施方案中，所述毒性结局是剂量限制性毒性的不存在。在一些实施方案中，剂量限制性毒性(DLT)被定义为任何3级或更高级别的毒性，如通过任何已知或公开的用于评估特定毒性的指南(诸如上述任何指南并且包括国家癌症研究所(NCI)的不良事件通用术语标准(Common Terminology Criteria for AdverseEvents，CTCAE)4.0版)所评估。

在一些实施方案中，通过根据所提供方法和/或用所提供制品或组合物施用一定剂量的T细胞观察到的发生毒性(例如，CRS或神经毒性或重度CRS或神经毒性，例如，3级或更高级别的CRS或神经毒性)的低比率、风险或可能性允许在门诊基础上施用所述细胞疗法。在一些实施方案中，根据所提供方法和/或用所提供制品或组合物施用所述细胞疗法(例如，T细胞(例如，CAR⁺T细胞)的剂量)是在门诊基础上进行，或者不需要使受试者入院，诸如需要过夜停留的入院。

在一些方面，被根据所提供方法和/或用所提供制品或组合物施用所述细胞疗法(例如，T细胞(例如，CAR+T细胞)的剂量)的受试者(包括在门诊基础上治疗的受试者)没有在施用所述细胞剂量之前或与其同时被施用用于治疗任何毒性的干预，除非或直到所述受试者展现毒性(诸如神经毒性或CRS)的体征或症状。用于治疗、延迟、减弱或改善毒性的示例性药剂描述于章节II中。

在一些实施方案中，如果被施用所述细胞疗法(例如，T细胞(例如，CAR⁺T细胞)的剂量)的受试者(包括在门诊基础上治疗的受试者)展现出发热，则给予所述受试者治疗或指示所述受试者接受或施用治疗以减轻发热。在一些实施方案中，将所述受试者的发热表征为所述受试者的体温等于或高于某一阈值温度或水平(或在所述阈值温度或水平下测量)。在一些方面，所述阈值温度是与至少低度发热、与至少中度发热和/或与至少高度发热相关的温度。在一些实施方案中，所述阈值温度是特定的温度或范围。例如，所述阈值温度可以是为或约或至少或至少约38、39、40、41或42摄氏度，和/或可以是为或约38摄氏度至为或约39摄氏度的范围、为或约39摄氏度至为或约40摄氏度的范围、为或约40摄氏度至为或约41度的范围、或为或约41摄氏度至为或约42摄氏度的范围。

在一些实施方案中，被设计为减轻发热的治疗包括用退热药治疗。所述退热药可以包括减轻发热的任何药剂，例如，化合物、组合物或成分，诸如已知具有退热作用的任何数量的药剂中的一种，诸如NSAID(诸如布洛芬、萘普生、酮洛芬和尼美舒利)、水杨酸盐(诸如阿司匹林、水杨酸胆碱、水杨酸镁和水杨酸钠)、扑热息痛、对乙酰氨基酚、安替比林甲胺甲烷、萘丁美酮、非那宗(Phenaxone)、安替比林、退烧药。在一些实施方案中，所述退热药是对乙酰氨基酚。在一些实施方案中，可以长达每四小时以12.5mg/kg的剂量口服或静脉内施用对乙酰氨基酚。在一些实施方案中，所述退热药是或包含布洛芬或阿司匹林。

在一些实施方案中，如果所述发热是持续发热，则向所述受试者施用用于治疗毒性的替代性治疗，诸如下文章节II中所述的任何治疗。对于在门诊基础上治疗的受试者，如果所述受试者已经和/或被确定为患有或患有持续发热，则指示所述受试者返回医院。在一些实施方案中，如果受试者展现出等于或高于相关阈值温度的发热，并且在指定治疗(诸如被设计为减轻发热的治疗，诸如使用退热药(例如，NSAID或水杨酸盐，例如，布洛芬、醋氨酚或阿司匹林)的治疗)后，受试者的发热或体温没有下降，或者没有下降指定量或超过指定量(例如，超过1℃，并且通常没有变动约或超过约0.5℃、0.4℃、0.3℃或0.2℃)的情况下，所述受试者已经和/或被确定为或认为患有持续发热。例如，如果受试者展现或被确定为展现至少或至少约38或39摄氏度的发热，所述发热即使在用诸如对乙酰氨基酚的退热药治疗后，在6小时时间段内、在8小时时间段内、或在12小时时间段内或在24小时时间段内，没有降低或没有降低超过或超过约0.5℃、0.4℃、0.3℃或0.2℃，或降低或降低约1％、2％、3％、4％或5％，则所述受试者被认为具有持续发热。在一些实施方案中，所述退热药的剂量是通常在这种受试者中有效减轻发热或特定类型的发热的剂量，所述特定类型的发热如与细菌或病毒感染(例如，局部或全身感染)相关的发热。

在一些实施方案中，如果受试者展现等于或高于相关阈值温度的发热，并且在受试者的发热或体温没有变动约或超过约1℃，并且通常没有变动约或超过约0.5℃、0.4℃、0.3℃或0.2℃的情况下，所述受试者已经具有和/或被确定为或认为具有持续发热。通常，这种高于或等于某一量的变动的不存在是在给定的时间段内测量(诸如，在24小时、12小时、8小时、6小时、3小时或1小时的时间段内，其可以从发烧的最初体征或最初高于所指示阈值的温度起测量)。例如，在一些实施方案中，如果受试者展现至少或至少约38或39摄氏度的发热，所述发热的温度在6小时时间段内、8小时时间段内、或12小时时间段内或24小时时间段内没有变动超过或超约0.5℃、0.4℃、0.3℃或0.2℃，则所述受试者被认为或被确定为展现持续发热。

在一些实施方案中，所述发热是持续发热；在一些方面，有可能诱导所述毒性的初始疗法(诸如细胞疗法，诸如T细胞(例如CAR⁺T细胞)的剂量)后，在已经确定受试者具有持续发热时(诸如在这种确定或首次这种确定的1、2、3、4、5、6小时或更短时间内)治疗所述受试者。

在一些实施方案中，在例如，如根据任何前述实施方案所测量，在确定或确认(诸如首次确定或确认)所述受试者展现出持续发热时或此前不久的时间，施用用于治疗所述毒性的一种或多种干预或药剂(诸如靶向毒性的疗法)。在一些实施方案中，在这种确认或确定的某一时间段内，诸如在这种确认或确定的30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、6小时或8小时内，施用所述一种或多种靶向毒性的疗法。

II.细胞疗法和工程化细胞

在一些实施方案中，本文公开的细胞疗法(例如，T细胞疗法)包括施用表达重组受体(例如CAR)的工程化细胞，所述重组受体被设计为识别和/或特异性地结合与疾病或病症(诸如r/r/MM)相关的抗原。

在所提供方法和用途的一些实施方案中，所述工程化细胞(诸如T细胞)表达嵌合受体(诸如嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合受体含有将提供针对所期望抗原(例如肿瘤抗原)的特异性的配体结合结构域(例如抗体或抗体片段)与细胞内信号传导结构域组合的一个或多个结构域。

所提供的实施方案包括组合物、制品、化合物、方法和用途，包括靶向或针对BCMA以及表达BCMA的细胞和疾病的那些。观察到BCMA在某些疾病和病症(诸如恶性肿瘤或其组织或细胞，例如，恶性浆细胞(诸如来自所有复发性或新诊断的骨髓瘤患者))上表达，例如不同地表达，例如在正常组织上具有少量表达。所提供的实施方案包括可用于治疗此类疾病和病症和/或用于靶向此类细胞类型的途径，包括编码BCMA结合受体(包括嵌合抗原受体(CAR))的核酸分子和编码的受体(诸如编码的CAR)以及包含其的组合物和制品。所述受体通常可以含有抗原结合结构域，其包括对BCMA具有特异性的抗体(包括抗原结合抗体片段，诸如重链可变区(V_H)、单结构域抗体片段和单链片段，包括scFv)。还提供了细胞，诸如表达此类BCMA结合受体(例如，抗BCMA CAR)和/或含有编码此类受体的核酸的工程化或重组细胞；以及含有此类细胞的组合物和制品和治疗性剂量。还提供了评价、优化、制备和使用一种或多种核酸序列(例如，编码重组BCMA结合受体的核酸序列)的方法。还提供了制备和使用(如在治疗或改善表达BCMA的疾病和病症中)表达或含有重组BCMA结合受体和重组BCMA结合受体编码多核苷酸的细胞(例如，工程化细胞)或含有此类细胞的组合物的方法。

过继细胞疗法(包括涉及施用表达目标疾病或障碍所特有的嵌合受体(诸如嵌合抗原受体(CAR)和/或其他重组抗原受体)的细胞的那些过继细胞疗法以及其他过继免疫细胞疗法和过继T细胞疗法)可以有效治疗癌症和其他疾病和障碍。在某些情况下，过继细胞疗法的可行途径可能并不总是完全令人满意。在一些方面，所施用的细胞的以下能力：识别并结合至靶标(例如，靶抗原，诸如BCMA)，运输、定位至并成功进入受试者、肿瘤和其环境内的适当部位，被激活、扩增、发挥各种效应子功能(包括细胞毒性杀伤和分泌各种因子(诸如细胞因子))，持续(包括长期)存在，分化、转变或参与重新编程为某些表型状态，在清除和再暴露于靶配体或抗原后提供有效且稳健的回忆反应，以及避免或减少耗竭、无反应性、终末分化和/或分化为抑制状态。

在一些方面，用于治疗疾病或障碍(诸如多发性骨髓瘤)的可用途径是复杂的，并且可能并不总是完全令人满意的。在一些方面，选择治疗方案可能取决于许多因素，包括药物可用性、对先前疗法的反应、复发的侵袭性、自体干细胞移植(ASCT)的资格以及复发是在疗法中还是在疗法后发生。在一些方面，MM导致复发和缓解，并且在一些情况下，现有的方案可能导致复发和/或来自治疗的毒性。在一些情况下，患有特别侵袭性疾病的受试者，如在各种疗法之后患有持续性或复发性疾病的受试者、具有高疾病负荷(诸如高肿瘤负荷)的受试者和/或患有特别侵袭性类型的疾病(诸如浆细胞瘤)的受试者可能特别难以治疗，并且这些受试者中对某些疗法的反应可能很差或持续时间短。在一些情况下，已进行大量预治疗的受试者(例如，在若干种不同的先前疗法之后已经复发的受试者)可能展现出低反应率和/或不良事件的高发生率。在一些方面，所提供的实施方案基于以下观察结果：根据所提供的实施方案的治疗导致高反应率、不良事件(例如，毒性)的低发生率、延长的反应、以及在一些情况下随着时间的推移所述反应的改善。

在一些情境下，所提供的实施方案基于来自临床研究的观察结果，即施用表达特定重组受体的工程化细胞(诸如本文所述的那些)导致高反应率和不良事件(诸如细胞因子释放综合征(CRS)或神经病学事件(NE；或神经毒性，NT))的低比率。在一些方面，所提供的细胞、方法和用途导致这样的细胞疗法，其展现出在施用所述细胞之后细胞的延长的持久性以及高反应率和毒性(例如，CRS或NE，诸如3级或更高级别的CRS或者3级或更高级别的神经毒性)的低比率。在一些方面，通过使用各种不同剂量的细胞实现这种高反应和毒性(例如，3级或更级别的CRS或者3级或更高级别的神经毒性)的低比率。例如，即使以相对较低剂量的细胞，也可实现客观反应的高比率和高水平的反应(例如，非常好的部分应答VGPR或更好)。在一些情况下，可以施用相对较高剂量的细胞，并且观察到此类剂量导致客观反应的高比率以及毒性(例如，3级或更高级别的CRS或者3级或更高级别的神经毒性)的低比率。在一些情况下，所提供的实施方案还允许所施用的工程化细胞的改善的扩增和/或持久性，并且在一些情况下导致延长的反应和/或随时间改善的反应。在一些方面，观察到根据所提供的实施方案对患有侵袭性或难治性疾病的受试者(例如，经大量预治疗的受试者、具有高肿瘤负荷的受试者和/或患有侵袭性疾病类型的受试者)的治疗提供了安全、有效且持久的治疗。

在一些情境下，对疗法的最佳反应可以取决于所述工程化重组受体(诸如CAR)在细胞表面上一致且可靠地表达和/或结合所述靶抗原的能力。例如，在一些情况下，来自所引入的转基因(例如，编码所述重组受体)的转录的RNA的异质性可能在用于细胞疗法中的细胞(诸如人T细胞)中表达的一些情况下影响所述重组受体的表达和/或活性。在一些情境下，所述重组受体(诸如CAR)中的间隔子的长度和类型可能影响所述受体的表达、活性和/或功能。

此外，在一些情境下，某些重组受体可以展现出抗原非依赖性活性或信号传导(也称为“基础信号传导(tonic signaling)”)，这可能导致不希望的作用，如由于表达所述重组受体的T细胞的分化增加和/或耗竭。在一些方面，此类活性可能限制T细胞的活性、作用或效力。在一些情况下，在用于重组受体表达的细胞的工程化和离体扩增过程中，所述细胞可能由于通过所述重组受体的基础信号传导而展现出指示耗竭的表型。

在一些情境下，所述重组受体特异性地结合、识别或靶向的特定靶抗原的特性可能影响所述受体的活性。在一些情境下，B细胞成熟抗原(BCMA)通常在恶性浆细胞上表达，并且是细胞疗法的有吸引力的治疗性靶标。在一些情况下，所述BCMA可以被γ分泌酶切割，产生可溶性BCMA(sBCMA)或“脱落”形式的BCMA，从而减少在靶细胞表面上表达的BCMA。在一些情况下，所述BCMA结合分子(诸如抗BCMA嵌合抗原受体)的活性可以通过可溶性BCMA的存在而被阻断或抑制。对于对细胞疗法，特别是特异性地结合、识别或靶向BCMA(诸如在靶细胞表面上表达的BCMA)的重组受体的最佳反应，需要改善的策略。

在一些情境下，所提供的实施方案基于以下观察结果：特定间隔子和核酸序列的优化可以导致所述重组受体的一致且稳健的表达。所提供的BCMA结合重组受体提供了相对于可用的细胞疗法(特别是BCMA靶向细胞疗法)途径的优点。在一些实施方案中，所提供的BCMA结合重组受体含有具有对于结合可溶性BCMA的低亲和力的完全人抗原结合结构域。在一些实施方案中，所提供的BCMA结合重组受体含有经修饰的间隔子，其导致与在靶细胞表面上表达的BCMA的增强的结合。在一些实施方案中，观察到所提供的BCMA结合重组受体展现出降低的抗原非依赖性基础信号传导，这在一些情况下可以导致降低的通过抗原非依赖性信号传导的细胞耗竭，以及通过可溶性BCMA的抑制的缺乏。在一些实施方案中，所提供的BCMA结合重组受体展现出针对表达低密度或低水平的BCMA的靶细胞的活性或效力。

在不同方面，所提供的BCMA结合重组受体、编码此类受体的多核苷酸、工程化细胞和细胞组合物展现出某些所需的特性，其可以克服或抵消某些局限性，所述某些局限性可能降低对细胞疗法(例如，具有表达BCMA结合重组受体的工程化细胞的细胞疗法)的最佳反应。在一些方面，观察到含有表达本文所提供的示例性BCMA结合重组受体的工程化细胞的组合物展现出工程化细胞的细胞健康的一致性，并且所述组合物与改善的临床反应相关。在一些方面，观察到含有表达本文所提供的示例性BCMA结合重组受体的工程化细胞的组合物富集了与中枢记忆T细胞(T_CM)表型相关的免疫细胞亚型(例如CD4+或CD8+T细胞亚型)，所述中枢记忆T细胞在一些方面与工程化细胞的增加的持久性和耐久性相关。在一些情况下，所提供的实施方案(包括所述重组受体、编码此类受体的多核苷酸、工程化细胞和细胞组合物)可以提供相对于靶向BCMA的可用疗法的各种优点，以改善重组受体的活性和对BCMA靶向细胞疗法的反应。另外，已经观察到所述工程化细胞或包含所述工程化细胞的组合物的所提供的方法和用途在治疗受试者方面提供了优点，其在所测试的各种不同剂量水平下导致高反应率、持久反应和低不良事件率。此外，已经观察到所述工程化细胞或包含所述工程化细胞的组合物的所提供的方法和用途在治疗患有特别侵袭性和/或难治性疾病的受试者或者对于针对所述疾病的许多不同的先前治疗已经复发和/或是难治的受试者方面提供了优点。

A.嵌合抗原受体

在一些方面，提供了BCMA结合剂(诸如细胞表面蛋白，诸如结合或识别BCMA分子的重组受体或嵌合抗原受体))和编码BCMA结合细胞表面蛋白(诸如重组受体(例如嵌合抗原受体，CAR))的多核苷酸以及表达此类受体的细胞。BCMA结合细胞表面蛋白通常含有抗体(例如，抗原结合抗体片段)和/或特异性地识别(诸如特异性地结合至)BCMA(诸如BCMA蛋白，诸如人BCMA蛋白)的其他结合肽。在一些方面，所述药剂与BCMA的细胞外部分结合。还提供了包含此类多核苷酸或表达此类受体的细胞(例如，工程化细胞)以及包含此类工程化细胞的组合物。在一些方面，还提供了使用此类细胞和组合物的方法以及其如在治疗方法中的用途。

在一些实施方案中，所述多核苷酸被优化或含有某些特征，所述某些特征被设计用于优化(诸如用于密码子使用)以降低RNA异质性和/或修饰(例如，增加或赋予)编码的受体在细胞产物批次之间更一致的表达(诸如表面表达)。在一些实施方案中，与参考多核苷酸相比，编码BCMA结合细胞表面蛋白的多核苷酸被修饰例如以去除隐秘或隐藏的剪接位点，从而降低RNA异质性。在一些实施方案中，编码BCMA结合细胞表面蛋白的多核苷酸是密码子优化的，如以用于在哺乳动物(例如人)细胞(诸如人T细胞)中表达。在一些方面，当在细胞中表达时，所述经修饰的多核苷酸导致改善的，例如增加的或更均匀或更一致的表达(例如，表面表达)水平。此类多核苷酸可以用于构建体中，以产生表达编码的BCMA结合细胞表面蛋白的工程化细胞。因此，还提供了表达由本文所提供的多核苷酸编码的重组受体的细胞及其在过继细胞疗法(诸如与BCMA表达相关的疾病和障碍(诸如多发性骨髓瘤)的治疗)中的用途。

所提供的多核苷酸包括编码特异性地识别(诸如特异性地结合)BCMA(诸如人BCMA)的重组受体(诸如抗原受体)的那些。在一些方面，还提供了编码的受体(诸如含有BCMA结合多肽的那些)及其组合物和制品以及用途。

所述BCMA结合多肽包括抗体，诸如单链抗体(例如，抗原结合抗体片段)或其部分。在一些实施方案中，所述重组受体是嵌合抗原受体，诸如含有抗BCMA抗体或其抗原结合片段的那些。在任何实施方案中，在所提供的CAR中特异性地识别抗原(例如BCMA)的抗体或抗原结合片段与所述抗原特异性地结合。所提供的多核苷酸可以掺入构建体(诸如脱氧核糖核酸(DNA)或RNA构建体，如可以引入细胞中以表达编码的重组BCMA结合受体的那些)中。

在一些情况下，编码所述BCMA结合受体的多核苷酸含有编码信号肽的信号序列，在一些情况下其在编码所述BCMA结合受体的核酸序列的上游编码或者在编码所述抗原结合结构域的核酸序列的5'末端处接合。在一些情况下，含有编码所述BCMA结合受体(例如，嵌合抗原受体(CAR))的核酸序列的多核苷酸含有编码信号肽的信号序列。在一些方面，所述信号序列可以编码源自天然多肽的信号肽。在其他方面，所述信号序列可能编码异源或非天然信号肽。在一些情况下，编码所述BCMA结合受体的多核苷酸可以含有编码另外的分子(诸如替代标记或其他标记)的核酸序列，或者可以含有另外的组分，诸如启动子、调节元件和/或多顺反子元件。在一些实施方案中，编码所述BCMA结合受体的核酸序列可以与任何另外的组分可操作地连接。

所提供的BCMA结合受体(例如在本文所提供的方法和用途中使用的细胞中表达的)通常含有细胞外结合分子和细胞内信号传导结构域。所提供的结合分子包括含有抗体的多肽，包括含有此类抗体的单链细胞表面蛋白(例如，重组受体，诸如嵌合抗原受体)。

所提供的结合分子(例如，BCMA结合分子)包括包含所提供的抗体或其片段(例如，BCMA结合片段)中的一种的单链细胞表面蛋白，诸如重组受体(例如，抗原受体)。所述重组受体包括特异性地结合或特异性地识别BCMA的抗原受体，诸如含有所提供的抗BCMA抗体(例如抗原结合片段)的抗原受体。所述抗原受体包括功能性非TCR抗原受体，诸如嵌合抗原受体(CAR)。还提供表达重组受体的细胞及其在过继细胞疗法(诸如与BCMA表达相关的疾病和障碍的治疗)中的用途。

示例性抗原受体(包括CAR)以及将此类抗原受体工程化并引入细胞中的方法包括例如以下文献中所述的那些：国际专利申请公开号WO 200014257、WO 2013126726、WO2012/129514、WO 2014031687、WO 2013166321、WO 2013071154、WO 2013123061，美国专利申请公开号US 2002131960、US 2013287748、US 20130149337、美国专利号6,451,995、7,446,190、8,252,592、8,339,645、8,398,282、7,446,179、6,410,319、7,070,995、7,265,209、7,354,762、7,446,191、8,324,353、和8,479,118，以及欧洲专利申请号EP 2537416；和/或以下文献中所述的那些：Sadelain等人，Cancer Discov.2013年4月；3(4):388–398；Davila等人(2013)PLoS ONE 8(4):e61338；Turtle等人,Curr.Opin.Immunol.,2012年10月；24(5):633-39；Wu等人,Cancer,2012March 18(2):160-75。在一些方面，抗原受体包括如美国专利号7,446,190中描述的CAR，以及国际专利申请公开号WO 2014055668中描述的那些。示例性CAR包括任何上述出版物(诸如WO 2014031687、US 8,339,645、US 7,446,179、US 2013/0149337、US 7,446,190和US 8,389,282)中披露的CAR，并且其中抗原结合部分(例如scFv)被如本文所提供的抗体或其抗原结合片段替代。

在一些实施方案中，所提供的CAR具有选自SEQ ID NO:15-20的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:15-20中任一个所示的氨基酸序列展现出至少或约至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所提供的CAR具有SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列展现出至少或约至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所提供的CAR由多核苷酸编码，所述多核苷酸诸如具有SEQ IDNO:9-14中任一个所示的核酸序列或与SEQ ID NO:9-14中任一个所示的核酸序列展现出至少或至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列的多核苷酸。在一些实施方案中，所提供的CAR由多核苷酸编码，所述多核苷酸诸如具有SEQID NO:13和14中任一个所示的核酸序列或与SEQ ID NO:13和14中任一个所示的核酸序列展现出至少或至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列的多核苷酸。在一些实施方案中，所提供的CAR由多核苷酸编码，所述多核苷酸诸如具有SEQ ID NO:13所示的核酸序列或与其展现出至少或至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列的多核苷酸。在一些实施方案中，所提供的CAR由多核苷酸诸如具有SEQ ID NO:13所示的核酸序列的多核苷酸编码。

在一些实施方案中，编码所述抗原结合结构域的核酸包含：(a)SEQ ID NO:30、31、50、51、59、60、82、84、113、115中任一个所示的核苷酸序列；(b)与SEQ ID NO:30、31、50、51、59、60、82、84、113、115中任一个具有至少90％序列同一性的核苷酸序列；或(c)(a)或(b)的简并序列。在一些实施方案中，编码所述抗原结合结构域的核酸包含：(a)编码SEQ ID NO:29、49、58、83、114、127、128、129、130中任一个所示的氨基酸序列的核苷酸序列；(b)与编码SEQ ID NO:29、49、58、83、114、126、127、128、129、130中任一个所示的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列；或(c)(a)或(b)的简并序列。

1.抗原结合结构域

所述嵌合受体包括嵌合抗原受体(CAR)。所述嵌合受体(诸如CAR)通常包含细胞外抗原结合结构域，其包括所提供的抗BCMA抗体中的一种、是所提供的抗BCMA抗体中的一种或包含在所提供的抗BCMA抗体中的一种内或者包含所提供的抗BCMA抗体中的一种。因此，所述嵌合受体(例如CAR)通常在其细胞外部分中包含一个或多个BCMA结合分子，如一个或多个抗原结合片段、结构域或部分，或一个或多个抗体可变区和/或抗体分子(诸如本文所述的那些)。

本文中的术语“抗体”在最广泛的意义上使用，并且包括多克隆和单克隆抗体，包括完整抗体和功能性(抗原结合)抗体片段，包括片段抗原结合(Fab)片段、F(ab')₂片段、Fab'片段、Fv片段、重组IgG(rIgG)片段、能够特异性地结合抗原的重链可变(V_H)区、单链抗体片段(包括单链可变片段(scFv))以及单结构域抗体(例如，sdAb、sdFv、纳米抗体)片段。所述术语涵盖免疫球蛋白的基因工程化的和/或以其他方式修饰的形式，诸如胞内抗体、肽体、嵌合抗体、全人抗体、人源化抗体和异缀合抗体、多特异性(例如，双特异性或三特异性)抗体、双抗体、三抗体和四抗体、串联双scFv、串联三scFv。除非另有说明，否则术语“抗体”应当理解为涵盖其功能抗体片段，在本文也称为“抗原结合片段”。所述术语还涵盖完整或全长抗体，包括任何类别或亚类(包括IgG及其亚类、IgM、IgE、IgA和IgD)的抗体。

术语“互补决定区”和“CDR”与“高变区”或“HVR”同义，在本领域中是已知的，是指抗体可变区内的非连续氨基酸序列，其赋予抗原特异性和/或结合亲和力。通常，在每个重链可变区中有三个CDR(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)，并且在每个轻链可变区中有三个CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)。“框架区”和“FR”在本领域中是已知的，是指重链和轻链的可变区的非CDR部分。通常，在每个全长重链可变区中有四个FR(FR-H1、FR-H2、FR-H3和FR-H4)，并且在每个全长轻链可变区中有四个FR(FR-L1、FR-L2、FR-L3和FR-L4)。

给定CDR或FR的精确氨基酸序列边界可以使用许多熟知的方案中的任一种容易地确定，包括以下文献中所述的那些：Kabat等人(1991),“Sequences of Proteins ofImmunological Interest,”第5版Public Health Service,National Institutes ofHealth,马里兰州贝塞斯达(“Kabat”编号方案)；Al-Lazikani等人,(1997)JMB 273,927-948(“Chothia”编号方案)；MacCallum等人,J.Mol.Biol.262:732-745(1996),“Antibody-antigen interactions:Contact analysis and binding site topography,”J.Mol.Biol.262,732-745”。(“Contact”编号方案)；Lefranc MP等人,“IMGT uniquenumbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Igsuperfamily V-like domains,”Dev Comp Immunol,2003年1月；27(1):55-77(“IMGT”编号方案)；Honegger A and Plückthun A,“Yet another numbering scheme forimmunoglobulin variable domains:an automatic modeling and analysis tool,”JMol Biol,2001年6月8号；309(3):657-70(“Aho”编号方案)；以及Martin等人,“Modelingantibody hypervariable loops:a combined algorithm,”PNAS,1989,86(23):9268-9272(“AbM”编号方案)。

给定CDR或FR的边界可能根据用于鉴定的方案而变化。例如，Kabat方案是基于结构比对，而Chothia方案是基于结构信息。Kabat和Chothia方案的编号都是基于最常见的抗体区域序列长度，其中通过插入字母(例如“30a”)提供插入，并且在一些抗体中出现缺失。这两种方案将某些插入和缺失(“插入缺失(indel)”)放置在不同的位置，从而产生不同的编号。Contact方案是基于对复杂晶体结构的分析，并且在许多方面与Chothia编号方案相似。AbM方案是Kabat与Chothia定义之间的折衷，是基于Oxford Molecular's AbM抗体建模软件使用的方案。

下表6列出了如分别通过Kabat、Chothia、AbM和Contact方案鉴定的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3以及CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3的示例性位置边界。对于CDR-H1，使用Kabat和Chothia两种编号方案列出残基编号。FR位于CDR之间，例如，FR-L1位于CDR-L1之前，FR-L2位于CDR-L1与CDR-L2之间，FR-L3位于CDR-L2与CDR-L3之间，等等。应注意，因为所示的Kabat编号方案在H35A和H35B处放置插入，所以当使用所示的Kabat编号惯例进行编号时，Chothia CDR-H1环的末端根据环的长度在H32与H34之间变化。

1-Kabat等人(1991),“Sequences of Proteins of Immunological Interest,”第5版Public Health Service,National Institutes of Health,马里兰州贝塞斯达

2-Al-Lazikani等人,(1997)JMB 273,927-948

因此，除非另有规定，否则应当理解给定抗体或其区域(诸如其可变区)的“CDR”或“互补决定区”或单独指定的CDR(例如，CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)涵盖如由任何前述方案或其他已知方案所定义的一个(或特定的)互补决定区。例如，在声明特定的CDR(例如，CDR-H3)含有给定V_H或V_L区氨基酸序列中的相应CDR的氨基酸序列的情况下，应理解，这种CDR具有在可变区内的相应CDR(例如，CDR-H3)的序列，如由任何前述方案或其他已知方案所定义的。在一些实施方案中，指定了特定的CDR序列。使用各种编号方案描述所提供抗体的示例性CDR序列，但应当理解，所提供抗体可以包括如根据任何其他上述编号方案或熟练技术人员已知的其他编号方案所描述的CDR。

同样，除非另有规定，否则给定抗体或其区域如其可变区的FR或单独指定的一个或多个FR(例如，FR-H1、FR-H2、FR-H3、FR-H4)应理解为涵盖如任何已知方案所定义的一个(或特定)框架区。在一些情形中，规定用于鉴定特定CDR、FR或多个特定FR或CDR的鉴定方案，诸如通过Kabat、Chothia、AbM、IMGT或Contact方法或其他已知方案定义的CDR。在其他情况下，给出了CDR或FR的特定氨基酸序列。

术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链中参与抗体与抗原的结合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变区(分别为V_H和V_L)通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守的框架区(FR)和三个CDR。(参见例如Kindt等人Kuby Immunology,第6版,W.H.Freeman and Co.,第91页(2007)。单一V_H或V_L结构域可能足以赋予抗原结合特异性。此外，可以使用来自结合抗原的抗体的V_H或V_L结构域分离结合所述特定抗原的抗体，以分别筛选互补的V_L或V_H结构域的文库。参见例如Portolano等人,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等人,Nature 352:624-628(1991)。

包括在所提供的CAR中的抗体包括抗体片段。“抗体片段”或“抗原结合片段”是指除了完整抗体以外的分子，其包含完整抗体的结合完整抗体所结合的抗原的一部分。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')₂；双抗体；线性抗体；重链可变(V_H)区、单链抗体分子(诸如scFv)和仅含有V_H区的单结构域抗体；和由抗体片段形成的多特异性抗体。在一些实施方案中，所提供的CAR中的抗原结合结构域是或包括含有可变重链(V_H)区和可变轻链(V_L)区的抗体片段。在特定实施方案中，抗体是包含重链可变(V_H)区和/或轻链可变(V_L)区的单链抗体片段(例如scFv)。

所述单结构域抗体(sdAb)是包含抗体的全部或部分重链可变区或者全部或部分轻链可变区的抗体片段。在某些实施方案中，所述单结构域抗体是人单结构域抗体。

抗体片段可以通过各种技术制备，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞产生。在一些实施方案中，所述抗体是重组产生的片段，诸如包含天然不存在的排列的片段(诸如具有通过合成接头(例如，肽接头)连接的两个或更多个抗体区或链的那些)，和/或可不通过酶消化天然存在的完整抗体产生的片段。在一些方面，所述抗体片段是scFv。

“人源化”抗体是如下抗体，其中所有或基本上所有CDR氨基酸残基都衍生自非人CDR并且所有或基本上所有FR氨基酸残基都衍生自人FR。人源化抗体任选地可以包括源自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。非人抗体的“人源化形式”是指非人抗体的变体，其已经经历人源化以通常降低对人的免疫原性，同时保留亲代非人抗体的特异性和亲和力。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些FR残基被来自非人抗体(例如，CDR残基所来源的抗体)的相应残基取代，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。

所提供的CAR中包含的抗BCMA抗体包括人抗体。“人抗体”是具有与人或人细胞或者利用人抗体库或其他人抗体编码序列(包括人抗体文库)的非人来源产生的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列的抗体。所述术语不包括包含非人抗原结合区的非人抗体的人源化形式，诸如所有或基本上所有CDR都是非人的那些。所述术语包括人抗体的抗原结合片段。

所述人抗体可以通过将免疫原施用于转基因动物来制备，所述转基因动物已经被修饰以响应于抗原激发产生完整人抗体或具有人可变区的完整抗体。此类动物通常含有人免疫球蛋白基因座的全部或部分，其替代内源免疫球蛋白基因座或者其存在于在染色体外或随机整合到动物的染色体中。在此类转基因动物中，通常内源免疫球蛋白基因座已经失活。所述人抗体也可以来源于含有源自人库的抗体编码序列的人抗体文库，包括噬菌体展示和无细胞文库。

所提供的CAR中包含的抗体包括作为单克隆抗体的那些，包括单克隆抗体片段。如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质抗体的群体(即，构成所述群体的单独抗体是相同的，但含有天然存在的突变或在单克隆抗体制剂的产生期间产生的可能变体除外，此类变体通常以少量存在)获得或在所述群体内的抗体。与通常包括针对不同表位的不同抗体的多克隆抗体制剂形成对比，单克隆抗体制剂的每种单克隆抗体针对抗原上的单一表位。所述术语不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。单克隆抗体可以通过多种技术制备，包括但不限于从杂交瘤产生、重组DNA方法、噬菌体展示和其他抗体展示方法。

在一些实施方案中，所述CAR包含抗体分子的一个或多个BCMA结合部分，诸如抗体的重链可变(V_H)区和/或轻链可变(V_L)区(例如scFv抗体片段)。在一些实施方案中，所提供的BCMA结合CAR含有赋予所提供的CAR的BCMA结合特性的抗体(诸如抗BCMA抗体)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合结构域可以是所述任何抗BCMA抗体或源自所述任何抗BCMA抗体。参见例如，Carpenter等人,Clin Cancer Res.,2013,19(8):2048-2060；WO 2016090320、WO 2016090327、WO 2010104949和WO 2017173256。任何此类抗BCMA抗体或抗原结合片段都可以用于所提供的CAR中。在一些实施方案中，所述抗BCMA CAR含有抗原结合结构域(其是scFv)，所述抗原结合结构域含有源自WO 2016090320或WO2016090327中所述的抗体的可变重链(V_H)区和/或可变轻链(V_L)区。

在一些实施方案中，所述抗体(例如，抗BCMA抗体或抗原结合片段)含有如所述的重链和/或轻链可变(V_H或V_L)区或其足够的抗原结合部分。在一些实施方案中，所述抗BCMA抗体(例如，抗原结合片段)含有V_H区序列或其足够的抗原结合部分，所述V_H区序列或其足够的抗原结合部分含有如所述的CDR-H1、CDR-H2和/或CDR-H3。在一些实施方案中，所述抗BCMA抗体(例如，抗原结合片段)含有V_L区序列或足够的抗原结合部分，所述V_L区序列或足够的抗原结合部分含有如所述的CDR-L1、CDR-L2和/或CDR-L3。在一些实施方案中，所述抗BCMA抗体(例如，抗原结合片段)含有V_H区序列，所述V_H区序列含有如所述的CDR-H1、CDR-H2和/或CDR-H3；并且含有V_L区序列，所述V_L区序列含有如所述的CDR-L1、CDR-L2和/或CDR-L3。所述抗体还包括具有与这样的序列至少或至少约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％相同的序列的那些。

在一些实施方案中，所述抗体是单结构域抗体(sdAb)，所述sdAb仅包含V_H区序列或其足够的抗原结合部分，诸如任何上述V_H序列(例如，CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3和/或CDR-H4)。

在一些实施方案中，包含V_H区的本文所提供的抗体(例如，抗BCMA抗体)或其抗原结合片段还包含轻链或其足够的抗原结合部分。例如，在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含V_H区和V_L区、或V_H和V_L区的足够的抗原结合部分。在此类实施方案中，所述V_H区序列可以是任何上述V_H序列。在一些此类实施方案中，所述抗体是抗原结合片段，诸如Fab或scFv。在一些此类实施方案中，所述抗体是还含有恒定区的全长抗体。

在一些实施方案中，所提供的CAR中的抗体(例如，其抗原结合片段)具有重链可变(V_H)区，所述重链可变区具有选自SEQ ID NO:32、52、61、85、116、125、131中任一个的氨基酸序列，或与选自SEQ ID NO:32、52、61、85、116、125、131中任一个的V_H区氨基酸具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；或者含有存在于这样的V_H序列中的CDR-H1、CDR-H2和/或CDR-H3。在一些实施方案中，所提供的CAR中的抗体或抗体片段具有WO 2016/090327、WO 2016/090320、WO 2017/173256或WO2019/090003中描述的任何抗体或抗体结合片段的V_H区。

在一些实施方案中，所提供的CAR中的抗体(例如，其抗原结合片段)具有轻链可变(V_L)区，所述轻链可变区具有选自SEQ ID NO:33、53、62、88、119、127、132中任一个的氨基酸序列，或与选自SEQ ID NO:33、53、62、88、119、127、132中任一个的V_L区氨基酸具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；或者含有存在于这样的V_L序列中的CDR-L1、CDR-L2和/或CDR-L3。在一些实施方案中，所提供的CAR中的抗体或抗体片段具有WO 2016/090327、WO 2016/090320、WO 2017/173256或WO2019/090003中描述的任何抗体或抗体结合片段的V_L区。

在一些实施方案中，所提供的CAR中的抗体或抗体片段具有WO 2016/090327、WO2016/090320、WO 2017/173256或WO 2019/090003中描述的任何抗体或抗体结合片段的VH区和VL区。在一些实施方案中，所提供的CAR中的抗体或抗体片段是WO 2016/090327、WO2016/090320、WO 2017/173256或WO 2019/090003中描述的任何抗体或抗体结合片段的scFv。

在一些实施方案中，针对BCMA的CAR是如WO 2016/090320、WO 2017/173256或WO2019/090003中任一篇中所描述的抗BCMA CAR。

在一些实施方案中，在所提供的CAR中，所述抗体的V_H和V_L区(例如其抗原结合片段)包含：分别地SEQ ID NO:32和33的氨基酸序列，或分别地与SEQ ID NO:32和33具有至少90％同一性的氨基酸序列；分别地SEQ ID NO:52和53的氨基酸序列，或分别地与SEQ IDNO:52和53具有至少90％同一性的氨基酸序列；分别地SEQ ID NO:61和62的氨基酸序列，或分别地与SEQ ID NO:61和62具有至少90％同一性的氨基酸序列；分别地SEQ ID NO:85和88的氨基酸序列，或分别地与SEQ ID NO:85和88具有至少90％同一性的氨基酸序列：分别地SEQ ID NO:116和119的氨基酸序列，或分别地与SEQ ID NO:116和119具有至少90％同一性的氨基酸序列；分别地SEQ ID NO:125和127的氨基酸序列，或分别地与SEQ ID NO:125和127具有至少90％同一性的氨基酸序列；分别地SEQ ID NO:131和132的氨基酸序列，或分别地与SEQ ID NO:131和132具有至少90％同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，在所提供的CAR中，所述抗体或其抗原结合片段的V_H和V_L区包含：分别地SEQ ID NO:32和33的氨基酸序列，或分别地与SEQ ID NO:32和33具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，在所提供的CAR中，所述抗体或其抗原结合片段的V_H和V_L区包含：分别地SEQ ID NO:52和53的氨基酸序列，或分别地与SEQ ID NO:52和53具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，在所提供的CAR中，所述抗体或其抗原结合片段的V_H和V_L区包含：分别地SEQ ID NO:61和62的氨基酸序列，或分别地与SEQ IDNO:61和62具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，在所提供的CAR中，所述抗体或其抗原结合片段的V_H和V_L区包含：分别地SEQ ID NO:85和88的氨基酸序列，或分别地与SEQ ID NO:85和88具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，在所提供的CAR中，所述抗体或其抗原结合片段的V_H和V_L区包含：分别地SEQ ID NO:116和119的氨基酸序列，或分别地与SEQ ID NO:116和119具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，在所提供的CAR中，所述抗体或其抗原结合片段的V_H和V_L区包含：分别地SEQ ID NO:125和127的氨基酸序列，或分别地与SEQ ID NO:125和127具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，在所提供的CAR中，所述抗体或其抗原结合片段的V_H和V_L区包含：分别地SEQ ID NO:131和132的氨基酸序列，或分别地与SEQ ID NO:131和132具有至少90％同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，在所提供的CAR中，所述抗体或其抗原结合片段包含V_H和V_L区，并且所述V_H区包含选自SEQ ID NO:32、52、61、85、116、125、131中任一个的V_H区氨基酸序列内含有的重链互补决定区1(CDR-H1)、重链互补决定区2(CDR-H2)和重链互补决定区3(CDR-H3)；并且所述V_L区包含选自SEQ ID NO:33、53、62、88、119、127、132中任一个的V_L区氨基酸序列内含有的轻链互补决定区1(CDR-L1)、轻链互补决定区2(CDR-L2)和轻链互补决定区3(CDR-L3)。

在一些实施方案中，在所提供的CAR中，所述抗体或其抗原结合片段包含V_H和V_L区，并且所述V_H区包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列内含有的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，并且所述V_L区包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列内含有的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；所述V_H区包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列内含有的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，并且所述V_L区包含SEQ IDNO:53的氨基酸序列内含有的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；所述V_H区包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列内含有的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，并且所述V_L区包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列内含有的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；所述V_H区包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列内含有的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，并且所述V_L区包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列内含有的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；所述V_H区包含SEQ ID NO:116的氨基酸序列内含有的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，并且所述V_L区包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列内含有的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；所述V_H区包含SEQ ID NO:125的氨基酸序列内含有的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，并且所述V_L区包含SEQ ID NO:127的氨基酸序列内含有的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；所述V_H区包含SEQ ID NO:131的氨基酸序列内含有的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，并且所述V_L区包含SEQ IDNO:132的氨基酸序列内含有的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。

在一些实施方案中，所提供的CAR中的抗体或其抗原结合片段的V_H和V_L区分别包含SEQ ID NO:32和33的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段的V_H和V_L区分别包含SEQ ID NO:52和53的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段的V_H和V_L区分别包含SEQ ID NO:61和62的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段的V_H和V_L区分别包含SEQ ID NO:85和88的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段的V_H和V_L区分别包含SEQ ID NO:116和119的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段的V_H和V_L区分别包含SEQ ID NO:125和127的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段的V_H和V_L区分别包含SEQ ID NO:131和132的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所提供的抗体或其抗原结合片段的V_H和V_L区包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:116和119，或与任何上述V_H和V_L具有至少90％序列同一性(如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或其99％序列同一性)的任何抗体或其抗原结合片段，或包含任何上述V_H和V_L的V_H区内含有的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3以及任何上述V_H和V_L的V_L区内含有的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的任何抗体或其抗原结合片段。

在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是单链抗体片段，诸如单链可变片段(scFv)或双抗体或单结构域抗体(sdAb)。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段是仅包含V_H区的单结构域抗体。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段是包含重链可变(V_H)区和轻链可变(V_L)区的scFv。在一些实施方案中，所述单链抗体片段(例如scFv)包含连接两个抗体结构域或区域(诸如重链可变(V_H)区和轻链可变(V_L)区)的一个或多个接头。所述接头通常是肽接头，例如，柔性和/或可溶性肽接头。所述接头包括富含甘氨酸和丝氨酸和/或在一些情况下苏氨酸的那些接头。在一些实施方案中，所述接头还包含可以改善溶解性的带电荷的残基(诸如赖氨酸和/或谷氨酸)。在一些实施方案中，所述接头还包括一个或多个脯氨酸。

因此，所提供的抗BCMA抗体包括单链抗体片段，诸如scFv和双抗体，特别是人单链抗体片段，通常包含连接两个抗体结构域或区域(诸如V_H和V_L区)的一个或多个接头。所述接头通常是肽接头，例如柔性和/或可溶性肽接头，诸如富含甘氨酸和丝氨酸的一种肽接头。

在一些方面，富含甘氨酸和丝氨酸(和/或苏氨酸)的接头包含至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的此类氨基酸。在一些实施方案中，它们包含至少或至少约50％、55％、60％、70％或75％的甘氨酸、丝氨酸和/或苏氨酸。在一些实施方案中，所述接头基本上完全由甘氨酸、丝氨酸和/或苏氨酸组成。所述接头的长度通常在约5个与约50个氨基酸之间，通常在为或约10个与为或约30个之间，例如10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个，并且在一些例子中长度在10个与25个氨基酸之间。示例性接头包括具有各种数量的序列GGGGS(4GS；SEQ ID NO:7)或GGGS(3GS；SEQ ID NO:2)的重复的接头，诸如在这样的序列的2个、3个、4个和5个重复之间。示例性接头包含具有SEQ ID NO:1(GGGGSGGGGSGGGGS)所示的序列或由其组成的那些接头。示例性接头还包含具有SEQ IDNO:176(GSTSGSGKPGSGEGSTKG)所示的序列或由其组成的那些接头。示例性接头还包含具有SEQ ID NO:255(SRGGGGSGGGGSGGGGSLEMA)所示的序列或由其组成的那些接头。

因此，在一些实施方案中，所提供的实施方案包括单链抗体片段(例如，scFv)，其包含一个或多个上述接头，诸如富含甘氨酸/丝氨酸的接头(包括具有GGGS(SEQ ID NO:2)或GGGGS(SEQ ID NO:7)重复的接头，如SEQ ID NO:1所示的接头)。

在一些实施方案中，所述接头具有含有SEQ ID NO:1所示序列的氨基酸序列。所述片段(例如，scFv)可以包含V_H区或其部分，接着是接头，接着是V_L区或其部分。所述片段(例如，scFv)可以包含V_L区或其部分，接着是接头，接着是V_H区或其部分。

表7提供了可包含在所提供的BCMA结合受体(诸如抗BCMA嵌合抗原受体(CAR))中的示例性抗原结合结构域(诸如抗体或抗原结合片段)的SEQ ID NO:。在一些实施方案中，所述BCMA结合受体含有BCMA结合抗体或其片段，所述BCMA结合抗体或其片段包含含有CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的V_H区和含有CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的V_L区，如下表7的每一行中列出的SEQ ID NO:中所示(根据Kabat编号)。在一些实施方案中，所述BCMA结合受体含有BCMA结合抗体或其片段，所述BCMA结合抗体或其片段包含下表7的每一行中列出的SEQID NO:中所示的V_H区序列和V_L区序列；或者包含与下表7的每一行中列出的SEQ ID NO:中所示的V_H区序列和V_L区序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的V_H和V_L区氨基酸序列的抗体。在一些实施方案中，所述BCMA结合受体含有BCMA结合抗体或其片段，所述BCMA结合抗体或其片段包含下表7的每一行中列出的SEQ IDNO:所示的V_H区序列和V_L区序列。在一些实施方案中，所述BCMA结合受体含有BCMA结合抗体或其片段，所述BCMA结合抗体或其片段包含下表7的每一行中列出的SEQ ID NO:所示的scFv序列；或者包含与下表7的每一行中列出的SEQ ID NO:所示的scFv序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的scFv氨基酸序列的抗体。在一些实施方案中，所述BCMA结合受体含有BCMA结合抗体或其片段，所述BCMA结合抗体或其片段包含SEQ ID NO:114所示的scFv序列；或者包含与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的scFv氨基酸序列的抗体。在一些实施方案中，所述BCMA结合受体含有BCMA结合抗体或其片段，所述BCMA结合抗体或其片段包含下表7的每一行中列出的SEQ ID NO:所示的scFv序列。在一些实施方案中，所述BCMA结合受体含有BCMA结合抗体或其片段，所述BCMA结合抗体或其片段包含SEQ ID NO:114所示的scFv序列。

所提供的CAR中的抗体(例如抗原结合片段)包括人抗体。在所提供的人抗BCMA抗体(例如，抗原结合片段)的一些实施方案中，人抗体含有V_H区，所述V_H区包含与由种系核苷酸人重链V区段编码的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的一部分、与由种系核苷酸人重链D区段编码的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的一部分、和/或与由种系核苷酸人重链J区段编码的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的一部分；和/或含有V_L区，所述V_L区包含与由种系核苷酸人κ或λ链V区段编码的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的一部分、和/或与由种系核苷酸人κ或λ链J区段编码的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的一部分。在一些实施方案中，所述V_H区的所述部分对应于CDR-H1、CDR-H2和/或CDR-H3。在一些实施方案中，所述V_H区的所述部分对应于框架区1(FR1)、FR2、FR2和/或FR4。在一些实施方案中，所述V_L区的所述部分对应于CDR-L1、CDR-L2和/或CDR-L3。在一些实施方案中，所述V_L区的所述部分对应于FR1、FR2、FR2和/或FR4。

在一些实施方案中，所述人抗体(例如，抗原结合片段)含有CDR-H1，所述CDR-H1与由种系核苷酸人重链V区段编码的序列内的相应CDR-H1区的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。例如，在一些实施方案中，所述人抗体含有具有如下序列的CDR-H1，所述序列与由种系核苷酸人重链V区段编码的序列内的相应CDR-H1区相比为100％相同或具有不多于一个、两个或三个氨基酸差异。

在一些实施方案中，所述人抗体(例如，抗原结合片段)含有CDR-H2，所述CDR-H2与由种系核苷酸人重链V区段编码的序列内的相应CDR-H2区的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。例如，在一些实施方案中，所述人抗体含有具有如下序列的CDR-H2，所述序列与由种系核苷酸人重链V区段编码的序列内的相应CDR-H2区相比为100％相同或具有不多于一个、两个或三个氨基酸差异。

在一些实施方案中，所述人抗体(例如，抗原结合片段)含有CDR-H3，所述CDR-H3与由种系核苷酸人重链V区段、D区段和J区段编码的序列内的相应CDR-H3区的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。例如，在一些实施方案中，所述人抗体含有具有如下序列的CDR-H3，所述序列与由种系核苷酸人重链V区段、D区段和J区段编码的序列内的相应CDR-H3区相比为100％相同或具有不多于一个、两个或三个氨基酸差异。

在一些实施方案中，所述人抗体(例如，抗原结合片段)含有CDR-L1，所述CDR-L1与由种系核苷酸人轻链V区段编码的序列内的相应CDR-L1区的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。例如，在一些实施方案中，所述人抗体含有具有如下序列的CDR-L1，所述序列与由种系核苷酸人轻链V区段编码的序列内的相应CDR-L1区相比为100％相同或具有不多于一个、两个或三个氨基酸差异。

在一些实施方案中，所述人抗体(例如，抗原结合片段)含有CDR-L2，所述CDR-L2与由种系核苷酸人轻链V区段编码的序列内的相应CDR-L2区的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。例如，在一些实施方案中，所述人抗体含有具有如下序列的CDR-L2，所述序列与由种系核苷酸人轻链V区段编码的序列内的相应CDR-L2区相比为100％相同或具有不多于一个、两个或三个氨基酸差异。

在一些实施方案中，所述人抗体(例如，抗原结合片段)含有CDR-L3，所述CDR-L3与由种系核苷酸人轻链V区段和J区段编码的序列内的相应CDR-L3区的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。例如，在一些实施方案中，所述人抗体含有具有如下序列的CDR-L3，所述序列与由种系核苷酸人轻链V区段和J区段编码的序列内的相应CDR-L3区相比为100％相同或具有不多于一个、两个或三个氨基酸差异。

在一些实施方案中，所述人抗体(例如，抗原结合片段)包含含有人种系基因区段序列的框架区。例如，在一些实施方案中，所述人抗体含有V_H区，其中框架区(例如FR1、FR2、FR3和FR4)与由人种系抗体区段(诸如V区段和/或J区段)编码的框架区具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在一些实施方案中，所述人抗体含有V_L区，其中框架区(例如FR1、FR2、FR3和FR4)与由人种系抗体区段(诸如V区段和/或J区段)编码的框架区具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。例如，在一些此类实施方案中，所述V_H区和/或V_L区内含有的框架区序列与由人种系抗体区段编码的框架区序列相比相差不多于10个氨基酸，诸如不多于9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸。

在一些实施方案中，所述参考抗体可以是在国际专利申请公开号WO 2010/104949中所描述的小鼠抗BCMA scFv。

所述抗体(例如，抗原结合片段)可以含有免疫球蛋白恒定区的至少一部分，诸如一个或多个恒定区结构域。在一些实施方案中，所述恒定区包含轻链恒定区和/或重链恒定区1(C_H1)。在一些实施方案中，所述抗体包含C_H2和/或C_H3结构域，诸如Fc区。在一些实施方案中，所述Fc区是人IgG(诸如IgG1或IgG4)的Fc区。

2.间隔子

在一些实施方案中，包含本文所提供的抗体(例如，抗原结合片段)的重组受体(例如，CAR)(诸如由本文所提供的方法和用途中使用的工程化细胞表达的那些)还包含间隔子或间隔子区域。所述间隔子典型地是多肽间隔子并且通常在CAR内位于CAR的抗原结合结构域与跨膜结构域之间。在一些方面，所述间隔子可以是或包括免疫球蛋白恒定区或其变体或经修饰的形式的至少一部分，如免疫球蛋白的铰链区(诸如IgG铰链区，例如IgG4或IgG4来源的铰链区)和/或C_H1/C_L和/或Fc区。在一些实施方案中，所述恒定区或其一个或多个部分是人IgG的，诸如人IgG4或IgG1或IgG2的。一般而言，所述间隔子(诸如所述恒定区的所述部分)用作抗原识别组分(例如，scFv)与跨膜结构域之间的间隔子区域。在一些实施方案中，所述间隔子的长度和/或组成被设计为优化或促进CAR与其靶标之间的相互作用的某些特征；在一些方面，所述间隔子的长度和/或组成被设计为优化在CAR与其在表达靶标的细胞上的靶标结合期间或之时或之后CAR表达细胞与表达所述CAR的靶标的细胞之间的生物物理突触距离；在一些方面，所述表达靶标的细胞是表达BCMA的肿瘤细胞。在一些实施方案中，所述CAR由T细胞表达，并且间隔子的长度是与T细胞激活或优化CAR T细胞性能兼容的长度。在一些实施方案中，所述间隔子是位于所述重组受体(例如，CAR)的配体结合结构域与跨膜结构域之间的间隔子区域。在一些实施方案中，所述间隔子区域是位于所述重组受体(例如，CAR)的配体结合结构域与跨膜结构域之间的区域。

在一些实施方案中，所述间隔子可以具有这样的长度，与不存在所述间隔子和/或存在不同间隔子(诸如仅长度不同的间隔子)的情况相比，所述长度在抗原结合后提供增加的细胞反应性。在一些实施方案中，所述间隔子具有至少100个氨基酸的长度，诸如至少110、125、130、135、140、145、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240或250个氨基酸的长度。在一些例子中，所述间隔子具有为或约12个氨基酸的长度或者具有不超过12个氨基酸的长度。示例性间隔子包括具有至少约10至300个氨基酸、约10至200个氨基酸、约50至175个氨基酸、约50至150个氨基酸、约10至125个氨基酸、约50至100个氨基酸、约100至300个氨基酸、约100至250个氨基酸、约125至250个氨基酸或约200至250个氨基酸(并且包括任何列出的范围的端点之间的任何整数)的那些。在一些实施方案中，所述间隔子或间隔子区域具有至少约12个氨基酸、至少约119个氨基酸、至少约125个氨基酸、至少约200个氨基酸、或至少约220个氨基酸或至少约225个氨基酸的长度。

在一些实施方案中，所述间隔子具有125至300个氨基酸的长度、125至250个氨基酸的长度、125至230个氨基酸的长度、125至200个氨基酸的长度、125至180个氨基酸的长度、125至150个氨基酸的长度、150至300个氨基酸的长度、150至250个氨基酸的长度、150至230个氨基酸的长度、150至200个氨基酸的长度、150至180个氨基酸的长度、180至300个氨基酸的长度、180至250个氨基酸的长度、180至230个氨基酸的长度、180至200个氨基酸的长度、200至300个氨基酸的长度、200至250个氨基酸的长度、200至230个氨基酸的长度、230至300个氨基酸的长度、230至250个氨基酸的长度或250至300个氨基酸的长度。在一些实施方案中，所述间隔子具有至少或至少约或者具有或具有约130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、221、222、223、224、225、226、227、228或229个氨基酸的长度或者任何前述值之间的长度。

示例性间隔子包括含有免疫球蛋白恒定区的一个或多个部分的那些，诸如含有Ig铰链(诸如IgG铰链结构域)的那些。在一些方面，所述间隔子包括单独的IgG铰链、与C_H2和C_H3结构域中的一个或多个连接的IgG铰链或者与C_H3结构域连接的IgG铰链。在一些实施方案中，IgG铰链、C_H2和/或C_H3可以全部或部分源自IgG4或IgG2。在一些实施方案中，所述间隔子可以是含有源自IgG4、IgG2和/或IgG2和IgG4的铰链、C_H2和/或C_H3序列中的一种或多种的嵌合多肽。在一些实施方案中，所述铰链区包含IgG4铰链区和/或IgG2铰链区的全部或一部分，其中IgG4铰链区任选地是人IgG4铰链区，并且IgG2铰链区任选地是人IgG2铰链区；C_H2区包含IgG4 C_H2区和/或IgG2 C_H2区的全部或一部分，其中IgG4 C_H2区任选地是人IgG4 C_H2区，并且IgG2 C_H2区任选地是人IgG2 C_H2区；和/或C_H3区包含IgG4 C_H3区和/或IgG2 C_H3区的全部或一部分，其中IgG4 C_H3区任选地是人IgG4 C_H3区，并且IgG2 C_H3区任选地是人IgG2C_H3区。在一些实施方案中，所述铰链C_H2和C_H3包含来自IgG4的铰链区C_H2和C_H3中的每一个的全部或一部分。在一些实施方案中，所述铰链区是嵌合的并且包含来自人IgG4和人IgG2的铰链区；所述C_H2区是嵌合的并且包含来自人IgG4和人IgG2的C_H2区；和/或所述C_H3区是嵌合的并且包含来自人IgG4和人IgG2的C_H3区。在一些实施方案中，所述间隔子包含IgG4/2嵌合铰链或含有与人IgG4铰链区相比的至少一个氨基酸替代的经修饰的IgG4铰链；人IgG2/4嵌合C_H2区；和人IgG4 C_H3区。

在一些实施方案中，所述间隔子可以全部或部分源自IgG4和/或IgG2，并且可以含有突变，诸如在一个或多个结构域中的一个或多个单氨基酸突变。在一些例子中，所述氨基酸修饰是在IgG4的铰链区中脯氨酸(P)对丝氨酸(S)的取代。在一些实施方案中，所述氨基酸修饰是用谷氨酰胺(Q)取代天冬酰胺(N)以降低糖基化异质性，诸如SEQ ID NO:173所示全长IgG4 Fc序列的C_H2区中的位置177处的N177Q突变，或者SEQ ID NO:172所示全长IgG2Fc序列的C_H2区中的位置176处的N176Q。在一些实施方案中，所述间隔子是或包含IgG4/2嵌合铰链或经修饰的IgG4铰链；IgG2/4嵌合C_H2区；和IgG4 C_H3区，并且任选地具有约228个氨基酸的长度；或SEQ ID NO:174所示的间隔子。在一些实施方案中，所述间隔子包含

ESKYGPPCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:174)

由已针对密码子表达和/或消除剪接位点(诸如隐秘的剪接位点)进行优化的多核苷酸编码的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述间隔子的编码序列包含SEQ ID NO:200所示的核酸序列。在一些实施方案中，所述间隔子的编码序列包含SEQ ID NO:236或8所示的核酸序列。

另外的示例性间隔子包括但不限于以下文献中所述的那些：Hudecek等人(2013)

Clin.Cancer Res.,19:3153；Hudecek等人(2015)Cancer Immunol.Res.,3(2):125-135或国际专利申请公开号WO 2014031687。在一些实施方案中，所述间隔子的核苷酸序列被优化以降低表达后的RNA异质性。在一些实施方案中，所述间隔子的核苷酸序列被优化以减少隐秘的剪接位点或减少剪接位点处发生剪接事件的可能性。

在一些实施方案中，所述间隔子具有SEQ ID NO:237所示的氨基酸序列，并且由SEQ ID NO:238所示的多核苷酸序列编码。在一些实施方案中，所述间隔子具有SEQ ID NO:157所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述间隔子具有SEQ ID NO:156所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述间隔子具有SEQ ID NO:134所示的氨基酸序列，并且由SEQID NO:135所示的多核苷酸序列编码。在一些实施方案中，所述间隔子具有SEQ ID NO:174所示氨基酸序列，其由SEQ ID NO:175、200、236或8所示的多核苷酸序列或与SEQ ID NO:175、200、236或8展现出至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的多核苷酸编码。在一些实施方案中，所述间隔子具有与SEQ ID NO:174展现出至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列，其由已任选地针对密码子使用和/或降低RNA异质性进行优化的多核苷酸编码。

在一些实施方案中，所述间隔子是或包含由SEQ ID NO:200所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列。

3.跨膜结构域和细胞内信号传导组分

所述抗原识别组分(例如，抗原结合结构域)通常与一个或多个含有信号传导组分的细胞内信号传导区连接，所述信号传导组分是例如模拟通过抗原受体复合物(诸如TCR复合物)(在CAR的情况下)的刺激和/或激活和/或经由另一种细胞表面受体发出信号的信号传导组分。因此，在一些实施方案中，BCMA结合分子(例如抗体或其抗原结合片段)与一个或多个跨膜结构域(诸如本文所述的那些)和包含一种或多种细胞内组分(诸如本文所述的那些)的细胞内信号传导区或细胞内信号传导结构域连接。在一些实施方案中，所述跨膜结构域与细胞外结构域融合。在一个实施方案中，使用天然地与受体(例如CAR)中的结构域之一相关的跨膜结构域。在一些情形中，通过氨基酸取代选择或修饰所述跨膜结构域以避免此类结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，以最小化与所述受体复合物的其他成员的相互作用。

在一些实施方案中，所述跨膜结构域源自天然或合成来源。当来源是天然的时，在一些方面，所述结构域可以源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。跨膜结构域包括源自以下各项的那些(即，包含以下各项的至少一个或多个跨膜结构域)：T细胞受体的α、β或ζ链，CD3ε，CD4，CD5，CD8，CD9，CD16，CD22，CD28，CD33，CD37，CD45，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137和/或CD154。例如，所述跨膜结构域可以是CD28跨膜结构域，所述CD28跨膜结构域包含SEQ IDNO:138所示的氨基酸序列，其由SEQ ID NO:139或SEQ ID NO:140所示核酸序列编码。可替代地，在一些实施方案中，跨膜结构域是合成的。在一些方面，合成跨膜结构域主要包含疏水性残基，诸如亮氨酸和缬氨酸。在一些方面，将在合成跨膜结构域的每个末端发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。在一些实施方案中，所述连接通过接头、间隔子和/或一个或多个跨膜结构域来实现。

细胞内信号传导区或细胞内信号传导结构域包括模拟或接近以下的那些：经由天然抗原受体的信号、经由这种受体与共刺激受体的组合的信号和/或仅经由共刺激受体的信号。在一些实施方案中，短的寡肽或多肽接头(例如，长度在2与10个之间的氨基酸的接头，诸如含有甘氨酸和丝氨酸的接头，例如甘氨酸-丝氨酸双联体)存在并形成CAR的跨膜结构域与细胞内信号传导结构域之间的连接。

受体(例如CAR)通常包括含有至少一种或多种细胞内信号传导组分的细胞内信号传导区。在一些实施方案中，受体包括TCR复合物的细胞内组分或信号传导结构域，诸如介导T细胞激活和细胞毒性的TCR CD3链，例如CD3ζ链。因此，在一些方面，所述BCMA结合抗体与一个或多个细胞信号传导模块连接。在一些实施方案中，细胞信号传导模块包括CD3跨膜结构域、CD3细胞内信号传导结构域和/或其他CD跨膜结构域。在一些实施方案中，所述受体(例如，CAR)还包括一种或多种另外的分子(诸如Fc受体γ、CD8、CD4、CD25或CD16)的一部分。例如，在一些方面，所述CAR包括CD3-zeta(CD3-ζ)或Fc受体γ与CD8、CD4、CD25或CD16之间的嵌合分子。

在一些实施方案中，在连接CAR时或之后，CAR的胞质结构域或细胞内信号传导结构域刺激和/或激活免疫细胞(例如，工程化以表达所述CAR的T细胞)的正常效应子功能或反应中的至少一种。例如，在一些情境下，CAR诱导T细胞的功能，诸如细胞溶解活性或T辅助活性，诸如细胞因子或其他因子的分泌。在一些实施方案中，使用抗原受体组分或共刺激分子的细胞内信号传导结构域的截短部分(例如，如果其转导效应子功能信号的话)代替完整的免疫刺激链。在一些实施方案中，所述一个或多个细胞内信号传导结构域包含T细胞受体(TCR)的胞质序列，并且在一些方面还包括共受体(其在天然背景下与这种受体并行起作用以在抗原受体接合后启动信号转导)和/或此类分子的任何衍生物或变体的那些，和/或具有相同功能能力的任何合成序列。

在天然TCR的情况下，完全激活通常不仅需要通过TCR进行信号传导，还需要共刺激信号。因此，在一些实施方案中，为了促进完全激活，用于生成次级或共刺激信号的组分也被包括在所述CAR中。在其他实施方案中，所述CAR不包括用于生成共刺激信号的组分。在一些方面，另外的CAR在同一细胞中表达，并且提供用于生成次级或共刺激信号的组分。

在一些方面，将T细胞激活描述为由两个类别的胞质信号传导序列来介导：通过TCR起始抗原依赖性初级激活的那些(初级胞质信号传导序列)，以及以非抗原依赖性方式作用以提供次级或共刺激信号的那些(次级胞质信号传导序列)。在一些方面，所述CAR包括此类胞质信号传导序列中的一者或两者。

在一些方面，所述CAR包括调节TCR复合物的初级刺激和/或激活的初级胞质信号传导序列。以刺激方式起作用的初级胞质信号传导序列可以含有信号传导基序(其称为免疫受体酪氨酸激活基序或ITAM)。含有ITAM的初级胞质信号传导序列的例子包括源自TCR或CD3ζ、FcRγ、CD3γ、CD3δ和CD3ε的那些。在一些实施方案中，所述CAR中的细胞内信号传导区或细胞内信号传导结构域含有源自CD3ζ的胞质信号传导结构域、其部分或序列。在一些实施方案中，所述CD3ζ包含SEQ ID NO:143所示的氨基酸序列，其由SEQ ID NO:144或SEQID NO:145所示的核酸序列编码。

在一些实施方案中，所述CAR包含共刺激分子(诸如T细胞共刺激分子)的信号传导结构域(例如细胞内或胞质信号传导结构域)和/或跨膜部分。示例性共刺激分子包括CD28、4-1BB、OX40、DAP10和ICOS。例如，共刺激分子可以源自4-1BB，并且可以包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，其由SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列编码。在一些方面，同一CAR包含刺激或激活组分(例如，胞质信号传导序列)和共刺激组分二者。

在一些实施方案中，所述刺激或激活组分被包含在一个CAR中，而所述共刺激组分由识别另一种抗原的另一种CAR提供。在一些实施方案中，所述CAR包括在同一细胞上表达的激活或刺激CAR和共刺激CAR(参见WO 2014/055668)。在一些方面，所述BCMA靶向CAR是刺激或激活CAR；在其他方面，其是共刺激CAR。在一些实施方案中，所述细胞还包含抑制性CAR(iCAR，参见Fedorov等人,Sci.Transl.Medicine,5(215)(2013年12月)，诸如识别除BCMA以外的抗原的CAR，由此通过靶向BCMA的CAR传递的刺激或激活信号由于抑制性CAR与其配体的结合而减小或被抑制，例如以降低脱靶效应。

在某些实施方案中，所述细胞内信号传导区包含连接至CD3(例如，CD3-ζ)细胞内结构域的CD28跨膜和信号传导结构域。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域包含连接至CD3ζ细胞内结构域的嵌合CD28和CD137(4-1BB，TNFRSF9)共刺激结构域。

在一些实施方案中，所述CAR涵盖在胞质部分中的一个或多个(例如，两个或更多个)共刺激结构域和刺激或激活结构域(例如初级激活结构域)。示例性CAR包括CD3ζ、CD28和4-1BB的细胞内组分。

在一些实施方案中，所提供的嵌合抗原受体包含：(a)特异性地识别B细胞成熟抗原(BCMA)的细胞外抗原结合结构域，诸如本文所述的任何抗原结合结构域；(b)长度为至少125个氨基酸的间隔子；(c)跨膜结构域；以及(d)细胞内信号传导区。在一些实施方案中，这种受体的抗原结合结构域包含分别含有SEQ ID NO:116和119的氨基酸序列或者分别与SEQID NO:116和119具有至少90％同一性的氨基酸序列的V_H区和V_L区。在一些实施方案中，这种受体的抗原结合结构域包含V_H区和V_L区，所述V_H区是或包含SEQ ID NO:116的V_H区氨基酸序列内含有的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述V_L区是或包含SEQ ID NO:119的V_L区氨基酸序列内含有的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一些实施方案中，这种受体的抗原结合结构域包含V_H区和V_L区，所述V_H区包含分别含有SEQ ID NO:97、101和103的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述V_L区包含分别含有SEQ ID NO:105、107和108的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一些实施方案中，这种受体的抗原结合结构域包含V_H区和V_L区，所述V_H区包含分别含有SEQ ID NO:96、100和103的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述V_L区包含分别含有SEQ ID NO:105、107和108的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一些实施方案中，这种受体的抗原结合结构域包含V_H区和V_L区，所述V_H区包含分别含有SEQ ID NO:95、99和103的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述V_L区包含分别含有SEQ ID NO:105、107和108的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一些实施方案中，这种受体的抗原结合结构域包含V_H区和V_L区，所述V_H区包含分别含有SEQ ID NO:94、98和102的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述V_L区包含分别含有SEQ ID NO:104、106和108的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一些实施方案中，这种受体的抗原结合结构域包含V_H区和V_L区，所述V_H区是或包含SEQ ID NO:116的氨基酸序列，所述V_L区是或包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列。在一些实施方案中，这种受体的抗原结合结构域包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述细胞内信号传导区包含刺激型胞质信号传导结构域。在一些实施方案中，所述刺激型胞质信号传导结构域能够在T细胞中诱导初级激活信号，是T细胞受体(TCR)组分，和/或包含基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。在一些实施方案中，所述刺激型胞质信号传导结构域是或包含CD3-zeta(CD3ζ)链的胞质信号传导结构域或其功能变体或信号传导部分。在一些实施方案中，所述刺激型胞质结构域是人的或源自人蛋白质。在一些实施方案中，所述刺激型胞质结构域是或包含SEQ ID NO:143所示的序列或与SEQ ID NO:143具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码所述刺激型胞质结构域的核酸是或包含SEQ ID NO:144所示的序列，或者是密码子优化的序列和/或其简并序列。在其他实施方案中，编码所述刺激型胞质信号传导结构域的核酸是或包含SEQ ID NO:145所示的序列。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导区还包括共刺激信号传导区。在一些实施方案中，所述共刺激信号传导区包括T细胞共刺激分子的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。在一些实施方案中，所述共刺激信号传导区包括CD28、4-1BB或ICOS的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。在一些实施方案中，所述共刺激信号传导区包含4-1BB的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，所述共刺激信号传导区是人的或源自人蛋白质。在其他实施方案中，所述共刺激信号传导区是或包含SEQ ID NO:4所示的序列或与SEQ ID NO:4所示的序列展现出至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码所述共刺激区的核酸是或包含SEQ ID NO:5所示的序列，或者是密码子优化的序列和/或其简并序列。在一些实施方案中，编码所述共刺激信号传导区的核酸包含SEQ ID NO:6所示的序列。在一些实施方案中，所述共刺激信号传导区位于所述跨膜结构域与所述细胞内信号传导区之间。在一些实施方案中，所述跨膜结构域是或包含源自CD4、CD28或CD8的跨膜结构域。在一些实施方案中，所述跨膜结构域是或包含源自CD28的跨膜结构域。在一些实施方案中，所述跨膜结构域是人的或源自人蛋白质。在其他实施方案中，所述跨膜结构域是或包含SEQ ID NO:138所示的序列或与SEQ ID NO:138展现出至少90％序列同一性的氨基酸序列。

提供了嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包含：(1)特异性地结合人B细胞成熟抗原(BCMA)的细胞外抗原结合结构域，其中所述细胞外抗原结合结构域包含：(i)含有与SEQID NO:116的V_H区序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的可变重链(V_H)；和(ii)含有与SEQ ID NO:119中任一个的V_L区序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的可变轻链(V_L)；(2)SEQ ID NO:174所示的间隔子，或者其中编码所述间隔子的核酸是或包含SEQ ID NO:200所示的序列；(3)跨膜结构域、任选来自人CD28的跨膜结构域；以及(4)含有CD3-zeta(CD3ζ)链的胞质信号传导结构域和T细胞共刺激分子的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导区。还提供了编码这种嵌合抗原受体的多核苷酸。

在一些实施方案中，所述V_H区包含SEQ ID NO:116的V_H区序列内含有的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；并且所述V_L区包含SEQ ID NO:119的V_L区序列内含有的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；或者所述V_H区包含分别含有SEQ ID NO:97、101和103的序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，并且所述V_L区包含分别含有SEQ ID NO:105、107和108的序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；所述V_H区包含分别含有SEQ ID NO:96、100和103的序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，并且所述V_L区包含分别含有SEQ ID NO:105、107和108的序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；所述V_H区包含分别含有SEQ ID NO:95、99和103的序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，并且所述V_L区包含分别含有SEQ ID NO:105、107和108的序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；或者所述V_H区包含分别含有SEQ ID NO:94、98和102的序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，并且所述V_L区包含分别含有SEQ ID NO:104、106和108的序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。

提供了嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包含：(1)与人B细胞成熟抗原(BCMA)特异性地结合的细胞外抗原结合结构域，其中所述细胞外抗原结合结构域包含：含有SEQ IDNO:116的V_H区序列内含有的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的可变重链(V_H)区和含有SEQ ID NO:119的V_L区序列内含有的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的可变轻链(V_L)区；或者所述V_H区包含SEQID NO:116的V_H区序列内含有的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；并且所述V_L区包含SEQ ID NO:119的V_L区序列内含有的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；或者所述V_H区包含分别含有SEQ ID NO:97、101和103的序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，并且所述V_L区包含分别含有SEQ ID NO:105、107和108的序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；所述V_H区包含分别含有SEQ ID NO:96、100和103的序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，并且所述V_L区包含分别含有SEQ ID NO:105、107和108的序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；所述V_H区包含分别含有SEQ ID NO:95、99和103的序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，并且所述V_L区包含分别含有SEQ ID NO:105、107和108的序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；或者所述V_H区包含分别含有SEQ ID NO:94、98和102的序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，并且所述V_L区包含分别含有SEQ ID NO:104、106和108的序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；(2)SEQ ID NO:174所示的间隔子，或其中编码所述间隔子的核酸是或包含SEQ ID NO:200所示的序列；(3)跨膜结构域、任选来自人CD28的跨膜结构域；以及(4)含有人CD3-zeta(CD3ζ)链的胞质信号传导结构域和T细胞共刺激分子(任选地来自人4-1BB或人CD28)的细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导区。还提供了编码这种嵌合抗原受体的多核苷酸。在一些实施方案中，所述细胞外抗原结合结构域包含SEQ ID NO:116的V_H区序列和SEQ ID NO:119的V_L区序列。在一些实施方案中，这种受体的抗原结合结构域包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述嵌合抗原受体的其他结构域、区域或组分包括本文所述的任何结构域、区域或组分。

4.替代标记

在一些实施方案中，所述CAR或编码所述CAR的多核苷酸还包含替代标记，诸如细胞表面标记(例如，截短的细胞表面标记)，其可以用于确认细胞的转导或工程化以表达受体。例如，在一些方面，非固有标记基因结合工程化细胞疗法用于允许检测或选择细胞，并且在一些情况下还用于促进通过ADCC进行细胞自杀。示例性标记基因包括截短的表皮生长因子受体(EGFRt)，其可以与转导细胞中的目标转基因(CAR)共表达(参见例如美国专利号8,802,374)。EGFRt含有由抗体西妥昔单抗

识别的表位。出于这个原因，

可以用于鉴定或选择已经用EGFRt构建体工程化的细胞，包括还用另一种重组受体(诸如嵌合抗原受体(CAR))共同工程化的细胞。另外地，EGFRt通常用作结合细胞疗法的自杀机制。在一些方面，当EGFRt在具有目标转基因(例如CAR)的细胞中共表达时，它可以被西妥昔单抗单克隆抗体靶向，以经由ADCC减少或耗尽转化的经基因修饰的细胞(参见，美国专利号8,802,374和Liu等人,Nature Biotech.2016年4月；34(4):430-434)。重要地，使用tEGFR的自杀杀伤途径要求抗体表位的可用性。这种标记基因的另一个例子是前列腺特异性膜抗原(PSMA)或其修饰形式。PSMA或其修饰形式可以包含被PSMA靶向分子(诸如抗体或其抗原结合片段)结合或由其识别的氨基酸序列。PSMA靶向分子可以用于鉴定或选择已经用PSMA或经修饰的构建体工程化的细胞，包括还用另一种重组受体(诸如本文所提供的嵌合抗原受体(CAR))共工程化的细胞。在一些方面，所述标记包括的CD34、神经生长因子受体(NGFR)、表皮生长因子受体(例如，EGFR)或PSMA的全部或部分(例如，截短形式)。

示例性替代标记可以包括截短形式的细胞表面多肽，诸如是非功能性的并且不转导或不能转导信号或通常被细胞表面多肽的全长形式转导的信号、和/或不内化或不能内化的截短形式。示例性截短的细胞表面多肽包括截短形式的生长因子或其他受体，诸如截短的人表皮生长因子受体2(tHER2)、截短的表皮生长因子受体(tEGFR，在SEQ ID NO:246所示的示例性tEGFR序列)或前列腺特异性膜抗原(PSMA)或其修饰形式。tEGFR可以含有被抗体西妥昔单抗

或其他治疗性抗EGFR抗体或结合分子识别的表位，其可以被用于鉴定或选择已经用tEGFR构建体和编码的外源蛋白质工程化的细胞，和/或用于消除或分离表达所编码的外源蛋白质的细胞。参见美国专利号8,802,374和Liu等人,NatureBiotech.2016年4月；34(4):430-434)。在一些方面，标记(例如替代标记)包括全部或部分(例如截短形式的)CD34、NGFR、CD19或截短的CD19(例如截短的非人CD19)或表皮生长因子受体(例如tEGFR)。在一些实施方案中，标记是或包含荧光蛋白，诸如绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)(诸如超折叠GFP(sfGFP))、红色荧光蛋白(RFP)(诸如tdTomato、mCherry、mStrawberry、AsRed2、DsRed或DsRed2)、青色荧光蛋白(CFP)、蓝绿色荧光蛋白(BFP)、增强型蓝色荧光蛋白(EBFP)和黄色荧光蛋白(YFP)及其变体，包括荧光蛋白的物种变体、单体变体和密码子优化的和/或增强的变体。在一些实施方案中，标记是或包含酶(诸如萤光素酶)、来自大肠杆菌的lacZ基因、碱性磷酸酶、分泌的胚胎碱性磷酸酶(SEAP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)。示例性发光报告基因包括萤光素酶(luc)、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、β-葡萄糖醛酸酶(GUS)或其变体。

在一些实施方案中，标记是选择标记。在一些实施方案中，选择标记是或包含赋予对外源药剂或药物的抗性的多肽。在一些实施方案中，选择标记是抗生素抗性基因。在一些实施方案中，选择标记是向哺乳动物细胞赋予抗生素抗性的抗生素抗性基因。在一些实施方案中，选择标记是或包含嘌呤霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、杀稻瘟菌素抗性基因、新霉素抗性基因、遗传霉素抗性基因或博莱霉素抗性基因或其修饰形式。

在一些实施方案中，编码标记的核酸可操作地连接至编码接头序列(诸如可切割接头序列，例如T2A)的多核苷酸。参见WO 2014031687。在一些实施方案中，引入编码由T2A核糖体开关隔开的CAR和替代标记的构建体可以表达来自相同构建体的两种蛋白质，使得所述替代标记可以用作检测表达这种构建体的细胞的标记。在一些实施方案中，所述替代标记和任选的接头序列可以是如国际公开号WO 2014031687中所披露的任一种。例如，所述标记可以是截短的EGFR(tEGFR)或PSMA，其任选地与接头序列(诸如2A可切割接头序列(例如，T2A、P2A、E2A或F2A可切割接头，如本文别处所述的))连接。截短的EGFR替代标记的示例性多肽包含SEQ ID NO:246所示的氨基酸序列或展现与SEQ ID NO:246至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述间隔子是或包含富甘氨酸-丝氨酸的序列或其他柔性接头，诸如已知的柔性接头。

在一些实施方案中，所述标记是并非在T细胞上天然发现的或并非在T细胞表面上天然发现的分子(例如，细胞表面蛋白)或其部分。

在一些实施方案中，所述分子是非自身分子，例如非自身蛋白，即不被将被过继转移细胞的宿主免疫系统识别为“自身”的分子。

在一些实施方案中，所述标记不提供任何治疗功能和/或不产生除了用作基因工程化标记(例如，用于选择成功工程化的细胞)以外的作用。在其他实施方案中，所述标记可以是治疗性分子或以其他方式发挥一定所需作用以增强和/或减弱细胞在过继转移和遇到配体后的反应的分子，诸如会在体内遇到的细胞的配体，诸如共刺激或免疫检查点分子。

在一些情况下，CAR被称为第一代、第二代和/或第三代CAR。在一些方面，第一代CAR是在抗原结合后或响应于抗原结合而仅提供CD3链诱导的信号的CAR；在一些方面，第二代CAR是提供这种信号和共刺激信号的CAR，如包括来自共刺激受体(诸如CD28或CD137)的细胞内信号传导结构域的CAR；在一些方面，第三代CAR是在一些方面包括不同共刺激受体的多个共刺激结构域的CAR。

在一些实施方案中，所述嵌合抗原受体包含含有本文所述的抗体或片段的细胞外部分。在一些方面，所述嵌合抗原受体包括含有本文所述的抗体或片段的细胞外部分和细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，所述抗体或片段包括scFv或仅包含V_H区的单结构域抗体，并且细胞内信号传导结构域含有ITAM。在一些方面，所述细胞内信号传导结构域包含CD3-zeta(CD3ζ)链的ζ链的信号传导结构域。在一些实施方案中，所述嵌合抗原受体包括连接细胞外结构域与细胞内信号传导结构域的跨膜结构域。在一些方面，所述跨膜结构域含有CD28的跨膜部分。所述细胞外结构域和跨膜结构域可以直接或间接地连接。在一些实施方案中，所述细胞外结构域和跨膜结构域通过间隔子(诸如本文所述的任何间隔子)连接。在一些实施方案中，所述嵌合抗原受体含有共刺激分子(例如T细胞共刺激分子)的细胞内结构域，诸如在跨膜结构域与细胞内信号传导结构域之间。在一些方面，所述T细胞共刺激分子是CD28或4-1BB。

在一些实施方案中，所述受体(例如CAR)的跨膜结构域是人CD28的跨膜结构域或其变体，例如人CD28(登录号：P10747.1)的27个氨基酸的跨膜结构域。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域包含人CD28的细胞内共刺激信号传导结构域或其功能变体，诸如其41个氨基酸的结构域，和/或在天然CD28蛋白的位置186-187处具有LL至GG取代的这种结构域。在一些实施方案中，所述细胞内结构域包含4-1BB的细胞内共刺激信号传导结构域或其功能变体，诸如人4-1BB的42个氨基酸的胞质结构域(登录号Q07011.1)。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域包含人CD3ζ刺激信号传导结构域或其功能变体，诸如人CD3ζ(登录号：P20963.2)的同种型3的112个AA的胞质结构域或如美国专利号7,446,190中所述的CD3ζ信号传导结构域。

例如，在一些实施方案中，所述CAR包括BCMA抗体或片段(诸如本文所述的任何人BCMA抗体，包括sdAb和scFv)、间隔子(诸如任何含有Ig铰链的间隔子)、CD28跨膜结构域、CD28细胞内信号传导结构域和CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方案中，所述CAR包括BCMA抗体或片段(诸如本文所述的任何人BCMA抗体，包括sdAb和scFv)、间隔子(诸如任何含有Ig铰链的间隔子)、CD28跨膜结构域、4-1BB细胞内信号传导结构域和CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方案中，此类CAR构建体还包括例如CAR下游的T2A核糖体跳跃元件和/或tEGFR序列。

在某些实施方案中，多特异性结合分子(例如多特异性嵌合受体，诸如多特异性CAR)可以含有任何多特异性抗体，包括例如双特异性抗体、多特异性单链抗体，例如双抗体、三抗体和四抗体、串联二scFv和串联三scFv。

B.用于基因工程化的核酸、载体和方法

在一些实施方案中，将细胞(例如T细胞)基因工程化以表达重组受体。在一些实施方案中，通过引入编码重组受体的多核苷酸来进行工程化。还提供了编码重组受体的多核苷酸，以及含有此类核酸和/或多核苷酸的载体或构建体。

在一些情况下，编码所述重组受体的核酸序列含有编码信号肽的信号序列。在一些方面，信号序列可以编码源自天然多肽的信号肽。在其他方面，信号序列可以编码异源或非天然信号肽，诸如SEQ ID NO:25所示并且由SEQ ID NO:24所示的核苷酸序列编码的GMCSFRα链的示例性信号肽。在一些情况下，编码重组受体(例如，嵌合抗原受体(CAR))的核酸序列含有编码信号肽的信号序列。信号肽的非限制性示例性例子包括例如SEQ ID NO:25所示并且由SEQ ID NO:24所示的核苷酸序列编码的GMCSFRα链信号肽，或SEQ ID NO:26所示的CD8α信号肽。

在一些实施方案中，编码重组受体的多核苷酸含有至少一个启动子，所述启动子可操作地连接以控制所述重组受体的表达。在一些例子中，多核苷酸含有两个、三个或更多个启动子，所述启动子可操作地连接以控制所述重组受体的表达。

在核酸分子编码两种或更多种不同多肽链(例如重组受体和标记)的某些情况下，每条多肽链可以由单独的核酸分子编码。例如，提供了两种单独的核酸，并且每一种可以单独转移到或引入细胞中以在细胞中表达。在一些实施方案中，编码重组受体的核酸和编码标记的核酸与相同的启动子可操作地连接，并且任选地通过内部核糖体进入位点(IRES)或编码自切割肽或导致核糖体跳跃的肽(其任选地是T2A、P2A、E2A或F2A)的核酸隔开。在一些实施方案中，编码标记的核酸和编码重组受体的核酸可操作地连接至两个不同的启动子。在一些实施方案中，编码标记的核酸和编码所述重组受体的核酸存在或插入于细胞基因组内的不同位置。在一些实施方案中，诸如通过逆转录病毒转导、转染或转化将编码重组受体的多核苷酸引入含有培养细胞的组合物中。

在一些实施方案中，诸如多核苷酸含有第一和第二核酸序列的那些实施方案中，编码不同多肽链中的每一种的编码序列可以与相同或不同的启动子可操作地连接。在一些实施方案中，核酸分子可以含有驱动两条或更多条不同多肽链表达的启动子。在一些实施方案中，此类核酸分子可以是多顺反子的(双顺反子的或三顺反子的，参见例如美国专利号6,060,273)。在一些实施方案中，可以将转录单位工程化为含有IRES(内部核糖体进入位点)的双顺反子单元，其允许通过来自单一启动子的信息共表达基因产物(例如编码标记和编码重组受体)。可替代地，在一些情况下，单一启动子可引导RNA的表达，所述RNA在单一开放阅读框(ORF)中含有两个或三个基因(例如编码标记和编码重组受体)，所述基因通过编码自切割肽(例如2A序列)的序列或蛋白酶识别位点(例如弗林蛋白酶(furin))彼此分开。因此，ORF编码单一多肽，其在翻译期间(在2A的情况下)或翻译后被处理成单独蛋白质。在一些情况下，肽(诸如T2A)可引起核糖体跳过2A元件C末端处肽键的合成(核糖体跳跃)，导致2A序列末端与相邻下游肽之间分开(参见例如，de Felipe,Genetic Vaccines andTher.2:13(2004)和de Felipe等人Traffic 5:616-626(2004))。各种2A元件是已知的。可以用于本文公开的方法和系统中的2A序列的例子包括但不限于来自以下病毒的2A序列：口蹄疫病毒(F2A，例如SEQ ID NO:21)、马鼻炎A病毒(E2A，例如SEQ ID NO:20)、明脉扁刺蛾β四体病毒(T2A，例如SEQ ID NO:6或17)和猪捷申病毒-1(P2A，例如SEQ ID NO:18或19)，如美国专利公开号20070116690中所述。

本文所述的任何重组受体可以由呈任何组合或排列的含有编码重组受体的一种或多种核酸序列的多核苷酸编码。例如，一种、两种、三种或更多种多核苷酸可以编码一种、两种、三种或更多种不同的多肽，例如重组受体。在一些实施方案中，一种载体或构建体含有编码标记的核酸序列，并且单独的载体或构建体含有编码重组受体(例如CAR)的核酸序列。在一些实施方案中，编码标记的核酸和编码重组受体的核酸与两种不同的启动子可操作地连接。在一些实施方案中，编码重组受体的核酸存在于编码标记的核酸的下游。

在一些实施方案中，所述载体骨架含有编码一种或多种标记的核酸序列。在一些实施方案中，所述一种或多种标记是转导标记、替代标记和/或选择标记。

在一些实施方案中，所述标记是转导标记或替代标记。转导标记或替代标记可以用于检测已经引入多核苷酸(例如，编码重组受体的多核苷酸)的细胞。在一些实施方案中，所述转导标记可以指示或确认对细胞的修饰。在一些实施方案中，所述替代标记是经制备在细胞表面上与重组受体(例如，CAR)共表达的蛋白质。在特定实施方案中，这种替代标记是已经修饰以具有极少或无活性的表面蛋白。在一些实施方案中，所述替代标记是由编码重组受体的相同多核苷酸编码。在一些实施方案中，编码重组受体的核酸序列与编码标记的核酸序列可操作地连接，任选地通过内部核糖体进入位点(IRES)或编码自切割肽或导致核糖体跳跃的肽(诸如2A序列，诸如T2A、P2A、E2A或F2A)的核酸分开。在一些情况下，外在标记基因可以结合工程化细胞用于允许检测或选择细胞，并且在一些情况下还可以用于促进细胞自杀。

在一些实施方案中，所述标记不提供任何治疗功能和/或不产生除了用作基因工程化标记(例如，用于选择成功工程化的细胞)以外的作用。在其他实施方案中，所述标记可以是治疗性分子或以其他方式发挥一些所需作用的分子，诸如在体内会遇到的细胞的配体，诸如用于在过继转移和遇到配体时增强和/或减弱细胞应答的共刺激或免疫检查点分子。

在一些实施方案中，编码标记的核酸与编码接头序列(诸如可切割接头序列，例如T2A)的多核苷酸可操作地连接。例如，标记和任选地接头序列可以是如PCT公开号WO2014031687中所披露的任何一种。例如，所述标记可以是截短的EGFR(tEGFR)，其任选地连接至接头序列，诸如T2A可切割接头序列。截短的EGFR(例如tEGFR)的示例性多肽包含SEQID NO:7或16所示的氨基酸序列或展现出与SEQ ID NO:7或16至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述标记是或包含荧光蛋白，诸如绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)(诸如超折叠GFP(sfGFP))、红色荧光蛋白(RFP)(诸如tdTomato、mCherry、mStrawberry、AsRed2、DsRed或DsRed2)、青色荧光蛋白(CFP)、蓝绿色荧光蛋白(BFP)、增强型蓝色荧光蛋白(EBFP)和黄色荧光蛋白(YFP)及其变体，包括荧光蛋白的物种变体、单体变体和密码子优化的和/或增强的变体。在一些实施方案中，所述标记是或包含酶(诸如萤光素酶)、来自大肠杆菌的lacZ基因、碱性磷酸酶、分泌的胚胎碱性磷酸酶(SEAP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)。示例性发光报告基因包括萤光素酶(luc)、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、β-葡萄糖醛酸酶(GUS)或其变体。

在一些实施方案中，使用重组感染性病毒颗粒(例如源自猿猴病毒40(SV40)、腺病毒、腺相关病毒(AAV)的载体)将重组核酸转移到细胞中。在一些实施方案中，使用重组慢病毒载体或逆转录病毒载体(诸如γ-逆转录病毒载体)将重组核酸转移到T细胞中(参见例如Koste等人(2014)Gene Therapy 2014年4月3日.doi:10.1038/gt.2014.25；Carlens等人(2000)Exp.Hematol.,28(10):1137-46；Alonso-Camino等人(2013)Mol.Ther.Nucl.Acids.,2,e93；Park等人,Trends Biotechnol.,2011年11月29(11):550–557。

在一些实施方案中，所述病毒载体是腺相关病毒(AAV)。

在一些实施方案中，所述逆转录病毒载体具有长末端重复序列(LTR)，例如源自莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)、骨髓增生性肉瘤病毒(MPSV)、鼠胚胎干细胞病毒(MESV)、鼠干细胞病毒(MSCV)或脾病灶形成病毒(SFFV)的逆转录病毒载体。大多数逆转录病毒载体源自鼠逆转录病毒。在一些实施方案中，所述逆转录病毒包括源自任何禽类或哺乳动物细胞来源的那些。所述逆转录病毒通常是双嗜性的，这意味着它们能够感染包括人在内的若干种物种的宿主细胞。在一个实施方案中，待表达的基因替代逆转录病毒gag、pol和/或env序列。已经描述了许多例示性逆转录病毒系统(例如，美国专利号5,219,740、6,207,453、5,219,740；Miller和Rosman(1989)BioTechniques 7:980-990；Miller,A.D.(1990)HumanGene Therapy 1:5-14；Scarpa等人(1991)Virology 180:849-852；Burns等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:8033-8037；以及Boris-Lawrie和Temin(1993)Cur.Opin.Genet.Develop.3:102-109。

慢病毒转导的方法是已知的。示例性方法描述于例如例如Wang等人(2012)J.Immunother.35(9):689-701；Cooper等人(2003)Blood.101:1637–1644；Verhoeyen等人(2009)Methods Mol Biol.506:97-114；以及Cavalieri等人(2003)Blood.102(2):497-505。

在一些实施方案中，经由电穿孔将重组核酸转移到T细胞中(参见例如，Chicaybam等人,(2013)PLoS ONE 8(3):e60298；以及Van Tedeloo等人(2000)Gene Therapy 7(16):1431-1437)。在一些实施方案中，重组核酸通过转座转移到T细胞中(参见例如，Manuri等人(2010)Hum Gene Ther 21(4):427-437；Sharma等人(2013)Molec Ther Nucl Acids 2,e74；以及Huang等人(2009)Methods Mol Biol 506:115-126)。在免疫细胞中引入和表达遗传物质的其他方法包括磷酸钙转染(例如，如在Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley&Sons,New York.N.Y.中所述)、原生质体融合、阳离子脂质体介导的转染；钨粒子促进的微粒轰击(Johnston,Nature,346:776-777(1990))；以及磷酸锶DNA共沉淀(Brash等人,Mol.Cell Biol.,7:2031-2034(1987))。

用于转移编码重组产物的核酸的其他方法和载体是例如国际专利申请公开号WO2014055668和美国专利号7,446,190中所述的那些。

在一些实施方案中，可以在扩增期间或之后例如用嵌合抗原受体(CAR)对细胞(例如T细胞)进行转染。例如，这种用于引入所需受体的基因的转染可以用任何合适的逆转录病毒载体进行。然后可以使遗传修饰的细胞群摆脱初始刺激物(例如抗CD3/抗CD28刺激物)，随后用第二类型的刺激物例如通过从头引入的受体进行刺激。该第二类型的刺激物可以包括呈肽/MHC分子形式的抗原刺激物、遗传引入的受体的同源(交联)配体(例如CAR的天然配体)或在新受体的框架内直接结合(例如通过识别受体内的恒定区)的任何配体(诸如抗体)。参见例如，Cheadle等人,“Chimeric antigen receptors for T-cell basedtherapy”Methods Mol Biol.2012；907:645-66或Barrett等人,Chimeric AntigenReceptor Therapy for Cancer Annual Review of Medicine第65卷:333-347(2014)。

在一些情况下，可以使用不需要激活细胞(例如，T细胞)的载体。在一些此类情形中，可以在激活之前选择和/或转导细胞。因此，可以在培养细胞之前或之后将细胞工程化，并且在一些情况下在培养的同一时间或至少一部分期间将细胞工程化。

另外的核酸(例如，用于引入的基因)包括用于改善治疗功效的那些，例如通过促进转移细胞的活力和/或功能；提供用于选择和/或评价细胞的遗传标记的基因，例如以评估体内存活或定位；改善安全性的基因，例如通过使细胞在体内对阴性选择易感，如LuptonS.D.等人,Mol.and Cell Biol.,11:6(1991)；和Riddell等人,Human Gene Therapy 3:319-338(1992)所述；还参见Lupton等人的PCT/US91/08442和PCT/US94/05601的公开，其描述了使用源自将显性阳性选择性标记与阴性选择性标记融合的双功能选择性融合基因。参见例如，Riddell等人,美国专利号6,040,177，第14-17栏。

用于基因工程化细胞的细胞和细胞的制备，在一些实施方案中，核酸是异源的，即通常不存在于细胞或从细胞获得的样品中，诸如从另一种生物或细胞获得的核酸，例如，所述核酸通常不在被工程化的细胞和/或衍生这种细胞的生物中发现。在一些实施方案中，核酸不是天然存在的，诸如自然界中未发现的核酸，包括包含编码来自多种不同细胞类型的各种结构域的核酸的嵌合组合的核酸。

细胞通常是真核细胞，例如哺乳动物细胞，并且通常是人细胞。在一些实施方案中，所述细胞源自血液、骨髓、淋巴或淋巴器官，是免疫系统的细胞，诸如先天或适应性免疫的细胞，例如骨髓或淋巴细胞，包括淋巴细胞，通常为T细胞和/或NK细胞。其他示例性细胞包括干细胞，诸如多潜能干细胞和多能干细胞，包括诱导多能干细胞(iPSC)。细胞通常是原代细胞，诸如直接从受试者分离和/或从受试者分离并冷冻的那些原代细胞。在一些实施方案中，所述细胞包括T细胞或其他细胞类型的一个或多个子集，诸如整个T细胞群、CD4+细胞、CD8+细胞及其亚群，诸如由以下各项所定义的那些亚群：功能、激活状态、成熟度、分化的可能性、扩增、再循环、定位和/或持久能力、抗原特异性、抗原受体类型、在特定器官或区室中的存在、标记或细胞因子分泌概况和/或分化程度。关于待治疗的受试者，所述细胞可以是同种异体的和/或自体的。所述方法包括现成的方法。在一些方面，诸如对于现成的技术，所述细胞是多能的和/或多潜能的，诸如干细胞，诸如诱导多能干细胞(iPSC)。在一些实施方案中，所述方法包括从受试者分离细胞、制备、加工、培养和/或将它们工程化，并且在冷冻保存之前或之后将它们重新引入同一受试者中。

T细胞和/或CD4+和/或CD8+T细胞的亚型和亚群包括幼稚T(T_N)细胞、效应T细胞(T_EFF)、记忆T细胞及其亚型(诸如干细胞记忆T(T_SCM)、中枢记忆T(T_CM)、效应记忆T(T_EM)或终末分化效应记忆T细胞)、肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)、未成熟T细胞、成熟T细胞、辅助T细胞、细胞毒性T细胞、粘膜相关恒定T(MAIT)细胞、天然存在和适应性调节T(Treg)细胞、辅助T细胞(诸如TH1细胞、TH2细胞、TH3细胞、TH17细胞、TH9细胞、TH22细胞、滤泡辅助T细胞)、α/βT细胞和δ/γT细胞。

在一些实施方案中，所述细胞是天然杀伤(NK)细胞。在一些实施方案中，所述细胞是单核细胞或粒细胞，例如骨髓细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞和/或嗜碱性粒细胞。

在一些实施方案中，所述细胞包括经由基因工程引入的一种或多种核酸，从而表达此类核酸的重组或基因工程化产物。在一些实施方案中，核酸是异源的，即通常不存在于细胞或从细胞获得的样品中，如从另一种生物或细胞获得的核酸，例如，所述核酸通常不在被工程化的细胞和/或衍生这种细胞的生物中发现。在一些实施方案中，核酸不是天然存在的，诸如自然界中未发现的核酸，包括包含编码来自多种不同细胞类型的各种结构域的核酸的嵌合组合的核酸。

在一些实施方案中，工程化细胞的制备包括一个或多个培养和/或制备步骤。用于引入编码转基因受体(诸如CAR)的核酸的细胞可以从样品(诸如生物样品，例如从受试者获得或源自受试者的生物样品)分离。在一些实施方案中，分离出细胞的受试者是患有疾病或病症或需要细胞疗法或将对其施用细胞疗法的受试者。在一些实施方案中，所述受试者是需要特定治疗性干预(诸如过继细胞疗法，其中细胞被分离、加工和/或工程化)的人。

因此，在一些实施方案中，所述细胞是原代细胞，例如原代人细胞。所述样品包括直接取自受试者的组织、体液和其他样品，以及来自一个或多个加工步骤(诸如分离、离心、基因工程化(例如用病毒载体转导)、洗涤和/或孵育)的样品。所述生物样品可以是直接从生物来源获得的样品或经过处理的样品。所述生物样品包括但不限于体液(诸如血液、血浆、血清、脑脊液、滑液、尿液和汗液)、组织和器官样品，包括由其衍生的加工样品。

在一些方面，所述细胞从其中衍生或分离的样品是血液或血液衍生的样品，或者是或源自单采术或白细胞单采术产物。示例性样品包括全血、外周血单核细胞(PBMC)、白细胞、骨髓、胸腺、组织活检、肿瘤、白血病、淋巴瘤、淋巴结、肠相关淋巴组织、黏膜相关淋巴组织、脾、其他淋巴组织、肝、肺、胃、肠、结肠、肾、胰腺、乳房、骨、前列腺、子宫颈、睾丸、卵巢、扁桃体或其他器官和/或由其衍生的细胞。在细胞疗法(例如过继细胞疗法)的背景下，所述样品包括来自自体和同种异体来源的样品。

在一些实施方案中，所述细胞源自细胞系，例如T细胞系。在一些实施方案中，所述细胞获得自异种来源，例如获得自小鼠、大鼠、非人灵长类动物和猪。

在一些实施方案中，所述细胞的分离包括一个或多个制备和/或基于非亲和力的细胞分离步骤。在一些例子中，将所述细胞在一种或多种试剂的存在下洗涤、离心和/或孵育，例如以去除不需要的组分、针对所需组分进行富集、裂解或去除对特定试剂敏感的细胞。在一些例子中，基于一种或多种特性(诸如密度、粘附特性、尺寸、对特定组分的敏感性和/或抗性)分离细胞。

在一些例子中，来自受试者循环血液的细胞例如通过单采术或白细胞单采术获得。在一些方面，所述样品含有淋巴细胞(包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞)、其他有核白细胞、红细胞和/或血小板，并且在一些方面含有除红细胞和血小板之外的细胞。

在一些实施方案中，洗涤从受试者收集的血细胞，例如以去除血浆级分并将细胞置于适当的缓冲液或介质中以用于随后的加工步骤。在一些实施方案中，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤所述细胞。在一些实施方案中，所述洗涤溶液缺乏钙和/或镁和/或许多或所有二价阳离子。在一些方面，根据制造商的说明书，通过半自动“流通”离心机(例如，Cobe2991细胞加工器，Baxter)完成洗涤步骤。在一些方面，根据制造商的说明书，通过切向流过滤(TFF)完成洗涤步骤。在一些实施方案中，洗涤后将细胞重悬于多种生物相容性缓冲液(例如像不含Ca⁺⁺/Mg⁺⁺的PBS)中。在某些实施方案中，去除血细胞样品的组分并将所述细胞直接重悬于培养基中。

在一些实施方案中，所述方法包括基于密度的细胞分离方法，诸如通过裂解红细胞并通过Percoll或Ficoll梯度离心而从外周血制备白细胞。

在一些实施方案中，分离方法包括基于细胞中一种或多种特定分子(诸如表面标记，例如表面蛋白、细胞内标记或核酸)的表达或存在来分离不同细胞类型。在一些实施方案中，可以使用任何已知的基于此类标记的分离方法。在一些实施方案中，分开是基于亲和力或基于免疫亲和力的分开。例如，在一些方面，所述分离包括基于所述细胞的一种或多种标记(通常为细胞表面标记)的表达或表达水平来分离细胞和细胞群，例如通过和与此类标记特异性结合的抗体或结合配偶体一起孵育，然后通常是洗涤步骤和从那些未与所述抗体或结合配偶体结合的细胞中分离已结合所述抗体或结合配偶体的细胞。

此类分离步骤可以基于阳性选择(其中保留已经结合所述试剂的细胞以供进一步使用)和/或阴性选择(其中保留未与所述抗体或结合配偶体结合的细胞)。在一些例子中，保留两种级分以供进一步使用。在一些方面，在没有可用于特异性鉴定异质群体中的细胞类型的抗体的情况下，阴性选择可能特别有用，使得最好基于由除所需群体之外的细胞表达的标记进行分离。

分离无需导致特定细胞群或表达特定标记的细胞的100％富集或去除。例如，针对特定类型的细胞(诸如表达标记的那些)的阳性选择或富集是指增加此类细胞的数量或百分比，但不需要导致不表达所述标记的细胞的完全不存在。同样地，特定类型的细胞(诸如表达标记的那些)的阴性选择、去除或耗尽是指减少此类细胞的数量或百分比，但不需要导致所有此类细胞的完全去除。

在一些例子中，进行多轮分离步骤，其中来自一个步骤的阳性或阴性选择的级分经受另一个分离步骤，诸如随后的阳性或阴性选择。在一些例子中，单个分离步骤可以同时耗竭表达多种标记的细胞，诸如通过将细胞与多种抗体或结合配偶体(每种抗体或结合配偶体对被靶向用于阴性选择的标记具特异性)一起孵育。同样地，通过将细胞与在各种细胞类型上表达的多种抗体或结合配偶体一起孵育，可以同时阳性选择多种细胞类型。

例如，在一些方面，T细胞的特定亚群，诸如对一种或多种表面标记呈阳性或高水平表达的细胞(例如CD28⁺、CD62L⁺、CCR7⁺、CD27⁺、CD127⁺、CD4⁺、CD8⁺、CD45RA⁺和/或CD45RO⁺T细胞)通过阳性或阴性选择技术来分离。

例如，可以使用抗CD3/抗CD28缀合的磁珠(例如，

M-450 CD3/CD28T细胞扩增器)阳性选择CD3⁺、CD28⁺T细胞。

在一些实施方案中，通过经由阳性选择富集特定细胞群，或经由阴性选择耗尽特定细胞群来进行分离。在一些实施方案中，通过将细胞与一种或多种抗体或其他结合剂一起孵育来完成阳性或阴性选择，所述一种或多种抗体或其他结合剂与分别在阳性或阴性选择的细胞上表达或以相对较高水平(标记^高)(标记⁺)的一种或多种表面标记特异性结合。

在一些实施方案中，通过阴性选择在非T细胞(诸如B细胞、单核细胞或其他白细胞，诸如CD14)上表达的标记，将T细胞与PBMC样品分离。在一些方面，CD4⁺或CD8⁺选择步骤用于分离CD4⁺辅助T细胞和CD8⁺细胞毒性T细胞。通过对在一种或多种幼稚、记忆和/或效应T细胞亚群上表达或以相对较高程度表达的标记的阳性或阴性选择，可以将此类CD4⁺和CD8⁺群体还分类成亚群。

在一些实施方案中，诸如通过基于与相应子群体相关的表面抗原进行阳性或阴性选择，将CD8⁺细胞针对幼稚、中枢记忆、效应子记忆和/或中枢记忆干细胞进一步富集或耗尽。在一些实施方案中，针对中枢记忆T(T_CM)细胞进行富集以增加功效，诸如以改善施用后的长期存活、扩增和/或植入，这在一些方面在此类亚群中特别稳健。参见Terakura等人(2012)Blood,1:72–82；Wang等人(2012)J Immunother.35(9):689-701。在一些实施方案中，组合富含T_CM的CD8⁺T细胞与CD4⁺T细胞进一步增强功效。

在实施方案中，记忆T细胞存在于CD8⁺外周血淋巴细胞的CD62L⁺和CD62L^-两个子集中。可以将PBMC针对CD62L^-CD8⁺和/或CD62L⁺CD8⁺级分进行富集或耗尽，诸如使用抗CD8和抗CD62L抗体。

在一些实施方案中，对中枢记忆T(T_CM)细胞的富集是基于CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD3和/或CD127的阳性或高表面表达；在一些方面，这是基于表达或高度表达CD45RA和/或颗粒酶B的细胞的阴性选择。在一些方面，富含T_CM细胞的CD8⁺群体的分离是通过耗尽表达CD4、CD14、CD45RA的细胞以及对表达CD62L的细胞的阳性选择或富集来进行的。在一个方面，中枢记忆T(T_CM)细胞的富集从基于CD4表达所选择的阴性细胞级分开始进行，所述阴性细胞级分基于CD14和CD45RA的表达进行阴性选择且基于CD62L进行阳性选择。在一些方面这种选择是同时进行的，而在其他方面以任何顺序依序进行。在一些方面，用于制备CD8⁺细胞群或亚群的相同的基于CD4表达的选择步骤也用于生成CD4⁺细胞群或亚群，使得来自基于CD4的分离的阳性和阴性级分被保留并用于所述方法的后续步骤中，任选地在一个或多个其他阳性或阴性选择步骤之后。

在特定例子中，PBMC样品或其他白细胞样品进行CD4+细胞的选择，其中保留了阴性和阳性级分。然后所述阴性级分基于CD14和CD45RA或CD19的表达进行阴性选择，并基于中枢记忆T细胞(诸如CD62L或CCR7)的标记特征进行阳性选择，其中以任何顺序进行所述阳性和阴性选择。

通过鉴定具有细胞表面抗原的细胞群，将CD4+T辅助细胞分类为幼稚、中枢记忆和效应细胞。CD4⁺淋巴细胞可以通过标准方法获得。在一些实施方案中，幼稚CD4⁺T淋巴细胞是CD45RO^-、CD45RA⁺、CD62L⁺、CD4⁺T细胞。在一些实施方案中，中枢记忆CD4⁺细胞是CD62L⁺且CD45RO⁺。在一些实施方案中，效应CD4⁺细胞是CD62L^-且CD45RO^-。

在一个例子中，为了通过阴性选择富集CD4⁺细胞，单克隆抗体混合剂通常包括针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。在一些实施方案中，所述抗体或结合配偶体与固体支持物或基质(诸如磁珠或顺磁珠)结合，以允许细胞分离以用于阳性和/或阴性选择。例如，在一些实施方案中，使用免疫磁性(或亲和磁性)分开技术来分开或分离细胞和细胞群(综述于Methods in Molecular Medicine,第58卷:Metastasis ResearchProtocols,第2卷:Cell Behavior In Vitro and In Vivo,第17-25页S.A.Brooks和U.Schumacher编辑

Humana Press Inc.,新泽西州托托瓦)。

在一些方面，将要分离的细胞的样品或组合物与小的可磁化或磁响应材料(诸如磁响应颗粒或微粒，诸如顺磁珠(例如，诸如Dynalbeads或MACS珠))一起孵育。磁响应材料(例如，颗粒)通常直接或间接地附着于结合配偶体(例如，抗体)，所述结合配偶体与希望分离(例如，希望阴性地或阳性地选择)的一个细胞、多个细胞或细胞群上存在的分子(例如，表面标记)特异性结合。

在一些实施方案中，所述磁性颗粒或珠包含与特异性结合成员(诸如抗体或其他结合配偶体)结合的磁响应材料。有许多在磁分离方法中使用的熟知的磁响应材料。合适的磁性颗粒包括在Molday的美国专利号4,452,773和欧洲专利说明书EP 452342B中所述的那些，将所述专利通过引用特此并入。其他的例子有胶体大小的颗粒(例如在Owen的美国专利号4,795,698；和Liberti等人的美国专利号5,200,084中所述的那些)。

孵育通常在这样的条件下进行，由此抗体或结合配偶体或者与附着于磁性颗粒或珠的此类抗体或结合配偶体特异性结合的分子(诸如二抗或其他试剂)与细胞表面分子(如果存在于所述样品内的细胞上的话)特异性结合。

在一些方面，将样品置于磁场中，并且具有附着于其上的磁响应或可磁化颗粒的那些细胞将被吸引到磁体并与未标记的细胞分离。对于阳性选择，保留被磁铁吸引的细胞；对于阴性选择，保留未被吸引的细胞(未标记的细胞)。在一些方面，在同一选择步骤期间进行阳性和阴性选择的组合，其中保留阳性和阴性级分并进一步处理或经受另外的分离步骤。

在某些实施方案中，磁响应颗粒被包被在一抗或其他结合配偶体、二抗、凝集素、酶或链霉亲和素中。在某些实施方案中，所述磁性颗粒通过对一种或多种标记具特异性的一抗的包被而附着于细胞。在某些实施方案中，用一抗或结合配偶体标记所述细胞而不是珠，并且然后添加细胞类型特异性二抗或其他结合配偶体(例如链霉亲和素)包被的磁性颗粒。在某些实施方案中，将链霉亲和素包被的磁性颗粒与生物素化的一抗或二抗结合使用。

在一些实施方案中，磁响应颗粒保持附着于所述细胞，所述细胞随后被孵育，培养和/或工程化；在一些方面，所述颗粒保持附着于所述细胞以用于施用于患者。在一些实施方案中，从所述细胞中去除可磁化或磁响应颗粒。从细胞中去除可磁化颗粒的方法是已知的，并且包括例如使用竞争的非标记抗体和与可切割接头缀合的可磁化颗粒或抗体。在一些实施方案中，所述可磁化颗粒是可生物降解的。

在一些实施方案中，基于亲和力的选择是经由磁激活细胞分选(MACS)(MiltenyiBiotec，加利福尼亚州奥本)。磁激活细胞分选(MACS)系统能够高纯度选择附着有磁化颗粒的细胞。在某些实施方案中，MACS以这样的模式操作，其中在施加外部磁场之后依序洗脱非靶标和靶标种类。也就是说，附着于磁化颗粒的细胞保持在适当的位置，而未附着的种类被洗脱。然后，在完成第一次洗脱步骤之后，以某种方式释放被捕获在磁场中并被阻止洗脱的种类，使得它们可以被洗脱和回收。在某些实施方案中，所述非靶细胞被标记并从异质细胞群中耗尽。

在某些实施方案中，使用这样的系统、装置或设备进行分离或分开，所述系统、装置或设备进行所述方法的分离、细胞制备、分开、加工、孵育、培养和/或制备步骤中的一种或多种。在一些方面，所述系统用于在封闭或无菌环境中进行这些步骤中的每一个，例如以最小化错误、用户操作和/或污染。在一个例子中，所述系统是如国际专利申请公开号WO2009/072003或US 20110003380 A1中所述的系统。

在一些实施方案中，所述系统或设备在集成或独立系统中和/或以自动化或可编程方式进行分离、处理、工程化和配制步骤中的一个或多个(例如，全部)。在一些方面，所述系统或设备包括与所述系统或设备通信的计算机和/或计算机程序，其允许用户对加工、分离、工程化和配制步骤的各个方面进行编程、控制、评估其结果和/或调整。

在一些方面，使用CliniMACS系统(Miltenyi Biotec)进行所述分离和/或其他步骤，例如以用于在封闭和无菌系统中在临床规模水平上自动分离细胞。部件可以包括集成微计算机、磁分离单元、蠕动泵和各种夹管阀。在一些方面，所述集成计算机控制所述仪器的所有部件并指示所述系统以标准化顺序执行重复程序。在一些方面，所述磁分离单元包括可移动的永磁体和用于选择柱的支架。所述蠕动泵控制整个管组(tubing set)的流速，并与夹管阀一起确保缓冲液通过所述系统的受控流动和细胞的连续悬浮。

在一些方面，所述CliniMACS系统使用抗体偶联的可磁化颗粒，其在无菌、无热原的溶液中提供。在一些实施方案中，在用磁性颗粒标记细胞后，洗涤所述细胞以去除过量的颗粒。然后将细胞制备袋连接到管组，所述管组又连接到含有缓冲液的袋和细胞收集袋。所述管组由预装配的无菌管(包括预柱和分离柱)组成，并且仅供一次性使用。在开始分离程序后，所述系统自动将细胞样品施加到分离柱。标记的细胞保留在柱内，而未标记的细胞通过一系列洗涤步骤去除。在一些实施方案中，用于与本文所述的方法一起使用的细胞群是未标记的并且不保留在柱中。在一些实施方案中，用于与本文所述的方法一起使用的细胞群被标记并保留在柱中。在一些实施方案中，用于与本文所述的方法一起使用的细胞群在去除磁场后从柱中洗脱，并且收集在细胞收集袋内。

在某些实施方案中，使用CliniMACS Prodigy系统(Miltenyi Biotec)进行分离和/或其他步骤。在一些方面，CliniMACS Prodigy系统配备有细胞加工联合体，其允许通过离心自动化洗涤和分级分离细胞。CliniMACS Prodigy系统还可以包括机载相机和图像识别软件，其通过辨别源细胞产物的宏观层来确定最佳的细胞分级分离终点。例如，外周血自动分离成红细胞、白细胞和血浆层。CliniMACS Prodigy系统还可以包括集成细胞培育室，其实现细胞培养方案例如细胞分化和扩增、抗原加载和长期细胞培养。输入端口可以、允许无菌移除和补充培养基，并且可以使用集成显微镜监测细胞。参见例如Klebanoff等人(2012)J Immunother.35(9):651–660；Terakura等人(2012)Blood.1:72–82；以及Wang等人(2012)J Immunother.35(9):689-701。

在一些实施方案中，通过流式细胞术收集和富集(或耗尽)本文所述的细胞群，其中针对多种细胞表面标记染色的细胞在流体流中载携。在一些实施方案中，经由制备规模(荧光激活细胞分选，FACS)分选来收集并富集(或耗尽)本文所述的细胞群。在某些实施方案中，通过使用微机电系统(MEMS)芯片结合基于FACS的检测系统来收集和富集(或耗尽)本文所述的细胞群(参见例如，WO 2010/033140，Cho等人(2010)Lab Chip 10,1567-1573；以及Godin等人(2008)J Biophoton.1(5):355–376。在两种情况下，细胞可以用多种标记来标记，允许以高纯度分离明确定义的T细胞子集。

在一些实施方案中，用一种或多种可检测标记来标记抗体或结合配偶体，以促进分离供阳性和/或阴性选择。例如，分离可能基于与荧光标记的抗体的结合。在一些例子中，基于对一种或多种细胞表面标记具有特异性的抗体或其他结合配偶体的结合来分离细胞携载于流体流中，诸如通过荧光激活细胞分选(FACS)(包括制备规模(FACS))和/或微机电系统(MEMS)芯片，例如与流式细胞检测系统组合。此类方法允许基于多种标记同时进行阳性和阴性选择。

在一些实施方案中，制备方法包括在分离、孵育和/或工程化之前或之后冷冻(例如，冷冻保存)细胞的步骤。在一些实施方案中，所述冷冻和后续解冻步骤去除所述细胞群中的粒细胞，并且在一定程度上去除单核细胞。在一些实施方案中，例如在洗涤步骤之后将细胞悬浮在冷冻溶液中以去除血浆和血小板。在一些方面，可以使用多种已知的冷冻溶液和参数中的任何一种。一个例子涉及使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白(HSA)的PBS，或其他合适的细胞冷冻培养基。然后将其用培养基1:1稀释，使得DMSO和HSA的最终浓度分别为10％和4％。然后通常将所述细胞以1℃/分钟的速率冷冻至-80℃并储存在液氮储罐的气相中。

在一些实施方案中，在基因工程化之前或与其相连地孵育和/或培养细胞。所述孵育步骤可以包括培养、培育、刺激、激活和/或繁殖。孵育和/或工程化可以在培养容器中进行，所述培养容器是如单元、室、孔、柱、管、管组、阀、小瓶、培养皿、袋或其他用于培养或培育细胞的容器。在一些实施方案中，在刺激条件或刺激剂的存在下孵育所述组合物或细胞。这些条件包括针对以下而设计的那些条件：用于诱导群体中细胞的增殖、扩增、激活和/或存活的条件，用于模拟抗原暴露和/或用于引发细胞进行基因工程化，诸如以引入重组抗原受体。

所述条件可以包括以下中的一种或多种：特定培养基、温度、氧含量、二氧化碳含量、时间、药剂(例如，营养素、氨基酸、抗生素、离子和/或刺激因子(诸如细胞因子、趋化因子、抗原、结合配偶体、融合蛋白、重组可溶受体和设计为激活细胞的任何其他药剂))。

在一些实施方案中，刺激条件或刺激剂包括能够激活或刺激TCR复合物的细胞内信号传导结构域的一种或多种药剂(例如，配体)。在一些方面，所述药剂在T细胞中开启或启动TCR/CD3细胞内信号传导级联。此类药剂可以包括抗体，诸如对于TCR具有特异性的抗体，例如抗CD3。在一些实施方案中，刺激条件包括一种或多种药剂例如配体，其能够刺激共刺激受体，例如抗CD28。在一些实施方案中，这种药剂和/或配体可结合至固体支撑物如珠和/或一种或多种细胞因子。任选地，扩增方法可以还包括向培养基中添加抗CD3和/或抗CD28抗体(例如，浓度为至少约0.5ng/mL)的步骤。在一些实施方案中，所述刺激剂包括IL-2、IL-15和/或IL-7。在一些方面，IL-2浓度为至少约10单位/mL。

在一些方面，孵育是根据多种技术来进行，例如以下文献中所述的那些技术：授予Riddell等人的美国专利号6,040,177；Klebanoff等人(2012)J Immunother.35(9):651–660；Terakura等人(2012)Blood.1:72–82；和/或Wang等人(2012)J Immunother.35(9):689-701。

在一些实施方案中，通过以下方法扩增T细胞：向培养起始组合物中添加饲养细胞，诸如非分裂外周血单核细胞(PBMC)(例如，使得对于要扩增的初始群体中的每个T淋巴细胞，所得细胞群含有至少约5、10、20或40个或更多个PBMC饲养细胞)；以及孵育培养物(例如，持续足以扩增T细胞数量的时间)。在一些方面，非分裂饲养细胞可以包含γ照射的PBMC饲养细胞。在一些实施方案中，用约3000至3600拉德范围内的γ射线照射PBMC以防止细胞分裂。在一些方面，在添加T细胞群之前将饲养细胞添加到培养基中。

在一些实施方案中，刺激条件包括适合于人T淋巴细胞生长的温度，例如至少约25摄氏度，通常为至少约30摄氏度，并且通常在或在约37摄氏度。任选地，孵育还可以包括添加非分裂的EBV转化的类淋巴母细胞(LCL)作为饲养细胞。可以用约6000至10,000拉德范围内的γ射线照射LCL。在一些方面，所述LCL饲养细胞以任何合适的量(诸如LCL饲养细胞与初始T淋巴细胞的比率为至少约10:1)提供。

在实施方案中，通过用抗原刺激幼稚或抗原特异性T淋巴细胞获得抗原特异性T细胞，诸如抗原特异性CD4+和/或CD8+T细胞。例如，可以通过从受感染的受试者中分离T细胞并用相同的抗原在体外刺激细胞，针对巨细胞病毒抗原产生抗原特异性T细胞系或克隆。

C.制造工程化细胞的方法

在特定实施方案中，所述工程化细胞通过如下过程来产生，所述过程从一种或多种输入组合物和/或从单个生物样品产生经富集T细胞的输出组合物。在某些实施方案中，所述输出组合物含有表达重组受体(例如CAR，诸如抗BCMA CAR)的细胞。在特定实施方案中，输出组合物的细胞适合用于作为疗法(例如自体细胞疗法，包括根据任何所提供的方法)施用于受试者。在一些实施方案中，输出组合物是富集CD3+T细胞或富集CD4+和CD8+T细胞的组合物。通过涉及在将核酸整合到细胞基因组中的条件下将编码CAR(例如抗BCMACAR)的核酸引入细胞中的方法对T细胞进行工程化。在一些实施方案中，工程化方法包括用病毒载体(诸如慢病毒载体)转导。在特定实施方案中，通过将细胞与寡聚试剂(例如链霉亲和素突变蛋白寡聚物)接触来激活或刺激T细胞。在一些实施方案中，通过在96小时或更短时间内完成的用寡聚试剂(例如链霉亲和素突变蛋白寡聚物)刺激细胞的过程对所述细胞进行工程化。在一些实施方案中，所提供的方法不包括在所述过程期间扩增细胞或增加细胞数量的步骤。PCT/US 2019/046062(通过引用以其整体并入)中披露了制造和通过此类方法产生的工程化细胞的示例性方法。

在特定实施方案中，所提供的方法与用于生成或产生工程化T细胞的输出细胞和/或输出群体的完整过程结合使用，所述完整过程诸如包括以下步骤中的一些或全部的过程：刺激来自输入群体的细胞；工程化、转化、转导或转染刺激的细胞以表达或含有异源或重组多核苷酸，例如，编码重组受体(诸如CAR)的多核苷酸；孵育所述细胞，从所述细胞去除或分离刺激试剂，并且收获和收集所述细胞，在一些方面由此产生工程化T细胞的输出群体。

在一些实施方案中，所提供的方法与用于生成或产生富集T细胞的输出细胞和/或输出组合物的完整过程结合使用，所述完整过程诸如包括以下步骤中的一些或全部的过程：收集或获得生物样品；从生物样品分离、选择或富集输入细胞；低温冷冻并储存输入细胞，然后解冻；刺激所述细胞；对刺激的细胞进行基因工程化以表达或含有重组多核苷酸，例如，编码重组受体(诸如CAR)的多核苷酸；配制输出组合物中的工程化细胞；以及低温冷冻并储存配制的输出细胞，直至释放所述细胞用于输注和/或施用于受试者。在一些实施方案中，所提供的方法不包括在所述过程期间扩增细胞或增加细胞数量的步骤，所述步骤诸如通过在生物反应器中在一定条件下培育细胞来进行，其中细胞扩增至诸如阈值量，所述阈值量与输入群体相比为至少3倍、4倍、5倍或更多倍的细胞量、水平或浓度。在一些实施方案中，将细胞基因工程化是或包括用病毒载体转导细胞的步骤，所述步骤如通过以下方式来进行：在病毒颗粒的存在下旋转接种细胞，然后在静态条件下在病毒颗粒的存在下孵育所述细胞。

在某些实施方案中，用于产生工程化细胞的所提供过程从开始刺激到收集、收获或配制细胞的总持续时间为、为约或小于36小时、42小时、48小时、54小时、60小时、72小时、84小时、96小时、108小时或120小时。在某些实施方案中，用于产生工程化细胞的所提供过程从开始刺激到收集、收获或配制细胞的总持续时间为、为约或小于1.5天、2天、3天、4天或5天。在一些实施方案中，用于产生工程化细胞的所提供过程从开始刺激到收集、收获或配制细胞的总持续时间在或在约36小时与120小时之间、48小时与96小时之间或48小时与72小时之间，包含端值，或者在或在约1.5天与5天之间、2天与4天之间或2天与3天之间，包含端值。在特定实施方案中，如从开始孵育到收获、收集或配制细胞所测量的完成所提供过程的时间量为、为约或小于48小时、72小时或96小时，或者为、为约或小于2天、3天或4天。在特定实施方案中，如从开始孵育到收获、收集或配制细胞所测量的完成所提供过程的时间量为48小时±6小时、72小时±6小时或96小时±6小时。

在一些实施方案中，例如在以下时间完成如章节II-C-5中所公开的孵育：在开始刺激之后的在或在约24小时与120小时之间、36小时与108小时之间、48小时与96小时之间、或48小时与72小时之间，包含端值。在一些实施方案中，在以下时间、约以下时间或以下时间内完成所述孵育：从开始刺激起120小时、108小时、96小时、72小时、48小时或36小时。在特定实施方案中，所述孵育在24小时±6小时、48小时±6小时或72小时±6小时之后完成。在一些实施方案中，在开始刺激后的以下时间完成所述孵育：在或在约一天与5天之间、1.5天与4.5天之间、2天与4天之间或2天与3天之间，包含端值。在一些实施方案中，在从开始刺激起的以下时间、约以下时间或以下时间内完成所述孵育：5天、4天、3天、2天或1.5天。

在一些实施方案中，整个过程用富集的T细胞(例如，CD4+和CD8+T细胞)的单一群体来进行。在某些实施方案中，所述过程用富集的T细胞(例如，CD4和CD8细胞)的两种或更多种输入群体进行，所述两种或更多种输入群体在生成或产生富集的T细胞的单一输出群体的过程之前和/或期间进行组合。在一些实施方案中，经富集T细胞是或包含工程化的T细胞，例如，转导以表达重组受体的T细胞。

在一些实施方案中，输出群体(例如，工程化T细胞的群体)通过以下方式产生：(i)将T细胞的输入群体或含有T细胞的输入群体在刺激条件下孵育在或在约18小时与30小时之间，包含端值，(ii)将编码重组受体的异源或重组多核苷酸引入受刺激的群体的T细胞中，(iii)孵育所述细胞，然后(iv)收集或收获孵育的细胞。

在一些实施方案中，开始在刺激条件下孵育之后的36小时与108小时之间或1.5天与4.5天之间内，收集或收获细胞。在特定实施方案中，在转化的(例如，基因工程化、转导或转染的)T细胞达到每个基因组的稳定的整合载体拷贝数(iVCN)(其在24-48小时或一天至两天的跨度内增加或减少不超过20％)之后48小时或两天内，收集或收获细胞。在一些实施方案中，当所测量的细胞群的iVCN在所述群体中测量的总载体拷贝数(VCN)的为或约20％、15％、10％或5％内时，认为整合是稳定的。特定实施方案考虑，为了实现稳定整合，在将病毒载体接触或引入细胞之后，必须将细胞孵育为、为约或为至少48小时、60小时或72小时或者一天、2天或3天。在一些实施方案中，稳定整合发生在孵育的为或为约72小时内。在一些实施方案中，在转化的T细胞的总数量为或小于输入群体中细胞的总数量时的时间，收集或收获细胞。在各种实施方案中，在输入群体的细胞已经倍增超过三次、两次或一次之前的时间，收集或收获细胞。PCT/US 2019/046048(通过引用以其整体并入)中披露了VCN和iVCN测定的示例性方法和组合物。

在某些实施方案中，输出群体(例如，工程化T细胞的群体)通过以下方式产生：(i)将包含T细胞的输入群体在刺激试剂(例如，本文如在章节II-C-2中所述的刺激试剂)的存在下在刺激条件下孵育18小时与30小时之间，包含端值，(ii)用编码重组受体的病毒载体转导刺激的T细胞，如通过在所述病毒载体的存在下旋转接种刺激的T细胞来进行，(iii)将转导的T细胞在静态条件下孵育在或在18小时与96小时之间，包含端值，以及(iv)在开始于刺激条件下孵育之后在或在约36小时与108小时内，收获转化的群体的T细胞。

在一些实施方案中，将与所提供方法相关的过程与替代性过程进行比较。例如，在一些实施方案中，将本文所提供的方法与含有用于扩增细胞的步骤的替代性过程相比较。在特定实施方案中，替代性过程可以在一个或多个特定方面不同，但在其他方面含有与所提供方法相关的过程相似或相同的特征、方面、步骤、阶段、试剂和/或条件。在一些实施方案中，替代性过程类似于与所提供的方法相关的过程，例如，缺少或不包括扩增，但是不同之处包括但不限于以下中的一种或多种：不同的试剂和/或培养基配制品；在孵育、转导、转染和/或孵育工程化细胞期间血清的存在；输入群体的不同的细胞组成，例如，CD4+与CD8+T细胞的比率；不同的刺激条件和/或不同的刺激试剂；不同的刺激试剂与细胞的比率；不同的转导载体和/或方法；不同的孵育、转导和/或转染细胞的时间安排或顺序；在孵育或转导期间存在的一种或多种重组细胞因子的不存在或差异(例如，不同的细胞因子或不同浓度)；或者不同的收获或收集细胞的时间安排。

在一些实施方案中，如从分离、富集和/或选择来自生物样品的输入细胞(例如，CD4+或CD8+T细胞)至收集、配制和/或低温保护输出细胞的时间所测量，完成所提供过程所需的持续时间或时间量是为、为约或小于48小时、72小时、96小时、120小时、2天、3天、4天、5天、7天或10天。在一些实施方案中，分离、选择或富集的细胞在刺激之前未进行低温保护，并且如从分离、富集和/或选择输入细胞(至收集、配制和/或低温保护输出细胞的时间)所测量，完成所提供过程所需的持续时间或时间量是为、为约或小于48小时、72小时、96小时、或120小时、或2天、3天、4天、或5天。

在某些实施方案中，对从生物样品分离、富集或选择的细胞(例如，CD4+和CD8+T细胞)的群体进行所提供的过程。在一些方面，所提供的方法可以从自受试者收集生物样品时起，在如与其他方法或过程相比缩短的时间量内，产生或生成工程化T细胞的组合物。在一些实施方案中，所提供的方法可以从自受试者收集生物样品时至收集、收获或配制工程化T细胞(例如，用于低温保存或施用)时，在或在约10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天、3天、2天内，或者在或在约120小时、96小时、72小时或48小时内，产生或生成工程化T细胞，包括在用于刺激或转导的步骤之前对生物样品或者富集、分离或选择的细胞进行低温保存和储存的任何或所有时间。在特定实施方案中，所提供的方法可以从自受试者收集生物样品时至收集、收获或配制工程化T细胞时，在或在约6天与8天之间(包含端值)内，产生或生成工程化T细胞，包括在用于刺激或转导的步骤之前对生物样品或者富集、分离或选择的细胞进行低温保存和储存的任何或所有时间。

在某些实施方案中，所提供的方法与生成或产生富集的T细胞的输出细胞和/或输出群体的过程结合使用。在特定实施方案中，富集的T细胞的输出细胞和/或输出群体是或包括如下细胞：从生物样品(诸如血液样品或白细胞单采术样品)收集、获得、分离、选择和/或富集；在刺激条件下孵育；工程化(例如，转导)以表达或含有重组多核苷酸，例如，编码重组受体(诸如CAR)的多核苷酸；孵育至阈值细胞量或密度；和/或进行配制。在一些实施方案中，例如，在所述过程的一个或多个步骤期间、之前和/或之后，输出群体的细胞先前已经进行低温保护和解冻。在一些实施方案中，输出群体含有表达重组受体(例如，CAR)的T细胞，例如，CD4+T细胞和CD8+T细胞。

在一些实施方案中，输出群体中至少30％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、或至少90％、至少95％的细胞表达重组受体。在某些实施方案中，输出组合物中至少50％的细胞表达重组受体。在某些实施方案中，输出组合物中至少30％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的CD3+T细胞表达重组受体。在一些实施方案中，输出组合物中至少50％的CD3+T细胞表达重组受体。在特定实施方案中，输出组合物中至少至少30％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或超过99％的CD4+T细胞表达重组受体。在特定实施方案中，输出组合物中至少50％的CD4+T细胞表达重组受体。在一些实施方案中，输出组合物中至少至少30％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或超过99％的CD8+T细胞表达重组受体。在某些实施方案中，输出组合物中至少50％的CD8+T细胞表达重组受体。

在特定实施方案中，如与通过替代性过程(例如，包括扩增细胞的一个或多个步骤的过程)产生的输出细胞相比，所述输出组合物的细胞具有改进的针对表达由重组受体结合和/或识别的抗原的细胞(例如，靶细胞)的细胞溶解活性。在一些实施方案中，当所述输出组合物的所述细胞暴露于表达所述抗原的细胞(例如，靶细胞)时，所述输出组合物的所述细胞杀伤、杀伤约或杀伤至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的表达所述抗原的细胞。在某些实施方案中，输出组合物的细胞比相似或相同条件下通过替代性过程产生的输出细胞多杀伤至少25％、50％、75％、100％、150％或者1倍、2倍、3倍、4倍或5倍的量的表达抗原的细胞(例如，靶细胞)。

在特定实施方案中，如与通过替代性过程(例如，包括扩增细胞的一个或多个步骤的过程)产生的输出细胞相比，输出群体的细胞具有改进的体内抗肿瘤活性。在一些实施方案中，在将输出组合物的细胞施用于受试者(例如，患有肿瘤或癌症的受试者)时，输出群体的细胞杀伤、杀伤约或杀伤至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的受试者体内的肿瘤细胞(例如，表达抗原的癌细胞或肿瘤细胞)。在某些实施方案中，输出组合物的细胞比相似或相同条件下通过替代性过程产生的输出细胞多杀伤至少25％、50％、75％、100％、150％或者1倍、2倍、3倍、4倍或5倍的量的体内肿瘤细胞。

在特定实施方案中，输出群体的大多数细胞是幼稚样、中枢记忆和/或效应记忆细胞。在特定实施方案中，输出群体的大多数细胞是幼稚样或中枢记忆细胞。在一些实施方案中，输出群体的大多数细胞对CCR7或CD27表达中的一种或多种呈阳性。在某些实施方案中，输出群体的细胞具有比从替代性过程(诸如涉及扩增的过程)产生的输出群体更大份额的幼稚样或中枢记忆细胞。

在某些实施方案中，输出群体的细胞具有低份额和/或频率的被耗竭的和/或衰老的细胞。在特定实施方案中，输出群体的细胞具有低份额和/或频率的被耗竭的和/或衰老的细胞。在一些实施方案中，输出群体中小于40％、小于35％、小于30％、小于25％、小于20％、小于15％、小于10％、小于5％或小于1％的细胞是被耗竭的和/或衰老的。在某些实施方案中，输出群体中小于25％的细胞是被耗竭的和/或衰老的。在某些实施方案中，输出群体中小于小于10％的细胞是被耗竭的和/或衰老的。在特定实施方案中，所述细胞具有低份额

在一些实施方案中，输出群体的细胞具有低份额和/或频率的对CD27和CCR7表达(例如，表面表达)呈阴性的细胞。在特定实施方案中，输出群体的细胞具有低份额和/或频率的CD27-CCR7-细胞。在一些实施方案中，输出群体中小于40％、小于35％、小于30％、小于25％、小于20％、小于15％、小于10％、小于5％或小于1％的细胞是CD27-CCR7-细胞。在某些实施方案中，输出群体中小于25％的细胞是CD27-CCR7-细胞。在某些实施方案中，输出群体中小于小于10％的细胞是CD27-CCR7-细胞。在实施方案中，输出群体中小于5％的细胞是CD27-CCR7-细胞。

在一些实施方案中，输出群体的细胞具有高份额和/或频率的对CD27和CCR7表达(例如，表面表达)中的一种或两种呈阳性的细胞。在一些实施方案中，输出群体的细胞具有高份额和/或频率的对CD27和CCR7中的一种或两种呈阳性的细胞。在一些实施方案中，输出群体中至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或大于95％的细胞对CD27和CCR7中的一种或两种呈阳性。在各种实施方案中，输出群体中至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或大于95％的CD4+CAR+细胞对CD27和CCR7中的一种或两种呈阳性。在一些实施方案中，输出群体中至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或大于95％的CD8+CAR+细胞对CD27和CCR7中的一种或两种呈阳性。

在某些实施方案中，输出群体的细胞具有高份额和/或频率的对CD27和CCR7表达(例如，表面表达)呈阳性的细胞。在一些实施方案中，输出群体的细胞具有高份额和/或频率的CD27+CCR7+细胞。在一些实施方案中，输出群体中至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或大于95％的细胞是CD27+CCR7+细胞。在各种实施方案中，输出群体中至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或大于95％的CD4+CAR+细胞是CD27+CCR7+细胞。在一些实施方案中，输出群体中至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或大于95％的CD8+CAR+细胞是CD27+CCR7+细胞。

在某些实施方案中，输出群体的细胞具有低份额和/或频率的对CCR7表达(例如，表面表达)呈阴性并且对CD45RA表达(例如，表面表达)呈阳性的细胞。在一些实施方案中，输出群体的细胞具有低份额和/或频率的CCR7-CD45RA+细胞。在特定实施方案中，输出群体中小于40％、小于35％、小于30％、小于25％、小于20％、小于15％、小于10％、小于5％或小于1％的细胞是CCR7-CD45RA+细胞。在一些实施方案中，输出群体中小于25％的细胞是CCR7-CD45RA+细胞。在特定实施方案中，输出群体中小于小于10％的细胞是CCR7-CD45RA+细胞。在某些实施方案中，输出群体中小于5％的细胞是CCR7-CD45RA+细胞。

在特定实施方案中，在细胞群的为、为约或至少一次、两次、三次、四次、五次、六次、八次、十次、二十次或更多次细胞倍增(例如，在孵育期间发生的倍增)之前，收获细胞。在某些实施方案中，在群体的任何倍增(例如，在孵育期间发生的倍增)之前，收获细胞。在一些方面，减少在工程化过程期间可能发生的倍增将在一些实施方案中增加幼稚样的工程化T细胞的份额。在一些实施方案中，增加工程化过程期间的倍增增加在工程化过程期间可能发生的T细胞分化。

在一些方面，考虑到，对于生成或产生工程化细胞组合物的过程，减少在过程期间(例如，在孵育期间)发生的扩增或细胞倍增增加所得工程化细胞组合物中幼稚样T细胞的量或份额。在特定方面，增加在过程期间发生的扩增或细胞倍增增加所得工程化细胞组合物中分化的T细胞的量或份额。在一些方面，考虑到，增加或增大所得工程化细胞组合物中幼稚样细胞的份额的过程(诸如本文所提供的过程)可以增加施用后工程化细胞组合物例如在体内的效力、功效和持久性。

1.用于基因工程化的细胞和细胞的制备

在一些实施方案中，与所提供的方法、用途、制品或组合物结合使用的细胞(诸如T细胞)是已经进行基因工程化以表达本文所述的重组受体(例如，CAR)的细胞。在一些实施方案中，工程化细胞是在细胞疗法(例如，过继细胞疗法)的情况下使用。在一些实施方案中，工程化细胞是免疫细胞。在一些实施方案中，工程化细胞是T细胞，诸如CD4+或CD8+T细胞。

在特定实施方案中，所提供的方法与从生物样品分离、选择或富集细胞以产生所富集细胞(例如，T细胞)的一个或多个输入群体结合使用。在一些实施方案中，所提供的方法包括从生物样品分离细胞或其群体，所述生物样品如获自或源自受试者的那些，所述受试者如患有特定疾病或病症或者需要细胞疗法或者将被施用细胞疗法的受试者。在一些方面，所述受试者是人，如作为需要特定治疗性干预(诸如过继细胞疗法，其中分离、处理和/或工程化细胞以用于所述过继细胞疗法)的患者的受试者。因此，在一些实施方案中，所述细胞是原代细胞，例如原代人细胞。所述样品包括直接取自受试者的组织、流体和其他样品。所述生物样品可以是直接从生物来源获得的样品或经过处理的样品。所述生物样品包括但不限于体液(诸如血液、血浆、血清、脑脊液、滑液、尿液和汗液)、组织和器官样品，包括由其衍生的加工样品。

在一些方面，所述样品是血液或源自血液的样品，或者源自单采术或白细胞单采术产物。在一些例子中，来自受试者循环血液的细胞例如通过单采术或白细胞单采术获得。在一些方面，所述样品含有淋巴细胞(包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞)、其他有核白细胞、红细胞和/或血小板，并且在一些方面含有除红细胞和血小板之外的细胞。

在一些实施方案中，洗涤从受试者收集的血细胞,例如以去除血浆级分，并将所述细胞置于适当缓冲液或介质中以用于后续的处理步骤。在一些实施方案中，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤所述细胞。在一些实施方案中，所述洗涤溶液缺乏钙和/或镁和/或许多或所有二价阳离子。在一些方面中，根据制造商的说明书，通过半自动“流通”离心机(例如，Cobe2991细胞加工器，Baxter)完成洗涤步骤。在一些方面，根据制造商的说明书，通过切向流过滤(TFF)完成洗涤步骤。在一些实施方案中，洗涤后将细胞重悬于多种生物相容性缓冲液(例如像不含Ca⁺⁺/Mg⁺⁺的PBS)中。在某些实施方案中，去除血细胞样品的组分并将所述细胞直接重悬于培养基中。

在一些实施方案中，洗涤含有细胞的样品(例如，单采术产物或白细胞单采术产物)，以去除在单采术或白细胞单采术期间添加的一种或多种抗凝剂，诸如肝素。

在一些实施方案中，将含有细胞的样品(例如，全血样品、血沉棕黄层样品、外周血单核细胞(PBMC)样品、未分级T细胞样品、淋巴细胞样品、白细胞样品、单采术产物或白细胞单采术产物)低温保存和/或低温保护(例如，冷冻)，然后在用于分离、选择、激活、刺激、工程化、转导、转染、孵育、培养、收获、配制细胞群和/或将配制的细胞群施用于受试者的任何步骤之前，将其解冻并任选地洗涤。

在一些实施方案中，在适于确保用于制造的适当质量的方法中从受试者收集含有自体外周血单核细胞(PBMC)的样品。在一方面，含有PBMC的样品源自分级分离的全血。在一些实施方案中，将来自受试者的全血通过白细胞单采术使用离心力并利用细胞表型之间的密度差异进行分级分离，此时优先富集自体单核细胞(MNC)，同时在所收集细胞组合物中减少其他细胞表型(诸如红细胞)。在一些实施方案中，在MNC收集期间并行收集自体血浆，这在一些方面可以允许延长白细胞单采术产物稳定性。在一方面，将自体血浆添加至白细胞单采术产物以改进白细胞单采术产物基质的缓冲能力。在一些方面，进行处理以生成白细胞单采术产物的全血的总体积为或为约2L、4L、6L、8L、10L、12L、14L、16L、18L或20L，或者是任何前述值之间的任何值。在一些实施方案中，收集的自体血浆的体积为或为约10mL、50mL、100mL、150mL、200mL、250mL或300mL或更多，或者是任何前述值之间的体积。在一些实施方案中，在白细胞单采术收集完成的约48小时内，使白细胞单采术产物经历一种程序，例如，洗涤和配制用于过程中低温保存。在一些实施方案中，例如，在白细胞单采术收集完成的约2小时、6小时、12小时、18小时、24小时、36小时或48小时内，使白细胞单采术产物经历一个或多个洗涤步骤。在一些方面，所述一个或多个洗涤步骤去除白细胞单采术收集期间的抗凝剂、白细胞单采术产物中可能积累的细胞废物、残余血小板和/或细胞碎片。在一些实施方案中，在所述一个或多个洗涤步骤期间进行一次或多次缓冲液交换。

在特定实施方案中，将单采术产物或白细胞单采术产物低温保存和/或低温保护(例如冷冻)，然后在进行如下文所述的细胞选择或分离步骤(例如，T细胞选择或分离步骤)之前进行解冻。在一些实施方案中，在使低温保存的和/或低温保护的单采术产物或白细胞单采术产物经历T细胞选择或分离步骤之后，在任何随后步骤(诸如激活、刺激、工程化、转导、转染、孵育、培养、收获、配制细胞群和/或将所配制的细胞群施用于受试者的步骤)期间或之间，不再进行低温保存和/或低温保护步骤。例如，在解冻并任选地洗涤用于下游过程(诸如T细胞激活/刺激或转导)之前，不再对选自解冻的低温保存的和/或低温保护的单采术产物或白细胞单采术产物的T细胞进行低温保存和/或低温保护。

在特定实施方案中，将单采术产物或白细胞单采术产物以以下密度在低温保存溶液或缓冲液中进行低温保存和/或低温保护(例如，冷冻)：为、约或至少5x10⁶个细胞/mL、10x10⁶个细胞/mL、20x10⁶个细胞/mL、30x10⁶个细胞/mL、40x10⁶个细胞/mL、50x10⁶个细胞/mL、60x10⁶个细胞/mL、70x10⁶个细胞/mL、80x10⁶个细胞/mL、90x10⁶个细胞/mL、100x10⁶个细胞/mL、110x10⁶个细胞/mL、120x10⁶个细胞/mL、130x10⁶个细胞/mL、140x10⁶个细胞/mL、或150x10⁶个细胞/mL，或者任何前述值之间的任何值。在一些实施方案中，所述低温保存溶液或缓冲液是或含有例如任选地包含人血清白蛋白(HSA)的DMSO溶液，或其他合适的细胞冷冻介质。

在特定实施方案中，将低温保存的和/或低温保护的单采术产物或白细胞单采术产物存放(例如，在冷冻样品之前不进行T细胞选择)，这在一些方面可以允许更灵活地进行后续制造步骤。在一些方面，将低温保存的和/或低温保护的单采术产物或白细胞单采术产物等分至多个低温保存容器(诸如袋)中，所述容器可以各自单独地或组合地用于产物处理中。例如，在单采术产物或白细胞单采术产物中活细胞的总数量小于15x10⁹个细胞时，将低温保存的和/或低温保护的单采术产物或白细胞单采术产物等分至四个低温保存容器(诸如袋)中。在一些实施方案中，在单采术产物或白细胞单采术产物中活细胞的总数量是15-30x10⁹个细胞时，将低温保存的和/或低温保护的单采术产物或白细胞单采术产物等分至八个低温保存容器(诸如袋)中。

在一个方面，在选择前存放细胞增加用于下游过程的细胞产量，并且较早存放细胞可能意味着，所述细胞更健康并且可能更易于符合制造成功的标准。在另一个方面，一旦解冻，就可以使低温保存的和/或低温保护的单采术产物或白细胞单采术产物经历一种或多种不同的选择方法。这种方法的优点尤其在于，增强了用于治疗受试者的疾病或病症的细胞疗法的细胞的可用性、功效和/或其他方面，如在所述样品的供体和/或另一接受者中。

在一些实施方案中，在供体被诊断为患有疾病或病症之后的时间，在细胞选择之前或在不进行在先细胞选择的情况下(例如，不进行在先T细胞选择，诸如通过色谱进行选择)，收集样品(例如单采术或白细胞单采术样品)并进行低温保存和/或低温保护。在一些方面，低温保存的时间也在供体已经接受以下中的一种或多种之前：用于所述疾病或病症的任何初始治疗、用于所述疾病或病症的任何靶向治疗或针对治疗进行标记的任何治疗、或者除了辐射和/或化学疗法以外的任何治疗。在一些实施方案中，在疾病的初始治疗后的首次疾病复发之后，以及在供体或受试者接受用于疾病的后续治疗之前，收集样品。初始和/或后续治疗可以是除了细胞疗法以外的疗法。在一些实施方案中，所收集的细胞可以用于初始和/或后续治疗后的细胞疗法中。在一个方面，在不进行在先细胞选择的情况下，低温保存的和/或低温保护的样品可以有助于降低前期费用，诸如与随机化临床试验中的非治疗患者相关的那些费用，所述患者可能发生交叉并且以后需要治疗。

在一些实施方案中，在疾病的二线治疗后疾病第二次复发后，以及在供体或受试者接受用于所述疾病的后续治疗之前的时间，在细胞选择前或在不进行在先细胞选择的情况下(例如，不进行在先T细胞选择，诸如通过色谱进行的选择)，收集样品(例如单采术或白细胞单采术样品)并进行低温保存和/或低温保护。在一些实施方案中，例如通过评估某些风险因子，将患者鉴定为可能在二线治疗后复发。在一些实施方案中，所述风险因子是基于疾病类型和/或遗传学，诸如双打击淋巴瘤、原发性难治性癌症或激活的B细胞淋巴瘤。在一些实施方案中，所述风险因子是基于临床表现，如一线治疗后的早期复发，或者治疗后的其他不良预后指数(例如，IPI(国际预后指数)>2)。

在一些实施方案中，在供体或受试者被诊断为患有疾病之前的时间，在细胞选择前或在不进行在先细胞选择的情况下(例如，不进行在先T细胞选择，诸如通过色谱进行的选择)，收集样品(例如单采术或白细胞单采术样品)并进行低温保存和/或低温保护。在一些方面，可以确定供体或受试者具有患上疾病的风险。在一些方面，供体或受试者可以是健康受试者。在某些情形中，在被认为没有患上疾病的风险或被诊断为未患疾病的情况下，供体或受试者可以选择存放或储存细胞，以免在生命的后期需要细胞疗法。在一些实施方案中，可以基于诸如以下等因素，认为供体或受试者具有患上疾病的风险：基因突变、基因异常、基因破坏、家族病史、蛋白质异常(诸如蛋白质产生和/或加工的缺陷)，以及可能增加患病风险的生活方式的选择。在一些实施方案中，收集细胞作为预防药。

在一些实施方案中，将低温保存的和/或低温保护的细胞样品(例如单采术或白细胞单采术样品)，如尚未经历在先细胞选择(例如，不进行在先T细胞选择，诸如通过色谱进行的选择)的细胞样品储存或存放如下时间段：大于或等于12小时、24小时、36小时或48小时，或者大于或等于0.5天、一天、1.5天或两天。在一些实施方案中，将样品储存或存放如下时间段：大于或等于1周、2周、3周或4周。在一些实施方案中，将样品放置于长期储存或长期存放中。在一些方面，将样品储存如下时间段：大于或等于1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、11年、12年、13年、14年、15年、16年、17年、18年、19年、20年、25年、30年、35年、40年或更久。

在一些实施方案中，将从供体获取的单采术或白细胞单采术样品在冷却的环境中运输到储存或处理设施，和/或在储存设施中低温储存，或者在处理设施中进行处理。在一些实施方案中，在运输前，例如通过选择T细胞(诸如CD3+T细胞、CD4+T细胞和/或CD8+T细胞)来处理样品。在一些实施方案中，在运输之后且在低温储存样品之前进行这种处理。在一些实施方案中，在低温储存后解冻样品之后进行所述处理。

通过允许供体在所述供体及因此其细胞尚未经历疾病的广泛治疗时和/或在患上疾病或病症或其诊断之前的阶段储存其细胞，与在一轮或多轮治疗后收获的细胞相比，这样的细胞可能具有用于细胞疗法的某些优点。例如，与已经历几轮治疗的细胞相比，在一轮或多轮治疗之前收获的细胞可能更健康，可能展现更高水平的某些细胞活性，可能生长更快，和/或可能更易接受基因操作。根据本文所述的实施方案的优点的另一个例子可以包括便利性。例如，通过在细胞疗法需要供体细胞之前收集(任选地处理)和储存所述供体细胞，如果接受者后来需要所述细胞以及在接受者后来需要所述细胞时，将容易地获得所述细胞。这可以增加单采术实验室容量，从而为技术人员安排单采术收集过程的时间提供更高灵活性。

用于来自样品(诸如单采术样品)的细胞的低温储存和处理的示例性方法和系统可以包括WO 2018170188中所述的那些。在一些实施方案中，所述方法和系统涉及在患者需要细胞疗法之前收集单采术，然后使所述单采术样品经历低温保存，以供以后用于用重组受体(例如CAR)工程化细胞(例如T细胞)的过程中。在一些情况下，此类过程可以包括本文所述的那些。在一些实施方案中，从受试者收集单采术样品，并且在细胞群的后续T细胞选择、激活、刺激、工程化、转导、转染、孵育、培养、收获、配制和/或将所配制的细胞群施用于受试者之前进行低温保存。在此类例子中，在使样品经历一个或多个选择步骤(诸如本文所述的任何步骤)之前，将低温保存的单采术样品解冻。

在一些实施方案中，将低温保存的和/或低温保护的细胞样品(例如单采术或白细胞单采术样品)(诸如尚未经历在先细胞选择(例如，不进行在先T细胞选择，如通过色谱进行的选择)的细胞样品)解冻，之后将其用于制造用于细胞疗法的细胞群(例如，含有CAR+T细胞的T细胞群)的下游过程中。在一些实施方案中，这种低温保存的和/或低温保护的细胞样品(例如单采术或白细胞单采术样品)与本文所提供的用于工程化T细胞疗法(诸如CAR+T细胞疗法)的过程结合使用。在特定例子中，在收获/配制步骤之前或期间不再进行低温保存步骤。

在一些实施方案中，细胞或群体的选择、分离或富集包括一个或多个制备步骤和/或非基于亲和力的细胞分离步骤。在一些例子中，将细胞在一种或多种试剂的存在下洗涤、离心和/或孵育，例如以去除不需要的组分、针对所需组分进行富集、裂解或去除对特定试剂敏感的细胞。在一些例子中，基于一种或多种特性(诸如密度、粘附特性、尺寸、对特定组分的敏感性和/或抗性)分离细胞。在一些实施方案中，所述方法包括基于密度的细胞分离方法，诸如通过裂解红细胞并通过Percoll或Ficoll梯度离心而从外周血制备白细胞。在一些实施方案中，细胞例如T细胞是通过色谱分离来分离、选择或富集，诸如通过柱色谱(包括亲和色谱或凝胶渗透色谱)进行。在一些实施方案中，所述方法采用与位于靶细胞(例如，要分离、选择或富集的细胞)表面上的受体分子结合的受体结合试剂。此类方法可以描述为(无踪迹)细胞亲和力色谱技术(CATCH)。在某些实施方案中，用于选择、分离和富集的方法、技术和试剂描述于例如WO 2013124474和WO2015164675中，所述申请通过引用以其整体特此并入。

细胞选择可以使用一个或多个色谱柱来进行。在一些实施方案中，一个或多个色谱柱包括在封闭系统中。在一些实施方案中，所述封闭系统是自动化封闭系统，例如需要最少或不需要用户(例如，人)输入。在一些实施方案中，细胞选择是依序进行(例如，顺序选择技术)。在一些实施方案中，一个或多个色谱柱是顺序排列。例如，第一柱的定向可以使得可以将所述柱的输出(例如，洗脱液)例如经由连接管道进给至第二色谱柱。在一些实施方案中，多个色谱柱可以依序排列。在一些实施方案中，细胞选择可以通过进行连续阳性和阴性选择步骤来实现，后一步骤使来自前一步骤的阴性和/或阳性级分经受进一步选择，其中整个过程在同一管或管组中进行。在一些实施方案中，使含有靶细胞的样品经受顺序选择，其中实现第一选择以富集CD4+或CD8+群体中的一种，并且使用来自第一选择的未选择细胞作为第二选择的细胞来源，用于富集CD4+或CD8+群体中的另一种。在一些实施方案中，可以实现一次或多次进一步选择以富集CD4+或CD8+群体中的一种或两种的亚群，例如，中枢记忆T(T_CM)细胞、幼稚T细胞和/或对一种或多种表面标记(例如，CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+和/或CD45RO+)呈阳性或高水平表达的细胞。在一些实施方案中，使含有靶细胞的样品经历连续选择，其中实现第一选择以富集CD3+群体，并且将所选择的细胞用作第二选择的细胞来源用于富集CD3+群体。在一些实施方案中，使含有靶细胞的样品经受顺序选择，其中在第一固定相上(例如，在第一色谱柱中)实现第一选择以富集CD3+群体，并且使用含有未结合细胞的流出物作为第二选择的细胞来源，用于在第二固定相上(例如，在第二色谱柱中)富集CD3+群体，其中所述第一和第二固定相依序排列。在一些实施方案中，所述选择是针对CD3+T细胞的阳性选择(例如，通过使用与细胞表面CD3特异性结合的抗体或其抗原结合片段)。在一些实施方案中，可以实现一次或多次进一步选择以富集CD3+群体的亚群，例如，中枢记忆T(T_CM)细胞、幼稚T细胞和/或对一种或多种表面标记(例如，CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+和/或CD45RO+)呈阳性或高水平表达的细胞。在一些实施方案中，使含有靶细胞的样品经受顺序选择，其中实现第一选择以富集CD3+群体，并且使用所选细胞作为第二选择的细胞来源，用于富集CD4+群体。在一些实施方案中，可以实现一次或多次进一步选择以富集CD3+CD4+群体的亚群，例如，中枢记忆T(T_CM)细胞、幼稚T细胞和/或对一种或多种表面标记(例如，CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+和/或CD45RO+)呈阳性或高水平表达的细胞。在一些实施方案中，使含有靶细胞的样品经受顺序选择，其中实现第一选择以富集CD3+群体，并且使用所选细胞作为第二选择的细胞来源，用于富集CD8+群体。在一些实施方案中，可以实现一次或多次进一步选择以富集CD3+CD8+群体的亚群，例如，中枢记忆T(T_CM)细胞、幼稚T细胞和/或对一种或多种表面标记(例如，CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+和/或CD45RO+)呈阳性或高水平表达的细胞。考虑到在一些方面，T细胞的特定亚群(例如，CD3+细胞)，诸如对一种或多种表面标记呈阳性或高水平表达的细胞(例如，CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+和/或CD45RO+T细胞)，是通过阳性或阴性顺序选择技术来选择。在一些实施方案中，细胞选择是平行进行(例如，平行选择技术)。在一些实施方案中，一个或多个色谱柱是平行排列。例如，两个或更多个柱的排列可以使得将样品经由管道同时加载至两个或更多个柱上，所述管道允许将样品施加至每个柱，而无需样品穿过第一柱。例如，使用平行选择技术，细胞选择可以通过例如在封闭系统中同时进行阳性和/或阴性选择步骤来实现，其中整个过程在同一管或管组中进行。在一些实施方案中，使含有靶细胞的样品经历平行选择，其中将样品加载到两个或更多个色谱柱上，其中每个柱实现对细胞群的选择。在一些实施方案中，两个或更多个色谱柱单独实现CD3+、CD4+或CD8+群体的选择。在一些实施方案中，两个或更多个色谱柱(包括亲和色谱或凝胶渗透色谱)独立实现相同细胞群的选择。例如，两个或更多个色谱柱可以实现CD3+细胞的选择。在一些实施方案中，两个或更多个色谱柱(包括亲和色谱或凝胶渗透色谱)独立实现不同细胞群的选择。例如，两个或更多个色谱柱可以独立地实现CD3+细胞、CD4+细胞和CD8+细胞的选择。在一些实施方案中，可以例如使用顺序选择技术实现一次或多次进一步选择，以富集经由平行选择而选择的一个或所有细胞群的亚群。例如，可以针对中枢记忆T(T_CM)细胞、幼稚T细胞和/或对一种或多种表面标记呈阳性或高水平表达的细胞(例如，CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+和/或CD45RO+)进一步选择选择的细胞。在一些实施方案中，使含有靶细胞的样品经受平行选择，其中在两个或更多个柱上实现平行选择以富集CD3+群体。在一些实施方案中，可以实现一次或多次进一步选择以富集亚CD3+群体的群，例如，中枢记忆T(T_CM)细胞、幼稚T细胞和/或对一种或多种表面标记呈阳性或高水平表达的细胞(例如，CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+和/或CD45RO+)。在一些实施方案中，使含有靶细胞的样品经历平行选择，其中在两个或更多个柱上独立地实现选择以富集CD3+群体和CD4+群体。在一些实施方案中，可以实现一次或多次进一步选择以富集CD3+和CD4+群体的亚群，例如，中枢记忆T(T_CM)细胞、幼稚T细胞和/或对一种或多种表面标记呈阳性或高水平表达的细胞(例如，CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+和/或CD45RO+)。在一些实施方案中，使含有靶细胞的样品经历平行选择，其中实现平行选择以富集CD3+群体和CD8+群体。在一些实施方案中，可以实现一次或多次进一步选择以富集CD3+和CD8+群体的亚群，例如，中枢记忆T(T_CM)细胞、幼稚T细胞和/或对一种或多种表面标记呈阳性或高水平表达的细胞(例如，CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+和/或CD45RO+)。在一些实施方案中，使含有靶细胞的样品经历平行选择，其中实现平行选择以富集CD4+群体和CD8+群体。在一些实施方案中，可以实现一次或多次进一步选择以富集CD4+和CD8+群体的亚群，例如，中枢记忆T(T_CM)细胞、幼稚T细胞和/或对一种或多种表面标记呈阳性或高水平表达的细胞(例如，CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+和/或CD45RO+)。考虑到在一些方面，通过阳性或阴性平行选择技术来选择T细胞的特定亚群(例如，CD3+、CD4+、CD8+T细胞)，诸如对一种或多种表面标记呈阳性或高水平表达的细胞，例如，CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+和/或CD45RO+T细胞。在一些实施方案中，顺序和平行选择技术可以组合使用。

2.激活/刺激

在一些实施方案中，在基因工程化之前或与其相连地孵育和/或培养细胞。所述孵育步骤可以包括培养、刺激、激活和/或繁殖。孵育和/或工程化可以在培养容器中进行，所述培养容器是诸如单元、室、孔、柱、管、管组、阀、小瓶、培养皿、袋或其他用于培养的容器。在一些实施方案中，在刺激条件或刺激剂的存在下孵育所述组合物或细胞。这些条件包括针对以下而设计的那些条件：用于诱导群体中细胞的增殖、扩增、激活和/或存活的条件，用于模拟抗原暴露和/或用于引发细胞进行基因工程化，诸如以引入重组抗原受体。

在特定实施方案中，所述刺激试剂含有寡聚试剂(例如链霉亲和素突变蛋白试剂)，其被缀合、连接或附着至一种或多种能够激活TCR复合物的细胞内信号传导结构域的药剂(例如配体)。在一些实施方案中，所述一种或多种药剂具有能够在特定的结合位点(例如结合位点Z)上结合寡聚试剂的附着的结合结构域或结合配偶体(例如，结合配偶体C)。在一些实施方案中，多种药剂可逆地结合寡聚试剂。在各种实施方案中，寡聚试剂具有多个特定结合位点，所述多个特定结合位点在某些实施方案中在结合结构域(例如，结合配偶体C)处可逆地结合多种药剂。在一些实施方案中，在竞争试剂(例如还能够结合特定结合位点(例如结合位点Z)的试剂)的存在下结合药剂的量被降低或减少。

在一些实施方案中，所述刺激试剂是或包括其中至少一种药剂(例如，能够在细胞(诸如T细胞)中产生信号的药剂)与寡聚试剂相关(例如可逆地相关)的可逆系统。在一些实施方案中，所述试剂含有能够与试剂结合(例如可逆地结合)的多个结合位点。在一些情况下，所述试剂是具有能够在细胞(诸如T细胞)中产生信号的至少一种附着的药剂的寡聚颗粒试剂。在一些实施方案中，所述药剂含有可以特异性结合分子的表位或区域的至少一个结合位点(例如结合位点B)并且还含有与试剂的至少一个结合位点(例如，试剂的结合位点Z)结合的结合配偶体(在本文中也称为结合配偶体C)。在一些实施方案中，结合配偶体C与至少一个结合位点Z之间的结合相互作用是非共价相互作用。在一些情形中，结合配偶体C与至少一个结合位点Z之间的结合相互作用是共价相互作用。在一些实施方案中，结合配偶体C与至少一个结合位点Z之间的结合相互作用(如非共价相互作用)是可逆的。

在此类可逆系统中可用作寡聚试剂的物质是已知的，参见例如美国专利号5,168,049；5,506,121；6,103,493；7,776,562；7,981,632；8,298,782；8,735,540；9,023,604；和国际公开PCT申请号WO 2013/124474和WO 2014/076277。下文描述了能够形成可逆相互作用的试剂和结合配偶体以及能够逆转这种结合的物质(例如竞争试剂)的非限制性例子。

在一些实施方案中，寡聚试剂是链霉亲和素、链霉亲和素突变蛋白或类似物、抗生物素蛋白、抗生物素蛋白突变蛋白或类似物(诸如中性抗生物素蛋白)或其混合物的寡聚物，其中这种寡聚试剂含有用于与药剂的结合结构域(例如，结合配偶体C)可逆地缔合的一个或多个结合位点。在一些实施方案中，所述药剂的结合结构域可以是生物素、生物素衍生物或类似物、或链霉亲和素结合肽或能够特异性结合链霉亲和素、链霉亲和素突变蛋白或类似物、抗生物素蛋白或抗生物素蛋白突变蛋白或类似物的其他分子。

在某些实施方案中，一种或多种药剂(例如，能够在细胞如T细胞中产生信号的药剂)例如经由寡聚试剂上存在的多个特定结合位点(例如，结合位点Z)与寡聚试剂缔合(诸如可逆地结合)。在一些情况下，这导致所述药剂彼此紧密地排列，使得如果使具有由所述药剂结合或识别的(至少两个拷贝的)细胞表面分子的靶细胞与所述药剂接触，则可以发生亲合力效应。

在一些实施方案中，寡聚试剂是链霉亲和素寡聚物、链霉亲和素突变蛋白寡聚物、链霉亲和素类似物寡聚物、抗生物素蛋白寡聚物、由抗生物素蛋白突变蛋白或抗生物素蛋白类似物(诸如中性抗生物素蛋白)构成的寡聚物或其混合物。在特定实施方案中，寡聚试剂含有能够与药剂的结合结构域(例如，结合配偶体C)结合的特定结合位点。在一些实施方案中，结合结构域可以是生物素、生物素衍生物或类似物、或链霉亲和素结合肽或能够与链霉亲和素、链霉亲和素突变蛋白或类似物、抗生物素蛋白或抗生物素蛋白突变蛋白或类似物特异性结合的其他分子。在一些实施方案中，链霉亲和素可以是野生型链霉亲和素、链霉亲和素突变蛋白或类似物(诸如链霉亲和素样多肽)。同样，在一些方面，抗生物素蛋白包括野生型抗生物素蛋白、或者抗生物素蛋白的突变蛋白或类似物(诸如中性抗生物素蛋白，所述中性抗生物素蛋白是具有修饰的精氨酸的去糖基化抗生物素蛋白，其通常展现更中性的pi并且可用作天然抗生物素蛋白的替代物)。通常，抗生物素蛋白的去糖基化的中性形式包括例如那些可商购获得的形式，诸如可通过Sigma Aldrich公司获得的“Extravidin”、或可从Thermo Scientific或Invitrogen公司获得的“NeutrAvidin”。

在一些实施方案中，所述试剂是链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白或类似物。在一些实施方案中，野生型链霉亲和素(wt-链霉亲和素)具有由Argarana等人,NucleicAcids Res.14(1986)1871-1882所披露的氨基酸序列(SEQ ID NO:256)。通常，链霉亲和素在自然界中作为四个相同亚基的四聚体存在，即它是同四聚体，其中每个亚基含有针对生物素、生物素衍生物或类似物或生物素模拟物的单一结合位点。链霉亲和素亚基的示例性序列是SEQ ID NO:256所示的氨基酸序列，但是这个序列还可以包括在来自其他链霉菌属(Streptomyces)物种的同源物中存在的序列。特别地，链霉亲和素的每个亚基可能对生物素展现出强大的结合亲和力，其离解常数(K_d)在约10^-14M的数量级。在一些情况下，链霉亲和素可以作为其中四个结合位点中仅有一个结合位点具有功能的单价四聚体(Howarth等人(2006)Nat.Methods,3:267-73；Zhang等人(2015)Biochem.Biophys.Res.Commun.,463:1059-63))、其中四个结合位点中有两个结合位点具有功能的二价四聚体(Fairhead等人(2013)J.Mol.Biol.,426:199-214)存在，或者也可以作为单体或二聚体形式存在(Wu等人(2005)J.Biol.Chem.,280:23225-31；Lim等人(2010)Biochemistry,50:8682-91)。

在一些实施方案中，链霉亲和素可以是任何形式，如野生型或未经修饰的链霉亲和素，如来自链霉菌属物种的链霉亲和素或其功能活性片段，所述功能活性片段包括含有针对生物素、生物素衍生物或类似物或生物素模拟物的结合位点的至少一个功能性亚基，诸如通常含有SEQ ID NO:256所示的来自阿维丁链霉菌(Streptomyces avidinii)的野生型链霉亲和素的至少一个功能性亚基或其功能活性片段。例如，在一些实施方案中，链霉亲和素可以包括野生型链霉亲和素的片段，所述片段在N末端和/或C末端被缩短。这种最小链霉亲和素包括任何如下链霉亲和素：在SEQ ID NO:256的氨基酸位置10至16的区域中的N末端开始，并且在SEQ ID NO:256的氨基酸位置133至142的区域中的C末端终止。在一些实施方案中，链霉亲和素的功能活性片段含有SEQ ID NO:257所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，诸如SEQ ID NO:257所示的链霉亲和素可以在对应于Ala13(其编号示于SEQ ID NO:256中)的位置进一步含有N末端甲硫氨酸。提及链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白中残基的位置是参考在SEQ ID NO:256中残基的编号。

链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白的例子在例如WO 86/02077、DE 19641876 Al、US 6,022,951、WO 98/40396或WO 96/24606中有提及。链霉亲和素突变蛋白的例子在本领域中是已知的，例如，美国专利号5,168,049、5,506,121、6,022,951、6,156,493、6,165,750、6,103,493或6,368,813；或国际发开的PCT申请号WO 2014/076277。

在一些实施方案中，链霉亲和素突变蛋白可以含有不属于未修饰或野生型链霉亲和素的一部分的氨基酸，或者可以仅包含野生型或未修饰的链霉亲和素的一部分。在一些实施方案中，链霉亲和素突变蛋白含有至少一个亚基，所述至少一个亚基与未经修饰的或野生型链霉亲和素的亚基相比(例如与在SEQ ID NO:256所示的野生型链霉亲和素亚基或例如在SEQ ID NO:257所示的其功能活性片段相比)可以具有一个或多个氨基酸取代(置换)。

在一些实施方案中，链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白对结合结构域的结合亲和力(诸如解离常数(K_d)为小于1x10^-4M、5x10^-4M、1x10^-5M、5x10^-5M、1x10^-6M、5x10^-6M或1x10^-7M，但通常大于1x10^-13M、1x10^-12M或1x10^-11M。例如，诸如在美国专利号5,506,121中所披露的肽序列(例如，Strep标签)可以充当生物素模拟物并展示对链霉亲和素的结合亲和力，例如，K_d为大约在10^-4M与10^-5M之间。在一些情况下，可以通过在链霉亲和素分子内进行突变来进一步改善结合亲和力，参见例如美国专利号6,103,493或WO 2014/076277。在一些实施方案中，结合亲和力可以通过本领域已知的方法(例如本文所述的任何方法)来确定。

在一些实施方案中，试剂(诸如链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白)展现出对肽配体结合配偶体的结合亲和力，所述肽配体结合配偶体可以是存在于药剂(例如，受体结合剂或选择剂)中的结合配偶体C。在一些实施方案中，肽序列含有具有通式His-Pro-Xaa的序列，其中Xaa是谷氨酰胺、天冬酰胺或甲硫氨酸，诸如含有SEQ ID NO:258所示的序列。在一些实施方案中，肽序列含有SEQ ID NO:259所示的序列。在一些实施方案中，肽序列具有SEQID NO:260所示的通式，诸如SEQ ID NO:261所示。在一个例子中，肽序列是Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly(也称为Strep-

示于SEQ ID NO:262中)。在一个例子中，肽序列是Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(也称为Strep-

II，示于SEQ ID NO:263中)。在一些实施方案中，肽配体含有至少两个链霉亲和素结合模块的顺序排列，其中在所述两个模块之间的距离为至少0个且不大于50个氨基酸，其中一个结合模块具有3个至8个氨基酸并且至少含有序列His-Pro-Xaa，其中Xaa是谷氨酰胺、天冬酰胺或甲硫氨酸，并且其中另一个结合模块具有相同或不同的链霉亲和素肽配体，诸如SEQ ID NO:260所示(参见例如国际公开的PCT申请号WO 02/077018；美国专利号7,981,632)。在一些实施方案中，肽配体含有具有SEQ ID NO:264或265中任一个所示的式的序列。在一些实施方案中，肽配体具有在SEQID NO:266-270中任一个所示的氨基酸序列。在大多数情况下，所有这些链霉亲和素结合肽结合相同的结合位点，即链霉亲和素的生物素结合位点。如果将一种或多种此类链霉亲和素结合肽用作结合配偶体C(例如C1和C2)，经由结合配偶体C与所述一种或多种药剂结合的多聚化试剂和/或低聚颗粒试剂通常由一种或多种链霉亲和素突变蛋白构成。

在一些实施方案中，链霉亲和素突变蛋白是如美国专利号6,103,493中所述的突变体。在一些实施方案中，基于野生型链霉亲和素的氨基酸序列(诸如SEQ ID NO:256所示)，链霉亲和素突变蛋白在氨基酸位置44至53的区域内含有至少一个突变。在一些实施方案中，链霉亲和素突变蛋白在一个或多个残基44、45、46和/或47处含有突变。在一些实施方案中，链霉亲和素突变蛋白含有疏水性脂肪族氨基酸(例如Val、Ala、Ile或Leu)对野生型链霉亲和素的位置44处的Glu的置换，位置45处的任何氨基酸，位置46处的脂肪族氨基酸(诸如疏水性脂肪族氨基酸)，和/或碱性氨基酸(例如Arg或Lys，诸如通常Arg)对位置47处的Val的置换。在一些实施方案中，Ala处于位置46和/或Arg处于位置47和/或Val或Ile处于位置44。在一些实施方案中，链霉亲和素突变体含有残基Val44-Thr45-Ala46-Arg47，诸如含有SEQ ID NO:271或SEQ ID NO:272或273所示的氨基酸序列的示例性链霉亲和素突变蛋白所示的(也称为链霉亲和素突变体1，SAM1)。在一些实施方案中，链霉亲和素突变蛋白含有残基Ile44-Gly45-Ala46-Arg47，如含有SEQ ID NO:274、275或276所示氨基酸序列的示例性链霉亲和素突变蛋白所示的(也称为SAM2)。在一些情况下，这种链霉亲和素突变蛋白描述于例如美国专利6,103,493中，并且可以在商标Strep-

下商业购得。在一些实施方案中，突变蛋白链霉亲和素含有SEQ ID NO:277或SEQ ID NO:278所示的氨基酸序列。在特定实施方案中，所述分子是包含SEQ ID NO:257、272、275、277、279、273或276中任一个所示的序列的链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白的四聚体，其作为四聚体是含有20个伯胺(每个单体包括1个N末端胺和4个赖氨酸)的分子。

在一些实施方案中，链霉亲和素突变蛋白展现出以解离常数(K_d)为或小于3.7x10^-5M为特征的对肽配体(Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly；也称为Strep-

如SEQ IDNO:262所示)的结合亲和力，和/或以解离常数为或小于7.1x10^-5M为特征的对肽配体(Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys；也称为Strep-

II，如SEQ ID NO:264所示)的结合亲和力，和/或以解离常数为或小于7.0x10^-5M、5.0x10^-5M、1.0x10^-5M、5.0x10^-6M、1.0x10^-6M、5.0x10^-7M或1.0x10^-7M、但通常大于1x10^-13M、1x10^-12M或1x10^-11M为特征的对SEQIDNO:264、264-265、269-270、266-268、261、262、258、260中任一个所示的任何肽配体的结合亲和力。

在一些实施方案中，所得的链霉亲和素突变蛋白展现出以缔合常数(K_a)为或大于2.7x10⁴M^-1为特征的对肽配体(Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly；也称为Strep-

如SEQIDNO:262所示)的结合亲和力，和/或以缔合常数为或大于1.4x10⁴M^-1为特征的对肽配体(Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys；也称为Strep-

II，如SEQIDNO:264所示)的结合亲和力，和/或以缔合常数为或大于1.43x10⁴M^-1、1.67x10⁴M^-1、2x10⁴M^-1、3.33x10⁴M^-1、5x10⁴M^-1、1x10⁵M^-1、1.11x10⁵M^-1、1.25x10⁵M^-1、1.43x10⁵M^-1、1.67x10⁵M^-1、2x10⁵M^-1、3.33x10⁵M^-1、5x10⁵M^-1、1x10⁶M^-1、1.11x10⁶M^-1、1.25x10⁶M^-1、1.43x10⁶M^-1、1.67x10⁶M^-1、2x10⁶M^-1、3.33x10⁶M^-1、5x10⁶M^-1、1x10⁷M^-1、但通常小于1x10¹³M^-1、1x10¹²M^-1或1x10¹¹M^-1为特征的对SEQIDNO:264、264-265、269-270、266-268、261、262、258、260中任一个所示的任何肽配体的结合亲和力。

在特定实施方案中，本文提供了由多个链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白四聚体构成和/或含有多个链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白四聚体的寡聚颗粒试剂。在某些实施方案中，本文提供的寡聚颗粒试剂含有可逆地结合或能够可逆地结合一种或多种药剂(例如刺激剂和/或选择剂)的多个结合位点。在一些实施方案中，寡聚颗粒具有在70nm与125nm之间(包含端值)的半径(例如，平均半径)；在1x10⁷g/mol与1x10⁹g/mol之间(包含端值)的分子量；和/或在1,000与5,000之间(包含端值)的链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白四聚体。在一些实施方案中，寡聚颗粒试剂与一种或多种药剂(诸如与细胞表面上的分子(例如受体)结合的药剂)结合(例如可逆地结合)。在某些实施方案中，所述一种或多种药剂是本文所述的药剂，例如在章节II-C-2中。在一些实施方案中，所述药剂是抗CD3和/或抗CD28抗体或其抗原结合片段，如含有结合配偶体(例如，链霉亲和素结合肽，例如Strep-

II)的抗体或其抗原片段。在特定实施方案中，所述一种或多种药剂与细胞表面受体和/或辅助分子结合以刺激细胞，并且可以包括靶向TCR复合物或其组分的抗体、靶向共刺激分子的抗体、抗CD3抗体、抗CD28抗体或抗CD3和/或抗CD28Fab)，并且所述一种或多种药剂包含结合配偶体，例如链霉亲和素结合肽，例如Strep-

II。在特定实施方案中，一种或多种药剂包含基于链霉亲和素的寡聚物，诸如链霉亲和素突变蛋白寡聚物，其与带Strep标签的抗CD3和带Strep标签的抗CD28Fab缀合。在一些实施方案中，寡聚颗粒试剂是如WO2015/158868或WO2018/197949(将其通过引用以其整体并入)中所述的任何寡聚颗粒试剂。

在特定实施方案中，通过聚合命名为STREP-

M2的示例性链霉亲和素突变蛋白来制备寡聚试剂(参见例如，美国专利号6,103,493以及Voss和Skerra(1997)Protein Eng.,1:975-982；以及Argarana等人(1986)Nucleic Acids Research,1871-1882)。

在特定实施方案中，为了制备用于寡聚化的链霉亲和素突变蛋白，将含有一个或多个反应性硫醇基的链霉亲和素突变蛋白与马来酰亚胺激活的链霉亲和素突变蛋白一起孵育。

在特定实施方案中，为了制备硫醇化的链霉亲和素突变蛋白，通过在总体积为2.6mL的100mM硼酸盐缓冲液中与2-亚氨基硫杂环戊烷盐酸盐以1:100的摩尔比在约8.5的pH下在24℃下一起孵育1小时，将约100mg链霉亲和素突变蛋白硫醇化。对于激活反应，在总体积为约10.4mL的磷酸钠缓冲液中将约400mg链霉亲和素突变蛋白与琥珀酰亚胺基-6-[(β-马来酰亚胺基丙酰胺基)己酸酯(SMPH)一起以1:2的摩尔比在约7.2的pH、24℃下孵育1小时。协调硫醇化和激活反应以在大致相同的时间开始，并控制所述反应的持续时间。在反应后，通过用PD-10脱盐柱(GE Healthcare)单独进行样品的凝胶过滤，从样品中去除2-亚氨基硫杂环戊烷盐酸盐和SMPH。对于每2.5mL体积的样品，平衡1mL PD-10柱并加载硫醇化突变蛋白链霉亲和素或马来酰亚胺突变蛋白链霉亲和素，并且通过添加3.5mL偶联缓冲液(100mM NaH₂PO₄、150mM NaCl、5mM EDTA，pH 7.2)进行洗脱。在4个柱上进行马来酰亚胺突变蛋白链霉亲和素的凝胶过滤至占据>10mL体积，并合并洗脱物。控制激活和硫醇化反应的时间安排以及激活和硫醇化反应的结束与寡聚化反应的开始之间的时间安排。通常，从凝胶过滤的开始(即，激活和硫醇化反应的结束)到开始寡聚化反应时，使经过不超过十分钟。

在特定实施方案中，然后将马来酰亚胺链霉亲和素突变蛋白和硫醇化链霉亲和素突变蛋白样品组合为约17.5mL的总体积并在7.2的pH下在24℃下在约600rpm的搅拌条件下孵育1小时。因为与SMPH一起孵育的链霉亲和素突变蛋白是与2-亚氨基硫杂环戊烷盐酸盐一起孵育的链霉亲和素突变蛋白的四倍，在寡聚化反应期间，硫醇化链霉亲和素突变蛋白与马来酰亚胺链霉亲和素突变蛋白的摩尔比为1:4。反应后，通过与N-乙基马来酰亚胺(NEM)一起在24℃下伴随搅拌(约600rpm)孵育15分钟，随后在4℃下再孵育16-20小时，使寡聚链霉亲和素突变蛋白的其余SH基团饱和。在与NEM一起孵育后，将含有寡聚链霉亲和素突变蛋白的样品离心，并通过0.45μm膜(Millex-HP 0.45μm，来自Merck Millopore)过滤上清液。然后将过滤的溶液加载至柱(Sephacryl S-300HR HiPrep 26/60，GE Healthcare)中，用于使用AKTA Explorer色谱系统(GE Healthcare)进行尺寸排阻色谱(SEC)。合并毫吸光度单位(mAU)大于或等于1500mAU的级分。将含有寡聚链霉亲和素突变蛋白的合并样品用100mM羟胺在6.35的pH下在室温下处理15分钟。为了在处理后去除羟胺，将样品加载至PD10柱(每个柱2.5mL)上并用3.5mL含有100mM NaH₂PO₄、140mM NaCl、1mM EDTA的缓冲液(pH7.2)洗脱。将PD10洗脱液合并，并用0.45μm过滤器之后用0.22μm过滤器进行无菌过滤，然后将样品冷冻并储存于-80℃下。在冷冻前，测量寡聚链霉亲和素突变蛋白试剂的终浓度，并通过动态光散射(DLS)确定寡聚链霉亲和素突变蛋白试剂的大小。

在一些实施方案中，通过与寡聚链霉亲和素突变蛋白试剂可逆地结合而将刺激剂(诸如抗CD3抗体和抗CD28 Fab抗体)多聚化。在一些实施方案中，刺激剂(例如抗CD3和抗CD28 Fab片段)经由链霉亲和素肽结合配偶体融合到每个刺激剂(例如每个Fab片段)。在一些实施方案中，抗CD3 Fab片段源自由杂交瘤细胞系OKT3(

CRL-8001^TM；还参见美国专利号4,361,549)产生的CD3结合单克隆抗体，并且含有Arakawa等人J.Biochem.120,657-662(1996)中所述的抗CD3抗体OKT3的重链可变结构域和轻链可变结构域。这些序列分别示于SEQ ID NO:280和281中。在一些实施方案中，抗CD28 Fab片段源自抗体CD28.3(作为合成单链Fv构建体以GenBank登录号AF451974.1存放；还参见Vanhove等人,BLOOD,2003年7月15日,第102卷,第2期,第564-570页)，并且含有分别如SEQ ID NO:282和283所示的抗CD28抗体CD28.3的重链和轻链可变结构域。关于示例性肽标记的Fab片段，参见国际专利申请公开号WO 2013/011011和WO 2013/124474。

在一些实施方案中，本文提供了由多个链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白四聚体构成和/或含有多个链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白四聚体的寡聚颗粒试剂。在某些实施方案中，本文提供的寡聚颗粒试剂含有可逆地结合或能够可逆地结合一种或多种药剂(例如刺激剂和/或选择剂)的多个结合位点。在一些实施方案中，所述寡聚颗粒具有在80nm与120nm之间且包含端值的半径(例如，平均半径)；在7.5x10⁶g/mol与2x10⁸g/mol之间且包含端值的分子量(例如，平均分子量)；和/或在500与10,000之间且包含端值的量(例如，平均量)的链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白四聚体。在一些实施方案中，所述寡聚颗粒试剂与一种或多种药剂(诸如与细胞表面上的分子(例如受体)结合的药剂)结合(例如可逆地结合)。在一些实施方案中，所述药剂包含与细胞表面受体和/或辅助分子结合以刺激细胞的一种或多种药剂(例如，诸如靶向TCR复合物或其组分的抗体、靶向共刺激分子的抗体、抗CD3抗体、抗CD28抗体或抗CD3/抗CD28 Fab)。在一些实施方案中，所述药剂是抗CD3和/或抗CD28 Fab，诸如含有结合配偶体(例如，链霉亲和素结合肽，例如Strep-

II)的Fab。在特定实施方案中，所述一种或多种药剂是含有结合配偶体(例如，链霉亲和素结合肽，例如Strep-

II)的抗CD3和/或抗CD28Fab。

在一些实施方案中，在以下试剂的存在下刺激所述细胞或使所述细胞经受刺激：每10⁶个细胞为、约或至少0.01μg、0.02μg、0.03μg、0.04μg、0.05μg、0.1μg、0.2μg、0.3μg、0.4μg、0.5μg、0.75μg、1μg、1.2μg、1.4μg、1.6μg、1.8μg、2μg、3μg、4μg、5μg、6μg、7μg、8μg、9μg、或10μg的寡聚刺激试剂(例如，基于链霉亲和素的寡聚物，诸如链霉亲和素突变蛋白寡聚物，其与带Strep标签的抗CD3和带Strep标签的抗CD28 Fab缀合)。在一些实施方案中，在以下试剂的存在下对所述细胞进行刺激或使其经受刺激：每10⁶个细胞为或为约4μg的寡聚刺激试剂(例如，基于链霉亲和素的寡聚物，诸如链霉亲和素突变蛋白寡聚物，其与带Strep标签的抗CD3和带Strep标签的抗CD28 Fab缀合)。在特定实施方案中，在以下试剂的存在下对所述细胞进行刺激或使其经受刺激：每10⁶个细胞为或为约1.2μg的寡聚刺激试剂(例如，基于链霉亲和素的寡聚物，诸如链霉亲和素突变蛋白寡聚物，其与带Strep标签的抗CD3和带Strep标签的抗CD28 Fab缀合)。在特定实施方案中，在以下试剂的存在下对所述细胞进行刺激或使其经受刺激：每10⁶个细胞为或为约0.8μg的寡聚刺激试剂(例如，基于链霉亲和素的寡聚物，诸如链霉亲和素突变蛋白寡聚物，其与带Strep标签的抗CD3和带Strep标签的抗CD28 Fab缀合)。在特定实施方案中，在以下试剂的存在下对所述细胞进行刺激或使其经受刺激：每10⁶个细胞为或为约1.8μg的寡聚刺激试剂(例如，基于链霉亲和素的寡聚物，诸如链霉亲和素突变蛋白寡聚物，其与带Strep标签的抗CD3和带Strep标签的抗CD28 Fab缀合)。在某些方面，在寡聚刺激试剂内，寡聚颗粒与附着药剂的质量比为约3:1。在某些方面，在寡聚刺激试剂内，寡聚颗粒、附着的抗CD3 Fab与附着的抗CD28 Fab之间的质量比为约3:0.5:0.5。在某些方面，4μg寡聚刺激试剂是或包括3μg寡聚颗粒和1μg附着药剂，例如，0.5μg抗CD3 Fab和0.5μg抗CD28 Fab。在其他例子中，每10⁶个细胞的1.2μg寡聚刺激试剂是或包括每10⁶个细胞的0.9μg寡聚颗粒和0.3μg附着药剂，例如，0.15μg抗CD3 Fab和0.15μg抗CD28 Fab。在一些实施方案中，将寡聚刺激试剂添加至无血清培养基，并且在无血清培养基中进行刺激，例如，如PCT/US2018/064627中所述。

在特定实施方案中，使为或为约900x10⁶个T细胞(例如，900x10⁶个CD3+T细胞、或450x10⁶个CD4+T细胞和450x10⁶个CD8+T细胞)的量的输入群体在寡聚刺激试剂(例如，基于链霉亲和素的寡聚物，如链霉亲和素突变蛋白寡聚物，其与带Strep标签的抗CD3和带Strep标签的抗CD28 Fab缀合)的存在下经受刺激，例如，在刺激条件下培养。在某些实施方案中，按以下密度对所述细胞(例如，输入群体的细胞)进行刺激或使其经受刺激(例如，在刺激条件下如在刺激试剂的存在下培养)：为、为约或至少0.01x10⁶个细胞/mL、0.1x10⁶个细胞/mL、0.5x10⁶个细胞/mL、1.0x10⁶个细胞/mL、1.5x10⁶个细胞/mL、2.0x10⁶个细胞/mL、2.5x10⁶个细胞/mL、3.0x10⁶个细胞/mL、4.0x10⁶个细胞/mL、5.0x10⁶个细胞/mL、10x10⁶个细胞/mL、或50x10⁶个细胞/mL。在某些实施方案中，以为、为约或至少3.0x10⁶个细胞/mL的密度对所述细胞(例如，输入群体的细胞)进行刺激或使其经受刺激(例如，在刺激条件下如在刺激试剂的存在下培养)。

在一些实施方案中，输出群体(例如，工程化T细胞的群体)通过包括以下的步骤产生：将T细胞的输入群体或含有T细胞的输入群体与寡聚刺激性颗粒试剂(例如，本文所述的基于寡聚物的刺激试剂)一起孵育在或在约18小时与30小时之间，包含端值；将编码重组受体的异源或重组多核苷酸引入受刺激的群体的T细胞中，(iii)在静态条件下孵育细胞，(iv)通过添加竞争试剂从细胞中去除或分离刺激试剂，以及(v)收集或收获孵育的细胞。

在某些实施方案中，输出群体(例如，工程化T细胞的群体)通过包括以下的步骤产生：将包含T细胞的输入群体在可逆地附着在与细胞表面受体和/或辅助分子结合以刺激细胞的一种或多种药剂(例如，靶向TCR复合物或其组分的抗体、靶向共刺激分子的抗体、抗CD3抗体、抗CD28抗体或抗CD3/抗CD28 Fab)上的链霉亲和素突变蛋白寡聚物的存在下在刺激条件下孵育18小时与30小时之间，包含端值；用编码重组受体的病毒载体转导刺激的T细胞，诸如通过在所述病毒载体的存在下旋转接种受刺激的T细胞来进行，然后将转导的T细胞在静态条件下孵育在或在约42小时与84小时之间，包含端值；以及收获或收集T细胞。

在一些实施方案中，所提供的用于产生工程化细胞群的方法包括以下中的一项或多项：在含有重组IL-2、IL-7和IL-15的无血清培养基中，在具有可逆地附着的抗CD3/抗CD28 Fab的寡聚链霉亲和素突变蛋白(其量为对于每10⁶个细胞在或在约0.4μg与8μg之间，包含端值，例如，对于每10⁶个细胞1.2μg)的存在下，将T细胞的输入群体刺激18小时与30小时之间，包含端值；通过以下方式用编码重组受体的病毒载体转导细胞：首先将细胞在病毒载体的存在下以693g的力旋转接种30分钟，然后将旋转接种的细胞与病毒载体一起孵育24小时与96小时之间，包含端值；将生物素(例如，D-生物素)添加至细胞以从细胞中去除或分离具有可逆地附着的抗CD3/抗CD28 Fab的寡聚链霉亲和素突变蛋白；以及收集或收获细胞。

在一些实施方案中，从开始刺激起在或在约36小时与96小时之间(包含端值)收获或收集细胞。在各种实施方案中，在开始刺激后的36小时与108小时之间或48小时与96小时之间(包含端值)收获或收集细胞。在特定实施方案中，在开始刺激之后36小时与96小时之间或48小时与72小时之间(包含端值)，将具有可逆地附着的抗CD3/抗CD28Fab的寡聚链霉亲和素突变蛋白从细胞中去除或分离。

在一些实施方案中，在从开始刺激起为或为约48小时(例如，48小时±6小时)之后，将具有可逆地附着的抗CD3/抗CD28 Fab的寡聚链霉亲和素突变蛋白从细胞中去除或分离(例如，如章节II-C-6中所述)。在特定实施方案中，在从开始刺激起为或为约72小时(例如，72小时±6小时)之后，将具有可逆地附着的抗CD3/抗CD28 Fab的寡聚链霉亲和素突变蛋白从细胞中去除或分离。在特定实施方案中，在从开始刺激起为或为约96小时(例如，96小时±6小时)之后，将具有可逆地附着的抗CD3/抗CD28 Fab的寡聚链霉亲和素突变蛋白从细胞中去除或分离。在特定实施方案中，在孵育之后将具有可逆地附着的抗CD3/抗CD28Fab的寡聚链霉亲和素突变蛋白从细胞中去除或分离，并且在添加生物素或生物素类似物之后收集或收获细胞。在某些实施方案中，在孵育期间将具有可逆地附着的抗CD3/抗CD28Fab的寡聚链霉亲和素突变蛋白从细胞中去除或分离，使得在添加生物素或生物素类似物之后将细胞返回到孵育。

在一些实施方案中，孵育在重组细胞因子(例如IL-2、IL-7和IL-15)的存在下在无血清培养基中进行。在某些实施方案中，孵育在不存在重组细胞因子的情况下进行。在特定实施方案中，孵育在基础培养基的存在下进行。在某些实施方案中，如与其中将用寡聚刺激试剂刺激的细胞在含有重组细胞因子的无血清培养基的存在下孵育的过程相比，在基础培养基中的孵育促进整合(例如，异源或重组核苷酸的稳定整合)，增加表达重组受体的细胞的百分比，改善效力，或者降低细胞的分化。

在特定实施方案中，诸如通过添加生物素或生物素类似物去除寡聚刺激试剂(例如，具有可逆地附着的抗CD3/抗CD28 Fab的寡聚链霉亲和素突变蛋白)减少在从细胞中分离或去除刺激试剂时可能发生的细胞损失的量。在一些实施方案中，在从细胞中分离或去除寡聚刺激试剂时，从细胞群中损失、杀伤或分离小于或小于约30％、25％、20％、15％、10％或5％的细胞。在某些实施方案中，从使用寡聚刺激试剂进行刺激的过程产生的输出群体具有的总细胞比从利用替代性刺激试剂(诸如抗体缀合的顺磁珠)的过程产生的输出群体多为、为约或至少15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％。

3.用于基因工程化的载体和方法

在一些实施方案中，与所提供的方法、用途、制品或组合物结合使用的工程化细胞(诸如T细胞)是已经进行基因工程化以表达本文所述的重组受体(例如，CAR)的细胞。在一些实施方案中，所述细胞通过引入、递送或转移编码所述重组受体和/或其他分子的核酸序列来进行工程化。

在一些实施方案中，用于产生工程化细胞的方法包括将编码重组受体(例如，抗BCMA CAR)的多核苷酸引入至细胞，例如像经刺激或激活的细胞中。在特定实施方案中，重组蛋白是重组受体，如任何所述的。将编码重组蛋白(诸如重组受体)的核酸分子引入细胞中可以使用许多已知载体中的任一种进行。此类载体包括病毒和非病毒系统，包括慢病毒和γ逆转录病毒系统，以及基于转座子的系统，诸如基于PiggyBac或Sleeping Beauty的基因转移系统。示例性方法包括用于转移编码受体的核酸的那些，包括通过病毒(例如逆转录病毒或慢病毒)、转导、转座子和电穿孔来进行。在一些实施方案中，工程化产生富集T细胞的一种或多种工程化组合物。

在一些实施方案中，所提供的方法包括将细胞基因工程化，例如，引入编码重组蛋白的异源或重组多核苷酸。此类重组蛋白可以包含重组受体，诸如章节II-A中所述的任何重组受体。可以使用将导致编码重组受体的多核苷酸整合至细胞如T细胞的基因组中的引入异源或重组多核苷酸的任何方法，包括病毒和非病毒基因工程化过程。将编码重组蛋白的多核苷酸(例如，异源或重组多核苷酸)引入细胞中可以使用多种已知载体中的任一种来进行。此类载体包括病毒系统，包括慢病毒和γ逆转录病毒系统。示例性方法包括用于转移编码受体的异源多核苷酸的那些方法，包括经由病毒(例如，逆转录病毒或慢病毒)转导。在一些实施方案中，将刺激细胞群基因工程化，诸如以引入编码重组受体的异源或重组多核苷酸，从而产生转化细胞的群体(本文中也称为转化的细胞群)。

在一些实施方案中，所提供的方法包括使用非病毒方法将细胞基因工程化，例如，引入编码重组蛋白的异源或重组多核苷酸，所述非病毒方法诸如电穿孔、磷酸钙转染、原生质体融合、阳离子脂质体介导的转染、纳米颗粒诸如脂质纳米颗粒、钨颗粒促进的微粒轰击、磷酸锶DNA共沉淀以及在例如WO 2014055668和美国专利号7,446,190中所述的其他方法。还考虑基于转座子的系统。

在特定实施方案中，在将细胞在刺激条件下刺激、激活和/或孵育后，将细胞基因工程化、转化或转导，诸如通过本文例如在章节II中提供的任何方法来进行。在特定实施方案中，一个或多个刺激的群体先前已经进行低温保护和储存，并且在基因工程化、转化、转染或转导细胞之前解冻并任选地洗涤。

在特定实施方案中，在对细胞进行刺激或使其经受刺激或在刺激条件下培养之后，将细胞基因工程化、转化或转导。在特定实施方案中，在从开始刺激起的以下时间、约以下时间或以下时间内，将细胞基因工程化、转化或转导：72小时、60小时、48小时、36小时、24小时或12小时，包含端值。在特定实施方案中，在从开始刺激起的以下时间、约以下时间或以下时间内，将细胞基因工程化、转化或转导：3天、两天或一天，包含端值。在某些实施方案中，在开始刺激之后在或在约12小时与48小时之间、16小时与36小时之间或18小时与30小时之间，将细胞基因工程化、转化或转导。在特定实施方案中，在开始刺激之后在或在约18小时与30小时之间，将细胞基因工程化、转化或转导。在特定实施方案中，在开始刺激之后在或在约16小时、18小时、20小时、22小时或24小时，将细胞基因工程化、转化或转导。

在某些实施方案中，用于基因工程化的方法是通过以下方式来进行：使群体的一个或多个细胞与编码重组蛋白(例如，重组受体)的核酸分子或多核苷酸接触，或向所述细胞中引入所述核酸分子或多核苷酸。在某些实施方案中，核酸分子或多核苷酸对于所述细胞是异源的。在特定实施方案中，异源核酸分子或异源多核苷酸对于所述细胞并非天然的。在某些实施方案中，所述异源核酸分子或异源多核苷酸编码并非由所述细胞天然表达的蛋白质(例如，重组蛋白)。在特定实施方案中，所述异源核酸分子或多核苷酸是或含有在所述接触或引入之前在所述细胞中未发现的核酸序列。

在一些实施方案中，在转导佐剂的存在下将所述细胞(例如，受刺激的细胞)工程化(例如，转导)。示例性转导佐剂包括但不限于聚阳离子、纤连蛋白或纤连蛋白来源的片段或变体、以及RetroNectin。在某些实施方案中，在聚阳离子、纤连蛋白或纤连蛋白来源的片段或变体和/或RetroNectin的存在下将所述细胞工程化。在特定实施方案中，在聚阳离子的存在下将所述细胞工程化，所述聚阳离子是聚凝胺、DEAE-葡聚糖、硫酸鱼精蛋白、聚-L-赖氨酸或阳离子脂质体。在特定实施方案中，在硫酸鱼精蛋白的存在下将所述细胞工程化。在一些实施方案中，寡聚刺激试剂的存在(例如，如章节II-C-2中所述)可以用作转导佐剂，参见例如WO/2017/068419，其通过引用并入本文。

在一些实施方案中，基因工程化(例如，转导)是在无血清培养基中进行，例如如本文中或PCT/US 2018/064627中所述。在一些实施方案中，所述无血清培养基是定义的或明确定义的细胞培养基。在某些实施方案中，所述无血清培养基是受控培养基，其已经过处理，例如被过滤以去除抑制剂和/或生长因子。在一些实施方案中，所述无血清培养基含有蛋白质。在某些实施方案中，所述无血清培养基可以含有血清白蛋白、水解产物、生长因子、激素、载体蛋白和/或附着因子。

在特定实施方案中，在一种或多种细胞因子的存在下将细胞工程化。在某些实施方案中，所述一种或多种细胞因子是重组细胞因子。在特定实施方案中，所述一种或多种细胞因子是人重组细胞因子。在某些实施方案中，所述一种或多种细胞因子结合和/或能够结合由T细胞表达的和/或对T细胞而言内源的受体。在特定实施方案中，所述一种或多种细胞因子是或包括细胞因子的4-α-螺旋束家族的成员。在一些实施方案中，所述细胞因子的4-α-螺旋束家族的成员包括但不限于白介素2(IL-2)、白介素4(IL-4)、白介素7(IL-7)、白介素9(IL-9)、白介素12(IL-12)、白介素15(IL-15)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。在一些实施方案中，所述一种或多种细胞因子是或包括IL-15。在特定实施方案中，所述一种或多种细胞因子是或包括IL-7。在特定实施方案中，所述一种或多种细胞因子是或包括重组IL-2。

在特定实施方案中，在刺激条件下在IL-2、IL-7和/或IL-15的存在下将细胞(例如，受刺激的细胞)工程化。在某些实施方案中，IL-2、IL-7和/或IL-15是重组的。在某些实施方案中，IL-2、IL-7和/或IL-15是人的。在特定实施方案中，所述一种或多种细胞因子是或包括人重组IL-2、IL-7和/或IL-15。在某些实施方案中，所述细胞被工程化(例如，转导)，或在刺激条件下，在重组IL-2、IL-7和IL-15(诸如重组人IL-2(例如，100IU/mL)、重组人IL-7(例如，600IU/mL)和/或重组人IL-15(例如，100IU/mL))的存在下。

在一些实施方案中，在与刺激期间存在的培养基相同或相似的培养基的存在下将细胞基因工程化、转化或转导。在一些实施方案中，在具有与刺激期间存在的培养基相同的细胞因子的培养基中将细胞基因工程化、转化或转导。在某些实施方案中，在以相同浓度具有与刺激期间存在的培养基相同的细胞因子的培养基中将细胞基因工程化、转化或转导。

在一些实施方案中，将细胞基因工程化是或包括将多核苷酸(例如，异源或重组多核苷酸)通过转导引入细胞中。在一些实施方案中，所述细胞用病毒载体进行转导或经受转导。在特定实施方案中，所述细胞用病毒载体进行转导或经受转导。在一些实施方案中，所述病毒是逆转录病毒载体，诸如γ逆转录病毒载体或慢病毒载体。慢病毒转导的方法是已知的。示例性方法描述于例如以下文献中：Wang等人(2012)J.Immunother.35(9):689-701；Cooper等人(2003)Blood.101:1637–1644；Verhoeyen等人(2009)Methods Mol Biol.506:97-114；以及Cavalieri等人(2003)Blood.102(2):497-505。

在一些实施方案中，转导通过使群体的一个或多个细胞与编码重组蛋白(例如重组受体)的核酸分子接触来进行。在一些实施方案中，所述接触可以通过离心诸如旋转接种(例如离心接种)来实现。此类方法包括如国际公开号WO 2016/073602中所述的那些方法中的任一种。示例性离心室包括由Biosafe SA生产和销售的那些，包括用于

和

2系统的那些，包括A-200/F和A-200离心室以及用于此类系统的各种试剂盒。示例性室、系统和处理仪器和机柜在以下文献中有所描述：例如，美国专利号6,123,655、美国专利号6,733,433和公开的美国专利申请公开号US 2008/0171951以及公开的国际专利申请公开号WO 00/38762，将其各自的内容通过引用以其整体并入本文。用于此类系统的示例性试剂盒包括但不限于由BioSafe SA以产品名CS-430.1、CS-490.1、CS-600.1或CS-900.2销售的一次性试剂盒。

在特定实施方案中，使已经经受刺激(例如，在刺激条件下培养)的组合物中为、为约或为至少50x10⁶、100x10⁶、150x10⁶、200x10⁶、250x10⁶、300x10⁶、350x10⁶、400x10⁶、450x10⁶、500x10⁶、550x10⁶、600x10⁶、700x10⁶、800x10⁶、900x10⁶或1,000x10⁶的量的细胞经受基因工程化，例如，转导。在特定实施方案中，已经经受刺激并且随后经受转导的细胞(例如，活T细胞，包括CD4+T细胞和CD8+T细胞两者)的总数量是为或约50x10⁶个细胞、为或约100x10⁶个细胞、为或约150x10⁶个细胞、为或约200x10⁶个细胞、为或约250x10⁶个细胞、为或约300x10⁶个细胞、为或约350x10⁶个细胞、为或约400x10⁶个细胞、为或约450x10⁶个细胞、为或约500x10⁶个细胞、为或约550x10⁶个细胞、为或约600x10⁶个细胞、为或约700x10⁶个细胞、为或约800x10⁶个细胞、为或约900x10⁶个细胞或为或约1,000x10⁶个细胞、或者任何前述值之间的任何值。在特定实施方案中，使输入群体中多达900x10⁶个细胞经受刺激，并且使为、为约或多达600x10⁶个细胞的量的已经经受刺激的细胞经受基因工程化，例如，转导。在特定实施方案中，经受基因工程化(例如，转导)的细胞组合物包含以下比率的活CD4+T细胞和活CD8+T细胞：在1:10与10:1之间、在1:5与5:1之间、在4:1与1:4之间、在1:3与3:1之间、在2:1与1:2之间、在1.5:1与1:1.5之间、在1.25:1与1:1.25之间、在1.2:1与1:1.2之间、在1.1:1与1:1.1之间、或约1:1、或1:1的活CD4+T细胞与活CD8+T细胞。

在一些实施方案中，所提供的方法与将含有编码重组受体的多核苷酸的病毒载体转导至为、为约或小于300x10⁶个细胞(例如，受刺激细胞群的活T细胞)中结合使用。

在某些实施方案中，对为或约100x10⁶个细胞(例如，受刺激细胞群的活T细胞)进行转导或使其经历转导。

在一些实施方案中，所提供的方法与将含有编码重组受体的多核苷酸的病毒载体转导至为、为约或小于600x10⁶个细胞(例如，受刺激细胞群的活T细胞)中结合使用。

在某些实施方案中，对为或约600x10⁶个细胞(例如，受刺激细胞群的活T细胞)进行转导或使其经历转导。在一些实施方案中，使多达900x10⁶个细胞(例如，活CD3+细胞或混合的活CD4+和活CD8+细胞(例如，以为或为约1:1比率混合))经受刺激，并且使为、为约或多达600x10⁶个细胞的量的已经经受刺激的细胞经受转导。

在一些实施方案中，转导在无血清培养基中进行。在一些实施方案中，转导在IL-2、IL-7和IL-15的存在下进行。在一些实施方案中，将用于转导的病毒载体在使用前冷冻并解冻，并用无血清培养基稀释解冻的病毒载体。在一些实施方案中，用于稀释病毒载体和用于转导的无血清培养基如本文中或PCT/US 2018/064627中所述。

在一些实施方案中，无血清培养基包含补充有一种或多种补充剂的基础培养基(例如OpTmizer^TMT细胞扩增基础培养基(ThermoFisher))。在一些实施方案中，所述一种或多种补充剂不含血清。在一些实施方案中，所述无血清培养基包含补充有一种或多种另外的组分的基础培养基，所述另外的组分用于细胞(例如，T细胞)的维持、扩增和/或激活，如由另外的补充剂(例如OpTmizer^TMT细胞扩增补充剂(ThermoFisher))来提供。在一些实施方案中，所述无血清培养基还包含血清替代物补充剂，例如，免疫细胞血清替代物，例如，ThermoFisher(#A2596101)、CTS^TM免疫细胞血清替代物、或Smith等人Clin TranslImmunology.2015年1月；4(1):e31中所述的免疫细胞血清替代物。在一些实施方案中，无血清培养基还包含游离形式的氨基酸，诸如L-谷氨酰胺。在一些实施方案中，无血清培养基还包含二肽形式的L-谷氨酰胺(例如，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺)，诸如Glutamax^TM(ThermoFisher)中的二肽。在一些实施方案中，无血清培养基还包含一种或多种重组细胞因子，诸如重组人IL-2、重组人IL-7和/或重组人IL-15。

在特定实施方案中，所述细胞(例如，受刺激细胞群的细胞)含有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的作为CD4+T细胞或CD8+T细胞的细胞。在一些实施方案中，转导(包括转导后孵育)进行24小时与48小时之间、36小时与12小时之间、18小时与30小时之间，或者进行或进行约24小时。在一些实施方案中，转导(包括转导后孵育)分别进行或进行约24小时、48小时或72小时，或者进行或进行约1天、2天或3天。在特定实施方案中，转导(包括转导后孵育)进行或进行约24小时±6小时、48小时±6小时或72小时±6小时。在特定实施方案中，转导(包括转导后孵育)进行或进行约72小时、72±4小时，或者进行或进行约3天。

在某些实施方案中，在起始或开始孵育(例如，在刺激条件下孵育)的两天内、36小时内、30小时内、24小时内、18小时内、16小时内、14小时内或12小时内开始转导步骤。在某些实施方案中，在起始或开始孵育(例如，在刺激条件下孵育)的约20小时开始转导步骤。在某些实施方案中，在起始或开始孵育(例如，在刺激条件下孵育)的20±4小时开始转导步骤。

在一些实施方案中，将系统与其他仪器一起包括和/或置于与其他仪器相关联，所述其他仪器包括用于操作、自动化、控制和/或监测转导步骤以及在系统中执行的一个或多个各种其他处理步骤(例如，可以使用或结合如本文或在国际公开号WO 2016/073602中所述的离心室系统进行的一个或多个处理步骤)的方面的仪器。在一些实施方案中，这种仪器容纳于机柜中。在一些实施方案中，所述仪器包括机柜，所述机柜包括外壳，所述外壳含有控制电路、离心机、罩、电机、泵、传感器、显示器和用户界面。示例性装置描述于美国专利号6,123,655、美国专利号6,733,433和US 2008/0171951中。

在一些实施方案中，所述系统包含一系列容器，例如袋、管道、旋塞、夹子、连接器和离心室。在一些实施方案中，所述容器(诸如袋)包括一个或多个容器(诸如袋)，其在同一容器或单独容器(例如同一袋或单独袋)中含有待转导的细胞和病毒载体颗粒。在一些实施方案中，所述系统还包括含有介质(诸如稀释剂和/或洗涤溶液)的一个或多个容器(诸如袋)，在所述方法期间使所述介质进入室和/或其他组件中以稀释、重悬和/或洗涤组分和/或群体。所述容器可以连接在系统中的一个或多个位置，例如连接在对应于输入管线、稀释剂管线、洗涤管线、废液管线和/或输出管线的位置。

在一些实施方案中，所述室与离心机相关联，离心机能够实现所述室的旋转，诸如围绕其旋转轴旋转。结合细胞的转导和/或在一个或多个其他处理步骤中，旋转可以发生在孵育之前、期间和/或之后。因此，在一些实施方案中，各个处理步骤中的一个或多个在旋转下(例如在特定的力下)进行。所述室通常能够竖直或大致竖直地旋转，使得所述室在离心期间竖直放置，并且侧壁和轴是竖直或大致竖直的，并且一个或多个端壁是水平或大致水平的。

在一些实施方案中，在将群体提供至空腔之前，可以将含有细胞的群体和含有病毒载体颗粒的群体和任选地空气组合或混合。在一些实施方案中，含有细胞的群体和含有病毒载体颗粒的群体和任选地空气是单独提供并且在空腔中组合并混合。在一些实施方案中，可以按任何顺序将含有细胞的群体、含有病毒载体颗粒的群体和任选地空气提供至内部空腔中。在任何此类一些实施方案中，含有细胞和病毒载体颗粒的群体在组合或混合在一起后就是输入群体，不论是在离心室内部还是外部组合或混合的，和/或不论细胞和病毒载体颗粒是一起还是单独(诸如同时或依序)提供至离心室中。

在一些实施方案中，在转导方法中，一定体积的气体(诸如空气)的摄入发生在孵育细胞和病毒载体颗粒(诸如旋转)之前。在一些实施方案中，在转导方法中，一定体积的气体(诸如空气)的摄入发生在细胞和病毒载体颗粒的孵育(诸如旋转)期间。

在一些实施方案中，构成转导群体的细胞或病毒载体颗粒的液体体积以及任选地空气的体积可以是预定体积。所述体积可以是被编程到系统中和/或由与所述系统相关联的电路控制的体积。

在一些实施方案中，手动、半自动和/或自动地控制转导群体和任选地气体(诸如空气)的摄入，直到已经将所需或预定的体积摄入室的内部空腔中为止。在一些实施方案中，与系统相关的传感器可以例如经由其颜色、流速和/或密度来检测流入和流出离心室的液体和/或气体，并且可以与相关电路通信以按照需要停止或继续摄入，直到已经实现这种所需或预定体积的摄入为止。在一些方面，可以使被编程或仅能够检测系统中的液体而非气体(例如空气)的传感器能够在不停止摄入的情况下允许气体(诸如空气)通过进入系统中。在一些此类实施方案中，当需要气体(诸如空气)摄入时，可以将一条不透明的管道放置在传感器附近的线中。在一些实施方案中，可以手动地控制气体(诸如空气)的摄入。

在所提供的方法的方面，使离心室的内部空腔经历高速旋转。在一些实施方案中，在摄入液体输入群体和任选地空气之前、同时、之后或间歇地实现旋转。在一些实施方案中，在摄入液体输入群体和任选地空气之后实现旋转。在一些实施方案中，旋转通过离心室的离心来进行，其在内部空腔的侧壁内表面处和/或在细胞的表面层处的相对离心力为或约或者至少或至少约200g、300g、400g、500g、600g、700g、800g、1000g、1100g、1500、1600g、1800g、2000g、2200g、2500g、3000g、3200g、3500g或4000g。在一些实施方案中，旋转通过离心进行，其力大于或大于约1100g，如大于或大于约1200g、大于或大于约1400g、大于或大于约1600g、大于或大于约1800g、大于或大于约2000g、大于或大于约2400g、大于或大于约2800g、大于或大于约3000g或者大于或大于约3200g。在特定实施方案中，通过离心进行的旋转的力在600g与800g之间。在特定实施方案中，通过离心进行的旋转的力为或为约693g。在一些实施方案中，旋转通过离心进行，其力为或为约1600g。

在一些实施方案中，将室的空腔中的气体(诸如空气)从室中排出。在一些实施方案中，将气体(诸如空气)排出到容器，所述容器作为封闭系统的一部分与离心室可操作地连接。在一些实施方案中，容器是自由或空的容器。在一些实施方案中，室的空腔中的空气(诸如气体)通过过滤器排出，所述过滤器经由无菌管组线与室的内部空腔可操作地连接。在一些实施方案中，使用手动、半自动或自动过程排出空气。在一些实施方案中，在从室的空腔中输送(express)含有孵育的细胞和病毒载体颗粒(诸如已经开始转导的细胞或已经用病毒载体转导的细胞)的输出群体之前、同时、间歇地或随后将空气从室中排出。

在一些实施方案中，转导和/或其他孵育作为连续或半连续过程或作为所述连续或半连续过程的一部分进行。在一些实施方案中，连续过程涉及连续摄入细胞和病毒载体颗粒，例如转导组合物(作为单一预先存在的组合物，或者通过连续抽入同一容器(例如空腔)中，从而混合其部分)，和/或在孵育的至少一部分期间(例如，在离心的同时)，从容器中连续输送或排出液体，以及任选地排出气体(例如空气)。在一些实施方案中，至少部分同时进行连续摄入和连续输送。在一些实施方案中，连续摄入发生在部分孵育期间，例如在部分离心期间，并且连续输送发生在孵育的单独部分期间。两者可以交替进行。因此，在进行孵育的同时，连续摄入和输送可以允许处理(例如转导)总体积更大的样品。

在一些实施方案中，孵育是连续过程的一部分，所述方法包括在孵育的至少一部分期间，实现在室旋转期间以及在孵育的一部分期间将所述转导组合物连续摄入空腔中，实现在室的旋转期间通过所述至少一个开口自空腔连续输送液体并任选地排出气体(例如空气)。

在一些实施方案中，通过在以下步骤之间交替来进行半连续孵育：实现将组合物摄入空腔中，孵育，自空腔输送液体和任选地自空腔排出气体(例如空气)，如到输出容器，然后摄入含有更多细胞和用于处理的其他试剂(例如，病毒载体颗粒)的随后的(例如第二、第三等)组合物，并重复所述过程。例如，在一些实施方案中，孵育是半连续过程的一部分，所述方法包括在孵育之前，实现通过所述至少一个开口将转导组合物摄入空腔中，并在孵育之后，实现从空腔中输送流体；实现将包含细胞和病毒载体颗粒的另一种转导组合物摄入所述内部空腔中；并且在所述内部空腔中在一定条件下孵育另一种转导组合物，借此将所述另一种转导组合物中的所述细胞用所述载体转导或经历转导。所述过程能以迭代的方式继续进行许多另外的回合。在此方面，半连续或连续方法可以允许产生甚至更大体积和/或数量的细胞。

在一些实施方案中，转导孵育的一部分在离心室中进行，其在包括旋转或离心的条件下进行。

在特定实施方案中，用病毒载体转导细胞是或包括旋转接种，例如，含有细胞和病毒颗粒的混合物的离心。在一些实施方案中，可以使含有细胞和病毒颗粒的组合物旋转，通常以相对较低的力或速度旋转，诸如速度低于用于沉淀细胞的速度，诸如从或从约600rpm至1700rpm(例如，为或约或至少600rpm、1000rpm、或1500rpm、或1700rpm)。在一些实施方案中，以如下力(例如，相对离心力)进行旋转：从或从约100g至4000g(例如为或约或者至少或至少约100g、200g、300g、400g、500g、600g、700g、800g、900g、1000g、1500g、2000g、2500g、3000g或3500g)，如例如在室或空腔的内壁或外壁处所测量。

在一些实施方案中，将所述细胞用病毒载体以如下力(例如，相对离心力)旋转接种：在或在约100g与4000g之间、200g与1,000g之间、500g与1200g之间、1000g与2000g之间、600g与800g之间、1200g与1800g之间、或1500g与1800g之间。在一些实施方案中，将所述细胞用病毒载体颗粒以如下力旋转接种：为、为至少或为约100g、200g、300g、400g、500g、600g、700g、800g、900g、1000g、1200g、1500g、1600g、2000g、2500g、3000g、3200g或3500g。在一些实施方案中，将所述细胞用病毒载体以为或为约692g或693g的力进行转导或经受转导。在特定实施方案中，将所述细胞用病毒载体以为或为约1600g的力进行转导或经受转导。在一些实施方案中，所述力是在内部空腔的侧壁的内表面处和/或在细胞的表面层处的力。

在某些实施方案中，将细胞旋转接种，例如，使含有细胞和病毒载体的细胞组合物旋转，进行大于或大于约5分钟，诸如大于或大于约10分钟、大于或大于约15分钟、大于或大于约20分钟、大于或大于约30分钟、大于或大于约45分钟、大于或大于约60分钟、大于或大于约90分钟或者大于或大于约120分钟；或者在或在约5分钟与120分钟之间、30分钟与90分钟之间、15分钟与60分钟之间、15分钟与45分钟之间、30分钟与60分钟之间或45分钟与60分钟之间，每个都包含端值。在一些实施方案中，将细胞用病毒载体旋转接种，持续为或为约30分钟。在某些实施方案中，将细胞用病毒载体旋转接种，持续为或为约60分钟。

在一些实施方案中，转导方法包括转导组合物和任选地空气在离心室中的旋转接种(例如，旋转或离心)，持续大于或大于约5分钟，诸如大于或大于约10分钟、大于或大于约15分钟、大于或大于约20分钟、大于或大于约30分钟、大于或大于约45分钟、大于或大于约60分钟、大于或大于约90分钟或者大于或大于约120分钟。在一些实施方案中，将转导组合物和任选地空气在离心室中旋转或离心，持续大于5分钟，但持续不超过60分钟、不超过45分钟、不超过30分钟或不超过15分钟。在特定实施方案中，转导包括旋转或离心持续或持续约60分钟。

在一些实施方案中，转导方法包括转导组合物和任选地空气在离心室中旋转或离心，进行在或在约10分钟与60分钟之间、15分钟与60分钟之间、15分钟与45分钟之间、30分钟与60分钟之间或45分钟与60分钟之间，每个都包含端值，并且其在内部空腔的侧壁的内表面处和/或在细胞的表面层处的力为、为约或在1000g、1100g、1200g、1400g、1500g、1600g、1800g、2000g、2200g、2400g、2800g、3200g或3600g。在特定实施方案中，转导方法包括转导组合物(例如，细胞和病毒载体颗粒)以为或为约1600g旋转或离心，进行为或为约60分钟。

4.载体拷贝数(VCN)

在一些实施方案中，转基因序列(诸如编码重组受体例如CAR的转基因序列)的基因组整合可以在与用于工程化细胞的任何所提供过程结合产生的细胞中进行评估。在一些实施方案中，评估整合拷贝数，其是整合至细胞的染色体DNA或基因组DNA中的转基因序列的拷贝数。

在一些实施方案中，用于评估转基因序列的基因组整合的方法涉及从自一种或多种细胞分离的DNA分开脱氧核糖核酸(DNA)的高分子量级分，诸如大于或大于约10千碱基(kb)的DNA种类。在一些方面，这种分离可以通过诸如脉冲场凝胶电泳(PFGE)的方法进行。在一些方面，所述一个或多个细胞含有或被怀疑含有至少一个工程化细胞，所述至少一个工程化细胞包含编码重组蛋白的转基因序列。在一些方面，所述方法涉及确定整合到所述一个或多个细胞的基因组中的转基因序列的存在、不存在或量，例如通过定量方法(诸如定量聚合酶链式反应(qPCR)、数字PCR(dPCR)或微滴式数字PCR(ddPCR))来确定。

在一些实施方案中，所述高分子量级分主要含有大DNA分子如染色体或基因组DNA，并且含有低的或几乎不含大小小于阈值的分子，诸如质粒、非整合的DNA片段、线性互补DNA(cDNA)、自体整合体(autointegrant)、长末端重复序列(LTR)环或者尚非整合至基因组中的其他残余种类或分子。在一些实施方案中，通过确定所述高分子量级分中转基因序列的存在、不存在或量，所检测到的转基因序列表示已整合到工程化细胞的基因组中的那些，并且最小限度地检测到非整合转基因序列。

在一些实施方案中，所述高分子量级分包含大小为大于或大于约10千碱基(kb)的DNA分子。在一些实施方案中，所述高分子量级分包含大小为大于或大于约10、11、12、12.5、13、14、15、16、17、17.5、18、19、20、25或30千碱基(kb)或更大的DNA分子。在一些实施方案中，所述高分子量级分包含大小为大于或大于约10、12.5、15、17.5或20千碱基(kb)或更大的DNA分子。在一些方面，所述高分子量级分含有基因组DNA或基因组DNA片段，并且排除或分离可能存在于DNA样品中的非整合或残留的核酸种类。在一些方面，所述高分子量级分例如高于阈值(诸如约10、11、12、12.5、13、14、15、16、17、17.5、18、19、20、25或30千碱基(kb)或更大)的DNA样品。在一些实施方案中，所述阈值为大于或大于约10、12.5、15、17.5或20千碱基(kb)或更大。

在一些实施方案中，使用基于电泳的方法分开或分离所述高分子量级分。在一些方面，电泳依据电荷和/或大小经由在存在电场的情况下通过分离基质的迁移率分离生物分子。在一些实施方案中，电泳系统可以用于基于大小或分子量来分级分离、分析和收集特定分析物，包括核酸分子。在一些方面，级分是或包括所述多个分子的子集。在一些方面，可以通过大小或分子量来定义或确定级分，或者在一些方面通过任何如下物理特性来定义或确定级分，当由电场力驱动其迁移通过本发明的缓冲液组合物时，所述物理特性使其以比多个分子或级分中的其他分子或级分更快或更慢的速率(即，电泳迁移率)迁移。

在一些实施方案中，使用脉冲场凝胶电泳(PFGE)分开或分离所述高分子量级分。在一些方面，PFGE涉及在电泳系统中引入交流电压梯度以提高较大核酸分子(诸如染色体或基因组DNA)的分辨率。在一些方面，所述电泳系统的电压在三个方向之间周期性地切换：一个沿着凝胶的中心轴，并且两个沿着两侧60度的角度。在一些方面，用于通过PFGE分开或分离核酸分子的示例性系统和方法包括在例如US 9599590、US 2017/0240882或US 2017/0254774中所述的那些。

在一些方面，所述电泳(诸如PFGE)可以使用设备或系统来进行。在一些方面，所述设备或系统是自动化系统或高通量系统。用于进行PFGE的示例性系统包括例如US9599590、US 2017/0240882或US 2017/0254774中所述的那些，或可商购的设备或系统，诸如Pippin Prep、Blue Pippin或Pippin HT(Sage Science)；CHEF

XA系统、CHEF-

III变角度系统、CHEF-DR II系统(Bio-Rad)；和Biometra Rotaphor 8系统(AnalytikJena AG)。

在一些方面，用于评估的示例性样品包括核酸、寡核苷酸、DNA分子、RNA分子或其任何组合。在一些方面，所述样品可以包括氨基酸、肽、蛋白质或其任何组合。在一些方面，所述样品可以是全细胞裂解物或细胞裂解物(诸如工程化用于过继细胞疗法的细胞的裂解物)的DNA或蛋白质级分。

在一些实施方案中，来自样品的核酸可以包括基因组DNA、双链DNA(dsDNA)、单链DNA(ssDNA)、编码DNA(或cDNA)、信使RNA(mRNA)、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微小RNA(miRNA)、单链RNA、双链RNA(dsRNA)、吗啉代、RNA干扰(RNAi)分子、线粒体核酸、叶绿体核酸、病毒DNA、病毒RNA和具有单独遗传物质的其他细胞器。在一些方面，来自样品的核酸还可以包括含有经修饰的、合成的或非天然存在的核苷酸或结构元件的核酸类似物或者其他替代/经修饰的核酸化学物质(诸如碱基类似物(诸如肌苷)、嵌入剂(美国专利号4,835,263)和小沟结合剂(美国专利号5,801,115)。

在一些实施方案中，在分离或分开高分子量或低分子量级分之前，可以将样品与如下试剂组合，所述试剂在电泳系统中评估之前赋予净负电荷、使肽或蛋白质变性或消化DNA或RNA分子。在一些方面，出于检测的目的，可以将样品与赋予样品或其级分荧光、磁性或放射性特性的药剂组合。在一些例子中，将dsDNA样品与溴化乙锭混合，施加至电泳盒，并且使用超亮绿色LED检测样品的级分。

在一些方面，用于分开或分离核酸样品的系统(诸如电泳系统)可以是自动化的和/或高通量的。在一些方面，所述电泳系统可以利用一次性消耗品或试剂，诸如电泳盒。

在一些方面，确定转基因序列的存在、不存在或量可以使用用于确定核酸序列的存在、不存在或量的方法来进行。特别地，用于定量核酸序列的方法(诸如定量聚合酶链式反应(qPCR)或相关方法)可以用于确定含有DNA的样品中或从含有DNA的样品分开或分离的特定级分(如高分子量级分)中的转基因序列的拷贝数。在一些实施方案中，确定转基因序列的存在、不存在或量包括例如使用下文用于对核酸分子进行定量的任一种示例性测定来确定拷贝数。

在一些方面，可以使用探针或引物检测特定序列的存在、不存在和/或量，所述探针或引物可以特异性结合或识别所述转基因序列的全部或一部分。在一些实施方案中，可以使用探针或引物序列来确定拷贝数，所述探针可以特异性检测所述转基因序列的一部分，所述引物序列可以特异性扩增所述转基因序列的一部分。在一些方面，所述探针或引物序列可以特异性检测、结合或识别所述转基因序列的一部分，诸如所述转基因序列中对细胞而言为异源的、外源的或转基因的部分。在一些实施方案中，用于qPCR或其他基于核酸的方法的引物或探针对结合、识别和/或扩增编码重组蛋白的核酸和/或所述质粒和/或载体的其他组分或元件具有特异性，所述其他组分或元件包括调节元件(例如启动子、转录和/或转录后调节元件或反应元件)或标记(例如替代标记)。在一些方面，所述探针或引物可以用于确定转基因序列的存在、不存在和/或量的示例性方法，诸如定量PCR(qPCR)、数字PCR(dPCR)或微滴式数字PCR(ddPCR)。

在一些方面，确定所述存在、不存在或量包括确定所述转基因序列的量，诸如确定在一个或多个细胞中或在含有一个或多个细胞的生物样品中所述转基因序列的质量、重量、浓度或拷贝数。在一些方面，确定核酸序列的存在、不存在或量或评估所述转基因序列的质量、重量、浓度或拷贝数可以在细胞群体的一部分或生物样品的一部分中进行，并且可以进行归一化、平均、和/或外推以确定整个样品或整个细胞群体中的存在、不存在或量。

在一些实施方案中，确定所述转基因序列的存在、不存在或量包括确定所述一个或多个细胞中的每个二倍体基因组或每个细胞中所述转基因序列的质量、重量、浓度或拷贝数。在一些实施方案中，所述一个或多个细胞构成细胞群体，其中所述群体的多个细胞包含编码所述重组蛋白的转基因序列。在一些实施方案中，所述拷贝数是所述细胞群中的每个二倍体基因组或每个细胞中的平均或均值拷贝数。

在一些方面，确定所述拷贝数包括确定存在于一个或多个细胞或生物样品中的转基因序列的拷贝数。在一些方面，所述拷贝数可以表示为平均或均值拷贝数。在一些方面，特定整合转基因的拷贝数包括每个细胞中的整合体(含有转基因序列)的数量。在一些方面，特定整合转基因的拷贝数包括每个二倍体基因组中的整合体(含有转基因序列)的数量。在一些方面，转基因序列的拷贝数表示为每个细胞中的整合转基因序列的数量。在一些方面，转基因序列的拷贝数表示为每个二倍体基因组中的整合转基因序列的数量。在一些方面，所述一个或多个细胞构成细胞群体，其中所述群体的多个细胞包含编码所述重组蛋白的转基因序列。在一些实施方案中，所述拷贝数是所述细胞群中的每个二倍体基因组或每个细胞中的平均或均值拷贝数。

在一些实施方案中，确定所述转基因序列的量包括评估所述一个或多个细胞的每个细胞中、任选每个CD3+、CD4+和/或CD8+细胞中和/或每个表达所述重组蛋白的细胞中所述转基因序列的质量、重量、浓度或拷贝数。在一些方面，可以使用基于细胞的方法(诸如通过流式细胞术或免疫染色)来确定在细胞上表达的表面标记或表型。在一些方面，表达重组蛋白的细胞可以使用基于细胞的方法来确定，诸如通过流式细胞术或免疫染色(例如使用抗独特型抗体或针对替代标记染色)来进行。在一些方面，转基因序列的量可以针对特定细胞(诸如CD3+、CD4+和/或CD8+细胞)的数量来归一化，和/或按照表达重组蛋白的细胞或按照细胞总数(诸如按照样品中的细胞总数或按照正在经历工程化过程的细胞总数)来归一化。

在一些实施方案中，所确定的拷贝数表示为归一化值。在一些实施方案中，将所确定的拷贝数定量为每个基因组或每个细胞中的转基因序列的拷贝数。在一些方面，每个基因组的值表示为每个二倍体基因组中的转基因序列的拷贝，因为典型的体细胞(诸如T细胞)含有二倍体基因组。在一些方面，所确定的拷贝数可以针对细胞的基因组中已知参考基因的拷贝数归一化。在一些方面，参考基因是RRP30(编码核糖核酸酶P蛋白亚基p30)、或18SrRNA(编码18S核糖体RNA)、28S rRNA(编码28S核糖体RNA)、TUBA(编码α微管蛋白)、ACTB(编码β肌动蛋白)、β2M(编码β2-微球蛋白)、ALB(编码白蛋白)、RPL32(编码核糖体蛋白L32)、TBP(编码TATA序列结合蛋白)、CYCC(编码亲环蛋白C)、EF1A(编码延伸因子1α)、GAPDH(编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶)、HPRT(编码次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶)或RPII(编码RNA聚合酶II)。在一些实施方案中，将所确定的拷贝数定量为每微克DNA中的转基因序列的拷贝。

在一些方面，所述拷贝数是来自多个细胞或细胞群体(诸如多个工程化细胞或工程化细胞群体)的平均、均值或中值拷贝数。在一些方面，拷贝数是来自多个细胞或细胞群(诸如多个工程化细胞或工程化细胞群)的平均或均值拷贝数。在一些方面，所述平均或均值拷贝数是从多个细胞或细胞群(诸如经受工程化或制造过程的一个或多个步骤的多个细胞或细胞群)或在细胞组合物(诸如用于施用于受试者的细胞组合物)中确定。在一些方面，归一化的平均拷贝数被确定为例如针对参考基因(诸如在二倍体基因组中以两个拷贝存在的已知基因)归一化的转基因序列的平均或均值拷贝数。在一些方面，针对通常在每个二倍体基因组中以两个拷贝存在的参考基因的归一化可以对应于细胞(诸如二倍体细胞)中的拷贝数。因此，在一些方面，归一化的平均或均值拷贝数可以对应于多个细胞(例如，通常具有二倍体基因组的T细胞)或细胞群体中检测到的转基因序列的平均或均值拷贝数。

在一些实施方案中，确定所述转基因序列的存在、不存在或量是通过聚合酶链式反应(PCR)进行的。在一些实施方案中，所述PCR是定量聚合酶链式反应(qPCR)、数字PCR或微滴式数字PCR，诸如下文所述的任一种。在一些实施方案中，所述转基因序列的存在、不存在或量通过微滴式数字PCR来确定。在一些实施方案中，所述PCR是使用与所述转基因序列的至少一部分互补或能够将其特异性扩增的一种或多种引物进行的，并且在一些情况下是使用与参考基因的至少一部分互补或能够将其特异性扩增的一种或多种引物进行的。

在一些方面，qPCR可以用于实时检测随着反应进展而测量的扩增产物的积累，并在每个循环后进行产物定量。因此，在一些方面，qPCR可以用于确定样品中特定核酸序列(诸如转基因序列)的拷贝数。在一些方面，qPCR在每个反应孔中使用荧光报告分子，所述荧光报告分子随着产物DNA的量增加而产生增加的荧光。在一些方面，使用的荧光化学物质包括DNA结合染料和荧光标记的序列特异性引物或探针。在一些方面，qPCR使用专门的热循环仪，所述热循环仪具有以指定波长照射每个样品并检测由激发的荧光团发射的荧光的能力。在一些方面，所测量的荧光与扩增子的总量成比例；荧光随时间的变化用于计算每个循环中产生的扩增子的量。

在一些实施方案中，dPCR是用于检测和定量核酸的方法，并且允许对靶核酸分子进行准确的定量分析和高度灵敏的检测。在一些方面，dPCR涉及将DNA有限稀释成一系列单独PCR反应物(或分区)。在一些方面，有限稀释可以基于待评估的模板核酸(例如，转基因序列)的随机分布和泊松统计，使用以纳米流体学和乳液化学物质划分的原理来测量对于给定比例的正分区存在的DNA的量。在一些方面，dPCR通常是线性的并且是灵敏的，能够检测或定量非常少量的DNA。在一些方面，dPCR允许使用无需标准曲线的单分子计数方法对DNA样品进行绝对定量，并且可以从每个孔的单个分区的PCR获得绝对定量(参见Pohl等人,(2004)Expert Rev.Mol.Diagn.4(1),41-47)。

用于dPCR的示例性可商购设备或系统包括Raindrop^TM数字PCR系统(Raindance^TMTechnologies)；QX200^TMDroplet Digital^TMPCR系统(Bio-Rad)；BioMark^TMHD系统和qdPCR 37K^TMIFC(Fluidigm Corporation)和QuantStudio^TM3D数字PCR系统(LifeTechnologies^TM)(参见例如，Huggett等人(2013)Clinical Chemistry 59:1691–1693；Shuga等人(2013)Nucleic Acids Research 41(16):e159；Whale等人(2013)PLoS One 3:e58177)。

在一些实施方案中，使用微滴式数字聚合酶链式反应(ddPCR)确定用于整合到工程化细胞的基因组中的转基因序列(诸如编码重组蛋白的转基因序列)的存在、不存在或量。ddPCR是一种类型的数字PCR，其中将所述PCR溶液通过水油乳液化学物质分成或划分为较小的反应物，以产生大量微滴。在一些方面，可以使用特定的表面活性剂产生油包水微滴。(参见例如，Hindson等人,(2011)Anal Chem 83(22):8604–8610；Pinheiro等人,(2012)Anal Chem 84,1003–1011)。在一些方面，每个单独微滴随后作为单独反应运行。在一些方面，将PCR样品划分为纳升大小的样品并封装进油性微滴中。在一些方面，所述油性微滴是使用微滴生成器制备的，所述微滴生成器向每个孔施加真空。在示例性的情况下，可以由20μL样品体积制备用于单独反应的大约20,000个油性微滴。

在一些方面，评估整合拷贝数的方法可以在不同时间点进行，以确定并比较基因工程化(诸如将引入的转基因序列整合至将所述转基因序列引入其中的细胞的基因组中)的时间安排、程度或进展。在一些方面，所述方法可以在用于工程化细胞组合物的工程化或制造过程(诸如所述的任何过程)的不同阶段进行。例如，所提供的方法可以在扩增工程化过程或非扩增工程化过程的各个阶段进行。

在一些方面，使用上述用于载体拷贝数的测定，针对诸如编码重组受体(例如CAR)的转基因序列的基因组整合来评估通过所提供的方法工程化的细胞。在一些实施方案中，所述方法涉及从自细胞分离的脱氧核糖核酸(DNA)分开大于或大于约10千碱基(kb)的高分子量级分，其中在所述分开之前，已经在用于将转基因序列整合至细胞基因组中的条件下，诸如通过病毒转导向细胞中引入包含转基因序列的多核苷酸；以及确定所述转基因序列在所述高分子量级分中的存在、不存在或量。

5.孵育

在一些实施方案中，用于产生例如用于根据所提供的方法、用途、制品或组合物中的任一种的细胞疗法的工程化细胞的方法包括用于在不促进增殖和/或扩增的条件下孵育细胞的一个或多个步骤。在一些实施方案中，在基因工程化的步骤(例如通过转导或转染将重组多肽引入细胞)之后，在促进增殖和/或扩增的条件下孵育细胞。在特定实施方案中，在刺激条件下孵育细胞并用重组多核苷酸(例如编码重组受体的多核苷酸)转导或转染细胞之后孵育细胞。因此，在一些实施方案中，在不促进增殖和/或扩增的条件下孵育已通过用编码CAR的重组多核苷酸转导或转染工程化的CAR阳性T细胞的组合物。

在特定实施方案中，诸如通过用病毒载体转化(例如转导)细胞进行基因工程化还包括在向细胞引入病毒载体或使细胞与病毒载体接触之后孵育细胞的一个或多个步骤。在一些实施方案中，在用于基因工程化、转化、转导或转染细胞以将病毒载体引入细胞中的过程之后，孵育细胞(例如，转化的细胞群的细胞(也称为“转化的细胞”)。在特定实施方案中，所述孵育得到孵育细胞的群体(本文中也称为孵育的细胞群)。

在一些实施方案中，在不进一步处理细胞的情况下进行异源或重组多核苷酸(例如，病毒载体颗粒)的引入之后，孵育所述细胞(例如转化的细胞)。在特定实施方案中，在孵育之前，洗涤细胞，诸如以去除或基本上去除编码异源或重组多核苷酸的外源或剩余多核苷酸(例如病毒载体颗粒)，如在旋转接种后在基因工程化过程之后培养基中剩余的那些。

在一些此类实施方案中，进一步孵育是在一定条件下实现，以使病毒载体整合到一个或多个细胞的宿主基因组中。例如，进一步孵育在例如经由旋转接种进行转导之后为可能结合至T细胞的病毒载体整合在细胞的基因组内以递送目标基因提供时间。在一些方面，进一步孵育在一定条件下进行，以允许细胞(例如转化的细胞)休眠或恢复，其中在孵育期间对细胞的培养支持或维持细胞的健康。在特定实施方案中，在静态条件(诸如不涉及培养基的离心、振荡、旋转、摇摆或灌注(例如，连续或半连续灌注)的条件)下孵育细胞。

评估或确定孵育是否已经导致病毒载体颗粒整合到宿主基因组中，并且因此凭经验确定进一步孵育的条件是在技术人员的水平内。在一些实施方案中，可以通过测量在孵育后由病毒载体颗粒基因组中含有的核酸编码的重组蛋白(诸如异源蛋白)的表达水平来评估病毒载体在宿主基因组中的整合。可以使用多种熟知方法来评价重组分子的表达水平，例如在细胞表面蛋白的情况下，例如通过基于亲和力的方法(例如基于免疫亲和力的方法)来检测，诸如通过流式细胞术进行。在一些例子中，通过检测转导标记和/或报道基因构建体来测量表达。在一些实施方案中，编码截短的表面蛋白的核酸包括在载体内并用作其表达和/或增强的标记。

在某些实施方案中，孵育是在静态条件(诸如不涉及培养基的离心、振荡、旋转、摇摆或灌注(例如，连续或半连续灌注)的条件)下进行。在一些实施方案中，在开始孵育之前或之后不久，例如在5、15或30分钟内，将细胞转移(例如，在无菌条件下转移)至容器诸如袋或小瓶中，并置于孵育器中。

在一些实施方案中，孵育的至少一部分在离心室的内部空腔中进行，诸如国际公开号WO 2016/073602中所述。

在一些实施方案中，将已经引入编码异源或重组多肽的多核苷酸(例如，病毒载体)的细胞转移至用于孵育的容器中。在一些实施方案中，容器是小瓶。在特定实施方案中，容器是袋。在一些实施方案中，将细胞和任选地异源或重组多肽在封闭或无菌条件下转移至容器中。在一些实施方案中，然后将容器(例如小瓶或袋)置入孵育器中进行孵育的全部或一部分。在特定实施方案中，将孵育器设定在为、为约或至少16℃、24℃或35℃。在一些实施方案中，将孵育器设定在37℃、约37℃或37℃±2℃、±1℃、±0.5℃或±0.1℃。

在一些方面，用于孵育的条件可以包括以下中的一种或多种：特定培养基、温度、氧含量、二氧化碳含量、时间、药剂(例如，营养素、氨基酸、抗生素、离子和/或刺激因子(诸如细胞因子、趋化因子、抗原、结合配偶体、融合蛋白、重组可溶性受体和任何其他旨在激活细胞的药剂))。

在一些实施方案中，在无血清培养基中进行孵育。在一些实施方案中，无血清培养基是定义的和/或明确定义的细胞培养基。在某些实施方案中，无血清培养基是受控培养基，其已经过处理，例如被过滤以去除抑制剂和/或生长因子。在一些实施方案中，所述无血清培养基含有蛋白质。在某些实施方案中，无血清培养基可以含有血清白蛋白、水解产物、生长因子、激素、载体蛋白和/或附着因子。

在特定实施方案中，在一种或多种细胞因子存在下孵育细胞。在某些实施方案中，所述一种或多种细胞因子是重组细胞因子。在特定实施方案中，所述一种或多种细胞因子是人重组细胞因子。在某些实施方案中，所述一种或多种细胞因子结合和/或能够结合由T细胞表达的和/或对T细胞而言内源的受体。在特定实施方案中，所述一种或多种细胞因子是或包括细胞因子的4-α-螺旋束家族的成员。在一些实施方案中，细胞因子的4-α-螺旋束家族的成员包括但不限于白介素2(IL-2)、白介素4(IL-4)、白介素7(IL-7)、白介素9(IL-9)、白介素12(IL-12)、白介素15(IL-15)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。在一些实施方案中，所述一种或多种细胞因子是或包括IL-15。在特定实施方案中，所述一种或多种细胞因子是或包括IL-7。在特定实施方案中，所述一种或多种细胞因子是或包括重组IL-2。

在特定实施方案中，在IL-2、IL-7和/或IL-15的存在下孵育细胞。在某些实施方案中，IL-2、IL-7和/或IL-15是重组的。在某些实施方案中，IL-2、IL-7和/或IL-15是人的。在特定实施方案中，所述一种或多种细胞因子是或包括人重组IL-2、IL-7和/或IL-15。在某些实施方案中，在重组IL-2、IL-7和IL-15的存在下孵育细胞。

在一些实施方案中，将细胞(例如，转化的细胞)与如下浓度的细胞因子(例如，重组人细胞因子)一起孵育：在1IU/mL与1,000IU/mL之间、在10IU/mL与50IU/mL之间、在50IU/mL与100IU/mL之间、在100IU/mL与200IU/mL之间、在100IU/mL与500IU/mL之间、在250IU/mL与500IU/mL之间、或在500IU/mL与1,000IU/mL之间。

在一些实施方案中，将细胞(例如，转化的细胞)与如下浓度的IL-2(例如，人重组IL-2)一起孵育：在1IU/mL与500IU/mL之间、在10IU/mL与250IU/mL之间、在50IU/mL与200IU/mL之间、在50IU/mL与150IU/mL之间、在75IU/mL与125IU/mL之间、在100IU/mL与200IU/mL之间、或在10IU/mL与100IU/mL之间。在特定实施方案中，将细胞(例如，转化的细胞)与如下浓度的重组IL-2一起孵育：为或为约50IU/mL、60IU/mL、70IU/mL、80IU/mL、90IU/mL、100IU/mL、110IU/mL、120IU/mL、130IU/mL、140IU/mL、150IU/mL、160IU/mL、170IU/mL、180IU/mL、190IU/mL或100IU/mL。在一些实施方案中，在为或为约100IU/mL重组IL-2(例如，人重组IL-2)的存在下孵育细胞(例如，转化的细胞)。

在一些实施方案中，将细胞(例如，转化的细胞)与如下浓度的重组IL-7(例如，人重组IL-7)一起孵育：在100IU/mL与2,000IU/mL之间、在500IU/mL与1,000IU/mL之间、在100IU/mL与500IU/mL之间、在500IU/mL与750IU/mL之间、在750IU/mL与1,000IU/mL之间、或在550IU/mL与650IU/mL之间。在特定实施方案中，将细胞(例如，转化的细胞)与如下浓度的IL-7一起孵育：为或为约50IU/mL、100IU/mL、150IU/mL、200IU/mL、250IU/mL、300IU/mL、350IU/mL、400IU/mL、450IU/mL、500IU/mL、550IU/mL、600IU/mL、650IU/mL、700IU/mL、750IU/mL、800IU/mL、750IU/mL、750IU/mL、750IU/mL或1,000IU/mL。在特定实施方案中，在为或为约600IU/mL IL-7的存在下孵育细胞(例如，转化的细胞)。

在一些实施方案中，将细胞(例如，转化的细胞)与如下浓度的重组IL-15(例如，人重组IL-15)一起孵育：在1IU/mL与500IU/mL之间、在10IU/mL与250IU/mL之间、在50IU/mL与200IU/mL之间、在50IU/mL与150IU/mL之间、在75IU/mL与125IU/mL之间、在100IU/mL与200IU/mL之间、或在10IU/mL与100IU/mL之间。在特定实施方案中，将细胞(例如，转化的细胞)与如下浓度的重组IL-15一起孵育：为或为约50IU/mL、60IU/mL、70IU/mL、80IU/mL、90IU/mL、100IU/mL、110IU/mL、120IU/mL、130IU/mL、140IU/mL、150IU/mL、160IU/mL、170IU/mL、180IU/mL、190IU/mL或200IU/mL。在一些实施方案中，在为或为约100IU/mL重组IL-15(例如，人重组IL-2)的存在下孵育细胞(例如，转化的细胞)。

在特定实施方案中，在IL-2、IL-7和/或IL-15的存在下孵育细胞(例如，转化的细胞)。在一些实施方案中，IL-2、IL-7和/或IL-15是重组的。在某些实施方案中，IL-2、IL-7和/或IL-15是人的。在特定实施方案中，所述一种或多种细胞因子是或包括人重组IL-2、IL-7和/或IL-15。在某些实施方案中，在重组IL-2、IL-7和IL-15的存在下孵育细胞。

在一些实施方案中，例如，非扩增过程的孵育的全部或一部分是在包含以下的培养基中进行：基础培养基(例如，CTS OpTmizer基础培养基(Thermofisher))、谷氨酰胺和一种或多种重组细胞因子，诸如重组IL-2、IL-7和/或IL-15。在一些实施方案中，培养基可以含有一种或多种另外的组分。在一些实施方案中，所述一种或多种另外的组分可以包括二肽形式的L-谷氨酰胺(例如，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺)。在一些实施方案中，所述一种或多种另外的组分由另外的补充剂(例如

补充剂(Thermofisher))提供。在一些实施方案中，培养基是无血清培养基并且不含任何血清组分。在一些方面，培养基可以含有一种或多种血清取代蛋白，诸如白蛋白、胰岛素或转铁蛋白(例如CTS^TM免疫细胞血清替代物)中的一种或多种。

在一些实施方案中，在与细胞刺激期间存在的培养基相同或相似的培养基的存在下孵育细胞，诸如与上述刺激方法或过程结合进行。在一些实施方案中，在具有与细胞刺激期间存在的培养基相同的细胞因子的培养基中孵育细胞，诸如与上述刺激方法或过程结合进行。在某些实施方案中，在以相同浓度具有与细胞刺激期间存在的培养基相同的细胞因子的培养基中孵育细胞，诸如与上述刺激方法或过程结合进行。在一些实施方案中，在不存在重组细胞因子的情况下孵育细胞。在一些实施方案中，在不存在如本文所述的一种或多种细胞因子的情况下孵育细胞。在一些实施方案中，在不存在本文所述的所有细胞因子的情况下孵育细胞。

在一些方面，进一步孵育在一定条件下进行以允许细胞休眠或恢复，所述进一步孵育不包括刺激条件(例如，呈重组细胞因子或其他刺激剂的形式)的存在。例如，孵育在足以支持或维持孵育期间细胞的健康的培养的无脂培养基的存在下进行。

在一些实施方案中，孵育的全部或一部分在基础培养基(诸如不含一种或多种重组细胞因子或不含任何重组细胞因子的基础培养基)中进行。在一些实施方案中，培养基不包含一种或多种重组细胞因子，诸如重组人IL-2、重组人IL-7和/或重组人IL-15。在一些方面，孵育在没有任何重组细胞因子的情况下进行。在某些实施方案中，基础培养基补充有另外的添加剂。在一些实施方案中，基础培养基未补充任何另外的添加剂。细胞培养基的添加剂可以包括但不限于营养素、糖(例如，葡萄糖)、氨基酸、维生素或添加剂(诸如ATP和NADH)。还可以添加其他添加剂，但通常特定添加剂和量使得含有细胞的培养基的孵育有利于维持细胞，但在孵育期间最小化、限制和/或不诱导细胞的代谢活性。

在特定实施方案中，培养基是基础培养基，其不含一种或多种重组细胞因子并且不含血清组分，即是无血清培养基，但是可以含有一种或多种另外的组分。在特定实施方案中，在例如非扩增过程的孵育的全部或一部分中使用这种无血清培养基提供无脂培养基，所述无脂培养基提供细胞的维持，但不包括可以激活细胞或使细胞具有代谢活性的某些因子，从而培养所处状态是或可能是休眠或静息状态的细胞。在一些方面，在这种无血清培养基的存在下孵育允许细胞在刺激和基因工程化(例如转导)之后恢复或休眠。在一些方面，在这种无血清培养基的存在下孵育得到输出组合物，所述输出组合物含有对损伤或活力的损失不太敏感的细胞，例如在制造过程期间或之后，以及在将收获/配制的细胞冷冻保存，然后在即将使用前解冻时。在一些实施方案中，输出组合物中的细胞在解冻时具有的半胱天冬酶或其他凋亡标记的水平低于在类似培养基中孵育的细胞，但所述类似培养基含有一种或多种重组细胞因子、血清或可能使细胞的代谢活性在输出组合物的冷冻保存时更强的其他因子。

在一些实施方案中，基础培养基含有无机盐、糖、氨基酸和任选地维生素、有机酸和/或缓冲液或其他熟知的细胞培养营养素的混合物。除了营养素外，培养基还有助于维持pH和渗透压。在一些方面，基础培养基的试剂支持细胞生长、增殖和/或扩增。多种可商业购得的基础培养基对本领域技术人员而言是熟知的，并且包括达尔伯克改良的伊格尔培养基(DMEM)、罗斯威尔公园纪念学院培养基(Roswell Park Memorial Institute Medium，RPMI)、伊斯科夫改良的达尔伯克培养基和哈氏(Hams)培养基。在一些实施方案中，基础培养基是伊斯科夫改良的达尔伯克培养基、RPMI-1640或α-MEM。

在一些实施方案中，基础培养基是平衡盐溶液(例如，PBS、DPBS、HBSS、EBSS)。在一些实施方案中，基础培养基选自达尔伯克改良的伊格尔培养基(DMEM)、最小必需培养基(MEM)、伊格尔基础培养基(BME)、F-10、F-12、RPMI 1640、格拉斯哥最小必需培养基(GMEM)、α最小必需培养基(αMEM)、伊斯科夫改良的达尔伯克培养基和M199。在一些实施方案中，基础培养基是复合培养基(例如，RPMI-1640、IMDM)。在一些实施方案中，基础培养基是OpTmizer^TMCTS^TMT细胞扩增基础培养基(ThermoFisher)。

在一些实施方案中，基础培养基不含蛋白质。在一些实施方案中，基础培养基不含人蛋白(例如，人血清蛋白)。在一些实施方案中，基础培养基不含血清。在一些实施方案中，基础培养基不含源自人的血清。在一些实施方案中，基础培养基不含重组蛋白。在一些实施方案中，基础培养基不含人蛋白和重组蛋白。在一些实施方案中，基础培养基不含如本文所述的一种或多种或所有细胞因子。在一些实施方案中，例如非扩增过程的孵育的全部或一部分在不含任何另外的添加剂或重组细胞因子的基础培养基中进行。在一些实施方案中，基础培养基是不含任何另外的添加剂或重组细胞因子的CTS OpTmizer基础培养基(Thermofisher)。

在一些实施方案中，例如非扩增过程的孵育的全部或一部分在包含以下的培养基中进行：基础培养基和谷氨酰胺，例如，含有谷氨酰胺的CTS OpTmizer基础培养基(Thermofisher)。

在一些实施方案中，例如非扩增过程的全部或部分孵育是在包含以下的培养基中进行：不含一种或多种重组细胞因子(诸如重组人IL-2、重组人IL-7和/或重组人IL-15)的基础培养基(例如，CTS OpTmizer基础培养基(Thermofisher))。在一些实施方案中，培养基补充有一种或多种另外的非血清组分。在一些实施方案中，所述一种或多种补充剂不含血清。在一些实施方案中，无血清培养基还包含游离形式的氨基酸，诸如L-谷氨酰胺。在一些实施方案中，无血清培养基不包含血清替代物补充剂。在一些实施方案中，无血清培养基不包含二肽形式的L-谷氨酰胺(例如，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺)。在一些实施方案中，无血清培养基不包含任何重组细胞因子。在一些实施方案中，无血清培养基包含补充有T细胞补充剂和游离形式的L-谷氨酰胺的基础培养基，并且不含任何免疫细胞血清替代物、任何二肽形式的L-谷氨酰胺或任何重组细胞因子。在一些实施方案中，所述无血清培养基包含基础培养基(例如OpTmizer^TMT细胞扩增基础培养基)、L-谷氨酰胺和如由补充剂(例如OpTmizer^TMT细胞扩增补充剂)提供的一种或多种另外的组分。

在特定实施方案中，在如下浓度的无血清培养基中孵育细胞：为或为约0.25×10⁶个细胞/mL、0.5×10⁶个细胞/mL、0.75×10⁶个细胞/mL、1.0×10⁶个细胞/mL、1.25×10⁶个细胞/mL、1.5×10⁶个细胞/mL、1.75×10⁶个细胞/mL、或2.0×10⁶个细胞/mL。在特定实施方案中，在浓度为或为约0.75×10⁶个细胞/mL的无血清培养基中孵育细胞。在一些实施方案中，所述孵育进行或进行约18小时与30小时之间。在特定实施方案中，所述孵育进行或进行约24小时或者进行或进行约一天。在一些实施方案中，所述孵育分别进行或进行约48小时或72小时，或者进行或进行约2天或3天。在特定实施方案中，所述孵育进行或进行约24小时±6小时、48小时±6小时或72小时±6小时。在特定实施方案中，所述孵育进行或进行约72小时、72±4小时，或者进行或进行约3天，例如，在该时间期间在浓度为或为约0.75×10⁶个细胞/mL的无血清培养基中孵育细胞。在一些实施方案中，所述孵育的全部或一部分在包含以下的无血清培养基中进行：不含一种或多种重组细胞因子诸如重组人IL-2、重组人IL-7和/或重组人IL-15的基础培养基(例如，CTS OpTmizer基础培养基(Thermofisher))。在一些实施方案中，所述无血清培养基补充有L-谷氨酰胺和/或一种或多种细胞补充剂，例如OpTmizer^TMT细胞扩增补充剂，但是不含任何免疫细胞血清替代物、任何二肽形式的L-谷氨酰胺或任何重组细胞因子。

在特定实施方案中，在不存在细胞因子的情况下孵育细胞。在特定实施方案中，在不存在任何重组细胞因子的情况下孵育细胞。在特定实施方案中，在不存在一种或多种重组细胞因子诸如重组IL-2、IL-7和/或IL-15的情况下孵育细胞。

在一些实施方案中，所述基础培养基还包含谷氨酰胺，诸如L-谷氨酰胺。在一些方面，谷氨酰胺是游离形式的谷氨酰胺，诸如L-谷氨酰胺。在一些实施方案中，谷氨酰胺(诸如L-谷氨酰胺)在基础培养基中的浓度为约或小于约0.5mM-1mM、0.5mM-1.5mM、0.5mM-2mM、0.5mM-2.5mM、0.5mM-3mM、0.5mM-3.5mM、0.5mM-4mM、0.5mM-4.5mM、0.5mM-5mM、1mM-1.5mM、1mM-2mM、1mM-2.5mM、1mM-3mM、1mM-3.5mM、1mM-4mM、1mM-4.5mM、1mM-5mM、1.5mM-2mM、1.5mM-2.5mM、1.5mM-3mM、1.5mM-3.5mM、1.5mM-4mM、1.5mM-4.5mM、1.5mM-5mM、2mM-2.5mM、2mM-3mM、2mM-3.5mM、2mM-4mM、2mM-4.5mM、2mM-5mM、2.5mM-3mM、2.5mM-3.5mM、2.5mM-4mM、2.5mM-4.5mM、2.5mM-5mM、3mM-3.5mM、3mM-4mM、3mM-4.5mM、3mM-5mM、3.5mM-4mM、3.5mM-4.5mM、3.5mM-5mM、4mM-4.5mM、4mM-5mM、或4.5mM-5mM，每个都包含端值。在一些实施方案中，谷氨酰胺(诸如L-谷氨酰胺)在基础培养基中的浓度为至少约0.5mM、1mM、1.5mM、2mM、2.5mM、3mM、3.5mM、4mM、4.5mM、或5mM。在一些实施方案中，谷氨酰胺(诸如L-谷氨酰胺)在基础培养基中的浓度为至多约2mM、2.5mM、3mM、3.5mM、4mM、4.5mM、5mM。在一些实施方案中，谷氨酰胺诸如L-谷氨酰胺在基础培养基中的浓度为约2mM。在一些实施方案中，基础培养基还可以包含蛋白质或肽。在一些实施方案中，所述至少一种蛋白质不是非哺乳动物来源的。在一些实施方案中，所述至少一种蛋白质是人蛋白质或源自人。在一些实施方案中，所述至少一种蛋白质是重组的。在一些实施方案中，所述至少一种蛋白质包括白蛋白、转铁蛋白、胰岛素、纤连蛋白、抑肽酶或胎球蛋白。在一些实施方案中，所述蛋白质包含白蛋白、胰岛素或转铁蛋白中的一种或多种，任选地人或重组白蛋白、胰岛素或转铁蛋白中的一种或多种。

在一些实施方案中，所述蛋白质是白蛋白或白蛋白取代物。在一些实施方案中，白蛋白是人源白蛋白。在一些实施方案中，白蛋白是重组白蛋白。在一些实施方案中，白蛋白是天然人血清白蛋白。在一些实施方案中，白蛋白是重组人血清白蛋白。在一些实施方案中，白蛋白是来自非人来源的重组白蛋白。白蛋白取代物可以是任何蛋白质或多肽来源。此类蛋白质或多肽样品的例子包括但不限于牛垂体提取物、植物水解物(例如，大米水解物)、胎牛白蛋白(胎球蛋白)、卵白蛋白、人血清白蛋白(HSA)或另一种动物来源的白蛋白、鸡提取物、牛胚胎提取物、

I和

II。在一些实施方案中，蛋白质或肽包含转铁蛋白。在一些实施方案中，蛋白质或肽包括纤连蛋白。在一些实施方案中，蛋白质或肽包括抑肽酶。在一些实施方案中，蛋白质包括胎球蛋白。

在一些实施方案中，所述一种或多种另外的蛋白质是被添加至基础培养基中的血清替代物补充剂的一部分。血清替代物补充剂的例子包括例如免疫细胞血清替代物(ThermoFisher，#A2598101)或Smith等人Clin Transl Immunology.2015年1月；4(1):e31中所述的那些。

在某些实施方案中，在引入编码异源或重组蛋白的多核苷酸(例如，病毒载体)之后将细胞孵育为、为约或为至少18小时、24小时、30小时、36小时、40小时、48小时、54小时、60小时、72小时、84小时、96小时、或超过96小时。在某些实施方案中，在引入编码异源或重组蛋白的多核苷酸(例如，病毒载体)之后将细胞孵育为、为约或为至少一天、2天、3天、4天、或超过4天。在一些实施方案中，在基因工程化之前，所述孵育进行如下时间量：在30分钟与2小时之间、在1小时与8小时之间、在6小时与12小时之间、在12小时与18小时之间、在16小时与24小时之间、在18小时与30小时之间、在24小时与48小时之间、在24小时与72小时之间、在42小时与54小时之间、在60小时与120小时之间、在96小时与120小时之间、在90小时与在1天与7天之间之间、在3天与8天之间、在1天与3天之间、在4天与6天之间、或在4天与5天之间。在一些实施方案中，所述孵育进行或进行约18小时与30小时之间。在特定实施方案中，所述孵育进行或进行约24小时或者进行或进行约一天。

在某些实施方案中，所述孵育的总持续时间为、为约或为至少12小时、18小时、24小时、30小时、36小时、42小时、48小时、54小时、60小时、72小时、84小时、96小时、108小时或120小时。在某些实施方案中，所述孵育的总持续时间为、为约或为至少一天、2天、3天、4天或5天。在特定实施方案中，在以下时间、在约以下时间或在以下时间内完成所述孵育：120小时、108小时、96小时、84小时、72小时、60小时、54小时、48小时、42小时、36小时、30小时、24小时、18小时或12小时。在特定实施方案中，在以下时间、在约以下时间或在以下时间内完成所述孵育：一天、2天、3天、4天或5天。在一些实施方案中，所述孵育的总持续时间在或在约12小时与120小时之间、18小时与96小时之间、24小时与72小时之间或24小时与48小时之间，包含端值。在一些实施方案中，所述孵育的总持续时间在或约在1小时与48小时之间、4小时与36小时之间、8小时与30小时之间或12小时与24小时之间，包含端值。在特定实施方案中，所述孵育分别进行为或为约24小时、48小时或72小时，或者进行为或为约1天、2天或3天。在特定实施方案中，所述孵育进行24小时±6小时、48小时±6小时或72小时±6小时。在特定实施方案中，所述孵育进行为或为约72小时或者进行为或为约3天。

在特定实施方案中，在开始刺激之后在、在约或至少12小时、18小时、24小时、30小时、36小时、42小时、48小时开始所述孵育。在特定实施方案中，在开始刺激后为、为约或为至少0.5天、一天、1.5天或2天开始所述孵育。在特定实施方案中，在开始刺激的以下时间、在约以下时间或在以下时间内开始所述孵育：120小时、108小时、96小时、84小时、72小时、60小时、54小时、48小时、42小时、36小时、30小时、24小时、18小时或12小时。在特定实施方案中，在以下时间、在约以下时间或在以下时间内开始所述孵育：开始刺激的5天、4天、3天、2天、一天或0.5天。

在一些实施方案中，在开始刺激之后的以下时间完成所述孵育：在或在约24小时与120小时之间、36小时与108小时之间、48小时与96小时之间、或48小时与72小时之间，包含端值。在一些实施方案中，在以下时间、约以下时间或以下时间内完成所述孵育：从开始刺激起120小时、108小时、96小时、72小时、48小时或36小时。在一些实施方案中，在从开始刺激的以下时间、约以下时间或以下时间内完成所述孵育：5天、4.5天、4天、3天、2天或1.5天。在特定实施方案中，在开始刺激之后的以下小时后完成所述孵育：24小时±6小时、48小时±6小时或72小时±6小时。在一些实施方案中，在或在约72小时后或者在或在约3天后完成所述孵育。

在一些实施方案中，所述孵育进行足以使异源或重组多核苷酸被整合至基因组中的时间量。在特定实施方案中，所述孵育进行足以使至少整合病毒拷贝数(iVCN)是每个二倍体基因组为、为约或为至少0.1、0.5、1、2、3、4、5或大于5的时间量。在特定实施方案中，所述孵育进行足以使至少iVCN为、为约或为至少0.5或1的时间量。在特定实施方案中，所述孵育进行足以使异源或重组多核苷酸被稳定整合至基因组中的时间量。在特定实施方案中，当每个二倍体基因组的iVCN在例如至少12、24或48小时的时间段内变化不超过20％、15％、10％、5％、1％或0.1％时，认为所述异源或重组多核苷酸被稳定整合。在特定实施方案中，在稳定整合之前完成所述孵育。

在某些实施方案中，至少直至在基因组中检测到整合载体为止，执行或进行所述孵育。在一些实施方案中，在达到每个二倍体基因组的稳定的整合载体拷贝数(iVCN)之前完成所述孵育。在特定实施方案中，至少直至在基因组中检测到整合载体为止，但在达到每个二倍体基因组的稳定iVCN之前，执行或进行所述孵育。在某些实施方案中，当所述iVCN达到峰值和/或保持不变或者在容许误差内不变持续一段时间时，达到每个二倍体基因组的稳定iVCN。在一些实施方案中，容许误差为以下值，在以下值内或为约以下值：±40％、±35％、±30％、±25％、±20％、±15％、±10％、±5％、±2％、±1％或小于±1％。在某些实施方案中，所述时间段为、为约或为至少2小时、4小时、6小时、8小时、12小时、16小时、18小时、24小时、36小时、48小时、60小时或72小时。在某些实施方案中，所述时间段为、为约或为至少一天、2天或3天。在某些实施方案中，当所述iVCN达到峰值并保持不变或者在容许误差(例如，±25％)内不变持续为、为约或为至少24小时或一天的一段时间时，达到每个二倍体基因组的稳定iVCN。在一些实施方案中，当转化细胞群的二倍体基因组中的iVCN与总载体拷贝数(VCN)的分数平均为、为至少或为约0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4或1.5或在其容许误差内(例如±25％、±20％、±15％、±10％、±5％或±1％)时，实现每个二倍体基因组的稳定iVCN。在某些实施方案中，当转化细胞群的二倍体基因组中的iVCN与总载体拷贝数(VCN)的分数平均为或为约0.8或在其容许误差内时，实现每个二倍体基因组的稳定iVCN。在一些实施方案中，当转化细胞群的二倍体基因组中的iVCN与总载体拷贝数(VCN)的分数平均为或为约1.0或者在其容许误差内时，实现每个二倍体基因组的稳定iVCN。

在一些实施方案中，在iVCN达到、达到约或达到至少5.0、4.0、3.0、2.5、2.0、1.75、1.5、1.25、1.2、1.1、1.0、0.9、0.8、0.75、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3或0.25个拷贝/二倍体基因组之前完成所述孵育。在某些实施方案中，在iVCN达到或达到约1.0个拷贝/二倍体基因组之前完成所述孵育。在特定实施方案中，在iVCN达到或达到约0.5个拷贝/二倍体基因组之前完成所述孵育。

在某些实施方案中，在细胞群的为、为约或至少一次、两次、三次、四次、五次、六次、八次、十次、二十次或更多次细胞倍增(例如，在孵育期间发生的倍增)之前，收获细胞。在特定实施方案中，细胞倍增的量可以通过在不同时间点，诸如在工程化过程的不同时间或阶段测量群体中活细胞的数量来计算。在特定实施方案中，可以通过将在一个时间点的活细胞的总量与在较早时间点存在的活细胞的总数量进行比较来计算细胞倍增。在某些实施方案中，所述孵育在细胞群的为、为约或至少一次、两次、三次、四次、五次、六次、八次、十次、二十次或更多次细胞倍增(例如，在孵育期间发生的倍增)之前完成。在某些方面，通过以下方式来计算细胞倍增：在开始孵育时和在完成孵育时确定总有核细胞数(TNC)，然后确定完成时的TNC除以开始时的TNC的乘积的自然对数，然后将乘积的所述自然对数除以2的自然对数。

在一些方面，在群体中(例如，在工程化过程期间)发生的倍增数是使用下式来确定：

在某些实施方案中，在群体中(例如，在工程化过程期间)发生的倍增数是使用下式来确定：

在各种实施方案中，在群体中(例如，在工程化过程期间)发生的倍增数是使用下式来确定：

在特定实施方案中，在群体中(例如，在工程化过程期间)发生的倍增数是使用下式来确定：

在某些实施方案中，所述孵育在细胞的总数量(例如，孵育细胞或经历孵育的细胞的总数量)是输入群体的细胞数量(例如，与刺激试剂接触的细胞的总数量)的大于或大于约一倍、两倍、三倍、四倍、五倍、六倍、八倍、十倍、二十倍或超过二十倍之前完成。在各种实施方案中，所述孵育在孵育细胞的总数量是转化、转导或旋转接种的细胞的总数量(例如，与病毒载体接触的细胞的总数量)的大于或大于约一倍、两倍、三倍、四倍、五倍、六倍、八倍、十倍、二十倍或超过二十倍之前完成。在某些实施方案中，所述细胞是T细胞、活T细胞、CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、表达CAR的T细胞、或任何前述的组合。在一些实施方案中，所述孵育在细胞总数大于输入群体中细胞的总数量之前完成。在一些实施方案中，所述孵育在活CD3+T细胞的总数量大于输入群体中活CD3+细胞的总数量之前完成。在某些实施方案中，所述孵育在细胞总数大于转化、转导或旋转接种的细胞中细胞的总数量之前完成。在一些实施方案中，所述孵育在活CD3+T细胞的总数量大于转化、转导或旋转接种的细胞中活CD3+的总数量之前完成。

在一些实施方案中，细胞群的总细胞数或总活细胞数在孵育期间保持相似、相同或基本上相同。在特定实施方案中，细胞群的总细胞数或总活细胞数在孵育期间不变。在一些方面，总细胞数或总活细胞数在孵育期间降低。在特定方面，在开始刺激之前(例如即将开始之前)或开始时，总活细胞数是输入群体的总细胞数或总活细胞数的为、为约或小于95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％或50％。

6.刺激试剂的去除

在一些实施方案中，根据本文所提供的任何方法产生或生成孵育的T细胞的群体，其中将物质(诸如竞争剂)添加至T细胞以破坏(诸如减少和/或终止)一种或多种刺激剂的信号传导。在一些实施方案中，所孵育的T细胞群体含有物质(诸如竞争剂，例如生物素或生物素类似物，例如D-生物素)的存在。在一些实施方案中，所述物质(诸如竞争剂，例如生物素或生物素类似物，例如D-生物素)以如下量存在：是其中在孵育期间没有外源性添加所述物质的培养T细胞的参考群体或制剂中所述物质的量的至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、至少100倍、至少1000倍或更多倍。在一些实施方案中，所述物质(诸如竞争剂，例如生物素或生物素类似物，例如D-生物素)在培养T细胞的群体中的量是从或从约10μΜ至100μΜ、100μΜ至1mM、100μΜ至500μΜ或10μΜ至100μΜ。在一些实施方案中，将10μm或约10μm的生物素或生物素类似物(例如D-生物素)添加至细胞或细胞群，以从所述细胞或细胞群分离或去除寡聚刺激试剂。

在某些实施方案中，一种或多种药剂(例如刺激或激活TCR和/或共受体的药剂)诸如经由寡聚试剂上存在的多个特定结合位点(例如，结合位点Z)与寡聚试剂缔合(诸如可逆地结合)。在一些情况下，这导致所述药剂彼此紧密地排列，使得如果使具有由所述药剂结合或识别的(至少两个拷贝的)细胞表面分子的靶细胞与所述药剂接触，则可以发生亲合力效应。在一些方面，受体结合试剂在结合位点B处对细胞的受体分子具有低亲和力，使得受体结合试剂在竞争试剂的存在下从细胞解离。因此，在一些实施方案中，在竞争试剂的存在下从细胞去除所述药剂。

在一些实施方案中，寡聚刺激试剂是具有可逆地附着的抗CD3和抗CD28 Fab的链霉亲和素突变蛋白寡聚物。在一些实施方案中，所附着的Fab含有链霉亲和素结合结构域，例如，其允许可逆地附着至链霉亲和素突变蛋白寡聚物。在一些情况下，抗CD3和抗CD28Fab相互紧密布置，使得如果使表达CD3和/或CD28的T细胞与具有可逆地附着的Fab的寡聚刺激试剂接触，则可能发生亲合力作用。在一些方面，Fab对CD3和CD28具有低亲和力，使得Fab在竞争试剂(例如生物素或生物素变体或类似物)的存在下从细胞中解离。因此，在一些实施方案中，在竞争试剂(例如D-生物素)的存在下将Fab从细胞去除或解离。

在一些实施方案中，在收集、收获或配制细胞前，从细胞或细胞群去除或分离寡聚刺激试剂(例如，寡聚链霉亲和素突变蛋白刺激试剂)。在一些实施方案中，在孵育(例如，本文中诸如章节II-C-5中所述的孵育)之后或期间，通过接触或暴露于竞争试剂(例如，生物素或生物素类似物，诸如D-生物素)从细胞或细胞群去除或分离寡聚刺激试剂(例如，寡聚链霉亲和素突变蛋白刺激试剂)。在某些实施方案中，在孵育之后但在用于收集、收获或配制细胞的步骤之前，将细胞或细胞群接触或暴露于竞争试剂(例如，生物素或生物素类似物，诸如D-生物素)，以去除寡聚刺激试剂，例如寡聚链霉亲和素突变蛋白刺激试剂。在特定实施方案中，在孵育后，使细胞或细胞群接触或暴露于竞争试剂(例如，生物素或生物素类似物，诸如D-生物素)，以去除寡聚刺激试剂(例如，寡聚刺激性链霉亲和素突变蛋白试剂)。在一些方面，当在孵育期间例如通过接触或暴露于竞争试剂(例如，生物素或生物素类似物，诸如D-生物素)将寡聚刺激试剂(例如，寡聚刺激性链霉亲和素突变蛋白试剂)从细胞分离或去除时，使细胞返回到与分离或去除之前相同的孵育条件，持续孵育的剩余持续时间。

在一些实施方案中，使细胞与为、为约或为至少0.01μM、0.05μM、0.1μM、0.5μM、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、10μM、100μM、500μM、0.01μM、1mM或10mM的竞争试剂接触，以从细胞中去除或分离寡聚刺激试剂。在各种实施方案中，使细胞与为、为约或为至少0.01μM、0.05μM、0.1μM、0.5μM、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、10μM、100μM、500μM、0.01μM、1mM或10mM的生物素或生物素类似物诸如D-生物素接触，以将具有可逆地附着的抗CD3和抗CD28 Fab的刺激性链霉亲和素突变蛋白寡聚物从细胞中去除或分离。在各种实施方案中，使细胞与在或在约100μM与10mM之间(例如，1mM)的生物素或生物素类似物诸如D-生物素接触，以将具有可逆地附着的抗CD3和抗CD28 Fab的寡聚刺激试剂(诸如链霉亲和素突变蛋白寡聚物)从细胞中去除或分离。在各种实施方案中，在接触或暴露于D-生物素之后，使细胞与在或在约100μM与10mM之间(例如，1mM)的生物素或生物素类似物诸如D-生物素接触为或为约2小时、6小时、12小时、18小时、24小时、30小时、36小时、42小时或48小时。

在特定实施方案中，在开始刺激的为或为约120小时、108小时、96小时、84小时、72小时、60小时、48小时、36小时、24小时或12小时(包含端值)内，从细胞中去除或分离寡聚刺激试剂(例如，寡聚刺激性链霉亲和素突变蛋白试剂)。在特定实施方案中，在开始刺激的为或为约5天、4天、3天、2天、一天或0.5天(包含端值)内，将寡聚刺激试剂(例如，寡聚刺激性链霉亲和素突变蛋白试剂)从细胞中去除或分离。在特定实施方案中，在开始刺激后为或为约48小时或者为或为约2天，将寡聚刺激试剂(例如，寡聚刺激性链霉亲和素突变蛋白试剂)从细胞中去除或分离。在某些实施方案中，在开始刺激后为或为约72小时或者为或为约3天，将寡聚刺激试剂(例如，寡聚刺激性链霉亲和素突变蛋白试剂)从细胞中去除或分离。在一些实施方案中，在开始刺激后为或为约96小时或者为或为约4天，将寡聚刺激试剂(例如，寡聚刺激性链霉亲和素突变蛋白试剂)从细胞中去除或分离。

在某些实施方案中，在开始刺激后为或为约48小时或者为或为约2天，例如，在本文如在章节II-C-5中所述的孵育期间或之后，使细胞或细胞群接触或暴露于竞争试剂(例如，生物素或生物素类似物，诸如D-生物素)，以去除寡聚刺激试剂(例如，寡聚刺激性链霉亲和素突变蛋白试剂)。在一些方面，当在孵育期间例如通过接触或暴露于竞争试剂(例如，生物素或生物素类似物，诸如D-生物素)将寡聚刺激试剂(例如，寡聚刺激性链霉亲和素突变蛋白试剂)从细胞分离或去除时，使细胞返回到与分离或去除之前相同的孵育条件，持续孵育的剩余持续时间。在其他方面，当在孵育之后例如通过接触或暴露于竞争试剂(例如，生物素或生物素类似物，诸如D-生物素)将寡聚刺激试剂(例如，寡聚刺激性链霉亲和素突变蛋白试剂)从细胞分离或去除时，在接触或暴露于竞争试剂之后将细胞进一步孵育持续或持续约2小时、6小时、12小时、18小时、24小时、30小时、36小时、42小时或48小时。在一些实施方案中，在D-生物素添加之后，将用D-生物素处理转导的细胞进一步孵育持续或持续约48小时。

7.收获、收集或配制细胞

在一些实施方案中，收获或收集细胞。在特定实施方案中，在孵育完成后收集或收获细胞。在某些实施方案中，收集或收获的细胞是输出群体的细胞。在一些实施方案中，输出群体包括如下细胞：是活的、CD3+、CD4+、CD8+和/或对重组受体呈阳性(例如，CAR+)。在特定实施方案中，收获的CD4+T细胞和配制的CD8+T细胞是输出CD4+和CD8+T细胞。在特定实施方案中，配制的细胞群(例如，富集的CD4+和CD8+细胞的配制群体)是输出细胞群，例如，富集的CD4+和CD8+细胞的输出群体。

在一些实施方案中，收获、收集或配制的细胞或细胞群尚未经历任何扩增，例如，如下任何条件：其中在一定条件下孵育或培育细胞，并在所述孵育或培育期间增加活细胞的量。例如，在一些方面，收获的细胞尚未经历任何孵育或培育，其中如与所述孵育或培育开始时总活细胞的数量相比，在所述孵育或培育结束时总活细胞的量增加。在一些实施方案中，收获的细胞尚未经历任何孵育或培育步骤，所述步骤明确用于与孵育或培育过程开始时相比，在所述孵育或培育过程结束时增加(例如，扩增)活细胞总数量的目的。在一些实施方案中，在可以导致扩增的条件下孵育细胞，但是孵育条件的进行并非出于扩增细胞群的目的。在一些实施方案中，虽然是在不包括扩增步骤的过程中制造，但收获的细胞可能已经经历了扩增。在一些实施方案中，不包括扩增步骤的制造过程被称为非扩增或最小扩增的过程。“非扩增”过程也可以被称为“最小扩增”过程。在一些实施方案中，虽然过程不包括用于扩增的步骤，但非扩增或最小扩增过程可能得到已经经历扩增的细胞。在一些实施方案中，收获的细胞可能已经经历孵育或培育步骤，所述步骤包括设计用于降低、抑制、最小化或消除细胞群作为群体的扩增的培养基组合物。在一些实施方案中，收集、收获或配制的细胞先前尚未经历在如下生物反应器中或在如下条件下进行的孵育或培育：其中在孵育或培育的全部或一部分中摇摆、旋转、振荡或灌注细胞。PCT/US 2019/046062(通过引用以其整体并入)中披露了制造和通过此类过程产生的工程化细胞的非扩增过程。

在一些实施方案中，细胞选择、分离、分开、富集和/或纯化步骤在收获、收集或配制细胞或细胞群之前进行。在一些实施方案中，细胞选择、分离、分开、富集和/或纯化步骤使用如本文所公开的色谱进行。在一些实施方案中，通过色谱进行的T细胞选择步骤在T细胞转导之后，但在收获之前、在收集之前和/或在配制细胞之前进行。在一些实施方案中，通过色谱进行的T细胞选择步骤在即将收获细胞之前进行。

在某些实施方案中，从开始刺激到收集、收获或配制细胞的时间量为、为约或小于36小时、42小时、48小时、54小时、60小时、72小时、84小时、96小时、108小时或120小时。在某些实施方案中，从开始刺激到收集、收获或配制细胞的时间量为、为约或小于1.5天、2天、3天、4天或5天。在一些实施方案中，从开始刺激到收集、收获或配制细胞用于生成工程化细胞的时间量，从开始刺激到收集、收获或配制细胞为在或在约36小时与120小时之间、48小时与96小时之间或48小时与72小时之间，包含端值，或者在或在约1.5天与5天之间、2天与4天之间或2天与3天之间，包含端值。在特定实施方案中，从开始孵育到收获、收集或配制细胞的时间量为、为约或小于48小时、72小时或96小时。在特定实施方案中，从开始孵育到收获、收集或配制细胞的时间量为、为约或小于2天、3天或4天。在特定实施方案中，从开始孵育到收获、收集或配制细胞的时间量为48小时±6小时、72小时±6小时或96小时±6小时。在特定实施方案中，从开始孵育到收获、收集或配制细胞的时间量为或为约96小时或四天。

在特定实施方案中，将细胞收获、收集或配制在无血清培养基中，诸如本文中或PCT/US 2018/064627中所述的无血清培养基，所述申请通过引用并入本文。在一些实施方案中，将细胞收获、收集或配制至如孵育期间所用的相同无血清培养基中。

在特定实施方案中，将细胞收获、收集或配制在基础培养基中，所述基础培养基不含一种或多种重组细胞因子并且不含血清组分(即，是无血清培养基)，但可能含有一种或多种另外的组分。在特定实施方案中，使用这种无血清培养基提供无脂培养基，所述无脂培养基提供细胞的维持，但不包括可以激活细胞或使细胞具有代谢活性的某些因子，从而培养所处状态是或可能是休眠或静息状态的细胞。在一些方面，在这种无血清培养基的存在下孵育允许细胞在刺激和基因工程化(例如转导)之后恢复或休眠。在一些方面，在这种无血清培养基的存在下收获、收集或配制细胞得到输出组合物的配制品，所述组合物含有对损伤或活力的损失不太敏感的细胞，例如，在将收获/配制的细胞冷冻保存，然后在即将使用前解冻时。在一些实施方案中，输出组合物中的细胞在解冻时具有的半胱天冬酶或其他凋亡标记的水平低于在类似培养基中孵育的细胞，但所述类似培养基含有一种或多种重组细胞因子、血清或可能使细胞的代谢活性在输出组合物的冷冻保存时更强的其他因子。

在某些实施方案中，配制富集的T细胞的一个或多个群体。在特定实施方案中，在已经工程化和/或孵育一个或多个群体之后，配制富集的T细胞的一个或多个群体。在特定实施方案中，所述一个或多个群体是输入群体。在一些实施方案中，所述一个或多个输入群体先前已经进行冷冻保护和储存，并且在孵育之前解冻。

在某些实施方案中，至少在基因组中检测到整合载体时，收获或收集细胞。在一些实施方案中，在达到每个二倍体基因组的稳定的整合载体拷贝数(iVCN)之前，收获或收集细胞。在特定实施方案中，在基因组中检测到整合载体之后但在达到每个二倍体基因组的稳定iVCN之前，收获或收集细胞。

在一些实施方案中，在iVCN达到、达到约或达到至少5.0、4.0、3.0、2.5、2.0、1.75、1.5、1.25、1.2、1.1、1.0、0.9、0.8、0.75、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3或0.25个拷贝/二倍体基因组之前，收获或收集细胞。在特定实施方案中，在iVCN达到或达到约1.0个拷贝/二倍体基因组之前，收获或收集细胞。在一些实施方案中，在iVCN达到或达到约0.5个拷贝/二倍体基因组之前，收集或收获细胞。

在某些实施方案中，在细胞群的为、为约或为至少一次、两次、三次、四次、五次、六次、八次、十次、二十次或更多次细胞倍增(例如，在孵育期间发生的倍增)之前，收获细胞。

在特定实施方案中，在细胞的总数量(例如，孵育细胞或经历孵育的细胞的总数量)是输入群体的细胞数量(例如，与刺激试剂接触的细胞的总数量)的大于或大于约一倍、两倍、三倍、四倍、五倍、六倍、八倍、十倍、二十倍或超过二十倍之前的时间，收获或收集细胞。在一些实施方案中，在孵育细胞的总数量是转化、转导或旋转接种的细胞的总数量(例如，与病毒载体接触的细胞的总数量)的大于或大于约一倍、两倍、三倍、四倍、五倍、六倍、八倍、十倍、二十倍或超过二十倍之前的时间，收获或收集细胞。在某些实施方案中，所述细胞是T细胞、活T细胞、CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、表达CAR的T细胞、或任何前述的组合。在特定实施方案中，在细胞总数大于输入群体中细胞的总数量之前的时间，收获或收集细胞。在各种实施方案中，在活CD3+T细胞的总数量大于输入群体中活CD3+细胞的总数量之前的时间，收获或收集细胞。在特定实施方案中，在细胞总数大于转化、转导或旋转接种的细胞中细胞的总数量之前的时间，收获或收集细胞。在各种实施方案中，在活CD3+T细胞的总数量大于转化、转导或旋转接种的细胞中活CD3+细胞的总数量之前的时间，收获或收集细胞。在各种实施方案中，在活CD4+细胞和CD8+细胞的总数量大于输入群体中活CD4+细胞和CD8+细胞的总数量之前的时间，收获或收集细胞。在特定实施方案中，在细胞总数大于转化、转导或旋转接种的细胞中细胞的总数量之前的时间，收获或收集细胞。在各种实施方案中，在活CD4+细胞和CD8+细胞的总数量大于转化、转导或旋转接种的细胞中活CD4+细胞和CD8+细胞的总数量之前的时间，收获或收集细胞。

在某些实施方案中，所述过程包括如下步骤：在收获或收集期间或之后例如使用过滤器(例如，40μm过滤器)过滤细胞组合物，例如，以去除大颗粒。在某些实施方案中，所述过滤步骤在正在收获或收集细胞的同时进行。例如，可以将过滤器串联在转导后被孵育的细胞与收获/收集装置(诸如

或Sepax

细胞处理系统)之间。在某些实施方案中，收获或收集细胞，然后过滤，之后任选地洗涤过滤的组合物。在某些实施方案中，收获或收集细胞，洗涤，并且过滤洗涤的细胞组合物。

在某些实施方案中，经配制细胞是输出细胞。在一些实施方案中，富集的T细胞的配制群体是富集的T细胞的输出群体。在特定实施方案中，配制的CD4+T细胞和配制的CD8+T细胞是输出CD4+和CD8+T细胞。在特定实施方案中，配制的细胞群(例如，富集的CD4+和CD8+细胞的配制群体)是输出细胞群，例如，富集的CD4+和CD8+细胞的输出群体。

在一些实施方案中，可以将细胞配制到容器诸如袋或小瓶中。在一些实施方案中，小瓶可以是输注小瓶。在一些实施方案中，使小瓶配制为具有所述工程化细胞的单一单位剂量，所述单一单位剂量诸如包括用于以给定剂量或其部分施用的细胞数量。

在一些实施方案中，将细胞配制在药学上可接受的缓冲液中，所述药学上可接受的缓冲液在一些方面可以包括药学上可接受的载体或赋形剂。在一些实施方案中，处理包括将介质交换成药学上可接受的或施用于受试者所需的介质或配制缓冲液。在一些实施方案中，处理步骤可以涉及洗涤转导的和/或扩增的细胞以替代药学上可接受的缓冲液中的细胞，所述药学上可接受的缓冲液可以包括一种或多种任选的药学上可接受的载体或赋形剂。包括药学上可接受的载体或赋形剂的此类药物形式的例子可以是下文与将细胞和组合物施用于受试者可接受的形式结合描述的任何形式。在一些实施方案中，药物组合物以有效治疗或预防疾病或病症的量(诸如治疗有效量或预防有效量)含有细胞。

“药学上可接受的载体”是指药物配制品中除了活性成分之外对受试者无毒的成分。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲液、赋形剂、稳定剂或防腐剂。

在一些方面，载体的选择部分取决于特定细胞和/或施用方法。因此，存在多种合适的配制品。例如，所述药物组合物可以含有防腐剂。合适的防腐剂可以包括例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸钠和苯扎氯铵。在一些方面中，使用两种或更多种防腐剂的混合物。所述防腐剂或其混合物通常以按总组合物的重量计约0.0001％至约2％的量存在。载体描述于例如Remington’s Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编辑(1980)中。药学上可接受的载体在所用的剂量和浓度下通常对接受者无毒，并且包括但不限于：缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲氯铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；烷基对羟基苯甲酸酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，诸如钠；金属络合物(例如锌-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如聚乙二醇(PEG)。

在一些方面，在所述组合物中包括缓冲剂。合适的缓冲剂包括例如柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸、磷酸钾和各种其他酸和盐。在一些方面中，使用两种或更多种缓冲剂的混合物。所述缓冲剂或其混合物通常以按总组合物的重量计约0.001％至约4％的量存在。用于制备可施用的药物组合物的方法是已知的。示例性方法更详细地描述于例如Remington:TheScience and Practice of Pharmacy,Lippincott Williams&Wilkins；第21版(2005年5月1日)中。

配制品可以包括水溶液。所述配制品或组合物还可含有可用于用细胞治疗的特定适应症、疾病或病症的多于一种活性成分，优选具有与所述细胞互补的活性的那些成分，其中各自的活性不会相互产生不利影响。此类活性成分以有效用于既定目的的量以合适的方式组合存在。因此，在一些实施方案中，药物组合物还包括其他药物活性药剂或药物，诸如化学治疗剂，例如天冬酰胺酶、白消安、卡铂、顺铂、柔红霉素、多柔比星、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、甲氨蝶呤、紫杉醇、利妥昔单抗、长春碱和/或长春新碱。在一些实施方案中，将药剂或细胞以盐(例如，药学上可接受的盐)的形式施用。合适的药学上可接受的酸加成盐包括源自无机酸(诸如盐酸、氢溴酸、磷酸、偏磷酸，硝酸和硫酸)和有机酸(诸如酒石酸、乙酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、富马酸、苯甲酸、乙醇酸、葡萄糖酸、琥珀酸和芳基磺酸，例如对甲苯磺酸)的那些盐。

在一些实施方案中，药物组合物含有有效治疗或预防疾病或病症的量(诸如治疗有效量或预防有效量)的药剂或细胞。在一些实施方案中，通过定期评估所治疗的受试者来监测治疗或预防功效。对于数天或更长时间的重复给予，取决于病症，重复所述治疗直至出现所需疾病症状的抑制。然而，其他剂量方案可能是有用的并且可以被确定。所需剂量可以通过单次推注给予所述组合物、通过多次推注给予所述组合物或通过连续输注给予所述组合物来递送。

所述药剂或细胞可以通过任何合适的方式施用，例如通过推注输注，通过注射例如静脉内或皮下注射、眼内注射、眼周注射、视网膜下注射、玻璃体内注射、经中隔注射、巩膜下注射、脉络膜内注射、前房注射、结膜下(subconjectval)注射、结膜下(subconjuntival)注射、眼球筋膜囊下(sub-Tenon)注射、球后注射、球周注射或后近巩膜(posterior juxtascleral)递送。在一些实施方案中，将它们通过肠胃外、肺内和鼻内以及(如果需要进行局部治疗的话)病灶内施用来施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。在一些实施方案中，给定剂量通过细胞或药剂的单次推注施用来施用。在一些实施方案中，其是通过例如在不超过3天的时间段内对细胞或药剂的多次推注施用或通过细胞或药剂的连续输注施用来施用。

对于疾病的预防或治疗，适当的剂量可以取决于待治疗的疾病类型、一种或多种药剂的类型、细胞或重组受体的类型、疾病的严重程度和病程、施用药剂或细胞是用于预防目的还是治疗目的、先前疗法、受试者的临床病史和对药剂或细胞的反应以及主治医师的决断。在一些实施方案中，所述组合物适合一次或在一系列治疗中施用于受试者。

可以使用标准施用技术、配制品和/或设备施用细胞或药剂。提供了用于储存和施用所述组合物的配制品和装置(诸如注射器和小瓶)。关于细胞，施用可以是自体的或异源的。例如，免疫应答细胞或祖细胞可以获得自一名受试者，并且施用于同一受试者或不同的相容受试者。外周血衍生的免疫应答细胞或其后代(例如，体内、离体或体外衍生的)可以经由局部注射施用，包括导管施用、全身注射、局部注射、静脉内注射或肠胃外施用。当施用治疗性组合物(例如，含有基因修饰的免疫反应性细胞或治疗或改善神经毒性症状的药剂的药物组合物)时，通常将其配制成单位剂量可注射形式(溶液、悬浮液、乳液)。

配制品包括用于口服、静脉内、腹膜内、皮下、经肺、透皮、肌内、鼻内、经颊、舌下或栓剂施用的那些。在一些实施方案中，肠胃外施用药剂或细胞群。如本文所用术语“肠胃外”包括静脉内、肌内、皮下、直肠、阴道和腹膜内施用。在一些实施方案中，使用通过静脉内、腹膜内或皮下注射的外周全身递送向受试者施用药剂或细胞群。

在一些实施方案中，组合物作为无菌液体制剂提供，例如等渗水溶液、悬浮液、乳液、分散体或粘性组合物，其在一些方面可以缓冲至选择的pH。液体制剂一般比凝胶、其他粘性组合物和固体组合物制备起来更容易。另外地，液体组合物稍微更方便给予，特别是通过注射。在另一方面，粘性组合物可以配制在适当的黏度范围内，以提供与特定组织的更长的接触时间。液体或粘性组合物可以包含载体，其可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇)及其合适的混合物。

无菌可注射溶液可以通过以下方式来制备：将所述药剂或细胞掺入溶剂中，诸如掺入与合适的载体、稀释剂或赋形剂(诸如无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋糖等)的混合物中。

用于体内施用的配制品通常是无菌的。可以例如通过经无菌滤膜过滤容易地实现无菌。

在一些实施方案中，所施用细胞的剂量在冷冻保存的组合物中。在一些方面，在将冷冻保存的组合物解冻后施用组合物。在一些实施方案中，在解冻后为或约30分钟、45分钟、60分钟、90分钟、120分钟、150分钟或180分钟内施用组合物。在一些实施方案中，在解冻后为或约120分钟内施用组合物。

在一些实施方案中，用注射器施用细胞的剂量。在一些实施方案中，注射器具有为或约0.5、1、2、2.5、3、4、5、7.5、10、20或25mL或由任何前述值限定的范围的体积。

还提供了制品和试剂盒，其含有根据所提供的方法的表达重组受体的工程化细胞或其组合物，以及任选地使用说明书，例如施用说明书。在一些实施方案中，说明书指定选择或鉴定用于根据任何所提供方法的疗法的受试者的标准。

在一些实施方案中，提供了制品和/或试剂盒，其包括包含治疗有效量的本文所述的任何工程化细胞的组合物、以及向受试者施用以治疗疾病或病症的说明书。在一些实施方案中，所述说明书可以指定本文所提供方法的一些或所有要素。在一些实施方案中，所述说明书指定施用用于细胞疗法的细胞的具体指导，例如，用于施用的剂量、时间安排、受试者的选择和/或鉴定以及用于施用的条件。在一些实施方案中，所述制品和/或试剂盒还包括用于疗法(例如，淋巴细胞清除疗法和/或组合疗法，诸如本文所述的任一种)的一种或多种另外的药剂，并且任选地还包括用于施用另外的用于疗法的药剂的说明书。在一些实施方案中，所述制品和/或试剂盒还包含用于淋巴细胞清除疗法的药剂，并且任选地还包括用于施用淋巴细胞清除疗法的说明书。在一些实施方案中，所述说明书可以作为伴随用于施用的组合物的标签或包装说明书而包含在内。

可以添加各种增强所述组合物的稳定性和无菌性的添加剂，包括抗微生物防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和缓冲液。可以通过各种抗细菌和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚和山梨酸)来确保防止微生物的作用。通过使用延迟吸收的药剂(例如单硬脂酸铝和明胶)可以实现可注射药物形式的延长吸收。

在一些实施方案中，配制缓冲液含有冷冻保存剂。在一些实施方案中，用冷冻保存剂溶液配制细胞，所述冷冻保存剂溶液含有1.0％至30％的DMSO溶液，诸如5％至20％的DMSO溶液或5％至10％的DMSO溶液。在一些实施方案中，冷冻保存剂溶液是或含有例如含有20％DMSO和8％人血清白蛋白(HSA)的PBS、或其他合适的细胞冷冻介质。在一些实施方案中，冷冻保存剂溶液是或含有例如至少或约7.5％DMSO。在一些实施方案中，处理步骤可以涉及洗涤经转导的和/或扩增的细胞以交换在冷冻保存剂溶液中的细胞。在一些实施方案中，将所述细胞在介质和/或溶液中冷冻(例如冷冻保护或冷冻保存)，所述介质和/或溶液具有最终浓度为或为约12.5％、12.0％、11.5％、11.0％、10.5％、10.0％、9.5％、9.0％、8.5％、8.0％、7.5％、7.0％、6.5％、6.0％、5.5％或5.0％的DMSO或者在1％与15％之间、在6％与12％之间、在5％与10％之间或在6％与8％之间的DMSO。在特定实施方案中，将所述细胞在介质和/或溶液中冷冻(例如，冷冻保护或冷冻保存)，所述介质和/或溶液具有最终浓度为或为约5.0％、4.5％、4.0％、3.5％、3.0％、2.5％、2.0％、1.5％、1.25％、1.0％、0.75％、0.5％或0.25％的HSA或者在0.1％与5％之间、在0.25％与4％之间、在0.5％与2％之间或在1％与2％之间的HSA。

在特定实施方案中，将富集的T细胞(例如，已经进行刺激、工程化和/或孵育的T细胞)的组合物配制，低温保护，然后储存一定时间量。在某些实施方案中，储存配制的低温保护的细胞，直至释放细胞用于输注。在特定实施方案中，将配制的低温保护的细胞储存1天与6个月之间、1个月与3个月之间、1天与14天之间、1天与7天之间、3天与6天之间、6个月与12个月之间、或长于12个月。在一些实施方案中，将细胞低温保护并储存为、为约或为小于1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天。在某些实施方案中，在储存之后，将细胞解冻并施用于受试者。在某些实施方案中，将细胞储存持续或持续约5天。在一些实施方案中，配制的细胞并未低温保存。

在一些实施方案中，使用一个或多个处理步骤进行配制，所述步骤包括洗涤、稀释或浓缩细胞。在一些实施方案中，处理可以包括将细胞稀释或浓缩至所需浓度或数量，诸如包括用于以给定剂量或其部分用的细胞数量的单位剂型组合物。在一些实施方案中，处理步骤可以包括减小体积，从而根据需要增加细胞的浓度。在一些实施方案中，处理步骤可以包括增加体积，从而根据需要减小细胞的浓度。在一些实施方案中，处理包括向转导的和/或孵育的细胞添加一定体积的配制缓冲液。在一些实施方案中，配制缓冲液的体积是从或从约10mL至1000mL，诸如至少或约至少或为约或为50mL、100mL、200mL、300mL、400mL、500mL、600mL、700mL、800mL、900mL或1000mL。

在一些实施方案中，用于配制细胞组合物的这样的处理步骤在封闭系统中进行。此类处理步骤的例子可以使用与跟细胞处理系统相关的一个或多个系统或套件结合的离心室(诸如由Biosafe SA生产和出售的离心室，包括用于与

或Sepax

细胞处理系统一起使用的那些)来进行。在国际公开号WO2016/073602中描述了示例性系统和过程。在一些实施方案中，所述方法包括实现自离心室的内部空腔输送经配制组合物，所述经配制组合物是在如所述的任何以上实施方案中，在配制缓冲液(诸如药学上可接受的缓冲液)中配制的所得细胞组合物。在一些实施方案中，将所配制的组合物输送到容器，诸如作为封闭系统的一部分与离心室可操作地连接的袋。在一些实施方案中，容器(诸如袋)在输出线或输出位置处与系统连接。

在一些实施方案中，诸如与离心室或细胞处理系统相关联的封闭系统包括多端口输出试剂盒，所述试剂盒含有在管线各末端与端口相关联的多路管歧管，所述端口可以连接至一个或多个容器以供经配制组合物输送。在一些方面，可以将所需数量或多个输出容器(例如，袋)无菌地连接至多端口输出的一个或多个(通常两个或更多个，诸如至少3、4、5、6、7、8个或更多个)端口。例如，在一些实施方案中，可以将一个或多个容器(例如，袋)附着到端口，或者附着到少于所有端口。因此，在一些实施方案中，所述系统可以实现将输出组合物输送到多个输出袋中。

在一些方面，可以将细胞以用于剂量施用(诸如用于单一单位剂量施用或多剂量施用)的量输送到多个输出袋中的一个或多个中。例如，在一些实施方案中，输出袋可以各自含有用于以给定剂量或其部分施用的细胞数量。因此，在一些方面，每个袋可以含有用于施用的单一单位剂量或可以含有所需剂量的一部分，使得多个输出袋中的多于一个(诸如两个输出袋、或3个输出袋)一起构成用于施用的剂量。

因此，容器(例如输出袋)通常含有要施用的细胞，例如，其一个或多个单位剂量。单位剂量可以是要施用于受试者的细胞的量或数量，或者是要施用的细胞的数量的两倍(或更多数量)。其可以是要施用于受试者的细胞的最低剂量或最低可能剂量。

在一些实施方案中，每个容器(例如，袋)单独包含单位剂量的细胞。因此，在一些实施方案中，每个容器包含相同或大致或基本相同数量的细胞。在一些实施方案中，每个单位剂量含有至少或约至少1x10⁶、2x10⁶、5x10⁶、1x10⁷、5x10⁷个或1x10⁸个工程化的细胞、总细胞、T细胞或PBMC。在一些实施方案中，每个袋中配制的细胞组合物的体积是10mL至100mL，诸如至少或约至少20mL、30mL、40mL、50mL、60mL、70mL、80mL、90mL或100mL。

在一些实施方案中，将通过所述方法产生的此类细胞或包含此类细胞的组合物施用于受试者以治疗疾病或病症。

III.组合物和配制品

在一些实施方案中，本文提供了组合物，其包含表达嵌合抗原受体(CAR)(例如抗BCMA CAR，诸如靶向人BCMA的CAR)的工程化T细胞。在某些实施方案中，所述组合物是富集T细胞的治疗性组合物，例如，使用例如在章节II-C中用于生成或产生输出工程化细胞和/或包含本文所公开的工程化T细胞的输出组合物的过程制造的富集CD3+T细胞的组合物或富集CD4+和CD8+T细胞的组合物。在一些实施方案中，工程化T细胞作为组合物、配制品或剂量(诸如药物组合物、配制品或剂量)提供。此类组合物、配制品或剂量可以根据所提供的方法或用途和/或用所提供的制品或组合物来使用，诸如用于预防或治疗疾病、病症和障碍，或用于检测、诊断和预后方法。

在特定实施方案中，包含表达抗BCMA CAR的工程化T细胞的组合物富集CD3+T细胞。在一些实施方案中，所述组合物中至少或约50％、至少或约60％、至少或约65％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约85％、至少或约90％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约98％、至少或约98.5％、至少或约99％、至少或约99.5％、至少或约99.9％、100％或约100％的总细胞、总活细胞(total viable cells、total live cell)、总T细胞、总活T细胞(total viable T cells、total live T cell)、总活CD45+细胞或其CAR表达细胞是CD3+的，例如CD3+T细胞或CAR+CD3+T细胞。在一些实施方案中，所述组合物中在为或约75％与为或约80％之间、在为或约80％与为或约85％之间、在为或约85％与为或约90％之间、在为或约90％与为或约95％之间、在为或约95％与为或约99％之间的总细胞、总活细胞(total viable cells、total live cell)、总T细胞、总活T细胞(total viable Tcells、total live T cell)、总活CD45+细胞或其CAR表达细胞是CD3+的，例如CD3+T细胞或CAR+CD3+T细胞。在一些实施方案中，所述组合物中为或约80％、为或约81％、为或约82％、为或约83％、为或约84％、为或约85％、为或约86％、为或约87％、为或约88％、为或约89％、为或约90％、为或约91％、为或约92％、为或约93％、为或约94％、为或约95％、为或约96％、为或约97％、为或约98％、为或约99％的总活CD45+细胞或其CAR表达细胞是CD3+的，例如CD3+T细胞或CAR+CD3+T细胞。在一些实施方案中，所述组合物中在约80％与约100％之间、在约85％与约99％之间、在约88％与约98％之间、在约96％与约99％之间、或在约97％与约99％之间的总活CD45+细胞或其CAR表达细胞是CD3+的，例如CD3+T细胞或CAR+CD3+T细胞。在一些实施方案中，所述组合物由或基本上由CD3+T细胞组成。在一些实施方案中，所述组合物中至少或约80％的总细胞是CD3+T细胞，并且所述组合物中至少或约30％、至少或约40％、至少或约50％、至少或约60％、至少或约70％、至少或约80％、至少或约90％、或至少或约95％的总细胞表达抗BCMA CAR。在一些实施方案中，所述组合物中至少或约80％、至少或约85％、至少或约90％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约97％、至少或约98％、或至少或约99％的总活CD45+细胞是CD3+的，并且所述组合物中至少或约40％、或至少或约50％的总细胞表达抗BCMA CAR。

在一些实施方案中，所述组合物中小于或小于约2.5％、小于或小于约2％、小于或小于约1.5％、小于或小于约1％、小于或小于约0.5％、小于或小于约0.4％、小于或小于约0.3％、小于或小于约0.2％、小于或小于约0.1％、小于或小于约0.05％、或为或约0％的总细胞、总活细胞(total viable cells、total live cell)、总T细胞、总活T细胞(totalviable T cells、total live T cell)、总活CD45+细胞或其CAR表达细胞对表达NK细胞标记呈阳性。在一些实施方案中，所述组合物中在为或约2.5％与为或约2％之间、在为或约2％与为或约1.5％之间、在为或约1.5％与为或约1％之间、在为或约1％与为或约0.5％之间、在为或约0.5％与为或约0.4％之间、在为或约0.4％与为或约0.3％之间、在为或约0.3％与为或约0.2％之间、在为或约0.2％与为或约0.1％之间、在为或约0.1％与为或约0.05％之间、小于或小于约0.05％、或为或约0％的总细胞、总活细胞(total viablecells、total live cell)、总T细胞、总活T细胞(total viable T cells、total live Tcell)、总活CD45+细胞或其CAR表达细胞是NK细胞。在一些实施方案中，所述组合物中在为或约1.5％与为或约0％之间、或在为或约0.5％与为或约0％之间的总活CD45+细胞是NK细胞。在一些实施方案中，所述组合物不含或基本上不含NK细胞或对表达NK细胞标记呈阳性的细胞。

在一些实施方案中，所述组合物中小于或小于约0.2％、小于或小于约0.15％、小于或小于约0.1％、小于或小于约0.05％、小于或小于约0.01％、或为或约0％的总细胞、总活细胞(total viable cells、total live cell)、总T细胞、总活T细胞(total viable Tcells、total live T cell)、总活CD45+细胞或其CAR表达细胞是CD19+的。在一些实施方案中，所述组合物中在为或约0.2％与为或约0.15％之间、在为或约0.15％与为或约0.1％之间、在为或约0.1％与为或约0.05％之间、在为或约0.05％与为或约0.01％之间、小于或小于约0.01％、或为或约0％的总细胞、总活细胞(total viable cells、total live cell)、总T细胞、总活T细胞(total viable T cells、total live T cell)、总活CD45+细胞或其CAR表达细胞是CD19+的。在一些实施方案中，所述组合物中在为或约0.1％与为或约0％之间、或在为或约0.05％与为或约0％之间的总活CD45+细胞是CD19+的。在一些实施方案中，所述组合物不含或基本上不含CD19+细胞。

在一些实施方案中，所述组合物中至少或约80％的总活CD45+细胞是CD3+的，所述组合物中至少或约40％的总细胞表达抗BCMA CAR，所述组合物中小于约1.5％的总活CD45+细胞是NK细胞或对表达NK细胞标记呈阳性的细胞，并且所述组合物中小于约0.1％的总活CD45+细胞是BCMA+的。在一些实施方案中，所述组合物中至少或约96％的总活CD45+细胞是CD3+的，所述组合物中至少或约50％的总细胞表达抗BCMA CAR，所述组合物中小于约0.5％的总活CD45+细胞是NK细胞或对表达NK细胞标记呈阳性的细胞，并且所述组合物中小于约0.05％的总活CD45+细胞是BCMA+的。

在特定实施方案中，包含表达抗BCMA CAR的工程化T细胞的组合物富集CD4+和CD8+T细胞。在一些实施方案中，所述组合物中至少或约50％、至少或约60％、至少或约65％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约85％、至少或约90％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约98％、至少或约98.5％、至少或约99％、至少或约99.5％、至少或约99.9％、100％或约100％的总细胞、总活细胞(total viable cells、total live cell)、总T细胞、总活T细胞(total viable T cells、total live T cell)、总活CD45+细胞或其CAR表达细胞是CD4+或CD8+的。在一些实施方案中，所述组合物中在为或约75％与为或约80％之间、在为或约80％与为或约85％之间、在为或约85％与为或约90％之间、在为或约90％与为或约95％之间、在为或约95％与为或约99％之间的总细胞、总活细胞(total viablecells、total live cell)、总T细胞、总活T细胞(total viable T cells、total live Tcell)、总活CD45+细胞或其CAR表达细胞是CD4+或CD8+的。在一些实施方案中，所述组合物中为或约80％、为或约81％、为或约82％、为或约83％、为或约84％、为或约85％、为或约86％、为或约87％、为或约88％、为或约89％、为或约90％、为或约91％、为或约92％、为或约93％、为或约94％、为或约95％、为或约96％、为或约97％、为或约98％、为或约99％的总活CD45+细胞或其CAR表达细胞是CD4+或CD8+的。在一些实施方案中，所述组合物中在约80％与约100％之间、在约85％与约99％之间、在约88％与约98％之间、在约96％与约99％之间、或在约97％与约99％之间的总活CD45+细胞或其CAR表达细胞是CD4+或CD8+的。在一些实施方案中，所述组合物由或基本上由CD4+T细胞和CD8+T细胞组成。在一些实施方案中，所述组合物中至少或约80％的总细胞是CD4+T细胞和CD8+T细胞，并且所述组合物中至少或约30％、至少或约40％、至少或约50％、至少或约60％、至少或约70％、至少或约80％、至少或约90％、或至少或约95％的总细胞表达抗BCMA CAR。在一些实施方案中，所述组合物中至少或约80％、至少或约85％、至少或约90％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约97％、至少或约98％、或至少或约99％的总活CD45+细胞是CD4+T细胞和CD8+T细胞，并且所述组合物中至少或约40％、或至少或约50％的总细胞表达抗BCMA CAR。

在特定实施方案中，CD3+CD4+细胞占所述组合物中的总细胞、总活细胞(totalviable cells、total live cell)、总T细胞、总活T细胞(total viable T cells、totallive T cell)、总活CD45+细胞或其CAR表达细胞的至少或约50％、至少或约60％、至少或约65％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约85％、至少或约90％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约98％、至少或约98.5％、至少或约99％、至少或约99.5％、至少或约99.9％、100％或约100％。在特定实施方案中，CD3+CD4+细胞占所述组合物中的总活CD45+细胞的在为或约50％与为或约70％之间、在为或约50％与为或约55％之间、在为或约55％与为或约60％之间、在为或约60％与为或约65％之间或在为或约65％与为或约70％之间。

在特定实施方案中，CD3+CD8+细胞占所述组合物中的总细胞、总活细胞(totalviable cells、total live cell)、总T细胞、总活T细胞(total viable T cells、totallive T cell)、总活CD45+细胞或其CAR表达细胞的至少或约30％、至少或约35％、至少或约40％、至少或约45％、至少或约50％、至少或约55％、至少或约60％、至少或约65％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约85％、至少或约90％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约98％、至少或约98.5％、至少或约99％、至少或约99.5％、至少或约99.9％、100％或约100％。在特定实施方案中，CD3+CD8+细胞占所述组合物中的总活CD45+细胞的在为或约30％与为或约50％之间、在为或约30％与为或约35％之间、在为或约35％与为或约40％之间、在为或约40％与为或约45％之间或在为或约45％与为或约50％之间。

在特定实施方案中，CD3+CD4+细胞占所述组合物中的总活CD45+细胞的在约55％与约65％之间，而CD3+CD8+细胞占所述组合物中的总活CD45+细胞的在约35％与约45％之间。在特定实施方案中，CD3+CD4+细胞占所述组合物中的总活CD45+细胞的60％，而CD3+CD8+细胞占约40％。

在特定实施方案中，CAR+CD3+细胞(例如，表达抗BCMA CAR的CD3+细胞)占所述组合物中的总细胞、总活细胞(total viable cells、total live cell)、总T细胞、总活T细胞(total viable T cells、total live T cell)、总活CD45+细胞或其CAR表达细胞的至少或约20％、至少或约30％、至少或约40％、至少或约50％、至少或约60％、至少或约65％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约85％、至少或约90％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约98％、至少或约98.5％、至少或约99％、至少或约99.5％、至少或约99.9％、100％或约100％。在特定实施方案中，CAR+CD3+细胞(例如，表达抗BCMA CAR的CD3+细胞)占所述组合物中的总活CD45+细胞的在为或约40％与为或约100％之间、在为或约40％与为或约45％之间、在为或约45％与为或约50％之间、在为或约50％与为或约55％之间、在为或约55％与为或约60％之间、在为或约60％与为或约65％之间、在为或约65％与为或约70％之间、在为或约70％与为或约75％之间、在为或约75％与为或约80％之间、在为或约80％与为或约85％之间、在为或约85％与为或约90％之间、在为或约90％与为或约95％之间、或在为或约95％与为或约99％之间。

在特定实施方案中，CAR+CD4+细胞(例如，表达抗BCMA CAR的CD4+细胞)占所述组合物中的总细胞、总活细胞(total viable cells、total live cell)、总T细胞、总活T细胞(total viable T cells、total live T cell)、总活CD45+细胞或其CAR表达细胞的至少或约20％、至少或约30％、至少或约40％、至少或约50％、至少或约60％、至少或约65％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约85％、至少或约90％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约98％、至少或约98.5％、至少或约99％、至少或约99.5％、至少或约99.9％、100％或约100％。在特定实施方案中，CAR+CD4+细胞(例如，表达抗BCMA CAR的CD4+细胞)占所述组合物中的总活CD45+细胞的在为或约20％与为或约60％之间、在为或约20％与为或约25％之间、在为或约25％与为或约30％之间、在为或约30％与为或约35％之间、在为或约35％与为或约40％之间、在为或约40％与为或约45％之间、在为或约45％与为或约50％之间、在为或约50％与为或约55％之间、或在为或约55％与为或约60％之间。

在特定实施方案中，CAR+CD8+细胞(例如，表达抗BCMA CAR的CD8+细胞)占所述组合物中的总细胞、总活细胞(total viable cells、total live cell)、总T细胞、总活T细胞(total viable T cells、total live T cell)、总活CD45+细胞或其CAR表达细胞的至少或约10％、至少或约20％、至少或约30％、至少或约35％、至少或约40％、至少或约45％、至少或约50％、至少或约55％、至少或约60％、至少或约65％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约85％、至少或约90％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约98％、至少或约98.5％、至少或约99％、至少或约99.5％、至少或约99.9％、100％或约100％。在特定实施方案中，CAR+CD8+细胞(例如，表达抗BCMA CAR的CD8+细胞)占所述组合物中的总活CD45+细胞的在为或约5％与为或约35％之间、在为或约5％与为或约10％之间、在为或约10％与为或约15％之间、在为或约15％与为或约20％之间、在为或约20％与为或约25％之间、在为或约25％与为或约30％之间、在为或约30％与为或约35％之间。

在特定实施方案中，CAR+CD3+细胞(例如，表达抗BCMA CAR的CD3+细胞)占所述组合物中的总活CD45+细胞的在约35％与约65％之间。在特定实施方案中，CAR+CD4+细胞(例如，表达抗BCMA CAR的CD4+细胞)占所述组合物中的总活CD45+细胞的在约25％与约55％之间，而CAR+CD8+细胞(例如，表达抗BCMA CAR的CD8+细胞)占所述组合物中的总活CD45+细胞的在约10％与约30％之间。在特定实施方案中，表达抗BCMA CAR的CD3+细胞占所述组合物中的总活CD45+细胞的约50％。在特定实施方案中，CAR+CD4+细胞占所述组合物中的总活CD45+细胞的30％，而CAR+CD8+细胞占约20％。在特定实施方案中，表达抗BCMA CAR的CD3+细胞占所述组合物中的总活CD45+细胞的约60％。在特定实施方案中，CAR+CD4+细胞占所述组合物中的总活CD45+细胞的40％，而CAR+CD8+细胞占约20％。

在特定实施方案中，所述组合物含有比率在5:1与1:5之间、在4:1与1:4之间、在3:1与1:3之间、在2.5:1与1:2.5之间、在2:1与1:2之间、在1.5:1与1:1.5之间、在1.4:1与1:1.4之间、在1.3:1与1:1.3之间、在1.2:1与1:1.2之间、或在1.1:1与1:1.1之间的CD4+T细胞与CD8+T细胞。在一些实施方案中，细胞组合物具有比率为或为约5:1、为或为约4:1、为或为约3:1、为或为约2.8:1、为或为约2.5:1、为或为约2.25:1、为或为约2:1、为或为约1.8:1、为或为约1.7:1、为或为约1.6:1、为或为约1.5:1、为或为约1.4:1、为或为约1.3:1、为或为约1.2:1、为或为约1.1:1、为或为约1:1、为或为约1:1.1、为或为约1:1.2、为或为约1:1.3、为或为约1:1.4、为或为约1:1.5、为或为约1:1.6、为或为约1:1.7、为或为约1:1.8、为或为约1:2、为或为约1:2.25、为或为约1:2.5、为或为约1:2.8、或为或为约1:3的CD4+T细胞与CD8+T细胞。在特定实施方案中，所述组合物含有比率在4:1与1:1之间或在约4:1与约1:1之间的CD4+T细胞与CD8+T细胞。

在一些实施方案中，所述输出组合物含有比率在5:1与1:5之间、在4:1与1:4之间、在3:1与1:3之间、在2.5:1与1:2.5之间、在2:1与1:2之间、在1.5:1与1:1.5之间、在1.4:1与1:1.4之间、在1.3:1与1:1.3之间、在1.2:1与1:1.2之间、或在1.1:1与1:1.1之间的表达重组受体(例如，抗BCMA CAR)的CD4+T细胞与表达重组受体(例如，抗BCMA CAR)的CD8+T细胞。在一些实施方案中，在所述输出组合物中表达重组受体(例如，抗BCMA CAR)的CD4+T细胞与表达重组受体(例如，抗BCMA CAR)的CD8+T细胞的比率为或为约3:1、为或为约2.8:1、为或为约2.5:1、为或为约2.25:1、为或为约2:1、为或为约1.8:1、为或为约1.7:1、为或为约1.6:1、为或为约1.5:1、为或为约1.4:1、为或为约1.3:1、为或为约1.2:1、为或为约1.1:1、为或为约1:1、为或为约1:1.1、为或为约1:1.2、为或为约1:1.3、为或为约1:1.4、为或为约1:1.5、为或为约1:1.6、为或为约1:1.7、为或为约1:1.8、为或为约1:2、为或为约1:2.25、为或为约1:2.5、为或为约1:2.8、或为或为约1:3。在特定实施方案中，所述组合物含有比率在5:1与2:1之间或在约5:1与约2:1之间的CD4+CAR+T细胞与CD8+CAR+T细胞。

在特定实施方案中，所述组合物含有比率在约5:1与约1:2之间或在约4:1与约1:1之间的CD4+T细胞与CD8+T细胞。在特定实施方案中，所述组合物含有比率在约5:1与约1:2之间或在约4:1与约1:1之间的CD4+CAR+T细胞与CD8+CAR+T细胞。在一些实施方案中，细胞组合物具有比率为或为约1.5:1的CD4+T细胞与CD8+T细胞。在特定实施方案中，所述组合物含有比率在约3:1与约1:1之间的CAR+CD4+细胞与CAR+CD8+细胞。在特定实施方案中，所述组合物含有比率在约2.5:1与约1.5:1之间的CAR+CD4+细胞与CAR+CD8+细胞。在一些实施方案中，细胞组合物具有比率为或为约2:1的CAR+CD4+细胞与CAR+CD8+细胞。在一些实施方案中，细胞组合物具有比率为或为约1.5:1的CD4+T细胞与CD8+T细胞，以及比率为或为约2:1的CAR+CD4+细胞与CAR+CD8+细胞。

在特定实施方案中，所述组合物含有至少或至少约50％、至少或至少约60％、至少或至少约70％、至少或至少约75％、至少或至少约80％、至少或至少约85％、至少或至少约90％、至少或至少约95％、至少或至少约99％、或至少或至少约99.9％的活细胞。在一些实施方案中，所述组合物含有至少或至少约75％的活细胞。在某些实施方案中，所述组合物含有至少或至少约85％、至少或至少约90％、或至少或至少约95％的活细胞。在一些实施方案中，所述组合物含有至少或至少约50％、至少或至少约60％、至少或至少约70％、至少或至少约75％、至少或至少约80％、至少或至少约85％、至少或至少约90％、至少或至少约95％、至少或至少约99％、或至少或至少约99.9％的活CD3+T细胞。在特定实施方案中，所述组合物含有至少或至少约75％的活CD3+T细胞。在某些实施方案中，所述组合物含有至少或至少约85％、至少或至少约90％、或至少或至少约95％的活CD3+T细胞。在一些实施方案中，所述组合物含有至少或至少约50％、至少或至少约60％、至少或至少约70％、至少或至少约75％、至少或至少约80％、至少或至少约85％、至少或至少约90％、至少或至少约95％、至少或至少约99％、或至少或至少约99.9％的活CD4+T细胞。在某些实施方案中，所述组合物含有至少或至少约75％的活CD4+T细胞。在特定实施方案中，所述组合物含有至少或至少约85％、至少或至少约90％、或至少或至少约95％的活CD4+T细胞。在特定实施方案中，所述组合物含有至少或至少约50％、至少或至少约60％、至少或至少约70％、至少或至少约75％、至少或至少约80％、至少或至少约85％、至少或至少约90％、至少或至少约95％、至少或至少约99％、或至少或至少约99.9％的活CD8+T细胞。在一些实施方案中，所述组合物含有至少或至少约75％的活CD8+T细胞。在某些实施方案中，所述组合物含有至少或至少约85％、至少或至少约90％、或至少或至少约95％的活CD8+T细胞。

在特定实施方案中，所述组合物具有低份额和/或频率的正在经历和/或被准备、引发和/或进入凋亡的细胞。在特定实施方案中，所述组合物具有低份额和/或频率的对凋亡标记呈阳性的细胞。在一些实施方案中，所述组合物中小于或小于约40％、小于或小于约35％、小于或小于约30％、小于或小于约25％、小于或小于约20％、小于或小于约15％、小于或小于约10％、小于或小于约5％或小于或小于约1％的细胞表达、含有凋亡标记和/或对凋亡标记呈阳性。在某些实施方案中，所述组合物中小于或小于约25％的细胞表达、含有凋亡标记和/或对凋亡标记呈阳性。在某些实施方案中，所述组合物中小于或小于约小于或小于约10％的细胞表达、含有凋亡标记和/或对凋亡标记呈阳性。

在特定实施方案中，所述组合物中至少或至少约50％、至少或至少约60％、至少或至少约70％、至少或至少约75％、至少或至少约80％、至少或至少约85％、至少或至少约90％、至少或至少约95％、至少或至少约99％、或至少或至少约99.9％的抗BCMA CAR表达细胞是活细胞，例如，对凋亡标记诸如半胱天冬酶(例如，激活的半胱天冬酶3)呈阴性的细胞。在某些实施方案中，所述组合物中至少或至少约85％、至少或至少约90％、或至少或至少约95％的抗BCMA CAR表达细胞对凋亡标记诸如半胱天冬酶(例如，激活的半胱天冬酶3)呈阴性。在一些实施方案中，所述组合物中至少或至少约50％、至少或至少约60％、至少或至少约70％、至少或至少约75％、至少或至少约80％、至少或至少约85％、至少或至少约90％、至少或至少约95％、至少或至少约99％、或至少或至少约99.9％的CD3+T细胞是活细胞，例如，对凋亡标记诸如半胱天冬酶(例如，激活的半胱天冬酶-3)呈阴性的细胞。在某些实施方案中，所述组合物中至少为或约85％、至少为或约90％、或至少或至少约95％的CD3+T细胞对凋亡标记诸如半胱天冬酶(例如，激活的半胱天冬酶-3)呈阴性。在特定实施方案中，所述组合物中至少或至少约90％的CD3+T细胞是活细胞，例如，对凋亡标记诸如半胱天冬酶(例如，激活的半胱天冬酶-3)呈阴性的细胞。在一些实施方案中，所述组合物中至少或至少约50％、至少或至少约60％、至少或至少约70％、至少或至少约75％、至少或至少约80％、至少或至少约85％、至少或至少约90％、至少或至少约95％、至少或至少约99％、或至少或至少约99.9％的CAR+CD3+T细胞是活细胞，例如，对凋亡标记诸如半胱天冬酶(例如，激活的半胱天冬酶-3)呈阴性的细胞。在特定实施方案中，所述组合物中至少或至少约85％、至少或至少约90％、或至少或至少约95％的抗BCMA CAR表达CD3+T细胞是活细胞，例如，对凋亡标记诸如半胱天冬酶(例如，激活的半胱天冬酶-3)呈阴性的细胞。

在一些实施方案中，所述组合物中小于或小于约30％、小于或小于约25％、小于或小于约20％、小于或小于约15％、小于或小于约10％、或小于或小于约5％的总细胞、总T细胞、总CD45+细胞、总CD3+细胞、总CD4+和CD8+细胞或其CAR表达细胞表达凋亡标记，任选地膜联蛋白V或活性半胱天冬酶3。在一些实施方案中，所述组合物中在为或约30％与为或约25％之间、在为或约25％与为或约20％之间、在为或约20％与为或约15％之间、在为或约15％与为或约10％之间、在为或约10％与为或约5％之间的总细胞、总T细胞、总CD45+细胞、总CD3+细胞、总CD4+和CD8+细胞或其CAR表达细胞表达凋亡标记，任选地膜联蛋白V或活性半胱天冬酶3。在一些实施方案中，所述组合物中为或约6％、为或约8％、为或约10％、为或约12％、为或约14％、为或约16％、为或约18％、为或约20％、为或约22％、为或约24％、为或约26％、为或约28％、为或约30％的CD3+细胞表达凋亡标记，任选地膜联蛋白V或活性半胱天冬酶3。

在一些实施方案中，表达抗BCMA CAR可以包括但不限于具有定位于细胞膜和/或细胞表面的一种或多种重组受体蛋白，具有可检测量的重组受体蛋白，具有可检测量的编码重组受体的mRNA，具有或含有编码重组受体的重组多核苷酸，和/或具有或含有作为重组受体表达的替代标记的mRNA或蛋白质。

在一些实施方案中，所述组合物中至少或约5％、至少或约10％、至少或约20％、至少或约30％、至少或约40％、至少或约45％、至少或约50％、至少或约55％、至少或约60％、至少或约65％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约85％、至少或约90％、至少或约95％、至少或约97％、至少或约99％或超过99％的细胞表达重组受体，例如抗BCMA CAR。在某些实施方案中，所述组合物中至少或约50％的细胞表达抗BCMA CAR。在某些实施方案中，所述组合物中至少或约5％、至少或约10％、至少或约20％、至少或约30％、至少或约40％、至少或约45％、至少或约50％、至少或约55％、至少或约60％、至少或约65％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约85％、至少或约90％、至少或约95％、至少或约97％、至少或约99％或超过99％的CD3+T细胞表达抗BCMA CAR。在一些实施方案中，所述组合物中至少或约50％的CD3+T细胞表达抗BCMA CAR。在某些实施方案中，所述组合物中至少或约5％、至少或约10％、至少或约20％、至少或约30％、至少或约40％、至少或约45％、至少或约50％、至少或约55％、至少或约60％、至少或约65％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约85％、至少或约90％、至少或约95％、至少或约97％、至少或约99％或超过99％的细胞是表达抗BCMA CAR的CD3+T细胞。在一些实施方案中，所述组合物中至少或约50％的细胞是表达抗BCMA CAR的CD3+T细胞。

在一些实施方案中，所述组合物包含至少或至少约0.2x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、0.3x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、0.4x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、0.5x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、0.6x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、0.7x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、0.8x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、0.9x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、1x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、1.1x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、1.2x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、1.3x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、1.4x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、1.5x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、1.6x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、1.7x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、1.8x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、1.9x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、2x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、2.1x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、2.2x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、2.3x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、2.4x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、2.5x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、2.6x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、2.7x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、2.8x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、2.9x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、3x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、3.1x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、3.2x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、3.3x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、3.4x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、3.5x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、3.6x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、3.7x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、3.8x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、3.9x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、4x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、4.1x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、4.2x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、4.3x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、4.4x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、4.5x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、4.6x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、4.7x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、4.8x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、4.9x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、5x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、5.1x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、5.2x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、5.3x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、5.4x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、5.5x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、5.6x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、5.7x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、5.8x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、5.9x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL或6x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL，每个都包含端值。在一些实施方案中，所述组合物包含至少或至少约0.2x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、0.3x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、0.4x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、0.5x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、0.6x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、0.7x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、0.8x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、0.9x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、1x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、1.1x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、1.2x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、1.3x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、1.4x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、1.5x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、1.6x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、1.7x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、1.8x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、1.9x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、2x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、2.1x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、2.2x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、2.3x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、2.4x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、2.5x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、2.6x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、2.7x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、2.8x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、2.9x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、3x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、3.1x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、3.2x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、3.3x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、3.4x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、3.5x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、3.6x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、3.7x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、3.8x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、3.9x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、4x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、4.1x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、4.2x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、4.3x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、4.4x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、4.5x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、4.6x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、4.7x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、4.8x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、4.9x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、5x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、5.1x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、5.2x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、5.3x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、5.4x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、5.5x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、5.6x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、5.7x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、5.8x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、5.9x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL或6x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL，每个都包含端值。

在特定实施方案中，所述组合物中至少或约30％、至少或约40％、至少或约45％、至少或约50％、至少或约55％、至少或约60％、至少或约65％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约85％、至少或约90％、至少或约95％、至少或约97％、至少或约99％或超过99％的CD4+T细胞表达重组受体，例如抗BCMA CAR。在特定实施方案中，所述组合物中至少或约50％的CD4+T细胞表达重组受体，例如抗BCMA CAR。在一些实施方案中，所述组合物中至少或约30％、至少或约40％、至少或约45％、至少或约50％、至少或约55％、至少或约60％、至少或约65％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约85％、至少或约90％、至少或约95％、至少或约97％、至少或约99％或超过99％的CD8+T细胞表达重组受体，例如抗BCMA CAR。在某些实施方案中，所述组合物中至少或约50％的CD8+T细胞表达重组受体，例如抗BCMA CAR。

在一些实施方案中，所述组合物中至少或约5％、至少或约10％、至少或约20％、至少或约30％、至少或约40％、至少或约45％、至少或约50％、至少或约55％、至少或约60％、至少或约65％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约85％、至少或约90％、至少或约95％、至少或约97％、至少或约99％或超过99％的活CD45+细胞是CD3+CAR+的(例如，表达抗BCMA CAR的CD3+T细胞)、CD4+CAR+的(例如，表达抗BCMA CAR的CD4+T细胞)和/或CD8+CAR+的(例如，表达抗BCMA CAR的CD8+T细胞)。在某些实施方案中，所述组合物中至少或约50％的活CD45+细胞是表达抗BCMA CAR的CD3+T细胞。在某些实施方案中，所述组合物中在为或约60％与为或约65％之间的活CD45+细胞是表达抗BCMA CAR的CD3+T细胞。在某些实施方案中，所述组合物中在为或约35％与为或约45％之间、在为或约35％与为或约40％之间、或在为或约40％与为或约45％之间的活CD45+细胞是表达抗BCMA CAR的CD4+T细胞。在某些实施方案中，所述组合物中在为或约15％与为或约25％之间、在为或约15％与为或约20％之间、或在为或约20％与为或约25％之间的活CD45+细胞是表达抗BCMA CAR的CD8+T细胞。在某些实施方案中，在所述组合物中的活CD45+细胞中，至少或约60％是表达抗BCMA CAR的CD3+T细胞，至少或约40％是表达抗BCMA CAR的CD4+T细胞，并且至少或约20％是表达抗BCMA CAR的CD8+T细胞。

在任何前述实施方案中，在一个或多个容器(诸如小瓶)中，所述组合物可以包含约或至少约10x10⁶个、约或至少约20x10⁶个、约或至少约25x10⁶个、约或至少约50x10⁶个、约或至少约100x10⁶个、约或至少约200x10⁶个、约或至少约400x10⁶个、约或至少约600x10⁶个、约或至少约800x10⁶个、约或至少约1000x10⁶个、约或至少约1200x10⁶个、约或至少约1400x10⁶个、约或至少约1600x10⁶个、约或至少约1800x10⁶个、约或至少约2000x10⁶个、约或至少约2500x10⁶个、约或至少约3000x10⁶个或约或至少约4000x10⁶个总细胞，例如总活细胞。在任何前述实施方案中，所述组合物的体积可以在1.0mL与10mL之间(包含端值)，任选地，为或约2mL、为或约3mL、为或约4mL、为或约5mL、为或约6mL、为或约7mL、为或约8mL、为或约9mL、或为或约10mL，或任何前述值之间的任何值。在一些实施方案中，所述组合物被包含在多个容器中，诸如2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个小瓶中。在任何前述实施方案中，所述组合物可以包含每个单位容器(诸如每个小瓶)约或至少约5x10⁶个、约或至少约10x10⁶个、约或至少约20x10⁶个、约或至少约25x10⁶个、约或至少约50x10⁶个、约或至少约100x10⁶个、约或至少约150x10⁶个、约或至少约200x10⁶个、约或至少约250x10⁶个、约或至少约300x10⁶个、约或至少约350x10⁶个、约或至少约400x10⁶个、约或至少约450x10⁶个、约或至少约500x10⁶个、约或至少约550x10⁶个、或约或至少约600x10⁶个总细胞，例如总活细胞。在一些实施方案中，在所述一个或多个容器中的所述组合物的细胞在溶液或缓冲液中(例如在冷冻保存溶液或缓冲液中)的密度为约或至少5x10⁶个细胞/mL、10x10⁶个细胞/mL、20x10⁶个细胞/mL、30x10⁶个细胞/mL、40x10⁶个细胞/mL、50x10⁶个细胞/mL、60x10⁶个细胞/mL、70x10⁶个细胞/mL、80x10⁶个细胞/mL、90x10⁶个细胞/mL、100x10⁶个细胞/mL、110x10⁶个细胞/mL、120x10⁶个细胞/mL、130x10⁶个细胞/mL、140x10⁶个细胞/mL或150x10⁶个细胞/mL。在一些实施方案中，使约或多达约900x10⁶个细胞(例如，活CD4+T细胞和活CD8+T细胞或活CD3+T细胞)经受刺激，其中使受刺激的组合物的约或多达约600x10⁶个细胞(例如，活CD4+T细胞和活CD8+T细胞或活CD3+T细胞)经受诸如用病毒载体例如通过转导进行的基因工程化或非病毒基因工程化方法，随后在没有任何重组细胞因子的无血清基础培养基(例如，补充有一种或多种补充剂)中孵育约72小时或约三天。在一些实施方案中，在一个或多个容器(诸如小瓶)中，所产生的输出组合物包含在约100x10⁶个与约1400x10⁶个之间的总细胞，例如总活细胞。

在特定实施方案中，所述组合物中的大多数细胞是幼稚或幼稚样细胞、中枢记忆细胞和/或效应记忆细胞。在特定实施方案中，所述组合物中的大多数细胞是幼稚样或中枢记忆细胞。在一些实施方案中，输出组合物中的大多数细胞是中枢记忆细胞。在一些方面，分化程度较低的细胞(例如，中枢记忆细胞)存活更久，并且耗竭较慢，从而增加持久性和耐久性。在一些方面，细胞疗法(诸如CAR-T细胞疗法)的反应者具有增加的中枢记忆基因表达。参见例如，Fraietta等人(2018)Nat Med.24(5):563-571。

在某些实施方案中，所述组合物的细胞具有高份额和/或频率的幼稚样T细胞或对幼稚样T细胞上表达的标记呈表面阳性的T细胞。在某些实施方案中，所述组合物的细胞中幼稚样细胞的份额和/或频率大于从替代性过程(诸如涉及扩增的过程(例如包括扩增单元操作和/或包括旨在引起细胞扩增的步骤的过程))产生的组合物。在某些实施方案中，幼稚样T细胞可以包括处于不同分化状态的细胞，并且特征可以是某些细胞标记的阳性或高表达(例如，表面表达或细胞内表达)和/或其他细胞标记的阴性或低表达(例如，表面表达或细胞内表达)。在一些方面，幼稚样T细胞的特征为CCR7、CD45RA、CD28和/或CD27的阳性或高表达。在一些方面，幼稚样T细胞的特征为CD25、CD45RO、CD56、CD62L和/或KLRG1的阴性表达。在一些方面，幼稚样T细胞的特征为CD95的低表达。在某些实施方案中，幼稚样T细胞或对幼稚样T细胞上表达的标记呈表面阳性的T细胞是CCR7+CD45RA+的，其中所述细胞是CD27+或CD27-的。在某些实施方案中，幼稚样T细胞或对幼稚样T细胞上表达的标记呈表面阳性的T细胞是CD27+CCR7+的，其中所述细胞是CD45RA+或CD45RA-的。在某些实施方案中，幼稚样T细胞或对幼稚样T细胞上表达的标记呈表面阳性的T细胞是CD62L-CCR7+的。

在特定实施方案中，所述组合物的细胞富集CCR7+细胞。CCR7是在T细胞进入淋巴结中涉及的趋化因子受体。在特定方面，CCR7由幼稚或幼稚样T细胞(例如CCR7+CD45RA+或CCR7+CD27+)和中枢记忆T细胞(CCR7+CD45RA-)表达。在一些实施方案中，通过所提供的方法产生的所提供的工程化T细胞组合物包含T细胞群，其中所述群体中大于为或约50％、大于为或约55％、大于或大于为或约60％、大于或大于为或约65％、大于或大于为或约70％、大于或大于为或约75％、大于或大于为或约80％、大于或大于为或约85％、或大于或大于为或约90％的T细胞是中枢记忆和幼稚样T细胞。在一些实施方案中，通过所提供的方法产生的所提供的工程化T细胞组合物包括T细胞群，其中所述群体中大于为或约50％、大于为或约55％、大于或大于为或约60％、大于或大于为或约65％、大于或大于为或约70％、大于或大于为或约75％、大于或大于为或约80％、大于或大于为或约85％、或大于或大于为或约90％的T细胞是CCR7+T细胞。在一些实施方案中，通过所提供的方法产生的所提供的工程化T细胞组合物包括T细胞群，其中所述群体中大于为或约50％、大于为或约55％、大于或大于为或约60％、大于或大于为或约65％、大于或大于为或约70％、大于或大于为或约75％、大于或大于为或约80％、大于或大于为或约85％、或大于或大于为或约90％的T细胞是CCR7+CD27+。在一些实施方案中，通过所提供的方法产生的所提供的工程化T细胞组合物包括T细胞群，其中所述群体中大于为或约50％、大于为或约55％、大于或大于为或约60％、大于或大于为或约65％、大于或大于为或约70％、大于或大于为或约75％、大于或大于为或约80％、大于或大于为或约85％、或大于或大于为或约90％的T细胞是CCR7+CD45RA-。

在某些实施方案中，输出组合物的细胞具有高份额和/或频率的中枢记忆T细胞或对中枢记忆T细胞上表达的标记呈表面阳性的T细胞。在某些实施方案中，输出组合物的细胞中中枢记忆细胞的份额和/或频率大于从替代性过程(诸如涉及扩增的过程(例如包括扩增单元操作和/或包括旨在引起细胞扩增的步骤的过程))产生的输出组合物。在某些实施方案中，中枢记忆T细胞可以包括处于不同分化状态的细胞，并且特征可以是某些细胞标记的阳性或高表达(例如，表面表达)和/或其他细胞标记的阴性或低表达(例如，表面表达)。在一些方面，中枢记忆T细胞的特征为CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD3和/或CD127的阳性或高表达。在一些方面，中枢记忆T细胞的特征为CD45RA和/或颗粒酶B的阴性或低表达。在某些实施方案中，中枢记忆T细胞或对中枢记忆T细胞上表达的标记呈表面阳性的T细胞是CCR7+CD45RA-是。

在某些实施方案中，输出组合物的细胞中幼稚样细胞和中枢记忆细胞的份额和/或频率大于从替代性过程(诸如涉及扩增的过程(例如包括扩增单元操作和/或包括旨在引起细胞扩增的步骤的过程))产生的输出组合物。

在某些实施方案中，输出组合物的细胞具有低份额和/或频率的效应记忆和/或效应记忆RA T细胞或对效应记忆和/或效应记忆RA T细胞上表达的标记呈表面阳性的T细胞。在某些实施方案中，输出组合物的细胞中效应记忆和/或效应记忆RA T细胞的份额和/或频率低于从替代性过程(诸如涉及扩增的过程(例如包括扩增单元操作和/或包括旨在引起细胞扩增的步骤的过程))产生的输出组合物。在某些实施方案中，效应记忆和/或效应记忆RAT细胞可以包括处于不同分化状态的细胞，并且特征可以是某些细胞标记的阳性或高表达(例如，表面表达或细胞内表达)和/或其他细胞标记的阴性或低表达(例如，表面表达或细胞内表达)。在某些实施方案中，效应记忆T细胞或对效应记忆T细胞上表达的标记呈表面阳性的T细胞是CCR7-CD45RA-的。在某些实施方案中，效应记忆RA T细胞或对效应记忆RA T细胞上表达的标记呈表面阳性的T细胞是CCR7-CD45RA+的。

在某些实施方案中，输出组合物的细胞中效应记忆T细胞的份额和/或频率低于从替代性过程(诸如涉及扩增的过程(例如包括扩增单元操作和/或包括旨在引起细胞扩增的步骤的过程))产生的输出组合物。在某些实施方案中，输出组合物的细胞中效应记忆RA T细胞的份额和/或频率低于从替代性过程(诸如涉及扩增的过程(例如包括扩增单元操作和/或包括旨在引起细胞扩增的步骤的过程))产生的输出组合物。在某些实施方案中，输出组合物的细胞中幼稚样细胞和中枢记忆细胞的份额和/或频率大于从替代性过程(诸如涉及扩增的过程(例如包括扩增单元操作和/或包括旨在引起细胞扩增的步骤的过程))产生的输出组合物，并且效应记忆和效应记忆RA T细胞的份额和/或频率低于所述从替代性过程产生的输出组合物。

在某些实施方案中，输出组合物的细胞具有高份额和/或频率的幼稚样和/或中枢记忆细胞。在某些实施方案中，输出组合物的细胞具有高份额和/或频率的中枢记忆细胞。在一些实施方案中，输出组合物中至少或为或约30％、至少或为或约40％、至少或为或约50％、至少或为或约60％、至少或为或约70％、至少或为或约75％、至少或为或约80％、至少或为或约85％、至少或为或约90％、至少或为或约95％、或大于95％的细胞具有记忆表型，具有幼稚样或中枢记忆表型，或者是幼稚样或中枢记忆T细胞，或者是中枢记忆T细胞。在某些实施方案中，输出组合物中至少或为或约50％、至少或为或约55％、至少或为或约60％、或至少或为或约65％的CD4+T细胞和CD8+T细胞是幼稚样或中枢记忆T细胞，或是中枢记忆T细胞。在一些实施方案中，输出组合物中至少或为或约30％、至少或为或约40％、至少或为或约50％、至少或为或约60％、至少或为或约70％、至少或为或约75％、至少或为或约80％、至少或为或约85％、至少或为或约90％、至少或为或约95％、或大于95％的CD4+T细胞是幼稚样或中枢记忆CD4+T细胞，或是中枢记忆CD4+T细胞。在某些实施方案中，输出组合物中至少或为或约50％、至少或为或约55％、至少或为或约60％、或至少或为或约65％的CD4+T细胞是幼稚样或中枢记忆CD4+T细胞，或是中枢记忆CD4+T细胞。在某些实施方案中，输出组合物中在为或约40％与为或约65％之间、在为或约40％与为或约45％、在为或约45％与为或约50％、在为或约50％与为或约55％、在为或约55％与为或约60％、或在为或约60％与为或约65％之间的CD4+T细胞是幼稚样或中枢记忆CD4+T细胞。在一些实施方案中，输出组合物中至少或为或约30％、至少或为或约40％、至少或为或约50％、至少或为或约60％、至少或为或约70％、至少或为或约75％、至少或为或约80％、至少或为或约85％、至少或为或约90％、至少或为或约95％、或大于95％的CD4+CAR+T细胞是幼稚样或中枢记忆CD4+CAR+T细胞，或是中枢记忆CD4+CAR+T细胞。在某些实施方案中，输出组合物中至少或为或约50％、至少或为或约55％、至少或为或约60％、或至少或为或约65％的CD4+CAR+T细胞是幼稚样或中枢记忆CD4+CAR+T细胞，或是中枢记忆CD4+CAR+T细胞。在某些实施方案中，输出组合物中在为或约40％与为或约65％之间、在为或约40％与为或约45％之间、在为或约45％与为或约50％之间、在为或约50％与为或约55％之间、在为或约55％与为或约60％之间、或在为或约60％与为或约65％之间的CD4+CAR+T细胞是幼稚样或中枢记忆CD4+CAR+T细胞，或是中枢记忆CD4+CAR+T细胞。在一些实施方案中，输出组合物中至少或为或约30％、至少或为或约40％、至少或为或约50％、至少或为或约60％、至少或为或约70％、至少或为或约75％、至少或为或约80％、至少或为或约85％、至少或为或约90％、至少或为或约95％、或大于95％的CD8+T细胞是幼稚样或中枢记忆CD8+T细胞，或是中枢记忆CD8+T细胞。在某些实施方案中，输出组合物中至少或为或约50％、至少或为或约55％、至少或为或约60％、或至少或为或约65％的CD8+T细胞是幼稚样或中枢记忆CD8+T细胞，或是中枢记忆CD8+T细胞。在某些实施方案中，输出组合物中在为或约40％与为或约65％之间、在为或约40％与为或约45％之间、在为或约45％与为或约50％之间、在为或约50％与为或约55％之间、在为或约55％与为或约60％之间、或在为或约60％与为或约65％之间的CD8+T细胞是幼稚样或中枢记忆CD8+T细胞，或是中枢记忆CD8+T细胞。在一些实施方案中，输出组合物中至少或为或约30％、至少或为或约40％、至少或为或约50％、至少或为或约60％、至少或为或约70％、至少或为或约75％、至少或为或约80％、至少或为或约85％、至少或为或约90％、至少或为或约95％、或大于95％的CD8+CAR+T细胞是幼稚样或中枢记忆CD8+CAR+T细胞，或是中枢记忆CD8+CAR+T细胞。在某些实施方案中，输出组合物中至少或为或约50％、至少或为或约55％、至少或为或约60％、或至少或为或约65％的CD8+CAR+T细胞是幼稚样或中枢记忆CD8+CAR+T细胞，或是中枢记忆CD8+CAR+T细胞。在某些实施方案中，输出组合物中在为或约40％与为或约65％之间、在为或约40％与为或约45％之间、在为或约45％与为或约50％之间、在为或约50％与为或约55％之间、在为或约55％与为或约60％之间、或在为或约60％与为或约65％之间的CD8+CAR+T细胞是幼稚样或中枢记忆CD8+CAR+T细胞，或是中枢记忆CD8+CAR+T细胞。在一些实施方案中，输出组合物中至少或为或约30％、至少或为或约40％、至少或为或约50％、至少或为或约60％、至少或为或约70％、至少或为或约75％、至少或为或约80％、至少或为或约85％、至少或为或约90％、至少或为或约95％、或大于95％的CAR+T细胞(例如，CD4+CAR+T细胞和CD8+CAR+T细胞)是幼稚样或中枢记忆T细胞，或是中枢记忆T细胞。在某些实施方案中，输出组合物中至少或为或约50％、至少或为或约55％、至少或为或约60％、或至少或为或约65％的CAR+T细胞(例如，CD4+CAR+T细胞和CD8+CAR+T细胞)是幼稚样或中枢记忆T细胞，或是中枢记忆T细胞。在一些实施方案中，所述组合物中至少或为或约30％、至少或为或约40％、至少或为或约50％、至少或为或约60％、至少或为或约70％、至少或为或约75％、至少或为或约80％、至少或为或约85％、至少或为或约90％、至少或为或约95％、或大于95％的CAR+T细胞是CD27+、CD28+、CCR7+、CD45RA-、CD45RO+、CD62L+、CD3+、CD95+、颗粒酶B-和/或CD127+的。在一些实施方案中，所述组合物中至少或为或约50％、至少或为或约55％、至少或为或约60％、或至少或为或约65％的CAR+T细胞是CD27+、CD28+、CCR7+、CD45RA-、CD45RO+、CD62L+、CD3+、CD95+、颗粒酶B-和/或CD127+的。

在某些实施方案中，输出组合物中至少或为或约85％的细胞具有幼稚样或中枢记忆表型，或是幼稚样或中枢记忆T细胞。在某些实施方案中，输出组合物中小于或为或约15％的细胞是效应或效应RA表型，或者是效应或效应RA T细胞。在某些实施方案中，输出组合物的细胞具有低份额和/或频率的被耗竭和/或是衰老的细胞。在特定实施方案中，输出组合物的细胞具有低份额和/或频率的被耗竭和/或衰老的细胞。在一些实施方案中，输出组合物中的细胞的小于或小于约40％、小于或小于约35％、小于或小于约30％、小于或小于约25％、小于或小于约20％、小于或小于约15％、小于或小于约10％、小于或小于约5％、或小于或小于约1％被耗竭和/或是衰老的。在某些实施方案中，输出组合物中小于或小于约25％的细胞被耗竭和/或是衰老的。在某些实施方案中，输出组合物中小于或小于约小于或小于约10％的细胞被耗竭和/或是衰老的。

在一些实施方案中，输出组合物的细胞具有低份额和/或频率的对CD27和CD28表达(例如表面表达)呈阴性的细胞。在特定实施方案中，输出组合物的细胞具有低份额和/或频率的CD27-CD28-细胞。在一些实施方案中，输出组合物中的细胞的小于或小于约40％、小于或小于约35％、小于或小于约30％、小于或小于约25％、小于或小于约20％、小于或小于约15％、小于或小于约10％、小于或小于约5％、或小于或小于约1％是CD27-CD28-细胞。在某些实施方案中，输出组合物中小于或小于约25％的细胞是CD27-CD28-细胞。在某些实施方案中，输出组合物中小于或小于约小于或小于约10％的细胞是CD27-CD28-细胞。在实施方案中，输出组合物中小于或小于约5％的细胞是CD27-CD28-细胞。

在某些实施方案中，输出组合物的细胞具有高份额和/或频率的对CD27和CD28表达(例如表面表达)呈阳性的细胞。在一些实施方案中，输出组合物中的细胞具有高份额和/或频率的CD27+CD28+细胞。在一些实施方案中，输出组合物中至少或至少约50％、至少或至少约60％、至少或至少约70％、至少或至少约75％、至少或至少约80％、至少或至少约85％、至少或至少约90％、至少或至少约95％、或大于或大于约95％的细胞是CD27+CD28+细胞。在某些实施方案中，输出组合物中小于或小于约25％的细胞是CD27-CD28-细胞。在某些实施方案中，输出组合物中至少或至少约50％的细胞是CD27+CD28+细胞。在实施方案中，输出组合物中至少或至少约75％的细胞是CD27+CD28+细胞。

在特定实施方案中，输出组合物的细胞具有低份额和/或频率的作为T_EMRA细胞的细胞。在特定实施方案中，输出组合物的细胞具有低份额和/或频率的T_EMRA细胞。在一些实施方案中，输出组合物中的细胞的小于或小于约40％、小于或小于约35％、小于或小于约30％、小于或小于约25％、小于或小于约20％、小于或小于约15％、小于或小于约10％、小于或小于约5％、或小于或小于约1％是T_EMRA细胞。在一些实施方案中，输出组合物中小于或小于约25％的细胞是T_EMRA细胞。在一些实施方案中，输出组合物中小于或小于约10％的细胞是T_EMRA细胞。在一些实施方案中，输出组合物中小于或小于约5％的细胞是T_EMRA细胞。

在某些实施方案中，输出组合物的细胞具有低份额和/或频率的对CCR7表达(例如表面表达)呈阴性并且对CD45RA表达(例如表面表达)呈阳性的细胞。在一些实施方案中，输出组合物的细胞具有低份额和/或频率的CCR7-CD45RA+细胞。在特定实施方案中，输出组合物中小于或小于约40％、小于或小于约35％、小于或小于约30％、小于或小于约25％、小于或小于约20％、小于或小于约15％、小于或小于约10％、小于或小于约5％、或小于或小于约1％的细胞是CCR7-CD45RA+细胞。在一些实施方案中，输出组合物中小于或小于约25％的细胞是CCR7-CD45RA+细胞。在特定实施方案中，输出组合物中小于或小于约小于或小于约10％的细胞是CCR7-CD45RA+细胞。在某些实施方案中，输出组合物中小于或小于约5％的细胞是CCR7-CD45RA+细胞。

在某些实施方案中，输出组合物的细胞具有高份额和/或频率的处于早期分化阶段中的T细胞，或对处于早期分化阶段中的T细胞上表达的标记呈表面阳性的T细胞。在某些实施方案中，输出组合物的细胞中处于早期分化阶段中的T细胞的份额和/或频率大于从替代性过程(诸如涉及扩增的过程(例如包括扩增单元操作和/或包括旨在引起细胞扩增的步骤的过程))产生的输出组合物。在某些实施方案中，处于早期分化阶段中的T细胞的特征可以是某些细胞标记的阳性或高表达(例如，表面表达或细胞内表达)和/或其他细胞标记的阴性或低表达(例如，表面表达或细胞内表达)。在一些方面，处于早期分化阶段中的T细胞的特征为CCR7和/或CD27的阳性或高表达。在某些实施方案中，处于早期分化阶段中的T细胞或对处于早期分化阶段中的T细胞上表达的标记呈表面阳性的T细胞是CCR7+CD27+。

在某些实施方案中，输出组合物的细胞具有低份额和/或频率的处于中期分化阶段中的T细胞，或对处于中期分化阶段中的T细胞上表达的标记呈表面阳性的T细胞。在某些实施方案中，输出组合物的细胞中处于中期分化阶段中的T细胞的份额和/或频率低于从替代性过程(诸如涉及扩增的过程)产生的输出组合物。在某些实施方案中，处于中期分化阶段中的T细胞的特征可以是某些细胞标记的阳性或高表达(例如，表面表达或细胞内表达)和/或其他细胞标记的阴性或低表达(例如，表面表达或细胞内表达)。在某些实施方案中，处于中期分化阶段中的T细胞或对处于中期分化阶段中的T细胞上表达的标记呈表面阳性的T细胞是CCR7+CD27-的。在某些实施方案中，处于中期分化阶段中的T细胞或对处于中期分化阶段中的T细胞上表达的标记呈表面阳性的T细胞是CCR7-CD27+的。在某些实施方案中，处于中期分化阶段中的T细胞或对处于中期分化阶段中的T细胞上表达的标记呈表面阳性的T细胞包括呈CCR7+CD27-的细胞和呈CCR7-CD27+的细胞。

在某些实施方案中，输出组合物的细胞具有低份额和/或频率的高分化的T细胞，或对高分化的T细胞上表达的标记呈表面阳性的T细胞。在某些实施方案中，输出组合物的细胞中高分化的T细胞的份额和/或频率低于从替代性过程(诸如涉及扩增的过程)产生的输出组合物。在某些实施方案中，高分化的T细胞的特征可以是某些细胞标记的阳性或高表达(例如，表面表达或细胞内表达)和/或其他细胞标记的阴性或低表达(例如，表面表达或细胞内表达)。在一些方面，高分化的T细胞的特征为CCR7和/或CD27的阴性或低表达。在某些实施方案中，高分化的T细胞或对高分化的T细胞上表达的标记呈表面阳性的T细胞是CCR7-CD27-的。

在某些实施方案中，输出组合物的细胞中处于早期分化阶段中的T细胞(例如，呈CCR7+CD27+的细胞)的份额和/或频率大于从替代性过程(诸如涉及扩增的过程)产生的输出组合物，处于中期分化阶段中的T细胞(例如，呈CCR7+CD27-的细胞和/或呈CCR7-CD27+的细胞)的份额和/或频率低于所述从替代性过程产生的输出组合物，并且高分化的T细胞(例如，呈CCR7-CD27-的细胞)的份额和/或频率低于所述从替代性过程产生的输出组合物。

在某些实施方案中，输出组合物的细胞中幼稚样细胞和中枢记忆细胞的份额和/或频率大于从替代性过程(诸如涉及扩增的过程)产生的输出组合物。在某些实施方案中，幼稚样细胞和中枢记忆细胞包括处于不同分化状态的细胞，包括处于早期分化阶段中的T细胞，例如，呈CCR7+CD27+的细胞。

在某些实施方案中，输出组合物的细胞具有高份额和/或频率的对CCR7和CD27表达(例如表面表达)呈阳性的细胞。在一些实施方案中，输出组合物中的细胞具有高份额和/或频率的CCR7+CD27+细胞。在某些实施方案中，输出组合物中小于或小于约5％、小于或小于约10％、小于或小于约15％、小于或小于约20％、小于或小于约25％或小于或小于约30％的细胞是CCR7-或CD27-细胞。在一些实施方案中，输出组合物中至少或为或约30％、至少或为或约40％、至少或为或约50％、至少或为或约60％、至少或为或约70％、至少或为或约75％、至少或为或约80％、至少或为或约85％、至少或为或约90％、至少或为或约95％、至少或为或约98％、或大于98％的细胞是CCR7+CD27+的。在某些实施方案中，输出组合物中至少或为或约50％、至少或为或约55％、至少或为或约60％、或至少或为或约65％的CD4+T细胞和CD8+T细胞是CCR7+CD27+的。在一些实施方案中，输出组合物中至少或为或约30％、至少或为或约40％、至少或为或约50％、至少或为或约60％、至少或为或约70％、至少或为或约75％、至少或为或约80％、至少或为或约85％、至少或为或约90％、至少或为或约95％、或大于95％的CD4+T细胞是CCR7+CD27+的。在某些实施方案中，输出组合物中至少或为或约50％、至少或为或约55％、至少或为或约60％、或至少或为或约65％的CD4+T细胞是CCR7+CD27+的。在某些实施方案中，输出组合物中在为或约40％与为或约65％之间、在为或约40％与为或约45％之间、在为或约45％与为或约50％之间、在为或约50％与为或约55％之间、在为或约55％与为或约60％之间、或在为或约60％与为或约65％之间的CD4+T细胞是CCR7+CD27+的。在一些实施方案中，输出组合物中至少或为或约30％、至少或为或约40％、至少或为或约50％、至少或为或约60％、至少或为或约70％、至少或为或约75％、至少或为或约80％、至少或为或约85％、至少或为或约90％、至少或为或约95％、或大于95％的CD4+CAR+T细胞是CCR7+CD27+的。在某些实施方案中，输出组合物中至少或为或约50％、至少或为或约55％、至少或为或约60％、或至少或为或约65％的CD4+CAR+T细胞是CCR7+CD27+的。在某些实施方案中，输出组合物中在为或约40％与为或约65％之间、在为或约40％与为或约45％之间、在为或约45％与为或约50％之间、在为或约50％与为或约55％之间、在为或约55％与为或约60％之间、或在为或约60％与为或约65％之间的CD4+CAR+T细胞是CCR7+CD27+的。在一些实施方案中，输出组合物中至少或为或约30％、至少或为或约40％、至少或为或约50％、至少或为或约60％、至少或为或约70％、至少或为或约75％、至少或为或约80％、至少或为或约85％、至少或为或约90％、至少或为或约95％、或大于95％的CD8+T细胞是CCR7+CD27+的。在某些实施方案中，输出组合物中至少或为或约50％、至少或为或约55％、至少或为或约60％、或至少或为或约65％的CD8+T细胞是CCR7+CD27+的。在某些实施方案中，输出组合物中在为或约40％与为或约65％之间、在为或约40％与为或约45％之间、在为或约45％与为或约50％之间、在为或约50％与为或约55％之间、在为或约55％与为或约60％之间、或在为或约60％与为或约65％之间的CD8+T细胞是CCR7+CD27+的。在一些实施方案中，输出组合物中至少或为或约30％、至少或为或约40％、至少或为或约50％、至少或为或约60％、至少或为或约70％、至少或为或约75％、至少或为或约80％、至少或为或约85％、至少或为或约90％、至少或为或约95％、或大于95％的CD8+CAR+T细胞是CCR7+CD27+的。在某些实施方案中，输出组合物中至少或为或约50％、至少或为或约55％、至少或为或约60％、或至少或为或约65％的CD8+CAR+T细胞是CCR7+CD27+的。在某些实施方案中，输出组合物中在为或约40％与为或约65％之间、在为或约40％与为或约45％之间、在为或约45％与为或约50％之间、在为或约50％与为或约55％之间、在为或约55％与为或约60％之间、或在为或约60％与为或约65％之间的CD8+CAR+T细胞是CCR7+CD27+的。在一些实施方案中，输出组合物中至少或为或约30％、至少或为或约40％、至少或为或约50％、至少或为或约60％、至少或为或约70％、至少或为或约75％、至少或为或约80％、至少或为或约85％、至少或为或约90％、至少或为或约95％、或大于95％的CAR+T细胞(例如，CD4+CAR+T细胞和CD8+CAR+T细胞)是CCR7+CD27+的。在某些实施方案中，输出组合物中至少或为或约50％、至少或为或约55％、至少或为或约60％、或至少或为或约65％的CAR+T细胞(例如，CD4+CAR+T细胞和CD8+CAR+T细胞)是CCR7+CD27+的。在一些实施方案中，所述组合物中至少或为或约30％、至少或为或约40％、至少或为或约50％、至少或为或约60％、至少或为或约70％、至少或为或约75％、至少或为或约80％、至少或为或约85％、至少或为或约90％、至少或为或约95％、或大于95％的CAR+T细胞是CD27+、CD28+、CCR7+、CD45RA-、CD45RO+、CD62L+、CD3+、CD95+、颗粒酶B-和/或CD127+的。在一些实施方案中，所述组合物中至少或为或约50％、至少或为或约55％、至少或为或约60％、或至少或为或约65％的CAR+T细胞是CD27+、CD28+、CCR7+、CD45RA-、CD45RO+、CD62L+、CD3+、CD95+、颗粒酶B-和/或CD127+的。

在一些实施方案中，本文提供治疗性T细胞组合物，其包含和/或富含表达重组受体的CD3+T细胞，其中所述组合物中至少50％、60％、70％、80％或90％的总受体⁺/CD3+细胞是CD27+CCR7+的。在一些实施方案中，所述组合物中至少或至少约80％、至少或至少约85％、至少或至少约90％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、至少或至少约99％、约100％或100％的细胞是CD3+T细胞。在一些实施方案中，所述组合物中至少或至少约90％的细胞是CD3+T细胞，并且所述组合物中至少或至少约40％、50％、60％、70％、80％或90％的总受体⁺/CD3+细胞是CD27+CCR7+的。在一些实施方案中，所述组合物中至少或至少约95％的细胞是CD3+T细胞，并且所述组合物中至少或至少约50％、60％、70％、80％或90％的总受体⁺/CD3+细胞是CD27+CCR7+的。在一些实施方案中，所述组合物中至少或至少约98％的细胞是CD3+T细胞，并且所述组合物中至少或至少约50％、60％、70％、80％或90％的总受体⁺/CD3+细胞是CD27+CCR7+的。在一些实施方案中，所述组合物中至少50％、60％、70％、80％或90％的细胞是CD3+T细胞，并且所述组合物中至少50％的总受体⁺/CD8+细胞是CD27+CCR7+，并且所述组合物中至少50％的总受体⁺/CD4+细胞是CD27+CCR7+的。在一些实施方案中，所述组合物中至少90％的细胞是CD3+T细胞，所述组合物中至少50％、60％、70％、80％或90％的总受体⁺/CD8+细胞是CD27+CCR7+，并且所述组合物中至少50％、60％、70％、80％或90％的总受体⁺/CD4+细胞是CD27+CCR7+的。

在一些实施方案中，本文提供治疗性T细胞组合物，其包含和/或富集表达重组受体的CD3+T细胞，其中所述组合物中至少50％、60％、70％、80％或90％的总受体⁺/CD3+细胞是幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞或者对幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞上表达的标记呈表面阳性。在一些实施方案中，所述组合物中至少或至少约80％、至少或至少约85％、至少或至少约90％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、至少或至少约99％、约100％或100％的细胞是CD3+T细胞。在一些实施方案中，所述组合物中至少或至少约90％的细胞是CD3+T细胞，并且所述组合物中至少或至少约40％、50％、60％、70％、80％或90％的总受体⁺/CD3+细胞是幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞或者对幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞上表达的标记呈表面阳性。在一些实施方案中，所述组合物中至少或至少约95％的细胞是CD3+T细胞，并且所述组合物中至少或至少约50％、60％、70％、80％或90％的总受体⁺/CD3+细胞是幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞或者对幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞上表达的标记呈表面阳性。在一些实施方案中，所述组合物中至少或至少约98％的细胞是CD3+T细胞，并且所述组合物中至少或至少约50％、60％、70％、80％或90％的总受体⁺/CD3+细胞是幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞或者对幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞上表达的标记呈表面阳性。在一些实施方案中，所述组合物中至少50％、60％、70％、80％或90％的细胞是CD3+T细胞，所述组合物中至少50％的总受体⁺/CD8+细胞是幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞或者对幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞上表达的标记呈表面阳性，并且所述组合物中至少50％的总受体⁺/CD4+细胞是幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞或者对幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞上表达的标记呈表面阳性。在一些实施方案中，所述组合物中至少90％的细胞是CD3+T细胞，所述组合物中至少50％、60％、70％、80％或90％的总受体⁺/CD8+细胞是幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞或者对幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞上表达的标记呈表面阳性，并且所述组合物中至少50％、60％、70％、80％或90％的总受体⁺/CD4+细胞是幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞或者对幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞上表达的标记呈表面阳性。

在一些实施方案中，本文提供治疗性T细胞组合物，其包含和/或富集表达重组受体的CD4+T细胞和CD8+T细胞，其中所述组合物中至少50％、60％、70％、80％或90％的总受体⁺/CD4⁺和受体⁺/CD8+细胞是CD27+CCR7+的。在一些实施方案中，所述组合物中至少或至少约80％、至少或至少约85％、至少或至少约90％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、至少或至少约99％、约100％、或100％的细胞是CD4+T细胞和CD8+T细胞。

在一些实施方案中，本文提供治疗性T细胞组合物，其包含和/或富集表达重组受体的CD4+T细胞和CD8+T细胞，其中所述组合物中至少50％、60％、70％、80％或90％的总受体+/CD4+和受体+/CD8+细胞是幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞或者对幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞上表达的标记呈表面阳性。在一些实施方案中，所述组合物中至少或至少约80％、至少或至少约85％、至少或至少约90％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、至少或至少约99％、约100％、或100％的细胞是CD4+T细胞和CD8+T细胞。在一些实施方案中，所述组合物中至少或至少约90％的细胞是CD4+T细胞和CD8+T细胞，并且所述组合物中至少或至少约40％、50％、60％、70％、80％或90％的总受体+/CD4+和受体+/CD8+细胞是幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞或者对幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞上表达的标记呈表面阳性。在一些实施方案中，所述组合物中至少或至少约95％的细胞是CD4+T细胞和CD8+T细胞，并且所述组合物中至少或至少约50％、60％、70％、80％或90％的总受体+/CD4+和受体+/CD8+细胞是幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞或者对幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞上表达的标记呈表面阳性。在一些实施方案中，所述组合物中至少或至少约98％的细胞是CD4+T细胞和CD8+T细胞，并且所述组合物中至少或至少约50％、60％、70％、80％或90％的总受体+/CD4+和受体+/CD8+细胞是幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞或者对幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞上表达的标记呈表面阳性。在一些实施方案中，所述组合物中至少50％、60％、70％、80％或90％的细胞是CD4+T细胞和CD8+T细胞，所述组合物中至少50％的总受体⁺/CD8+细胞是幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞或者对幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞上表达的标记呈表面阳性，并且所述组合物中至少50％的总受体⁺/CD4+细胞是幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞或者对幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞上表达的标记呈表面阳性。在一些实施方案中，所述组合物中至少90％的细胞是CD4+T细胞和CD8+T细胞，所述组合物中至少50％、60％、70％、80％或90％的总受体⁺/CD8+细胞是幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞或者对幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞上表达的标记呈表面阳性，并且所述组合物中至少50％、60％、70％、80％或90％的总受体⁺/CD4+细胞是幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞或者对幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞上表达的标记呈表面阳性。

在某些实施方案中，本文公开治疗性T细胞组合物，其包含表达重组受体的CD4+T细胞和表达重组受体的CD8+T细胞，其中所述组合物中至少50％、60％、70％、80％或90％的总受体⁺/CD8+细胞是CD27+CCR7+的，并且所述组合物中至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的总受体⁺/CD4+细胞是CD27+CCR7+的，其中所述组合物中至少或至少约80％、至少或至少约85％、至少或至少约90％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、至少或至少约99％、约100％、或100％的细胞是CD3+T细胞。在某些实施方案中，本文公开治疗性T细胞组合物，其包含表达重组受体的CD4+T细胞和表达重组受体的CD8+T细胞，其中所述组合物中至少50％、60％、70％、80％或90％的总受体⁺/CD8+细胞是CD27+CCR7+的，并且所述组合物中至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的总受体⁺/CD4+细胞是CD27+CCR7+的，其中所述组合物中至少或至少约80％、至少或至少约85％、至少或至少约90％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、至少或至少约99％、约100％、或100％的细胞是CD4+T细胞和CD8+T细胞。在一些方面，所述组合物中至少或至少约90％的细胞是CD4+T细胞和CD8+T细胞，所述组合物中至少或至少约60％的总受体⁺/CD8+细胞是CD27+CCR7+的，并且治疗性T细胞组合物中至少或至少约40％的总受体⁺/CD4+细胞是CD27+CCR7+的。在一些方面，所述组合物中至少或至少约95％的细胞是CD4+T细胞和CD8+T细胞，所述组合物中至少或至少约65％的总受体⁺/CD8+细胞是CD27+CCR7+的，并且治疗性T细胞组合物中至少或至少约45％的总受体⁺/CD4+细胞是CD27+CCR7+的。在一些方面，所述组合物中至少或至少约98％的细胞是CD4+T细胞和CD8+T细胞，所述组合物中至少或至少约70％、至少或至少约75％、至少或至少约80％、或者至少或至少约85％的总受体⁺/CD8+细胞是CD27+CCR7+的，并且治疗性T细胞组合物中至少或至少约50％、至少或至少约55％、至少或至少约60％、或者至少或至少约65％的总受体⁺/CD4+细胞是CD27+CCR7+的。在一些方面，所述组合物中至少或至少约98％的细胞是CD4+T细胞和CD8+T细胞，所述组合物中至少或至少约75％的总受体⁺/CD8+细胞是CD27+CCR7+的，并且治疗性T细胞组合物中至少或至少约55％的总受体⁺/CD4+细胞是CD27+CCR7+的。在一些方面，所述组合物中至少或至少约98％的细胞是CD4+T细胞和CD8+T细胞，所述组合物中至少或至少约80％的总受体⁺/CD8+细胞是CD27+CCR7+的，并且所述组合物中至少或至少约60％的总受体⁺/CD4+细胞是CD27+CCR7+的。在一些方面，所述组合物中至少或至少约98％的细胞是CD4+T细胞和CD8+T细胞，所述组合物中至少或至少约85％的总受体⁺/CD8+细胞是CD27+CCR7+的，并且所述组合物中至少或至少约65％的总受体⁺/CD4+细胞是CD27+CCR7+的。在一些方面，所述组合物中至少或至少约98％的细胞是CD4+T细胞和CD8+T细胞，所述组合物中至少或至少约90％的总受体⁺/CD8+细胞是CD27+CCR7+的，并且所述组合物中至少或至少约70％的总受体⁺/CD4+细胞是CD27+CCR7+的。在一些方面，所述组合物中至少90％的细胞是CD4+T细胞和CD8+T细胞，所述组合物中至少60％的总受体⁺/CD8+细胞是CD27+CCR7+的，并且所述组合物中至少40％的总受体⁺/CD4+细胞是CD27+CCR7+的。在一些方面，所述组合物中至少90％的细胞是CD4+T细胞和CD8+T细胞，所述组合物中至少70％的总受体⁺/CD8+细胞是CD27+CCR7+的，并且所述组合物中至少50％的总受体⁺/CD4+细胞是CD27+CCR7+的。在一些方面，所述组合物中至少90％的细胞是CD4+T细胞和CD8+T细胞，所述组合物中至少70％的总受体⁺/CD8+细胞是CD27+CCR7+的，并且所述组合物中至少60％的总受体⁺/CD4+细胞是CD27+CCR7+的。在一些方面，所述组合物中至少95％的细胞是CD4+T细胞和CD8+T细胞，所述组合物中至少70％的总受体⁺/CD8+细胞是CD27+CCR7+的，并且所述组合物中至少70％的总受体⁺/CD4+细胞是CD27+CCR7+的。在一些方面，所述组合物中至少95％的细胞是CD4+T细胞和CD8+T细胞，所述组合物中至少80％的总受体⁺/CD8+细胞是CD27+CCR7+的，并且所述组合物中至少80％的总受体⁺/CD4+细胞是CD27+CCR7+的。

在任何前述实施方案中，细胞群或组合物内对一种或多种标记(例如，CD3、CD4、CD8、CD27、CD28、CCR7或CD45RA等)呈阳性/阴性的细胞的百分比可以是来自通过本文所公开方法产生的多种输出组合物的平均、均值或中值百分比。在一些实施方案中，细胞群或组合物内对标记呈阳性的细胞的百分比是来自通过本文所公开方法产生的多种输出组合物的此类百分比的平均值。在一些实施方案中，多种输出组合物是通过本文所公开方法从多种输入组合物产生，所述输入组合物可以源自例如来自同一供体或不同供体的相同生物样品或不同生物样品(例如，PBMC或单采术或白细胞单采术样品)。在一些方面，所述平均值是基于约或至少约5、约或至少约10、约或至少约15、约或至少约20、约或至少约25、约或至少约30、约或至少约35、约或至少约40、约或至少约45、约或至少约50、约或至少约55、约或至少约60、约或至少约100、或者超过约100种通过本文所公开方法产生的输出组合物的多个值。

在一些实施方案中，其中平均而言，在通过所述方法产生的多种输出组合物(例如，约或至少约5种)中，所述组合物中T细胞的总数量或所述组合物中表达重组蛋白的T细胞的总数量的至少或至少约或者为或约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％是CD4+T细胞和CD8+T细胞。在一些实施方案中，平均而言，在通过所述方法产生的多种输出组合物(例如，约或至少约5种)中，所述组合物中至少50％、60％、70％、80％或90％的总受体⁺/CD4+和受体⁺/CD8+细胞是幼稚样T细胞或者对幼稚样T细胞上表达的标记呈表面阳性(例如，CD27+CCR7+细胞)。在一些实施方案中，多种(例如，约或至少约5种)通过本文所公开方法产生的输出组合物在所述组合物的总受体⁺/CD4+和受体⁺/CD8+细胞中平均包含至少50％、60％、70％、80％或90％的幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞或者对幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞上表达的标记呈表面阳性。在一些实施方案中，多种(例如，约或至少约5种)通过本文所公开方法产生的输出组合物在所述组合物的总受体⁺/CD4+和受体⁺/CD8+细胞中平均包含至少50％、60％、70％、80％或90％的CD27+CCR7+细胞。在一些实施方案中，多种(例如，约或至少约5种)通过本文所公开方法产生的输出组合物平均包含至少或至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的CD3+T细胞。在一些实施方案中，多种(例如，约或至少约5种)通过本文所公开方法产生的输出组合物在所述组合物的总受体⁺/CD3+细胞中平均包含至少50％、60％、70％、80％或90％的幼稚样T细胞或者对幼稚样T细胞(例如，CD27+CCR7+细胞)上表达的标记呈表面阳性。在一些实施方案中，多种(例如，约或至少约5种)通过本文所公开方法产生的输出组合物在所述组合物的总受体⁺/CD3+细胞中平均包含至少50％、60％、70％、80％或90％的幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞或者对幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞上表达的标记呈表面阳性。在一些实施方案中，多种(例如，约或至少约5种)通过本文所公开方法产生的输出组合物在所述组合物的总受体⁺/CD3+细胞中平均包含至少50％、60％、70％、80％或90％的CD27+CCR7+细胞。

在一些实施方案中，所述组合物包含具有整合到T细胞基因组中的编码抗BCMACAR的异源或重组多核苷酸的T细胞。在特定实施方案中，所述组合物中细胞的整合载体拷贝数(iVCN)平均为每个二倍体基因组约或至少0.1、0.5、1、2、3、4、5或大于5。在特定实施方案中，所述组合物中的CAR+细胞的iVCN平均在或在约每个二倍体基因组0.4个拷贝与每个二倍体基因组3.0个拷贝之间，包含端值。在特定实施方案中，所述组合物中的CAR+细胞的iVCN平均为每个二倍体基因组约0.4、约0.5、约0.6、约0.7、约0.8、约0.9、约1.0、约1.1、约1.2、约1.3、约1.4、约1.5、约1.6、约1.7、约1.8、约1.9、约2.0、约2.1、约2.2、约2.3、约2.4、约2.5、约2.6、约2.7、约2.8、约2.9或约3.0个拷贝，包含端值。

在某些实施方案中，转化细胞群的二倍体基因组中的iVCN与总载体拷贝数(VCN)的分数平均小于或小于约0.9，例如为至少或为约0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9，或在其容许误差内，例如±25％、±20％、±15％、±10％、±5％或±1％。在某些实施方案中，转化细胞群的二倍体基因组中的iVCN与总载体拷贝数(VCN)的分数平均为或为约0.8或在其容许误差内。

在一些实施方案中，所述组合物中细胞的总载体拷贝数(VCN)平均为小于或小于约20、18、16、14、12、10、9、8、7、6、5、4、3或2个拷贝，包含端值。在一些实施方案中，所述组合物中CD3+细胞的总载体拷贝数(VCN)平均为小于或小于约20、18、16、14、12、10、9、8、7、6、5、4、3或2个拷贝，包含端值。在一些实施方案中，所述组合物中CD3+CAR+细胞的总载体拷贝数(VCN)平均为小于或小于约20、18、16、14、12、10、9、8、7、6、5、4、3或2个拷贝，包含端值。

在一些实施方案中，所述组合物包含残留的刺激试剂，例如根据章节II-C-6中所述的任何方法未去除的刺激试剂。在一些实施方案中，残留的刺激试剂包括章节II-C-2中所述的任何寡聚刺激试剂。在一些实施方案中，残留的刺激试剂包括章节II-C-2中所述的任何寡聚链霉亲和素突变蛋白试剂。在一些实施方案中，所述组合物含有在或在约50与2000ng/mL之间的残留刺激试剂，诸如在或在约50与1900ng/mL之间、50与1800ng/mL之间、50与1700ng/mL之间、50与1600ng/mL之间、50与1500ng/mL之间、50与1400ng/mL之间、50与1300ng/mL之间、50与1200ng/mL之间、50与1100ng/mL之间、50与1000ng/mL之间、50与900ng/mL之间、50与800ng/mL之间、50与700ng/mL之间、50与600ng/mL之间、50与500ng/mL之间、50与400ng/mL之间、50与300ng/mL之间、50与200ng/mL之间、50与100ng/mL之间、100与2000ng/mL之间、100与1900ng/mL之间、100与1800ng/mL之间、100与1700ng/mL之间、100与1600ng/mL之间、100与1500ng/mL之间、100与1400ng/mL之间、100与1300ng/mL之间、100与1200ng/mL之间、100与1100ng/mL之间、100与1000ng/mL之间、100与900ng/mL之间、100与800ng/mL之间、100与700ng/mL之间、100与600ng/mL之间、100与500ng/mL之间、100与400ng/mL之间、100与300ng/mL之间、100与200ng/mL之间、200与2000ng/mL之间、200与1900ng/mL之间、200与1800ng/mL之间、200与1700ng/mL之间、200与1600ng/mL之间、200与1500ng/mL之间、200与1400ng/mL之间、200与1300ng/mL之间、200与1200ng/mL之间、200与1100ng/mL之间、200与1000ng/mL之间、200与900ng/mL之间、200与800ng/mL之间、200与700ng/mL之间、200与600ng/mL之间、200与500ng/mL之间、200与400ng/mL之间、200与300ng/mL之间、300与2000ng/mL之间、300与1900ng/mL之间、300与1800ng/mL之间、300与1700ng/mL之间、300与1600ng/mL之间、300与1500ng/mL之间、300与1400ng/mL之间、300与1300ng/mL之间、300与1200ng/mL之间、300与1100ng/mL之间、300与1000ng/mL之间、300与900ng/mL之间、300与800ng/mL之间、300与700ng/mL之间、300与600ng/mL之间、300与500ng/mL之间、300与400ng/mL之间、400与2000ng/mL之间、400与1900ng/mL之间、400与1800ng/mL之间、400与1700ng/mL之间、400与1600ng/mL之间、400与1500ng/mL之间、400与1400ng/mL之间、400与1300ng/mL之间、400与1200ng/mL之间、400与1100ng/mL之间、400与1000ng/mL之间、400与900ng/mL之间、400与800ng/mL之间、400与700ng/mL之间、400与600ng/mL之间、400与500ng/mL之间、500与2000ng/mL之间、500与1900ng/mL之间、500与1800ng/mL之间、500与1700ng/mL之间、500与1600ng/mL之间、500与1500ng/mL之间、500与1400ng/mL之间、500与1300ng/mL之间、500与1200ng/mL之间、500与1100ng/mL之间、500与1000ng/mL之间、500与900ng/mL之间、500与800ng/mL之间、500与700ng/mL之间、500与600ng/mL之间、600与2000ng/mL之间、600与1900ng/mL之间、600与1800ng/mL之间、600与1700ng/mL之间、600与1600ng/mL之间、600与1500ng/mL之间、600与1400ng/mL之间、600与1300ng/mL之间、600与1200ng/mL之间、600与1100ng/mL之间、600与1000ng/mL之间、600与900ng/mL之间、600与800ng/mL之间、600与700ng/mL之间、700与2000ng/mL之间、700与1900ng/mL之间、700与1800ng/mL之间、700与1700ng/mL之间、700与1600ng/mL之间、700与1500ng/mL之间、700与1400ng/mL之间、700与1300ng/mL之间、700与1200ng/mL之间、700与1100ng/mL之间、700与1000ng/mL之间、700与900ng/mL之间、700与800ng/mL之间、800与2000ng/mL之间、800与1900ng/mL之间、800与1800ng/mL之间、800与1700ng/mL之间、800与1600ng/mL之间、800与1500ng/mL之间、800与1400ng/mL之间、800与1300ng/mL之间、800与1200ng/mL之间、800与1100ng/mL之间、800与1000ng/mL之间、800与900ng/mL之间、900与2000ng/mL之间、900与1900ng/mL之间、900与1800ng/mL之间、900与1700ng/mL之间、900与1600ng/mL之间、900与1500ng/mL之间、900与1400ng/mL之间、900与1300ng/mL之间、900与1200ng/mL之间、900与1100ng/mL之间、900与1000ng/mL之间、1000与2000ng/mL之间、1000与1900ng/mL之间、1000与1800ng/mL之间、1000与1700ng/mL之间、1000与1600ng/mL之间、1000与1500ng/mL之间、1000与1400ng/mL之间、1000与1300ng/mL之间、1000与1200ng/mL之间、1000与1100ng/mL之间、1100与2000ng/mL之间、1100与1900ng/mL之间、1100与1800ng/mL之间、1100与1700ng/mL之间、1100与1600ng/mL之间、1100与1500ng/mL之间、1100与1400ng/mL之间、1100与1300ng/mL之间、1100与1200ng/mL之间、1200与2000ng/mL之间、1200与1900ng/mL之间、1200与1800ng/mL之间、1200与1700ng/mL之间、1200与1600ng/mL之间、1200与1500ng/mL之间、1200与1400ng/mL之间、1200与1300ng/mL之间、1300与2000ng/mL之间、1300与1900ng/mL之间、1300与1800ng/mL之间、1300与1700ng/mL之间、1300与1600ng/mL之间、1300与1500ng/mL之间、1300与1400ng/mL之间、1400与2000ng/mL之间、1400与1900ng/mL之间、1400与1800ng/mL之间、1400与1700ng/mL之间、1400与1600ng/mL之间、1400与1500ng/mL之间、1500与2000ng/mL之间、1500与1900ng/mL之间、1500与1800ng/mL之间、1500与1700ng/mL之间、1500与1600ng/mL之间、1600与2000ng/mL之间、1600与1900ng/mL之间、1600与1800ng/mL之间、1600与1700ng/mL之间、1700与2000ng/mL之间、1700与1900ng/mL之间、1700与1800ng/mL之间、1800与2000ng/mL之间、1800与1900ng/mL之间、或1900与2000ng/mL之间，每个都包含端值。

本文还公开了一种治疗多发性骨髓瘤(MM)的方法，所述方法包括向患有或怀疑患有MM的受试者施用包含表达靶向BCMA的CAR的工程化T细胞的组合物，其中所施用的组合通过产生展现出预定特征的输出组合物的制造过程产生，其中当在多名不同的单独受试者中进行时，所述制造过程的迭代任选地从人生物样品产生多种所述输出组合物，其中在所述多种输出组合物中的输出组合物的预定特征选自任何组合的在章节III中公开的组合物特征，包括CD3+细胞的百分比、CD4+/CD8+或CD4CAR+/CD8+CD8+细胞的比率、表达凋亡标记的细胞的百分比、分化程度较低的细胞的百分比以及iVCN和iVCN/VCN值。

IV.定义

除非另外定义，否则本文使用的所有领域术语、符号和其他技术和科学术语或命名旨在具有与所要求保护的主题所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。在一些情况下，为了清楚和/或为了便于参考而在本文中定义具有通常理解的含义的术语，并且本文中包含的此类定义不应被解释为表示与本领域通常理解的实质性差异。

术语“多肽”与“蛋白质”可互换使用以指代氨基酸残基的聚合物，并且不限于最小长度。多肽(包括所提供的受体和其他多肽，例如接头或肽)可以包括氨基酸残基，包括天然和/或非天然氨基酸残基。所述术语还包括多肽的表达后修饰，例如糖基化、唾液酸化、乙酰化和磷酸化。在一些方面，多肽可以含有关于自然或天然序列的修饰，只要蛋白质维持所需活性即可。这些修饰可能是故意的(如通过定点诱变)，或者可能是偶然的(诸如通过产生所述蛋白质的宿主的突变或由于PCR扩增引起的错误)。

如本文所用，“受试者”是哺乳动物，诸如人或其他动物，并且通常是人。在一些实施方案中，被施用一种或多种药剂、细胞、细胞群或组合物的受试者(例如，患者)是哺乳动物，通常是灵长类动物，诸如人。在一些实施方案中，所述灵长类动物是猴或猿。所述受试者可以是雄性或雌性，并且可以处于任何合适的年龄，包括婴儿、幼年、青春期、成年和老年受试者。在一些实施方案中，所述受试者是非灵长类哺乳动物，诸如啮齿动物。

如本文所用，“治疗(treatment)”(及其语法变体诸如“治疗”(“treat”或“treating”))是指疾病或病症或障碍或者与之相关的症状、不良效应或结局或表型的完全或部分改善或减轻。理想的治疗效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、症状的缓解、疾病的任何直接或间接病理后果的减少、预防转移、降低疾病进展的速度、改善或缓解疾病状态以及缓解或改善预后。所述术语并不暗示完全治愈疾病或完全消除任何症状或对所有症状或结局的影响。

如本文所用，“延迟疾病的发生”意指推迟、阻碍、减缓、延缓、稳定、抑制和/或延期疾病(诸如癌症)的发生。此延迟可以具有不同的时间长度，这取决于病史和/或所治疗的个体。在一些实施方案中，足够或显著的延迟实际上可以涵盖预防，因为个体不会患上疾病。例如，可能延迟晚期癌症，诸如转移的发展。

如本文所用，“预防”包括提供关于受试者的疾病的发生或复发的预防，所述受试者可能易患所述疾病但尚未被诊断患有所述疾病。在一些实施方案中，所提供的细胞和组合物用于延迟疾病的发展或延缓疾病的进展。

如本文所用的，“抑制”功能或活性是当与除了目标条件或参数之外在其他方面相同的条件相比时，或者可替代地，与另一种情况相比时，减少功能或活性。例如，与不存在所述细胞的情况下的肿瘤生长速率相比，抑制肿瘤生长的细胞降低了肿瘤的生长速率。

在施用的情况下，药剂(例如，药物配制品、细胞或组合物)的“有效量”是指在必要的剂量/量下和必要的时间段内有效实现所需结果(诸如治疗或预防结果)的量。

药剂(例如，药物配制品或细胞)的“治疗有效量”是指在所需剂量下和所需时间段中有效实现所需治疗结果(诸如针对疾病、病症或障碍的治疗)和/或治疗的药代动力学或药效学作用的量。治疗有效量可以根据诸如疾病状态、受试者的年龄、性别和体重和所施用的细胞群等因素而变化。在一些实施方案中，所提供的方法涉及以有效量(例如，治疗有效量)施用细胞和/或组合物。

“预防有效量”是指在必要的剂量和持续必要的时间段的情况下能有效实现所需预防结果的量。通常但不是必须的，因为预防剂量是在疾病之前或早期在受试者体内使用的，所以预防有效量将小于治疗有效量。在肿瘤负荷较低的情况下，在一些方面，预防有效量将高于治疗有效量。

如本文所用的术语“约”是指本技术领域的技术人员容易知道的相应值的常用误差范围。本文对“约”某一值或参数的提及包括(并描述)针对所述值或参数本身的实施方案。

除非上下文明确指示其他含义，否则如本文所用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指代物。例如，“一种/个(a或an)”意指“至少一种/个”或“一种/个或多种/个”。

贯穿本公开文本，所要求保护的主题的各个方面以范围形式呈现。应理解的是，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，并且不应该被解释为对所要求保护的主题的范围的不能转变的限制。因此，应该认为范围的描述具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的单个数值。例如，在提供了值的范围的情况下，应理解，在该范围的上限和下限之间的每个中间值以及在所陈述范围内的任何其他所述或中间值涵盖在所要求保护的主题内。这些较小范围的上限和下限可以独立地被包括在该较小范围内，并且也涵盖在所要求保护的主题内，受制于在所陈述范围内任何确切排除的限制。在所陈述范围包括限制中的一者或两者的情况下，排除了那些包括的限制中的任一者或两者的范围也包括在所要求保护的主题内。无论范围的宽度如何，这都适用。

如本文所用，所述组合物是指两种或更多种产物、物质或化合物(包括细胞)的任何混合物。其可以是溶液、悬浮液、液体、粉末、糊剂、水性、非水性或其任何组合。

如本文所用，当提及一种或多种特定细胞类型或细胞群时，“富集”是指例如与所述组合物中的总细胞数或组合物体积相比，或者相对于其他细胞类型，诸如通过基于所述群体或细胞表达的标记的阳性选择，或通过基于在要耗尽的所述细胞群或细胞上不存在的标记的阴性选择，增加所述细胞类型或群体的数量或百分比。所述术语不需要从组合物完全去除其他细胞、细胞类型或群体，并且不需要如此富集的细胞在被富集组合物中以等于或甚至接近100％存在。

如本文所用，细胞或细胞群对特定标记呈“阳性”的陈述是指特定标记(通常为表面标记)在细胞上或细胞中的可检测的存在。当提及表面标记时，所述术语是指如通过流式细胞术(例如通过用特异性地结合至所述标记的抗体染色并检测所述抗体)所检测的表面表达的存在，其中所述染色可通过流式细胞术以如下水平检测到：显著高于在其他都相同的条件下用同种型匹配的对照或荧光减一(FMO)门控对照通过实施相同程序检测到的染色的水平，和/或与已知对所述标记呈阳性的细胞的水平基本上相似的水平，和/或显著高于已知对所述标记呈阴性的细胞的水平的水平。

如本文所用，细胞或细胞群对特定标记呈“阴性”的陈述是指特定标记(通常为表面标记)在细胞上或细胞中不存在实质上可检测的存在。当提及表面标记时，所述术语是指如通过流式细胞术(例如通过用特异性地结合至所述标记的抗体染色并检测所述抗体)所检测的表面表达的不存在，其中所述染色未通过流式细胞术以如下水平检测到：显著高于在其他都相同的条件下用同种型匹配的对照或荧光减一(FMO)门控对照通过实施相同程序检测到的染色的水平，和/或显著低于已知对所述标记呈阳性的细胞的水平的水平，和/或与已知对所述标记呈阴性的细胞的水平基本上相似的水平。

如本文所用，术语“载体”是指能传播其所连接的另一核酸分子的核酸分子。所述术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及掺入已引入其的宿主细胞基因组中的载体。某些载体能够指导它们可操作地连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。

V.示例性实施方案

1.一种治疗多发性骨髓瘤(MM)的方法，所述方法包括向患有或怀疑患有MM的受试者施用组合物，所述组合物包含表达靶向B细胞成熟抗原(BCMA)的嵌合抗原受体(CAR)的工程化T细胞，其中：

所述组合物包含表达所述CAR的CD4⁺T细胞和表达所述CAR的CD8⁺T细胞；

所述组合物包含在为或约5×10⁶个CAR表达T细胞与为或约200×10⁶个之间的CAR表达T细胞，包含端值；并且

所述组合物中至少或至少约80％的细胞是CD3⁺细胞。

2.一种治疗多发性骨髓瘤(MM)的方法，所述方法包括向患有或怀疑患有MM的受试者施用组合物，所述组合物包含表达靶向B细胞成熟抗原(BCMA)的嵌合抗原受体(CAR)的工程化T细胞，其中：

所述组合物包含在约1:2.5与约5:1之间的比率的表达所述CAR的CD4⁺T细胞和表达所述CAR的CD8⁺T细胞；

所述组合物包含在为或约5×10⁶个CAR表达T细胞与为或约200×10⁶个之间的CAR表达T细胞，包含端值；

所述组合物中至少或至少约90％的细胞是CD3⁺细胞。

3.一种治疗多发性骨髓瘤(MM)的方法，所述方法包括向患有或怀疑患有MM的受试者施用组合物，所述组合物包含表达靶向B细胞成熟抗原(BCMA)的嵌合抗原受体(CAR)的工程化T细胞，其中：

所述组合物包含表达所述CAR的CD8⁺T细胞和表达所述CAR的CD4⁺T细胞；

所述组合物中至少或至少约80％的细胞是CD3⁺细胞；并且

所述组合物中至少或至少约80％的CAR⁺T细胞具有幼稚样或中枢记忆表型。

4.一种治疗多发性骨髓瘤(MM)的方法，所述方法包括向患有或怀疑患有MM的受试者施用组合物，所述组合物包含表达靶向B细胞成熟抗原(BCMA)的嵌合抗原受体(CAR)的工程化T细胞，其中：

所述组合物中至少或至少约80％的细胞是CD3⁺细胞；并且

所述组合物中至少或至少约50％的CD4⁺CAR⁺T细胞是CD27⁺CCR7⁺的，和/或所述组合物中至少或至少约50％的CD8⁺CAR⁺T细胞是CD27⁺CCR7⁺的。

5.一种治疗多发性骨髓瘤(MM)的方法，所述方法包括向患有或怀疑患有MM的受试者施用组合物，所述组合物包含表达靶向B细胞成熟抗原(BCMA)的嵌合抗原受体(CAR)的工程化T细胞，其中：

所述组合物中至少或至少约80％的细胞是CD3⁺细胞；并且

所述组合物中的所述CAR⁺T细胞中的整合载体拷贝数(iVCN)与总VCN的分数平均小于或小于约0.9。

6.一种治疗多发性骨髓瘤(MM)的方法，所述方法包括向患有或怀疑患有MM的受试者施用组合物，所述组合物包含表达靶向B细胞成熟抗原(BCMA)的嵌合抗原受体(CAR)的工程化T细胞，其中：

所述组合物中至少或至少约80％的细胞是CD3⁺细胞；并且

所述组合物中的所述CAR⁺T细胞的整合载体拷贝数(iVCN)平均在或在约每个二倍体基因组0.4个拷贝与每个二倍体基因组2.0个拷贝之间，包含端值。

7.根据实施方案1-6中任一项所述的方法，其中所述组合物包含在为或约50×10⁶个CAR表达T细胞与为或约200×10⁶个之间的CAR表达T细胞，包含端值。

8.根据实施方案1-6中任一项所述的方法，其中所述组合物包含在为或约70×10⁶个与为或约200×10⁶个之间的CAR表达T细胞，包含端值。

9.根据实施方案1-6中任一项所述的方法，其中所述组合物包含在为或约80×10⁶个CAR表达T细胞与为或约200×10⁶个之间的CAR表达T细胞，包含端值。

10.根据实施方案1-6中任一项所述的方法，其中所述组合物包含在为或约80×10⁶个CAR表达T细胞与为或约160×10⁶个之间的CAR表达T细胞，包含端值。

11.一种治疗多发性骨髓瘤(MM)的方法，所述方法包括向患有或怀疑患有MM的受试者施用组合物，所述组合物包含表达靶向B细胞成熟抗原(BCMA)的嵌合抗原受体(CAR)的工程化T细胞，其中：

所述组合物包含在为或约5×10⁶个CAR表达T细胞与为或约40×10⁶个之间的CAR表达T细胞，包含端值；并且

所述组合物中至少或至少约80％的细胞是CD3⁺细胞。

12.一种治疗多发性骨髓瘤(MM)的方法，所述方法包括向患有或怀疑患有MM的受试者施用组合物，所述组合物包含表达靶向B细胞成熟抗原(BCMA)的嵌合抗原受体(CAR)的工程化T细胞，其中：

所述组合物包含在为或约5×10⁶个CAR表达T细胞与为或约80×10⁶个之间的CAR表达T细胞，包含端值；

所述组合物中至少或至少约90％的细胞是CD3⁺细胞。

13.一种治疗多发性骨髓瘤(MM)的方法，所述方法包括向患有或怀疑患有MM的受试者施用组合物，所述组合物包含表达靶向B细胞成熟抗原(BCMA)的嵌合抗原受体(CAR)的工程化T细胞，其中：

所述组合物包含在为或约5×10⁶个CAR表达T细胞与为或约10×10⁶个之间的CAR表达T细胞，包含端值；并且

所述组合物中至少或至少约80％的细胞是CD3⁺细胞。

14.一种治疗多发性骨髓瘤(MM)的方法，所述方法包括向患有或怀疑患有MM的受试者施用组合物，所述组合物包含表达靶向B细胞成熟抗原(BCMA)的嵌合抗原受体(CAR)的工程化T细胞，其中：

所述组合物中至少或至少约80％的细胞是CD3⁺细胞；并且

15.一种治疗多发性骨髓瘤(MM)的方法，所述方法包括向患有或怀疑患有MM的受试者施用组合物，所述组合物包含表达靶向B细胞成熟抗原(BCMA)的嵌合抗原受体(CAR)的工程化T细胞，其中：

所述组合物包含在为或约5×10⁶个CAR表达T细胞与为或约100×10⁶个之间的CAR表达T细胞，包含端值；

所述组合物中至少或至少约80％的细胞是CD3⁺细胞；并且

16.一种治疗多发性骨髓瘤(MM)的方法，所述方法包括向患有或怀疑患有MM的受试者施用组合物，所述组合物包含表达靶向B细胞成熟抗原(BCMA)的嵌合抗原受体(CAR)的工程化T细胞，其中：

所述组合物包含在为或约5×10⁶个CAR表达T细胞与为或约20×10⁶个之间的CAR表达T细胞，包含端值；

所述组合物中至少或至少约80％的细胞是CD3⁺细胞；

并且

17.一种治疗多发性骨髓瘤(MM)的方法，所述方法包括向患有或怀疑患有MM的受试者施用组合物，所述组合物包含表达靶向B细胞成熟抗原(BCMA)的嵌合抗原受体(CAR)的工程化T细胞，其中：

所述组合物中至少或至少约80％的细胞是CD3⁺细胞；并且

18.一种治疗多发性骨髓瘤(MM)的方法，所述方法包括向患有或怀疑患有MM的受试者施用组合物，所述组合物包含表达靶向B细胞成熟抗原(BCMA)的嵌合抗原受体(CAR)的工程化T细胞，其中：

所述组合物中至少或至少约80％的细胞是CD3⁺细胞；并且

19.根据实施方案1-18中任一项所述的方法，其中所述组合物包含在约1:2与约4:1之间、在约1:1.5与约2:1之间或为或为约1:1的比率的表达所述CAR的CD4⁺T细胞和表达所述CAR的CD8⁺T细胞。

20.根据实施方案1-18中任一项所述的方法，其中所述组合物包含在约5:1与约2:1之间、在约4:1与约2:1之间、在约3:1与约2:1之间、为或为约5:1、为或为约4:1、为或为约3:1或为或为约2:1的比率的表达所述CAR的CD4⁺T细胞和表达所述CAR的CD8⁺T细胞。

21.根据实施方案1-6和11-20中任一项所述的方法，其中所述组合物包含在为或约5×10⁶个CAR表达T细胞与为或约10×10⁶个之间的CAR表达T细胞，包含端值。

22.根据实施方案1-6和11-20中任一项所述的方法，其中所述组合物包含在为或约10×10⁶个与为或约20×10⁶个之间的CAR表达T细胞，包含端值。

23.根据实施方案1-6和11-20中任一项所述的方法，其中所述组合物包含为或约20×10⁶个CAR表达T细胞。

24.根据实施方案1-6和11-20中任一项所述的方法，其中所述组合物包含为或约30×10⁶个CAR表达T细胞。

25.根据实施方案1-6和11-20中任一项所述的方法，其中所述组合物包含为或约40×10⁶个CAR表达T细胞。

26.根据实施方案1-25中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、或至少或至少约96％的细胞是CD3⁺细胞。

27.根据实施方案1-26中任一项所述的方法，其中所述组合物中在为或约2％与为或约30％之间的CAR⁺T细胞表达凋亡标记，任选地膜联蛋白V或活性半胱天冬酶3。

28.根据实施方案1-26中任一项所述的方法，其中所述组合物中在为或约5％与为或约10％之间的CAR⁺T细胞表达凋亡标记，任选地膜联蛋白V或活性半胱天冬酶3。

29.根据实施方案1-26中任一项所述的方法，其中所述组合物中在为或约10％与为或约15％之间的CAR⁺T细胞表达凋亡标记，任选地膜联蛋白V或活性半胱天冬酶3。

30.根据实施方案1-26中任一项所述的方法，其中所述组合物中在为或约15％与为或约20％之间的CAR⁺T细胞表达凋亡标记，任选地膜联蛋白V或活性半胱天冬酶3。

31.根据实施方案1-26中任一项所述的方法，其中所述组合物中在为或约20％与为或约30％之间的CAR⁺T细胞表达凋亡标记，任选地膜联蛋白V或活性半胱天冬酶3。

32.根据实施方案1-26中任一项所述的方法，其中所述组合物中为或约5％、为或约10％、为或约15％、为或约20％、为或约25％、或为或约30％的CAR⁺T细胞表达凋亡标记，任选地膜联蛋白V或活性半胱天冬酶3。

33.根据实施方案1-32中任一项所述的方法，其中所述组合物中在为或约80％与为或约85％之间的CAR⁺T细胞具有幼稚样或中枢记忆表型。

34.根据实施方案1-32中任一项所述的方法，其中所述组合物中在为或约85％与为或约90％之间的CAR⁺T细胞具有幼稚样或中枢记忆表型。

35.根据实施方案1-32中任一项所述的方法，其中所述组合物中在为或约90％与为或约95％之间的CAR⁺T细胞具有幼稚样或中枢记忆表型。

36.根据实施方案1-32中任一项所述的方法，其中所述组合物中在为或约95％与为或约99％之间的CAR⁺T细胞具有幼稚样或中枢记忆表型。

37.根据实施方案1-32中任一项所述的方法，其中所述组合物中为或约85％、为或约90％、为或约95％、或为或约99％的CAR⁺T细胞具有幼稚样或中枢记忆表型。

38.根据实施方案1-37中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少或至少约80％的CAR⁺T细胞对在幼稚样或中枢记忆T细胞上表达的标记呈表面阳性。

39.根据实施方案38所述的方法，其中所述在幼稚样或中枢记忆T细胞上表达的标记选自CD45RA、CD27、CD28和CCR7。

40.根据实施方案1-39中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少或至少约80％的CAR⁺T细胞为CCR7⁺CD45RA⁺、CD27⁺CCR7⁺和/或CD62L^-CCR7⁺的。

41.根据实施方案1-40中任一项所述的方法，其中所述组合物中在为或约80％与为或约85％之间、在为或约85％与为或约90％之间、在为或约90％与为或约95％之间、在为或约95％与为或约99％之间的CAR⁺T细胞为CCR7⁺CD45RA⁺、CD27⁺CCR7⁺和/或CD62L^-CCR7⁺的。

42.根据实施方案1-41中任一项所述的方法，其中所述组合物中为或约80％、为或约85％、为或约90％、为或约95％、或为或约99％的CAR⁺T细胞为CCR7⁺CD45RA⁺、CD27⁺CCR7⁺和/或CD62L^-CCR7⁺的。

43.根据实施方案1-42中任一项所述的方法，其中所述组合物中为或约80％、为或约85％、为或约90％、为或约95％、或为或约99％的CAR⁺T细胞为CD27⁺CCR7⁺的。

44.根据实施方案1-43中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少或至少约50％的CD4⁺CAR⁺T细胞为CCR7⁺CD45RA⁺或CCR7⁺CD45RA^-的。

45.根据实施方案1-43中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少或至少约60％的CD4⁺CAR⁺T细胞为CCR7⁺CD45RA⁺或CCR7⁺CD45RA^-的。

46.根据实施方案1-43中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少或至少约70％的CD4⁺CAR⁺T细胞为CCR7⁺CD45RA⁺或CCR7⁺CD45RA^-的。

47.根据实施方案1-43中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少或至少约80％的CD4⁺CAR⁺T细胞为CCR7⁺CD45RA⁺或CCR7⁺CD45RA^-的。

48.根据实施方案1-43中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少或至少约85％的CD4⁺CAR⁺T细胞为CCR7⁺CD45RA⁺或CCR7⁺CD45RA^-的。

49.根据实施方案1-48中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少或至少约50％的CD4⁺CAR⁺T细胞为CD27⁺CCR7⁺的。

50.根据实施方案1-48中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少或至少约60％的CD4⁺CAR⁺T细胞为CD27⁺CCR7⁺的。

51.根据实施方案1-48中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少或至少约70％的CD4⁺CAR⁺T细胞为CD27⁺CCR7⁺的。

52.根据实施方案1-48中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少或至少约80％的CD4⁺CAR⁺T细胞为CD27⁺CCR7⁺的。

53.根据实施方案1-48中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少或至少约85％的CD4⁺CAR⁺T细胞为CD27⁺CCR7⁺的。

54.根据实施方案1-53中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少或至少约50％的CD8⁺CAR⁺T细胞为CCR7⁺CD45RA⁺或CCR7⁺CD45RA^-的。

55.根据实施方案1-53中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少或至少约60％的CD8⁺CAR⁺T细胞为CCR7⁺CD45RA⁺或CCR7⁺CD45RA^-的。

56.根据实施方案1-53中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少或至少约70％的CD8⁺CAR⁺T细胞为CCR7⁺CD45RA⁺或CCR7⁺CD45RA^-的。

57.根据实施方案1-53中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少或至少约80％的CD8⁺CAR⁺T细胞为CCR7⁺CD45RA⁺或CCR7⁺CD45RA^-的。

58.根据实施方案1-53中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少或至少约85％的CD8⁺CAR⁺T细胞为CCR7⁺CD45RA⁺或CCR7⁺CD45RA^-的。

59.根据实施方案1-58中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少或至少约50％的CD8⁺CAR⁺T细胞为CD27⁺CCR7⁺的。

60.根据实施方案1-58中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少或至少约60％的CD8⁺CAR⁺T细胞为CD27⁺CCR7⁺的。

61.根据实施方案1-58中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少或至少约70％的CD8⁺CAR⁺T细胞为CD27⁺CCR7⁺的。

62.根据实施方案1-58中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少或至少约80％的CD8⁺CAR⁺T细胞为CD27⁺CCR7⁺的。

63.根据实施方案1-58中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少或至少约85％的CD8⁺CAR⁺T细胞为CD27⁺CCR7⁺的。

64.根据实施方案1-63中任一项所述的方法，其中所述组合物中的所述CAR⁺T细胞中的整合载体拷贝数(iVCN)与总VCN的分数平均在为或约0.9与为或约0.8之间。

65.根据实施方案1-63中任一项所述的方法，其中所述组合物中的所述CAR⁺T细胞中的整合载体拷贝数(iVCN)与总VCN的分数平均小于或小于约0.8。

66.根据实施方案1-63中任一项所述的方法，其中所述组合物中的所述CAR⁺T细胞中的整合载体拷贝数(iVCN)与总VCN的分数平均在为或约0.8与为或约0.7之间。

67.根据实施方案1-63中任一项所述的方法，其中所述组合物中的所述CAR⁺T细胞中的整合载体拷贝数(iVCN)与总VCN的分数平均在为或约0.7与为或约0.6之间。

68.根据实施方案1-63中任一项所述的方法，其中所述组合物中的所述CAR⁺T细胞中的整合载体拷贝数(iVCN)与总VCN的分数平均在为或约0.6与为或约0.5之间。

69.根据实施方案1-63中任一项所述的方法，其中所述组合物中的所述CAR⁺T细胞中的整合载体拷贝数(iVCN)与总VCN的分数平均在为或约0.5与为或约0.4之间。

70.根据实施方案1-69中任一项所述的方法，其中所述组合物中的所述CAR⁺T细胞的整合载体拷贝数(iVCN)平均在或在约每个二倍体基因组0.8个拷贝与每个二倍体基因组2.0个拷贝之间，包含端值。

71.根据实施方案1-69中任一项所述的方法，其中所述组合物中的所述CAR⁺T细胞的整合载体拷贝数(iVCN)平均在或在约每个二倍体基因组0.8个拷贝与每个二倍体基因组1.0个拷贝之间，包含端值。

72.根据实施方案1-69中任一项所述的方法，其中所述组合物中的所述CAR⁺T细胞的整合载体拷贝数(iVCN)平均在或在约每个二倍体基因组1.0个拷贝与每个二倍体基因组1.5个拷贝之间，包含端值。

73.根据实施方案1-69中任一项所述的方法，其中所述组合物中的所述CAR⁺T细胞的整合载体拷贝数(iVCN)平均在或在约每个二倍体基因组1.5个拷贝与每个二倍体基因组2.0个拷贝之间，包含端值。

74.根据实施方案1-73中任一项所述的方法，其中在施用所述工程化T细胞组合物时或之前，所述受试者已接受过至少3种先前抗骨髓瘤治疗方案。

75.根据实施方案1-74中任一项所述的方法，其中在施用所述工程化T细胞组合物时或之前，所述受试者已接受过三种或更多种疗法，任选地四种或更多种先前疗法，所述疗法选自：

自体干细胞移植(ASCT)；

免疫调节剂；

蛋白酶体抑制剂；和

抗CD38剂，

除非所述受试者不是一种或多种所述疗法的候选者或对其有禁忌。

76.根据实施方案1-75中任一项所述的方法，其中在施用所述工程化T细胞组合物时或之前，所述受试者已接受过三种或更多种疗法，任选地四种或更多种先前疗法，所述疗法任选地选自：

自体干细胞移植(ASCT)；

单独或组合的免疫调节剂和蛋白酶体抑制剂；和

抗CD38剂。

77.根据实施方案1-76中任一项所述的方法，其中在施用所述工程化T细胞组合物时或之前，所述受试者已接受过所有三种以下疗法：自体干细胞移植(ASCT)；包含免疫调节剂和蛋白酶体抑制剂的方案；和抗CD38剂。

78.根据实施方案1-77中任一项所述的方法，其中有或没有骨髓移植以及有或没有维持疗法的诱导被认为是一种方案，目的是确定先前抗骨髓瘤治疗方案的数目。

79.根据实施方案1-78中任一项所述的方法，其中在施用所述工程化T细胞组合物时或之前，所述受试者对最后一种抗骨髓瘤治疗方案是难治的。

80.根据实施方案1-79中任一项所述的方法，其中难治性骨髓瘤被定义为在用最后一种抗骨髓瘤治疗方案治疗期间或从最后一个剂量起测量的在完成最后一种抗骨髓瘤治疗方案的治疗60天内有记录在案的疾病进展。

81.根据实施方案75-80中任一项所述的方法，其中所述免疫调节剂选自单独或组合的沙利度胺、来那度胺和泊马度胺。

82.根据实施方案75-81中任一项所述的方法，其中所述蛋白酶体抑制剂选自单独或组合的硼替佐米、卡非佐米和伊沙佐米。

83.根据实施方案75-82中任一项所述的方法，其中所述受试者已经历过至少连续2个周期的免疫调节剂方案和/或蛋白酶体抑制剂方案中每一种的治疗，除非疾病进展是对所述方案的最佳反应。

84.根据实施方案75-83中任一项所述的方法，其中所述抗CD38剂是抗CD38抗体。

85.根据实施方案75-84中任一项所述的方法，其中所述抗CD38剂是或包含达雷木单抗。

86.根据实施方案75-85中任一项所述的方法，其中所述抗CD38剂被用作组合方案的一部分或用作单一疗法。

87.根据实施方案1-86中任一项所述的方法，其中在施用所述剂量的细胞时和/或在淋巴细胞清除化疗或白细胞单采术时，所述受试者尚未患有活动性浆细胞白血病(PCL)或不具有PCL病史。

88.根据实施方案1-87中任一项所述的方法，其中在施用时，所述受试者在至少3种或至少4种针对多发性骨髓瘤的先前疗法后已经复发或是难治的。

89.根据实施方案1-88中任一项所述的方法，其中在施用时，所述受试者从诊断多发性骨髓瘤起有大约4年或在2年与15年之间或在2年与12年之间的时间。

90.根据实施方案1-89中任一项所述的方法，其中在施用时，所述受试者已接受过约10种或在3与15种之间或在4与15种之间的针对多发性骨髓瘤的先前方案。

91.根据实施方案1-90中任一项所述的方法，其中在施用时，所述受试者已经对硼替佐米、卡非佐米、来那度胺、泊马度胺和/或抗CD38单克隆抗体是难治的或无反应。

92.根据实施方案1-91中任一项所述的方法，其中在施用时，所述受试者已经进行过先前自体干细胞移植。

93.根据实施方案1-91中任一项所述的方法，其中在施用时，由于没资格进行自体干细胞移植(ASCT)，例如由于年龄或其他记录在案的原因，所述受试者没有接受过先前ASCT。

94.根据实施方案1-93中任一项所述的方法，其中在施用时，所述受试者具有IMWG高风险细胞遗传学。

95.根据实施方案1-94中任一项所述的方法，其中所述受试者没有MM的中枢神经系统受累、浆细胞白血病、华氏巨球蛋白血症、POEMS(多神经病、器官巨大症、内分泌病、单克隆蛋白质、皮肤变化)综合征和/或临床意义的淀粉样变性。

96.根据实施方案1-95中任一项所述的方法，其中所述受试者尚未接受过先前CART细胞或经遗传修饰的T细胞疗法。

97.根据实施方案1-96中任一项所述的方法，其中所述受试者尚未接受过靶向BCMA的先前疗法，诸如抗BCMA单克隆抗体或双特异性抗体。

98.根据实施方案1-97中任一项所述的方法，所述方法还包括从所述受试者中获得白细胞单采术样品用于制造所述工程化T细胞组合物。

99.根据实施方案98所述的方法，其中所述受试者尚未接受过治疗剂量的糖皮质激素，任选地在白细胞单采术之前的为或约14天内。

100.根据实施方案98或99所述的方法，其中所述受试者在白细胞单采术的4周内尚未接受过免疫抑制疗法，例如钙神经素抑制剂、甲氨蝶呤或其他化学治疗剂、麦考酚酯、雷帕霉素、免疫抑制抗体诸如抗TNF、抗IL6或抗IL6R。

101.根据实施方案98-100中任一项所述的方法，其中所述受试者在白细胞单采术之前的为或约6个月内尚未接受过自体干细胞移植。

102.根据实施方案1-101中任一项所述的方法，其中所述受试者尚未响应于先前疗法实现完全缓解(CR)。

103.根据实施方案1-102中任一项所述的方法，其中所述受试者尚未实现对先前疗法的客观反应(部分反应(PR)或更好)。

104.根据实施方案1-103中任一项所述的方法，其中所述受试者被鉴定为或已经被鉴定为东部肿瘤协作组体能状态(ECOG PS)为0或1。

105.根据实施方案1-104中任一项所述的方法，其中所述CAR包含：

(a)细胞外抗原结合结构域，所述细胞外抗原结合结构域包含：

含有SEQ ID NO:116所示的序列内含有的重链互补决定区1(CDR-H1)、重链互补决定区2(CDR-H2)和重链互补决定区3(CDR-H3)的可变重链(V_H)以及含有SEQ ID NO:119所示的序列内含有的轻链互补决定区1(CDR-L1)、轻链互补决定区2(CDR-L2)和轻链互补决定区3(CDR-L3)的可变轻链(V_L)；

含有分别如SEQ ID NO:97、101和103所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的V_H以及含有分别如SEQ ID NO:105、107和108所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的V_L；

含有分别如SEQ ID NO:96、100和103所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的V_H以及含有分别如SEQ ID NO:105、107和108所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的V_L；

含有分别如SEQ ID NO:95、99和103所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的V_H以及含有分别如SEQ ID NO:105、107和108所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的V_L；

含有分别如SEQ ID NO:94、98和102所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的V_H以及含有分别如SEQ ID NO:104、106和108所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的V_L；或

含有SEQ ID NO:116的氨基酸序列的V_H以及含有SEQ ID NO:119的氨基酸序列的V_L；

(b)间隔子，所述间隔子包含IgG4/2嵌合铰链或经修饰的IgG4铰链、IgG2/4嵌合C_H2区和IgG4 C_H3区，所述间隔子任选地具有约228个氨基酸的长度；或SEQ ID NO:174所示的间隔子；

(c)跨膜结构域，任选地来自人CD28的跨膜结构域；以及

(d)细胞内信号传导区，所述细胞内信号传导区包含CD3-zeta(CD3ζ)链的胞质信号传导结构域和共刺激信号传导区，所述共刺激信号传导区包含T细胞共刺激分子的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。

106.根据实施方案105所述的方法，其中所述V_H是或包含SEQ ID NO:116的氨基酸序列；并且所述V_L是或包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列。

107.根据实施方案105或106所述的方法，其中所述细胞外抗原结合结构域包含scFv。

108.根据实施方案105-107中任一项所述的方法，其中所述V_H和所述V_L通过柔性接头连接。

109.根据实施方案108所述的方法，其中所述scFv包含接头，所述接头包含氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:1)。

110.根据实施方案105-109中任一项所述的方法，其中所述V_H位于所述V_L的羧基末端。

111.根据实施方案105-110中任一项所述的方法，其中所述细胞外抗原结合结构域包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列或与SEQ ID NO:114的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。

112.根据实施方案105-111中任一项所述的方法，其中所述细胞外抗原结合结构域包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列。

113.根据实施方案105-112中任一项所述的方法，其中编码所述细胞外抗原结合结构域的核酸包含(a)SEQ ID NO:113的核苷酸序列；(b)与其具有至少90％序列同一性的核苷酸序列；或(c)(a)或(b)的简并序列。

114.根据实施方案105-113中任一项所述的方法，其中编码所述细胞外抗原结合结构域的核酸包含SEQ ID NO:115的核苷酸序列。

115.根据实施方案105-114中任一项所述的方法，其中所述V_H位于所述V_L的氨基末端。

116.根据实施方案105-115中任一项所述的方法，其中所述胞质信号传导结构域是或包含SEQ ID NO:143所示的序列或与SEQ ID NO:143具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

117.根据实施方案105-116中任一项所述的方法，其中所述共刺激信号传导区包含CD28、4-1BB或ICOS的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。

118.根据实施方案105-117中任一项所述的方法，其中所述共刺激信号传导区包含4-1BB、任选人4-1BB的细胞内信号传导结构域。

119.根据实施方案105-118中任一项所述的方法，其中所述共刺激信号传导区是或包含SEQ ID NO:4所示的序列或与SEQ ID NO:4所示的序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

120.根据实施方案105-119中任一项所述的方法，其中所述共刺激信号传导区位于所述跨膜结构域与所述CD3-zeta(CD3ζ)链的胞质信号传导结构域之间。

121.根据实施方案105-120中任一项所述的方法，其中所述跨膜结构域是或包含来自人CD28的跨膜结构域。

122.根据实施方案105-121中任一项所述的方法，其中所述跨膜结构域是或包含SEQ ID NO:138所示的序列或与SEQ ID NO:138具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

123.根据实施方案105-122中任一项所述的方法，其中所述CAR从其N末端至C末端依次包含：所述细胞外抗原结合结构域、所述间隔子、所述跨膜结构域和所述细胞内信号传导区。

124.根据实施方案105-123中任一项所述的方法，其中所述CAR包含：

(b)间隔子，所述间隔子包含经修饰的IgG4铰链、IgG2/4嵌合C_H2区和IgG4 C_H3区，所述间隔子具有约228个氨基酸的长度；

(c)来自人CD28的跨膜结构域；以及

(d)细胞内信号传导区，所述细胞内信号传导区包含CD3-zeta(CD3ζ)链的胞质信号传导结构域和共刺激信号传导区，所述共刺激信号传导区包含4-1BB的细胞内信号传导结构域。

125.根据实施方案124所述的方法，其中所述CAR包含：

(a)细胞外抗原结合结构域，所述细胞外抗原结合结构域包含SEQ ID NO:114所示的序列或与SEQ ID NO:114的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；

(b)间隔子，所述间隔子包含SEQ ID NO:174所示的序列或与SEQ ID NO:174具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；

(c)跨膜结构域，所述跨膜结构域包含SEQ ID NO:138所示的序列或与SEQ ID NO:138具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；以及

(d)细胞内信号传导区，所述细胞内信号传导区包含胞质信号传导结构域和共刺激信号传导区，所述胞质信号传导结构域包含SEQ ID NO:143所示的序列或与SEQ ID NO:143具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，所述共刺激信号传导区包含SEQ ID NO:4所示的序列或与SEQ ID NO:4所示的序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

126.根据实施方案124或125所述的方法，其中所述CAR包含：

(a)细胞外抗原结合结构域，所述细胞外抗原结合结构域包含SEQ ID NO:114所示的序列；

(b)间隔子，所述间隔子包含SEQ ID NO:174所示的序列；

(c)跨膜结构域，所述跨膜结构域包含SEQ ID NO:138所示的序列；以及

(d)细胞内信号传导区，所述细胞内信号传导区包含含有SEQ ID NO:143所示的序列的胞质信号传导结构域和含有SEQ ID NO:4所示的序列的共刺激信号传导区。

127.根据实施方案124-126中任一项所述的方法，其中所述CAR包含SEQ ID NO:19所示的序列。

128.根据实施方案1-127中任一项所述的方法，其中在人细胞、任选人T细胞中表达编码所述CAR的多核苷酸后，从所述多核苷酸转录的RNA、任选信使RNA(mRNA)展现出至少70％、75％、80％、85％、90％或95％的RNA同质性。

129.根据实施方案1-128中任一项所述的方法，其中所述CAR由以下多核苷酸序列编码，所述多核苷酸序列包含SEQ ID NO:13所示的序列或与其展现出至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。

130.根据实施方案1-129中任一项所述的方法，其中所述CAR是由包含SEQ ID NO:13所示的序列的多核苷酸序列编码。

131.根据实施方案1-130中任一项所述的方法，其中在存在可溶性或脱落形式的BCMA的情况下，在暴露于表达表面BCMA的细胞后，所述细胞外抗原结合结构域和/或所述CAR的结合或指示所述CAR的功能或活性的量度未被降低或阻断或未被明显降低或阻断。

132.根据实施方案131所述的方法，其中所述可溶性或脱落形式的所述BCMA的浓度或量对应于所述受试者或多发性骨髓瘤患者的血清或血液或血浆中存在的浓度或量，或者多发性骨髓瘤患者群体中的平均浓度或平均量；或者为一定浓度或量的所述可溶性或脱落BCMA，在所述浓度或量下在相同测定中对于表达参考抗BCMA重组受体、任选参考抗BCMACAR的细胞，所述结合或量度被降低或阻断或者被明显降低或阻断。

133.根据实施方案1-132中任一项所述的方法，其中在所述施用之前，所述受试者已接受过淋巴细胞清除疗法，所述淋巴细胞清除疗法包括每天施用为或约20-40mg/m²受试者体表面积、任选为或约30mg/m²的氟达拉滨，持续2-4天，和/或每天施用为或约200-400mg/m²受试者体表面积、任选为或约300mg/m²的环磷酰胺，持续2-4天。

134.根据实施方案1-133中任一项所述的方法，其中在所述施用之前，所述受试者已接受过淋巴细胞清除疗法，所述淋巴细胞清除疗法包括每天施用为或约20-40mg/m²受试者体表面积、任选为或约30mg/m²的氟达拉滨，持续2-4天。

135.根据实施方案1-134中任一项所述的方法，其中在所述施用之前，受试者已接受过淋巴细胞清除疗法，所述淋巴细胞清除疗法包括每天施用为或约200-400mg/m²受试者体表面积、任选为或约300mg/m²的环磷酰胺，持续2-4天。

136.根据实施方案1-135中任一项所述的方法，其中所述受试者已接受过淋巴细胞清除疗法，所述淋巴细胞清除疗法包括每天施用为或约30mg/m²受试者体表面积的氟达拉滨以及每天施用为或约300mg/m²受试者体表面积的环磷酰胺，持续3天。

137.根据实施方案1-136中任一项所述的方法，其中在患有所述疾病或障碍的受试者群组中的至少一名受试者中或至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的受试者中，所述方法能够任选地在开始所述施用后的指定时间点实现规定的反应或结局，其中：

所述反应选自客观反应(OR)、完全反应(CR)、严格的完全反应(sCR)、非常好的部分反应(VGPR)、部分反应(PR)和最小反应(MR)；

所述反应或结局是或包括OR；和/或

所述反应或结局是或包括CR。

138.根据实施方案137所述的方法，其中所述受试者群组具有与通过所述方法治疗的受试者至少相同数量的先前疗法、预后或预后因素、亚型、二次受累或其他一种或多种规定的患者特征。

139.根据实施方案137或138所述的方法，其中所述反应或结局可持续大于或大于约3、6、9或12个月。

140.根据实施方案137-139中任一项所述的方法，其中与在所述指定时间点确定的反应或结局相比，在所述指定时间点之后为或约3、6、9或12个月时确定的反应或结局是相等的或改善的。

141.根据实施方案137-140中任一项所述的方法，其中所述反应或结局是或包括或还包括不存在神经毒性、不存在细胞因子释放综合征(CRS)和/或不存在巨噬细胞激活综合征/噬血细胞性淋巴组织细胞增多症(MAS/HLH)。

142.根据实施方案1-141中任一项所述的方法，其中在患有所述疾病或障碍的受试者群组中的至少一名受试者中或至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的受试者中，所述方法任选地在开始所述施用后的指定时间点不导致规定的毒性结局。

143.根据实施方案142所述的方法，其中所述规定的毒性结局是神经毒性、细胞因子释放综合征(CRS)和/或巨噬细胞激活综合征/噬血细胞性淋巴组织细胞增多症(MAS/HLH)。

144.根据实施方案142或143所述的方法，其中所述规定的毒性结局是神经毒性，并且在所述群组中的至少60％、70％或80％的受试者中未导致神经毒性。

145.根据实施方案142-144中任一项所述的方法，其中所述规定的毒性结局是3级或更高级别或4级或更高级别的神经毒性。

146.根据实施方案142-145中任一项所述的方法，其中所述规定的毒性结局是3级或更高级别的神经毒性，并且在所述群组中的至少80％、85％、90％或95％的受试者中未导致3级或更高级别的神经毒性。

147.根据实施方案142或143所述的方法，其中所述规定的毒性结局是细胞因子释放综合征(CRS)，任选地3级或更高级别或4级或更高级别的细胞因子释放综合征(CRS)。

148.根据实施方案147所述的方法，其中在所述群组中的至少15％、20％、25％或30％的受试者中不导致所述CRS。

149.根据实施方案137-148中任一项所述的方法，其中所述指定时间点是在开始所述施用后为或约1个月、3个月、6个月、9个月或12个月。

150.根据实施方案1-149中任一项所述的方法，其中将所述细胞组合物肠胃外施用，任选地静脉内施用。

151.根据实施方案1-150中任一项所述的方法，其中所述受试者是人受试者。

152.根据实施方案1-151中任一项所述的方法，其中所述包含工程化T细胞的组合物通过如下制造过程产生，所述制造过程包括将包含原代T细胞的输入组合物在刺激T细胞的条件下暴露于包含含有多个抗生物素蛋白、链霉亲和素、抗生物素蛋白突变蛋白或链霉亲和素突变蛋白分子的寡聚颗粒试剂的刺激试剂，从而产生受刺激的群体，其中所述刺激试剂能够激活TCR复合物的一种或多种组分的一个或多个细胞内信号传导结构域和一种或多种共刺激分子的一个或多个细胞内信号传导结构域。

153.根据实施方案152所述的方法，其中所述制造过程还包括将编码所述靶向BCMA的CAR的异源多核苷酸引入受刺激群体的T细胞中，从而产生转化细胞群。

154.根据实施方案153所述的方法，其中所述制造过程还包括将所述转化细胞群孵育长达96小时。

155.根据实施方案154所述的方法，其中所述孵育是在缺少一种或多种重组细胞因子的基础培养基中进行。

156.根据实施方案154或155所述的方法，其中所述制造过程还包括收获所述转化群体的T细胞，从而产生工程化细胞组合物。

157.根据实施方案156所述的方法，其中所述收获在开始暴露于所述刺激试剂后的24小时与120小时之间且包含端值的时候进行。

158.根据实施方案156或157所述的方法，其中所述收获在开始暴露于所述刺激试剂后的48小时与120小时之间且包含端值的时候进行。

159.根据实施方案156-158中任一项所述的方法，其中所述收获是在基因组中检测到整合的载体时但在达到每个二倍体基因组的稳定的整合载体拷贝数(iVCN)之前的时候进行。

160.根据实施方案156-159中任一项所述的方法，其中所述收获是在收获时活细胞总数大于或大于约三倍所述受刺激群体的活细胞总数之前的时候进行。

161.根据实施方案160所述的方法，其中所述收获是在收获时活细胞总数是所述受刺激群体的活细胞总数的为或约三倍、为或约两倍、或与之相同或大致相同的时候进行。

162.根据实施方案156-161中任一项所述的方法，其中所述收获是在所述群体中的总T细胞、所述群体中的总CD3⁺T细胞、所述群体中的总CD4⁺T细胞、所述群体中的总CD8⁺T细胞或其CAR表达细胞中的CD27⁺CCR7⁺细胞的百分比大于或大于约50％的时候进行。

163.根据实施方案156-162中任一项所述的方法，其中所述收获是在所述群体中的总T细胞、所述群体中的总CD3⁺T细胞、所述群体中的总CD4⁺T细胞、所述群体中的总CD8⁺T细胞或其CAR表达细胞中的CD45RA⁺CCR7⁺和CD45RA^-CCR7⁺细胞的百分比大于或大于约60％的时候进行。

164.根据实施方案1-163中任一项所述的方法，其中所施用的组合物中的细胞通过用于产生展现出预定特征的输出组合物的制造过程来产生，其中当在多名不同的单独受试者中进行时，所述制造过程的迭代任选地从人生物样品产生多种所述输出组合物，其中所述多种输出组合物中的所述输出组合物的预定特征选自：

在所述多种所述输出组合物中的具有记忆表型的细胞的平均百分比在约40％与约65％之间、在约40％与约45％之间、在约45％与约50％之间、在约50％与约55％之间、在约55％与约60％之间、或在约60％与约65％之间；

在所述多种所述输出组合物中的具有中枢记忆表型的细胞的平均百分比在约40％与约65％之间、在约40％与约45％之间、在约45％与约50％之间、在约50％与约55％之间、在约55％与约60％之间、或在约60％与约65％之间；

在所述多种所述输出组合物中的为CD27+、CD28+、CCR7+、CD45RA-、CD45RO+、CD62L+、CD3+、CD95+、颗粒酶B-和/或CD127+的细胞的平均百分比在约40％与约65％之间、在约40％与约45％之间、在约45％与约50％之间、在约50％与约55％之间、在约55％与约60％之间、或在约60％与约65％之间；

在所述多种所述输出组合物中的为CCR7+/CD45RA-或CCR7+/CD45RO+的细胞的平均百分比在约40％与约65％之间、在约40％与约45％之间、在约45％与约50％之间、在约50％与约55％之间、在约55％与约60％之间、或在约60％与约65％之间；

在所述多种所述输出组合物的所述工程化CD4+T细胞、任选地CAR+CD4+T细胞中的中枢记忆CD4+T细胞的平均百分比在约40％与约65％之间、在约40％与约45％之间、在约45％与约50％之间、在约50％与约55％之间、在约55％与约60％之间、或在约60％与约65％之间；

在所述多种所述输出组合物的所述工程化CD8+T细胞、任选地CAR+CD8+T细胞中的中枢记忆CD8+T细胞的平均百分比在约40％与约65％之间、在约40％与约45％之间、在约45％与约50％之间、在约50％与约55％之间、在约55％与约60％之间、或在约60％与约65％之间；和/或

在所述多种所述输出组合物的所述工程化T细胞、任选地CAR+T细胞中的中枢记忆T细胞、任选地CD4+中枢记忆T细胞和CD8+中枢记忆T细胞的平均百分比在约40％与约65％之间、在约40％与约45％之间、在约45％与约50％之间、在约50％与约55％之间、在约55％与约60％之间、或在约60％与约65％之间。

165.根据实施方案164所述的方法，其中所施用的组合物通过在至少约80％、约90％、约95％、约97％、约99％、约100％或为100％的人生物样品中产生输出组合物的制造过程产生，所述输出组合物展现出预定特征、任选地在所述输出组合物中有阈值数量的表达所述CAR的细胞，其中所述制造过程在多名不同的单独受试者中进行。

166.根据实施方案152-165中任一项所述的方法，其中包含基因工程化细胞的组合物不含有来自所述制造过程的残留珠。

167.根据实施方案1-166中任一项所述的方法，其中所述MM是复发性和/或难治性多发性骨髓瘤(r/r MM)。

168.一种制品，所述制品包含含有表达靶向BCMA的嵌合抗原受体(CAR)的基因工程化细胞的组合物、以及根据实施方案1-167中任一项所述的方法施用所述细胞组合物的说明书。

VI.实施例

以下实施例被包括在内仅用于说明目的，并不旨在限制本发明的范围。

实施例1：含有使用非扩增过程产生的CAR+T细胞的T细胞组合物。

含有表达抗BCMA嵌合抗原受体(CAR)的T细胞的工程化原代T细胞组合物通过如下过程产生，所述过程在用病毒载体转导之前利用由抗CD3/抗CD28 Fab缀合的寡聚试剂构成的刺激试剂来激活T细胞，但是未涉及用于扩增转导细胞的后续步骤。使用两个类似的非扩增过程(指定的非扩增过程A和非扩增过程B)来产生CAR+T细胞组合物。与培养步骤的开始相比，非扩增过程在转导后不含有为了在培养步骤结束时增加(例如，扩增)活细胞总数的目的的培养步骤。尽管孵育条件不是为了扩增细胞群的目的而进行的，但是与孵育的开始相比，收获时的组合物可能已经经历扩增或展现出细胞数的增加。对于比较，来自同一供体的T细胞通过在转导后培养细胞进行扩增的过程来进行工程化。评估了所产生的靶向BCMA的CAR治疗性T细胞组合物的表型和活性。

所有过程都包括用相同的靶向BCMA的CAR对T细胞进行工程化。所述CAR含有scFv结合结构域、IgG衍生的间隔子、跨膜结构域和包含串联的4-1BB胞内结构域和CD3ζ胞内结构域的细胞内信号传导区。编码抗BCMA CAR的多核苷酸序列不包含已鉴定的潜在隐秘剪接供体和受体位点。病毒载体还含有编码截短的受体的序列，所述截短的受体用作CAR表达的替代标记；所述序列通过T2A核糖体跳跃序列与所述CAR序列隔开。

A.靶向BCMA的CAR T细胞组合物的产生。

在非扩增过程A中，从人供体中收集白细胞单采术样品，洗涤并经历CD4+和CD8+T细胞组合物的基于免疫亲和力的选择。选择后，将单独的CD4+和CD8+T细胞组合物低温冷冻，然后解冻并且以大约1:1的活CD4+T细胞与活CD8+T细胞(约300×10⁶个CD4+和300×10⁶个CD8+细胞)的比率混合，之后通过在含有重组IL-2(100IU/mL)、重组IL-7(600IU/mL)和重组IL-15(100IU/mL)的无血清完全培养基中与抗CD3/抗CD28Fab缀合的寡聚链霉亲和素突变蛋白试剂一起孵育18-30小时进行刺激。刺激后，通过用编码抗BCMA CAR的慢病毒载体旋转接种来转导细胞。旋转接种后，将细胞洗涤并重悬于没有添加重组细胞因子的基础无血清培养基中，并且在孵育器中以约37.0℃孵育。在刺激开始后约48小时后，然后添加D-生物素并将其与细胞混合，以将抗CD3和抗CD28 Fab试剂与寡聚链霉亲和素试剂解离。进一步将细胞再孵育48小时(直到刺激开始后约4天)，然后用冷冻保护剂进行配制。

在非扩增过程B中，从人供体收集白细胞单采术样品，洗涤并冷冻保存。使冷冻保存的样品解冻，之后通过基于免疫亲和力的选择从每个样品中选择CD4+和CD8+细胞的单独组合物。将所选择的CD4+和CD8+T细胞组合物以多达900×10⁶个总活CD4+和CD8+T细胞(并且通常以大约1:1的比率)混合，之后通过在含有重组IL-2(100IU/mL)、重组IL-7(600IU/mL)和重组IL-15(100IU/mL)的无血清完全培养基中与抗CD3/抗CD28Fab缀合的寡聚链霉亲和素突变蛋白试剂一起孵育16-24小时来进行刺激。刺激后，通过用编码抗BCMA CAR的慢病毒载体旋转接种来转导细胞。旋转接种后，将细胞洗涤并重悬于没有添加重组细胞因子的基础无血清培养基中，并且在孵育器中以约37.0℃孵育。在刺激开始后约48小时后，然后添加D-生物素并将其与细胞混合，以将抗CD3和抗CD28 Fab试剂与寡聚链霉亲和素试剂解离。进一步将细胞再孵育48小时(直到刺激开始后约4天)，然后用冷冻保护剂进行配制。

在扩增的过程中，从人白细胞单采术样品选择CD4+和CD8+细胞的单独组合物并将其低温冷冻。随后使所选择的细胞组合物解冻并以1:1的活CD4+T细胞与活CD8+T细胞的比率混合。在含有重组IL-2、IL-7和IL-15的无血清培养基中，在附着有抗CD3和抗CD28抗体的顺磁性聚苯乙烯包被的珠的存在下以1:1的珠与细胞的比率将混合组合物的大约300×10⁶个T细胞(150×10⁶个CD4和150×10⁶个CD8+T细胞)刺激18至30小时之间的时间。在所述孵育后，将来自受刺激的细胞组合物的大约100×10⁶个活细胞在含有重组IL-2、IL-7和IL-15的无血清培养基中浓缩。通过用编码抗BCMA CAR的慢病毒载体以大约1600g旋转接种60分钟来转导细胞。在旋转接种后，将细胞重悬于含有重组IL-2、IL-7和IL-15的无血清培养基中，并且在约37℃下孵育约18至30小时。然后，通过转移到生物反应器(例如摇摆运动生物反应器)中的约500mL无血清培养基中来培育细胞进行扩增，所述无血清培养基含有两倍于在孵育和转导步骤期间所用的浓度的IL-2、IL-7和IL-15。当实现设定的活细胞密度时，开始灌注，其中在持续混合下通过半连续灌注更换培养基。第二天在生物反应器中培育细胞，直至实现约3x10⁶个细胞/mL的阈值细胞密度为止，这通常发生在涉及6-7天扩增的过程中。通过暴露于磁场从细胞组合物中去除抗CD3和抗CD28抗体缀合的顺磁珠。然后收集细胞，对其进行配制和冷冻保护。

B.工程化T细胞组合物的纯度。

用识别表面标记(包括CD3、NK细胞标记和BCMA)的抗体对从非扩增工程化过程产生的T细胞组合物进行染色，并且通过流式细胞术对其进行定量，如图1所示。

产生模拟转导的T细胞组合物并用作对照。使用非扩增过程产生的细胞组合物通常展现出高百分比的CD3+T细胞(>96％)与低百分比的NK细胞和CD19+细胞。

C.CD4/CD8频率和CD4/CD8比率。

用识别表面标记(包括CD3、CD4和CD8)的抗体对从扩增和非扩增工程化过程产生的T细胞组合物进行染色，并且通过流式细胞术对其进行定量，如图2和图3所示。产生模拟转导的T细胞组合物并用作对照。因为扩增过程产生了单独的CD4和CD8组合物，因此通过该过程CD4+或CD8+T细胞中的每一种都以约100％存在于相应生成的组合物中。

D.细胞活力。

将从非扩增工程化过程产生的T细胞组合物针对指示凋亡的因子的表达进行染色，诸如用作为细胞健康的量度的膜联蛋白V或激活的半胱天冬酶3(aCas3)以及识别包括CD3在内的表面标记的抗体进行表面染色。图4示出了与模拟转导的T细胞组合物相比从非扩增工程化过程产生的细胞组合物的CD3+细胞中aCas3+细胞的百分比。

E.CAR的载体拷贝数和表面表达。

使用包括通过脉冲场凝胶电泳(PFGE)分离高和低分子量DNA种类的标准载体拷贝数(VCN)测定和整合载体拷贝数(iVCN)测定，对从基本上如本实施例中所述的非扩增和扩增工程化过程产生的T细胞组合物进行了测定。如通过VCN和iVCN测定确定的CAR的载体拷贝数还与CAR的表面表达相关。PCT/US2019/046048(通过引用以其整体并入)中披露了VCN和iVCN测定的示例性方法和组合物。

具体而言，从细胞中制备基因组DNA，并且通过(1)使用阈值将>15kb(“iVCN”)较高分子量DNA种类与低于15kb阈值的低分子量非染色体种类分离的iVCN方法，其中通过自动PFGE(例如，PippinHT(Sage Science,Beverly,MA)设备)进行分离或(2)其中没有首先通过PFGE分离基因组DNA的标准VCN方法(“VCN”)进行转基因序列拷贝数的评估。在两种测定中，转基因拷贝数通过ddPCR使用对转基因所独有的序列具有特异性的引物(例如，对重组蛋白的调节元件具有特异性的引物)来确定，并针对如使用对参考基因(例如，白蛋白(ALB)基因)具有特异性的引物确定的二倍体基因组进行归一化。

结果表明，使用VCN测定评估的转基因拷贝数大体上与通过iVCN评估的转基因拷贝数相关(图5A)。然而，对于使用非扩增过程制造的细胞，通过VCN获得的值高于通过iVCN获得的值，这与检测可能存在于含有使用非扩增过程产生的细胞的样品中的非整合转基因序列的VCN测定一致。相比之下，对于使用扩增过程制造的细胞，通过VCN和iVCN获得的值几乎相同(在VCN＝iVCN线附近)。这些差异可能是由于与扩增过程相比，在较短的非扩增过程中样品中存在更大量的游离的、非整合转基因序列拷贝所致。这些结果与以下观察结果一致：与iVCN测定相比，能够检测高分子量和低分子量DNA两者的标准VCN测定具有局限性，特别是当用于在转基因引入后的早期评估细胞时，诸如在将T细胞工程化的缩短过程(其中游离的、非整合转基因序列拷贝可能仍存在于样品中)中。

为了评估iVCN或VCN测定与CAR的表面表达的相关性程度，通过流式细胞术评估来自非扩增或扩增过程的细胞样品的CD3、CD45和CAR的表达，以确定在活CD45+细胞中CD3+CAR+细胞的百分比。如图5B所示，与通过非扩增过程工程化相比，VCN测定展现出与通过扩增过程工程化的样品的CAR+细胞的百分比更好的相关性，这可能是由于存在未促进表面CAR表达的非整合CAR DNA序列。如图5C所示，在已通过非扩增或扩增过程工程化的细胞中，iVCN显示相似的与CAR表达的相关性。对于所有样品，与通过VCN测定(R²＝0.5903)确定的每个细胞中的拷贝数相比，CAR表达与通过iVCN测定(R²＝0.8952)确定的每个细胞中的拷贝数的相关性更高。

F.T细胞组合物的记忆概况。

将从非扩增工程化过程产生的T细胞组合物针对激活的半胱天冬酶3(aCas3)并用识别表面标记(包括CD4、CD8、CCR7、CD27和CD45RA)的抗体进行染色。确定指示幼稚/幼稚样T细胞(CD45RA+CCR7+)、中枢记忆(CD45RA-CCR7+)、效应记忆(CD45RA-CCR7-；T_E+_EM)和效应记忆CD45RA+细胞(CCR7-CD45RA+；T_EMRA)的T细胞的百分比。如图6A所示，工程化组合物富集中枢记忆/幼稚样T细胞。

在对CCR7和CD27染色两者呈阳性的aCas-T细胞中，CD4+CAR+和CD8+CAR+T细胞的百分比示于图6B中。如图所示，工程化组合物富集CCR7+CD27+细胞。

这些结果支持从非扩增过程产生的工程化细胞组合物中具有幼稚样的分化程度较低的表型的细胞的份额大于从扩增过程产生的细胞组合物。

实施例2：使用非扩增过程产生的T细胞组合物的体外活性。

使用用于制造工程化T细胞的非扩增和扩增过程，从匹配的供体产生含有表达抗BCMA嵌合抗原受体(CAR)T细胞的的原代T细胞的工程化T细胞组合物，并且比较了细胞组合物的属性。

从一名健康供体(HD1)或3位患有多发性骨髓瘤的患者(MM1、MM2或MM3)中收集白细胞单采术样品，并且使用基本上如实施例1中的过程A所述的非扩增过程进行制造运行以用抗BCMA CAR对T细胞进行工程化。将所述工程化T细胞组合物与使用如实施例1中所述的扩增过程从供体匹配的过程运行产生的T细胞组合物进行比较。所述CAR含有scFv结合结构域、IgG衍生的间隔子、跨膜结构域和包含串联的4-1BB胞内结构域和CD3ζ胞内结构域的细胞内信号传导区。编码抗BCMA CAR的多核苷酸序列不包含已鉴定的潜在隐秘剪接供体和受体位点。病毒载体还含有编码截短的受体的序列，所述截短的受体用作CAR表达的替代标记；所述序列通过T2A核糖体跳跃序列与所述CAR序列隔开。

1)记忆概况。

分析了通过非扩增和扩增过程从匹配供体产生的工程化T细胞组合物中的细胞。具体而言，通过流式细胞术评估了抗BCMA CAR-T细胞产物的表面标记(包括CD4、CD8、CCR7、CD45RA)和CAR(替代标记+或抗独特型+)。细胞在对CAR表达呈双阳性的活CD3+细胞上进行门控。然后，在记忆亚型分型之前将CD3+CAR+细胞作为CD4+(图7，上图)或CD8+(图7，下图)细胞进行门控。与使用扩增过程产生的细胞组合物相比，使用非扩增过程产生的细胞组合物展现出较高比例的幼稚样和中枢记忆T细胞以及较低比例的效应记忆亚型。

2)增殖能力。

在长期刺激测定中分析了通过非扩增和扩增过程从匹配供体产生的工程化T细胞组合物的细胞，所述长期刺激测定涉及在与针对抗BCMA CAR的激动性抗独特型抗体缀合的微珠的存在下连续孵育10天以提供CAR依赖性刺激。该测定模仿细胞在长期暴露于抗原后存活的适应性和能力，就像施用后可能在体内发生的那样。在长期CAR依赖性刺激后评估增殖能力，并且每2天确定总活细胞数量(图8A-图8C)。包括来自MM1或来自MM3的未转录(模拟)人CD3+T细胞作为阴性对照。与供体匹配的扩增细胞产物中的工程化细胞相比，来自抗BCMA非扩增细胞产物的细胞展现出明显增强的增殖能力(平均2至7倍)。这些结果与以下观察结果一致：非扩增细胞产物含有更高相对比例的分化程度较低的T细胞(包括维持与中枢记忆和干细胞记忆T细胞类似的特征的细胞)，并且因此具有响应于经由CAR的信号传导经历另外多轮分裂的能力。

3)细胞因子产生

将在长期刺激之前来自非扩增或扩增过程的工程化CAR-T细胞组合物在板结合的抗ID上孵育5小时。通过流式细胞术测量细胞内IL-2、IFNγ或TNF细胞因子产生。在CD4+CAR+或CD8+CAR+群体内确定表达单一细胞因子的CAR+细胞的频率。在与MM.1S BCMA阳性靶细胞一起培养细胞24小时之后通过对分泌的细胞因子浓度的多重免疫测定定量测量细胞因子蛋白分泌。

从非扩增和扩增过程两者产生的抗BCMA CAR-T细胞的细胞因子产生是稳健的，并且在CAR+中而非CAR阴性细胞中观察到(图9A-图9C，CAR阴性数据未示出)。从非扩增过程产生的细胞趋向于具有更多的多功能性，并且同时产生IL-2、IFNγ和TNFα的细胞的比例更大。如图9D所示，在同时生产IL-2、IFNγ和TNFα的非扩增过程产物中的CAR+CD8+细胞的百分比显著高于扩增过程产物中的CAR+CD8+细胞的百分比。与扩增过程产物中的细胞相比，非扩增过程产物中的细胞还产生了显著更大量的分泌细胞因子蛋白(图9E)。总的来说，这些结果表明，响应于经由CAR的信号传导，与扩增过程抗BCMA CAR产物相比，非扩增过程抗BCMA CAR产物在每个细胞基础上具有更多的多功能性并产生更大量的细胞因子。

4)细胞溶解活性。

将在长期刺激之前来自非扩增或扩增过程的工程化CAR-T细胞组合物与表达NucLight Red(NLR)以允许通过显微镜检查对其进行跟踪的RPMI-8226/NLR靶细胞一起共培养，并且通过使用连续活细胞成像进行定量来测量细胞毒性。将工程化供体匹配的CAR-T细胞组合物和靶细胞以1:1和0.5:1的效应物与靶细胞(E:T)比率进行共培养。通过测量在96小时时间段内活靶细胞的损失来评估细胞溶解活性，如通过红色荧光信号所确定(使用

活细胞分析系统，Essen Bioscience)。将数据转化为曲线下面积(AUC)，用于针对单独供体/过程或依据制造过程进行比较。总的来说，在每个细胞基础上，与使用扩增过程产生的T细胞组合物相比，使用非扩增过程产生的工程化CAR-T细胞组合物展现出相似的细胞溶解活性(图10A-图10B)。

实施例3：使用非扩增过程产生的T细胞组合物的体内抗肿瘤活性。

在OPM-2小鼠异种移植骨髓瘤肿瘤模型中评价从非扩增和扩增供体匹配的工程化过程产生的抗BCMA CAR-T细胞组合物。向免疫功能低下的NOD.Cg-Prkdc^scidIL-2rg^tm1Wjl/SzJ小鼠静脉内输注2.0×10⁵个OPM-2萤火虫萤光素酶-绿色荧光蛋白(FfLuc-GFP)骨髓瘤细胞，并且13天后，将小鼠随机化为多个组以平衡肿瘤负荷。第二天，向小鼠以1.0×10⁶个(高剂量)或0.25×10⁶个(低剂量)细胞/只小鼠(n＝8只小鼠/组)静脉内输注供体匹配的抗BCMA CAR人CD3+活T细胞。对照小鼠未经治疗(仅肿瘤，虚线；n＝10只小鼠)。通过成像OPM-2FfLuc阳性BLI评估了播散性肿瘤生长。示出了所有组(肿瘤负荷)的BLI辐射(p/s；y轴)的变化(图11A)，并且对于每个组从AUC计算出的前后图中示出了从第1天到第53天的肿瘤生长(图11B)。使用曼-惠特尼U检验比较差异；*p<0.05。

用高剂量非扩增过程产物治疗的小鼠具有低于基线的完全肿瘤消退，这维持了至少53天；然而，用供体匹配的扩增过程产物治疗的小鼠具有低于基线的肿瘤生长初始抑制，这没有持续，而肿瘤负荷在治疗后大约第20天增加到高于基线(图11A，左图)。

与未经治疗的对照小鼠(单独的肿瘤)相比，用低剂量扩增过程产物治疗的小鼠的肿瘤负荷具有少量的瞬时减少，表明扩增过程产物在该低剂量下有活性。相比之下，低于基线的肿瘤消退发生在用低剂量的来自HD1、MM2和MM3供体的供体匹配的非扩增过程产物治疗的OPM-2异种移植小鼠中(图11B，右图)。

在第4天和第17天从一半的小鼠和在CAR T细胞治疗后第10天和第24天从一半的小鼠收集血液。通过流式细胞术对循环CAR T细胞进行定量，以评估非扩增过程产物的扩增潜力。具体而言，通过流式细胞术分析血液细胞以鉴定CAR特异性人CD3+T细胞，并且对于单只小鼠计算每微升血液的细胞数。在低剂量组和高剂量组两者中，与非扩增过程产物的数量相比，在治疗后第4天用扩增过程产物治疗的组中的循环CAR T细胞数量更高(图12A-图12B)。然而，在第4天之后，与扩增过程产物治疗组相比，非扩增过程产物治疗组显示出CART细胞的体内扩增更大，平均大了约10倍(图12B，非扩增，NE；扩增，E)。综上所述，这些体内数据与非扩增过程组合物的CAR-T细胞的增殖能力和效力更大一致，这可能是在人中的抗肿瘤活性增强的指示。

实施例4：向患有复发性和/或难治性多发性骨髓瘤的受试者施用抗BCMA CAR表达细胞。

将含有表达对B细胞成熟抗原(BCMA)具有特异性的CAR的自体T细胞的嵌合抗原受体(CAR)表达T细胞组合物施用于患有复发性和/或难治性多发性骨髓瘤(MM)的人受试者。

将含有被工程化以表达对BCMA具有特异性的示例性CAR的自体T细胞的组合物施用于已接受过3种或更多种先前抗骨髓瘤治疗的患有复发性或难治性(R/R)多发性骨髓瘤(MM)的成年人受试者。

通过如下过程产生所施用的表达抗BCMA CAR的治疗性T细胞组合物，所述过程被设计成产生具有含有较高比例的分化程度较低的细胞类型的表型谱的CAR T细胞产物，这可能会影响临床反应和反应的耐久性。所述过程包括从来自要治疗的单独受试者的先前冷冻保存的白细胞单采术样品基于免疫亲和力(例如，免疫磁性选择)富集CD4⁺和CD8⁺细胞。混合分离的CD4⁺和CD8⁺T细胞，并且使其经历使用抗CD3/抗CD28 Fab缀合的寡聚链霉亲和素突变蛋白试剂的刺激，随后用编码抗BCMA CAR的病毒载体(例如，慢病毒载体)转导受刺激的组合物。所述CAR含有scFv结合结构域、IgG衍生的间隔子、跨膜结构域和包含串联的4-1BB胞内结构域和CD3ζ胞内结构域的细胞内信号传导区。编码抗BCMA CAR的多核苷酸序列不包含已鉴定的潜在隐秘剪接供体和受体位点。

所述过程不涉及随后扩增转导细胞的步骤，并且通常比涉及扩增转导细胞的过程更短。在刺激开始后约4天收获细胞，然后用冷冻保护剂进行配制。与起始样品和与使用涉及旨在扩增转导细胞的培养步骤的制造过程产生的细胞组合物相比，所述过程导致了富集中枢记忆表型的细胞组合物。

在CAR-T输注之前，受试者接受过用氟达拉滨(flu，30mg/m²/天)IV和环磷酰胺(Cy，300mg/m²/天)IV的淋巴细胞清除化疗(LDC)，持续三天。在输注前第-5、-4和-3天施用LDC。

在静脉内施用前在床边解冻冷冻保存的细胞组合物，其中输注日被指定在第1天(在LDC完成后2至9天)。在第1天，以20×10⁶个CAR+T细胞或40×10⁶个总CAR+T细胞将CAR表达T细胞的剂量施用于受试者。所述研究考虑了向受试者给药以下另外剂量水平之一：60×10⁶个总CAR+T细胞或80×10⁶个总CAR+T细胞。每个剂量含有CD3+CAR+T细胞(≥80％CD3+细胞；≥10％CD3+CAR+细胞)。

功效评估包括实验室评估、EMP评估(临床检查或PET、CT或MRI)(如适用的话)、骨骼检查以及骨髓活检和抽吸。使用“国际骨髓瘤工作组(IMWG)统一反应标准”评估疾病反应(Kumar等人(2016)Lancet Oncol 17(8):e328-346)。

本发明并不旨在限于具体公开的实施方案的范围，提供所述实施方案例如是为了说明本发明的各个方面。根据本文的描述和传授，对所描述的组合物和方法的各种修改将变得清楚。可以在不脱离本公开文本的真实范围和精神的情况下实践这些变化，并且这些变化旨在落入本公开文本的范围内。

序列

序列表

<110> 朱诺治疗学股份有限公司

<120> 针对BCMA的嵌合抗原受体T细胞组合物及其方法和用途

<130> 735042023540

<140> 尚未分配

<141> 同时随同提交

<150> US 62/975,731

<151> 2020-02-12

<160> 283

<170> 用于Windows的FastSEQ 4.0版

<210> 1

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> (4GS)3接头

<400> 1

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 2

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 3GS接头

<400> 2

Gly Gly Gly Ser

1

<210> 3

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 4-1BB/CD3ζ预测的剪接受体位点

<400> 3

gctgagagtc aagttttcca ggtccgccga cgctccagcc t 41

<210> 4

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 4-1BB来源的细胞内共信号传导序列

<400> 4

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 5

<211> 126

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 4-1BB来源的细胞内共信号传导序列

<400> 5

aagcggggga gaaagaaact gctgtatatt ttcaaacagc cctttatgag acctgtgcag 60

actacccagg aggaagacgg atgcagctgt aggtttcccg aggaagagga aggaggctgt 120

gagctg 126

<210> 6

<211> 126

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 4-1BB来源的细胞内共信号传导序列

<400> 6

aagcggggca gaaagaagct gctctacatc ttcaagcagc ccttcatgcg gcccgtgcag 60

accacacaag aggaagatgg ctgctcctgc agattccccg aggaagaaga aggcggctgc 120

gagctg 126

<210> 7

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 4GS接头

<400> 7

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 8

<211> 684

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 替代性CO/SSE间隔子

<400> 8

gaatctaagt acggaccgcc ttgtcctcct tgtcccgctc ctcctgttgc cggaccttcc 60

gtgttcctgt ttcctccaaa gcctaaggac accctgatga tcagcaggac ccctgaagtg 120

acctgcgtgg tggtggatgt gtcccaagag gatcccgagg tgcagttcaa ctggtatgtg 180

gacggcgtgg aagtgcacaa cgccaagacc aagcctagag aggaacagtt ccagagcacc 240

tacagagtgg tgtccgtgct gacagtgctg caccaggatt ggctgaacgg caaagagtac 300

aagtgcaagg tgtccaacaa gggcctgcct agcagcatcg agaaaaccat ctccaaggcc 360

aagggccagc caagagagcc ccaggtttac acactgcctc caagccaaga ggaaatgacc 420

aagaatcagg tgtccctgac atgcctggtc aagggcttct acccctccga tatcgccgtg 480

gaatgggaga gcaatggcca gcctgagaac aactacaaga ccacacctcc tgtgctggac 540

agcgacggca gtttcttcct gtatagtaga ctcaccgtgg ataaatcaag atggcaagag 600

ggcaacgtgt tcagctgcag cgtgatgcac gaggccctgc acaaccacta cacccagaaa 660

agcctgagcc tgtctctggg caag 684

<210> 9

<211> 1959

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗BCMA CAR

<400> 9

gaggtgcagc tggtggagtc cggaggaggc ctggtgaagc caggaggctc cctgaggctg 60

tcttgcgcag ccagcggctt cacctttagc gactactata tgtcctggat cagacaggca 120

cctggcaagg gcctggagtg ggtgagctac atcagctcct ctggctccac aatctactat 180

gccgactctg tgaagggccg gtttaccatc agcagagata acgccaagaa ttccctgtat 240

ctgcagatga acagcctgag ggccgaggac acagccgtgt actattgcgc caaggtggac 300

ggcgattaca ccgaggatta ttggggccag ggcacactgg tgaccgtgag ctccggcggc 360

ggcggctctg gaggaggagg cagcggcgga ggaggctccc agtctgccct gacacagcca 420

gccagcgtgt ccggctctcc cggacagtcc atcacaatct cttgtaccgg ctctagctcc 480

gacgtgggca agtacaacct ggtgtcctgg tatcagcagc cccctggcaa ggcccctaag 540

ctgatcatct acgatgtgaa caagaggcca tctggcgtga gcaatcgctt cagcggctcc 600

aagtctggca ataccgccac actgaccatc agcggcctgc agggcgacga tgaggcagat 660

tactattgtt ctagctacgg cggcagcaga tcctacgtgt tcggcacagg caccaaggtg 720

accgtgctgg aatctaagta cggaccgcct tgtcctcctt gtcccgctcc tcctgttgcc 780

ggaccttccg tgttcctgtt tcctccaaag cctaaggaca ccctgatgat cagcaggacc 840

cctgaagtga cctgcgtggt ggtggatgtg tcccaagagg atcccgaggt gcagttcaac 900

tggtatgtgg acggcgtgga agtgcacaac gccaagacca agcctagaga ggaacagttc 960

cagagcacct acagagtggt gtccgtgctg acagtgctgc accaggattg gctgaacggc 1020

aaagagtaca agtgcaaggt gtccaacaag ggcctgccta gcagcatcga gaaaaccatc 1080

tccaaggcca agggccagcc aagagagccc caggtttaca cactgcctcc aagccaagag 1140

gaaatgacca agaatcaggt gtccctgaca tgcctggtca agggcttcta cccctccgat 1200

atcgccgtgg aatgggagag caatggccag cctgagaaca actacaagac cacacctcct 1260

gtgctggaca gcgacggcag tttcttcctg tatagtagac tcaccgtgga taaatcaaga 1320

tggcaagagg gcaacgtgtt cagctgcagc gtgatgcacg aggccctgca caaccactac 1380

acccagaaaa gcctgagcct gtctctgggc aagatgttct gggtgctcgt ggtcgttggc 1440

ggagtgctgg cctgttacag cctgctggtt accgtggcct tcatcatctt ttgggtcaag 1500

cggggcagaa agaagctgct ctacatcttc aagcagccct tcatgcggcc cgtgcagacc 1560

acacaagagg aagatggctg ctcctgcaga ttccccgagg aagaagaagg cggctgcgag 1620

ctgagagtga agttcagcag atccgccgac gctccagcct atcagcaggg ccaaaaccag 1680

ctgtacaacg agctgaacct ggggagaaga gaagagtacg acgtgctgga taagcggaga 1740

ggcagagatc ctgaaatggg cggcaagccc agacggaaga atcctcaaga gggcctgtat 1800

aatgagctgc agaaagacaa gatggccgag gcctacagcg agatcggaat gaagggcgag 1860

cgcagaagag gcaagggaca cgatggactg taccagggcc tgagcaccgc caccaaggat 1920

acctatgacg cactgcacat gcaggccctg ccacctaga 1959

<210> 10

<211> 1950

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗BCMA CAR

<400> 10

gaggtgcagc tggtgcagag cggaggaggc ctggtgcagc ctggcaggtc cctgcgcctg 60

tcttgcaccg ccagcggctt cacatttggc gactatgcca tgtcctggtt caagcaggca 120

ccaggcaagg gcctggagtg ggtgggcttt atccgctcta aggcctacgg cggcaccaca 180

gagtatgccg ccagcgtgaa gggccggttc accatcagcc gggacgactc taagagcatc 240

gcctacctgc agatgaactc tctgaagacc gaggacacag ccgtgtacta ttgcgcagca 300

tggagcgccc caaccgatta ttggggccag ggcaccctgg tgacagtgag ctccggcggc 360

ggcggctctg gaggaggagg aagcggagga ggaggatccg acatccagat gacacagtcc 420

cctgcctttc tgtccgcctc tgtgggcgat agggtgaccg tgacatgtcg cgcctcccag 480

ggcatctcta actacctggc ctggtatcag cagaagcccg gcaatgcccc tcggctgctg 540

atctacagcg cctccaccct gcagagcgga gtgccctccc ggttcagagg aaccggctat 600

ggcacagagt tttctctgac catcgacagc ctgcagccag aggatttcgc cacatactat 660

tgtcagcagt cttacaccag ccggcagaca tttggccccg gcacaagact ggatatcaag 720

gagtctaaat acggaccgcc ttgtcctcct tgtcccgctc ctcctgttgc cggaccttcc 780

gtgttcctgt ttcctccaaa gcctaaggac accctgatga tcagcaggac ccctgaagtg 840

acctgcgtgg tggtggatgt gtcccaagag gatcccgagg tgcagttcaa ctggtatgtg 900

gacggcgtgg aagtgcacaa cgccaagacc aagcctagag aggaacagtt ccagagcacc 960

tacagagtgg tgtccgtgct gacagtgctg caccaggatt ggctgaacgg caaagagtac 1020

aagtgcaagg tgtccaacaa gggcctgcct agcagcatcg agaaaaccat ctccaaggcc 1080

aagggccagc caagagagcc ccaggtttac acactgcctc caagccaaga ggaaatgacc 1140

aagaatcagg tgtccctgac atgcctggtc aagggcttct acccctccga tatcgccgtg 1200

gaatgggaga gcaatggcca gcctgagaac aactacaaga ccacacctcc tgtgctggac 1260

agcgacggca gtttcttcct gtatagtaga ctcaccgtgg ataaatcaag atggcaagag 1320

ggcaacgtgt tcagctgcag cgtgatgcac gaggccctgc acaaccacta cacccagaaa 1380

agcctgagcc tgtctctggg caagatgttc tgggtgctcg tggtcgttgg cggagtgctg 1440

gcctgttaca gcctgctggt taccgtggcc ttcatcatct tttgggtcaa gcggggcaga 1500

aagaagctgc tctacatctt caagcagccc ttcatgcggc ccgtgcagac cacacaagag 1560

gaagatggct gctcctgcag attccccgag gaagaagaag gcggctgcga gctgagagtg 1620

aagttcagca gatccgccga cgctccagcc tatcagcagg gccaaaacca gctgtacaac 1680

gagctgaacc tggggagaag agaagagtac gacgtgctgg ataagcggag aggcagagat 1740

cctgaaatgg gcggcaagcc cagacggaag aatcctcaag agggcctgta taatgagctg 1800

cagaaagaca agatggccga ggcctacagc gagatcggaa tgaagggcga gcgcagaaga 1860

ggcaagggac acgatggact gtaccagggc ctgagcaccg ccaccaagga tacctatgac 1920

gcactgcaca tgcaggccct gccacctaga 1950

<210> 11

<211> 1953

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗BCMA CAR

<400> 11

gaggtgcagc tggtggagtc cggaggaggc ctggtgaagc caggaggctc tctgaggctg 60

agctgcgcag cctccggctt caccttttct gactactata tgagctggat caggcaggca 120

ccaggcaagg gcctggagtg ggtgtcttac atcagctcct ctggcagcac aatctactat 180

gccgactccg tgaagggcag gttcaccatc tctcgcgata acgccaagaa tagcctgtat 240

ctgcagatga actccctgcg ggccgaggat acagccgtgt actattgcgc caaggtggac 300

ggcccccctt cctttgatat ctggggccag ggcacaatgg tgaccgtgag ctccggagga 360

ggaggatccg gcggaggagg ctctggcggc ggcggctcta gctatgtgct gacccagcca 420

ccatccgtgt ctgtggcacc tggacagaca gcaaggatca cctgtggagc aaacaatatc 480

ggcagcaagt ccgtgcactg gtaccagcag aagcctggcc aggccccaat gctggtggtg 540

tatgacgatg acgatcggcc cagcggcatc cctgagagat tttctggcag caactccggc 600

aataccgcca cactgaccat ctctggagtg gaggcaggcg acgaggcaga ttacttctgt 660

cacctgtggg accggagcag agatcactac gtgttcggca caggcaccaa gctgaccgtg 720

ctggaatcta agtacggacc gccttgtcct ccttgtcccg ctcctcctgt tgccggacct 780

tccgtgttcc tgtttcctcc aaagcctaag gacaccctga tgatcagcag gacccctgaa 840

gtgacctgcg tggtggtgga tgtgtcccaa gaggatcccg aggtgcagtt caactggtat 900

gtggacggcg tggaagtgca caacgccaag accaagccta gagaggaaca gttccagagc 960

acctacagag tggtgtccgt gctgacagtg ctgcaccagg attggctgaa cggcaaagag 1020

tacaagtgca aggtgtccaa caagggcctg cctagcagca tcgagaaaac catctccaag 1080

gccaagggcc agccaagaga gccccaggtt tacacactgc ctccaagcca agaggaaatg 1140

accaagaatc aggtgtccct gacatgcctg gtcaagggct tctacccctc cgatatcgcc 1200

gtggaatggg agagcaatgg ccagcctgag aacaactaca agaccacacc tcctgtgctg 1260

gacagcgacg gcagtttctt cctgtatagt agactcaccg tggataaatc aagatggcaa 1320

gagggcaacg tgttcagctg cagcgtgatg cacgaggccc tgcacaacca ctacacccag 1380

aaaagcctga gcctgtctct gggcaagatg ttctgggtgc tcgtggtcgt tggcggagtg 1440

ctggcctgtt acagcctgct ggttaccgtg gccttcatca tcttttgggt caagcggggc 1500

agaaagaagc tgctctacat cttcaagcag cccttcatgc ggcccgtgca gaccacacaa 1560

gaggaagatg gctgctcctg cagattcccc gaggaagaag aaggcggctg cgagctgaga 1620

gtgaagttca gcagatccgc cgacgctcca gcctatcagc agggccaaaa ccagctgtac 1680

aacgagctga acctggggag aagagaagag tacgacgtgc tggataagcg gagaggcaga 1740

gatcctgaaa tgggcggcaa gcccagacgg aagaatcctc aagagggcct gtataatgag 1800

ctgcagaaag acaagatggc cgaggcctac agcgagatcg gaatgaaggg cgagcgcaga 1860

agaggcaagg gacacgatgg actgtaccag ggcctgagca ccgccaccaa ggatacctat 1920

gacgcactgc acatgcaggc cctgccacct aga 1953

<210> 12

<211> 1974

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗BCMA CAR

<400> 12

agctatgagc tgacacagcc tccaagcgcc tctggcacac ctggacagcg agtgacaatg 60

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<220>

<223> 抗BCMA CAR

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<211> 1959

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tactggatgc ggcaggcccc tggacaggga ctcgaatcta tgggctggat caaccccaat 540

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Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala

210 215 220

Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Ser Gly Ser Phe Asp Asn Trp Gly Gln

225 230 235 240

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys

245 250 255

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe

260 265 270

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val

275 280 285

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe

290 295 300

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro

305 310 315 320

Arg Glu Glu Gln Phe Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr

325 330 335

Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val

340 345 350

Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala

355 360 365

Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln

370 375 380

Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly

385 390 395 400

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro

405 410 415

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser

420 425 430

Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu

435 440 445

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His

450 455 460

Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Met Phe Trp Val

465 470 475 480

Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr

485 490 495

Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu

500 505 510

Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu

515 520 525

Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys

530 535 540

Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln

545 550 555 560

Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu

565 570 575

Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly

580 585 590

Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu

595 600 605

Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly

610 615 620

Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser

625 630 635 640

Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro

645 650 655

Pro Arg

<210> 19

<211> 654

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗BCMA CAR

<400> 19

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Ala Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Ile Ala Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Trp Tyr

20 25 30

Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr Glu Asp Ser

35 40 45

Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly

50 55 60

Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala

65 70 75 80

Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Asn Thr Arg Ser Ser Thr Leu Val Phe Gly

85 90 95

Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Glu Met Ala Glu Val

115 120 125

Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Met Lys Lys Pro Gly Ala Ser Leu

130 135 140

Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ile Asp Tyr Tyr Val

145 150 155 160

Tyr Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Ser Met Gly Trp

165 170 175

Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly

180 185 190

Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu

195 200 205

Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg

210 215 220

Ser Gln Arg Asp Gly Tyr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

225 230 235 240

Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro

245 250 255

Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

260 265 270

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

275 280 285

Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val

290 295 300

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

305 310 315 320

Phe Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

325 330 335

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly

340 345 350

Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

355 360 365

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr

370 375 380

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

385 390 395 400

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

405 410 415

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

420 425 430

Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe

435 440 445

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

450 455 460

Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Met Phe Trp Val Leu Val Val Val

465 470 475 480

Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile

485 490 495

Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys

500 505 510

Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys

515 520 525

Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val

530 535 540

Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn

545 550 555 560

Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val

565 570 575

Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg

580 585 590

Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys

595 600 605

Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg

610 615 620

Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys

625 630 635 640

Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

645 650

<210> 20

<211> 653

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗BCMA CAR

<400> 20

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Ala Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Ile Ala Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Trp Tyr

20 25 30

Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr Glu Asp Ser

35 40 45

Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly

50 55 60

Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala

65 70 75 80

Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Asn Thr Arg Ser Ser Thr Leu Val Phe Gly

85 90 95

Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Glu Met Ala Glu Val

115 120 125

Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Met Lys Lys Pro Gly Ala Ser Leu

130 135 140

Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ile Asp Tyr Tyr Val

145 150 155 160

Tyr Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Ser Met Gly Trp

165 170 175

Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly

180 185 190

Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu

195 200 205

Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg

210 215 220

Ser Gln Arg Asp Gly Tyr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

225 230 235 240

Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro

245 250 255

Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

260 265 270

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

275 280 285

Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val

290 295 300

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

305 310 315 320

Phe Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

325 330 335

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly

340 345 350

Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

355 360 365

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr

370 375 380

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

385 390 395 400

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

405 410 415

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

420 425 430

Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe

435 440 445

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

450 455 460

Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Met Phe Trp Val Leu Val Val Val

465 470 475 480

Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile

485 490 495

Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr

500 505 510

Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln

515 520 525

Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys

530 535 540

Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln

545 550 555 560

Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu

565 570 575

Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg

580 585 590

Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met

595 600 605

Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly

610 615 620

Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp

625 630 635 640

Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

645 650

<210> 21

<211> 5

<212> PRT

<213> 智人 (Homo sapiens)

<220>

<223> BCMA表位

<400> 21

Tyr Phe Asp Ser Leu

1 5

<210> 22

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-23 CDR-L1

<400> 22

Thr Gly Ser Ser Ser Asp Val Gly Lys Tyr Asn Leu Val Ser

1 5 10

<210> 23

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-23 CDR-L2

<400> 23

Asp Val Asn Lys Arg Pro Ser

1 5

<210> 24

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-23 CDR-L3

<400> 24

Ser Ser Tyr Gly Gly Ser Arg Ser Tyr Val

1 5 10

<210> 25

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-23预测的剪接受体位点

<400> 25

ggctgattat tattgtagct catatggagg tagtaggtct t 41

<210> 26

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-23预测的剪接受体位点

<400> 26

ctactacatg agctggatcc gccaggctcc agggaagggg c 41

<210> 27

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-23预测的剪接受体位点 (O/SSE)

<400> 27

ctactatatg tcctggatca gacaggcacc tggcaagggc c 41

<210> 28

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-23预测的剪接受体位点 (O/SSE)

<400> 28

ggcagattac tattgttcta gctacggcgg cagcagatcc t 41

<210> 29

<211> 243

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-23 scFv

<400> 29

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Val Asp Gly Asp Tyr Thr Glu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser

130 135 140

Gly Ser Pro Gly Gln Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser

145 150 155 160

Asp Val Gly Lys Tyr Asn Leu Val Ser Trp Tyr Gln Gln Pro Pro Gly

165 170 175

Lys Ala Pro Lys Leu Ile Ile Tyr Asp Val Asn Lys Arg Pro Ser Gly

180 185 190

Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu

195 200 205

Thr Ile Ser Gly Leu Gln Gly Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser

210 215 220

Ser Tyr Gly Gly Ser Arg Ser Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val

225 230 235 240

Thr Val Leu

<210> 30

<211> 729

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-23 scFv

<400> 30

gaagtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtcaagc ctggagggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt gactactaca tgagctggat ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtttcatac attagtagta gtggtagtac catatactac 180

gcagactctg tgaagggccg attcaccatc tccagggaca acgccaagaa ctcactgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gaaagtagac 300

ggagactaca cagaggacta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctcaggtgga 360

ggcggttcag gcggaggtgg ctctggcggt ggcggatcgc agtctgccct gactcagcct 420

gcctccgtgt ctgggtctcc tggacagtcg atcactatct cctgcactgg aagcagcagt 480

gatgttggca aatataatct tgtctcctgg taccaacagc ccccaggcaa agcccccaag 540

ctcataattt atgacgtcaa taagcggccc tcaggggttt ctaatcgctt ctctggctcc 600

aagtctggca acacggccac cctgacaatc tctgggctcc agggtgacga cgaggctgat 660

tattattgta gctcatatgg aggtagtagg tcttatgtct tcggaactgg gaccaaggtg 720

accgtccta 729

<210> 31

<211> 729

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-23 scFv

<400> 31

gaggtgcagc tggtggagtc cggaggaggc ctggtgaagc caggaggctc cctgaggctg 60

tcttgcgcag ccagcggctt cacctttagc gactactata tgtcctggat cagacaggca 120

cctggcaagg gcctggagtg ggtgagctac atcagctcct ctggctccac aatctactat 180

gccgactctg tgaagggccg gtttaccatc agcagagata acgccaagaa ttccctgtat 240

ctgcagatga acagcctgag ggccgaggac acagccgtgt actattgcgc caaggtggac 300

ggcgattaca ccgaggatta ttggggccag ggcacactgg tgaccgtgag ctccggcggc 360

ggcggctctg gaggaggagg cagcggcgga ggaggctccc agtctgccct gacacagcca 420

gccagcgtgt ccggctctcc cggacagtcc atcacaatct cttgtaccgg ctctagctcc 480

gacgtgggca agtacaacct ggtgtcctgg tatcagcagc cccctggcaa ggcccctaag 540

ctgatcatct acgatgtgaa caagaggcca tctggcgtga gcaatcgctt cagcggctcc 600

aagtctggca ataccgccac actgaccatc agcggcctgc agggcgacga tgaggcagat 660

tactattgtt ctagctacgg cggcagcaga tcctacgtgt tcggcacagg caccaaggtg 720

accgtgctg 729

<210> 32

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-23 VH链

<400> 32

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Val Asp Gly Asp Tyr Thr Glu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 33

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-23 VL链

<400> 33

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asp Val Gly Lys Tyr

20 25 30

Asn Leu Val Ser Trp Tyr Gln Gln Pro Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Ile Ile Tyr Asp Val Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Gln Gly Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Gly Gly Ser

85 90 95

Arg Ser Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu

100 105 110

<210> 34

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-23、-26 CDR-H1 (aa) Kabat编号

<400> 34

Asp Tyr Tyr Met Ser

1 5

<210> 35

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-23、-26 CDR-H2 (aa) Kabat编号

<400> 35

Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 36

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-23 CDR-H3 (aa)

<400> 36

Val Asp Gly Asp Tyr Thr Glu Asp Tyr

1 5

<210> 37

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-25 CDR-H1 (aa) Kabat编号

<400> 37

Asp Tyr Ala Met Ser

1 5

<210> 38

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-25 CDR-H2 (aa) Kabat编号

<400> 38

Phe Ile Arg Ser Lys Ala Tyr Gly Gly Thr Thr Glu Tyr Ala Ala Ser

1 5 10 15

Val Lys Gly

<210> 39

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-25 CDR-H3 (aa)

<400> 39

Trp Ser Ala Pro Thr Asp Tyr

1 5

<210> 40

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-25 CDR-L1 (aa)

<400> 40

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 41

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-25 CDR-L2 (aa)

<400> 41

Ser Ala Ser Thr Leu Gln Ser

1 5

<210> 42

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-25 CDR-L3 (aa)

<400> 42

Gln Gln Ser Tyr Thr Ser Arg Gln Thr

1 5

<210> 43

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-25预测的剪接受体位点

<400> 43

ctatgccatg tcctggttca ggcaggcacc aggcaagggc c 41

<210> 44

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-25预测的剪接受体位点

<400> 44

gtccgcctct gtgggcgata gggtgaccgt gacatgtcgc g 41

<210> 45

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-25预测的剪接受体位点

<400> 45

gtgggcttta tccgctctaa ggcctacggc ggcaccacag a 41

<210> 46

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-25预测的剪接受体位点

<400> 46

gtgacatgtc gcgcctccca gggcatctct aactacctgg c 41

<210> 47

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-25预测的剪接受体位点

<400> 47

tacagcgcct ccaccctgca gagcggagtg ccctcccggt t 41

<210> 48

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-25预测的剪接受体位点 (O/SSE)

<400> 48

ctatgccatg tcctggttca agcaggcacc aggcaagggc c 41

<210> 49

<211> 240

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-25 scFv序列

<400> 49

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Asp Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Phe Ile Arg Ser Lys Ala Tyr Gly Gly Thr Thr Glu Tyr Ala Ala

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ile

65 70 75 80

Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Ala Trp Ser Ala Pro Thr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu

130 135 140

Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Val Thr Cys Arg Ala Ser Gln

145 150 155 160

Gly Ile Ser Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala

165 170 175

Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro

180 185 190

Ser Arg Phe Arg Gly Thr Gly Tyr Gly Thr Glu Phe Ser Leu Thr Ile

195 200 205

Asp Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser

210 215 220

Tyr Thr Ser Arg Gln Thr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Asp Ile Lys

225 230 235 240

<210> 50

<211> 720

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-25 scFv

<400> 50

gaggtgcagc tggtgcagag cggaggaggc ctggtgcagc ctggcaggtc cctgcgcctg 60

tcttgcaccg ccagcggctt cacatttggc gactatgcca tgtcctggtt caggcaggca 120

ccaggcaagg gcctggagtg ggtgggcttt atccgctcta aggcctacgg cggcaccaca 180

gagtatgccg ccagcgtgaa gggccggttc accatcagcc gggacgactc taagagcatc 240

gcctacctgc agatgaactc tctgaagacc gaggacacag ccgtgtacta ttgcgcagca 300

tggagcgccc caaccgatta ttggggccag ggcaccctgg tgacagtgag ctccggcggc 360

ggcggctctg gaggaggagg aagcggagga ggaggatccg acatccagat gacacagtcc 420

cctgcctttc tgtccgcctc tgtgggcgat agggtgaccg tgacatgtcg cgcctcccag 480

ggcatctcta actacctggc ctggtatcag cagaagcccg gcaatgcccc tcggctgctg 540

atctacagcg cctccaccct gcagagcgga gtgccctccc ggttcagagg aaccggctat 600

ggcacagagt tttctctgac catcgacagc ctgcagccag aggatttcgc cacatactat 660

tgtcagcagt cttacaccag ccggcagaca tttggccccg gcacaagact ggatatcaag 720

<210> 51

<211> 720

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-25 scFv (nt) (O/SSE)

<400> 51

gaggtgcagc tggtgcagag cggaggaggc ctggtgcagc ctggcaggtc cctgcgcctg 60

tcttgcaccg ccagcggctt cacatttggc gactatgcca tgtcctggtt caagcaggca 120

ccaggcaagg gcctggagtg ggtgggcttt atccgctcta aggcctacgg cggcaccaca 180

gagtatgccg ccagcgtgaa gggccggttc accatcagcc gggacgactc taagagcatc 240

gcctacctgc agatgaactc tctgaagacc gaggacacag ccgtgtacta ttgcgcagca 300

tggagcgccc caaccgatta ttggggccag ggcaccctgg tgacagtgag ctccggcggc 360

ggcggctctg gaggaggagg aagcggagga ggaggatccg acatccagat gacacagtcc 420

cctgcctttc tgtccgcctc tgtgggcgat agggtgaccg tgacatgtcg cgcctcccag 480

ggcatctcta actacctggc ctggtatcag cagaagcccg gcaatgcccc tcggctgctg 540

atctacagcg cctccaccct gcagagcgga gtgccctccc ggttcagagg aaccggctat 600

ggcacagagt tttctctgac catcgacagc ctgcagccag aggatttcgc cacatactat 660

tgtcagcagt cttacaccag ccggcagaca tttggccccg gcacaagact ggatatcaag 720

<210> 52

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-25 VH链

<400> 52

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Asp Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Phe Ile Arg Ser Lys Ala Tyr Gly Gly Thr Thr Glu Tyr Ala Ala

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ile

65 70 75 80

Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Ala Trp Ser Ala Pro Thr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 53

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-25 VL链

<400> 53

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Val Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Arg Gly

50 55 60

Thr Gly Tyr Gly Thr Glu Phe Ser Leu Thr Ile Asp Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Ser Arg Gln

85 90 95

Thr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Asp Ile Lys

100 105

<210> 54

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-26 CDR-H3

<400> 54

Val Asp Gly Pro Pro Ser Phe Asp Ile

1 5

<210> 55

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-26 CDR-L1

<400> 55

Gly Ala Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val His

1 5 10

<210> 56

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-26 CDR-L2

<400> 56

Asp Asp Asp Asp Arg Pro Ser

1 5

<210> 57

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-26 CDR-L3

<400> 57

His Leu Trp Asp Arg Ser Arg Asp His Tyr Val

1 5 10

<210> 58

<211> 241

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-26 scFv序列

<400> 58

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Val Asp Gly Pro Pro Ser Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser

130 135 140

Val Ala Pro Gly Gln Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Ala Asn Asn Ile

145 150 155 160

Gly Ser Lys Ser Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro

165 170 175

Met Leu Val Val Tyr Asp Asp Asp Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu

180 185 190

Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser

195 200 205

Gly Val Glu Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys His Leu Trp Asp

210 215 220

Arg Ser Arg Asp His Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Thr Val

225 230 235 240

Leu

<210> 59

<211> 723

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-26 scFv

<400> 59

gaggtgcagc tggtggagtc cggaggaggc ctggtgaagc caggaggctc tctgaggctg 60

agctgcgcag cctccggctt caccttttct gactactata tgagctggat caggcaggca 120

ccaggcaagg gcctggagtg ggtgtcttac atcagctcct ctggcagcac aatctactat 180

gccgactccg tgaagggcag gttcaccatc tctcgcgata acgccaagaa tagcctgtat 240

ctgcagatga actccctgcg ggccgaggat acagccgtgt actattgcgc caaggtggac 300

ggcccccctt cctttgatat ctggggccag ggcacaatgg tgaccgtgag ctccggagga 360

ggaggatccg gcggaggagg ctctggcggc ggcggctcta gctatgtgct gacccagcca 420

ccatccgtgt ctgtggcacc tggacagaca gcaaggatca cctgtggagc aaacaatatc 480

ggcagcaagt ccgtgcactg gtaccagcag aagcctggcc aggccccaat gctggtggtg 540

tatgacgatg acgatcggcc cagcggcatc cctgagagat tttctggcag caactccggc 600

aataccgcca cactgaccat ctctggagtg gaggcaggcg acgaggcaga ttacttctgt 660

cacctgtggg accggagcag agatcactac gtgttcggca caggcaccaa gctgaccgtg 720

ctg 723

<210> 60

<211> 723

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-26 scFv (nt) (O/SSE)

<400> 60

gaggtgcagc tggtggagtc cggaggaggc ctggtgaagc caggaggctc tctgaggctg 60

agctgcgcag cctccggctt caccttttct gactactata tgagctggat caggcaggca 120

ccaggcaagg gcctggagtg ggtgtcttac atcagctcct ctggcagcac aatctactat 180

gccgactccg tgaagggcag gttcaccatc tctcgcgata acgccaagaa tagcctgtat 240

ctgcagatga actccctgcg ggccgaggat acagccgtgt actattgcgc caaggtggac 300

ggcccccctt cctttgatat ctggggccag ggcacaatgg tgaccgtgag ctccggagga 360

ggaggatccg gcggaggagg ctctggcggc ggcggctcta gctatgtgct gacccagcca 420

ccatccgtgt ctgtggcacc tggacagaca gcaaggatca cctgtggagc aaacaatatc 480

ggcagcaagt ccgtgcactg gtaccagcag aagcctggcc aggccccaat gctggtggtg 540

tatgacgatg acgatcggcc cagcggcatc cctgagagat tttctggcag caactccggc 600

aataccgcca cactgaccat ctctggagtg gaggcaggcg acgaggcaga ttacttctgt 660

cacctgtggg accggagcag agatcactac gtgttcggca caggcaccaa gctgaccgtg 720

ctg 723

<210> 61

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-26 VH链

<400> 61

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Val Asp Gly Pro Pro Ser Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Met Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 62

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-26 VL链

<400> 62

Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Ala Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Met Leu Val Val Tyr

35 40 45

Asp Asp Asp Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Glu Ala Gly

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys His Leu Trp Asp Arg Ser Arg Asp His

85 90 95

Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 63

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-52 CDR-H1

<400> 63

Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp

1 5

<210> 64

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-52 CDR-H1 (aa) - AbM编号

<400> 64

Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Gly

1 5 10

<210> 65

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-52 CDR-H1 (aa) - Chothia编号

<400> 65

Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr

1 5

<210> 66

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-52 CDR-H1 (aa) - Kabat编号

<400> 66

Ser Tyr Trp Ile Gly

1 5

<210> 67

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-52 CDR-H2 (aa)

<400> 67

Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr

1 5

<210> 68

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-52 CDR-H2 (aa) - AbM编号

<400> 68

Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg

1 5 10

<210> 69

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-52 CDR-H2 (aa) - Chothia编号

<400> 69

Tyr Pro Gly Asp Ser Asp

1 5

<210> 70

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-52 CDR-H2 (aa) - Kabat编号

<400> 70

Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 71

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-52 CDR-H3 (aa)

<400> 71

Ala Arg Tyr Ser Gly Ser Phe Asp Asn

1 5

<210> 72

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-52 CDR-H3 (aa) - Kabat、Chothia和AbM编号

<400> 72

Tyr Ser Gly Ser Phe Asp Asn

1 5

<210> 73

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-52 CDR-L1 (aa)

<400> 73

Ser Ser Asn Ile Gly Ser His Ser

1 5

<210> 74

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-52 CDR-L1 (aa) - Kabat、Chothia和AbM编号

<400> 74

Ser Gly Thr Ser Ser Asn Ile Gly Ser His Ser Val Asn

1 5 10

<210> 75

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-52 CDR-L2 (aa)

<400> 75

Thr Asn Asn

1

<210> 76

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-52 CDR-L2 (aa) - Kabat、Chothia和AbM编号

<400> 76

Thr Asn Asn Gln Arg Pro Ser

1 5

<210> 77

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-52 CDR-L3 (aa) - Kabat、Chothia和AbM编号

<400> 77

Ala Ala Trp Asp Gly Ser Leu Asn Gly Leu Val

1 5 10

<210> 78

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-52预测的剪接受体位点

<400> 78

ctggccatca gtggcctcca gtctgaggat gaggctgatt a 41

<210> 79

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-52预测的剪接受体位点

<400> 79

agatacagcc cgtccttcca aggccacgtc accatctcag c 41

<210> 80

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-52预测的剪接受体位点 (O/SSE)

<400> 80

ctggctattt ctggactgca gagcgaggac gaggccgact a 41

<210> 81

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-52预测的剪接受体位点 (O/SSE)

<400> 81

agatacagcc ctagctttca gggccacgtg accatcagcg c 41

<210> 82

<211> 744

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-52 scFv

<400> 82

tcctatgagc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatg 60

tcttgttctg gaaccagctc caacatcgga agtcactctg taaactggta ccagcagctc 120

ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat actaataatc agcggccctc aggggtccct 180

gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tggcctccag 240

tctgaggatg aggctgatta ttactgtgca gcatgggatg gcagcctgaa tggtctggta 300

ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta ggttctagag gtggtggtgg tagcggcggc 360

ggcggctctg gtggtggtgg atccctcgag atggccgagg tgcagctggt gcagtctgga 420

gcagaggtga aaaagcccgg ggagtctctg aagatctcct gtaagggttc tggatacagc 480

tttaccagct actggatcgg ctgggtgcgc cagatgcccg ggaaaggcct ggagtggatg 540

gggatcatct atcctggtga ctctgatacc agatacagcc cgtccttcca aggccacgtc 600

accatctcag ctgacaagtc catcagcact gcctacctgc agtggagcag cctgaaggcc 660

tcggacaccg ccatgtatta ctgtgcgcgc tactctggtt ctttcgataa ctggggtcaa 720

ggtactctgg tgaccgtctc ctca 744

<210> 83

<211> 248

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-52 scFv

<400> 83

Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Met Ser Cys Ser Gly Thr Ser Ser Asn Ile Gly Ser His

20 25 30

Ser Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Thr Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Gly Ser Leu

85 90 95

Asn Gly Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ser

100 105 110

Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Leu Glu Met Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys

130 135 140

Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser

145 150 155 160

Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly

165 170 175

Leu Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr

180 185 190

Ser Pro Ser Phe Gln Gly His Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile

195 200 205

Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala

210 215 220

Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Ser Gly Ser Phe Asp Asn Trp Gly Gln

225 230 235 240

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

245

<210> 84

<211> 744

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-52 scFv (nt) (O/SSE)

<400> 84

agctatgagc tgacacagcc tccaagcgcc tctggcacac ctggacagcg agtgacaatg 60

agctgtagcg gcaccagcag caacatcggc agccacagcg tgaactggta tcagcagctg 120

cctggcacag cccctaaact gctgatctac accaacaacc agcggcctag cggcgtgccc 180

gatagatttt ctggcagcaa gagcggcaca agcgccagcc tggctatttc tggactgcag 240

agcgaggacg aggccgacta ttattgtgcc gcctgggacg gctctctgaa cggccttgtt 300

tttggcggag gcaccaagct gacagtgctg ggatctagag gtggcggagg atctggcggc 360

ggaggaagcg gaggcggcgg atctcttgaa atggctgaag tgcagctggt gcagtctggc 420

gccgaagtga agaagcctgg cgagagcctg aagatcagct gcaaaggcag cggctacagc 480

ttcaccagct actggatcgg ctgggtccga cagatgcctg gcaaaggcct tgagtggatg 540

ggcatcatct accccggcga cagcgacacc agatacagcc ctagctttca gggccacgtg 600

accatcagcg ccgacaagtc tatcagcacc gcctacctgc agtggtccag cctgaaggcc 660

tctgacaccg ccatgtacta ctgcgccaga tactctggca gcttcgacaa ttggggccag 720

ggcacactgg tcaccgtgtc cagc 744

<210> 85

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-52 VH链

<400> 85

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe

50 55 60

Gln Gly His Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Ser Gly Ser Phe Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 86

<211> 350

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-52 VH链

<400> 86

gaggtgcagc tggtgcagtc tggagcagag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc 60

tcctgtaagg gttctggata cagctttacc agctactgga tcggctgggt gcgccagatg 120

cccgggaaag gcctggagtg gatggggatc atctatcctg gtgactctga taccagatac 180

agcccgtcct tccaaggcca cgtcaccatc tcagctgaca agtccatcag cactgcctac 240

ctgcagtgga gcagcctgaa ggcctcggac accgccatgt attactgtgc gcgctactct 300

ggttctttcg ataactgggg tcaaggtact ctggtgaccg tctcctcagc 350

<210> 87

<211> 348

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-52 VH链 (nt) (O/SSE)

<400> 87

gaagtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaagc ctggcgagag cctgaagatc 60

agctgcaaag gcagcggcta cagcttcacc agctactgga tcggctgggt ccgacagatg 120

cctggcaaag gccttgagtg gatgggcatc atctaccccg gcgacagcga caccagatac 180

agccctagct ttcagggcca cgtgaccatc agcgccgaca agtctatcag caccgcctac 240

ctgcagtggt ccagcctgaa ggcctctgac accgccatgt actactgcgc cagatactct 300

ggcagcttcg acaattgggg ccagggcaca ctggtcaccg tgtccagc 348

<210> 88

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-52 VL链

<400> 88

Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Met Ser Cys Ser Gly Thr Ser Ser Asn Ile Gly Ser His

20 25 30

Ser Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Thr Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Gly Ser Leu

85 90 95

Asn Gly Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105 110

<210> 89

<211> 333

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-52 VL链

<400> 89

tcctatgagc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatg 60

tcttgttctg gaaccagctc caacatcgga agtcactctg taaactggta ccagcagctc 120

ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat actaataatc agcggccctc aggggtccct 180

gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tggcctccag 240

tctgaggatg aggctgatta ttactgtgca gcatgggatg gcagcctgaa tggtctggta 300

ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta ggt 333

<210> 90

<211> 333

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-52 VL链 (nt) (O/SSE)

<400> 90

agctatgagc tgacacagcc tccaagcgcc tctggcacac ctggacagcg agtgacaatg 60

agctgtagcg gcaccagcag caacatcggc agccacagcg tgaactggta tcagcagctg 120

cctggcacag cccctaaact gctgatctac accaacaacc agcggcctag cggcgtgccc 180

gatagatttt ctggcagcaa gagcggcaca agcgccagcc tggctatttc tggactgcag 240

agcgaggacg aggccgacta ttattgtgcc gcctgggacg gctctctgaa cggccttgtt 300

tttggcggag gcaccaagct gacagtgctg gga 333

<210> 91

<211> 5

<212> PRT

<213> 智人 (Homo sapiens)

<220>

<223> BCMA-52-scFV-mFc BCMA结合表位1

<400> 91

Gln Asn Glu Tyr Phe

1 5

<210> 92

<211> 6

<212> PRT

<213> 智人 (Homo sapiens)

<220>

<223> BCMA-52-scFV-mFc BCMA结合表位2

<400> 92

Cys Ile Pro Cys Gln Leu

1 5

<210> 93

<211> 5

<212> PRT

<213> 智人 (Homo sapiens)

<220>

<223> BCMA-52-scFV-mFc BCMA结合表位3

<400> 93

Cys Gln Arg Tyr Cys

1 5

<210> 94

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-55 CDR-H1 (aa)

<400> 94

Gly Tyr Thr Phe Ile Asp Tyr Tyr

1 5

<210> 95

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-55 CDR-H1 (aa) - AbM编号

<400> 95

Gly Tyr Thr Phe Ile Asp Tyr Tyr Val Tyr

1 5 10

<210> 96

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-55 CDR-H1 (aa) - Chothia编号

<400> 96

Gly Tyr Thr Phe Ile Asp Tyr

1 5

<210> 97

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-55 CDR-H1 (aa) - Kabat编号

<400> 97

Asp Tyr Tyr Val Tyr

1 5

<210> 98

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-55 CDR-H2 (aa)

<400> 98

Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr

1 5

<210> 99

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-55 CDR-H2 (aa) - AbM编号

<400> 99

Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn

1 5 10

<210> 100

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-55 CDR-H2 (aa) - Chothia编号

<400> 100

Asn Pro Asn Ser Gly Gly

1 5

<210> 101

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-55 CDR-H2 (aa) - Kabat编号

<400> 101

Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 102

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-55 CDR-H3 (aa)

<400> 102

Ala Arg Ser Gln Arg Asp Gly Tyr Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 103

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-55 CDR-H3 (aa) - Kabat、Chothia和AbM编号

<400> 103

Ser Gln Arg Asp Gly Tyr Met Asp Tyr

1 5

<210> 104

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-55 CDR-L1 (aa)

<400> 104

Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp

1 5

<210> 105

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-55 CDR-L1 (aa) - Kabat、Chothia和AbM编号

<400> 105

Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly

1 5

<210> 106

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-55 CDR-L2 (aa)

<400> 106

Glu Asp Ser

1

<210> 107

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-55 CDR-L2 (aa) - Kabat、Chothia和AbM编号

<400> 107

Glu Asp Ser Lys Arg Pro Ser

1 5

<210> 108

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-55 CDR-L3 (aa) - Kabat、Chothia和AbM编号

<400> 108

Ser Ser Asn Thr Arg Ser Ser Thr Leu Val

1 5 10

<210> 109

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-55预测的剪接受体位点

<400> 109

gccctcaggg gtttctaatc gcttctctgg ctccaagtct g 41

<210> 110

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-55预测的剪接受体位点

<400> 110

cgaggctgat tattactgca gctcaaatac aagaagcagc a 41

<210> 111

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-55预测的剪接受体位点 (O/SSE)

<400> 111

cgaggccgat tactactgca gcagcaacac ccggtccagc a 41

<210> 112

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-55预测的剪接受体位点 (O/SSE)

<400> 112

gcccagcggc gtgtccaata gattcagcgg cagcaagagc g 41

<210> 113

<211> 732

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-55 scFv

<400> 113

caatctgccc tgactcagcc tgcctccgtg tctgcgtctc ctggacagtc gatcgccatc 60

tcctgcactg gaaccagcag tgacgttggt tggtatcaac agcacccagg caaagccccc 120

aaactcatga tttatgagga cagtaagcgg ccctcagggg tttctaatcg cttctctggc 180

tccaagtctg gcaacacggc ctccctgacc atctctgggc tccaggctga ggacgaggct 240

gattattact gcagctcaaa tacaagaagc agcactttgg tgttcggcgg agggaccaag 300

ctgaccgtcc taggttctag aggtggtggt ggtagcggcg gcggcggctc tggtggtggt 360

ggatccctcg agatggccga agtgcagctg gtgcagtctg gggctgagat gaagaagcct 420

ggggcctcac tgaagctctc ctgcaaggct tctggataca ccttcatcga ctactatgta 480

tactggatgc gacaggcccc tggacaaggg cttgagtcca tgggatggat caaccctaac 540

agtggtggca caaactatgc acagaagttt cagggcaggg tcaccatgac cagggacacg 600

tccatcagca cagcctacat ggagctgagc aggctgagat ctgacgacac cgccatgtat 660

tactgtgcgc gctcccagcg tgacggttac atggattact ggggtcaagg tactctggtg 720

accgtctcct ca 732

<210> 114

<211> 244

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-55 scFv

<400> 114

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Ala Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Ile Ala Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Trp Tyr

20 25 30

Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr Glu Asp Ser

35 40 45

Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly

50 55 60

Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala

65 70 75 80

Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Asn Thr Arg Ser Ser Thr Leu Val Phe Gly

85 90 95

Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Glu Met Ala Glu Val

115 120 125

Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Met Lys Lys Pro Gly Ala Ser Leu

130 135 140

Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ile Asp Tyr Tyr Val

145 150 155 160

Tyr Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Ser Met Gly Trp

165 170 175

Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly

180 185 190

Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu

195 200 205

Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg

210 215 220

Ser Gln Arg Asp Gly Tyr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

225 230 235 240

Thr Val Ser Ser

<210> 115

<211> 732

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-55 scFv (nt) (O/SSE)

<400> 115

cagtctgccc tgacacagcc tgccagcgtt agtgctagtc ccggacagtc tatcgccatc 60

agctgtaccg gcaccagctc tgacgttggc tggtatcagc agcaccctgg caaggcccct 120

aagctgatga tctacgagga cagcaagagg cccagcggcg tgtccaatag attcagcggc 180

agcaagagcg gcaacaccgc cagcctgaca attagcggac tgcaggccga ggacgaggcc 240

gattactact gcagcagcaa cacccggtcc agcacactgg tttttggcgg aggcaccaag 300

ctgacagtgc tgggatctag aggtggcgga ggatctggcg gcggaggaag cggaggcggc 360

ggatctcttg aaatggctga agtgcagctg gtgcagtctg gcgccgagat gaagaaacct 420

ggcgcctctc tgaagctgag ctgcaaggcc agcggctaca ccttcatcga ctactacgtg 480

tactggatgc ggcaggcccc tggacaggga ctcgaatcta tgggctggat caaccccaat 540

agcggcggca ccaattacgc ccagaaattc cagggcagag tgaccatgac cagagacacc 600

agcatcagca ccgcctacat ggaactgagc cggctgagat ccgacgacac cgccatgtac 660

tactgcgcca gatctcagcg cgacggctac atggattatt ggggccaggg aaccctggtc 720

accgtgtcca gc 732

<210> 116

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-55 VH链

<400> 116

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Met Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ile Asp Tyr

20 25 30

Tyr Val Tyr Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Ser Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Gln Arg Asp Gly Tyr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 117

<211> 354

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-55 VH链

<400> 117

gaagtgcagc tggtgcagtc tggggctgag atgaagaagc ctggggcctc actgaagctc 60

tcctgcaagg cttctggata caccttcatc gactactatg tatactggat gcgacaggcc 120

cctggacaag ggcttgagtc catgggatgg atcaacccta acagtggtgg cacaaactat 180

gcacagaagt ttcagggcag ggtcaccatg accagggaca cgtccatcag cacagcctac 240

atggagctga gcaggctgag atctgacgac accgccatgt attactgtgc gcgctcccag 300

cgtgacggtt acatggatta ctggggtcaa ggtactctgg tgaccgtctc ctca 354

<210> 118

<211> 354

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-55 VH链 (nt) (O/SSE)

<400> 118

gaagtgcagc tggtgcagtc tggcgccgag atgaagaaac ctggcgcctc tctgaagctg 60

agctgcaagg ccagcggcta caccttcatc gactactacg tgtactggat gcggcaggcc 120

cctggacagg gactcgaatc tatgggctgg atcaacccca atagcggcgg caccaattac 180

gcccagaaat tccagggcag agtgaccatg accagagaca ccagcatcag caccgcctac 240

atggaactga gccggctgag atccgacgac accgccatgt actactgcgc cagatctcag 300

cgcgacggct acatggatta ttggggccag ggaaccctgg tcaccgtgtc cagc 354

<210> 119

<211> 105

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-55 VL链

<400> 119

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Ala Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Ile Ala Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Trp Tyr

20 25 30

Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr Glu Asp Ser

35 40 45

Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly

50 55 60

Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala

65 70 75 80

Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Asn Thr Arg Ser Ser Thr Leu Val Phe Gly

85 90 95

Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105

<210> 120

<211> 312

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-55 VL链

<400> 120

caatctgccc tgactcagcc tgcctccgtg tctgcgtctc ctggacagtc gatcgccatc 60

tcctgcactg gaaccagcag tgacgttggt tggtatcaac agcacccagg caaagccccc 120

aaactcatga tttatgagga cagtaagcgg ccctcagggg tttctaatcg cttctctggc 180

tccaagtctg gcaacacggc ctccctgacc atctctgggc tccaggctga ggacgaggct 240

gattattact gcagctcaaa tacaagaagc agcactttgg tgttcggcgg agggaccaag 300

ctgaccgtcc ta 312

<210> 121

<211> 312

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-55 VL链 (nt) (O/SSE)

<400> 121

cagtctgccc tgacacagcc tgccagcgtt agtgctagtc ccggacagtc tatcgccatc 60

agctgtaccg gcaccagctc tgacgttggc tggtatcagc agcaccctgg caaggcccct 120

aagctgatga tctacgagga cagcaagagg cccagcggcg tgtccaatag attcagcggc 180

agcaagagcg gcaacaccgc cagcctgaca attagcggac tgcaggccga ggacgaggcc 240

gattactact gcagcagcaa cacccggtcc agcacactgg tttttggcgg aggcaccaag 300

ctgacagtgc tg 312

<210> 122

<211> 5

<212> PRT

<213> 智人 (Homo sapiens)

<220>

<223> BCMA-55-scFv-mFc BCMA结合表位1

<400> 122

Met Leu Met Ala Gly

1 5

<210> 123

<211> 6

<212> PRT

<213> 智人 (Homo sapiens)

<220>

<223> BCMA-55-scFv-mFc BCMA结合表位2

<400> 123

Tyr Phe Asp Ser Leu Leu

1 5

<210> 124

<211> 11

<212> PRT

<213> 智人 (Homo sapiens)

<220>

<223> BCMA-55-scFv-mFc BCMA结合表位3

<400> 124

Gln Leu Arg Cys Ser Ser Asn Thr Pro Pro Leu

1 5 10

<210> 125

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-C1 VH链

<400> 125

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Ser Ile Asn Trp Val Lys Arg Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Arg Glu Pro Ala Tyr Ala Tyr Asp Phe

50 55 60

Arg Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Tyr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Leu Asp Tyr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 126

<211> 243

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-C1 VH-VL scFv

<400> 126

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Ser Ile Asn Trp Val Lys Arg Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Arg Glu Pro Ala Tyr Ala Tyr Asp Phe

50 55 60

Arg Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Tyr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Leu Asp Tyr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Pro Ser Leu Ala

130 135 140

Met Ser Leu Gly Lys Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser

145 150 155 160

Val Thr Ile Leu Gly Ser His Leu Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

165 170 175

Gly Gln Pro Pro Thr Leu Leu Ile Gln Leu Ala Ser Asn Val Gln Thr

180 185 190

Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr

195 200 205

Leu Thr Ile Asp Pro Val Glu Glu Asp Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys

210 215 220

Leu Gln Ser Arg Thr Ile Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu

225 230 235 240

Glu Ile Lys

<210> 127

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-C1 VL链

<400> 127

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Pro Ser Leu Ala Met Ser Leu Gly

1 5 10 15

Lys Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Thr Ile Leu

20 25 30

Gly Ser His Leu Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Thr Leu Leu Ile Gln Leu Ala Ser Asn Val Gln Thr Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Asp Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Arg

85 90 95

Thr Ile Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 128

<211> 243

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-C1 VL-VH scFv

<400> 128

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Pro Ser Leu Ala Met Ser Leu Gly

1 5 10 15

Lys Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Thr Ile Leu

20 25 30

Gly Ser His Leu Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Thr Leu Leu Ile Gln Leu Ala Ser Asn Val Gln Thr Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Asp Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Arg

85 90 95

Thr Ile Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly

100 105 110

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile

115 120 125

Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu Thr Val

130 135 140

Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ser Ile

145 150 155 160

Asn Trp Val Lys Arg Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met Gly Trp

165 170 175

Ile Asn Thr Glu Thr Arg Glu Pro Ala Tyr Ala Tyr Asp Phe Arg Gly

180 185 190

Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Gln

195 200 205

Ile Asn Asn Leu Lys Tyr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Leu

210 215 220

Asp Tyr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr

225 230 235 240

Val Ser Ser

<210> 129

<211> 244

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-C2 VH-VL scFv

<400> 129

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Asp Leu Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Thr Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Phe

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Phe Lys Trp Met

35 40 45

Ala Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Ser Tyr Phe Ala Asp Asp Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Val Glu Thr Ser Ala Thr Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Glu Ile Tyr Tyr Gly Tyr Asp Gly Gly Phe Ala Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser

130 135 140

His Arg Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys

145 150 155 160

Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys

165 170 175

Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Phe Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr

180 185 190

Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Ala Asp Phe

195 200 205

Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr

210 215 220

Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys

225 230 235 240

Leu Asp Ile Lys

<210> 130

<211> 244

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-C2 VL-VH scFv

<400> 130

Asp Val Val Met Thr Gln Ser His Arg Phe Met Ser Thr Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

20 25 30

Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Phe Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Ala Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Asp Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile Gln Leu Val Gln

115 120 125

Ser Gly Pro Asp Leu Lys Lys Pro Gly Glu Thr Val Lys Leu Ser Cys

130 135 140

Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Phe Gly Met Asn Trp Val Lys

145 150 155 160

Gln Ala Pro Gly Lys Gly Phe Lys Trp Met Ala Trp Ile Asn Thr Tyr

165 170 175

Thr Gly Glu Ser Tyr Phe Ala Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe

180 185 190

Ser Val Glu Thr Ser Ala Thr Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu

195 200 205

Lys Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Glu Ile Tyr

210 215 220

Tyr Gly Tyr Asp Gly Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

225 230 235 240

Thr Val Ser Ala

<210> 131

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-C2 VH链

<400> 131

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Asp Leu Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Thr Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Phe

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Phe Lys Trp Met

35 40 45

Ala Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Ser Tyr Phe Ala Asp Asp Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Val Glu Thr Ser Ala Thr Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Glu Ile Tyr Tyr Gly Tyr Asp Gly Gly Phe Ala Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

115 120

<210> 132

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-C2 VL链

<400> 132

Asp Val Val Met Thr Gln Ser His Arg Phe Met Ser Thr Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

20 25 30

Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Phe Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Ala Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Asp Ile Lys

100 105

<210> 133

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人 (Homo sapiens)

<220>

<223> BCMA表位

<400> 133

Gln Asn Glu Tyr Phe Asp Ser Leu Leu

1 5

<210> 134

<211> 39

<212> PRT

<213> 智人 (Homo sapiens)

<220>

<223> CD28胞外结构域间隔子

<400> 134

Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn

1 5 10 15

Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu

20 25 30

Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro

35

<210> 135

<211> 117

<212> DNA

<213> 智人 (Homo sapiens)

<220>

<223> CD28胞外结构域间隔子

<400> 135

attgaagtta tgtatcctcc tccttaccta gacaatgaga agagcaatgg aaccattatc 60

catgtgaaag ggaaacacct ttgtccaagt cccctatttc ccggaccttc taagccc 117

<210> 136

<211> 41

<212> PRT

<213> 智人 (Homo sapiens)

<220>

<223> CD28胞内域

<400> 136

Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr

1 5 10 15

Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro

20 25 30

Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

35 40

<210> 137

<211> 123

<212> DNA

<213> 智人 (Homo sapiens)

<220>

<223> CD28胞内域

<400> 137

aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 60

gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120

tcc 123

<210> 138

<211> 28

<212> PRT

<213> 智人 (Homo sapiens)

<220>

<223> CD28跨膜结构域

<400> 138

Met Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser

1 5 10 15

Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val

20 25

<210> 139

<211> 84

<212> DNA

<213> 智人 (Homo sapiens)

<220>

<223> CD28跨膜结构域

<400> 139

atgttttggg tgctggtcgt ggtcggaggg gtgctggcct gttacagcct gctggtgaca 60

gtcgctttca tcatcttctg ggtg 84

<210> 140

<211> 84

<212> DNA

<213> 智人 (Homo sapiens)

<220>

<223> CD28跨膜结构域

<400> 140

atgttctggg tgctcgtggt cgttggcgga gtgctggcct gttacagcct gctggttacc 60

gtggccttca tcatcttttg ggtc 84

<210> 141

<211> 41

<212> DNA

<213> 智人 (Homo sapiens)

<220>

<223> CD28TM预测的剪接受体位点

<400> 141

aggggtgctg gcctgttaca gcctgctggt gacagtcgct t 41

<210> 142

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD33信号肽

<400> 142

Met Pro Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Trp Ala Gly Ala Leu Ala

1 5 10 15

<210> 143

<211> 112

<212> PRT

<213> 智人 (Homo sapiens)

<220>

<223> CD3ζ来源的细胞内信号传导结构域

<400> 143

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 144

<211> 336

<212> DNA

<213> 智人 (Homo sapiens)

<220>

<223> CD3ζ来源的细胞内信号传导结构域

<400> 144

agagtcaagt tttccaggtc cgccgacgct ccagcctacc agcaggggca gaaccagctg 60

tacaacgagc tgaacctggg cagaagggaa gagtacgacg tcctggataa gcggagaggc 120

cgggaccctg agatgggcgg caagcctcgg cggaagaacc cccaggaagg cctgtataac 180

gaactgcaga aagacaagat ggccgaggcc tacagcgaga tcggcatgaa gggcgagcgg 240

aggcggggca agggccacga cggcctgtat cagggcctgt ccaccgccac caaggatacc 300

tacgacgccc tgcacatgca ggccctgccc ccaagg 336

<210> 145

<211> 336

<212> DNA

<213> 智人 (Homo sapiens)

<220>

<223> CD3ζ来源的细胞内信号传导结构域

<400> 145

agagtgaagt tcagcagatc cgccgacgct ccagcctatc agcagggcca aaaccagctg 60

tacaacgagc tgaacctggg gagaagagaa gagtacgacg tgctggataa gcggagaggc 120

agagatcctg aaatgggcgg caagcccaga cggaagaatc ctcaagaggg cctgtataat 180

gagctgcaga aagacaagat ggccgaggcc tacagcgaga tcggaatgaa gggcgagcgc 240

agaagaggca agggacacga tggactgtac cagggcctga gcaccgccac caaggatacc 300

tatgacgcac tgcacatgca ggccctgcca cctaga 336

<210> 146

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD8α信号肽

<400> 146

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala

<210> 147

<211> 183

<212> PRT

<213> 智人 (Homo sapiens)

<220>

<223> 食蟹猴BCMA (GenBank号EHH60172.1)

<400> 147

Met Leu Gln Met Ala Arg Gln Cys Ser Gln Asn Glu Tyr Phe Asp Ser

1 5 10 15

Leu Leu His Asp Cys Lys Pro Cys Gln Leu Arg Cys Ser Ser Thr Pro

20 25 30

Pro Leu Thr Cys Gln Arg Tyr Cys Asn Ala Ser Met Thr Asn Ser Val

35 40 45

Lys Gly Met Asn Ala Ile Leu Trp Thr Cys Leu Gly Leu Ser Leu Ile

50 55 60

Ile Ser Leu Ala Val Phe Val Leu Thr Phe Leu Leu Arg Lys Met Ser

65 70 75 80

Ser Glu Pro Leu Lys Asp Glu Phe Lys Asn Thr Gly Ser Gly Leu Leu

85 90 95

Gly Met Ala Asn Ile Asp Leu Glu Lys Gly Arg Thr Gly Asp Glu Ile

100 105 110

Val Leu Pro Arg Gly Leu Glu Tyr Thr Val Glu Glu Cys Thr Cys Glu

115 120 125

Asp Cys Ile Lys Asn Lys Pro Lys Val Asp Ser Asp His Cys Phe Pro

130 135 140

Leu Pro Ala Met Glu Glu Gly Ala Thr Ile Leu Val Thr Thr Lys Thr

145 150 155 160

Asn Asp Tyr Cys Asn Ser Leu Ser Ala Ala Leu Ser Val Thr Glu Ile

165 170 175

Glu Lys Ser Ile Ser Ala Arg

180

<210> 148

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> E2A肽

<400> 148

Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser

1 5 10 15

Asn Pro Gly Pro

20

<210> 149

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> E2A肽

<400> 149

Gly Ser Gly Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp

1 5 10 15

Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro

20

<210> 150

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> EF1a/HTLV启动子正向引物

<400> 150

ctttttcgca acgggtttgc 20

<210> 151

<211> 544

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有HTLV1增强子的EF1α启动子

<400> 151

ggatctgcga tcgctccggt gcccgtcagt gggcagagcg cacatcgccc acagtccccg 60

agaagttggg gggaggggtc ggcaattgaa ccggtgccta gagaaggtgg cgcggggtaa 120

actgggaaag tgatgtcgtg tactggctcc gcctttttcc cgagggtggg ggagaaccgt 180

atataagtgc agtagtcgcc gtgaacgttc tttttcgcaa cgggtttgcc gccagaacac 240

agctgaagct tcgaggggct cgcatctctc cttcacgcgc ccgccgccct acctgaggcc 300

gccatccacg ccggttgagt cgcgttctgc cgcctcccgc ctgtggtgcc tcctgaactg 360

cgtccgccgt ctaggtaagt ttaaagctca ggtcgagacc gggcctttgt ccggcgctcc 420

cttggagcct acctagactc agccggctct ccacgctttg cctgaccctg cttgctcaac 480

tctacgtctt tgtttcgttt tctgttctgc gccgttacag atccaagctg tgaccggcgc 540

ctac 544

<210> 152

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> F2A肽

<400> 152

Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val

1 5 10 15

Glu Ser Asn Pro Gly Pro

20

<210> 153

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> F2A肽

<400> 153

Gly Ser Gly Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala

1 5 10 15

Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro

20 25

<210> 154

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> GMCSFRα链信号肽

<400> 154

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro

20

<210> 155

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GMCSFRα链信号肽

<400> 155

atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60

atccca 66

<210> 156

<211> 229

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 铰链-CH2-CH3间隔子

<400> 156

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe

1 5 10 15

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

20 25 30

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

35 40 45

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

50 55 60

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

65 70 75 80

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

85 90 95

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

100 105 110

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

115 120 125

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

130 135 140

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

145 150 155 160

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

165 170 175

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

180 185 190

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

195 200 205

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

210 215 220

Leu Ser Leu Gly Lys

225

<210> 157

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 铰链-CH3间隔子

<400> 157

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Gly Gln Pro Arg

1 5 10 15

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

20 25 30

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

35 40 45

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

50 55 60

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

65 70 75 80

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

85 90 95

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

100 105 110

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

115

<210> 158

<211> 11

<212> PRT

<213> 智人 (Homo sapiens)

<220>

<223> 人BCMA表位 (残基17-27)

<400> 158

Leu Leu His Ala Cys Ile Pro Cys Gln Leu Arg

1 5 10

<210> 159

<211> 7

<212> PRT

<213> 智人 (Homo sapiens)

<220>

<223> 人BCMA表位 (残基21-27)

<400> 159

Cys Ile Pro Cys Gln Leu Arg

1 5

<210> 160

<211> 10

<212> PRT

<213> 智人 (Homo sapiens)

<220>

<223> 人BCMA表位 (残基30-39)

<400> 160

Ser Asn Thr Pro Pro Leu Thr Cys Gln Arg

1 5 10

<210> 161

<211> 7

<212> PRT

<213> 智人 (Homo sapiens)

<220>

<223> 人BCMA表位 (残基44-50)

<400> 161

Ser Val Thr Asn Ser Val Lys

1 5

<210> 162

<211> 7

<212> PRT

<213> 智人 (Homo sapiens)

<220>

<223> 人BCMA表位 (残基8-15)

<400> 162

Cys Ser Gln Asn Glu Tyr Phe

1 5

<210> 163

<211> 135

<212> PRT

<213> 智人 (Homo sapiens)

<220>

<223> 人BCMA变体 (GenBank号ABN42510.1)

<400> 163

Met Leu Gln Met Ala Gly Gln Cys Ser Gln Asn Glu Tyr Phe Asp Ser

1 5 10 15

Leu Leu His Ala Cys Ile Pro Cys Gln Leu Arg Cys Ser Ser Asn Thr

20 25 30

Pro Pro Leu Thr Cys Gln Arg Tyr Cys Asn Ala Arg Ser Gly Leu Leu

35 40 45

Gly Met Ala Asn Ile Asp Leu Glu Lys Ser Arg Thr Gly Asp Glu Ile

50 55 60

Ile Leu Pro Arg Gly Leu Glu Tyr Thr Val Glu Glu Cys Thr Cys Glu

65 70 75 80

Asp Cys Ile Lys Ser Lys Pro Lys Val Asp Ser Asp His Cys Phe Pro

85 90 95

Leu Pro Ala Met Glu Glu Gly Ala Thr Ile Leu Val Thr Thr Lys Thr

100 105 110

Asn Asp Tyr Cys Lys Ser Leu Pro Ala Ala Leu Ser Ala Thr Glu Ile

115 120 125

Glu Lys Ser Ile Ser Ala Arg

130 135

<210> 164

<211> 184

<212> PRT

<213> 智人 (Homo sapiens)

<220>

<223> 人BCMA (GenBank号BAB60895.1)

<400> 164

Met Leu Gln Met Ala Gly Gln Cys Ser Gln Asn Glu Tyr Phe Asp Ser

1 5 10 15

Leu Leu His Ala Cys Ile Pro Cys Gln Leu Arg Cys Ser Ser Asn Thr

20 25 30

Pro Pro Leu Thr Cys Gln Arg Tyr Cys Asn Ala Ser Val Thr Asn Ser

35 40 45

Val Lys Gly Thr Asn Ala Ile Leu Trp Thr Cys Leu Gly Leu Ser Leu

50 55 60

Ile Ile Ser Leu Ala Val Phe Val Leu Met Phe Leu Leu Arg Lys Ile

65 70 75 80

Ser Ser Glu Pro Leu Lys Asp Glu Phe Lys Asn Thr Gly Ser Gly Leu

85 90 95

Leu Gly Met Ala Asn Ile Asp Leu Glu Lys Ser Arg Thr Gly Asp Glu

100 105 110

Ile Ile Leu Pro Arg Gly Leu Glu Tyr Thr Val Glu Glu Cys Thr Cys

115 120 125

Glu Asp Cys Ile Lys Ser Lys Pro Lys Val Asp Ser Asp His Cys Phe

130 135 140

Pro Leu Pro Ala Met Glu Glu Gly Ala Thr Ile Leu Val Thr Thr Lys

145 150 155 160

Thr Asn Asp Tyr Cys Lys Ser Leu Pro Ala Ala Leu Ser Ala Thr Glu

165 170 175

Ile Glu Lys Ser Ile Ser Ala Arg

180

<210> 165

<211> 184

<212> PRT

<213> 智人 (Homo sapiens)

<220>

<223> 人BCMA (NCBI号NP_001183.2)

<400> 165

Met Leu Gln Met Ala Gly Gln Cys Ser Gln Asn Glu Tyr Phe Asp Ser

1 5 10 15

Leu Leu His Ala Cys Ile Pro Cys Gln Leu Arg Cys Ser Ser Asn Thr

20 25 30

Pro Pro Leu Thr Cys Gln Arg Tyr Cys Asn Ala Ser Val Thr Asn Ser

35 40 45

Val Lys Gly Thr Asn Ala Ile Leu Trp Thr Cys Leu Gly Leu Ser Leu

50 55 60

Ile Ile Ser Leu Ala Val Phe Val Leu Met Phe Leu Leu Arg Lys Ile

65 70 75 80

Asn Ser Glu Pro Leu Lys Asp Glu Phe Lys Asn Thr Gly Ser Gly Leu

85 90 95

Leu Gly Met Ala Asn Ile Asp Leu Glu Lys Ser Arg Thr Gly Asp Glu

100 105 110

Ile Ile Leu Pro Arg Gly Leu Glu Tyr Thr Val Glu Glu Cys Thr Cys

115 120 125

Glu Asp Cys Ile Lys Ser Lys Pro Lys Val Asp Ser Asp His Cys Phe

130 135 140

Pro Leu Pro Ala Met Glu Glu Gly Ala Thr Ile Leu Val Thr Thr Lys

145 150 155 160

Thr Asn Asp Tyr Cys Lys Ser Leu Pro Ala Ala Leu Ser Ala Thr Glu

165 170 175

Ile Glu Lys Ser Ile Ser Ala Arg

180

<210> 166

<211> 20

<212> PRT

<213> 智人 (Homo sapiens)

<220>

<223> 人IgG-κ信号肽

<400> 166

Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser

1 5 10 15

Gly Ala Tyr Gly

20

<210> 167

<211> 60

<212> DNA

<213> 智人 (Homo sapiens)

<220>

<223> 人IgG-κ信号序列

<400> 167

atggtgctgc agacccaggt gttcatcagc ctgctgctgt ggatctccgg agcatacgga 60

<210> 168

<211> 60

<212> DNA

<213> 智人 (Homo sapiens)

<220>

<223> 人IgG -κ信号序列

<400> 168

atggtgctgc agacacaggt gttcatcagc ctgctgctgt ggatctccgg agcatacgga 60

<210> 169

<211> 60

<212> DNA

<213> 智人 (Homo sapiens)

<220>

<223> 人IgG-κ信号序列

<400> 169

atggtgctgc agacccaggt gttcatcagc ctgctgctgt ggatctctgg cgcctacggc 60

<210> 170

<211> 60

<212> DNA

<213> 智人 (Homo sapiens)

<220>

<223> 人IgG-κ信号序列

<400> 170

atggtgctgc agacccaggt gttcatcagc ctgctgctgt ggatctctgg cgcctatgga 60

<210> 171

<211> 60

<212> DNA

<213> 智人 (Homo sapiens)

<220>

<223> 人IgG-κ信号序列

<400> 171

atggtgctgc agacacaggt gttcatctcc ctgctgctgt ggatctctgg agcatacgga 60

<210> 172

<211> 326

<212> PRT

<213> 智人 (Homo sapiens)

<220>

<223> 人IgG2 Fc (Uniprot P01859)

<400> 172

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

100 105 110

Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

115 120 125

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

130 135 140

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

145 150 155 160

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn

165 170 175

Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp

180 185 190

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro

195 200 205

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu

210 215 220

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn

225 230 235 240

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

245 250 255

Ser Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

260 265 270

Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

275 280 285

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

290 295 300

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

305 310 315 320

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325

<210> 173

<211> 327

<212> PRT

<213> 智人 (Homo sapiens)

<220>

<223> 人IgG4 Fc (Uniprot P01861)

<400> 173

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro

100 105 110

Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

115 120 125

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

130 135 140

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

145 150 155 160

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

165 170 175

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

180 185 190

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

195 200 205

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

210 215 220

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

225 230 235 240

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

245 250 255

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

260 265 270

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

275 280 285

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

290 295 300

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

305 310 315 320

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

325

<210> 174

<211> 228

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 经修饰的IgG4铰链- IgG2/IgG4 CH2- IgG4 CH3间隔子

<400> 174

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val

1 5 10 15

Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

20 25 30

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

35 40 45

Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

50 55 60

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Gln Ser Thr

65 70 75 80

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

85 90 95

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser

100 105 110

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

115 120 125

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

130 135 140

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

145 150 155 160

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

165 170 175

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr

180 185 190

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

195 200 205

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

210 215 220

Ser Leu Gly Lys

225

<210> 175

<211> 684

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 经修饰的IgG4铰链- IgG2/IgG4 CH2- IgG4 CH3间隔子

<400> 175

gaatctaagt acggaccgcc ctgccctccc tgccctgctc ctcctgtggc tggaccaagc 60

gtgttcctgt ttccacctaa gcctaaagat accctgatga tttcccgcac acctgaagtg 120

acttgcgtgg tcgtggacgt gagccaggag gatccagaag tgcagttcaa ctggtacgtg 180

gacggcgtgg aagtccacaa tgctaagact aaaccccgag aggaacagtt tcagtcaact 240

taccgggtcg tgagcgtgct gaccgtcctg catcaggatt ggctgaacgg gaaggagtat 300

aagtgcaaag tgtctaataa gggactgcct agctccatcg agaaaacaat tagtaaggca 360

aaagggcagc ctcgagaacc acaggtgtat accctgcccc ctagccagga ggaaatgacc 420

aagaaccagg tgtccctgac atgtctggtc aaaggcttct atccaagtga catcgccgtg 480

gagtgggaat caaatgggca gcccgagaac aattacaaga ccacaccacc cgtgctggac 540

tctgatggaa gtttctttct gtattccagg ctgaccgtgg ataaatctcg ctggcaggag 600

ggcaacgtgt tctcttgcag tgtcatgcac gaagccctgc acaatcatta tacacagaag 660

tcactgagcc tgtccctggg caaa 684

<210> 176

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头

<400> 176

Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr

1 5 10 15

Lys Gly

<210> 177

<211> 399

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MND启动子

<400> 177

tttatttagt ctccagaaaa aggggggaat gaaagacccc acctgtaggt ttggcaagct 60

aggatcaagg ttaggaacag agagacagca gaatatgggc caaacaggat atctgtggta 120

agcagttcct gccccggctc agggccaaga acagttggaa cagcagaata tgggccaaac 180

aggatatctg tggtaagcag ttcctgcccc ggctcagggc caagaacaga tggtccccag 240

atgcggtccc gccctcagca gtttctagag aaccatcaga tgtttccagg gtgccccaag 300

gacctgaaat gaccctgtgc cttatttgaa ctaaccaatc agttcgcttc tcgcttctgt 360

tcgcgcgctt ctgctccccg agctcaataa aagagccca 399

<210> 178

<211> 554

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 经修饰的EF1α启动子

<400> 178

ggatctgcga tcgctccggt gcccgtcagt gggcagagcg cacatcgccc acagtccccg 60

agaagttggg gggaggggtc ggcaattgaa ccggtgccta gagaaggtgg cgcggggtaa 120

actgggaaag tgatgtcgtg tactggctcc gcctttttcc cgagggtggg ggagaaccgt 180

atataagtgc agtagtcgcc gtgaacgttc tttttcgcaa cgggtttgcc gccagaacac 240

agctgaagct tcgaggggct cgcatctctc cttcacgcgc ccgccgccct acctgaggcc 300

gccatccacg ccggttgagt cgcgttctgc cgcctcccgc ctgtggtgcc tcctgaactg 360

cgtccgccgt ctaggtaagt ttaaagctca ggtcgagacc gggcctttgt ccggcgctcc 420

cttggagcct acctagactc agccggctct ccacgctttg cctgaccctg cttgctcaac 480

tctacgtctt tgtttcgttt tctgttctgc gccgttacag atccaagctg tgaccggcgc 540

ctacggctag cgcc 554

<210> 179

<211> 185

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 小鼠BCMA (NCBI号NP_035738.1)

<400> 179

Met Ala Gln Gln Cys Phe His Ser Glu Tyr Phe Asp Ser Leu Leu His

1 5 10 15

Ala Cys Lys Pro Cys His Leu Arg Cys Ser Asn Pro Pro Ala Thr Cys

20 25 30

Gln Pro Tyr Cys Asp Pro Ser Val Thr Ser Ser Val Lys Gly Thr Tyr

35 40 45

Thr Val Leu Trp Ile Phe Leu Gly Leu Thr Leu Val Leu Ser Leu Ala

50 55 60

Leu Phe Thr Ile Ser Phe Leu Leu Arg Lys Met Asn Pro Glu Ala Leu

65 70 75 80

Lys Asp Glu Pro Gln Ser Pro Gly Gln Leu Asp Gly Ser Ala Gln Leu

85 90 95

Asp Lys Ala Asp Thr Glu Leu Thr Arg Ile Arg Ala Gly Asp Asp Arg

100 105 110

Ile Phe Pro Arg Ser Leu Glu Tyr Thr Val Glu Glu Cys Thr Cys Glu

115 120 125

Asp Cys Val Lys Ser Lys Pro Lys Gly Asp Ser Asp His Phe Phe Pro

130 135 140

Leu Pro Ala Met Glu Glu Gly Ala Thr Ile Leu Val Thr Thr Lys Thr

145 150 155 160

Gly Asp Tyr Gly Lys Ser Ser Val Pro Thr Ala Leu Gln Ser Val Met

165 170 175

Gly Met Glu Lys Pro Thr His Thr Arg

180 185

<210> 180

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 优化的剪接受体位点

<400> 180

cagtttcttc ctgtatagta gactcaccgt ggataaatca a 41

<210> 181

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 优化的剪接受体位点

<400> 181

gggcaacgtg ttcagctgca gcgtgatgca cgaggccctg c 41

<210> 182

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 优化的剪接受体位点

<400> 182

cggagtgctg gcctgttaca gcctgctggt taccgtggcc t 41

<210> 183

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 优化的剪接受体位点

<400> 183

gctgagagtg aagttcagca gatccgccga cgctccagcc t 41

<210> 184

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 优化的剪接受体位点

<400> 184

acacctccac tggatcccca agagctggat atcctgaaaa c 41

<210> 185

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 优化的剪接受体位点

<400> 185

accggattcc tcctgatcca agcctggcca gagaacagaa c 41

<210> 186

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 优化的剪接受体位点

<400> 186

acggccagtt tagcctggct gtggtgtctc tgaacatcac c 41

<210> 187

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 优化的剪接受体位点

<400> 187

aagtttcttt ctgtattcca gactgaccgt ggataaatct c 41

<210> 188

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 优化的剪接受体位点

<400> 188

cgccttgtcc tccttgtccc gctcctcctg ttgccggacc t 41

<210> 189

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 优化的剪接供体位点

<400> 189

agtctaaata cggac 15

<210> 190

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 优化的剪接供体位点

<400> 190

tcaactggta tgtgg 15

<210> 191

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 优化的剪接供体位点

<400> 191

accatctcca aggcc 15

<210> 192

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 优化的剪接供体位点

<400> 192

gccccaggtt tacac 15

<210> 193

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 优化的剪接供体位点

<400> 193

tcagcagatc cgccg 15

<210> 194

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 优化的剪接供体位点

<400> 194

ctcctgtgtg aactc 15

<210> 195

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 优化的剪接供体位点

<400> 195

tcggaaagtg tgcaa 15

<210> 196

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 优化的剪接供体位点

<400> 196

cagcacggcc agttt 15

<210> 197

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 优化的剪接供体位点

<400> 197

aaccggggcg agaac 15

<210> 198

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 优化的剪接供体位点

<400> 198

ctggaaggcg agccc 15

<210> 199

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 优化的剪接供体位点 (编码区之外最近的4 nt)

<400> 199

tgttcatgtg agcgg 15

<210> 200

<211> 684

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 优化的经SSE修饰的IgG4铰链- IgG2/IgG4 CH2- IgG4 CH3间隔子

<400> 200

gagtctaaat acggaccgcc ttgtcctcct tgtcccgctc ctcctgttgc cggaccttcc 60

gtgttcctgt ttcctccaaa gcctaaggac accctgatga tcagcaggac ccctgaagtg 120

acctgcgtgg tggtggatgt gtcccaagag gatcccgagg tgcagttcaa ctggtatgtg 180

gacggcgtgg aagtgcacaa cgccaagacc aagcctagag aggaacagtt ccagagcacc 240

tacagagtgg tgtccgtgct gacagtgctg caccaggatt ggctgaacgg caaagagtac 300

aagtgcaagg tgtccaacaa gggcctgcct agcagcatcg agaaaaccat ctccaaggcc 360

aagggccagc caagagagcc ccaggtttac acactgcctc caagccaaga ggaaatgacc 420

aagaatcagg tgtccctgac atgcctggtc aagggcttct acccctccga tatcgccgtg 480

gaatgggaga gcaatggcca gcctgagaac aactacaaga ccacacctcc tgtgctggac 540

agcgacggca gtttcttcct gtatagtaga ctcaccgtgg ataaatcaag atggcaagag 600

ggcaacgtgt tcagctgcag cgtgatgcac gaggccctgc acaaccacta cacccagaaa 660

agcctgagcc tgtctctggg caag 684

<210> 201

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> P2A肽

<400> 201

Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn

1 5 10 15

Pro Gly Pro

<210> 202

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> P2A肽

<400> 202

Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val

1 5 10 15

Glu Glu Asn Pro Gly Pro

20

<210> 203

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 预测的剪接受体位点

<400> 203

cgccttgtcc tccttgtcca gctcctcctg ttgccggacc t 41

<210> 204

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 预测的剪接受体位点

<400> 204

cagtttcttc ctgtatagta gactcaccgt ggataaatca a 41

<210> 205

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 预测的剪接受体位点

<400> 205

accggattcc tcctgattca ggcctggcca gagaacagaa c 41

<210> 206

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 预测的剪接供体位点

<400> 206

cgtctaggta agttt 15

<210> 207

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 预测的剪接供体位点

<400> 207

gaccaaggtg accgt 15

<210> 208

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 预测的剪接供体位点

<400> 208

tgcactggta ccagc 15

<210> 209

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 预测的剪接供体位点

<400> 209

taaactggta ccagc 15

<210> 210

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 预测的剪接供体位点

<400> 210

atctcctgta agggt 15

<210> 211

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 预测的剪接供体位点

<400> 211

ggtcaaggta ctctg 15

<210> 212

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 预测的剪接供体位点

<400> 212

gaggacagta agcgg 15

<210> 213

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 预测的剪接供体位点

<400> 213

ggtcaaggta ctctg 15

<210> 214

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 预测的剪接供体位点

<400> 214

tgcctccgtg tctgc 15

<210> 215

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 预测的剪接供体位点

<400> 215

caccaaggtg accgt 15

<210> 216

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 预测的剪接供体位点

<400> 216

tgaactggta tcagc 15

<210> 217

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 预测的剪接供体位点

<400> 217

atctcttgaa atggt 15

<210> 218

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 预测的剪接供体位点

<400> 218

ggccagggca cactg 15

<210> 219

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 预测的剪接供体位点

<400> 219

gaggacagca agagg 15

<210> 220

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 预测的剪接供体位点

<400> 220

ggccagggaa ccctg 15

<210> 221

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 预测的剪接供体位点

<400> 221

tgccagcgtt agtgc 15

<210> 222

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 预测的剪接供体位点

<400> 222

aatctaagta cggac 15

<210> 223

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 预测的剪接供体位点

<400> 223

tcaactggta cgtgg 15

<210> 224

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 预测的剪接供体位点

<400> 224

acaattagta aggca 15

<210> 225

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 预测的剪接供体位点

<400> 225

accacaggtg tatac 15

<210> 226

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 预测的剪接供体位点

<400> 226

tttccaggtc cgccg 15

<210> 227

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 预测的剪接供体位点

<400> 227

ctgctctgtg agtta 15

<210> 228

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 预测的剪接供体位点

<400> 228

acgcaaagtg tgtaa 15

<210> 229

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 预测的剪接供体位点

<400> 229

caacatggtc agttt 15

<210> 230

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 预测的剪接供体位点

<400> 230

aacagaggtg aaaac 15

<210> 231

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 预测的剪接供体位点

<400> 231

ctggagggtg agcca 15

<210> 232

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 启动子预测的剪接受体位点

<400> 232

tggctccgcc tttttcccga gggtggggga gaaccgtata t 41

<210> 233

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 启动子预测的剪接受体位点

<400> 233

tgaactgcgt ccgccgtcta ggtaagttta aagctcaggt c 41

<210> 234

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 启动子预测的剪接受体位点

<400> 234

ttctgttctg cgccgttaca gatccaagct gtgaccggcg c 41

<210> 235

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 刚好在WPRE的5′处的反向引物

<400> 235

gatatcgaat tcctgcagcc 20

<210> 236

<211> 684

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 间隔子 - 密码子优化

<400> 236

gagtctaaat acggaccgcc ttgtcctcct tgtccagctc ctcctgttgc cggaccttcc 60

gtgttcctgt ttcctccaaa gcctaaggac accctgatga tcagcaggac ccctgaagtg 120

acctgcgtgg tggtggatgt gtcccaagag gatcccgagg tgcagttcaa ttggtacgtg 180

gacggcgtgg aagtgcacaa cgccaagacc aagcctagag aggaacagtt ccagagcacc 240

tacagagtgg tgtccgtgct gacagtgctg caccaggatt ggctgaacgg caaagagtac 300

aagtgcaagg tgtccaacaa gggcctgcct agcagcatcg agaaaaccat ctccaaggcc 360

aagggccagc caagagagcc ccaggtttac acactgcctc caagccaaga ggaaatgacc 420

aagaatcagg tgtccctgac atgcctggtc aagggcttct acccctccga tatcgccgtg 480

gaatgggaga gcaatggcca gcctgagaac aactacaaga ccacacctcc tgtgctggac 540

agcgacggca gtttcttcct gtatagtaga ctcaccgtgg ataaatcaag atggcaagag 600

ggcaacgtgt tcagctgcag cgtgatgcac gaggccctgc acaaccacta cacccagaaa 660

agcctgagcc tgtctctggg caaa 684

<210> 237

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 间隔子 (IgG4铰链)

<400> 237

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10

<210> 238

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 间隔子 (IgG4铰链)

<400> 238

gaatctaagt acggaccgcc ctgcccccct tgccct 36

<210> 239

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 间隔子预测的剪接受体位点

<400> 239

aagtttcttt ctgtattcca ggctgaccgt ggataaatct c 41

<210> 240

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 间隔子预测的剪接受体位点

<400> 240

gggcaacgtg ttctcttgca gtgtcatgca cgaagccctg c 41

<210> 241

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> T2A肽

<400> 241

Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro

1 5 10 15

Gly Pro

<210> 242

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> T2A肽

<400> 242

Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu

1 5 10 15

Glu Asn Pro Gly Pro

20

<210> 243

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> T2A肽

<400> 243

Leu Glu Gly Gly Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp

1 5 10 15

Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg

20

<210> 244

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> T2A肽

<400> 244

ctcgagggcg gcggagaggg cagaggaagt cttctaacat gcggtgacgt ggaggagaat 60

cccggcccta gg 72

<210> 245

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> T2A肽

<400> 245

cttgaaggtg gtggcgaagg cagaggcagc ctgcttacat gcggagatgt ggaagagaac 60

cccggaccta ga 72

<210> 246

<211> 357

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 截短的EGFR (tEGFR) 序列

<400> 246

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly

20 25 30

Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe

35 40 45

Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala

50 55 60

Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu

65 70 75 80

Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile

85 90 95

Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu

100 105 110

Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala

115 120 125

Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu

130 135 140

Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr

145 150 155 160

Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys

165 170 175

Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly

180 185 190

Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu

195 200 205

Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys

210 215 220

Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu

225 230 235 240

Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met

245 250 255

Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala

260 265 270

His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val

275 280 285

Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His

290 295 300

Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro

305 310 315 320

Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala

325 330 335

Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly

340 345 350

Ile Gly Leu Phe Met

355

<210> 247

<211> 1074

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 截短的EGFR (tEGFR) 序列

<400> 247

atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60

atcccacgca aagtgtgtaa cggaataggt attggtgaat ttaaagactc actctccata 120

aatgctacga atattaaaca cttcaaaaac tgcacctcca tcagtggcga tctccacatc 180

ctgccggtgg catttagggg tgactccttc acacatactc ctcctctgga tccacaggaa 240

ctggatattc tgaaaaccgt aaaggaaatc acagggtttt tgctgattca ggcttggcct 300

gaaaacagga cggacctcca tgcctttgag aacctagaaa tcatacgcgg caggaccaag 360

caacatggtc agttttctct tgcagtcgtc agcctgaaca taacatcctt gggattacgc 420

tccctcaagg agataagtga tggagatgtg ataatttcag gaaacaaaaa tttgtgctat 480

gcaaatacaa taaactggaa aaaactgttt gggacctccg gtcagaaaac caaaattata 540

agcaacagag gtgaaaacag ctgcaaggcc acaggccagg tctgccatgc cttgtgctcc 600

cccgagggct gctggggccc ggagcccagg gactgcgtct cttgccggaa tgtcagccga 660

ggcagggaat gcgtggacaa gtgcaacctt ctggagggtg agccaaggga gtttgtggag 720

aactctgagt gcatacagtg ccacccagag tgcctgcctc aggccatgaa catcacctgc 780

acaggacggg gaccagacaa ctgtatccag tgtgcccact acattgacgg cccccactgc 840

gtcaagacct gcccggcagg agtcatggga gaaaacaaca ccctggtctg gaagtacgca 900

gacgccggcc atgtgtgcca cctgtgccat ccaaactgca cctacggatg cactgggcca 960

ggtcttgaag gctgtccaac gaatgggcct aagatcccgt ccatcgccac tgggatggtg 1020

ggggccctcc tcttgctgct ggtggtggcc ctggggatcg gcctcttcat gtga 1074

<210> 248

<211> 1074

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 截短的EGFR (tEGFR) 序列 (nt) (O/SSE)

<400> 248

atgctgctcc tcgtgacaag cctgctcctg tgtgaactcc ctcatccagc ttttctgctc 60

attcctcgga aagtgtgcaa cggcatcggc atcggagagt tcaaggacag cctgagcatc 120

aatgccacca acatcaagca cttcaagaat tgcaccagca tcagcggcga cctgcacatt 180

ctgcctgtgg cctttagagg cgacagcttc acccacacac ctccactgga tccccaagag 240

ctggatatcc tgaaaaccgt gaaagagatt accggattcc tcctgatcca agcctggcca 300

gagaacagaa ccgatctgca cgccttcgag aacctcgaga tcatcagagg ccggaccaaa 360

cagcacggcc agtttagcct ggctgtggtg tctctgaaca tcaccagtct gggcctgaga 420

agcctgaaag aaatctccga cggcgacgtg atcatctccg gaaacaagaa cctgtgctac 480

gccaacacca tcaactggaa gaagctgttc ggcacctccg gccagaaaac aaagatcatc 540

tctaaccggg gcgagaacag ctgcaaggcc accggacaag tttgtcacgc cctgtgtagc 600

cctgaaggct gttggggacc cgaacctaga gactgtgtgt cctgccggaa tgtgtcccgg 660

ggcagagaat gtgtggataa gtgcaacctg ctggaaggcg agccccgcga gtttgtggaa 720

aacagcgagt gcatccagtg tcaccccgag tgtctgcccc aggccatgaa cattacatgc 780

accggcagag gccccgacaa ctgtattcag tgcgcccact acatcgacgg ccctcactgc 840

gtgaaaacat gtccagctgg cgtgatggga gagaacaaca ccctcgtgtg gaagtatgcc 900

gacgccggac atgtgtgcca cctgtgtcac cctaattgca cctacggctg taccggacct 960

ggcctggaag gatgccctac aaacggccct aagatcccca gcattgccac cggaatggtt 1020

ggagccctgc tgcttctgtt ggtggtggcc ctcggaatcg gcctgttcat gtga 1074

<210> 249

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 截短的标记预测的剪接受体位点

<400> 249

actcctcctc tggatccaca ggaactggat attctgaaaa c 41

<210> 250

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 截短的标记预测的剪接受体位点

<400> 250

acagggtttt tgctgattca ggcttggcct gaaaacagga c 41

<210> 251

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 截短的标记预测的剪接受体位点

<400> 251

atggtcagtt ttctcttgca gtcgtcagcc tgaacataac a 41

<210> 252

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 截短的标记预测的剪接供体位点

<400> 252

tcttcatgtg agcgg 15

<210> 253

<211> 589

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 土拨鼠肝炎病毒 (WHP) 转录后调节元件 (WPRE)

<400> 253

aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60

ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120

atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180

tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240

ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300

attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360

ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaatcat cgtcctttcc ttggctgctc 420

gcctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480

aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540

cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc 589

<210> 254

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 预测的剪接位点

<400> 254

tcaattggta cgtgg 15

<210> 255

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223>接头

<400> 255

Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Glu Met Ala

20

<210> 256

<211> 159

<212> PRT

<213> 阿维丁链霉菌 (Streptomyces avidinii)

<220>

<223> 链霉亲和素 (UniProt号P22629)

<400> 256

Asp Pro Ser Lys Asp Ser Lys Ala Gln Val Ser Ala Ala Glu Ala Gly

1 5 10 15

Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr Phe Ile Val Thr

20 25 30

Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Glu Ser Ala Val Gly

35 40 45

Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr Asp Ser Ala Pro

50 55 60

Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr Val Ala Trp Lys

65 70 75 80

Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp Ser Gly Gln Tyr

85 90 95

Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp Leu Leu Thr Ser

100 105 110

Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu Val Gly His Asp

115 120 125

Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser Ile Asp Ala Ala Lys

130 135 140

Lys Ala Gly Val Asn Asn Gly Asn Pro Leu Asp Ala Val Gln Gln

145 150 155

<210> 257

<211> 126

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 最小链霉亲和素

<400> 257

Glu Ala Gly Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr Phe

1 5 10 15

Ile Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Glu Ser

20 25 30

Ala Val Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr Asp

35 40 45

Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr Val

50 55 60

Ala Trp Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp Ser

65 70 75 80

Gly Gln Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp Leu

85 90 95

Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu Val

100 105 110

Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser

115 120 125

<210> 258

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 链霉亲和素结合肽

<400> 258

His Pro Gln Phe

1

<210> 259

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 链霉亲和素结合肽

<220>

<221> 变体

<222> (3)...(3)

<223> Xaa选自Gln、Asp和Met

<400> 259

His Pro Xaa

1

<210> 260

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 链霉亲和素结合肽

<220>

<221> 变体

<222> (1)...(1)

<223> Xaa是Trp、Lys或Arg

<220>

<221> 变体

<222> (2)...(2)

<223> Xaa是任何氨基酸

<220>

<221> 变体

<222> (7)...(7)

<223> Xaa是Gly或Glu

<220>

<221> 变体

<222> (8)...(8)

<223> Xaa是Gly、Lys或Arg

<400> 260

Xaa Xaa His Pro Gln Phe Xaa Xaa

1 5

<210> 261

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 链霉亲和素结合肽

<220>

<221> 变体

<222> (2)...(2)

<223> Xaa是任何氨基酸

<220>

<221> 变体

<222> (7)...(7)

<223> Xaa是Gly或Glu

<220>

<221> 变体

<222> (8)...(8)

<223> Xaa是Gly、Lys或Arg

<400> 261

Trp Xaa His Pro Gln Phe Xaa Xaa

1 5

<210> 262

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 链霉亲和素结合肽，Strep-tag

<400> 262

Trp Arg His Pro Gln Phe Gly Gly

1 5

<210> 263

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Strep-tag II

<400> 263

Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

1 5

<210> 264

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 链霉亲和素结合肽的顺序模块

<220>

<221> 变体

<222> (9)...(9)

<223> Xaa是任何氨基酸

<220>

<221> 重复

<222> (9)...(9)

<223> Xaa被重复8或12次

<400> 264

Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Xaa Trp Ser His Pro Gln Phe Glu

1 5 10 15

Lys

<210> 265

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 链霉亲和素结合肽的顺序模块

<220>

<221> 重复

<222> (9)...(12)

<223> GlyGlyGlySer被重复2或3次

<400> 265

Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Trp Ser His Pro

1 5 10 15

Gln Phe Glu Lys

20

<210> 266

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Twin-Strep-tag

<400> 266

Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

20 25

<210> 267

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Twin-Strep-tag

<400> 267

Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

20

<210> 268

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Twin-Strep-tag

<400> 268

Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

Gly Gly Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

20 25

<210> 269

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Twin-Strep-tag

<400> 269

Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly

1 5 10 15

Gly Ser Gly Gly Gly Ser Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

20 25 30

<210> 270

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Twin-Strep-tag

<400> 270

Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly

1 5 10 15

Gly Ser Gly Gly Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

20 25 30

<210> 271

<211> 159

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变蛋白链霉亲和素Val44-Thr45-Ala46-Arg47

<400> 271

Asp Pro Ser Lys Asp Ser Lys Ala Gln Val Ser Ala Ala Glu Ala Gly

1 5 10 15

Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr Phe Ile Val Thr

20 25 30

Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Val Thr Ala Arg Gly

35 40 45

Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr Asp Ser Ala Pro

50 55 60

Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr Val Ala Trp Lys

65 70 75 80

Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp Ser Gly Gln Tyr

85 90 95

Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp Leu Leu Thr Ser

100 105 110

Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu Val Gly His Asp

115 120 125

Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser Ile Asp Ala Ala Lys

130 135 140

Lys Ala Gly Val Asn Asn Gly Asn Pro Leu Asp Ala Val Gln Gln

145 150 155

<210> 272

<211> 126

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变蛋白链霉亲和素Val44-Thr45-Ala46-Arg47

<400> 272

Glu Ala Gly Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr Phe

1 5 10 15

Ile Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Val Thr

20 25 30

Ala Arg Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr Asp

35 40 45

Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr Val

50 55 60

Ala Trp Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp Ser

65 70 75 80

Gly Gln Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp Leu

85 90 95

Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu Val

100 105 110

Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser

115 120 125

<210> 273

<211> 127

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变蛋白链霉亲和素Val44-Thr45-Ala46-Arg47

<400> 273

Met Glu Ala Gly Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr

1 5 10 15

Phe Ile Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Val

20 25 30

Thr Ala Arg Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr

35 40 45

Asp Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr

50 55 60

Val Ala Trp Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp

65 70 75 80

Ser Gly Gln Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp

85 90 95

Leu Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu

100 105 110

Val Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser

115 120 125

<210> 274

<211> 159

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变蛋白链霉亲和素Ile44-Gly45-Ala-46-Arg47

<400> 274

Asp Pro Ser Lys Asp Ser Lys Ala Gln Val Ser Ala Ala Glu Ala Gly

1 5 10 15

Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr Phe Ile Val Thr

20 25 30

Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Ile Gly Ala Arg Gly

35 40 45

Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr Asp Ser Ala Pro

50 55 60

Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr Val Ala Trp Lys

65 70 75 80

Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp Ser Gly Gln Tyr

85 90 95

Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp Leu Leu Thr Ser

100 105 110

Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu Val Gly His Asp

115 120 125

Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser Ile Asp Ala Ala Lys

130 135 140

Lys Ala Gly Val Asn Asn Gly Asn Pro Leu Asp Ala Val Gln Gln

145 150 155

<210> 275

<211> 126

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变蛋白链霉亲和素Ile44-Gly45-Ala-46-Arg47

<400> 275

Glu Ala Gly Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr Phe

1 5 10 15

Ile Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Ile Gly

20 25 30

Ala Arg Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr Asp

35 40 45

Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr Val

50 55 60

Ala Trp Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp Ser

65 70 75 80

Gly Gln Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp Leu

85 90 95

Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu Val

100 105 110

Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser

115 120 125

<210> 276

<211> 127

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变蛋白链霉亲和素Ile44-Gly45-Ala-46-Arg47

<400> 276

Met Glu Ala Gly Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr

1 5 10 15

Phe Ile Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Ile

20 25 30

Gly Ala Arg Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr

35 40 45

Asp Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr

50 55 60

Val Ala Trp Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp

65 70 75 80

Ser Gly Gln Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp

85 90 95

Leu Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu

100 105 110

Val Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser

115 120 125

<210> 277

<211> 126

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变蛋白链霉亲和素Val44-Thr45-Ala46-Arg47和

Glu117、Gly120、Try121 (突变蛋白m1-9)

<400> 277

Glu Ala Gly Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr Phe

1 5 10 15

Ile Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Val Thr

20 25 30

Ala Arg Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr Asp

35 40 45

Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr Val

50 55 60

Ala Trp Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp Ser

65 70 75 80

Gly Gln Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp Leu

85 90 95

Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu Glu Asn Ala Gly Tyr Ser Thr Leu Val

100 105 110

Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser

115 120 125

<210> 278

<211> 139

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变蛋白链霉亲和素Val44-Thr45-Ala46-Arg47和

Glu117、Gly120、Try121 (突变蛋白m1-9)

<400> 278

Asp Pro Ser Lys Asp Ser Lys Ala Gln Val Ser Ala Ala Glu Ala Gly

1 5 10 15

Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr Phe Ile Val Thr

20 25 30

Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Val Thr Ala Arg Gly

35 40 45

Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr Asp Ser Ala Pro

50 55 60

Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr Val Ala Trp Lys

65 70 75 80

Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp Ser Gly Gln Tyr

85 90 95

Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp Leu Leu Thr Ser

100 105 110

Gly Thr Thr Glu Glu Asn Ala Gly Tyr Ser Thr Leu Val Gly His Asp

115 120 125

Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser

130 135

<210> 279

<211> 127

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 最小链霉亲和素

<400> 279

Met Glu Ala Gly Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr

1 5 10 15

Phe Ile Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Glu

20 25 30

Ser Ala Val Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr

35 40 45

Asp Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr

50 55 60

Val Ala Trp Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp

65 70 75 80

Ser Gly Gln Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp

85 90 95

Leu Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu

100 105 110

Val Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser

115 120 125

<210> 280

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗CD3抗体OKT3的可变重链

<400> 280

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr

20 25 30

Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

115

<210> 281

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗CD3抗体OKT3的可变轻链

<400> 281

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala His Phe Arg Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gly Met Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr

85 90 95

Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn

100 105

<210> 282

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗CD28抗体CD28.3的可变重链

<400> 282

Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Arg

1 5 10 15

Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr Ile Ile His

20 25 30

Trp Ile Lys Leu Arg Ser Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Trp Phe

35 40 45

Tyr Pro Gly Ser Asn Asp Ile Gln Tyr Asn Ala Lys Phe Lys Gly Lys

50 55 60

Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu

65 70 75 80

Thr Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Arg

85 90 95

Asp Asp Phe Ser Gly Tyr Asp Ala Leu Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Met Val Thr Val

115

<210> 283

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗CD28抗体CD28.3的可变轻链

<400> 283

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ser Val Gly

1 5 10 15

Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Asn Glu Asn Ile Tyr Ser Asn

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Thr His Leu Val Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Thr Ser Leu Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Phe Gly Asn Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Cys

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

Claims

所述组合物中至少或至少约80％的细胞是CD3⁺细胞；并且

3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述组合物包含在约1:2.5与约5:1之间的比率的表达所述CAR的CD4⁺T细胞和表达所述CAR的CD8⁺T细胞。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述组合物包含在约1:2与约4:1之间、在约1:1.5与约2:1之间或为或为约1:1的比率的表达所述CAR的CD4⁺T细胞和表达所述CAR的CD8⁺T细胞。

5.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述组合物包含在约5:1与约2:1之间、在约4:1与约2:1之间、在约3:1与约2:1之间、为或为约5:1、为或为约4:1、为或为约3:1、或为或为约2:1的比率的表达所述CAR的CD4⁺T细胞和表达所述CAR的CD8⁺T细胞。

6.根据权利要求2-5中任一项所述的方法，其中所述组合物包含在为或约5×10⁶个CAR表达T细胞与为或约80×10⁶个之间的CAR表达T细胞，包含端值。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述组合物包含在为或约5×10⁶个CAR表达T细胞与为或约40×10⁶个之间的CAR表达T细胞，包含端值。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述组合物包含在为或约5×10⁶个CAR表达T细胞与为或约20×10⁶个之间的CAR表达T细胞，包含端值。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述组合物包含在为或约5×10⁶个CAR表达T细胞与为或约10×10⁶个之间的CAR表达T细胞，包含端值。

10.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述组合物包含在为或约10×10⁶个CAR表达T细胞与为或约20×10⁶个之间的CAR表达T细胞，包含端值。

11.根据权利要求1-8和10中任一项所述的方法，其中所述组合物包含为或约20×10⁶个CAR表达T细胞。

12.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述组合物包含为或约30×10⁶个CAR表达T细胞。

13.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述组合物包含为或约40×10⁶个CAR表达T细胞。

14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少或至少约90％的细胞是CD3⁺细胞。

15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、或至少或至少约96％的细胞是CD3⁺细胞。

16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述组合物中在为或约2％与为或约30％之间的CAR⁺T细胞表达凋亡标记，任选地膜联蛋白V或活性半胱天冬酶3。

17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述组合物中在为或约5％与为或约10％之间的CAR⁺T细胞表达凋亡标记，任选地膜联蛋白V或活性半胱天冬酶3。

18.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述组合物中在为或约10％与为或约15％之间的CAR⁺T细胞表达凋亡标记，任选地膜联蛋白V或活性半胱天冬酶3。

19.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述组合物中在为或约15％与为或约20％之间的CAR⁺T细胞表达凋亡标记，任选地膜联蛋白V或活性半胱天冬酶3。

20.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述组合物中在为或约20％与为或约30％之间的CAR⁺T细胞表达凋亡标记，任选地膜联蛋白V或活性半胱天冬酶3。

21.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述组合物中为或约5％、为或约10％、为或约15％、为或约20％、为或约25％、或为或约30％的CAR⁺T细胞表达凋亡标记，任选地膜联蛋白V或活性半胱天冬酶3。

22.根据权利要求2-21中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少或至少约80％的CAR⁺T细胞具有幼稚样或中枢记忆表型。

23.根据权利要求1-22中任一项所述的方法，其中所述组合物中在为或约80％与为或约85％之间的CAR⁺T细胞具有幼稚样或中枢记忆表型。

24.根据权利要求1-22中任一项所述的方法，其中所述组合物中在为或约85％与为或约90％之间的CAR⁺T细胞具有幼稚样或中枢记忆表型。

25.根据权利要求1-22中任一项所述的方法，其中所述组合物中在为或约90％与为或约95％之间的CAR⁺T细胞具有幼稚样或中枢记忆表型。

26.根据权利要求1-22中任一项所述的方法，其中所述组合物中在为或约95％与为或约99％之间的CAR⁺T细胞具有幼稚样或中枢记忆表型。

27.根据权利要求1-22中任一项所述的方法，其中所述组合物中为或约85％、为或约90％、为或约95％、或为或约99％的CAR⁺T细胞具有幼稚样或中枢记忆表型。

28.根据权利要求1和3-27中任一项所述的方法，其中所述组合物中具有幼稚样或中枢记忆表型的所述至少或至少约80％的CAR⁺T细胞对在幼稚样或中枢记忆T细胞上表达的标记呈表面阳性。

29.根据权利要求28所述的方法，其中在幼稚样或中枢记忆T细胞上表达的所述标记选自CD45RA、CD27、CD28和CCR7。

30.根据权利要求1和3-29中任一项所述的方法，其中所述组合物中具有幼稚样或中枢记忆表型的所述至少或至少约80％的CAR⁺T细胞具有选自CCR7⁺CD45RA⁺、CD27⁺CCR7⁺或CD62L^-CCR7⁺的表型。

31.根据权利要求1-30中任一项所述的方法，其中所述组合物中在为或约80％与为或约85％之间、在为或约85％与为或约90％之间、在为或约90％与为或约95％之间、在为或约95％与为或约99％之间的CAR⁺T细胞具有选自CCR7⁺CD45RA⁺、CD27⁺CCR7⁺或CD62L^-CCR7⁺的幼稚样或中枢记忆表型。

32.根据权利要求1-31中任一项所述的方法，其中所述组合物中为或约80％、为或约85％、为或约90％、为或约95％、或为或约99％的CAR⁺T细胞具有选自CCR7⁺CD45RA⁺、CD27⁺CCR7⁺或CD62L^-CCR7⁺的幼稚样或中枢记忆表型。

33.根据权利要求1-32中任一项所述的方法，其中所述组合物中为或约80％、为或约85％、为或约90％、为或约95％、或为或约99％的CAR⁺T细胞具有为CD27⁺CCR7⁺的幼稚样或中枢记忆表型。

34.根据权利要求1-33中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少或至少约50％的CD4⁺CAR⁺T细胞具有为CCR7⁺CD45RA⁺或CCR7⁺CD45RA^-的幼稚样或中枢记忆表型。

35.根据权利要求1-34中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少或至少约60％的CD4⁺CAR⁺T细胞具有为CCR7⁺CD45RA⁺或CCR7⁺CD45RA^-的幼稚样或中枢记忆表型。

36.根据权利要求1-35中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少或至少约70％的CD4⁺CAR⁺T细胞具有为CCR7⁺CD45RA⁺或CCR7⁺CD45RA^-的幼稚样或中枢记忆表型。

37.根据权利要求1-36中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少或至少约80％的CD4⁺CAR⁺T细胞具有为CCR7⁺CD45RA⁺或CCR7⁺CD45RA^-的幼稚样或中枢记忆表型。

38.根据权利要求1-37中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少或至少约85％的CD4⁺CAR⁺T细胞具有为CCR7⁺CD45RA⁺或CCR7⁺CD45RA^-的幼稚样或中枢记忆表型。

39.根据权利要求1-38中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少或至少约50％的CD4⁺CAR⁺T细胞具有为CD27⁺CCR7⁺的幼稚样或中枢记忆表型。

40.根据权利要求1-39中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少或至少约60％的CD4⁺CAR⁺T细胞具有为CD27⁺CCR7⁺的幼稚样或中枢记忆表型。

41.根据权利要求1-40中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少或至少约70％的CD4⁺CAR⁺T细胞具有为CD27⁺CCR7⁺的幼稚样或中枢记忆表型。

42.根据权利要求1-41中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少或至少约80％的CD4⁺CAR⁺T细胞具有为CD27⁺CCR7⁺的幼稚样或中枢记忆表型。

43.根据权利要求1-42中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少或至少约85％的CD4⁺CAR⁺T细胞具有为CD27⁺CCR7⁺的幼稚样或中枢记忆表型。

44.根据权利要求1-43中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少或至少约50％的CD8⁺CAR⁺T细胞具有为CCR7⁺CD45RA⁺或CCR7⁺CD45RA^-的幼稚样或中枢记忆表型。

45.根据权利要求1-44中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少或至少约60％的CD8⁺CAR⁺T细胞具有为CCR7⁺CD45RA⁺或CCR7⁺CD45RA^-的幼稚样或中枢记忆表型。

46.根据权利要求1-45中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少或至少约70％的CD8⁺CAR⁺T细胞具有为CCR7⁺CD45RA⁺或CCR7⁺CD45RA^-的幼稚样或中枢记忆表型。

47.根据权利要求1-46中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少或至少约80％的CD8⁺CAR⁺T细胞具有为CCR7⁺CD45RA⁺或CCR7⁺CD45RA^-的幼稚样或中枢记忆表型。

48.根据权利要求1-47中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少或至少约85％的CD8⁺CAR⁺T细胞具有为CCR7⁺CD45RA⁺或CCR7⁺CD45RA^-的幼稚样或中枢记忆表型。

49.根据权利要求1-48中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少或至少约50％的CD8⁺CAR⁺T细胞具有为CD27⁺CCR7⁺的幼稚样或中枢记忆表型。

50.根据权利要求1-49中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少或至少约60％的CD8⁺CAR⁺T细胞具有为CD27⁺CCR7⁺的幼稚样或中枢记忆表型。

51.根据权利要求1-50中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少或至少约70％的CD8⁺CAR⁺T细胞具有为CD27⁺CCR7⁺的幼稚样或中枢记忆表型。

52.根据权利要求1-51中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少或至少约80％的CD8⁺CAR⁺T细胞具有为CD27⁺CCR7⁺的幼稚样或中枢记忆表型。

53.根据权利要求1-52中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少或至少约85％的CD8⁺CAR⁺T细胞具有为CD27⁺CCR7⁺的幼稚样或中枢记忆表型。

54.根据权利要求1-53中任一项所述的方法，其中所述组合物中的所述CAR⁺T细胞中的整合载体拷贝数(iVCN)与总VCN的分数平均小于或小于约0.9。

55.根据权利要求1-54中任一项所述的方法，其中所述组合物中的所述CAR⁺T细胞中的整合载体拷贝数(iVCN)与总VCN的分数平均在为或约0.9与为或约0.8之间。

56.根据权利要求1-54中任一项所述的方法，其中所述组合物中的所述CAR⁺T细胞中的整合载体拷贝数(iVCN)与总VCN的分数平均小于或小于约0.8。

57.根据权利要求1-54和56中任一项所述的方法，其中所述组合物中的所述CAR⁺T细胞中的整合载体拷贝数(iVCN)与总VCN的分数平均在为或约0.8与为或约0.7之间。

58.根据权利要求1-54和56中任一项所述的方法，其中所述组合物中的所述CAR⁺T细胞中的整合载体拷贝数(iVCN)与总VCN的分数平均在为或约0.7与为或约0.6之间。

59.根据权利要求1-54和56中任一项所述的方法，其中所述组合物中的所述CAR⁺T细胞中的整合载体拷贝数(iVCN)与总VCN的分数平均在为或约0.6与为或约0.5之间。

60.根据权利要求1-54和56中任一项所述的方法，其中所述组合物中的所述CAR⁺T细胞中的整合载体拷贝数(iVCN)与总VCN的分数平均在为或约0.5与为或约0.4之间。

61.根据权利要求1-60中任一项所述的方法，其中所述组合物中的所述CAR⁺T细胞的整合载体拷贝数(iVCN)平均在或在约每个二倍体基因组0.4个拷贝与每个二倍体基因组2.0个拷贝之间，包含端值。

62.根据权利要求1-61中任一项所述的方法，其中所述组合物中的所述CAR⁺T细胞的整合载体拷贝数(iVCN)平均在或在约每个二倍体基因组0.8个拷贝与每个二倍体基因组2.0个拷贝之间，包含端值。

63.根据权利要求1-62中任一项所述的方法，其中所述组合物中的所述CAR⁺T细胞的整合载体拷贝数(iVCN)平均在或在约每个二倍体基因组0.8个拷贝与每个二倍体基因组1.0个拷贝之间，包含端值。

64.根据权利要求1-62中任一项所述的方法，其中所述组合物中的所述CAR⁺T细胞的整合载体拷贝数(iVCN)平均在或在约每个二倍体基因组1.0个拷贝与每个二倍体基因组1.5个拷贝之间，包含端值。

65.根据权利要求1-62中任一项所述的方法，其中所述组合物中的所述CAR⁺T细胞的整合载体拷贝数(iVCN)平均在或在约每个二倍体基因组1.5个拷贝与每个二倍体基因组2.0个拷贝之间，包含端值。

66.根据权利要求1-65中任一项所述的方法，其中在施用所述包含工程化T细胞的组合物时或之前，所述受试者已接受过至少3种先前抗骨髓瘤治疗方案。

67.根据权利要求1-66中任一项所述的方法，其中在施用所述包含工程化T细胞的组合物时或之前，所述受试者已接受过所有三种以下抗骨髓瘤治疗方案：自体干细胞移植(ASCT)；包含免疫调节剂和蛋白酶体抑制剂的方案；和抗CD38剂。

68.根据权利要求66或权利要求67所述的方法，其中在施用所述包含工程化T细胞的组合物时或之前，所述受试者对最后一种抗骨髓瘤治疗方案是难治的。

69.根据权利要求68所述的方法，其中难治性骨髓瘤被定义为在用最后一种抗骨髓瘤治疗方案治疗期间或从最后一个剂量起测量的在完成最后一种抗骨髓瘤治疗方案的治疗的12个月内有记录在案的疾病进展。

70.根据权利要求1-69中任一项所述的方法，其中所述受试者尚未接受过先前CAR T细胞或经遗传修饰的T细胞疗法。

71.根据权利要求1-70中任一项所述的方法，其中所述受试者尚未接受过靶向BCMA的先前疗法，诸如抗BCMA单克隆抗体或双特异性抗体。

72.根据权利要求1-71中任一项所述的方法，所述方法还包括从所述受试者中获得白细胞单采术样品用于制造所述包含工程化T细胞的组合物。

73.根据权利要求1-72中任一项所述的方法，其中所述CAR包含：

(b)间隔子，所述间隔子包含IgG4/2嵌合铰链或经修饰的IgG4铰链、IgG2/4嵌合C_H2区和IgG4 C_H3区，所述间隔子任选地具有约228个氨基酸的长度；任选地其中所述间隔子如SEQID NO:174所示；

(c)跨膜结构域，任选地来自人CD28的跨膜结构域；以及

74.根据权利要求73所述的方法，其中所述V_H是或包含SEQ ID NO:116的氨基酸序列；并且所述V_L是或包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列。

75.根据权利要求73或权利要求74所述的方法，其中所述细胞外抗原结合结构域包含scFv。

76.根据权利要求73-75中任一项所述的方法，其中所述V_H和所述V_L通过柔性接头连接。

77.根据权利要求75或权利要求76所述的方法，其中所述scFv包含含有氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:1)的接头。

78.根据权利要求73-77中任一项所述的方法，其中所述细胞外抗原结合结构域包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列或与SEQ ID NO:114的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。

79.根据权利要求73-78中任一项所述的方法，其中所述细胞外抗原结合结构域包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列。

80.根据权利要求73-79中任一项所述的方法，其中所述胞质信号传导结构域是或包含SEQ ID NO:143所示的序列或与SEQ ID NO:143具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

81.根据权利要求73-80中任一项所述的方法，其中所述共刺激信号传导区包含CD28、4-1BB或ICOS的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。

82.根据权利要求73-81中任一项所述的方法，其中所述共刺激信号传导区包含4-1BB、任选人4-1BB的细胞内信号传导结构域。

83.根据权利要求73-82中任一项所述的方法，其中所述共刺激信号传导区是或包含SEQ ID NO:4所示的序列或与SEQ ID NO:4所示的序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

84.根据权利要求73-83中任一项所述的方法，其中所述共刺激信号传导区位于所述跨膜结构域与所述CD3-zeta(CD3ζ)链胞质信号传导结构域之间。

85.根据权利要求73-84中任一项所述的方法，其中所述跨膜结构域是或包含来自人CD28的跨膜结构域。

86.根据权利要求73-85中任一项所述的方法，其中所述跨膜结构域是或包含SEQ IDNO:138所示的序列或与SEQ ID NO:138具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

87.根据权利要求73-86中任一项所述的方法，其中所述CAR从其N末端至C末端依次包含：所述细胞外抗原结合结构域、所述间隔子、所述跨膜结构域和所述细胞内信号传导区。

88.根据权利要求1-87中任一项所述的方法，其中所述CAR包含：

89.根据权利要求1-88中任一项所述的方法，其中所述CAR包含：

(b)间隔子，所述间隔子包含SEQ ID NO:174所示的序列；

90.根据权利要求1-89中任一项所述的方法，其中所述CAR包含SEQ ID NO:19所示的序列。

91.根据权利要求1-90中任一项所述的方法，其中在所述施用之前，所述受试者已接受过淋巴细胞清除疗法，所述淋巴细胞清除疗法包括每天施用为或约20-40mg/m²受试者体表面积、任选为或约30mg/m²的氟达拉滨，持续2-4天，和/或每天施用为或约200-400mg/m²受试者体表面积、任选为或约300mg/m²的环磷酰胺，持续2-4天。

92.根据权利要求1-91中任一项所述的方法，其中所述方法能够在患有所述MM的受试者群组中的至少一名受试者中或至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的受试者中任选地在开始所述施用后的指定时间点实现规定的反应或结局，其中：

所述反应或结局选自客观反应(OR)、完全反应(CR)、严格的完全反应(sCR)、非常好的部分反应(VGPR)、部分反应(PR)和最小反应(MR)；

所述反应或结局是或包括OR；和/或

所述反应或结局是或包括CR。

93.根据权利要求92所述的方法，其中所述反应或结局可持续大于或大于约3、6、9或12个月。

94.根据权利要求92或权利要求93所述的方法，其中与在所述指定时间点确定的反应或结局相比，在所述指定时间点之后为或约3、6、9或12个月时确定的反应或结局是相等的或改善的。

95.根据权利要求1-94中任一项所述的方法，其中所述方法不会在患有所述MM的所述受试者群组中的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的受试者中导致任何细胞因子释放综合征(CRS)。

96.根据权利要求1-95中任一项所述的方法，其中所述方法不会在患有所述MM的所述受试者群组中的至少至少至少80％、至少90％或至少95％的受试者中导致重度细胞因子释放综合征(CRS)。

97.根据权利要求1-96中任一项所述的方法，其中所述方法不会在患有所述MM的所述受试者群组中的至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的受试者中导致任何神经毒性。

98.根据权利要求1-97中任一项所述的方法，其中所述方法不会在患有所述MM的所述受试者群组中的至少至少至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的受试者中导致重度神经毒性。

99.根据权利要求1-98中任一项所述的方法，其中所述方法不会在患有所述MM的所述受试者群组中的至少至少至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的受试者中导致重度CRS和重度神经毒性。

100.根据权利要求1-99中任一项所述的方法，其中所述方法不会在患有所述MM的所述受试者群组中的至少80％、至少90％或至少95％的受试者中导致重度CRS和重度神经毒性。

101.根据权利要求96、99和100所述的方法，其中所述重度CRS是3级或更高级别、4级或更高级别或5级CRS。

102.根据权利要求98、99或100所述的方法，其中所述重度神经毒性是3级或更高级别、4级或更高级别或5级CRS。

103.根据权利要求1-102中任一项所述的方法，其中所述组合物的施用是在门诊基础上和/或在不使所述受试者住院的情况下和/或不在医院过夜停留的情况下和/或不需要住院或在医院过夜停留的情况下进行，任选地除非或直到所述受试者展现持续的发热或在用退热药治疗后没有被或还没有被降低或降低超过1℃的发热。

104.根据权利要求1-103中任一项所述的方法，其中所述包含工程化T细胞的组合物是肠胃外施用的，任选地静脉内施用的。

105.根据权利要求1-104中任一项所述的方法，其中所述受试者是人受试者。

106.根据权利要求1-105中任一项所述的方法，其中所述包含工程化T细胞的组合物通过如下制造过程产生，所述制造过程包括：

(i)在刺激T细胞的条件下将包含原代T细胞的输入组合物、任选地包含选自所述受试者的自体T细胞的输入组合物暴露于包含含有多个链霉亲和素突变蛋白分子的寡聚颗粒试剂的刺激试剂，从而产生受刺激的群体，其中：

所述寡聚颗粒试剂包含含有抗CD3抗体或其抗原结合片段的第一药剂以及含有抗CD28抗体或其抗原结合片段的第二药剂；

(ii)将编码所述靶向BCMA的CAR的异源多核苷酸引入所述受刺激群体的T细胞中，从而产生转化细胞群；

(iii)将所述转化细胞群孵育长达96小时；以及

(iv)收获所述转化细胞群的T细胞，从而产生工程化细胞组合物，其中所述收获是在开始暴露于所述刺激试剂后的24小时与120小时之间且包含端值的时候进行。

107.根据权利要求106所述的方法，其中所述抗CD3抗体或抗原结合片段是Fab，并且所述抗CD28抗体或抗原结合片段是Fab。

108.根据权利要求106或权利要求107所述的方法，其中所述第一药剂和所述第二药剂各自包含使所述第一药剂和所述第二药剂与所述寡聚颗粒试剂可逆地结合的链霉亲和素结合肽，任选地其中所述链霉亲和素结合肽包含SEQ ID NO:266-270中任一个所示的氨基酸序列。

109.根据权利要求106-108中任一项所述的方法，其中所述链霉亲和素突变蛋白分子是包含氨基酸残基Val44-Thr45-Ala46-Arg47或Ile44-Gly45-Ala46-Arg47的链霉亲和素突变蛋白的四聚体，任选地其中所述链霉亲和素突变蛋白包含SEQ ID NO:257、272、275、277、279、273或276中任一个所示的序列。

110.根据权利要求106-109中任一项所述的方法，其中所述寡聚颗粒试剂包含1,000个与5,000个之间的链霉亲和素突变蛋白四聚体，包含端值。

111.根据权利要求106-110中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在收获所述细胞之前，在所述孵育之后或期间添加生物素或生物素类似物。

112.根据权利要求106-111中任一项所述的方法，其中所述收获是在开始暴露于所述刺激试剂后的48小时与120小时之间且包含端值的时候进行。

113.根据权利要求106-112中任一项所述的方法，其中所述收获是在基因组中检测到整合载体的时候但在达到每个二倍体基因组的稳定整合载体拷贝数(iVCN)之前进行。

114.根据权利要求106-113中任一项所述的方法，其中所述收获是在所述收获时活细胞总数是所述受刺激群体的活细胞总数的大于或大于约三倍之前的时候进行。

115.根据权利要求106-114中任一项所述的方法，其中所述收获是在所述收获时活细胞总数是所述受刺激群体的活细胞总数的为或约三倍、为或约两倍、或与之相同或大致相同的时候进行。

116.根据权利要求106-115中任一项所述的方法，其中所述收获是在所述转化细胞群中的总T细胞、所述转化细胞群中的总CD3⁺T细胞、所述转化细胞群中的总CD4⁺T细胞、所述转化细胞群中的总CD8⁺T细胞或其CAR表达细胞中的CD27⁺CCR7⁺细胞的百分比大于或大于约50％的时候进行。

117.根据权利要求106-116中任一项所述的方法，其中所述收获是在所述转化细胞群中的总T细胞、所述转化细胞群中的总CD3⁺T细胞、所述转化细胞群中的总CD4⁺T细胞、所述转化细胞群中的总CD8⁺T细胞或其CAR表达细胞中的CD45RA⁺CCR7⁺和CD45RA^-CCR7⁺细胞的百分比大于或大于约60％的时候进行。

118.根据权利要求1-117中任一项所述的方法，其中所施用的组合物中的细胞通过产生输出组合物的制造过程产生，所述输出组合物(i)包含工程化CD4+T细胞和工程化CD8+T细胞，并且(ii)展现出预定特征，其中当在多名不同的单独受试者中进行时，所述制造过程的迭代任选地从人生物样品产生多种所述输出组合物，其中所述多种输出组合物中的输出组合物的预定特征选自：

119.根据权利要求1-118中任一项所述的方法，其中所施用的组合物通过在至少约80％、约90％、约95％、约97％、约99％、约100％或为100％的人生物样品中产生输出组合物的制造过程来产生，所述输出组合物展现出预定特征、任选地在所述输出组合物中有阈值数量的表达所述CAR的细胞，其中所述制造过程在多名不同的单独受试者中进行。

120.根据权利要求1-119中任一项所述的方法，其中所述MM是复发性和/或难治性多发性骨髓瘤(r/r MM)。

121.一种制品，所述制品包含含有表达靶向BCMA的嵌合抗原受体(CAR)的基因工程化细胞的组合物、以及根据权利要求1-120中任一项所述的方法施用所述细胞组合物的说明书。