CN113614108A - G蛋白偶合受体c类5族成员d(gprc5d)特异性嵌合抗原受体 - Google Patents
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Abstract
本发明提供含有G蛋白偶合受体C类5族成员D(GPRC5D)特异性抗体部分的嵌合抗原受体(CAR)，和编码GPRC5D特异性CAR的多核苷酸。本发明进一步涉及含有此类GPRC5D结合受体的经基因工程改造的细胞，和其在过继细胞疗法中的用途。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求以下美国临时申请的优先权：2018年11月1日提交的题为“CHIMERICANTIGEN RECEPTORS SPECIFIC FOR GPROTEIN-COUPLED RECEPTOR CLASS C GROUP5MEMBER D(GPRC5D)”的美国临时申请62/754,576；2018年11月30日提交的题为“CHIMERICANTIGEN RECEPTORS SPECIFIC FOR GPROTEIN-COUPLED RECEPTOR CLASS C GROUP5MEMBER D(GPRC5D)”的美国临时申请62/774,159；2019年3月15日提交的题为“CHIMERICANTIGEN RECEPTORS SPECIFIC FOR GPROTEIN-COUPLED RECEPTOR CLASS C GROUP5MEMBER D(GPRC5D)”的美国临时申请62/819,422；2019年9月23日提交的题为“CHIMERICANTIGEN RECEPTORS SPECIFIC FOR GPROTEIN-COUPLED RECEPTOR CLASS C GROUP5MEMBER D(GPRC5D)”的美国临时申请62/904,197；和2019年9月23日提交的题为“BICISTRONIC POLYNUCLEOTIDE CONSTRUCTS ENCODING CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS”的美国临时申请62/904,187，其内容针对所有目的全部并入本申请以作参考。
序列表以引用的方式并入
本申请与电子格式的序列表一起提交。序列表以名为735042013740SeqList.TXT的文件形式提供，创建于2019年10月31日，大小为294千字节。序列表电子格式的信息通过引用的方式整体并入本申请。
技术领域
在一些方面中，本发明涉及含有G蛋白偶合受体C类5族成员D(GPRC5D)特异性抗体部分的嵌合抗原受体(CAR)，和编码GPRC5D特异性CAR的多核苷酸。本发明进一步涉及含有此类GPRC5D结合受体的经基因工程改造的细胞，和其在过继细胞疗法中的用途。
背景技术
G蛋白偶合受体C类5族成员D(GPRC5D)是一种G蛋白偶合受体，其具体功能尚未确定。GPRC5D在患有多发性骨髓瘤(MM)的患者的骨髓样品中具有高表达，但GPRC5D在患有其他血液恶性病的患者的骨髓样品中具有最少表达。基于GPRC5D的表达，其可为MM肿瘤的标记物和治疗靶标。可获得各种GPRC5D结合嵌合抗原受体(CAR)和表达此类CAR的细胞。然而，仍需要改良的GPRC5D结合CAR和经基因工程改造的表达GPRC5D-CAR的靶细胞，例如用于过继细胞疗法中。本申请提供满足此类需要的实施方式。
发明内容
本申请提供嵌合抗原受体，其含有：(1)特异性结合人G蛋白偶联受体C类5族成员D(GPRC5D)的细胞外抗原结合结构域，其中该细胞外抗原结合结构域含有：(i)重链可变(VH)区，其含有与SEQ ID NO:21、23、25、27、29、31或33中的任一个中所示的VH区氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列；和(ii)轻链可变(VL)区，其含有与SEQ ID NO:22、24、26、28、30、32或34中的任一个中所示的VL区氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列；(2)长度为至少125个氨基酸的间隔子；(3)跨膜结构域；和(4)细胞内信号转导区。
也提供嵌合抗原受体，其含有：(1)特异性结合人G蛋白偶联受体C类5族成员D(GPRC5D)的细胞外抗原结合结构域，其中该细胞外抗原结合结构域含有：(i)含选自SEQ IDNO:21、23、25、27、29、31或33中的任一个的区氨基酸序列内所包含的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的重链可变(VH)；和(ii)含选自SEQ ID NO:22、24、26、28、30、32或34中的任一个的VL区氨基酸序列内所包含的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的轻链可变(VL)区；(2)长度为至少125个氨基酸的间隔子；(3)跨膜结构域；和(4)细胞内信号转导区。
也提供嵌合抗原受体，其含有：(1)特异性结合人G蛋白偶联受体C类5族成员D(GPRC5D)的细胞外抗原结合结构域，其中该细胞外抗原结合结构域含有：(i)可变重链(VH)，其包括含选自SEQ ID NO:75、78、80、82、90、93、95、97、105、108、110、112、120、123、125、127、135、138、140、142、135、152、162、165、167或169中的任一个的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR-H1)；(b)含选自SEQ ID NO:76、79、81、83、91、94、96、98、106、109、111、113、121、124、126、128、136、139、141、143、150、153、154、155、163、166、169或170中的任一个的氨基酸序列的重链互补决定区2(CDR-H2)；和(c)含选自SEQ ID NO:77、84、92、99、107、114、133、129、137、144、151、156、164或171中的任一个的氨基酸序列的重链互补决定区3(CDR-H3)；和(ii)轻链可变(VL)区，其包括含选自SEQ ID NO:85、88、100、103、115、118、130、133、145、148、157、160、172或174中的任一个的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR-L1)；(b)含选自SEQ ID NO:86、89、101、104、116、119、131、134、146、149、158或161中的任一个的氨基酸序列的轻链互补决定区2(CDR-L2)；和(c)含选自SEQ ID NO:87、102、117、132、147、159、173、175或297中的任一个的氨基酸序列的轻链互补决定区3(CDR-L3)；(2)长度为至少125个氨基酸的间隔子；(3)跨膜结构域；和(4)细胞内信号转导区。
在任何所提供的实施方式中的一些中，该嵌合抗原受体的细胞外抗原结合结构域含有：(i)重链可变(VH)，其含有与SEQ ID NO:21、23、25、27、29、31或33中的任一个中所示的VH区氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列；和(ii)轻链可变(VL)区，其含有与SEQ ID NO:22、24、26、28、30、32或34中的任一个中所示的VL区氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。
在任何所提供的实施方式中的一些中，该间隔子的长度是自或自约125至300个氨基酸、125至250个氨基酸、125至230个氨基酸、125至200个氨基酸、125至180个氨基酸、125至150个氨基酸、150至300个氨基酸、150至250个氨基酸、150至230个氨基酸、150至200个氨基酸、150至180个氨基酸、180至300个氨基酸、180至250个氨基酸、180至230个氨基酸、180至200个氨基酸、200至300个氨基酸、200至250个氨基酸、200至230个氨基酸、230至300个氨基酸、230至250个氨基酸、或250至300个氨基酸。在任何所提供的实施方式中的一些中，该间隔子的长度是至少或至少约或是或是约130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、221、222、223、224、225、226、227、228或229个氨基酸，或其长度在任何前述两个数值之间。
在任何所提供的实施方式中的一些中，该间隔子来源于免疫球蛋白。在任何所提供的实施方式中的一些中，该间隔子含有铰链区、CH2区和CH3区的序列。在任何所提供的实施方式中的一些中，该铰链、CH2和CH3中的一个或多个全部或部分地来源于IgG4或IgG2，任选为人IgG4或人IgG2。在任何所提供的实施方式中的一些中，该铰链、CH2和CH3来源于IgG4。在任何所提供的实施方式中的一些中，该铰链、CH2和CH3中的一个或多个是嵌合的且含有来源于IgG4和IgG2的序列。在任何所提供的实施方式中的一些中，该间隔子含有IgG4/2嵌合铰链，或相较于人IgG4含有至少一个氨基酸置换的经修饰的IgG4、IgG2/4嵌合CH2和IgG4 CH3区。
在任何所提供的实施方式中的一些中，该间隔子是或含有(i)SEQ ID NO:17中所示的序列；(ii)与SEQ ID NO:17具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的SEQID NO:17的功能变体；或(iii)长度为至少125个氨基酸的(i)或(ii)的连续部分。在任何所提供的实施方式中的一些中，该间隔子是或含有SEQ ID NO:17中所示的序列。在任何所提供的实施方式中的一些中，该间隔子是或含有由SEQ ID NO:48中所示(也如SEQ ID NO:74中所示)的核苷酸序列编码的序列。
在任何所提供的实施方式中的一些中，该VH区和该VL区分别含有SEQ ID NO:21和22中所示的氨基酸序列，或分别含有与SEQ ID NO:21和22具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列；该VH区和该VL区含有分别如SEQID NO:23和24中所示的氨基酸序列，或分别与SEQ ID NO:23和24具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列；该VH区和该VL区含有分别如SEQ ID NO:25和26中所示的氨基酸序列，或分别与SEQ ID NO:25和26具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列；该VH区和该VL区含有分别如SEQ ID NO:27和28中所示的氨基酸序列，或分别与SEQ ID NO:27和28具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列；该VH区和该VL区含有分别如SEQ ID NO:29和30中所示的氨基酸序列，或分别与SEQ ID NO:29和30具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列；该VH区和该VL区含有分别如SEQ ID NO:31和32中所示的氨基酸序列，或分别与SEQ IDNO:31和32具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列；或该VH区和该VL区含有分别如SEQ ID NO:33和34中所示的氨基酸序列，或分别与SEQ ID NO:33和34具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列。
在任何所提供的实施方式中的一些中，该VH区包括分别含SEQ ID NO:80、81和77的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该VL区包括分别含SEQ ID NO:85、86和87的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；该VH区包括分别含SEQ ID NO:82、83和84的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该VL区包括分别含SEQ ID NO:88、89和87的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；该VH区包括分别含SEQ ID NO:95、96、92的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该VL区包括分别含SEQ ID NO:100、101和102的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；该VH区包括分别含SEQ ID NO:97、98和99的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该VL区包括分别含SEQ ID NO:103、104和102的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；该VH区包括分别含SEQ ID NO:110、111和107的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该VL区包括分别含SEQ ID NO:115、116和117的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；该VH区包括分别含SEQ ID NO:112、113和114的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该VL区包括分别含SEQ ID NO:118、119和117的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；该VH区包括分别含SEQ ID NO:125、126和122的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该VL区包括分别含SEQ ID NO:130、131和132的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；该VH区包括分别含SEQ ID NO:127、128和129的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该VL区包括分别含SEQ ID NO:133、134和132的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；该VH区包括分别含SEQ ID NO:140、141和137的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该VL区包括分别含SEQ ID NO:145、146和147的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；该VH区包括分别含SEQ ID NO:142、143和144的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该VL区包括分别含SEQ ID NO:148、149和147的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；该VH区包括分别含SEQ ID NO:140、154和151的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该VL区包括分别含SEQ ID NO:157、158和159的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；该VH区包括分别含SEQ ID NO:142、155和156的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该VL区包括分别含SEQ ID NO:160、161和159的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；该VH区包括分别含SEQ ID NO:167、168和164的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该VL区包括分别含SEQ ID NO:172、86、173的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；该VH区包括分别含SEQ ID NO:169、170和171的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该VL区包括分别含SEQ ID NO:174、89和175的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；或该VH区包括分别含SEQ ID NO:169、170和171的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该VL区包括分别含SEQ ID NO:174、89和297的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
在任何所提供的实施方式中的一些中，该VH区和该VL区分别含有SEQ ID NO:21和22中所示的氨基酸序列；该VH区和该VL区分别含有SEQ ID NO:23和24中所示的氨基酸序列；该VH区和该VL区分别含有SEQ ID NO:25和26中所示的氨基酸序列；该VH区和该VL区分别含有SEQ ID NO:27和28中所示的氨基酸序列；该VH区和该VL区分别含有SEQ ID NO:29和30中所示的氨基酸序列；该VH区和该VL区分别含有SEQ ID NO:31和32中所示的氨基酸序列；或该VH区和该VL区分别含有SEQ ID NO:33和34中所示的氨基酸序列。
在任何所提供的实施方式中的一些中，该VH区和该VL区分别含有SEQ ID NO:21和22中所示的氨基酸序列，或分别与SEQ ID NO:21和22具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列；该VH区和该VL区分别含有SEQ IDNO:23和24中所示的氨基酸序列，或分别与SEQ ID NO:23和24具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列；该VH区和该VL区分别含有SEQ ID NO:27和28中所示的氨基酸序列，或分别与SEQ ID NO:27和28具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列；或该VH区和该VL区含有SEQ ID NO:31和32中所示的氨基酸序列，或分别与SEQ ID NO:31和32具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列。
在任何所提供的实施方式中的一些中，该VH区包括分别含SEQ ID NO:80、81和77的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该VL区包括分别含SEQ ID NO:85、86和87的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；该VH区包括分别含SEQ ID NO:82、83和84的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该VL区包括分别含SEQ ID NO:88、89和87的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；该VH区包括分别含SEQ ID NO:95、96、92的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该VL区包括分别含SEQ ID NO:100、101和102的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；该VH区包括分别含SEQ ID NO:97、98和99的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该VL区包括分别含SEQ ID NO:103、104和102的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；该VH区包括分别含SEQ ID NO:125、126和122的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该VL区包括分别含SEQ ID NO:130、131和132的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；该VH区包括分别含SEQ ID NO:127、128和129的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该VL区包括分别含SEQ ID NO:133、134和132的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；该VH区包括分别含SEQ ID NO:140、154和151的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该VL区包括分别含SEQ ID NO:157、158和159的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；或该VH区包括分别含SEQ ID NO:142、155和156的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该VL区包括分别含SEQ ID NO:160、161和159的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
在任何所提供的实施方式中的一些中，该VH区和该VL区分别含有SEQ ID NO:21和22中所示的氨基酸序列；该VH区和该VL区分别含有SEQ ID NO:23和24中所示的氨基酸序列；该VH区和该VL区分别含有SEQ ID NO:27和28中所示的氨基酸序列；或该VH区和该VL区分别含有SEQ ID NO:31和32中所示的氨基酸序列。
在任何所提供的实施方式中的一些中，该细胞外抗原结合结构域与小鼠GPRC5D交叉反应或结合和/或与食蟹猕猴GPRC5D交叉反应或结合。在任何所提供的实施方式中的一些中，该细胞外抗原结合结构域不与小鼠GPRC5D或食蟹猕猴GPRC5D交叉反应或不与其结合。
在任何所提供的实施方式中的一些中，该VH区该VL区含有分别如SEQ ID NO:27和28中所示的氨基酸序列，或分别与SEQ ID NO:27和28具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列。
在任何所提供的实施方式中的一些中，该嵌合抗原受体含有：重链可变(VH)，其含有SEQ ID NO:27中所示的VH区氨基酸序列内所包含的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；和轻链可变(VL)区，其含有SEQ ID NO:28中所示的VL区氨基酸序列内所包含的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在任何所提供的实施方式中的一些中，该VH区包括分别含SEQ ID NO:125、126和122的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该VL区包括分别含SEQ ID NO:130、131和132的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在任何所提供的实施方式中的一些中，该VH区包括分别含SEQ ID NO:127、128和129的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该VL区包括分别含SEQ ID NO:133、134和132的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在任何所提供的实施方式中的一些中，该VH区包括分别含SEQ ID NO:120、121和122的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该VL区包括分别含SEQ ID NO:130、131和132的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在任何所提供的实施方式中的一些中，该VH区包括分别含SEQ ID NO:123、124和122的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该VL区包括分别含SEQ ID NO:130、131和132的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在任何所提供的实施方式中的一些中，该VH区和该VL区分别含有SEQ ID NO:27和28中所示的氨基酸序列。
在任何所提供的实施方式中的一些中，该细胞外抗原结合结构域是单链抗体片段。在任何所提供的实施方式中的一些中，该片段是或含有单链可变片段(scFv)。
在任何所提供的实施方式中的一些中，该VH区和该VL区通过柔性连接物接合。在任何所提供的实施方式中的一些中，该VH区和该VL区通过含有氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:52)的连接物接合。在任何所提供的实施方式中的一些中，该VH区和该VL区通过柔性连接物接合。在任何所提供的实施方式中的一些中，该VH区和该VL区通过含有氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:320)的连接物接合。
在任何所提供的实施方式中的一些中，该VH区在该VL区的氨基末端。在任何所提供的实施方式中的一些中，该抗原结合结构域含有选自SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11或13中的任一个的氨基酸序列或与选自SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11或13中的任一个的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。在任何所提供的实施方式中的一些中，该抗原结合结构域含有选自SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11或13中的任一个的氨基酸序列。在任何所提供的实施方式中的一些中，该抗原结合结构域含有选自SEQ ID NO:1、3、7或11中的任一个的氨基酸序列或与选自SEQ ID NO:1、3、7或11中的任一个的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。在任何所提供的实施方式中的一些中，该抗原结合结构域含有选自SEQ ID NO:1、3、7或11中的任一个的氨基酸序列。在任何所提供的实施方式中的一些中，该抗原结合结构域含有SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。在任何所提供的实施方式中的一些中，该抗原结合结构域含有SEQID NO:7中所示的氨基酸序列。
在任何所提供的实施方式中的一些中，该VH区在该VL区的羧基末端。在任何所提供的实施方式中的一些中，该抗原结合结构域含有选自SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12或14中的任一个的氨基酸序列或与选自SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12或14中的任一个的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。在任何所提供的实施方式中的一些中，该抗原结合结构域含有选自SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12或14中的任一个的氨基酸序列。在任何所提供的实施方式中的一些中，该抗原结合结构域含有选自SEQ ID NO:2、4、8或12中的任一个的氨基酸序列或与选自SEQ ID NO:2、4、8或12中的任一个的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。在任何所提供的实施方式中的一些中，该抗原结合结构域含有选自SEQ ID NO:2、4、8或12中的任一个的氨基酸序列。在任何所提供的实施方式中的一些中，该抗原结合结构域含有SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。在任何所提供的实施方式中的一些中，该抗原结合结构域含有SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列。在任何所提供的实施方式中的一些中，该抗原结合结构域由SEQ ID NO:264中所示的核苷酸序列编码。
在任何所提供的实施方式中的一些中，细胞内信号转导区含有细胞内细胞质信号转导结构域。在任何所提供的实施方式中的一些中，该细胞内信号转导结构域能够在T细胞中诱导初级活化信号，是T细胞受体(TCR)组分和/或含有免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)。在任何所提供的实施方式中的一些中，该细胞内信号转导结构域是或含有CD3-zeta(CD3ζ)链ζ链或其功能变体或信号转导部分的细胞质信号转导结构域。
在任何所提供的实施方式中的一些中，该细胞内信号转导结构域是人的或来源于人蛋白质。在任何所提供的实施方式中的一些中，该细胞内信号转导结构域是或含有SEQID NO:20中所示的序列或与SEQ ID NO:20具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。
在任何所提供的实施方式中的一些中，细胞内信号转导区进一步含有共刺激信号转导区。在任何所提供的实施方式中的一些中，共刺激信号转导区含有T细胞共刺激分子或其信号转导部分的细胞内信号转导结构域。在任何所提供的实施方式中的一些中，共刺激信号转导区含有CD28、4-1BB或ICOS或其信号转导部分的细胞内信号转导结构域。在任何所提供的实施方式中的一些中，共刺激信号转导区含有4-1BB或其信号转导部分的细胞内信号转导结构域。在任何所提供的实施方式中的一些中，共刺激信号转导区是人的或来源于人蛋白质。在任何所提供的实施方式中的一些中，共刺激信号转导区含有CD28的细胞内信号转导结构域，如人CD28的细胞内信号转导结构域。
在任何所提供的实施方式中的一些中，共刺激信号转导区是或含有SEQ ID NO:46中所示的序列或与SEQ ID NO:46中所示的序列展现至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。在任何所提供的实施方式中的一些中，共刺激信号转导区含有4-1BB的细胞内信号转导结构域。在任何所提供的实施方式中的一些中，共刺激信号转导区是或含有SEQ ID NO:19中所示的序列或SEQ ID NO:19中所示的序列展现至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。
在任何所提供的实施方式中的一些中，共刺激信号转导区在跨膜结构域与细胞内信号转导区之间。在任何所提供的实施方式中的一些中，跨膜结构域是含有含有来源于CD4、CD28或CD8的跨膜结构域。在任何所提供的实施方式中的一些中，跨膜结构域是或含有来源于CD28的跨膜结构域。在任何所提供的实施方式中的一些中，跨膜结构域是人类的或来源于人类蛋白质。在任何所提供的实施方式中的一些中，跨膜结构域是或含有SEQ IDNO:18中所示的序列或与SEQ ID NO:18展现至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。
也提供嵌合抗原受体，其含有：(1)特异性结合人G蛋白偶联受体C类5族成员D(GPRC5D)的细胞外抗原结合结构域，其中该细胞外抗原结合结构域含有：(i)重链可变(VH)区，其含有与SEQ ID NO:27中所示的VH区氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列；和(ii)轻链可变(VL)区，其含有与SEQ ID NO:28中所示的VL区氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列；(2)SEQ ID NO:17中所示的间隔子；(3)来源于人CD28的跨膜结构域；和(4)细胞内信号转导区，其含有CD3-zeta(CD3ζ)链的ζ链的细胞质信号转导结构域和T细胞共刺激分子的细胞内信号转导结构域。
在任何所提供的实施方式中的一些中，该VH区含有SEQ ID NO:27中所示的VH区氨基酸序列内所包含的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；且该VL区含有SEQ ID NO:28中所示的VL区氨基酸序列内所包含的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；或该VH区包括分别含SEQ ID NO:125、126和122的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该VL区包括分别含SEQ ID NO:130、131和132的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；该VH区包括分别含SEQ ID NO:127、128和129的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该VL区包括分别含SEQ ID NO:133、134和132的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；该VH区包括分别含SEQ ID NO:120、121和122的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该VL区包括分别含SEQ ID NO:130、131和132的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；或该VH区包括分别含SEQ ID NO:123、124和122的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该VL区包括分别含SEQ ID NO:130、131和132的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
也提供嵌合抗原受体，其含有：(1)特异性结合人G蛋白偶联受体C类5族成员D(GPRC5D)的细胞外抗原结合结构域，其中该细胞外抗原结合结构域含有：含SEQ ID NO:27中所示的VH区氨基酸序列内所包含的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的重链可变(VH)区，和含SEQID NO:28中所示的VL区氨基酸序列内所包含的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的轻链可变(VL)区；或包括分别含SEQ ID NO:125、126和122的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的VH区，和包括分别含SEQ ID NO:130、131和132的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的VL区；包括分别含SEQ ID NO:127、128和129的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的VH区，和包括分别含SEQ ID NO:133、134和132的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的VL区；包括分别含SEQ ID NO:120、121和122的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的VH区，和包括分别含SEQ ID NO:130、131和132的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的VL区；或包括分别含SEQ ID NO:123、124和122的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的VH区，和包括分别含SEQ ID NO:130、131和132的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的VL区；(2)SEQ ID NO:17中所示的间隔子；(3)来源于人CD28的跨膜结构域；和(4)细胞内信号转导区，其含有人CD3-zeta(CD3ζ)链的ζ链的细胞质信号转导结构域和人CD28或人4-1BB的细胞内信号转导结构域。
也提供嵌合抗原受体，其含有：(1)特异性结合人G蛋白偶联受体C类5族成员D(GPRC5D)的细胞外抗原结合结构域，其中该细胞外抗原结合结构域含有：含SEQ ID NO:27中所示的VH区氨基酸序列内所包含的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的重链可变(VH)区，和含SEQID NO:28中所示的VL区氨基酸序列内所包含的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的轻链可变(VL)区；或包括分别含SEQ ID NO:125、126和122的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的VH区，和包括分别含SEQ ID NO:130、131和132的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的VL区；(2)SEQ ID NO:17中所示的间隔子；(3)来源于人CD28的跨膜结构域；和(4)细胞内信号转导区，其含有人CD3-zeta(CD3ζ)链的ζ链的细胞质信号转导结构域和人CD28的细胞内信号转导结构域。也提供嵌合抗原受体，其含有：(1)特异性结合人G蛋白偶联受体C类5族成员D(GPRC5D)的细胞外抗原结合结构域，其中该细胞外抗原结合结构域含有：含SEQ ID NO:27中所示的VH区氨基酸序列内所包含的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的重链可变(VH)区，和含SEQID NO:28中所示的VL区氨基酸序列内所包含的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的轻链可变(VL)区；或包括分别含SEQ ID NO:125、126和122的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的VH区，和包括分别含SEQ ID NO:130、131和132的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的VL区；(2)SEQ ID NO:17中所示的间隔子；(3)来源于人CD28的跨膜结构域；和(4)细胞内信号转导区，其含有人CD3-zeta(CD3ζ)链的ζ链的细胞质信号转导结构域和人4-1BB的细胞内信号转导结构域。
在任何所提供的实施方式中的一些中，该细胞外抗原结合结构域含有SEQ ID NO:27中所示的VH区氨基酸序列和SEQ ID NO:28中所示的VL区氨基酸序列；和/或在任何所提供的实施方式中的一些中，该细胞外抗原结合结构域含有SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8中所示的scFv。在任何所提供的实施方式中的一些中，该细胞外抗原结合结构域含有SEQ IDNO:27中所示的VH区氨基酸序列和SEQ ID NO:28中所示的VL区氨基酸序列；和/或在任何所提供的实施方式中的一些中，该细胞外抗原结合结构域含有SEQ ID NO:7中所示的scFv。在任何所提供的实施方式中的一些中，该细胞外抗原结合结构域含有SEQ ID NO:27中所示的VH区氨基酸序列和SEQ ID NO:28中所示的VL区氨基酸序列；和/或在任何所提供的实施方式中的一些中，该细胞外抗原结合结构域含有SEQ ID NO:8中所示的scFv。
在任何所提供的实施方式中的一些中，跨膜结构域是或含有SEQ ID NO:18中所示的序列或与SEQ ID NO:18展现至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。在任何所提供的实施方式中的一些中，跨膜结构域是或含有SEQ ID NO:18中所示的序列。
在任何所提供的实施方式中的一些中，细胞内信号转导区含有SEQ ID NO:20中所示的序列或与SEQ ID NO:20中所示的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列，以及SEQ ID NO:46中所示的序列或与SEQ ID NO:46中所示的序列展现至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。在任何所提供的实施方式中的一些中，细胞内信号转导区是或含有SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:46中所示的序列。在任何所提供的实施方式中的一些中，细胞内信号转导区含有SEQ ID NO:20中所示的序列或与SEQ ID NO:20具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列，以及SEQ ID NO:19中所示的序列或与SEQ ID NO:19中所示的序列展现至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。在任何所提供的实施方式中的一些中，细胞内信号转导区是或含有SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:19中所示的序列。
在任何所提供的实施方式中的一些中，该嵌合抗原受体自其N末端至C末端依序含有：抗原结合结构域、间隔子、跨膜结构域和细胞内信号转导区。
也提供多核苷酸，其含有编码本申请所提供的嵌合抗原受体中的任一种的核苷酸序列。
在任何所提供的实施方式中的一些中，编码该间隔子的核酸含有至少一个经修饰的剪接供体和/或剪接受体位点，该经修饰的剪接供体和/或受体位点含有对应于SEQ IDNO:73中所示的序列中所含参考剪接供体位点和/或参考剪接受体位点的一个或多个核苷酸修饰。在任何所提供的实施方式中的一些中，该一个或多个核苷酸修饰含有氨基酸取代。在任何所提供的实施方式中的一些中，该参考剪接供体和/或参考剪接受体位点为典型、非典型或隐蔽的剪接位点。在任何所提供的实施方式中的一些中，该参考剪接供体和/或该参考剪接受体位点的剪接位点预测分数为至少或至少约0.4分、0.5分、0.6分、0.70分、0.75分、0.80分、0.85分、0.90分、0.95分、0.99分或1.0分；和/或该参考剪接供体和/或该参考剪接受体位点涉及剪接事件的概率预测为至少40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％。
在任何所提供的实施方式中的一些中，参考剪接供体位点含有序列aatctaagtacggac(SEQ ID NO:176)、tcaactggtacgtgg(SEQ ID NO:177)、acaattagtaaggca(SEQ ID NO:178)和/或accacaggtgtatac(SEQ ID NO:179)；和/或参考剪接受体位点含有序列aagtttctttctgtattccaggctgaccgtggataaatctc(SEQ ID NO:180)和/或gggcaacgtgttctcttgcagtgtcatgcacgaagccctgc(SEQ ID NO:181)。
在任何所提供的实施方式中的一些中，参考剪接供体和/或参考剪接受体位点的剪接位点预测分数为至少或至少约0.70分、0.75分、0.80分、0.85分、0.90分、0.95分、0.99分或1.0分；和/或在任何所提供的实施方式中的一些中，参考剪接供体和/或参考剪接受体位点涉及剪接事件的概率预测为至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％。
在任何所提供的实施方式中的一些中，参考剪接供体位点含有序列tcaactggtacgtgg(SEQ ID NO:177)；和/或参考剪接受体位点含有序列aagtttctttctgtattccaggctgaccgtggataaatctc(SEQ ID NO:180)。
在任何所提供的实施方式中的一些中，该一个或多个核苷酸修饰中的至少一个在参考剪接受体和/或参考剪接供体位点的剪接位点接合处(junction)的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个残基内。
在任何所提供的实施方式中的一些中，该一个或多个核苷酸修饰是沉默的，和/或相较于SEQ ID NO:73产生简并密码子，和/或不改变所编码的间隔子的氨基酸序列。
在任何所提供的实施方式中的一些中，经修饰的剪接供体位点如agtctaaatacggac(SEQ ID NO:182)、tcaactggtatgtgg(SEQ ID NO:183)、accatctccaaggcc(SEQ ID NO:184)和/或gccccaggtttacac(SEQ ID NO:185)中所示；和/或经修饰的剪接受体位点如cagtttcttcctgtatagtagactcaccgtggataaatcaa(SEQ ID NO:186)、gggcaacgtgttcagctgcagcgtgatgcacgaggccctgc(SEQ ID NO:187)和/或cgccttgtcctccttgtcccgctcctcctgttgccggacct(SEQ ID NO:188)中所示。在任何所提供的实施方式中的一些中，该经修饰的剪接供体位点如tcaactggtatgtgg(SEQ ID NO:183)中所示，和/或该经修饰的受体位点如cagtttcttcctgtatagtagactcaccgtggataaatcaa(SEQ ID NO:186)和/或cgccttgtcctccttgtcccgctcctcctgttgccggacct(SEQ ID NO:188)中所示。
在任何所提供的实施方式中的一些中，间隔子是由SEQ ID NO:74中所示(也如SEQID NO:48中所示)的核苷酸序列或其部分编码。在任何所提供的实施方式中的一些中，间隔子是由SEQ ID NO:73中所示的核苷酸序列或其部分编码。在任何所提供的实施方式中的一些中，间隔子是由SEQ ID NO:74中所示的核苷酸序列或其部分编码。在任何所提供的实施方式中的一些中，间隔子是由SEQ ID NO:283中所阐述的核苷酸序列或其部分编码。在任何所提供的实施方式中的一些中，间隔子是由SEQ ID NO:284中所阐述的核苷酸序列或其部分编码。在任何所提供的实施方式中的一些中，间隔子是由SEQ ID NO:305中所示的核苷酸序列或其部分编码。
在任何所提供的实施方式中的一些中，当在细胞中表达多核苷酸时，由该多核苷酸转录的RNA、任选为信使RNA(mRNA)展现至少70％、75％、80％、85％、90％或95％RNA均质性。
在任何所提供的实施方式中的一些中，当在细胞中表达时，相较于自参考多核苷酸转录的mRNA的异质性，由该多核苷酸转录的RNA、任选为信使RNA(mRNA)展现减小的异质性，该参考多核苷酸编码与该多核苷酸相同的氨基酸序列，其中该参考多核苷酸的不同之处在于在编码间隔子的核酸该存在一个或多个剪接供体位点和/或一个或多个剪接受体位点，和/或相较于该多核苷酸含有一个或多个核苷酸修饰，和/或含有SEQ ID NO:73中所示的间隔子。在任何所提供的实施方式中的一些中，RNA异质性的减小大于或大于约10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％或更高百分比。在任何所提供的实施方式中的一些中，由参考多核苷酸转录的RNA、任选为信使RNA(mRNA)展现出大于或大于约10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％或更高RNA异质性。在任何所提供的实施方式中的一些中，RNA均质性和/或异质性通过琼脂糖凝胶电泳、基于芯片的毛细电泳、分析型超速离心、场流动分级分离或液相层析测定。
在任何所提供的实施方式中的一些中，该多核苷酸经密码子优化以用于在人类细胞中表达。
在任何所提供的实施方式中的一些中，嵌合受体是第一嵌合受体且多核苷酸进一步含有编码第二嵌合抗原受体的核苷酸序列。因此，本申请也提供编码针对GPRC5D的第一嵌合受体(包括如本申请所提供的任何嵌合受体)和第二嵌合受体的多核苷酸。在任何所提供的实施方式中的一些中，该第一嵌合受体和该第二嵌合受体由一个或多个多顺反子组件分隔开。在任何所提供的实施方式中的一些中，该一个或多个多顺反子组件是或含有核糖体跳跃序列。在一些实施方式中，核糖体跳跃序列是T2A、P2A、E2A或F2A组件。在任何所提供的实施方式中的一些中，该一个或多个多顺反子组件含有SEQ ID NO:37中所示的氨基酸序列。在任何所提供的实施方式中的一些中，该一个或多个多顺反子组件由选自SEQ ID NO:44、45、319的核苷酸序列编码。在任何所提供的实施方式中的一些中，编码该一个或多个多顺反子组件的核苷酸序列是密码子趋异的。在任何所提供的实施方式中的一些中，编码T2A的核苷酸序列是密码子趋异的。在任何所提供的实施方式中的一些中，编码T2A的核苷酸序列是或包含SEQ ID NO:319中所示的序列。
在任何所提供的实施方式中的一些中，第二嵌合受体含有特异性结合多发性骨髓瘤上表达或与多发性骨髓瘤相关的第二抗原，如不为GPRC5D的第二抗原的细胞外抗原结合结构域。在任何所提供的实施方式中的一些中，第二CAR含有结合第二抗原的细胞外抗原结合结构域、间隔子、跨膜结构域和细胞内信号转导区。在任何所提供的实施方式中的一些中，第二抗原选自B细胞成熟抗原(BCMA)、CD38、CD138、CS-1、BAFF-R、TACI或FcRH5。在任何所提供的实施方式中的一些中，第二抗原是BCMA。
在任何所提供的实施方式中的一些中，第二CAR含有：(1)特异性结合BCMA的细胞外抗原结合结构域，其中该细胞外抗原结合结构域含有：(i)重链可变(VH)区，其含有与SEQID NO:189、191、193、195或197中的任一个中所示的VH区氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列；和(ii)轻链可变(VL)区，其含有与SEQ ID NO:190、192、194、196或198中任一个中所示的VL区氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列；(2)间隔子；(3)跨膜结构域；和(4)细胞内信号转导区。在任何所提供的实施方式中的一些中，第二CAR的VH区含有SEQ ID NO:189、191、193、195或197中任一个中所示的VH区氨基酸序列内所包含的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；且VL区含有SEQ ID NO:190、192、194、196或198中任一个中所示的VL区氨基酸序列内所包含的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
在任何所提供的实施方式中的一些中，第二CAR含有：(1)特异性结合BCMA的细胞外抗原结合结构域，其中该细胞外抗原结合结构域含有：(i)重链可变(VH)，其包括含选自SEQ ID NO:199、202、206、209、212或215中的任一个的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR-H1)；(b)含选自SEQ ID NO:200、203、207、210、213或216中的任一个的氨基酸序列的重链互补决定区2(CDR-H2)；和(c)含选自SEQ ID NO:201、204、205、208、211、214或217中的任一个的氨基酸序列的重链互补决定区3(CDR-H3)；和(ii)轻链可变(VL)区，其包括含选自SEQ ID NO:218、221、224、227、230、233或235中的任一个的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR-L1)；(b)含选自SEQ ID NO:219、222、225、228、231、234或236中的任一个的氨基酸序列的轻链互补决定区2(CDR-L2)；和(c)含选自SEQ ID NO:220、223、226、229或232中的任一个的氨基酸序列的轻链互补决定区3(CDR-L3)；(2)间隔子；(3)跨膜结构域；和(4)细胞内信号转导区。在任何所提供的实施方式中的一些中，第二CAR含有：(1)特异性结合BCMA的细胞外抗原结合结构域，其中该细胞外抗原结合结构域含有：(i)重链可变(VH)，其包括含选自SEQ ID NO:199、202、206、209、212或215中的任一个的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR-H1)；(b)含选自SEQ ID NO:200、203、207、210、213或216中的任一个的氨基酸序列的重链互补决定区2(CDR-H2)；和(c)含选自SEQ ID NO:201、204、205、208、211、214或217中的任一个的氨基酸序列的重链互补决定区3(CDR-H3)；和(ii)轻链可变(VL)区，其包括含选自SEQ ID NO:218、221、224、227、230、233或235中的任一个的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR-L1)；(b)含选自SEQ ID NO:219、222、225、228、231、234或236中的任一个的氨基酸序列的轻链互补决定区2(CDR-L2)；和(c)含选自SEQ ID NO:220、223、226、229或232中的任一个的氨基酸序列的轻链互补决定区3(CDR-L3)；(2)SEQ ID NO:17中所示的间隔子；(3)源自人CD28的跨膜结构域；和(4)细胞内信号转导区，其含有人CD3-zeta(CD3ζ)链的ζ链的细胞质信号转导结构域和人4-1BB的细胞内信号转导结构域。在任何所提供的实施方式中的一些中，该第二CAR的VH区含有SEQ ID NO:197任一项中所示的VH区氨基酸序列内包含的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；和VL区含有SEQ ID NO:198任一项中所示的VL区氨基酸序列内包含的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在任何所提供的实施方式中的一些中，第二CAR是或包含SEQ NO:251中所示的氨基酸序列。在任何所提供的实施方式中的一些中，第二CAR由SEQ NO:246中所示的核苷酸序列编码。
在任何所提供的实施方式中的一些中，第二CAR含有：(1)特异性结合BCMA的细胞外抗原结合结构域，其中该细胞外抗原结合结构域含有：(i)重链可变(VH)，其包括含选自SEQ ID NO:199、202、206、209、212或215中的任一个的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR-H1)；(b)含选自SEQ ID NO:200、203、207、210、213或216中的任一个的氨基酸序列的重链互补决定区2(CDR-H2)；和(c)含选自SEQ ID NO:201、204、205、208、211、214或217中的任一个的氨基酸序列的重链互补决定区3(CDR-H3)；和(ii)轻链可变(VL)区，其包括含选自SEQ ID NO:218、221、224、227、230、233或235中的任一个的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR-L1)；(b)含选自SEQ ID NO:219、222、225、228、231、234或236中的任一个的氨基酸序列的轻链互补决定区2(CDR-L2)；和(c)含选自SEQ ID NO:220、223、226、229或232中的任一个的氨基酸序列的轻链互补决定区3(CDR-L3)；(2)间隔子；(3)跨膜结构域；和(4)细胞内信号转导区。
在任何所提供的实施方式中的一些中，第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:199、200和201的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且第二CAR的VL区包括分别含SEQID NO:218、219和220的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:202、203、204的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:221、222和223的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:199、200、205的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:224、225和226的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:206、207、208的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:227、228和229的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:209、210和211的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:230、231和232的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:212、213和214的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:233、234和229的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；或第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:215、216和217的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:235、236和232的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
在任何所提供的实施方式中的一些中，编码的第二CAR的VH区包括分别含SEQ IDNO:209、210和211的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:230、231和232的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；或该第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:215、216和217的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:235、236和232的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在任何所提供的实施方式中的一些中，编码的第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:209、210和211的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ IDNO:230、231和232的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在任何所提供的实施方式中的一些中，第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:215、216和217的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:235、236和232的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
在任何所提供的实施方式中的一些中，编码的第二CAR的VH区和VL区含有分别如SEQ ID NO:189和SEQ ID NO:190中所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:189和SEQ ID NO:190展现至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列；该第二CAR的VH区和VL区含有分别如SEQ ID NO:191和SEQ ID NO:192中所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:191和SEQ ID NO:192展现至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列；该第二CAR的VH区和VL区含有分别如SEQID NO:193和SEQ ID NO:194中所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:193和SEQ ID NO:194展现至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列；该第二CAR的VH区和VL区含有分别如SEQ ID NO:195和SEQ ID NO:196中所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:195和SEQ ID NO:196展现至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列；或该第二CAR的VH区和VL区含有分别如SEQ ID NO:197和SEQ ID NO:198中所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:197和SEQ ID NO:198展现至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。
在任何所提供的实施方式中的一些中，编码的第二CAR的VH区和VL区分别含有SEQID NO:189和SEQ ID NO:190中所示的氨基酸序列；该第二CAR的VH区和VL区含有SEQ ID NO:191和SEQ ID NO:192中所示的氨基酸序列；该第二CAR的VH区和VL区含有SEQ ID NO:193和SEQ ID NO:194中所示的氨基酸序列；该第二CAR的VH区和VL区含有SEQ ID NO:195和SEQ IDNO:196中所示的氨基酸序列；或该第二CAR的VH区和VL区分别含有SEQ ID NO:197和SEQ IDNO:198中所示的氨基酸序列。在任何所提供的实施方式中的一些中，编码的第二CAR的VH区和VL区分别含有SEQ ID NO:197和SEQ ID NO:198中所示的氨基酸序列。
在任何所提供的实施方式中的一些中，编码的第二CAR的细胞外抗原结合结构域是单链抗体片段。在任何所提供的实施方式中的一些中，编码的片段是或含有单链可变片段(scFv)。在任何所提供的实施方式中的一些中，编码的第二CAR的VH区和VL区通过柔性连接物接合。在任何所提供的实施方式中的一些中，编码的第二CAR的scFv包括含氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:52)的连接物。在任何所提供的实施方式中的一些中，编码的第二CAR的scFv包括含氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:320)的连接物。在任何所提供的实施方式中的一些中，编码的第二CAR中的VH区在VL区的氨基末端。在任何所提供的实施方式中的一些中，编码的第二CAR中的VH区在VL区的羧基末端。
在任何所提供的实施方式中的一些中，编码的第二CAR的抗原结合结构域含有选自SEQ ID NO:227、238、239、240或241中的任一个的氨基酸序列或与选自SEQ ID NO:227、238、239、240或241中的任一个的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。在任何所提供的实施方式中的一些中，编码的第二CAR的抗原结合结构域含有选自SEQ ID NO:227、238、239、240或241中的任一个的氨基酸序列。在任何所提供的实施方式中的一些中，编码的第二CAR的抗原结合结构域含有SEQ ID NO:241中所述的氨基酸序列或与SEQ ID NO:241中所述的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。在任何所提供的实施方式中的一些中，编码的第二CAR的抗原结合结构域含有SEQ ID NO:241中所述的氨基酸序列。
在任何所提供的实施方式中的一些中，第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:209、210和211的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且第二CAR的VL区包括分别含SEQID NO:230、231和232的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；或第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:215、216和217的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:235、236和232的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；和/或该第二CAR的VH区和VL区分别含有SEQ ID NO:197和SEQ ID NO:198中所示的氨基酸序列；和/或该第二CAR的抗原结合结构域含有SEQ ID NO:241中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:241中所示的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的序列。在任何所提供的实施方式中的一些中，第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:209、210和211的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且第二CAR的VL区包括分别含SEQID NO:230、231和232的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；和/或该第二CAR的VH区和VL区分别含有SEQ ID NO:197和SEQ ID NO:198中所示的氨基酸序列；和/或该第二CAR的抗原结合结构域含有SEQ ID NO:241中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:241中所示的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的序列。在任何所提供的实施方式中的一些中，第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:215、216和217的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:235、236和232的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；和/或该第二CAR的VH区和VL区分别含有SEQID NO:197和SEQ ID NO:198中所示的氨基酸序列；和/或该第二CAR的抗原结合结构域含有SEQ ID NO:241中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:241中所示的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的序列。
在任何所提供的实施方式中的一些中，编码的第二CAR的跨膜结构域是或含有来源于CD4、CD28或CD8，任选来自人CD4、人CD28或人CD8的跨膜结构域。
在任何所提供的实施方式中的一些中，编码的第二CAR的跨膜结构域是或含有来源于人CD28的跨膜结构域，和/或是或含有SEQ ID NO:18中所示的序列或与SEQ ID NO:18展现至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。在任何所提供的实施方式中的一些中，编码的第二CAR的跨膜结构域是或含有SEQ IDNO:18中所示的序列。
在任何所提供的实施方式中的一些中，编码的第二CAR的细胞内信号转导区含有细胞内信号转导结构域。在任何所提供的实施方式中的一些中，编码的第二CAR的细胞内信号转导结构域能够在T细胞中诱导初级活化信号，T细胞受体(TCR)组分和/或含有免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)。在任何所提供的实施方式中的一些中，编码的第二CAR的细胞内信号转导结构域是或含有CD3-zeta(CD3ζ)链的ζ链或其功能变体或信号转导部分，任选人CD3ζ链的细胞质信号转导结构域。在任何所提供的实施方式中的一些中，编码的第二CAR的细胞内信号转导区含有SEQ ID NO:20中所示的序列或与SEQ ID NO:20具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。
在任何所提供的实施方式中的一些中，编码的第二CAR的细胞内信号转导区进一步含有共刺激信号转导区。在任何所提供的实施方式中的一些中，编码的第二CAR的共刺激信号转导区含有T细胞共刺激分子或其信号转导部分的细胞内信号转导结构域。在任何所提供的实施方式中的一些中，编码的第二CAR的共刺激信号转导区含有CD28、4-1BB或ICOS或其信号转导部分，任选人CD28、人4-1BB或人ICOS的细胞内信号转导结构域。在任何所提供的实施方式中的一些中，编码的第二CAR的共刺激信号转导区含有4-1BB或其信号转导部分的细胞内信号转导结构域。在任何所提供的实施方式中的一些中，第一嵌合抗原受体和第二嵌合抗原受体中的至少一种包括含4-1BB或其信号转导部分、任选为人4-1BB的细胞内信号转导结构域的细胞内信号转导区。
在任何所提供的实施方式中的一些中，编码的第二CAR的共刺激信号转导区含有：人CD28的细胞内信号转导结构域；和/或SEQ ID NO:46中所示的序列或与SEQ ID NO:46中所示的序列展现至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。
在任何所提供的实施方式中的一些中，编码的第二CAR的共刺激信号转导区含有：人4-1BB的细胞内信号转导结构域；和/或SEQ ID NO:19中所示的序列或与SEQ ID NO:19中所示的序列展现至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。
在任何所提供的实施方式中的一些中，编码的第二嵌合抗原受体自其N末端至C末端依序含有：抗原结合结构域、间隔子、跨膜结构域和细胞内信号转导区。
在任何所提供的实施方式中的一些中，编码该第一嵌合抗原受体的多核苷酸序列和编码该第二嵌合抗原受体的多核苷酸序列中的至少一个是密码子趋异的。在任何所提供的实施方式中的一些中，编码第一嵌合抗原受体的多核苷酸序列和编码第二嵌合抗原受体的多核苷酸序列具有不超过约30个、不超过约20个或不超过约10个序列同源的连续碱基对。
在任何所提供的实施方式中的一些中，编码CAR的核苷酸序列可操作地连接至启动子以在由引入该多核苷酸的细胞表达时控制编码的CAR的表达，任选其中该启动子是异源启动子，任选其中该异源启动子是或含有人类延伸因子1α(EF1α)启动子或MND启动子或其变体。
在其中多核苷酸编码两个CAR的任何所提供的实施方式中的一些中，编码第一CAR的核苷酸序列可操作地连接至第一启动子以在由引入多核苷酸的细胞表达时控制该第一CAR的表达，且编码第二CAR的核苷酸序列可操作地连接至第二启动子以在由引入多核苷酸的细胞表达时控制该第二CAR的表达。在一些实施方式中，第一启动子和第二启动子独立地为异源启动子，如其中该异源启动子是或含有人类延伸因子1α(EF1α)启动子或MND启动子或其变体。在一些此类实施方式中，第一启动子与第二启动子相同。在一些此类实施方式中，第一启动子与第二启动子不同。
也提供含有所提供的多核苷酸中的任一种的载体。在任何所提供的实施方式中的一些中，载体是病毒载体。在任何所提供的实施方式中的一些中，病毒载体是慢病毒载体或逆转录病毒载体。
也提供含有本申请所提供的嵌合抗原受体中任一种的基因工程细胞。在任何所提供的实施方式中的一些中，基因工程细胞含有本申请所提供的嵌合抗原受体且进一步包括含编码第二嵌合抗原受体的核苷酸序列的多核苷酸。
也提供含有本申请所提供的多核苷酸中任一种的基因工程细胞。
在任何所提供的实施方式中的一些中，提供的细胞的第二嵌合受体含有特异性结合多发性骨髓瘤上表达或与多发性骨髓瘤相关的第二抗原的细胞外抗原结合结构域。在任何所提供的实施方式中的一些中，第二CAR含有结合第二抗原的细胞外抗原结合结构域、间隔子、跨膜结构域和细胞内信号转导区。在任何此类实施方式中的一些中，第二抗原选自B细胞成熟抗原(BCMA)、CD38、CD138、CS-1、BAFF-R、TACI或FcRH5。在任何所提供的实施方式中的一些中，第二抗原是BCMA。
在基因工程细胞的任何所提供的实施方式中的一些中，第二CAR含有：(1)特异性结合BCMA的细胞外抗原结合结构域，其中该细胞外抗原结合结构域含有：(i)重链可变(VH)区，其含有与SEQ ID NO:189、191、193、195或197中的任一个中所示的VH区氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列；和(ii)轻链可变(VL)区，其含有与SEQ ID NO:190、192、194、196或198中的任一个中所示的VL区氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列；(2)间隔子；(3)跨膜结构域；和(4)细胞内信号转导区。在一些此类实施方式中，VH区包括含SEQ ID NO:189、191、193、195或197中的任一个中所示的VH区氨基酸序列内所包含的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；且VL区含有SEQ ID NO:190、192、194、196或198中的任一个中所示的VL区氨基酸序列内所包含的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
在基因工程细胞的任何所提供的实施方式中的一些中，第二CAR含有：(1)特异性结合BCMA的细胞外抗原结合结构域，其中该细胞外抗原结合结构域含有：(i)重链可变(VH)，其包括含选自SEQ ID NO:199、202、206、209、212或215中的任一个的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR-H1)；(b)含选自SEQ ID NO:200、203、207、210、213或216中的任一个的氨基酸序列的重链互补决定区2(CDR-H2)；和(c)含选自SEQ ID NO:201、204、205、208、211、214或217中的任一个的氨基酸序列的重链互补决定区3(CDR-H3)；和(ii)轻链可变(VL)区，其包括含选自SEQ ID NO:218、221、224、227、230、233或235中的任一个的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR-L1)；(b)含选自SEQ ID NO:219、222、225、228、231、234或236中的任一个的氨基酸序列的轻链互补决定区2(CDR-L2)；和(c)含选自SEQ ID NO:220、223、226、229或232中的任一个的氨基酸序列的轻链互补决定区3(CDR-L3)；(2)间隔子；(3)跨膜结构域；和(4)细胞内信号转导区。
在基因工程细胞的任何所提供的实施方式中的一些中，第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:199、200和201的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:218、219和220的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:202、203、204的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:221、222和223的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:199、200、205的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:224、225和226的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:206、207、208的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:227、228和229的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:209、210和211的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:230、231和232的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:212、213和214的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:233、234和229的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；或第二CAR的VH区包括分别含SEQ IDNO:215、216和217的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:235、236和232的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
在基因工程细胞的任何所提供的实施方式中的一些中，第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:209、210和211的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:230、231和232的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；或第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:215、216和217的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:235、236和232的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
在基因工程细胞的任何所提供的实施方式中的一些中，该第二CAR的VH区和VL区含有分别如SEQ ID NO:189和SEQ ID NO:190中所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:189和SEQID NO:190展现至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列；该第二CAR的VH区和VL区含有分别如SEQ ID NO:191和SEQ ID NO:192中所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:191和SEQ ID NO:192展现至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列；该第二CAR的VH区和VL区含有分别如SEQ ID NO:193和SEQ ID NO:194中所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:193和SEQID NO:194展现至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列；该第二CAR的VH区和VL区含有分别如SEQ ID NO:195和SEQ ID NO:196中所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:195和SEQ ID NO:196展现至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列；或该第二CAR的VH区和VL区含有分别如SEQ ID NO:197和SEQ ID NO:198中所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:197和SEQID NO:198展现至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。
在基因工程细胞的任何所提供的实施方式中的一些中，该第二CAR的VH区和VL区分别含有SEQ ID NO:189和SEQ ID NO:190中所示的氨基酸序列；该第二CAR的VH区和VL区含有SEQ ID NO:191和SEQ ID NO:192中所示的氨基酸序列；该第二CAR的VH区和VL区含有SEQ IDNO:193和SEQ ID NO:194中所示的氨基酸序列；该第二CAR的VH区和VL区含有SEQ ID NO:195和SEQ ID NO:196中所示的氨基酸序列；或该第二CAR的VH区和VL区分别含有SEQ ID NO:197和SEQ ID NO:198中所示的氨基酸序列。
在基因工程细胞的任何所提供的实施方式中的一些中，第二CAR的细胞外抗原结合结构域是单链抗体片段。在任何此类实施方式中的一些中，该片段是或含有单链可变片段(scFv)。
在基因工程细胞的任何所提供的实施方式中的一些中，该VH区和该VL区通过柔性连接物接合。在一些此类实施方式中，连接物含有氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ IDNO:52)。在一些此类实施方式中，连接物含有氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ IDNO:320)。
在基因工程细胞的任何所提供的实施方式中的一些中，第二CAR中的VH区在VL区的氨基末端。在基因工程细胞的任何所提供的实施方式中的一些中，VH区在VL区的羧基末端。在基因工程细胞的任何所提供的实施方式中的一些中，第二CAR的抗原结合结构域含有选自SEQ ID NO:227、238、239、240或241中的任一个的氨基酸序列或与选自SEQ ID NO:227、238、239、240或241中的任一个的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。
在基因工程细胞的任何所提供的实施方式中的一些中，第二CAR的抗原结合结构域含有选自SEQ ID NO:227、238、239、240或241中的任一个的氨基酸序列。在基因工程细胞的任何所提供的实施方式中的一些中，第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:209、210和211的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:230、231和232的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；或第二CAR的VH区包括分别含SEQID NO:215、216和217的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:235、236和232的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；和/或该第二CAR的VH区和VL区分别含有SEQ ID NO:197和SEQ ID NO:198中所示的氨基酸序列；和/或该第二CAR的抗原结合结构域含有SEQ ID NO:241中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:241中所示的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的序列。
在基因工程细胞的任何所提供的实施方式中的一些中，第二CAR的抗原结合结构域含有选自SEQ ID NO:241中所述的氨基酸序列。在基因工程细胞的任何所提供的实施方式中的一些中，第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:209、210和211的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:230、231和232的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；和/或该第二CAR的VH区和VL区分别含有SEQ ID NO:197和SEQID NO:198中所示的氨基酸序列；和/或该第二CAR的抗原结合结构域含有SEQ ID NO:241中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:241中所示的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的序列。
在基因工程细胞的任何所提供的实施方式中的一些中，第二CAR的跨膜结构域是或含有来源于CD4、CD28或CD8，任选来源于人CD4、人CD28或人CD8的跨膜结构域。在基因工程细胞的任何所提供的实施方式中的一些中，第二CAR的跨膜结构域是或含有来源于人CD28的跨膜结构域；和/或该跨膜结构域是或含有SEQ ID NO:18中所示的序列或与SEQ IDNO:18展现至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。在基因工程细胞的任何所提供的实施方式中的一些中，第二CAR的跨膜结构域是或含有SEQ ID NO:18中所示的序列。
在基因工程细胞的任何所提供的实施方式中的一些中，第二CAR的细胞内信号转导区含有细胞内信号转导结构域。
在基因工程细胞的任何所提供的实施方式中的一些中，第二CAR的细胞内信号转导结构域能够在T细胞中诱导初级活化信号，是T细胞受体(TCR)组分和/或含有免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)。在基因工程细胞的任何所提供的实施方式中的一些中，第二CAR的细胞内信号转导结构域是或含有CD3-zeta(CD3ζ)链的ζ链或其功能变体或信号转导部分、任选为人CD3ζ链的细胞质信号转导结构域。在基因工程细胞的任何所提供的实施方式中的一些中，第二CAR的细胞内信号转导区含有SEQ ID NO:20中所示的序列或与SEQ ID NO:20具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。
在基因工程细胞的任何所提供的实施方式中的一些中，第二CAR的细胞内信号转导区进一步含有共刺激信号转导区。在基因工程细胞的任何所提供的实施方式中的一些中，第二CAR的共刺激信号转导区含有T细胞共刺激分子或其信号转导部分的细胞内信号转导结构域。在基因工程细胞的任何所提供的实施方式中的一些中，第二CAR的共刺激信号转导区含有CD28、4-1BB或ICOS或其信号转导部分，任选人CD28、人4-1BB或人ICOS的细胞内信号转导结构域。在基因工程细胞的任何所提供的实施方式中的一些中，第二CAR的共刺激信号转导区含有4-1BB或其信号转导部分的细胞内信号转导结构域。在任何所提供的实施方式中的一些中，第一嵌合抗原受体和第二嵌合抗原受体中的至少一种包括含4-1BB或其信号转导部分，任选人4-1BB的细胞内信号转导结构域的细胞内信号转导区。
在基因工程细胞的任何所提供的实施方式中的一些中，第二CAR的共刺激信号转导区含有：人CD28的细胞内信号转导结构域；和/或SEQ ID NO:46中所示的序列或与SEQ IDNO:46中所示的序列展现至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。
在基因工程细胞的任何所提供的实施方式中的一些中，第二CAR的共刺激信号转导区含有：人4-1BB的细胞内信号转导结构域；和/或SEQ ID NO:19中所示的序列或与SEQID NO:19中所示的序列展现至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。
在基因工程细胞的任何所提供的实施方式中的一些中，编码的第二嵌合抗原受体自其N末端至C末端依序含有：抗原结合结构域、间隔子、跨膜结构域和细胞内信号转导区。
在任何所提供的实施方式中的一些中，基因工程细胞是淋巴细胞。在任何所提供的实施方式中的一些中，基因工程细胞是NK细胞或T细胞。在任何所提供的实施方式中的一些中，基因工程细胞是T细胞，且该T细胞是CD4+或CD8+ T细胞。
在任何所提供的实施方式中的一些中，基因工程细胞由获自受试者的初代细胞工程改造。
在任何所提供的实施方式中的一些中，基因工程细胞在复数个基因工程细胞中，其中该复数个细胞中小于或小于约10％、9％、8％、7％、5％、4％、3％、2％或1％的细胞含有展现进补信号转导和/或抗原非依赖性活性或信号转导的嵌合抗原受体。
也提供含有本申请所提供的嵌合抗原受体中的任一种的组合物。也提供含有本申请所提供的基因工程细胞中的任一种的组合物。在任何所提供的实施方式中的一些中，该组合物含有CD4+和CD8+ T细胞且CD4+ T细胞与CD8+ T细胞的比率是自或自约1:3至3:1，任选为1:2至2:1。在任何所提供的实施方式中的一些中，该组合物含有CD4+和CD8+ T细胞且CD4+ T细胞与CD8+ T细胞的比率是约1:1。
也提供组合物，其含有：含有第一嵌合抗原受体的复数个第一基因工程细胞，该第一嵌合抗原受体是本申请所提供的嵌合抗原受体中的任一种或由本申请所提供的多核苷酸中的任一种编码；含有第二嵌合抗原受体的复数个第二基因工程细胞在任何所提供的实施方式中的一些中，在复数个第一基因工程细胞中，该复数个细胞中小于或小于约10％、9％、8％、7％、5％、4％、3％、2％或1％的细胞含有展现进补信号转导和/或独立抗原的活性或信号转导的嵌合抗原受体。在任何所提供的实施方式中的一些中，在复数个第二基因工程细胞中，该复数个细胞中小于或小于约10％、9％、8％、7％、5％、4％、3％、2％或1％的细胞含有展现进补信号转导和/或独立抗原的活性或信号转导的嵌合抗原受体。
在任何所提供的实施方式中的一些中，该组合物中的复数个第二基因工程细胞中的第二嵌合受体含有特异性结合多发性骨髓瘤上表达或与多发性骨髓瘤相关的第二抗原的细胞外抗原结合结构域。在任何所提供的实施方式中的一些中，该组合物中的复数个第二基因工程细胞中的第二CAR含有该第二抗原的细胞外抗原结合结构域一间隔子、跨膜结构域和细胞内信号转导区。在任何所提供的实施方式中的一些中，该组合物中的复数个第二基因工程细胞中的第二抗原选自B细胞成熟抗原(BCMA)、CD38、CD138、CS-1、BAFF-R、TACI或FcRH5。在任何所提供的实施方式中的一些中，该组合物中的复数个第二基因工程细胞中的第二抗原是BCMA。
在任何所提供的实施方式中的一些中，该组合物中的复数个第二基因工程细胞中的第二CAR含有：(1)特异性结合BCMA的细胞外抗原结合结构域，其中该细胞外抗原结合结构域含有：(i)重链可变(VH)区，其含有与SEQ ID NO:189、191、193、195或197中的任一个中所示的VH区氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列；和(ii)轻链可变(VL)区，其含有与SEQ ID NO:190、192、194、196或198中的任一个中所示的VL区氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列；(2)间隔子；(3)跨膜结构域；和(4)细胞内信号转导区。在一些此类实施方式中，VH区包括含SEQ ID NO:189、191、193、195或197中的任一个中所示的VH区氨基酸序列内所包含的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；且VL区含有SEQ ID NO:190、192、194、196或198中的任一个中所示的VL区氨基酸序列内所包含的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
在任何所提供的实施方式中的一些中，该组合物中的复数个第二基因工程细胞中的第二CAR含有：(1)特异性结合BCMA的细胞外抗原结合结构域，其中该细胞外抗原结合结构域含有：(i)重链可变(VH)，其包括含选自SEQ ID NO:199、202、206、209、212或215中的任一个的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR-H1)；(b)含选自SEQ ID NO:200、203、207、210、213或216中的任一个的氨基酸序列的重链互补决定区2(CDR-H2)；和(c)含选自SEQ ID NO:201、204、205、208、211、214或217中的任一个的氨基酸序列的重链互补决定区3(CDR-H3)；和(ii)轻链可变(VL)区，其包括含选自SEQ ID NO:218、221、224、227、230、233或235中的任一个的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR-L1)；(b)含选自SEQ ID NO:219、222、225、228、231、234或236中的任一个的氨基酸序列的轻链互补决定区2(CDR-L2)；和(c)含选自SEQ IDNO:220、223、226、229或232中的任一个的氨基酸序列的轻链互补决定区3(CDR-L3)；(2)间隔子；(3)跨膜结构域；和(4)细胞内信号转导区。
在任何所提供的实施方式中的一些中，该组合物中的第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:199、200和201的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:218、219和220的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:202、203、204的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:221、222和223的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:199、200、205的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:224、225和226的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:206、207、208的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:227、228和229的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:209、210和211的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:230、231和232的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:212、213和214的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:233、234和229的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；或第二CAR的VH区包括分别含SEQ IDNO:215、216和217的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:235、236和232的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
在任何所提供的实施方式中的一些中，该组合物中的第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:209、210和211的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:230、231和232的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；或第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:215、216和217的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:235、236和232的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
在任何所提供的实施方式中的一些中，该组合物中的第二CAR的VH区和VL区含有分别如SEQ ID NO:189和SEQ ID NO:190中所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:189和SEQ IDNO:190展现至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列；该第二CAR的VH区和VL区含有分别如SEQ ID NO:191和SEQ ID NO:192中所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:191和SEQ ID NO:192展现至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列；该第二CAR的VH区和VL区含有分别如SEQ ID NO:193和SEQ ID NO:194中所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:193和SEQ IDNO:194展现至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列；该第二CAR的VH区和VL区含有分别如SEQ ID NO:195和SEQ ID NO:196中所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:195和SEQ ID NO:196展现至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列；或该第二CAR的VH区和VL区含有分别如SEQ ID NO:197和SEQ ID NO:198中所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:197和SEQ IDNO:198展现至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。
在任何所提供的实施方式中的一些中，该组合物中的第二CAR的VH区和VL区分别含有SEQ ID NO:189和SEQ ID NO:190中所示的氨基酸序列；该组合物中的第二CAR的VH区和VL区有SEQ ID NO:191和SEQ ID NO:192中所示的氨基酸序列；该组合物中的第二CAR的VH区和VL区含有SEQ ID NO:193和SEQ ID NO:194中所示的氨基酸序列；该组合物中的第二CAR的VH区和VL区含有SEQ ID NO:195和SEQ ID NO:196中所示的氨基酸序列；或该组合物中的第二CAR的VH区和VL区分别含有SEQ ID NO:197和SEQ ID NO:198中所示的氨基酸序列。
在任何所提供的实施方式中的一些中，该组合物中的第二CAR的细胞外抗原结合结构域是单链抗体片段。在一些此类实施方式中，该片段是或含有单链可变片段(scFv)。在任何所提供的实施方式中的一些中，该组合物中的第二CAR的VH区和VL区通过柔性连接物接合。在任何所提供的实施方式中的一些中，连接物含有氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQID NO:52)。在任何所提供的实施方式中的一些中，连接物含有氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:320)。
在任何所提供的实施方式中的一些中，该组合物中的第二CAR中的VH区在VL区的氨基末端。在任何所提供的实施方式中的一些中，该组合物中的第二CAR中的VH区在VL区的羧基末端。在任何所提供的实施方式中的一些中，该组合物中的第二CAR中的抗原结合结构域含有选自SEQ ID NO:227、238、239、240或241中的任一个的氨基酸序列或与选自SEQ IDNO:227、238、239、240或241中的任一个的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。在任何所提供的实施方式中的一些中，该组合物中的第二CAR中的抗原结合结构域含有选自SEQ ID NO:227、238、239、240或241中的任一个的氨基酸序列。
在任何所提供的实施方式中的一些中，该组合物中的第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:209、210和211的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:230、231和232的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；或该第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:215、216和217的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:235、236和232的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；和/或该组合物中的第二CAR的VH区和VL区分别含有SEQ ID NO:197和SEQ ID NO:198中所示的氨基酸序列；和/或该组合物中的抗原结合结构域含有SEQ ID NO:241中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:241中所示的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的序列。在任何所提供的实施方式中的一些中，该组合物中的第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:209、210和211的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:230、231和232的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；和/或该组合物中的第二CAR的VH区和VL区分别含有SEQ ID NO:197和SEQ ID NO:198中所示的氨基酸序列；和/或该组合物中的抗原结合结构域含有SEQID NO:241中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:241中所示的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的序列
在任何所提供的实施方式中的一些中，该组合物中的第二CAR的跨膜结构域是或含有来源于CD4、CD28或CD8，任选来源于人CD4、人CD28或人CD8的跨膜结构域。在任何所提供的实施方式中的一些中，该组合物中的第二CAR的跨膜结构域是或含有来源于人CD28的跨膜结构域；和/或该组合物中的第二CAR的跨膜结构域是或含有SEQ ID NO:18中所示的序列或与SEQ ID NO:18展现至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。在任何所提供的实施方式中的一些中，该组合物中的第二CAR的跨膜结构域是或含有SEQ ID NO:18中所示的序列。
在任何所提供的实施方式中的一些中，该组合物中的第二CAR的细胞内信号转导区含有细胞内信号转导结构域。在任何所提供的实施方式中的一些中，该组合物中的第二CAR的细胞内信号转导结构域能够在T细胞中诱导初级活化信号是T细胞受体(TCR)组分和/或含有免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)。在任何所提供的实施方式中的一些中，该组合物中的第二CAR的细胞内信号转导结构域是或含有CD3-zeta(CD3ζ)链的ζ链或其功能变体或信号转导部分、任选为人CD3ζ链的细胞质信号转导结构域。在任何所提供的实施方式中的一些中，该合物中的第二CAR的细胞内信号转导区含有SEQ ID NO:20中所示的序列或与SEQID NO:20具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。
在任何所提供的实施方式中的一些中，该组合物中的第二CAR的细胞内信号转导区进一步含有共刺激信号转导区。在任何所提供的实施方式中的一些中，该组合物中的第二CAR的共刺激信号转导区含有T细胞共刺激分子或其信号转导部分的细胞内信号转导结构域。在任何所提供的实施方式中的一些中，该组合物中的第二CAR的共刺激信号转导区含有CD28、4-1BB或ICOS或其信号转导部分，任选人CD28、人4-1BB或人ICOS的细胞内信号转导结构域。在任何所提供的实施方式中的一些中，组合物中的第二CAR的共刺激信号转导区含有4-1BB或其信号转导部分，任选人4-1BB的细胞内信号转导结构域。在任何所提供的实施方式中的一些中，第一嵌合抗原受体和第二嵌合抗原受体中的至少一种包括含4-1BB或其信号转导部分，任选人4-1BB的细胞内信号转导结构域的细胞内信号转导区。在任何所提供的实施方式中的一些中，该组合物中的第二CAR的共刺激信号转导区含有：人CD28的细胞内信号转导结构域；和/或SEQ ID NO:46中所示的序列或与SEQ ID NO:46中所示的序列展现至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。在任何所提供的实施方式中的一些中，该组合物中的第二CAR的共刺激信号转导区含有：人4-1BB的细胞内信号转导结构域；和/或SEQ ID NO:19中所示的序列或与SEQ ID NO:19中所示的序列展现至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。
在任何所提供的实施方式中的一些中，该组合物中的编码的第二嵌合抗原受体自其N末端至C末端依序含有：抗原结合结构域、间隔子该跨膜结构域和细胞内信号转导区。
在任何所提供的实施方式中的一些中，该组合物中的复数个基因工程细胞含有T细胞，任选其中这些T细胞包括CD4+和CD8+ T细胞，任选其中CD4+ T细胞与CD8+ T细胞的比率是自或自约1:3至3:1，任选为1:2至2:1。在任何所提供的实施方式中的一些中，该组合物中的复数个第一基因工程细胞包含T细胞，任选其中该T细胞包括CD4+和CD8+ T细胞，任选其中CD4+ T细胞与CD8+ T细胞的比率为约1:1。
在任何所提供的实施方式中的一些中，该组合物中的复数个第二基因工程细胞含有T细胞，任选其中这些T细胞包括CD4+和CD8+ T细胞，任选其中CD4+CD8+ T细胞的比率是自或自约1:3至3:1，任选为1:2至2:1。在任何所提供的实施方式中的一些中，该组合物中的复数个第二基因工程细胞包含T细胞，任选其中该T细胞包括CD4+和CD8+ T细胞，任选其中CD4+ T细胞与CD8+ T细胞的比率为约1:1。
在任何所提供的实施方式中的一些中，该组合物含有的第一复数个基因工程细胞与第二复数个基因工程细胞的比率是自或自约1:3至3:1，任选为1:2至2:1，任选是或是约1:1。在任何所提供的实施方式中的一些中，该组合物含有表达第一嵌合抗原受体的第一复数个细胞和表达第二嵌合抗原受体的第二复数个细胞，该第一复数个细胞与该第二复数个细胞的比率是自约1:3至3:1，任选为约1:2至2:1。在特定实施方式中，该组合物中该第一复数个基因工程细胞与该第二复数个基因工程细胞的比率是或是约1:1。在任何所提供的实施方式中的一些中，该组合物进一步含有药学上可接受的赋形剂。在任何所提供的实施方式中的一些中，该组合物是无菌的。
本申请也提供本申请所提供的组合物中的任一种的用途。在任何所提供的实施方式中的一些中，该组合物用于治疗患有疾病或病况的受试者。在任何所提供的实施方式中的一些中，该疾病或病况是癌症。在任何所提供的实施方式中的一些中，该疾病或病况是多发性骨髓瘤，任选为复发性/难治性多发性骨髓瘤。提供的用途和本申请所提供的用途的组合物可以根据所提供的方法中的任一种的方面治疗受试者。
本申请也提供治疗方法，其含有向患有疾病或病症的受试者给予含有本申请所提供的基因工程细胞中任一个的本申请所提供的组合物中任一种或含有本申请所提供的嵌合抗原受体中任一种的本申请所提供组合物中的任一种。在任何所提供的实施方式中的一些中，细胞剂量包括在或在约1.0×107个表达CAR的T细胞与1.2×109个表达CAR的T细胞之间、在约1.25×107个表达CAR的T细胞与1.2×109个表达CAR的T细胞之间、在约1.5×107个表达CAR的T细胞与1.2×109个表达CAR的T细胞之间、在约5.0×107个表达CAR的T细胞与4.5×108个表达CAR的T细胞之间、在约1.5×108个表达CAR的T细胞与3.0×108个表达CAR的T细胞之间。在任何所提供的实施方式中的一些中，细胞剂量包括在或在约2.5×107个表达CAR的T细胞与1.2×109个表达CAR的T细胞之间、在或在约5.0×107个表达CAR的T细胞与4.5×108个表达CAR的T细胞之间、在或在约1.5×108个表达CAR的T细胞与3.0×108个表达CAR的T细胞之间。
在任何实方式中的一些中，细胞剂量包括在或在约1×107个表达CAR的T细胞与或与约2×109个表达CAR的T细胞之间。在任何实方式中的一些中，细胞剂量包括在或在约2.5×107个表达CAR的T细胞与或与约1.2×109个表达CAR的T细胞之间、在或在约5.0×107个表达CAR的T细胞与或与约4.5×108个表达CAR的T细胞之间、或在或在约1.5×108个表达CAR的T细胞与或与约3.0×108个表达CAR的T细胞之间。在任何实方式中的一些中，细胞剂量含有或含有约2.5×107个、含有或含有约5.0×107个、含有或含有约1.5×108个、含有或含有约3.0×108个、含有或含有约4.5×108个、含有或含有约8.0×108个、或含有或含有约1.2×109个表达CAR的T细胞。在任何实方式中的一些中，细胞剂量含有或含有约5.0×107个、含有或含有约1.5×108个、含有或含有约3.0×108个、或含有或含有约4.5×108个表达CAR的T细胞。在任何实方式中的一些中，细胞剂量含有或含有约5.0×107个、含有或含有约1.5×108个、含有或含有约3.0×108个、或含有或含有约4.5×108个表达CAR的T细胞。在任何实方式中的一些中，细胞剂量含有或含有约5.0×107个表达CAR的T细胞。
本申请也提供第一组合物和第二组合物的用途，该第一组合物包括含第一嵌合抗原受体的复数个第一基因工程细胞，该第一嵌合抗原受体是本申请所提供的嵌合抗原受体中的任一种或由本申请所提供的多核苷酸中的任一种编码；该第二组合物包括含第二嵌合抗原受体的复数个第二基因工程细胞，以供使用。在任何所提供的实施方式中的一些中，这些组合物一起使用以用于治疗患有疾病或病况的受试者。在任何所提供的实施方式中的一些中，该疾病或病况是癌症。在任何所提供的实施方式中的一些中，该疾病或病况是多发性骨髓瘤，任选为复发性/难治性多发性骨髓瘤。提供的用途和本申请所提供的用途的组合物可以根据所提供的方法中的任一方面治疗受试者。
本申请也提供治疗方法，其包括：向患有疾病或病症的受试者给予含有复数个第一基因工程细胞的组合物，该复数个第一基因工程细胞含有第一嵌合抗原受体，该第一嵌合抗原受体是本申请所提供的任何嵌合抗原受体或由本申请所提供的多核苷酸中的任一种编码；以及向该受试者给予含有复数个第二基因工程细胞的组合物，该复数个第二基因工程细胞含有第二嵌合抗原受体。在任何所提供的实施方式中的一些中，该复数个第一基因工程细胞的剂量和该复数个第二基因工程细胞的剂量独立地含有在或在约1.0×107个表达CAR的T细胞与1.5×109个表达CAR的T细胞之间、在或在约1.25×107个表达CAR的T细胞与0.6×108个表达CAR的T细胞之间、在或在约2.5×107个表达CAR的T细胞与2.25×108个表达CAR的T细胞之间、在或在约7.5×107个表达CAR的T细胞与1.5×108个表达CAR的T细胞之间、在或在约2.5×107个表达CAR的T细胞与1.2×109个表达CAR的T细胞之间、在或在约5.0×107个表达CAR的T细胞与4.5×108个表达CAR的T细胞之间、在或在约1.5×108个表达CAR的T细胞与3.0×108个表达CAR的T细胞之间。在任何实方式中的一些中，该复数个第一基因工程细胞的剂量和该复数个第二基因工程细胞的剂量独立地含有在或在约1×107个表达CAR的T细胞与或与约2×109个表达CAR的T细胞之间。在任何实方式中的一些中，细胞剂量包括在或在约2.5×107个表达CAR的T细胞与或与约1.2×109个表达CAR的T细胞之间、在或在约5.0×107个表达CAR的T细胞与或与约4.5×108个表达CAR的T细胞之间、或在或在约1.5×108个表达CAR的T细胞与或与约3.0×108个表达CAR的T细胞之间。在任何实方式中的一些中，细胞剂量含有或含有约2.5×107个、含有或含有约5.0×107个、含有或含有约1.5×108个、含有或含有约3.0×108个、含有或含有约4.5×108个、含有或含有约8.0×108个、或含有或含有约1.2×109个表达CAR的T细胞。在任何实方式中的一些中，细胞剂量含有或含有约5.0×107个、含有或含有约1.5×108个、含有或含有约3.0×108个、或含有或含有约4.5×108个表达CAR的T细胞。在任何实方式中的一些中，细胞剂量含有或含有约5.0×107个、含有或含有约1.5×108个、含有或含有约3.0×108、或含有或含有约4.5×108个表达CAR的T细胞。在任何实方式中的一些中，细胞剂量含有或含有约5.0×107个表达CAR的T细胞。
在任何所提供的实施方式中的一些中，含有该复数个第一基因工程细胞的组合物和含有该复数个第二基因工程细胞的组合物同时、依序或间歇地给予。在任何所提供的实施方式中的一些中，含有该复数个第一基因工程细胞的组合物和含有该复数个第二基因工程细胞的组合物按任何次序依序给予。
在任何所提供的实施方式中的一些中，在提供的治疗方法中或用于治疗用途的组合物的复数个第一基因工程细胞中，该复数个细胞中小于或小于约10％、9％、8％、7％、5％、4％、3％、2％或1％的细胞含有展现进补信号转导和/或抗原非依赖性活性或信号转导的嵌合抗原受体。
在任何所提供的实施方式中的一些中，在提供的治疗方法中或用于治疗用途的组合物的复数个第二基因工程细胞中，该复数个细胞中小于或小于约10％、9％、8％、7％、5％、4％、3％、2％或1％的细胞含有展现进补信号转导和/或抗原非依赖性活性或信号转导的嵌合抗原受体。
在任何所提供的实施方式中的一些中，这些治疗方法中或用于治疗用途的组合物的基因工程细胞中的第二嵌合受体含有特异性结合多发性骨髓瘤上表达或与多发性骨髓瘤相关的第二抗原的细胞外抗原结合结构域。
在任何所提供的实施方式中的一些中，提供的方法中或用于治疗用途的组合物的基因工程细胞中的第二CAR含有结合第二抗原的细胞外抗原结合结构域、间隔子、跨膜结构域和细胞内信号转导区。
在任何所提供的实施方式中的一些中，作为提供在方法中用于用途治疗的组合物的基因工程细胞中的第二CAR的靶标的第二抗原选自B细胞成熟抗原(BCMA)、CD38、CD138、CS-1、BAFF-R、TACI或FcRH5。在任何所提供的实施方式中的一些中，提供的方法中的第二抗原是BCMA。
在任何所提供的实施方式中的一些中，提供的方法中或用于治疗用途的组合物的基因工程细胞中的第二CAR含有：(1)特异性结合BCMA的细胞外抗原结合结构域，其中该细胞外抗原结合结构域含有：(i)重链可变(VH)区，其含有与SEQ ID NO:189、191、193、195或197中的任一个中所示的VH区氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列；和(ii)轻链可变(VL)区，其含有与SEQID NO:190、192、194、196或198中的任一个中所示的VL区氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列；(2)间隔子；(3)跨膜结构域；和(4)细胞内信号转导区。在任何所提供的实施方式中的一些中，提供的方法中的第二CAR的VH区含有SEQ ID NO:189、191、193、195或197中的任一个中所示的VH区氨基酸序列内所包含的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；且VL区含有SEQ ID NO:190、192、194、196或198中的任一个中所示的VL区氨基酸序列内所包含的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
在任何所提供的实施方式中的一些中，提供的方法中或用于治疗用途的组合物的基因工程细胞中的第二CAR含有：(1)特异性结合BCMA的细胞外抗原结合结构域，其中该细胞外抗原结合结构域含有：(i)重链可变(VH)，其含有与SEQ ID NO:197中所示的VH区氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列；和(ii)轻链可变(VL)区，其含有与SEQ ID NO:198中所示的VL区氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列；(2)间隔子；(3)跨膜结构域；和(4)细胞内信号转导区。在任何所提供的实施方式中的一些中，提供的方法中第二CAR的VH区包括197中所示的VH区氨基酸序列内所包含的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；且VL区含有SEQ ID NO:198中所示的VL区氨基酸序列内所包含的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
在任何所提供的实施方式中的一些中，提供的方法中或用于治疗用途的组合物的基因工程细胞中的第二CAR含有：(1)特异性结合BCMA的细胞外抗原结合结构域，其中该细胞外抗原结合结构域含有：(i)重链可变(VH)，其包括含选自SEQ ID NO:199、202、206、209、212或215中的任一个的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR-H1)；(b)含选自SEQ ID NO:200、203、207、210、213或216中的任一个的氨基酸序列的重链互补决定区2(CDR-H2)；和(c)含选自SEQ ID NO:201、204、205、208、211、214或217中的任一个的氨基酸序列的重链互补决定区3(CDR-H3)；和(ii)轻链可变(VL)区，其包括含选自SEQ ID NO:218、221、224、227、230、233或235中的任一个的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR-L1)；(b)含选自SEQ IDNO:219、222、225、228、231、234或236中的任一个的氨基酸序列的轻链互补决定区2(CDR-L2)；和(c)含选自SEQ ID NO:220、223、226、229或232中的任一个的氨基酸序列的轻链互补决定区3(CDR-L3)；(2)间隔子；(3)跨膜结构域；和(4)细胞内信号转导区。
在任何所提供的实施方式中的一些中，提供的方法中或用于治疗用途的组合物的基因工程细胞中的第二CAR含有细胞外抗原结合结构域，其中第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:199、200和201的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:218、219和220的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:202、203、204的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:221、222和223的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:199、200、205的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:224、225和226的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:206、207、208的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:227、228和229的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:209、210和211的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:230、231和232的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:212、213和214的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:233、234和229的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；或第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:215、216和217的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且第二CAR的VL区包括分别含SEQID NO:235、236和232的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
在任何所提供的实施方式中的一些中，提供的方法中或用于治疗用途的组合物的基因工程细胞中的第二CAR含有细胞外抗原结合结构域，其中第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:209、210和211的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:230、231和232的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；或提供的方法中的第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:215、216和217的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:235、236和232的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在任何所提供的实施方式中的一些中，提供的方法中或用于治疗用途的组合物的基因工程细胞中的第二CAR含有细胞外抗原结合结构域，其中第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:209、210和211的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:230、231和232的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
在任何所提供的实施方式中的一些中，提供的方法中或用于治疗用途的组合物的基因工程细胞中的第二CAR含有细胞外抗原结合结构域，其中VH区和VL区含有分别如SEQ IDNO:189和SEQ ID NO:190中所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:189和SEQ ID NO:190展现至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列；该第二CAR的VH区和VL区含有分别如SEQ ID NO:191和SEQ ID NO:192中所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:191和SEQ ID NO:192展现至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列；该第二CAR的VH区和VL区含有分别如SEQ IDNO:193和SEQ ID NO:194中所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:193和SEQ ID NO:194展现至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列；该第二CAR的VH区和VL区含有分别如SEQ ID NO:195和SEQ ID NO:196中所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:195和SEQ ID NO:196展现至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列；或该第二CAR的VH区和VL区含有分别如SEQ IDNO:197和SEQ ID NO:198中所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:197和SEQ ID NO:198展现至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。
在任何所提供的实施方式中的一些中，提供的方法中或用于治疗用途的组合物的基因工程细胞中的第二CAR含有细胞外抗原结合结构域，其中VH区和VL区分别含有SEQ IDNO:197和SEQ ID NO:198中所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:197和SEQ ID NO:198展现至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。
在任何所提供的实施方式中的一些中，提供的方法中或用于治疗用途的组合物的基因工程细胞中的第二CAR含有细胞外抗原结合结构域，其中VH区和VL区分别含有SEQ IDNO:189和SEQ ID NO:190中所示的氨基酸序列；该第二CAR的VH区和VL区含有SEQ ID NO:191和SEQ ID NO:192中所示的氨基酸序列；该第二CAR的VH区和VL区含有SEQ ID NO:193和SEQID NO:194中所示的氨基酸序列；该第二CAR的VH区和VL区含有SEQ ID NO:195和SEQ ID NO:196中所示的氨基酸序列；或该第二CAR的VH区和VL区分别含有SEQ ID NO:197和SEQ ID NO:198中所示的氨基酸序列。在任何所提供的实施方式中的一些中，提供的方法中或用于治疗用途的组合物中的基因工程细胞中的第二CAR含有细胞外抗原结合结构域，其中VH区和VL区分别含有SEQ ID NO:197和SEQ ID NO:198中所示的氨基酸序列。
在任何所提供的实施方式中的一些中，提供的方法中或用于治疗用途的组合物中的基因工程细胞中的第二CAR的细胞外抗原结合结构域是单链抗体片段。在任何所提供的实施方式中的一些中，该片段是或含有单链可变片段(scFv)。
在提供的方法或用于治疗用途的任何所提供的实施方式中的一些中，组合物中的基因工程细胞中的第二CAR的细胞外抗原结合结构域的VH区和VL区通过柔性连接物接合。在任何所提供的实施方式中的一些中，组合物中的基因工程细胞中的第二CAR的连接物含有氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:52)。在任何所提供的实施方式中的一些中，组合物中的基因工程细胞中的第二CAR的连接物含有氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:52)。
在提供的方法或用于治疗用途的任何所提供的实施方式中的一些中，第二CAR的细胞外抗原结合结构域中的VH区在VL区的氨基末端。在提供的方法的何所提供的实施方式中的一些中，第二CAR中的VH区在VL区的羧基末端。
在提供的方法或用于治疗用途的任何所提供的实施方式中的一些中，第二CAR的细胞外抗原结合结构域含有选自SEQ ID NO:227、238、239、240或241中的任一个的氨基酸序列或与选自SEQ ID NO:227、238、239、240或241中的任一个的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。在提供的方法的任何所提供的实施方式中的一些中，该第二CAR的抗原结合结构域含有选自SEQ IDNO:227、238、239、240或241中的任一个的氨基酸序列。在提供的方法或用于治疗用途的任何所提供的实施方式中的一些中，第二CAR的细胞外抗原结合结构域含有SEQ ID NO:241中的氨基酸序列或与SEQ ID NO:241中的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。在提供的方法或用于治疗用途的任何所提供的实施方式中的一些中，第二CAR的细胞外抗原结合结构域含有SEQ ID NO:241中的氨基酸序列。
在提供的方法或用于治疗用途的任何所提供的实施方式中的一些中，该细胞外抗原结合结构域具有VH区和VL区，其中第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:209、210和211的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:230、231和232的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；或第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:215、216和217的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且第二CAR的VL区包括分别含SEQID NO:235、236和232的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；和/或该第二CAR的VH区和VL区分别含有SEQ ID NO:197和SEQ ID NO:198中所示的氨基酸序列；和/或该抗原结合结构域含有SEQ ID NO:241中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:241中所示的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的序列。在提供的方法或用于治疗用途的任何所提供的实施例中的一些中，该细胞外抗原结合结构域具有VH区和VL区，其中第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:209、210和211的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:230、231和232的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；和/或该第二CAR的VH区和VL区分别含有SEQ ID NO:197和SEQ IDNO:198中所示的氨基酸序列；和/或该抗原结合结构域含有SEQ ID NO:241中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:241中所示的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的序列。
在提供的方法或用于治疗用途的任何所提供的实施方式中的一些中，第二CAR的跨膜结构域是或含有来源于CD4、CD28或CD8，任选来源于人CD4、人CD28或人CD8的跨膜结构域。在提供的方法的任何所提供的实施方式中的一些中，第二CAR的跨膜结构域是或含有来源于人CD28的跨膜结构域；和/或该跨膜结构域是或含有SEQ ID NO:18中所示的序列或与SEQ ID NO:18展现至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。在提供的方法的任何所提供的实施方式中的一些中，第二CAR的跨膜结构域是或含有SEQ ID NO:18中所示的序列。
在提供的方法或用于治疗用途的任何所提供的实施方式中的一些中，第二CAR的细胞内信号转导区含有细胞内信号转导结构域。在提供的方法的任何所提供的实施方式中的一些中，第二CAR的细胞内信号转导结构域能够在T细胞中诱导初级活化信号，是T细胞受体(TCR)组分和/或含有免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)。在提供的方法的任何所提供的实施方式中的一些中，第二CAR的细胞内信号转导结构域是或含有CD3-zeta(CD3ζ)链的ζ链或其功能变体或信号转导部分、任选为人CD3ζ链的细胞质信号转导结构域。在提供的方法的任何所提供的实施方式中的一些中，第二CAR的细胞内信号转导区含有SEQ ID NO:20中所示的序列或SEQ ID NO:20具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。
在提供的方法或用于治疗用途的任何所提供的实施方式中的一些中，第二CAR的细胞内信号转导区进一步含有共刺激信号转导区。在提供的方法的任何所提供的实施方式中的一些中，第二CAR的共刺激信号转导区含有T细胞共刺激分子或其信号转导部分的细胞内信号转导结构域。在提供的方法的任何所提供的实施方式中的一些中，第二CAR的共刺激信号转导区含有CD28、4-1BB或ICOS或其信号转导部分，任选人CD28、人4-1BB或人ICOS的细胞内信号转导结构域。在提供的方法的任何所提供的实施方式中的一些中，第二CAR的共刺激信号转导区含有4-1BB或其信号转导部分，任选人4-1BB的细胞内信号转导结构域。在任何所提供的实施方式中的一些中，第一嵌合抗原受体和第二嵌合抗原受体中的至少一种包括含4-1BB或其信号转导部分，任选人4-1BB的细胞内信号转导结构域的细胞内信号转导区。
在提供的方法或用于治疗用途的任何所提供的实施方式中的一些中，第二CAR的共刺激信号转导区含有：人CD28的细胞内信号转导结构域；和/或SEQ ID NO:46中所示的序列或与SEQ ID NO:46中所示的序列展现至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。
在提供的方法或用于治疗用途的任何所提供的实施方式中的一些中，第二CAR的共刺激信号转导区含有：人4-1BB的细胞内信号转导结构域；和/或SEQ ID NO:19中所示的序列或与SEQ ID NO:19中所示的序列展现至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。
在提供的方法或用于治疗用途的任何所提供的实施方式中的一些中，编码的嵌合抗原受体自其N末端至C末端依序含有：抗原结合结构域、间隔子、跨膜结构域和细胞内信号转导区。
在本申请所提供的多核苷酸中有包含以下的多核苷酸：(i)编码第一嵌合抗原受体(CAR)的第一核酸序列，该第一CAR含有第一抗原结合结构域；和(ii)编码第二嵌合抗原受体(CAR)的第二核酸序列，该第二CAR含有第二抗原结合结构域；其中该第一CAR和该第二CAR各自含有以下：(a)该第一抗原结合结构域或该第二抗原结合结构域、(b)间隔子、(c)跨膜结构域和(d)包含细胞内信号转导结构域和共刺激信号转导区的细胞内信号转导区；其中该第一CAR中(b)至(d)中的一个或多个与该第二CAR中(b)至(d)中相同的一个或多个含有一致氨基酸序列；且其中编码该第一CAR中(b)至(d)中该一个或多个的核苷酸序列在序列方面不同于编码该第二CAR中(b)至(d)中该相同的一个或多个的核苷酸序列。
本申请也提供含有以下的多核苷酸：(i)编码第一嵌合抗原受体(CAR)的第一核酸序列，该第一CAR含有能够结合至GPRC5D或BCMA之一的第一抗原结合结构域和(ii)编码第二嵌合抗原受体(CAR)的第二核酸序列，该第二CAR含有能够结合至GPRC5D或BCMA中的另一个的第二抗原结合结构域；其中该第一CAR和该第二CAR各自含有以下：(a)该第一抗原结合结构域或该第二抗原结合结构域、(b)间隔子、(c)跨膜结构域和(d)包含细胞内信号转导结构域和共刺激信号转导区的细胞内信号转导区；其中该第一CAR中(b)至(d)中的一个或多个与该第二CAR中(b)至(d)中相同的一个或多个含有一致氨基酸序列；且其中编码该第一CAR中(b)至(d)中该一个或多个的核苷酸序列在序列方面不同于编码该第二CAR中(b)至(d)中该相同的一个或多个的核苷酸序列。
在任何所提供的实施方式中的一些中，第一结合结构域与第二抗原结合结构域结合至相同抗原。在任何所提供的实施方式中的一些中，第一结合结构域与第二抗原结合结构域结合相同抗原的不同抗原决定簇。在任何所提供的实施方式中的一些中，第一结合结构与第二抗原结合结构域结合至不同抗原。在任何所提供的实施方式中的一些中，第一抗原结合结构域结合由疾病或病况的细胞表达或与疾病或病况的细胞相关的第一抗原且第二抗原结合结构域结合由相同疾病或病况的细胞表达或与相同疾病或病况的细胞相关的第二抗原。
在任何所提供的实施方式中的一些中，该疾病或病况是癌症。在任何所提供的实施方式中的一些中，该疾病或病况是表达GPRC5D的癌症。在任何所提供的实施方式中的一些中，该疾病或病况是表达BCMA的癌症。在任何所提供的实施方式中的一些中，该疾病或病况是表达BCMA且表达GPRC5D的癌症。在任何所提供的实施方式中的一些中，癌症是浆细胞恶性病，且该浆细胞恶性病是多发性骨髓瘤(MM)或浆细胞瘤。在任何所提供的实施方式中的一些中，癌症是多发性骨髓瘤。在任何所提供的实施方式中的一些中，癌症是复发性/难治性多发性骨髓瘤。
在任何所提供的实施方式中的一些中，第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域独立地结合至选自由以下组成的群组的抗原：GPRC5D、BCMA、CD38、CD138、CS-1、BAFF-R、TACI和FcRH5。在任何所提供的实施方式中的一些中，第一抗原结合结构域结合至B细胞成熟抗原(BCMA)。在任何所提供的实施方式中的一些中，第一抗原结合结构域结合至G蛋白偶合受体C类5族成员D(GPRC5D)。在任何所提供的实施方式中的一些中，第二抗原结合结构域结合至BCMA。在任何所提供的实施方式中的一些中，第二抗原结合结构域结合至GPRC5D。
在任何所提供的实施方式中的一些中，(a)是或含有第一抗原结合结构域或第二抗原结合结构域，(b)是或含有间隔子，(c)是或含有跨膜结构域，且(d)是或包括含细胞内信号转导结构域和共刺激信号转导区的细胞内信号转导区。在任何所提供的实施方式中的一些中，(b)至(d)中的一个或多个是(b)至(d)之一。在任何所提供的实施方式中的一些中，(b)至(d)中的一个或多个是(b)至(d)中的两个。在任何所提供的实施方式中的一些中，(b)至(d)中的一个或多个是(b)至(d)中的每一个。
在任何所提供的实施方式中的一些中，(a)是或含有第一抗原结合结构域或第二抗原结合结构域，(b)是或含有间隔子，(c)是或含有跨膜结构域，且(d)是或包括含细胞内信号转导结构域和共刺激信号转导区的细胞内信号转导区。在任何所提供的实施方式中的一些中，编码第一CAR中(a)至(d)中的一个或多个的核苷酸序列和编码第二CAR中(a)至(d)中相同的一个或多个的核苷酸序列包含不超过约20个序列同源的连续碱基对；和/或编码第一CAR的第一核酸序列该编码第二CAR的第二核酸序列含有不超过约20个序列同源的连续碱基对。在任何所提供的实施方式中的一些中，编码第一CAR中(a)至(d)中的一个或多个的核苷酸序列和编码第二CAR中(a)至(d)中相同的一个或多个的核苷酸序列含有不超过在约5个与约15个之间的序列同源的连续碱基对；和/或编码第一CAR的第一核酸序列和编码第二CAR的第二核酸序列含有不超过在约5个与约15个之间的序列同源的连续碱基对。在任何所提供的实施方式中的一些中，编码第一CAR中(a)至(d)中的一个或多个的核苷酸序列和编码第二CAR中(a)至(d)中相同的一个或多个的核苷酸序列含有不超过约10个序列同源的连续碱基对；和/或编码第一CAR的第一核酸序列和编码第二CAR的第二核酸序列含有不超过约10个序列同源的连续碱基对。
在任何所提供的实施方式中的一些中，编码第一CAR的第一核酸和编码第二CAR的第二核酸由编码多顺反子组件的核苷酸序列分隔开，任选其中该多顺反子组件双顺反子组件。在任何所提供的实施方式中的一些中，该多顺反子组件是IRES或是核糖体跳跃序列或自裂解肽。在任何所提供的实施方式中的一些中，多顺反子组件是核糖体跳跃序列或自裂解肽且该核糖体跳跃序列或自裂解肽是T2A、P2A、E2A或F2A组件。在任何所提供的实施方式中的一些中，编码该一个或多个多顺反子组件的核苷酸序列是密码子趋异的。在任何所提供的实施方式中的一些中，编码T2A的核苷酸序列是密码子趋异的。在任何所提供的实施方式中的一些中，编码T2A的核苷酸序列是或含有SEQ ID NO:319中所示的序列。
在任何所提供的实施方式中的一些中，编码第一CAR的第一核酸序列经密码子优化以用于在人类细胞中表达。在任何所提供的实施方式中的一些中，编码第二CAR的第二核酸序列经密码子优化以用于在人类细胞中表达。在任何所提供的实施方式中的一些中，该多核苷酸经密码子优化以用于在人类细胞中表达。在任何所提供的实施方式中的一些中，在人类细胞，任选在人T细胞中转录该多核苷酸之后，由该多核苷酸转录的、任选的信使RNA展现至少约70％、75％、80％、85％、90％或95％RNA均质性。在任何所提供的实施方式中的一些中，在人类细胞，任选在人T细胞中转录编码该多核苷酸的第一CAR的第一核酸之后，由该第一核酸转录的mRNA、任选为信使RNA展现至少约70％、75％、80％、85％、90％或95％RNA均质性。在任何所提供的实施方式中的一些中，在人类细胞，任选在人T细胞中转录编码该多核苷酸的第二CAR的第二核酸之后，由该第二核酸转录的mRNA、任选为信使RNA展现至少约70％、75％、80％、85％、90％或95％RNA均质性。
在任何所提供的实施方式中的一些中，编码第一CAR的第一核酸中存在的任何潜在剪接供体和/或剪接受体位点展现的剪接预测分数是约或至少约低于0.70分、0.65分、0.60分、0.55分、0.50分、0.45分、0.40分、0.35分、0.30分、0.25分、0.20分和/或涉及剪接事件的概率预测为小于70％、小于65％、小于60％、小于55％、小于50％、小于45％、小于40％、小于35％、小于30％、小于25％或小于20％。在任何所提供的实施方式中的一些中，编码第二CAR的第二核酸中存在的任何潜在剪接供体或受体位点展现的剪接预测分数是约或至少约低于0.70分、0.65分、0.60分、0.55分、0.50分、0.45分、0.40分、0.35分、0.30分、0.25分、0.20分和/或涉及剪接事件的概率预测为小于70％、小于65％、小于60％、小于55％、小于50％、小于45％、小于40％、小于35％、小于30％、小于25％或小于20％。在任何所提供的实施方式中的一些中，该多核苷酸中的任何潜在剪接供体或受体位点展现的剪接预测分数是约或至少约低于0.70分、0.65分、0.60分、0.55分、0.50分、0.45分、0.40分、0.35分、0.30分、0.25分、0.20分和/或涉及剪接事件的概率预测为小于70％、小于65％、小于60％、小于55％、小于50％、小于45％、小于40％、小于35％、小于30％、小于25％或小于20％。
在任何所提供的实施方式中的一些中，(a)的第一抗原结合结构域和/或第二抗原结合结构域是单链抗体片段。在任何所提供的实施方式中的一些中，(a)的第一抗原结合结构域和/或第二抗原结合结构域是或含有单链可变片段(scFv)。在任何所提供的实施方式中的一些中，(a)的第一抗原结合结构域和/或第二抗原结合结构域含有重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区。
在任何所提供的实施方式中的一些中，第一抗原结合结构域或该第二抗原结合结构域含有：VH区，其含有如SEQ ID NO:209中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO:210中所示的CDR-H2和如SEQ ID NO:211中所示的CDR-H3；和VL区，其含有如SEQ ID NO:230中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO:231中所示的CDR-L2和如SEQ ID NO:232中所示的CDR-L3。在任何所提供的实施方式中的一些中，第一抗原结合结构域或第二抗原结合结构域之一包括分别含SEQ IDNO:197和198中所示的氨基酸序列的VH区和VL区。在任何所提供的实施方式中，第一抗原结合结构域或第二抗原结合结构域含有SEQ ID NO:241中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:241展现至少或至少约90％、至少约或约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。
在任何所提供的实施方式中的一些中，第一抗原结合结构域或该第二抗原结合结构域含有：VH区，其含有如SEQ ID NO:125中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO:126中所示的CDR-H2和如SEQ ID NO:127中所示的CDR-H3；和VL区，其含有如SEQ ID NO:130中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO:131中所示的CDR-L2和如SEQ ID NO:132中所示的CDR-L3。在任何所提供的实施方式中，第一抗原结合结构域或第二抗原结合结构域之一包括分别含SEQ ID NO:27和28中所示的氨基酸序列的VH区和VL区。在任何所提供的实施方式中，第一抗原结合结构域或第二抗原结合结构域之一含有SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:8展现至少或至少约90％、至少约或约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。
在任何所提供的实施方式中，第一抗原结合结构域或第二抗原结合结构域之一含有：VH区，其含有如SEQ ID NO:209中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO:210中所示的CDR-H2和如SEQ ID NO:211中所示的CDR-H3；和VL区，其含有如SEQ ID NO:230中所示的CDR-L1、如SEQID NO:231中所示的CDR-L2和如SEQ ID NO:232中所示的CDR-L3；且第一抗原结合结构域或第二抗原结合结构域中的另一个含有VH区，其含有如SEQ ID NO:125中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO:126中所示的CDR-H2和如SEQ ID NO:127中所示的CDR-H3；和VL区，其含有如SEQID NO:130中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO:131中所示的CDR-L2和如SEQ ID NO:132中所示的CDR-L3。在任何所提供的实施方式中的一些中，第一抗原结合结构域或第二抗原结合结构域之一包括分别含SEQ ID NO:197和198中所示的氨基酸序列的VH区和VL区；且第一抗原结合结构域或第二抗原结合结构域中的另一个包括分别含SEQ ID NO:27和28中所示的氨基酸序列的VH区和VL区。在任何所提供的实施方式中的一些中，第一抗原结合结构域或第二抗原结合结构域该含有SEQ ID NO:241中所示的氨基酸序列且第一抗原结合结构域或第二抗原结合结构域中的另一个含有SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列。
在任何所提供的实施方式中的一些中，第一抗原结合结构域或第二抗原结合结构域之一由SEQ ID NO:310中所示的核苷酸序列编码。在任何所提供的实施方式中的一些中，第一抗原结合结构域或第二抗原结合结构域之一由SEQ ID NO:264或SEQ ID NO:311中所示的核苷酸序列编码。在任何所提供的实施方式中的一些中，第一抗原结合结构域或第二抗原结合结构域由SEQ ID NO:310中所示的核苷酸序列编码，且第一抗原结合结构域或第二抗原结合结构域中的另一个由SEQ ID NO:311中所示的核苷酸序列编码。
在任何所提供的实施方式中的一些中，(b)是或含有间隔子。在任何所提供的实施方式中的一些中，(b)含有免疫球蛋白的一部分。在任何所提供的实施方式中的一些中，(b)含有铰链区、CH2区和CH3区的序列。在任何所提供的实施方式中的一些中，铰链区含有IgG4铰链区和/或IgG2铰链区的全部或一部分，其中该IgG4铰链区任选为人IgG4铰链区且该IgG2铰链区任选为人IgG2铰链区；CH2区含有IgG4 CH2和/或IgG2 CH2的全部或一部分，其中该IgG4 CH2任选为人IgG4 CH2且该IgG2 CH2任选为人IgG2 CH2；和/或CH3区含有IgG4 CH3和/或IgG2 CH3的全部或一部分，其中该IgG4 CH3任选为人IgG4 CH3且该IgG2 CH3任选为人IgG2 CH3。在任何所提供的实施方式中的一些中，铰链区、CH2和CH3含有来自人IgG4的铰链的全部或一部分、CH2的全部或一部分和CH3的全部或一部分。在任何所提供的实施方式中的一些中，铰链区、CH2和CH3中的一个或多个是嵌合的且含有来自人IgG4和人IgG2的铰链、CH2和CH3。在任何所提供的实施方式中的一些中，(b)含有IgG4/2嵌合铰链区，或相较于人IgG4铰链含有至少一个氨基酸置换的经修饰的IgG4铰链区；IgG2/4嵌合CH2区；和IgG4 CH3区。
在任何所提供的实施方式中的一些中，(b)是或含有间隔子。在任何所提供的实施方式中的一些中，(b)的长度是自或自约125至300个氨基酸、125至250个氨基酸、125至230个氨基酸、125至200个氨基酸、125至180个氨基酸、125至150个氨基酸、150至300个氨基酸、150至250个氨基酸、150至230个氨基酸、150至200个氨基酸、150至180个氨基酸、180至300个氨基酸、180至250个氨基酸、180至230个氨基酸、180至200个氨基酸、200至300个氨基酸、200至250个氨基酸、200至230个氨基酸、230至300个氨基酸、230至250个氨基酸、或250至300个氨基酸，任选其中该间隔子的长度是至少或至少约224个、至少或至少约225个、至少或至少约226个、至少或至少约227个、至少或至少约228个、或至少或至少约229个氨基酸。在任何所提供的实施方式中的一些中，(b)是或含有SEQ ID NO:17中所示的氨基酸序列。在任何所提供的实施方式中的一些中，第一CAR或第二CAR的一中的(b)由SEQ ID NO:48中所示的核苷酸序列编码，且第一CAR或第二CAR中的另一个中的(b)由SEQ ID NO:305中所示的核苷酸序列编码。
在任何所提供的实施方式中的一些中，(c)是或含有跨膜结构域。在任何所提供的实施方式中的一些中，(c)是或含有CD4、CD28或CD8的跨膜结构域，任选来自人CD4、人CD28或人CD8的跨膜结构域。在任何所提供的实施方式中的一些中，(c)是或含有人CD28跨膜结构域。在任何所提供的实施方式中的一些中，(c)是或含有SEQ ID NO:18中所示的氨基酸序列。在任何所提供的实施方式中的一些中，第一CAR或第二CAR的一中的(c)由SEQ ID NO:56中所示的核苷酸序列编码，且第一CAR或第二CAR中的另一个中的(c)由SEQ ID NO:307中所示的核苷酸序列编码。
在任何所提供的实施方式中的一些中，(d)是或包括含细胞内信号转导结构域和共刺激信号转导区的细胞内信号转导区。在任何所提供的实施方式中的一些中，(d)的细胞内信号转导结构域能够在T细胞中诱导初级活化信号，是T细胞受体(TCR)组分和/或含有免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)。在任何所提供的实施方式中的一些中，(d)的细胞内信号转导结构域是或含有CD3-zeta(CD3ζ)链或其功能变体或信号转导部分、任选为人CD3ζ链的细胞质信号转导结构域。在任何所提供的实施方式中的一些中，(d)的细胞内信号转导结构域是或含有SEQ ID NO:20中所示的氨基酸序列。在任何所提供的实施方式中的一些中，第一CAR或第二CAR之一的(d)的细胞内信号转导结构域由SEQ ID NO:58中所示的核苷酸序列编码且第一CAR或第二CAR中的另一个中的(d)的细胞内信号转导结构域由SEQ ID NO:309中所示的核苷酸序列编码。在任何所提供的实施方式中的一些中，(d)是或包括含细胞内信号转导结构域和共刺激信号转导区的细胞内信号转导区。在任何所提供的实施方式中的一些中，(d)的共刺激信号转导区含有T细胞共刺激分子或其信号转导部分的细胞内信号转导结构域。在任何所提供的实施方式中的一些中，(d)的共刺激信号转导区含有CD28、4-1BB或ICOS或其信号转导部分，任选人CD28、人4-1BB或人ICOS的细胞内信号转导结构域。在任何所提供的实施方式中的一些中，(d)的共刺激信号转导区含有4-1BB的细胞内信号转导结构域。在任何所提供的实施方式中的一些中，(d)的共刺激信号转导区是或含有SEQ ID NO:19中所示的氨基酸序列。在任何所提供的实施方式中的一些中，第一CAR或第二CAR的一中的(d)的共刺激信号转导区由SEQ ID NO:60中所示的核苷酸序列编码且第一CAR或第二CAR中的另一个中的(d)的共刺激信号转导区由SEQ ID NO:308中所示的核苷酸序列编码。
在任何所提供的实施方式中的一些中，(a)是或含有第一抗原结合结构域或第二抗原结合结构域，(b)是或含有间隔子，(c)是或含有跨膜结构域，且(d)是或包括含细胞内信号转导结构域和共刺激信号转导区的细胞内信号转导区。在任何所提供的实施方式中的一些中，第一CAR或第二CAR中的一种含有(a)结合至GPRC5D的第一抗原结合结构域，任选其中该第一抗原结合结构域由SEQ ID NO:311中所示的核苷酸序列编码；(b)由SEQ ID NO:305中所示的核苷酸编码的间隔子；(c)由SEQ ID NO:307中所示的核苷酸序列编码的跨膜结构域；和(d)含有由SEQ ID NO:309中所示的核苷酸序列编码的细胞内信号转导结构域和由SEQ ID NO:308中所示的核苷酸序列编码的共刺激信号转导区的细胞内信号转导区；第一CAR该第二CAR中的另一种含有(a)结合至BCMA的抗原结合结构域，任选其中该抗原结合结构域由SEQ ID NO:310中所示的核苷酸序列编码；(b)由SEQ ID NO:48中所示的核苷酸编码的间隔子；(c)由SEQ ID NO:56中所示的核苷酸序列编码的跨膜结构域；和(d)含有由SEQID NO:58中所示的核苷酸序列编码的细胞内信号转导结构域和由SEQ ID NO:60中所示的核苷酸序列编码的共刺激信号转导结构域区的细胞内信号转导区。
在任何所提供的实施方式中的一些中，编码第一CAR的第一核酸序列相对于编码第一CAR的第二核酸序列位于该多核苷酸的5'端。在任何所提供的实施方式中的一些中，第一CAR含有结合至GPRC5D的抗原结合结构域且第二CAR含有结合至BCMA的抗原结合结构域。在任何所提供的实施方式中的一些中，第一CAR含有结合至BCMA的抗原结合结构域且第二CAR含有结合至GPRC5D的抗原结合结构域。
本申请也提供多核苷酸，其含有(i)编码第一嵌合抗原受体(CAR)的第一核酸序列、(ii)编码第二嵌合抗原受体(CAR)的第二核酸序列和(iii)编码多顺反子组件的核苷酸序列，其中编码第一CAR的第一核酸和编码第二CAR的第二核酸通过该多顺反子组件分隔开；其中该第一CAR含有结合至GPRC5D的第一抗原结合结构域，任选其中该第一抗原结合结构域由SEQ ID NO:311中所示的核苷酸序列编码；由SEQ ID NO:305中所示的核苷酸编码的间隔子；由SEQ ID NO:307中所示的核苷酸序列编码的跨膜结构域；以及含有由SEQ ID NO:309中所示的核苷酸序列编码的细胞内信号转导结构域和由SEQ ID NO:308中所示的核苷酸序列编码的共刺激信号转导区的细胞内信号转导区；其中该第二CAR含有结合至BCMA的第二抗原结合结构域，任选其中该第二抗原结合结构域由SEQ ID NO:310中所示的核苷酸序列编码；由SEQ ID NO:48中所示的核苷酸编码的间隔子；由SEQ ID NO:56中所示的核苷酸序列编码的跨膜结构域；以及含有由SEQ ID NO:58中所示的核苷酸序列编码的细胞内信号转导结构域和由SEQ ID NO:60中所示的核苷酸序列编码的共刺激信号转导结构域区的细胞内信号转导区；且其中编码第一CAR的第一核酸序列相对于编码第二CAR的第二核酸序列位于该多核苷酸的5'端。
本申请也提供多核苷酸，其含有(i)编码第一嵌合抗原受体(CAR)的第一核酸序列、(ii)编码第二嵌合抗原受体(CAR)的第二核酸序列和(iii)编码多顺反子组件的核苷酸序列，其中编码第一CAR的第一核酸和编码第二CAR的第二核酸通过该多顺反子组件分隔开；其中该第一CAR含有结合至BCMA的第一抗原结合结构域，任选其中该第一抗原结合结构域由SEQ ID NO:310中所示的核苷酸序列编码；由SEQ ID NO:48中所示的核苷酸编码的间隔子；由SEQ ID NO:56中所示的核苷酸序列编码的跨膜结构域；以及含有由SEQ ID NO:58中所示的核苷酸序列编码的细胞内信号转导结构域和由SEQ ID NO:60中所示的核苷酸序列编码的共刺激信号转导结构域区的细胞内信号转导区；其中该第二CAR含有结合至GPRC5D的第二抗原结合结构域，任选其中该第二抗原结合结构域由SEQ ID NO:311中所示的核苷酸序列编码；由SEQ ID NO:305中所示的核苷酸编码的间隔子；由SEQ ID NO:307中所示的核苷酸序列编码的跨膜结构域；以及含有由SEQ ID NO:309中所示的核苷酸序列编码的细胞内信号转导结构域和由SEQ ID NO:308中所示的核苷酸序列编码的共刺激信号转导区的细胞内信号转导区；且其中编码第一CAR的第一核酸序列相对于编码第二CAR的第二核酸序列位于该多核苷酸的5'端。
在任何所提供的实施方式中的一些中，该多顺反子组件含有SEQ ID NO:37中所示的氨基酸序列。在任何所提供的实施方式中的一些中，该多顺反子组件由SEQ ID NO:44或SEQ ID NO:45中所示的核苷酸序列编码。在任何所提供的实施方式中的一些中，该多顺反子组件由SEQ ID NO:319中所示的核苷酸序列编码。
在任何所提供的实施方式中的一些中，该多核苷酸含有SEQ ID NO:299中所示的核苷酸序列。在任何所提供的实施方式中的一些中，该多核苷酸编码SEQ ID NO:298中所示的序列。
在任何所提供的实施方式中的一些中，该多核苷酸含有SEQ ID NO:302中所示的核苷酸序列。在任何所提供的实施方式中的一些中，该多核苷酸编码SEQ ID NO:301中所示的序列。
在任何所提供的实施方式中的一些中，该多核苷酸含有SEQ ID NO:315中所示的核苷酸序列。在任何所提供的实施方式中的一些中，该多核苷酸含有SEQ ID NO:316中所示的核苷酸序列。
本申请也提供多核苷酸，其中多核苷酸编码GPRC5D结合结构域、BCMA结合结构域和含有4-1BB的细胞内信号转导结构域的细胞内信号转导区。在任何所提供的实施方式中的一些中，该多核苷酸含有SEQ ID NO:317中所示的核苷酸序列。
也提供含有所提供的多核苷酸中的任一种的载体。在任何所提供的实施方式中的一些中，载体是病毒载体。在任何所提供的实施方式中的一些中，病毒载体是慢病毒载体或逆转录病毒载体。
也提供含有本申请所提供的嵌合抗原受体中的任一种的基因工程细胞。在任何所提供的实施方式中的一些中，基因工程细胞含有本申请所提供的嵌合抗原受体且进一步包括含编码第二嵌合抗原受体的核苷酸序列的多核苷酸。
也提供含有本申请所提供的多核苷酸中的任一种的基因工程细胞。
在任何所提供的实施方式中的一些中，基因工程细胞是淋巴细胞。在任何所提供的实施方式中的一些中，基因工程细胞是NK细胞或T细胞。在任何所提供的实施方式中的一些中，基因工程细胞是T细胞，且该T细胞是CD4+或CD8+ T细胞。
在任何所提供的实施方式中的一些中，基因工程细胞由获自受试者的初代细胞进行基因工程改造。
在任何所提供的实施方式中的一些中，基因工程细胞在复数个基因工程细胞中，其中该复数个细胞中小于或小于约10％、9％、8％、7％、5％、4％、3％、2％或1％的细胞含有展现进补信号转导和/或抗原非依赖性活性或信号转导的嵌合抗原受体。
也提供含有本申请所提供的嵌合抗原受体中的任一种的组合物。在任何所提供的实施方式中的一些中，该组合物含有CD4+和CD8+ T细胞且CD4+ T细胞与CD8+ T细胞的比率是自或自约1:3至3:1。在一些实施方式中，该组合物中CD4+ T细胞与CD8+ T细胞的比率是1:2至2:1。在一些实施方式中，该组合物中CD4+ T细胞与CD8+ T细胞的比率是1:1。在任何所提供的实施方式中的一些中，该组合物进一步含有药学上可接受的赋形剂。在任何所提供的实施方式中的一些中，该组合物是无菌的。
本申请也提供治疗方法，其包括向患有疾病或病症的受试者给予含有本申请所提供的基因工程细胞中任一种的本申请所提供的组合物中任一种或含有本申请所提供的嵌合抗原受体中任一种的本申请所提供的组合物中任一种。在任何所提供的实施方式中的一些中，细胞剂量包括在至少或至少约2.5×107个表达CAR的T细胞与1.2×109个表达CAR的T细胞之间、在至少或至少约5.0×107个表达CAR的T细胞与4.5×108个表达CAR的T细胞之间、在至少或至少约1.5×108个表达CAR的T细胞与3.0×108个表达CAR的T细胞之间。在任何实方式中的一些中，细胞剂量包括在或在约1×107个表达CAR的T细胞与或与约2×109个表达CAR的T细胞之间。在任何实方式中的一些中，细胞剂量包括在或在约2.5×107个表达CAR的T细胞与或与约1.2×109个表达CAR的T细胞之间、在或在约5.0×107个表达CAR的T细胞与或与约4.5×108个表达CAR的T细胞之间、或在或在约1.5×108个表达CAR的T细胞与或与约3.0×108个表达CAR的T细胞之间。在任何实方式中的一些中，细胞剂量含有或含有约2.5×107个、含有或含有约5.0×107个、含有或含有约1.5×108个、含有或含有约3.0×108个、含有或含有约4.5×108个、含有或含有约8.0×108个、或含有或含有约1.2×109个表达CAR的T细胞。在任何实方式中的一些中，细胞剂量含有或含有约5.0×107个、含有或含有约1.5×108个、含有或含有约3.0×108个、或含有或含有约4.5×108个表达CAR的T细胞。在任何实方式中的一些中，细胞剂量含有或含有约5.0×107个、含有或含有约1.5×108个、含有或含有约3.0×108个、或含有或含有约4.5×108个表达CAR的T细胞。在任何实方式中的一些中，细胞剂量含有或含有约5.0×107个表达CAR的T细胞。
本申请也提供治疗方法，其包括向患有疾病或病症的受试者给予含有本申请所提供的基因工程细胞中任一种的本申请所提供的组合物中任一种或含有本申请所提供的嵌合抗原受体中任一种的本申请所提供的组合物中的任一种。在任何所提供的实施方式中的一些中，细胞剂量包括在至少或至少约1.0×107个表达CAR的T细胞与1.2×109个表达CAR的T细胞之间、在至少或至少约1.5×107个表达CAR的T细胞与4.5×108个表达CAR的T细胞之间、在至少或至少约2.0×107个表达CAR的T细胞与3.0×108个表达CAR的T细胞之间。
本申请也提供治疗方法，其包括：向患有疾病或病症的受试者给予含有复数个基因工程细胞的组合物，该复数个基因工程细胞含有第一嵌合抗原受体和第二嵌合抗原受体，其中其各自是本申请所提供的任何嵌合抗原受体或由本申请所提供的多核苷酸中的任一种编码；以及向该受试者给予含有复数个第二基因工程细胞的组合物，该复数个第二基因工程细胞含有第二嵌合抗原受体。在任何所提供的实施方式中的一些中，该复数个第一基因工程细胞的剂量和该复数个第二基因工程细胞的剂量独立地含有在或在约1.0×107个表达CAR的T细胞与1.5×109个表达CAR的T细胞之间、在或在约1.25×107个表达CAR的T细胞与0.6×108个表达CAR的T细胞之间、在或在约2.5×107个表达CAR的T细胞与2.25×108个表达CAR的T细胞之间、在或在约7.5×107个表达CAR的T细胞与1.5×108个表达CAR的T细胞之间、在或在约2.5×107个表达CAR的T细胞与1.2×109个表达CAR的T细胞之间、在或在约5.0×107个表达CAR的T细胞与4.5×108个表达CAR的T细胞之间、在或在约1.5×108个表达CAR的T细胞与3.0×108个表达CAR的T细胞之间。
在提供的方法的任何所提供的实施方式中的一些中，该疾病或病症与G蛋白偶合C类5族成员D(GPRC5D)的表达相关。
在提供的方法的任何所提供的实施方式中的一些中，该疾病或病症进一步与B细胞成熟抗原(BCMA)的表达相关。
在提供的方法的任何所提供的实施方式中的一些中，该疾病或病症是B细胞相关病症。在提供的方法的任何所提供的实施方式中的一些中，该与BCMA相关的疾病或病症是自体免疫性疾病或病症。在提供的方法的任何所提供的实施方式中的一些中，该自体免疫性疾病或病症是全身性红斑性狼疮症(SLE)、狼疮性肾炎、发炎性肠病、类风湿性关节炎、ANCA相关血管炎、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、自体免疫性血小板减少症、却格司氏病(Chagas'disease)、格雷夫氏病(Grave's disease)、韦格纳氏肉芽肿病(Wegener's granulomatosis)、结节性多动脉炎、休格连氏症候群(Sjogren's syndrome)、寻常性天疱疮、硬皮病、多发性硬化、牛皮癣、IgA肾病变、IgM多发性神经病、血管炎、糖尿病、雷诺氏症候群(Reynaud's syndrome)、抗磷脂症候群、古巴士德氏病(Goodpasture's disease)、川崎病(Kawasaki disease)、自体免疫性溶血性贫血、重症肌无力或进行性丝球体肾炎。
在提供的方法的任何所提供的实施方式中的一些中，该疾病或病症是癌症。在提供的方法的任何所提供的实施方式中的一些中，癌症是表达GPRC5D的癌症。在提供的方法的任何所提供的实施方式中的一些中，癌症是浆细胞恶性病，且该浆细胞恶性病是多发性骨髓瘤(MM)或浆细胞瘤。在提供的方法的任何所提供的实施方式中的一些中，癌症是多发性骨髓瘤(MM)。在提供的方法的任何所提供的实施方式中的一些中，癌症是复发性/难治性多发性骨髓瘤。
在提供的方法的任何所提供的实施方式中的一些中，受试者在给予BCMA靶向疗法后、任选在给予包含特异性结合BCMA的CAR的T细胞后是难治疗的或已经复发。在提供的方法的任何所提供的实施方式中的一些中，选择以下受试者进行治疗，其在给予BCMA靶向疗法后、任选在给予包含特异性结合BCMA的CAR的T细胞后是难治疗的或已经复发。在提供的方法的任何所提供的实施方式中的一些中，在给予细胞剂量之前，受试者已预先接受用于治疗该疾病或病症的BCMA靶向疗法的给予。在提供的方法的任何所提供的实施方式中的一些中，在给予第一剂量的细胞和第二剂量细胞之前，受试者已预先接受用于治疗疾病或病症的BCMA靶向疗法的给予。
在提供的方法的任何所提供的实施方式中的一些中，BCMA靶向疗法包括含T细胞的组合物，这些T细胞包含特异性结合BCMA的CAR。在提供的方法的任何所提供的实施方式中的一些中，受试者是在给予BCMA靶向疗法后、任选在给予包含特异性结合BCMA的CAR的T细胞后是难治疗的或已经复发。在提供的方法的任何所提供的实施方式中的一些中，该受试者包含在先前给予之后展现BCMA抗原或抗原决定簇损失、BCMA下调和/或BCMA阴性肿瘤细胞的多发性骨髓瘤细胞。
附图说明
图1A显示癌细胞系百科全书CD138 mRNA表达数据(以log2计)。癌症类型自左至右为：上呼吸消化道癌(32)；食道癌(25)；前列腺癌(7)；多发性骨髓瘤(30)；胆管癌(8)；肺癌(131)；胰脏癌(44)；肾癌(34)；乳癌(58)；结肠直肠癌(61)；胃癌(38)；脊膜瘤(3)；肝癌(28)；神经胶质瘤(62)；骨肉瘤(10)；甲状腺癌(12)；子宫内膜癌(27)；软组织癌(21)；间皮瘤(11)；卵巢癌(51)；软骨肉瘤(4)；小细胞肺癌(53)；黑素瘤(61)；神经母细胞瘤(17)；神经管母细胞瘤(4)；尤文氏肉瘤(Ewing sarcoma)(12)；霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)(12)；DLBCL(18)；其他淋巴瘤(28)；B细胞癌(15)；CML(15)；伯基特氏淋巴瘤(Burkittlymphoma)(11)；T细胞癌(16)；AML(34)；其他白血病(1)。
图1B显示恶性细胞系[n＝1036；癌细胞系百科全书(CCLE)]中GPRC5D的mRNA表达。RMA，稳健的多阵列平均值；DLBCL，弥漫性大B细胞淋巴瘤；CML，慢性骨髓性白血病；ALL，急性淋巴母细胞白血病；AML，急性骨髓性白血病；NSC，非小细胞。癌症类型自左至右为：多发性骨髓瘤(30)；其他白血病(1)；DLBCL(18)；CML(15)；脊膜瘤(3)；其他淋巴瘤(28)；伯基特氏淋巴瘤(11)；霍奇金氏淋巴瘤(12)；T细胞癌(16)；B细胞癌(15)；胆管癌(8)；AML(34)；胰脏癌(44)；甲状腺癌(12)；结肠直肠癌(61)；肾癌(34)；骨肉瘤(10)；泌尿道癌(27)；乳癌(58)；神经母细胞瘤(17)；非小细胞肺癌(131)；尤文氏肉瘤(12)；前列腺癌(7)；黑素瘤(61)；上呼吸消化道癌(32)；子宫内膜癌(27)；神经管母细胞瘤(4)；肝癌(28)；卵巢癌(51)；胃癌(38)；神经胶质瘤(62)；小细胞肺癌(53)；间皮瘤(11)；食道癌(25)；其他癌症(150)；软骨肉瘤(4)。
图2A显示各种器官的CD138 GTEx RNASeq表达数据。组织的类型自左至右为：小脑、大脑半球、前扣带皮质、额叶皮质、皮质、杏仁核、海马、伏隔核、尾状核、壳核、乙状结肠、胫骨神经、骨胳肌肉、子宫、食道肌层、食道胃连接部、丘脑下部、脂肪组织、子宫颈、冠状动脉、颈部脊髓、黑质、卵巢、胫骨动脉、乳房组织、输卵管、脂肪组织、肾脏、左心室、子宫颈、肾上腺、膀胱、全血、皮肤(暴露于日光)、皮肤(未暴露于日光)、主动脉、扁桃体、小肠、胰脏、肝、心耳、阴道、胃、前列腺、脾、脐带血、甲状腺、横结肠、垂体、食道黏膜、睪丸、小唾液腺、肺、骨髓。
图2B显示根据Gtex RNASeq数据(Gtex 708 ENSG00000111291.4)，正常组织中GPRC5D的mRNA表达。虚线表示CD138分选的原发性MM细胞中GPRC5D的表达量(BlueprintRNAseq；n＝9)。FPKM，每千碱基个的转录物每百万个映射读段的片段数。组织的类型自左至右为：小脑、大脑半球、前扣带皮质、额叶皮质、皮质、杏仁核、海马、伏隔核、尾状核、壳核、乙状结肠、胫骨神经、骨胳肌肉、子宫、食道肌层、食道胃连接部、丘脑下部、脂肪组织、子宫颈、冠状动脉、颈部脊髓、黑质、卵巢、胫骨动脉、乳房组织、输卵管、脂肪组织、肾脏、左心室、子宫颈、肾上腺、膀胱、全血、皮肤(暴露于日光)、皮肤(未暴露于日光)、主动脉、扁桃体、小肠、胰脏、肝、心耳、阴道、胃、前列腺、脾、脐带血、甲状腺、横结肠、垂体、食道黏膜、睪丸、小唾液腺、肺、原发性MM(骨髓)。
图2C显示由Blueprint RNAseq测定的初代人类组织细胞类型中的GPRC5D mRNA表达。FPKM，每千碱基个的转录物每百万个映射读段的片段数。
图3A显示通过患有MM的受试者分层的有关无进展生存期(PFS)的卡普兰-迈耶曲线(Kaplan-Meier curve)，通过RNA-seq测定这些患有MM的受试者的GPRC5D表达高于(>)或低于(<)中值GPRC5D表达。通过对数秩测试(log-rank test)测定等危险性的显著性(p＝0.0031；n＝765)。
图3B显示通过GPRC5D表达量分层的患有MM的受试者的国际分期系统(ISS)分数(n＝369名高于中值，374名低于中值)。
图3C-3H显示通过GPRC5D表达量分层的MM受试者中常见细胞遗传异常的频率(n＝287-291名高于中值，280-282名低于中值)。
图4A显示在免疫组织化学侦测之后，细胞系上GPRC5D蛋白质的离群值盒状图定量。离群值盒状图指示中值膜光学密度和四分位数范围(IQR)；盒须是1.5×IQR。经基因工程改造以表达蛋白质的K562细胞中GPRC5D表达的平均荧光强度(MFI)由在以K562-GPRC5D命名的细胞系之后的数字给出。
图4B显示来自MM患者的83份骨髓样品中的自动定量免疫荧光。每个柱表示各个患者样品。
图4C显示如通过来自MM患者的83份骨髓样品中的自动定量免疫荧光所测定的超过50％的CD138+细胞表达BCMA、GPRC5D、或BCMA或GPRC5D的患者样品的百分比。
图4D显示CD138+细胞上BCMA与GPRC5D表达的相关性；R2＝0.156。
图5显示通过基于ELISA的技术评估的GPRC5D靶向scFv子集的线性、构象和不连续抗原决定簇结合。
图6A和6B显示含有指定scFv和间隔子的CAR的抗原非依赖性(进补)信号转导。用42种CAR/GFP双顺反子构建体中的1种转导Jurkat Nur77-RFP报导体细胞。在转导之后11天，在无靶标抗原存在下，涂铺(plate)5×105个活的GFP+Jurkat细胞并监测RFP表达。RFP和GFP两者的表达指示进补信号转导；仅GFP表达指示经CAR转导且无进补信号转导。
图6C-6E描绘在将Jurkat Nur77-RFP报导体细胞与MM.1S细胞(表达内源性GPRC5D)以2:1培养20小时之后测量的具有长间隔子(图6C)、中等长度间隔子(图6D)和短间隔子(图6E)的候选CAR的抗原依赖性信号转导与抗原非依赖性信号转导的比较。通过通过以下测定CAR T细胞信号转导百分比：RFP+GFP+细胞/总GFP+细胞。数据代表2个实验。
图6F显示沿y轴以GFP+指示的CAR转导的细胞。RFP沿x轴显示，其是Nur77表达的替代物。显示的百分比仅属于呈RFP+的经转导的GFP+细胞(仅顶部象限)。
图7A描绘通过自动流动式细胞测量分析定量的短暂表达人G蛋白偶联受体(GPCR)文库之一和细胞质GFP的HEK293细胞与共培养的短暂表达抗GPRC5D scFv克隆物203、长间隔子和细胞质mCherry 761的HEK293细胞(两者均在悬浮液中)的结合。预先指定的显著性临限值(红线)：Z分数3分；p<0.0027。
图7B显示抗GPRC5D scFv克隆物203mIgG2a Fc嵌合抗体与表达指定细胞表面蛋白质的HEK293细胞的结合。显示证实与在关于>4400种跨膜蛋白的微阵列筛选中鉴别的潜在脱靶蛋白质和非特异性结合物的结合。ZsGreen1，转染对照；同型，不相关的scFv-mIgG2aFc阴性对照；CTLA-4/CD86相互作用，阳性对照。
图7C显示关于潜在脱靶蛋白质PCDH1A或FCGR2A经由GPRC5D(203)CAR活化的评价结果。将表达含有GPRC5D(203)CAR和GFP的双顺反子质粒的Jurkat Nur77-RFP活化报导体细胞与表达指定抗原、GPRC5D(阳性对照)或BCMA(阴性对照)的K562细胞共培养。活化以RFP+GFP+细胞/总GFP+细胞％测定。
图7D显示，如通过流动式细胞测量术测量RFP表达的变化所评估的CRISPR-Cas9介导的MM细胞系中GPRC5D基因敲除使GPRC5D(203)CAR-Jurkat Nur77报导体细胞的活化消除。
图8A显示MM细胞系和原发性MM细胞(加框)中的GPRC5D mRNA表达。
图8B显示如通过针对供体相配、模拟转导的CAR T细胞归一化的溶胞百分比指示的在24小时共培养之后表达GPRC5D(203)的CAR T细胞针对MM1.S、OPM2和RPMI-8226靶细胞的细胞毒性的结果(两名供体各自在技术上一式三份；平均值±SD)。
图9A显示如由添加荧光素之后ATP依赖性生物发光指示的在共培养24小时之后，由并入指定scFv的CAR T细胞诱导的OPM2-ffLuc MM细胞的细胞杀伤；针对仅肿瘤细胞对照归一化(自分别一式三份执行的2个实验汇集的数据，平均值±SEM；p<0.001)。
图9B和9C描绘流动式细胞测量术分析，描绘了来自患有多次复发性MM的患者的初代骨髓单核细胞(BMMC)在与抗GPRC5D CAR T细胞以1:1的CAR+ T细胞:BMMC比率共培养过夜之后的杀灭情况。MM细胞，CD138+/CD38hi；曲线针对活的CD3-细胞选通。
图9D描绘关于来自额外患者的初代BMMC的流动式细胞测量术分析，针对CD138+/CD3-标绘。
图10A至10C显示如在上清液中通过多重流式荧光检测术(luminex)分析测量的在与OPM2 MM细胞以1:1共培养或单独培养24小时之后由并入指定scFv的CAR T细胞产生的细胞因子。
图11A和11B显示单独培养，或与B-ALL细胞(Nalm6；GPRC5D-)或与MM细胞(OPM2；内源性GPRC5D+)以1:1比率培养的模拟转导或表达GPRC5D(203)的CAR T细胞的增殖情况且图11C和11D显示其活化。T细胞在共培养之前用CellTrace紫(CTV)染色，并在72小时之后针对CD4、CD8和CD25染色。(A，B)增殖通过CTV荧光的稀释指示。(C，D)活化通过增加的CD25荧光指示。
图12A描绘使用间隔子特异性抗体测量的关于CAR T细胞中CAR表达的代表性FACS分析。
图12B描绘注射OPM2后14天，用含有并入指定抗GPRC5D scFv克隆物的CAR T细胞的3×106个4-1BB治疗的小鼠的存活率(n＝8只/组)。
图12C描绘来自两个实验之一的RPMI-8226异种移植模型中的小鼠肿瘤体积和存活率；中值存活天数29天相对于50天(p<0.05；n＝5只/组，代表两个实验)。
图12D描绘如使用针对间隔子的抗体侦测CAR，通过末梢血液的流动式细胞测量术监测的RPMI-8226异种移植模型中的小鼠肿瘤体积和CAR T细胞扩增情况(p<0.001；n＝10只/组；两个时间点)。
图13A描绘注射OPM2后21天，用经修饰成表达双顺反子构建体的3×106个T细胞基因治疗的小鼠的存活率(n＝5只/组)，该双顺反子构建体编码extGLuc和CAR，该CAR并入scFv CD19(SJ25C1)或GPRC5D(203)以及4-1BB或CD28共刺激结构域。
图13B、C和D描绘来自图13A的小鼠的肿瘤负荷(OPM-ffLuc的D-荧光素生物发光图像[BLI])。
图13E显示在CAR T细胞治疗后第7天对来自图13A的小鼠执行CAR T细胞归巢(extGLuc CAR T细胞的腔肠素BLI)的结果。
图14A和14B显示在注射OPM2后14天给予的以GPRC5D为靶标和以BCMA为靶标的CART细胞疗法的剂量反应(n＝8只小鼠/组)。在图14A中，显示通过OPM-ffLuc的BLI评估的肿瘤负荷。在图14B中，显示存活率百分比(显示的p值是相对于模拟转导或不相关靶向的CAR T细胞)。
图15A-15C描绘在将GPRC5D(203)、抗BCMA或模拟处理的T细胞与二十种不同的正常初代人类细胞类型或OPM2细胞共培养20小时之后的IFN-γ(图15A)、TNF-α(图15B)和IL-2(图15C)水平(平均值±SD)。
图15D描绘针对进补信号转导筛选鼠类和食蟹猕猴交叉反应性scFv克隆物的结果。RFP+％指示以1:1的效应物:靶标比率共培养之后的活化情况(相对于GFP+ CAR转导的细胞)。
图16A-C显示在向小鼠注射3×106个表达含有人类/鼠类交叉反应性抗GPRC5DscFv(克隆物205)的CAR的人T细胞之后的身体质量变化(图16A)、体温(图16B)或OPM2-ffLuc细胞的BLI(图16C)。
图17A显示如在经转导以表达食蟹猕猴交叉反应性GPRC5D CAR或食蟹猕猴GPRC5D的非人类灵长类动物(NHP)T细胞中使用截短的受体替代物标记物所测量的CAR表达的代表性FACs分析。
图17B显示在各种效应物:靶标(E:T)比率下，由针对自体靶标抗原呈现细胞(tAPC)的经转导以表达食蟹猕猴交叉反应性GPRC5D CAR的NHP T细胞或仿真T细胞引起的靶标溶解且图17C显示这些细胞的IFNγ产生情况。
图17D显示在各种效应物:靶标(E:T)比率下，由针对靶标K562或K562-GPRC5D细胞的经转导以表达食蟹猕猴交叉反应性GPRC5D CAR的NHP T细胞或仿真T细胞引起的靶标溶解且图17E显示这些细胞的IFNγ产生情况。
图18A显示在输注之后第21天以末梢血液和骨髓中CAR T细胞存留性量度的编码CAR的DNA的PCR结果。CAR转导的NHP T细胞用作阳性对照。
图18B-D显示在向食蟹猕猴注射经修饰以表达含有人类/食蟹猕猴交叉反应性抗GPRC5D scFv克隆物202的CAR的食蟹猕猴T细胞之后1至21天的病理评价结果。图18B描绘体温，图18C描绘身体质量变化，且图18D描绘身体质量。
图19A描绘在第0天注射1×106个混合OPM2WT细胞和OPM2BCMA-KO(GFP/ffLuc+)细胞群并在第8天和第16天注射3×106个指定CAR T细胞的小鼠在第7天和第15天的BLI图像且图19B描绘其在第34天的图像。n＝5只小鼠/组，代表2个实验。
图20A和20B显示如图19A和19B中所描述的注射OPM2细胞和CAR T细胞混合群的小鼠的骨髓中的OPM2细胞。代表性图为每组3只小鼠。执行活细胞/死细胞选通但未示出(n＝2次重复实验，具有类似的结果)。
图21A显示经由示例性抗BCMA CAR进行的最低进补信号转导。
图21B显示表达示例性抗BCMA CAR的初代人T细胞引起的靶细胞的溶解。
图21C显示表达示例性抗BCMA CAR的初代人T细胞当与靶细胞共培养时的IFN-γ分泌情况。
图22A显示分别在GPRC5D或BCMA基因敲除的OPM2细胞中通过流动式细胞测量术评估的GPRC5D表达或BCMA表达的损失。
图22B显示示例性抗BCMA和抗GPRC5D CAR的抗原特异性活化。
图23显示多发性骨髓瘤细胞系中BCMA和GPRC5D的基因表达量。
图24显示多发性骨髓瘤和对照细胞系中BCMA和GPRC5D蛋白质表达量。
图25A和25B显示注射OPM2 WT细胞(图25A)、OPM2 BCMA KO细胞(图25B；上图)或OPM2 GPRC5D KO细胞(图25B；下图)的小鼠中的OPM2肿瘤负荷。用细胞组合物治疗小鼠，这些细胞组合物含有表达抗BCMA CAR(BCMA)或抗GPRC5D CAR(GPRC5D)的细胞，或含有产生的含有1:1比率的表达抗BCMA CAR的细胞和表达抗GPRC5D CAR的细胞的一组细胞(GPRC5D与BCMA汇集的细胞)。
图26显示注射OPM2肿瘤细胞并用三种不同剂量的表达抗GPRC5D CAR(GPRC5D)或抗BCMA CAR(BCMA)的细胞，或一组表达抗BCMA CAR的细胞和表达抗GPRC5D CAR的细胞(GPRC5D和BCMA汇集的细胞)治疗的小鼠的存活率百分比。
图27显示注射RPMI8226细胞并用三种不同剂量的表达抗GPRC5D CAR(GPRC5D)或抗BCMA CAR(BCMA)的细胞，或一组表达抗BCMA CAR的细胞和表达抗GPRC5D CAR的细胞(GPRC5D和BCMA汇集的细胞)治疗的小鼠中的肿瘤体积。
图28显示来自图27的小鼠的存活率百分比。
图29描绘抗BCMA和抗GPRC5D双重靶向策略。(i)和(ii)表示表达抗BCMA CAR的细胞和表达抗GPRC5D CAR的细胞的集合(GPRC5D和BCMA汇集的细胞)。(iii)和(iv)表示双顺反子构建体，其各自含有通过自裂解肽分隔开的抗BCMA CAR和抗GPRC5D CAR。(v)表示“单柄(single stalk)”CAR方法，其中抗BCMA scFv与抗GPRC5D scFv串联，仅通过连接物分隔开。
图30显示在用来自图29的各自构建体以逆转录病毒转导细胞之后，细胞表面上指定构建体的表达。
图31显示如通过流动式细胞测量分析评估的图29中所描绘的构建体各自的逆转录病毒转导效率。
图32A描绘如由溶解的肿瘤细胞的百分比指示的表达图29中所描绘的构建体的T细胞在与野生型OPM2多发性骨髓瘤细胞系共培养后的细胞毒性。表达CAR的T细胞和靶细胞是以递增的E:T比率培养。
图32B描绘如由溶解的肿瘤细胞的百分比指示的在与BCMA基因敲除的OPM2细胞系共培养后表达图29中所描绘的构建体的细胞的细胞毒性。表达CAR的T细胞与靶细胞是以递增的E:T比率培养。
图33A显示表达指定CAR构建体的T细胞当与表达BCMA和GPRC5D的靶细胞共培养24小时的时候分泌各种细胞因子的能力。
图33B显示表达指定CAR构建体的T细胞当与表达BCMA的GPRC5D阴性靶细胞共培养24小时的时候分泌各种细胞因子的能力。
图33C显示表达指定CAR构建体的T细胞当与表达GPRC5D的BCMA阴性靶细胞共培养24小时的时候分泌各种细胞因子的能力。
图34A描绘在用表达指定CAR的T细胞治疗后，注射OPM2野生型细胞的小鼠的存活率。
图34B描绘在用表达指定CAR的T细胞治疗后，第二次注射BCMA基因敲除的OPM2细胞之后来自图34A的小鼠的存活率。
图35A-C描绘在用3×106个表达CAR的T细胞治疗后，如经由生物发光成像评估的初次注射BCMA基因敲除的OPM2细胞(2×106个)之后30天(图35A)或105天(图35B)，或在第二次注射BCMA基因敲除的OPM2细胞(3×106个)之后36天(图35C)的小鼠体内的肿瘤生长情况。
图36显示在注射2×106个野生型OPM2细胞之后，用较低剂量(5×105个)表达指定CAR的细胞治疗的小鼠的存活率。
图37A-C描绘在用表达指定CAR的细胞治疗的0天(图37A)、15天(图37B)或22天(图37C)之后，如经由生物发光成像评估的注射野生型OPM2细胞的小鼠中的肿瘤负荷。
图38描绘在用5×105个表达指定CAR的细胞治疗后，如经由野生型OPM2细胞和BCMA基因敲除的OPM2细胞的生物发光成像评估的注射野生型OPM2细胞和5-10％BCMA基因敲除的OPM2细胞的混合组合物的小鼠体内的肿瘤负荷。
图39显示在用2.5×105个表达指定CAR的细胞治疗后，注射野生型OPM2细胞和5-10％BCMA基因敲除的OPM2细胞的混合组合物的小鼠的存活率。
图40A-C描绘在用5×105个表达指定CAR的细胞治疗后0天(图40A)、22天(图40B)或34天(图40C)，如经由生物发光成像评估的注射野生型OPM2细胞和5-10％BCMA基因敲除的OPM2细胞的混合组合物的小鼠体内的肿瘤负荷。
图41A和41B显示非密码子趋异的双顺反子构建体中后置CAR(分别为BCMA和GPRC5D)的表达损失。
图42A和42B显示双顺反子构建体的密码子趋异挽救后置CAR(分别为BCMA和GPRC5D)的表达。
图43显示在与靶细胞共培养之后，表达指定CAR的Jurkat Nur77-RFP报导体细胞的刺激。
图44A-C显示在与靶细胞共培养时表达指定CAR的初代人T细胞中IFN-γ、IL-2和TNF-α(分别地)的表达。
图45显示在与OPM2 WT细胞、OPM2 BCMA KO细胞或OPM2 GPRC5D KO细胞共培养时，经指定CAR转导的Jurkat Nur77-RFP报导体细胞的抗原特异性活化。
图46A-C显示当与OPM2 WT细胞、OPM2 BCMA KO细胞或OPM2 GPRC5D KO细胞培养时，表达指定CAR的初代人T细胞中IFN-γ、IL-2和TNF-α(分别地)的表达。
图47A显示注射OPM2 WT细胞并用表达指定CAR的细胞治疗的小鼠体内的肿瘤负荷(如通过BLI评估)。图47B和47C显示注射OPM2 WT与BCMA KO细胞的组合(图47B)或OPM2 WT与GPRC5D KO细胞的组合(图47C)并用表达指定CAR的细胞治疗的小鼠体内的肿瘤负荷(通过由BLI评估)。
图48显示来自图47A-C的小鼠的存活率百分比。
具体实施方式
本申请提供靶向或针对G蛋白偶合受体C类5族成员D(GPRC5D)以及表达GPRC5D的细胞和疾病的嵌合抗原受体(CAR)。也提供经基因工程改造以表达所提供的抗GPRC5D CAR的细胞，诸如T细胞，以及含有此类细胞的组合物。据观察，GPRC5D在某些疾病和病况，诸如恶性病中，或在其组织或细胞上，例如在诸如来自复发性或新诊断的骨髓瘤患者的恶性浆细胞上表达，例如异质地表达，而例如在正常组织上表达极少。在所提供的实施方式中有可用于治疗疾病和病况和/或可用于靶向此类细胞类型的方法，包括编码GPRC5D结合受体(包括嵌合抗原受体(CAR))的核酸分子，和编码的受体(诸如编码的CAR)，以及包含其的组合物和制品。这些受体一般可含有GPRC5D特异性抗体(包括抗原结合抗体片段，诸如重链可变(VH)区、单结构域抗体片段和单链片段，包括scFv)。也提供表达此类GPRC5D结合受体，例如抗GPRC5D CAR和/或含有编码此类受体的核酸的细胞，诸如经基因工程改造或重组的细胞，以及含有此类细胞的组合物和制品和治疗剂。
过继性T细胞疗法，诸如CAR-T细胞疗法在治疗多发性骨髓瘤方面显示出前景，且临床工作主要集中于靶向B细胞成熟抗原(BCMA)。然而，尽管BCMA在许多恶性浆细胞上表达，但在一些情况下，表达量可以为异质的。在一些方面中，靶标抗原表达的异质性可引起变化或不一致的反应。在一些方面中，也已观察到，细胞表面上BCMA的表达因γ分泌酶介导的细胞外结构域脱落而随时间变化。与用CD19和CD22 CAR抗原得到的观察结果类似，据报导，在BCMA靶向T细胞疗法之后复发的多发性骨髓瘤(MM)患者中出现BCMA抗原下调(Brudno等人(2018)J.Clin.Oncol.,JCO2018778084；Cohen等人(2017)Blood 130:505)。另外，在一些情况下，重组受体可展现抗原非依赖性活性或信号转导(又称为“进补信号转导”)，由此可导致不合需要的影响，诸如由表达该重组受体的T细胞的分化和/或耗竭增加引起。在一些方面中，此类活性可能限制T细胞的活性、作用或效力。在一些情况下，在基因工程改造并离体扩增细胞以进行重组受体表达期间，细胞可能因重组受体引起的进补信号转导而展现指示耗竭的表型。在一些情况下，需要替代性或额外MM靶向T细胞疗法。
提供的实施方式是关于作为多发性骨髓瘤的CAR T细胞靶标的GPRC5D。GPRC5D(Uniprot登录号Q9NZD1，例如SEQ ID NO:49中所示)是属于视黄酸诱导性基因-1(retinoicacid-inducible gene-1，RAIG)家族的G蛋白偶联受体C类5族成员D。其是具有七个跨膜螺旋的39kDa G蛋白偶合受体，具有两种报导的同功异型物，且同功异型物差异出现在该蛋白质的细胞内C末端。本申请中的结果显示，GPRC5D在多发性骨髓瘤中高水平表达，且总体而言，其在大部分正常组织中以低水平表达。
本申请中的观察结果展示在多发性骨髓瘤细胞上存在GPRC5D的蛋白质表达，证实其为治疗MM的可行CAR T细胞靶标，包括基于潜在的在靶/脱靶肿瘤毒性的评价。另外，在提供的嵌合抗原受体中有展示低进补信号转导，由此使抗原非依赖性(进补)信号转导的可能性减到最小的嵌合受体。确切地说，本申请所提供的抗GPRC5D CAR包括具有高抗原依赖性活化和最低信号转导的CAR。确切地说，已发现，某些构建体，包括在CAR的抗体片段的细胞外部分中重链可变(VH)和轻链可变(VL)呈特定取向和/或含有某一长度的间隔子的构建体展现出有利的特性，包括相较于替代性抗GPRC5D CAR形式，诸如具有较短间隔子的形式，较高的抗原依赖性活化和较低的进补信号转导。
在一些实施方式中，间隔子一般是位于CAR的细胞外抗原结合结构域与跨膜结构域之间的氨基酸序列，由此将该细胞外抗原结合结构域与该跨膜结构域连接在一起。在抗GPRC5D CAR的特定实施方式中，间隔子是免疫球蛋白，例如来自IgG4或IgG2的一部分，诸如含有铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域的一部分。在此类间隔子中有人类免疫球蛋白或其修饰形式的一部分，包括长度大于125个氨基酸，诸如大于150个氨基酸、大于180个氨基酸、大于200个氨基酸或大于200个氨基酸长度的部分。在一些实施方式中，免疫球蛋白间隔子是混合或嵌合间隔子和/或经修饰，以便减少或防止糖基化。在一些实施方式中，提供的抗GPRC5D CAR包括IgG4/IgG2铰链-IgG4/IgG2 CH2-IgG4 CH3免疫球蛋白混合/修饰的间隔子，诸如SEQ ID NO:17中所示的间隔子。
在一些实施方式中，在本申请所提供的CAR中有由多核苷酸编码的CAR，这些多核苷酸经优化，或含有设计用于优化，诸如针对密码子使用优化的某些特征，以减小RNA异质性和/或修饰，例如增加编码的受体的表达，诸如表面表达，或使多个细胞产物批料中编码的受体的表达，诸如表面表达更一致。在一些实施方式中，编码GPRC5D结合细胞表面蛋白质的多核苷酸与参考多核苷酸相比经修饰，以便移除隐蔽或隐藏的剪接位点，以减小RNA异质性。在一些实施方式中，编码GPRC5D结合细胞表面蛋白质的多核苷酸经密码子优化以诸如用于在哺乳动物(例如人类)细胞中，诸如在人T细胞中表达。在一些方面中，当在细胞中表达时，经修饰的多核苷酸引起表达量，例如表面表达量的改善，例如表达量增加或更均匀或更一致。此类多核苷酸可用于产生表达编码的GPRC5D结合细胞表面蛋白质的基因工程细胞的构建体中。因此，也提供表达由本申请所提供的多核苷酸编码的重组受体的细胞和其在过继细胞疗法中的用途，诸如用于治疗与GPRC5D表达相关的疾病和病症，例如多发性骨髓瘤。
提供利用在自体初代T细胞上表达的抗GPRC5D CAR用作针对多发性骨髓瘤浆细胞的治疗剂的单药疗法。在一些实施方式中，已知或疑似具有或选择的具有较低或无表达BCMA的MM浆细胞，和/或用抗BCMA CAR治疗缓解后复发、难以用抗BCMA CAR治疗、用抗BCMACAR治疗失败或不耐受的受试者可能希望单药疗法。
本申请也提供靶向与特定疾病或病况，诸如多发性骨髓瘤相关的第一抗原和第二抗原的多药靶向策略。在一些实施方式中，多重组受体特异性结合或靶向由相同多核苷酸构建体编码或包括在本申请所提供的细胞、组合物和方法中的不同抗原。在一些实施方式中，复数种抗原，例如第一抗原和第二抗原是在或疑似在所靶向的细胞、组织或疾病或病况上，诸如在癌细胞上表达。在一些方面中，该细胞、组织、疾病或病况是多发性骨髓瘤或多发性骨髓瘤细胞。
举例而言，本申请也提供将表达抗GPRC5D CAR的细胞与表达抗BCMA CAR的细胞的组合用作针对浆细胞的治疗剂的双药疗法靶向方法。在一些方面中，双重靶向方法可以有利地解决与MM浆细胞上BCMA和/或GPRC5D的异质表达相关的限制。据观察，GPRC5D和BCMA在某些疾病和病况，诸如恶性病中，或在其组织或细胞上，例如在诸如来自复发性或新诊断的骨髓瘤患者的恶性浆细胞上表达，例如异质地表达，而例如在正常组织上表达极少。归因于GPRC5D和BCMA在包括癌症在内的各种疾病和病况中的作用，GPRC5D和BCMA成为治疗靶标。
在一些情况下，同时靶向如本申请所提供的两种抗原可以改善患者中的反应深度和耐久性，同时使抗原逃避引起的复发减到最少。如在B细胞恶性病中由来自CAR T细胞试验的数据所证实，对CAR T细胞疗法具有抗性的机制可为靶标抗原的损失或下调(“逃避”)。(Robbie G.Majzner和Crystal L.Mackall,Cancer Discov August 22 2018；DOI10.1158/2159-8290.CD-18-0442)。相较于涉及仅靶向单一抗原的单药疗法，基于靶向两种抗原的此类组合或双重靶向策略可以达成协同的或改善的肿瘤反应。实际上，本申请中的研究展示，BCMA和GPRC5D表达是彼此独立的。双重靶向方法可以有利地解决因抗原损失可能性而引起的问题和/或最大程度地靶向MM中的抗原。本申请中的观察结果展示在多发性骨髓瘤细胞上存在GPRC5D、BCMA或两者的蛋白质表达，证实两种抗原可作为治疗MM的可行CAR T细胞靶标，包括基于潜在的在靶/脱靶肿瘤毒性的评价。
提供的实施方式中有可用于治疗此类疾病和病况和/或可用于靶向此类细胞类型的方法，包括编码GPRC5D结合受体和BCMA结合受体(包括嵌合抗原受体(CAR))的核酸分子，和编码的受体，诸如编码的CAR，以及包含其的组合物和制品。这些受体一般可以含有GPRC5D或BCMA特异性抗体(包括抗原结合抗体片段，诸如重链可变(VH)区、单结构域抗体片段和单链片段，包括单链可变片段(scFv))。也提供表达此类GPRC5D结合受体(例如抗GPRC5D CAR)、BCMA结合性受体(例如抗BCMA CAR)和/或含有编码此类受体的核酸的细胞，诸如经基因工程改造或重组的细胞，以及含有此类细胞的组合物和制品和治疗剂。提供的实施方式中有作为用于表达多种CAR，诸如抗GPRCD CAR和抗BCMA CAR的双顺反子的多核苷酸。本申请中的观察结果展示，细胞中多种CAR，例如抗GPRC5D CAR和抗BCMA CAR的表达可通过使编码一或多种CAR的多核苷酸序列密码子趋异而改善。已发现，编码两种CAR的多核苷酸构建体的密码子趋异性使编码CAR的核苷酸序列的表达改善，该核苷酸序列相对于编码另一CAR的核苷酸序列在3'端(或C末端)。
另外，已发现，提供的含有某一长度的间隔子的CAR展现有利的特性，包括相较于替代性抗GPRC5D或抗BCMA CAR形式，诸如具有较短间隔子的形式，较高的高依赖性活化和较低的进补信号转导。在一些实施方式中，CAR中的间隔子组分一般是位于CAR的细胞外抗原结合结构域与跨膜结构域之间的氨基酸序列，由此将该细胞外抗原结合结构域与该跨膜结构域连接在一起。在抗GPRC5D或抗BCMA CAR的特定实施方式中，间隔子是免疫球蛋白，例如来自IgG4或IgG2的一部分，诸如含有铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域的一部分。在此类间隔子中有人免疫球蛋白或其修饰形式的一部分，包括长度大于125个氨基酸，诸如大于150个氨基酸、大于180个氨基酸、大于200个氨基酸或大于200个氨基酸长度的部分。在一些实施方式中，免疫球蛋白间隔子是混合或嵌合间隔子和/或经修饰，以便减少或防止糖基化。在一些实施方式中，提供的抗GPRC5D或抗BCMA CAR包括IgG4/IgG2铰链-IgG4/IgG2CH2-IgG4 CH3免疫球蛋白混合/修饰的间隔子，诸如SEQ ID NO:17中所示的间隔子。在特定实施方式中，编码CAR的多核苷酸含有经修饰以消除剪接位点，诸如隐蔽剪接和/或受体位点的间隔子区。编码间隔子的示例性核苷酸已有描述。在一些实施方式中，间隔子的编码序列包含SEQ ID NO:48中所示(也如SEQ ID NO:74中所示)的核酸序列。在一些实施方式中，当在细胞(例如T细胞)中表达时，提供的CAR展现减小的RNA异质性。在一些实施方式中，编码CAR的提供的多核苷酸也可经密码子优化以进一步改善表达。
本申请中提及的所有出版物，包括专利文件、科学论文和数据库，均以全文引用的方式并入本申请中用于所有目的，其引用的程度就如同每一个别出版物以引用的方式个别地并入一般。若本申请所阐述的定义与以引用方式并入本申请中的专利、申请、公开申请和其他出版物中所述的定义相反或另外不一致，则相对于以引用方式并入本申请中的定义，以本申请所阐述的定义为准。
本申请所使用的部分标题仅用于组织目的且不应解释为限制所描述的主题内容。
I.GPRC5D结合受体和编码多核苷酸
在一些方面中，提供GPRC5D结合剂，诸如结合GPRC5D分子的重组受体或嵌合抗原受体，和编码GPRC5D结合细胞表面蛋白质，诸如重组受体(例如CAR)的多核苷酸，以及表达此类受体的细胞。GPRC5D结合细胞表面蛋白质一般含有特异性结合至GPRC5D，诸如特异性结合至GPRC5D蛋白质，诸如人GPRC5D蛋白质的抗体(例如抗原结合抗体片段)和/或其他结合肽。在一些方面中，这些药剂结合至GPRC5D的细胞外部分。
提供的多核苷酸中有编码特异性结合GPRC5D的重组受体，诸如抗原受体的多核苷酸。在一些方面中，也提供编码的受体，诸如含有GPRC5D结合多肽的受体，以及其组合物和制品和用途。
这些GPRC5D结合多肽中有抗体，诸如单链抗体(例如抗原结合抗体片段)，或其部分。在一些实例中，重组受体是嵌合抗原受体，诸如含有抗GPRC5D抗体或其抗原结合片段的嵌合抗原受体。提供的多核苷酸可并入构建体中，诸如脱氧核糖核酸(DNA)或RNA构建体中，诸如可引入用于表达编码的重组GPRC5D结合受体的细胞中的构建体中。
1.编码的重组GPRC5D结合受体的组分
提供的GPRC5D结合受体一般含有细胞外结合分子和细胞内信号转导结构域。提供的受体中有含有抗体的多肽，诸如含有抗GPRC5D抗体的重组细胞表面受体。此类受体包括含有此类抗体的嵌合抗原受体。
提供的重组受体中有包括GPRC5D结合片段的抗原受体。这些重组受体包括特异性结合至GPRC5D的抗原受体，诸如含有抗GPRC5D抗体，例如GPRC5D抗原结合片段的抗原受体。这些抗原受体中有功能性非TCR抗原受体，诸如嵌合抗原受体(CAR)。也提供表达这些重组受体的细胞和其在过继细胞疗法中的用途，诸如用于治疗与GPRC5D表达相关的疾病和病症，例如多发性骨髓瘤。
a.细胞外抗原结合结构域
在这些嵌合受体中有嵌合抗原受体(CAR)。这些嵌合受体，诸如CAR一般包括细胞外抗原结合结构域，该细胞外抗原结合结构域包括、是或包含抗GPRC5D抗体。因此，嵌合受体，例如CAR，在其细胞外部分中通常包括一个或多个GPRC5D结合分子，诸如一个或多个抗原结合片段、结构域或部分，或一个或多个抗体可变区、和/或抗体分子，诸如本申请所描述的分子。
术语“抗体”在本申请中是以最广泛意义使用且包括多株和单克隆抗体，包括完整抗体和功能性(抗原结合)抗体片段，包括片段抗原结合片段(Fab)、F(ab')2片段、Fab'片段、Fv片段、重组IgG(rIgG)片段、能够特异性结合抗原的重链可变(VH)区、单链抗体片段，包括单链可变片段(scFv)和单结构域抗体(例如sdAb、sdFv、奈米抗体)片段。该术语涵盖免疫球蛋白的经基因工程改造和/或以其他方式修饰的形式，诸如胞内抗体、肽体、嵌合抗体、完全人类抗体、人类化抗体，和异型缀合抗体、多特异性(例如双特异性或三特异性)抗体、双功能抗体、三功能抗体和四功能抗体、串联二-scFv、串联三-scFv。除非另外陈述，否则术语“抗体”应理解为涵盖其功能性抗体片段，在本申请中又称为“抗原结合片段”。该术语也涵盖完整或全长抗体，包括任何类别或子类的抗体，包括IgG和其子类、IgM、IgE、IgA和IgD。
术语“互补决定区”和“CDR”与“高变区”或“HVR”同义，在此项技术中是已知的，意思指抗体可变区内的不相邻氨基酸序列，其赋予抗原特异性和/或结合亲和力。一般而言，各重链可变区中存在三个CDR(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)且各轻链可变区中存在三个CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)。“构架区”和“FR”在此项技术中是已知的，意思指重链和轻链可变区的非CDR部分。一般而言，各全长重链可变区中存在四个FR(FR-H1、FR-H2、FR-H3和FR-H4)，且各全长轻链可变区中存在四个FR(FR-L1、FR-L2、FR-L3和FR-L4)。
给定CDR或FR的确切氨基酸序列边界可使用多种熟知方案中的任一种容易地测定，包括以下文献中所描述的方案：Kabat等人(1991),“Sequences of Proteins ofImmunological Interest”,第5版Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD(“Kabat”编号方案)；Al-Lazikani等人(1997)JMB 273,927-948(“Chothia”编号方案)；MacCallum等人,J.Mol.Biol.262:732-745(1996),“Antibody-antigen interactions:Contact analysis and binding site topography”,J.Mol.262,732-745.(“接触”编号方案)；Lefranc MP等人,“IMGT unique numbering forimmunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-likedomains”,Dev Comp Immunol,2003年6月；27(1):55-77(“IMGT”编号方案)；Honegger A和Plückthun A,“Yet another numbering scheme for immunoglobulin variabledomains:an automatic modeling and analysis tool”,J Mol Biol,2001年7月8日；309(3):657-70,(“Aho”编号方案)；和Martin等人,“Modeling antibody hypervariableloops:a combined algorithm”,PNAS,1989,86(23):9268-9272,(“AbM”编号方案)。
给定CDR或FR的边界可根据用于标识的方案而变化。举例而言，Kabat方案基于结构比对，而Chothia方案基于结构信息。Kabat与Chothia方案的编号均基于最常用的抗体区序列长度，其中在一些抗体中出现由插入字母(例如“30a”)表示的插入以及缺失。这两个方案将某些插入和缺失(“插入缺失”)放于不同位置，产生不同编号。接触方案基于对复杂晶体结构的分析，且在多个方面与Chothia编号方案类似。AbM方案是基于Oxford Molecular的AbM抗体模型化软件使用的方案确定的在Kabat与Chothia定义之间的折衷。
以下表1列出分别如通过Kabat、Chothia、AbM和接触方案标识的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3和CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3的示例性位置边界。CDR-H1的残基编号使用Kabat与Chothia编号方案列出。FR位于各CDR之间，例如，其中FR-L1位于CDR-L1之前，FR-L2位于CDR-L1与CDR-L2之间，FR-L3位于CDR-L2与CDR-L3之间等等。应注意，由于所示Kabat编号方案将插入放于H35A和H35B处，故取决于环长度，Chothia CDR-H1环的末端在使用所示Kabat编号惯例编号时在H32与H34之间变化。
1-Kabat等人(1991),“Sequences of Proteins of Immunological Interest”,第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD
2-Al-Lazikani等人(1997)JMB 273,927-948
因此，除非另外说明，否则给定抗体或其区域(诸如其可变区)的“CDR”或“互补决定区”或个别指定的CDR(例如CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)应理解为涵盖如通过任一前述方案或其他已知方案定义的互补决定区(或特定互补决定区)。举例而言，在陈述特定CDR(例如CDR-H3)含有给定VH或VL区氨基酸序列中相应CDR的氨基酸序列的情况下，应理解，此类CDR具有如通过任一前述方案或其他已知方案定义的可变区内相应CDR(例如CDR-H3)的序列。在一些实施方式中，指定具体CDR序列。提供的抗体的示例性CDR序列使用各种编号方案描述，但应理解，提供的抗体可包括如根据任一其他前述编号方案或相关技术人员已知的其他编号方案所描述的CDR。
同样，除非另外说明，否则给定抗体或其区域(诸如其可变区)的FR或个别指定的FR(例如FR-H1、FR-H2、FR-H3、FR-H4)应理解为涵盖如通过任一已知方案定义的构架区(或特定构架区)。在一些情况下，指定用于标识特定CDR、FR或多个FR或CDR的方案，诸如通过Kabat、Chothia、AbM或接触方法或其他已知方案定义的CDR。在其他情况下，给出CDR或FR的特定氨基酸序列。
术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链中参与抗体与抗原的结合的结构域。天然抗体的重链和轻链(分别为VH和VL)的可变区一般具有类似结构，且各结构域包含四个保守性构架区(FR)和三个CDR。(参见例如Kindt等人,Kuby Immunology,第6版,W.H.Freeman and Co.,第91页(2007))。单个VH或VL结构域可足以赋予抗原结合特异性。此外，可使用来自结合抗原的抗体的VH或VL结构域分离结合特定抗原的抗体以分别筛选互补VH或VL结构域的文库。(参见例如Portolano等人,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等人,Nature 352:624-628(1991))。
在提供的CAR中所包括的抗体中有抗体片段。“抗体片段”或“抗原结合片段”是指包含完整抗体中结合该完整抗体所结合的抗原的一部分的除完整抗体以外的分子。抗体片段的实例包括(但不限于)Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双功能抗体；线性抗体；重链可变(VH)区、单链抗体分子，诸如scFv和仅包含VH区的单结构域抗体；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。在一些实施方式中，提供的CAR中的抗原结合结构域是或包括含重链可变(VH)和轻链可变(VL)区的抗体片段。在特定实施方式中，抗体是包含重链可变(VH)区和/或轻链可变(VL)区的单链抗体片段，诸如scFv。
单结构域抗体(sdAb)是包含抗体的重链可变区的全部或一部分或轻链可变区的全部或一部分的抗体片段。在某些实施方式中，单结构域抗体是人类单结构域抗体。
抗体片段可通过各种技术制备，包括(但不限于)完整抗体的蛋白质水解消化以及由重组宿主细胞产生。在一些实施方式中，抗体是重组产生的片段，诸如包含呈非天然存在的布置的片段，诸如两个或两个以上抗体区域或链通过合成连接物、例如肽连接物接合的片段，和/或酶消化天然存在的完整抗体不能产生的片段。在一些方面中，抗体片段为scFvs。
“人类化”抗体是全部或基本上全部CDR氨基酸残基均来源于非人CDR且全部或基本上全部FR氨基酸残基均来源于人类FR的抗体。人类化抗体任选可包括来源于人类抗体的抗体恒定区的至少一部分。非人类抗体的“人类化形式”是指已经历人类化，通常用以降低对人类的免疫原性，同时保持亲本非人类抗体的特异性和亲和力的非人类抗体变体。在一些实施方式中，人类化抗体中的一些FR残基经来自非人类抗体(例如作为CDR残基来源的抗体)的相应残基取代，例如用以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
在提供的CAR中所包括的抗GPRC5D抗体中有人类抗体。“人类抗体”是氨基酸序列对应于人类或人类细胞所产生的抗体的氨基酸序列或利用人类抗体谱系或其他人类抗体编码序列(包括人类抗体文库)的非人类来源的抗体。该术语不包括含非人类抗原结合区的非人类抗体的人类化形式，诸如全部或基本上全部CDR是非人CDR的那些。该术语包括人类抗体的抗原结合片段。
人类抗体可通过将免疫原给予转殖基因动物来制备，该转殖基因动物经修饰以响应于抗原攻击而产生完整人类抗体或具有人类可变区的完整抗体。此类动物通常含有人类免疫球蛋白基因座的全部或一部分，其置换内源性免疫球蛋白基因座，或存在于染色体外或随机整合至动物染色体中。在此类转殖基因动物中，内源性免疫球蛋白基因座一般未活化。人类抗体也可来源于人类抗体文库，包括噬菌体呈现文库和无细胞文库，其含有来源于人类谱系的抗体编码序列。
在提供的CAR中所包括的抗体中有作为单克隆抗体的那些，包括单克隆抗体片段。如本申请所使用，术语“单克隆抗体”是指自实质上均质的抗体群获得或在实质上均质的抗体群内的抗体，即，构成该群体的个别抗体除含有天然存在的突变或在制备单克隆抗体制剂期间产生的可能变体以外，其余是一致的，这些变体一般是以微量存在。与通常包括针对不同抗原决定簇的不同抗体的多株抗体制剂相比，单克隆抗体制剂中的每一单克隆抗体是针对抗原上的单一抗原决定簇。该术语不应解释为需要通过任何特定方法来产生抗体。单克隆抗体可通过多种技术制备，包括(但不限于)自融合瘤产生、重组DNA方法、噬菌体呈现和其他抗体呈现方法。
在一些实施方式中，CAR包括抗体分子的一个或多个GPRC5D结合部分，诸如抗体的重链可变(VH)区和/或轻链可变(VL)区，例如scFv抗体片段。在一些实施方式中，提供的GPRC5D结合CAR含有赋予所提供CAR的GPRC5D结合特性的抗体，诸如抗GPRC5D抗体，或其抗原结合片段。在一些实施方式中，抗体或抗原结合结构域可为所描述的任何抗GPRC5D抗体或来源于所描述的任何抗GPRC5D抗体(参见例如WO 2016/090312、WO 2016/090329、WO2018/017786)。此类抗GPRC5D抗体或抗原结合片段中的任一种均可用于所提供的CAR中。在一些实施方式中，抗GPRC5D CAR含有抗原结合结构域，其是含有来源于WO 2016/090312、WO2016/090329或WO 2018/017786中所描述的抗体的重链可变(VH)和/或轻链可变(VL)区的scFv。
在一些实施方式中，抗体，例如抗GPRC5D抗体，或抗原结合片段含有如所描述的重链和/或轻链可变(VH或VL)区序列或其足够抗原结合部分。
在一些实施方式中，抗GPRC5D抗体，例如抗原结合片段，包括含如所描述的CDR-H1、CDR-H2和/或CDR-H3的VH区序列或其足够抗原结合部分。在一些实施方式中，抗GPRC5D抗体，例如抗原结合片段，包括含如所描述的CDR-L1、CDR-L2和/或CDR-L3的VL区序列或其足够抗原结合部分。在一些实施方式中，抗GPRC5D抗体，例如抗原结合片段，包括含如所描述的CDR-H1、CDR-H2和/或CDR-H3的VH区序列，且包括含如所描述的CDR-L1、CDR-L2和/或CDR-L3的VL区序列。另外，在这些抗体中有具有与此类序列至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致的序列的抗体。
在一些实施方式中，所提供的CAR中的抗体或抗体片段具有WO 2016/090312、WO2016/090329和WO 2018/017786中任一个所描述的抗体或抗体结合片段中的任一种的VH区。
在一些实施方式中，CAR含有抗体或其抗原结合片段，其具有重链可变(VH)区，该VH区具有选自SEQ ID NO:21、23、25、27、29、31或33中的任一个的氨基酸序列，或与选自SEQID NO:21、23、25、27、29、31或33中的任一个的VH区氨基酸具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列，或含有此类VH序列中存在的CDR-H1、CDR-H2和/或CDR-H3。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段的VH区包含根据Kabat编号的CDR-H1、CDR-H2和/或CDR-H3。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段的VH区包含根据Chothia编号的CDR-H1、CDR-H2和/或CDR-H3。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段的VH区包含根据AbM编号的CDR-H1、CDR-H2和/或CDR-H3。
在一些实施方式中，CAR含有抗体或其抗原结合片段，其具有重链可变(VH)区，该VH区包括含选自SEQ ID NO:75、78、80、82、90、93、95、97、105、108、110、112、120、123、125、127、135、138、140、142、152、162、165、167和169的氨基酸序列的CDR-H1；(b)含选自SEQ IDNO:76、79、81、83、91、94、96、98、106、109、111、113、121、124、126、128、136、139、141、143、150、153、154、155、163、166、168和170的氨基酸序列的CDR-H2；和(c)含选自SEQ ID NO:77、84、92、99、107、114、122、129、137、144、151、156、164和171的氨基酸序列的CDR-H3。
在一些实施方式中，该抗体或其抗原结合片段包含VH区，其包括分别含以下的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3：SEQ ID NO:75、76和77；SEQ ID NO:78、79和77；SEQID NO:80、81和77；SEQ ID NO:82、83和84；SEQ ID NO:90、91和92；SEQ ID NO:93、94和92；SEQ ID NO:95、96和92；SEQ ID NO:97、98和99；SEQ ID NO:105、106和107；SEQ ID NO:108、109和107；SEQ ID NO:110、111和107；SEQ ID NO:112、113和114；SEQ ID NO:120、121和122；SEQ ID NO:123、124和122；SEQ ID NO:125、126和122；SEQ ID NO:127、128和129；SEQID NO:135、136和137；SEQ ID NO:138、139和137；SEQ ID NO:140、141和137；SEQ ID NO:142、143和144；SEQ ID NO:135、150和151；SEQ ID NO:152、153和151；SEQ ID NO:140、154和151；SEQ ID NO:142、155和156；SEQ ID NO:162、163和164；SEQ ID NO:165、166和164；SEQ ID NO:167、168和164；SEQ ID NO:169、170和171。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含VH区，其包含以下的氨基酸序列：对应地SEQ ID NO:75、76和77；对应地SEQ ID NO:78、79和77；对应地SEQ ID NO:80、81和77；对应地SEQ ID NO:82、83和84；对应地SEQ ID NO:90、91和92；对应地SEQ ID NO:93、94和92；对应地SEQ ID NO:95、96和92；对应地SEQ ID NO:97、98和99；对应地SEQ ID NO:105、106和107；对应地SEQ ID NO:108、109和107；对应地SEQ ID NO:110、111和107；对应地SEQID NO:112、113和114；对应地SEQ ID NO:120、121和122；对应地SEQ ID NO:123、124和122；对应地SEQ ID NO:125、126和122；对应地SEQ ID NO:127、128和129；对应地SEQ ID NO:135、136和137；对应地SEQ ID NO:138、139和137；对应地SEQ ID NO:140、141和137；对应地SEQ ID NO:142、143和144；对应地SEQ ID NO:135、150和151；对应地SEQ ID NO:152、153和151；对应地SEQ ID NO:140、154和151；对应地SEQ ID NO:142、155和156；对应地SEQ IDNO:162、163和164；对应地SEQ ID NO:165、166和164；对应地SEQ ID NO:167、168和164；对应地SEQ ID NO:169、170和171。
在一些实施方式中，该抗体或其抗原结合片段包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其分别包含SEQ ID NO:21、23、25、27、29、31或33中的任一个中所示的VH区氨基酸序列内所包含的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的氨基酸序列。
在本申请所提供的抗体或其抗原结合片段的一些实施方式中，VH区包含如所描述的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3中的任一个且包含分别与SEQ ID NO:21、23、25、27、29、31或33中的任一个中所示的VH区氨基酸序列内所包含的FR1、FR2、FR3和/或FR4具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的构架区1(FR1)、FR2、FR3和/或FR4。
在一些实施方式中，该抗体或其抗原结合片段包括含SEQ ID NO:21、23、25、27、29、31或33中的任一个中所示的氨基酸序列的VH区。
在一些实施方式中，提供的CAR(例如抗GPRC5D CAR)中包含VH区的抗体或抗体片段进一步包含轻链或其足够抗原结合部分。举例而言，在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段含有VH区和VL区，或VH和VL区的足够抗原结合部分。在此类实施方式中，VH区序列可为上文所描述的VH序列中的任一个。在一些此类实施方式中，抗体是抗原结合片段，诸如Fab或scFv。在一些此类实施方式中，抗体是另外含有恒定区的全长抗体。
在一些实施方式中，本申请所提供的CAR包括含以上VH区中的任一个且含有轻链可变区或其足够抗原结合部分的抗体，诸如抗GPRC5D抗体，或其抗原结合片段。举例而言，在一些实施方式中，CAR包括含VH区和轻链可变(VL)区、或VH和VL区的足够抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段。在此类实施方式中，VH区序列可为上文所描述的VH序列中的任一个。在一些此类实施方式中，抗体是抗原结合片段，诸如Fab或scFv。在一些此类实施方式中，抗体是另外含有恒定区的全长抗体。
在一些实施方式中，抗体或抗原结合片段具有WO 2016/090312、WO 2016/090329和WO 2018/017786中的任一个中所描述的VL区。
在一些实施方式中，CAR含有抗体或其抗原结合片段，其具有轻链可变(VL)区，该VL区具有选自SEQ ID NO:22、24、26、28、30、32、34、63、64、65、66、67、68或69中的任一个的氨基酸序列，或与选自SEQ ID NO:22、24、26、28、30、32、34、63、64、65、66、67、68或69中的任一个的VL区氨基酸具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列，或含有此类VL序列中存在的CDR-L1、CDR-L2和/或CDR-L3。在一些实施方式中，CAR含有抗体或其抗原结合片段，其具有轻链可变(VL)区，该VL区具有选自SEQ ID NO:22、24、26、28、30、32或34中的任一个的氨基酸序列，或与选自SEQ ID NO:22、24、26、28、30、32或34中的任一个的VL区氨基酸具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列，或含有此类VL序列中存在的CDR-L1、CDR-L2和/或CDR-L3。在一些实施方式中，CAR含有抗体或其抗原结合片段，其具有轻链可变(VL)区，该VL区具有选自SEQ ID NO:63、64、65、66、67、68或69中的任一个的氨基酸序列，或与选自SEQ ID NO:63、64、65、66、67、68或69中的任一个的VL区氨基酸具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列，或含有此类VL序列中存在的CDR-L1、CDR-L2和/或CDR-L3。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段的VL区包含根据Kabat编号的CDR-L1、CDR-L2和/或CDR-L3。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段的VL区包含根据Chothia编号的CDR-L1、CDR-L2和/或CDR-L3。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段的VL区包含根据AbM编号的CDR-L1、CDR-L2和/或CDR-L3。
在一些实施方式中，CAR含有抗体或其抗原结合片段，其具有轻链可变(VL)区，该VL区包括含选自SEQ ID NO:85、88、100、103、115、118、130、133、145、148、157、160、172和174的氨基酸序列的CDR-L1；(b)含选自SEQ ID NO:86、89、101、104、116、119、131、134、146、149、158和161的氨基酸序列的CDR-L2；和(c)含选自SEQ ID NO:87、102、117、132、147、159、173和175的氨基酸序列的CDR-L3。
在一些实施方式中，该抗体或其抗原结合片段包含VL区，其包括分别含以下的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3：SEQ ID NO:85、86和87；SEQ ID NO:88、89和87；SEQID NO:100、101和102；SEQ ID NO:103、104和102；SEQ ID NO:115、116和117；SEQ ID NO:118、119和117；SEQ ID NO:130、131和132；SEQ ID NO:133、134和132；SEQ ID NO:145、146和147；SEQ ID NO:148、149和147；SEQ ID NO:157、158和159；SEQ ID NO:160、161和159；SEQ ID NO:172、86和173；SEQ ID NO:174、89和175；SEQ ID NO:174、89和297。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含VL区，其包含以下的氨基酸序列：分别为SEQ ID NO:85、86和87；分别为SEQ ID NO:88、89和87；分别为SEQ ID NO:100、101和102；分别为SEQ ID NO:103、104和102；分别为SEQ ID NO:115、116和117；分别为SEQ IDNO:118、119和117；分别为SEQ ID NO:130、131和132；分别为SEQ ID NO:133、134和132；分别为SEQ ID NO:145、146和147；分别为SEQ ID NO:148、149和147；分别为SEQ ID NO:157、158和159；分别为SEQ ID NO:160、161和159；分别为SEQ ID NO:172、86和173；分别为SEQID NO:174、89和175；分别为SEQ ID NO:174、89和297。
在一些实施方式中，该抗体或其抗原结合片段含有选自SEQ ID NO:22、24、26、28、30、32、34、63、64、65、66、67、68或69中的任一个的VL区氨基酸序列内分别包含的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一些实施方式中，该抗体或其抗原结合片段含有选自SEQ ID NO:22、24、26、28、30、32或34中的任一个的VL区氨基酸序列内分别包含的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一些实施方式中，该抗体或其抗原结合片段含有选自SEQ ID NO:63、64、65、66、67、68或69中的任一个的VL区氨基酸序列内分别包含的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
在本申请所提供的CAR中有这样一种CAR，其中提供的CAR中的抗体，诸如抗GPRC5D抗体或抗体片段包含与SEQ ID NO:21、23、25、27、29、31或33中的任一个中所示的氨基酸序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的VH区氨基酸序列，和含与SEQ ID NO:22、24、26、28、30、32、34、63、64、65、66、67、68或69中的任一个中所示的氨基酸序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列的VL区。
在一些实施方式中，该抗体或其抗原结合片段的VH区包括分别含选自SEQ ID NO:21、23、25、27、29、31或33中的任一个的VH区氨基酸序列内所包含的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3；且包括分别含选自SEQ ID NO:22、24、26、28、30、32、34、63、64、65、66、67、68或69中的任一个的VL区氨基酸序列内所包含的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3。
在一些实施方式中，该抗体或其抗原结合片段的VH区包含SEQ ID NO:21、23、25、27、29、31或33的氨基酸序列且该抗体或抗原结合片段的VL区包含SEQ ID NO:22、24、26、28、30、32或34的氨基酸序列。在一些实施方式中，该抗体或其抗原结合片段的VH和VL区分别包含以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:21和22；SEQ ID NO:23和24；SEQ ID NO:25和26；SEQID NO:27和28；SEQ ID NO:29和30；SEQ ID NO:31和32；或SEQ ID NO:33和34，或与以上VH和VL中的任一个具有至少90％序列一致性，诸如与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的任何抗体或其抗原结合片段。
举例而言，其中提供的抗体或其抗原结合片段的VH和VL区包含分别选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:21和22；SEQ ID NO:23和24；SEQ ID NO:25和26；SEQ ID NO:27和28；SEQ ID NO:29和30；SEQ ID NO:31和32；SEQ ID NO:33和34。在其他实例中，其中提供的抗体或其抗原结合片段的VH和VL区包含分别选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:21和63；SEQID NO:23和64；SEQ ID NO:25和65；SEQ ID NO:27和66；SEQ ID NO:29和67；SEQ ID NO:31和68；SEQ ID NO:33和69。
在一些实施方式中，提供的CAR中的抗体或其抗原结合片段是单链抗体片段，诸如单链可变片段(scFv)、或双功能抗体、或单结构域抗体(sdAb)。在一些实施方式中，抗体或抗原结合片段是仅包含VH区的单结构域抗体。
在一些实施方式中，抗体或抗原结合片段是包含重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区的scFv。在一些实施方式中，单链抗体片段(例如scFv)包括接合两个抗体结构域或区域，诸如重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区的一个或多个连接物。连接物通常是肽连接物，例如柔性和/或可溶性肽连接物。在这些连接物中有富含甘氨酸和丝氨酸和/或在一些情况下富含苏氨酸的连接物。在一些实施方式中，连接物进一步包括能够改善溶解度的带电残基，诸如赖氨酸和/或谷氨酸。在一些实施方式中，连接物进一步包括一个或多个脯氨酸。
因此，所提供的CAR含有抗GPRC5D抗体，其包括单链抗体片段，诸如scFv和双功能抗体，尤其是人类单链抗体片段，通常包含接合两个抗体结构域或区域，即这些VH和VL区的连接物。连接物通常是肽连接物，例如柔性和/或可溶性肽连接物，诸如富含甘氨酸和丝氨酸的肽连接物。
在一些方面中，富含甘氨酸和丝氨酸(和/或苏氨酸)的连接物包括至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的此类氨基酸。在一些实施方式中，其包括至少或至少约50％、55％、60％、70％或75％的甘氨酸、丝氨酸和/或苏氨酸。在一些实施方式中，连接物基本上完全由甘氨酸、丝氨酸和/或苏氨酸构成。连接物的长度一般在约5个与约50个氨基酸之间，通常在或在约10个与或与约30个之间，例如为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个，且在一些实例中，长度在10个与25个氨基酸之间。示例性连接物包括具有各种数量的序列GGGGS(4GS；SEQ IDNO:50)或GGGS(3GS；SEQ ID NO:51)的重复(诸如在2、3、4与5个之间的此类序列的重复)的连接物。示例性连接物包括具有SEQ ID NO:52中所示的序列(GGGGSGGGGSGGGGS)或由其组成的连接物。示例性连接物进一步包括具有SEQ ID NO:53中所示的序列(GSTSGSGKPGSGEGSTKG)或由其组成的连接物。示例性连接物进一步包括具有SEQ ID NO:54中所示的序列(SRGGGGSGGGGSGGGGSLEMA)或由其组成的连接物。示例性连接物包括具有SEQID NO:47中所示的序列(GSRGGGGSGGGGSGGGGSLEMA)或由其组成的连接物。
因此，在一些实施方式中，所提供的实施方式包括含前述连接物中的一个或多个的单链抗体片段，例如scFv，这些连接物为诸如富含甘氨酸/丝氨酸的连接物，包括具有GGGS(SEQ ID NO:51)或GGGGS(SEQ ID NO:50)的重复的连接物，诸如SEQ ID NO:47、52或54中所示的连接物。
在一些实施方式中，VH区可在VL区的氨基末端。在一些实施方式中，VH区可在VL区的羧基末端。在特定实施方式中，片段，例如scFv，可包括VH区或其部分，随后为连接物，随后为VL区或其部分。在其他实施方式中，片段，例如scFv，可包括VL区或其部分，随后为连接物，随后为VH区或其部分。
在一些方面中，本申请所提供的scFv包含选自SEQ ID NO:1-14中的任一个的氨基酸序列，或具有与选自SEQ ID NO:1-14中的任一个的氨基酸序列至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。
在提供的抗GPRC5D CAR中有这样一种CAR，其中抗体或抗原结合片段含有VH区，其包含SEQ ID NO:21中所示的序列或与SEQ ID NO:21具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；且含有VL区，其包含SEQ ID NO:22中所示的序列或与SEQ ID NO:22具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％至少或至少约至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列。在一些实施方式中，提供的CAR是这样一种CAR，其中抗体或抗原结合片段含有VH区，其包含SEQ ID NO:21中所示的序列或与SEQ IDNO:21具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；且含有VL区，其包含SEQ ID NO:63中所示的序列或与SEQ ID NO:63具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列。在一些实施方式中，提供的CAR中的抗体或抗原结合片段含有：VH区，其具有分别含SEQ ID NO:75、76和77的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和VL区，其具有分别含SEQ ID NO:85、86和87的氨基酸序列的CDRL1、CDRL2和CDRL3。在一些实施方式中，提供的CAR中的抗体或抗原结合片段含有：VH区，其具有分别含SEQ ID NO:78、79和77的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和VL区，其含有分别含SEQ ID NO:85、86和87的氨基酸序列的CDRL1、CDRL2和CDRL3。在一些实施方式中，提供的CAR中的抗体或抗原结合片段含有：VH区，其具有分别含SEQ ID NO:80、81和77的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和VL区，其含有分别含SEQ ID NO:85、86和87的氨基酸序列的CDRL1、CDRL2和CDRL3。在一些实施方式中，提供的CAR中的抗体或抗原结合片段含有：VH区，其具有分别含SEQ ID NO:82、83和84的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和VL区，其含有分别含SEQ ID NO:88、89和87的氨基酸序列的CDRL1、CDRL2和CDRL3。在一些实施方式中，该VH区包含SEQ ID NO:21中所示的序列且该VL区包含SEQ ID NO:22中所示的序列。在一些实施方式中，该VH区包含SEQ ID NO:21中所示的序列且该VL区包含SEQ ID NO:63中所示的序列。在一些实施方式中，该抗体或抗原结合片段是单链抗体片段，诸如scFv。在一些实施方式中，scFv包含SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致的氨基酸序列。在一些实施方式中，scFv由SEQ ID NO:257中所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO:257至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致的核苷酸序列编码。在一些实施方式中，scFv包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:2至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致的氨基酸序列。在一些实施方式中，scFv由SEQ ID NO:258中所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO:258至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致的核苷酸序列编码。
提供的抗GPRC5D CAR是这样一种CAR，其中该抗体或抗原结合片段含有VH区，其包含SEQ ID NO:23中所示的序列或与SEQ ID NO:23具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；且含有VL区，其包含SEQ ID NO:24中所示的序列或与SEQ ID NO:24具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列。在一些实施方式中，提供的CAR是这样一种CAR，其中该抗体或抗原结合片段含有VH区包含SEQ ID NO:23中所示的序列或与SEQ ID NO:23具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；且含有VL区，其包含SEQ ID NO:64中所示的序列或与SEQ ID NO:64具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列。在一些实施方式中，提供的CAR中的抗体或抗原结合片段含有：VH区，其具有分别含SEQ ID NO:90、91、92的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和VL区，其具有分别含SEQ ID NO:100、101和102的氨基酸序列的CDRL1、CDRL2和CDRL3。在一些实施方式中，提供的CAR中的抗体或抗原结合片段含有：VH区，其具有分别含SEQ ID NO:93、94和92的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和VL区，其含有分别含SEQ ID NO:100、101和102的氨基酸序列的CDRL1、CDRL2和CDRL3。在一些实施方式中，提供的CAR中的抗体或抗原结合片段含有：VH区，其具有分别含SEQ ID NO:95、96和92的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和VL区，其含有分别含SEQ ID NO:100、101和102的氨基酸序列的CDRL1、CDRL2和CDRL3。在一些实施方式中，提供的CAR中的抗体或抗原结合片段含有：VH区，其具有分别含SEQ ID NO:97、98和99的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和VL区，其含有分别含SEQ ID NO:103、104和102的氨基酸序列的CDRL1、CDRL2和CDRL3。在一些实施方式中，该VH区包含SEQ ID NO:23中所示的序列且该VL区包含SEQ ID NO:24中所示的序列。在一些实施方式中，该VH区包含SEQ ID NO:23中所示的序列且该VL区包含SEQ ID NO:64中所示的序列。在一些实施方式中，该抗体或抗原结合片段是单链抗体片段，诸如scFv。在一些实施方式中，scFv包含SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:3至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致的氨基酸序列。在一些实施方式中，scFv由SEQ ID NO:259中所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO:259至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致的核苷酸序列编码。在一些实施方式中，scFv包含SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:4至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致的氨基酸序列。在一些实施方式中，scFv由SEQ ID NO:260中所示的核苷酸序列或与SEQID NO:260至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致的核苷酸序列编码。
提供的抗GPRC5D CAR中有这样一种CAR，其中该抗体或抗原结合片段含有VH区，其包含SEQ ID NO:25中所示的序列或与SEQ ID NO:25具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；且含有VL区，其包含SEQ ID NO:26中所示的序列或与SEQ ID NO:26具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列。在一些实施方式中，提供的CAR是这样一种CAR，其中该抗体或抗原结合片段含有VH区，其包含SEQ ID NO:25中所示的序列或与SEQ ID NO:25具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；且含有VL区，其包含SEQ ID NO:65中所示的序列或与SEQ ID NO:65具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列。在一些实施方式中，提供的CAR中的抗体或抗原结合片段含有：VH区，其具有分别含SEQ ID NO:105、106、107的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和VL区，其具有分别含SEQ ID NO:115、116和117的氨基酸序列的CDRL1、CDRL2和CDRL3。在一些实施方式中，提供的CAR中的抗体或抗原结合片段含有：VH区，其具有分别含SEQ ID NO:108、109和107的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和VL区，其含有分别含SEQ ID NO:115、116和117的氨基酸序列的CDRL1、CDRL2和CDRL3。在一些实施方式中，提供的CAR中的抗体或抗原结合片段含有：VH区，其具有分别含SEQ IDNO:110、111和107的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和VL区，其含有分别含SEQ ID NO:115、116和117的氨基酸序列的CDRL1、CDRL2和CDRL3。在一些实施方式中，提供的CAR中的抗体或抗原结合片段含有：VH区，其具有分别含SEQ ID NO:112、113和114的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和VL区，其含有分别含SEQ ID NO:118、119和117的氨基酸序列的CDRL1、CDRL2和CDRL3。在一些实施方式中，该VH区包含SEQ ID NO:25中所示的序列且该VL区包含SEQ ID NO:26中所示的序列。在一些实施方式中，该VH区包含SEQ ID NO:25中所示的序列且该VL区包含SEQ ID NO:65中所示的序列。在一些实施方式中，该抗体或抗原结合片段是单链抗体片段，诸如scFv。在一些实施方式中，scFv包含SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:5至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致的氨基酸序列。在一些实施方式中，scFv由SEQ ID NO:261中所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO:261至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致的核苷酸序列编码。在一些实施方式中，scFv包含SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:6至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致的氨基酸序列。在一些实施方式中，scFv由SEQ IDNO:262中所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO:262至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致的核苷酸序列编码。
提供的抗GPRC5D CAR中有这样一种CAR，其中该抗体或抗原结合片段含有VH区，其包含SEQ ID NO:27中所示的序列或与SEQ ID NO:27具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；且含有VL区，其包含SEQ ID NO:28中所示的序列或与SEQ ID NO:28具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列。在一些实施方式中，提供的CAR是这样一种CAR，其中该抗体或抗原结合片段含有VH区，其包含SEQ ID NO:27中所示的序列或与SEQ ID NO:27具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；且含有VL区，其包含SEQ ID NO:66中所示的序列或与SEQ ID NO:66具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列。在一些实施方式中，提供的CAR中的抗体或抗原结合片段含有：VH区，其具有分别含SEQ ID NO:120、121和122的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和VL区，其具有分别含SEQ ID NO:130、131和132的氨基酸序列的CDRL1、CDRL2和CDRL3。在一些实施方式中，提供的CAR中的抗体或抗原结合片段含有：VH区，其具有分别含SEQ ID NO:123、124和122的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和VL区，其含有分别含SEQ ID NO:130、131和132的氨基酸序列的CDRL1、CDRL2和CDRL3。在一些实施方式中，提供的CAR中的抗体或抗原结合片段含有：VH区，其具有分别含SEQ IDNO:125、126和122的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和VL区，其含有分别含SEQ ID NO:130、131和132的氨基酸序列的CDRL1、CDRL2和CDRL3。在一些实施方式中，提供的CAR中的抗体或抗原结合片段含有：VH区，其具有分别含SEQ ID NO:127、128和129的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和VL区，其含有分别含SEQ ID NO:133、134和132的氨基酸序列的CDRL1、CDRL2和CDRL3。在一些实施方式中，该VH区包含SEQ ID NO:27中所示的序列且该VL区包含SEQ ID NO:28中所示的序列。在一些实施方式中，该VH区包含SEQ ID NO:27中所示的序列且该VL区包含SEQ ID NO:66中所示的序列。在一些实施方式中，该抗体或抗原结合片段是单链抗体片段，诸如scFv。在一些实施方式中，scFv包含SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:7至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致的氨基酸序列。在一些实施方式中，scFv由SEQ ID NO:263中所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO:263至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致的核苷酸序列编码。在一些实施方式中，scFv包含SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:8至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致的氨基酸序列。在一些实施方式中，scFv由SEQ IDNO:264中所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO:264至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致的核苷酸序列编码。
提供的抗GPRC5D CAR中有这样一种CAR，其中该抗体或抗原结合片段含有VH区，其包含SEQ ID NO:29中所示的序列或与SEQ ID NO:29具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；且含有VL区，其包含SEQ ID NO:30中所示的序列或与SEQ ID NO:30具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列。在一些实施方式中，提供的CAR是这样一种CAR，其中该抗体或抗原结合片段含有VH区，其包含SEQ ID NO:29中所示的序列或与SEQ ID NO:29具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；且含有VL区，其包含SEQ ID NO:67中所示的序列或与SEQ ID NO:67具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列。在一些实施方式中，提供的CAR中的抗体或抗原结合片段含有：VH区，其具有分别含SEQ ID NO:135、136和137的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和VL区，其具有分别含SEQ ID NO:145、146和147的氨基酸序列的CDRL1、CDRL2和CDRL3。在一些实施方式中，提供的CAR中的抗体或抗原结合片段含有：VH区，其具有分别含SEQ ID NO:138、139和137的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和VL区，其含有分别含SEQ ID NO:145、146和147的氨基酸序列的CDRL1、CDRL2和CDRL3。在一些实施方式中，提供的CAR中的抗体或抗原结合片段含有：VH区，其具有分别含SEQ IDNO:140、141和137的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和VL区，其含有分别含SEQ ID NO:145、146和147的氨基酸序列的CDRL1、CDRL2和CDRL3。在一些实施方式中，提供的CAR中的抗体或抗原结合片段含有：VH区，其具有分别含SEQ ID NO:142、143和144的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和VL区，其含有分别含SEQ ID NO:148、149和147的氨基酸序列的CDRL1、CDRL2和CDRL3。在一些实施方式中，该VH区包含SEQ ID NO:29中所示的序列且该VL区包含SEQ ID NO:30中所示的序列。在一些实施方式中，该VH区包含SEQ ID NO:29中所示的序列且该VL区包含SEQ ID NO:67中所示的序列。在一些实施方式中，该抗体或抗原结合片段是单链抗体片段，诸如scFv。在一些实施方式中，scFv包含SEQ ID NO:9中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:9至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致的氨基酸序列。在一些实施方式中，scFv由SEQ ID NO:265中所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO:265至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致的核苷酸序列编码。在一些实施方式中，scFv包含SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:10至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致的氨基酸序列。在一些实施方式中，scFv由SEQ IDNO:266中所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO:266至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致的核苷酸序列编码。
提供的抗GPRC5D CAR中有这样一种CAR，其中该抗体或抗原结合片段含有VH区，其包含SEQ ID NO:31中所示的序列或与SEQ ID NO:31具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；且含有VL区，其包含SEQ ID NO:32中所示的序列或与SEQ ID NO:32具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列。在一些实施方式中，提供的CAR是这样一种CAR，其中该抗体或抗原结合片段含有VH区，其包含SEQ ID NO:31中所示的序列或与SEQ ID NO:31具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；且含有VL区，其包含SEQ ID NO:68中所示的序列或与SEQ ID NO:68具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列。在一些实施方式中，提供的CAR中的抗体或抗原结合片段含有：VH区，其具有分别含SEQ ID NO:135、150和151的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和VL区，其具有分别含SEQ ID NO:157、158和159的氨基酸序列的CDRL1、CDRL2和CDRL3。在一些实施方式中，提供的CAR中的抗体或抗原结合片段含有：VH区，其具有分别含SEQ ID NO:152、153和151的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和VL区，其含有分别含SEQ ID NO:157、158和159的氨基酸序列的CDRL1、CDRL2和CDRL3。在一些实施方式中，提供的CAR中的抗体或抗原结合片段含有：VH区，其具有分别含SEQ IDNO:140、154和151的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和VL区，其含有分别含SEQ ID NO:157、158和159的氨基酸序列的CDRL1、CDRL2和CDRL3。在一些实施方式中，提供的CAR中的抗体或抗原结合片段含有：VH区，其具有分别含SEQ ID NO:142、155和156的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和VL区，其含有分别含SEQ ID NO:160、161和159的氨基酸序列的CDRL1、CDRL2和CDRL3。在一些实施方式中，该VH区包含SEQ ID NO:31中所示的序列且该VL区包含SEQ ID NO:32中所示的序列。在一些实施方式中，该VH区包含SEQ ID NO:31中所示的序列且该VL区包含SEQ ID NO:68中所示的序列。在一些实施方式中，该抗体或抗原结合片段是单链抗体片段，诸如scFv。在一些实施方式中，scFv包含SEQ ID NO:11中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:11至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致的氨基酸序列。在一些实施方式中，scFv由SEQ ID NO:267中所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO:267至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致的核苷酸序列编码。在一些实施方式中，scFv包含SEQ ID NO:12中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:12至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致的氨基酸序列。在一些实施方式中，scFv由SEQ IDNO:268中所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO:268至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致的核苷酸序列编码。
提供的抗GPRC5D CAR中有这样一种CAR，其中该抗体或抗原结合片段含有VH区，其包含SEQ ID NO:33中所示的序列或与SEQ ID NO:33具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；且含有VL区，其包含SEQ ID NO:34中所示的序列或与SEQ ID NO:34具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列。在一些实施方式中，提供的CAR是这样一种CAR，其中该抗体或抗原结合片段含有VH区，其包含SEQ ID NO:33中所示的序列或与SEQ ID NO:33具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；且含有VL区，其包含SEQ ID NO:69中所示的序列或与SEQ ID NO:69具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列。在一些实施方式中，提供的CAR中的抗体或抗原结合片段含有：VH区，其具有分别含SEQ ID NO:162、163和164的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和VL区，其具有分别含SEQ ID NO:172、86、173的氨基酸序列的CDRL1、CDRL2和CDRL3。在一些实施方式中，提供的CAR中的抗体或抗原结合片段含有：VH区，其具有分别含SEQ ID NO:165、166和164的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和VL区，其含有分别含SEQ ID NO:172、86和173的氨基酸序列的CDRL1、CDRL2和CDRL3。在一些实施方式中，提供的CAR中的抗体或抗原结合片段含有：VH区，其具有分别含SEQ ID NO:167、168和164的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和VL区，其含有分别含SEQ ID NO:172、86和173的氨基酸序列的CDRL1、CDRL2和CDRL3。在一些实施方式中，提供的CAR中的抗体或抗原结合片段含有：VH区，其具有分别含SEQ ID NO:169、170、171的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和VL区，其含有分别含SEQ ID NO:174、89和175的氨基酸序列的CDRL1、CDRL2和CDRL3。在一些实施方式中，提供的CAR中的抗体或抗原结合片段含有：VH区，其具有分别含SEQ ID NO:169、170、171的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和VL区，其含有分别含SEQ ID NO:174、89和297的氨基酸序列的CDRL1、CDRL2和CDRL3。在一些实施方式中，该VH区包含SEQ ID NO:33中所示的序列且该VL区包含SEQ ID NO:34中所示的序列。在一些实施方式中，该VH区包含SEQ ID NO:33中所示的序列且该VL区包含SEQ ID NO:69中所示的序列。在一些实施方式中，该抗体或抗原结合片段是单链抗体片段，诸如scFv。在一些实施方式中，scFv包含SEQ ID NO:13中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:13至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致的氨基酸序列。在一些实施方式中，scFv由SEQ ID NO:269中所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO:269至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致的核苷酸序列编码。在一些实施方式中，scFv包含SEQ ID NO:14中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:14至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致的氨基酸序列。在一些实施方式中，scFv由SEQ ID NO:270中所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO:270至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致的核苷酸序列编码。
在所提供的CAR中的抗体，例如抗原结合片段中有人类抗体。在所提供的人抗GPRC5D抗体，例如抗原结合片段的一些实施方式中，人类抗体含有VH区，其包含与由生殖系核苷酸人类重链V区段编码的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的部分、与由生殖系核苷酸人类重链D区段编码的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的部分、和/或与由生殖系核苷酸人类重链J区段编码的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的部分；和/或含有VL区，其包含与由生殖系核苷酸人类κ或λ链V区段编码的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的部分和/或与由生殖系核苷酸人类κ或λ链J区段编码的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的部分。在一些实施方式中，VH区的该部分对应于CDR-H1、CDR-H2和/或CDR-H3。在一些实施方式中，VH区的该部分对应于构架区1(FR1)、FR2、FR2和/或FR4。在一些实施方式中，VL区的该部分对应于CDR-L1、CDR-L2和/或CDR-L3。在一些实施方式中，VL区的该部分对应于FR1、FR2、FR2和/或FR4。
在一些实施方式中，人类抗体，例如抗原结合片段，含有与由生殖系核苷酸人类重链V区段编码的序列内的相应CDR-H1区的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的CDR-H1。举例而言，在一些实施方式中，人类抗体含有的CDR-H1具有与由生殖系核苷酸人类重链V区段编码的序列内的相应CDR-H1区100％一致、或与其有不超过一个、两个或三个氨基酸差异的序列。
在一些实施方式中，人类抗体，例如抗原结合片段，含有与由生殖系核苷酸人类重链V区段编码的序列内的相应CDR-H2区的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的CDR-H2。举例而言，在一些实施方式中，人类抗体含有的CDR-H2具有与由生殖系核苷酸人类重链V区段编码的序列内的相应CDR-H2区100％一致、或与其有不超过一个、两个或三个氨基酸差异的序列。
在一些实施方式中，人类抗体，例如抗原结合片段，含有与由生殖系核苷酸人类重链V区段、D区段和J区段编码的序列内的相应CDR-H3区的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的CDR-H3。举例而言，在一些实施方式中，人类抗体含有的CDR-H3具有与由生殖系核苷酸人类重链V区段、D区段和J区段编码的序列内的相应CDR-H3区100％一致、或与其有不超过一个、两个或三个氨基酸差异的序列。
在一些实施方式中，人类抗体，例如抗原结合片段，含有与由生殖系核苷酸人类轻链V区段编码的序列内的相应CDR-L1区的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的CDR-L1。举例而言，在一些实施方式中，人类抗体含有的CDR-L1具有与由生殖系核苷酸人类轻链V区段所编码的序列内的相应CDR-L1区100％一致、或与其有不超过一个、两个或三个氨基酸差异的序列。
在一些实施方式中，人类抗体，例如抗原结合片段，含有与由生殖系核苷酸人类轻链V区段编码的序列内的相应CDR-L2区的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的CDR-L2。举例而言，在一些实施方式中，人类抗体含有的CDR-L2具有与由生殖系核苷酸人类轻链V区段编码的序列内的相应CDR-L2区100％一致、或与其有不超过一个、两个或三个氨基酸差异的序列。
在一些实施方式中，人类抗体，例如抗原结合片段，含有与由生殖系核苷酸人类轻链V区段和J区段编码的序列内的相应CDR-L3区的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的CDR-L3。举例而言，在一些实施方式中，人类抗体含有的CDR-L3具有与由生殖系核苷酸人类轻链V区段和J区段编码的序列内的相应CDR-L3区100％一致、或与其有不超过一个、两个或三个氨基酸差异的序列。
在一些实施方式中，人类抗体，例如抗原结合片段，包括含人类生殖系基因区段序列的构架区。举例而言，在一些实施方式中，人类抗体含有VH区，其中构架区，例如FR1、FR2、FR3和FR4与由人类生殖系抗体区段，诸如V区段和/或J区段编码的构架区具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性。在一些实施方式中，人类抗体含有VL区，其中构架区，例如FR1、FR2、FR3和FR4与由人类生殖系抗体区段，诸如V区段和/或J区段编码的构架区具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性。举例而言，在一些此类实施方式中，VH区和/或VL区内所含有的构架区序列与由人类生殖系抗体区段编码的构架区序列有不超过10个氨基酸，诸如不超过9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸差异。
b.间隔子
在一些实施方式中，包含本申请所提供的抗体(例如抗原结合片段)的重组受体，诸如CAR进一步包括间隔子，其可为或包括免疫球蛋白恒定区或其变体或经修饰形式的至少一部分。在一些实施方式中，免疫球蛋白恒定区的该部分包括铰链区，例如IgG4铰链区，和/或CH1、CH2或CH3和/或Fc区。在一些实施方式中，该恒定区或部分来自人类IgG，诸如IgG4或IgG1。在一些方面中，恒定区的该部分用作抗原识别组分，诸如抗原结合结构域(例如scFv)跨膜结构域之间的间隔子区。在一些实施方式中，间隔子的长度经调整以使表达CAR的细胞(诸如表达CAR的细胞)与CAR的靶标(诸如表达GPRC5D的肿瘤细胞)之间的生物物理学突触距离优化。在一些实施方式中，CAR由T细胞表达，且间隔子的长度经调整成适于T细胞活化的长度或经调整以使CAR T细胞效能优化。
在一些实施方式中，相较于在无间隔子存在下的情形，或相较于长度不同(例如较短长度)的替代性间隔子，间隔子具有的长度可在抗原结合之后提供增加的细胞反应性。在一些实例中，间隔子的长度是或是约12个氨基酸或其长度不超过12个氨基酸。在一些实施方式中，间隔子的长度是至少100个氨基酸，诸如长度是至少110、125、130、135、140、145、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240或250个氨基酸。示例性间隔子包括具有至少约10至300个氨基酸、约10至200个氨基酸、约50至175个氨基酸、约50至150个氨基酸、约10至125个氨基酸、约50至100个氨基酸、约100至300个氨基酸、约100至250个氨基酸、约125至250个氨基酸或约200至250个氨基酸且包括介于任一所列范围的端点间的任何整数的间隔子。在一些实施方式中，间隔子区的长度是至少约12个氨基酸、至少约119个或更少氨基酸、至少约125个氨基酸、至少约200个氨基酸、或至少约220个氨基酸、或至少约225个氨基酸。
在一些实施方式中，间隔子的长度是125至300个氨基酸、125至250个氨基酸、125至230个氨基酸、125至200个氨基酸、125至180个氨基酸、125至150个氨基酸、150至300个氨基酸、150至250个氨基酸、150至230个氨基酸、150至200个氨基酸、150至180个氨基酸、180至300个氨基酸、180至250个氨基酸、180至230个氨基酸、180至200个氨基酸、200至300个氨基酸、200至250个氨基酸、200至230个氨基酸、230至300个氨基酸、230至250个氨基酸或250至300个氨基酸。在一些实施方式中，间隔子的长度是至少或至少约或是或是约130个、140个、150个、160个、170个、180个、190个、200个、210个、220个、221个、222个、223个、224个、225个、226个、227个、228个或229个氨基酸，或其长度在任何前述两个数值之间。
示例性间隔子包括单独IgG铰链、连接至CH2和CH3结构域中的一个或多个的IgG铰链、或连接至CH3结构域的IgG铰链。在一些实施方式中，IgG铰链、CH2和/或CH3可以全部或部分地来源于IgG4或IgG2，诸如来自人类IgG4或人IgG2的全部或一部分。在一些实施方式中，间隔子可为含有来源于IgG4、IgG2和/或IgG2和IgG4的铰链、CH2和/或CH3序列中的一个或多个的嵌合多肽。在一些实施方式中，铰链区包含IgG4铰链区和/或IgG2铰链区的全部或一部分，其中该IgG4铰链区任选为人IgG4铰链区且该IgG2铰链区任选为人IgG2铰链区；CH2区含有IgG4 CH2区和/或IgG2 CH2区的全部或一部分，其中该IgG4 CH2区任选为人类IgG4 CH2区且该IgG2 CH2区任选为人IgG2 CH2区；和/或CH3区含有IgG4 CH3区和/或IgG2 CH3区的全部或一部分，其中该IgG4 CH3区任选为人类IgG4 CH3区且该IgG2 CH3区任选为人IgG2 CH3区。在一些实施方式中，铰链、CH2和CH3包含来自IgG4的铰链区、CH2和CH3中的每一个的全部或一部分。在一些实施方式中，铰链区是嵌合的且包含来自人类IgG4和人IgG2的铰链区；CH2区是嵌合的且包含来自人类IgG4和人IgG2的CH2区；和/或CH3区是嵌合的且包含来自人类IgG4和人IgG2的CH3区。在一些实施方式中，间隔子包含IgG4/2嵌合铰链或相较于人IgG4铰链区包含至少一个氨基酸置换的经修饰的IgG4铰链；人IgG2/4嵌合CH2区；和人类IgG4 CH3区。
在一些实施方式中，间隔子可全部或部分地来源于IgG4和/或IgG2，且可含有突变，诸如在一个或多个结构域中含有一个或多个单一氨基酸突变。在一些实例中，氨基酸修饰在IgG4的铰链区中脯氨酸(P)取代丝氨酸(S)。在一些实施方式中，氨基酸修饰是谷氨酰胺(Q)取代天冬酰胺(N)以减小糖基化异质性，诸如在SEQ ID NO:281中所示的全长IgG4 Fc序列的CH2区中177位处的N177Q突变或在SEQ ID NO:282中所示的全长IgG2 Fc序列的CH2区中176位处的N176Q突变。在一些实施方式中，间隔子是或包含IgG4/2嵌合铰链或经修饰的IgG4铰链；IgG2/4嵌合CH2区；和IgG4 CH3区。在一些实施方式中，间隔子的长度是约228个氨基酸。在一些实施方式中，间隔子如SEQ ID NO:17中所示。在一些实施方式中，间隔子包含以下氨基酸序列：
ESKYGPPCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:17)。
在一些实施方式中，间隔子由经优化以用于密码子表达和/或消除剪接位点(诸如隐蔽剪接位点)的多核苷酸编码。在一些实施方式中，间隔子的编码序列包含SEQ ID NO:74中所示的核酸序列。在一些实施方式中，间隔子的编码序列包含SEQ ID NO:73中所示的核酸序列。在一些实施方式中，间隔子的编码序列包含SEQ ID NO:283中所示的核酸序列。在一些实施方式中，间隔子的编码序列包含SEQ ID NO:284中所示的核酸序列。
额外示例性间隔子包括(但不限于)Hudecek等人(2013)Clin.Cancer Res.,19:3153；Hudecek等人(2015)Cancer Immunol.Res.,3(2):125-135；或国际专利申请公开第WO2014031687号中所述的间隔子。在一些实施方式中，间隔子的核苷酸序列经优化以在表达时减小RNA异质性。在一些实施方式中，间隔子的核苷酸序列经优化以减少隐蔽剪接位点或降低在剪接位点处发生剪接事件的可能性。
在一些实施方式中，间隔子具有SEQ ID NO:15中所示的氨基酸序列，且由SEQ IDNO:285中所示的多核苷酸序列编码。在一些实施方式中，间隔子具有SEQ ID NO:16中所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，间隔子具有SEQ ID NO:286中所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，间隔子具有SEQ ID NO:288中所示的氨基酸序列，且由SEQ ID NO:287中所示的多核苷酸序列编码。在一些实施方式中，间隔子具有SEQ ID NO:17中所示的氨基酸序列，由SEQ ID NO:73、74、283或284中所示的多核苷酸序列或与SEQ ID NO:73、74、283或284展现至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列一致性的多核苷酸编码。
在一些实施方式中，间隔子具有与SEQ ID NO:17展现至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列一致性的氨基酸序列，由任选经优化以用于密码子使用和/或减小RNA异质性的多核苷酸编码。减小RNA异质性，诸如通过移除隐蔽剪接供体和/或受体位点减小RNA异质性的方法描述如下，诸如描述于I.B.2.b部分中。观察结果显示，隐蔽剪接供体和/或受体位点当存在于CAR中时存在于某些免疫球蛋白间隔子的间隔子区中。在一些实施方式中，提供的CAR中的间隔子由多核苷酸编码，在细胞中表达之后，该多核苷酸中的一个或多个隐蔽剪接供体和/或受体位点经消除和/或经修饰以减小由构建体转录的RNA诸如mRNA的异质性。在一些实施方式中，间隔子由SEQ ID NO:74中所示(也如SEQ ID NO:48中所示)的核苷酸序列编码。在一些实施方式中，间隔子由SEQ ID NO:283中所示的核苷酸序列编码。在一些实施方式中，间隔子由SEQID NO:284中所示的核苷酸序列编码。在一些实施方式中，间隔子由SEQ ID NO:305中所示的核苷酸序列编码。
c.跨膜结构域和细胞内信号转导组分
抗原识别组分一般连接至一或多种细胞内信号转导组分，诸如模拟经由抗原受体复合物(诸如在CAR的情况下，TCR复合物)实现的活化和/或经由另一种细胞表面受体进行信号转导的信号转导组分。因此，在一些实施方式中，GPRC5D结合分子(例如抗体或其抗原结合片段)连接至一个或多个跨膜结构域，诸如本申请所描述的跨膜结构域，和包含一或多种细胞内组分，诸如本申请所描述的组分的细胞内信号转导结构域。在一些实施方式中，跨膜结构域与细胞外结构域融合。在一个实施方式中，使用与受体，例如CAR中的一个结构域天然地缔合的跨膜结构域。在一些情况下，跨膜结构域经选择或通过氨基酸取代修饰以避免此类结构域结合至相同或不同表面膜蛋白质的跨膜结构域，由此使与受体复合物的其他成员的相互作用降至最低。
在一些实施方式中，跨膜结构域来源于天然或合成来源。在天然来源的情况下，在一些方面中，结构域来源于任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。跨膜结构域包括来源于以下的跨膜结构域(即，至少包含以下的跨膜结构域)：T细胞受体的α、β或ζ链，CD3ε、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和/或CD154。举例而言，跨膜结构域可为包含SEQ ID NO:18中所示的氨基酸序列的CD28跨膜结构域，这些氨基酸序列由SEQ ID NO:55或SEQ ID NO:56中所示的核酸序列编码。或者，在一些实施方式中，跨膜结构域是合成的。在一些方面中，合成跨膜结构域主要包含疏水性残基，诸如亮氨酸和缬氨酸。在一些方面中，在合成跨膜结构域的两端处发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸构成的三联体。在一些实施方式中，连接通过连接物、间隔子和/或跨膜结构域进行。
细胞内信号转导结构域中有模拟或接近经由天然抗原受体进行的信号转导、经由此类受体与共刺激受体的组合进行的信号转导和/或经由单独共刺激受体进行的信号转导的结构域。在一些实施方式中，存在短的寡核苷酸或多肽连接物，例如长度在2与10个氨基酸之间的连接物，诸如含有甘氨酸和丝氨酸的连接物，例如甘氨酸-丝氨酸二联体，且其形成CAR的跨膜结构域与细胞内信号转导结构域之间的连接。
受体，例如CAR，一般包括含至少一种细胞内信号转导组分的细胞内信号转导区。在一些实施方式中，受体包括TCR复合物的细胞内组分或信号转导结构域，诸如介导T细胞活化和细胞毒性的TCR CD3链，例如CD3zeta(CD3-ζ)链。因此，在一些方面中，GPRC5D结合抗体连接至一个或多个细胞信号转导模块。在一些实施方式中，细胞信号转导模块包括CD3跨膜结构域、CD3细胞内信号转导结构域和/或其他CD跨膜结构域。在一些实施方式中，受体，例如CAR，进一步包括诸如Fc受体γ、CD8、CD4、CD25或CD16的一个或多个额外分子的一部分。举例而言，在一些方面中，CAR包括CD3-zeta(CD3-ζ)或Fc受体γ与CD8、CD4、CD25或CD16之间的嵌合分子。
在一些实施方式中，在CAR接合时，该CAR的细胞质结构域或细胞内信号转导结构域刺激和/或活化免疫细胞，例如经基因工程改造以表达CAR的T细胞的正常效应功能或反应中的至少一种。举例而言，在一些情形中，CAR诱导T细胞的功能，诸如细胞溶解活性；或T辅助细胞活性，诸如细胞因子或其他因子的分泌。在一些实施方式中，使用抗原受体组分或共刺激分子的细胞内信号转导结构域的截短部分置换完整免疫刺激链，例如当该部分转导效应功能信号时。在一些实施方式中，一个或多个细胞内信号转导结构域包括T细胞受体(TCR)的细胞质序列，且在一些方面中，也包括在天然环境中与此类受体协同作用以在抗原受体接合之后起始信号转导的共受体的细胞质序列，和/或此类分子的任何衍生物或变体，和/或具有相同功能性能力的任何合成序列。
在天然TCR的情形中，完全活化一般不仅需要经由TCR进行的传导信号，而且也需要共刺激信号。因此，在一些实施方式中，为促进完全活化，CAR中也包括用于产生次级或共刺激信号的组分。在其他实施方式中，CAR不包括用于产生共刺激信号的组分。在一些方面中，另一种CAR在相同细胞中表达且提供用于产生次级或共刺激信号的组分。
T细胞活化在一些方面中描述为由两类细胞质信号转导序列介导：经由TCR起始抗原依赖性初级活化的那些细胞质信号转导序列(初级细胞质信号转导序列)，和以抗原非依赖性方式起作用以提供二级或共刺激信号的那些细胞质信号转导序列(二级细胞质信号转导序列)。在一些方面中，CAR包括此类细胞质信号转导序列中的一者或两者。
在一些方面中，CAR包括调控TCR复合物的初级刺激和/或活化的初级细胞质信号转导序列。以刺激方式起作用的初级细胞质信号转导序列可含有信号转导基元，称为免疫受体酪氨酸活化基序或ITAM。含有ITAM的初级细胞质信号转导序列的实例包括来源于以下的初级细胞质信号转导序列：TCR或CD3ζ、FcRγ、CD3γ、CD3δ和CD3ε。在一些实施方式中，CAR中的细胞内信号转导区含有来源于CD3ζ的细胞质信号转导结构域、其部分或序列。在一些实施方式中，CD3ζ包含SEQ ID NO:20中所示的氨基酸序列，这些氨基酸序列由SEQ IDNO:57SEQ ID NO:58中所示的核酸序列编码。
在一些实施方式中，CAR包括共刺激分子，诸如T细胞共刺激分子的信号转导结构域(例如细胞内或细胞质信号转导结构域)和/或跨膜部分。示例性共刺激分子包括CD28、4-1BB、OX40、DAP10和ICOS。举例而言，共刺激分子可来源于4-1BB，且可包含SEQ ID NO:19中的氨基酸序列，这些氨基酸序列由SEQ ID NO:59或SEQ ID NO:60中所示的核苷酸序列编码。在一些方面中，该CAR包括刺激或活化组分(例如细胞质信号转导序列)和共刺激组分。
在一些实施方式中，这些刺激或活化组分包括在一个CAR内，而该共刺激组分由识别另一抗原的另一种CAR提供。在一些实施方式中，CAR包括在相同细胞上表达的活化或刺激CAR和共刺激CAR(参见WO 2014/055668)。在一些方面中，靶向GPRC5D的CAR是刺激或活化CAR；在其他方面中，其是共刺激CAR。在一些实施方式中，细胞进一步包括抑制性CAR(iCAR，参见Fedorov等人,Sci.Transl.Medicine,5(215)(2013年12月)，诸如识别非GPRC5D抗原的CAR，由此经由靶向GPRC5D的CAR输送的刺激或活化信号因该抑制性CAR结合至其配体而减弱或抑制，例如以减小脱靶效应。
在某些实施方式中，细胞内信号转导区包含连接至CD3(例如CD3-ζ)细胞内结构域的CD28跨膜和信号转导结构域。在一些实施方式中，细胞内信号转导结构域包含连接至CD3ζ细胞内结构域的嵌合CD28和4-1BB(CD137；TNFRSF9)共刺激结构域。
在一些实施方式中，CAR在细胞质部分中包含一个或多个，例如两个或两个以上共刺激结构域和一个刺激或活化结构域，例如初级活化结构域。示例性CAR包括CD3-ζ、CD28和4-1BB的细胞内组分。
在一些实施方式中，提供的抗GPRC5D CAR的实施方式包括含本申请(诸如在I.1a部分中)所描述的抗GPRC5D抗体或抗原结合片段中的任一种的细胞外抗原结合结构域；含IgG4/2嵌合铰链或经修饰的IgG4铰链；IgG2/4嵌合CH2区；和IgG4 CH3区的间隔子，诸如长度为约228个氨基酸的间隔子，SEQ ID NO:17中所示的间隔子，诸如由SEQ ID NO:73、74、283或284中的任一个中所示的核苷酸序列编码；跨膜结构域，诸如来自人CD28的跨膜结构域；和含CD3-zeta(CD3ζ)链的细胞质信号转导结构域和T细胞共刺激分子的细胞内信号转导结构域的细胞内信号转导区。也提供编码此类嵌合抗原受体的多核苷酸。在一些实施方式中，跨膜结构域是或包含SEQ ID NO:18中所示的序列。在一些实施方式中，T细胞共刺激分子的细胞内信号转导结构域一人CD28、人4-1BB或人ICOS或其信号转导部分的细胞内信号转导结构域。在特定实施方式中，细胞内信号转导结构域是人4-1BB的细胞内信号转导结构域。在一些实施方式中，细胞内信号转导结构域是或包含SEQ ID NO:19中所示的序列。在一些实施方式中，细胞质信号转导结构域是人CD3-ζ细胞质信号转导结构域，诸如SEQ ID NO:20中所示。在一些实施方式中，细胞内信号转导区包含SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:19中所示的序列。
在一些实施方式中，提供的抗GPRC5D CAR的实施方式具有SEQ ID NO:289中所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:289中所示的氨基酸序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。在一些实施方式中，提供的抗GPRC5D CAR的实施方式由SEQ ID NO:290中所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO:290中所示的序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的核苷酸序列编码。
2.示例性特征
在任何所提供的实施方式中的一些中，抗GPRC5D CAR和/或抗GPRC5D抗原结合结构域特异性结合至GPRC5D，诸如多发性骨髓瘤浆细胞表面上的GPRC5D。在这些实施方式中的任一个中，提供的CAR中的抗体或抗原结合片段特异性结合GPRC5D。在一些实施方式中，结合可为结合至人类GPRC5D、小鼠GPRC5D蛋白质或非人类灵长类动物(例如食蟹猕猴)GPRC5D蛋白质。在一些实施方式中，在提供的抗GPRC5D CAR和/或抗GPRC5D抗原结合结构域中有结合人类GPRC5D蛋白质的那些。一种抗体或其他结合分子结合至GPRC5D蛋白质或特异性结合至GPRC5D蛋白质的观察结果未必意味着其结合至每一物种的GPRC5D蛋白质。举例而言，在一些实施方式中，结合至GPRC5D蛋白质的特征，诸如与其特异性结合、和/或与参考抗体竞争结合至其、和/或以特定亲和力结合或竞争达到特定程度的能力在一些实施方式中是指针对人类GPRC5D蛋白质的能力且该抗体可能对另一物种(诸如小鼠)的GPRC5D蛋白质不具有此特征。
在一些实施方式中，抗体特异性结合至人类GPRC5D蛋白质，诸如人类GPRC5D蛋白质的抗原决定簇或区域，诸如包含SEQ ID NO:49(Uniprot Q9NZD1)的氨基酸序列的人类BCMA蛋白，或其对偶基因变体或剪接变体。
在一个实施方式中，如例如通过放射免疫分析(RIA)测量，抗GPRC5D抗体或抗原结合结构域或CAR结合至不相关的非GPRC5D蛋白质，诸如非人类GPRC5D蛋白质或其他非GPRC5D蛋白质的程度低于或低于约该抗体或抗原结合结构域或CAR结合至人类GPRC5D蛋白质或人类膜结合GPRC5D的10％。在一些实施方式中，提供的CAR中的抗体或抗原结合结构域中有与小鼠GPRC5D蛋白质的结合低于或为或为约该抗体与人类GPRC5D蛋白质的结合的10％的抗体或抗原结合结构域或CAR。在一些实施方式中，提供的CAR中的抗体或抗原结合结构域是与食蟹猕猴GPRC5D蛋白质的结合低于或为或为约该抗体与人类GPRC5D蛋白质的结合的10％的抗体。在一些实施方式中，提供的CAR中的抗体或抗原结合结构域是食蟹猕猴GPRC5D蛋白质和/或小鼠GPRC5D蛋白质的结合类似于或大致等同于该抗体与人类GPRC5D蛋白质的结合的抗体。
在一些实施方式中，提供的CAR中的抗体能够以至少一定亲和力结合GPRC5D蛋白质，诸如人类GPRC5D蛋白质，该亲和力通过多种已知方法中的任一种测量。在一些实施方式中，亲和力由平衡解离常数(KD)表示；在一些实施方式中，亲和力由EC50表示。
已知多种分析可用于评估结合亲和力和/或确定结合分子(例如抗体或其片段)是否特异性结合至特定配体(例如抗原，诸如GPRC5D蛋白质)。测定一个结合分子，例如抗体对抗原，例如GPRC5D，诸如人类GPRC5D或食蟹猕猴GPRC5D或小鼠GPRC5D的结合亲和力是在本领域技术人员的技能范围内，诸如通过使用此项技术中熟知的多种结合分析中的任一种。举例而言，在一些实施方式中，可使用
仪器，使用表面电浆子共振(SPR)分析测定两种蛋白质(例如抗体或其片段与抗原，诸如GPRC5D蛋白质)之间的复合物的结合动力学和常数(参见例如Scatchard等人,Ann.N.Y.Acad.Sci.51:660,1949；Wilson,Science 295:2103,2002；Wolff等人,Cancer Res.53:2560,1993；和美国专利第5,283,173号、第5,468,614号或等效内容)。
SPR测量在分子结合至传感器表面或自该表面解离时该表面处的分子浓度的变化。SPR信号的变化与接近表面的质量浓度的变化成正比，由此允许测量两个分子之间的结合动力学。复合物的解离常数可通过监测在缓冲液越过芯片时折射率随时间的变化来测定。其他适合的用于测量一种蛋白质与另一种蛋白质的结合的分析包括例如免疫分析，诸如酶联免疫吸附分析(ELISA)和放射免疫分析(RIA)，或通过经荧光、UV吸收、圆二色性或核磁共振(NMR)监测蛋白质的光谱或光学特性的变化来测定结合。其他示例性分析包括(但不限于)西方墨点法(Western blot)、ELISA、分析型超速离心、光谱法、流动式细胞测量术、测序和用于侦测所表达的多核苷酸或蛋白质的结合的其他方法。
在一些实施方式中，结合分子，例如CAR的抗体或其片段或抗原结合结构域以等于或大于105M-1的亲和力或KA(即，特定结合相互作用的平衡缔合常数，其单位为1/M；在假定为双分子相互作用情况下，等于此缔合反应的缔合速率[kon或ka]与解离速率[koff或kd]的比率)结合(诸如特异性结合)至抗原，例如GPRC5D蛋白质或其中的抗原决定簇。在一些实施方式中，CAR的抗体或其片段或抗原结合结构域对肽抗原决定簇展现的结合亲和力的KD(即，特定结合相互作用的平衡解离常数，其单位为M；在假定为双分子相互作用的情况下，等于此缔合反应的解离速率[koff或kd]与缔合速率[kon或ka]的比率)等于或小于10-5M。举例而言，平衡解离常数KD在10-5M至10-13M，诸如10-7M至10-11M、10-8M至10-10M或10-9M至10-10M的范围内。缔合速率(缔合速率常数；kon或ka；以1/Ms为单位)和解离速率(解离速率常数；koff或kd；以1/s为单位)可使用此项技术中已知的分析方法中的任一种，例如表面电浆子共振(SPR)来测定。
在一些实施方式中，CAR的抗体(例如抗原结合片段)或抗原结合结构域与约GPRC5D蛋白质，诸如人类GPRC5D蛋白质的结合亲和力(EC50)和/或解离常数是自或自约0.01nM至约500nM、自或自约0.01nM至约400nM、自或自约0.01nM至约100nM、自或自约0.01nM至约50nM、自或自约0.01nM至约10nM、自或自约0.01nM至约1nM、自或自约0.01nM至约0.1nM、自或自约0.1nM至约500nM、自或自约0.1nM至约400nM、自或自约0.1nM至约100nM、自或自约0.1nM至约50nM、自或自约0.1nM至约10nM、自或自约0.1nM至约1nM、自或自约0.5nM至约200nM、自或自约1nM至约500nM、自或自约1nM至约100nM、自或自约1nM至约50nM、自或自约1nM至约10nM、自或自约2nM至约50nM、自或自约10nM至约500nM、自或自约10nM至约100nM、自或自约10nM至约50nM、自或自约50nM至约500nM、自或自约50nM至约100nM、或自或自约100nM至约500nM。在某些实施方式中，抗体与GPRC5D蛋白质，诸如人类GPRC5D蛋白质的结合亲和力(EC50)和/或平衡解离常数KD是为或小于或为约400nM、300nM、200nM、100nM、50nM、40nM、30nM、25nM、20nM、19nM、18nM、17nM、16nM、15nM、14nM、13nM、12nM、11nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM或1nM或更低。在一些实施方式中，抗体以亚奈莫耳浓度结合亲和力，例如以小于约1nM，诸如小于约0.9nM、约0.8nM、约0.7nM、约0.6nM、约0.5nM、约0.4nM、约0.3nM、约0.2nM或约0.1nM或更低的结合亲和力结合至GPRC5D蛋白质，诸如人类GPRC5D蛋白质。
在一些实施方式中，结合亲和力可分类为高亲和力或低亲和力。在一些情况下，展现低至中等亲和力的结合的CAR的结合分子(例如抗体或其片段)或抗原结合结构域展现的KA为至多107M-1、至多106M-1、至多105M-1。在一些情况下，与特定抗原决定簇展现高亲和力结合的结合分子(例如抗体或其片段)与此类抗原决定簇相互作用的KA为至少107M-1、至少108M-1、至少109M-1、至少1010M-1、至少1011M-1、至少1012M-1或至少1013M-1。在一些实施方式中，结合分子，例如CAR中的抗GPRC5D抗体或其片段或抗原结合结构域与GPRC5D蛋白质的结合亲和力(EC50)和/或平衡解离常数KD是自或自约0.01nM至约1μM、0.1nM至1μM、1nM至1μM、1nM至500nM、1nM至100nM、1nM至50nM、1nM至10nM、10nM至500nM、10nM至100nM、10nM至50nM、50nM至500nM、50nM至100nM、或100nM至500nM。在某些实施方式中，结合分子，例如CAR的抗GPRC5D抗体或其片段或抗原结合结构域与GPRC5D蛋白质的结合亲和力(EC50)和/或平衡解离常数KD的解离常数是或是约或小于或小于约1μM、500nM、100nM、50nM、40nM、30nM、25nM、20nM、19nM、18nM、17nM、16nM、15nM、14nM、13nM、12nM、11nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM或1nM或更低。特定抗体的亲和力程度可与已知抗体(诸如参考抗体)的亲和力相比较。
在一些实施方式中，结合分子，诸如CAR的抗GPRC5D抗体或抗原结合结构域对不同抗原，例如来自不同物种的GPRC5D蛋白质的结合亲和力可以相比较以确定物种交叉反应性。举例而言，物种交叉反应性可分类为高交叉反应性或低交叉反应性。在一些实施方式中，可比较针对不同抗原，例如来自不同物种，诸如来自人类、食蟹猕猴或小鼠的GPRC5D蛋白质的平衡解离常数KD以确定物种交叉反应性。在一些实施方式中，CAR的抗GPRC5D抗体或抗原结合结构域的物种交叉反应可以较高，例如抗GPRC5D抗体与人类GPRC5D和物种变体GPRC5D以类似程度结合，例如对人类GPRC5D的KD与对物种变体GPRC5D的KD的比率是或是约1。在一些实施方式中，CAR的抗GPRC5D抗体或抗原结合结构域的物种交叉反应性可较低，例如抗GPRC5D抗体对人类GPRC5D具有高亲和力，但对物种变体GPRC5D具有低亲和力，或反之亦然。举例而言，对物种变体GPRC5D的KD与对人类GPRC5D的KD的比率超过10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、200、500、1000、2000或更高，且抗GPRC5D抗体具有低物种交叉反应性。物种交叉反应性的程度可与已知抗体(诸如参考抗体)的物种交叉反应性相比较。
提供的CAR中有展现抗原依赖性活性或信号转导，即在无抗原，例如GPRC5D存在下明显不存在信号转导活性或存在背景水平的信号转导活性的CAR。因此，在一些方面中，提供的CAR在无抗原，例如GPRC5D存在下不展现或展现不超过背景水平，或展现容许或较低水平的进补信号转导或抗原非依赖性活性或信号转导。在一些实施方式中，提供的表达抗GPRC5DCAR的细胞展现生物活性或功能，包括细胞毒性活性、细胞因子产生和增殖能力。
在一些实施方式中，嵌合受体的生物活性或功能活性，诸如细胞毒性活性，可使用多种已知方法中的任一种测量。该活性可以在活体外或活体内评估或测定。在一些实施方式中，可以在将细胞给予受试者(例如人类)之后评估活性。评估的参数包括经基因工程改造或天然的T细胞或其他免疫细胞与抗原例如在活体内特异性结合，例如通过成像测定；或离体特异性结合，例如通过ELISA或流动式细胞测量术测定。在某些实施方式中，基因工程细胞破坏靶细胞的能力可使用此项技术中已知的任何适合方法测量，诸如以下中所描述的细胞毒性分析：例如Kochenderfer等人,J.Immunotherapy,32(7):689-702(2009)；和Herman等人,J.Immunological Methods,285(1):25-40(2004)。在某些实施方式中，细胞的生物活性也可通过分析某些细胞因子的表达和/或分泌来测量，这些细胞因子为诸如介白素-2(IL-2)、干扰素-γ(IFNγ)、介白素-4(IL-4)、TNF-α(TNFα)、介白素-6(IL-6)、介白素-10(IL-10)、介白素-12(IL-12)、颗粒球-巨噬细胞群落刺激因子(GM-CSF)、CD107a和/或TGF-β(TGFβ)。用于测量细胞因子的分析是此项技术中熟知的，且包括(但不限于)ELISA、细胞内细胞因子染色、细胞测量珠粒阵列(cytometric bead array)、RT-PCR、ELISPOT、流动式细胞测量术和生物分析，其中在测试样品存在下测试细胞响应于相关细胞因子的反应性(例如增殖)。在一些方面中，通过评估临床结果，诸如肿瘤负荷或负载的减小来测量生物活性。
在一些方面中，可采用报导体细胞的监测抗原非依赖性活性和/或经由表达抗GPRC5D CAR的细胞进行的进补信号转导。在一些实施方式中，T细胞系，诸如Jurkat细胞是含有在内源性Nur77转录调控组件控制下表达的报导体分子，诸如荧光蛋白或其他可侦测分子，诸如红色荧光蛋白。在一些实施方式中，Nur77报导体表达是细胞固有的且取决于经由在T细胞中含有初级活化信号的重组报导体、T细胞受体(TCR)组分的信号转导结构域和/或包含免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)的信号转导结构域，诸如CD3ζ链进行的信号转导。Nur77表达一般不受其他信号转导路径诸如细胞因子信号转导或类铎受体(toll-likereceptor，TLR)信号转导的影响，其可以细胞外源性方式作用且可能不取决于经由重组受体进行的信号转导。因此，仅表达含有适当信号转导区的外源重组受体，例如抗GPRC5D CAR的细胞在刺激(例如结合特定抗原)时能够表达Nur77。在一些情况下，Nur77表达也可对刺激(例如抗原)量显示出剂量依赖性反应。
在一些实施方式中，提供的抗GPRC5D CAR诸如相较于具有一致氨基酸序列但由除去非剪接位点和/或未密码子优化的核苷酸序列编码的替代性CAR在细胞表面上展现出改善的表达。在一些实施方式中，可以评估在细胞表面上重组受体的表达。用于测定细胞表面上重组受体的表达的方法可以包括使用嵌合抗原受体(CAR)特异性抗体(例如Brentjens等人,Sci.Transl.Med.2013年3月；5(177):177ra38)、蛋白质L(Zheng等人,J.Transl.Med.2012年2月；10:29)、抗原决定簇标签和特异性结合至CAR多肽的单克隆抗体(参见国际专利申请公开第WO2014190273号)。在一些实施方式中，可例如通过流动式细胞测量术，使用能可侦测地结合至重组受体或其部分的结合分子评估细胞(例如初代T细胞)的表面上重组受体的表达。在一些实施方式中，用于侦测重组受体的表达的结合分子是抗受试者基因型抗体，例如结合结构域(例如scFv)特异性抗受试者基因型激动剂抗体或其部分。在一些实施方式中，结合分子是或包含分离或纯化的抗原，例如以重组方式表达的抗原。
A.双重抗原靶向嵌合抗原受体
也提供编码嵌合抗原受体和/或其部分(例如链)的多核苷酸。提供的多核苷酸中有编码本申请所描述的结合至BCMA和GPRC5D(例如抗原结合片段)的嵌合抗原受体，诸如包含抗BCMA scFv和抗GPRC5D scFv的嵌合抗原受体(“单柄”嵌合抗原受体)的多核苷酸。多核苷酸可包括含天然和/或非天然存在的核苷酸和碱基的多核苷酸，例如包括具有主链修饰的多核苷酸。术语“核酸分子”、“核酸”和“多核苷酸”可互换使用，且是指核苷酸聚合物。此类核苷酸聚合物可含有天然和/或非天然核苷酸且包括(但不限于)DNA、RNA和PNA。“核酸序列”是指构成核酸分子或多核苷酸的核苷酸的线性序列。在一些情况下，多核苷酸可包含SEQ ID NO:317中所示的序列。
在一些情况下，编码GPRC5D结合和BCMA结合分子的多核苷酸含有编码信号肽的信号序列，在一些情况下，该信号序列在编码GPRC5D结合和BCMA结合分子的核酸序列上游进行编码，或在编码抗原结合结构域的核酸序列的5'末端接合。在一些情况下，含有编码GPRC5D结合和BCMA结合受体(例如嵌合抗原受体(CAR))的核酸序列的多核苷酸含有编码信号肽的信号序列。在一些方面中，信号序列可编码来源于初始多肽的信号肽。在其他方面中，信号序列可编码异源或非初始信号肽。在一些方面中，非限制性示例性信号肽包括SEQID NO:271中所示，或由SEQ ID NO:272或273-276中所示的核苷酸序列编码的IgGκ链的信号肽。在一些方面中，非限制性示例性信号肽包括SEQ ID NO:278中所示且由SEQ ID NO:277中所示的核苷酸序列编码的GMCSFRα链的信号肽。在一些方面中，非限制性示例性信号肽包括SEQ ID NO:279中所示的CD8α信号肽的信号肽。在一些方面中，非限制性示例性信号肽包括SEQ ID NO:280中所示的CD33信号肽的信号肽。在一些情况下，编码GPRC5D结合和BCMA结合受体的多核苷酸可含有编码额外分子，诸如替代性标记物或其他标记物的核酸序列，或可含有额外组分，诸如启动子、调控组件和/或多顺反子组件。在一些实施方式中，编码GPRC5D结合和BCMA结合受体的核酸序列可操作地连接至这些额外组分中的任一种。在一些情况下，抗GPRC5D scFv与抗BCMA scFv通过编码柔性连接物的核苷酸序列，诸如SEQ IDNO:320中所示的核苷酸序列分隔开。在一些情况下，包含GPRC5D结合和BCMA结合受体的构建体进一步包含4-1BB共刺激结构域(SEQ ID NO:60，编码SEQ ID NO:19)。
在一些实施方式中，细胞表达结合GPRC5D和BCMA的CAR作为针对MM浆细胞的治疗剂。在一些实施方式中，多核苷酸构建体是密码子趋异的以改善由该多核苷酸编码的一个或多个scFv的表达。
在一些实施方式中，本申请所提供的CAR中有由多核苷酸编码的CAR，这些多核苷酸经优化或含有设计用于优化，诸如针对密码子使用优化的某些特征，以减小RNA异质性和/或修饰，例如增加编码的受体的表达，诸如表面表达，或使多个细胞产物批料中编码的受体的表达，诸如表面表达更一致，诸如以下IB部分中所描述。因此，也提供表达由本申请所提供的多核苷酸编码的重组受体的细胞和其在过继细胞疗法中的用途，诸如用于治疗与GPRC5D和/或BCMA表达相关的疾病和病症，例如多发性骨髓瘤。
也提供经基因工程改造以表达编码提供的多核苷酸的多核苷酸的细胞，诸如T细胞，该多核苷酸包括编码第一和第二scFv的多核苷酸；以及含有此类细胞的组合物。在一些实施方式中，多核苷酸构建体如以下IB部分中所描述进行修饰。
B.编码重组受体的多核苷酸
也提供编码嵌合抗原受体和/或其部分(例如链)的多核苷酸。在所提供的多核苷酸中有编码本申请所描述的抗GPRC5D嵌合抗原受体(例如抗原结合片段)的多核苷酸。多核苷酸可包括含天然和/或非天然存在的核苷酸和碱基的多核苷酸，例如包括具有主链修饰的多核苷酸。术语“核酸分子”、“核酸”和“多核苷酸”可互换使用，且是指核苷酸聚合物。此类核苷酸聚合物可含有天然和/或非天然核苷酸且包括(但不限于)DNA、RNA和PNA。“核酸序列”是指构成核酸分子或多核苷酸的核苷酸的线性序列。
在一些情况下，编码GPRC5D结合受体的多核苷酸含有编码信号肽的信号序列，在一些情况下，该信号序列在编码GPRC5D结合受体的核酸序列的上游进行编码或在编码抗原结合结构域的核酸序列的5'端处接合。在一些情况下，含有编码GPRC5D结合(例如嵌合抗原受体(CAR))的核酸序列的多核苷酸含有编码信号肽的信号序列。在一些方面中，信号序列可编码来源于初始多肽的信号肽。在其他方面中，信号序列可编码异源或非初始信号肽。在一些方面中，非限制性示例性信号肽包括SEQ ID NO:271中所示，或由SEQ ID NO:272或273-276中所示的核苷酸序列编码的IgGκ链的信号肽。
在一些方面中，非限制性示例性信号肽包括SEQ ID NO:278中所示且由SEQ IDNO:277中所示的核苷酸序列编码的GMCSFRα链的信号肽。在一些方面中，非限制性示例性信号肽包括SEQ ID NO:279中所示的CD8α信号肽的信号肽。在一些方面中，非限制性示例性信号肽包括SEQ ID NO:280中所示的CD33信号肽的信号肽。在一些情况下，编码GPRC5D结合受体的多核苷酸可含有编码额外分子，诸如替代性标记物或其他标记物的核酸序列，或可含有额外组分，诸如启动子、调控组件和/或多顺反子组件。在一些实施方式中，编码GPRC5D结合受体的核酸序列可操作地连接至这些额外组分中的任一种。
本申请也提供多核苷酸构建体，其编码具有第一抗原结合结构域的第一CAR和具有第二抗原结合结构域的第二CAR，包括密码子趋异的多核苷酸构建体。在一些实施方式中，由多核苷酸构建体编码的第一CAR和第二CAR能够结合至不同抗原。在一些实施方式中，多核苷酸构建体编码能够结合GPRC5D的第一CAR，诸如本申请中所描述的任何CAR；和能够结合BCMA的第二CAR。结合BCMA的示例性CAR如本申请所描述，诸如参见II部分。在一些实施方式中，细胞表达抗GPRC5D CAR和抗BCMA CAR作为针对MM浆细胞的治疗剂。在一些实施方式中，多核苷酸构建体是密码子趋异的以改善由该多核苷酸编码的一或多种CAR的表达。
在一些实施方式中，在本申请所提供的CAR中有由多核苷酸编码的CAR，这些多核苷酸经优化，或含有设计用于优化，诸如针对密码子使用优化的某些特征，以减小RNA异质性和/或修饰，例如增加编码的受体的表达，诸如表面表达，或使多个细胞产物批料中编码的受体的表达，诸如表面表达更一致。在一些实施方式中，编码GPRC5D结合细胞表面蛋白质的多核苷酸与参考多核苷酸相比经修饰，以便移除隐蔽或隐藏的剪接位点，以减小RNA异质性。在一些实施方式中，编码GPRC5D结合和BCMA结合细胞表面蛋白质的多核苷酸经密码子优化以诸如用于在哺乳动物(例如人类)细胞中，诸如在人类T细胞中表达。在一些方面中，当在细胞中表达时，经修饰的多核苷酸引起表达量，例如表面表达量的改善，例如表达量增加或更均匀或更一致。此类多核苷酸可用于产生表达编码的GPRC5D结合和BCMA结合细胞表面蛋白质的基因工程细胞的构建体中。因此，也提供表达由本申请所提供的多核苷酸编码的重组受体的细胞和其在过继细胞疗法中的用途，诸如用于治疗与GPRC5D和/或BCMA表达相关的疾病和病症，例如多发性骨髓瘤。
也提供经基因工程改造以表达编码提供的多核苷酸的多核苷酸的细胞，诸如T细胞，该多核苷酸包括编码第一和第二CAR的多核苷酸；以及含有此类细胞的组合物。在一些实施方式中，多核苷酸构建体经密码子优化以用于在人类细胞中表达。在一些实施方式中，多核苷酸构建体中的一个或多个剪接供体和/或受体位点经修饰以在细胞中表达之后减小由该构建体转录的RNA，诸如mRNA的异质性。
1.双顺反子多核苷酸
在一些方面中，提供多核苷酸，其编码能够结合，诸如能够特异性结合第一抗原的第一嵌合抗原受体，和能够结合，诸如能够特异性结合第二抗原的第二嵌合抗原受体。本申请提供的多核苷酸是表达多种CAR，诸如抗GPRCD CAR和抗BCMA CAR的双顺反子。在一些实施方式中，该多核苷酸可以含有编码本申请所提供的抗GPRC5D CAR的核酸和编码第二CAR(诸如抗BCMA CAR)的核酸，这些核酸通过用于在同一细胞中表达两种CAR的多顺反子组件分隔开。在一些方面中，提供编码的嵌合抗原受体，诸如含有BCMA结合多肽或GPRC5D结合多肽的嵌合抗原受体，以及其组合物和制品和用途，且其可用作针对MM浆细胞的治疗剂。
在BCMA结合多肽和GPRC5D结合多肽中有抗体，诸如单链抗体(例如抗原结合抗体片段)，或其部分。在一些实例中，嵌合抗原受体含有抗BCMA抗体或其抗原结合片段。在一些实例中，嵌合抗原受体含有抗GPRC5D抗体或其抗原结合片段。提供的多核苷酸可并入构建体，诸如脱氧核糖核酸(DNA)或RNA构建体中，诸如可引入至用于表达所编码的重组抗BCMA和抗GPRC5D CAR的细胞中的构建体中。
在一些方面中，提供BCMA结合剂，诸如结合BCMA分子的重组受体或嵌合抗原受体，以及编码BCMA结合细胞表面蛋白质，诸如重组受体(例如CAR)的多核苷酸，和表达此类受体的细胞。BCMA结合细胞表面蛋白质一般含有特异性结合至BCMA，诸如特异性结合至BCMA蛋白质，诸如人类BCMA蛋白质的抗体(例如抗原结合抗体片段)和/或其他结合肽。在一些方面中，这些药剂结合至BCMA的细胞外部分。
在一些方面中，提供GPRC5D结合剂，诸如结合GPRC5D分子的重组受体或嵌合抗原受体，和编码GPRC5D结合细胞表面蛋白质，诸如重组受体(例如CAR)的多核苷酸，以及表达此类受体的细胞。GPRC5D结合细胞表面蛋白质一般含有特异性结合至GPRC5D，诸如特异性结合至GPRC5D蛋白质，诸如人类GPRC5D蛋白质的抗体(例如抗原结合抗体片段)和/或其他结合肽。在一些方面中，这些药剂结合至GPRC5D的细胞外部分。
在一些实施方式中，第一和/或第二嵌合抗原受体包括抗原结合结构域、间隔子、跨膜结构域和细胞内信号转导区中的一个或多个。在一些实施方式中，多核苷酸构建体是密码子趋异的以改善由该多核苷酸编码的一或多种CAR的表达。在一些实施方式中，编码一或多种组分或第一和/或第二嵌合抗原受体的核苷酸序列已密码子趋异。在一些实施方式中，密码子趋异改善一或多种嵌合抗原受体的表达。在一些实施方式中，密码子趋异改善由核苷酸序列编码的嵌合抗原受体的表达，编码该嵌合抗原受体的核苷酸序列相对于编码另一嵌合抗原受体的核苷酸序列在3'端。在一些实施方式中，多核苷酸构建体经密码子优化以用于在人类细胞中表达。在一些实施方式中，多核苷酸构建体中的一个或多个剪接供体和/或受体位点经修饰以在细胞中表达之后减小由该构建体转录的RNA，诸如mRNA的异质性。
在一些实施方式中，本申请提供密码子趋异的编码该两种CAR的多核苷酸构建体。在本申请中观察到，由多核苷酸构建体的核苷酸序列编码的CAR的表达相较于由该多核苷酸构建体的核苷酸序列编码的另一CAR减少。在一些实施方式中，相对于另一编码的CAR在3'端的由核苷酸序列编码的CAR标识为“后置”CAR。类似地，相对于另一编码的CAR在5'端的由该核苷酸序列编码的CAR标识为“前导”CAR。在一些实施方式中，“前导”CAR对应于相对于另一CAR在N末端表达的CAR，且“后置”CAR对应于相对于另一CAR在C末端表达的CAR。
在本申请中观察到，相对于由另一核苷酸序列编码的CAR(“前导”CAR)位于3'端的由核苷酸序列编码的CAR(“后置”CAR)的表达减少。在一些实施方式中，预期DNA重组引起相对于编码另一CAR的核苷酸序列位于3'端的编码CAR的核苷酸序列的损失、相对于编码另一CAR的核苷酸序列在3'端的由核苷酸序列编码的CAR的表达损失、或两者。
在一些实施方式中，本申请所提供的多核苷酸构建体是密码子趋异的，诸如通过使编码一种CAR(例如前导CAR或后置CAR)的核苷酸序列密码子趋异以防止此类损失。在一些实施方式中，编码一种CAR的核苷酸序列是密码子趋异的，由此使编码第一CAR的核苷酸序列与编码第二CAR的核苷酸序列共有不超过20个碱基对、15个碱基对、10个碱基对或5个碱基对的序列同源性。在一些实施方式中，编码抗GPRC5D CAR的核苷酸序列，或其组分，诸如包括GPRC5D结合scFv、间隔子、跨膜结构域和细胞内信号转导区的组分是密码子趋异的。
此类密码子趋异的多核苷酸可以用于产生表达所编码的GPRC5D结合和BCMA结合细胞表面蛋白质的基因工程细胞的构建体中。因此，也提供表达由本申请所提供的密码子趋异的多核苷酸编码的重组受体的细胞和其在过继细胞疗法中的用途，诸如用于治疗与GPRC5D和/或BCMA表达相关的疾病和病症，例如多发性骨髓瘤。
a.密码子趋异
在提供的实施方式中的任一个中，多核苷酸构建体是密码子趋异的以改善由该多核苷酸编码的一或多种CAR的表达。本申请中的观察结果进一步展示，细胞中多种CAR，例如抗GPRC5D CAR和抗BCMA CAR的表达可通过使编码一或多种CAR的多核苷酸序列密码子趋异而改善。在本申请中发现，编码两种CAR的多核苷酸构建体的密码子趋异使相对于编码另一CAR的核苷酸序列在3'端(或C末端)的编码CAR的核苷酸序列的表达改善，例如后置CAR的表达因密码子趋异而改善。
在一些实施方式中，本申请提供密码子趋异的编码该两种CAR的多核苷酸构建体。在本申请中观察到，由多核苷酸构建体的核苷酸序列编码的CAR的表达相较于由该多核苷酸构建体的核苷酸序列编码的另一CAR减少。确切地说，在本申请中观察到相对于由另一核苷酸序列编码的CAR位于3'端的由核苷酸序列编码的CAR减少。
在一些实施方式中，预期DNA重组引起相对于编码另一CAR的核苷酸序列位于3'端的编码CAR的核苷酸序列的部分或全部损失、相对于编码另一CAR的核苷酸序列在3'端的由该核苷酸序列编码的CAR的表达损失或两者。预期DNA重组引起的这一损失由编码该两种CAR的核苷酸序列之间的序列同源性引起。
在一些实施方式中，本申请所提供的多核苷酸构建体是密码子趋异的，诸如通过使编码一种CAR的核苷酸序列密码子趋异，以防止此类损失。在一些实施方式中，编码一种CAR的核苷酸序列是密码子趋异的以减小编码该两种CAR的核苷酸序列之间的同源性。在一些实施方式中，编码该两种CAR的核苷酸序列之间的同源性减小将降低同源重组的概率和编码后置CAR的核苷酸序列的部分或全部损失。在一些实施方式中，密码子趋异包括修饰前导CAR的核苷酸序列以防止编码后置CAR的序列损失、后置CAR的表达损失、或两者。在一些实施方式中，密码子趋异包括修饰后置CAR的核苷酸序列以防止编码后置CAR的序列损失、后置CAR的表达损失、或两者。
在一些实施方式中，编码一种CAR的核苷酸序列是密码子趋异的，由此使编码第一CAR的核苷酸序列与编码第二CAR的核苷酸序列CAR不超过约20个碱基对、约15个碱基对、约10个碱基对、或约5个碱基对的序列同源性。在一些实施方式中，编码一种CAR的核苷酸序列是密码子趋异的，由此使编码该两种CAR的核苷酸序列在编码该两种CAR的核苷酸序列内发现的任一个序列中共有不超过约20个、不超过约15个、不超过约10个或不超过约5个连续一致碱基。
在一些实施方式中，编码以下CAR组分中的一种或多种的核苷酸序列是密码子趋异的：(a)抗原结合结构域；(b)间隔子；(c)跨膜结构域；(d)细胞内信号转导区。在一些实施方式中，编码组分(b)至(d)中的一种或多种的核苷酸序列是密码子趋异的，使得第一CAR的一种或多种组分具有与第二CAR的相同组分不同的核苷酸序列。在一些实施方式中，编码第一CAR中组分(b)至(d)中的一种或多种的核苷酸序列不同于编码第二CAR中相同组分的核苷酸序列，但第一CAR中编码该组分的核苷酸序列与第二CAR中编码相同组分的核苷酸序列编码相同的氨基酸序列。
在一些实施方式中，编码第一CAR中的间隔子的核苷酸序列以SEQ ID NO:305给出且编码第二CAR中的相同间隔子的核苷酸序列给定以SEQ ID NO:74给出。在一些实施方式中，间隔子由SEQ ID NO:17中所示的氨基酸序列给出。在一些实施方式中，编码第一CAR中的跨膜结构域的核苷酸序列由SEQ ID NO:307给出且编码第二CAR中的相同跨膜结构域的核苷酸序列由SEQ ID NO:56给出。在一些实施方式中，跨膜结构域由SEQ ID NO:18中所示的氨基酸序列给出。在一些实施方式中，编码第一CAR中细胞内信号转导区的4-1BB胞内结构域的核苷酸序列以SEQ ID NO:308给出且编码第二CAR中细胞内信号转导区的相同4-1BB胞内结构域的核苷酸序列以SEQ ID NO:60给出。在一些实施方式中，4-1BB胞内结构域由SEQ ID NO:19中所示的氨基酸序列给出。在一些实施方式中，编码第一CAR中细胞内信号转导区的CD3ζ胞内结构域的核苷酸序列以SEQ ID NO:309给出且编码第二CAR中细胞内信号转导区的相同CD3ζ胞内结构域的核苷酸序列由SEQ ID NO:58给出。在一些实施方式中，CD3ζ胞内结构域由SEQ ID NO:20中所示的氨基酸序列给出。
在一些实施方式中，第一CAR的抗原结合结构域与第二CAR的抗原结合结构域结合不同的抗原。在一些实施方式中，第一或第二CAR的抗原结合结构域相较于其初始序列是密码子趋异的。在一些实施方式中，密码子趋异的编码第一或第二CAR的抗原结合结构域的核苷酸序列以SEQ ID NO:311给出且编码相同抗原结合结构域的初始核苷酸序列以SEQ IDNO:264给出。在一些实施方式中，第一或第二CAR的抗原结合结构域以SEQ ID NO:8给出。在一些实施方式中，第一或第二CAR中另一个的抗原结合结构域相较于其初始序列不存在密码子趋异。在一些实施方式中，编码第一或第二CAR中另一个的抗原结合结构域的核苷酸序列以SEQ ID NO:310给出。在一些实施方式中，第一或第二CAR中另一个的抗原结合结构域以SEQ ID NO:241给出。
在一些实施方式中，编码抗GPRC5D CAR的核苷酸序列，或其组分，诸如包括GPRC5D结合scFv、间隔子、跨膜结构域和细胞内信号转导区的组分是密码子趋异的。此类密码子趋异的多核苷酸可以用于产生表达所编码的GPRC5D结合和BCMA结合细胞表面蛋白质的基因工程细胞的构建体中。因此，也提供表达由本申请所提供的密码子趋异的多核苷酸编码的重组受体的细胞和其在过继细胞疗法中的用途，诸如用于治疗与GPRC5D和/或BCMA表达相关的疾病和病症，例如多发性骨髓瘤。
b.多顺反子组件
在所提供的实施方式中的任一个中，多核苷酸进一步在第一与第二核酸序列之间含有内部核糖体进入位点(IRES)，以在翻译之后得到第一和第二核酸序列的翻译产物。举例而言，在一些实施方式中，转录单元可经基因工程改造为含有IRES(内部核糖体进入位点)的双顺反子单元，其允许通过来自单个启动子的讯息对基因产物(例如编码第一和第二嵌合受体)进行共表达。举例而言，在一些实施方式中，载体或构建体可以含有处于单个启动子的调控下的编码本申请所提供的抗GPRC5D受体(例如抗GPRC5D CAR)的核酸和编码抗BCMA受体(例如抗BCMA CAR)的核酸，这些核酸通过IRES分隔开。
或者，在提供的实施方式中的任一个中多核苷酸含有编码第一与第二核酸序列之间的连接肽的核酸序列，其中该连接肽在翻译期间或之后分隔开第一与第二核酸序列的翻译产物。在一些方面中，该连接肽含有自裂解肽、或引起核糖体跳跃的肽，任选为T2A肽。在一些实施方式中，单个启动子可引导RNA的表达，该RNA在单一开放阅读框架(ORF)中含有通过序列自裂解肽(例如2A裂解序列)或蛋白酶识别位点(例如弗林蛋白酶(furin))彼此隔开的两个或三个基因(例如编码第一和第二结合分子，例如抗体重组受体)。因此，ORF编码单个多肽，该多肽在翻译期间(在T2A的情况下)或之后裂解成个别蛋白质。在一些情况下，肽，诸如T2A可使核糖体在2A组件的C末端跳跃(核糖体跳跃)合成肽键，由此在2A序列的一端与接下来的肽下游之间产生分离(参见例如de Felipe.Genetic Vaccines and Ther.2:13(2004)和deFelipe等人,Traffic 5:616-626(2004))。已知许多2A组件。可用于本申请所揭示的方法和多核苷酸中的2A序列的实例不限于如美国专利公开第20070116690号中所描述的来自口蹄疫病毒的2A序列(F2A，例如SEQ ID NO:42或43))、来自马A型鼻炎病毒的2A序列(E2A，例如SEQ ID NO:40或41)、来自明脉扁刺蛾(Thosea asigna)病毒的2A序列(T2A，例如SEQ ID NO:35、36或37)和来自猪捷申病毒-1的2A序列(P2A，例如SEQ ID NO:38或39)。
在提供的多核苷酸构建体中的任一种中，编码第一CAR的第一核酸序列和编码第二CAR的第二核酸序列通过编码核糖体跳跃组件、诸如T2A的核酸序列分隔开。因此，在翻译期间之后，第一嵌合抗原受体和第二嵌合抗原受体裂解成独立蛋白质。在所提供的实施方式中的任一个中，编码T2A的核苷酸序列可为密码子趋异的。
2.多核苷酸的特征
a.密码子优化
在一些实施方式中，多核苷酸通过优化密码子以用于在人体内表达来修饰。在一些方面中，可在用于剪接位点鉴别和/或剪接位点消除的步骤之前和/或之后，和/或在用于减小RNA异质性的每一迭代步骤时考虑密码子优化。密码子优化一般涉及使所选密码子的百分比与人类转移RNA的丰度(例如所公开的丰度)平衡，例如以使得不发生过载或限制。在一些情况下，此类平衡是必要或有用的，因为大部分氨基酸由超过一种密码子编码，且密码子使用一般在生物体间变化。经转染或转导的基因或核酸与宿主细胞之间的密码子使用差异可对由核酸分子进行的蛋白质表达具有影响。下表2阐述示例性人类密码子使用频率表。在一些实施方式中，为了产生经密码子优化的核酸序列，选择密码子以选择与人类使用频率平衡的密码子。氨基酸密码子的冗余使得不同密码子编码一种氨基酸，诸如表2中所描绘。在选择用于置换的密码子时，需要所得突变是沉默突变，以使得密码子变化不影响氨基酸序列。一般而言，密码子的最后一个核苷酸(例如在第三个位置处)可保持不变，同时不影响氨基酸序列。
举例而言，密码子TCT、TCC、TCA、TCG、AGT和AGC均编码丝氨酸(应注意，DNA中的T等效于RNA中的U)。根据诸如上表2中所阐述的人类密码子使用频率，这些密码子的相应使用频率分别为15.2、17.7、12.2、4.4、12.1和19.5。由于TCG对应于4.4％，故当此密码子在基因合成中常用时，则此密码子的tRNA将为限制性的。在密码子优化过程中，目标是将各密码子的使用与意欲表达转殖基因的动物物种中的正常使用频率平衡。
b.剪接位点
本申请提供多核苷酸，其中已鉴别出一个或多个潜在剪接供体和/或剪接受体位点且在一个或多个所鉴别的剪接供体位点处或附近的核酸序列已经修饰。在一些实施方式中，接着合成所得经修饰的核酸序列，且将其用于转导细胞以测试如由RNA异质性所指示的剪接。
本申请也提供多核苷酸，诸如编码本申请所提供的抗体、受体(诸如抗原受体，诸如嵌合抗原受体)和/或GPRC5D特异性和/或BCMA特异性结合蛋白中的任一种的多核苷酸，这些多核苷酸经修饰或已经修饰以减小异质性或含有一个或多个本申请中所观察到的核酸序列(诸如通过优化方法)，由此使多肽，诸如CAR的特征相较于含有不同参考序列或未经修饰的多肽有所改善。在此类特征中包括RNA异质性改善，诸如由一个或多个剪接位点，诸如一个或多个隐蔽剪接位点的存在而引起的异质性改善；和/或所编码的蛋白质的表达和/或表面表达改善，诸如在经基因工程改造以表达这些多肽的细胞或不同治疗性细胞组合物中表达的水平、均匀性或一致性增加。
可通过自表达细胞收集RNA，利用逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)扩增并利用琼脂糖凝胶电泳解析以相较于初始序列，测定RNA的异质性，由此鉴别出多核苷酸序列中的剪接位点。在一些情况下，可将改良的序列重新提交给基因合成供货商进行进一步密码子优化和剪接位点移除，随后进行进一步隐蔽剪接位点评价、修饰、合成和测试，直至琼脂糖凝胶上的RNA展现最小RNA异质性。
也提供经修饰以消除剪接位点，诸如隐蔽剪接位点的多核苷酸。在自然界中，哺乳动物细胞中的基因组核酸序列一般在转录同时或在转录后立即经历处理，其中在一些情况下，自基因组脱氧核糖核酸(DNA)序列转录的新生前驱信使核糖核酸(前驱mRNA)藉助于剪接进行编辑以移除内含子，随后在真核细胞中进行外显子接合。剪接位点的共同序列是已知的，但在一些方面中，确定剪接位点的具体核苷酸信息可能较复杂，且基于可用方法可能无法显而易见。隐蔽剪接位点基于标准共同序列无法预测且可变地活化的剪接位点。因此，当在真核细胞中表达时，前驱mRNA在隐蔽剪接位点处的可变剪接在经转录的mRNA产物中导致异质性。
产生的用于表达转殖基因的多核苷酸通常是由不含内含子的核酸序列，诸如互补DNA(cDNA)或其部分来构筑。因此，预期此类序列不会发生剪接。然而，cDNA序列内隐蔽剪接位点的存在可在经转录的mRNA中导致非预期或非所需的剪接反应和异质性。此类异质性引起非预期蛋白质产物的翻译，诸如展现经调节的表达和/或活性的具有可变氨基酸序列的截短的蛋白质产物。
在一些实施方式中，消除剪接位点，诸如隐蔽剪接位点可使转殖基因产物，诸如自转殖基因翻译的多肽，诸如抗GPRC5D CAR多肽的表达改善或优化。在编码的转殖基因，诸如编码的GPRC5D CAR分子的隐蔽剪接位点处的剪接可使蛋白质表达，例如细胞表面上的表达减少，和/或使功能减退，例如使细胞内信号转导减少。本申请提供编码抗GPRC5D CAR蛋白质的多核苷酸，其已经优化以减少或消除隐蔽剪接位点。本申请也提供编码抗GPRC5D CAR蛋白质的多核苷酸，其已针对密码子表达优化；和/或其中存在一个或多个序列，诸如通过本申请关于剪接位点的方法或观察结果所鉴别的序列；和/或其中不存在所鉴别的剪接位点，诸如本申请所鉴别的剪接位点中的任一个。在所提供的多核苷酸中有当在某些条件下表达和/或引入指定细胞类型，诸如人类T细胞，诸如初代人类T细胞中时展现低于某种程度的RNA异质性或剪接形式的多核苷酸，以及含有此类多肽和/或展现此类特性的细胞和组合物和制品。在一些实施方式中，转录的RNA的RNA异质性相较于未经修饰以移除隐蔽剪接位点和/或经历密码子优化的多核苷酸减小超过或超过约10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％或更高百分比。在一些实施方式中，提供的编码抗GPRC5D CAR的多核苷酸展现至少70％、75％、80％、85％、90％或95％或更高百分比的转录的RNA的RNA均质性。
在一些实施方式中，消除剪接位点，诸如隐蔽剪接位点可使转殖基因产物，诸如自转殖基因翻译的多肽，诸如抗BCMA CAR多肽的表达改善或优化。在编码的转殖基因，诸如编码的BCMA CAR分子的隐蔽剪接位点处的剪接可使蛋白质表达，例如细胞表面上的表达减少，和/或使功能减退，例如使细胞内信号转导减少。本申请提供编码抗BCMA CAR蛋白质的多核苷酸，其已经优化以减少或消除隐蔽剪接位点。本申请也提供编码抗BCMA CAR蛋白质的多核苷酸，其已针对密码子表达优化；和/或其中存在一个或多个序列，诸如通过本申请关于剪接位点的方法或观察结果所鉴别的序列；和/或其中不存在所鉴别的剪接位点，诸如本申请所鉴别的剪接位点中的任一个。在所提供的多核苷酸中有当在某些条件下表达和/或引入指定细胞类型，诸如人类T细胞，诸如初代人类T细胞中时展现低于某种程度的RNA异质性或剪接形式的多核苷酸，以及含有此类多肽和/或展现此类特性的细胞和组合物和制品。在一些实施方式中，转录的RNA的RNA异质性相较于未经修饰以移除隐蔽剪接位点和/或经历密码子优化的多核苷酸减小超过或超过约10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％或更高百分比。在一些实施方式中，提供的编码抗BCMA CAR的多核苷酸展现至少70％、75％、80％、85％、90％或95％或更高百分比的转录的RNA的RNA均质性。
RNA异质性可通过本申请所提供或描述或已知的多种方法中的任一种测定。在一些实施方式中，经转录核酸的RNA异质性通过以下方式测定：利用诸如逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)使经转录核酸扩增，随后侦测一种或多种扩增产物的一种或多种差异，诸如尺寸差异。在一些实施方式中，RNA异质性基于尺寸不同的扩增产物的数量或各种尺寸不同的扩增产物的比例来测定。在一些实施方式中，RNA，诸如总RNA或细胞质聚腺苷酸化RNA，自表达待优化的转殖基因的细胞收集，且通过逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)，使用对位于经转录RNA中转殖基因上游的5'非翻译区(5'UTR)(在一些情况下，其对应于表达载体中启动子序列的一部分)具特异性的引物和对位于经转录RNA序列中所表达的转殖基因下游的3'非翻译区(3'UTR)具特异性的引物或对转殖基因内的序列具特异性的引物来扩增。在特定实施方式中，采用至少一个与5'非翻译区(UTR)中的序列互补的引物和至少一个与3'非翻译区(UTR)中的序列互补的引物来使转殖基因扩增。熟练技术人员可解析RNA，诸如信使RNA，且通过若干方法来分析其异质性。非限制性示例性方法包括琼脂糖凝胶电泳、基于芯片的毛细电泳、分析型离心、场流动分级分离和层析，诸如尺寸排阻层析或液相层析。
在一些方面中，转录物，诸如转殖基因转录物中潜在隐蔽剪接位点(剪接供体和/或受体位点)的存在可在细胞中表达后引起转录物的RNA异质性。在一些实施方式中，可存在于转殖基因转录物中、不合需要和/或可在转殖基因转录物中由各种基础序列产生的一个或多个潜在剪接位点在转录物的密码子优化之后和/或通过突变或转录错误或差错鉴别。在所提供的实施方式的一些方面中，剪接供体位点和剪接受体位点独立地鉴别。在一些实施方式中，剪接受体和/或供体位点是典型、非典型和/或隐蔽的剪接受体和/或供体位点。
在一些实施方式中，对多核苷酸，诸如编码可展现RNA异质性的转殖基因(诸如重组受体)的多核苷酸中的一个或多个潜在剪接位点(例如典型、非典型和/或隐蔽的剪接受体和/或供体位点或分支位点)进行鉴别和/或修饰。也提供此类剪接位点的数量相较于此类参考多核苷酸减少的多肽。
在一些方面中，在核酸序列中鉴别一个或多个剪接位点是一个迭代的过程。在一些实施方式中，剪接位点可使用剪接位点和/或密码子优化预测工具来鉴别，诸如通过将编码转殖基因，诸如GPRC5D或BCMA结合受体，例如抗GPRC5D或抗BCMA CAR的起始或参考序列提交至能够在计算上或算法上比较起始或参考序列的数据库、基因合成供货商或其他来源以鉴别或预测剪接位点和/或用于密码子优化和/或剪接位点移除。在一些实施方式中，在修饰序列以进行密码子优化和/或剪接位点移除之后，使用一或多种其他或额外剪接位点预测工具对序列，诸如经修正或经修饰的核酸序列进行一或多种其他评估，以进一步评价剪接位点移除，诸如隐蔽剪接位点移除。
在一些方面中，RNA异质性可由存在于真核细胞中的剪接体的活性引起。在一些方面中，剪接通常在由剪接体催化的一系列反应中进行。剪接位点的共同序列是已知的，但在一些方面中，确定剪接位点的具体核苷酸信息可能较复杂，且基于可用方法可能无法显而易见。隐蔽剪接位点基于标准共同序列无法预测且可变地活化的剪接位点。因此，在真核细胞中表达后，前驱mRNA在隐蔽剪接位点处的可变剪接在经转录的mRNA产物中导致异质性。在一些情况下，在剪接体内含子内，剪接事件需要供体位点(通常在内含子的5'端)、分支位点(在内含子的3'端附近)和受体位点(在内含子的3'端)。剪接供体位点可包括在内含子5'端处的GU序列，其具有较大的保守性较低的区域。在内含子3'端处的剪接受体位点可以AG序列终止。
在一些实施方式中，剪接位点，包括潜在隐蔽剪接位点在内，均可通过将序列与已知剪接位点序列(诸如序列数据库中的序列)相比较来鉴别。在一些实施方式中，剪接位点可在计算上通过提交核苷酸序列以利用剪接位点预测工具分析来鉴别，这些剪接位点预测工具诸如Human Splice Finder(Desmet等人,Nucl.Acids Res.37(9):e67(2009))、神经网络剪接位点预测工具NNSplice(Reese等人,J.Comput.Biol.,4(4):311(1997))、GeneSplicer(Pertea等人,Nucleic Acids Res.2001 29(5):1185-1190)或NetUTR(Eden和Brunak,Nucleic Acids Res.32(3):1131(2004))，其鉴别潜在剪接位点和此类位点处剪接事件的概率。额外剪接预测工具包括RegRNA、ESEfinder和MIT剪接预测器。剪接位点预测工具，诸如GeneSplicer，已在用于不同物种，诸如人类、黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、阿拉伯芥(Arabidopsisthaliana)和稻米的数据库上成功地进行训练和/或测试。在一些实施方式中，不同预测工具可经调适以用于不同数据库上的不同范围和/或用于不同物种。在一些实施方式中，一或多种预测工具基于其在某些数据库中和/或用于某些物种的效用来选择。参见例如Saxonov等人(2000)Nucleic Acids Res.,28,185-190。
在一些实施方式中，使用一个或多个剪接位点预测工具来确定潜在剪接供体和/或受体位点。在一些实施方式中，可采用的剪接位点预测工具可在本地运行；可在用户位置处用一组数据重新训练；可使用特定物种(诸如人类)的数据库；可经编译以用于多个平台；允许实时预测序列选择；和/或为OSI认证的开放原始码软件，由此可修改特定工具或插件。可采用的示例性工具包括NNSplice、GeneSplicer或两者。
在一些方面中，这些剪接位点预测工具可用于鉴别含有转殖基因序列的序列(诸如多核苷酸序列)中的潜在剪接供体和/或剪接受体位点的清单。在一些方面中，这些预测工具也可生成多核苷酸中一个或多个序列的一个或多个预测分数，这些预测分数可指示该一个或多个序列成为剪接供体或受体位点序列的可能性。
在一些实施方式中，将特定剪接位点的预测分数与临限分数或参考分数相比较以确定或鉴别作为候选的特定剪接位点以进行消除或移除。举例而言，在一些实施方式中，当预测分数大于或不低于临限分数或参考分数时，将所预测的剪接位点鉴别为潜在剪接位点。在一些方面中，有关消除或移除特定剪接位点的考虑因素包括预测分数与参考分数或临限分数的比较；和特定剪接位点是否为所希望的或有意的(例如当剪接事件更有利或调控转录和/或翻译需要剪接事件时)。在一些方面中，当确定要消除或移除的特定供体和/或受体位点时，也可考虑所得剪接变体丧失所需功能或功能受损的可能性。在一些方面中，一个或多个潜在剪接供体和/或剪接受体位点展现约或至少约0.7分、0.75分、0.8分、0.85分、0.9分、0.95分或1.0分(例如在最大值为1.0的标度上)的剪接事件分数或剪接事件概率，且该位点可为用于剪接位点消除或移除的候选位点。在一些方面中，在一个或多个潜在剪接供体和/或剪接位点处的分数，例如GeneSplicer所使用的分数基于由真马尔可夫模型(Markov model)返回的该序列的优势对数分数与由假马尔可夫模型计算的分数之间的差异。在特定实施方式中，剪接供体位点和剪接受体位点独立地或个别地评价。在一些实施方式中，剪接供体位点和剪接受体位点以剪接供体/受体对形式进行评价。
在一些实施方式中，将一个或多个剪接供体和/或剪接受体位点，诸如可能涉及非所需或引起非所需RNA异质性的隐蔽剪接事件的潜在剪接供体和/或受体位点消除。在一些实施方式中，消除一个或多个剪接位点包含对作为移除候选的剪接供体和/或受体位点中、在这些剪接供体和/或受体位点处、含有这些剪接供体和/或受体位点或在剪接供体和/或受体位点附近的一个或多个核苷酸进行修饰(例如通过取代或置换进行修饰)。在一些方面中，在剪接位点处、含有该剪接位点或在该剪接位点附近的密码子内的特定核苷酸经修饰(例如经取代或置换)。在一些方面中，修饰(诸如取代或置换)保留或保持由该位点处的特定密码子编码的氨基酸，同时移除潜在剪接供体和/或受体位点。
在一些实施方式中，剪接位点处或附近要修饰的密码子包含涉及潜在剪接位点处两个核苷酸中的一个或两个的一个或多个密码子(在一些情况下，称为“剪接位点密码子”)。当预测在密码子中的两个核苷酸之间会发生潜在剪接时，该密码子是此剪接位点的唯一剪接位点密码子。若预测在两个相邻密码子之间，例如在第一密码子的最后一个核苷酸与下一密码子的第一核苷酸之间发生潜在剪接，则该两个密码子均为剪接位点密码子。举例而言，对于预测处于两个密码子的边界处的剪接位点，该两个相邻密码子均可为核苷酸修饰的候选。在一些实施方式中，该一个或多个密码子包含一个剪接位点密码子。在一些实施方式中，该一个或多个密码子包含两个剪接位点密码子。在一些实施方式中，通过修饰一个或两个剪接位点密码子来消除潜在剪接供体位点。在一些实施方式中，通过修饰一个或两个剪接位点密码子来消除潜在剪接受体供体位点。在一些实施方式中，例如当剪接位点密码子不存在同义密码子时，该剪接位点处的一个或两个密码子未经修饰。在一些实施方式中，若不存在可用于特定剪接位点密码子的同义密码子，则邻近密码子中的一个或多个核苷酸可经修饰。在一些实施方式中，经修饰的一个或多个密码子包括剪接位点密码子，其中该修饰包含将该剪接位点处的一个或两个核苷酸变为一个或多个不同核苷酸。在一些实施方式中，通过修饰一个或两个剪接位点密码子来消除剪接供体位点，其中修饰不会将该剪接位点处的核苷酸中的一个或两个变为不同核苷酸，但邻近核苷酸例如邻近于剪接位点的密码子的一部分经修饰。在一些实施方式中，可经修饰的邻近或相邻核苷酸包括修饰作为邻近或相邻密码子的一部分的核苷酸，该邻近或相邻密码子诸如为在剪接位点密码子上游或下游的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个密码子内的密码子。
在一些情况下，多核苷酸可经手动地修饰，同时保留编码的氨基酸序列，以减小预测的剪接位点的概率。在一些实施方式中，具有至少80％、85％、90％或95％的剪接位点概率的所预测的剪接位点中的一个或多个经手动修饰以减小剪接事件的概率。在一些实施方式中，一个或多个修饰通过对1、2、3、4、5、6或7个核苷酸进行核苷酸置换或取代。在一些实施方式中，修饰在剪接供体位点的接合处或在剪接受体位点的接合处。在一些实施方式中，一个或多个核苷酸修饰中的至少一个在剪接受体和/或剪接供体位点的剪接位点接合处的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个残基内。在一些实施方式中，可产生隐蔽剪接位点概率降低的经修饰的核酸序列的文库。在一些实施方式中，剪接供体位点和剪接受体位点以剪接供体/受体对形式进行评价。在特定实施方式中，剪接供体位点和剪接受体位点被独立地或个别地评价，而不是作为剪接供体/受体对的一部分进行评价。在一些实施方式中，一个或多个所预测的剪接位点未得到消除。在一些实施方式中，转录物的启动子区内的剪接位点(诸如已知或所预测的剪接位点)未得到消除。
在一些实施方式中，通过修饰一或两个剪接位点密码子或一个或多个邻近或相邻密码子(例如，若无法获得剪接位点密码子的同义密码子)来消除一个或多个潜在供体剪接位点。在一些实施方式中，通过修饰一或两个剪接位点密码子或一个或多个邻近或相邻密码子(例如，若无法获得剪接位点密码子的同义密码子)来消除一个或多个潜在受体剪接位点。在一些实施方式中，经历修饰的邻近或相邻密码子包括在剪接位点密码子上游或下游的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个密码子内的密码子，诸如在距剪接位点一个、两个或三个密码子内的密码子。在一些实施方式中，将用于剪接的潜在分支位点移除或消除。在一些方面中，在该分支位点处或附近的密码子内的核苷酸可经修饰，例如经取代或置换，以消除隐蔽剪接和/或减小RNA异质性。在一些实施方式中，修饰一个或多个核苷酸可涉及取代或置换可能涉及剪接的核苷酸中的一个(诸如在剪接供体位点、剪接受体位点或剪接分支位点处)，以使得保持由该密码子编码的氨基酸，且核苷酸取代或置换不改变由多核苷酸编码的多肽序列。在一些情况下，密码子中的第三个位置比其他两个位置更具简并性。因此，各种同义密码子可编码特定氨基酸(参见例如以上I.B.2.a.部分)。在一些实施方式中，修饰包括用引入多核苷酸的细胞的物种(例如人类)中所用的同义密码子置换该密码子。在一些实施方式中，该物种是人类。在一些实施方式中，一个或多个密码子经物种中最常使用的相应同义密码子或使用频率与相应密码子类似(例如使用频率最接近)的同义密码子置换(参见例如以上I.B.2.a部分)。
在一些实施方式中，在最初提出的修饰之后，评估用于剪接位点移除的转殖基因候选性。在一些方面中，在修饰和/或密码子优化之后，可再次评价所提出的修饰，以评估所提出的修饰并鉴别任何其他潜在剪接位点。在一些实施方式中，在修饰序列以进行密码子优化和/或剪接位点移除之后，使用相同的或一或多种其他或额外剪接位点预测工具对序列，诸如经修正或经修饰的核酸序列进行一或多种其他评估，以进一步评价剪接位点移除，诸如隐蔽剪接位点移除。在一些方面中，将考虑针对后续步骤提出的修饰，且可使用迭代优化。在一些方面中，可重复鉴别和/或修饰步骤中的任一个，例如直至转录物的异质性相较于最初所测定的转录物的异质性减小为止。在一些实施方式中，可在迭代评价和评估之后进行另一个或不同的修饰，诸如在同一密码子处用不同核苷酸置换，或在不同位置或密码子处进行修饰。在一些实施方式中，可使用相应不同的同义密码子，诸如使用特定物种中第二最常用的或与相应密码子具有类似使用频率(例如次最接近的使用频率)的密码子(参见例如以下II.B.2部分)。
在一些方面中，可进一步评价所提出的修饰以例如评估该修饰是否在多核苷酸中产生非所需或额外的限制位点。在一些方面中，可能不需要额外限制位点，且可考虑另一个或不同的修饰(例如在同一密码子处用不同核苷酸置换或在不同位置或密码子处进行修饰)。在一些方面中，避免特定限制位点，诸如指定的限制位点。在一些方面中，若修饰不会实质上减小剪接位点预测分数，则可提出额外或替代性修饰。在一些实施方式中，在这些方法的一或多次迭代之后，剪接位点预测分数可减小或降低至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或75％。
在一些实施方式中，可使用计算机系统执行一个或多个步骤、工具、功能、过程或脚本。在一些实施方式中，用于剪接位点消除或移除的剪接位点预测、评价和修饰可通过计算机实施的方法和/或通过包括计算机实施的步骤的方法来执行。在一些实施方式中，将序列与已知数据库相比较、计算剪接位点预测分数、确定潜在核苷酸修饰、密码子优化和/或任一个迭代步骤均可通过计算机或使用计算机实施的步骤、工具、功能、过程或脚本来实施。在特定实施方式中，提供包含处理器和内存的计算机系统，其中该内存含有可操作以使处理器进行本申请所提供的方法中的任一个或多个步骤的指令。在一些实施方式中，在计算上执行，例如使用一或多种计算机程序和/或经由使用计算算法来执行步骤、功能、过程或脚本。
用于鉴别和/或移除可能的剪接位点的示例性步骤、功能、过程或脚本包括以下的一个或多个步骤：选择序列，写入FASTA格式序列，加载密码子表(例如来自www.kazusa.or.jp/codon)，运行GeneSplicer，加载预测，解析密码子，测定预测中的重迭，鉴别次最高使用的同义密码子，检查限制位点，产生注释或评估其他密码子。特定步骤可评估正向和反向股两者。在一些方面中，也可考虑先前注释的剪接位点修饰，以使迭代优化。在一些实施方式中，可重复步骤、功能、过程或脚本中的任一个或多个。
在一些实施方式中，提供的编码本申请所提供的抗GPRC5D CAR的多核苷酸，或本申请所提供的构建体包括修饰以移除可能造成剪接事件和/或减少表达和/或增加RNA异质性的一个或多个剪接供体和/或受体位点。在一些实施方式中，提供的多核苷酸在间隔子区中的一个或多个多核苷酸中进行修饰以消除或减少剪接事件。经修饰或未包括在提供的CAR中的潜在剪接供体和/或受体位点示于SEQ ID NO:176、177、178、179、180或181中。
在一些实施方式中，用于减小或消除潜在剪接和/或供体位点的此类位点的经修饰核苷酸示于SEQ ID NO:182、183、184、185、186、187或188中。
在一些实施方式中，提供的编码抗GPRC5D CAR或另一CAR的多核苷酸含有SEQ IDNO:182、183、184、185、186、187或188中所示的一个或多个核苷酸序列。在一些实施方式中，提供的抗GPRC5D CAR包括SEQ ID NO:74中所示的核苷酸序列。在一些实施方式中，间隔子由SEQ ID NO:283中所示的核苷酸序列编码。在一些实施方式中，间隔子由SEQ ID NO:284中所示的核苷酸序列编码。在一些实施方式中，间隔子由SEQ ID NO:305中所示的核苷酸序列编码。
c.其他特征
也提供含有多核苷酸的载体和含有这些载体的宿主细胞，例如用于制造嵌合抗原受体。也提供用于制造嵌合抗原受体的方法。该核酸可编码包含抗体VL区和/或VH区(例如抗体轻链和/或重链)的嵌合抗原受体。该核酸可编码一或多种氨基嵌合抗原受体，这些嵌合抗原受体各自包含抗体VL区和/或VH区(例如抗体轻链和/或重链)。在另一实施方式中，提供一或多种包含此类多核苷酸的载体(例如表达载体)。在另一实施方式中，提供包含此类多核苷酸的宿主细胞。在一个此类实施方式中，宿主细胞包括含编码嵌合抗原受体的核酸的载体(例如经该载体转型)，该嵌合抗原受体包含抗体VH区。在另一个此类实施方式中，宿主细胞包含(例如经以下转型)：(1)含编码嵌合抗原受体的核酸的载体，该嵌合抗原受体包含抗体VL区和抗体VH区；或(2)第一载体和第二载体，该第一载体包含编码含第一抗体的嵌合抗原受体的核酸且该第二载体包含编码含第二抗体的嵌合抗原受体的核酸。在一些实施方式中，宿主细胞包含一个或多个载体(例如经该一个或多个载体转型)，该一个或多个载体包含编码一或多种嵌合抗原受体的一个或多个核酸。在一些实施方式中，提供一或多种此类宿主细胞。在一些实施方式中，提供含有一或多种此类宿主细胞的组合物。在一些实施方式中，该一个或多个宿主细胞可以表达不同嵌合抗原受体，或相同嵌合抗原受体。在一些实施方式中，这些宿主细胞各自可以表达多于一种嵌合抗原受体。
也提供制备抗GPRC5D嵌合抗原受体的方法。对于重组制造嵌合受体，可分离编码例如本申请所描述的嵌合受体抗体的核酸序列并将其插入一个或多个载体中以在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。此类核酸序列可使用常规程序容易地分离和测序(例如通过使用能够特异性结合至编码抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。在一些实施方式中，提供制备抗GPRC5D嵌合抗原受体的方法，其中该方法包含在适于表达受体的条件下培养包含如上文所提供的编码抗体的核酸序列的宿主细胞。
也提供制备抗BCMA嵌合抗原受体的方法。对于重组制造嵌合受体，可分离编码例如本申请所描述的嵌合受体抗体的核酸序列并将其插入一个或多个载体中以在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。此类核酸序列可使用常规程序容易地分离和测序(例如通过使用能够特异性结合至编码抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。在一些实施方式中，提供制造抗BCMA嵌合抗原受体的方法，其中该方法包含在适于表达受体的条件下培养包含如上文所提供的编码抗体的核酸序列的宿主细胞。
也提供制备嵌合抗原构建体的方法，这些嵌合抗原构建体包含抗GPRC5D嵌合抗原受体和抗BCMA嵌合抗原受体两者。对于重组制造嵌合受体，可分离编码例如本申请所描述的两种嵌合受体抗体的核酸序列并将其插入一个或多个载体中以在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。此类核酸序列可使用常规程序容易地分离和测序(例如通过使用能够特异性结合至编码抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。在一些实施方式中，提供制备双重CAR的方法，其中该方法包含在适于表达受体的条件下培养包含如上文所提供的编码抗体的核酸序列的宿主细胞。
也提供制备结合GPRC5D和BCMA两者的嵌合抗原受体的方法。对于重组制造嵌合受体，可分离编码例如本申请所描述的两种嵌合受体抗体的核酸序列并将其插入一个或多个载体中以在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。此类核酸序列可使用常规程序容易地分离和测序(例如通过使用能够特异性结合至编码抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。在一些实施方式中，提供制备结合BCMA和GPRC5D的嵌合抗原受体的方法，其中该方法包含在适于表达受体的条件下培养包含如以上所提供的编码抗体的核酸序列的宿主细胞。
在一些实施方式中，提供一种制备细胞组合物的方法，该细胞组合物包含表达抗BCMA嵌合抗原受体的细胞和表达抗GPRC5D嵌合抗原受体的细胞。
除原核生物之外，真核微生物，诸如丝状真菌或酵母，也适用于编码抗体的载体的克隆或表达宿主，包括糖基化路径已经修饰以仿真或接近人类细胞中的糖基化路径，从而产生具有部分或完全人类糖基化模式的抗体的真菌和酵母菌株。参见Gerngross,Nat.Biotech.22:1409-1414(2004)；和Li等人,Nat.Biotech.24:210-215(2006)。
可用于表达多肽的示例性真核细胞包括(但不限于)COS细胞，包括COS 7细胞；293细胞，包括293-6E细胞；CHO细胞，包括CHO-S、DG44.Lec13 CHO细胞和FUT8 CHO细胞；PER.
细胞；和NSO细胞。在一些实施方式中，抗体重链和/或轻链(例如VH区和/或VL区)可在酵母中表达(参见例如美国公开第2006/0270045A1号)。在一些实施方式中，特定真核宿主细胞基于其对重链和/或轻链(例如VH区和/或VL区)进行所需翻译后修饰的能力来选择。举例而言，在一些实施方式中，CHO细胞产生多肽，这些多肽的唾液酸化水平高于在293细胞中所产生的相同多肽。在特定实例中，使用免疫细胞，诸如人类免疫细胞表达所提供的编码嵌合抗原受体的多肽。在一些实例中，免疫细胞是T细胞，诸如CD4+和/或CD8+免疫细胞。
II.BCMA结合受体和编码多核苷酸
在一些方面中，提供BCMA结合剂，诸如结合BCMA分子的重组受体或嵌合抗原受体，以及编码BCMA结合细胞表面蛋白质，诸如重组受体(例如CAR)的多核苷酸，和表达此类受体的细胞。BCMA结合细胞表面蛋白质一般含有特异性结合至BCMA，诸如特异性结合至BCMA蛋白质，诸如人类BCMA蛋白质的抗体(例如抗原结合抗体片段)和/或其他结合肽。在一些方面中，这些药剂结合至BCMA的细胞外部分。
提供的多核苷酸中有编码特异性结合BCMA的重组受体，诸如抗原受体的多核苷酸。在一些方面中，也提供所编码的受体，诸如含有BCMA结合多肽的受体，以及其组合物和制品和用途。
这些BCMA结合结合多肽中有抗体，诸如单链抗体(例如抗原结合抗体片段)，或其部分。在一些实例中，重组受体是嵌合抗原受体，诸如含有抗BCMA抗体或其抗原结合片段的嵌合抗原受体。所提供的多核苷酸可并入构建体中，诸如脱氧核糖核酸(DNA)或RNA构建体中，诸如可引入至用于表达所编码的重组BCMA结合受体的细胞中的构建体中。
编码BCMA结合多肽的多核苷酸包含如类似前述部分，包括I部分(例如I.C.部分)中所阐述的特征。
所提供的BCMA结合受体一般含有细胞外结合分子和细胞内信号转导结构域。提供的受体中有含有抗体的多肽，诸如含有抗BCMA的重组细胞表面受体。此类受体包括含有此类抗体的嵌合抗原受体。
提供的重组受体中有包括BCMA结合片段的嵌合抗原受体。这些重组受体包括特异性结合至BCMA的嵌合抗原受体，诸如含有抗BCMA抗体，例如BCMA抗原结合片段的抗原受体。这些抗原受体中有功能性非TCR抗原受体，诸如嵌合抗原受体(CAR)。也提供表达重组受体的细胞和其在过继细胞疗法中的用途，诸如用于治疗与BCMA表达相关的疾病和病症，例如多发性骨髓瘤。
在这些嵌合受体中有嵌合抗原受体(CAR)。这些嵌合受体，诸如CAR一般包括细胞外抗原结合结构域，该细胞外抗原结合结构域包括、是或包含抗BCMA抗体。因此，嵌合受体，例如CAR，在其细胞外部分中通常包括一个或多个BCMA结合分子，诸如一个或多个抗原结合片段、结构域或部分，或一个或多个抗体可变区、和/或抗体分子，诸如本申请所描述的分子。
在一些实施方式中，第一CAR包括抗体分子的一个或多个GPRC5D结合部分，诸如抗体的重链可变(VH)区和/或轻链可变(VL)区，例如scFv抗体片段。在一些实施方式中，提供的GPRC5D结合CAR含有赋予所提供CAR的GPRC5D结合特性的抗体，诸如抗GPRC5D抗体，或其抗原结合片段。在一些实施方式中，该抗体或抗原结合结构域可为所描述的任何抗GPRC5D抗体或来源于所描述的任何抗GPRC5D抗体(参见例如WO 2016/090312、WO 2016/090329、WO2018/017786)。此类抗GPRC5D抗体或抗原结合片段中的任一种均可用于所提供的CAR中。在一些实施方式中，抗GPRC5D CAR含有抗原结合结构域，其是含有来源于WO 2016/090312、WO2016/090329或WO 2018/017786中所描述的抗体的重链可变(VH)和/或轻链可变(VL)区的scFv。
在一些实施方式中，抗体，例如抗GPRC5D抗体，或抗原结合片段含有如所描述的重链和/或轻链可变(VH或VL)区序列或其足够抗原结合部分。在一些实施方式中，抗GPRC5D抗体，例如抗原结合片段，包括含如所描述的CDR-H1、CDR-H2和/或CDR-H3的VH区序列或其足够抗原结合部分。在一些实施方式中，抗GPRC5D抗体，例如抗原结合片段，包括含如所描述的CDR-L1、CDR-L2和/或CDR-L3的VL区序列或其足够抗原结合部分。在一些实施方式中，抗GPRC5D抗体，例如抗原结合片段，包括含如所描述的CDR-H1、CDR-H2和/或CDR-H3的VH区序列，且包括含如所描述的CDR-L1、CDR-L2和/或CDR-L3的VL区序列。另外，在这些抗体中有具有与此类序列至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致的序列的抗体。
在一些实施方式中，所提供的CAR中的抗体或抗体片段具有WO 2016/090312、WO2016/090329和WO 2018/017786中任一个所描述的抗体或抗体结合片段中的任一种的VH区。
在一些实施方式中，CAR含有抗体或其抗原结合片段，其具有重链可变(VH)区，该VH区具有选自SEQ ID NO:21、23、25、27、29、31或33中的任一个的氨基酸序列或与选自SEQID NO:21、23、25、27、29、31或33中的任一个的VH区氨基酸具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列，或含有此类VH序列中存在的CDR-H1、CDR-H2和/或CDR-H3。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段的VH区包含根据Kabat编号的CDR-H1、CDR-H2和/或CDR-H3。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段的VH区包含根据Chothia编号的CDR-H1、CDR-H2和/或CDR-H3。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段的VH区包含根据AbM编号的CDR-H1、CDR-H2和/或CDR-H3。
在一些实施方式中，CAR含有抗体或其抗原结合片段，其具有重链可变(VH)区，该VH区包括含选自SEQ ID NO:75、78、80、82、90、93、95、97、105、108、110、112、120、123、125、127、135、138、140、142、152、162、165、167和169的氨基酸序列的CDR-H1；(b)含选自SEQ IDNO:76、79、81、83、91、94、96、98、106、109、111、113、121、124、126、128、136、139、141、143、150、153、154、155、163、166、168和170的氨基酸序列的CDR-H2；和(c)含选自SEQ ID NO:77、84、92、99、107、114、122、129、137、144、151、156、164和171的氨基酸序列的CDR-H3。
在一些实施方式中，该抗体或其抗原结合片段包含VH区，其包括分别含以下的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3：SEQ ID NO:75、76和77；SEQ ID NO:78、79和77；SEQID NO:80、81和77；SEQ ID NO:82、83和84；SEQ ID NO:90、91和92；SEQ ID NO:93、94和92；SEQ ID NO:95、96和92；SEQ ID NO:97、98和99；SEQ ID NO:105、106和107；SEQ ID NO:108、109和107；SEQ ID NO:110、111和107；SEQ ID NO:112、113和114；SEQ ID NO:120、121和122；SEQ ID NO:123、124和122；SEQ ID NO:125、126和122；SEQ ID NO:127、128和129；SEQID NO:135、136和137；SEQ ID NO:138、139和137；SEQ ID NO:140、141和137；SEQ ID NO:142、143和144；SEQ ID NO:135、150和151；SEQ ID NO:152、153和151；SEQ ID NO:140、154和151；SEQ ID NO:142、155和156；SEQ ID NO:162、163和164；SEQ ID NO:165、166和164；SEQ ID NO:167、168和164；SEQ ID NO:169、170和171。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含VH区，其包含以下的氨基酸序列：分别为SE Q ID NO:75、76和77；分别为SEQ ID NO:78、79和77；分别为SEQ ID NO:80、81和77；分别为SEQ ID NO:82、83和84；分别为SEQ ID NO:90、91和92；分别为SEQ ID NO:93、94和92；分别为SEQ ID NO:95、96和92；分别为SEQ ID NO:97、98和99；分别为SEQ ID NO:105、106和107；分别为SEQ ID NO:108、109和107；分别为SEQ ID NO:110、111和107；分别为SEQID NO:112、113和114；分别为SEQ ID NO:120、121和122；分别为SEQ ID NO:123、124和122；分别为SEQ ID NO:125、126和122；分别为SEQ ID NO:127、128和129；分别为SEQ ID NO:135、136和137；分别为SEQ ID NO:138、139和137；分别为SEQ ID NO:140、141和137；分别为SEQ ID NO:142、143和144；分别为SEQ ID NO:135、150和151；分别为SEQ ID NO:152、153和151；分别为SEQ ID NO:140、154和151；分别为SEQ ID NO:142、155和156；分别为SEQ IDNO:162、163和164；分别为SEQ ID NO:165、166和164；分别为SEQ ID NO:167、168和164；分别为SEQ ID NO:169、170和171。
在一些实施方式中，该抗体或其抗原结合片段包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其分别包含SEQ ID NO:21、23、25、27、29、31或33中的任一个中所示的VH区氨基酸序列内所包含的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的氨基酸序列。
在本申请所提供的抗体或其抗原结合片段的一些实施方式中，VH区包含如所描述的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3中的任一个且包含分别与SEQ ID NO:21、23、25、27、29、31或33中的任一个中所示的VH区氨基酸序列内所包含的FR1、FR2、FR3和/或FR4具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的构架区1(FR1)、FR2、FR3和/或FR4。
在一些实施方式中，该抗体或其抗原结合片段包括含SEQ ID NO:21、23、25、27、29、31或33中的任一个中所示的氨基酸序列的VH区。
在一些实施方式中，提供的CAR(例如抗GPRC5D CAR)中包含VH区的抗体或抗体片段进一步包含轻链或其足够抗原结合部分。举例而言，在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段含有VH区和VL区，或VH和VL区的足够抗原结合部分。在此类实施方式中，VH区序列可为上文所描述的VH序列中的任一个。在一些此类实施方式中，抗体是抗原结合片段，诸如Fab或scFv。在一些此类实施方式中，抗体是另外含有恒定区的全长抗体。
在一些实施方式中，本申请所提供的CAR包括含以上VH区中的任一个且含有轻链可变区或其足够抗原结合部分的抗体，诸如抗GPRC5D抗体，或其抗原结合片段。举例而言，在一些实施方式中，CAR包括含VH区和轻链可变(VL)区、或VH和VL区的足够抗原结合部分的抗体或其抗原结合片段。在此类实施方式中，VH区序列可为上文所描述的VH序列中的任一个。在一些此类实施方式中，抗体是抗原结合片段，诸如Fab或scFv。在一些此类实施方式中，抗体是另外含有恒定区的全长抗体。
在一些实施方式中，抗体或抗原结合片段具有WO 2016/090312、WO 2016/090329和WO 2018/017786中的任一个中所描述的VL区。
在一些实施方式中，CAR含有抗体或其抗原结合片段，其具有轻链可变(VL)区，该VL区具有选自SEQ ID NO:22、24、26、28、30、32、34、63、64、65、66、67、68或69中的任一个的氨基酸序列或与选自SEQ ID NO:22、24、26、28、30、32、34、63、64、65、66、67、68或69中的任一个的VL区氨基酸具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列，或含有此类VL序列中存在的CDR-L1、CDR-L2和/或CDR-L3。在一些实施方式中，CAR含有抗体或其抗原结合片段，其具有轻链可变(VL)区，该VL区具有选自SEQ ID NO:22、24、26、28、30、32或34中的任一个的氨基酸序列，或与选自SEQ ID NO:22、24、26、28、30、32或34中的任一个的VL区氨基酸具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列，或含有此类VL序列中存在的CDR-L1、CDR-L2和/或CDR-L3。在一些实施方式中，CAR含有抗体或其抗原结合片段，其具有轻链可变(VL)区，该VL区具有选自SEQ ID NO:63、64、65、66、67、68或69中的任一个的氨基酸序列，或与选自SEQ ID NO:63、64、65、66、67、68或69中的任一个的VL区氨基酸具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列，或含有此类VL序列中存在的CDR-L1、CDR-L2和/或CDR-L3。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段的VL区包含根据Kabat编号的CDR-L1、CDR-L2和/或CDR-L3。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段的VL区包含根据Chothia编号的CDR-L1、CDR-L2和/或CDR-L3。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段的VL区包含根据AbM编号的CDR-L1、CDR-L2和/或CDR-L3。
在一些实施方式中，CAR含有抗体或其抗原结合片段，其具有轻链可变(VL)区，该VL区包括含选自SEQ ID NO:85、88、100、103、115、118、130、133、145、148、157、160、172和174的氨基酸序列的CDR-L1；(b)含选自SEQ ID NO:86、89、101、104、116、119、131、134、146、149、158和161的氨基酸序列的CDR-L2；和(c)含选自SEQ ID NO:87、102、117、132、147、159、173和175的氨基酸序列的CDR-L3。
在一些实施方式中，该抗体或其抗原结合片段包含VL区，其包括分别含以下的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3：SEQ ID NO:85、86和87；SEQ ID NO:88、89和87；SEQID NO:100、101和102；SEQ ID NO:103、104和102；SEQ ID NO:115、116和117；SEQ ID NO:118、119和117；SEQ ID NO:130、131和132；SEQ ID NO:133、134和132；SEQ ID NO:145、146和147；SEQ ID NO:148、149和147；SEQ ID NO:157、158和159；SEQ ID NO:160、161和159；SEQ ID NO:172、86和173；SEQ ID NO:174、89和175；SEQ ID NO:174、89和297。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含VL区，其包含以下的氨基酸序列：分别为SEQ ID NO:85、86和87；分别为SEQ ID NO:88、89和87；分别为SEQ ID NO:100、101和102；分别为SEQ ID NO:103、104和102；分别为SEQ ID NO:115、116和117；分别为SEQ IDNO:118、119和117；分别为SEQ ID NO:130、131和132；分别为SEQ ID NO:133、134和132；分别为SEQ ID NO:145、146和147；分别为SEQ ID NO:148、149和147；分别为SEQ ID NO:157、158和159；分别为SEQ ID NO:160、161和159；分别为SEQ ID NO:172、86和173；分别为SEQID NO:174、89和175；分别为SEQ ID NO:174、89和297。
在一些实施方式中，该抗体或其抗原结合片段含有选自SEQ ID NO:22、24、26、28、30、32、34、63、64、65、66、67、68或69中的任一个的VL区氨基酸序列内分别包含的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一些实施方式中，该抗体或其抗原结合片段含有选自SEQ ID NO:22、24、26、28、30、32或34中的任一个的VL区氨基酸序列内分别包含的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一些实施方式中，该抗体或其抗原结合片段含有选自SEQ ID NO:63、64、65、66、67、68或69中的任一个的VL区氨基酸序列内分别包含的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
在本申请所提供的CAR中有这样一种CAR，其中提供的CAR中的抗体，诸如抗GPRC5D抗体或抗体片段包含与SEQ ID NO:21、23、25、27、29、31或33中的任一个中所示的氨基酸序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的VH区氨基酸序列，和含与SEQ ID NO:22、24、26、28、30、32、34、63、64、65、66、67、68或69中的任一个中所示的氨基酸序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列的VL区。
在一些实施方式中，该抗体或其抗原结合片段的VH区包括分别含选自SEQ ID NO:21、23、25、27、29、31或33中的任一个的VH区氨基酸序列内所包含的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3；且包括分别含选自SEQ ID NO:22、24、26、28、30、32、34、63、64、65、66、67、68或69中的任一个的VL区氨基酸序列内所包含的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3。
在一些实施方式中，该抗体或其抗原结合片段的VH区包含SEQ ID NO:21、23、25、27、29、31或33的氨基酸序列且该抗体或抗原结合片段的VL区包含SEQ ID NO:22、24、26、28、30、32或34的氨基酸序列。在一些实施方式中，该抗体或其抗原结合片段的VH和VL区分别包含以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:21和22；SEQ ID NO:23和24；SEQ ID NO:25和26；SEQID NO:27和28；SEQ ID NO:29和30；SEQ ID NO:31和32；或SEQ ID NO:33和34，或与以上VH和VL中的任一个具有至少90％序列一致性，诸如与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的任何抗体或其抗原结合片段。
举例而言，其中提供的抗体或其抗原结合片段的VH和VL区包含分别选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:21和22；SEQ ID NO:23和24；SEQ ID NO:25和26；SEQ ID NO:27和28；SEQ ID NO:29和30；SEQ ID NO:31和32；SEQ ID NO:33和34。在其他实例中，其中提供的抗体或其抗原结合片段的VH和VL区包含分别选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:21和63；SEQID NO:23和64；SEQ ID NO:25和65；SEQ ID NO:27和66；SEQ ID NO:29和67；SEQ ID NO:31和68；SEQ ID NO:33和69。
在一些实施方式中，提供的CAR中的抗体或其抗原结合片段是单链抗体片段，诸如单链可变片段(scFv)、或双功能抗体、或单结构域抗体(sdAb)。在一些实施方式中，抗体或抗原结合片段是仅包含VH区的单结构域抗体。在一些实施方式中，抗体或抗原结合片段是包含重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区的scFv。在一些实施方式中，单链抗体片段(例如scFv)包括接合两个抗体结构域或区域，诸如重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区的一个或多个连接物。连接物通常是肽连接物，例如柔性和/或可溶性肽连接物。在这些连接物中有富含甘氨酸和丝氨酸和/或在一些情况下富含苏氨酸的连接物。在一些实施方式中，连接物进一步包括能够改善溶解度的带电残基，诸如赖氨酸和/或谷氨酸。在一些实施方式中，连接物进一步包括一个或多个脯氨酸。
因此，所提供的CAR含有抗GPRC5D抗体，其包括单链抗体片段，诸如scFv和双功能抗体，尤其是人类单链抗体片段，通常包含接合两个抗体结构域或区域，即这些VH和VL区的连接物。连接物通常是肽连接物，例如柔性和/或可溶性肽连接物，诸如富含甘氨酸和丝氨酸的肽连接物。
在一些方面中，富含甘氨酸和丝氨酸(和/或苏氨酸)的连接物包括至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的此类氨基酸。在一些实施方式中，其包括至少或至少约50％、55％、60％、70％或75％的甘氨酸、丝氨酸和/或苏氨酸。在一些实施方式中，连接物基本上完全由甘氨酸、丝氨酸和/或苏氨酸构成。连接物的长度一般在约5个与约50个氨基酸之间，通常在或在约10个与或与约30个之间，例如为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个，且在一些实例中，长度在10个与25个氨基酸之间。示例性连接物包括具有各种数量的序列GGGGS(4GS；SEQ IDNO:50)或GGGS(3GS；SEQ ID NO:51)的重复(诸如在2、3、4与5个之间的此类序列的重复)的连接物。示例性连接物包括具有SEQ ID NO:52中所示的序列(GGGGSGGGGSGGGGS)或由其组成的连接物。示例性连接物进一步包括具有SEQ ID NO:53中所示的序列(GSTSGSGKPGSGEGSTKG)或由其组成的连接物。示例性连接物进一步包括具有SEQ ID NO:54中所示的序列(SRGGGGSGGGGSGGGGSLEMA)或由其组成的连接物。示例性连接物包括具有SEQID NO:47中所示的序列(GSRGGGGSGGGGSGGGGSLEMA)或由其组成的连接物。
因此，在一些实施方式中，所提供的实施方式包括含前述连接物中的一个或多个的单链抗体片段，例如scFv，这些连接物为诸如富含甘氨酸/丝氨酸的连接物，包括具有GGGS(SEQ ID NO:51)或GGGGS(SEQ ID NO:50)的重复的连接物，诸如SEQ ID NO:47、52或54中所示的连接物。
在一些实施方式中，VH区可在VL区的氨基末端。在一些实施方式中，VH区可在VL区的羧基末端。在特定实施方式中，片段，例如scFv，可包括VH区或其部分，随后为连接物，随后为VL区或其部分。在其他实施方式中，片段，例如scFv，可包括VL区或其部分，随后为连接物，随后为VH区或其部分。
在一些方面中，本申请所提供的scFv包含选自SEQ ID NO:1-14中的任一个的氨基酸序列，或具有与选自SEQ ID NO:1-14中的任一个的氨基酸序列至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。
在提供的抗GPRC5D CAR中有这样一种CAR，其中抗体或抗原结合片段含有VH区，其包含SEQ ID NO:21中所示的序列或与SEQ ID NO:21具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；且含有VL区，其包含SEQ ID NO:22中所示的序列或与SEQ ID NO:22具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％至少或至少约至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列。在一些实施方式中，提供的CAR是这样一种CAR，其中抗体或抗原结合片段含有VH区，其包含SEQ ID NO:21中所示的序列或与SEQ IDNO:21具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；且含有VL区，其包含SEQ ID NO:63中所示的序列或与SEQ ID NO:63具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列。在一些实施方式中，提供的CAR中的抗体或抗原结合片段包括：VH区，其具有分别含SEQ ID NO:75、76和77的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和VL区，其具有分别含SEQ ID NO:85、86和87的氨基酸序列的CDRL1、CDRL2和CDRL3。在一些实施方式中，提供的CAR中的抗体或抗原结合片段包括：VH区，其具有分别含SEQ ID NO:78、79和77的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和VL区，其具有分别含SEQ ID NO:85、86和87的氨基酸序列的CDRL1、CDRL2和CDRL3。在一些实施方式中，提供的CAR中的抗体或抗原结合片段包括：VH区，其具有分别含SEQ ID NO:80、81和77的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和VL区，其具有分别含SEQ ID NO:85、86和87的氨基酸序列的CDRL1、CDRL2和CDRL3。在一些实施方式中，提供的CAR中的抗体或抗原结合片段包括：VH区，其具有分别含SEQ ID NO:82、83和84的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和VL区，其具有分别含SEQ ID NO:88、89和87的氨基酸序列的CDRL1、CDRL2和CDRL3。在一些实施方式中，VH区包含SEQ ID NO:21中所示的序列且VL区包含SEQ ID NO:22中所示的序列。在一些实施方式中，VH区包含SEQ ID NO:21中所示的序列且VL区包含SEQ ID NO:63中所示的序列。在一些实施方式中，抗体或抗原结合片段是单链抗体片段，诸如scFv。在一些实施方式中，scFv包含SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致的氨基酸序列。在一些实施方式中，scFv由SEQ ID NO:257中所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO:257至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致的核苷酸序列编码。在一些实施方式中，scFv包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:2至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致的氨基酸序列。在一些实施方式中，scFv由SEQ ID NO:258中所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO:258至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致的核苷酸序列编码。
提供的抗GPRC5D CAR中有这样一种CAR，其中该抗体或抗原结合片段含有VH区，其包含SEQ ID NO:23中所示的序列或与SEQ ID NO:23具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；且含有VL区，其包含SEQ ID NO:24中所示的序列或与SEQ ID NO:24具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列。在一些实施方式中，提供的CAR是这样一种CAR，其中该抗体或抗原结合片段含有VH区，其包含SEQ ID NO:23中所示的序列或与SEQ ID NO:23具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；且含有VL区，其包含SEQ ID NO:64中所示的序列或与SEQ ID NO:64具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列。在一些实施方式中，提供的CAR中的抗体或抗原结合片段含有VH区，其具有分别含SEQ ID NO:90、91、92的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和VL区，其具有分别含SEQ ID NO:100、101和102的氨基酸序列的CDRL1、CDRL2和CDRL3。在一些实施方式中，提供的CAR中的抗体或抗原结合片段含有VH区，其具有分别含SEQ ID NO:93、94和92的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和VL区，其包括含SEQ ID NO:100、101和102的氨基酸序列的CDRL1、CDRL2和CDRL3。在一些实施方式中，提供的CAR中的抗体或抗原结合片段含有VH区，其具有分别含SEQ ID NO:95、96和92的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和VL区，其包括分别含SEQ ID NO:100、101和102的氨基酸序列的CDRL1、CDRL2和CDRL3。在一些实施方式中，提供的CAR中的抗体或抗原结合片段含有VH区，其具有分别含SEQ ID NO:97、98和99的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和VL区，其包括分别含SEQ ID NO:103、104和102的氨基酸序列的CDRL1、CDRL2和CDRL3。在一些实施方式中，该VH区包含SEQ ID NO:23中所示的序列且该VL区包含SEQ ID NO:24中所示的序列。在一些实施方式中，该VH区包含SEQ ID NO:23中所示的序列且该VL区包含SEQ IDNO:64中所示的序列。在一些实施方式中，该抗体或抗原结合片段是单链抗体片段，诸如scFv。在一些实施方式中，scFv包含SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:3至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致的氨基酸序列。在一些实施方式中，scFv由SEQ ID NO:259中所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO:259至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致的核苷酸序列编码。在一些实施方式中，scFv包含SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:4至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致的氨基酸序列。在一些实施方式中，scFv由SEQ ID NO:260中所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO:260至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致的核苷酸序列编码。
提供的抗GPRC5D CAR是这样一种CAR，其中该抗体或抗原结合片段含有VH区，其包含SEQ ID NO:25中所示的序列或与SEQ ID NO:25具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；且含有VL区，其包含SEQ ID NO:26中所示的序列或与SEQ ID NO:26具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列。在一些实施方式中，提供的CAR是这样一种CAR，其中该抗体或抗原结合片段含有VH区，其包含SEQ ID NO:25中所示的序列或与SEQ ID NO:25具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；且含有VL区，其包含SEQ ID NO:65中所示的序列或与SEQ ID NO:65具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列。在一些实施方式中，提供的CAR中的抗体或抗原结合片段含有VH区，其具有分别含SEQ ID NO:105、106、107的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和VL区，其具有分别含SEQ ID NO:115、116和117的氨基酸序列的CDRL1、CDRL2和CDRL3。在一些实施方式中，提供的CAR中的抗体或抗原结合片段含有VH区，其具有分别含SEQ ID NO:108、109和107的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和VL区，其包括分别含SEQ ID NO:115、116和117的氨基酸序列的CDRL1、CDRL2和CDRL3。在一些实施方式中，提供的CAR中的抗体或抗原结合片段含有VH区，其具有分别含SEQ ID NO:110、111和107的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和VL区，其包括分别含SEQ ID NO:115、116和117的氨基酸序列的CDRL1、CDRL2和CDRL3。在一些实施方式中，提供的CAR中的抗体或抗原结合片段含有VH区，其具有分别含SEQ ID NO:112、113和114的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和VL区，其包括分别含SEQ ID NO:118、119和117的氨基酸序列的CDRL1、CDRL2和CDRL3。在一些实施方式中，该VH区包含SEQ ID NO:25中所示的序列且该VL区包含SEQ ID NO:26中所示的序列。在一些实施方式中，该VH区包含SEQ ID NO:25中所示的序列且该VL区包含SEQ ID NO:65中所示的序列。在一些实施方式中，该抗体或抗原结合片段是单链抗体片段，诸如scFv。在一些实施方式中，scFv包含SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:5至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致的氨基酸序列。在一些实施方式中，scFv由SEQ ID NO:261中所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO:261至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致的核苷酸序列编码。在一些实施方式中，scFv包含SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:6至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致的氨基酸序列。在一些实施方式中，scFv由SEQ IDNO:262中所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO:262至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致的核苷酸序列编码。
提供的抗GPRC5D CAR是这样一种CAR，其中该抗体或抗原结合片段含有VH区，其包含SEQ ID NO:27中所示的序列或与SEQ ID NO:27具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；且含有VL区，其包含SEQ ID NO:28中所示的序列或与SEQ ID NO:28具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列。在一些实施方式中，提供的CAR是这样一种CAR，其中该抗体或抗原结合片段含有VH区，其包含SEQ ID NO:27中所示的序列或与SEQ ID NO:27具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；且含有VL区，其包含SEQ ID NO:66中所示的序列或与SEQ ID NO:66具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列。在一些实施方式中，提供的CAR中的抗体或抗原结合片段含有VH区，其具有分别含SEQ ID NO:120、121和122的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和VL区，其具有分别含SEQ ID NO:130、131和132的氨基酸序列的CDRL1、CDRL2和CDRL3。在一些实施方式中，提供的CAR中的抗体或抗原结合片段含有VH区，其具有分别含SEQ ID NO:123、124和122的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和VL区，其包括分别含SEQ ID NO:130、131和132的氨基酸序列的CDRL1、CDRL2和CDRL3。在一些实施方式中，提供的CAR中的抗体或抗原结合片段含有VH区，其具有分别含SEQ ID NO:125、126和122的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和VL区，其包括分别含SEQ ID NO:130、131和132的氨基酸序列的CDRL1、CDRL2和CDRL3。在一些实施方式中，提供的CAR中的抗体或抗原结合片段含有VH区，其具有分别含SEQ ID NO:127、128和129的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和VL区，其包括分别含SEQ ID NO:133、134和132的氨基酸序列的CDRL1、CDRL2和CDRL3。在一些实施方式中，该VH区包含SEQ ID NO:27中所示的序列且该VL区包含SEQ ID NO:28中所示的序列。在一些实施方式中，该VH区包含SEQ ID NO:27中所示的序列且该VL区包含SEQ ID NO:66中所示的序列。在一些实施方式中，该抗体或抗原结合片段是单链抗体片段，诸如scFv。在一些实施方式中，scFv包含SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:7至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致的氨基酸序列。在一些实施方式中，scFv由SEQ ID NO:263中所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO:263至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致的核苷酸序列编码。在一些实施方式中，scFv包含SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:8至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致的氨基酸序列。在一些实施方式中，scFv由SEQ IDNO:264中所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO:264至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致的核苷酸序列编码。
提供的抗GPRC5D CAR是这样一种CAR，其中该抗体或抗原结合片段含有VH区，其包含SEQ ID NO:29中所示的序列或与SEQ ID NO:29具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；且含有VL区，其包含SEQ ID NO:30中所示的序列或与SEQ ID NO:30具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列。在一些实施方式中，提供的CAR是这样一种CAR，其中该抗体或抗原结合片段含有VH区，其包含SEQ ID NO:29中所示的序列或与SEQ ID NO:29具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；且含有VL区，其包含SEQ ID NO:67中所示的序列或与SEQ ID NO:67具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列。在一些实施方式中，提供的CAR中的抗体或抗原结合片段含有VH区，其具有分别含SEQ ID NO:135、136和137的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和VL区，其具有分别含SEQ ID NO:145、146和147的氨基酸序列的CDRL1、CDRL2和CDRL3。在一些实施方式中，提供的CAR中的抗体或抗原结合片段含有VH区，其具有分别含SEQ ID NO:138、139和137的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和VL区，其包括分别含SEQ ID NO:145、146和147的氨基酸序列的CDRL1、CDRL2和CDRL3。在一些实施方式中，提供的CAR中的抗体或抗原结合片段含有VH区，其具有分别含SEQ ID NO:140、141和137的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和VL区，其包括分别含SEQ ID NO:145、146和147的氨基酸序列的CDRL1、CDRL2和CDRL3。在一些实施方式中，提供的CAR中的抗体或抗原结合片段含有VH区，其具有分别含SEQ ID NO:142、143和144的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和VL区，其包括分别含SEQ ID NO:148、149和147的氨基酸序列的CDRL1、CDRL2和CDRL3。在一些实施方式中，该VH区包含SEQ ID NO:29中所示的序列且该VL区包含SEQ ID NO:30中所示的序列。在一些实施方式中，该VH区包含SEQ ID NO:29中所示的序列且该VL区包含SEQ ID NO:67中所示的序列。在一些实施方式中，该抗体或抗原结合片段是单链抗体片段，诸如scFv。在一些实施方式中，scFv包含SEQ ID NO:9中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:9至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致的氨基酸序列。在一些实施方式中，scFv由SEQ ID NO:265中所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO:265至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致的核苷酸序列编码。在一些实施方式中，scFv包含SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:10至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致的氨基酸序列。在一些实施方式中，scFv由SEQ IDNO:266中所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO:266至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致的核苷酸序列编码。
提供的抗GPRC5D CAR是这样一种CAR，其中该抗体或抗原结合片段含有VH区，其包含SEQ ID NO:31中所示的序列或与SEQ ID NO:31具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；且含有VL区，其包含SEQ ID NO:32中所示的序列或与SEQ ID NO:32具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列。在一些实施方式中，提供的CAR是这样一种CAR，其中该抗体或抗原结合片段含有VH区，其包含SEQ ID NO:31中所示的序列或与SEQ ID NO:31具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；且含有VL区，其包含SEQ ID NO:68中所示的序列或与SEQ ID NO:68具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列。在一些实施方式中，提供的CAR中的抗体或抗原结合片段含有VH区，其具有分别含SEQ ID NO:135、150和151的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和VL区，其具有分别含SEQ ID NO:157、158和159的氨基酸序列的CDRL1、CDRL2和CDRL3。在一些实施方式中，提供的CAR中的抗体或抗原结合片段含有VH区，其具有分别含SEQ ID NO:152、153和151的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和VL区，其包括分别含SEQ ID NO:157、158和159的氨基酸序列的CDRL1、CDRL2和CDRL3。在一些实施方式中，提供的CAR中的抗体或抗原结合片段含有VH区，其具有分别含SEQ ID NO:140、154和151的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和VL区，其包括分别含SEQ ID NO:157、158和159的氨基酸序列的CDRL1、CDRL2和CDRL3。在一些实施方式中，提供的CAR中的抗体或抗原结合片段含有VH区，其具有分别含SEQ ID NO:142、155和156的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和VL区，其包括分别含SEQ ID NO:160、161和159的氨基酸序列的CDRL1、CDRL2和CDRL3。在一些实施方式中，该VH区包含SEQ ID NO:31中所示的序列且该VL区包含SEQ ID NO:32中所示的序列。在一些实施方式中，该VH区包含SEQ ID NO:31中所示的序列且该VL区包含SEQ ID NO:68中所示的序列。在一些实施方式中，该抗体或抗原结合片段是单链抗体片段，诸如scFv。在一些实施方式中，scFv包含SEQ ID NO:11中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:11至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致的氨基酸序列。在一些实施方式中，scFv由SEQ ID NO:267中所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO:267至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致的核苷酸序列编码。在一些实施方式中，scFv包含SEQ ID NO:12中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:12至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致的氨基酸序列。在一些实施方式中，scFv由SEQ IDNO:268中所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO:268至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致的核苷酸序列编码。
提供的抗GPRC5D CAR是这样一种CAR，其中该抗体或抗原结合片段含有VH区，其包含SEQ ID NO:33中所示的序列或与SEQ ID NO:33具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；且含有VL区，其包含SEQ ID NO:34中所示的序列或与SEQ ID NO:34具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列。在一些实施方式中，提供的CAR是这样一种CAR，其中该抗体或抗原结合片段含有VH区，其包含SEQ ID NO:33中所示的序列或与SEQ ID NO:33具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；且含有VL区，其包含SEQ ID NO:69中所示的序列或与SEQ ID NO:69具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列。在一些实施方式中，提供的CAR中的抗体或抗原结合片段含有VH区，其具有分别含SEQ ID NO:162、163和164的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和VL区，其具有分别含SEQ ID NO:172、86、173的氨基酸序列的CDRL1、CDRL2和CDRL3。在一些实施方式中，提供的CAR中的抗体或抗原结合片段含有VH区，其具有分别含SEQ ID NO:165、166和164的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和VL区，其包括分别含SEQ ID NO:172、86和173的氨基酸序列的CDRL1、CDRL2和CDRL3。在一些实施方式中，提供的CAR中的抗体或抗原结合片段含有VH区，其具有分别含SEQ ID NO:167、168和164的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和VL区，其包括分别含SEQ ID NO:172、86和173的氨基酸序列的CDRL1、CDRL2和CDRL3。在一些实施方式中，提供的CAR中的抗体或抗原结合片段含有VH区，其具有分别含SEQ ID NO:169、170、171的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和VL区，其包括分别含SEQ ID NO:174、89和175的氨基酸序列的CDRL1、CDRL2和CDRL3。在一些实施方式中，提供的CAR中的抗体或抗原结合片段含有VH区，其具有分别含SEQ ID NO:169、170、171的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和VL区，其包括分别含SEQID NO:174、89和297的氨基酸序列的CDRL1、CDRL2和CDRL3。在一些实施方式中，该VH区包含SEQ ID NO:33中所示的序列且该VL区包含SEQ ID NO:34中所示的序列。在一些实施方式中，该VH区包含SEQ ID NO:33中所示的序列且该VL区包含SEQ ID NO:69中所示的序列。在一些实施方式中，该抗体或抗原结合片段是单链抗体片段，诸如scFv。在一些实施方式中，scFv包含SEQ ID NO:13中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:13至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致的氨基酸序列。在一些实施方式中，scFv由SEQ ID NO:269中所示的核苷酸序列或与SEQID NO:269至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致的核苷酸序列编码。在一些实施方式中，scFv包含SEQID NO:14中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:14至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致的氨基酸序列。在一些实施方式中，scFv由SEQ ID NO:270中所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO:270至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致的核苷酸序列编码。
在所提供的CAR中的抗体，例如抗原结合片段中有人类抗体。在所提供的人类抗GPRC5D抗体，例如抗原结合片段的一些实施方式中，人类抗体含有VH区，其包含与由生殖系核苷酸人类重链V区段编码的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的部分、与由生殖系核苷酸人类重链D区段编码的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的部分、和/或与由生殖系核苷酸人类重链J区段编码的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的部分；和/或含有VL区，其包含与由生殖系核苷酸人类κ或λ链V区段编码的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的部分和/或与由生殖系核苷酸人类κ或λ链J区段编码的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的部分。在一些实施方式中，VH区的该部分对应于CDR-H1、CDR-H2和/或CDR-H3。在一些实施方式中，VH区的该部分对应于构架区1(FR1)、FR2、FR2和/或FR4。在一些实施方式中，VL区的该部分对应于CDR-L1、CDR-L2和/或CDR-L3。在一些实施方式中，VL区的该部分对应于FR1、FR2、FR2和/或FR4。
在一些实施方式中，人类抗体，例如抗原结合片段，含有与由生殖系核苷酸人类重链V区段编码的序列内的相应CDR-H1区的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的CDR-H1。举例而言，在一些实施方式中，人类抗体含有的CDR-H1具有与由生殖系核苷酸人类重链V区段编码的序列内的相应CDR-H1区100％一致、或与其有不超过一个、两个或三个氨基酸差异的序列。
在一些实施方式中，人类抗体，例如抗原结合片段，含有与由生殖系核苷酸人类重链V区段编码的序列内的相应CDR-H2区的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的CDR-H2。举例而言，在一些实施方式中，人类抗体含有的CDR-H2具有与由生殖系核苷酸人类重链V区段编码的序列内的相应CDR-H2区100％一致、或与其有不超过一个、两个或三个氨基酸差异的序列。
在一些实施方式中，人类抗体，例如抗原结合片段，含有与由生殖系核苷酸人类重链V区段、D区段和J区段编码的序列内的相应CDR-H3区的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的CDR-H3。举例而言，在一些实施方式中，人类抗体含有的CDR-H3具有与由生殖系核苷酸人类重链V区段、D区段和J区段编码的序列内的相应CDR-H3区100％一致、或与其有不超过一个、两个或三个氨基酸差异的序列。
在一些实施方式中，人类抗体，例如抗原结合片段，含有与由生殖系核苷酸人类轻链V区段编码的序列内的相应CDR-L1区的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的CDR-L1。举例而言，在一些实施方式中，人类抗体含有的CDR-L1具有与由生殖系核苷酸人类轻链V区段所编码的序列内的相应CDR-L1区100％一致、或与其有不超过一个、两个或三个氨基酸差异的序列。
在一些实施方式中，人类抗体，例如抗原结合片段，含有与由生殖系核苷酸人类轻链V区段编码的序列内的相应CDR-L2区的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的CDR-L2。举例而言，在一些实施方式中，人类抗体含有的CDR-L2具有与由生殖系核苷酸人类轻链V区段编码的序列内的相应CDR-L2区100％一致、或与其有不超过一个、两个或三个氨基酸差异的序列。
在一些实施方式中，人类抗体，例如抗原结合片段，含有与由生殖系核苷酸人类轻链V区段和J区段编码的序列内的相应CDR-L3区的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的CDR-L3。举例而言，在一些实施方式中，人类抗体含有的CDR-L3具有与由生殖系核苷酸人类轻链V区段和J区段编码的序列内的相应CDR-L3区100％一致、或与其有不超过一个、两个或三个氨基酸差异的序列。
在一些实施方式中，人类抗体，例如抗原结合片段，包括含人类生殖系基因区段序列的构架区。举例而言，在一些实施方式中，人类抗体含有VH区，其中构架区，例如FR1、FR2、FR3和FR4与由人类生殖系抗体区段，诸如V区段和/或J区段编码的构架区具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性。在一些实施方式中，人类抗体含有VL区，其中构架区，例如FR1、FR2、FR3和FR4与由人类生殖系抗体区段，诸如V区段和/或J区段编码的构架区具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性。举例而言，在一些此类实施方式中，VH区和/或VL区内所含有的构架区序列与由人类生殖系抗体区段编码的构架区序列有不超过10个氨基酸，诸如不超过9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸差异。
在一些实施方式中，该另一重组受体是抗BCMA受体，诸如抗BCMA CAR。涵盖本申请中提供的细胞、方法和用途中任何抗BCMACAR的使用或并入。同样涵盖在例如多顺反子(例如双顺反子)表达载体中编码本申请所提供的抗GPRC5D受体和另一受体的多核苷酸。示例性抗BCMA CAR分子描述于以下中：WO 2013/154760、WO 2015/052538、WO 2015/090229、WO2015/092024、WO 2015/158671、WO 2016/014565、WO 2016/014789、WO 2016/094304、WO2016/166630、WO 2017/021450、WO 2017/083511、WO 2017/130223、WO 2017/211900、WO2018/085690、WO 2018/028647、WO 2019/090003。
在一些实施方式中，CAR是对BCMA、例如人类BCMA具有特异性的抗BCMA CAR。先前已描述含有包括小鼠抗人类BCMA抗体和人类抗人类抗体在内的抗BCMA抗体的嵌合抗原受体，和表达此类嵌合受体的细胞。参见Carpenter等人,Clin Cancer Res.,2013,19(8):2048-2060；WO 2016/090320；WO2016090327；WO2010104949A2；和WO2017173256。在一些实施方式中，抗BCMA CAR含有抗原结合结构域，诸如scFv，其含有来源于WO 2016/090320或WO2016090327中所描述的抗体的重链可变(VH)和/或轻链可变(VL)区。
提供的抗BCMA CAR中有这样一种CAR，其中该抗体或抗原结合片段含有VH区，其包含SEQ ID NO:189中所示的序列或与SEQ ID NO:189具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；且含有VL区，其包含SEQ ID NO:190中所示的序列或与SEQ ID NO:190具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列。在一些实施方式中，提供的CAR中的抗体或抗原结合片段含有VH区，其具有分别含SEQ ID NO:199、200、201的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和VL区，其具有分别含SEQ ID NO:218、219和220的氨基酸序列的CDRL1、CDRL2和CDRL3。在一些实施方式中，该VH区包含SEQ ID NO:189中所示的序列且该VL区包含SEQ IDNO:190中所示的序列。在一些实施方式中，该抗体或抗原结合片段是单链抗体片段，诸如scFv。在一些实施方式中，scFv包含SEQ ID NO:237中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:237至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致的氨基酸序列。在一些实施方式中，scFv由SEQ ID NO:242中所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO:242至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致的核苷酸序列编码。在一些实施方式中，该抗BCMA CAR具有SEQ NO:247中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:247至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致的氨基酸序列。
提供的抗BCMA CAR中有这样一种CAR，其中该抗体或抗原结合片段含有VH区，其包含SEQ ID NO:191中所示的序列或与SEQ ID NO:191具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；且含有VL区，其包含SEQ ID NO:192中所示的序列或与SEQ ID NO:192具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列。在一些实施方式中，提供的CAR中的抗体或抗原结合片段含有VH区，其具有分别含SEQ ID NO:202、203、204的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和VL区，其具有分别含SEQ ID NO:221、222、223的氨基酸序列的CDRL1、CDRL2和CDRL3。在一些实施方式中，该VH区包含SEQ ID NO:191中所示的序列且该VL区包含SEQ IDNO:192中所示的序列。在一些实施方式中，该抗体或抗原结合片段是单链抗体片段，诸如scFv。在一些实施方式中，scFv包含SEQ ID NO:238中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:238至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致的氨基酸序列。在一些实施方式中，scFv由SEQ ID NO:243中所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO:243至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致的核苷酸序列编码。在一些实施方式中，该抗BCMA CAR具有SEQ NO:248中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:248至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致的氨基酸序列。
提供的抗BCMA CAR中有这样一种CAR，其中该抗体或抗原结合片段含有VH区，其包含SEQ ID NO:193中所示的序列或与SEQ ID NO:193具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；且含有VL区，其包含SEQ ID NO:194中所示的序列或与SEQ ID NO:194具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列。在一些实施方式中，提供的CAR中的抗体或抗原结合片段含有VH区，其具有分别含SEQ ID NO:199、200和205的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和VL区，其具有分别含SEQ ID NO:224、225和226的氨基酸序列的CDRL1、CDRL2和CDRL3。在一些实施方式中，该VH区包含SEQ ID NO:193中所示的序列且该VL区包含SEQ IDNO:194中所示的序列。在一些实施方式中，该抗体或抗原结合片段是单链抗体片段，诸如scFv。在一些实施方式中，scFv包含SEQ ID NO:239中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:239至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致的氨基酸序列。在一些实施方式中，scFv由SEQ ID NO:244中所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO:244至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致的核苷酸序列编码。在一些实施方式中，该抗BCMA CAR具有SEQ NO:249中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:249至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致的氨基酸序列。
提供的抗BCMA CAR中有这样一种CAR，其中该抗体或抗原结合片段含有VH区，其包含SEQ ID NO:195中所示的序列或与SEQ ID NO:195具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；且含有VL区，其包含SEQ ID NO:196中所示的序列或与SEQ ID NO:196具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列。在一些实施方式中，提供的CAR中的抗体或抗原结合片段含有VH区，其具有分别含SEQ ID NO:206、207和208的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和VL区，其具有分别含SEQ ID NO:227、228和229的氨基酸序列的CDRL1、CDRL2和CDRL3。在一些实施方式中，提供的CAR中的抗体或抗原结合片段含有VH区，其具有分别含SEQ ID NO:212、213和214的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和VL区，其具有分别含SEQID NO:233、234和229的氨基酸序列的CDRL1、CDRL2和CDRL3。在一些实施方式中，该VH区包含SEQ ID NO:195中所示的序列且该VL区包含SEQ ID NO:196中所示的序列。在一些实施方式中，该抗体或抗原结合片段是单链抗体片段，诸如scFv。在一些实施方式中，scFv包含SEQID NO:240中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:240至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致的氨基酸序列。在一些实施方式中，scFv由SEQ ID NO:245中所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO:245至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致的核苷酸序列编码。在一些实施方式中，该抗BCMA CAR具有SEQNO:250中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:250至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致的氨基酸序列。
提供的抗BCMA CAR中有这样一种CAR，其中该抗体或抗原结合片段含有VH区，其包含SEQ ID NO:197中所示的序列或与SEQ ID NO:197具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；且含有VL区，其包含SEQ ID NO:198中所示的序列或与SEQ ID NO:198具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列。在一些实施方式中，提供的CAR中的抗体或抗原结合片段含有VH区，其具有分别含SEQ ID NO:209、210和211的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和VL区，其具有分别含SEQ ID NO:230、231和232的氨基酸序列的CDRL1、CDRL2和CDRL3。在一些实施方式中，提供的CAR中的抗体或抗原结合片段含有VH区，其具有分别含SEQ ID NO:215、216和217的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和VL区，其具有分别含SEQID NO:235、236、232的氨基酸序列的CDRL1、CDRL2和CDRL3。在一些实施方式中，该VH区包含SEQ ID NO:197中所示的序列且该VL区包含SEQ ID NO:198中所示的序列。在一些实施方式中，该抗体或抗原结合片段是单链抗体片段，诸如scFv。在一些实施方式中，scFv包含SEQID NO:241中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:241至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致的氨基酸序列。在一些实施方式中，scFv由SEQ ID NO:246中所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO:246至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致的核苷酸序列编码。在一些实施方式中，该抗BCMA CAR具有SEQNO:251或252中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:251或252至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致的氨基酸序列。
在一些实施方式中，包含本申请所提供的抗BCMA抗体(例如抗原结合片段)的重组受体，诸如CAR进一步包括间隔子，诸如以上I.1.b.部分中所描述的任何间隔子。
在一些实施方式中，包含本申请所提供的抗BCMA抗体(例如抗原结合片段)的重组受体，诸如CAR进一步包括跨膜结构域，诸如以上I.1.c.部分中所描述的任何跨膜结构域。
III.基因工程细胞
也提供含有重组受体(例如嵌合抗原受体)的细胞，诸如基因工程细胞，该重组受体诸如为包括含如本申请所提供的抗GPRC5D抗体的细胞外结构域的重组受体。也提供此类细胞的群体、含有此类细胞和/或富含此类细胞的组合物，诸如其中表达GPRC5D结合受体的细胞占该组合物中总细胞或某一类型的细胞诸如T细胞、CD8+细胞或CD4+细胞至少50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高百分比。
也提供经基因工程改造成含有重组抗GPRC5D受体(例如抗GPRC5DCAR)和至少一种第二重组受体的细胞，诸如基因工程细胞。在一些实施方式中，该第二受体是抗BCMA受体。在一些实施方式中，该第二受体是CAR。在一些实施方式中，抗GPRC5D受体是CAR且第二受体是CAR。在一些实施方式中，基因工程细胞含有如本申请所提供的重组抗GPRC5D受体(例如抗GPRC5D CAR)和抗BCMA受体(例如抗BCMA CAR)。抗BCMA受体可以为任何已知的抗BCMA受体，诸如本申请或别处所描述的抗BCMA CAR(参见例如WO 2013/154760、WO 2015/052538、WO 2015/090229、WO 2015/092024、WO 2015/158671、WO 2016/014565、WO 2016/014789、WO2016/094304、WO 2016/166630、WO 2017/021450、WO 2017/083511、WO 2017/130223、WO2017/211900、WO 2018/085690、WO 2018/028647)。示例性抗BCMA CAR描述于II部分中。预期所描述的抗BCMA CAR中的任一种均可用作提供的利用抗GPRC5D CAR靶向GPRC5D和BCMA的多重靶向方法中的任一种中的第二CAR。
在一些实施方式中，本申请所提供的基因工程细胞可以与表达一或多种其他重组受体的一个或多个基因工程细胞群体组合。此类基因工程细胞群可以配制为相同或独立的组合物。在这些组合物中有用于投药，诸如用于过继细胞疗法的药物组合物和配制物。也提供用于向受试者例如患者给予本申请所提供的细胞和组合物中的任一种的治疗方法。
因此，也提供表达含有抗体的重组受体的经基因工程改造的细胞，例如含有CAR的细胞。细胞一般为真核细胞，诸如哺乳动物细胞，且通常为人类细胞。在一些实施方式中，细胞来源于血液、骨髓、淋巴或淋巴器官，是免疫系统的细胞，诸如先天性或后天性免疫细胞，例如骨髓或淋巴细胞，包括淋巴球，通常为T细胞和/或NK细胞。其他示例性细胞包括干细胞，诸如多潜能(multipotent)和多能(pluripotent)干细胞，包括经诱导的多能干细胞(iPSC)。细胞通常为初代细胞，诸如直接自受试者分离和/或自受试者分离且冷冻的细胞。在一些实施方式中，细胞包括T细胞或其他细胞类型的一个或多个亚群，诸如完整T细胞群、CD4+细胞、CD8+细胞和其亚群，诸如根据以下定义的细胞：功能、活化状态、成熟度、分化潜能、扩增、再循环、位置和/或持久能力、抗原特异性、抗原受体类型、特定器官或区室中的存在、标记物或细胞因子分泌型态和/或分化程度。提及待治疗的受试者时，细胞可为同种异体细胞和/或自体细胞。在这些方法当中包括现成方法。在一些方面中，诸如在现成技术中，细胞是多能和/或多潜能细胞，诸如干细胞，诸如经诱导的多能干细胞(iPSC)。在一些实施方式中，这些方法包括如本申请所述自受试者分离出细胞、对其进行制备、处理、培养和/或基因工程改造，以及在低温保存之前或之后将其再引入同一患者体内。
T细胞和/或CD4+ T细胞和/或CD8+ T细胞的亚型和亚群是未处理T(TN)细胞、效应T细胞(TEFF)、记忆型T细胞和其亚型，诸如干细胞记忆型T(TSCM)、中枢记忆型T(TCM)、效应记忆型T(TEM)或终末分化效应记忆型T细胞；肿瘤浸润性淋巴球(TIL)、不成熟T细胞、成熟T细胞、辅助T细胞、细胞毒性T细胞、黏膜相关不变T(MAIT)细胞、天然存在和适应性调节T(Treg)细胞、辅助T细胞，诸如TH1细胞、TH2细胞、TH3细胞、TH17细胞、TH9细胞、TH22细胞、滤泡性辅助T细胞；α/βT细胞和δ/γT细胞。
在一些实施方式中，细胞是自然杀手(NK)细胞。在一些实施方式中，细胞是单核球或粒细胞，例如骨髓细胞、巨噬细胞、嗜中性白血球、树突状细胞、肥大细胞、嗜伊红白血球和/或嗜碱性球。
在一些实施方式中，细胞包括一个或多个经由基因工程改造引入的多核苷酸，且由此表达此类多核苷酸的重组产物或经基因工程改造的产物。在一些实施方式中，多核苷酸是异源多核苷酸，即通常不存在于细胞或获自该细胞的样品中，诸如获自另一生物体或细胞的多核苷酸，此类多核苷酸例如在基因工程细胞和/或作为此类细胞来源的生物体中通常未发现。在一些实施方式中，多核苷酸不为天然存在的多核苷酸，诸如在自然界中未发现的多核苷酸，包括含编码来自多种不同细胞类型的各种结构域的多核苷酸的嵌合组合的多核苷酸。在一些实施方式中，细胞(例如基因工程细胞)包含如本申请所描述的载体(例如病毒载体、表达载体等)，诸如包含编码本申请所描述的重组受体的核酸的载体。
A.用于基因工程改造的载体和方法
也提供用于表达抗GPRC5D重组受体(例如CAR)和用于制造表达此类受体的经基因工程改造的细胞的方法、多核苷酸、组合物和套组。在一些实施方式中，一个或多个重组受体(例如CAR)可经基因工程改造放入细胞或复数个细胞中。基因工程改造一般涉及将编码重组组分或经工程改造的组分的核酸引入细胞中，诸如通过慢病毒转导、逆转录病毒转导、转染或转型来引入。
在一些实施方式中，基因转移通过以下方式实现：首先刺激细胞，诸如通过将细胞与诱导反应的刺激物组合，该反应诸如为增殖、存活和/或活化，例如由细胞因子或活化标记物的表达测量；随后转导经活化的细胞，和在培养物中扩增至足以用于临床应用的数量。
在一些情形中，刺激因子(例如淋巴激素或细胞因子)的过度表达可对受试者有毒。因此，在一些情形中，基因工程细胞包括使细胞诸如以过继免疫疗法给予时易于在活体内经历阴性选择的基因区段。举例而言，在一些方面中，细胞经基因工程改造，以使得其可因给予其的患者的活体内条件变化而消除。可阴性选择的表型可由于赋予对所给予药剂(例如化合物)的敏感性的基因的插入而产生。可阴性选择的基因包括赋予更昔洛韦(ganciclovir)敏感性的单纯性疱疹病毒I型胸苷激酶(HSV-I TK)基因(Wigler等人,Cell2:223,1977)；细胞次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)基因、细胞腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(APRT)基因、细菌胞嘧啶脱胺酶(Mullen等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89:33(1992))。
在一些方面中，细胞进一步经基因工程改造以促进细胞因子或其他因子的表达。用于引入经基因工程改造的组分，例如抗原受体，例如CAR的各种方法是熟知的，且可与所提供的方法和组合物一起使用。示例性方法包括用于转移编码这些受体的多核苷酸的方法，包括经由病毒(例如逆转录病毒或慢病毒)转导、转座子和电穿孔来进行。
在一些实施方式中，使用重组感染性病毒粒子，诸如来源于猴病毒40(SV40)、腺病毒、腺相关病毒(AAV)的载体将重组多核苷酸转移至细胞中。在一些实施方式中，使用重组慢病毒载体，诸如基于HIV-1慢病毒的载体(慢病毒载体；参见例如Amado等人,Science.1999年7月30日；285(5428):674-676)，或逆转录病毒载体诸如γ逆转录病毒载体(参见例如Koste等人(2014)Gene Therapy 2014年4月3日.doi:10.1038/gt.2014.25；Carlens等人(2000)Exp Hematol 28(10):1137-46；Alonso-Camino等人(2013)Mol TherNucl Acids 2,e93；Park等人,Trends Biotechnol.2011年11月29日(11):550-557)将重组多核苷酸转移至T细胞中。
在一些实施方式中，逆转录病毒载体或慢病毒载体具有长末端重复序列(LTR)。在一些实施方式中，载体来源于莫罗尼鼠类白血病病毒(Moloney murine leukemia virusMoMLV)、骨髓增生性肉瘤病毒(MPSV)、鼠类胚胎干细胞病毒(MESV)、鼠类干细胞病毒(MSCV)、形成脾脏病灶病毒(SFFV)、人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)、人类免疫缺陷病毒2型(HIV-2/SIV)或腺相关病毒(AAV)。在一些实施方式中，载体是自灭活(SIN)的。在一些实施方式中，载体是条件复制型(可移动的)载体。大部分慢病毒载体来源于人类、猫科动物或猴慢病毒。大部分逆转录病毒载体来源于鼠类逆转录病毒。在一些实施方式中，慢病毒或逆转录病毒包括来源于任何禽鸟或哺乳动物细胞来源者。慢病毒或逆转录病毒通常具有双嗜性，意谓其能够感染包括人类在内的若干物种的宿主细胞。在一个实施方式中，待表达的基因置换逆转录病毒gag、pol和/或env序列。慢病毒转导方法是已知的。示例性方法描述于例如Wang等人(2012)J.Immunother.35(9):689-701；Cooper等人(2003)Blood.101:1637-1644；Verhoeyen等人(2009)Methods Mol Biol.506:97-114；和Cavalieri等人(2003)Blood.102(2):497-505中。多种示例性逆转录病毒系统也已有描述(例如Amado等人(1999)Science 285(5428):674-676；美国专利第5,219,740号、第6,207,453号、第5,219,740号；Miller和Rosman(1989)BioTechniques 7:980-990；Miller(1990)Human Gene Therapy 1:5-14；Scarpa等人(1991)Virology 180:849-852；Burns等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:8033-8037；以及Boris-Lawrie和Temin(1993)Cur.Opin.Genet.Develop.3:102-109)。
在一些实施方式中，经由电穿孔将重组多核苷酸转移至T细胞中(参见例如Chicaybam等人(2013)PLoS ONE 8(3):e60298；和Van Tedeloo等人(2000)Gene Therapy 7(16):1431-1437)。在一些实施方式中，经由转位将重组多核苷酸转移至T细胞中(参见例如Manuri等人(2010)Hum Gene Ther 21(4):427-437；Sharma等人(2013)Molec Ther NuclAcids 2,e74；和Huang等人(2009)Methods Mol Biol 506:115-126)。将遗传物质引入免疫细胞中并在免疫细胞中表达的其他方法包括磷酸钙转染(例如，如Current Protocols inMolecular Biology,John Wiley&Sons,New York.N.Y.中所述)、初始质粒融合、阳离子性脂质粒介导转染；钨粒子促进的微粒轰击(Johnston(1990),Nature 346:776-777)；和磷酸锶DNA共沉淀(Brash等人(1987),Mol.Cell Biol.7:2031-2034)。用于转移编码重组产物的多核苷酸的其他方法和载体是例如国际专利申请公开第WO2014055668号和美国专利第7,446,190号中所描述的方法和载体。
在额外多核苷酸，例如供引入的基因中有改善疗法结果，诸如通过促进所转移细胞的存活力和/或功能来改善疗法结果的多核苷酸；提供基因标记物以选择和/或评估细胞，诸如评估活体内存活或定位的基因；改善安全性，例如通过使细胞对活体内阴性选择敏感来改善安全性的基因，如Lupton S.D.等人,Mol.and Cell Biol.,11:6(1991)；和Riddell等人,Human Gene Therapy 3:319-338(1992)所描述；也参见Lupton等人的公开PCT/US91/08442和PCT/US94/05601，其描述了使用通过使显性阳性可选择标记物与阴性可选择标记物融合得到的双功能可选择融合基因。参见例如Riddell等人，美国专利第6,040,177号，第14-17行。
在一些实施方式中，一个或多个重组受体(例如CAR)可经基因工程改造以在细胞或复数个细胞中表达。在一些实施方式中，第一重组受体和第二结合分子(例如重组受体)由相同或独立核酸分子编码。在一些实施方式中，额外结合分子经基因工程改造以在细胞或复数个细胞中表达。在一些实施方式中，第二结合分子是抗BCMA受体，诸如本申请中或以下中所描述的抗BCMA CAR：WO 2013/154760、WO 2015/052538、WO 2015/090229、WO 2015/092024、WO 2015/158671、WO 2016/014565、WO 2016/014789、WO 2016/094304、WO 2016/166630、WO 2017/021450、WO 2017/083511、WO 2017/130223、WO 2017/211900、WO 2018/085690、WO 2018/028647。
在一些实施方式中，载体或构建体可含有启动子和/或增强子或调控所编码的重组受体的表达的调控组件。在一些实例中，启动子和/或增强子或调控组件可为条件依赖性启动子、增强子和/或调控组件。在一些实例中，此等组件驱动转殖基因的表达。在一些实例中，CAR转殖基因可操作地连接至启动子，诸如具有HTLV1增强子的EF1α启动子(SEQ ID NO:61)。在一些实例中，CAR转殖基因可操作地连接至位于转殖基因下游的土拨鼠肝炎病毒(WHP)转录后调控组件(WPRE；SEQ ID NO:62)。
在一些实施方式中，载体或构建体可含有驱动一个或多个核酸分子的表达的单个启动子。在一些实施方式中，此类核酸分子，例如转录物，可为多顺反子(双顺反子或三顺反子，参见例如美国专利第6,060,273号)。举例而言，在一些实施方式中，转录单元可经基因工程改造为含有IRES(内部核糖体进入位点)的双顺反子单元，其允许通过来自单个启动子的讯息对基因产物(例如编码第一和第二嵌合受体)进行共表达。举例而言，在一些实施方式中，载体或构建体可以含有处于单个启动子的调控下的编码本申请所提供的抗GPRC5D受体(例如抗GPRC5D CAR)的核酸和编码抗BCMA受体(例如抗BCMA CAR)的核酸，这些核酸通过IRES分隔开。
或者，在一些情况下，单个启动子可引导RNA的表达，该RNA在单个开放阅读框架(ORF)中含有由编码自裂解肽(例如2A裂解序列)或蛋白酶识别位点(例如弗林蛋白酶)的序列彼此间隔开的两个或三个基因(例如编码第一和第二结合分子，例如抗体重组受体)。因此，ORF编码单个多肽，该多肽在翻译期间(在T2A的情况下)或之后裂解成个别蛋白质。在一些情况下，肽，诸如T2A可使核糖体在2A组件的C末端跳跃(核糖体跳跃)合成肽键，由此在2A序列的一端与接下来的肽下游之间产生分离(参见例如de Felipe.Genetic Vaccines andTher.2:13(2004)和deFelipe等人Traffic 5:616-626(2004))。已知许多2A组件。可用于本申请所揭示的方法和多核苷酸中的2A序列的实例不限于如美国专利公开第20070116690号中所描述的来自口蹄疫病毒的2A序列(F2A，例如SEQ ID NO:42或43))、来自马A型鼻炎病毒的2A序列(E2A，例如SEQ ID NO:40或41)、来自明脉扁刺蛾病毒的2A序列(T2A，例如SEQ IDNO:35、36或37)和来自猪捷申病毒-1的2A序列(P2A，例如SEQ ID NO:38或39)。在一些实施方式中，一个或多个不同或独立的启动子驱动编码一个或多个结合分子(例如重组受体)的一个或多个核酸分子的表达。
本申请所提供的重组受体中的任一种，例如抗GPRC5D重组受体和/或额外重组受体，均可由呈任何组合或布置的含有一个或多个编码这些受体的核酸分子的多核苷酸编码。举例而言，一个、两个、三个或超过三个多核苷酸可编码一个、两个、三个或超过三个不同的受体或结构域。在一些实施方式中，一个载体或构建体含有编码一或多种重组受体的核酸分子，且独立的载体或构建体含有编码额外结合分子，例如抗体和/或重组受体，诸如抗BCMA受体(例如抗BCMA CAR)的核酸分子。这些核酸分子各自也可编码一个或多个替代标记物，诸如荧光蛋白(例如绿色荧光蛋白(GFP))或细胞表面标记物(例如截短的表面标记物，诸如截短的EGFR(tEGFR))，其可用于确定用于表达该受体的细胞的转导或基因工程改造。举例而言，在一些方面中，将外源性标记物基因与基因工程细胞疗法结合使用以容许侦测或选择细胞，且在一些情况下，也促进由ADCC进行的细胞自杀。示例性标记物基因包括截短的表皮生长因子受体(EGFRt)，其可与所关注的转殖基因(例如CAR或TCR)一起在经转导的细胞中共表达(参见例如美国专利第8,802,374号)。EGFRt含有由抗体西妥昔单抗(cetuximab)
识别的抗原决定簇。出于此原因，
可用于鉴别或选择已经EGFRt构建体基因工程改造的细胞，包括在也经另一重组受体(诸如嵌合抗原受体(CAR))共同基因工程改造的细胞中进行鉴别或选择。
在一些实施方式中，标记物是非天然发现于T细胞上或非天然发现于T细胞的表面上的分子，例如细胞表面蛋白质，或其一部分。
在一些实施方式中，分子是非自体分子，例如非自体蛋白质，即不能被过继转移这些细胞的宿主的免疫系统识别为“自体”的分子。
在一些实施方式中，标记物不具有治疗功能和/或不产生除用作基因基因工程改造的标记物，例如以选择成功地基因工程改造的细胞之外的作用。在其他实施方式中，标记物可为治疗分子或以其他方式发挥某种所需作用的分子，诸如细胞将在活体内遇到的配体，诸如共刺激或免疫检查点分子，以在过继转移时增强和/或减弱细胞反应且与配体相遇。
也提供含有核酸分子、载体或构建体中的一种或多种，诸如上文所描述的任何核酸分子、载体构建体构建体的组合物。在一些实施方式中，核酸分子、载体、构建体或组合物可用于对细胞，诸如T细胞进行基因工程改造以表达结合分子(例如抗体或重组受体)和/或额外结合分子中的任一个。
B.用于基因工程改造的细胞的制备
在一些实施方式中，基因工程细胞的制备包括一个或多个培养和/或制备步骤。用于引入重组受体(例如CAR)的细胞可自样品，诸如生物样品，例如获自或来源于受试者的样品分离。在一些实施方式中，用于分离细胞的受试者是患有疾病或病况、或需要细胞疗法、或将给予细胞疗法的受试者。在一些实施方式中，受试者需要特定治疗性干预，诸如过继细胞疗法的人类，对于过继细胞疗法而言，细胞经历分离、处理和/或基因工程改造。
因此，在一些实施方式中，细胞是初代细胞，例如初代人类细胞。样品包括组织、流体和直接自受试者取得的其他样品，以及由一个或多个处理步骤得到的样品，该一个或多个处理步骤诸如分离、离心、基因工程改造(例如用病毒载体转导)、洗涤和/或培育。生物样品可为直接获自生物学来源的样品或经处理的样品。生物样品包括(但不限于)体液，诸如血液、血浆、血清、脑脊髓液、滑液、尿液和汗液、组织和器官样品，包括来源于其的经处理样品。
在一些方面中，用于获得或分离细胞的样品是血液或血源性样品，或是或来源于血球分离术或白血球分离术产物。示例性样品包括全血、末梢血液单核细胞(PBMC)、白血球、骨髓、胸腺、组织活检体、肿瘤、白血病、淋巴瘤、淋巴结、肠道相关淋巴组织、黏膜相关淋巴组织、脾脏、其他淋巴组织、肝脏、肺、胃、肠、结肠、肾脏、胰脏、乳房、骨骼、前列腺、子宫颈、睪丸、卵巢、扁桃体或其他器官，和/或来源于其的细胞。在细胞疗法，例如过继细胞疗法的情形中，样品包括来自于自体和同种异体来源的样品。
在一些实施方式中，细胞来源于细胞系，例如T细胞系。在一些实施方式中，细胞自异种来源获得，例如自小鼠、大鼠、非人类灵长类动物和猪获得。
在一些实施方式中，细胞的分离包括一个或多个制备步骤和/或基于非亲和力的细胞分离步骤。在一些实例中，对细胞进行洗涤、离心和/或在一或多种试剂存在下培育，以例如移除不想要的组分、富集所需组分、溶解或移除对特定试剂敏感的细胞。在一些实例中，细胞基于一或多种特性，诸如密度、黏附特性、尺寸、敏感性和/或对特定组分的抗性来分离。
在一些实例中，自受试者的循环血液获得细胞，例如通过血球分离术或白血球分离术获得。在一些方面中，样品含有淋巴球，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他成核白血球、红血球和/或血小板，且在一些方面中含有除红血球和血小板之外的细胞。
在一些实施方式中，对自受试者收集的血球进行洗涤，例如以移除血浆部分并将细胞置放于适当缓冲液或培养基中以用于后续处理步骤。在一些实施方式中，细胞用磷酸盐缓冲生理食盐水(PBS)洗涤。在一些实施方式中，洗涤溶液不含钙和/或镁和/或多种或所有二价阳离子。在一些方面中，根据制造商的说明书，利用半自动化“穿流”式离心机(例如Cobe 2991细胞处理器，Baxter)完成洗涤步骤。在一些方面中，根据制造商的说明书，通过切向流过滤(TFF)来实现洗涤步骤。在一些实施方式中，在洗涤之后，将细胞再悬浮于多种生物兼容性缓冲液，诸如不含Ca++/Mg++的PBS中。在某些实施方式中，移除血球样品的组分，且将细胞直接再悬浮于培养基中。
在一些实施方式中，这些方法包括基于密度的细胞分离方法，诸如通过溶解红血球而自末梢血液制备白血球和经由Percoll或Ficoll梯度离心。
在一些实施方式中，分离方法包括基于一个或多个特定分子，诸如表面标记物(例如表面蛋白质)、细胞内标记物或核酸在细胞中的表达或存在，分离不同细胞类型。在一些实施方式中，可使用基于此类标记物进行分离的任何已知方法。在一些实施方式中，分离基于亲和力或免疫亲和力的分离。举例而言，在一些方面中，分离包括基于一或多种标记物，通常为细胞表面标记物的细胞表达或表达量分离细胞和细胞群，例如通过与特异性结合至此类标记物的抗体或结合搭配物一起培育，随后一般进行洗涤步骤并将已结合抗体或结合搭配物的细胞与未结合至抗体或结合搭配物的细胞分离。
此类分离步骤可基于阳性选择，其中保留已结合试剂的细胞以进一步使用；和/或基于阴性选择，其中保留未结合至抗体或结合搭配物的细胞。在一些实例中，两个部分皆保留以供进一步使用。在一些方面中，阴性选择可为特别有用的，其中无法得到特异性鉴别异质群体中的细胞类型的抗体，由此基于除所需群体外的细胞所表达的标记物进行分离最佳。
分离无需100％富集或移除特定细胞群体或表达特定标记物的细胞。举例而言，特定类型细胞，诸如表达标记物的细胞的阳性选择或富集是指增加此类细胞的数量或百分比，而无需使不表达该标记物的细胞完全不存在。同样，特定类型细胞，诸如表达标记物的细胞的阴性选择、移除或耗竭是指减小此类细胞的数量或百分比，而无需完全移除所有此类细胞。
在一些实例中，进行多轮分离步骤，其中对来自一个步骤的经阳性或阴性选择的级分进行另一个分离步骤，诸如后续阳性或阴性选择。在一些实例中，单个分离步骤可耗竭同时表达多个标记物的细胞，诸如通过将细胞与各自对作为阴性选择靶标的标记物具特异性的复数种抗体或结合搭配物一起培育。同样，通过将细胞与各种细胞类型上表达的复数种抗体或结合搭配物一起培育可同时对多种细胞类型进行阳性选择。
例如，在一些方面中，特定T细胞亚群，诸如阳性或高水平表达一或多种表面标记物的细胞，例如CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+和/或CD45RO+ T细胞，通过阳性或阴性选择技术分离。
举例而言，CD3+、CD28+ T细胞可使用CD3/CD28缀合的磁性珠粒(例如
M-450CD3/CD28T细胞扩增剂，MACSiBeadsTM等)进行阳性选择。
在一些实施方式中，分离通过以下方式进行：利用阳性选择富集特定细胞群体，和/或利用阴性选择耗竭特定细胞群体。在一些实施方式中，阳性或阴性选择通过将细胞与一或多种特异性结合至一或多种表面标记物的抗体或其他结合剂一起培育实现，该一或多种表面标记物分别在阳性或阴性选择的细胞上表达(标记物+)或以相对较高的水平(标记物高)表达。
在一些实施方式中，通过在非T细胞，诸如B细胞、单核球或其他白血球(诸如CD14)上表达的标记物的阴性选择，自PBMC样品分离T细胞。在一些方面中，使用CD4+或CD8+选择步骤分离CD4+辅助和CD8+细胞毒性T细胞。此类CD4+和CD8+群体可通过对在一或多种初始、记忆型和/或效应T细胞亚群上表达或以相对较高程度表达的标记物进行阳性或阴性选择而进一步分选成亚群。
在一些实施方式中，CD8+细胞诸如通过基于与各别亚群相关的表面抗原的阳性或阴性选择而进一步富集或耗竭初始、中枢记忆型、效应记忆型和/或中枢记忆型干细胞。在一些实施方式中，进行中枢记忆型T(TCM)细胞富集以在给予后增加某些特征，诸如以改善长期存活、扩增和/或植入，在一些方面中该富集在此类亚群中特别稳固(参见Terakura等人(2012)Blood.1:72-82；Wang等人(2012)J Immunother.35(9):689-701)。在一些实施方式中，将富集TCM的CD8+ T细胞与CD4+ T细胞组合可进一步增强反应。
在实施方式中，记忆型T细胞存在于CD8+末梢血液淋巴球的CD62L+与CD62L-亚群两者中。可诸如使用抗CD8和抗CD62L抗体富集或耗竭CD62L-CD8+和/或CD62L+CD8+级分的PBMC。
在一些实施方式中，中枢记忆型T(TCM)细胞的富集基于CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD3和/或CD 127的阳性或高表面表达；在一些方面中，其是基于对表达或高水平表达CD45RA和/或颗粒酶B的细胞的阴性选择。在一些方面中，通过耗竭表达CD4、CD14、CD45RA的细胞和对表达CD62L的细胞进行阳性选择或富集来分离富含TCM细胞的CD8+群体。在一个方面中，以基于CD4表达选择的阴性细胞部分为起始物，基于CD14和CD45RA的表达进行阴性选择，且基于CD62L进行阳性选择，由此富集中枢记忆型T(TCM)细胞。在一些方面中，此类选择是同时进行的且在其他方面中按任一次序依序进行。在一些方面中，制备CD8+细胞群或亚群时使用的该基于CD4表达的选择步骤也用于产生CD4+细胞群或亚群，由此保留基于CD4的分离得到的阳性与阴性级分且用于这些方法之后续步骤，任选在一个或多个其他阳性或阴性选择步骤之后。
在一个特定实例中，对PBMC样品或其他白血球样品进行CD4+细胞的选择，其中阴性和阳性级分两者均得到保留。接着，基于CD14和CD45RA的表达对阴性级分进行阴性选择，且基于中枢记忆型T细胞特有的标记物，诸如CD62L或CCR7进行阳性选择，其中阳性和阴性选择以任一次序进行。
通过鉴别具有细胞表面抗原的细胞群将CD4+ T辅助细胞分选为初始、中枢记忆型和效应细胞。CD4+淋巴球可通过标准方法获得。在一些实施方式中，初始CD4+ T淋巴球是CD45RO-、CD45RA+、CD62L+、CD4+ T细胞。在一些实施方式中，中枢记忆型CD4+细胞是CD62L+和CD45RO+。在一些实施方式中，效应CD4+细胞是CD62L-和CD45RO-。
在一个实例中，为了通过阴性选择来富集CD4+细胞，单克隆抗体混合液通常包括针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。在一些实施方式中，抗体或结合搭配物结合至固体载体或基质，诸如磁性珠粒或顺磁性珠粒，以允许分离出细胞进行阳性和/或阴性选择。举例而言，在一些实施方式中，使用免疫磁性(或亲和磁性)分离技术分开或分离细胞和细胞群(评述于Methods in Molecular Medicine,第58卷:Metastasis ResearchProtocols，第2卷：Cell Behavior In vitro and In vivo，第17-25页，由以下编辑：S.A.Brooks and U.Schumacher
Humana Press Inc.,Totowa,NJ)。
在一些方面中，将待分开的细胞的样品或组合物与可磁化或磁性反应性小材料，诸如磁性反应性粒子或微粒，诸如顺磁性珠粒(例如
或
珠粒)一起培育。磁性反应性材料，例如粒子，一般直接或间接地连接至结合搭配物，例如抗体，该结合搭配物特异性结合至希望分离，例如希望阴性或阳性选择的细胞或细胞群上存在的分子，例如表面标记物。
在一些实施方式中，磁性粒子或珠粒包含结合至特异性结合成员，诸如抗体或其他结合搭配物上的磁性反应性材料。存在多种在磁性分离方法中使用的熟知磁性反应性材料。适合的磁性粒子包括Molday的美国专利第4,452,773号和欧洲专利说明书EP 452342B中所描述的粒子，这些专利以引用的方式并入本申请中。胶态尺寸化粒子，诸如Owen的美国专利第4,795,698号和Liberti等人的美国专利第5,200,084号中所描述的粒子，是其他实例。
培育一般在一定条件下进行，借此连接至磁性粒子或珠粒的抗体或结合搭配物或特异性结合至此类抗体或结合搭配物的分子，诸如二次抗体或其他试剂，特异性结合至样品内的细胞上的细胞表面分子(若存在)。
在一些方面中，将样品置放于磁场中，且连接有磁性反应性或可磁化粒子的细胞将经吸引至磁体且与未标记的细胞分开。对于阳性选择，保留吸引至磁体的细胞；对于阴性选择，保留未吸引的细胞(未标记的细胞)。在一些方面中，在同一选择步骤期间执行阳性和阴性选择的组合，其中阳性和阴性级分得以保留且进一步处理或经历其他分离步骤。
在某些实施方式中，磁性反应性粒子经一次抗体或其他结合搭配物、二次抗体、凝集素、酶或抗生蛋白链菌素涂布。在某些实施方式中，磁性粒子经由涂布对一或多种标记物具有特异性的一次抗体而连接至细胞。在某些实施方式中，细胞(而非珠粒)经一次抗体或结合搭配物标记，且接着添加经细胞类型特异性二次抗体或其他结合搭配物(例如抗生蛋白链菌素)涂布的磁性粒子。在某些实施方式中，将经抗生蛋白链菌素涂布的磁性粒子与生物素化一次或二次抗体结合使用。
在一些实施方式中，磁性反应性粒子保持连接至细胞，这些细胞随后经历培育、培养和/或基因工程改造；在一些方面中，这些粒子保持连接至向患者给予的细胞。在一些实施方式中，自细胞移除可磁化或磁性反应性粒子。自细胞移除可磁化粒子的方法是已知的且包括例如使用未标记的竞争性抗体、可磁化粒子或抗体与可裂解连接物的缀合物等。在一些实施方式中，可磁化粒子是可生物降解的。
在一些实施方式中，基于亲和力的选择经由磁性活化细胞分选
(Miltenyi Biotech,Auburn,CA)进行。磁性活化细胞分选
系统能够高纯度选择连接至磁化粒子的细胞。在某些实施方式中，
以一定模式操作，其中非靶标物种和靶标物种在施加外部磁场之后依序溶离。即，连接至磁化粒子的细胞保持在适当位置，同时溶离未连接的物种。接着，在该第一个溶离步骤完成之后，在磁场中捕获且防止溶离的物种以某一方式释放，使其可溶离和回收。在某些实施方式中，对非靶细胞进行标记且自异质细胞群体耗竭。
在某些实施方式中，分离(isolation)或分离(separation)使用进行这些方法的分离(isolation)、细胞制备、分离(separation)、处理、培育、培养和/或配制步骤中的一个或多个的系统、装置或设备进行。在一些方面中，使用该系统在封闭或无菌环境中进行此等步骤中的每一个，以例如使误差、使用者操作和/或污染减到最少。在一个实例中，该系统是如国际专利申请公开第WO2009/072003号或US 20110003380 A1中所描述的系统。
在一些实施方式中，该系统或设备在整合式或自含式系统中和/或以自动化或可程序化方式进行分离、处理、基因工程改造和配制步骤中的一个或多个，例如全部。在一些方面中，该系统或设备包括与该系统或设备通信的计算机和/或计算机程序，其允许使用者对处理、分离、基因工程改造和配制步骤进行程序化、控制、评估其结果和/或调整其各个方面。
在一些方面中，分离和/或其他步骤使用
系统(Miltenyi Biotec)进行，例如用于在封闭且无菌系统中在临床规模水平上自动分离细胞。组件可包括整合式微电脑、磁性分离单元、蠕动泵和各种夹阀。在一些方面中，整合式计算机控制仪器的所有组件且引导系统以标准化顺序执行重复程序。在一些方面中，磁性分离单元包括可移动式永久磁体和用于选择管柱的固持器。蠕动泵控制通过整个管组的流速且连同夹阀一起确保控制缓冲液通过系统的流动和细胞的持续悬浮。
在一些方面中，
系统使用以无菌、非热解溶液形式供应的抗体偶合的可磁化粒子。在一些实施方式中，在用磁性粒子标记细胞之后，洗涤细胞以移除过量粒子。接着，将细胞制剂袋连接至管组，管组又连接至含有缓冲液的袋和细胞收集袋。管组由预组装的无菌管组成，包括前置管柱和分离管柱，且仅用于单次使用。在起始分离程序之后，该系统将细胞样品自动地施加至分离管柱上。经标记的细胞保留在管柱内，而未标记的细胞通过一系列洗涤步骤移除。在一些实施方式中，用于本申请所述的方法的细胞群未经标记且未保留在管柱中。在一些实施方式中，用于本申请所述的方法的细胞群经标记且保留在管柱中。在一些实施方式中，移除磁场之后，自管柱溶离用于本申请所述的方法的细胞群，并将其收集在细胞收集袋内。
在某些实施方式中，使用CliniMACS
系统(Miltenyi Biotec)进行分离和/或其他步骤。在一些方面中，CliniMACS
系统装备有细胞处理单元，其允许自动洗涤和通过离心对细胞进行分级分离。CliniMACS
系统也可包括机载照相机和影像识别软件，该软件通过辨别源细胞产物的宏观层来确定最佳的细胞分级分离终点。举例而言，末梢血液可自动分离成红血球、白血球和血浆层。CliniMACS
系统也可包括整合式细胞培育室，其实现细胞培养方案，诸如细胞分化和扩增、抗原负载和长期细胞培养。输入端允许无菌移除和补充培养基且可使用整合式显微镜监测细胞(参见例如Klebanoff等人(2012)J Immunother.35(9):651-660；Terakura等人(2012)Blood.1:72-82；和Wang等人(2012)J Immunother.35(9):689-701)。
在一些实施方式中，本申请所描述的细胞群经由流动式细胞测量术收集和富集(或耗竭)，其中将针对多种细胞表面标记物染色的细胞载运于流体流中。在一些实施方式中，本申请所描述的细胞群经由制备级(FACS)分选收集和富集(或耗竭)。在某些实施方式中，本申请所描述的细胞群通过使用微机电系统(MEMS)芯片与基于FACS的侦测系统的组合来收集和富集(或耗竭)(参见例如WO 2010/033140；Cho等人(2010)Lab Chip 10,1567-1573；和Godin等人(2008)J Biophoton.1(5):355-376)。在两种情况下，细胞可用多种标记物标记，由此允许高纯度分离明确地确定的T细胞亚群。
在一些实施方式中，抗体或结合搭配物经一或多种可侦测标记物标记，以促进根据阳性和/或阴性选择进行的分离。举例而言，分离可基于与荧光标记的抗体的结合。在一些实例中，将基于对一或多种细胞表面标记物具有特异性的抗体或其他结合搭配物的结合分离的细胞载运于流体流中，诸如通过荧光活化细胞分选(FACS)，包括制备级(FACS)和/或微机电系统(MEMS)芯片，例如与流式细胞测量侦测系统的组合。此类方法允许基于多种标记物同时进行阳性和阴性选择。
在一些实施方式中，制备方法包括在分离、培育和/或工程化之前或之后冷冻，例如低温保藏细胞的步骤。在一些实施方式中，冷冻和随后的解冻步骤移除细胞群中的粒细胞且在一定程度上移除单核球。在一些实施方式中，将细胞悬浮于冷冻溶液中，例如在洗涤步骤之后将细胞悬浮于冷冻溶液中，以移除血浆和血小板。在一些方面中，可使用多种已知的冷冻溶液和参数中的任一种。一个实例涉及使用含有20％DMSO和8％人类血清白蛋白(HSA)的PBS，或其他适合的细胞冷冻介质。接着，将其用培养基以1:1稀释，使得DMSO和HAS的最终浓度分别为10％和4％。接着，细胞以每分钟1℃的速率冷冻至-80℃且储存于液氮储槽的气相中。
在一些实施方式中，所提供的方法包括栽培、培育、培养和/或基因工程改造步骤。举例而言，在一些实施方式中，提供对耗竭的细胞群进行培育和/或基因工程改造的方法和起始培养的组合物。
因此，在一些实施方式中，在起始培养的组合物中培育细胞群。培育和/或基因工程改造可在培养容器中进行，诸如用于培养或栽培细胞的单元、腔室、孔、管柱、管、管组、阀、小瓶、培养皿、袋或其他容器。
在一些实施方式中，细胞在基因基因工程改造之前或结合基因工程改造进行培育和/或培养。培育(incubation)步骤可包括培养、栽培、刺激、活化和/或繁殖。在一些实施方式中，组合物或细胞在刺激条件或刺激剂存在下培育。此类条件包括经设计以诱导群体中细胞的增殖、扩增、活化和/或存活、模拟抗原暴露和/或引发细胞以进行基因工程改造，诸如用于引入重组抗原受体的条件。
这些条件可包括以下一或多种：特定培养基、温度、氧含量、二氧化碳含量、时间、药剂，例如营养物、氨基酸、抗生素、离子和/或刺激因子，诸如细胞因子、趋化因子、抗原、结合搭配物、融合蛋白、重组可溶性受体和经设计以使细胞活化的任何其他药剂。
在一些实施方式中，刺激条件或刺激剂包括能够活化TCR复合物的细胞内信号转导结构域的一或多种药剂，例如配体。在一些方面中，药剂开启或起始T细胞中的TCR/CD3细胞内信号转导级联。此类药剂可包括抗体，诸如对TCR组分和/或共刺激受体(例如抗CD3、抗CD28，例如其结合至固体载体，诸如珠粒)和/或一或多种细胞因子具有特异性的抗体。任选地，扩增方法可进一步包含将抗CD3和/或抗CD28抗体(例如至少约0.5ng/ml浓度)添加至培养基中的步骤。在一些实施方式中，刺激剂包括IL-2和/或IL-15，例如至少约10单位/毫升浓度的IL-2。
在一些方面中，培育根据诸如Riddell等人的美国专利第6,040,177号；Klebanoff等人(2012)J Immunother.35(9):651-660；Terakura等人(2012)Blood.1:72-82；和/或Wang等人(2012)J Immunother.35(9):689-701中所描述的技术之类技术进行。
在一些实施方式中，T细胞通过向起始培养的组合物中添加饲养细胞，诸如非分裂末梢血液单核细胞(PBMC)(例如使所得细胞群含有至少约5、10、20或40个或更多PBMC饲养细胞用于待扩增的初始群中的各T淋巴球)；并培育培养物(例如保持足以扩增T细胞数量的时间)来扩增。在一些方面中，非分裂饲养细胞可包含γ照射的PBMC饲养细胞。在一些实施方式中，PBMC用在约3000至3600拉德(rads)范围内的γ射线照射以防止细胞分裂。在一些方面中，在添加T细胞群之前，将饲养细胞添加至培养基中。
在一些实施方式中，刺激条件包括适于人类T淋巴球生长的温度，例如至少约25℃，一般至少约30℃，且一般为或为约37℃。任选，培育可进一步包含添加非分裂EBV转型的类淋巴母细胞(LCL)作为饲养细胞。LCL可经在约6000至10,000拉德范围内的γ射线照射。在一些方面中，LCL饲养细胞以任何适合量提供，诸如LCL饲养细胞与初始T淋巴球的比率为至少约10:1。
在实施方式中，抗原特异性T细胞，诸如抗原特异性CD4+和/或CD8+T细胞，通过用抗原刺激初始或抗原特异性T淋巴球来获得。举例而言，可通过自经感染的受试者分离T细胞并在活体外用细胞巨大病毒抗原刺激这些细胞来产生针对该抗原的抗原特异性T细胞系或克隆物。
C.用于多重靶向的基因工程细胞、载体和组合物
也提供可结合至和/或靶向多种抗原的细胞，诸如基因工程细胞。在一些实施方式中，经由靶向多种抗原的策略来达成选择性和特异性的改善。此类策略一般涉及多个抗原结合结构域，这些抗原结合结构域通常存在于不同的经基因工程改造的抗原受体上且特异性结合至不同抗原。在一些实施方式中，细胞经基因工程改造成能够结合超过一种抗原。举例而言，在一些实施方式中，细胞经工程改造以表达多特异性结合分子。在一些实施方式中，细胞表达多个结合分子，例如重组受体，这些结合分子各自可靶向一种抗原或多种抗原，例如靶向GPRC5D的一种受体，诸如本申请所描述的任何受体，和靶向另一抗原，诸如肿瘤抗原，例如BCMA的另一受体。示例性抗BCMA受体描述于本申请和以下中：WO 2013/154760、WO 2015/052538、WO 2015/090229、WO 2015/092024、WO 2015/158671、WO 2016/014565、WO 2016/014789、WO 2016/094304、WO 2016/166630、WO 2017/021450、WO 2017/083511、WO 2017/130223、WO 2017/211900、WO 2018/085690、WO 2018/028647。
在一些方面中，将复数个经基因工程改造的抗原受体引入细胞中，这些抗原受体特异性结合至不同抗原，这些抗原各自在待用这些细胞靶向的疾病或病况或其组织或细胞中或其上表达。在一些方面中，此类特征可解决或降低脱靶效应的可能性和/或增加反应。举例而言，在疾病或病况中表达的单个抗原也在未患病或正常细胞上或其中表达的情况下，此类多重靶向方法可通过需要经多个抗原受体结合来提供对所需细胞类型的选择性，以便使该细胞活化或诱导特定效应功能。在一些实施方式中，复数个细胞可经基因工程改造以表达一个或多个不同的结合分子，例如重组受体，该一个或多个不同的结合分子各自可靶向一种抗原或多种抗原。
也提供多特异性细胞或组合物，诸如含有本申请所提供的结合分子或细胞中的任一种的一个或多个的多特异性细胞或组合物。在一些方面中，多特异性细胞，诸如包括含抗GPRC5D受体或其结构域的细胞表面蛋白质和额外细胞表面蛋白质或其结构域(诸如额外嵌合受体或其结构域)的细胞结合至不同抗原或GPRC5D上的不同抗原决定簇。在一些实施方式中，该额外嵌合受体结合BCMA抗原或BCMA的抗原决定簇，或该额外抗原是BCMA。在一些实施方式中，提供表达重组受体的细胞的组合物，其中结合分子、多特异性结合分子和/或重组受体中的一种或多种结合和/或靶向GPRC5D。在一些实施方式中，这些多特异性结合分子和/或重组受体和/或细胞或组合物靶向GPRC5D上的一个或多个不同的抗原决定簇。在一些实施方式中，这些多特异性结合分子和/或重组受体或细胞或组合物靶向GPRC5D上的一个或多个不同的抗原决定簇和BCMA上的一个或多个抗原决定簇。
在一些实施方式中，提供细胞的组合物，其中该组合物内的细胞表达一个或多个结合分子，例如重组受体。在一些实施方式中，该细胞包含一个或多个载体或构建体(且在一些情况下经一个或多个载体或构建体转型或转染或转导)，该一个或多个载体或构建体包含编码一个或多个氨基酸序列的一个或多个核酸，该一个或多个氨基酸序列构成一或多种抗体和/或其部分，例如其抗原结合片段。在一些实施方式中，提供一个或多个此类细胞。在一些实施方式中，提供含有一个或多个此类细胞的组合物。在一些实施方式中，该一个或多个细胞可表达不同受体或相同受体。在一些实施方式中，该组合物内的细胞表达多特异性结合分子，例如多特异性受体，例如CAR。
在一些方面中，提供的实施方式包括多重靶向策略，这些策略靶向GPRC5D和与特定疾病或病况相关的第二或额外抗原。在一些实施方式中，该第二或额外抗原是多特异性结合分子和/或多个结合分子和/或各自经基因工程改造以表达一或多种重组受体的复数个细胞(例如一个或多个细胞)的靶标。在一些实施方式中，靶向第二或额外抗原的重组受体在与GPRC5D结合分子、例如抗GPRC5D CAR相同的细胞上或在不同细胞上表达。
在一些实施方式中，特异性结合或靶向第二抗原的其他重组受体包括在本申请所提供的细胞、组合物和方法中。在一些实施方式中，复数种抗原，例如第一抗原例如GPRC5D，和第二或额外抗原例如BCMA是在所靶向的细胞、组织或疾病或病况上，诸如在癌细胞上表达或疑似在该细胞、组织或疾病或病况上表达在一些方面中，该细胞、组织、疾病或病况是多发性骨髓瘤或多发性骨髓瘤细胞。
在一些方面中，第二抗原，例如额外或其他抗原，诸如疾病特异性抗原和/或相关抗原，在多发性骨髓瘤上表达，诸如BCMA、CD38(环状ADP核糖水解酶)、CD138(多配体蛋白聚糖-1、多配体蛋白聚糖、SYN-1)、CS-1(CS1、CD2亚群1、CRACC、SLAMF7、CD319和19A24)、BAFF-R、TACI和/或FcRH5。其他示例性多发性骨髓瘤抗原包括CD56、TIM-3、CD33、CD123、CD44、CD20、CD40、CD74、CD200、EGFR、β2-微球蛋白、HM1.24、IGF-1R、IL-6R、TRAIL-R1和活化素受体IIA型(ActRIIA)(参见Benson和Byrd,J.Clin.Oncol.(2012)30(16):2013-15；Tao和Anderson,Bone Marrow Research(2011):924058；Chu等人,Leukemia(2013)28(4):917-27；Garfall等人,Discov Med.(2014)17(91):37-46)。在一些实施方式中，抗原包括存在于淋巴肿瘤、骨髓瘤、AIDS相关淋巴瘤和/或移植后淋巴组织增生上的抗原，诸如CD38。针对此类抗原的抗体或抗原结合片段是已知的且包括例如以下中描述者：美国专利第8,153,765号、第8,603477号、第8,008,450号；美国公开第US20120189622号和第US20100260748号；和/或国际PCT公开第WO 2006/099875号、第WO 2009/080829号、第WO 2012/092612号、第WO2014210064号、第WO 2013/154760号、第WO 2015/052538号、第WO 2015/090229号、第WO2015/092024号、第WO 2015/158671号、第WO 2016/014565号、第WO 2016/014789号、第WO2016/094304号、第WO 2016/166630号、第WO 2017/021450号、第WO 2017/083511号、第WO2017/130223号、第WO 2017/211900号、第WO 2018/085690号、第WO 2018/028647号。在一些实施方式中，此类抗体或其抗原结合片段(例如scFv)包含在多特异性抗体、多特异性嵌合受体(诸如多特异性CAR)和/或多特异性细胞中。
在一些实施方式中，提供的细胞表达提供的CAR和一或多种其他重组受体，诸如抗BCMA重组受体(例如抗BCMA CAR)。在一些实施方式中，提供的细胞含有编码一或多种其他重组受体(例如抗BCMA CAR)的多核苷酸，以及编码本申请所提供的抗GPRC5D受体的一个或多个多核苷酸。在一些实施方式中，将提供的细胞与表达非抗GPRC5D受体的重组受体的其他基因工程细胞，诸如表达抗BCMA受体(例如抗BCMA CAR)的基因工程细胞组合于同一组合物或独立组合物中，且可一起或分开地以提供的方法或用途中的任一种给予。任何重组受体均可与提供的抗GPRC5D受体组合于提供的细胞中的任一个中，由此提供的细胞表达本申请所提供的抗GPRC5D受体和另一受体。表达抗GPRC5D受体(例如抗GPRC5D CAR)的细胞可与表达任何重组受体的细胞组合于同一组合物或独立组合物中，以用于本申请所提供的方法或用途中。此类细胞、组合物和多核苷酸在本申请中别处描述。
在一些实施方式中，该另一重组受体是抗BCMA受体，诸如抗BCMA CAR。涵盖本申请中提供的细胞、方法和用途中任何抗BCMA CAR的使用或并入。同样涵盖在例如多顺反子(例如双顺反子)表达载体中编码本申请所提供的抗GPRC5D受体和另一受体的多核苷酸。示例性抗BCMA CAR分子描述于以下中：WO 2013/154760、WO 2015/052538、WO 2015/090229、WO2015/092024、WO 2015/158671、WO 2016/014565、WO 2016/014789、WO 2016/094304、WO2016/166630、WO 2017/021450、WO 2017/083511、WO 2017/130223、WO 2017/211900、WO2018/085690、WO 2018/028647。
在一些实施方式中，CAR是对BCMA，例如人类BCMA具有特异性的抗BCMA CAR。先前已描述含有包括小鼠抗人类BCMA抗体和人类抗人类抗体在内的抗BCMA抗体的嵌合抗原受体，和表达此类嵌合受体的细胞。参见Carpenter等人,Clin Cancer Res.,2013,19(8):2048-2060；WO 2016/090320；WO2016090327；WO2010104949A2；和WO2017173256。在一些实施方式中，抗BCMA CAR含有抗原结合结构域，诸如scFv，其含有来源于WO 2016/090320或WO2016090327中所描述的抗体的重链可变(VH)和/或轻链可变(VL)区。
提供的抗BCMA CAR中有这样一种CAR，其中该抗体或抗原结合片段含有VH区，其包含SEQ ID NO:189中所示的序列或与SEQ ID NO:189具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；且含有VL区，其包含SEQ ID NO:190中所示的序列或与SEQ ID NO:190具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列。在一些实施方式中，提供的CAR中的抗体或抗原结合片段含有VH区，其具有分别含SEQ ID NO:199、200、201的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和VL区，其具有分别含SEQ ID NO:218、219和220的氨基酸序列的CDRL1、CDRL2和CDRL3。在一些实施方式中，该VH区包含SEQ ID NO:189中所示的序列且该VL区包含SEQ IDNO:190中所示的序列。在一些实施方式中，该抗体或抗原结合片段是单链抗体片段，诸如scFv。在一些实施方式中，scFv包含SEQ ID NO:237中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:237至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致的氨基酸序列。在一些实施方式中，scFv由SEQ ID NO:242中所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO:242至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致的核苷酸序列编码。在一些实施方式中，该抗BCMA CAR具有SEQ NO:247中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:247至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致的氨基酸序列。
提供的抗BCMA CAR中有这样一种CAR，其中该抗体或抗原结合片段含有VH区，其包含SEQ ID NO:191中所示的序列或与SEQ ID NO:191具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；且含有VL区，其包含SEQ ID NO:192中所示的序列或与SEQ ID NO:192具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列。在一些实施方式中，提供的CAR中的抗体或抗原结合片段含有VH区，其具有分别含SEQ ID NO:202、203、204的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和VL区，其具有分别含SEQ ID NO:221、222、223的氨基酸序列的CDRL1、CDRL2和CDRL3。在一些实施方式中，该VH区包含SEQ ID NO:191中所示的序列且该VL区包含SEQ IDNO:192中所示的序列。在一些实施方式中，该抗体或抗原结合片段是单链抗体片段，诸如scFv。在一些实施方式中，scFv包含SEQ ID NO:238中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:238至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致的氨基酸序列。在一些实施方式中，scFv由SEQ ID NO:243中所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO:243至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致的核苷酸序列编码。在一些实施方式中，该抗BCMACAR具有SEQ NO:248中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:248至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致的氨基酸序列。
提供的抗BCMA CAR中有这样一种CAR，其中该抗体或抗原结合片段含有VH区，其包含SEQ ID NO:193中所示的序列或与SEQ ID NO:193具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；且含有VL区，其包含SEQ ID NO:194中所示的序列或与SEQ ID NO:194具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列。在一些实施方式中，提供的CAR中的抗体或抗原结合片段含有VH区，其具有分别含SEQ ID NO:199、200和205的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和VL区，其具有分别含SEQ ID NO:224、225和226的氨基酸序列的CDRL1、CDRL2和CDRL3。在一些实施方式中，该VH区包含SEQ ID NO:193中所示的序列且该VL区包含SEQ IDNO:194中所示的序列。在一些实施方式中，该抗体或抗原结合片段是单链抗体片段，诸如scFv。在一些实施方式中，scFv包含SEQ ID NO:239中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:239至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致的氨基酸序列。在一些实施方式中，scFv由SEQ ID NO:244中所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO:244至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致的核苷酸序列编码。在一些实施方式中，该抗BCMA CAR具有SEQ NO:249中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:249至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致的氨基酸序列。
提供的抗BCMA CAR中有这样一种CAR，其中该抗体或抗原结合片段含有VH区，其包含SEQ ID NO:195中所示的序列或与SEQ ID NO:195具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；且含有VL区，其包含SEQ ID NO:196中所示的序列或与SEQ ID NO:196具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列。在一些实施方式中，提供的CAR中的抗体或抗原结合片段含有VH区，其具有分别含SEQ ID NO:206、207和208的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和VL区，其具有分别含SEQ ID NO:227、228和229的氨基酸序列的CDRL1、CDRL2和CDRL3。在一些实施方式中，提供的CAR中的抗体或抗原结合片段含有VH区，其具有分别含SEQ ID NO:212、213和214的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和VL区，其具有分别含SEQID NO:233、234和229的氨基酸序列的CDRL1、CDRL2和CDRL3。在一些实施方式中，该VH区包含SEQ ID NO:195中所示的序列且该VL区包含SEQ ID NO:196中所示的序列。在一些实施方式中，该抗体或抗原结合片段是单链抗体片段，诸如scFv。在一些实施方式中，scFv包含SEQID NO:240中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:240至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致的氨基酸序列。在一些实施方式中，scFv由SEQ ID NO:245中所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO:245至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致的核苷酸序列编码。在一些实施方式中，该抗BCMA CAR具有SEQNO:250中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:250至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致的氨基酸序列。
提供的抗BCMA CAR中有这样一种CAR，其中该抗体或抗原结合片段含有VH区，其包含SEQ ID NO:197中所示的序列或与SEQ ID NO:197具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；且含有VL区，其包含SEQ ID NO:198中所示的序列或与SEQ ID NO:198具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列。在一些实施方式中，提供的CAR中的抗体或抗原结合片段含有VH区，其具有分别含SEQ ID NO:209、210和211的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和VL区，其具有分别含SEQ ID NO:230、231和232的氨基酸序列的CDRL1、CDRL2和CDRL3。在一些实施方式中，提供的CAR中的抗体或抗原结合片段含有VH区，其具有分别含SEQ ID NO:215、216和217的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和VL区，其具有分别含SEQID NO:235、236、232的氨基酸序列的CDRL1、CDRL2和CDRL3。在一些实施方式中，该VH区包含SEQ ID NO:197中所示的序列且该VL区包含SEQ ID NO:198中所示的序列。在一些实施方式中，该抗体或抗原结合片段是单链抗体片段，诸如scFv。在一些实施方式中，scFv包含SEQID NO:241中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:241至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致的氨基酸序列。在一些实施方式中，scFv由SEQ ID NO:246中所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO:246至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致的核苷酸序列编码。在一些实施方式中，该抗BCMACAR具有SEQNO:251或252中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:251或252至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致的氨基酸序列。
在一些实施方式中，这些细胞和方法包括多重靶向策略，诸如在细胞上表达两种或两种以上经基因工程改造的受体，这些受体各自识别不同抗原且在一些方面中各自包括不同的细胞内信号转导组分。此类多重靶向策略描述于例如国际专利申请公开第WO 2014055668号(描述活化和共刺激CAR的组合，例如靶向个别地存在于脱靶，例如正常细胞上，但仅一起存在于待治疗的疾病或病况的细胞上的两种不同抗原)和Fedorov等人(2013)Sci.Transl.Medicine,5(215)(描述表达活化和抑制性CAR的细胞，诸如活化CAR结合至在正常或未患病细胞和待治疗疾病或病况的细胞上表达的一种抗原，且抑制性CAR结合至仅在正常细胞或不需要治疗的细胞上表达的另一抗原者)中。
在一些实施方式中，提供复数个细胞，其各自经基因工程改造以表达一或多种重组受体。举例而言，在一些实施方式中，一个细胞经基因工程改造以表达结合和/或靶向GPRC5D的结合分子，且另一细胞经基因工程改造以表达结合和/或靶向额外或第二抗原的结合分子。在一些实施方式中，该额外或第二抗原是BCMA。在一些实施方式中，这些细胞可各自表达多特异性结合分子，例如多特异性重组受体，其中一个或多个靶标抗原是GPRC5D。在一些此类实施方式中，该复数个细胞可在一起或分开地给予。在一些实施方式中，该复数个细胞在这些细胞同时、同步或之后给予，例如与该复数个细胞中的另一基因工程细胞在同一天和/或按任何次序依序或间歇地给予。举例而言，在一些实施方式中，将表达GPRC5D结合受体，例如CAR的基因工程细胞与表达结合不同靶标抗原，例如BCMA，或GPRC5D上的不同抗原决定簇的结合分子的另一基因工程细胞同时或按任何次序依序给予。在一些实施方式中，该复数个细胞可在同一组合物中。
IV.药物组合物
也提供包括抗GPRC5D重组受体(例如抗GPRC5D CAR)和基因工程细胞的组合物，包括药物组合物和配制物。在此类组合物中有包括表达所提供的抗GPRC5D重组受体(例如CAR)的基因工程细胞，诸如复数个基因工程细胞的组合物。
也提供包括抗GPRC5D重组受体(例如抗GPRC5D CAR)和第二重组受体(例如CAR)，诸如抗BCMA重组受体(例如抗BCMA CAR)，和基因工程细胞的组合物，包括药物组合物和配制物。在此类组合物中有包括表达提供的抗GPRC5D重组受体(例如CAR)和/或第二重组受体(例如CAR)，诸如抗BCMA重组受体(例如抗BCMA CAR)的基因工程细胞，诸如复数个基因工程细胞的组合物。在一些实施方式中，提供的组合物包括表达提供的抗GPRC5D CAR以及表达抗BCMA CAR的基因工程细胞，诸如复数个基因工程细胞。在一些实施方式中，提供的组合物包括表达提供的CAR的基因工程细胞，这些CAR结合GPRC5D和BCMA，诸如包含抗GPRC5D scFv和抗BCMA scFv的CAR。
提供药物配制物，其包含GPRC5D结合重组嵌合抗原受体和表达这些受体的基因工程细胞、表达这些受体和/或用于组合治疗或疗法的额外药剂的复数个基因工程细胞。药物组合物和配制物一般包括一或多种任选选用的药学上可接受的载剂或赋形剂。在一些实施方式中，该组合物包括至少一种额外治疗剂。
术语“药物配制物”是指呈现容许其中所含活性成分的生物活性有效的形式且不含对给予该配制物的受试者具有不可接受毒性的额外组分的制剂。
“药学上可接受的载剂”是指药物配制物中除活性成分以外的对受试者无毒的成分。药学上可接受的载剂包括(但不限于)缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
在一些方面中，载剂的选择部分地由特定细胞、结合分子和/或抗体和/或通过投药方法确定。因此，存在多种适合的配制物。举例而言，药物组合物可含有防腐剂。适合防腐剂可包括例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸钠和苯扎氯铵(benzalkoniumchloride)。在一些方面中，使用两种或两种以上防腐剂的混合物。防腐剂或其混合物通常以总组合物的约0.0001重量％至约2重量％的量存在。载剂描述于例如Remington'sPharmaceutical Sciences,第16版,Osol,A.编(1980)中。药学上可接受的载剂一般在所用剂量和浓度下对接受者无毒，且包括(但不限于)缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苯甲基铵、氯化六羟季铵、苯扎氯铵、苄索氯铵(benzethonium chloride)、苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟苯甲酸烷酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；以及间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯啶酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单醣、双醣和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖，诸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，诸如钠；金属错合物(例如Zn-蛋白质错合物)；和/或非离子性界面活性剂，诸如聚乙二醇(PEG)。
在一些方面中，组合物中包括缓冲剂。适合缓冲剂包括例如柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸、磷酸钾以及各种其他酸和盐。在一些方面中，使用两种或两种以上缓冲剂的混合物。缓冲剂或其混合物通常以总组合物的约0.001重量％至约4重量％的量存在。用于制备可给予的药物组合物的方法是已知的。示例性方法更详细地描述于例如Remington:The Scienceand Practice of Pharmacy,Lippincott Williams&Wilkins；第21版(2005年5月1日)中。
本申请所描述的抗体的配制物可包括冻干配制物和水溶液。
配制物或组合物也可含有超过一种可用于特定适应症、疾病或病况的活性成分，该适应症、疾病或病况用结合分子或细胞，较佳具有与该结合分子或细胞互补的活性的结合分子或细胞治疗，其中各别活性剂彼此间无不利影响。此类活性成分宜以有效达成预期目的的量组合存在。因此，在一些实施方式中，药物组合物进一步包括其他医药活性剂或药物，诸如化学治疗剂，例如天冬酰胺酶、白消安(busulfan)、卡铂(carboplatin)、顺铂(cisplatin)、道诺霉素(daunorubicin)、小红莓(doxorubicin)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、吉西他滨(gemcitabine)、羟基脲、甲胺喋呤(methotrexate)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、利妥昔单抗(rituximab)、长春碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)等。在一些实施方式中，细胞或抗体以盐，例如药学上可接受的盐的形式给予。适合的药学上可接受的酸加成盐包括衍生自无机酸和有机酸的酸加成盐，这些无机酸诸如盐酸、氢溴酸、磷酸、偏磷酸、硝酸和硫酸，这些有机酸诸如酒石酸、乙酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、反丁烯二酸、苯甲酸、乙醇酸、葡萄糖酸、琥珀酸和芳基磺酸，例如对甲苯磺酸。
活性成分可截留于微胶囊、胶态药物递送系统(例如脂质粒、白蛋白微球体、微乳液、奈米粒子和奈米胶囊)或巨乳液中。在某些实施方式中，药物组合物配制为包合错合物，诸如环糊精包合错合物形式；或配制为脂质粒。脂质粒可用于使宿主细胞(例如T细胞或NK细胞)靶向特定组织。有许多方法可用于制备脂质粒，诸如以下中所描述的方法：Szoka等人,Ann.Rev.Biophys.Bioeng.,9:467(1980)；和美国专利4,235,871、4,501,728、4,837,028和5,019,369。
在一些方面中，药物组合物可采用定时释放型、延迟释放型和持续释放型递送系统，由此使组合物的递送在待治疗部位敏化之前发生且其时间足以引起待治疗部位的敏化。多种类型的释放递送系统是可用且已知的。此类系统可避免重复给予组合物，由此增加受试者和医师的便利性。
在一些实施方式中，药物组合物含有有效治疗或预防疾病或病况的量的结合分子和/或细胞，诸如治疗有效量或预防有效量。在一些实施方式中，治疗或预防功效通过定期评估所治疗的受试者监测。对于经数天或更长时间重复给予，取决于病况，重复治疗直至出现所希望的疾病症状抑制。然而，其他给药方案也可为有用的且可确定。所希望的剂量可通过单次快速给予组合物、通过多次快速给予组合物或通过连续输注给予组合物来递送。
在某些实施方式中，在经基因工程改造的细胞含有结合分子的情形中，向受试者给予范围为约1×106至约1×1011个细胞，诸如1×106至约5×1010个细胞(例如约5×106个细胞、约2.5×107个细胞、约5×108个细胞、约1×109个细胞、约5×109个细胞、约2×1010个细胞、约3×1010个细胞、约4×1010个细胞，或由任何两个前述值界定的范围)，诸如约1×107至约1×1011个细胞(例如约2×107个细胞、约3×107个细胞、约4×107个细胞、约6×107个细胞、约7×107个细胞、约8×107个细胞、约9×107个细胞、约1×1010个细胞、约2.5×1010个细胞、约5×1010个细胞、约7.5×1010个细胞、约9×1010个细胞，或由任何两个前述值界定的范围)，且在一些情况下，为约1×108个细胞至约5×1010个细胞(例如约1.2×108个细胞、约2.5×108个细胞、约3.5×108个细胞、约4.5×108个细胞、约6.5×108个细胞、约8×108个细胞、约9×108个细胞、约3×109个细胞、约3×1010个细胞、约4.5×1010个细胞)或此等范围之间的任何值和/或以每公斤体重计的这些细胞数量。在一些方面中，在表达结合分子，例如CAR的经基因工程改造的细胞的情形中，组合物可含有至少用于给予一定剂量细胞疗法的数量的细胞，诸如约或至少用于给予的数量的本申请所描述的细胞。
该组合物可使用标准投药技术、配制物和/或装置进行给予。提供配制物和用于储存和给予组合物的装置，诸如注射器和小瓶。细胞的给予可为自体或异源的。举例而言，免疫反应性细胞或祖细胞可自一位受试者获得且向同一受试者或不同的兼容性受试者给予。末梢血液源性免疫反应性细胞或其后代(例如活体内、离体或活体外来源)可经由局部注射给予，包括导管给予、全身注射、局部注射、静脉内注射或非经肠给予。当给予治疗性组合物(例如含有经基因修饰的免疫反应性细胞的药物组合物)时，其一般配制成单位剂量可注射形式(溶液、悬浮液、乳液)。
配制物包括供经口、静脉内、腹膜内、皮下、经肺、经皮、肌肉内、鼻内、经颊、舌下或栓剂给予的配制物。在一些实施方式中，细胞群非经肠给予。如本申请所使用，术语“非经肠”包括静脉内、肌肉内、皮下、经直肠、经阴道、颅内、胸内和腹膜内给予。在一些实施方式中，细胞群使用周边全身递送、通过静脉内、腹膜内或皮下注射来给予受试者。
在一些实施方式中，组合物以无菌液体制剂形式提供，例如等张水溶液、悬浮液、乳液、分散液或组合物组合物，在一些方面中，其可经缓冲至所选pH值。液体制剂的制备通常比凝胶、其他黏性组合物和固体组合物要容易。另外，液体组合物的给予在某种程度上更方便，尤其是通过注射给予。另一方面，黏性组合物可在适当黏度范围内配制以提供与特定组织的较长接触时段。液体或黏性组合物可包含载剂，这些载剂可为含有例如水、生理食盐水、磷酸盐缓冲生理食盐水、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇)和其适合混合物的溶剂或分散介质。
无菌可注射溶液可通过将结合分子并入溶剂中，诸如与适合载剂、稀释剂或赋形剂(诸如无菌水、生理食盐水、葡萄糖、右旋糖或其类似物)混合来制备。组合物也可经冻干。取决于给予途径和所需制剂，组合物可含有辅助物质，诸如湿润剂、分散剂或乳化剂(例如甲基纤维素)、pH缓冲剂、胶凝或黏度增强性添加剂、防腐剂、调味剂、颜料和其类似物。在一些方面中，可查询标准本申请以制备适合制剂。
可添加增强组合物的稳定性和无菌性的各种添加剂，包括抗微生物防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和缓冲剂。可利用各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸和其类似物来确保防止微生物的作用。可注射医药形式的延长吸收可通过使用延迟吸收的试剂，诸如单硬脂酸铝和明胶来实现。
可以制备持续释放型制剂。持续释放型制剂的适合实例包括含有抗体的固体疏水性聚合物的半渗透基质，这些基质呈成形物品形式，例如呈膜或微胶囊形式。
用于活体内给予的配制物一般是无菌的。无菌性可通过例如经无菌过滤膜过滤容易地实现。
也提供用于组合疗法的药物组合物。可制备用于本申请所描述的组合疗法的任何额外药剂，诸如II.C部分中所描述的药剂，且与本申请所描述的抗GPRC5D重组受体(例如嵌合抗原受体)和/或表达这些分子(例如重组受体)的基因工程细胞一起以一或多种药物组合物形式给予。组合疗法可以一或多种药物组合物形式给予，例如其中结合分子、重组受体和/或细胞与额外药剂在相同的药物组合物中或在独立药物组合物中。举例而言，在一些实施方式中，该额外药剂是额外基因工程细胞，例如经基因工程改造以表达不同重组受体，诸如靶向BCMA的重组受体的细胞，且以同一组合物或以独立组合物给予。在一些实施方式中，该药物组合物各自根据特定结合分子、重组受体、细胞(例如基因工程细胞)和/或额外药剂、和特定给药方案和/或递送方法而以适合配制物形式配制。
V.方法和用途
也提供使用靶向GPRC5D的重组受体、基因工程细胞以及其药物组合物和配制物的方法和用途，诸如用于治疗表达GPRC5D的疾病、病况和病症，和/或侦测、诊断和预后方法中。在此类方法和用途中有涉及向受试者给予表达提供的抗GPRC5D重组受体(例如CAR)的基因工程细胞，诸如复数个基因工程细胞的方法和用途。也提供组合疗法和/或治疗的方法。
A.治疗和预防方法和用途
也提供给予抗GPRC5D重组受体(例如CAR)、表达这些重组受体(例如CAR)的基因工程细胞、表达这些受体的复数个基因工程细胞和/或包含其的组合物的方法和其用途，诸如治疗和预防用途。此类方法和用途包括治疗方法和用途，例如其涉及向患有与GPRC5D相关的疾病、病况或病症，诸如患有与GPRC5D表达相关的疾病、病况或病症和/或细胞或组织表达(例如特异性表达)GPRC5D的受试者给予这些分子(例如重组受体)、细胞(例如基因工程细胞)或含有其的组合物。在一些实施方式中，该分子、细胞和/或组合物以有效实现疾病或病症的治疗的量给予。本申请提供重组受体(例如CAR)和细胞(例如基因工程细胞)在此类方法和治疗中和在制备进行此类治疗方法的药剂中的用途。在一些实施方式中，这些方法通过向患有、曾患有或疑似患有疾病或病况的受试者给予结合分子或细胞或包含其的组合物来进行。在一些实施方式中，这些方法由此治疗受试者的疾病或病况或病症。本申请也提供这些组合物中的任一种，诸如本申请所提供的药物组合物的用途，其用于治疗与GPRC5D相关的疾病或病症，诸如用于治疗方案中。
也提供给予抗GPRC5D和抗BCMA重组受体(例如CAR)、表达这些重组受体(例如CAR)的基因工程细胞、表达这些受体的复数个基因工程细胞和/或包含其的组合物的方法和其用途，诸如治疗和预防用途。此类方法和用途包括治疗方法和用途，例如其涉及向患有与GPRC5D和/或BCMA相关的疾病、病况或病症，诸如患有与GPRC5D和/或BCMA表达相关的疾病、病况或病症和/或细胞或组织表达(例如特异性表达)GPRC5D和/或BCMA的受试者给予这些分子(例如重组受体)、细胞(例如基因工程细胞)或含有其的组合物。在一些实施方式中，该分子、细胞和/或组合物以有效实现疾病或病症的治疗的量给予。本申请提供重组受体(例如CAR)和细胞(例如基因工程细胞)在此类方法和治疗中和在制备进行此类治疗方法的药剂中的用途。在一些实施方式中，这些方法通过向患有、曾患有或疑似患有疾病或病况的受试者给予结合分子或细胞或包含其的组合物来进行。在一些实施方式中，这些方法由此治疗受试者的疾病或病况或病症。本申请也提供这些组合物中的任一种，诸如本申请所提供的药物组合物的用途，其用于治疗与GPRC5D和/或BCMA相关的疾病或病症，诸如用于治疗方案中。
如本申请所使用，“治疗(treatment)”(和其文法变化形式，诸如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)是指疾病或病况或病症、或症状、不良作用或后果、或与其相关的表型的完全或部分改善或减轻。所需治疗作用包括(但不限于)预防疾病的发生或复发、缓解症状、减轻疾病的任何直接或间接病理结果、预防癌转移、降低疾病进展速率、改善或缓和疾病病况和缓解或改善预后。这些术语不表示疾病的完全治愈、或任何症状的完全消除、或对所有症状或结果的影响。
如本申请所使用，“延迟疾病发展”意谓推迟、阻碍、减慢、阻滞、稳定和/或推迟疾病(诸如癌症)的发展。此延迟可取决于疾病病史和/或所治疗的受试者而具有不同的时间长度。充分或显著延迟可实际上涵盖预防，因为受试者不会发展该疾病。举例而言，可延迟晚期癌症，诸如癌转移的发展。
如本申请所使用，“预防”包括针对可能易患疾病但尚未诊断患有该疾病的受试者的疾病发生或复发提供预防作用。在一些实施方式中，使用所提供的分子和组合物延迟疾病发展或减慢疾病进展。
如本申请所使用，“抑制”功能或活性当与除所关注条件或参数外在其他方面皆相同的条件相比较或者与另一条件相比较时功能或活性减退。举例而言，与在无抗体或组合物或细胞存在下的肿瘤生长速率相比较，抑制肿瘤生长的抗体或组合物或细胞使肿瘤生长速率降低。
在给予情形下，一种药剂，例如药物配制物、结合分子、抗体、细胞或组合物的“有效量”是指在必要剂量/量下和在必要时间段内有效达成所需结果，诸如治疗或预防结果的量。
一种药剂，例如药物配制物、结合分子、抗体、细胞或组合物的“治疗有效量”是指在必要剂量/量下和在必要时间段内达成所需治疗结果，诸如治疗疾病、病况或病症，和/或治疗的药物动力学或药效学作用的量。治疗有效量可根据诸如以下因素而变化：疾病状态、受试者的年龄、性别和体重，和给予的细胞群。在一些实施方式中，提供的方法涉及给予有效量，例如治疗有效量的分子、抗体、细胞和/或组合物。
“预防有效量”是指在必要剂量下和在必要的时间段内有效达成所需预防结果的量。通常但非必需，由于预防剂量在患病之前或在疾病早期用于受试者，故预防有效量将小于治疗有效量。
如本申请所使用，“受试者(subject)”或“个体(individual)”是哺乳动物。在一些实施方式中，“哺乳动物”包括人类、非人类灵长类动物、家畜和农畜，以及动物园动物、运动用动物或宠物，诸如犬、马、兔、牛、猪、仓鼠、沙鼠、小鼠、雪貂、大鼠、猫、猴等。在一些实施方式中，受试者是人类。
给予细胞以进行过继细胞疗法的方法是已知的且可与所提供的方法和组合物结合使用。举例而言，过继T细胞疗法方法描述于例如Gruenberg等人的美国专利申请公开第2003/0170238号；Rosenberg的美国专利第4,690,915号；Rosenberg(2011)Nat Rev ClinOncol.8(10):577-85)中。参见例如Themeli等人(2013)Nat Biotechnol.31(10):928-933；Tsukahara等人(2013)Biochem Biophys Res Commun 438(1):84-9；Davila等人(2013)PLoS ONE 8(4):e61338。
待治疗的疾病中有与GPRC5D相关的任何疾病或病症，或特异性表达GPRC5D和/或以GPRC5D作为治疗靶标的任何疾病或病症(在本申请中也可与“GPRC5D相关疾病或病症”互换提及)。与GPRC5D表达相关的癌症包括血液恶性疾病，诸如骨髓瘤，例如多发性骨髓瘤。在一些实施方式中，与GPRC5D相关的疾病或病症是B细胞相关病症或恶性疾病。在一些实施方式中，与GPRC5D相关的疾病或病症是多发性骨髓瘤或瓦登斯特罗姆氏巨球蛋白血症(Waldenstrom's Macroglobulinemia)。在某些实施方式中，该疾病或病症是多发性骨髓瘤。
待治疗的疾病中有与GPRC5D和/或BCMA相关的任何疾病或病症，或特异性表达GPRC5D和/或BCMA和/或以GPRC5D和/或BCMA作为治疗靶标的任何疾病或病症(在本申请中也可与“GPRC5D相关疾病或病症”或“BCMA相关疾病或病症”互换提及)。与GPRC5D和/或BCMA表达相关的癌症包括血液恶性疾病，诸如骨髓瘤，例如多发性骨髓瘤。在一些实施方式中，与GPRC5D和/或BCMA相关的疾病或病症是B细胞相关病症或恶性疾病。在一些实施方式中，与GPRC5D和/或BCMA相关的疾病或病症是多发性骨髓瘤或瓦登斯特罗姆氏巨球蛋白血症。在某些实施方式中，该疾病或病症是多发性骨髓瘤。
在一些实施方式中，该疾病或病症与GPRC5D和BCMA的表达相关。在一些实施方式中，该疾病的细胞疑似表达两种抗原。在一些实施方式中，这些抗原中的一种或两种易于发生抗原损失，因为该疾病中的一些细胞可能不再表达两种抗原。因此，在一些实施方式中，靶向GPRC5D和BCMA两种的双重靶向方法可能为有利的。
在一些实施方式中，这些方法可鉴别患有是疑似患有GPRC5D相关疾病或病症、或有患上该疾病或病症的风险的受试者。因此，提供用于鉴别患有与GPRC5D表达相关的疾病或病症的受试者并选择其以用提供的GPRC5D结合重组受体(例如CAR)和/或表达这些重组受体的基因工程细胞治疗的方法。
在一些实施方式中，这些方法可鉴别患有、疑似患有GPRC5D和/或BCMA相关疾病或病症、或有患上该疾病或病症的风险的受试者。因此，提供用于鉴别患有与GPRC5D和/或BCMA表达相关的疾病或病症的受试者并选择其以用提供的GPRC5D结合和BCMA结合重组受体(例如CAR)和/或表达这些重组受体的基因工程细胞治疗的方法。
举例而言，可针对与GPRC5D表达升高相关的疾病或病症，诸如表达GPRC5D的癌症的存在筛选受试者。在一些实施方式中，这些方法包括针对GPRC5D相关疾病，例如肿瘤的存在进行筛选或侦测其存在。因此，在一些方面中，样品可自疑似患有与GPRC5D表达升高相关的疾病或病症的患者获得并分析GPRC5D的表达量。在一些方面中，可选择针对GPRC5D相关疾病或病症测试呈阳性的受试者以通过本发明方法治疗，且可给予治疗有效量的包含GPRC5D结合分子的重组受体(例如CAR)、含有重组受体的细胞或如本申请所描述的其药物组合物。
举例而言，可针对与GPRC5D和/或BCMA表达升高相关的疾病或病症，诸如表达GPRC5D和/或BCMA的癌症的存在筛选受试者。在一些实施方式中，这些方法包括针对GPRC5D和/或BCMA相关疾病(例如肿瘤)的存在进行筛选或侦测其存在。因此，在一些方面中，样品可自疑似患有与GPRC5D和/或BCMA表达升高相关的疾病或病症的患者获得并分析GPRC5D和/或BCMA的表达量。在一些方面中，可选择针对GPRC5D和/或BCMA相关疾病或病症测试呈阳性的受试者以通过本发明方法治疗，且可给予治疗有效量的包含表达含GPRC5D结合分子的重组受体(例如CAR)且表达含BCMA结合分子的重组受体的细胞的组合物、或如本申请所描述的其药物组合物。在一些方面中，可选择针对GPRC5D和/或BCMA相关疾病或病症测试呈阳性的受试者以本发明方法治疗，且可给予治疗有效量的包含表达含GPRC5D结合分子和BCMA结合分子的重组受体(例如CAR)的细胞的组合物、表达含GPRC5D结合分子的重组受体和含BCMA结合分子的重组受体的细胞、或如本申请所描述的其药物组合物。
在一些实施方式中，该受试者患有持久性或复发性疾病，例如在用GPRC5D特异性抗体和/或表达靶向GPRC5D的嵌合受体的细胞和/或其他疗法治疗后患有持久性或复发性疾病，该其他疗法包括化学疗法、辐射和/或造血干细胞移植(HSCT)，例如同种异体HSCT或自体HSCT。在一些实施方式中，尽管受试者对另一种GPRC5D靶向疗法变得具有抗性，但该给予仍有效地治疗受试者。在一些实施方式中，受试者未复发，但经测定具有复发的风险，诸如有高复发风险，且因此预防性给予化合物或组合物，以例如降低复发可能性或防止复发。
在一些实施方式中，受试者已接受先前疗法，即BCMA CAR疗法或另一种BCMA靶向疗法。在一些实施方式中，受试者难以用此类BCMA CAR疗法或另一种BCMA靶向疗法治疗或在此类BCMA CAR疗法或另一种BCMA靶向疗法后复发。在一些情况下，受试者难以用疗法治疗或在疗法后因BCMA抗原阴性肿瘤细胞和/或BCMA抗原/抗原决定簇损失而复发。
在一些实施方式中，受试者在用另一疗法治疗，诸如用BCMA特异性抗体、BCMA靶向受体和/或表达BCMA靶向嵌合受体的细胞治疗后患有持久性或复发性疾病。在一些实施方式中，尽管受试者对另一种疗法，诸如BCMA靶向疗法变得具有抗性，但该给予仍有效地治疗受试者。在一些实施方式中，受试者未复发，但经测定具有复发的风险，诸如有高复发风险，且因此预防性给予化合物或组合物，以例如降低复发可能性或防止复发。
在一些实施方式中，受试者符合移植条件，诸如符合造血干细胞移植(HSCT)条件，例如同种异体HSCT或自体HSCT条件的受试者。在一些此类实施方式中，在给予如本申请所提供的抗GPRC5D重组受体(例如CAR)、表达这些重组受体(例如CAR)的基因工程细胞、表达这些受体的复数个基因工程细胞和/或包含其的组合物之前，受试者尽管符合条件但先前未接受过移植。
在一些实施方式中，受试者不符合移植条件，诸如不符合造血干细胞移植(HSCT)条件，例如同种异体HSCT或自体HSCT条件的受试者。在一些此类实施方式中，根据本申请提供的实施方式，向此类受试者给予抗GPRC5D重组受体(例如CAR)、表达这些重组受体(例如CAR)的基因工程细胞、表达这些受体的复数个基因工程细胞和/或包含其的组合物。
在一些实施方式中，在起始给予基因工程细胞之前，受试者已接受一或多种先前疗法。在一些实施方式中，受试者已接受至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种或更多种先前疗法。在一些实施方式中，受试者已接受至少3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种先前疗法。
在一些方面中，受试者在一或多种先前疗法之后复发，或难以用一或多种先前疗法中的一种或多种，例如该一或多种先前疗法中的每一个别疗法治疗。在一些方面中，这些先前疗法包括用自体干细胞移植(ASCT)、免疫调节剂、蛋白酶体抑制剂和抗CD38抗体治疗；除非受试者不为一或多种这些疗法的候选者或禁忌使用一或多种这些疗法。在一些实施方式中，免疫调节剂选自沙立度胺(thalidomide)、来那度胺(lenalidomide)或泊利度胺(pomalidomide)。在一些实施方式中，蛋白酶体抑制剂选自硼替佐米(bortezomib)、卡非佐米(carfilzomib)或依萨佐米(ixazomib)。在一些实施方式中，抗CD38抗体是或包含达雷木单抗(daratumumab)。在一些实施方式中，受试者必须对每一方案经历至少2个连续治疗周期，除非进行性疾病对该方案具有最佳反应。
在一些实施方式中，该方法可涉及基于特定标准、诊断或适应症，在提供的抗GPRC5D抗体、重组受体和/或包含此类受体的细胞的疗法中包括或排除特定受试者。在一些实施方式中，在给予细胞剂量时，受试者并无活动性浆细胞白血病(PCL)或无PCL史。在一些实施方式中，若受试者在给予时患有活动性PCL或有PCL史，则可将受试者排除在根据提供的方法的治疗以外。在一些实施方式中，若受试者在给予时发展PCL，诸如继发性PCL，则可将该受试者排除在根据提供的方法的治疗以外。在一些实施方式中，在筛选符合或适合根据提供的方法治疗的受试者时、在治疗方案的各种步骤、在接受淋巴球耗竭疗法时和/或在起始给予基因工程细胞或其组合物时或即将起始给予基因工程细胞或其组合物之前，可执行标准、诊断或适应症的评估。
在一些实施方式中，该方法可涉及基于特定标准、诊断或适应症，在提供的抗GPRC5D和抗BCMA抗体、重组受体和/或包含此类受体的细胞的疗法中包括或排除特定受试者。在一些实施方式中，在给予细胞剂量时，受试者并无活动性浆细胞白血病(PCL)或无PCL史。在一些实施方式中，若受试者在给予时患有活动性PCL或有PCL史，则可将受试者排除在根据提供的方法的治疗以外。在一些实施方式中，若受试者在给予时发展PCL，诸如继发性PCL，则可将该受试者排除在根据提供的方法的治疗以外。在一些实施方式中，在筛选符合或适合根据提供的方法治疗的受试者时、在治疗方案的各种步骤、在接受淋巴球耗竭疗法时和/或在起始给予基因工程细胞或其组合物时或即将起始给予基因工程细胞或其组合物之前，可执行标准、诊断或适应症的评估。
在一些实施方式中，治疗无法诱导受试者对疗法的免疫反应，和/或无法诱导此类反应达到阻碍有效治疗疾病或病况的程度。在一些方面中，免疫原性和/或移植物抗宿主反应的程度小于使用不同但相当的疗法所观察到的程度。举例而言，在使用表达包括提供的抗GPRC5D抗体的CAR的细胞进行过继细胞疗法情况下，在一些实施方式中，免疫原性的程度相较于包括结合至类似，例如重迭抗原决定簇和/或与该抗体，诸如小鼠或猴或兔或人类化抗体竞争结合至GPRC5D的不同抗体的CAR减小。
在一些实施方式中，这些方法包括过继细胞疗法，其中向受试者给予表达所提供的包含GPRC5D结合分子的重组受体(例如包含抗GPRC5D抗体或其抗原结合片段的CAR)的经基因工程改造的细胞。此类投药可促进细胞以靶向GPRC5D的方式活化(例如T细胞活化)，由此使疾病或病症的细胞成为破坏的靶标。
在一些实施方式中，这些方法包括过继细胞疗法，其中向受试者给予表达所提供的包含GPRC5D结合分子的重组受体(例如包含抗GPRC5D抗体或其抗原结合片段的CAR)的经基因工程改造的细胞和表达所提供的包含BCMA结合分子的重组受体(例如包含抗BCMA抗体或其抗原结合片段的CAR)的经基因工程改造的细胞。在一些实施方式中，这些方法包括过继细胞疗法，其中向受试者给予表达所提供的包含GPRC5D结合分子和BCMA结合分子的重组受体(例如包含抗GPRC5D和抗BCMA抗体或其抗原结合片段的CAR)的经基因工程改造的细胞。
因此，所提供的方法和用途包括用于过继细胞疗法的方法和用途。在一些实施方式中，这些方法包括向受试者、组织或细胞，诸如患有疾病、病况或病症、有患疾病、病况或病症的风险或疑似患有疾病、病况或病症者给予细胞或含有细胞的组合物。在一些实施方式中，向患有待治疗的特定疾病或病况的受试者给予细胞、群体和组合物，例如经由过继细胞疗法，诸如过继T细胞疗法给予。在一些实施方式中，将细胞或组合物给予受试者，诸如患有疾病或病况或有患疾病或病况的风险的受试者。在一些方面中，这些方法藉此治疗，例如改善疾病或病况的一种或多种症状，诸如通过减轻表达GPRC5D的癌症中的肿瘤负荷进行治疗。
给予细胞以进行过继细胞疗法的方法是已知的且可与所提供的方法和组合物结合使用。举例而言，过继T细胞疗法方法描述于例如Gruenberg等人的美国专利申请公开第2003/0170238号；Rosenberg的美国专利第4,690,915号；Rosenberg(2011)Nat Rev ClinOncol.8(10):577-85)。参见例如Themeli等人(2013)Nat Biotechnol.31(10):928-933；Tsukahara等人(2013)Biochem Biophys Res Commun 438(1):84-9；Davila等人(2013)PLoS ONE 8(4):e61338。
在一些实施方式中，细胞疗法，例如过继细胞疗法，例如过继T细胞疗法，通过自体转移进行，其中细胞自将接受细胞疗法的受试者或自来源于此受试者的样品分离和/或以其他方式制备。因此，在一些方面中，细胞来源于需要治疗的受试者，例如患者且细胞在分离和处理之后给予同一受试者。
在一些实施方式中，细胞疗法，例如过继细胞疗法，例如过继T细胞疗法，通过同种异体转移进行，其中细胞自除将接受或最终接受该细胞疗法的受试者(例如第一受试者)以外的受试者分离和/或以其他方式制备。在此类实施方式中，接着将这些细胞给予相同物种的不同受试者，例如第二受试者。在一些实施方式中，第一和第二受试者在基因上相同。在一些实施方式中，第一和第二受试者在基因上类似。在一些实施方式中，第二受试者表达的HLA种类或超类型与第一受试者相同。
在一些实施方式中，给予细胞、细胞群或组合物的受试者是灵长类动物，诸如人类。在一些实施方式中，给予细胞、细胞群或组合物的受试者是非人类灵长类动物。在一些实施方式中，非人类灵长类动物是猴(例如食蟹猕猴)或猿。受试者可为雄性或雌性且可为任何适龄(包括婴儿、幼年、青年、成年和老年)受试者。在一些实施方式中，受试者是非灵长类哺乳动物，诸如啮齿动物(例如小鼠、大鼠等)。在一些实例中，患者或受试者是经验证用于疾病、过继细胞疗法和/或用于评估毒性结果，诸如细胞因子释放症候群(CRS)的动物模型。
GPRC5D结合重组受体(例如CAR)和表达其的细胞可通过任何适合方式给予，例如通过注射，例如静脉内或皮下注射、眼内注射、眼周注射、视网膜下注射、玻璃体内注射、经中隔注射、巩膜下注射、脉络膜内注射、前房内注射、结膜下注射(subconjunctivalinjection)、结膜下注射(subconjuntival injection)、眼球筋膜囊下注射(sub-Tenon'sinjection)、眼球后注射、眼球周注射，或后近巩膜递送。GPRC5D结合重组受体、BCMA结合重组受体和GPRC5D和BCMA结合重组受体(例如CAR)和表达其的细胞可通过任何适合方式给予，例如通过注射，例如静脉内或皮下注射、眼内注射、眼周注射、视网膜下注射、玻璃体内注射、经中隔注射、巩膜下注射、脉络膜内注射、前房内注射、结膜下注射、结膜下注射、眼球筋膜囊下注射、眼球后注射、眼球周注射，或后近巩膜递送。在一些实施方式中，其通过非经肠、肺内和鼻内途径给予，且在需要局部治疗时，经病灶内给予。非经肠输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内、颅内、胸内或皮下给予。给药和投药可部分地取决于投药是短暂的或长期的。各种给药时程包括(但不限于)单次投药或在各种时间点多次投药、快速注射投药和脉冲输注。
对于疾病的预防或治疗，结合分子、重组受体或细胞的适当剂量可取决于待治疗疾病的类型、结合分子或重组受体的类型、疾病的严重程度和病程、结合分子或重组受体出于预防抑或治疗目的给予、先前疗法、患者的临床病史和对重组受体或细胞的反应，以及主治医师的判断。在一些实施方式中，组合物和分子和细胞适合一次性或经一系列治疗给予患者。
在一些实施方式中，投药的剂量和/或频率基于功效和/或反应来决定。在一些实施方式中，功效通过评价疾病状态来确定。用于评估疾病状态的示例性方法包括：通过电泳和免疫固定来测量生物流体，诸如血液和/或尿液中的M蛋白质；对血液中的sFLC(κ和λ)进行定量；骨骼调查；和在患有髓外疾病的受试者中通过正电子发射断层摄影术(PET)/计算机断层摄影术(CT)进行成像。在一些实施方式中，疾病状态可通过骨髓检查来评价。
在一些实例中，投药的剂量和/或频率通过重组受体或细胞在血液和/或骨髓中的扩增和存留性来决定。在一些实施方式中，投药的剂量和/或频率基于重组受体或基因工程细胞的抗肿瘤活性来决定。在一些实施方式中，抗肿瘤活性通过总反应率(ORR)和/或国际骨髓瘤工作小组(International Myeloma Working Group，IMWG)统一反应标准来确定(参见Kumar等人(2016)Lancet Oncol 17(8):e328-346)。在一些实施方式中，反应使用微小残留病(MRD)评估来进行评价。在一些实施方式中，MRD可通过诸如流动式细胞测量术和高通量测序，例如深度测序的类方法评估。在一些实施方式中，反应基于给予重组受体或细胞之后的反应持续时间来评价。在一些实例中，投药的剂量和/或频率可基于毒性。在一些实施方式中，剂量和/或频率可基于给予重组受体和/或细胞的受试者的健康相关生活质量(HRQoL)来决定。在一些实施方式中，投药的剂量和/或频率可基于以上标准中的任一个而变化，即增加或减少。
在一些实施方式中，待治疗的疾病或病症是多发性骨髓瘤。在一些实施方式中，针对多发性骨髓瘤的可测量的疾病标准可包括(1)血清M蛋白质1g/dL或更高；(2)尿液M蛋白质200mg或更高/24小时；(3)累和的血清游离轻链(sFLC)水平10mg/dL或更高，和异常κ与λ比率。在一些情况下，轻链疾病仅对于血清或尿液中无可测量疾病的受试者是可接受的。
在一些实施方式中，可使用东部肿瘤协作组(Eastern Cooperative OncologyGroup，ECOG)体能状态指标评估或选择进行治疗的受试者，例如自先前疗法具有较差体能的受试者(参见例如Oken等人(1982)Am J Clin Oncol.5:649-655)。关于体能状态的ECOG量表就患者自理能力、日常活动和体质能力(例如步行、工作等)描述患者的机能水平。在一些实施方式中，ECOG体能状态为0指示，受试者可执行正常活动。在一些方面中，ECOG体能状态为1的受试者在身体活动方面展现某种限制，但受试者完全可走动。在一些方面中，ECOG体能状态为2的患者是超过50％可走动的。在一些情况下，ECOG体能状态为2的受试者也能够自理；参见例如
等人(1993)Br J Cancer 67(4)773-775。在一些实施方式中，根据本申请所提供的方法或治疗方案投药的受试者包括ECOG体能状态为0或1的受试者。
在一些实施方式中，尽管受试者对另一种疗法变得具有抗性，但该给予仍可治疗受试者。在一些实施方式中，当根据本申请所描述的实施方式向受试者投药时，剂量或组合物能够在至少50％、60％、70％、80％、90％或95％的投药受试者中获得客观反应(OR)。在一些实施方式中，OR包括受试者实现严格完全反应(sCR)、完全反应(CR)、极佳部分反应(VGPR)、部分反应(PR)和最小反应(MR)。在一些实施方式中，当该本申请所描述的实施方式向受试者投药时，剂量或组合物能够在至少50％、60％、70％、80％或85％的投药受试者中实现严格完全反应(sCR)、完全反应(CR)、极佳部分反应(VGPR)或部分反应(PR)。在一些实施方式中，当该本申请所描述的实施方式向受试者投药时，剂量或组合物能够在至少20％、30％、40％、50％、60％或70％的投药受试者中实现严格完全反应(sCR)或完全反应(CR)。在一些实施方式中，示例性剂量包括约5.0×107个、1.5×108个、3.0×108个或4.5×108个表达CAR的T细胞。在一些实施方式中，示例性剂量包括约1.0×107个、1.25×107个、1.5×107个、2.0×107个、2.0×107个、2.5×107个、3.0×107个、3.5×107个、4.0×107个、4.5×107个、5.0×107个、1.5×108个、3.0×108个、4.5×108或6.0×108个表达CAR的T细胞。在一些方面中，对例如根据本申请所提供的方法的治疗的具体反应可基于国际骨髓瘤工作组(IMWG)统一反应标准评估(参见Kumar等人(2016)Lancet Oncol 17(8):e328-346)。在一些实施方式中，实现特定结果，诸如OR的示例性剂量包括约5.0×107个表达CAR的T细胞。
在一些实施方式中，可监测治疗的毒性和/或副作用，并使用其来调整给予重组受体(例如CAR)、细胞和或组合物的剂量和/或频率。举例而言，可监测不良事件和实验室异常，并使用其来调整投药的剂量和/或频率。不良事件包括输注反应、细胞因子释放症候群(CRS)、神经毒性、巨噬细胞活化症候群和肿瘤溶解症候群(TLS)。此类事件中的任一件均可确立剂量限制性毒性且证明需降低剂量和/或终止治疗。可用作确立投药的剂量和/或频率的指南的其他副作用或不良事件包括非血液学不良事件，其包括(但不限于)疲乏、发热或发热性嗜中性球减少症、转胺酶增加一定持续时间(例如小于或等于2周或小于或等于7天)、头痛、骨痛、低血压、低氧、发冷、腹泻、恶心/呕吐、神经毒性(例如混乱、失语、癫痫发作、抽搐、昏睡和/或精神状态改变)、弥散性血管内凝血、其他无症状的非血液学临床实验室异常，诸如电解质异常。可用作确立投药的剂量和/或频率的指南的其他副作用或不良事件包括血液学不良事件，其包括(但不限于)嗜中性球减少症、白血球减少症、血小板减少症、动物和/或B细胞发育不全和低γ球蛋白血症(hypogammaglobinemia)。
在一些实施方式中，相较于例如给予其他疗法，根据提供的方法治疗可引起较低比率和/或较低程度的毒性、有毒的结果或症状、促进毒性的型态、因子或特性，诸如与细胞因子释放症候群(CRS)或神经毒性，诸如重度CRS或重度神经毒性相关或指示CRS或神经毒性的症状或结果。
在某些实施方式中，在含有结合分子或重组受体的经基因工程改造的细胞的情形中，向受试者给予范围为约1×106至约1×1011个细胞和/或以每公斤体重计的细胞量，诸如约1×106至约5×1010个细胞(例如约5×106个细胞、约1×107个细胞、约1.25×107个细胞、约1.5×107个细胞、约2.0×107个细胞、约2.5×107个细胞、约5×108个细胞、约1×109个细胞、约5×109个细胞、约2×1010个细胞、约3×1010个细胞、约4×1010个细胞或由任何两个前述值界定的范围)，诸如约1×107个细胞至约1×1011个细胞(例如约1×107个细胞、约1.25×107个细胞、约1.5×107个细胞、约2.0×107个细胞、约2.5×107个细胞、约3×107个细胞、约4×107个细胞、约5×107个细胞、约6×107个细胞、约7×107个细胞、约8×107个细胞、约9×107个细胞、约1×1010个细胞、约2.5×1010个细胞、约5×1010个细胞、约7.5×1010个细胞、约9×1010个细胞或由任何两个前述值界定的范围)且在一些情况下约1×108个细胞至约5×1010个细胞(例如1.2×108个细胞、约1.5×108个细胞、约2.5×108个细胞、约3×108个细胞、约3.5×108个细胞、约4.5×108个细胞、约5×108个细胞、约6×108个细胞、约6.5×108个细胞、约8×108个细胞、约9×108个细胞、约1×109个细胞、约1.2×109个细胞、约3×109个细胞、约3×1010个细胞、约4.5×1010个细胞或约5×1010个细胞)或这些范围之间和/或以每公斤体重计的任何值。此外，剂量可取决于疾病或病症和/或患者和/或其他治疗特有的性质而变化。
在一些实施方式中，这些方法包含给予一定剂量基因工程细胞或包含一定剂量基因工程细胞的组合物。在一些实施方式中，基因工程细胞或含有基因工程细胞的组合物可用于治疗方案中，其中治疗方案治疗方案包含给予一定剂量基因工程细胞或包含一定剂量基因工程细胞的组合物。在一些实施方式中，该剂量可含有例如特定数量或范围的表达重组受体的T细胞、总T细胞或总末梢血液单核细胞(PBMC)，诸如多种本申请所描述的此类细胞。在一些实施方式中，可给予含有一定剂量细胞的组合物。在一些方面中，细胞群或细胞组合物中表达CAR的细胞的数量、量或比例可通过侦测替代物标记物，例如通过流动式细胞测量术或其他方式，或通过侦测能特异性结合至本申请所提供的结合分子或受体的经标记分子，诸如经标记抗原的结合来评估。
在一些实施方式中，例如，在受试者是人类的情况下，剂量包括超过约1×106个表达重组受体(例如CAR)的总细胞、T细胞或末梢血液单核细胞(PBMC)且低于约2×109个表达重组受体(例如CAR)的总细胞、T细胞或末梢血液单核细胞(PBMC)，例如在约2.5×107至约1.2×109个此类细胞，诸如2.5×107个、5×107个、1.5×108个、3×108个、4.5×108个、8×108个或1.2×109个总此类细胞范围内或在任何两个前述值之间的范围。在一些实施方式中，例如，在受试者是人类的情况下，剂量包括超过约1×106个表达重组受体(例如CAR)的总细胞、T细胞或末梢血液单核细胞(PBMC)且低于约2×109个表达重组受体(例如CAR)的总细胞、T细胞或末梢血液单核细胞(PBMC)，例如在约1.0×107至约1.2×109个此类细胞，诸如1.0×107个、1.25×107个、1.5×107个、2.0×107个、2.5×107个、5×107个、1.5×108个、3×108个、4.5×108、8×108或1.2×109个总此类细胞范围内或在任何两个前述值之间的范围。在一些实施方式中，例如，在受试者是人类的情况下，剂量包括超过约1×106个表达重组受体(例如CAR)的总细胞、T细胞或末梢血液单核细胞(PBMC)且低于约2×109个表达重组受体(例如CAR)的总细胞、T细胞或末梢血液单核细胞(PBMC)，例如在约1.0×107至约6.5×108个此类细胞、约1.5×107至约6.0×108个此类细胞、约1.5×107个至约6.5×108个此类细胞、约2.5×107至约6.0×108个此类细胞、或约5.0×107至约6.0×108个此类细胞。
在一些实施方式中，经基因工程改造的细胞的剂量包含在或在约2.5×107个表达CAR的T细胞、总T细胞或总末梢血液单核细胞(PBMC)与或与约1.2×109个表达CAR的T细胞、总T细胞或总PBMC之间、在或在约5.0×107个表达CAR的T细胞与或与约4.5×108个表达CAR的T细胞、总T细胞或总末梢血液单核细胞(PBMC)之间、在或在约1.5×108个表达CAR的T细胞与或与约3.0×108个表达CAR的T细胞、总T细胞或总PBMC之间，各自包括端点。在一些实施方式中，数量是针对CD3+或CD8+的总数目，在一些情况下也针对表达CAR的(例如CAR+)细胞的总数目。在一些实施方式中，剂量包含自或自约2.5×107至或至约1.2×109个CD3+或CD8+总T细胞或表达CD3+或CD8+ CAR的细胞、自或自约5.0×107至或至约4.5×108个CD3+或CD8+总T细胞或表达CD3+或CD8+ CAR的细胞、或自或自约1.5×108至或至约3.0×108个CD3+或CD8+总T细胞或表达CD3+或CD8+ CAR的细胞的多种细胞，各自包括端点。
在一些实施方式中，经基因工程改造的细胞的剂量包含在或在约1.0×107个表达CAR的T细胞、总T细胞或总末梢血液单核细胞(PBMC)与或与约1.2×109个表达CAR的T细胞、总T细胞或总PBMC之间、在或在约2.0×107个表达CAR的T细胞与或与约4.5×108个表达CAR的T细胞、总T细胞或总末梢血液单核细胞(PBMC)之间、在或在约1.5×108个表达CAR的T细胞与或与约3.0×108个表达CAR的T细胞、总T细胞或总PBMC之间，各自包括端点。在一些实施方式中，数量是针对CD3+或CD8+的总数目，在一些情况下也针对表达CAR的(例如CAR+)细胞的总数目。在一些实施方式中，该剂量包含自或自约1.0×107至或至约1.2×109个CD3+或CD8+总T细胞或表达CD3+或CD8+ CAR的细胞、自或自约1.5×107至或至约1.2×109个CD3+或CD8+总T细胞或表达CD3+或CD8+ CAR的细胞、自或自约2.5×107至或至约1.2×109个CD3+或CD8+总T细胞或表达CD3+或CD8+ CAR的细胞、自或自约1.5×107至或至约8.0×108个CD3+或CD8+总T细胞或表达CD3+或CD8+ CAR的细胞、自或自约2.5×107至或至约8.0×108个CD3+或CD8+总T细胞或表达CD3+或CD8+ CAR的细胞、自或自约1.5×107至或至约6.0×108个CD3+或CD8+总T细胞或表达CD3+或CD8+ CAR的细胞、自或自约2.5×107至或至约6.0×108个CD3+或CD8+总T细胞或表达CD3+或CD8+ CAR的细胞、自或自约5.0×107至或至约6.0×108个CD3+或CD8+总T细胞或表达CD3+或CD8+ CAR的细胞、自或自约5.0×107至或至约4.5×108个CD3+或CD8+总T细胞或表达CD3+或CD8+ CAR的细胞、或自或自约1.5×108至或至约3.0×108个CD3+或CD8+总T细胞或表达CD3+或CD8+ CAR的细胞的多种细胞，各自包括端点。
在一些实施方式中，该剂量的T细胞包括CD4+ T细胞、CD8+ T细胞或CD4+和CD8+ T细胞。
在一些实施方式中，例如，在受试者是人类的情况下，CD8+ T细胞的剂量，包括含CD4+和CD8+ T细胞的剂量包括在或在约1×106与或与约2×109个表达重组受体(例如CAR)的总CD8+细胞之间，例如在或在约5×107至或至约4.5×108个此类细胞范围内，诸如为或为约2.5×107个、为或为约5×107个、为或为约1.5×108个、为或为约3×108个、为或为约4.5×108个、为或为约8×108个、或为或为约1.2×109个总此类细胞，或在任何两个前述值之间的范围。
在一些实施方式中，例如，在受试者是人类的情况下，CD8+ T细胞的剂量，包括含CD4+和CD8+ T细胞的剂量包括在或在约1×106与或与约2×109个表达重组受体(例如CAR)的总CD8+细胞之间，例如在或在约1×107至或至约4.5×108个此类细胞范围内，诸如为或为约1.0×107个、为或为约1.25×107个、为或为约1.5×107个、为或为约2.0×107个、为或为约2.5×107个、为或为约5×107个、为或为约1.5×108个、为或为约3×108个、为或为约4.5×108个、为或为约8×108个、或为或为约1.2×109个总此类细胞，或在任何两个前述值之间的范围。
在一些实施方式中，该剂量的细胞，例如表达重组受体的T细胞以单次剂量给予受试者或在两周、一个月、三个月、六个月、1年或更长时间段内仅给予一次。在一些实施方式中，向患者给予多次剂量，且这些剂量或总剂量各自可在任何前述值的范围内。
在一些实施方式中，供给予的基因工程细胞或供给予的基因工程细胞的组合物展现指示或符合细胞健康状况的特性。在一些实施方式中，该剂量中为或为约或至少或至少约70％、75％、80％、85％或90％的CAR+细胞展现指示细胞健康或生物活性CAR细胞的一种或多种特性或表型，诸如不存在凋亡标记物的表达。
在特定实施方式中，该表型是或包括不存在细胞凋亡和/或关于细胞正在经历凋亡过程的指示。细胞凋亡是计划性细胞死亡的过程，其包括导致特有特性变化和死亡的一系列刻板化形态和生物化学事件，包括出泡、细胞皱缩、核断裂、染色质凝集、染色体DNA断裂和总体mRNA衰减。在一些方面中，早期细胞凋亡可由某些半胱天冬酶，例如半胱天冬酶2、8、9和10活化指示。在一些方面中，中期至晚期细胞凋亡以膜完整性的进一步丧失、染色质凝集和DNA断裂，包括诸如半胱天冬酶3、6和7活化的类生物化学事件为特征。
在特定实施方式中，表型是与计划性细胞死亡相关的一个或多个因子，例如已知会引发细胞凋亡的促凋亡因子，例如死亡受体路径的成员、粒线体(固有)路径的活化成员，诸如Bcl-2家族成员，例如Bax、Bad和Bid，以及半胱天冬酶的阴性表达。在某些实施方式中，表型是当与细胞组合物一起培育或接触时不存在优先结合至正在经历细胞凋亡的细胞的指标，例如磷脂结合蛋白V分子或TUNEL染色。在一些实施方式中，表型是或包括指示细胞的凋亡状态的一或多种标记物的表达。在一些实施方式中，表型是半胱天冬酶，诸如半胱天冬酶3的表达缺乏和/或活化。在一些方面中，半胱天冬酶3的活化指示细胞凋亡的增加或再发生。在某些实施方式中，半胱天冬酶活化可通过已知方法侦测。在一些实施方式中，可使用特异性结合至活化的半胱天冬酶(即，特异性结合至裂解的多肽)的抗体用于半胱天冬酶活化。在特定实施方式中，表型是或包括半胱天冬酶3-。在一些实施方式中，细胞凋亡的标记物是侦测细胞中与细胞凋亡相关的特征的试剂。在某些实施方式中，该试剂是磷脂结合蛋白V分子。
在一些实施方式中，供给予的含有基因工程细胞的组合物含有一定数量或量的展现指示或符合细胞健康状况的表型的细胞。在任何实方式中的一些中，该剂量的经基因工程改造的T细胞中小于约25％、20、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的表达CAR的T细胞表达细胞凋亡的标记物，任选表达磷脂结合蛋白V或活性半胱天冬酶3。在任何实方式中的一些中，该剂量的经基因工程改造的T细胞中小于5％、4％、3％、2％或1％的表达CAR的T细胞表达磷脂结合蛋白V或活性半胱天冬酶3。
在一些实施方式中，所给予的细胞是经基因工程改造以表达GPRC5D结合重组受体(例如CAR)的免疫细胞。在一些实施方式中，免疫细胞是T细胞。在一些实施方式中，所给予的细胞是CD4+ T细胞。在一些实施方式中，所给予的细胞是CD8+ T细胞。在一些实施方式中，所给予的细胞是CD4+和CD8+ T细胞的组合，诸如CAR T细胞。在一些实例中，CD4+细胞与CD8+细胞的比率(CD4:CD8)是1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1。
在一些实施方式中，细胞、结合分子或重组受体作为组合治疗的一部分给予，诸如与另一治疗性干预，诸如另一抗体或基因工程细胞或受体或药剂，诸如细胞毒性剂或治疗剂同时或按任何次序依序给予。
在一些实施方式中，细胞、结合分子和/或重组受体与一或多种额外治疗剂共给予或与另一种治疗性干预结合，同时或按任何次序依序共给予。在一些情形中，细胞与另一种疗法在足够接近的时间共给予，由此使细胞群增强一或多种额外治疗剂的作用，或反之亦然。在一些实施方式中，细胞、结合分子和/或重组受体在该一或多种额外治疗剂之前给予。在一些实施方式中，细胞、结合分子和/或重组受体在该一或多种额外治疗剂之后给予。
在一些实施方式中，受试者可在白血球清除术之后且在淋巴球耗竭化学疗法之前接受桥接疗法(bridging therapy)。治疗医师可在制造所提供的组合物或细胞期间确定例如疾病控制是否需要桥接疗法。在一些实施方式中，桥接疗法不包括生物试剂，诸如抗体(例如达雷木单抗)。在一些实施方式中，桥接疗法在淋巴球耗竭起始之前停止。在一些实施方式中，桥接疗法在淋巴球耗竭之前1天、2天、3天、4天、5天、7天、10天、14天、21天、28天、45天或60天停止。
在一些方面中，一旦向哺乳动物(例如人类)给予细胞，即通过多种已知方法中的任一种来测量基因工程细胞群和/或抗体的生物活性。评估的参数包括经基因工程改造或天然的T细胞或其他免疫细胞与抗原例如在活体内的特异性结合，例如通过成像测定；或离体的特异性结合，例如通过ELISA或流动式细胞测量术测定。在某些实施方式中，基因工程细胞破坏靶细胞的能力可使用此项技术中已知的任何适合方法测量，诸如以下中所描述的细胞毒性分析：例如Kochenderfer等人,J.Immunotherapy,32(7):689-702(2009)；和Herman等人,J.Immunological Methods,285(1):25-40(2004)。在某些实施方式中，细胞的生物活性也可通过分析某些细胞因子(诸如CD 107a、IFNγ、IL-2和TNF)的表达和/或分泌来加以测量。在一些方面中，通过评估临床结果，诸如肿瘤负荷或负载的减小来测量生物活性。
在某些实施方式中，基因工程细胞以多种方式修饰，由此增加其治疗或预防功效。举例而言，在一些实施方式中，由群体表达的经基因工程改造的CAR或TCR直接地或经由连接物间接地与靶向部分缀合。使化合物，例如CAR或TCR与靶向部分缀合的实践是此项技术中已知的。参见例如Wadwa等人,J.Drug Targeting,3(2):111(1995)；和美国专利5,087,616。
B.组合疗法
也提供组合疗法的方法，其包括给予抗GPRC5D结合重组受体(例如CAR)、表达这些重组受体(例如CAR)的基因工程细胞、表达这些受体的复数个基因工程细胞和/或包含其的组合物和其用途，诸如治疗和预防用途。也提供组合疗法的方法，其包括给予抗GPRC5D结合和BCMA结合重组受体(例如CAR)、表达这些重组受体(例如CAR)的基因工程细胞、表达这些受体的复数个基因工程细胞和/或包含其的组合物和其用途，诸如治疗和预防用途。
在一些实施方式中，本申请所描述的GPRC5D结合重组受体(例如CAR)和/或表达这些分子(例如重组受体)的基因工程细胞作为组合治疗或组合疗法的一部分给予，诸如与一或多种额外治疗性干预同时给予、按任何次序依序或间歇地给予。在一些实施方式中，该一或多种额外治疗性干预包括例如抗体、基因工程细胞、受体和/或药剂，诸如表达重组受体的细胞，和/或细胞毒性剂或治疗剂，例如化学治疗剂。在一些实施方式中，组合疗法包括给予一或多种额外药剂、疗法和/或治疗，例如本申请所描述的额外药剂、疗法和/或治疗中的任一种。在一些实施方式中，组合疗法包括给予一或多种用于治疗或疗法的额外药剂，诸如免疫调节剂、免疫检查点抑制剂、腺苷路径或腺苷受体拮抗剂或激动剂、和激酶抑制剂。在一些实施方式中，组合治疗或组合疗法包括额外治疗，诸如手术治疗、移植和/或放射线疗法。也提供组合治疗或组合疗法的方法，其包括本申请所描述的GPRC5D结合重组受体(例如CAR)、细胞和/或组合物和一或多种额外治疗性干预。
在一些实施方式中，本申请所描述的GPRC5D结合重组受体、BCMA结合重组受体、GPRC5D和BCMA结合重组受体(例如CAR)和/或表达这些分子(例如重组受体)的基因工程细胞作为组合治疗或组合疗法的一部分给予，诸如与一或多种额外治疗性干预同时给予、按任何次序依序或间歇地给予。在一些实施方式中，该一或多种额外治疗性干预包括例如抗体、基因工程细胞、受体和/或药剂，诸如表达重组受体的细胞，和/或细胞毒性剂或治疗剂，例如化学治疗剂。在一些实施方式中，组合疗法包括给予一或多种额外药剂、疗法和/或治疗，例如本申请所描述的额外药剂、疗法和/或治疗中的任一种。在一些实施方式中，组合疗法包括给予一或多种用于治疗或疗法的额外药剂，诸如免疫调节剂、免疫检查点抑制剂、腺苷路径或腺苷受体拮抗剂或激动剂、和激酶抑制剂。在一些实施方式中，组合治疗或组合疗法包括额外治疗，诸如手术治疗、移植和/或放射线疗法。也提供组合治疗或组合疗法的方法，其包括本申请所描述的GPRC5D结合重组受体、BCMA结合重组受体、GPRC5D和BCMA结合重组受体(例如CAR)、细胞和/或组合物以及一或多种额外治疗性干预。
在一些实施方式中，用于组合治疗或组合疗法的额外药剂增强、加强和/或促进结合分子、重组受体、细胞和/或组合物的治疗作用的功效和/或安全性。在一些实施方式中，该额外药剂增强或改善所给予的细胞，例如表达结合分子或重组受体的细胞的功效、存活或存留性。在一些实施方式中，该额外药剂选自蛋白质磷酸酶抑制剂、激酶抑制剂、细胞因子、免疫调节剂或降低调节T(Treg)细胞的水平或活性的药剂。在一些实施方式中，该额外药剂通过减轻或改善所给予的结合分子、重组受体、细胞和/或组合物的不良作用来增强其安全性。在一些实施方式中，该额外药剂可治疗相同疾病、病况或共病。在一些实施方式中，该额外药剂可改善、减轻或消除与给予重组受体、细胞和/或组合物，例如表达CAR的细胞相关的一或多种毒性、不良作用或副作用。
在一些实施方式中，可在给予本申请所提供的重组受体、细胞或组合物之前、期间或之后给予疼痛管理药物治疗(诸如乙酰胺苯酚)或抗组胺剂(诸如苯海拉明(diphenhydramine))，以改善或减轻或消除与治疗相关的轻微副作用。在一些实例中，可给予红血球和血小板输注和/或群落刺激因子，以减轻或消除与给予重组受体、细胞和/或组合物，例如表达CAR的细胞相关的一或多种毒性、不良作用或副作用。在一些实施方式中，可给予预防性或经验性抗感染剂(例如用于肺囊虫肺炎[PCP]预防的甲氧苄啶(trimethoprim)/磺胺甲基异恶唑(sulfamethoxazole)、广谱抗生素、抗真菌剂或用于发热性嗜中性球减少症的抗病毒剂)以治疗由治疗引起的副作用。在一些实例中，必要时，可提供预防疗法以治疗由治疗引起的淋巴球减少症和/或嗜中性球减少症。
在一些实施方式中，额外疗法、治疗或药剂包括化学疗法、放射线疗法、手术、移植、过继细胞疗法、抗体、细胞毒性剂、化学治疗剂、细胞因子、生长抑制剂、抗激素剂、激酶抑制剂、抗血管生成剂、心脏保护剂、免疫刺激剂、免疫抑制剂、免疫检查点抑制剂、抗生素、血管生成抑制剂、代谢调节剂或其他治疗剂，或其任何组合。在一些实施方式中，该额外药剂是蛋白质、肽、核酸、小分子药剂、细胞、毒素、脂质、碳水化合物或其组合，或任何其他类型的治疗剂，例如放射线。在一些实施方式中，该额外疗法、药剂或治疗包括手术、化学疗法、放射线疗法、移植、给予表达重组受体(例如CAR)的细胞、激酶抑制剂、免疫检查点抑制剂、mTOR路径抑制剂、免疫抑制剂、免疫调节剂、抗体、免疫消融剂、抗体和/或其抗原结合片段、抗体缀合物、其他抗体疗法、细胞毒素、类固醇、细胞因子、肽疫苗、激素疗法、抗代谢物、代谢调节剂、抑制钙依赖性磷酸酶钙调神经磷酸酶或p70S6激酶FK506或抑制p70S6激酶的药物、烷基化剂、蒽环霉素(anthracycline)、长春花生物碱(vinca alkaloid)、蛋白酶体抑制剂、GITR激动剂、蛋白质酪氨酸磷酸酶抑制剂、蛋白激酶抑制剂、溶瘤病毒和/或其他类型的免疫疗法。在一些实施方式中，该额外药剂或治疗是骨髓移植、使用化学治疗剂(诸如氟达拉滨(fludarabine))的T细胞消融疗法、外部射束放射线疗法(XRT)、环磷酰胺和/或抗体疗法。
在一些实施方式中，将细胞、GPRC5D结合重组受体和/或组合物(例如表达CAR的细胞)与其他基因工程细胞(例如其他表达CAR的细胞)组合给予。在一些实施方式中，细胞、GPRC5D结合重组受体和/或组合物(例如表达CAR的细胞)与额外药剂组合给予。在一些实施方式中，将细胞、GPRC5D结合重组受体和/或组合物(例如表达CAR的细胞)与其他基因工程细胞(例如其他表达CAR的细胞)以及额外药剂一起组合给予。在一些实施方式中，该额外药剂是激酶抑制剂，布鲁顿氏酪氨酸激酶(Bruton's tyrosine kinase，BtK)抑制剂，例如依鲁替尼(ibrutinib)。在一些实施方式中，该额外药剂是腺苷路径或腺苷受体拮抗剂或激动剂。在一些实施方式中，该额外药剂是免疫调节剂，诸如沙立度胺(thalidomide)或沙立度胺衍生物(例如来那度胺(lenalidomide))。在一些实施方式中，该额外药剂是γ分泌酶抑制剂，诸如抑制或减少细胞(诸如肿瘤/癌细胞)上的γ分泌酶靶标，例如GPRC5D的膜内裂解的γ分泌酶抑制剂。在一些实施方式中，该额外疗法、药剂或治疗是细胞毒性剂或化学治疗剂、生物疗法(例如抗体，例如单克隆抗体；或细胞疗法)或抑制剂(例如激酶抑制剂)。
在一些实施方式中，将细胞、GPRC5D结合重组受体、BCMA结合重组受体、GPRC5D和BCMA结合重组受体和/或组合物(例如表达CAR的细胞)与其他基因工程细胞(例如其他表达CAR的细胞)组合给予。在一些实施方式中，将细胞、GPRC5D结合重组受体、BCMA结合重组受体、GPRC5D和BCMA结合重组受体和/或组合物(例如表达CAR的细胞)与额外药剂组合给予。在一些实施方式中，将细胞、GPRC5D结合重组受体、BCMA结合重组受体、GPRC5D和BCMA结合重组受体和/或组合物(例如表达CAR的细胞)与其他基因工程细胞(例如其他表达CAR的细胞)以及额外药剂一起组合给予。在一些实施方式中，该额外药剂是激酶抑制剂，布鲁顿氏酪氨酸激酶(BtK)抑制剂，例如依鲁替尼。在一些实施方式中，该额外药剂是腺苷路径或腺苷受体拮抗剂或激动剂。在一些实施方式中，该额外药剂是免疫调节剂，诸如沙立度胺或沙立度胺衍生物(例如来那度胺)。在一些实施方式中，该额外药剂是γ分泌酶抑制剂，诸如抑制或减少细胞(诸如肿瘤/癌细胞)上的γ分泌酶靶标，例如GPRC5D和/或BCMA的膜内裂解的γ分泌酶抑制剂。在一些实施方式中，该额外疗法、药剂或治疗是细胞毒性剂或化学治疗剂、生物疗法(例如抗体，例如单克隆抗体；或细胞疗法)或抑制剂(例如激酶抑制剂)。
在一些实施方式中，该额外药剂是化学治疗剂。示例性化学治疗剂包括蒽环霉素(例如小红莓，诸如脂质粒小红莓)；长春花生物碱(例如长春碱、长春新碱、长春地辛(vindesine)、长春瑞滨(vinorelbine))；烷基化剂(例如环磷酰胺、达喀尔巴嗪(decarbazine)、美法仑(melphalan)、异环磷酰胺、替莫唑胺(temozolomide))；免疫细胞抗体(例如阿仑单抗(alemtuzumab)、吉妥珠单抗(gemtuzumab)、利妥昔单抗、托西莫单抗(tositumomab))；抗代谢物(包括例如叶酸拮抗剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物和腺苷脱胺酶抑制剂，诸如氟达拉滨)；TNFR糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白质(GITR)激动剂；蛋白酶体抑制剂(例如阿克拉霉素A(aclacinomycin A)、胶毒素(gliotoxin)或硼替佐米(bortezomib))；免疫调节药，诸如沙立度胺或沙立度胺衍生物(例如来那度胺)。
在一些实施方式中，该额外疗法或治疗是细胞疗法，例如过继细胞疗法。在一些实施方式中，该额外疗法包括给予基因工程细胞，例如额外的表达CAR的细胞。在一些实施方式中，额外的基因工程细胞表达与本申请所提供的基因工程细胞，例如表达抗GPRC5D CAR的细胞相同或不同的重组受体的表达CAR的细胞。在一些实施方式中，在额外的基因工程细胞上表达的重组受体(例如CAR)识别不同抗原和/或抗原决定簇。在一些实施方式中，在额外的基因工程细胞上表达的重组受体(例如CAR)识别与本申请所描述的重组受体(例如GPRC5D)所识别同一抗原的不同抗原决定簇。在一些实施方式中，在额外的基因工程细胞上表达的重组受体(例如CAR)识别不同抗原，例如不同肿瘤抗原或抗原组合。举例而言，在一些实施方式中，在额外的基因工程细胞上表达的重组受体(例如CAR)靶向表达早期谱系标记物的癌细胞，例如癌症干细胞，而其他表达CAR的细胞靶向表达晚期谱系标记物的癌细胞。在此类实施方式中，额外的基因工程细胞在给予(例如输注)本申请所描述的表达CAR的细胞之前、同时或之后给予。在一些实施方式中，额外的基因工程细胞表达同种异体CAR。
在一些实施方式中，一个或多个CAR分子的组态包含一个初级细胞内信号转导结构域和两个或两个以上(例如2、3、4或5个或更多个)共刺激信号转导结构域。在一些实施方式中，一个或多个CAR分子可具有相同或不同的初级细胞内信号转导结构域、相同或不同的共刺激信号转导结构域、或相同数量或不同数量的共刺激信号转导结构域。在一些实施方式中，一个或多个CAR分子可经组态成分离(split)的CAR，其中一个CAR分子包含抗原结合结构域和共刺激结构域(例如4-1BB)，而另一个CAR分子包含抗原结合结构域和初级细胞内信号转导结构域(例如CD3ζ)。
在一些实施方式中，额外药剂是经基因工程改造以表达一个或多个抗GPRC5D结合分子的细胞和/或经基因工程改造以表达靶向不同抗原的额外结合分子，例如重组受体(例如CAR)的细胞中的任一种。在一些实施方式中，额外药剂包括本申请例如在I.C部分中所描述的细胞或复数个细胞中的任一种。在一些实施方式中，额外药剂是经基因工程改造以表达靶向不同抗原决定簇和/或抗原，例如与疾病或病况相关的不同抗原的重组受体(例如CAR)的细胞。在一些实施方式中，额外药剂是经基因工程改造以表达靶向多发性骨髓瘤中表达的第二或额外抗原(例如CD38、CD138、CS-1、BAFF-R、TACI和/或FcRH5)的重组受体(例如CAR)的细胞。
在一些实施方式中，额外药剂是免疫调节剂。在一些实施方式中，组合疗法包括免疫调节剂，其可诸如通过抑制免疫抑制性信号转导或增强免疫刺激性信号转导刺激、增大和/或以其他方式增强抗肿瘤免疫反应，例如由给予基因工程细胞引起的抗肿瘤免疫反应。在一些实施方式中，免疫调节剂是肽、蛋白质或为小分子。在一些实施方式中，蛋白质可为融合蛋白或重组蛋白。在一些实施方式中，免疫调节剂结合至免疫靶标，诸如在免疫细胞，诸如T细胞、B细胞或抗原呈现细胞上表达的细胞表面受体。举例而言，在一些实施方式中，免疫调节剂是抗体或抗原结合抗体片段、融合蛋白、小分子或多肽。在一些实施方式中，将重组受体、细胞和/或组合物与额外药剂组合给予，该额外药剂是抗体或其抗原结合片段，诸如单克隆抗体。
在一些实施方式中，免疫调节剂阻断、抑制或对抗免疫检查点路径的组分。免疫系统具有多条参与维持自体耐受性和用于调节免疫反应的抑制性路径。肿瘤可使用某些免疫检查点路径作为主要免疫抵抗机制，特别是针对肿瘤抗原特异性T细胞(Pardoll(2012)Nature Reviews Cancer 12:252-264)，例如基因工程细胞，诸如表达CAR的细胞。由于许多此类免疫检查点通过配体-受体相互作用起始，故其可容易地由针对这些配体和/或其受体的抗体阻断。
因此，使用阻断免疫检查点路径的拮抗分子，诸如小分子、核酸抑制剂(例如RNAi)或抗体分子的疗法正成为用于癌症和其他疾病的免疫疗法的有前景的途径。与大部分抗癌剂相对，检查点抑制剂不必直接靶向肿瘤细胞，而是靶向淋巴球受体或其配体以便增强免疫系统的内源性抗肿瘤活性。
如本申请所使用，术语“免疫检查点抑制剂”是指完全或部分地减少、抑制、干扰或调节一或多种检查点蛋白质的分子。检查点蛋白质调控T细胞活化或功能。此等蛋白质负责T细胞反应的共刺激或抑制性相互作用。免疫检查点蛋白质调控并维持自体耐受性以及生理免疫反应的持续时间和幅度。在一些实施方式中，可向受试者给予可增强或加强免疫反应的额外药剂，该免疫反应例如由本申请所提供的GPRC5D结合重组受体、细胞和/或组合物实现的针对疾病或病况，例如癌症(诸如本申请所描述的任何癌症)的免疫反应。
免疫检查点抑制剂包括以统计学显著的方式阻断或抑制免疫系统的抑制路径的任何药剂。此类抑制剂可包括小分子抑制剂或可包括抗体或其抗原结合片段，其结合至并阻断或抑制免疫检查点受体、配体和/或受体-配体相互作用。在一些实施方式中，调节、增强和/或刺激特定受体可克制免疫检查点路径组分。可作为阻断、抑制、调节、增强和/或刺激的靶标的示例性免疫检查点分子包括(但不限于)PD-1(CD279)、PD-L1(CD274、B7-H1)、PDL2(CD273、B7-DC)、CTLA-4、LAG-3(CD223)、TIM-3、4-1BB(CD137)、4-1BBL(CD137L)、GITR(TNFRSF18、AITR)、CD40、OX40(CD134、TNFRSF4)、CXCR2、肿瘤相关抗原(TAA)、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、GAL9、B7H3、B7H4、VISTA、KIR、2B4(属于CD2分子家族且在所有NK、γδ和记忆型CD8+(αβ)T细胞上表达)、CD160(也称为BY55)、CGEN-15049、CEACAM(例如CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、I类MHC、II类MHC、GAL9、腺苷和转型生长因子受体(TGFR；例如TGFRβ)。免疫检查点抑制剂包括抗体或其抗原结合片段、或其他结合蛋白，其结合至并阻断或抑制和/或增强或刺激任何这些分子中的一个或多个的活性。
示例性免疫检查点抑制剂包括曲美单抗(Tremelimumab)(CTLA-4阻断抗体，也称为替西单抗(ticilimumab)、CP-675,206)、抗OX40药、PD-L1单克隆抗体(抗B7-H1药；MEDI4736)、MK-3475(PD-1阻断剂)、纳武单抗(nivolumab)(抗PD-1抗体)、CT-011(抗PD-1抗体)、BY55单克隆抗体、AMP224(抗PD-L1抗体)、BMS-936559(抗PD-L1抗体)、MPLDL3280A(抗PD-L1抗体)、MSB0010718C(抗PD-L1抗体)和伊匹单抗(ipilimumab)(抗CTLA-4抗体，也称为
MDX-010和MDX-101)。示例性免疫调节抗体包括(但不限于)达利珠单抗(Daclizumab)(Zenapax)、贝伐单抗(Bevacizumab)
巴利昔单抗(Basiliximab)、伊匹单抗、纳武单抗、派立珠单抗(pembrolizumab)、MPDL3280A、皮立珠单抗(Pidilizumab)(CT-011)、MK-3475、BMS-936559、MPDL3280A(阿特珠单抗(Atezolizumab))、曲美单抗、IMP321、BMS-986016、LAG525、乌瑞鲁单抗(urelumab)、PF-05082566、TRX518、MK-4166、达西珠单抗(dacetuzumab)(SGN-40)、鲁卡木单抗(lucatumumab)(HCD122)、SEA-CD40、CP-870、CP-893、MEDI6469、MEDI6383、MOXR0916、AMP-224、MSB0010718C(艾维路单抗(Avelumab))、MEDI4736、PDR001、rHIgM12B7、尤洛库单抗(Ulocuplumab)、BKT140、瓦里木单抗(Varlilumab)(CDX-1127)、ARGX-110、MGA271、利瑞路单抗(lirilumab)(BMS-986015、IPH2101)、IPH2201、ARGX-115、埃玛图单抗(Emactuzumab)、CC-90002和MNRP1685A或其抗体结合片段。其他示例性免疫调节剂包括例如阿夫妥珠单抗(afutuzumab)(可购自
)；派非格司亭(pegfilgrastim)
来那度胺(CC-5013，
)；沙立度胺
艾可米得(actimid)(CC4047)；和IRX-2(包括介白素1、介白素2和干扰素γ的人类细胞因子混合物，CAS 951209-71-5，可购自IRXTherapeutics)。
计划性细胞死亡1(PD-1)是在B细胞、NK细胞和T细胞中表达的免疫检查点蛋白质(Shinohara等人,1995,Genomics 23:704-6；Blank等人,2007,Cancer ImmunolImmunother 56:739-45；Finger等人,1997,Gene 197:177-87；Pardoll(2012)NatureReviews Cancer 12:252-264)。PD-1的主要作用是限制周边组织中的T细胞在发炎期间响应于感染的活性以及限制自体免疫。PD-1表达在活化T细胞中得到诱导，且PD-1与其内源性配体中的一种的结合通过抑制刺激性激酶而起到抑制T细胞活化的作用。PD-1也起到抑制TCR“终止信号”的作用。PD-1在Treg细胞上高水平表达，且可在配体存在下增加其增殖(Pardoll(2012)Nature Reviews Cancer 12:252-264)。抗PD 1抗体已用于治疗黑素瘤、非小细胞肺癌、膀胱癌、前列腺癌、结肠直肠癌、头颈癌、三阴性乳癌、白血病、淋巴瘤和肾细胞癌(Topalian等人,2012,N Engl J Med 366:2443-54；Lipson等人,2013,Clin Cancer Res19:462-8；Berger等人,2008,Clin Cancer Res 14:3044-51；Gildener-Leapman等人,2013,Oral Oncol 49:1089-96；Menzies和Long,2013,Ther Adv Med Oncol 5:278-85)。示例性抗PD-1抗体包括纳武单抗(BMS的Opdivo)、派立珠单抗(Merck的Keytruda)、皮立珠单抗(Cure Tech的CT-011)、拉立珠单抗(lambrolizumab)(Merck的MK-3475、和AMP-224(Merck)，纳武单抗(又称为Opdivo、BMS-936558或MDX1106；Bristol-Myers Squibb)特异性阻断PD-1的完全人类IgG4单克隆抗体。纳武单抗(克隆物5C4)和特异性结合至PD-1的其他人类单克隆抗体描述于US 8,008,449和WO2006/121168中。皮立珠单抗(CT-011；CureTech)结合至PD-1的人类化IgG1k单克隆抗体。皮立珠单抗和其他人类化抗PD-1单克隆抗体描述于WO2009/101611中。派立珠单抗(先前称为拉立珠单抗，且也称为Keytruda、MK03475；Merck)结合至PD-1的人类化IgG4单克隆抗体。派立珠单抗和其他人类化抗PD-1抗体描述于US 8,354,509和WO2009/114335中。其他抗PD-1抗体尤其包括AMP 514(Amplimmune)，例如US 8,609,089、US 2010028330、US 20120114649和/或US 20150210769中所描述的抗PD-1抗体。AMP-224(B7-DCIg；Amplimmune；例如描述于WO2010/027827和WO2011/066342中)是阻断PD-1与B7-H1之间相互作用的PD-L2 Fc融合可溶性受体。
PD-L1(也称为CD274和B7-H1)和PD-L2(也称为CD273和B7-DC)是PD-1的配体，其见于活化T细胞、B细胞、骨髓细胞、巨噬细胞和一些类型的肿瘤细胞上。抗肿瘤疗法已集中在抗PD-L1抗体。PD-1和PD-L1的复合物抑制CD8+ T细胞的增殖并减轻免疫反应(Topalian等人,2012,N Engl J Med 366:2443-54；Brahmer等人,2012,N Eng J Med 366:2455-65)。抗PD-L1抗体已用于治疗非小细胞肺癌、黑素瘤、结肠直肠癌、肾细胞癌、胰脏癌、胃癌、卵巢癌、乳癌和血液恶性病(Brahmer等人,2012,N Eng J Med 366:2455-65；Ott等人,2013,Clin Cancer Res 19:5300-9；Radvanyi等人,2013,Clin Cancer Res 19:5541；Menzies和Long,2013,Ther Adv Med Oncol 5:278-85；Berger等人,2008,Clin Cancer Res 14:13044-51)。示例性抗PD-L1抗体包括MDX-1105(Medarex)、MEDI4736(Medimmune)、MPDL3280A(Genentech)、BMS-935559(Bristol-Myers Squibb)和MSB0010718C。MEDI4736(Medimmune)是结合至PD-L1且抑制配体与PD-1的相互作用的人类单克隆抗体。MDPL3280A(Genentech/Roche)是结合至PD-L1的经人类Fc优化的IgG1单克隆抗体。MDPL3280A和针对PD-L1的其他人类单克隆抗体描述于美国专利第7,943,743号和美国公开第20120039906号中。其他抗PD-L1结合剂包括YW243.55.S70(参见WO2010/077634)和MDX-1105(也称为BMS-936559，和例如WO2007/005874中所描述的抗PD-L1结合剂)。
细胞毒性T淋巴球相关抗原(CTLA-4)，也称为CD152，是用以调控T细胞活化的共抑制分子。CTLA-4是仅仅在T细胞上表达的免疫球蛋白超家族成员。CTLA-4起到抑制T细胞活化的作用，且据报导其抑制辅助T细胞活性且增强调节T细胞的免疫抑制活性。尽管CTLA-4的确切作用机制仍在研究中，但已表明其通过在与CD28竞争结合至CD80和CD86中胜出以及向T细胞主动递送抑制剂信号来抑制T细胞活化(Pardoll(2012)Nature Reviews Cancer12:252-264)。抗CTLA-4抗体已在临床试验中用于治疗黑素瘤、前列腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌(Robert和Ghiringhelli,2009,Oncologist 14:848-61；Ott等人,2013,ClinCancer Res 19:5300；Weber,2007,Oncologist 12:864-72；Wada等人,2013,J Transl Med11:89)。抗CTLA-4的显著特征是抗肿瘤作用的动力学，其初始治疗之后生理反应需要延滞长达6个月时间。在一些情况下，在治疗起始之后，肿瘤可在发现减小之前实际上尺寸增加(Pardoll(2012)Nature Reviews Cancer 12:252-264)。示例性抗CTLA-4抗体包括伊匹单抗(Bristol-Myers Squibb)和曲美单抗(Pfizer)。伊匹单抗最近已被FDA批准用于治疗转移性黑素瘤(Wada等人,2013,J Transl Med 11:89)。
淋巴球活化基因-3(LAG-3)，也称为CD223，是另一种免疫检查点蛋白质。LAG-3已与淋巴球活性抑制相关联，且在一些情况下与淋巴球失能的诱导相关联。LAG-3在免疫系统中的各种细胞上表达，包括B细胞、NK细胞和树突状细胞。LAG-3是II类MHC受体的天然配体，其在黑素瘤浸润性T细胞上，包括具有强效免疫抑制活性的T细胞上大量表达。示例性抗LAG-3抗体包括BMS-986016(Bristol-Myers Squib)，其是靶向LAG-3的单克隆抗体。IMP701(Immutep)是拮抗性LAG-3抗体，且IMP731(Immutep和GlaxoSmithKline)是耗竭性LAG-3抗体。其他LAG-3抑制剂包括IMP321(Immutep)，其是LAG3和Ig的可溶性部分的重组融合蛋白，其结合至II类MHC分子且活化抗原呈现细胞(APC)。其他抗体描述于例如WO2010/019570和US 2015/0259420中。
经显示，最初在活化Th1细胞上鉴别的T细胞免疫球蛋白结构域和黏蛋白结构域-3(TIM-3)是免疫反应的负调控子。TIM-3的阻断促进T细胞介导的抗肿瘤免疫且在一系列小鼠肿瘤模型内具有抗肿瘤活性。TIM-3阻断与其他免疫治疗剂(诸如TSR-042、抗CD137抗体和其他)的组合在增加抗肿瘤作用方面可提供累加或协同作用。TIM-3表达已与包括黑素瘤、NSCLC和肾癌在内的多种不同肿瘤类型相关联，且另外，经显示，肿瘤内TIM-3的表达与包括NSCLC、子宫颈癌和胃癌在内的一系列肿瘤类型的不良预后相关。TIM-3的阻断也在促进针对多种慢性病毒性疾病的免疫性增加中受关注。也已显示，TIM-3与包括半乳糖凝集素-9、磷脂酰丝氨酸和HMGB1在内的多种配体相互作用，但目前尚不清楚此等配体中的哪一种(若存在)与抗肿瘤反应的调控相关。在一些实施方式中，靶向TIM-3的抗体、抗体片段、小分子或肽抑制剂可结合至TIM-3的IgV结构域以抑制与其配体的相互作用。抑制TIM-3的示例性抗体和肽描述于US 2015/0218274、WO2013/006490和US 2010/0247521中。其他抗TIM-3抗体包括RMT3-23的人类化形式(Ngiow等人,2011,Cancer Res,71:3540-3551)和克隆物8B.2C12(Monney等人,2002,Nature,415:536-541)。抑制TIM-3和PD-1的双特异性抗体描述于US 2013/0156774中。
在一些实施方式中，额外药剂是CEACAM抑制剂(例如CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5抑制剂)。在一些实施方式中，CEACAM的抑制剂是抗CEACAM抗体分子。示例性抗CEACAM-1抗体描述于WO 2010/125571、WO 2013/082366、WO 2014/059251和WO 2014/022332中，例如单克隆抗体34B1、26H7和5F4；或其重组形式，如例如US 2004/0047858、US7,132,255和WO 99/052552中所描述。在一些实施方式中，抗CEACAM抗体结合至CEACAM-5，如例如Zheng等人PLoS One.(2011)6(6):e21146)中所描述，或与CEACAM-1和CEACAM-5交叉反应，如例如WO 2013/054331和US 2014/0271618中所描述。
4-1BB，也称为CD137，是属于TNFR超家族的跨膜醣蛋白。4-1BB受体存在于活化T细胞和B细胞以及单核球上。示例性抗4-1BB抗体是乌瑞鲁单抗(BMS-663513)，其具有潜在免疫刺激和抗赘生活性。
肿瘤坏死因子受体超家族成员4(TNFRSF4)，也称为OX40和CD134，是TNFR超家族的另一个成员。OX40不会组成性表达于休眠初始T细胞上，且充当二级共刺激免疫检查点分子。示例性抗OX40抗体是MEDI6469和MOXR0916(RG7888，Genentech)。
在一些实施方式中，额外药剂包括减少调节T细胞(Treg)群体的分子。减少Treg细胞的数量(例如耗竭)的方法是此项技术中已知的，且包括例如CD25耗竭、环磷酰胺给予和调节糖皮质激素诱导的TNFR家族相关基因(GITR)功能。GITR是在活化T细胞上上调的TNFR超家族成员，其增强免疫系统。在血球分离术之前或在给予基因工程细胞(例如表达CAR的细胞)之前减少受试者中Treg细胞的数量可减少肿瘤微环境中不想要的免疫细胞(例如Treg)的数量且降低受试者复发的风险。在一些实施方式中，额外药剂包括靶向GITR和/或调节GITR功能的分子，诸如GITR激动剂和/或耗竭调节T细胞(Treg)的GITR抗体。在一些实施方式中，额外药剂包括环磷酰胺。在一些实施方式中，GITR结合分子和/或调节GITR功能的分子(例如GITR激动剂和/或耗竭Treg的GITR抗体)在基因工程细胞(例如表达CAR的细胞)之前给予。举例而言，在一些实施方式中，GITR激动剂可在细胞血球分离术之前进行给予。在一些实施方式中，环磷酰胺在给予(例如输注或再输注)基因工程细胞(例如表达CAR的细胞)之前或在细胞的血球分离术之前给予受试者。在一些实施方式中，环磷酰胺和抗GITR抗体在给予(例如输注或再输注)基因工程细胞(例如表达CAR的细胞)之前或在细胞的血球分离术之前给予受试者。
在一些实施方式中，额外药剂是GITR激动剂。示例性GITR激动剂包括例如GITR融合蛋白和抗GITR抗体(例如二价抗GITR抗体)，诸如美国专利第6,111,090号、欧洲专利第090505B 1号、美国专利第8,586,023号、PCT公开第WO 2010/003118号和第2011/090754号中所描述的GITR融合蛋白；或例如美国专利第7,025,962号、欧洲专利第1947183B 1号、美国专利第7,812,135号、美国专利第8,388,967号、美国专利第8,591,886号、欧洲专利第EP1866339号、PCT公开第WO 2011/028683号、PCT公开第WO 2013/039954号、PCT公开第WO2005/007190号、PCT公开第WO 2007/133822号、PCT公开第WO2005/055808号、PCT公开第WO 99/40196号、PCT公开第WO 2001/03720号、PCT公开第WO99/20758号、PCT公开第WO2006/083289号、PCT公开第WO 2005/115451号、美国专利第7,618,632号和PCT公开第WO 2011/051726号中所描述的抗GITR抗体。示例性抗GITR抗体是TRX518。
在一些实施方式中，额外药剂增强所给予的细胞(例如表达CAR的细胞)的肿瘤浸润或转移(transmigration)。举例而言，在一些实施方式中，额外药剂刺激CD40，诸如CD40L，例如重组人CD40L。分化簇40(CD40)也为TNFR超家族的成员。CD40是在抗原呈现细胞上发现的共刺激蛋白质，且介导广泛多种免疫和发炎性反应。CD40也在一些恶性病上表达，其中其促进增殖。示例性抗CD40抗体是达西珠单抗(SGN-40)、鲁卡木单抗(Novartis，拮抗剂)、SEA-CD40(Seattle Genetics)和CP-870,893。在一些实施方式中，增强肿瘤浸润的额外药剂包括酪氨酸激酶抑制剂舒尼替尼(sunitnib)、肝素酶和/或趋化因子受体，诸如CCR2、CCR4和CCR7。
在一些实施方式中，额外药剂包括沙立度胺药物或其类似物和/或其衍生物，诸如来那度胺、泊利度胺(pomalidomide)或阿普司特(apremilast)。参见例如Bertilaccio等人,Blood(2013)122:4171；Otahal等人,Oncoimmunology(2016)5(4):e1115940；Fecteau等人,Blood(2014)124(10):1637-1644；和Kuramitsu等人,Cancer Gene Therapy(2015)22:487-495)。来那度胺((RS)-3-(4-氨基-1-侧氧基-1,3-二氢-2H-异吲哚-2-基)哌啶-2,6-二酮；也称为Revlimid)是沙立度胺的合成衍生物，且具有多种免疫调节作用，包括在T细胞与抗原呈现细胞(APC)之间强制形成免疫突触。举例而言，在一些情况下，来那度胺调节T细胞反应且使CD4+和CD8+ T细胞中介白素(IL)-2的产生增加，诱导T辅助(Th)反应自Th2转换成Th1，抑制T细胞调节亚群(Treg)的扩增，并改善滤泡性淋巴瘤和慢性淋巴球性白血病(CLL)中免疫突触的机能(Otahal等人,Oncoimmunology(2016)5(4):e1115940)。来那度胺在患有多发性骨髓瘤(MM)的患者中也具有直接肿瘤破坏活性，且通过影响淋巴组织微环境中发现的支持性细胞，诸如类抚育细胞(nurse-like cell)来直接并间接调节CLL肿瘤细胞的存活。来那度胺也可响应于T细胞经由CD3接合的活化或树突状细胞介导的活化而增进T细胞增殖和干扰素-γ产生。来那度胺也可诱导恶性B细胞表达较高量的免疫刺激性分子，诸如CD80、CD86、HLA-DR、CD95和CD40(Fecteau等人,Blood(2014)124(10):1637-1644)。在一些实施方式中，来那度胺以每日约1mg至约20mg，例如每日约1mg至约10mg、约2.5mg至约7.5mg、约5mg至约15mg，诸如约5mg、10mg、15mg或20mg的剂量给予。在一些实施方式中，来那度胺以约10μg/kg至5mg/kg，例如约100μg/kg至约2mg/kg、约200μg/kg至约1mg/kg、约400μg/kg至约600μg/kg，诸如约500μg/kg的剂量给予。在一些实施方式中，利妥昔单抗以约350-550mg/m2(例如350-375、375-400、400-425、425-450、450-475或475-500mg/m2)的剂量给予，例如静脉内给予。在一些实施方式中，来那度胺以低剂量给予。
在一些实施方式中，额外药剂是B细胞抑制剂。在一些实施方式中，额外药剂是选自以下的一种或多种B细胞抑制剂：CD10、CD19、CD20、CD22、CD34、CD123、CD79a、CD79b、CD179b、FLT-3或ROR1的抑制剂，或其组合。在一些实施方式中，B细胞抑制剂是抗体(例如单特异性或双特异性抗体)或其抗原结合片段。在一些实施方式中，额外药剂是表达靶向B细胞靶标的重组受体的基因工程细胞，这些B细胞靶标例如CD10、CD19、CD20、CD22、CD34、CD123、CD79a、CD79b、CD179b、FLT-3或ROR1。
在一些实施方式中，额外药剂是CD20抑制剂，例如抗CD20抗体(例如抗CD20单特异性或双特异性抗体)或其片段。示例性抗CD20抗体包括(但不限于)利妥昔单抗、奥伐木单抗(ofatumumab)、奥克珠单抗(ocrelizumab)(也称为GA101或RO5072759)、维托珠单抗(veltuzumab)、欧比托珠单抗(obinutuzumab)、TRU-015(Trubion Pharmaceuticals)、奥卡拉珠单抗(ocaratuzumab)(也称为AME-133v或奥卡拉珠单抗)和Pro131921(Genentech)。参见例如Lim等人,Haematologica.(2010)95(1):135-43。在一些实施方式中，抗CD20抗体包含利妥昔单抗。利妥昔单抗是结合至CD20且引起表达CD20的细胞的细胞溶解的嵌合小鼠/人类单克隆抗体IgG1κ。在一些实施方式中，额外药剂包括利妥昔单抗。在一些实施方式中，CD20抑制剂是小分子。
在一些实施方式中，额外药剂是CD22抑制剂，例如抗CD22抗体(例如抗CD22单特异性或双特异性抗体)或其片段。示例性抗CD22抗体包括依帕珠单抗(epratuzumab)和RFB4。在一些实施方式中，CD22抑制剂是小分子。在一些实施方式中，抗体是单特异性抗体，其任选与第二药剂，诸如化学治疗剂缀合。举例而言，在一些实施方式中，抗体是抗CD22单克隆抗体-MMAE缀合物(例如DCDT2980S)。在一些实施方式中，抗体是抗CD22抗体的scFv，例如抗体RFB4的scFv。在一些实施方式中，scFv与假单胞菌外毒素-A(例如BL22)的全部或片段融合。在一些实施方式中，scFv与假单胞菌外毒素-A(例如帕西妥莫单抗(moxetumomabpasudotox))的全部或片段(例如38kDa片段)融合。在一些实施方式中，抗CD22抗体是抗CD19/CD22双特异性抗体，其任选与毒素缀合。举例而言，在一些实施方式中，抗CD22抗体包含抗CD19/CD22双特异性部分(例如两个scFv配体，其识别人CD19和CD22)，其任选连接至白喉毒素(DT)的全部或一部分，例如白喉毒素(DT)的前389个氨基酸，即DT 390，例如配体定向毒素，诸如DT2219ARL)。在一些实施方式中，双特异性部分(例如抗CD 19/抗CD22)连接至毒素，诸如脱糖基化蓖麻毒素A链(例如Combotox)。
在一些实施方式中，免疫调节剂是细胞因子。在一些实施方式中，免疫调节剂是细胞因子或是诱导细胞因子在肿瘤微环境中的表达增加的药剂。细胞因子具有与T细胞扩增、分化、存活和动态平衡相关的重要功能。可向接受本申请所提供的GPRC5D结合重组受体、细胞和/或组合物的受试者给予的细胞因子包括IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15、IL-18和IL-21中的一种或多种。可向接受本申请所提供的GPRC5D结合重组受体、BCMA结合重组受体、GPRC5D和BCMA结合重组受体、细胞和/或组合物的受试者给予的细胞因子包括IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15、IL-18和IL-21中的一种或多种。在一些实施方式中，所给予的细胞因子是IL-7、IL-15或IL-21，或其组合。在一些实施方式中，给予细胞因子可改善所给予的细胞例如表达CAR的细胞的某些方面，诸如反应或抗肿瘤活性。
细胞因子可指由一种细胞群体释放的作为细胞间介体作用于另一细胞的蛋白质。此类细胞因子的实例是淋巴激素、单核球激素和传统多肽激素。细胞因子中包括生长激素，诸如人类生长激素、N-甲硫胺酰基人类生长激素和牛生长激素；副甲状腺激素；甲状腺素(thyroxine)；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；醣蛋白激素，诸如滤泡刺激激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和促黄体激素(LH)；肝生长因子(HGF)；纤维母细胞生长因子(FGF)；促乳素；胎盘催乳激素；肿瘤坏死因子-α和肿瘤坏死因子-β；苗勒氏管抑制性物质(mullerian-inhibiting substance)；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；活化素；血管内皮生长因子；整合素；血小板生成素(TPO)；神经生长因子(NGF)，诸如NGF-β；血小板生长因子；转型生长因子(TGF)，诸如TGF-α和TGF-β；类胰岛素生长因子-I和类胰岛素生长因子-II；红血球生成素(EPO)；骨诱导因子；干扰素，诸如干扰素-α、干扰素-β和干扰素-γ；群落刺激因子(CSF)，诸如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)；和粒细胞-CSF(G-CSF)；介白素(IL)，诸如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12；IL-15、肿瘤坏死因子，诸如TNF-α或TNF-β；和其他多肽因子，包括LIF和kit配体(KL)。如本申请所使用，术语细胞因子包括来自天然源或来自重组细胞培养物的蛋白质，和天然序列细胞因子的生物活性等效物。举例而言，免疫调节剂是细胞因子，且该细胞因子是IL-4、TNF-α、GM-CSF或IL-2。
在一些实施方式中，额外药剂包括介白素-15(IL-15)多肽、介白素-15受体α(IL-15Rα)多肽或其组合，例如hetIL-15(Admune Therapeutics,LLC)。hetIL-15是IL-15和IL-15Rα的异二聚非共价复合物。hetIL-15描述于例如U.S.8,124,084、U.S.2012/0177598、U.S.2009/0082299、U.S.2012/0141413和U.S.2011/0081311。在一些实施方式中，免疫调节剂可含有一或多种细胞因子。举例而言，介白素可包括白血球介白素注射液(Multikine)，其为天然细胞因子的组合。在一些实施方式中，免疫调节剂是类铎受体(TLR)激动剂、佐剂或细胞因子。
在一些实施方式中，额外药剂是改善或中和与细胞疗法相关的一或多种毒性或副作用的药剂。在一些实施方式中，额外药剂选自类固醇(例如皮质类固醇)、TNFα抑制剂和IL-6抑制剂。TNFα抑制剂的实例是抗TNFα抗体分子，诸如英利昔单抗(infliximab)、阿达木单抗(adalimumab)、聚乙二醇化赛妥珠单抗(certolizumab pegol)和戈利木单抗(golimumab)。TNFα抑制剂的另一实例是融合蛋白，诸如依那西普(entanercept)。TNFα的小分子抑制剂包括(但不限于)黄嘌呤衍生物(例如己酮可可碱(pentoxifylline))和安非他酮(bupropion)。IL-6抑制剂的一个实例是抗IL-6抗体分子，诸如托西利单抗(tocilizumab)、沙瑞卢单抗(sarilumab)、艾思莫单抗(elsilimomab)、CNTO 328、ALD518/BMS-945429、CNTO 136、CPSI-2364、CDP6038、VX30、ARGX-109、FE301和FM101。在一些实施方式中，抗IL-6抗体分子是托西利单抗。在一些实施方式中，额外药剂是IL-1R抑制剂，诸如阿那白滞素(anakinra)。
在一些实施方式中，额外药剂是腺苷水平和/或腺苷路径组分的调节剂。腺苷可在体内充当免疫调节剂。举例而言，非选择性活化腺苷受体亚型的腺苷和一些腺苷类似物减少中性粒细胞产生发炎性氧化性产物(Cronstein等人,Ann.N.Y.Acad.Sci.451:291,1985；Roberts等人,Biochem.J.,227:669,1985；Schrier等人,J.Immunol.137:3284,1986；Cronstein等人,Clinical Immunol.Immunopath.42:76,1987)。在一些情况下，细胞外腺苷或腺苷类似物的浓度可在具体环境，例如肿瘤微环境(TME)中增加。在一些情况下，腺苷或腺苷类似物信号转导取决于低氧或参与低氧的因子或其调控，例如低氧诱导性因子(HIF)。在一些实施方式中，腺苷信号转导增加可增加细胞内cAMP和cAMP依赖性蛋白质激酶，其引起对促炎性细胞因子产生的抑制，且可导致免疫抑制分子的合成和Treg的发育(Sitkovsky等人,Cancer Immunol Res(2014)2(7):598-605)。在一些实施方式中，额外药剂可减小或逆转腺苷、腺苷类似物和/或腺苷信号转导的免疫抑制作用。在一些实施方式中，额外药剂可减小或逆转低氧驱动的A2腺苷激导性T细胞免疫抑制。在一些实施方式中，额外药剂是选自腺苷受体的拮抗剂、细胞外腺苷降解剂、CD39/CD73胞外酶产生腺苷的抑制剂和低氧-HIF-1α信号转导的抑制剂。在一些实施方式中，额外药剂是腺苷受体拮抗剂或激动剂。
通过细胞外腺苷的抑制剂(诸如防止细胞外腺苷形成、降解、使其无活性和/或减少的药剂)和/或腺苷受体抑制剂(诸如腺苷受体拮抗剂)抑制或减少细胞外腺苷或腺苷受体可增强免疫反应，诸如巨噬细胞、嗜中性白血球、粒细胞、树突状细胞、T细胞和/或B细胞介导的反应。另外，Gs蛋白质的抑制剂介导的cAMP依赖性细胞内路径和腺苷受体触发的Gi蛋白质的抑制剂介导的细胞内路径也可增加急性和慢性发炎。
在一些实施方式中，额外药剂是腺苷受体拮抗剂或激动剂，例如腺苷受体A2a、A2b、A1和A3中的一种或多种的拮抗剂或激动剂。A1和A3抑制而A2a和A2b刺激腺苷酸环化酶活性。某些腺苷受体，诸如A2a、A2b和A3可在发炎期间抑制或减少免疫反应。因此，拮抗免疫抑制腺苷受体可强化、加强或增强免疫反应，例如由所给予的细胞，例如表达CAR的T细胞的免疫反应。在一些实施方式中，额外药剂抑制细胞外腺苷产生和腺苷经由腺苷受体触发的信号转导。举例而言，可通过抑制或减少产生腺苷的局部组织低氧；通过降解积累的细胞外腺苷(或使其无活性)；通过防止或减少腺苷受体在免疫细胞上的表达；和/或通过抑制/拮抗腺苷配体经由腺苷受体的信号转导来增强免疫反应增强、局部组织发炎和靶标组织破坏。
拮抗剂是倾向于取消另一种物质的作用的任何物质，其是结合至细胞受体而不引发生物反应的药剂。在一些实施方式中，拮抗剂是作为腺苷受体，诸如A2a、A2b或A3受体的拮抗剂的化合物。在一些实施方式中，拮抗剂结合腺苷受体但不触发Gi蛋白质依赖性细胞内路径的肽或拟肽。示例性拮抗剂描述于美国专利第5,565,566号、第5,545,627号、第5,981,524号、第5,861,405号、第6,066,642号、第6,326,390号、第5,670,501号、第6,117,998号、第6,232,297号、第5,786,360号、第5,424,297号、第6,313,131号、第5,504,090号和第6,322,771号。
在一些实施方式中，额外药剂是A2受体(A2R)拮抗剂，诸如A2a拮抗剂。示例性A2R拮抗剂包括KW6002(伊曲茶碱(istradefyline))、SCH58261、咖啡碱、副黄嘌呤、3,7-二甲基-1-炔丙基黄嘌呤(DMPX)、8-(间氯苯乙烯基)咖啡碱(CSC)、MSX-2、MSX-3、MSX-4、CGS-15943、ZM-241385、SCH-442416、普雷迪南(preladenant)、韦帕迪兰(vipadenant)(BII014)、V2006、ST-1535、SYN-115、PSB-1115、ZM241365、FSPTP和靶向A2R表达的抑制性核酸(例如siRNA或shRNA)，或靶向A2R的任何抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，额外药剂是描述于例如以下中的A2R拮抗剂：Ohta等人,Proc Natl Acad Sci U S A(2006)103:13132-13137；Jin等人,Cancer Res.(2010)70(6):2245-2255；Leone等人,Computational and Structural Biotechnology Journal(2015)13:265-272；Beavis等人,Proc Natl Acad Sci U S A(2013)110:14711-14716；和Pinna,A.,Expert OpinInvestig Drugs(2009)18:1619-1631；Sitkovsky等人,Cancer Immunol Res(2014)2(7):598-605；US 8,080,554；US 8,716,301；US 20140056922；WO2008/147482；US 8,883,500；US 20140377240；WO02/055083；US 7,141,575；US 7,405,219；US 8,883,500；US 8,450,329；和US 8,987,279。
在一些实施方式中，拮抗剂是特异性结合编码腺苷受体的mRNA的反义分子、抑制性核酸分子(例如小抑制性RNA(siRNA))或催化性核酸分子(例如核糖核酸酶)。在一些实施方式中，反义分子、抑制性核酸分子或催化性核酸分子结合编码A2a、A2b或A3的核酸。在一些实施方式中，反义分子、抑制性核酸分子或催化性核酸靶向腺苷受体下游的生物化学路径。举例而言，反义分子或催化性核酸可抑制参与Gs蛋白质或Gi蛋白质依赖性细胞内路径的酶。在一些实施方式中，额外药剂包括腺苷受体，诸如A2a、A2b或A3的显性阴性突变形式。
在一些实施方式中，抑制细胞外腺苷的额外药剂包括使细胞外腺苷无功能(或减弱此类功能)的药剂，诸如修饰腺苷的结构以抑制腺苷经由腺苷受体进行信号转导的能力的物质。在一些实施方式中，额外药剂是细胞外腺苷产生酶或腺苷降解酶、其修饰形式或其调节剂。举例而言，在一些实施方式中，额外药剂是酶(例如腺苷脱胺酶)或另一种催化性分子，其选择性结合并破坏腺苷，由此消除或显著降低内源性形成的腺苷经由腺苷受体进行信号转导且终止发炎的能力。
在一些实施方式中，额外药剂是腺苷脱胺酶(ADA)或其修饰形式，例如重组ADA和/或聚乙二醇修饰的ADA(ADA-PEG)，其可抑制细胞外腺苷的局部组织积累。ADA-PEG已用于治疗患有ADA SCID的患者(Hershfield(1995)Hum Mutat.5:107)。在一些实施方式中，抑制细胞外腺苷的药剂包括防止或减少细胞外腺苷形成、和/或防止或减少细胞外腺苷积累，由此消除或显著减弱腺苷的免疫抑制作用的药剂。在一些实施方式中，额外药剂特异性抑制参与促发炎分子(包括核转录因子调节剂)合成和/或分泌的调控的酶和蛋白质。抑制腺苷受体表达或Gs蛋白质或Gi蛋白质依赖性细胞内路径或cAMP依赖性细胞内路径的表达可使免疫反应增加/增强。
在一些实施方式中，额外药剂可靶向产生或制备细胞外腺苷的胞外酶。在一些实施方式中，额外药剂靶向CD39和CD73胞外酶，其以串联方式用以产生细胞外腺苷。CD39(也称为胞外核苷三磷酸酯二磷酸水解酶)将细胞外ATP(或ADP)转化成5'AMP。随后，CD73(也称为5'核苷酸酶)将5'AMP转化成腺苷。CD39的活性在NDP激酶和腺苷酸激酶作用下是可逆的，而CD73的活性是不可逆的。CD39和CD73在肿瘤基质细胞上表达，包括在内皮细胞和Treg，以及多种癌细胞上表达。举例而言，CD39和CD73在内皮细胞上的表达在肿瘤微环境的低氧条件下增加。肿瘤低氧可由不充分的血液供应和杂乱的肿瘤血管，由此损害氧气递送引起(Carroll和Ashcroft(2005),Expert.Rev.Mol.Med.7(6):1-16)。低氧也抑制腺苷酸激酶(AK)，其将腺苷转化成AMP，导致极高细胞外腺苷浓度。因此，腺苷响应于低氧而以高浓度释放，其为在实体肿瘤中或周围的肿瘤微环境(TME)常常出现的条件。在一些实施方式中，额外药剂是抗CD39抗体或其抗原结合片段、抗CD73抗体或其抗原结合片段(例如MEDI9447或TY/23)、α-β-亚甲基-二磷酸腺苷(ADP)、ARL 67156、POM-3、IPH52中的一种或多种(参见例如Allard等人Clin Cancer Res(2013)19(20):5626-5635；Hausler等人,Am J Transl Res(2014)6(2):129-139；Zhang,B.,Cancer Res.(2010)70(16):6407-6411)。
在一些实施方式中，额外药剂是低氧诱导性因子1α(HIF-1α)信号转导的抑制剂。HIF-1α的示例性抑制剂包括地高辛(digoxin)、吖啶黄素(acriflavine)、长寿蛋白(sirtuin)-7和加利特皮(ganetespib)。
在一些实施方式中，额外药剂包括蛋白质酪氨酸磷酸酶抑制剂，例如本申请所描述的蛋白质酪氨酸磷酸酶抑制剂。在一些实施方式中，蛋白质酪氨酸磷酸酶抑制剂是SHP-1抑制剂，例如本申请所描述的SHP-1抑制剂，诸如葡萄糖酸锑钠。在一些实施方式中，蛋白质酪氨酸磷酸酶抑制剂是SHP-2抑制剂，例如本申请所描述的SHP-2抑制剂。
在一些实施方式中，额外药剂是激酶抑制剂。激酶抑制剂，诸如CDK4激酶抑制剂、BTK激酶抑制剂、MNK激酶抑制剂或DGK激酶抑制剂，可调控肿瘤细胞中存在的组成性活性存活路径和/或调节免疫细胞的功能。在一些实施方式中，激酶抑制剂是布鲁顿氏酪氨酸激酶(BTK)抑制剂，例如依鲁替尼。在一些实施方式中，激酶抑制剂是磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶(PI3K)抑制剂。在一些实施方式中，激酶抑制剂是CDK4抑制剂，例如CDK4/6抑制剂。在一些实施方式中，激酶抑制剂是mTOR抑制剂，诸如雷帕霉素(rapamycin)、雷帕霉素类似物、OSI-027。mTOR抑制剂可为例如mTORC1抑制剂和/或mTORC2抑制剂，例如mTORC1抑制剂和/或mTORC2抑制剂。在一些实施方式中，激酶抑制剂是MNK抑制剂或PI3K/mTOR双重抑制剂。在一些实施方式中，其他示例性激酶抑制剂包括AKT抑制剂哌立福新(perifosine)、mTOR抑制剂替西罗莫司(temsirolimus)、Src激酶抑制剂达沙替尼(dasatinib)和福他替尼(fostamatinib)、JAK2抑制剂帕瑞替尼(pacritinib)和芦可替尼(ruxolitinib)、PKCβ抑制剂恩扎妥林(enzastaurin)和苔藓虫素(bryostatin)、以及AAK抑制剂阿立塞替(alisertib)。
在一些实施方式中，激酶抑制剂选自以下的BTK抑制剂：依鲁替尼(PCI-32765)；GDC-0834；RN-486；CGI-560；CGI-1764；HM-71224；CC-292；ONO-4059；CNX-774；和LFM-A13。在一些实施方式中，BTK抑制剂不会减小或抑制介白素-2诱导性激酶(ITK)的激酶活性，且选自GDC-0834；RN-486；CGI-560；CGI-1764；HM-71224；CC-292；ONO-4059；CNX-774；和LFM-A13。
在一些实施方式中，激酶抑制剂是BTK抑制剂，例如依鲁替尼(1-[(3R)-3-[4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基]哌啶-1-基]丙-2-烯-1-酮；也称为PCI-32765)。在一些实施方式中，激酶抑制剂是BTK抑制剂，例如依鲁替尼(PCI-32765)，且依鲁替尼以每日约250mg、300mg、350mg、400mg、420mg、440mg、460mg、480mg、500mg、520mg、540mg、560mg、580mg、600mg(例如250mg、420mg或560mg)的剂量给予一段时间，例如在21天的周期内每日给予，或在28天的周期内每日给予。在一些实施方式中，给予1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个或更多个周期的依鲁替尼。在一些实施方式中，BTK抑制剂是国际申请WO2015/079417中所描述的BTK抑制剂。
在一些实施方式中，激酶抑制剂是PI3K抑制剂。PI3K是参与细胞周期调控和淋巴瘤存活的PI3K/Akt/mTOR路径的中心。示例性PI3K抑制剂包括艾德昔布(idelalisib)(PI3Kδ抑制剂)。在一些实施方式中，额外药剂是艾德昔布和利妥昔单抗。
在一些实施方式中，额外药剂是哺乳动物雷帕霉素靶标(mTOR)的抑制剂。在一些实施方式中，激酶抑制剂是选自以下的mTOR抑制剂：替西罗莫司；瑞达莫司(ridaforolimus)(也称为AP23573和MK8669)；依维莫司(everolimus)(RAD001)；雷帕霉素(AY22989)；斯马匹莫(simapimod)；AZD8055；PF04691502；SF1126；和XL765。在一些实施方式中，额外药剂是有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK)的抑制剂，诸如维罗非尼(vemurafenib)、达拉非尼(dabrafenib)和曲美替尼(trametinib)。
在一些实施方式中，额外药剂是调控促凋亡蛋白或抗凋亡蛋白的药剂。在一些实施方式中，额外药剂包括B细胞淋巴瘤2(BCL-2)抑制剂(例如维奈托克(venetoclax)，也称为ABT-199或GDC-0199；或ABT-737)。维奈托克是抑制抗凋亡蛋白BCL-2的小分子(4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基-1-环己-1-基]甲基}-1-哌嗪基)-N-({3-硝基-4-[(四氢-2H-哌喃-4-基甲基)氨基]苯基}磺酰基)-2-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺)。调节促凋亡蛋白或抗凋亡蛋白的其他药剂包括用于最大功效的BCL-2抑制剂ABT-737、纳维克拉斯(navitoclax)(ABT-263)；Mcl-1siRNA或Mcl-1抑制剂类视黄素N-(4-羟基苯基)瑞汀酰胺(4-HPR)。在一些实施方式中，额外药剂提供促凋亡刺激，诸如重组肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导性配体(TRAIL)，其可通过结合至肿瘤细胞表面上的TRAIL死亡受体DR-4和DR-5或TRAIL-R2激动性抗体来活化细胞凋亡路径。
在一些实施方式中，额外药剂包括吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)抑制剂。IDO是催化氨基酸L-色氨酸降解为犬尿氨酸的酶。许多癌症过度表达IDO，例如前列腺癌、结肠直肠癌、胰脏癌、子宫颈癌、胃癌、卵巢癌、头部癌和肺癌。浆细胞样树突状细胞(pDC)、巨噬细胞和树突状细胞(DC)可表达IDO。在一些方面中，L-色氨酸减少(例如通过IDO催化)通过诱导T细胞失能和细胞凋亡而产生免疫抑制环境。因此，在一些方面中，IDO抑制剂可例如通过减少所给予的表达CAR的细胞的抑制或死亡来增强本申请所描述的GPRC5D结合重组受体、细胞和/或组合物的功效。示例性IDO抑制剂包括(但不限于)1-甲基-色氨酸、吲哚莫德(indoximod)(New Link Genetics)(参见例如临床试验标识号NCT01191216；NCT01792050)和INCB024360(Incyte Corp.)(参见例如临床试验标识号NCT01604889；NCT01685255)。
在一些实施方式中，额外药剂包括细胞毒性剂，例如CPX-351(CelatorPharmaceuticals)、阿糖胞苷(cytarabine)、道诺霉素、沃萨洛辛(vosaroxin)(SunesisPharmaceuticals)、沙帕他滨(sapacitabine)(Cyclacel Pharmaceuticals)、伊达比星(idarubicin)或米托蒽醌(mitoxantrone)。在一些实施方式中，额外药剂包括低甲基化剂，例如DNA甲基转移酶抑制剂，例如阿扎胞苷(azacitidine)或地西他滨(decitabine)。
在另一个实施方式中，额外疗法是移植，例如同种异体干细胞移植。
在一些实施方式中，额外疗法是淋巴球耗竭疗法。淋巴球耗竭化学疗法被认为可改善表达重组受体的细胞，诸如CAR T细胞的植入和活性。在一些实施方式中，淋巴球耗竭化学疗法可增强过继性转移的肿瘤特异性T细胞经由内动态平衡增殖而进行的活体内增殖(Grossman 2004，Stachel 2004)。在一些实施方式中，化学疗法可减少或消除CD4+CD25+调节T细胞，这些细胞可抑制靶向肿瘤的过继性转移的T细胞的功能(Turk 2004)。在一些实施方式中，在过继性T细胞疗法之前进行淋巴球耗竭化学疗法可增强基质细胞源性因子1(SDF-1)在骨髓中的表达，由此增强经修饰T细胞经由SDF-1与在T细胞表面上表达的CXCR-4的结合而归巢至原发性肿瘤(Pinthus 2004)。在一些实施方式中，淋巴球耗竭化学疗法可进一步减小受试者的肿瘤负荷，且潜在地降低CRS的风险和严重程度。
在一些实施方式中，淋巴球耗竭例如在给予基因工程细胞，例如表达CAR的细胞之前对受试者执行。在一些实施方式中，淋巴球耗竭包含给予美法仑、环磷氮介(Cytoxan)、环磷酰胺和/或氟达拉滨。在一些实施方式中，淋巴球耗竭化学疗法在给予(例如输注)基因工程细胞，例如表达CAR的细胞之前、同时或之后给予受试者。在一个实例中，淋巴球耗竭化学疗法在给予基因工程细胞，例如表达CAR的细胞之前给予受试者。在一些实施方式中，淋巴球耗竭化学疗法在给予基因工程细胞之前1至10天，诸如在起始给予经基因工程改造经基因工程改造细胞之前1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天、或在起始给予基因工程细胞之前至少2天，诸如至少3、4、5、6或7天给予。在一些实施方式中，在起始给予基因工程细胞之前不超过7天、诸如不超过6、5、4、3或2天向受试者给予预调节剂。给予基因工程细胞在淋巴球耗竭化学疗法之后的天数可基于临床或逻辑情形来决定。在一些实例中，对淋巴球耗竭化学疗法方案的剂量调整或其他改变可因如由治疗医师所确定的受试者的健康状况，诸如受试者的基础器官功能来实施。
在一些实施方式中，淋巴球耗竭化学疗法包含给予淋巴球耗竭剂，诸如环磷酰胺、氟达拉滨或其组合。在一些实施方式中，向受试者给予剂量在或在约20mg/kg与100mg/kg受试者体重之间，诸如在或在约40mg/kg与80mg kg之间的环磷酰胺。在一些方面中，向受试者给予约60mg/kg环磷酰胺。在一些实施方式中，环磷酰胺每日一次给予，持续一天或两天。在一些实施方式中，在淋巴球耗竭剂包含环磷酰胺的情况下，向受试者给予剂量在或在约100mg/m2与500mg/m2受试者的体表面积之间，诸如在或在约200mg/m2与400mg/m2之间、或在250mg/m2与350mg/m2之间(包括端点)的环磷酰胺。在一些情况下，向受试者给予约300mg/m2的环磷酰胺。在一些实施方式中，环磷酰胺可以单次剂量给予或可以复数次剂量给予，诸如每日、隔日或每三天给予。在一些实施方式中，环磷酰胺每日给予，诸如持续1-5天，例如持续2至4天。在一些情况下，在起始细胞疗法之前，每日向受试者给予约300mg/m2的环磷酰胺，持续3天。
在一些实施方式中，在淋巴球耗竭剂包含氟达拉滨的情况下，向受试者给予剂量在或在约1mg/m2与100mg/m2受试者的体表面积之间，诸如在或在约10mg/m2与75mg/m2之间、15mg/m2与50mg/m2之间、20mg/m2与40mg/m2之间、或24mg/m2与35mg/m2之间(包括端点)的氟达拉滨。在一些情况下，向受试者给予约30mg/m2的氟达拉滨。在一些实施方式中，氟达拉滨可以单次剂量给予或可以复数次剂量给予，诸如每日、隔日或每三天给予。在一些实施方式中，氟达拉滨每日给予，诸如持续1-5天，例如持续2至4天。在一些情况下，在起始细胞疗法之前，每日向受试者给予约30mg/m2氟达拉滨，持续3天。
在一些实施方式中，淋巴球耗竭剂包含药剂组合，诸如环磷酰胺与氟达拉滨的组合。因此，药剂组合可以包括任何剂量或给予时程(诸如以上描述者)的环磷酰胺，以及任何剂量或给予时程(诸如以上描述者)的氟达拉滨。举例而言，在一些方面中，向受试者每日给予或给予约30mg/m2氟达拉滨，且每日给予或给予约300mg/m2环磷酰胺，持续3天。
在一些实施方式中，可在淋巴球耗竭化学疗法之前给予除地塞米松(dexamethasone)或其他类固醇以外的止吐疗法。在一些实施方式中，美司钠(Mesna)可用于有出血性膀胱炎病史的受试者。
在一些实施方式中，额外药剂是溶瘤病毒。在一些实施方式中，溶瘤病毒能够在癌细胞中选择性复制，且触发癌细胞死亡或减慢癌细胞生长。在一些情况下，溶瘤病毒对非癌细胞无作用或具有极小作用。溶瘤病毒包括(但不限于)溶瘤腺病毒、溶瘤单纯性疱疹病毒、溶瘤逆转录病毒、溶瘤小病毒、溶瘤痘疮病毒、溶瘤辛必斯病毒(oncolytic Sinbisvirus)、溶瘤流感病毒或溶瘤RNA病毒(例如溶瘤呼肠孤病毒、溶瘤新城疫病毒(NewcastleDisease Virus，NDV)、溶瘤麻疹病毒或溶瘤水泡性口炎病毒(VSV))。
其他示例性组合疗法、治疗和/或药剂包括抗过敏剂、止吐药、镇痛剂和辅助疗法。在一些实施方式中，额外药剂包括细胞保护剂，诸如神经保护剂、自由基清除剂、心脏保护剂、蒽环霉素外渗中和剂和营养物。
在一些实施方式中，用作额外药剂的抗体缀合或以其他方式结合至治疗剂，例如化学治疗剂(例如环磷氮介、氟达拉滨、组蛋白脱乙酰基酶抑制剂、脱甲基化剂、肽疫苗、抗肿瘤抗生素、酪氨酸激酶抑制剂、烷基化剂、抗微管或抗有丝分裂剂)、抗过敏剂、抗恶心剂(或止吐剂)、疼痛舒解剂或本申请所描述的细胞保护剂。在一些实施方式中，额外药剂是抗体-药物缀合物。
在一些实施方式中，额外药剂可在DNA、RNA或蛋白质层面上调节、抑制或刺激特定因子，诸如以增强或加强某些方面。在一些实施方式中，额外药剂可在核酸(例如DNA或RNA)层面上，在所给予的细胞，例如经基因工程改造以表达重组受体(例如CAR)的细胞内调节因子。在一些实施方式中，抑制性核酸，例如抑制性核酸，例如dsRNA，例如siRNA或shRNA，或成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)、类转录活化因子效应核酸酶(TALEN)或锌指核酸内切酶(ZFN)可用于抑制基因工程细胞，例如表达CAR的细胞中抑制性分子的表达。在一些实施方式中，抑制剂是shRNA。在一些实施方式中，抑制性分子在基因工程细胞，例如表达CAR的细胞内受抑制。在一些实施方式中，编码抑制调节或调控(例如抑制)T细胞功能的分子的表达的dsRNA分子的核酸分子可操作地连接至启动子，例如HI源性或U6源性启动子，由此使抑制性分子的表达抑制的dsRNA分子在基因工程细胞，例如表达CAR的细胞内表达。参见例如Brummelkamp TR等人(2002)Science 296:550-553；Miyagishi M等人(2002)Nat.Biotechnol.19:497-500。
在一些实施方式中，额外药剂能够破坏编码抑制性分子的基因，诸如本申请所描述的任何免疫检查点抑制剂。在一些实施方式中，破坏通过缺失，例如整个基因、外显子或区域缺失；和/或用外源序列置换；和/或通过在该基因内，通常在该基因的外显子内行突变，例如读框转移或错义突变实现。在一些实施方式中，破坏使得提前终止密码子并入至基因中，由此使抑制性分子不表达或不以能够在细胞表面上表达和/或能够介导细胞信号转导的形式表达。破坏一般在DNA层面上进行。破坏一般为永久、不可逆或非暂时的。
在一些方面中，破坏通过基因编辑，诸如使用特异性结合至作为破坏靶标的区域处的基因或与其杂交的DNA结合蛋白或DNA结合核酸进行。在一些方面中，蛋白质或核酸与核酸酶偶合或复合，诸如在嵌合或融合蛋白中偶合或复合。举例而言，在一些实施方式中，破坏使用对所破坏的基因具特异性的包含靶向DNA的蛋白质和核酸酶的融合物来实现，该核酸酶诸如锌指核酸酶(ZFN)或TAL效应核酸酶(TALEN)或RNA引导的核酸酶，诸如成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)-Cas系统，诸如CRISPR-Cas9系统。在一些实施方式中，制备或产生经基因工程改造的细胞，例如表达CAR的细胞的方法包括向细胞群中引入编码经基因工程改造的抗原受体(例如CAR)的核酸分子和编码靶向抑制性分子的药剂(即基因编辑核酸酶)的核酸分子，该药剂诸如对抑制性分子具特异性的包含靶向DNA的蛋白质和核酸酶的融合物，该核酸酶诸如ZFN或TALEN、或RNA引导的核酸酶，诸如CRISPR-Cas9系统的核酸酶。
本申请所描述的额外药剂中的任一种可制备且与本申请所描述的GPRC5D结合重组受体(例如嵌合抗原受体)和/或表达这些分子(例如重组受体)的基因工程细胞一起以组合疗法形式给予，诸如以包含组合疗法的一种或多种药剂和药学上可接受的载剂的药物组合物(诸如本申请所描述的任何药物组合物)形式给予。本申请所描述的额外药剂中的任一种可制备且与本申请所描述的GPRC5D结合(和BCMA结合)重组受体(例如嵌合抗原受体)和/或表达这些分子(例如重组受体)的基因工程细胞一起以组合疗法形式给予，诸如以包含组合疗法的一种或多种药剂和药学上可接受的载剂的药物组合物(诸如本申请所描述的任何药物组合物)形式给予。在一些实施方式中，GPRC5D结合重组受体(例如嵌合抗原受体)、表达这些分子(例如重组受体)的基因工程细胞、表达这些分子(例如重组受体)的复数个基因工程细胞可与额外药剂、疗法或治疗同时、同时或按任何次序依序给予，其中此类给予在受试者的体内提供治疗有效量的各药剂。在一些实施方式中，额外药剂可与本申请所描述的GPRC5D结合重组受体、细胞和/或组合物共给予，例如作为同一药物组合物的一部分或使用相同递送方法共给予。在一些实施方式中，将额外药剂与本申请所描述的GPRC5D结合重组受体、细胞和/或组合物同时给予，但以独立组合物给予。在一些实施方式中，额外药剂是额外的基因工程细胞，例如经基因工程改造以表达不同重组受体的细胞，且以同一组合物中或以独立组合物给予。在一些实施方式中，在给予细胞之前，将基因工程细胞、例如表达CAR的细胞额外药剂与这些一起培育。
在一些实例中，一或多种额外药剂在给予本申请所描述的GPRC5D结合重组受体、细胞和/或组合物之后或之前，间隔所选时间段给予。在一些实例中，一或多种额外药剂在给予本申请所描述的GPRC5D结合(和BCMA结合)重组受体、细胞和/或组合物之后或之前，间隔所选时间段给予。在一些实例中，该时间段是1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周、1个月、2个月或3个月。在一些实例中，一或多种额外药剂多次给予，和/或本申请所描述的GPRC5D结合重组受体、细胞和/或组合物多次给予。举例而言，在一些实施方式中，额外药剂在本申请所描述的GPRC5D结合重组受体、细胞和/或组合物之前给予，例如在投药之前两周、12天、10天、8天、一周、6天、5天、4天、3天、2天或1天给予。举例而言，在一些实施方式中，额外药剂在本申请所描述的GPRC5D合重组受体、细胞和/或组合物之后给予，例如在投药之后两周、12天、10天、8天、一周、6天、5天、4天、3天、2天或1天给予。
额外药剂的剂量可为任何治疗有效量，例如本申请所描述的任何剂量，且额外药剂的适当剂量可取决于待治疗疾病的类型，所给予的重组受体、细胞和/或组合物的类型、剂量和/或频率、疾病的严重程度和病程、重组受体、细胞和/或组合物出于预防目的抑或出于治疗目的给予、先前疗法、患者的临床病史和其对重组受体、细胞和/或组合物的反应，和主治医师的判断。重组受体、细胞和/或组合物和/或额外药剂和/或疗法可一次性给予、重复或历经一系列治疗给予患者。
VI.制品或套组
也提供含有提供的重组受体(例如CAR)、经基因工程改造的细胞和/或包含其的组合物的制品或套组。制品可包括容器和在容器上或与容器相联的标签或药品说明书。适合容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、试管、IV溶液袋等。容器可由多种材料，诸如玻璃或塑料形成。在一些实施方式中，容器具有无菌接取口。示例性容器包括静脉内溶液袋、小瓶，包括具有可由注射用针刺穿的塞子的容器。制品或套组可进一步包括指示组合物可用于治疗特定病况，诸如本申请所描述的病况(例如多发性骨髓瘤)的药品说明书。替代地或另外，制品或套组可进一步包括含药学上可接受的缓冲液的另一个或同一个容器。其可进一步包括其他材料，诸如其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针和/或注射器。
卷标或药品说明书可指示组合物用于治疗受试者的表达GPRC5D或GPRC5D相关的疾病、病症或病况。在容器上或与容器相联的标签或药品说明书可指示有关复原和/或使用配制物的说明。标签或药品说明书可进一步指示配制物可用于或意欲用于皮下、静脉内或其他给予模式以治疗或预防受试者的表达GPRC5D或GPRC5D相关的疾病、病症或病况。
在一些实施方式中，容器装有单独或与另一种有效治疗、预防和/或诊断病况的组合物组合的组合物。制品或套组可包括(a)其中含有组合物(即，第一药剂)的第一容器，其中该组合物包括重组受体(例如CAR或含有CAR的基因工程细胞)；以及(b)其中含有组合物(即，第二药剂)的第二容器，其中该组合物包括另一药剂，诸如细胞毒性剂或其他治疗剂，且该物品或套组进一步包含在标签或药品说明书上的有关用有效量的第二药剂治疗受试者的说明书。
在一些实施方式中，制品或套组可包括(a)其中含有组合物(即，第一药剂)的第一容器，其中组合物包括抗GPRC5D重组受体(例如CAR或含有CAR的基因工程细胞)；(b)其中含有组合物(即，第二药剂)的第二容器其中组合物包括针对GPRC5D的不同抗原决定簇一不同抗原(例如BCMA)的第二重组受体(例如CAR或含有CAR的基因工程细胞)，且该物品或套组进一步包含在标签或药品说明书上有关用有效量的第二药剂治疗受试者的说明书。在一些实施方式中，制品或套组可进一步包括(c)其中含有组合物(即，第三药剂)的第三容器，其中该组合物包括另一药剂，诸如细胞毒性剂或其他治疗剂，且该物品或套组进一步包含在标签或药品说明书上的有关用有效量的药剂治疗受试者的说明书。
VII.定义
除非另外定义，否则本申请所使用的所有技术术语、表示法以及其他技术和科学术语意欲具有与一般熟习所主张主题所属领域技术人员通常所理解相同的含义。在一些情况下，出于清楚起见和/或方便参考，在本申请中定义具有通常所理解含义的术语，且本申请中包括此类定义不应必然解释为表示与此项技术中通常所理解存在实质性差异。
如本申请所使用，提及抗体的“相应形式”意谓当比较两种抗体的特性或活性时，该特性使用相同抗体形式比较。举例而言，若陈述抗体活性大于抗体的相应形式的活性，则意谓该抗体的特定形式(诸如scFv)的活性大于第一抗体的scFv形式。
术语“Fc区”在本申请中用于定义含有至少一部分恒定区的免疫球蛋白重链的C末端区。该术语包括天然序列Fc区和变异Fc区。在一个实施方式中，人类IgG重链Fc区自Cys226、或自Pro230延伸至重链的羧基末端。然而，Fc区的C末端赖氨酸(Lys447)可存在或可不存在。除非本申请另外说明，否则Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号根据EU编号系统，也称为EU索引，如Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中所描述。
术语“全长抗体”、“完整抗体”和“完全抗体”在本申请中可互换使用，指结构实质上类似于天然抗体结构或具有含如本申请所定义的Fc区的重链的抗体。
“经分离”抗体是已与其天然环境的组分分离的抗体。在一些实施方式中，抗体纯化至大于95％或99％的纯度，纯度通过例如电泳(例如SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或层析(例如离子交换或逆相HPLC)测定。关于抗体纯度评估方法的评述，参见例如Flatman等人,J.Chromatogr.B 848:79-87(2007)。
“经分离”核酸是指已与其天然环境的组分分离的核酸分子。经分离核酸包括通常含有核酸分子的细胞中所包含的核酸分子，但该核酸分子存在于染色体外或存在于不同于其天然染色体位置的染色体位置处。
“编码抗GPRC5D抗体的经分离核酸”是指编码抗体重链和轻链(或其片段)的一个或多个核酸分子，包括呈单一载体或独立载体形式的此类核酸分子和存在于宿主细胞中一个或多个位置处的此类核酸分子。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用且是指引入了外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转型体”和“经转型细胞”，其包括初代经转型细胞和由其得到的后代，不考虑继代次数。后代的核酸含量与母细胞可能不完全相同，而且可能含有突变。本申请中包括针对原始经转型细胞筛选或选择的具有相同功能或生物活性的突变后代。
术语“多肽”和“蛋白质”可互换使用且是指氨基酸残基的聚合物，且不限于最小长度。多肽，包括抗体和抗体链和其他肽，例如连接物，可包括氨基酸残基，包括天然和/或非天然氨基酸残基。这些术语也包括多肽的表达后修饰，例如糖基化、唾液酸化、乙酰化、磷酸化和其类似修饰。在一些方面中，多肽可相对于初始或天然序列含有修饰，只要蛋白质维持所需活性。此等修饰可为有意的，如经由定点突变诱发修饰；或可为偶发的，诸如经由产生蛋白质的宿主的突变或由PCR扩增引起的错误。
如本申请所使用，“氨基酸序列一致性百分比(％)”和“一致性百分比”和“序列一致性”当结合氨基酸序列(参考多肽序列)使用时，定义为在对准序列且必要时引入空位以达成最大序列一致性百分比之后且在不将任何保守性取代视为序列一致性的一部分的情况下，候选序列(例如受试者抗体或片段)中与参考多肽序列中氨基酸残基一致的氨基酸残基的百分比。出于测定氨基酸序列一致性百分比的目的进行的对准可通过在此项技术的技能范围内的各种方式，例如使用公开可得的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件实现。熟习此项技术者可测定用于对准序列的适当参数，包括在所比较的序列的全长内达成最大对准所需的任何算法。
氨基酸取代可包括多肽中的一个氨基酸经另一个氨基酸置换。可将氨基酸取代引入所关注的结合分子(例如抗体)中且根据所需活性，例如保持/改善的抗原结合，或降低的免疫原性筛选产物。
氨基酸一般可根据以下共同侧链特性分组：
(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)碱性：His、Lys、Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；
(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。
非保守性取代包括将此等类别中的一个的成员换成另一类别。
如本申请所使用，术语“载体”是指这样一种核酸分子，其能够传播其所连接的另一核酸分子。该术语包括呈自我复制核酸结构的载体以及并入引入其的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够引导其可操作地连接的核酸的表达。此类载体在本申请中称为“表达载体”。
术语“药品说明书”用以指通常包括在治疗产品的商业包装中的说明书，其含有关于与使用此类治疗产品有关的适应症、用法、剂量、给予、组合疗法、禁忌和/或警告的信息。
除非本申请另外明确规定，否则如本申请所使用，单数形式“一个(种)(a/an)”和“该”包括复数个(种)指示物。举例而言，“一个(种)”意谓“至少一个(种)”或“一个或多个(种)”。应理解，本申请所描述的方面、实施方式和变化形式包括“包含方面、实施方式和变化形式”、“由方面、实施方式和变化形式组成”和/或“基本上由方面、实施方式和变化形式组成”。
在本发明通篇，所主张的主题的各种方面均以范围形式呈现。应理解，范围形式的描述仅为方便和简洁起见，且不应解释为对所主张主题的范围的坚定限制。因此，范围的描述应视为特定地揭示的所有可能子范围以及该范围内的个别数值。举例而言，在提供值范围的情况下，应理解，在该范围的上限与下限之间的每一中间值和该所述范围内的任何其他所述值或中间值均涵盖于所主张的主题内。此等较小范围的上限和下限可独立地包括在较小范围内且也涵盖于所主张的主题内，满足所述范围内任何特别排除的限制。在所述范围包括这些限值中的一个或两个的情况下，排除这些所包括的限值中的任一个或两个的范围也包括在所主张的主题中。不管范围的宽度如何，此均适用。
如本申请所使用，术语“约”是指熟习此项技术者易于知晓的各别值的常见误差范围。本申请中提及“约”某一值或参数包括(且描述)针对该值或参数本身的实施方式。举例而言，提及“约X”的描述包括有关“X”的描述。
如本申请所使用，“组合物”是指两种或两种以上产物、物质或化合物(包括细胞)的任何混合物。其可为溶液、悬浮液、液体、粉末、糊膏、水溶液、非水性溶液或其任何组合。
如本申请所使用，陈述细胞或细胞群对特定标记物呈“阳性”是指细胞上或细胞中特定标记物，通常表面标记物的可侦测的存在。当提及表面标记物时，该术语是指如通过流动式细胞测量术，例如通过用特异性结合至该标记物的抗体染色且侦测该抗体，侦测到表面表达的存在，其中该染色可通过流动式细胞测量术侦测，其水平实质上高于使用同型匹配对照物在其他方面相同的条件下进行相同程序所侦测到的染色，和/或水平实质上类似于已知对该标记物呈阳性的细胞的染色，和/或水平实质上高于已知对该标记物呈阴性的细胞的染色。
如本申请所使用，陈述细胞或细胞群对特定标记物呈“阴性”是指特定标记物，通常表面标记物并未显著可侦测地存在于细胞上或细胞中。当提及表面标记物时，该术语是指如通过流动式细胞测量术，例如用特异性结合至该标记物的抗体染色且侦测该抗体，未侦测到表面表达，其中通过流动式细胞测量术未侦测到该染色，其水平实质上高于使用同型匹配对照物，在其他方面相同的条件下进行相同程序所侦测到染色，和/或其水平实质上低于已知对该标记物呈阳性的细胞的染色，和/或其水平实质上类似于已知对该标记物呈阴性的细胞的染色。
VIII.示例性实施方式
提供的实施方式尤其是以下那些：
1.一种嵌合抗原受体，其包含：
(1)特异性结合人G蛋白偶联受体C类5族成员D(GPRC5D)的细胞外抗原结合结构域，其中该细胞外抗原结合结构域包含：
(i)重链可变(VH)区，其包含与SEQ ID NO:21、23、25、27、29、31或33中所示的氨基酸序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列；和
(ii)轻链可变(VL)区，其包含与SEQ ID NO:22、24、26、28、30、32、34、63、64、65、66、67、68或69中所示的氨基酸序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列；
(2)长度为至少125个氨基酸的间隔子；
(3)跨膜结构域；和
(4)细胞内信号转导区。
2.一种嵌合抗原受体，其包含：
(1)特异性结合人G蛋白偶联受体C类5族成员D(GPRC5D)的细胞外抗原结合结构域，其中该细胞外抗原结合结构域包含：
(i)重链可变(VH)区，其包含选自SEQ ID NO:21、23、25、27、29、31和33的VH区氨基酸序列内所包含的重链互补决定区1(CDR-H1)、重链互补决定区2(CDR-H2)和重链互补决定区3(CDR-H3)；和
(ii)轻链可变(VL)区，其包含选自SEQ ID NO:22、24、26、28、30、32、34、63、64、65、66、67、68和69的VL区氨基酸序列内所包含的轻链互补决定区1(CDR-L1)、轻链互补决定区2(CDR-L2)和轻链互补决定区3(CDR-L3)；
(2)长度为至少125个氨基酸的间隔子；
(3)跨膜结构域；和
(4)细胞内信号转导区。
3.一种嵌合抗原受体，其包含：
(1)特异性结合人G蛋白偶联受体C类5族成员D(GPRC5D)的细胞外抗原结合结构域，其中该细胞外抗原结合结构域包含：
(i)重链可变(VH)区，其包括含选自SEQ ID NO:75、78、80、82、90、93、95、97、105、108、110、112、120、123、125、127、135、138、140、142、152、162、165、167和169的氨基酸序列的CDR-H1；(b)含选自SEQ ID NO:76、79、81、83、91、94、96、98、106、109、111、113、121、124、126、128、136、139、141、143、150、153、154、155、163、166、168和170的氨基酸序列的CDR-H2；和(c)含选自SEQ ID NO:77、84、92、99、107、114、122、129、137、144、151、156、164和171的氨基酸序列的CDR-H3；和
(ii)轻链可变(VL)区，其包括含选自SEQ ID NO:85、88、100、103、115、118、130、133、145、148、157、160、172和174的氨基酸序列的CDR-L1；(b)含选自SEQ ID NO:86、89、101、104、116、119、131、134、146、149、158和161的氨基酸序列的CDR-L2；和(c)含选自SEQID NO:87、102、117、132、147、159、173、175和297的氨基酸序列的CDR-L3；
(2)长度为至少125个氨基酸的间隔子；
(3)跨膜结构域；和
(4)细胞内信号转导区。
4.如实施方式2或实施方式3所述的嵌合抗原受体，其中该细胞外抗原结合结构域包含：
(i)重链可变(VH)区，其包含与SEQ ID NO:21、23、25、27、29、31或33中所示的氨基酸序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列；和
(ii)轻链可变(VL)区，其包含与SEQ ID NO:22、24、26、28、30、32、34、63、64、65、66、67、68或69中所示的氨基酸序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。
5.如实施方式1至4中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该间隔子的长度在125个与300个之间或在约125个与约300个之间、在125个与250个之间或在约125个与约250个之间、在125个与230个之间或在约125个与约230个之间、在125个与200个之间或在约125个与约200个之间、在125个与180个之间或在约125个与约180个之间、在125个与150个之间或在约125个与约150个之间、在150个与300个之间或在约150个与约300个之间、在150个与250个之间或在约150个与约250个之间、在150个与230个之间或在约150个与约230个之间、在150个与200个之间或在约150个与约200个之间、在150个与180个之间或在约150个与约180个之间、在180个与300个之间或在约180个与约300个之间、在180个与250个之间或在约180个与约250个之间、在125个与300个之间或在约125个与约300个之间、在180个与230个之间或在约180个与约230个之间、在180个与200个之间或在约180个与约200个之间、在200个与300个之间或在约200个与约300个之间、在200个与250个之间或在约200个与约250个之间、在200个与230个之间或在约200个与约230个之间、在230个与300个之间或在约230个与约300个之间、在230个与250个之间或在约230个与约250个之间、或在250个与300个之间或在约250个与约300个之间。
6.如实施方式1至5中任一项所述的嵌合抗原受体，其中：
该间隔子的长度是、或者至少是约130个、140个、150个、160个、170个、180个、190个、200个、210个、220个、221个、222个、223个、224个、225个、226个、227个、228个或229个氨基酸，或其长度在任何前述两个数值之间；或
该间隔子的长度是约、或者至少是约130个、140个、150个、160个、170个、180个、190个、200个、210个、220个、221个、222个、223个、224个、225个、226个、227个、228个或229个氨基酸，或其长度在任何前述两个数值之间。
7.如实施方式1至6中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该间隔子包含免疫球蛋白的一部分。
8.如实施方式1至7中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该间隔子包含铰链区、CH2区和CH3区的序列。
9.如实施方式8所述的嵌合抗原受体，其中：
该铰链区包含IgG4铰链区和/或IgG2铰链区的全部或一部分，其中该IgG4铰链区任选为人IgG4铰链区且该IgG2铰链区任选为人IgG2铰链区；
该CH2区包含IgG4 CH2和/或IgG2 CH2的全部或一部分，其中该IgG4CH2任选为人类IgG4 CH2且该IgG2 CH2任选为人IgG2 CH2；和/或
该CH3区包含IgG4 CH3和/或IgG2 CH3的全部或一部分，其中该IgG4CH3任选为人类IgG4 CH3且该IgG2 CH3任选为人IgG2 CH3。
10.如实施方式8或实施方式9所述的嵌合抗原受体，其中该铰链区、CH2和CH3包含来自人类IgG4的铰链的全部或一部分、CH2的全部或一部分和CH3的全部或一部分。
11.如实施方式8或实施方式9所述的嵌合抗原受体，其中该铰链区、该CH2和该CH3中的一个或多个是嵌合的且包含来自人类IgG4和人IgG2的铰链、CH2和CH3。
12.如实施方式1至11中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该间隔子包含IgG4/2嵌合铰链区或与人类IgG4铰链相比，包含至少一个氨基酸置换的经修饰的IgG4铰链区；IgG2/4嵌合CH2区；和IgG4 CH3区。
13.如实施方式1至12中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该间隔子是或包含(i)SEQ ID NO:17中所示的序列；(ii)与SEQ ID NO:17具有至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的SEQ IDNO:17的功能变体；或(iii)长度为至少125个氨基酸的(i)或(ii)的连续部分。
14.如实施方式1至13中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该间隔子是或包含SEQID NO:17中所示的序列。
15.如实施方式1至14中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该间隔子是或包含由SEQ ID NO:48中所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
16.如实施方式1至15中任一项所述的嵌合抗原受体，其中：
该VH区包含SEQ ID NO:21中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:21具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；且该VL区包含SEQ ID NO:22中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:22具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；
该VH区包含SEQ ID NO:21中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:21具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；且该VL区包含SEQ ID NO:63中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:63具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；
该VH区包含SEQ ID NO:23中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:23具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；且该VL区包含SEQ ID NO:24中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:24具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；
该VH区包含SEQ ID NO:23中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:23具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；且该VL区包含SEQ ID NO:64中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:64具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；
该VH区包含SEQ ID NO:25中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:25具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；且该VL区包含SEQ ID NO:26中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:26具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；
该VH区包含SEQ ID NO:25中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:25具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；且该VL区包含SEQ ID NO:65中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:65具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；
该VH区包含SEQ ID NO:27中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:27具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；且该VL区包含SEQ ID NO:28中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:28具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；
该VH区包含SEQ ID NO:27中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:27具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；且该VL区包含SEQ ID NO:66中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:66具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；
该VH区包含SEQ ID NO:29中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:29具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；且该VL区包含SEQ ID NO:30中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:30具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；
该VH区包含SEQ ID NO:29中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:29具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；且该VL区包含SEQ ID NO:67中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:67具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；
该VH区包含SEQ ID NO:31中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:31具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；且该VL区包含SEQ ID NO:32中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:32具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；
该VH区包含SEQ ID NO:31中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:31具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；且该VL区包含SEQ ID NO:68中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:68具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；
该VH区包含SEQ ID NO:33中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:33具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；且该VL区包含SEQ ID NO:34中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:34具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；或
该VH区包含SEQ ID NO:33中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:33具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；且该VL区包含SEQ ID NO:69中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:69具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列。
17.如实施方式1至16中任一项所述的嵌合抗原受体，其中：
该VH区分别包含SEQ ID NO:80、81和77的氨基酸序列，且该VL区分别包含SEQ IDNO:85、86和87的氨基酸序列；
该VH区分别包含SEQ ID NO:82、83和84的氨基酸序列，且该VL区分别包含SEQ IDNO:88、89和87的氨基酸序列；
该VH区分别包含SEQ ID NO:95、96、92的氨基酸序列，且该VL区分别包含SEQ IDNO:100、101和102的氨基酸序列；
该VH区分别包含SEQ ID NO:97、98和99的氨基酸序列，且该VL区分别包含SEQ IDNO:103、104和102的氨基酸序列；
该VH区分别包含SEQ ID NO:110、111和107的氨基酸序列，且该VL区分别包含SEQID NO:115、116和117的氨基酸序列；
该VH区分别包含SEQ ID NO:112、113和114的氨基酸序列，且该VL区分别包含SEQID NO:118、119和117的氨基酸序列；
该VH区分别包含SEQ ID NO:125、126和122的氨基酸序列，且该VL区分别包含SEQID NO:130、131和132的氨基酸序列；
该VH区分别包含SEQ ID NO:127、128和129的氨基酸序列，且该VL区分别包含SEQID NO:133、134和132的氨基酸序列；
该VH区分别包含SEQ ID NO:140、141和137的氨基酸序列，且该VL区分别包含SEQID NO:145、146和147的氨基酸序列；
该VH区分别包含SEQ ID NO:142、143和144的氨基酸序列，且该VL区分别包含SEQID NO:148、149和147的氨基酸序列；
该VH区分别包含SEQ ID NO:140、154和151的氨基酸序列，且该VL区分别包含SEQID NO:157、158和159的氨基酸序列；
该VH区分别包含SEQ ID NO:142、155和156的氨基酸序列，且该VL区分别包含SEQID NO:160、161和159的氨基酸序列；
该VH区分别包含SEQ ID NO:167、168和164的氨基酸序列，且该VL区分别包含SEQID NO:172、86、173的氨基酸序列；
该VH区分别包含SEQ ID NO:169、170和171的氨基酸序列，且该VL区分别包含SEQID NO:174、89和175的氨基酸序列；或
该VH区分别包含SEQ ID NO:169、170和171的氨基酸序列，且该VL区分别包含SEQID NO:174、89和297的氨基酸序列。
18.如实施方式1至17中任一项所述的嵌合抗原受体，其中：
该VH区和该VL区包含分别如SEQ ID NO:21和22中所示的氨基酸序列，或分别如SEQ ID NO:21和63中所示的氨基酸序列；
该VH区和该VL区包含分别如SEQ ID NO:23和24中所示的氨基酸序列，或分别如SEQ ID NO:23和64中所示的氨基酸序列；
该VH区和该VL区包含分别如SEQ ID NO:25和26中所示的氨基酸序列，或分别如SEQ ID NO:25和65中所示的氨基酸序列；
该VH区和该VL区包含分别如SEQ ID NO:27和28中所示的氨基酸序列，或分别如SEQ ID NO:27和66中所示的氨基酸序列；
该VH区和该VL区包含分别如SEQ ID NO:29和30中所示的氨基酸序列，或分别如SEQ ID NO:29和67中所示的氨基酸序列；
该VH区和该VL区包含分别如SEQ ID NO:31和32中所示的氨基酸序列，或分别如SEQ ID No:31和68中所示的氨基酸序列；或
该VH区和该VL区包含分别如SEQ ID NO:33和34中所示的氨基酸序列，或分别如SEQ ID No:33和69中所示的氨基酸序列。
19.如实施方式1至18中任一项所述的嵌合抗原受体，其中：
该VH区包含SEQ ID NO:21中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:21具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；且该VL区包含SEQ ID NO:22中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:22具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；
该VH区包含SEQ ID NO:21中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:21具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；且该VL区包含SEQ ID NO:63中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:63具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；
该VH区包含SEQ ID NO:23中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:23具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；且该VL区包含SEQ ID NO:24中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:24具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；
该VH区包含SEQ ID NO:23中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:23具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；且该VL区包含SEQ ID NO:64中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:64具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；
该VH区包含SEQ ID NO:27中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:27具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；且该VL区包含SEQ ID NO:28中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:28具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；
该VH区包含SEQ ID NO:27中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:27具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；且该VL区包含SEQ ID NO:66中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:66具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；
该VH区包含SEQ ID NO:31中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:31具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；且该VL区包含SEQ ID NO:32中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:32具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；或
该VH区包含SEQ ID NO:31中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:31具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；且该VL区包含SEQ ID NO:68中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:68具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列。
20.如实施方式1至19中任一项所述的嵌合抗原受体，其中：
该VH区分别包含SEQ ID NO:80、81和77的氨基酸序列，且该VL区分别包含SEQ IDNO:85、86和87的氨基酸序列；
该VH区分别包含SEQ ID NO:82、83和84的氨基酸序列，且该VL区分别包含SEQ IDNO:88、89和87的氨基酸序列；
该VH区分别包含SEQ ID NO:95、96、92的氨基酸序列，且该VL区分别包含SEQ IDNO:100、101和102的氨基酸序列；
该VH区分别包含SEQ ID NO:97、98和99的氨基酸序列，且该VL区分别包含SEQ IDNO:103、104和102的氨基酸序列；
该VH区分别包含SEQ ID NO:125、126和122的氨基酸序列，且该VL区分别包含SEQID NO:130、131和132的氨基酸序列；
该VH区分别包含SEQ ID NO:127、128和129的氨基酸序列，且该VL区分别包含SEQID NO:133、134和132的氨基酸序列；
该VH区分别包含SEQ ID NO:140、154和151的氨基酸序列，且该VL区分别包含SEQID NO:157、158和159的氨基酸序列；或
该VH区分别包含SEQ ID NO:142、155和156的氨基酸序列，且该VL区分别包含SEQID NO:160、161和159的氨基酸序列。
21.如实施方式1至20中任一项所述的嵌合抗原受体，其中：
该VH区和该VL区包含分别如SEQ ID NO:21和22中所示的氨基酸序列，或分别如SEQ ID No:21和63中所示的氨基酸序列；
该VH区和该VL区包含分别如SEQ ID NO:23和24中所示的氨基酸序列，或分别如SEQ ID No:23和64中所示的氨基酸序列；
该VH区和该VL区包含分别如SEQ ID NO:27和28中所示的氨基酸序列，或分别如SEQ ID No:27和66中所示的氨基酸序列；或
该VH区和该VL区包含分别如SEQ ID NO:31和32中所示的氨基酸序列，或分别如SEQ ID No:31和68中所示的氨基酸序列。
22.如实施方式1至21中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该细胞外抗原结合结构域与小鼠GPRC5D交叉反应或结合。
23.如实施方式1至22中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该细胞外抗原结合结构域与食蟹猕猴GPRC5D交叉反应或结合。
24.如实施方式1至21中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该细胞外抗原结合结构域不与小鼠GPRC5D或食蟹猕猴GPRC5D交叉反应或不与其结合。
25.如实施方式1至21和24中任一项所述的嵌合抗原受体，其中：
该VH区包含SEQ ID NO:27中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:27具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；且该VL区包含SEQ ID NO:28中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:28具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；或
该VH区包含SEQ ID NO:27中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:27具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；且该VL区包含SEQ ID NO:66中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:66具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列。
26.如实施方式1至21、24和25中任一项所述的嵌合抗原受体，其包括含SEQ IDNO:27中所示的VH区氨基酸序列内所包含的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的重链可变(VH)区；和含SEQ ID NO:28或66中所示的VL区氨基酸序列内所包含的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的轻链可变(VL)区。
27.如实施方式1至21和24至26中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该VH区分别包含SEQ ID NO:125、126和122的氨基酸序列，且该VL区分别包含SEQ ID NO:130、131和132的氨基酸序列。
28.如实施方式1至21和24至26中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该VH区分别包含SEQ ID NO:127、128和129的氨基酸序列，且该VL区分别包含SEQ ID NO:133、134和132的氨基酸序列。
29.如实施方式1至21和24至26中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该VH区分别包含SEQ ID NO:120、121和122的氨基酸序列，且该VL区分别包含SEQ ID NO:130、131和132的氨基酸序列。
30.如实施方式1至21和24至26中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该VH区分别包含SEQ ID NO:123、124和122的氨基酸序列，且该VL区分别包含SEQ ID NO:130、131和132的氨基酸序列。
31.如实施方式1至21和24至30中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该VH区和该VL区包含分别如SEQ ID NO:27和28中所示的氨基酸序列，或分别如SEQ ID NO:27和66中所示的氨基酸序列。
32.如实施方式1至31中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该细胞外抗原结合结构域是单链抗体片段。
33.如实施方式1至32中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该单链抗体片段是或包含单链可变片段(scFv)。
34.如实施方式1至33中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该VH区和该VL区通过柔性连接物接合。
35.如实施方式34所述的嵌合抗原受体，其中该连接物包含氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:52)。
36.如实施方式1至35中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该VH区在该VL区的氨基末端。
37.如实施方式1至36中任一项所述的嵌合抗原受体，其中：
该细胞外抗原结合结构域包含选自SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11和13的氨基酸序列，或与选自SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11和13的氨基酸序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列；和/或
该细胞外抗原结合结构域由选自SEQ ID No:257、259、261、263、265、267和269的核苷酸序列或与选自SEQ ID No:257、259、261、263、265、267和269的核苷酸序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的核苷酸序列编码。
38.如实施方式1至37中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该细胞外抗原结合结构域包含选自SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11和13的氨基酸序列。
39.如实施方式1至37中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该细胞外抗原结合结构域包含选自SEQ ID NO:1、3、7和11的氨基酸序列或与选自SEQ ID NO:1、3、7和11的氨基酸序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。
40.如实施方式1至37和39中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该抗原结合结构域包含选自SEQ ID NO:1、3、7和11的氨基酸序列。
41.如实施方式1至36和38中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该抗原结合结构域包含SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。
42.如实施方式1至37、39和41中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该抗原结合结构域包含SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列。
43.如实施方式1至35中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该VH区在该VL区的羧基末端。
44.如实施方式1至35和43中任一项所述的嵌合抗原受体，其中：
该细胞外抗原结合结构域包含选自SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12和14的氨基酸序列或与选自SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12和14的氨基酸序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列；和/或
该细胞外抗原结合结构域由选自SEQ ID No:258、260、262、264、266、268和270的核苷酸序列或与选自SEQ ID No:258、260、262、264、266、268和270的核苷酸序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的核苷酸序列编码。
45.如实施方式1至35、43和44中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该细胞外抗原结合结构域包含选自SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12和14的氨基酸序列。
43.如实施方式1至35、43和44中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该细胞外抗原结合结构域包含选自SEQ ID NO:2、4、8和12的氨基酸序列或与选自SEQ ID NO:2、4、8和12的氨基酸序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。
47.如实施方式1至35、43、44和46中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该细胞外抗原结合结构域包含选自SEQ ID NO:2、4、8和12的氨基酸序列。
48.如实施方式1至35、43、44和46中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该抗原结合结构域包含SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。
49.如实施方式1至35、43、44、46和48中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该细胞外抗原结合结构域包含SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列。
50.如实施方式1至49中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该细胞内信号转导区包含细胞内细胞质信号转导结构域。
51.如实施方式50所述的嵌合抗原受体，其中该细胞内信号转导结构域能够在T细胞中诱导初级活化信号，是T细胞受体(TCR)组分和/或含有免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)。
52.如实施方式50或实施方式51所述的嵌合抗原受体，其中该细胞内信号转导结构域是或包含CD3-zeta(CD3ζ)链或其功能变体或信号转导部分的细胞质信号转导结构域。
53.如实施方式50或52中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该细胞内信号转导结构域是人的或来源于人蛋白质。
54.如实施方式50至53中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该细胞内信号转导结构域是或包含SEQ ID NO:20中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:20具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸。
55.如实施方式50至54中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该细胞内信号转导区进一步包含共刺激信号转导区。
56.如实施方式55所述的嵌合抗原受体，其中该共刺激信号转导区含有T细胞共刺激分子或其信号转导部分的细胞内信号转导结构域。
57.如实施方式55或实施方式56所述的嵌合抗原受体，其中该共刺激信号转导区包含CD28、4-1BB或ICOS或其信号转导部分的细胞内信号转导结构域。
58.如实施方式55至57中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该共刺激信号转导区是人的或来源于人蛋白质。
59.如实施方式55至58中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该共刺激信号转导区包含CD28的细胞内信号转导结构域。
60.如实施方式55至59中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该共刺激信号转导区是或包含SEQ ID NO:46中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:46中所示的序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。
61.如实施方式55至58中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该共刺激信号转导区包含4-1BB的细胞内信号转导结构域。
62.如实施方式55至58和61中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该共刺激信号转导区是或包含SEQ ID NO:19中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:19中所示的序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。
63.如实施方式55至62中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该共刺激信号转导区在该跨膜结构域与该细胞内信号转导区之间。
64.如实施方式1至63中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该跨膜结构域是或包含来自CD4、CD28或CD8的跨膜结构域。
65.如实施方式1至64中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该跨膜结构域是或包含来源于CD28的跨膜结构域。
66.如实施方式1至65中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该跨膜结构域是人的或来源于人蛋白质。
67.如实施方式1至66中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该跨膜结构域是或包含SEQ ID NO:18中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:18中所示的序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。
68.一种嵌合抗原受体，其包含：
(1)特异性结合人G蛋白偶联受体C类5族成员D(GPRC5D)的细胞外抗原结合结构域，其中该细胞外抗原结合结构域包含：
(i)重链可变(VH)区，其包含与SEQ ID NO:27中所示的氨基酸序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列；和
(ii)轻链可变(VL)区，其包含与SEQ ID NO:28或66中所示的氨基酸序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列；
(2)间隔子，其包含IgG4/2嵌合铰链或经修饰的IgG4铰链；IgG2/4嵌合CH2区；和IgG4 CH3区，任选地其长度为约228个氨基酸；或SEQ ID NO:17中所示的间隔子；
(3)来自人CD28的跨膜结构域；和
(4)细胞内信号转导区，其包含CD3-zeta(CD3ζ)链的细胞质信号转导结构域和T细胞共刺激分子的细胞内信号转导结构域。
69.如实施方式68所述的嵌合抗原受体，其中：
该VH区包含SEQ ID NO:27中所示的VH区氨基酸序列内所包含的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；且该VL区包含SEQ ID NO:28或66中所示的VL区氨基酸序列内所包含的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；或
该VH区包括分别含SEQ ID NO:125、126和122的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该VL区包括分别含SEQ ID NO:130、131和132的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；
该VH区包括分别含SEQ ID NO:127、128和129的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该VL区包括分别含SEQ ID NO:133、134和132的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；
该VH区包括分别含SEQ ID NO:120、121和122的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该VL区包括分别含SEQ ID NO:130、131和132的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；或
该VH区包括分别含SEQ ID NO:123、124和122的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该VL区包括分别含SEQ ID NO:130、131和132的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
70.一种嵌合抗原受体，其包含：
(1)特异性结合人G蛋白偶联受体C类5族成员D(GPRC5D)的细胞外抗原结合结构域，其中该细胞外抗原结合结构域包含：
含SEQ ID NO:27中所示的VH区氨基酸序列内所包含的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的VH区；和含SEQ ID NO:28或66中所示的VL区氨基酸序列内所包含的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的轻链可变(VL)区；或
包括分别含SEQ ID NO:125、126和122的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的VH区，和包括分别含SEQ ID NO:130、131和132的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的VL区；
包括分别含SEQ ID NO:127、128和129的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的VH区，和包括分别含SEQ ID NO:133、134和132的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的VL区；
包括分别含SEQ ID NO:120、121和122的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的VH区，和包括分别含SEQ ID NO:130、131和132的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的VL区；或
包括分别含SEQ ID NO:123、124和122的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的VH区，和包括分别含SEQ ID NO:130、131和132的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的VL区；
(2)间隔子，其包含IgG4/2嵌合铰链或经修饰的IgG4铰链；IgG2/4嵌合CH2区；和IgG4 CH3区，任选地其长度为约228个氨基酸；或SEQ ID NO:17中所示的间隔子；
(3)来自人CD28的跨膜结构域；和
(4)细胞内信号转导区，其包含人CD3-zeta(CD3ζ)链的细胞质信号转导结构域和人CD28或人4-1BB的细胞内信号转导结构域。
71.如实施方式68至70中任一项所述的嵌合抗原受体，其中：
该细胞外抗原结合结构域包含SEQ ID NO:27中所示的VH区氨基酸序列和SEQ IDNO:28或66中所示的VL区氨基酸序列；和/或
该细胞外抗原结合结构域包含SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8中所示的scFv。
72.如实施方式68至71中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该跨膜结构域是或包含SEQ ID NO:18中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:18具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。
73.如实施方式72所述的嵌合抗原受体，其中该跨膜结构域是或包含SEQ ID NO:18中所示的序列。
74.如实施方式68至73中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该细胞内信号转导区包含(a)SEQ ID NO:20中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:20具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列；和(b)SEQ ID NO:46中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:46中所示的序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。
75.如实施方式68至74中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该细胞内信号转导区是或包含SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:46中所示的序列。
76.如实施方式68至73中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该细胞内信号转导区包含(a)SEQ ID NO:20中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:20具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列，和(b)SEQ ID NO:19中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:19中所示的序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。
77.如实施方式68至73和76中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该细胞内信号转导区是或包含SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:19中所示的序列。
78.如实施方式1至77中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该编码的嵌合抗原受体自其N末端至C末端依序含有：抗原结合结构域、间隔子、跨膜结构域和细胞内信号转导区。
79.一种多核苷酸，其包含编码如实施方式1至78中任一项所述的嵌合抗原受体的核苷酸序列。
80.如实施方式79所述的多核苷酸，其中编码间隔子的核酸包含至少一个经修饰的剪接供体和/或剪接受体位点，该经修饰的剪接供体和/或受体位点对应于SEQ ID NO:73中所示的序列中所包含的参考剪接供体位点和/或参考剪接受体位点包含一个或多个核苷酸修饰。
81.如实施方式80所述的多核苷酸，其中该一个或多个核苷酸修饰包含氨基酸取代。
82.如实施方式80或实施方式81所述的多核苷酸，其中该参考剪接供体和/或参考剪接受体位点为典型、非典型或隐蔽的剪接位点。
83.如实施方式80至82中任一项所述的多核苷酸，其中：
该参考剪接供体和/或参考剪接受体位点的剪接位点预测分数为至少或至少约0.4分、至少或至少约0.5分、至少或至少约0.6分、至少或至少约0.70分、至少或至少约0.75分、至少或至少约0.80分、至少或至少约0.85分、至少或至少约0.90分、至少或至少约0.95分、至少或至少约0.99分、或至少或至少约1.0分；和/或
该参考剪接供体和/或参考剪接受体位点涉及剪接事件的概率预测为至少或至少约40％、至少或至少约50％、至少或至少约60％、至少或至少约70％、至少或至少约75％、至少或至少约80％、至少或至少约85％、至少或至少约90％、至少或至少约95％、至少或至少约99％、或至少或至少约100％。
84.如实施方式80至83中任一项所述的多核苷酸，其中：
该参考剪接供体位点包含序列aatctaagtacggac(SEQ ID NO:176)、tcaactggtacgtgg(SEQ ID NO:177)、acaattagtaaggca(SEQ ID NO:178)和/或accacaggtgtatac(SEQ ID NO:179)；和/或
该参考剪接受体位点包含序列aagtttctttctgtattccaggctgaccgtggataaatctc(SEQ ID NO:180)和/或gggcaacgtgttctcttgcagtgtcatgcacgaagccctgc(SEQ ID NO:181)。
85.如实施方式80至84中任一项所述的多核苷酸，其中：
该参考剪接供体和/或参考剪接受体位点的剪接位点预测分数为至少或至少约0.70分、至少或至少约0.75分、至少或至少约0.80分、至少或至少约0.85分、至少或至少约0.90分、至少或至少约0.95分、至少或至少约0.99分、或至少或至少约1.0分；和/或
该参考剪接供体和/或参考剪接受体位点涉及剪接事件的概率预测为至少或至少约70％、至少或至少约75％、至少或至少约80％、至少或至少约85％、至少或至少约90％、至少或至少约95％、至少或至少约99％、或至少或至少约100％。
86.如实施方式80至85中任一项所述的多核苷酸，其中：
该参考剪接供体位点包含序列tcaactggtacgtgg(SEQ ID NO:177)；和/或
该参考剪接受体位点包含序列aagtttctttctgtattccaggctgaccgtggataaatctc(SEQ ID NO:180)。
87.如实施方式80至86中任一项所述的多核苷酸，其中该一个或多个核苷酸修饰中的至少一个在参考剪接受体和/或参考剪接供体位点的剪接位点接合处的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个残基内。
88.如实施方式80至87中任一项所述的多核苷酸，其中该一个或多个核苷酸修饰是沉默修饰，和/或相较于SEQ ID NO:73产生简并密码子，和/或不会改变所编码的间隔子的氨基酸序列。
89.如实施方式80至88中任一项所述的多核苷酸，其中：
该经修饰的剪接供体位点示于agtctaaatacggac(SEQ ID NO:182)、tcaactggtatgtgg(SEQ ID NO:183)、accatctccaaggcc(SEQ ID NO:184)和/或gccccaggtttacac(SEQ ID NO:185)中；和/或
该经修饰的剪接受体位点示于cagtttcttcctgtatagtagactcaccgtggataaatcaa(SEQ ID NO:186)、gggcaacgtgttcagctgcagcgtgatgcacgaggccctgc(SEQ ID NO:187)和/或cgccttgtcctccttgtcccgctcctcctgttgccggacct(SEQ ID NO:188)中。
90.如实施方式80至89中任一项所述的多核苷酸，其中该经修饰的剪接供体位点示于tcaactggtatgtgg(SEQ ID NO:183)中和/或该经修饰的受体位点示于cagtttcttcctgtatagtagactcaccgtggataaatcaa(SEQ ID NO:186)和/或cgccttgtcctccttgtcccgctcctcctgttgccggacct(SEQ ID NO:188)中。
91.如实施方式80至90中任一项所述的多核苷酸，其中该间隔子由SEQ ID NO:74中所示的核苷酸序列或其部分编码。
92.如实施方式79至91中任一项所述的多核苷酸，其中当在细胞中表达多核苷酸时，由该多核苷酸转录的RNA、任选为信使RNA(mRNA)展现至少70％、75％、80％、85％、90％或95％RNA均质性。
93.如实施方式79至92中任一项所述的多核苷酸，其中当在细胞中表达时，相较于自参考多核苷酸转录的信使RNA(mRNA)的异质性，由该多核苷酸转录的RNA，任选mRNA展现减小的异质性，该参考多核苷酸编码与该多核苷酸所编码相同的氨基酸序列，其中该参考多核苷酸的不同的处在于在编码该间隔子的核酸中存在一个或多个剪接供体位点和/或一个或多个剪接受体位点，和/或相较于该多核苷酸，包含一个或多个核苷酸修饰，和/或包含SEQ ID NO:73中所示的间隔子。
94.如实施方式93所述的多核苷酸，其中该RNA异质性的减小大于或大于约10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％或更高百分比。
95.如实施方式93或实施方式94所述的多核苷酸，其中由参考多核苷酸转录的RNA、任选为信使RNA(mRNA)展现出大于或大于约10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％或更高RNA异质性。
96.如实施方式79至95中任一项所述的多核苷酸，其中该RNA均质性和/或异质性通过琼脂糖凝胶电泳、基于芯片的毛细电泳、分析型超速离心、场流动分级分离或液相层析测定。
97.如实施方式79至96中任一项所述的多核苷酸，其中该多核苷酸经密码子优化以用于在人类细胞中表达。
98.如实施方式79至96中任一项所述的多核苷酸，其中该嵌合抗原受体是第一嵌合抗原受体且该多核苷酸进一步包含编码第二嵌合抗原受体的核苷酸序列。
99.如实施方式98所述的多核苷酸，其中该第一嵌合抗原受体和该第二嵌合抗原受体通过一个或多个多顺反子组件分隔开。
100.如实施方式99所述的多核苷酸，其中该一个或多个多顺反子组件是或包含核糖体跳跃序列，任选其中该核糖体跳跃序列是T2A、P2A、E2A或F2A组件。
101.如实施方式100所述的多核苷酸，其中该编码一个或多个多顺反子组件的核苷酸序列是密码子趋异的。
102.如实施方式100或实施方式101所述的多核苷酸，其中该编码一个或多个多顺反子组件的核苷酸序列是或包含SEQ ID NO:319中所示的序列。
103.如实施方式80至82中任一项所述的多核苷酸，其中该第二嵌合抗原受体(CAR)包含特异性结合多发性骨髓瘤上表达或与多发性骨髓瘤相关的第二抗原的细胞外抗原结合结构域。
104.如实施方式103所述的多核苷酸，其中该第二CAR进一步包含间隔子、跨膜结构域和细胞内信号转导区。
105.如实施方式103或实施方式104所述的多核苷酸，其中该第二抗原选自B细胞成熟抗原(BCMA)、CD38、CD138、CS-1、BAFF-R、TACI和FcRH5。
106.如实施方式103至105中任一项所述的多核苷酸，其中该第二抗原是BCMA。
107.如实施方式103至106中任一项所述的多核苷酸，其中该第二CAR包含：
(1)特异性结合BCMA的细胞外抗原结合结构域，其中该细胞外抗原结合结构域包含：
(i)重链可变(VH)区，其包含与SEQ ID NO:189、191、193、195或197中所示的氨基酸序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列；和
(ii)轻链可变(VL)区，其包含与SEQ ID NO:190、192、194、196或198中所示的氨基酸序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列；
(2)间隔子，任选为包含IgG4/2嵌合铰链或经修饰的IgG4铰链；IgG2/4嵌合CH2区；和IgG4 CH3区的间隔子，任选地其长度为约228个氨基酸，或SEQ ID NO:17中所示的间隔子；
(3)跨膜结构域；和
(4)细胞内信号转导区。
108.如实施方式107所述的多核苷酸，其中该VH区包含SEQ ID NO:189、191、193、195或197中所示的VH区氨基酸序列内所包含的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；且该VL区包含SEQID NO:190、192、194、196或198中所示的VL区氨基酸序列内所包含的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
109.如实施方式103至106中任一项所述的多核苷酸，其中该第二CAR包含：
(1)特异性结合BCMA的细胞外抗原结合结构域，其中该细胞外抗原结合结构域包含：
(i)重链可变(VH)区，其包括含选自SEQ ID NO:199、202、206、209、212和215的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR-H1)；(b)含选自SEQ ID NO:200、203、207、210、213和216的氨基酸序列的重链互补决定区2(CDR-H2)；和(c)含选自SEQ ID NO:201、204、205、208、211、214和217的氨基酸序列的重链互补决定区3(CDR-H3)；和
(ii)轻链可变(VL)区，其包括含选自SEQ ID NO:218、221、224、227、230、233和235的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR-L1)；(b)含选自SEQ ID NO:219、222、225、228、231、234和236中的任一个的氨基酸序列的轻链互补决定区2(CDR-L2)；和(c)含选自SEQ ID NO:220、223、226、229和232的氨基酸序列的轻链互补决定区3(CDR-L3)；
(2)间隔子，任选为包含IgG4/2嵌合铰链或经修饰的IgG4铰链；IgG2/4嵌合CH2区；和IgG4 CH3区的间隔子，任选地其长度是或是约228个氨基酸，或SEQ ID NO:17中所示的间隔子；
(3)跨膜结构域；和
(4)细胞内信号转导区。
110.如实施方式107至109中任一项所述的多核苷酸，其中：
该第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:199、200和201的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:218、219和220的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；
该第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:202、203、204的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:221、222和223的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；
该第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:199、200、205的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:224、225和226的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；
该第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:206、207、208的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:227、228和229的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；
该第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:209、210和211的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:230、231和232的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；
该第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:212、213和214的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:233、234和229的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；或
该第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:215、216和217的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:235、236和232的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
111.如实施方式107至109中任一项所述的多核苷酸，其中：
该第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:209、210和211的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:230、231和232的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；或
该第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:215、216和217的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:235、236和232的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
112.如实施方式107至111中任一项所述的多核苷酸，其中：
该第二CAR的VH区和VL区包含(a)分别如SEQ ID NO:189和SEQ ID NO:190中所示的氨基酸序列，或(b)与SEQ ID NO:189具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列和与SEQ ID NO:190具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列；
该第二CAR的VH区和VL区包含(a)分别如SEQ ID NO:191和SEQ ID NO:192中所示的氨基酸序列，或(b)与SEQ ID NO:191具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列和与SEQ ID NO:192具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列；
该第二CAR的VH区和VL区包含(a)分别如SEQ ID NO:193和SEQ ID NO:194中所示的氨基酸序列，或(b)与SEQ ID NO:193具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列和与SEQ ID NO:194具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列；
该第二CAR的VH区和VL区包含(a)分别如SEQ ID NO:195和SEQ ID NO:196中所示的氨基酸序列，或(b)与SEQ ID NO:195具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列和与SEQ ID NO:196具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列；或
该第二CAR的VH区和VL区包含(a)分别如SEQ ID NO:197和SEQ ID NO:198中所示的氨基酸序列，或(b)与SEQ ID NO:197具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列和与SEQ ID NO:198具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。
113.如实施方式107至112中任一项所述的多核苷酸，其中：
该第二CAR的VH区和VL区分别包含SEQ ID NO:189和SEQ ID NO:190中所示的氨基酸序列；
该第二CAR的VH区和VL区包含SEQ ID NO:191和SEQ ID NO:192中所示的氨基酸序列；
该第二CAR的VH区和VL区包含SEQ ID NO:193和SEQ ID NO:194中所示的氨基酸序列；
该第二CAR的VH区和VL区包含SEQ ID NO:195和SEQ ID NO:196中所示的氨基酸序列；或
该第二CAR的VH区和VL区分别包含SEQ ID NO:197和SEQ ID NO:198中所示的氨基酸序列。
114.如实施方式107至113中任一项所述的多核苷酸，其中该第二CAR的细胞外抗原结合结构域是单链抗体片段。
115.如实施方式114所述的多核苷酸，其中该单链抗体片段是或包含单链可变片段(scFv)。
116.如实施方式107至115中任一项所述的多核苷酸，其中该第二CAR的VH区和该VL区通过柔性连接物接合。
117.如实施方式116所述的多核苷酸，其中该第二CAR的连接物包含氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:52)。
118.如实施方式107至117中任一项所述的多核苷酸，其中该VH区在该VL区的氨基末端。
119.如实施方式107至117中任一项所述的多核苷酸，其中该VH区在该VL区的羧基末端。
120.如实施方式107至119中任一项所述的多核苷酸，其中该抗原结合结构域包含选自SEQ ID NO:237、238、239、240和241的氨基酸序列或与选自SEQ ID NO:237、238、239、240和241的氨基酸序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。
121.如实施方式107至120中任一项所述的多核苷酸，其中该抗原结合结构域包含选自SEQ ID NO:237、238、239、240和241的氨基酸序列。
122.如实施方式107至121中任一项所述的多核苷酸，其中：
该第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:209、210和211的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:230、231和232的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；或该第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:215、216和217的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:235、236和232的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；和/或
该第二CAR的VH区和VL区分别包含SEQ ID NO:197和SEQ ID NO:198中所示的氨基酸序列；和/或
该细胞外抗原结合结构域包含SEQ ID NO:241中所示的氨基酸序列或与SEQ IDNO:241中所示的序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。
123.如实施方式104至122中任一项所述的多核苷酸，其中该第二CAR的跨膜结构域是或包含来自CD4、CD28或CD8，任选来自人CD4、人CD28或人CD8的跨膜结构域。
124.如实施方式104至123中任一项所述的多核苷酸，其中：
该第二CAR的跨膜结构域是或包含来自人CD28的跨膜结构域；和/或
该第二CAR的跨膜结构域是或包含SEQ ID NO:18中所示的氨基酸序列或与SEQ IDNO:18具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。
125.如实施方式124所述的多核苷酸，其中该第二CAR的跨膜结构域是或含有SEQID NO:18中所示的序列。
126.如实施方式104至125中任一项所述的多核苷酸，其中该第二CAR的细胞内信号转导区包含细胞内信号转导结构域。
127.如实施方式126所述的多核苷酸，其中该第二CAR的细胞内信号转导结构域能够在T细胞中诱导初级活化信号，是T细胞受体(TCR)组分和/或含有免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)。
128.如实施方式126或实施方式127所述的多核苷酸，其中该第二CAR的细胞内信号转导结构域是或包含CD3-zeta(CD3ζ)链或其功能变体或信号转导部分、任选为人CD3ζ链的细胞质信号转导结构域。
129.如实施方式126至128中任一项所述的多核苷酸，其中该第二CAR的细胞内信号转导结构域包含SEQ ID NO:20中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:20具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。
130.如实施方式126至129中任一项所述的多核苷酸，其中该第二CAR的细胞内信号转导区进一步包含共刺激信号转导区。
131.如实施方式130所述的多核苷酸，其中该第二CAR的共刺激信号转导区含有T细胞共刺激分子或其信号转导部分的细胞内信号转导结构域。
132.如实施方式130或实施方式131所述的多核苷酸，其中该第二CAR的共刺激信号转导区包含CD28、4-1BB或ICOS，或其信号转导部分，任选人CD28、人4-1BB或人ICOS的细胞内信号转导结构域。
133.如实施方式98至132中任一项所述的多核苷酸，其中该第一嵌合抗原受体和该第二嵌合抗原受体中的至少一种包括含4-1BB或其信号转导部分，任选人4-1BB的细胞内信号转导结构域的细胞内信号转导区。
134.如实施方式130至132中任一项所述的多核苷酸，其中该第二CAR的共刺激信号转导区包含：
人CD28的细胞内信号转导结构域；和/或
SEQ ID NO:46中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:46具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。
135.如实施方式130至133中任一项所述的多核苷酸，其中该共刺激信号转导区包含：
人4-1BB的细胞内信号转导结构域；和/或
SEQ ID NO:19中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:19具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。
136.如实施方式104至135中任一项所述的多核苷酸，其中该第二嵌合抗原受体自其N末端至C末端依序含有：细胞外抗原结合结构域、间隔子、跨膜结构域和细胞内信号转导区。
137.如实施方式79至97中任一项所述的多核苷酸，其中编码CAR的核苷酸序列可操作地连接至启动子以在由引入该多核苷酸的细胞表达时控制编码的CAR的表达，任选其中该启动子是异源启动子，任选其中该异源启动子是或含有人类延伸因子1α(EF1α)启动子或MND启动子或其变体。
138.如实施方式98至136中任一项所述的多核苷酸，其中编码第一CAR的核苷酸序列可操作地连接至第一启动子以在由引入多核苷酸的细胞表达时控制该第一CAR的表达，且编码第二CAR的核苷酸序列可操作地连接至第二启动子以在由引入多核苷酸的细胞表达时控制该第二CAR的表达，任选其中第一启动子和第二启动子独立地为异源启动子，任选其中该异源启动子是或含有人类延伸因子1α(EF1α)启动子或MND启动子或其变体。
139.如实施方式138所述的多核苷酸，其中第一启动子与第二启动子相同。
140.如实施方式138所述的多核苷酸，第一启动子与第二启动子不同。
141.一种多核苷酸，其包含：
(i)编码第一嵌合抗原受体(CAR)的第一核酸序列，该第一CAR包含第一抗原结合结构域；和
(ii)编码第二嵌合抗原受体(CAR)的第二核酸序列，该第二CAR包含第二抗原结合结构域；
其中该第一CAR和该第二CAR各自包含以下：(a)该第一抗原结合结构域或该第二抗原结合结构域、(b)间隔子、(c)跨膜结构域和(d)包含细胞内信号转导结构域和共刺激信号转导区的细胞内信号转导区；
其中该第一CAR中(b)至(d)中的一个或多个与该第二CAR中(b)至(d)中相同的一个或多个包含一致氨基酸序列；且
其中编码该第一CAR中(b)至(d)中该一个或多个的核苷酸序列在序列方面不同于编码该第二CAR中(b)至(d)中该相同的一个或多个的核苷酸序列。
142.实施方式141所述的多核苷酸，其中第一结合结构域与第二抗原结合结构域结合至相同抗原。
143.实施方式141或实施方式142所述的多核苷酸，其中第一结合结构域与第二抗原结合结构域结合相同抗原的不同抗原决定簇。
144.实施方式141所述的多核苷酸，其中第一结合结构与第二抗原结合结构域结合至不同抗原。
145.实施方式141至144中任一项所述的多核苷酸，其中第一抗原结合结构域结合由疾病或病况的细胞表达或与疾病或病况的细胞相关的第一抗原且第二抗原结合结构域结合由相同疾病或病况的细胞表达或与相同疾病或病况的细胞相关的第二抗原。
146.实施方式145所述的多核苷酸，其中该疾病或病况是癌症。
147.实施方式146所述的多核苷酸，其中该疾病或病况是表达GPRC5D的癌症或表达BCMA的癌症。
148.实施方式146或实施方式147所述的多核苷酸，其中该癌症是浆细胞恶性病，且该浆细胞恶性病是多发性骨髓瘤(MM)或浆细胞瘤。
149.实施方式146至148中任一项所述的多核苷酸，其中癌症是多发性骨髓瘤。
150.实施方式146至149中任一项所述的多核苷酸，其中癌症是复发性/难治性多发性骨髓瘤。
151.实施方式141至150中任一项所述的多核苷酸，其中第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域独立地结合至选自由以下组成的群组的抗原：GPRC5D、BCMA、CD38、CD138、CS-1、BAFF-R、TACI和FcRH5。
152.实施方式141至151中任一项所述的多核苷酸，其中第一抗原结合结构域结合至B细胞成熟抗原(BCMA)。
153.实施方式141至151中任一项所述的多核苷酸，其中第一抗原结合结构域结合至G蛋白偶合受体C类5族成员D(GPRC5D)。
154.实施方式152或实施方式153所述的多核苷酸，其中第二抗原结合结构域结合至BCMA。
155.实施方式152或实施方式153所述的多核苷酸，其中第二抗原结合结构域结合至GPRC5D。
156.一种多核苷酸，其包含：
(i)编码第一嵌合抗原受体(CAR)的第一核酸序列，该第一CAR包含能够结合至GPRC5D或BCMA的一的第一抗原结合结构域和
(ii)编码第二嵌合抗原受体(CAR)的第二核酸序列，该第二CAR包含能够结合至GPRC5D或BCMA中的另一个的第二抗原结合结构域；
其中该第一CAR和该第二CAR各自包含以下：(a)该第一抗原结合结构域或该第二抗原结合结构域、(b)间隔子、(c)跨膜结构域和(d)包含细胞内信号转导结构域和共刺激信号转导区的细胞内信号转导区；
其中该第一CAR中(b)至(d)中的一个或多个与该第二CAR中(b)至(d)中相同的一个或多个包含一致氨基酸序列；且
其中编码该第一CAR中(b)至(d)中该一个或多个的核苷酸序列在序列方面不同于编码该第二CAR中(b)至(d)中该相同的一个或多个的核苷酸序列。
157.实施方式141至156中任一项所述的多核苷酸，其中(b)至(d)中的一个或多个是(b)至(d)之一。
158.实施方式141至156中任一项所述的多核苷酸，其中(b)至(d)中的一个或多个是(b)至(d)中的两个。
159.实施方式141至156中任一项所述的多核苷酸，其中(b)至(d)中的一个或多个是(b)至(d)中的每一个。
160.实施方式141至159中任一项所述的多核苷酸，其中：
编码第一CAR中(b)至(d)中的一个或多个的核苷酸序列和编码第二CAR中(b)至(d)中相同的一个或多个的核苷酸序列包含不超过约20个序列同源的连续碱基对；和/或
编码第一CAR的第一核酸序列该编码第二CAR的第二核酸序列含有不超过约20个序列同源的连续碱基对。
161.实施方式141至160中任一项所述的多核苷酸，其中：
编码第一CAR中(b)至(d)中的一个或多个的核苷酸序列和编码第二CAR中(b)至(d)中相同的一个或多个的核苷酸序列含有不超过在约5个与约15个之间的序列同源的连续碱基对；和/或
编码第一CAR的第一核酸序列该编码第二CAR的第二核酸序列含有不超过在约5个与约15个之间的序列同源的连续碱基对。
162.实施方式141至161中任一项所述的多核苷酸，其中：
编码第一CAR中(b)至(d)中的一个或多个的核苷酸序列和编码第二CAR中(b)至(d)中相同的一个或多个的核苷酸序列含有不超过约10个序列同源的连续碱基对；和/或
编码第一CAR的第一核酸序列该编码第二CAR的第二核酸序列含有不超过约10个序列同源的连续碱基对。
163.实施方式141至162中任一项所述的多核苷酸，其中编码第一CAR的第一核酸和编码第二CAR的第二核酸由编码多顺反子组件的核苷酸序列分隔开，任选其中该多顺反子组件双顺反子组件。
164.实施方式163所述的多核苷酸，其中该多顺反子组件是IRES或是核糖体跳跃序列或自裂解肽。
165.实施方式164所述的多核苷酸，其中多顺反子组件是核糖体跳跃序列或自裂解肽且该核糖体跳跃序列或自裂解肽是T2A、P2A、E2A或F2A组件。
166.实施方式141至165中任一项所述的多核苷酸，其编码第一CAR的第一核酸序列经密码子优化以用于在人类细胞中表达。
167.实施方式141至166中任一项所述的多核苷酸，其中编码第二CAR的第二核酸序列经密码子优化以用于在人类细胞中表达。
168.实施方式141至167中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸经密码子优化以用于在人类细胞中表达。
169.实施方式141至168中任一项所述的多核苷酸，其中在人类细胞，任选在人T细胞中转录该多核苷酸之后，由该多核苷酸转录的、任选的信使RNA展现至少约70％、75％、80％、85％、90％或95％RNA均质性。
170.实施方式141-169中任一项所述的多核苷酸，其中在人类细胞，任选在人T细胞中转录编码该多核苷酸的第一CAR的第一核酸之后，由该第一核酸转录的mRNA、任选为信使RNA展现至少约70％、75％、80％、85％、90％或95％RNA均质性。
171.实施方式141至170中任一项所述的多核苷酸，其中在人类细胞，任选在人T细胞中转录编码该多核苷酸的第二CAR的第二核酸之后，由该第二核酸转录的mRNA、任选为信使RNA展现至少约70％、75％、80％、85％、90％或95％RNA均质性。
172.实施方式141至171中任一项所述的多核苷酸，
其中编码第一CAR的第一核酸中存在的任何潜在剪接供体和/或剪接受体位点展现的剪接预测分数是约或至少约低于0.70分、0.65分、0.60分、0.55分、0.50分、0.45分、0.40分、0.35分、0.30分、0.25分、0.20分和/或涉及剪接事件的概率预测为小于70％、小于65％、小于60％、小于55％、小于50％、小于45％、小于40％、小于35％、小于30％、小于25％或小于20％。
173.实施方式141至172中任一项所述的多核苷酸，
其中编码第二CAR的第二核酸中存在的任何潜在剪接供体或受体位点展现的剪接预测分数是约或至少约低于0.70分、0.65分、0.60分、0.55分、0.50分、0.45分、0.40分、0.35分、0.30分、0.25分、0.20分和/或涉及剪接事件的概率预测为小于70％、小于65％、小于60％、小于55％、小于50％、小于45％、小于40％、小于35％、小于30％、小于25％或小于20％。
174.实施方式141至173中任一项所述的多核苷酸，其中该多核苷酸中的任何潜在剪接供体或受体位点展现的剪接预测分数是约或至少约低于0.70分、0.65分、0.60分、0.55分、0.50分、0.45分、0.40分、0.35分、0.30分、0.25分、0.20分和/或涉及剪接事件的概率预测为小于70％、小于65％、小于60％、小于55％、小于50％、小于45％、小于40％、小于35％、小于30％、小于25％或小于20％。
175.实施方式141至174中任一项所述的多核苷酸，其中(a)的第一抗原结合结构域和/或第二抗原结合结构域是单链抗体片段。
176.实施方式141至175中任一项所述的多核苷酸，其中(a)的第一抗原结合结构域和/或第二抗原结合结构域是或含有单链可变片段(scFv)。
177.实施方式141至176中任一项所述的多核苷酸，其中(a)的第一抗原结合结构域和/或第二抗原结合结构域含有重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区。
178.实施方式141至177中任一项所述的多核苷酸，其中第一抗原结合结构域或该第二抗原结合结构域之一含有：VH区，其含有如SEQ ID NO:209中所示的CDR-H1、如SEQ IDNO:210中所示的CDR-H2和如SEQ ID NO:211中所示的CDR-H3；和VL区，其含有如SEQ ID NO:230中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO:231中所示的CDR-L2和如SEQ ID NO:232中所示的CDR-L3。
179.实施方式141至178中任一项所述的多核苷酸，其中第一抗原结合结构域或第二抗原结合结构域之一包括分别含SEQ ID NO:197和198中所示的氨基酸序列的VH区和VL区。
180.实施方式141至179中任一项所述的多核苷酸，其中第一抗原结合结构域或第二抗原结合结构域之一含有SEQ ID NO:241中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:241展现至少或至少约90％、至少约或约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。
181.实施方式141至180中任一项所述的多核苷酸，其中第一抗原结合结构域或该第二抗原结合结构域之一含有：VH区，其含有如SEQ ID NO:125中所示的CDR-H1、如SEQ IDNO:126中所示的CDR-H2和如SEQ ID NO:127中所示的CDR-H3；和VL区，其含有如SEQ ID NO:130中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO:131中所示的CDR-L2和如SEQ ID NO:132中所示的CDR-L3。
182.实施方式141至181中任一项所述的多核苷酸，其中第一抗原结合结构域或第二抗原结合结构域之一包括分别含SEQ ID NO:27和28中所示的氨基酸序列的VH区和VL区。
183.实施方式141至182中任一项所述的多核苷酸，其中第一抗原结合结构域或第二抗原结合结构域之一含有SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:8展现至少或至少约90％、至少约或约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。
184.实施方式141至183中任一项所述的多核苷酸，其中：
第一抗原结合结构域或第二抗原结合结构域之一含有：VH区，其含有如SEQ IDNO:209中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO:210中所示的CDR-H2和如SEQ ID NO:211中所示的CDR-H3；和VL区，其含有如SEQ ID NO:230中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO:231中所示的CDR-L2和如SEQ ID NO:232中所示的CDR-L3；且
第一抗原结合结构域或第二抗原结合结构域中的另一个含有VH区，其含有如SEQID NO:125中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO:126中所示的CDR-H2和如SEQ ID NO:127中所示的CDR-H3；和VL区，其含有如SEQ ID NO:130中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO:131中所示的CDR-L2和如SEQ ID NO:132中所示的CDR-L3。
185.实施方式141至184中任一项所述的多核苷酸，其中：
第一抗原结合结构域或第二抗原结合结构域之一包括分别含SEQ ID NO:197和198中所示的氨基酸序列的VH区和VL区；且
第一抗原结合结构域或第二抗原结合结构域中的另一个包括分别含SEQ ID NO:27和28中所示的氨基酸序列的VH区和VL区。
186.实施方式141至185中任一项所述的多核苷酸，其中第一抗原结合结构域或第二抗原结合结构域该含有SEQ ID NO:241中所示的氨基酸序列且第一抗原结合结构域或第二抗原结合结构域中的另一个含有SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列。
187.实施方式141至186中任一项所述的多核苷酸，其中第一抗原结合结构域或第二抗原结合结构域之一由SEQ ID NO:310中所示的核苷酸序列编码。
188.实施方式141至187中任一项所述的多核苷酸，其中一抗原结合结构域或第二抗原结合结构域之一由SEQ ID NO:264或SEQ ID NO:311中所示的核苷酸序列编码。
189.实施方式141至188中任一项所述的多核苷酸，其中第一抗原结合结构域或第二抗原结合结构域由SEQ ID NO:310中所示的核苷酸序列编码，且第一抗原结合结构域或第二抗原结合结构域中的另一个由SEQ ID NO:311中所示的核苷酸序列编码。
190.实施方式141至189中任一项所述的多核苷酸，其中(b)含有免疫球蛋白的一部分。
191.实施方式141至190中任一项所述的多核苷酸，其中(b)含有铰链区、CH2区和CH3区的序列。
192.实施方式191所述的多核苷酸，其中：
铰链区含有IgG4铰链区和/或IgG2铰链区的全部或一部分，其中该IgG4铰链区任选为人IgG4铰链区且该IgG2铰链区任选为人IgG2铰链区；
CH2区含有IgG4 CH2和/或IgG2 CH2的全部或一部分，其中该IgG4 CH2任选为人IgG4 CH2且该IgG2 CH2任选为人IgG2 CH2；和/或
CH3区含有IgG4 CH3和/或IgG2 CH3的全部或一部分，其中该IgG4 CH3任选为人IgG4 CH3且该IgG2 CH3任选为人IgG2 CH3。
193.实施方式191或实施方式192所述的多核苷酸，其中铰链区、CH2和CH3含有来自人IgG4的铰链的全部或一部分、CH2的全部或一部分和CH3的全部或一部分。
194.实施方式191或实施方式193所述的多核苷酸，其中铰链区、CH2和CH3中的一个或多个是嵌合的且含有来自人IgG4和人IgG2的铰链、CH2和CH3。
195.实施方式141至194中任一项所述的多核苷酸，(b)含有IgG4/2嵌合铰链区，或相较于人IgG4铰链含有至少一个氨基酸置换的经修饰的IgG4铰链区；IgG2/4嵌合CH2区；和IgG4 CH3区。
196.实施方式141至195中任一项所述的多核苷酸，其中(b)的长度是自或自约125至300个氨基酸、125至250个氨基酸、125至230个氨基酸、125至200个氨基酸、125至180个氨基酸、125至150个氨基酸、150至300个氨基酸、150至250个氨基酸、150至230个氨基酸、150至200个氨基酸、150至180个氨基酸、180至300个氨基酸、180至250个氨基酸、180至230个氨基酸、180至200个氨基酸、200至300个氨基酸、200至250个氨基酸、200至230个氨基酸、230至300个氨基酸、230至250个氨基酸、或250至300个氨基酸，任选其中该间隔子的长度是至少或至少约224个、至少或至少约225个、至少或至少约226个、至少或至少约227个、至少或至少约228个、或至少或至少约229个氨基酸。
197.实施方式141至196中任一项所述的多核苷酸，其中(b)是或含有SEQ ID NO:17中所示的氨基酸序列。
198.实施方式141至197中任一项所述的多核苷酸，其中第一CAR或第二CAR的一中的(b)由SEQ ID NO:48中所示的核苷酸序列编码，且第一CAR或第二CAR中的另一个中的(b)由SEQ ID NO:305中所示的核苷酸序列编码。
199.实施方式141至198中任一项所述的多核苷酸，其中(c)是或含有CD4、CD28或CD8的跨膜结构域，任选来自人CD4、人CD28或人CD8的跨膜结构域。
200.实施方式141至199中任一项所述的多核苷酸，其中(c)是或含有人CD28跨膜结构域。
201.实施方式141至200中任一项所述的多核苷酸，其中(c)是或含有SEQ ID NO:18中所示的氨基酸序列。
202.实施方式141至201中任一项所述的多核苷酸，其中第一CAR或第二CAR的一中的(c)由SEQ ID NO:56中所示的核苷酸序列编码，且第一CAR或第二CAR中的另一个中的(c)由SEQ ID NO:307中所示的核苷酸序列编码。
203.实施方式141至202中任一项所述的多核苷酸，其中(d)的细胞内信号转导结构域能够在T细胞中诱导初级活化信号，是T细胞受体(TCR)组分和/或含有免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)。
204.实施方式141至203中任一项所述的多核苷酸，其中(d)的细胞内信号转导结构域是或含有CD3-zeta(CD3ζ)链或其功能变体或信号转导部分、任选为人CD3ζ链的细胞质信号转导结构域。
205.实施方式141至204中任一项所述的多核苷酸，其中(d)的细胞内信号转导结构域是或含有SEQ ID NO:20中所示的氨基酸序列。
206.实施方式141至205中任一项所述的多核苷酸，其中第一CAR或第二CAR之一的(d)的细胞内信号转导结构域由SEQ ID NO:58中所示的核苷酸序列编码且第一CAR或第二CAR中的另一个中的(d)的细胞内信号转导结构域由SEQ ID NO:309中所示的核苷酸序列编码。
207.实施方式141至206中任一项所述的多核苷酸，其中(d)的共刺激信号转导区含有T细胞共刺激分子或其信号转导部分的细胞内信号转导结构域。
208.实施方式141至207中任一项所述的多核苷酸，其中(d)的共刺激信号转导区含有CD28、4-1BB或ICOS或其信号转导部分，任选人CD28、人4-1BB或人ICOS的细胞内信号转导结构域。
209.实施方式141至208中任一项所述的多核苷酸，其中(d)的共刺激信号转导区含有4-1BB的细胞内信号转导结构域。
210.实施方式141至209中任一项所述的多核苷酸，其中(d)的共刺激信号转导区是或含有SEQ ID NO:19中所示的氨基酸序列。
211.实施方式141至210中任一项所述的多核苷酸，其中第一CAR或第二CAR的一中的(d)的共刺激信号转导区由SEQ ID NO:60中所示的核苷酸序列编码且第一CAR或第二CAR中的另一个中的(d)的共刺激信号转导区由SEQ ID NO:308中所示的核苷酸序列编码。
212.实施方式141至211中任一项所述的多核苷酸，其中：
第一CAR或第二CAR中的一种含有(a)结合至GPRC5D的第一抗原结合结构域，任选其中该第一抗原结合结构域由SEQ ID NO:311中所示的核苷酸序列编码；(b)由SEQ ID NO:305中所示的核苷酸编码的间隔子；(c)由SEQ ID NO:307中所示的核苷酸序列编码的跨膜结构域；和(d)含有由SEQ ID NO:309中所示的核苷酸序列编码的细胞内信号转导结构域和由SEQ ID NO:308中所示的核苷酸序列编码的共刺激信号转导区的细胞内信号转导区；
第一CAR该第二CAR中的另一种含有(a)结合至BCMA的抗原结合结构域，任选其中该抗原结合结构域由SEQ ID NO:310中所示的核苷酸序列编码；(b)由SEQ ID NO:48中所示的核苷酸编码的间隔子；(c)由SEQ ID NO:56中所示的核苷酸序列编码的跨膜结构域；和(d)含有由SEQ ID NO:58中所示的核苷酸序列编码的细胞内信号转导结构域和由SEQ IDNO:60中所示的核苷酸序列编码的共刺激信号转导结构域区的细胞内信号转导区。
213.实施方式141至212中任一项所述的多核苷酸，其中编码第一CAR的第一核酸序列相对于编码第一CAR的第二核酸序列位于该多核苷酸的5'端。
214.实施方式141至213中任一项所述的多核苷酸，其中第一CAR含有结合至GPRC5D的抗原结合结构域且第二CAR含有结合至BCMA的抗原结合结构域。
215.实施方式141至213中任一项所述的多核苷酸，其中第一CAR含有结合至BCMA的抗原结合结构域且第二CAR含有结合至GPRC5D的抗原结合结构域。
216.一种多核苷酸，其包含(i)编码第一嵌合抗原受体(CAR)的第一核酸序列、(ii)编码第二嵌合抗原受体(CAR)的第二核酸序列和(iii)编码多顺反子组件的核苷酸序列，其中编码该第一CAR的第一核酸和编码该第二CAR的第二核酸通过该多顺反子组件分隔开；
其中该第一CAR包含结合至GPRC5D的第一抗原结合结构域，任选其中该第一抗原结合结构域由SEQ ID NO:311中所示的核苷酸序列编码；由SEQ ID NO:305中所示的核苷酸编码的间隔子；由SEQ ID NO:307中所示的核苷酸序列编码的跨膜结构域；以及包含由SEQID NO:309中所示的核苷酸序列编码的细胞内信号转导结构域和由SEQ ID NO:308中所示的核苷酸序列编码的共刺激信号转导区的细胞内信号转导区；
其中该第二CAR包含结合至BCMA的第二抗原结合结构域，任选其中该第二抗原结合结构域由SEQ ID NO:310中所示的核苷酸序列编码；由SEQ ID NO:74中所示的核苷酸编码的间隔子；由SEQ ID NO:56中所示的核苷酸序列编码的跨膜结构域；以及包含由SEQ IDNO:58中所示的核苷酸序列编码的细胞内信号转导结构域和由SEQ ID NO:60中所示的核苷酸序列编码的共刺激信号转导结构域区的细胞内信号转导区；
且其中编码该第一CAR的第一核酸序列相对于编码该第二CAR的第二核酸序列位于该多核苷酸的5'端。
217.一种多核苷酸，其包含(i)编码第一嵌合抗原受体(CAR)的第一核酸序列、(ii)编码第二嵌合抗原受体(CAR)的第二核酸序列和(iii)编码多顺反子组件的核苷酸序列，其中编码该第一CAR的第一核酸和编码该第二CAR的第二核酸通过该多顺反子组件分隔开；
其中该第一CAR包含结合至BCMA的第一抗原结合结构域，任选其中该第一抗原结合结构域由SEQ ID NO:310中所示的核苷酸序列编码；由SEQ ID NO:74中所示的核苷酸编码的间隔子；由SEQ ID NO:56中所示的核苷酸序列编码的跨膜结构域；以及包含由SEQ IDNO:58中所示的核苷酸序列编码的细胞内信号转导结构域和由SEQ ID NO:60中所示的核苷酸序列编码的共刺激信号转导结构域区的细胞内信号转导区；
其中该第二CAR包含结合至GPRC5D的第二抗原结合结构域，任选其中该第二抗原结合结构域由SEQ ID NO:311中所示的核苷酸序列编码；由SEQ ID NO:305中所示的核苷酸编码的间隔子；由SEQ ID NO:307中所示的核苷酸序列编码的跨膜结构域；以及包含由SEQID NO:309中所示的核苷酸序列编码的细胞内信号转导结构域和由SEQ ID NO:308中所示的核苷酸序列编码的共刺激信号转导区的细胞内信号转导区；
且其中相对于编码该第二CAR的第二核酸序列，编码该第一CAR的第一核酸序列位于该多核苷酸的5'端。
218.实施方式163至217中任一项所述的多核苷酸，其中该多顺反子组件含有SEQID NO:37中所示的氨基酸序列。
219.实施方式163至218中任一项所述的多核苷酸，其中该多顺反子组件由SEQ IDNO:44或SEQ ID NO:45中所示的核苷酸序列编码。
220.实施方式141至75和217至219中任一项所述的多核苷酸，该多核苷酸含有SEQID NO:299中所示的核苷酸序列。
221.实施方式141至215和217至219中任一项所述的多核苷酸，该多核苷酸编码SEQ ID NO:298中所示的序列。
222.实施方式141至216、218和219中任一项所述的多核苷酸，该多核苷酸含有SEQID NO:302中所示的核苷酸序列。
223.实施方式141至216、218、219和222中任一项所述的多核苷酸，该多核苷酸编码SEQ ID NO:301中所示的序列。
224.一种载体，其包含如实施方式79至223中任一项所述的多核苷酸。
225.如实施方式224的载体，其是病毒载体。
226.如实施方式225的载体，其中病毒载体是慢病毒载体或逆转录病毒载体
227.一种细胞，其包含如实施方式1至78中任一项所述的嵌合抗原受体。
228.如实施方式114的细胞，其中该嵌合抗原受体是第一嵌合受体且该细胞进一步包括含编码第二嵌合抗原受体的核苷酸的多核苷酸。
229.一种细胞，其包含如实施方式79至223中任一项所述的多核苷酸。
230.一种细胞，其包含如实施方式79至97中任一项所述的多核苷酸，该多核苷酸是第一多核苷酸，且该细胞包括含编码第二嵌合抗原受体(CAR)的核苷酸序列的第二多核苷酸。
231.如实施方式228或实施方式230所述的细胞，其中该第二嵌合抗原受体(CAR)包含特异性结合多发性骨髓瘤上表达或与多发性骨髓瘤相关的第二抗原的细胞外抗原结合结构域。
232.如实施方式231的细胞，其中该第二CAR进一步包含间隔子、跨膜结构域和细胞内信号转导区。
233.如实施方式231或实施方式232的细胞，其中该第二抗原选自B细胞成熟抗原(BCMA)、CD38、CD138、CS-1、BAFF-R、TACI和FcRH5。
234.如实施方式231至233中任一项所述的细胞，其中该第二抗原是BCMA。
235.如实施方式142至234中任一项所述的细胞，其中该第二CAR包含：
(1)特异性结合BCMA的细胞外抗原结合结构域，其中该细胞外抗原结合结构域包含：
(i)重链可变(VH)区，其包含与SEQ ID NO:189、191、193、195或197中所示的氨基酸序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列；和
(ii)轻链可变(VL)区，其包含与SEQ ID NO:190、192、194、196或198中所示的氨基酸序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列；
(2)间隔子，任选为包含IgG4/2嵌合铰链或经修饰的IgG4铰链；IgG2/4嵌合CH2区；和IgG4 CH3区的间隔子，任选地其长度是或是约228个氨基酸，或SEQ ID NO:17中所示的间隔子；
(3)跨膜结构域；和
(4)细胞内信号转导区。
236.如实施方式235的细胞，其中该VH区包含SEQ ID NO:189、191、193、195或197中所示的VH区氨基酸序列内所包含的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；且该VL区包含SEQ ID NO:190、192、194、196或198中所示的VL区氨基酸序列内所包含的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
237.如实施方式231至234中任一项所述的细胞，其中该第二CAR包含：
(1)特异性结合BCMA的细胞外抗原结合结构域，其中该细胞外抗原结合结构域包含：
(i)重链可变(VH)区，其包括含SEQ ID NO:199、202、206、209、212或215中所示的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR-H1)；(b)含SEQ ID NO:200、203、207、210、213或216中所示的氨基酸序列的重链互补决定区2(CDR-H2)；和(c)含SEQ ID NO:201、204、205、208、211、214或217中所示的氨基酸序列的重链互补决定区3(CDR-H3)；和
(ii)轻链可变(VL)区，其包括含SEQ ID NO:218、221、224、227、230、233或235中所示的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR-L1)；(b)含SEQ ID NO:219、222、225、228、231、234或236中所示的氨基酸序列的轻链互补决定区2(CDR-L2)；和(c)含SEQ ID NO:220、223、226、229或232中所示的氨基酸序列的轻链互补决定区3(CDR-L3)；
(2)间隔子，任选为包含IgG4/2嵌合铰链或经修饰的IgG4铰链；IgG2/4嵌合CH2区；和IgG4 CH3区的间隔子，任选地其长度为约228个氨基酸，或SEQ ID NO:17中所示的间隔子；
(3)跨膜结构域；和
(4)细胞内信号转导区。
238.如实施方式228至237中任一项所述的细胞，其中：
该第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:199、200和201的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:218、219和220的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；
该第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:202、203、204的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:221、222和223的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；
该第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:199、200、205的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:224、225和226的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；
该第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:206、207、208的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:227、228和229的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；
该第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:209、210和211的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:230、231和232的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；
该第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:212、213和214的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:233、234和229的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；或
该第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:215、216和217的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:235、236和232的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
239.如实施方式235至238中任一项所述的细胞，其中：
该第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:209、210和211的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:230、231和232的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；或
该第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:215、216和217的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:235、236和232的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
240.如实施方式235至239中任一项所述的细胞，其中：
该第二CAR的VH区和VL区包含(a)分别如SEQ ID NO:189和SEQ ID NO:190中所示的氨基酸序列，或(b)与SEQ ID NO:189具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列和与SEQ ID NO:190具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列；
该第二CAR的VH区和VL区包含(a)分别如SEQ ID NO:191和SEQ ID NO:192中所示的氨基酸序列，或(b)与SEQ ID NO:191具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列和与SEQ ID NO:192具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列；
该第二CAR的VH区和VL区包含(a)分别如SEQ ID NO:193和SEQ ID NO:194中所示的氨基酸序列，或(b)与SEQ ID NO:193具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列和与SEQ ID NO:194具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列；
该第二CAR的VH区和VL区包含(a)分别如SEQ ID NO:195和SEQ ID NO:196中所示的氨基酸序列，或(b)与SEQ ID NO:195具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列和与SEQ ID NO:196具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列；或
该第二CAR的VH区和VL区包含(a)分别如SEQ ID NO:197和SEQ ID NO:198中所示的氨基酸序列，或(b)与SEQ ID NO:197具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列和与SEQ ID NO:198具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。
250.如实施方式235至249中任一项所述的细胞，其中：
该第二CAR的VH区和VL区分别包含SEQ ID NO:189和SEQ ID NO:190中所示的氨基酸序列；
该第二CAR的VH区和VL区包含SEQ ID NO:191和SEQ ID NO:192中所示的氨基酸序列；
该第二CAR的VH区和VL区包含SEQ ID NO:193和SEQ ID NO:194中所示的氨基酸序列；
该第二CAR的VH区和VL区包含SEQ ID NO:195和SEQ ID NO:196中所示的氨基酸序列；或
该第二CAR的VH区和VL区分别包含SEQ ID NO:197和SEQ ID NO:198中所示的氨基酸序列。
251.如实施方式231至250中任一项所述的细胞，其中编码的第二CAR的细胞外抗原结合结构域是单链抗体片段。
252.如实施方式251所述的细胞，其中该单链抗体片段是或含有单链可变片段(scFv)。
253.如实施方式235至252中任一项所述的细胞，其中该第二CAR的VH区和VL区通过柔性连接物接合。
254.如实施方式253所述的细胞，其中该第二CAR的连接物包括氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:52)。
255.如实施方式235至254中任一项所述的细胞，其中该第二CAR的VH区在该第二CAR的VL区的氨基末端。
256.如实施方式231至256中任一项所述的细胞，其中该第二CAR的VH区在该第二CAR的VL区的羧基末端。
257.如实施方式231至256中任一项所述的细胞，其中该抗原结合结构域包含选自SEQ ID NO:237、238、239、240和241的氨基酸序列或与选自SEQ ID NO:237、238、239、240和241的氨基酸序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。
258.如实施方式231至257中任一项所述的细胞，其中该抗原结合结构域包含选自SEQ ID NO:237、238、239、240和241的氨基酸序列。
259.如实施方式235至258中任一项所述的细胞，其中：
该第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:209、210和211的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:230、231和232的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；或该第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:215、216和217的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:235、236和232的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；和/或
该第二CAR的VH区和VL区分别包含SEQ ID NO:197和SEQ ID NO:198中所示的氨基酸序列；和/或
该抗原结合结构域包含SEQ ID NO:241中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:241中所示的序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。
260.如实施方式231至259中任一项所述的细胞，其中该第二CAR的跨膜结构域是或包含来自CD4、CD28或CD8，任选来自人CD4、人CD28或人CD8的跨膜结构域。
260.如实施方式232至259中任一项所述的细胞，其中：
该第二CAR的跨膜结构域是或包含来自人CD28的跨膜结构域；和/或
该第二CAR的跨膜结构域是或包含SEQ ID NO:18中所示的氨基酸序列或与SEQ IDNO:18中所示的序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。
261.如实施方式260所述的细胞，其中该第二CAR的跨膜结构域是或包含SEQ IDNO:18中所示的序列。
262.如实施方式232至261中任一项所述的细胞，其中该第二CAR的细胞内信号转导区包含细胞内信号转导结构域。
263.如实施方式262所述的细胞，其中该细胞内信号转导结构域能够在T细胞中诱导初级活化信号，是T细胞受体(TCR)组分和/或含有免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)。
264.如实施方式262或实施方式263所述的细胞，其中该细胞内信号转导结构域是或包含CD3-zeta(CD3ζ)链或其功能变体或信号转导部分、任选为人CD3ζ链的细胞质信号转导结构域。
265.如实施方式262至264中任一项所述的细胞，其中该细胞内信号转导区包含SEQ ID NO:20中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:20中所示的序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。
266.如实施方式262至264中任一项所述的细胞，其中该细胞内信号转导区进一步包含共刺激信号转导区。
267.如实施方式266所述的细胞，其中该共刺激信号转导区含有T细胞共刺激分子或其信号转导部分的细胞内信号转导结构域。
268.如实施方式266或实施方式267所述的细胞，其中该共刺激信号转导区包含CD28、4-1BB或ICOS，或其信号转导部分，任选人CD28、人4-1BB或人ICOS的细胞内信号转导结构域。
269.如实施方式266至268中任一项所述的细胞，其中该共刺激信号转导区包含：
人CD28的细胞内信号转导结构域；和/或
SEQ ID NO:46中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:46中所示的序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。
270.如实施方式266至269中任一项所述的细胞，其中该共刺激信号转导区包含：
人4-1BB的细胞内信号转导结构域；和/或
SEQ ID NO:19中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:19中所示的序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。
271.如实施方式228至270中任一项所述的细胞，其中该第二嵌合抗原受体自其N末端至C末端依序含有：抗原结合结构域、间隔子、跨膜结构域和细胞内信号转导区。
272.如实施方式227至271中任一项所述的细胞，其是淋巴细胞。
273.如实施方式272所述的细胞，其是NK细胞或T细胞。
274.如实施方式272或实施方式273所述的细胞，其中该细胞是T细胞，且该T细胞是CD4+或CD8+ T细胞。
275.如实施方式227至274中任一项所述的细胞，其中该细胞是获自受试者的初代细胞。
276.如实施方式227至275中任一项所述的细胞，其中，在复数个细胞之中，该复数个细胞中小于或小于约10％、小于或小于约9％、小于或小于约8％、小于或小于约7％、小于或小于约5％、小于或小于约4％、小于或小于约3％、小于或小于约2％或小于或小于约1％的细胞含有展现进补信号转导和/或抗原非依赖性活性或信号转导的嵌合抗原受体。
277.一种组合物，其包含如实施方式1至78中任一项所述的嵌合抗原受体。
278.一种组合物，其包含如实施方式227至277中任一项所述的细胞或复数个如实施方式227至277中任一项所述的细胞。
279.如实施方式278所述的组合物，其中该组合物包含CD4+和CD8+T细胞，且CD4+T细胞与CD8+ T细胞的比率为约1:3至3:1，任选为约1:2至2:1。
280.一种组合物，其包含：
包含第一嵌合抗原受体的复数个第一细胞，该第一嵌合抗原受体是如实施方式1至78中任一项所述的嵌合抗原受体或由如实施方式79至97中任一项所述的多核苷酸编码；和
包含第二嵌合抗原受体的复数个第二细胞。
281.如实施方式280所述的组合物，其中，在复数个第一细胞之中，该复数个细胞中小于或小于约10％、小于或小于约9％、小于或小于约8％、小于或小于约7％、小于或小于约5％、小于或小于约4％、小于或小于约3％、小于或小于约2％或小于或小于约1％的细胞含有展现进补信号转导和/或抗原非依赖性活性或信号转导的嵌合抗原受体。
282.如实施方式280或实施方式281所述的组合物，其中，在复数个第二细胞之中，该复数个细胞中小于或小于约10％、小于或小于约9％、小于或小于约8％、小于或小于约7％、小于或小于约5％、小于或小于约4％、小于或小于约3％、小于或小于约2％或小于或小于约1％的细胞含有展现进补信号转导和/或抗原非依赖性活性或信号转导的嵌合抗原受体。
283.如实施方式280至282中任一项所述的组合物，其中该第二嵌合受体包含特异性结合多发性骨髓瘤上表达或与多发性骨髓瘤相关的第二抗原的细胞外抗原结合结构域。
284.如实施方式280至283中任一项所述的组合物，其中该第二CAR含有：结合第二抗原的细胞外抗原结合结构域、间隔子、跨膜结构域和细胞内信号转导区。
285.如实施方式283或实施方式284所述的组合物，其中该第二抗原选自B细胞成熟抗原(BCMA)、CD38、CD138、CS-1、BAFF-R、TACI和FcRH5。
286.如实施方式280至285中任一项所述的组合物，其中该第二抗原是BCMA。
287.如实施方式280至286中任一项所述的组合物，其中该第二CAR包含：
(1)特异性结合BCMA的细胞外抗原结合结构域，其中该细胞外抗原结合结构域包含：
(i)重链可变(VH)区，其包含与SEQ ID NO:189、191、193、195或197中所示的氨基酸序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列；和
(ii)轻链可变(VL)区，其包含与SEQ ID NO:190、192、194、196或198中所示的氨基酸序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列；
(2)间隔子，任选为包含IgG4/2嵌合铰链或经修饰的IgG4铰链；IgG2/4嵌合CH2区；和IgG4 CH3区的间隔子，任选地其长度为约228个氨基酸，或SEQ ID NO:17中所示的间隔子；
(3)跨膜结构域；和
(4)细胞内信号转导区。
288.如实施方式287所述的组合物，其中该第二CAR的VH区包含SEQ ID NO:189、191、193、195或197中所示的VH区氨基酸序列内所包含的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；且该VL区包含SEQ ID NO:190、192、194、196或198中所示的VL区氨基酸序列内所包含的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
289.如实施方式280至286中任一项所述的组合物，其中该第二CAR包含：
(1)特异性结合BCMA的细胞外抗原结合结构域，其中该细胞外抗原结合结构域包含：
(i)重链可变(VH)区，其包括含SEQ ID NO:199、202、206、209、212或215中所示的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR-H1)；(b)含SEQ ID NO:200、203、207、210、213或216中所示的氨基酸序列的重链互补决定区2(CDR-H2)；和(c)含SEQ ID NO:201、204、205、208、211、214或217中所示的氨基酸序列的重链互补决定区3(CDR-H3)；和
(ii)轻链可变(VL)区，其包括含SEQ ID NO:218、221、224、227、230、233或235中所示的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR-L1)；(b)含SEQ ID NO:219、222、225、228、231、234或236中所示的氨基酸序列的轻链互补决定区2(CDR-L2)；和(c)含SEQ ID NO:220、223、226、229或232中所示的氨基酸序列的轻链互补决定区3(CDR-L3)；
(2)间隔子，任选为包含IgG4/2嵌合铰链或经修饰的IgG4铰链；IgG2/4嵌合CH2区；和IgG4 CH3区的间隔子，任选地其长度为约228个氨基酸，或SEQ ID NO:17中所示的间隔子；
(3)跨膜结构域；和
(4)细胞内信号转导区。
290.如实施方式286至289中任一项所述的组合物，其中：
该第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:199、200和201的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:218、219和220的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；
该第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:202、203、204的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:221、222和223的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；
该第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:199、200、205的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:224、225和226的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；
该第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:206、207、208的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:227、228和229的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；
该第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:209、210和211的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:230、231和232的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；
该第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:212、213和214的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:233、234和229的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；或
该第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:215、216和217的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:235、236和232的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
291.如实施方式286至290中任一项所述的组合物，其中：
该第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:209、210和211的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:230、231和232的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；或
该第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:215、216和217的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:235、236和232的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
292.如实施方式286至291中任一项所述的组合物，其中：
该第二CAR的VH区和VL区包含(a)分别如SEQ ID NO:189和SEQ ID NO:190中所示的氨基酸序列，或(b)与SEQ ID NO:189具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列和与SEQ ID NO:190具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列；
该第二CAR的VH区和VL区包含(a)分别如SEQ ID NO:191和SEQ ID NO:192中所示的氨基酸序列，或(b)与SEQ ID NO:191具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列和与SEQ ID NO:192具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列；
该第二CAR的VH区和VL区包含(a)分别如SEQ ID NO:193和SEQ ID NO:194中所示的氨基酸序列，或(b)与SEQ ID NO:193具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列和与SEQ ID NO:194具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列；
该第二CAR的VH区和VL区包含(a)分别如SEQ ID NO:195和SEQ ID NO:196中所示的氨基酸序列，或(b)与SEQ ID NO:195具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列和与SEQ ID NO:196具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列；或
该第二CAR的VH区和VL区包含(a)分别如SEQ ID NO:197和SEQ ID NO:198中所示的氨基酸序列，或(b)与SEQ ID NO:197具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列和与SEQ ID NO:198具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。
293.如实施方式286至292中任一项所述的组合物，其中：
该第二CAR的VH区和VL区分别包含SEQ ID NO:189和SEQ ID NO:190中所示的氨基酸序列；
该第二CAR的VH区和VL区包含SEQ ID NO:191和SEQ ID NO:192中所示的氨基酸序列；
该第二CAR的VH区和VL区包含SEQ ID NO:193和SEQ ID NO:194中所示的氨基酸序列；
该第二CAR的VH区和VL区包含SEQ ID NO:195和SEQ ID NO:196中所示的氨基酸序列；或
该第二CAR的VH区和VL区分别包含SEQ ID NO:197和SEQ ID NO:198中所示的氨基酸序列。
294.如实施方式286至293中任一项所述的组合物，其中该第二CAR的细胞外抗原结合结构域是单链抗体片段。
295.如实施方式294所述的组合物，其中该单链抗体片段是或含有单链可变片段(scFv)。
296.如实施方式286至295中任一项所述的组合物，其中该第二CAR的VH区和VL区通过柔性连接物接合。
297.如实施方式296所述的组合物，其中该第二CAR的连接物含有氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:52)。
298.如实施方式286至297中任一项所述的组合物，其中该第二CAR的VH区在该第二CAR的VL区的氨基末端。
299.如实施方式286至298中任一项所述的组合物，其中该第二CAR的VH区在该第二CAR的VL区的羧基末端。
300.如实施方式286至299中任一项所述的组合物，其中该第二CAR的抗原结合结构域包含选自SEQ ID NO:237、238、239、240和241的氨基酸序列或与选自SEQ ID NO:237、238、239、240和241的氨基酸序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。
301.如实施方式286至300中任一项所述的组合物，其中该第二CAR的抗原结合结构域包含选自SEQ ID NO:237、238、239、240和241的氨基酸序列。
302.如实施方式286至301中任一项所述的组合物，其中：
该第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:209、210和211的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:230、231和232的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；或该第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:215、216和217的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:235、236和232的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；和/或
该第二CAR的VH区和VL区分别包含SEQ ID NO:197和SEQ ID NO:198中所示的氨基酸序列；和/或
该第二CAR的抗原结合结构域包含SEQ ID NO:241中所示的氨基酸序列或与SEQID NO:241中所示的序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。
303.如实施方式286至302中任一项所述的组合物，其中该第二CAR的跨膜结构域是或包含来自CD4、CD28或CD8的跨膜结构域，任选为来自人CD4、人CD38或人CD8的跨膜结构域。
304.如实施方式286至303中任一项所述的组合物，其中：
该第二CAR的跨膜结构域是或包含来自人CD28的跨膜结构域；和/或
该第二CAR的跨膜结构域是或包含SEQ ID NO:18中所示的氨基酸序列或与SEQ IDNO:18具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。
305.如实施方式304所述的组合物，其中该第二CAR的跨膜结构域是或包含SEQ IDNO:18中所示的序列。
306.如实施方式286至305中任一项所述的组合物，其中该第二CAR的细胞内信号转导区包含细胞内信号转导结构域。
307.如实施方式306所述的组合物，其中该第二CAR的细胞内信号转导结构域能够在T细胞中诱导初级活化信号，是T细胞受体(TCR)组分和/或含有免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)。
308.如实施方式306或实施方式307所述的组合物，其中该第二CAR的细胞内信号转导结构域是或包含CD3-zeta(CD3ζ)链或其功能变体或信号转导部分、任选为人CD3ζ链的细胞质信号转导结构域。
309.如实施方式306至308中任一项所述的组合物，其中该第二CAR的细胞内信号转导区包含SEQ ID NO:20中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:20具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。
310.如实施方式306至309中任一项所述的组合物，其中该第二CAR的细胞内信号转导区进一步包含共刺激信号转导区。
311.如实施方式310所述的组合物，其中该第二CAR的共刺激信号转导区含有T细胞共刺激分子或其信号转导部分的细胞内信号转导结构域。
312.如实施方式310或实施方式311所述的组合物，其中该第二CAR的共刺激信号转导区包含CD28、4-1BB或ICOS、或其信号转导部分、任选为人CD28、人4-1BB或人ICOS的细胞内信号转导结构域。
313.如实施方式310至312中任一项所述的组合物，其中该第二CAR的共刺激信号转导区包含：
人CD28的细胞内信号转导结构域；和/或
SEQ ID NO:46中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:46中所示的序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。
314.如实施方式280至312中任一项所述的组合物，其中该第一嵌合抗原受体和该第二嵌合抗原受体中的至少一个包含细胞内信号转导区，该细胞内信号转导区包含4-1BB或其信号转导部分、任选为人4-1BB的细胞内信号转导结构域。
315.如实施方式310至312中任一项所述的组合物，其中该第二CAR的共刺激信号转导区包含：
人4-1BB的细胞内信号转导结构域；和/或
SEQ ID NO:19中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:19中所示的序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。
316.如实施方式280至315中任一项所述的组合物，其中编码的第二嵌合抗原受体自其N末端至C末端依序含有：抗原结合结构域、间隔子、跨膜结构域和细胞内信号转导区。
317.如实施方式208至316中任一项所述的组合物，其中该复数个第一细胞包含T细胞，任选其中这些T细胞包含CD4+和CD8+ T细胞，任选其中CD4+ T细胞与CD8+ T细胞的比率为约1:3至3:1，任选为1:2至2:1。
318.如实施方式186至222中任一项所述的组合物，其中该复数个第二细胞包含T细胞，任选其中这些T细胞包含CD4+和CD8+ T细胞，任选其中CD4+ T细胞与CD8+ T细胞的比率为约1:3至3:1，任选为约1:2至2:1。
319.如实施方式208至318中任一项所述的组合物，其中该组合物包含的该第一复数个细胞与该第二复数个细胞的比率为约1:3至3:1，任选为约1:2至2:1，任选为约1:1。
320.如实施方式280至319中任一项所述的组合物，其中该组合物包含表达该第一嵌合抗原受体的该第一复数个细胞和表达该第二嵌合抗原受体的该第二复数个细胞，该第一复数个细胞与该第二复数个细胞的比率为约1:3至3:1，任选为约1:2至2:1，任选为约1:1。
321.如实施方式277至320中任一项所述的组合物，其进一步含有药学上可接受的赋形剂。
322.如实施方式277至321中任一项所述的组合物，其是无菌的。
323.一种药物组合物，其用于治疗疾病或病况，任选为癌症，所述药物组合物包含实施方式227至276中任一项所述的细胞作为活性成分。
324.一种药物组合物，其用于治疗疾病或病况，任选为癌症，所述药物组合物包含实施方式227至322或388中任一项所述的组合物作为活性成分。
325.一种药物组合物，其用于治疗疾病或病况，任选为癌症，所述药物组合物包含以下组合物作为活性成分：包括第一剂量的包含为实施方式1至67中任一项所述的嵌合抗原受体或由实施方式68至79中任一项所述的多核苷酸编码的第一嵌合抗原受体的复数个第一细胞的组合物，和包括第二剂量的复数个包含第二嵌合抗原受体的第二细胞的组合物。
326.一种治疗方法，其包含向患有疾病或病症的受试者给予包含一定剂量如实施方式79至97中任一项所述的细胞的组合物或如实施方式280至325和388中任一项所述的组合物。
327.如实施方式227至276中任一项所述的细胞用于治疗疾病或病况的用途，任选地其中所述疾病或病况是癌症。
328.如实施方式277至322或388中任一项所述的组合物用于治疗疾病或病况的用途，任选地其中所述疾病或病况是癌症。
329.如实施方式227至276中任一项所述的细胞在制备用于治疗疾病或病况的药物中的用途，任选地其中所述疾病或病况是癌症。
330.如实施方式277至322、或388中任一项所述的组合物在制备用于治疗疾病或病况的药物中的用途，任选地其中所述疾病或病况是癌症。
331.如实施方式326至330中任一项所述的方法或用途或如实施方式323至325中任一项所述的用于所述用途的药物组合物，其中该细胞剂量包含在约1.0×107个表达CAR的T细胞与1.2×109个表达CAR的T细胞之间、在约1.0×107个表达CAR的T细胞与6.5×108个表达CAR的T细胞之间、在约1.5×107个表达CAR的T细胞与6.5×108个表达CAR的T细胞之间、在约1.5×107个表达CAR的T细胞与6.0×108个表达CAR的T细胞之间、在约2.5×107个表达CAR的T细胞与6.0×108个表达CAR的T细胞之间、在约5.0×107个表达CAR的T细胞与6.0×108个表达CAR的T细胞之间、在约1.25×107个表达CAR的T细胞与1.2×109个表达CAR的T细胞之间、在约1.5×107个表达CAR的T细胞与1.2×109个表达CAR的T细胞之间、在约5.0×107个表达CAR的T细胞与4.5×108个表达CAR的T细胞之间、或在约1.5×108个表达CAR的T细胞与3.0×108个表达CAR的T细胞之间，各自包括端点在内。
331.如实施方式326至330中任一项所述的方法或用途或如实施方式323至325中任一项所述的用于所述用途的药物组合物，其中该细胞剂量包含在或包含约1.5×107个表达CAR的T细胞、包含在或包含约2.5×107个表达CAR的T细胞、包含在或包含约5.0×107个表达CAR的T细胞、包含在或包含约7.5×107个表达CAR的T细胞、包含在或包含约1.5×108个表达CAR的T细胞、包含在或包含约2.25×108个表达CAR的T细胞、包含在或包含约3.0×108个表达CAR的T细胞、包含在或包含约4.5×108个表达CAR的T细胞、包含在或包含约6.0×108个表达CAR的T细胞、包含在或包含约8.0×108个表达CAR的T细胞、包含在或包含约1.2×109个表达CAR的T细胞。
332.包括第一剂量的包含为实施方式1至67中任一项所述的嵌合抗原受体或由实施方式68至79中任一项所述的多核苷酸编码的第一嵌合抗原受体的复数个第一细胞的组合物、和包括第二剂量的复数个包含第二嵌合抗原受体的第二细胞的组合物用于治疗疾病或病况的用途，任选地其中所述疾病或病况是癌症。
333.包括第一剂量的包含为实施方式1至67中任一项所述的嵌合抗原受体或由实施方式68至79中任一项所述的多核苷酸编码的第一嵌合抗原受体的复数个第一细胞的组合物、和包括第二剂量的复数个包含第二嵌合抗原受体的第二细胞的组合物在制备用于治疗疾病或病况的药物中的用途，任选地其中所述疾病或病况是癌症。
334.一种治疗方法，其包含：
向患有疾病或病症的受试者给予包含第一剂量的复数个第一细胞的组合物，该复数个第一细胞包含第一嵌合抗原受体，该第一嵌合抗原受体系如实施方式1至78中任一项所述的嵌合抗原受体或由如实施方式79至97中任一项所述的多核苷酸编码；和
向该受试者给予包含第二剂量的复数个第二细胞的组合物，该复数个第二细胞包含第二嵌合抗原受体。
335.如实施方式334所述的方法或用途，其中该复数个第一细胞的第一剂量和该复数个第二细胞的第二剂量独立地包含在或在约1.0×107个表达CAR的T细胞与或与约1.5×109个表达CAR的T细胞之间、在或在约1.0×107个表达CAR的T细胞与或与约6.5×108个表达CAR的T细胞之间、在或在约1.25×107个表达CAR的T细胞与或与约0.6×108个表达CAR的T细胞之间、在或在约1.5×107个表达CAR的T细胞与或与约6.5×108个表达CAR的T细胞之间、在或在约1.5×107个表达CAR的T细胞与或与约6.0×108个表达CAR的T细胞之间、在或在约2.5×107个表达CAR的T细胞与或与约2.25×108个表达CAR的T细胞之间、在或在约2.5×107个表达CAR的T细胞与或与约6.0×108个表达CAR的T细胞之间、在或在约5.0×107个表达CAR的T细胞与或与约6.0×108个表达CAR的T细胞之间、在或在约7.5×107个表达CAR的T细胞与或与约1.5×108个表达CAR的T细胞之间、在或在约2.5×107个表达CAR的T细胞与或与约1.2×109个表达CAR的T细胞之间、在或在约5.0×107个表达CAR的T细胞与或与约4.5×108个表达CAR的T细胞之间，或在或在约1.5×108个表达CAR的T细胞与或与约3.0×108个表达CAR的T细胞之间，各自包括端点在内。
336.如实施方式334或335中任一项所述的方法或用途或如实施方式323至325中任一项所述的药物组合物，其中含有该复数个第一细胞的组合物和含有该复数个第二细胞的组合物同时、依序或间歇地给予。
337.如实施方式334至336中任一项所述的方法，其中含有该复数个第一细胞的组合物和含有该复数个第二细胞的组合物按任何次序依序给予。
338.如实施方式334至337中任一项所述的方法，其中，在复数个第一细胞之中，该复数个细胞中小于或小于约10％、小于或小于约9％、小于或小于约8％、小于或小于约7％、小于或小于约5％、小于或小于约4％、小于或小于约3％、小于或小于约2％或小于或小于约1％的细胞含有展现进补信号转导和/或抗原非依赖性活性或信号转导的嵌合抗原受体。
339.如实施方式334至338中任一项所述的方法，其中，在复数个第二细胞之中，该复数个细胞中小于或小于约10％、小于或小于约9％、小于或小于约8％、小于或小于约7％、小于或小于约5％、小于或小于约4％、小于或小于约3％、小于或小于约2％或小于或小于约1％的细胞含有展现进补信号转导和/或抗原非依赖性活性或信号转导的嵌合抗原受体。
340.如实施方式334至339中任一项所述的方法，其中该第二嵌合受体包含特异性结合多发性骨髓瘤上表达或与多发性骨髓瘤相关的第二抗原的细胞外抗原结合结构域。
341.如实施方式334至339中任一项所述的方法，其中该第二CAR含有：结合第二抗原的细胞外抗原结合结构域、间隔子、跨膜结构域和细胞内信号转导区。
342.如实施方式340或实施方式341的方法，其中该第二抗原选自B细胞成熟抗原(BCMA)、CD38、CD138、CS-1、BAFF-R、TACI和FcRH5。
343.如实施方式334至342中任一项所述的方法，其中该第二抗原是BCMA。
344.如实施方式334至343中任一项所述的方法，其中该第二CAR包含：
(1)特异性结合BCMA的细胞外抗原结合结构域，其中该细胞外抗原结合结构域包含：
(i)重链可变(VH)区，其包含与SEQ ID NO:189、191、193、195或197中所示的氨基酸序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列；和
(ii)轻链可变(VL)区，其包含与SEQ ID NO:190、192、194、196或198中所示的氨基酸序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列；
(2)间隔子，任选为包含IgG4/2嵌合铰链或经修饰的IgG4铰链；IgG2/4嵌合CH2区；和IgG4 CH3区的间隔子，任选地其长度为约228个氨基酸，或SEQ ID NO:17中所示的间隔子；
(3)跨膜结构域；和
(4)细胞内信号转导区。
345.如实施方式344的方法，其中该VH区包含SEQ ID NO:189、191、193、195或197中所示的VH区氨基酸序列内所包含的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；且该VL区包含SEQ ID NO:190、192、194、196或198中所示的VL区氨基酸序列内所包含的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
346.如实施方式344至345中任一项所述的方法，其中该第二CAR包含：
(1)特异性结合BCMA的细胞外抗原结合结构域，其中该细胞外抗原结合结构域包含：
(i)重链可变(VH)区，其包括含选自SEQ ID NO:199、202、206、209、212和215的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR-H1)；(b)含选自SEQ ID NO:200、203、207、210、213和216的氨基酸序列的重链互补决定区2(CDR-H2)；和(c)含选自SEQ ID NO:201、204、205、208、211、214和217的氨基酸序列的重链互补决定区3(CDR-H3)；和
(ii)轻链可变(VL)区，其包括含选自SEQ ID NO:218、221、224、227、230、233和235的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR-L1)；(b)含选自SEQ ID NO:219、222、225、228、231、234和236的氨基酸序列的轻链互补决定区2(CDR-L2)；和(c)含选自SEQ ID NO:220、223、226、229和232的氨基酸序列的轻链互补决定区3(CDR-L3)；
(2)间隔子，任选为包含IgG4/2嵌合铰链或经修饰的IgG4铰链；IgG2/4嵌合CH2区；和IgG4 CH3区的间隔子，任选地其长度为约228个氨基酸，或SEQ ID NO:17中所示的间隔子；
(3)跨膜结构域；和
(4)细胞内信号转导区。
347.如实施方式344至346中任一项所述的方法，其中：
该第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:199、200和201的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:218、219和220的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；
该第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:202、203、204的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:221、222和223的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；
该第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:199、200、205的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:224、225和226的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；
该第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:206、207、208的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:227、228和229的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；
该第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:209、210和211的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:230、231和232的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；
该第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:212、213和214的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:233、234和229的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；或
该第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:215、216和217的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:235、236和232的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
347.如实施方式344至346中任一项所述的方法，其中：
该第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:209、210和211的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:230、231和232的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；或
该第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:215、216和217的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:235、236和232的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
348.如实施方式344至347中任一项所述的方法，其中：
该第二CAR的VH区和VL区包含(a)分别如SEQ ID NO:189和SEQ ID NO:190中所示的氨基酸序列，或(b)与SEQ ID NO:189具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列和与SEQ ID NO:190具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列；
该第二CAR的VH区和VL区包含(a)分别如SEQ ID NO:191和SEQ ID NO:192中所示的氨基酸序列，或(b)与SEQ ID NO:191具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列和与SEQ ID NO:192具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列；
该第二CAR的VH区和VL区包含(a)分别如SEQ ID NO:193和SEQ ID NO:194中所示的氨基酸序列，或(b)与SEQ ID NO:193具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列和与SEQ ID NO:194具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列；
该第二CAR的VH区和VL区包含(a)分别如SEQ ID NO:195和SEQ ID NO:196中所示的氨基酸序列，或(b)与SEQ ID NO:195具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列和与SEQ ID NO:196具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列；或
该第二CAR的VH区和VL区包含(a)分别如SEQ ID NO:197和SEQ ID NO:198中所示的氨基酸序列，或(b)与SEQ ID NO:197和SEQ ID NO:198具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。
349.如实施方式344至348中任一项所述的方法，其中：
该第二CAR的VH区和VL区分别包含SEQ ID NO:189和SEQ ID NO:190中所示的氨基酸序列；
该第二CAR的VH区和VL区包含SEQ ID NO:191和SEQ ID NO:192中所示的氨基酸序列；
该第二CAR的VH区和VL区包含SEQ ID NO:193和SEQ ID NO:194中所示的氨基酸序列；
该第二CAR的VH区和VL区包含SEQ ID NO:195和SEQ ID NO:196中所示的氨基酸序列；或
该第二CAR的VH区和VL区分别包含SEQ ID NO:197和SEQ ID NO:198中所示的氨基酸序列。
350.如实施方式344至349中任一项所述的方法，其中该第二CAR的细胞外抗原结合结构域是单链抗体片段。
351.如实施方式350所述的方法，其中该单链抗体片段是或含有单链可变片段(scFv)。
352.如实施方式344至351中任一项所述的方法，其中该第二CAR的VH区和VL区通过柔性连接物接合。
353.如实施方式352所述的方法，其中该第二CAR的连接物含有氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:52)。
354.如实施方式344至353中任一项所述的方法，其中该VH区在该VL区的氨基末端。
355.如实施方式344至354中任一项所述的方法，其中该VH区在该VL区的羧基末端。
356.如实施方式344至355中任一项所述的方法，其中该抗原结合结构域包含选自SEQ ID NO:237、238、239、240和241的氨基酸序列或与选自SEQ ID NO:237、238、239、240和241的氨基酸序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。
357.如实施方式344至356中任一项所述的方法，其中该抗原结合结构域包含选自SEQ ID NO:237、238、239、240和241的氨基酸序列。
358.如实施方式344至357中任一项所述的方法，其中：
该第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:209、210和211的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:230、231和232的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；或该第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:215、216和217的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:235、236和232的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；和/或
该第二CAR的VH区和VL区分别包含SEQ ID NO:197和SEQ ID NO:198中所示的氨基酸序列；和/或
该抗原结合结构域包含SEQ ID NO:241中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:241中所示的序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。
359.如实施方式344至358中任一项所述的方法，其中该跨膜结构域是或包含来自CD4、CD28或CD8、任选为来自人CD4、人CD38或人CD8的跨膜结构域。
360.如实施方式344至359中任一项所述的方法，其中：
该跨膜结构域是或包含来自人CD28的跨膜结构域；和/或
该跨膜结构域是或包含SEQ ID NO:18中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:18具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。
361.如实施方式360所述的方法，其中该跨膜结构域是或包含SEQ ID NO:18中所示的序列。
362.如实施方式344至361中任一项所述的方法，其中该细胞内信号转导区包含细胞内信号转导结构域。
363.如实施方式362所述的方法，其中该细胞内信号转导结构域能够在T细胞中诱导初级活化信号，是T细胞受体(TCR)组分和/或含有免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)。
364.如实施方式362或实施方式363所述的方法，其中该细胞内信号转导结构域是或包含CD3-zeta(CD3ζ)链或其功能变体或信号转导部分、任选为人CD3ζ链的细胞质信号转导结构域。
365.如实施方式362至364中任一项所述的方法或用途，其中该细胞内信号转导区包含SEQ ID NO:20中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:20具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。
366.如实施方式362至365中任一项所述的方法或用途，其中该细胞内信号转导区进一步包含共刺激信号转导区。
367.如实施方式366所述的方法或用途，其中该共刺激信号转导区含有T细胞共刺激分子或其信号转导部分的细胞内信号转导结构域。
368.如实施方式366或实施方式367所述的方法或用途，其中该共刺激信号转导区包含CD28、4-1BB或ICOS、或其信号转导部分、任选为人CD28、人4-1BB或人ICOS的细胞内信号转导结构域。
369.如实施方式366至368中任一项所述的方法或用途，其中该共刺激信号转导区包含：
人CD28的细胞内信号转导结构域；和/或
SEQ ID NO:46中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:46中所示的序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。
370.如实施方式366至369中任一项所述的方法或用途，其中该共刺激信号转导区包含：
人4-1BB的细胞内信号转导结构域；和/或
SEQ ID NO:19中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:19中所示的序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。
371.如实施方式344至370中任一项所述的方法或用途，其中编码的第二嵌合抗原受体自其N末端至C末端依序含有：细胞外抗原结合结构域、间隔子、跨膜结构域。
372.如实施方式326至371中任一项所述的方法或用途，其中该疾病或病症与GPRC5D的表达相关。
373.如实施方式372所述的方法或用途，其中该疾病或病症进一步与B细胞成熟抗原(BCMA)的表达相关。
374.如实施方式326至373中任一项所述的方法或用途，其中该疾病或病症是B细胞相关病症。
375.如实施方式326至374中任一项所述的方法或用途，其中与BCMA相关的该疾病或病症是自体免疫性疾病或病症。
376.如实施方式375所述的方法或用途，其中该自体免疫性疾病或病症是全身性红斑性狼疮症(SLE)、狼疮性肾炎、发炎性肠病、类风湿性关节炎、ANCA相关血管炎、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、自体免疫性血小板减少症、却格司氏病(Chagas'disease)、格雷夫氏病(Grave's disease)、韦格纳氏肉芽肿病(Wegener'sgranulomatosis)、结节性多动脉炎、休格连氏症候群(Sjogren's syndrome)、寻常性天疱疮、硬皮病、多发性硬化、牛皮癣、IgA肾病变、IgM多发性神经病、血管炎、糖尿病、雷诺氏症候群(Reynaud's syndrome)、抗磷脂症候群、古巴士德氏病(Goodpasture's disease)、川崎病(Kawasaki disease)、自体免疫性溶血性贫血、重症肌无力或进行性丝球体肾炎。
377.如实施方式326至376中任一项所述的方法或用途，其中该疾病或病症是癌症。
378.如实施方式377所述的方法或用途，其中该癌症是表达GPRC5D的癌症。
379.如实施方式377或实施方式378所述的方法或用途，其中该癌症是浆细胞恶性病，且该浆细胞恶性病是多发性骨髓瘤(MM)或浆细胞瘤。
380.如实施方式377至379中任一项所述的方法或用途，其中该癌症是多发性骨髓瘤(MM)。
381.如实施方式380所述的方法或用途，其中该癌症是复发性/难治性多发性骨髓瘤。
382.如实施方式326至381中任一项所述的方法或用途，其中：
在给予BCMA靶向疗法后、任选在给予包含特异性结合BCMA的CAR的T细胞后，受试者是难治疗的或已经复发；或
该方法包括选择在给予BCMA靶向疗法后、任选在给予包含特异性结合BCMA的CAR的T细胞后难治疗或已经复发的受试者进行治疗。
383.如实施方式326至333和335至382中任一项所述的方法或用途，其中在给予该剂量的细胞之前，该受试者已预先接受用于治疗该疾病或病症的BCMA靶向疗法的给予。
384.如实施方式334所述的方法，其中在给予该第一剂量的细胞和该第二剂量的细胞之前，该受试者已预先接受用于治疗该疾病或病症的BCMA靶向疗法的给予。
385.如实施方式383或实施方式383所述的方法或用途，其中该BCMA靶向疗法包括含T细胞的组合物，这些T细胞包含特异性结合BCMA的CAR。
386.如实施方式383至385中任一项所述的方法或用途，其中在给予BCMA靶向疗法后、任选在给予包含特异性结合BCMA的CAR的T细胞后，该受试者是难治疗的或已经复发。
387.如实施方式326至386中任一项所述的方法或用途，其中该受试者包含在先前给予之后展现BCMA抗原或抗原决定簇损失、BCMA下调和/或BCMA阴性肿瘤细胞的多发性骨髓瘤细胞。
388.如实施方式278或实施方式279所述的组合物，其中该组合物包含复数个细胞，其中这些细胞的至少一部分包含特异性结合GPRC5D的第一CAR，这些细胞的一部分包含特异性结合在多发性骨髓瘤上表达或与多发性骨髓瘤相关的第二抗原的第二CAR，任选其中该第二抗原系BCMA，且这些细胞的一部分包含该第一CAR和该第二CAR两者。
389.一种组合，其包含：
包含第一嵌合抗原受体的复数个第一细胞，该第一嵌合抗原受体是如实施方式1至78中任一项所述的嵌合抗原受体和/或由如实施方式79至97中任一项所述的多核苷酸编码；和
包含第二嵌合抗原受体的复数个第二细胞。
390.如实施方式389所述的组合，其中，在复数个基第一细胞之中，该复数个细胞中小于或小于约10％、小于或小于约9％、小于或小于约8％、小于或小于约7％、小于或小于约5％、小于或小于约4％、小于或小于约3％、小于或小于约2％或小于或小于约1％的细胞含有展现进补信号转导和/或抗原非依赖性活性或信号转导的嵌合抗原受体。
391.如实施方式389或实施方式390所述的组合，其中，在复数个基第二细胞之中，该复数个细胞中小于或小于约10％、小于或小于约9％、小于或小于约8％、小于或小于约7％、小于或小于约5％、小于或小于约4％、小于或小于约3％、小于或小于约2％或小于或小于约1％的细胞含有展现进补信号转导和/或抗原非依赖性活性或信号转导的嵌合抗原受体。
392.如实施方式389至391中任一项所述的组合，其中该第二嵌合受体包含特异性结合多发性骨髓瘤上表达或与多发性骨髓瘤相关的第二抗原的细胞外抗原结合结构域。
393.如实施方式389至391中任一项所述的组合，其中该第二CAR含有：结合第二抗原的细胞外抗原结合结构域、间隔子、跨膜结构域和细胞内信号转导区。
394.如实施方式392或实施方式393所述的组合，其中该第二抗原选自由B细胞成熟抗原(BCMA)、CD38、CD138、CS-1、BAFF-R、TACI和FcRH5组成的群组。
395.如实施方式389至394中任一项所述的组合，其中该第二抗原是BCMA。
396.如实施方式389至395中任一项所述的组合，其中该第二CAR包含：
(1)特异性结合BCMA的细胞外抗原结合结构域，其中该细胞外抗原结合结构域包含：
(i)重链可变(VH)区，其包含与SEQ ID NO:189、191、193、195或197中所示的氨基酸序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列；和
(ii)轻链可变(VL)区，其包含与SEQ ID NO:190、192、194、196或198中的任一个中所示的氨基酸序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列；
(2)间隔子，任选为包含IgG4/2嵌合铰链或经修饰的IgG4铰链；IgG2/4嵌合CH2区；和IgG4 CH3区的间隔子，任选地其长度为约228个氨基酸，和/或SEQ ID NO:17中所示的间隔子；
(3)跨膜结构域；和
(4)细胞内信号转导区。
397.如实施方式396所述的组合，其中该VH区包含SEQ ID NO:189、191、193、195或197中所示的VH区氨基酸序列内所包含的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；且该VL区包含SEQ IDNO:190、192、194、196或198中所示的VL区氨基酸序列内所包含的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
398.如实施方式396或实施方式397中任一项所述的组合，其中该第二CAR包含：
(1)特异性结合BCMA的细胞外抗原结合结构域，其中该细胞外抗原结合结构域包含：
(i)重链可变(VH)区，其包括含SEQ ID NO:199、202、206、209、212或215中所示的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR-H1)；(b)含SEQ ID NO:200、203、207、210、213或216中所示的氨基酸序列的重链互补决定区2(CDR-H2)；和(c)含SEQ ID NO:201、204、205、208、211、214或217中所示的氨基酸序列的重链互补决定区3(CDR-H3)；和
(ii)轻链可变(VL)区，其包括含SEQ ID NO:218、221、224、227、230、233或235中所示的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR-L1)；(b)含SEQ ID NO:219、222、225、228、231、234或236中所示的氨基酸序列的轻链互补决定区2(CDR-L2)；和(c)含SEQ ID NO:220、223、226、229或232中所示的氨基酸序列的轻链互补决定区3(CDR-L3)；
(2)间隔子，任选为包含IgG4/2嵌合铰链或经修饰的IgG4铰链；IgG2/4嵌合CH2区；和IgG4 CH3区的间隔子，任选地其长度为约228个氨基酸，和/或SEQ ID NO:17中所示的间隔子；
(3)跨膜结构域；和
(4)细胞内信号转导区。
399.如实施方式396至398中任一项所述的组合，其中：
该第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:199、200和201的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:218、219和220的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；
该第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:202、203、204的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:221、222和223的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；
该第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:199、200、205的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:224、225和226的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；
该第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:206、207、208的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:227、228和229的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；
该第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:209、210和211的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:230、231和232的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；
该第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:212、213和214的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:233、234和229的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；或
该第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:215、216和217的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:235、236和232的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
400.如实施方式396至399中任一项所述的组合，其中：
该第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:209、210和211的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:230、231和232的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；或
该第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:215、216和217的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:235、236和232的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
401.如实施方式396至400中任一项所述的组合，其中：
该第二CAR的VH区和VL区包含(a)分别如SEQ ID NO:189和SEQ ID NO:190中所示的氨基酸序列，或(b)与SEQ ID NO:189具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、至少或至少约99％、或至少或至少约100％序列一致性的氨基酸序列和与SEQ ID NO:190具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列；
该第二CAR的VH区和VL区包含(a)分别如SEQ ID NO:191和SEQ ID NO:192中所示的氨基酸序列，或(b)与SEQ ID NO:191具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列和与SEQ ID NO:192具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列；
该第二CAR的VH区和VL区包含(a)分别如SEQ ID NO:193和SEQ ID NO:194中所示的氨基酸序列，或(b)与SEQ ID NO:193具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列和与SEQ ID NO:194具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列；
该第二CAR的VH区和VL区包含(a)分别如SEQ ID NO:195和SEQ ID NO:196中所示的氨基酸序列，或(b)与SEQ ID NO:195具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列和与SEQ ID NO:196具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列；或
该第二CAR的VH区和VL区包含(a)分别如SEQ ID NO:197和SEQ ID NO:198中所示的氨基酸序列，或(b)与SEQ ID NO:197具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列和与SEQ ID NO:198具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。
402.如实施方式396至401中任一项所述的组合，其中：
该第二CAR的VH区和VL区分别包含SEQ ID NO:189和SEQ ID NO:190中所示的氨基酸序列；
该第二CAR的VH区和VL区包含SEQ ID NO:191和SEQ ID NO:192中所示的氨基酸序列；
该第二CAR的VH区和VL区包含SEQ ID NO:193和SEQ ID NO:194中所示的氨基酸序列；
该第二CAR的VH区和VL区包含SEQ ID NO:195和SEQ ID NO:196中所示的氨基酸序列；或
该第二CAR的VH区和VL区分别包含SEQ ID NO:197和SEQ ID NO:198中所示的氨基酸序列。
403.如实施方式396至402中任一项所述的组合，其中该第二CAR的细胞外抗原结合结构域是单链抗体片段。
404.如实施方式403所述的组合，其中该单链抗体片段是或含有单链可变片段(scFv)。
405.如实施方式396至404中任一项所述的组合，其中该VH区和VL区通过柔性连接物接合。
406.如实施方式405所述的组合，其中该连接物含有氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:52)。
407.如实施方式396至406中任一项所述的组合，其中该VH区在该VL区的氨基末端。
408.如实施方式396至406中任一项所述的组合，其中该VH区在该VL区的羧基末端。
409.如实施方式396至408中任一项所述的组合，其中该抗原结合结构域包含SEQID NO:237、238、239、240或241中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:227、238、239、240或241中所示的氨基酸序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。
410.如实施方式396至409中任一项所述的组合，其中该抗原结合结构域包含SEQID NO:237、238、239、240或241中所示的氨基酸序列。
411.如实施方式396至410中任一项所述的组合，其中：
该第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:209、210和211的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:230、231和232的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；或该第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:215、216和217的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:235、236和232的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；和/或
该第二CAR的VH区和VL区分别包含SEQ ID NO:197和SEQ ID NO:198中所示的氨基酸序列；和/或
该抗原结合结构域包含SEQ ID NO:241中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:241中所示的序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。
412.如实施方式396至411中任一项所述的组合，其中该跨膜结构域是或包含来自CD4、CD28或CD8、任选为来自人CD4、人CD38或人CD8的跨膜结构域。
413.如实施方式396至412中任一项所述的组合，其中：
该跨膜结构域是或包含来自人CD28的跨膜结构域；和/或
该跨膜结构域是或包含SEQ ID NO:18中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:18具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。
414.如实施方式413所述的组合，其中该跨膜结构域是或含有SEQ ID NO:18中所示的序列。
415.如实施方式396至414中任一项所述的组合，其中该细胞内信号转导区包含细胞内信号转导结构域。
416.如实施方式415所述的组合，其中该细胞内信号转导结构域能够在T细胞中诱导初级活化信号，是T细胞受体(TCR)组分和/或含有免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)。
417.如实施方式415或实施方式416所述的组合，其中该细胞内信号转导结构域是或包含CD3-zeta(CD3ζ)链或其功能变体或信号转导部分、任选为人CD3ζ链的细胞质信号转导结构域。
418.如实施方式415至417中任一项所述的组合，其中该细胞内信号转导结构域包含SEQ ID NO:20中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:20具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。
419.如实施方式415至418中任一项所述的组合，其中该细胞内信号转导区进一步包含共刺激信号转导区。
420.如实施方式419所述的组合，其中该共刺激信号转导区含有T细胞共刺激分子或其信号转导部分的细胞内信号转导结构域。
421.如实施方式419或实施方式420所述的组合，其中该共刺激信号转导区包含CD28、4-1BB或ICOS、或其信号转导部分、任选为人CD28、人4-1BB或人ICOS的细胞内信号转导结构域。
422.如实施方式419至421中任一项所述的组合，其中该共刺激信号转导区包含：
人CD28的细胞内信号转导结构域；和/或
SEQ ID NO:46中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:46中所示的序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。
423.如实施方式419至422中任一项所述的组合，其中该共刺激信号转导区包含：
人4-1BB的细胞内信号转导结构域；和/或
SEQ ID NO:19中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:19中所示的序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。
424.如实施方式389至423中任一项所述的组合，其中编码的第二嵌合抗原受体自其N末端至C末端依序含有：细胞外抗原结合结构域、间隔子、跨膜结构域和细胞内信号转导区。
425.一种套组，其包含如实施方式389至424中任一项所述的组合和使用说明书，任选其中这些说明书是关于任选根据如实施方式326至387中任一项所述的方法或用途给予一定剂量的该第一复数个细胞和该第二复数个细胞。
426.一种制品，其包含如实施方式389至424中任一项所述的组合或如实施方式425所述的套组。
427.如实施方式426所述的制品，其包括含一定剂量的该复数个第一细胞的第一容器和含一定剂量的该复数个第二细胞的第二容器，任选其中该第一容器和该第二容器独立地是小瓶或袋子。
428.如实施方式389至424中任一项所述的组合用于治疗疾病或病况的用途，任选地其中所述疾病或病况是癌症。
429.如实施方式389至424中任一项所述的组合在制备用于治疗疾病或病况的药物中的用途，任选地其中所述疾病或病况是癌症。
430.一种药物组合物，其用于治疗疾病或病况、任选为癌症，所述药物组合物包含实施方式389至424中任一项所述的组合作为活性成分。
IX.实施例
包括以下实施例仅为达成说明的目的，且不意欲限制本发明的范围。
实施例1：多发性骨髓瘤(MM)中G蛋白偶合受体C类5族成员D(GPRC5D)的表达
D.GPRC5D mRNA表达
为了鉴别和评价多发性骨髓瘤(MM)的免疫疗法的潜在细胞表面靶标，使用癌细胞系百科全书(CCLE；Barretina等人,Nature.(2012)483(7391):603-607)以计算器评价包括30种MM细胞系在内的超过1,000种不同恶性疾病细胞系的mRNA表达。除肿瘤细胞外，也挖掘基因型-组织表达(GTEx)计划数据库(GTEx联盟,Nat Genet.(2013)45(6):580-585)以评价初代、非恶性组织类型中的mRNA表达。
使用CD138作为对照标记物，因为CD138是用于鉴别正常和恶性浆细胞的常见表面标记物。CD138在MM细胞系中和来自大部分肿瘤类型的细胞系中高水平表达，且在上呼吸消化道肿瘤中具有最高平均表达(图1A)。GPRC5D mRNA在MM细胞系中高水平表达(n＝30)；然而，与CD138相比，并无其他肿瘤类型展现显著表达(图1B)。
分析来自基因型-组织表达(GTEx)数据库的数据的初代正常(非恶性)组织类型中的表达揭示CD138 mRNA在食道、皮肤、肺和肝等组织中具有较高表达(图2A)。相比之下，GPRC5D mRNA在任何正常组织中没有高水平表达，而在皮肤样品中具有可变的表达(图2B)。分析人类骨髓样品中的GTEx mRNA表达显示GPRC5D mRNA在初代恶性浆细胞和正常浆细胞中的表达分别比来自末梢血液的B细胞中的表达高出1000倍和500倍(图2C)。
为了评价GPRC5D mRNA表达与临床结果之间的关系，在MMRF CoMMpass临床试验(NCT0145429)中对公开可得的来自765名患者的经CD138分选的RNAseq表达数据(research.mmrf.org；IA13版)进行分析。将患者分成两组：(1)高于中值GPRC5D表达的患者和(2)低于中值GPRC5D表达的患者。较高的GPRC5D表达与无进展生存期缩短明显相关(图3A)。不过，GPRC5D表达与国际分期系统(ISS)分数(图3B；n＝369名高于中值，374名低于中值)或包括基因扩增、缺失和易位在内的任何所评价的常见细胞遗传异常不相关(图3C-3H；n＝287-291名高于中值，280-282名低于中值)。
E.GPRC5D蛋白质表达
1.免疫组织化学(IHC)分析
先前关于评价多发性骨髓瘤细胞中GPRC5D蛋白质的报导无法使用流动式细胞测量分析鉴别细胞表面表达(Frigyesi.等人,Robust isolation of malignant plasmacells in multiple myeloma.Blood 123,1336-40(2014)。使用各种可用试剂确定这些阴性结果。实际上，为了评价GPRC5D蛋白质表达，使用单株人类抗GPRC5D抗体(Abcam，目录号ab55044)对经基因工程改造以表达GPRC5D的K562细胞(K562-GPRC5D)和表达内源性GPRC5D的人类MM细胞系(OPM-2和NCI-H929)进行抗GPRC5D免疫组织化学(IHC)分析。用多聚辣根过氧化酶-连接物抗体缀合物系统和色原体3,3'-二氨基联苯胺(看起来呈褐色染色以观测GPRC5D免疫反应性)处理载片并用苏木精对比染色。表达GPRC5D的细胞展示阳性染色，在亲本K562细胞上未观察到染色，并在来自初代人类扁桃体的组织中仅观察到稀少浆细胞染色。通过对各细胞系的IHC图像进行膜光学密度的数字影像分析(Halo)的离群值盒状图定量(平均值±四分位数范围)来测定显示最大范围的抗体浓度(图4A)。
2.多发性骨髓瘤(MM)中的GPRC5D和BCMA表达
使用多重定量免疫荧光(Q-IF)对来自83名骨髓瘤患者的初代骨髓样品中的CD138、BCMA和GPRC5D表达进行定量。来自多发性骨髓瘤患者的83份骨髓样品的福尔马林固定、石蜡包埋的切片经历抗原获取，随后通过多重免疫荧光，使用以下进行分析：(1)兔抗人CD138和荧光团罗丹明6G；(2)小鼠抗人类B细胞成熟抗原(BCMA)和荧光团DCC；和(3)小鼠抗人G蛋白偶联受体家族C类5族成员D(GPRC5D)和荧光团CY5。使用Pannoramic P250载片扫描仪(3DHISTECH,Perkin Elmer,Waltham,MA)，在设定曝光下扫描经染色的骨髓样品的完整切片。阳性细胞的百分比使用Halo 2.0图像分析平台(Indica Labs,Corrales,NM)，基于设定对各标记物呈阳性的临限值得到。对阳性细胞和阴性细胞计数。自CD138+肿瘤细胞中选出阳性细胞并将阳性细胞百分比针对CD138+肿瘤细胞归一化。测量阳性率为1％或更高的CD138+肿瘤细胞中BCMA和GPRC5D的出现率。
如图4B中所示，98％的经评估骨髓样品在至少一小组CD138+细胞中展现GPRC5D阳性染色。在所有样品中，大部分CD138+细胞对BCMA和GPRC5D呈阳性，但在若干样品中一大群CD138+细胞仅表达该两种抗原之一，而不是表达该两种抗原。也评估83份初代患者样品中超过50％的CD138+细胞也对BCMA、GPRC5D、或BCMA或GPRC5D呈阳性的样品的百分比(图4C)。确切地说，使用在一些靶向BCMA的CAR T细胞疗法试验(NCT02215967、NCT02658929)中使用的CD138+细胞上大于或等于百分的五十抗原表达的截止值，当考虑BCMA或GPRC5D的表达时，观察到65％(54/83)的样品具有高于此水平的GPRC5D表达，73％(61/83)的样品满足此针对BCMA的临限值，而88％(73/83)满足此临限值(图4C)。
使用皮尔森相关性分析(Pearson correlation analysis)评价BCMA与GPRC5D表达之间相关性的显著性，且R2显示拟合成回归线。分析指示CD138+细胞上GPRC5D的表达与BCMA表达无关(R2＝0.156；图4D)。
3.非恶性组织中的GPRC5D表达
评价正常组织上的GPRC5D蛋白质表达。通过免疫染色评价分别来自三名人类供体的30种不同初代正常组织的空芯针活检体。其中，有24种不表达GPRC5D蛋白质(肾上腺、骨髓、乳房(n＝5)、脑(小脑)、脑(大脑)、脑垂体)、食道、心脏、肝、肺(无支气管周围腺体)、间皮细胞、卵巢、周边神经、胎盘、前列腺、唾液腺、脾脏、骨胳肌、睪丸、胸腺、甲状腺、扁桃体、子宫和子宫颈组织)。
对于在IHC上显示任何阳性染色迹象的组织类型，使用来自非人类灵长类动物(食蟹猕猴；与人类具有96％氨基酸同源性；抗体交叉反应)的样品重复染色，得到类似结果。通过对人类、食蟹猕猴和鼠类组织执行RNA原位杂交(RNA-ISH)和在一些情况下执行qPCR来确定IHC表达结果(表E1)。在非浆细胞正常组织中，IHC在包括来自毛囊球和支气管周围腺体的细胞在内的细胞中呈阳性，且毛囊球是通过RNA原位杂交(ISH)和定量PCR确定表达的唯一组织。皮肤的定量PCR呈弱阳性(表E1)，与表达局限于皮肤中的少数细胞类型相符。
---未测试
NP：不存在于组织中
实施例2：抗GPRC5D scFv的产生和抗原决定簇定位
A.抗GPRC5D scFv的产生
使用人类B细胞源性scFv噬菌体展示文库鉴别结合表达GPRC5D的细胞，但不结合表达非GPRC5D蛋白质的细胞的GPRC5D特异性scFv。为了产生表达GPRC5D的细胞用于筛选，经由逆转录病毒，用人类GPRC5DcDNA稳定转导NIH-3T3纤维母细胞以产生稳定人工抗原呈现细胞(hGPRC5D-aAPC)用于噬菌体展示文库淘选。通过流动式细胞测量术确定hGPRC5D-aAPC上GPRC5D的表达，并使高表达次克隆物扩增。通过针对hGPRC5D-aAPC淘选人类B细胞源性scFv噬菌体展示文库进行噬菌体展示。
在噬菌体文库筛选之后，对阳性克隆物测序，且独特克隆物经历第二个验证步骤，即验证其结合至人类MM细胞是MM.1S和NCI-H929，但不结合至急性骨髓性白血病(AML)细胞系SET2。用分别覆盖5个和3个亚家族且HCDR3长度在6-23个氨基酸范围内的轻链和重链CDR鉴别三十二(32)个独特克隆物。如下所述，选择与MM.1S和NCI-H929细胞展现最高特异性结合，但不特异性结合GPRC5D阴性细胞系(来源于其他血液恶性疾病)的七个克隆物产生CAR构建体。
B.抗原决定簇定位
合成覆盖GPRC5D细胞外结构域的重迭15聚体肽文库并以化学方式连接至柔性支架，使用基于ELISA的方法评估一小组以上产生的靶向GPRC5D的scFv的线性、构象和不连续(经由肽化学键联至支架上)抗原决定簇结合。scFv结合至不同抗原决定簇，且至少一种所鉴别的scFv结合GPRC5D七跨膜蛋白的所有细胞外环(图5)。
实施例3：产生抗GPRC5D嵌合抗原受体(CAR)和表达抗GPRC5DCAR的细胞
对嵌合抗原受体(CAR)进行基因工程改造，并入呈不同结构形式的来自以上所鉴别的7种候选物的靶向GPRC5D的人类scFv(表E3)。
产生编码CAR的多核苷酸构建体，这些构建体编码含有上述每一scFv的抗原结合结构域，其中重链可变(VH)和轻链可变(VL)经连接物(含有SEQ ID NO:52中所示的残基)连接且其中产生的各scFv呈VH/VL取向和VL/VH取向。
每一所产生的CAR构建体含有scFv抗原结合结构域；三种不同长度的免疫球蛋白源性间隔子结构域中的一种[短(仅铰链，12个aa；SEQ ID NO:15)；中等(铰链-CH3，119个aa；SEQ ID NO:16)；或长(铰链-CH2-CH3，228个aa；SEQ ID NO:17，由SEQ ID NO:73中所示的序列编码)且具有限制Fc受体结合的CH2修饰]；人CD28源性跨膜结构域(SEQ ID NO:18)；人4-1BB源性细胞内信号转导结构域(SEQ ID NO:19)；以及人CD3ζ源性细胞内信号转导结构域(SEQ ID NO:20)。
表E3阐述所产生的示例性抗GPRC5D CAR构建体的组分和SEQ ID NO。
产生呈双顺反子构建体形式的编码CAR且也编码示例性报导体绿色荧光蛋白(GFP)的核酸构建体，该GFP通过自裂解T2A序列(SEQ ID NO:44中所示的序列，编码SEQ IDNO:37中所示的氨基酸序列)与CAR序列分隔开。
将核酸构建体克隆至慢病毒表达载体或逆转录病毒表达载体中以转导细胞。对于慢病毒构建体，对编码含长间隔子的抗GPRC5D CAR的核苷酸序列进行密码子优化并评估潜在剪接位点，且以保守方式进行修饰，包括移除潜在的预测剪接位点。在进行密码子优化以在人类细胞中表达之后，接着分析DNA序列中的剪接位点(例如NNSPLICE 0.9版在线剪接位点预测工具；fruitfly.org,Berkeley Drosophila Genome Project,Berkeley,CA)。剪接供体位点和剪接受体位点独立地评价。通过沉默突变修饰所鉴别的剪接位点分数>0.7分(>70％的剪接事件概率，例如在启动子区和长间隔子区中)的剪接供体剪接受体位点以将剪接位点分数减小至低于0.7分。在密码子优化之后进一步修饰以消除剪接位点的这些区域是较长间隔子区序列内的区域。经修饰核苷酸序列中编码CAR的长间隔子的核苷酸序列示于SEQ ID NO:74中。
对于转导初代人类T细胞，如以下研究中所描述，自获自健康供体或纽约血液中心(New York Blood Center；New York,NY)的全血分离出初代人类T细胞。在重组IL-2、IL-7和IL-15存在下，用植物血球凝集素(2mg/mL)或抗CD3/抗CD3磁珠以1:1比率刺激T细胞24小时。在起始刺激之后第2天至第3天，通过用病毒离心接种来转导T细胞，使其扩增并收集细胞，且在一些情况下低温保藏并在使用前解冻。在第4天至第10天，通过流动式细胞测量分析来测定转导效率。
实施例4：评估来自不同抗GPRC5D嵌合抗原受体(CAR)的抗原非依赖性(进补)信号转导
通过靶向整合，经同源依赖性修复(HDR)产生含有Nur77基因敲入报导体的稳定Jurkat T细胞报导体细胞系，其中在内源性Nur77基因座处插入编码该报导体分子的核酸序列。经由HDR靶向示例性红色荧光蛋白(RFP)报导体分子，该分子插入Jurkat T细胞克隆物E6-1(
TIB-152TM)中，在内源性Nr4a1(Nur77)基因的框内下游，在终止密码子之前且在“自裂解”T2A组件(SEQ ID NO:45中所示的序列，编码SEQ ID NO:37中所示的氨基酸序列)之后，由此允许共表达RFP作为Nur77表达的报导体。
用含有GFP的双顺反子构建体和以上实施例3中所描述的42种不同CAR构建体中的一种稳定转导Nur77-RFP Jurkat T细胞系。使用Nur77报导体细胞系评估经CAR基因工程改造的细胞中的T细胞活化，因为Nur77系T淋巴球中的立即早期基因产物；转录在CD3ζ信号转导的下游特异性起始，且不受细胞因子或TLR介导的信号影响。在此模型中，进补信号转导由在无GPRC5D抗原刺激存在下RFP的表达指示。
在无表达GPRC5D的细胞存在下培育5×105个经CAR转导的Nur77-RFP Jurkat T细胞中的每一个。通过GFP信号测量CAR的转导情况并在转导后第2天、第7天和第11天，以表达GFP(即，经CAR转导)且表达RFP的细胞的百分比测定进补信号转导。自GFP+细胞侦测的进补和非进补信号转导概述于图6A-6B中。分析结果展示CAR构建体中存在变化的进补信号转导，其中并入人类GPRC5D-203 scFv(VL/VH和VH/VL)的构建体展示最低的进补信号转导。也观察到与表达此类CAR的细胞中的最高水平进补信号转导相关的某些CAR构建体与Jurkat报导体细胞系的生长不良相关且将其自进一步评价(利用短间隔子的GPRC5D-204 VH/VL和VL/VH以及利用中等长度间隔子的GPRC5D-206 VL/VH)中排除。
比较CAR构建体的抗原非依赖性信号转导和抗原依赖性信号转导。在无抗原存在下或在表达GPRC5D的MM.1S骨髓瘤细胞存在下以1:2的效应物:靶标(E:T)比率培育经CAR转导的Nur77-RFP Jurkat T细胞或未经转导的亲本细胞。在20小时之后，分别通过测量CAR的转导情况或通过测量T细胞信号转导来评估GFP和RFP信号。将在无抗原存在下展示RFP信号的经CAR转导的Jurkat细胞(GFP+)的百分比针对在抗原存在下展示RFP信号的此类细胞作图(图6C-6E)。本分析的结果展示，并入长间隔子使抗原介导的经由CAR进行的信号转导增加，但不大可能诱导抗原非依赖性(进补)信号转导，利用具有较短间隔子的CAR构建体观察到此类进补信号转导。
图6F描绘含有长间隔子的示例性表达抗GPRC5D CAR的构建体或未经转导的亲本细胞在GPRC5D抗原(MM.1S骨髓瘤细胞)不存在(上部一列图；抗原非依赖性进补信号转导)或存在(下部一列图，抗原依赖性信号转导)下培育之后的代表性流式图。经CAR转导的细胞沿y轴以GFP+指示，且信号转导沿x轴以RFP+指示。各图的右上象限中显示的值是呈RFP+的GFP+细胞的百分比。在测试的CAR中，具有长间隔子的GPRC5D-203 VL/VH在抗原暴露之后具有最高的活化百分比，同时维持最低的进补信号转导百分比。
实施例5：人类抗GPRC5D CAR的特异性
测试GPRC5D-203 VL/VH-长间隔子CAR的scFv抗原结合结构域的结合特异性和脱靶结合。
A.细胞-细胞相互作用分析
在G蛋白偶合受体(GPCR)中测试GPRC5D-203 VL/VH-长间隔子CAR但缺乏信号转导结构域的结合特异性。使用包括细胞质mCherry的细胞表面表达载体，在HEK293细胞中短暂表达非信号转导CAR。同时，在HEK293细胞中短暂表达在表达细胞质GFP的载体中的来自人类GPCR文库的个别受体的cDNA。其中，202种GPCR通过>25％转导的质量控制并针对脱靶结合进行筛选。使用侦测细胞-细胞相互作用的自动流动式细胞测量分析测定结合。相较于评价的所有GPCR，示例性GPRC5D CAR仅与GPRC5D相互作用(图7A；预先指定的关于显著性的临限值(水平线)：Z分数3；P<0.0027)。
B.细胞微阵列分析
在scFv-Fc IHC分析中确定GPRC5D-203 VL/VH-长间隔子CAR的特异性。使分别表达4,417种人类浆膜蛋白质中的一种的个别HEK293细胞群在显微镜载片上的细胞微阵列斑点中生长并用抗GPRC5D-203 VL/VH scFv(SEQ ID NO:8)与mIgG2a Fc抗体，即mIgG2a Fc同型阴性对照的融合物筛选。通过自动荧光显微镜检查，用经荧光标记的抗mIgG2a二次抗体评估细胞微阵列的结合。
结果指示与GPRC5D的较强结合以及与两种额外蛋白质，即原钙黏着蛋白α1(PCDH1A)和作为已知可能发生Fc相互作用的蛋白质的Fcγ受体2A(CD32a；FCGR2A)的较弱至中等的潜在脱靶结合。针对表达这些蛋白质的细胞的第二次小型筛选指示可能发生结合(图7B)。
C.脱靶抗原依赖性活化
为了基于脱靶效应评价功能活性，使用实施例4中所描述的分析，在K562细胞中表达潜在脱靶结合物PCDH1A和FCGR2A并将其与经转导以表达GPRC5D-203 VL/VH-长间隔子CAR的Jurkat Nur77/RFP报导体细胞共培养。使用表达BCMA的K562细胞作为阴性对照。将细胞以5:1、1:1和1:5的E:T比率培育。测定在每种条件下经GFP+ CAR转导的细胞中的RFP+细胞百分比。如图7C中所示，仅与K562-GPRC5D细胞共培养引起表达抗GPRC5D CAR的报导体细胞的活化；与K562-PCDH1A、K562-FCGR2A或K562 BCMA共培养不会活化表达抗GPRC5D CAR的报导体。
D.GPRC5D依赖性活化
为了进一步确定GPRC5D 203 VL/VH-长间隔子CAR是否特异性识别GPRC5D，使用CRISPR-Cas9系统将GPRC5D自OPM2细胞基因敲除。简言之，选择靠近GPRC5D外显子1(SEQ IDNO:292-296)并在该外显子内的五个CRISPR RNA(crRNA)向导(gRNA)。使crRNA与Alt-RCRISP-Cas9反式活化crRNA(tracrRNA)以1:1比率形成复合物，由此产生两部分gRNA。汇集全部5种gRNA并将其与Cas9以2:1比率培育以产生核糖核蛋白(RNP)复合物。将靶向GPRC5D的Cas9 RNP电穿孔放入OPM2细胞中。使电穿孔的细胞扩增并克隆，且通过聚合酶链反应(PCR)筛选扩增的克隆物以确定在GPRC5D基因座处的缺失。
将OPM2亲本细胞或GPRC5D基因敲除的细胞与经基因工程改造以表达GPRC5D-203VL/VH-长间隔子CAR或抗BCMA CAR的Jurkat Nur77RFP细胞(如实施例4中所述)以1:1比率培养，并培育20小时。通过用流动式细胞测量术测量RFP表达的变化来评估CAR的活化。如图7D中所示，当将Jurkat Nur77/RFP报导体细胞实际上与使用CRISPR-Cas9进行GPRC5D基因敲除的OPM2细胞共培养时，在与OPM2细胞共培养之后由GPRC5D-203VL/VH CAR介导的JurkatNur77/RFP报导体细胞的活化消除。
此等结果揭示，抗GPRC5D-203(VL/VH)-长间隔子CAR特异性识别GPRC5D。
实施例6：靶向GPRC5D的CAR T细胞疗法的活体外活性
基于细胞毒性活性和在抗原存在下诱导产生细胞因子的能力测试并入GPRC5D-203 VL/VH-长间隔子CAR的CAR T细胞的功能活性。为了产生表达抗GPRC5D CAR的T细胞，通过基于免疫亲和力的富集法，自来自人类供体受试者的白血球清除术样品分离出T细胞。如实施例3中所描述，使经分离的T细胞活化并用含有编码抗GPRC5D-203 VL/VH-长间隔子CAR的多核苷酸构建体的逆转录病毒载体转导。作为对照，将来自同一供体的T细胞也用并入抗BCMA scFv或不相关靶向的抗CD19 scFv的CAR转导，或进行模拟转导。
A.细胞毒性
针对MM细胞通过CCLE RNAseq或针对初代MM细胞通过Blueprint RNAseq评价一组多发性骨髓瘤细胞系和初代多发性骨髓瘤细胞中的GPRC5D mRNA表达(图8A；初代多发性骨髓瘤细胞以框显示)。将CAR T细胞与MM1.S、OPM2和RPMI-8226细胞以一系列效应物:靶标(E:T)比率共培养24小时，并监测细胞溶解情况。如图8B中所示，表达抗GPRC5D CAR的T细胞在全部三种细胞系中均诱导细胞毒性，针对供体相配、经模拟转导的T细胞归一化。
CAR T细胞与经基因工程改造以表达萤火虫荧光素酶的OPM2人类MM靶细胞系(其表达内源性BCMA和GPRC5D)(OPM2-ffLuc MM)以一系列E:T比率共培养24小时。在添加荧光素之后，通过ATP依赖性生物发光测定靶细胞的杀灭情况，并针对仅含靶标肿瘤细胞的培养物中的杀灭情况归一化(N＝3，平均值±stdev)。如图9A中所示，表达抗GPRC5D CAR的T细胞在一系列较宽的效应物:靶标(E:T)比率内诱导细胞毒性，自0.03:1E:T比率的80％至1:1E:T比率的98％。此等结果类似于与抗BCMA CAR T细胞共培养的结果，且来自两种MM抗原靶向共培养物的细胞毒性明显高于当将OPM2-ffLuc MM细胞与不相关靶向的抗CD19 CAR T细胞共培养时所见到的背景细胞毒性。
也通过将CAR T细胞与来自患有多次复发性MM的患者的抽出物的初代骨髓单核细胞(BMMC)以1:1的CAR+ T细胞:BMMC共培养过夜，例如24-48小时，来评估针对初代细胞的细胞毒性。通过流动式细胞测量术，基于针对CD3阴性细胞选通之后呈CD138+/CD38hi的存活BMMC的百分比评估来自供体的初代骨髓抽出物MM细胞的杀灭情况。展示初代骨髓抽出物MM细胞(CD138+/CD38hi)杀灭的流动式细胞测量分析描绘图9B中。将BMMC细胞与靶向GPRC5D或BCMA的CAR T细胞共培养使得CD138+/CD38hi的杀灭百分率降低>90％，但与来自同一供体的靶向CD19(“不相关靶向”)的CAR T细胞共培养则不然(图9B；框)。为避免T细胞扩增或转导效率的影响，测定呈CD138+/CD3-的BMMC的百分比，如图9C中所描绘。关于将BMMC与来自额外供体的并入靶向BCMA且不含信号转导结构域的CAR(“del CAR”)或并入指定的靶向BCMA或GPRC5D的scFv的T细胞共培养的流动式细胞测量分析显示于图9D中。在所有情况下，抗GPRC5D CAR T细胞诱导的细胞毒性明显高于具有不含信号转导结构域的CAR(“delCAR”)的T细胞，且与靶向BCMA的CAR T细胞相当。
B.细胞因子分泌
将CAR T细胞与OPM2 MM细胞以1:1共培养或单独培养24小时，并收集上清液以通过
多重测定进行细胞因子分析。
如图10A至10C中所示，对于所评价的细胞因子而言，靶向GPRC5D或BCMA的CAR T细胞在与OPM2 MM细胞系共培养之后的细胞因子分泌型态是类似的。值得注意的是，当与将不相关靶向的靶向CD19的对照CAR T细胞与OPM2细胞共培养或在无靶细胞存在下培养的CART细胞相比较时，靶向任一抗原的CAR T细胞分泌多功能细胞因子型态，且IFNγ、MIP-1a、TNFα(效应物)；GM-CSF、IL2(刺激)；MIP-1b(化学吸引剂)；sCD40L和IL13(调控)细胞因子具有最大增加。
实施例7：靶向GPRC5D的CAR T细胞疗法的增殖和活化活性
在将并入GPRC5D-203 VL/VH-长间隔子CAR的CAR T细胞与表达抗原的细胞共培养之后，测试这些CAR T细胞的增殖和活化活性。为了产生表达抗GPRC5D CAR的T细胞，通过基于免疫亲和力的富集法，自来自人类供体受试者的白血球清除术样品分离出T细胞。如实施例3中所描述，使经分离的T细胞活化并用含有编码抗GPRC5D-203 VL/VH-长间隔子CAR的多核苷酸构建体的慢病毒载体转导，不过该构建体不包括编码GFP卷标的核苷酸。作为对照，将来自同一供体的T细胞也用并入抗BCMA scFv的CAR转导，或经历模拟转导。
将模拟转导的T细胞或抗GPRC5D-203 VL/VH-长间隔子CAR T细胞单独培养(无靶标)，与B细胞急性淋巴母细胞白血病(B-ALL)细胞(Nalm6；GPRC5D-)或MM细胞(OPM2；GPRC5D+)以1:1的效应物(T细胞):靶标(细胞系)比率共培养。T细胞在共培养之前用CellTrace紫(CTV)染色，并在72小时之后针对CD4、CD8和CD25染色。以CD4+和CD8+ T细胞中CTV荧光的稀释测量增殖，且通过CD25(介白素-2受体α；IL2RA)荧光的增加，指示CD25上调，来测量活化。
代表性数据阐述于图11A-D中，图中显示反应具有类似特异性。抗GPRC5D CAR T细胞在OPM2细胞存在下增殖(如由图11A和11B中CellTrace紫色的稀释指示)且使活化标记物CD25上调，但与B-ALL Nalm6细胞共培养时则不然(如图11C和11D中所示)。仿真转导的细胞对MM靶细胞不起反应。
实施例8：GPRC5D CAR T细胞疗法的活体内活性
使用导致骨髓主要疾病的OPM2人类骨髓瘤细胞系异种移植模型评价靶向GPRC5D的CAR T细胞疗法的活体内作用。经由尾静脉对NOD scidγ(NSGTM)小鼠注射2×106个OPM2-ffLuc细胞，使这些细胞植入并扩增14或21天，随后通过尾静脉注射3×106个CAR T细胞进行单次治疗。对照小鼠不接受T细胞(“仅肿瘤”)或接受来自同一供体的经模拟处理的T细胞(“模拟”)。使用ffLuc的生物发光成像(BLI)监测肿瘤负荷。
使用如实施例3中所描述的含编码抗GPRC5D CAR且不含编码GFP卷标的核苷酸的多核苷酸的慢病毒载体转导T细胞，这些T细胞系通过基于免疫亲和力的富集法，自来自人类供体受试者的白血球清除术样品分离。如实施例3中所描述，所评估的CAR包括三种抗GPRC5D scFv中的一种，即GPRC5D-200 VL/VH scFv(SEQ ID NO:2)、GPRC5D-202 VH/VL scFv(SEQ ID NO:5)或GPRC5D-203 VL/VH scFv(SEQ ID NO:8)；长间隔子、人CD28源性跨膜结构域、人4-1BB共刺激结构域和CD3ζ细胞内信号转导结构域。如图12A中所示，FACS分析揭示，不同CAR载体在T细胞表面上同等地表达，该表达使用间隔子特异性抗体测量。
在OPM2注射后14天，监测给予3×106个CAR T细胞的荷瘤小鼠的存活情况(每种CAR构建体8只小鼠)。如图12B中所示，在此模型中用各靶向GPRC5D的CAR T细胞治疗使小鼠的存活率相较于未治疗或用模拟转染的T细胞治疗增加。在CAR T细胞注射后100天，仅用并入GPRC5D-203VL/VH-长间隔子的CAR治疗的小鼠维持100％存活率。
除OPM2模型外，也使用低水平表达GPRC5D mRNA的人类多发性骨髓瘤细胞系RPMI-8226异种移植模型评价靶向GPRC5D的CAR T细胞疗法的活体内作用。对NSG小鼠皮下注射RPMI-8226细胞。当可触知肿瘤时(第0天)，根据类似肿瘤体积将小鼠分入治疗组和对照组中并通过单次静脉内注射3×106个表达GPRC5D-203 VL/VH-长间隔子的细胞进行治疗。对照小鼠不接受T细胞(“仅肿瘤”)或接受模拟处理的T细胞(“模拟”)。通过肿瘤体积监测早期抗肿瘤功效，并在第3天和第14天，通过流动式细胞测量术监测末梢血液中的CAR T细胞扩增情况。如图12C和12D中所示，经基因修饰以表达靶向GPRC5D的CAR的T细胞介导抗肿瘤活性并观察到活体内CAR T细胞扩增。
实施例9：不同共刺激结构域对靶向GPRC5D的CAR T细胞疗法的活体内活性的影响
使用导致骨髓主要疾病的OPM2人类骨髓瘤细胞系异种移植模型评价靶向GPRC5D的CAR T细胞疗法的活体内作用。经由尾静脉对NOD scidγ(NSGTM)小鼠注射2×106个OPM2-ffLuc细胞，使这些细胞植入并扩增14或21天，随后通过尾静脉注射3×106个CAR T细胞进行单次治疗。对照小鼠不接受T细胞或接受模拟处理的来自同一供体的T细胞。使用ffLuc的生物发光成像(BLI)监测肿瘤负荷。
为了产生表达抗GPRC5D CAR的T细胞，将后接编码用于活体内跟踪的外部长腹水蚤荧光素酶(external Gaussian luciferase，extGLuc)的核苷酸的如实施例3中所描述的编码CAR的多核苷酸构建体克隆至逆转录病毒载体中，并使用其转导T细胞，这些T细胞系通过基于免疫亲和力的富集法，自来自人类供体受试者的白血球清除术样品分离。如实施例3中所描述，所评估的CAR包括GPRC5D-203 VL/VH scFv(SEQ ID NO:8)；长间隔子、人CD28源性跨膜结构域、人4-1BB共刺激结构域和CD3ζ细胞内信号转导结构域。也如上文所描述产生并入GPRC5D-203 VL/VH scFv的CAR构建体，不过在该构建体中，4-1BB共刺激信号转导区经CD28共刺激信号转导区(SEQ ID NO:46)取代。
在用3×106个含有4-1BB共刺激信号转导结构域或CD28源性共刺激信号转导结构域的抗GPRC5D CAR T细胞治疗载有OPM2肿瘤的小鼠后，监测存活率和肿瘤生长情况，以比较含有不同共刺激信号转导区的CAR T细胞的活性。在本实施例中，在OPM2注射后21天治疗小鼠以在治疗之前提供较大肿瘤负荷，且每种CAR构建体治疗5只小鼠。
CAR T细胞含有并入GPRC5D-203 VL/VH-长间隔子CAR和4-1BB源性共刺激结构域的CAR(命名为GD-41BBz)，或含有相同CAR但具有CD28源性共刺激信号转导结构域(命名为GD-CD28z)。同时，研究用表达靶向不相关蛋白质CD19且具有长间隔子和CD28共刺激结构域的CAR(命名为19-CD28z)的CAR T细胞作为阴性对照。在本实验中，用于转导T细胞的CAR表达载体也包括嵌合外部长腹水蚤荧光素酶(extGLuc)基因和通过P2A组件与CAR编码序列隔开的CD8跨膜结构域。表达ExtGLuc的细胞可在注射腔肠素(来自ffLuc BLI所需荧光素的独特受质)的后成像，由此允许在同一只小鼠中进行肿瘤细胞(经由ffLuc)和CAR T细胞(经由ExtGLuc)的活体内BLI。
在用任何抗GPRC5D CAR构建体治疗后，经治疗小鼠的存活率相较于用抗CD19 CART细胞治疗的小鼠同等地增大，不管共刺激信号转导结构域如何(图13A)。
利用OPM2-ffLuc肿瘤细胞的荧光素进行的BLI指示，含任何共刺激结构域的抗GPRC5D CAR构建体在CAR T细胞注射之后的第2天与第7天之间均根除OPM2细胞，且根除明显较持久(图13B-D)。相比之下，在用抗CD19CAR T细胞治疗后，小鼠体内的肿瘤继续生长。在无OPM2 BLI信号存在下，抗GPRC5D CAR T细胞治疗的小鼠因继发异种GvHD而在约第60天死亡，此是已知的将人类T细胞注射至NSG小鼠中引起的供体依赖性局限(King等人(2009)Clin.Exp.Immunol.157:104-118；Covassin et al.(20110Clin.Exp.Immunol.166:269-280)。
通过在CAR T细胞治疗后7天，监测表达extGLuc的CAR T细胞的腔肠素BLI来评估CAR T细胞归巢至MM的能力。如图13E中所示，在治疗后一周注射腔肠素之后观测到，含任何共刺激结构域的靶向GPRC5D的CAR T细胞均局限于MM异种移植部位。
实施例10：在骨髓瘤模型中抗GPRC5D和抗BCMA CAR T细胞疗法的活体内剂量反应
在另一项研究中，在OPM2人类骨髓瘤细胞系异种移植模型中评价具有一致CAR主链的抗GPRC5D和抗BCMA CAR T细胞疗法。如实施例3中所描述，抗GPRC5D CAR含有GPRC5D-203 VL/VH scFv(SEQ ID NO:8)以及长间隔子、人CD28源性跨膜结构域、人4-1BB共刺激结构域和CD3ζ细胞内信号转导结构域。基于相同主链产生抗BCMA CAR，但其含有抗BCMA scFv代替抗GPRC5D scFv。将编码CAR的多核苷酸构建体克隆至慢病毒载体中并使用其转导T细胞，这些T细胞系通过基于免疫亲和力的富集法，自来自人类供体的白血球清除术样品分离。
大体上如实施例7中所描述，将约2×106个OPM2-ffLuc细胞注射至NOD scidγ(NSGTM)中以产生OPM2人类骨髓瘤细胞系异种移植模型。OPM2注射后十四(14)天，向小鼠给予较低剂量(3.3×105个)或较高剂量(1×106个)表达抗GPRC5D CAR的T细胞或表达抗BCMACAR的T细胞(N＝8只/条件)。也监测未治疗小鼠和给予经模拟转导的T细胞的小鼠进行比较(N＝8只/条件)。每3至9天监测存活率和肿瘤负荷(OPM-ffLuc的BLI)直至90天。
就两种剂量而言，靶向GPRC5D的CAR T细胞在经治疗小鼠中诱导肿瘤消退方面(图14A；分别为三角形相对于正方形)和在增大存活率方面(图14B；三角形相对于正方形)类似于或优于靶向BCMA的CAR T细胞。对于两种类型的CAR T细胞疗法，在肿瘤消退的动力学方面观察到剂量反应(图14A)。
实施例11：对靶向/脱靶(On Target/Off Tumor)效应的评价
部分由于在毛囊中侦测到GPRC5D表达(参见实施例1，表E1)，在细胞、鼠类和非人类灵长类动物模型系统中研究靶向GPRC5D的CAR T细胞疗法的脱靶、靶向效应的影响。
A.必要正常细胞对靶向GPRC5D的CAR T细胞的影响
为了评价必要正常细胞对靶向GPRC5D的CAR T细胞的潜在活化作用，将初代人类T细胞基因修饰成表达GPRC5D-203 VL/VH-长间隔子CAR并将其与一组分离的初代人类细胞类型共培养，之后测量细胞因子释放情况。将表达GPRC5D-203 VL/VH-长间隔子CAR的T细胞与阳性对照OPM2 MM细胞共培养使得大量释放IFNγ、IL-2和TNFα，而在与所研究的二十种正常组织类型中的任一种共培养之后培养基中细胞因子的量最少(图15A-15C)。举例而言，当与自正常组织分离的细胞共培养之后的最高值相比较时，在与OPM2共培养后，IFNγ增高2600倍。
B.报导体细胞中的靶向/脱靶效应
为了在小鼠和非人类灵长类动物中研究靶向、脱靶效应，鉴别出与鼠类GPRC5D(mGPRC5D)和/或食蟹猕猴GPRC5D(cGPRC5D)交叉反应的抗GPRC5D CAR，mGPRC5D和cGPRC5D分别与人类GPRC5D(hGPRC5D)具有82％和96％的氨基酸同源性。转导K562细胞以使其表达人类(hGPRC5D)、cGPRC5D或mGPRC5D。用实施例3中所描述的编码CAR的多核苷酸构建体转导以上描述的Jurkat Nur77-RFP活化报导体细胞系。在将各靶细胞类型与各表达抗GPRC5DCAR的报导体细胞以1:1的效应物:靶标比率共培养之后，以GFP+ CAR转导的细胞中的RFP+细胞百分比测量CAR活化情况。同时，将报导体细胞与亲本K562细胞一起培育，作为阴性对照。
图15B中提供了含有长间隔子和选自以下的scFV的示例性CAR的结果：GPRC5D-200VL/VH、GPRC5D-201 VL/VH、GPRC5D-202 VH/VL、GPRC5D-203 VL/VH、GPRC5D-205 VL/VH和GPRC5D-206 VH/VL。表达含GPRC5D-203 VL/VH scFv的CAR的细胞不与mGPRC5D或cGPRC5D交叉反应。表达含GPRC5D-205 VL/VH scFv的CAR的细胞与mGPRC5D和cGPRC5D交叉反应，且图15D中所示的其他4种CAR结合cGPRC5D。
C.小鼠模型中的靶向/脱靶效应
在鼠类肿瘤模型中测试表达CAR的人类CAR T细胞，该CAR并入与mGPRC5D交叉反应的GPRC5D-205 VL/VH scFv-长间隔子CAR或非交叉反应性GPRC5D-203 VL/VH scFv-长间隔子CAR。如上文所描述，将OPM2-ffLuc细胞注射至NOD scidγ(NSGTM)中以产生OPM2人类骨髓瘤细胞系异种移植模型。在注射OPM2 MM细胞系后14天，对小鼠注射3×106个人类CAR+ T细胞。未治疗和模拟转导的T细胞治疗充当对照。每日获取临床观察结果，包括体温和体重，持续13天，且每2-3天测量肿瘤负荷(通过OPM2 BLI评估)，持续14天。
如体重和体温曲线所示，含交叉反应性GPRC5D-205 VL/VH和非交叉反应性GPRC5D-203 VL/VH CAR的T细胞具有良好耐受性，且这些曲线在未治疗组与不同CAR T细胞治疗组之间并无显著不同(分别为图16A和图16B)。另外，含交叉反应性GPRC5D-205 VL/VH和非交叉反应性GPRC5D-203VL/VH CAR的T细胞疗法在减小OPM2肿瘤负荷方面显示出活性(图16C)。此外，在任何治疗条件下均未观察到毛皮损失或其他明显的毒性临床征象。
D.在非人类灵长类动物(NHP)模型中的靶向/脱靶效应
在灵长类动物肿瘤模型中测试表达CAR的人类CAR T细胞，该CAR并入与cGPRC5D交叉反应的GPRC5D-202 VH/VL scFv-长间隔子CAR。自命名为1001、1002和1003的三(3)只雄性非人类灵长类动物(NHP；食蟹猕猴)收集并分离T细胞，并用含有编码与cGPRC5D交叉反应的GPRC5D-202 VH/VL CAR的多核苷酸的逆转录病毒转导。如表E11A中所示，NHP T细胞中CAR的转导率是36-49％的CD3+细胞。在基因转移之后，NHP T细胞仍保持存活(80-92％)。图17A提供CAR表达的代表性FACs分析，CAR表达基于共表达的截短受体用作替代物标记物进行测量，该受体通过核糖体跳跃组件与编码CAR核酸序列隔开。
Tcm(T中枢记忆型；CD95+CD28+)；Teff(T效应记忆型；CD95+CD28-)
评价NHP T细胞针对自体靶标抗原呈现细胞(tAPC)和K562-cGPRC5D细胞的细胞溶解活性和细胞因子产生。如图17B-E中所示，确定NHP T细胞响应于暴露于抗原而具有功能，展现细胞溶解活性(图17B和D)和干扰素γ释放(在与表达GPRC5D的细胞以1:1E:T比率共培养之后释放量接近10,000pg/mL上清液)(图17C和E)。
在CAR T细胞注射之前2天和4天，用淋巴球耗竭调节性环磷酰胺(40mg/kg)预先治疗三(3)名NHP(即1001、1002和1003，由其得到上文产生的CAR T细胞)，且接着给予10×106个如上文所描述产生的CAR+半胱天冬酶3-自体食蟹猕猴T细胞/kg。自T细胞注射之前8天开始且持续到T细胞注射后21天，每2-7天获得临床观察结果，包括体温和体重。由于涉及毛囊表达GPRC5D，也使全部三名NHP在注射CAR T细胞之前4天暴露于皮肤刺激剂咪喹莫特(imiquimod)，以便增加侦测到可能毒性的敏感性。在CAR T细胞注射之后四天，使各NHP接受10×106个cGPRC5D+半胱天冬酶-自体人工抗原呈现T细胞/kg以用作抗原储集器并增进CAR T细胞扩增。在给予CAR T细胞后21天，处死NHP以进行整体和组织学检查。
在输注之后第21天，使用针对编码含GPRC5D-202 VH/VL的CAR的DNA进行的PCR监测末梢血液和骨髓中的T细胞存留情况。自2至4卷曲(20μm厚度)的FFPE细胞集结粒或组织样品分离出总RNA，并使用cDNA合成套组合成cDNA。PCR使用如下定量引物进行：GPRC5D正向引物(5'-ACTGCATCGAGTCCACTGGAGA-3'；SEQ ID NO:253)和反向引物(5'-GGATCTTTCGCATGAGGAAGAG-3'，SEQ ID NO:254)各0.25μM；以及管家基因β-肌动蛋白正向引物(5'-AGCATCCCCCAAAGTTCAC-3'；SEQ ID NO:255)和反向引物(5'-AAGGGACTTCCTGTAACAACG-3'，SEQ ID NO:256)各0.25μM。在384孔PCR盘中一式两份进行PCR反应。CAR转导的NHP T细胞用作阳性对照。如图18A中所示，在处死以进行整体和组织学检查时，在3名NHP中3名的末梢血液中和在3名NHP中2名的骨髓中侦测到输注后CAR T细胞存留。
如通过临床观察结果，即在CAR T细胞治疗之后保持稳定的体温(图18B)和体重曲线(图18C、D)所测定，含GPRC5D-202 VH/VL的CAR T细胞疗法具有良好耐受性。显微镜发现结果的概述提供于表E11B中。IFN-γ、IL-6或其他促发炎细胞因子未增加，且临床化学观察结果无相关变化。未出现毛皮损失或在临床上或病理上值得注意的皮肤、肺或其他组织损伤的其他临床征象。总体而言，此等数据与在NHP模型中给予GPRC5D特异性CAR T细胞不会引起与CAR T细胞的存在相关的任何明显毒性或组织病理的观察结果相符。
本表中省略不存在发现的严重程度等级
a圆括号中的数字表示具有发现的动物的数量
b动物鉴别数量
实施例12：鼠类BCMA抗原损失模型中靶向GPRC5D的CAR T细胞的评价
产生BCMA阴性多发性骨髓瘤的鼠类模型并使用其评估当向该模型的动物给予时靶向GPRC5D的CAR T细胞的影响。
为了产生BCMA基因敲除肿瘤细胞，用含BCMA单向导RNA(sgRNA)慢病毒转导表达GFP/荧光素酶Cas9的OPM2细胞。将针对SEQ ID NO:291中所示的靶序列的BCMA sgRNA克隆至pLentiV2质粒中，且随后与包装质粒(Pax2和Vsvg)一起共转染293T细胞中。转导在10μg/mL聚凝胺存在下进行。用4μg/mL嘌呤霉素选择经转导的细胞，保持10天，并将单细胞放入96孔盘中。使个别集落扩增并用抗BCMA抗体染色以确定BCMA基因敲除。使经确定的BCMA基因敲除的OPM2-GL-Cas9细胞的克隆物进一步扩增以用于实验。
为了模拟多发性骨髓瘤环境中BCMA抗原阴性肿瘤细胞(其可在用BCMA靶向剂治疗后潜在地导致复发或进展)的存在，在第0天对NSG小鼠注射未经操作的OPM2WT(约75％)与GFP/ffLuc+CRISPR介导的OPM2BCMA-KO(约25％)的混合群体(1×106个总OPM2细胞)。使OPM2细胞群植入并扩增7天。在第8天，对小鼠注射4×106个靶向CD19或BCMA的CAR T细胞。在第16天，预先注射靶向BCMA的CAR T细胞的小鼠注射4×106个表达抗BCMA CAR或GPRC5D-203 VL/VH-长间隔子CAR的T细胞。
使用BLI获取小鼠图像以侦测OPM2BCMAKO细胞(表达GFP/ffLUC的细胞群)。小鼠在第34天的图像揭示，OPM2BCMAKO亚群在第8天和第16天接受靶向BCMA的CAR T细胞注射的小鼠中发展。相比之下，在第8天接受靶向BCMA的CAR T细胞且在第16天接受靶向GPRC5D的CAR T细胞的小鼠在第34天未展现发光(图19A和19B)。这些结果与以下发现相符：抗GPRC5D CAR T细胞可在多发性骨髓瘤中展现抗肿瘤活性，甚至在肿瘤细胞不表达BCMA抗原或不对针对BCMA的CAR T细胞起反应的情况下也如此；表达GPRC5D-203 VL/VH CAR的T细胞可挽救肿瘤逃避。
在第35天通过流动式细胞测量术分析骨髓中CD138hi/GFP+细胞的百分比以评估正在进展的小鼠的骨髓中OPM2细胞的组成(hCD138+；WT：GFP-；BCMA-KO：GFP+)。自用靶向CD19-BCMA-或GPRC5D的CAR T细胞治疗的小鼠的经吹扫骨髓中评估OPM2(hCD138+)组合物(WT：GFP-；BCMAKO：GFP+)(图20A和B；代表3只小鼠/组；n＝2次重复实验，具有类似结果)。执行活细胞和死细胞选通，但未示出。来自在第8天接受靶向BCMA的CAR T细胞注射的小鼠的大部分骨髓细胞在第35天呈CD138hi/GFP+(图20A和B)。结果与靶向BCMA的CAR T细胞根除OPM2WT细胞的能力相符，尽管OPM2BCMA-KO肿瘤细胞亚群存留和/或进展。
实施例13：产生靶向GPRC5D和BCMA的经双重靶向嵌合抗原受体(CAR)基因工程改造的T细胞组合物
产生双重靶向T细胞组合物，其中这些组合物含有表达用于双重靶向BCMA和GPRC5D的嵌合抗原受体(CAR)的细胞。产生两种独立的经基因工程改造的T细胞组合物，其中一种经基因工程改造以表达抗BCMA CAR且另一种经基因工程改造以表达抗GPRC5D CAR，并将独立细胞组合物汇集起来。
示例性抗BCMA CAR含有能够结合表达BCMA的细胞的scFv抗原结合结构域(例如BCMA-55 VL/VH scFv(SEQ ID NO:241)；SEQ ID NO:17中所示的免疫球蛋白铰链-CH2-CH3，由SEQ ID NO:73中所示的序列编码；人CD28源性跨膜结构域(例如SEQ ID NO:18)；人4-1BB源性细胞内信号转导结构域(例如SEQ ID NO:19)；以及人CD3ζ源性细胞内信号转导结构域(例如SEQ ID NO:20)。
示例性抗GPRC5D CAR含有能够结合GPRC5D的scFv抗原结合结构域(例如GPRC5D-203 VL/VH scFv(SEQ ID NO:8)；SEQ ID NO:17中所示的免疫球蛋白铰链-CH2 CH3，由SEQID NO:73中所示的序列编码；人CD28源性跨膜结构域(例如SEQ ID NO:18)；人4-1BB源性细胞内信号转导结构域(例如SEQ ID NO:19)；以及人CD3ζ源性细胞内信号转导结构域(例如SEQ ID NO:20)。
A.产生汇集的表达抗GPRC5D和抗BCMA CAR的T细胞
将编码每一个别CAR的多核苷酸连接至下游核糖体跳跃组件(诸如自裂解T2A序列(SEQ ID NO:44中所示的序列，编码SEQ ID NO:37中所示的氨基酸序列)并将其克隆至慢病毒表达载体中。将T细胞组合物分别基因工程改造成表达抗BCMA CAR或抗GPRC5D CAR。对于每一种，用含有编码抗BCMA CAR或抗GPRC5D CAR的核酸的慢病毒载体中的任一种转导通过基于免疫亲和力的富集法自来自人类供体受试者的白血球清除术样品分离的Nur77-RFPJurkatT细胞系或初代T细胞。在转导之后，且在一些情况下，在扩增之后，用对各别CAR具有特异性的抗体对T细胞进行染色并通过流动式细胞测量术分析确定细胞的转导和CAR的表达。
在使用之前，以1:1的表达抗BCMACAR的细胞与表达抗GPRC5D CAR的细胞的比率汇集所收集的用抗BCMA CAR或抗GPRC5D CAR转导的初代人类T细胞(“αGPRC5D和αBCMA汇集的细胞”)。
实施例14：抗BCMA CAR的评估
评估以上实施例中描述的示例性抗BCMA CAR的抗原非依赖性(进补)信号转导以及在表达BCMA和非表达性细胞存在下的增殖和活化情况。
A.抗原非依赖性(进补信号转导)
用编码抗CD19 CAR(对照)、或如实施例13中所描述的示例性抗BCMA CAR的病毒载体转导先前实施例中所描述的Nur77-RFP报导体细胞系，两种病毒载体的不同之处在于，转导的替代物标记物是超折迭绿色荧光蛋白sfGFP。在本模型中，进补信号转导由在无BCMA抗原刺激存在下RFP的表达指示。在不进行抗原刺激的情况下培育表达CAR的细胞3天以评估抗原非依赖性(进补)信号转导的程度，且通过流动式细胞测量术评价其RFP表达。
如图21A中所示，如通过表达CAR的细胞(通过GFP+细胞指示)中RFP+细胞(指示进补报导体活化)的百分比所测定，示例性表达抗BCMACAR的细胞在无抗原刺激存在的情况下展现较低RFP表达。
B.靶向BCMA的CAR T细胞的增殖和活化
在示例性表达抗BCMA CAR的T细胞与表达不同BCMA量的表达BCMA的细胞一起培育后，评估细胞溶解活性、细胞因子释放和增殖。在存在或不存在可溶性BCMA情况下评价所有活性。
用CD3/CD28珠粒刺激自两个人类供体(D#1和D#2)收集的1:1比率的CD4+和CD8+初代T细胞，并用慢病毒载体转导以稳定表达BCMA-55CAR。在表达BCMA的靶细胞存在下，以1:3、1:1或3:1的E:T比率培养经转导的细胞。也将来自同一供体的经模拟处理的T细胞与靶细胞混合以用作对照。BCMA+靶细胞Daudi、RPMI-8226和K562-BCMA细胞展现表面不同水平的BCMA抗原密度(抗原密度：Daudi(<1000个BCMA分子/细胞)<RPMI-8226<K562-BCMA)，并用羧基荧光素琥珀酰亚氨基酯(CFSE)染色，随后与T细胞一起培育。在具有T细胞和BCMA+靶细胞的培养物中也包括相等数量的靶标阴性细胞，其不表达BCMA且经细胞踪迹紫(violet；CTV)染色。在培育24小时之后，通过流动式细胞测量术测量残留BCMA+对比BCMA-靶细胞，且评估靶细胞溶解的程度，其指示细胞毒性。
当与靶细胞一起培养时，不论BCMA表达量如何，表达抗BCMA CAR的T细胞均展示类似的细胞溶解活性(图21B)。另外，对于每个细胞表达大于100,000个分子的靶细胞(NCI-H929)，观察到类似结果。经仿真处理的T细胞针对任何BCMA+靶细胞系不展示活性。对BCMA表达呈阴性的靶细胞不被来自所测试的任何供体的抗BCMA CAR T细胞溶解(数据未示出)。
在培育后，分析上清液中积累的IFN-γ、TNF-α和IL-2细胞因子。数据与以下结论相符：抗BCMA CAR T细胞在与表达BCMA的靶细胞接合后释放一系列细胞因子；且所释放的细胞因子的水平一般与抗原水平的增加对应(即，Daudi<RPMI 8226<K562-BCMA)。IFN-γ的结果显示于图21C中；对于TNF-α和IL-2观察到类似数据(数据未示)。抗BCMA CAR T细胞不响应于BCMA阴性靶标而释放细胞因子，其也不会在无任何靶细胞存在的情况下表达细胞因子，由此展示对BCMA+靶细胞的特异性和进补信号转导的缺乏。
评估表达抗BCMA CAR的T细胞在存在可溶性BCMA对比不存在可溶性BCMA情况下的活性。将表达示例性抗BCMA CAR的T细胞与RPMI-8226肿瘤细胞、与重组BCMA-Fc或与来源于NCI-H929多发性骨髓瘤细胞的细胞培养物上清液(分泌BCMA的细胞系上清液含有可溶性BCMA)共培养。观察到肿瘤细胞溶解和细胞因子产生均不受任何浓度(高达1000ng/mL)的NCI-H929源性可溶性BCMA影响。在类似地较高生理水平的重组BCMA下，肿瘤细胞溶解和细胞因子产生仅极低程度地减少。
在表达抗BCMA CAR的T细胞和经模拟处理的T细胞中测量响应于BCMA的增殖。用细胞踪迹紫(violet；CTV)标记经转导的T细胞，并在BCMA阳性靶细胞、BCMA阴性靶细胞或无细胞存在下，以1:1的效应物:靶标(E:T)比率培养72小时。通过流动式细胞测量术测量增殖。仅观察到表达抗BCMA CAR的T细胞响应于与BCMA阳性靶细胞一起培育而发生T细胞(CD4+和CD8+ T细胞)增殖(数据未示)。
实施例15：含有表达抗GPRC5D和抗BCMA CAR的细胞的经基因工程改造的T细胞组合物的活体外评估
A.在BCMA或GPRC5D KO细胞存在下的抗原依赖性活性
为了理解抗BCMA和抗GPRC5D CAR的特异性，分别如先前实施例5和12中所描述对OPM2细胞进行GPRC5D或BCMA基因敲除。如图22A中所示，流动式细胞测量分析确定在OPM2GPRC5D KO细胞中缺乏GPRC5D表达且在OPM2 BCMA KO细胞中缺乏BCMA表达。OPM2野生型(OPM2 WT)细胞充当对照，显示GPRC5D和BCMA的表达。
评估含有经基因工程改造成仅表达抗GPRC5D CAR(αGPRC5D)或仅表达抗BCMA CAR(αBCMA)的细胞的Jurkat Nur77-RFP报导体细胞组合物的抗原特异性活性。将JurkatNur77-RFP报导细胞组合物与OPM2 WT、OPM2 GPRC5D KO或OPM2 BCMA KO细胞以1:1比率共培养20小时。通过用流动式细胞测量术测量RFP表达的变化来评估由细胞组合物表达的CAR的抗原特异性刺激作用。
如图22B中所示，当将仅表达靶向GPRC5D的CAR(αGPRC5D)或仅表达靶向BCMA的CAR(αBCMA)的Jurkat Nur77-RFP报导体细胞与分别经历GPRC5D或BCMA基因敲除的OPM2细胞共培养时，未观察到这些细胞的活化。此结果与抗BCMA和抗GRPC5D CAR对其各别抗原具有特异性的发现相符。
实施例16：汇集的含有表达靶向GPRC5D和BCMA的CAR的双重靶向细胞组合物的活体内评估
产生多种鼠类多发性骨髓瘤模型并使用其评估T细胞组合物的活体内作用，这些T细胞组合物含有(1)经基因工程改造成仅表达抗GPRC5D CAR的细胞(αGPRC5D)、(2)经基因工程改造成仅表达抗BCMA CAR的细胞(αBCMA)、或(3)汇集的含有分别经基因工程改造以表达抗BCMA CAR或抗GPRC5D CAR的细胞的细胞，以1:1的表达抗BCMA CAR的细胞与表达抗GPRC5D CAR的细胞比率汇集(αGPRC5D和αBCMA汇集的细胞)。
A.多发性骨髓瘤细胞系的GPRC5D和BCMA表达
在产生鼠类多发性骨髓瘤模型之前，评估各种多发性骨髓瘤细胞系中GPRC5D和BCMA的相对mRNA和蛋白质表达量。
通过RNA测序(RNA-seq)测定以下多发性骨髓瘤细胞系中如由癌细胞系百科全书(CCLE)所提供的GPRC5D和BCMA的mRNA表达量：KMS12BM、RPMI8226、U266B1、MM.1S、OPM2和NCI-H929。如图23中所示，在所有所分析的细胞系中，KMS12BM和RPMI8226细胞系展现两种基因的最低表达量。相较于其他细胞系，U266B1细胞系展现中等的GPRC5D和BCMA基因表达量。相较于其他细胞，MM.1S和OPM2细胞系展现较高的GPRC5D基因表达量和中等的BCMA基因表达量。最后，在所有测试细胞系中，NCI-H929展现最高的GPRC5D和BCMA基因表达量。
如图24中所示，另外分析以下细胞系中GPRC5D和BCMA的蛋白质表达量：K562亲本细胞、经基因工程改造以表达GPRC5D的K562细胞、KMS12BM、MM.1S、NCI-H929、OPM2和RPMI8226。用抗BCMA或抗GPRC5D抗体和活力标记物共标记5×105个总细胞，并通过流动式细胞测量术测定表达。就GPRC5D蛋白质表达而言，经基因工程改造以表达GPRC5D的K562细胞充当阳性对照，展示最高的GPRC5D表达量，而亲本K562细胞充当阴性对照，其GPRC5D表达量可忽略。大体上mRNA表达数据一致，KMS12BM和RPMI8226的GPRC5D蛋白质表达量相对较低。NCI-H929的GPRC5D蛋白质表达量中等，而MM.1S和OPM-2的GPRC5D蛋白质表达量相对较高。就BCMA蛋白质表达而言，KMS12BM、MM1S和RPMI8226的BCMA蛋白质表达量均为低等至中等，而OPM-2的BCMA蛋白质表达量较高。又，NCI-H929细胞的BCMA蛋白质表达量最高。
综合而言，这些结果与以下发现相符：RPMI8226细胞系展现相对较低的GPRC5D表达，而OPM2细胞系展现相对较高的GPRC5D表达。
B.在OPM2鼠类异种移植模型中表达抗BCMA和抗GPRC5D CAR的T细胞组合物的评估
在利用表达一种或两种靶标抗原的肿瘤的鼠类肿瘤模型中测试BCMA和GPRC5D双重靶向初代人类T细胞组合物，这些T细胞组合物含有(1)仅表达抗GPRC5D CAR的细胞、(2)表达抗BCMA CAR的细胞、或(3)汇集的分别经基因工程改造以表达抗BCMA CAR或抗GPRC5DCAR的细胞，以1:1的表达抗BCMACAR的细胞与表达抗GPRC5D CAR的细胞的比率汇集(αGPRC5D和αBCMA汇集的细胞)。
为了产生肿瘤模型，如实施例5和12中所描述，将OPM2-rFLuc细胞中的GPRC5D和BCMA分别基因敲除，以产生GPRC5D和BCMA单基因敲除的OPM2细胞系(分别为“OPM2 GPRC5DKO”和“OPM2 BCMA KO”)。作为对照，将表达GPRC5D和BCMA两者的OPM2-rFLuc细胞(OPM2 WT)与单基因敲除细胞系相比较。对NOD scidγ(NSGTM)注射2×106个总OPM2、OPM2 GPRC5D KO或OPM2 BCMA KO细胞。在注射(第0天)后第14天，测定肿瘤的生物发光并用含有经基因工程改造以表达抗GPRC5D CAR(αGPRC5D)或抗BCMA CAR(αBCMA)的细胞或含有αGPRC5D和αBCMA汇集的细胞的初代T细胞组合物治疗肿瘤大小类似的小鼠。在注射OPM2细胞之后14天，对小鼠注射以下三种剂量T细胞组合物中的一种：5×105个总CAR T细胞、1×106个总CAR T细胞或2×106个总CAR T细胞。未治疗和仿真转导的T细胞组合物充当对照。
如图25A和25B中所示，在给予3×106个总CAR T细胞的小鼠中，肿瘤负荷(通过OPM2 BLI评估)在用αGPRC5D和αBCMA汇集的细胞治疗的小鼠较低，不管注射的OPM2细胞类型如何。相比之下，当注射OPM2 BCMA KO细胞时，仅用表达抗BCMA CAR的细胞(αBCMA)治疗的小鼠展示递增的肿瘤负荷(图25B，上图)。类似地，当注射OPM2 GPRC5D KO细胞时，仅用表达抗GPRC5D CAR的细胞(αGPRC5D)治疗的小鼠展示递增的肿瘤负荷(图25B，下图)。此结果与个别CAR对其靶向抗原具有特异性的普遍发现一致。
在类似实验中，在注射表达BCMA和GPRC5D的OPM2细胞之后，用来自组合物的5×105个、1×106个或2×106个总初代人类T细胞治疗NOD scidγ(NSGTM)小鼠，这些组合物含有(1)经基因工程改造以表达抗BCMA CAR的细胞、(2)经基因工程改造以表达抗GPRC5D CAR的细胞、或(3)αGPRC5D和αBCMA汇集的细胞。作为对照，也用模拟转导的初代人类T细胞组合物治疗小鼠。如图26中所示，评估直至100天的存活率。如所示，在本模型中，相较于给予含有仅表达抗BCMA CAR的细胞的T细胞组合物，给予含有αGPRC5D和αBCMA汇集的细胞的T细胞组合物使抗肿瘤功效改善。
C.在RPMI8226鼠类异种移植模型中T细胞组合物的评估
除OPM2模型外，也使用低水平表达GPRC5D的RPMI 8226模型评价含有表达抗GPRC5D CAR的细胞(αGPRC5D)或表达抗BCMA CAR的细胞(αBCMA)或含有两者的人类T细胞组合物的活体内作用。
将总计1×107个RPMI8226细胞皮下注射至NOD scidγ(NSGTM)体内。在注射RPMI226细胞后约25天，给予表达CAR的T细胞组合物，这些T细胞组合物含有(1)经基因工程改造以表达抗GPRC5D CAR的细胞(αGPRC5D)、(2)经基因工程改造以表达抗BCMA CAR的细胞(αBCMA)、或(3)产生的表达靶向GPRC5D的CAR的细胞比表达靶向BCMA的CAR的细胞比率为1:1的汇集细胞(αGPRC5D和αBCMA汇集的细胞)。在注射RPMI8226细胞之后25天，用以下三种剂量的T细胞组合物中的一种治疗小鼠：1.25×106个总CAR T细胞、2.5×106个总CAR T细胞或5×106个总CAR T细胞。未治疗和模拟转导的T细胞治疗充当对照。
如图27中所示，在用仅表达抗GPRC5D CAR的细胞治疗的小鼠中肿瘤体积以剂量依赖性方式增加。相比之下，用仅表达抗BCMA CAR的细胞或用αGPRC5D和αBCMA汇集的细胞治疗小鼠展示肿瘤体积的最低限度增加。值得注意的是，结果指示，在所有测试剂量(5×106个、2.5×106个和1.25×106个)下，αGPRC5D和αBCMA汇集的细胞具有类似于仅表达抗BCMACAR的T细胞的功效，不过抗BCMA CAR的贡献是汇集的T细胞组合物中的一半。此结果指示，在汇集的组合物中表达抗GPRC5D CAR的细胞以大于其单次剂量的方式起作用。如图28中所示，评估直至第100天的存活率。分析存活率揭示类似结果，因为用仅表达抗GPRC5D CAR的细胞治疗的小鼠在整个时间段内展现降低的存活率，但在较高剂量下，用αGPRC5D和αBCMA汇集的细胞治疗的小鼠展现与用仅表达抗BCMA CAR的T细胞治疗的小鼠类似的功效。此等结果与以下普遍发现一致：用仅表达抗GPRC5DCAR的细胞治疗在低水平表达GPRC5D的肿瘤模型中可能不太有效，但抗GPRC5D CAR在表达双重靶向CAR的细胞组合物存在下可促成抗肿瘤功效。
实施例17：产生双顺反子抗BCMA和抗GPRC5D CAR基因工程改造的T细胞组合物
对初代人类T细胞组合物进行基因工程改造以产生双重靶向T细胞组合物，其中这些组合物含有表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞以进行BCMA和GPRC5D的双重靶向。如图29中所概述，产生五种独立的经基因工程改造的T细胞组合物。每一所产生的CAR构建体含有针对GPRC5D(例如SEQ ID NO:8)或BCMA(例如SEQ ID NO:241)的示例性scFv抗原结合结构域；长间隔子(铰链-CH2-CH3，228aa；SEQ ID NO:17；具有限制Fc受体结合的CH2修饰)；人CD28源性跨膜结构域(SEQ ID NO:18)；人4-1BB源性细胞内信号转导结构域(SEQ ID NO:19)或人CD28源性细胞内信号转导结构域(SEQ ID NO:18)；以及人CD3ζ源性细胞内信号转导结构域(SEQ ID NO:20)。
在一种策略(由图29的(i)和(ii)显示)中，并行制造出表达针对BCMA或GPRC5D的单一CAR的细胞并汇集成含有1:1比率的表达抗BCMA CAR的细胞和表达抗GPRC5D CAR的细胞(GPRC5D和BCMA汇集的细胞)的单一组合物。汇集组合物中的表达抗BCMA CAR的T细胞经基因工程改造以表达并入4-1BB共刺激结构域(SEQ ID NO:312)的抗BCMA CAR。汇集组合物中的表达抗GPRC5D CAR的T细胞经基因工程改造以表达并入4-1BB共刺激结构域(SEQ IDNO:313)或CD28共刺激结构域(SEQ ID NO:314)的抗GPRC5D CAR。由此产生两种不同的汇集组合物。第一组合物含有表达并入4-1BB共刺激结构域的抗BCMA CAR的细胞和表达并入4-1BB共刺激结构域的抗GPRC5D CAR的细胞(BCMA-41BB和GPRC5D-41BB汇集的细胞)。第二组合物含有表达并入4-1BB共刺激结构域的抗BCMA CAR的细胞和表达并入CD28共刺激结构域的抗GPRC5D CAR的细胞(BCMA-41BB和GPRC5D-CD28汇集的细胞)。产生含有仅表达抗BCMACAR或仅表达抗GPRC5D CAR的细胞的独立组合物充当对照。
在图29的(iii)和(iv)中所示的另一种双重靶向策略中，产生编码两种独立CAR(抗BCMA和抗GPRC5D)的双顺反子构建体，其中编码抗BCMA CAR与编码抗GPRC5D CAR的核苷酸序列通过编码T2A双顺反子自裂解肽的核苷酸序列(SEQ ID NO:319，编码SEQ ID NO:37)分隔开。使编码不同CAR的多核苷酸密码子趋异以减少编码抗BCMA CAR与编码和GPRC5DCAR的核苷酸的同源重组。在(iii)中所描绘的构建体中，两种CAR均并入4-1BB共刺激结构域(BCMA-41BB-GPRC5D-41BB；SEQ ID NO:315)。在(iv)中所描绘的构建体中，抗BCMA CAR并入4-1BB共刺激结构域且抗GPRC5D CAR并入CD28共刺激结构域(BCMA-41BB-GPRC5D-CD28；SEQID NO:316)。
在另一种双重靶向策略中，产生如(v)中所示的编码串联BCMA特异性scFv和GPRC5D特异性scFv的“单柄”CAR构建体(GPRC5D-BCMA-41BB；SEQ ID NO:317)，其中编码该两种scFv的序列通过柔性连接物(SEQ ID NO:320)分隔开。示例性构建体并入4-1BB共刺激结构域(SEQ ID NO:60，编码SEQ ID NO:19)。
大体上如实施例3中所描述，将编码各种CAR的核酸构建体克隆至逆转录病毒表达载体中以转导初代人类T细胞。在逆转录病毒转导细胞之后，通过流动式细胞测量分析，用抗GPRC5D CAR或抗BCMACAR特异性试剂，或针对所有CAR构建体共有之间隔子结构域的抗体评估各种构建体的表达。如图30中所示，初代人类T细胞同等地表达所有测试构建体。荧光减一(FMO)阴性对照不展现表达。
在转导后四至十天，使用各CAR特异性试剂评估初代人类T细胞的转导效率。结果显示于图31中。对于所有评估的供体，相较于存在于汇集CAR组合物中的经基因工程改造以表达单一CAR的细胞(如图31的i和ii所示)，测定用双重靶向双顺反子构建体(如图31的iii和iv所示)或“单柄”构建体(如图31的v所示)基因工程改造的细胞的逆转录病毒转导效率在50-70％之间。所示结果来自代表性供体。
实施例18：双顺反子抗BCMA和抗GPRC5D嵌合抗原受体的活体外评估
A.T细胞组合物的细胞毒性
将如实施例17中所描述产生的表达CAR的初代人类T细胞与OPM2野生型多发性骨髓瘤细胞系或BCMA基因敲除(KO)的OPM2细胞以递增的E:T比率共培养24小时，并评估细胞溶解。以下表达单靶向CAR的细胞组合物充当对照：含4-1BB共刺激结构域的抗BCMA CAR(BCMA-41BB)、含4-1BB共刺激结构域的抗GPRC5D CAR(GPRC5D-41BB)或含CD28共刺激结构域的抗GPRC5D CAR(GPRC5D-CD28)。作为阴性对照，产生细胞组合物，其中细胞表达相同抗BCMA CAR，但缺乏4-1BB和CD3ζ信号转导结构域(BCMA del CAR；SEQ ID NO:318)。
如图32A中所示，所有示例性所产生的细胞组合物能够有效地溶解野生型OPM2靶细胞，但表达BCMA del CAR的细胞除外。如图32B中所示，所有示例性所产生的细胞组合物能够溶解BCMA KO OPM2靶细胞，但表达BCMA del CAR的细胞和表达单靶向BCMA-41BB CAR的细胞除外，与抗BCMA CAR对其靶标抗原的选择性相符。结果以平均值±SEM给出且显示一式三份操作的代表性实验。
B.T细胞组合物的细胞因子分泌
将示例性所产生的细胞组合物与表达BCMA和GPRC5D两者(图33A)、仅表达BCMA(图33B)或仅表达GPRC5D(图33C)的靶细胞以1:1比率共培养24小时。收集上清液以通过
多重测定来分析细胞因子。图33A-C中显示示例性细胞因子GM-CSF、IFNg、IL-13和IL-2(自左至右)的结果；浓度以pg/mL为单位，且标度上的刻痕表示50,000pg/mL和100,000pg/mL。
当与表达两种抗原的靶细胞一起培养时，所有示例性所产生的细胞组合物均展现细胞因子分泌，但表达BCMA del CAR的细胞除外。当与仅表达BCMA的靶细胞一起培养时，仅表达单靶向抗GRPC5D CAR的细胞组合物(GPRC5D-41BB和GPRC5D-CD28)不能分泌可侦测水平的所评估细胞因子。类似地，当与仅表达GPRC5D的靶细胞一起培养时，仅表达单一抗BCMACAR的细胞组合物(BCMA-41BB)不能分泌可侦测水平的所评估细胞因子。此等结果大体上与以下发现相符：经基因工程改造以表达示例性所产生的CAR构建体的T细胞能够进行抗原特异性细胞因子分泌。
实施例19：双顺反子抗BCMA和抗GPRC5D嵌合抗原受体的活体内评估
使用鼠类多发性骨髓瘤模型评估实施例17和18中所描述的含有经基因工程改造以表达示例性所产生的单一和双重抗原靶向CAR构建体的细胞的T细胞组合物的活体内作用。研究在OPM2鼠类异种移植模型中进行。OPM2细胞系经基因工程改造以表达萤火虫荧光素酶(OPM2-ffLuc)或膜系栓的海萤荧光素酶(OPM2海萤Luc)。在第0天，对NOD scidγ(NSGTM)小鼠经尾静脉注射2×106个OPM2-ffLuc细胞，使其植入并扩增14天。
A.在OPM2鼠类异种移植模型中双重靶向CAR的作用
在OPM2鼠类异种移植模型中测试初代人类T细胞组合物，这些组合物含有(1)仅表达抗BCMA del CAR的细胞，BCMA del CAR；(2)仅表达并入4-1BB共刺激结构域的抗BCMACAR的细胞，BCMA-41BB；(3)表达靶向BCMA和GPRC5D的“单柄”构建体的细胞，GPRC5D-BCMA-41BB；或(4)表达双顺反子构建体的细胞，该双顺反子构建体编码通过双顺反子组件分隔开的抗BCMACAR和抗GPRC5D CAR，呈BCMA-41BB-GPRC5D-41BB形式或BCMA-41BB-GPRC5D-CD28形式。
在OPM2-ffLuc细胞植入之后第14天，通过尾静脉注射3×106个表达以下CAR构建体之一的T细胞治疗小鼠：(1)BCMA del CAR；(2)BCMA-41BB CAR；(3)BCMA-41BB-GPRC5D-41BB CAR；(4)BCMA-41BB-GPRC5D-CD28CAR；或(5)GPRC5D-BCMA-41BB。BCMA del CAR和单一靶向CAR充当对照。
图34A显示经治疗小鼠的存活率曲线。当在第105天监测时，用BCMA del CAR(阴性对照)治疗的小鼠的中值总生存期(mOS)是32天，而其他组的mOS未达到(p<0.05)。
在相关实验中，大体上如先前实施例中所描述，产生BCMA基因敲除(KO)的OPM2细胞系。通过第二次注射2×106个BCMA KO OPM2细胞再攻击图34A中的存活小鼠。如图34B中所示，再攻击之后，用表达单一靶向BCMA-41BB CAR的细胞治疗的小鼠的mOS是37天，而用任一种双重靶向CAR构建体治疗的小鼠的mOS未达到(p<0.05)。
在初次注射OPM2细胞之后第30天和第105天，和在用BCMA KOOPM2细胞再攻击之后第36天，通过生物发光成像(BLI)评估经治疗小鼠的肿瘤负荷(图35A-C)。如图35A和图35B中所示，仅用BCMA del CAR治疗的小鼠在再攻击之前展现肿瘤负荷。如图35C中所示，相较于用表达双重靶向CAR构建体的细胞治疗的小鼠，用表达单一靶向BCMA-41BB CAR的细胞治疗的小鼠在用BCMA KO OPM2细胞再攻击之后展现显著肿瘤负荷。
此等结果与以下发现相符：相较于靶向BCMA和GPRC5D两者的方法，单一靶向抗BCMA CAR在控制不表达BCMA的肿瘤细胞方面不太有效。
B.在鼠类多发性骨髓瘤模型中CAR共刺激信号转导结构域的比较
在OPM2-ffLuc肿瘤细胞植入和扩增之后，用5×105个表达以下单一或双重靶向构建体之一的T细胞治疗小鼠：(1)BCMA del CAR；(2)BCMA-41BB；(3)GPRC5D-41BB；(4)GPRC5D-CD28；(5)GPRC5D-BCMA-41BB；(6)BCMA-41BB-GPRC5D-41BB；或(7)BCMA-41BB-GPRC5D-CD28。BCMA del CAR和单一靶向CAR充当对照。
小鼠的存活率显示于图36中。用BCMA del CAR治疗的小鼠(阴性对照)的mOS是38天。相比之下，所有其他治疗组中小鼠的mOS明显增加超出38天(p<0.05)。相较于用表达其他构建体的细胞治疗，用表达并入CD28共刺激结构域的单一抗GPRC5D CAR的细胞治疗与较短mOS相关(p<0.05)。
在注射OPM2细胞之后14天(图37A)、29天(图37B)和36天(图37C)，经由生物发光成像(BLI)评估肿瘤负荷。如图37A中所示，所有组的小鼠在用CAR T细胞组合物治疗时展示显著肿瘤负荷。图37B和图37C分别显示，在注射OPM2细胞之后第29天或第36天，用表达BCMAdel CAR的细胞治疗的小鼠(阴性对照)展现显著肿瘤负荷。此外，用表达单一靶向GPRC5D-CD28 CAR的细胞治疗的小鼠展示最小肿瘤负荷。相比之下，所有其他治疗组在第29天具有减小的肿瘤负荷且在第36天不展现明显肿瘤负荷。
C.在多发性骨髓瘤抗原逃避鼠类模型中CAR共刺激信号转导结构域的比较
为了解鼠类多发性骨髓瘤抗原逃避模型中不同共刺激结构域的影响，在第0天经尾静脉对NSG小鼠注射2×106个经基因工程改造以表达膜系栓的海萤荧光素酶(OPM2海萤Luc)的OPM2细胞，外加5-10％的经基因工程改造以表达萤火虫荧光素酶的BCMAKO OPM2细胞(萤火虫Luc)。所用不同荧光素酶允许进行野生型OPM2细胞和BCMA KO OPM2细胞的差异成像。使肿瘤细胞植入并扩增14天。
在第14天，用5×105个经基因工程改造以表达以下构建体之一的T细胞治疗小鼠：(1)BCMA del CAR；(2)BCMA-41BB；(3)BCMA-41BB和GPRC5D-41BB汇集的细胞；(4)BCMA-41BB和GPRC5D-CD28汇集的细胞；(5)BCMA-41BB-GPRC5D-41BB；(6)BCMA-41BB-GPRC5D-CD28；或(7)GPRC5D-BCMA-41BB。BCMA del CAR和单一靶向CAR充当对照。
在第28天，通过BLI评估小鼠体内的肿瘤负荷。如图38中所示，用CAR T细胞治疗根除所有组中的OPM2野生型细胞。相比之下，表达并入CD28共刺激结构域的抗GPRC5D CAR的CAR T细胞无论包括在汇集T细胞组合物中还是双顺反子构建体中均无法根除BCMA KOOPM2细胞。
在类似实验中，在第0天对NSG小鼠静脉内注射OPM2野生型和BCMA KO OPM2细胞的混合组合物以建立骨髓嗜性多发性骨髓瘤异种移植模型。使细胞植入并扩增14天，且接着通过单次静脉内注射2.5×105个表达以下构建体之一的T细胞治疗小鼠：(1)BCMA delCAR；(2)BCMA-41BB和GPRC5D-41BB汇集的细胞；(3)BCMA-41BB-GPRC5D-41BB；以及(4)GPRC5D-BCMA-41BB。用表达BCMA del CAR的细胞治疗的小鼠充当阴性对照。在本实验中，除阴性对照外的所有CAR构建体均并入4-1BB共刺激结构域。
在OPM2注射之后14天用指定细胞组合物治疗的小鼠的存活率显示于图39中。相较于用表达BCMA del CAR的细胞治疗的小鼠，所有其他治疗组显示存活率显著增加(所有CAR相对于对照，p<0.001)。值得注意的是，当与用以下治疗的小鼠相比较时，用表达单柄GPRC5D-BCMA-41BB CAR的细胞治疗的小鼠展现明显缩短的生存期：(1)表达BCMA-41BB-GPRC5D-41BB构建体的细胞或(2)以1:1比率汇集的表达GPRC5D-41BB CAR的细胞和表达BCMA-41BB CAR的细胞(单柄构建体相较于其他两种双重靶向方法，p<0.05)。
在注射肿瘤细胞之后14天(图40A)、36天(图40B)和48天(图40C)，通过BLI评估骨髓嗜性模型的肿瘤负荷。如图40A中所示，所有治疗组在CAR T细胞治疗时均展现肿瘤负荷。如图40B中所示，在第36天，所有治疗均能有效地控制OPM2野生型细胞。然而，如图40C中所示，到第48天，GPRC5D-4-1BB/BCMA-41BB CAR汇集的细胞组合物和BCMA-41BB-GPRC5D-41BB双顺反子构建体细胞组合物比含有表达单柄CAR构建体的细胞(GPRC5D-BCMA-41BB)的组合物更有效。
实施例20：产生编码抗GPRC5D和抗BCMA嵌合抗原受体的额外双顺反子多核苷酸
产生编码抗GPRC5D CAR和抗BCMA CAR的额外双顺反子多核苷酸。
示例性抗GPRC5D CAR含有能够结合至GPRC5D的scFv抗原结合结构域(例如GPRC5D-203 VL/VH scFv(SEQ ID NO:8)；SEQ ID NO:17中所示的免疫球蛋白铰链-CH2-CH3，由SEQ ID NO:73中所示的序列编码；人CD28源性跨膜结构域(例如SEQ ID NO:18)；人4-1BB源性细胞内信号转导结构域(例如SEQ ID NO:19)；以及人CD3ζ源性细胞内信号转导结构域(例如SEQ ID NO:20)。
示例性抗BCMA CAR含有能够结合表达BCMA的细胞的scFv抗原结合结构域(例如BCMA-55 VL/VH scFv(SEQ ID NO:241)；SEQ ID NO:17中所示的免疫球蛋白铰链-CH2-CH3，由SEQ ID NO:73中所示的序列编码；人CD28源性跨膜结构域(例如SEQ ID NO:18)；人4-1BB源性细胞内信号转导结构域(例如SEQ ID NO:19)；以及人CD3ζ源性细胞内信号转导结构域(例如SEQ ID NO:20)。
编码各CAR的核苷酸序列分别在其组合成单双顺反子多核苷酸构建体之前经密码子优化。“
双顺反子多核苷酸以两种形式产生。产生第一种形式，其具有编码抗GPRC5D CAR的核苷酸序列相对于编码抗BCMA CAR的核苷酸序列位于多核苷酸的5'端(多肽的N末端)(“αGPRC5D-αBCMA”；SEQ ID NO:303编码SEQ ID NO:301)。产生第二种形式，其具有编码抗BCMA CAR的核苷酸序列相对于编码抗GPRC5D CAR的核苷酸序列位于多核苷酸的5'端(多肽的N末端)(“αBCMA-αGPRC5D”；SEQ ID NO:300编码SEQ ID NO:298)。编码抗GPRC5D CAR与编码抗BCMA CAR的核苷酸序列通过编码下游核糖体跳跃组件(诸如自裂解T2A肽；SEQ ID NO:44或45编码SEQ ID NO:37)的核苷酸序列分隔开。
将多核苷酸构建体克隆至慢病毒表达载体中以转导T细胞。用含有多核苷酸双顺反子构建体的慢病毒载体稳定转导Jurkat细胞，这些多核苷酸双顺反子构建体含有αGPRC5D-αBCMA CAR形式或αBCMA-αGPRC5D CAR形式。作为对照，也用编码单抗原靶向抗GRPC5D CAR或抗BCMA CAR的构建体转导Jurkat细胞。转导用5×105个细胞/孔进行且在第3天测定CAR的表达。通过流动式细胞测量术，使用对各CAR的抗原结合结构域具有特异性的结合试剂评估CAR的表达。
流动式细胞测量分析显示，相较于由位于5'端的核苷酸序列编码的CAR(前导CAR)或相较于仅编码单一CAR的构建体的表达，呈两种双顺反子形式的由位于3'端的核苷酸序列编码的CAR(后置CAR)的表达明显减少。确切地说，图41A描绘所评估的形式中抗BCMA CAR的表达百分比的结果，且图41B显示所评估的形式中抗GPRC5D CAR的表达。关于经转导Jurkat细胞的基因组DNA的PCR分析指示，位于3'端的编码CAR的核苷酸序列经由重组而丢失(数据未示)。
实施例21：编码抗GPRC5D和抗BCMA嵌合抗原受体的双顺反子多核苷酸的密码子趋异
为了减少位于3'的编码CAR的核苷酸序列可能发生的重组和丢失，使编码这些CAR之一的核酸序列密码子趋异。在本实施例中，使编码抗GPRC5D CAR的核酸序列相较于实施例20中所描述的序列密码子趋异。
具体地，使核苷酸序列中编码scFv、免疫球蛋白间隔子、CD28跨膜结构域、4-1BB胞内结构域和CD3ζ胞内结构域的部分密码子趋异，由此使编码此等组分中每一种的核苷酸该核苷酸层面上不同于编码抗BCMACAR中相同组分的核苷酸序列，同时仍编码一致氨基酸序列。使核苷酸序列密码子趋异，由此使双顺反子构建体中编码抗GPRC5D CAR的核苷酸序列与编码抗BCMA CAR的核苷酸序列之间不存在超过10个序列同源的连续(或相邻)碱基对。在抗GPRC5D CAR密码子趋异之后，分析多核苷酸中的剪接位点(例如NNSPLICE 0.9版在线剪接位点预测工具；fruitfly.org,伯克利果蝇基因组项目(Berkeley Drosophila GenomeProject),Berkeley,CA)。剪接供体位点和剪接受体位点独立地评价。通过沉默突变修饰例如启动子区和长间隔子区中所鉴别的剪接位点分数>0.7分(>70％的剪接事件概率)的剪接供体剪接受体位点以将剪接位点分数减小至低于0.7分。
使用含有多核苷酸双顺反子构建体的慢病毒载体转导Jurkat T细胞并通过流动式细胞测量术，使用对各CAR抗原结合结构域具有特异性的结合试剂监测CAR的细胞表面表达。
如图42A和42B中所示，相较于由原始双顺反子多核苷酸编码的相同CAR的表达，双顺反子多核苷酸构建体的密码子趋异实质上改善由位于3'端的核苷酸序列编码的CAR的表达。举例而言，如图42A中所示，在该原始αGPRC5D-αBCMA双顺反子构建体转导的细胞中抗BCMA CAR的表达相对较低，但在用各别密码子趋异(CD)的构建体转导的细胞中该表达实质上得到改善。同样，如图42B中所示，在用原始αBCMA-αGPRC5D双顺反子构建体转导的细胞中抗GPRC5D CAR的表达相对较低，但在用各别密码子趋异(CD)的构建体转导的细胞中该表达实质上得到改善。
实施例22：GPRC5D/BCMA双重靶向CAR基因工程改造的T细胞组合物的活体外评估
分别评估T细胞组合物，即Jurkat Nur77-RFP报导体或初代T细胞在与抗原表达细胞共培养后的抗原特异性活性，这些T细胞组合物含有(1)经基因工程改造以仅表达抗GPRC5D CAR的细胞(αGPRC5D)、(2)经基因工程改造以仅表达抗BCMA CAR的细胞(αBCMA)、或(3)如实施例5中所描述通过密码子趋异的呈αBCMA-αGPRC5D或αGPRC5D-αBCMA形式的双顺反子构建体转导的表达两种CAR的双重靶向细胞。用编码单一CAR构建体或含有编码抗BCMACAR和抗GPRC5D CAR的双顺反子构建体(双重靶向细胞)的慢病毒载体转导Nur77-RFPJurkat T细胞系或通过基于免疫亲和力的富集法自来自人类供体受试者的白血球清除术样品分离的初代T细胞。在转导之后，且在一些情况下在扩增之后，用对各CAR具有特异性的抗体对T细胞染色并通过流动式细胞测量术分析，确定细胞的转导和CAR的表达。
在一些实验中，评估如实施例13中所描述的含有分别表达抗BCMA CAR和抗GPRC5DCAR的细胞的汇集T细胞组合物(“αGPRC5D和αBCMA汇集的细胞”)。
A.在多发性骨髓瘤细胞系存在下的抗原依赖性活性
将经基因工程改造的Jurkat细胞与表达不同量的BCMA和GPRC5D的多发性骨髓瘤细胞是以1:1的E:T比率共培养20小时。多发性骨髓瘤细胞系包括KMS12BM、MM.1S、NCI-H929、OPM-2和RPMI8226(参见实施例16，描述细胞系上GPRC5D和BCMA的表达量)。分别包括慢性骨髓性白血病(CML)细胞系K562以及经基因工程改造以表达GPRC5D的K562细胞系作为阴性对照和阳性对照。通过用流动式细胞测量术测量RFP表达的变化来评估CAR的抗原特异性刺激。
如图43中所示，如通过对RFP信号呈阳性的细胞的百分比(％Nur77)所证实，表达αBCMA、αGPRC5D、αBCMA-αGPRC5D或αGPRC5D-αBCMA CAR的Jurkat Nur77/RFP报导体细胞通过与各种多发性骨髓瘤细胞系共培养来刺激。如所示，仅表达αGPRC5D CAR的细胞对诸如KMS12BM细胞系之类某些靶细胞反应较弱，但表达双重靶向CAR的细胞组合物中报导体活性增加。
B.在多发性骨髓瘤细胞系存在下的细胞因子分泌
分别评估初代人类T细胞组合物的抗原特异性活性，这些T细胞组合物含有(1)经基因工程改造以仅表达抗GPRC5D CAR的T细胞(αGPRC5D)、(2)经基因工程改造以仅表达抗BCMA CAR的T细胞(αBCMA)、(3)通过呈αBCMA-αGPRC5D或αGPRC5D-αBCMA形式的双顺反子构建体转导而含有表达两种CAR的双重靶向细胞的T细胞、或(4)以1:1的表达抗BCMA CAR的细胞与表达抗GPRC5D CAR的细胞比率汇集的分别经基因工程改造以表达抗BCMA CAR或抗GPRC5D CAR的汇集T细胞(αGPRC5D和αBCMA汇集的细胞)。作为对照，对初代人类T细胞组合物进行仿真转导。将T细胞与KMS12BM、MM.1S、NCI-H929、OPM2和RPMI8226多发性骨髓瘤细胞以1:1的E:T比率共培养24小时，并收集上清液以通过
多重测定来分析细胞因子。
在将初代人类T细胞组合物与各种多发性骨髓瘤细胞系共培养之后，评估IFNγ、IL-2、TNFα的分泌水平，分别如图44A、44B和44C中所示。所有所测试的初代人类T细胞组合物观察到细胞因子分泌，但模拟转导的T细胞组合物除外。对于某些细胞系，相较于经基因工程改造以仅表达αGPRC5D或仅表达αBCMA CAR的细胞组合物，含有双重靶向αBCMA-αGPRC5D或αGPRC5D-αBCMA形式的细胞组合物或αGPRC5D和αBCMA汇集的细胞的细胞因子分泌增加。
D.在BCMA或GPRC5D KO细胞存在下的抗原依赖性活性
为理解在抗原损失情况下抗BCMA和抗GPRC5D CAR的抗原依赖性活性，通过自OPM2细胞进行GPRC5D或BCMA基因敲除来建立抗原损失模型。如实施例5中所描述，对OPM2细胞的GPRC5D进行基因敲除。如实施例12中所描述，对OPM2细胞的BCMA进行基因敲除。
流动式细胞测量分析确定在OPM2 GPRC5D KO细胞中缺乏GPRC5D表达且在OPM2BCMA KO细胞中缺乏BCMA表达。OPM2野生型(OPM2WT)细胞充当对照，显示GPRC5D和BCMA的表达(参见例如图22A)。
评估Jurkat Nur77-RFP报导体细胞组合物的抗原特异性活性，这些细胞组合物含有经基因工程改造以仅表达抗GPRC5D CAR(αGPRC5D)或仅表达抗BCMA CAR(αBCMA)的细胞、或含有通过呈αBCMA-αGPRC5D或αGPRC5D-αBCMA形式的双顺反子构建体转导的表达两种CAR的双重靶向细胞。将各种Jurkat Nur77-RFP报导细胞组合物与OPM2 WT、OPM2GPRC5D KO或OPM2 BCMA细胞以1:1比率共培养20小时。通过用流动式细胞测量术测量RFP表达的变化来评估由细胞组合物表达的CAR的抗原特异性刺激作用。
如图45中所示，当将仅表达靶向GPRC5D的CAR(αGPRC5D)或仅表达靶向BCMA的CAR(αBCMA)的非汇集Jurkat Nur77-RFP报导体细胞当与分别经历GPRC5D或BCMA基因敲除的OPM2细胞共培养时，未观察到这些细胞的活化。相比之下，当OPM2细胞经历BCMA或GPRC5D基因敲除时，含有表达αBCMA-αGPRC5D或αGPRC5D-αBCMA CAR的细胞的Jurkat Nur77-RFP报导体双重靶向细胞组合物中保持活化。此等结果展示，含有αBCMA-αGPRC5D和αGPRC5D-αBCMACAR形式的双重靶向基因工程改造的T细胞组合物能够调节活化，甚至在无靶向抗原中的一种的存在下也如此。
E.在BCMA或GPRC5D KO细胞存在下的细胞因子分泌
为了进一步评估抗原损失的影响，将OPM2 WT、OPM2 GPRC5D KO或OPM2 BCMA KO细胞与初代人类T细胞组合物以1:1比率培养24小时，并评估T细胞的细胞因子分泌。初代人类T细胞组合物含有(1)经基因工程改造以仅表达抗GPRC5D CAR的细胞(αGPRC5D)、(2)经基因工程改造以仅表达抗BCMA CAR的细胞(αBCMA)、(3)通过呈αBCMA-αGPRC5D或αGPRC5D-αBCMA形式的双顺反子构建体转导的表达两种CAR的双重靶向细胞、或(4)以1:1比率的表达抗BCMA CAR的细胞与表达抗GPRC5D CAR的细胞CAR汇集的分别经基因工程改造以表达抗BCMACAR或抗GPRC5DCAR的汇集的细胞(αGPRC5D和αBCMA汇集的细胞)。仿真转导的T细胞组合物充当对照。
在与OPM2细胞共培养之后，收集上清液以通过
多重测定来分析细胞因子。评估IFNγ、IL-2、TNFα的分泌水平，分别如图46A、46B和46C中所示。当将仅表达抗GPRC5D CAR(αGPRC5D)或仅表达抗BCMA CAR(αBCMA)的T细胞与分别经历GPRC5D或BCMA基因敲除的OPM2细胞共培养时，未观察到这些细胞的细胞因子分泌。然而，当OPM2细胞经历GPRC5D或BCMA基因敲除时，含有表达αBCMA-αGPRC5D或αGPRC5D-αBCMACAR的双重靶向细胞的组合物中和αGPRC5D和αBCMA汇集的细胞组合物中维持细胞因子分泌。此等结果指示，任一细胞用αBCMA-αGPRC5D或αGPRC5D-αBCMA CAR形式共转导或包括αGPRC5D和αBCMA汇集的细胞的双重靶向细胞能够分泌细胞因子，但不存在这些抗原中的一种。
实施例23：含有表达靶向GPRC5D和BCMA的CAR的双重靶向细胞组合物的活体内评估
产生OPM2鼠类多发性骨髓瘤模型并使用其评估T细胞组合物的活体内作用，这些T细胞组合物含有(1)经基因工程改造以仅表达抗GPRC5DCAR(αGPRC5D)的细胞、(2)经基因工程改造以仅表达抗BCMA CAR(αBCMA)的细胞、(3)通过呈αGPRC5D-αBCMA形式的双顺反子构建体转导的表达两种CAR的双重靶向细胞、或(4)以1:1的表达抗BCMA CAR的细胞比表达抗GPRC5D CAR的细胞比率汇集的分别经基因工程改造以表达抗BCMA CAR或抗GPRC5D CAR的汇集细胞(αGPRC5D和αBCMA汇集的细胞)。
A.在OPM2鼠类异种移植模型中表达抗BCMA和抗GPRC5D CAR的T细胞组合物的评估
进行实验，其中用3×106个来自组合物的总初代人类T细胞治疗NOD scidγ(NSGTM)小鼠，这些组合物含有(1)表达抗BCMA CAR(αBCMA)的细胞、(2)表达抗GPRC5D CAR(αGPRC5D)的细胞、(3)用呈αGPRC5D-αBCMA形式的编码两种CAR的双顺反子构建体产生的双重靶向细胞、或(4)以1:1的表达抗BCMA CAR的细胞比表达抗GPRC5D CAR的细胞比率汇集的分别经基因工程改造以表达抗BCMA CAR或抗GPRC5D CAR的汇集细胞(αGPRC5D和αBCMA汇集的细胞)。在注射OPM2细胞组合物之后14天，给予T细胞组合物。在本实验中，对小鼠注射100％OPM2 WT细胞、95％OPM2 WT细胞和5％OPM2 BCMA KO细胞、或95％OPM2 WT细胞和5％OPM2GPRC5D KO细胞。作为对照，也用模拟转导的初代人类T细胞组合物治疗小鼠。
如图47A中所示，在给予100％OPM2 WT细胞的未治疗和经注射的模拟治疗的小鼠中通过BLI评估的肿瘤负荷实质上增加。到第40天，在用仅表达抗BCMA CAR的细胞治疗的小鼠中也观察到肿瘤负荷增加。相比之下，如图47B中所示，在第20天之前，用含有仅表达抗BCMA CAR的细胞的T细胞组合物治疗使得注射5％OPM2 BCMA KO细胞的小鼠中的肿瘤负荷增加。类似地，在第10天之前，用含有仅表达抗GPRC5D CAR的细胞的T细胞组合物治疗小鼠使得注射5％OPM2 GPRC5D KO细胞的小鼠中的肿瘤负荷增加(图47C)。用含有αGPRC5D和αBCMA汇集的细胞的组合物治疗的小鼠，以及用含有表达来自αGPRC5D-αBCMA双顺反子构建体的CAR的双重靶向细胞的组合物治疗的小鼠到第60天时展现相对较小的肿瘤负荷增加。另外，用5％OPM2 GPRC5D KO细胞处理的小鼠中的肿瘤负荷通过用表达αGPRC5D-αBCMA双顺反子构建体的细胞治疗实现最佳控制。
在本研究中，通过分析CAR T细胞注射后第80天的小鼠存活率观察到类似结果(图48)。如所示，注射5％OPM2 GPRC5D KO细胞且仅用表达抗GPRC5D CAR的细胞治疗的小鼠的存活率降低。注射5％OPM2 BCMA KO细胞且仅用表达抗BCMA CAR的细胞治疗的小鼠的存活率也降低。其他治疗组展现
本发明不意欲限于特别公开的实施方式的范围，提供这些实施方式用于说明本发明的各种方面。对所描述的组合物和方法的各种修改基于本申请中的描述和教导是显而易知的。此类变化形式可在不背离本发明的真正范围和精神的情况下实践且意欲涵盖在本发明的范围内。
序列
序列表
<110> 朱诺治疗学股份有限公司
纪念斯隆凯特琳癌症中心
<120> G蛋白偶合受体C类5族成员D（GPRC5D）特异性嵌合抗原受体
<130> 73504-20137.40
<140> 尚未分配
<141> 与此同时
<150> US 62/754,576
<151> 2018-11-01
<150> US 62/774,159
<151> 2018-11-30
<150> US 62/819,422
<151> 2019-03-15
<150> US 62/904,197
<151> 2019-09-23
<150> US 62/904,187
<151> 2019-09-23
<160> 320
<170> Windows版本4.0的FastSEQ
<210> 1
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GPRC5D-200 VH/VL
<400> 1
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Ala Phe Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Ser Gly Arg Gly Arg Ser Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Tyr His Ala Gly Ala Phe Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Glu Met Ala Gln Ser Val Val
130 135 140
Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser Ile Thr Ile
145 150 155 160
Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser
165 170 175
Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr Asp
180 185 190
Val Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys
195 200 205
Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp
210 215 220
Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Ser Thr Leu Val
225 230 235 240
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
245 250
<210> 2
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GPRC5D-200 - VL/VH
<400> 2
Gln Ser Val Val Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Asp Val Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser
85 90 95
Ser Thr Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ser
100 105 110
Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Leu Glu Met Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Ala Phe Val
130 135 140
Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr
145 150 155 160
Phe Ser Ser Tyr Ala Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly
165 170 175
Leu Glu Trp Val Ser Thr Ile Ser Gly Arg Gly Arg Ser Thr Phe Tyr
180 185 190
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys
195 200 205
Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala
210 215 220
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr His Ala Gly Ala Phe Asp Leu Trp
225 230 235 240
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
245 250
<210> 3
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GPRC5D-201 VH/VL
<400> 3
Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Asn Arg Tyr
20 25 30
Ala Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Ser His Tyr Ala Gln Lys Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Gly Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Met Ala Tyr Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser Gly Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Leu Glu Met Ala Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Ala
130 135 140
Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser Leu Thr Ile Ser Cys Thr Gly
145 150 155 160
Thr Ser Asn Asp Val Gly Ala Tyr Lys Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln
165 170 175
Tyr Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Ile Leu Tyr Asp Val Phe Lys Arg
180 185 190
Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Asp Asn Thr
195 200 205
Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr
210 215 220
Tyr Cys Phe Ser Leu Thr Ser Ser Asn Thr Tyr Val Phe Gly Thr Gly
225 230 235 240
Thr Lys Val Thr Val Leu
245
<210> 4
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GPRC5D-201 VL-VH
<400> 4
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Leu Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Asn Asp Val Gly Ala Tyr
20 25 30
Lys Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Tyr Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Ile Leu Tyr Asp Val Phe Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Asp Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Phe Ser Leu Thr Ser Ser
85 90 95
Asn Thr Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Ser
100 105 110
Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Leu Glu Met Ala Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys
130 135 140
Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr
145 150 155 160
Phe Asn Arg Tyr Ala Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly
165 170 175
Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Ser His Tyr
180 185 190
Ala Gln Lys Leu Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr
195 200 205
Gly Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala
210 215 220
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Met Ala Tyr Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr
225 230 235 240
Leu Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 5
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GPRC5D-202 VH/VL
<400> 5
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Gly Lys Ala Tyr Asp Gln Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Glu Met Ala Gln Ser Val Leu Thr
130 135 140
Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser
145 150 155 160
Cys Ser Gly Ser Arg Ser Asn Val Gly Gly Asn Tyr Val Phe Trp Tyr
165 170 175
Gln Gln Val Pro Gly Ala Thr Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ser Asn
180 185 190
Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ala Gly Ser Lys Ser Gly
195 200 205
Ser Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Glu Ala
210 215 220
Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Asp Ser Leu Ser Gly Phe Val Phe
225 230 235 240
Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
245
<210> 6
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GPRC5D-202 VL/VH
<400> 6
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Arg Ser Asn Val Gly Gly Asn
20 25 30
Tyr Val Phe Trp Tyr Gln Gln Val Pro Gly Ala Thr Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Arg Ser Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ala
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Ser Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Ser Gly Phe Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Ser
100 105 110
Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Leu Glu Met Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val
130 135 140
Lys Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr
145 150 155 160
Phe Ser Asp Tyr Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly
165 170 175
Leu Glu Trp Val Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr
180 185 190
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys
195 200 205
Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala
210 215 220
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Tyr Gly Lys Ala Tyr Asp Gln Trp Gly
225 230 235 240
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 7
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GPRC5D-203 VH/VL
<400> 7
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser His
20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Ser Asp Ser Thr Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Gly Gln Trp Lys Tyr Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Glu Met Ala Ser Ser Glu
130 135 140
Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr Val Arg
145 150 155 160
Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr
165 170 175
Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Gly Lys Asn
180 185 190
Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly
195 200 205
Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala
210 215 220
Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn Pro Pro Val Val
225 230 235 240
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
245 250
<210> 8
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GPRC5D-203 VL/VH
<400> 8
Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn Pro
85 90 95
Pro Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ser Arg
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu
115 120 125
Glu Met Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val His
130 135 140
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
145 150 155 160
Arg Ser His Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
165 170 175
Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Ser Asp Ser Thr Tyr Thr Tyr Tyr Ala
180 185 190
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
195 200 205
Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
210 215 220
Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Gly Gln Trp Lys Tyr Tyr Asp Tyr Trp
225 230 235 240
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
245 250
<210> 9
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GPRC5D-204 VH/VL
<400> 9
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Ser Val Arg Tyr Thr Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Gly Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Glu Met Ala Asn Phe Met Leu Thr Gln
130 135 140
Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys Thr Val Ser Ile Ser Cys
145 150 155 160
Thr Arg Thr Ser Gly Ala Ile Ala Gly Ala Tyr Val Gln Trp Phe Gln
165 170 175
Gln Arg Pro Gly Ser Ala Pro Thr Thr Val Ile Tyr Asp Asp Asn Lys
180 185 190
Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ile Asp Lys Ser
195 200 205
Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Lys Thr Glu Asp Glu
210 215 220
Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Tyr Asp Ser Ser Asn Val Leu
225 230 235 240
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
245 250
<210> 10
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GPRC5D-204 VL/VH
<400> 10
Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys
1 5 10 15
Thr Val Ser Ile Ser Cys Thr Arg Thr Ser Gly Ala Ile Ala Gly Ala
20 25 30
Tyr Val Gln Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ala Pro Thr Thr Val
35 40 45
Ile Tyr Asp Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Ile Asp Lys Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly
65 70 75 80
Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Tyr
85 90 95
Asp Ser Ser Asn Val Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
Gly Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Leu Glu Met Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
145 150 155 160
Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
165 170 175
Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Asn Thr Tyr
180 185 190
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
195 200 205
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
210 215 220
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ser Val Arg Tyr Thr Asp Ile Trp
225 230 235 240
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
245 250
<210> 11
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GPRC5D-205 VH/VL
<400> 11
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Asn Gly Arg Gly Ser Ser Thr Ile Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Ile Ser Arg Gly Leu Gly Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Glu Met Ala Gln Ser Val Val
130 135 140
Thr Gln Pro Pro Ser Met Ser Ala Ala Pro Gly Gln Gln Val Thr Ile
145 150 155 160
Ser Cys Ser Gly Gly Asn Ser Asn Ile Glu Arg Asn Tyr Val Ser Trp
165 170 175
Tyr Leu Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Val Ile Phe Asp Asn
180 185 190
Asp Arg Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser
195 200 205
Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln Thr Gly Asp Glu
210 215 220
Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu Arg Gly Trp Val
225 230 235 240
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
245 250
<210> 12
<211> 248
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GPRC5D-205 VL/VH
<400> 12
Gln Ser Val Val Thr Gln Pro Pro Ser Met Ser Ala Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Gln Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Gly Asn Ser Asn Ile Glu Arg Asn
20 25 30
Tyr Val Ser Trp Tyr Leu Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Val
35 40 45
Ile Phe Asp Asn Asp Arg Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln
65 70 75 80
Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu
85 90 95
Arg Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ser
100 105 110
Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Leu Glu Met Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile
130 135 140
Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr
145 150 155 160
Phe Ser Asn Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly
165 170 175
Leu Glu Trp Val Ser Thr Ile Asn Gly Arg Gly Ser Ser Thr Ile Tyr
180 185 190
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys
195 200 205
Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala
210 215 220
Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Ile Ser Arg Gly Leu Gly Asp Ser Trp
225 230 235 240
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
245
<210> 13
<211> 253
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GPRC5D-206 VH/VL
<400> 13
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Arg Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ser Ser Arg Trp Gly Gly Trp Thr Gly Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Arg Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Glu Met Ala Gln
130 135 140
Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser
145 150 155 160
Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn
165 170 175
Phe Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Met
180 185 190
Ile Tyr Asp Val Ser Lys Arg Pro Ser Gly Ile Ser Asn Arg Phe Ser
195 200 205
Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln
210 215 220
Val Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Thr Arg
225 230 235 240
Thr Val Ile Phe Ala Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
245 250
<210> 14
<211> 253
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GPRC5D-206 VL/VH
<400> 14
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Phe Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val
35 40 45
Met Ile Tyr Asp Val Ser Lys Arg Pro Ser Gly Ile Ser Asn Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Val Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Thr
85 90 95
Arg Thr Val Ile Phe Ala Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Ser
100 105 110
Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Leu Glu Met Ala Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys
130 135 140
Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr
145 150 155 160
Phe Thr Ser Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly
165 170 175
Leu Glu Trp Met Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Arg Tyr
180 185 190
Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr
195 200 205
Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala
210 215 220
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ser Ser Arg Trp Gly Gly Trp Thr Gly
225 230 235 240
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
245 250
<210> 15
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 短间隔子
<400> 15
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 16
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 中等间隔子(铰链-CH3 119 aa)
<400> 16
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Gly Gln Pro Arg
1 5 10 15
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
20 25 30
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
35 40 45
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
50 55 60
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
65 70 75 80
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
85 90 95
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
100 105 110
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
115
<210> 17
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 长间隔子(IgG4/IgG2铰链- IgG2/IgG4 CH2- IgG4
CH3间隔子；228 aa)
<400> 17
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val
1 5 10 15
Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
20 25 30
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
35 40 45
Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
50 55 60
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Gln Ser Thr
65 70 75 80
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
85 90 95
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser
100 105 110
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
115 120 125
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
130 135 140
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
145 150 155 160
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
165 170 175
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr
180 185 190
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
195 200 205
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
210 215 220
Ser Leu Gly Lys
225
<210> 18
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28跨膜结构域
<400> 18
Met Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser
1 5 10 15
Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 19
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4-1BB源性细胞内共信号转导序列(aa)
<400> 19
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 20
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3-ζ源性细胞内信号转导结构域(aa)
<400> 20
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 21
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GPRC5D-200 VH
<400> 21
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Ala Phe Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Ser Gly Arg Gly Arg Ser Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Tyr His Ala Gly Ala Phe Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 22
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GPRC5D-200 VL
<400> 22
Gln Ser Val Val Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Asp Val Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser
85 90 95
Ser Thr Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105 110
<210> 23
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GPRC5D-201 VH
<400> 23
Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Asn Arg Tyr
20 25 30
Ala Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Ser His Tyr Ala Gln Lys Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Gly Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Met Ala Tyr Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 24
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GPRC5D-201 VL
<400> 24
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Leu Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Asn Asp Val Gly Ala Tyr
20 25 30
Lys Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Tyr Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Ile Leu Tyr Asp Val Phe Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Asp Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Phe Ser Leu Thr Ser Ser
85 90 95
Asn Thr Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
100 105 110
<210> 25
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GPRC5D-202 VH
<400> 25
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Gly Lys Ala Tyr Asp Gln Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 26
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GPRC5D-202 VL
<400> 26
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Arg Ser Asn Val Gly Gly Asn
20 25 30
Tyr Val Phe Trp Tyr Gln Gln Val Pro Gly Ala Thr Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Arg Ser Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ala
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Ser Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Ser Gly Phe Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
100 105 110
<210> 27
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GPRC5D-203 VH
<400> 27
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser His
20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Ser Asp Ser Thr Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Gly Gln Trp Lys Tyr Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 28
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GPRC5D-203 VL
<400> 28
Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn Pro
85 90 95
Pro Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105 110
<210> 29
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GPRC5D-204 VH
<400> 29
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Ser Val Arg Tyr Thr Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 30
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GPRC5D-204 VL
<400> 30
Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys
1 5 10 15
Thr Val Ser Ile Ser Cys Thr Arg Thr Ser Gly Ala Ile Ala Gly Ala
20 25 30
Tyr Val Gln Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ala Pro Thr Thr Val
35 40 45
Ile Tyr Asp Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Ile Asp Lys Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly
65 70 75 80
Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Tyr
85 90 95
Asp Ser Ser Asn Val Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
Gly
<210> 31
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GPRC5D-205 VH
<400> 31
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Asn Gly Arg Gly Ser Ser Thr Ile Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Ile Ser Arg Gly Leu Gly Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val
115
<210> 32
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GPRC5D-205 VL
<400> 32
Gln Ser Val Val Thr Gln Pro Pro Ser Met Ser Ala Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Gln Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Gly Asn Ser Asn Ile Glu Arg Asn
20 25 30
Tyr Val Ser Trp Tyr Leu Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Val
35 40 45
Ile Phe Asp Asn Asp Arg Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln
65 70 75 80
Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu
85 90 95
Arg Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105 110
<210> 33
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GPRC5D-206 VH
<400> 33
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Arg Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ser Ser Arg Trp Gly Gly Trp Thr Gly Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 34
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GPRC5D-206 VL
<400> 34
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Phe Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val
35 40 45
Met Ile Tyr Asp Val Ser Lys Arg Pro Ser Gly Ile Ser Asn Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Val Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Thr
85 90 95
Arg Thr Val Ile Phe Ala Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
100 105 110
<210> 35
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T2A肽(aa)
<400> 35
Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro
1 5 10 15
Gly Pro
<210> 36
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T2A肽 (aa)
<400> 36
Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu
1 5 10 15
Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 37
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T2A肽(aa)
<400> 37
Leu Glu Gly Gly Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp
1 5 10 15
Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg
20
<210> 38
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P2A肽(aa)
<400> 38
Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn
1 5 10 15
Pro Gly Pro
<210> 39
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P2A肽(aa)
<400> 39
Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 40
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> E2A肽(aa)
<400> 40
Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 41
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> E2A肽(aa)
<400> 41
Gly Ser Gly Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp
1 5 10 15
Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20
<210> 42
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> F2A肽(aa)
<400> 42
Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20
<210> 43
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> F2A肽(aa)
<400> 43
Gly Ser Gly Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala
1 5 10 15
Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20 25
<210> 44
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T2A肽(nt)
<400> 44
ctcgagggcg gcggagaggg cagaggaagt cttctaacat gcggtgacgt ggaggagaat 60
cccggcccta gg 72
<210> 45
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T2A肽(nt)
<400> 45
cttgaaggtg gtggcgaagg cagaggcagc ctgcttacat gcggagatgt ggaagagaac 60
cccggaccta ga 72
<210> 46
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28共刺激结构域
<400> 46
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 47
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 连接物
<400> 47
Gly Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Glu Met Ala
20
<210> 48
<211> 684
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 长间隔子(nt)
<400> 48
gagtctaaat acggaccgcc ttgtcctcct tgtcccgctc ctcctgttgc cggaccttcc 60
gtgttcctgt ttcctccaaa gcctaaggac accctgatga tcagcaggac ccctgaagtg 120
acctgcgtgg tggtggatgt gtcccaagag gatcccgagg tgcagttcaa ctggtatgtg 180
gacggcgtgg aagtgcacaa cgccaagacc aagcctagag aggaacagtt ccagagcacc 240
tacagagtgg tgtccgtgct gacagtgctg caccaggatt ggctgaacgg caaagagtac 300
aagtgcaagg tgtccaacaa gggcctgcct agcagcatcg agaaaaccat ctccaaggcc 360
aagggccagc caagagagcc ccaggtttac acactgcctc caagccaaga ggaaatgacc 420
aagaatcagg tgtccctgac atgcctggtc aagggcttct acccctccga tatcgccgtg 480
gaatgggaga gcaatggcca gcctgagaac aactacaaga ccacacctcc tgtgctggac 540
agcgacggca gtttcttcct gtatagtaga ctcaccgtgg ataaatcaag atggcaagag 600
ggcaacgtgt tcagctgcag cgtgatgcac gaggccctgc acaaccacta cacccagaaa 660
agcctgagcc tgtctctggg caag 684
<210> 49
<211> 345
<212> PRT
<213> 人工序列(Homo sapiens)
<220>
<223> GPRC5D蛋白质(Uniprot Q9NZD1)
<400> 49
Met Tyr Lys Asp Cys Ile Glu Ser Thr Gly Asp Tyr Phe Leu Leu Cys
1 5 10 15
Asp Ala Glu Gly Pro Trp Gly Ile Ile Leu Glu Ser Leu Ala Ile Leu
20 25 30
Gly Ile Val Val Thr Ile Leu Leu Leu Leu Ala Phe Leu Phe Leu Met
35 40 45
Arg Lys Ile Gln Asp Cys Ser Gln Trp Asn Val Leu Pro Thr Gln Leu
50 55 60
Leu Phe Leu Leu Ser Val Leu Gly Leu Phe Gly Leu Ala Phe Ala Phe
65 70 75 80
Ile Ile Glu Leu Asn Gln Gln Thr Ala Pro Val Arg Tyr Phe Leu Phe
85 90 95
Gly Val Leu Phe Ala Leu Cys Phe Ser Cys Leu Leu Ala His Ala Ser
100 105 110
Asn Leu Val Lys Leu Val Arg Gly Cys Val Ser Phe Ser Trp Thr Thr
115 120 125
Ile Leu Cys Ile Ala Ile Gly Cys Ser Leu Leu Gln Ile Ile Ile Ala
130 135 140
Thr Glu Tyr Val Thr Leu Ile Met Thr Arg Gly Met Met Phe Val Asn
145 150 155 160
Met Thr Pro Cys Gln Leu Asn Val Asp Phe Val Val Leu Leu Val Tyr
165 170 175
Val Leu Phe Leu Met Ala Leu Thr Phe Phe Val Ser Lys Ala Thr Phe
180 185 190
Cys Gly Pro Cys Glu Asn Trp Lys Gln His Gly Arg Leu Ile Phe Ile
195 200 205
Thr Val Leu Phe Ser Ile Ile Ile Trp Val Val Trp Ile Ser Met Leu
210 215 220
Leu Arg Gly Asn Pro Gln Phe Gln Arg Gln Pro Gln Trp Asp Asp Pro
225 230 235 240
Val Val Cys Ile Ala Leu Val Thr Asn Ala Trp Val Phe Leu Leu Leu
245 250 255
Tyr Ile Val Pro Glu Leu Cys Ile Leu Tyr Arg Ser Cys Arg Gln Glu
260 265 270
Cys Pro Leu Gln Gly Asn Ala Cys Pro Val Thr Ala Tyr Gln His Ser
275 280 285
Phe Gln Val Glu Asn Gln Glu Leu Ser Arg Ala Arg Asp Ser Asp Gly
290 295 300
Ala Glu Glu Asp Val Ala Leu Thr Ser Tyr Gly Thr Pro Ile Gln Pro
305 310 315 320
Gln Thr Val Asp Pro Thr Gln Glu Cys Phe Ile Pro Gln Ala Lys Leu
325 330 335
Ser Pro Gln Gln Asp Ala Gly Gly Val
340 345
<210> 50
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4GS 连接物
<400> 50
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 51
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 3GS连接物
<400> 51
Gly Gly Gly Ser
1
<210> 52
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 连接物
<400> 52
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 53
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 连接物
<400> 53
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 54
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 连接物
<400> 54
Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Glu Met Ala
20
<210> 55
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28 transmembrane domain (nt) - not optimized
<400> 55
atgttttggg tgctggtcgt ggtcggaggg gtgctggcct gttacagcct gctggtgaca 60
gtcgctttca tcatcttctg ggtg 84
<210> 56
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28 transmembrane domain (nt) - optimized
<400> 56
atgttctggg tgctcgtggt cgttggcgga gtgctggcct gttacagcct gctggttacc 60
gtggccttca tcatcttttg ggtc 84
<210> 57
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3-zeta derived intracellular signaling domain
(nt)
<400> 57
agagtcaagt tttccaggtc cgccgacgct ccagcctacc agcaggggca gaaccagctg 60
tacaacgagc tgaacctggg cagaagggaa gagtacgacg tcctggataa gcggagaggc 120
cgggaccctg agatgggcgg caagcctcgg cggaagaacc cccaggaagg cctgtataac 180
gaactgcaga aagacaagat ggccgaggcc tacagcgaga tcggcatgaa gggcgagcgg 240
aggcggggca agggccacga cggcctgtat cagggcctgt ccaccgccac caaggatacc 300
tacgacgccc tgcacatgca ggccctgccc ccaagg 336
<210> 58
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3-zeta derived intracellular signaling domain
(nt) - optimized
<400> 58
agagtgaagt tcagcagatc cgccgacgct ccagcctatc agcagggcca aaaccagctg 60
tacaacgagc tgaacctggg gagaagagaa gagtacgacg tgctggataa gcggagaggc 120
agagatcctg aaatgggcgg caagcccaga cggaagaatc ctcaagaggg cctgtataat 180
gagctgcaga aagacaagat ggccgaggcc tacagcgaga tcggaatgaa gggcgagcgc 240
agaagaggca agggacacga tggactgtac cagggcctga gcaccgccac caaggatacc 300
tatgacgcac tgcacatgca ggccctgcca cctaga 336
<210> 59
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 4-1BB-derived intracellular co-signaling sequence
(nt)
<400> 59
aagcggggga gaaagaaact gctgtatatt ttcaaacagc cctttatgag acctgtgcag 60
actacccagg aggaagacgg atgcagctgt aggtttcccg aggaagagga aggaggctgt 120
gagctg 126
<210> 60
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 4-1BB-derived intracellular co-signaling sequence
(nt) - optimized
<400> 60
aagcggggca gaaagaagct gctctacatc ttcaagcagc ccttcatgcg gcccgtgcag 60
accacacaag aggaagatgg ctgctcctgc agattccccg aggaagaaga aggcggctgc 120
gagctg 126
<210> 61
<211> 544
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EF1alpha promoter with HTLV1 ehancer
<400> 61
ggatctgcga tcgctccggt gcccgtcagt gggcagagcg cacatcgccc acagtccccg 60
agaagttggg gggaggggtc ggcaattgaa ccggtgccta gagaaggtgg cgcggggtaa 120
actgggaaag tgatgtcgtg tactggctcc gcctttttcc cgagggtggg ggagaaccgt 180
atataagtgc agtagtcgcc gtgaacgttc tttttcgcaa cgggtttgcc gccagaacac 240
agctgaagct tcgaggggct cgcatctctc cttcacgcgc ccgccgccct acctgaggcc 300
gccatccacg ccggttgagt cgcgttctgc cgcctcccgc ctgtggtgcc tcctgaactg 360
cgtccgccgt ctaggtaagt ttaaagctca ggtcgagacc gggcctttgt ccggcgctcc 420
cttggagcct acctagactc agccggctct ccacgctttg cctgaccctg cttgctcaac 480
tctacgtctt tgtttcgttt tctgttctgc gccgttacag atccaagctg tgaccggcgc 540
ctac 544
<210> 62
<211> 589
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Woodchuck Hepatitis Virus (WHP)
Posttranscriptional Regulatory Element (WPRE)
<400> 62
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaatcat cgtcctttcc ttggctgctc 420
gcctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc 589
<210> 63
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GPRC5D-200 VL
<400> 63
Gln Ser Val Val Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Asp Val Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser
85 90 95
Ser Thr Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 64
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GPRC5D-201 VL
<400> 64
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Leu Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Asn Asp Val Gly Ala Tyr
20 25 30
Lys Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Tyr Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Ile Leu Tyr Asp Val Phe Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Asp Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Phe Ser Leu Thr Ser Ser
85 90 95
Asn Thr Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105 110
<210> 65
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GPRC5D-202 VL
<400> 65
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Arg Ser Asn Val Gly Gly Asn
20 25 30
Tyr Val Phe Trp Tyr Gln Gln Val Pro Gly Ala Thr Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Arg Ser Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ala
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Ser Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Ser Gly Phe Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105 110
<210> 66
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GPRC5D-203 VL
<400> 66
Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn Pro
85 90 95
Pro Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 67
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GPRC5D-204 VL
<400> 67
Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys
1 5 10 15
Thr Val Ser Ile Ser Cys Thr Arg Thr Ser Gly Ala Ile Ala Gly Ala
20 25 30
Tyr Val Gln Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ala Pro Thr Thr Val
35 40 45
Ile Tyr Asp Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Ile Asp Lys Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly
65 70 75 80
Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Tyr
85 90 95
Asp Ser Ser Asn Val Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 68
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GPRC5D-205 VL
<400> 68
Gln Ser Val Val Thr Gln Pro Pro Ser Met Ser Ala Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Gln Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Gly Asn Ser Asn Ile Glu Arg Asn
20 25 30
Tyr Val Ser Trp Tyr Leu Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Val
35 40 45
Ile Phe Asp Asn Asp Arg Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln
65 70 75 80
Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu
85 90 95
Arg Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 69
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GPRC5D-206 VL
<400> 69
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Phe Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val
35 40 45
Met Ile Tyr Asp Val Ser Lys Arg Pro Ser Gly Ile Ser Asn Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Val Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Thr
85 90 95
Arg Thr Val Ile Phe Ala Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105 110
<210> 70
<211> 2028
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗GPRC5D CAR nt
<400> 70
atgccgctgc tgctactgct gcccctgctg tgggcagggg ctctagcttc ttctgagctg 60
acccaagatc ctgccgtgtc tgtggctctg ggccagacag tgcggattac ctgtcagggc 120
gatagcctga gaagctacta cgccagctgg tatcagcaga agcctggaca ggctcccgtg 180
ctggtcatct acggcaagaa caacagaccc agcggcatcc ccgatagatt cagcggaagc 240
agctctggca ataccgccag cctgacaatt actggcgccc aggccgaaga tgaggccgac 300
tactactgca acagcagaga cagctccggc aatcctcctg tggtttttgg cggaggcacc 360
aagctgacag tgctgggaag tagaggtggc ggaggatctg gcggcggagg aagcggaggc 420
ggcggatctc ttgaaatggc tcaggtgcag ctggtggaat caggcggtgg acttgttcac 480
cctggcggaa gcctgagact gtcttgtgcc gccagcggct tcaccttcag atcccacagc 540
atgaactggg tccgacaggc ccctggcaaa ggccttgaat gggtgtccag catcagcagc 600
gacagcacct acacctacta tgccgacagc gtgaagggca gattcaccat ctccagagac 660
aacgccaaga acagcctgta cctgcagatg aactccctga gagccgagga caccgccgtg 720
tactactgtg ctagaagtgg cggccagtgg aagtactacg actattgggg ccagggcacc 780
ctggtcacag ttagctctga gtctaaatac ggaccgcctt gtcctccttg tcccgctcct 840
cctgttgccg gaccttccgt gttcctgttt cctccaaagc ctaaggacac cctgatgatc 900
agcaggaccc ctgaagtgac ctgcgtggtg gtggatgtgt cccaagagga tcccgaggtg 960
cagttcaact ggtatgtgga cggcgtggaa gtgcacaacg ccaagaccaa gcctagagag 1020
gaacagttcc agagcaccta cagagtggtg tccgtgctga cagtgctgca ccaggattgg 1080
ctgaacggca aagagtacaa gtgcaaggtg tccaacaagg gcctgcctag cagcatcgag 1140
aaaaccatct ccaaggccaa gggccagcca agagagcccc aggtttacac actgcctcca 1200
agccaagagg aaatgaccaa gaatcaggtg tccctgacat gcctggtcaa gggcttctac 1260
ccctccgata tcgccgtgga atgggagagc aatggccagc ctgagaacaa ctacaagacc 1320
acacctcctg tgctggacag cgacggcagt ttcttcctgt atagtagact caccgtggat 1380
aaatcaagat ggcaagaggg caacgtgttc agctgcagcg tgatgcacga ggccctgcac 1440
aaccactaca cccagaaaag cctgagcctg tctctgggca agatgttctg ggtgctcgtg 1500
gtcgttggcg gagtgctggc ctgttacagc ctgctggtta ccgtggcctt catcatcttt 1560
tgggtcaagc ggggcagaaa gaagctgctc tacatcttca agcagccctt catgcggccc 1620
gtgcagacca cacaagagga agatggctgc tcctgcagat tccccgagga agaagaaggc 1680
ggctgcgagc tgagagtgaa gttcagcaga tccgccgacg ctccagccta tcagcagggc 1740
caaaaccagc tgtacaacga gctgaacctg gggagaagag aagagtacga cgtgctggat 1800
aagcggagag gcagagatcc tgaaatgggc ggcaagccca gacggaagaa tcctcaagag 1860
ggcctgtata atgagctgca gaaagacaag atggccgagg cctacagcga gatcggaatg 1920
aagggcgagc gcagaagagg caagggacac gatggactgt accagggcct gagcaccgcc 1980
accaaggata cctatgacgc actgcacatg caggccctgc cacctaga 2028
<210> 71
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD33 signal sequence
<400> 71
Met Pro Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Trp Ala Gly Ala Leu Ala
1 5 10 15
<210> 72
<211> 660
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗GPRC5D CAR
<400> 72
Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn Pro
85 90 95
Pro Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ser Arg
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu
115 120 125
Glu Met Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val His
130 135 140
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
145 150 155 160
Arg Ser His Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
165 170 175
Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Ser Asp Ser Thr Tyr Thr Tyr Tyr Ala
180 185 190
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
195 200 205
Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
210 215 220
Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Gly Gln Trp Lys Tyr Tyr Asp Tyr Trp
225 230 235 240
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
245 250 255
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe
260 265 270
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
275 280 285
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val
290 295 300
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
305 310 315 320
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
325 330 335
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
340 345 350
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
355 360 365
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
370 375 380
Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
385 390 395 400
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
405 410 415
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
420 425 430
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
435 440 445
Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
450 455 460
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Met Phe
465 470 475 480
Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu
485 490 495
Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys
500 505 510
Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr
515 520 525
Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly
530 535 540
Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala
545 550 555 560
Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg
565 570 575
Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu
580 585 590
Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn
595 600 605
Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
610 615 620
Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
625 630 635 640
Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala
645 650 655
Leu Pro Pro Arg
660
<210> 73
<211> 684
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG4/IgG2 铰链- IgG2/IgG4 CH2- IgG4 CH3 spacer
(nt)
<400> 73
gaatctaagt acggaccgcc ctgccctccc tgccctgctc ctcctgtggc tggaccaagc 60
gtgttcctgt ttccacctaa gcctaaagat accctgatga tttcccgcac acctgaagtg 120
acttgcgtgg tcgtggacgt gagccaggag gatccagaag tgcagttcaa ctggtacgtg 180
gacggcgtgg aagtccacaa tgctaagact aaaccccgag aggaacagtt tcagtcaact 240
taccgggtcg tgagcgtgct gaccgtcctg catcaggatt ggctgaacgg gaaggagtat 300
aagtgcaaag tgtctaataa gggactgcct agctccatcg agaaaacaat tagtaaggca 360
aaagggcagc ctcgagaacc acaggtgtat accctgcccc ctagccagga ggaaatgacc 420
aagaaccagg tgtccctgac atgtctggtc aaaggcttct atccaagtga catcgccgtg 480
gagtgggaat caaatgggca gcccgagaac aattacaaga ccacaccacc cgtgctggac 540
tctgatggaa gtttctttct gtattccagg ctgaccgtgg ataaatctcg ctggcaggag 600
ggcaacgtgt tctcttgcag tgtcatgcac gaagccctgc acaatcatta tacacagaag 660
tcactgagcc tgtccctggg caaa 684
<210> 74
<211> 684
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> optimized SSE IgG4/IgG2 铰链- IgG2/IgG4 CH2- IgG4
CH3间隔子(nt)
<400> 74
gagtctaaat acggaccgcc ttgtcctcct tgtcccgctc ctcctgttgc cggaccttcc 60
gtgttcctgt ttcctccaaa gcctaaggac accctgatga tcagcaggac ccctgaagtg 120
acctgcgtgg tggtggatgt gtcccaagag gatcccgagg tgcagttcaa ctggtatgtg 180
gacggcgtgg aagtgcacaa cgccaagacc aagcctagag aggaacagtt ccagagcacc 240
tacagagtgg tgtccgtgct gacagtgctg caccaggatt ggctgaacgg caaagagtac 300
aagtgcaagg tgtccaacaa gggcctgcct agcagcatcg agaaaaccat ctccaaggcc 360
aagggccagc caagagagcc ccaggtttac acactgcctc caagccaaga ggaaatgacc 420
aagaatcagg tgtccctgac atgcctggtc aagggcttct acccctccga tatcgccgtg 480
gaatgggaga gcaatggcca gcctgagaac aactacaaga ccacacctcc tgtgctggac 540
agcgacggca gtttcttcct gtatagtaga ctcaccgtgg ataaatcaag atggcaagag 600
ggcaacgtgt tcagctgcag cgtgatgcac gaggccctgc acaaccacta cacccagaaa 660
agcctgagcc tgtctctggg caag 684
<210> 75
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH1
<400> 75
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
1 5
<210> 76
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH2
<400> 76
Ser Gly Arg Gly Arg Ser
1 5
<210> 77
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH3
<400> 77
Tyr Tyr His Ala Gly Ala Phe Asp Leu
1 5
<210> 78
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH1
<400> 78
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Thr
1 5 10
<210> 79
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH2
<400> 79
Thr Ile Ser Gly Arg Gly Arg Ser Thr Phe
1 5 10
<210> 80
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH1
<400> 80
Ser Tyr Ala Met Thr
1 5
<210> 81
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH2
<400> 81
Thr Ile Ser Gly Arg Gly Arg Ser Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 82
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH1
<400> 82
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala
1 5
<210> 83
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH2
<400> 83
Ile Ser Gly Arg Gly Arg Ser Thr
1 5
<210> 84
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH3
<400> 84
Ala Arg Tyr Tyr His Ala Gly Ala Phe Asp Leu
1 5 10
<210> 85
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL1
<400> 85
Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser
1 5 10
<210> 86
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL2
<400> 86
Asp Val Ser Lys Arg Pro Ser
1 5
<210> 87
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL3
<400> 87
Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Ser Thr Leu Val
1 5 10
<210> 88
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL1
<400> 88
Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr
1 5
<210> 89
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL2
<400> 89
Asp Val Ser
1
<210> 90
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH1
<400> 90
Gly Tyr Thr Phe Asn Arg Tyr
1 5
<210> 91
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH2
<400> 91
Ser Ala Tyr Asn Gly Asn
1 5
<210> 92
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH3
<400> 92
Met Ala Tyr Asp Ser
1 5
<210> 93
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH1
<400> 93
Gly Tyr Thr Phe Asn Arg Tyr Ala Ile Thr
1 5 10
<210> 94
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH2
<400> 94
Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Ser His
1 5 10
<210> 95
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH1
<400> 95
Arg Tyr Ala Ile Thr
1 5
<210> 96
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH2
<400> 96
Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Ser His Tyr Ala Gln Lys Leu Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 97
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH1
<400> 97
Gly Tyr Thr Phe Asn Arg Tyr Ala
1 5
<210> 98
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH2
<400> 98
Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Ser
1 5
<210> 99
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH3
<400> 99
Ala Arg Met Ala Tyr Asp Ser
1 5
<210> 100
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL1
<400> 100
Thr Gly Thr Ser Asn Asp Val Gly Ala Tyr Lys Tyr Val Ser
1 5 10
<210> 101
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL2
<400> 101
Asp Val Phe Lys Arg Pro Ser
1 5
<210> 102
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL3
<400> 102
Phe Ser Leu Thr Ser Ser Asn Thr Tyr Val
1 5 10
<210> 103
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL1
<400> 103
Ser Asn Asp Val Gly Ala Tyr Lys Tyr
1 5
<210> 104
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL2
<400> 104
Asp Val Phe
1
<210> 105
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH1
<400> 105
Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
1 5
<210> 106
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH2
<400> 106
Ser Ser Ser Gly Ser Thr
1 5
<210> 107
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH3
<400> 107
Gly Tyr Gly Lys Ala Tyr Asp Gln
1 5
<210> 108
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH1
<400> 108
Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr Met Ser
1 5 10
<210> 109
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH2
<400> 109
Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr
1 5 10
<210> 110
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH1
<400> 110
Asp Tyr Tyr Met Ser
1 5
<210> 111
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH2
<400> 111
Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 112
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH1
<400> 112
Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr
1 5
<210> 113
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH2
<400> 113
Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile
1 5
<210> 114
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH3
<400> 114
Ala Arg Gly Tyr Gly Lys Ala Tyr Asp Gln
1 5 10
<210> 115
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL1
<400> 115
Ser Gly Ser Arg Ser Asn Val Gly Gly Asn Tyr Val Phe
1 5 10
<210> 116
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL2
<400> 116
Arg Ser Asn Gln Arg Pro Ser
1 5
<210> 117
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL3
<400> 117
Ala Thr Trp Asp Asp Ser Leu Ser Gly Phe Val
1 5 10
<210> 118
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL1
<400> 118
Arg Ser Asn Val Gly Gly Asn Tyr
1 5
<210> 119
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL2
<400> 119
Arg Ser Asn
1
<210> 120
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH1
<400> 120
Gly Phe Thr Phe Arg Ser His
1 5
<210> 121
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH2
<400> 121
Ser Ser Asp Ser Thr Tyr
1 5
<210> 122
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH3
<400> 122
Ser Gly Gly Gln Trp Lys Tyr Tyr Asp Tyr
1 5 10
<210> 123
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH1
<400> 123
Gly Phe Thr Phe Arg Ser His Ser Met Asn
1 5 10
<210> 124
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH2
<400> 124
Ser Ile Ser Ser Asp Ser Thr Tyr Thr Tyr
1 5 10
<210> 125
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH1
<400> 125
Ser His Ser Met Asn
1 5
<210> 126
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH2
<400> 126
Ser Ile Ser Ser Asp Ser Thr Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 127
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH1
<400> 127
Gly Phe Thr Phe Arg Ser His Ser
1 5
<210> 128
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH2
<400> 128
Ile Ser Ser Asp Ser Thr Tyr Thr
1 5
<210> 129
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH3
<400> 129
Ala Arg Ser Gly Gly Gln Trp Lys Tyr Tyr Asp Tyr
1 5 10
<210> 130
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL1
<400> 130
Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser
1 5 10
<210> 131
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL2
<400> 131
Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser
1 5
<210> 132
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL3
<400> 132
Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn Pro Pro Val Val
1 5 10
<210> 133
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL1
<400> 133
Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr
1 5
<210> 134
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL2
<400> 134
Gly Lys Asn
1
<210> 135
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH1
<400> 135
Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
1 5
<210> 136
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH2
<400> 136
Ser Gly Ser Gly Asn
1 5
<210> 137
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH3
<400> 137
Gly Ser Val Arg Tyr Thr Asp Ile
1 5
<210> 138
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH1
<400> 138
Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Ala Met Ser
1 5 10
<210> 139
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH2
<400> 139
Ala Ile Ser Gly Ser Gly Asn Thr Tyr
1 5
<210> 140
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH1
<400> 140
Asn Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 141
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH2
<400> 141
Ala Ile Ser Gly Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 142
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH1
<400> 142
Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Ala
1 5
<210> 143
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH2
<400> 143
Ile Ser Gly Ser Gly Asn Thr
1 5
<210> 144
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH3
<400> 144
Ala Arg Gly Ser Val Arg Tyr Thr Asp Ile
1 5 10
<210> 145
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL1
<400> 145
Thr Arg Thr Ser Gly Ala Ile Ala Gly Ala Tyr Val Gln
1 5 10
<210> 146
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL2
<400> 146
Asp Asp Asn Lys Arg Pro Ser
1 5
<210> 147
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL3
<400> 147
Gln Ser Tyr Asp Tyr Asp Ser Ser Asn Val Leu
1 5 10
<210> 148
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL1
<400> 148
Ser Gly Ala Ile Ala Gly Ala Tyr
1 5
<210> 149
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL2
<400> 149
Asp Asp Asn
1
<210> 150
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH2
<400> 150
Asn Gly Arg Gly Ser Ser
1 5
<210> 151
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH3
<400> 151
Tyr Ile Ser Arg Gly Leu Gly Asp Ser
1 5
<210> 152
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH1
<400> 152
Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Ala Met Asn
1 5 10
<210> 153
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH2
<400> 153
Thr Ile Asn Gly Arg Gly Ser Ser Thr Ile
1 5 10
<210> 154
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH2
<400> 154
Thr Ile Asn Gly Arg Gly Ser Ser Thr Ile Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 155
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH2
<400> 155
Ile Asn Gly Arg Gly Ser Ser Thr
1 5
<210> 156
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH3
<400> 156
Ala Arg Tyr Ile Ser Arg Gly Leu Gly Asp Ser
1 5 10
<210> 157
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL1
<400> 157
Ser Gly Gly Asn Ser Asn Ile Glu Arg Asn Tyr Val Ser
1 5 10
<210> 158
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL2
<400> 158
Asp Asn Asp Arg Arg Pro Ser
1 5
<210> 159
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL3
<400> 159
Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu Arg Gly Trp Val
1 5 10
<210> 160
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL1
<400> 160
Asn Ser Asn Ile Glu Arg Asn Tyr
1 5
<210> 161
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL2
<400> 161
Asp Asn Asp
1
<210> 162
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH1
<400> 162
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
1 5
<210> 163
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH2
<400> 163
Asn Pro Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 164
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH3
<400> 164
Gly Ser Ser Arg Trp Gly Gly Trp Thr Gly Asp Tyr
1 5 10
<210> 165
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH1
<400> 165
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Tyr Met His
1 5 10
<210> 166
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH2
<400> 166
Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Arg
1 5 10
<210> 167
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH1
<400> 167
Ser Tyr Tyr Met His
1 5
<210> 168
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH2
<400> 168
Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Arg Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 169
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH1
<400> 169
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Tyr
1 5
<210> 170
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH2
<400> 170
Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr
1 5
<210> 171
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH3
<400> 171
Ala Arg Gly Ser Ser Arg Trp Gly Gly Trp Thr Gly Asp
1 5 10
<210> 172
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL1
<400> 172
Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Phe Val Ser
1 5 10
<210> 173
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL3
<400> 173
Ser Ser Tyr Thr Ser Thr Arg Thr Val Ile
1 5 10
<210> 174
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL1
<400> 174
Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Phe
1 5
<210> 175
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL3
<400> 175
Ser Ser Tyr Thr Ser Thr Arg Thr Val Ile Phe Ala Gly Gly Thr Lys
1 5 10 15
Val Thr Val Leu
20
<210> 176
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 剪接供体位点
<400> 176
aatctaagta cggac 15
<210> 177
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 剪接供体位点
<400> 177
tcaactggta cgtgg 15
<210> 178
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 剪接供体位点
<400> 178
acaattagta aggca 15
<210> 179
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 剪接供体位点
<400> 179
accacaggtg tatac 15
<210> 180
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 剪接受体序列
<400> 180
aagtttcttt ctgtattcca ggctgaccgt ggataaatct c 41
<210> 181
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 剪接受体序列
<400> 181
gggcaacgtg ttctcttgca gtgtcatgca cgaagccctg c 41
<210> 182
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 经修饰的剪接供体位点
<400> 182
agtctaaata cggac 15
<210> 183
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 经修饰的剪接供体位点
<400> 183
tcaactggta tgtgg 15
<210> 184
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 经修饰的剪接供体位点
<400> 184
accatctcca aggcc 15
<210> 185
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 经修饰的剪接供体位点
<400> 185
gccccaggtt tacac 15
<210> 186
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 经修饰的剪接受体序列
<400> 186
cagtttcttc ctgtatagta gactcaccgt ggataaatca a 41
<210> 187
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 经修饰的剪接受体序列
<400> 187
gggcaacgtg ttcagctgca gcgtgatgca cgaggccctg c 41
<210> 188
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 经修饰的剪接受体序列
<400> 188
cgccttgtcc tccttgtccc gctcctcctg ttgccggacc t 41
<210> 189
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-23 VH
<400> 189
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Val Asp Gly Asp Tyr Thr Glu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 190
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-23 VL
<400> 190
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asp Val Gly Lys Tyr
20 25 30
Asn Leu Val Ser Trp Tyr Gln Gln Pro Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Ile Ile Tyr Asp Val Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Gly Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Gly Gly Ser
85 90 95
Arg Ser Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105 110
<210> 191
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-25 VH
<400> 191
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Asp Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Phe Ile Arg Ser Lys Ala Tyr Gly Gly Thr Thr Glu Tyr Ala Ala
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ile
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Ala Trp Ser Ala Pro Thr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 192
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-25 VL
<400> 192
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Val Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Arg Gly
50 55 60
Thr Gly Tyr Gly Thr Glu Phe Ser Leu Thr Ile Asp Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Ser Arg Gln
85 90 95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Asp Ile Lys
100 105
<210> 193
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-26 VH
<400> 193
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Val Asp Gly Pro Pro Ser Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Met Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 194
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-26 VL
<400> 194
Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Ala Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Met Leu Val Val Tyr
35 40 45
Asp Asp Asp Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Glu Ala Gly
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys His Leu Trp Asp Arg Ser Arg Asp His
85 90 95
Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 195
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-52 VH
<400> 195
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly His Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Ser Gly Ser Phe Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 196
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-52 VL
<400> 196
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Met Ser Cys Ser Gly Thr Ser Ser Asn Ile Gly Ser His
20 25 30
Ser Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Thr Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Gly Ser Leu
85 90 95
Asn Gly Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105 110
<210> 197
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-55 VH
<400> 197
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Met Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ile Asp Tyr
20 25 30
Tyr Val Tyr Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Ser Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gln Arg Asp Gly Tyr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 198
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-55 VL
<400> 198
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Ala Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Ala Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Trp Tyr
20 25 30
Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr Glu Asp Ser
35 40 45
Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly
50 55 60
Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala
65 70 75 80
Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Asn Thr Arg Ser Ser Thr Leu Val Phe Gly
85 90 95
Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105
<210> 199
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH1
<400> 199
Asp Tyr Tyr Met Ser
1 5
<210> 200
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH2
<400> 200
Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 201
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH3
<400> 201
Val Asp Gly Asp Tyr Thr Glu Asp Tyr
1 5
<210> 202
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH1
<400> 202
Asp Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 203
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH2
<400> 203
Phe Ile Arg Ser Lys Ala Tyr Gly Gly Thr Thr Glu Tyr Ala Ala Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 204
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH3
<400> 204
Trp Ser Ala Pro Thr Asp Tyr
1 5
<210> 205
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH3
<400> 205
Val Asp Gly Pro Pro Ser Phe Asp Ile
1 5
<210> 206
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH1
<400> 206
Ser Tyr Trp Ile Gly
1 5
<210> 207
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH2
<400> 207
Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 208
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH3
<400> 208
Tyr Ser Gly Ser Phe Asp Asn
1 5
<210> 209
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH1
<400> 209
Asp Tyr Tyr Val Tyr
1 5
<210> 210
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH2
<400> 210
Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 211
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH3
<400> 211
Ser Gln Arg Asp Gly Tyr Met Asp Tyr
1 5
<210> 212
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH1
<400> 212
Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp
1 5
<210> 213
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH2
<400> 213
Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr
1 5
<210> 214
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH3
<400> 214
Ala Arg Tyr Ser Gly Ser Phe Asp Asn
1 5
<210> 215
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH1
<400> 215
Gly Tyr Thr Phe Ile Asp Tyr Tyr
1 5
<210> 216
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH2
<400> 216
Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr
1 5
<210> 217
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH3
<400> 217
Ala Arg Ser Gln Arg Asp Gly Tyr Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 218
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL1
<400> 218
Thr Gly Ser Ser Ser Asp Val Gly Lys Tyr Asn Leu Val Ser
1 5 10
<210> 219
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL2
<400> 219
Asp Val Asn Lys Arg Pro Ser
1 5
<210> 220
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL3
<400> 220
Ser Ser Tyr Gly Gly Ser Arg Ser Tyr Val
1 5 10
<210> 221
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL1
<400> 221
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr Leu Ala
1 5 10
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL2
<400> 222
Ser Ala Ser Thr Leu Gln Ser
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<400> 223
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<220>
<223> CDRL1
<400> 224
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1 5 10
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<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL2
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Asp Asp Asp Asp Arg Pro Ser
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<211> 11
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<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL3
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<213> 人工序列
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<400> 237
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Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
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100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser
130 135 140
Gly Ser Pro Gly Gln Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser
145 150 155 160
Asp Val Gly Lys Tyr Asn Leu Val Ser Trp Tyr Gln Gln Pro Pro Gly
165 170 175
Lys Ala Pro Lys Leu Ile Ile Tyr Asp Val Asn Lys Arg Pro Ser Gly
180 185 190
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Thr Ile Ser Gly Leu Gln Gly Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser
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<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-25 scFv
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Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Asp Tyr
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Ala Met Ser Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Gly Phe Ile Arg Ser Lys Ala Tyr Gly Gly Thr Thr Glu Tyr Ala Ala
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Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ile
65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Val Thr Cys Arg Ala Ser Gln
145 150 155 160
Gly Ile Ser Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala
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Ser Arg Phe Arg Gly Thr Gly Tyr Gly Thr Glu Phe Ser Leu Thr Ile
195 200 205
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210 215 220
Tyr Thr Ser Arg Gln Thr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Asp Ile Lys
225 230 235 240
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<211> 241
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<213> 人工序列
<220>
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<400> 239
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Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
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Ala Lys Val Asp Gly Pro Pro Ser Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser
130 135 140
Val Ala Pro Gly Gln Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Ala Asn Asn Ile
145 150 155 160
Gly Ser Lys Ser Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
165 170 175
Met Leu Val Val Tyr Asp Asp Asp Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu
180 185 190
Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser
195 200 205
Gly Val Glu Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys His Leu Trp Asp
210 215 220
Arg Ser Arg Asp His Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Thr Val
225 230 235 240
Leu
<210> 240
<211> 248
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-52 scFv
<400> 240
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
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Arg Val Thr Met Ser Cys Ser Gly Thr Ser Ser Asn Ile Gly Ser His
20 25 30
Ser Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Thr Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
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100 105 110
Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Leu Glu Met Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys
130 135 140
Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser
145 150 155 160
Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly
165 170 175
Leu Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr
180 185 190
Ser Pro Ser Phe Gln Gly His Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile
195 200 205
Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala
210 215 220
Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Ser Gly Ser Phe Asp Asn Trp Gly Gln
225 230 235 240
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 241
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-55 scFv
<400> 241
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Ala Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Ala Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Trp Tyr
20 25 30
Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr Glu Asp Ser
35 40 45
Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly
50 55 60
Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala
65 70 75 80
Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Asn Thr Arg Ser Ser Thr Leu Val Phe Gly
85 90 95
Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Glu Met Ala Glu Val
115 120 125
Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Met Lys Lys Pro Gly Ala Ser Leu
130 135 140
Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ile Asp Tyr Tyr Val
145 150 155 160
Tyr Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Ser Met Gly Trp
165 170 175
Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly
180 185 190
Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu
195 200 205
Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg
210 215 220
Ser Gln Arg Asp Gly Tyr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
225 230 235 240
Thr Val Ser Ser
<210> 242
<211> 1959
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗BMCA CAR
<400> 242
gaggtgcagc tggtggagtc cggaggaggc ctggtgaagc caggaggctc cctgaggctg 60
tcttgcgcag ccagcggctt cacctttagc gactactata tgtcctggat cagacaggca 120
cctggcaagg gcctggagtg ggtgagctac atcagctcct ctggctccac aatctactat 180
gccgactctg tgaagggccg gtttaccatc agcagagata acgccaagaa ttccctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag ggccgaggac acagccgtgt actattgcgc caaggtggac 300
ggcgattaca ccgaggatta ttggggccag ggcacactgg tgaccgtgag ctccggcggc 360
ggcggctctg gaggaggagg cagcggcgga ggaggctccc agtctgccct gacacagcca 420
gccagcgtgt ccggctctcc cggacagtcc atcacaatct cttgtaccgg ctctagctcc 480
gacgtgggca agtacaacct ggtgtcctgg tatcagcagc cccctggcaa ggcccctaag 540
ctgatcatct acgatgtgaa caagaggcca tctggcgtga gcaatcgctt cagcggctcc 600
aagtctggca ataccgccac actgaccatc agcggcctgc agggcgacga tgaggcagat 660
tactattgtt ctagctacgg cggcagcaga tcctacgtgt tcggcacagg caccaaggtg 720
accgtgctgg aatctaagta cggaccgcct tgtcctcctt gtcccgctcc tcctgttgcc 780
ggaccttccg tgttcctgtt tcctccaaag cctaaggaca ccctgatgat cagcaggacc 840
cctgaagtga cctgcgtggt ggtggatgtg tcccaagagg atcccgaggt gcagttcaac 900
tggtatgtgg acggcgtgga agtgcacaac gccaagacca agcctagaga ggaacagttc 960
cagagcacct acagagtggt gtccgtgctg acagtgctgc accaggattg gctgaacggc 1020
aaagagtaca agtgcaaggt gtccaacaag ggcctgccta gcagcatcga gaaaaccatc 1080
tccaaggcca agggccagcc aagagagccc caggtttaca cactgcctcc aagccaagag 1140
gaaatgacca agaatcaggt gtccctgaca tgcctggtca agggcttcta cccctccgat 1200
atcgccgtgg aatgggagag caatggccag cctgagaaca actacaagac cacacctcct 1260
gtgctggaca gcgacggcag tttcttcctg tatagtagac tcaccgtgga taaatcaaga 1320
tggcaagagg gcaacgtgtt cagctgcagc gtgatgcacg aggccctgca caaccactac 1380
acccagaaaa gcctgagcct gtctctgggc aagatgttct gggtgctcgt ggtcgttggc 1440
ggagtgctgg cctgttacag cctgctggtt accgtggcct tcatcatctt ttgggtcaag 1500
cggggcagaa agaagctgct ctacatcttc aagcagccct tcatgcggcc cgtgcagacc 1560
acacaagagg aagatggctg ctcctgcaga ttccccgagg aagaagaagg cggctgcgag 1620
ctgagagtga agttcagcag atccgccgac gctccagcct atcagcaggg ccaaaaccag 1680
ctgtacaacg agctgaacct ggggagaaga gaagagtacg acgtgctgga taagcggaga 1740
ggcagagatc ctgaaatggg cggcaagccc agacggaaga atcctcaaga gggcctgtat 1800
aatgagctgc agaaagacaa gatggccgag gcctacagcg agatcggaat gaagggcgag 1860
cgcagaagag gcaagggaca cgatggactg taccagggcc tgagcaccgc caccaaggat 1920
acctatgacg cactgcacat gcaggccctg ccacctaga 1959
<210> 243
<211> 1950
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗BMCA CAR
<400> 243
gaggtgcagc tggtgcagag cggaggaggc ctggtgcagc ctggcaggtc cctgcgcctg 60
tcttgcaccg ccagcggctt cacatttggc gactatgcca tgtcctggtt caagcaggca 120
ccaggcaagg gcctggagtg ggtgggcttt atccgctcta aggcctacgg cggcaccaca 180
gagtatgccg ccagcgtgaa gggccggttc accatcagcc gggacgactc taagagcatc 240
gcctacctgc agatgaactc tctgaagacc gaggacacag ccgtgtacta ttgcgcagca 300
tggagcgccc caaccgatta ttggggccag ggcaccctgg tgacagtgag ctccggcggc 360
ggcggctctg gaggaggagg aagcggagga ggaggatccg acatccagat gacacagtcc 420
cctgcctttc tgtccgcctc tgtgggcgat agggtgaccg tgacatgtcg cgcctcccag 480
ggcatctcta actacctggc ctggtatcag cagaagcccg gcaatgcccc tcggctgctg 540
atctacagcg cctccaccct gcagagcgga gtgccctccc ggttcagagg aaccggctat 600
ggcacagagt tttctctgac catcgacagc ctgcagccag aggatttcgc cacatactat 660
tgtcagcagt cttacaccag ccggcagaca tttggccccg gcacaagact ggatatcaag 720
gagtctaaat acggaccgcc ttgtcctcct tgtcccgctc ctcctgttgc cggaccttcc 780
gtgttcctgt ttcctccaaa gcctaaggac accctgatga tcagcaggac ccctgaagtg 840
acctgcgtgg tggtggatgt gtcccaagag gatcccgagg tgcagttcaa ctggtatgtg 900
gacggcgtgg aagtgcacaa cgccaagacc aagcctagag aggaacagtt ccagagcacc 960
tacagagtgg tgtccgtgct gacagtgctg caccaggatt ggctgaacgg caaagagtac 1020
aagtgcaagg tgtccaacaa gggcctgcct agcagcatcg agaaaaccat ctccaaggcc 1080
aagggccagc caagagagcc ccaggtttac acactgcctc caagccaaga ggaaatgacc 1140
aagaatcagg tgtccctgac atgcctggtc aagggcttct acccctccga tatcgccgtg 1200
gaatgggaga gcaatggcca gcctgagaac aactacaaga ccacacctcc tgtgctggac 1260
agcgacggca gtttcttcct gtatagtaga ctcaccgtgg ataaatcaag atggcaagag 1320
ggcaacgtgt tcagctgcag cgtgatgcac gaggccctgc acaaccacta cacccagaaa 1380
agcctgagcc tgtctctggg caagatgttc tgggtgctcg tggtcgttgg cggagtgctg 1440
gcctgttaca gcctgctggt taccgtggcc ttcatcatct tttgggtcaa gcggggcaga 1500
aagaagctgc tctacatctt caagcagccc ttcatgcggc ccgtgcagac cacacaagag 1560
gaagatggct gctcctgcag attccccgag gaagaagaag gcggctgcga gctgagagtg 1620
aagttcagca gatccgccga cgctccagcc tatcagcagg gccaaaacca gctgtacaac 1680
gagctgaacc tggggagaag agaagagtac gacgtgctgg ataagcggag aggcagagat 1740
cctgaaatgg gcggcaagcc cagacggaag aatcctcaag agggcctgta taatgagctg 1800
cagaaagaca agatggccga ggcctacagc gagatcggaa tgaagggcga gcgcagaaga 1860
ggcaagggac acgatggact gtaccagggc ctgagcaccg ccaccaagga tacctatgac 1920
gcactgcaca tgcaggccct gccacctaga 1950
<210> 244
<211> 1953
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗BMCA CAR
<400> 244
gaggtgcagc tggtggagtc cggaggaggc ctggtgaagc caggaggctc tctgaggctg 60
agctgcgcag cctccggctt caccttttct gactactata tgagctggat caggcaggca 120
ccaggcaagg gcctggagtg ggtgtcttac atcagctcct ctggcagcac aatctactat 180
gccgactccg tgaagggcag gttcaccatc tctcgcgata acgccaagaa tagcctgtat 240
ctgcagatga actccctgcg ggccgaggat acagccgtgt actattgcgc caaggtggac 300
ggcccccctt cctttgatat ctggggccag ggcacaatgg tgaccgtgag ctccggagga 360
ggaggatccg gcggaggagg ctctggcggc ggcggctcta gctatgtgct gacccagcca 420
ccatccgtgt ctgtggcacc tggacagaca gcaaggatca cctgtggagc aaacaatatc 480
ggcagcaagt ccgtgcactg gtaccagcag aagcctggcc aggccccaat gctggtggtg 540
tatgacgatg acgatcggcc cagcggcatc cctgagagat tttctggcag caactccggc 600
aataccgcca cactgaccat ctctggagtg gaggcaggcg acgaggcaga ttacttctgt 660
cacctgtggg accggagcag agatcactac gtgttcggca caggcaccaa gctgaccgtg 720
ctggaatcta agtacggacc gccttgtcct ccttgtcccg ctcctcctgt tgccggacct 780
tccgtgttcc tgtttcctcc aaagcctaag gacaccctga tgatcagcag gacccctgaa 840
gtgacctgcg tggtggtgga tgtgtcccaa gaggatcccg aggtgcagtt caactggtat 900
gtggacggcg tggaagtgca caacgccaag accaagccta gagaggaaca gttccagagc 960
acctacagag tggtgtccgt gctgacagtg ctgcaccagg attggctgaa cggcaaagag 1020
tacaagtgca aggtgtccaa caagggcctg cctagcagca tcgagaaaac catctccaag 1080
gccaagggcc agccaagaga gccccaggtt tacacactgc ctccaagcca agaggaaatg 1140
accaagaatc aggtgtccct gacatgcctg gtcaagggct tctacccctc cgatatcgcc 1200
gtggaatggg agagcaatgg ccagcctgag aacaactaca agaccacacc tcctgtgctg 1260
gacagcgacg gcagtttctt cctgtatagt agactcaccg tggataaatc aagatggcaa 1320
gagggcaacg tgttcagctg cagcgtgatg cacgaggccc tgcacaacca ctacacccag 1380
aaaagcctga gcctgtctct gggcaagatg ttctgggtgc tcgtggtcgt tggcggagtg 1440
ctggcctgtt acagcctgct ggttaccgtg gccttcatca tcttttgggt caagcggggc 1500
agaaagaagc tgctctacat cttcaagcag cccttcatgc ggcccgtgca gaccacacaa 1560
gaggaagatg gctgctcctg cagattcccc gaggaagaag aaggcggctg cgagctgaga 1620
gtgaagttca gcagatccgc cgacgctcca gcctatcagc agggccaaaa ccagctgtac 1680
aacgagctga acctggggag aagagaagag tacgacgtgc tggataagcg gagaggcaga 1740
gatcctgaaa tgggcggcaa gcccagacgg aagaatcctc aagagggcct gtataatgag 1800
ctgcagaaag acaagatggc cgaggcctac agcgagatcg gaatgaaggg cgagcgcaga 1860
agaggcaagg gacacgatgg actgtaccag ggcctgagca ccgccaccaa ggatacctat 1920
gacgcactgc acatgcaggc cctgccacct aga 1953
<210> 245
<211> 1974
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗BMCA CAR
<400> 245
agctatgagc tgacacagcc tccaagcgcc tctggcacac ctggacagcg agtgacaatg 60
agctgtagcg gcaccagcag caacatcggc agccacagcg tgaactggta tcagcagctg 120
cctggcacag cccctaaact gctgatctac accaacaacc agcggcctag cggcgtgccc 180
gatagatttt ctggcagcaa gagcggcaca agcgccagcc tggctatttc tggactgcag 240
agcgaggacg aggccgacta ttattgtgcc gcctgggacg gctctctgaa cggccttgtt 300
tttggcggag gcaccaagct gacagtgctg ggatctagag gtggcggagg atctggcggc 360
ggaggaagcg gaggcggcgg atctcttgaa atggctgaag tgcagctggt gcagtctggc 420
gccgaagtga agaagcctgg cgagagcctg aagatcagct gcaaaggcag cggctacagc 480
ttcaccagct actggatcgg ctgggtccga cagatgcctg gcaaaggcct tgagtggatg 540
ggcatcatct accccggcga cagcgacacc agatacagcc ctagctttca gggccacgtg 600
accatcagcg ccgacaagtc tatcagcacc gcctacctgc agtggtccag cctgaaggcc 660
tctgacaccg ccatgtacta ctgcgccaga tactctggca gcttcgacaa ttggggccag 720
ggcacactgg tcaccgtgtc cagcgagtct aaatacggac cgccttgtcc tccttgtccc 780
gctcctcctg ttgccggacc ttccgtgttc ctgtttcctc caaagcctaa ggacaccctg 840
atgatcagca ggacccctga agtgacctgc gtggtggtgg atgtgtccca agaggatccc 900
gaggtgcagt tcaactggta tgtggacggc gtggaagtgc acaacgccaa gaccaagcct 960
agagaggaac agttccagag cacctacaga gtggtgtccg tgctgacagt gctgcaccag 1020
gattggctga acggcaaaga gtacaagtgc aaggtgtcca acaagggcct gcctagcagc 1080
atcgagaaaa ccatctccaa ggccaagggc cagccaagag agccccaggt ttacacactg 1140
cctccaagcc aagaggaaat gaccaagaat caggtgtccc tgacatgcct ggtcaagggc 1200
ttctacccct ccgatatcgc cgtggaatgg gagagcaatg gccagcctga gaacaactac 1260
aagaccacac ctcctgtgct ggacagcgac ggcagtttct tcctgtatag tagactcacc 1320
gtggataaat caagatggca agagggcaac gtgttcagct gcagcgtgat gcacgaggcc 1380
ctgcacaacc actacaccca gaaaagcctg agcctgtctc tgggcaagat gttctgggtg 1440
ctcgtggtcg ttggcggagt gctggcctgt tacagcctgc tggttaccgt ggccttcatc 1500
atcttttggg tcaagcgggg cagaaagaag ctgctctaca tcttcaagca gcccttcatg 1560
cggcccgtgc agaccacaca agaggaagat ggctgctcct gcagattccc cgaggaagaa 1620
gaaggcggct gcgagctgag agtgaagttc agcagatccg ccgacgctcc agcctatcag 1680
cagggccaaa accagctgta caacgagctg aacctgggga gaagagaaga gtacgacgtg 1740
ctggataagc ggagaggcag agatcctgaa atgggcggca agcccagacg gaagaatcct 1800
caagagggcc tgtataatga gctgcagaaa gacaagatgg ccgaggccta cagcgagatc 1860
ggaatgaagg gcgagcgcag aagaggcaag ggacacgatg gactgtacca gggcctgagc 1920
accgccacca aggataccta tgacgcactg cacatgcagg ccctgccacc taga 1974
<210> 246
<211> 1962
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗BMCA CAR
<400> 246
cagtctgccc tgacacagcc tgccagcgtt agtgctagtc ccggacagtc tatcgccatc 60
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gattactact gcagcagcaa cacccggtcc agcacactgg tttttggcgg aggcaccaag 300
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tactggatgc ggcaggcccc tggacaggga ctcgaatcta tgggctggat caaccccaat 540
agcggcggca ccaattacgc ccagaaattc cagggcagag tgaccatgac cagagacacc 600
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tactgcgcca gatctcagcg cgacggctac atggattatt ggggccaggg aaccctggtc 720
accgtgtcca gcgagtctaa atacggaccg ccttgtcctc cttgtcccgc tcctcctgtt 780
gccggacctt ccgtgttcct gtttcctcca aagcctaagg acaccctgat gatcagcagg 840
acccctgaag tgacctgcgt ggtggtggat gtgtcccaag aggatcccga ggtgcagttc 900
aactggtatg tggacggcgt ggaagtgcac aacgccaaga ccaagcctag agaggaacag 960
ttccagagca cctacagagt ggtgtccgtg ctgacagtgc tgcaccagga ttggctgaac 1020
ggcaaagagt acaagtgcaa ggtgtccaac aagggcctgc ctagcagcat cgagaaaacc 1080
atctccaagg ccaagggcca gccaagagag ccccaggttt acacactgcc tccaagccaa 1140
gaggaaatga ccaagaatca ggtgtccctg acatgcctgg tcaagggctt ctacccctcc 1200
gatatcgccg tggaatggga gagcaatggc cagcctgaga acaactacaa gaccacacct 1260
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tacacccaga aaagcctgag cctgtctctg ggcaagatgt tctgggtgct cgtggtcgtt 1440
ggcggagtgc tggcctgtta cagcctgctg gttaccgtgg ccttcatcat cttttgggtc 1500
aagcggggca gaaagaagct gctctacatc ttcaagcagc ccttcatgcg gcccgtgcag 1560
accacacaag aggaagatgg ctgctcctgc agattccccg aggaagaaga aggcggctgc 1620
gagctgagag tgaagttcag cagatccgcc gacgctccag cctatcagca gggccaaaac 1680
cagctgtaca acgagctgaa cctggggaga agagaagagt acgacgtgct ggataagcgg 1740
agaggcagag atcctgaaat gggcggcaag cccagacgga agaatcctca agagggcctg 1800
tataatgagc tgcagaaaga caagatggcc gaggcctaca gcgagatcgg aatgaagggc 1860
gagcgcagaa gaggcaaggg acacgatgga ctgtaccagg gcctgagcac cgccaccaag 1920
gatacctatg acgcactgca catgcaggcc ctgccaccta ga 1962
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<220>
<223> 抗BMCA CAR
<400> 247
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Val Asp Gly Asp Tyr Thr Glu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser
130 135 140
Gly Ser Pro Gly Gln Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser
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Asp Val Gly Lys Tyr Asn Leu Val Ser Trp Tyr Gln Gln Pro Pro Gly
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Lys Ala Pro Lys Leu Ile Ile Tyr Asp Val Asn Lys Arg Pro Ser Gly
180 185 190
Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu
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210 215 220
Ser Tyr Gly Gly Ser Arg Ser Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val
225 230 235 240
Thr Val Leu Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala
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Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
260 265 270
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
275 280 285
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
290 295 300
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
305 310 315 320
Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
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Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
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Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
385 390 395 400
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
405 410 415
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
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Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
435 440 445
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450 455 460
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Met Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly
465 470 475 480
Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile
485 490 495
Phe Trp Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln
500 505 510
Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser
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Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys
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Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln
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Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu
565 570 575
Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg
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Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly
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Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp
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<220>
<223> 抗BMCA CAR
<400> 248
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Asp Tyr
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Ala Met Ser Trp Phe Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Gly Phe Ile Arg Ser Lys Ala Tyr Gly Gly Thr Thr Glu Tyr Ala Ala
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Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ile
65 70 75 80
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Tyr Cys Ala Ala Trp Ser Ala Pro Thr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu
130 135 140
Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Val Thr Cys Arg Ala Ser Gln
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Gly Ile Ser Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala
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Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro
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Ser Arg Phe Arg Gly Thr Gly Tyr Gly Thr Glu Phe Ser Leu Thr Ile
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Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val
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Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
275 280 285
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Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
325 330 335
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser
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Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
370 375 380
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
385 390 395 400
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
405 410 415
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr
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Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
435 440 445
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450 455 460
Ser Leu Gly Lys Met Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu
465 470 475 480
Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
485 490 495
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
500 505 510
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
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Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg
530 535 540
Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn
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Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg
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<213> 人工序列
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<223> 抗BMCA CAR
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
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Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Gly Gly Gly Gly Ser Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser
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Val Ala Pro Gly Gln Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Ala Asn Asn Ile
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Gly Ser Lys Ser Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
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Met Leu Val Val Tyr Asp Asp Asp Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu
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Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser
195 200 205
Gly Val Glu Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys His Leu Trp Asp
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Arg Ser Arg Asp His Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Thr Val
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Leu Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro
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Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
260 265 270
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
275 280 285
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
290 295 300
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Gln Ser
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Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
325 330 335
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
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Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
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Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
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Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
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Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
405 410 415
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
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Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
435 440 445
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
450 455 460
Leu Ser Leu Gly Lys Met Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val
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Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp
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Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe
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Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg
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Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser
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Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr
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Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys
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His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr
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<213> 人工序列
<220>
<223> 抗BMCA CAR
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Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
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Arg Val Thr Met Ser Cys Ser Gly Thr Ser Ser Asn Ile Gly Ser His
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Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
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Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly
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Leu Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr
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Ser Pro Ser Phe Gln Gly His Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile
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Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala
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Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Ser Gly Ser Phe Asp Asn Trp Gly Gln
225 230 235 240
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys
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Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
260 265 270
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
275 280 285
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe
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Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
305 310 315 320
Arg Glu Glu Gln Phe Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
325 330 335
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
340 345 350
Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
355 360 365
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln
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Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
385 390 395 400
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
405 410 415
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Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu
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Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr
485 490 495
Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu
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Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu
515 520 525
Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys
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545 550 555 560
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565 570 575
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580 585 590
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595 600 605
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Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser
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Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro
645 650 655
Pro Arg
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<211> 654
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗BMCA CAR
<400> 251
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Ala Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Ala Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Trp Tyr
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Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr Glu Asp Ser
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Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ile Asp Tyr Tyr Val
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Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly
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Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu
195 200 205
Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg
210 215 220
Ser Gln Arg Asp Gly Tyr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
225 230 235 240
Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
245 250 255
Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
260 265 270
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
275 280 285
Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val
290 295 300
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
305 310 315 320
Phe Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
325 330 335
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly
340 345 350
Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
355 360 365
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr
370 375 380
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
385 390 395 400
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
405 410 415
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
420 425 430
Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe
435 440 445
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
450 455 460
Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Met Phe Trp Val Leu Val Val Val
465 470 475 480
Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile
485 490 495
Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys
500 505 510
Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys
515 520 525
Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val
530 535 540
Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn
545 550 555 560
Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val
565 570 575
Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg
580 585 590
Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys
595 600 605
Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg
610 615 620
Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys
625 630 635 640
Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
645 650
<210> 252
<211> 653
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗BMCA CAR
<400> 252
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Ala Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Ala Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Trp Tyr
20 25 30
Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr Glu Asp Ser
35 40 45
Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly
50 55 60
Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala
65 70 75 80
Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Asn Thr Arg Ser Ser Thr Leu Val Phe Gly
85 90 95
Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Glu Met Ala Glu Val
115 120 125
Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Met Lys Lys Pro Gly Ala Ser Leu
130 135 140
Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ile Asp Tyr Tyr Val
145 150 155 160
Tyr Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Ser Met Gly Trp
165 170 175
Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly
180 185 190
Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu
195 200 205
Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg
210 215 220
Ser Gln Arg Asp Gly Tyr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
225 230 235 240
Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
245 250 255
Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
260 265 270
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
275 280 285
Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val
290 295 300
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
305 310 315 320
Phe Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
325 330 335
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly
340 345 350
Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
355 360 365
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr
370 375 380
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
385 390 395 400
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
405 410 415
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
420 425 430
Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe
435 440 445
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
450 455 460
Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Met Phe Trp Val Leu Val Val Val
465 470 475 480
Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile
485 490 495
Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr
500 505 510
Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln
515 520 525
Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys
530 535 540
Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln
545 550 555 560
Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu
565 570 575
Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg
580 585 590
Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met
595 600 605
Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly
610 615 620
Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp
625 630 635 640
Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
645 650
<210> 253
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GPRC5D CAR正向引物
<400> 253
actgcatcga gtccactgga ga 22
<210> 254
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GPRC5D CAR反向引物
<400> 254
ggatctttcg catgaggaag ag 22
<210> 255
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 管家基因β-肌动蛋白正向引物
<400> 255
agcatccccc aaagttcac 19
<210> 256
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 管家基因β-肌动蛋白反向引物
<400> 256
aagggacttc ctgtaacaac g 21
<210> 257
<211> 750
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GPRC5D-200 VH/VL (nt)
<400> 257
gaagtgcagc tggttgaaag cggcggagcc tttgttcagc ctggcggatc tctgagactg 60
agctgtgccg ccagcggctt cacctttagc agctacgcca tgacctgggt ccgacaggct 120
cctggcaaag gccttgaatg ggtgtccacc atcagcggca gaggcagaag caccttctac 180
gccgatagcg tgaagggcag attcaccatc tccagagaca acagcaagaa caccctgtac 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagatattat 300
cacgctggcg ccttcgatct gtggggccag ggaacactgg tcacagtgtc tagtggaagc 360
agaggcggcg gaggatctgg cggaggcggt agcggtggtg gtggatctct tgaaatggcc 420
cagagcgtgg tcacacagcc tgcctctgtt tctggctctc ctggccagag catcacaatc 480
agctgtaccg gcaccagctc tgacgtcggc ggctacaatt acgtgtcctg gtatcagcag 540
caccccggca aggcccctaa gctgatgatc tacgacgtgt ccaagaggcc cagcggcgtg 600
tccaatagat tcagcggctc caagagcggc aacaccgcca gccttacaat cagcggactg 660
caggccgagg acgaggccga ttactactgc agcagctaca ccagcagcag cacactggtt 720
tttggaggcg gcaccaagct gaccgtgctt 750
<210> 258
<211> 750
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GPRC5D-200 - VL/VH (nt)
<400> 258
cagtctgtgg ttacacagcc tgccagcgtg tccggatctc ctggccagag catcaccatc 60
agctgtaccg gcaccagctc tgatgtcggc ggctacaatt acgtgtcctg gtatcagcag 120
caccccggca aggcccctaa gctgatgatc tacgacgtgt ccaagaggcc cagcggcgtg 180
tccaatagat tcagcggcag caagagcggc aacaccgcca gcctgacaat tagcggactg 240
caggccgagg acgaggccga ttactactgt agcagctaca ccagcagcag cacactggtg 300
tttggcggag gcaccaagct gacagtgctt ggaagtagag gcggcggagg aagcggaggc 360
ggaggatctg gtggtggtgg atctctggaa atggccgagg tgcagctggt ggaatctggc 420
ggagcttttg ttcagcctgg cggcagcctg agactgtctt gtgctgccag cggcttcacc 480
ttcagcagct acgccatgac ctgggtccga caggctcctg gcaaaggcct tgaatgggtg 540
tccaccatct ccggcagagg cagaagcacc ttctacgccg atagcgtgaa gggcagattc 600
acaatcagcc gggacaacag caagaacacc ctgtacctgc agatgaactc cctgagagcc 660
gaggacaccg ccgtgtacta ctgcgccaga tattatcacg ctggcgcctt cgatctgtgg 720
ggccagggaa cactggtcac cgttagttct 750
<210> 259
<211> 738
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GPRC5D-201 VH/VL (nt)
<400> 259
caaatgcagc tggttcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac ctggcgcctc tgtgaaggtg 60
tcctgcaagg ccagcggcta caccttcaat agatacgcca tcacctgggt ccgacaggcc 120
cctggacaag gacttgaatg gatgggctgg atcagcgcct acaacggcaa tagccactac 180
gcccagaaac tgcagggcag agtgaccatg accaccgata cctctaccgg caccgcctac 240
atggaactgc ggagactgag aagcgacgac accgccgtgt actactgtgc cagaatggcc 300
tacgatagct ggggccaggg aaccctggtt acagtgtcta gtggaagcag aggcggcgga 360
ggatctggcg gaggtggtag tggcggaggc ggatctcttg aaatggccca gtctgtgctg 420
acccagcctg cctctgtttc tggctctcct ggccaaagcc tgaccatctc ttgtaccggc 480
acaagcaacg acgtgggagc ctacaaatac gtgtcctggt atcagcagta ccccggcaag 540
gcccctaagc tgatcctgta cgacgtgttc aagaggccca gcggcgtgtc caatagattc 600
agcggcagca agtccgacaa caccgccagc ctgacaatca gcggactgca ggccgaagat 660
gaggccgact actactgctt cagcctgacc tccagcaaca cctacgtgtt cggcaccggc 720
accaaagtga cagtgctt 738
<210> 260
<211> 738
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GPRC5D-201 VL-VH (nt)
<400> 260
caatctgtgc tgacacagcc tgccagcgtg tccggatctc ctggacagag cctgaccatc 60
agctgtaccg gcaccagcaa tgacgtgggc gcctacaaat acgtgtcctg gtatcagcag 120
taccccggca aggcccctaa gctgatcctg tacgacgtgt tcaagaggcc cagcggcgtg 180
tccaatagat tcagcggcag caagagcgac aacaccgcca gcctgacaat tagcggactg 240
caggccgagg acgaggccga ctactactgt tttagcctga cctccagcaa cacctacgtg 300
ttcggcaccg gcacaaaagt gacagtgctg ggaagtagag gcggcggagg atctggcgga 360
ggtggaagtg gcggaggcgg atctcttgaa atggcccaga tgcagctggt gcagtctggc 420
gccgaagtga aaaaacctgg cgcctccgtg aaggtgtcct gcaaggcttc tggctacacc 480
ttcaacagat acgccatcac ctgggtccga caggcccctg gacaaggact tgaatggatg 540
ggctggatct ccgcctacaa cggcaatagc cactacgccc agaaactgca gggcagagtg 600
accatgacca ccgatacctc taccggcaca gcctacatgg aactgcggag actgagatcc 660
gacgacaccg ccgtgtacta ctgtgccaga atggcctacg atagctgggg ccagggaacc 720
ctggttaccg tttcttct 738
<210> 261
<211> 747
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GPRC5D-202 VH/VL (nt)
<400> 261
gaagtgcagc tggttgaatc tggcggcgga ctggttaagc ctggcggatc tctgagactg 60
agctgtgccg ccagcggctt caccttcagc gactactaca tgagctggat cagacaggcc 120
cctggcaaag gcctggaatg ggtgtcctac atcagcagct ctggcagcac catctactac 180
gccgacagcg tgaagggcag attcaccatc agccgggaca acgccaagaa cagcctgtac 240
ctgcagatga actccctgag agccgaggac accgccgtgt actattgtgc cagaggctac 300
ggcaaggcct acgatcaatg gggccagggc acactggtca cagtgtctag tggaagtaga 360
ggcggcggag gatctggcgg aggtggaagt ggcggaggcg gttctcttga aatggcccag 420
tctgtgctga cccagcctcc ttctgcttct ggcacacctg gccagagagt gaccatcagc 480
tgtagcggca gcagaagcaa cgtcggcggc aactacgtgt tctggtatca gcaggtccca 540
ggcgccacac ctaaactgct gatctacaga agcaatcagc ggcccagcgg cgtgcccgat 600
agatttgccg gatctaagtc tggcagctcc gccagcctgg ccatttctgg actgagatct 660
gaggacgagg ccgattacta ctgcgccacc tgggatgata gcctgagcgg ctttgtgttt 720
ggcaccggca ccaaagtgac cgtgctt 747
<210> 262
<211> 747
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GPRC5D-202 VL/VH (nt)
<400> 262
caatctgtgc tgacacagcc tcctagcgcc tctggaacac ctggccagag agtgaccatc 60
agctgtagcg gcagcagaag caacgtcggc ggcaactacg tgttctggta tcagcaggtc 120
ccaggcgcca cacctaagct gctgatctac agaagcaatc agcggcctag cggcgtgccc 180
gatagatttg ccggaagcaa gagcggcagc tctgccagcc ttgccatctc tggactgaga 240
agcgaggacg aggccgacta ctactgtgcc acctgggatg atagcctgag cggcttcgtg 300
tttggcaccg gcaccaaagt gacagtgctg ggaagtagag gcggcggagg atctggcgga 360
ggtggaagtg gcggaggcgg atctcttgaa atggccgagg tgcagctggt ggaatctggt 420
ggcggacttg tgaagcctgg cggctctctg agactgtctt gtgccgccag cggcttcacc 480
ttcagcgatt actacatgag ctggatcaga caggcccctg gcaaaggcct ggaatgggtg 540
tcctacatca gctccagcgg ctctaccatc tactacgccg acagcgtgaa gggcagattc 600
accatcagcc gggacaacgc caagaacagc ctgtacctgc agatgaactc cctgagagcc 660
gaggacaccg ccgtgtacta ttgtgccaga ggctacggca aggcctacga tcaatggggc 720
cagggcacac tggtcaccgt tagttct 747
<210> 263
<211> 750
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GPRC5D-203 VH/VL (nt)
<400> 263
caagttcagc tggtggaatc tggcggcgga ctggttcatc ctggcggatc tctgagactg 60
agctgtgccg ccagcggctt cacctttaga agccacagca tgaactgggt ccgacaggcc 120
cctggcaaag gccttgaatg ggtgtccagc atcagcagcg acagcaccta cacctactac 180
gccgacagcg tgaagggcag attcaccatc tccagagaca acgccaagaa cagcctgtac 240
ctgcagatga actccctgag agccgaggac accgccgtgt actactgtgc tagatctggc 300
ggacagtgga agtactacga ctactggggc cagggcaccc tggtcacagt tagctctgga 360
agtagaggcg gcggaggaag cggaggcgga ggttctggtg gcggaggatc tctggaaatg 420
gccagcagcg aactgacaca ggaccctgca gtgtctgtgg ccctgggcca gacagtgcgg 480
attacttgtc agggcgacag cctgcggagc tactatgcct cttggtatca gcagaagccc 540
ggccaggctc ctgtgctggt tatctacggc aagaacaaca gacccagcgg catccccgat 600
agattcagcg gaagcagctc tggcaatacc gccagcctga caattactgg cgcccaggcc 660
gaagatgagg ccgactacta ctgcaacagc agagacagct ccggcaatcc tcctgtggtt 720
tttggcggag gcaccaagct gacagtgctc 750
<210> 264
<211> 750
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GPRC5D-203 VL/VH (nt)
<400> 264
tcttctgagc tgacccaaga tcctgccgtg tctgtggctc tgggccagac agtgcggatt 60
acctgtcagg gcgatagcct gagaagctac tacgccagct ggtatcagca gaagcctgga 120
caggctcccg tgctggtcat ctacggcaag aacaacagac ccagcggcat ccccgataga 180
ttcagcggaa gcagctctgg caataccgcc agcctgacaa ttactggcgc ccaggccgaa 240
gatgaggccg actactactg caacagcaga gacagctccg gcaatcctcc tgtggttttt 300
ggcggaggca ccaagctgac agtgctggga agtagaggtg gcggaggatc tggcggcgga 360
ggaagcggag gcggcggatc tcttgaaatg gctcaggtgc agctggtgga atcaggcggt 420
ggacttgttc accctggcgg aagcctgaga ctgtcttgtg ccgccagcgg cttcaccttc 480
agatcccaca gcatgaactg ggtccgacag gcccctggca aaggccttga atgggtgtcc 540
agcatcagca gcgacagcac ctacacctac tatgccgaca gcgtgaaggg cagattcacc 600
atctccagag acaacgccaa gaacagcctg tacctgcaga tgaactccct gagagccgag 660
gacaccgccg tgtactactg tgctagaagt ggcggccagt ggaagtacta cgactattgg 720
ggccagggca ccctggtcac agttagctct 750
<210> 265
<211> 750
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GPRC5D-204 VH/VL (nt)
<400> 265
gaagtgcagc tggttgaatc tggcggcgga ctggttcaac ctggcggatc tctgagactg 60
agctgtgccg ccagcggctt caccttcagc aattacgcca tgagctgggt ccgacaggcc 120
cctggaaaag gccttgaatg ggtgtccgcc atcagcggca gcggcaatac ctactacgcc 180
gactctgtga agggcagatt caccatcagc cgggacaaca gcaagaacac cctgtacctg 240
cagatgaaca gcctgagagc cgaggacacc gccgtgtact attgtgccag aggcagcgtg 300
cggtacaccg atatttgggg ccagggcaca ctggtcacag tgtctagtgg aagtagaggc 360
ggcggaggat ctggcggagg tggaagtggc ggaggcggtt ctctggaaat ggccaacttc 420
atgctgaccc agcctcacag cgtgtccgag tctccaggca agaccgtgtc catcagctgc 480
accagaacaa gcggagccat tgccggcgct tacgtgcagt ggttccagca gaggcctgga 540
agcgctccta ccaccgtgat ctacgacgac aacaagaggc ctagcggcgt gcccgataga 600
ttcagcggct ccatcgacaa gagcagcaac agcgccagcc tgacaatcag cggcctgaaa 660
acagaggacg aggccgacta ctactgccag agctacgact acgacagcag caacgtgctg 720
tttggaggcg gcaccaagct gacagtgctt 750
<210> 266
<211> 750
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GPRC5D-204 VL/VH (nt)
<400> 266
aacttcatgc tgacccagcc tcacagcgtg tccgagtctc caggcaagac cgtgtccatc 60
agctgcacca gaacaagcgg agccattgcc ggcgcttacg tgcagtggtt ccagcagagg 120
cctggaagcg ctcctaccac cgtgatctac gacgacaaca agaggcctag cggcgtgccc 180
gatagattca gcggcagcat cgacaagagc agcaacagcg ccagcctgac aatcagcggc 240
ctgaaaacag aggacgaggc cgactactac tgccagagct acgactacga cagcagcaac 300
gtgctgtttg gcggaggcac caagctgaca gtgcttggaa gtagaggcgg cggaggaagc 360
ggaggcggag gatctggtgg tggtggatct ctggaaatgg ccgaagtgca gctggtcgag 420
tctggcggag gacttgttca acctggcggc agcctgagac tgtcttgtgc cgcttccggc 480
ttcaccttca gcaactacgc catgtcctgg gtccgacagg cccctggaaa aggactggaa 540
tgggtgtccg ccatcagcgg ctctggcaat acctactacg ccgacagcgt gaagggcaga 600
ttcaccatca gccgggacaa cagcaagaac accctgtacc tgcagatgaa ctccctgaga 660
gccgaggaca ccgccgtgta ctattgtgcc agaggcagcg tgcggtacac cgatatttgg 720
ggccagggca cactggtcac cgtgtcatct 750
<210> 267
<211> 750
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GPRC5D-205 VH/VL (nt)
<400> 267
gaagtgcagc tggttgaatc tggcggcgga ctgattcagc ctggcggatc tctgagactg 60
agctgtgccg ccagcggctt caccttcagc aactacgcca tgaactgggt ccgacaggcc 120
cctggcaaag gccttgaatg ggtgtccacc atcaacggca gaggcagcag caccatctac 180
gccgattctg tgaagggcag attcaccatc agccgggaca acagcaagaa caccctgtac 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac accgccacct attactgtgc cagatatatc 300
agcagaggcc tgggcgattc ttggggccag ggaacactgg tcacagtgtc tagtggaagt 360
agaggcggcg gaggatctgg cggaggtgga agtggcggag gcggttctct tgaaatggcc 420
cagtctgtgg tcacccagcc acctagcatg tctgccgctc caggacagca agtgaccatc 480
tcttgtagcg gcggcaacag caacatcgag cggaactacg tgtcctggta tctgcagctg 540
cctggcacag cccctaagct ggtcatcttc gacaacgaca gacggcccag cggcatcccc 600
gatagatttt ctggcagcaa gagcggcacc agcgccacac tgggaattac aggactgcag 660
acaggcgacg aggccgacta ctattgtggc acctgggaca gctccctgag aggctgggtt 720
ttcggaggcg gcacaaagct gacagtgctc 750
<210> 268
<211> 750
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GPRC5D-205 VL/VH (nt)
<400> 268
cagtctgtgg ttacacagcc tcctagcatg tctgccgctc ccgggcagca agtgaccatc 60
tcttgtagcg gcggcaacag caacatcgag cggaactacg tgtcctggta tctgcagctg 120
cctggcacag cccctaagct ggtcatcttc gacaacgaca gacggcccag cggcatcccc 180
gatagatttt ctggcagcaa gagcggcacc agcgccacac tgggaattac aggactgcag 240
acaggcgacg aggccgacta ctattgtggc acctgggact ctagcctgag aggctgggtt 300
ttcggcggag gcacaaagct gacagtgctg ggaagtagag gcggcggagg atctggcgga 360
ggtggaagtg gcggaggcgg atctcttgaa atggccgagg tgcagctggt ggaatcaggc 420
ggaggactga ttcagcctgg cggctctctg agactgtctt gtgccgccag cggcttcacc 480
ttcagcaact acgccatgaa ctgggtccga caggcccctg gcaaaggcct tgaatgggtg 540
tccaccatca acggcagagg cagcagcacc atctacgccg attctgtgaa gggcagattc 600
accatcagcc gggacaacag caagaacacc ctgtacctgc agatgaactc cctgagagcc 660
gaggacaccg ccacctatta ctgtgccaga tatatcagca gaggcctggg cgattcttgg 720
ggccagggaa cactggtcac agtctctagt 750
<210> 269
<211> 759
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GPRC5D-206 VH/VL (nt)
<400> 269
caagttcagc tggttcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac ctggcgcctc tgtgaaggtg 60
tcctgcaagg ccagcggcta cacctttacc agctactaca tgcactgggt ccgacaggcc 120
cctggacaag gacttgagtg gatgggcatc atcaacccta gcggcggcag cacaagatac 180
gcccagaaat tccagggcag agtgaccatg accagagaca ccagcacctc caccgtgtat 240
atggaactga gcagcctgcg gagcgaggac acagccgtgt actattgtgc cagaggcagc 300
agcagatggg gcggatggac aggcgattat tggggccagg gaaccctggt cacagtgtct 360
agtggaagta gaggcggcgg aggatctggc ggaggtggaa gtggcggagg cggatctctt 420
gaaatggccc agtctgccct gacacagcct gcctctgttt ctggctctcc tggccagagc 480
atcaccatca gctgtaccgg caccagctct gatgtcggcg gctacaattt cgtgtcctgg 540
tatcagcagc accccggcaa ggcccctaaa gtgatgatct acgacgtgtc caagcggccc 600
agcggcatca gcaatagatt cagcggcagc aagagcggca acaccgccag cctgacaatt 660
agcggactgc aggttgagga cgaggccgag tactactgca gcagctacac aagcaccaga 720
accgtgatct tcgctggcgg caccaaagtg acagtgctc 759
<210> 270
<211> 759
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GPRC5D-206 VL/VH (nt)
<400> 270
caatctgctc tgacacagcc tgccagcgtg tccggatctc ctggccagag catcaccatc 60
agctgtaccg gcaccagctc tgatgtcggc ggctacaatt tcgtgtcctg gtatcagcag 120
caccccggca aggcccctaa agtgatgatc tacgacgtgt ccaagcggcc cagcggcatc 180
agcaatagat tcagcggcag caagagcggc aacaccgcca gcctgacaat tagcggactg 240
caggttgagg acgaggccga gtactactgc agcagctaca ccagcaccag aaccgtgatc 300
tttgctggcg gcaccaaagt gacagtgctg ggaagtagag gcggcggagg atctggcgga 360
ggtggaagtg gcggaggcgg atctcttgaa atggctcagg tgcagctggt gcagtctggc 420
gccgaagtga aaaaacctgg cgcctccgtg aaggtgtcct gcaaggcttc tggctacacc 480
tttaccagct actacatgca ctgggtccga caggcccctg gacaaggact tgagtggatg 540
ggcatcatca accctagcgg cggcagcaca agatacgccc agaaattcca gggcagagtg 600
accatgacca gagacacctc caccagcaca gtgtatatgg aactgagcag cctgcggagc 660
gaggacacag ccgtgtacta ttgtgccaga ggcagcagca gatggggcgg atggacaggc 720
gattattggg gccagggaac cctggtcaca gtgtctagc 759
<210> 271
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人IgGkappa信号序列(nt)
<400> 271
atggtgctgc agacccaggt gttcatcagc ctgctgctgt ggatctccgg agcatacgga 60
<210> 272
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人IgGkappa信号肽(aa)
<400> 272
Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser
1 5 10 15
Gly Ala Tyr Gly
20
<210> 273
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人IgGkappa信号序列(nt)
<400> 273
atggtgctgc agacccaggt gttcatcagc ctgctgctgt ggatctctgg cgcctacggc 60
<210> 274
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人IgGkappa信号序列(nt)
<400> 274
atggtgctgc agacccaggt gttcatcagc ctgctgctgt ggatctctgg cgcctatgga 60
<210> 275
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人IgGkappa信号序列(nt)
<400> 275
atggtgctgc agacacaggt gttcatctcc ctgctgctgt ggatctctgg agcatacgga 60
<210> 276
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人IgGkappa信号序列(nt)
<400> 276
atggtgctgc agacacaggt gttcatcagc ctgctgctgt ggatctccgg agcatacgga 60
<210> 277
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GMCSFR α链信号序列
<400> 277
atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60
atccca 66
<210> 278
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GMCSFR α链信号肽
<400> 278
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro
20
<210> 279
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD8 α信号肽
<400> 279
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala
<210> 280
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD33 信号肽
<400> 280
Met Pro Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Trp Ala Gly Ala Leu Ala
1 5 10 15
<210> 281
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人IgG4 Fc (Uniprot P01861)
<400> 281
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 282
<211> 326
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人IgG2 Fc (Uniprot P01859)
<400> 282
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
195 200 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ser Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 283
<211> 684
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG4/IgG2铰链- IgG2/IgG4 CH2- IgG4 CH3间隔子，仅间隔子经密码子优化(nt)
<400> 283
gagtctaaat acggaccgcc ttgtcctcct tgtccagctc ctcctgttgc cggaccttcc 60
gtgttcctgt ttcctccaaa gcctaaggac accctgatga tcagcaggac ccctgaagtg 120
acctgcgtgg tggtggatgt gtcccaagag gatcccgagg tgcagttcaa ttggtacgtg 180
gacggcgtgg aagtgcacaa cgccaagacc aagcctagag aggaacagtt ccagagcacc 240
tacagagtgg tgtccgtgct gacagtgctg caccaggatt ggctgaacgg caaagagtac 300
aagtgcaagg tgtccaacaa gggcctgcct agcagcatcg agaaaaccat ctccaaggcc 360
aagggccagc caagagagcc ccaggtttac acactgcctc caagccaaga ggaaatgacc 420
aagaatcagg tgtccctgac atgcctggtc aagggcttct acccctccga tatcgccgtg 480
gaatgggaga gcaatggcca gcctgagaac aactacaaga ccacacctcc tgtgctggac 540
agcgacggca gtttcttcct gtatagtaga ctcaccgtgg ataaatcaag atggcaagag 600
ggcaacgtgt tcagctgcag cgtgatgcac gaggccctgc acaaccacta cacccagaaa 660
agcctgagcc tgtctctggg caaa 684
<210> 284
<211> 684
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 替代性CO/SSE IgG4/IgG2铰链- IgG2/IgG4 CH2-
IgG4 CH3 (nt)
<400> 284
gaatctaagt acggaccgcc ttgtcctcct tgtcccgctc ctcctgttgc cggaccttcc 60
gtgttcctgt ttcctccaaa gcctaaggac accctgatga tcagcaggac ccctgaagtg 120
acctgcgtgg tggtggatgt gtcccaagag gatcccgagg tgcagttcaa ctggtatgtg 180
gacggcgtgg aagtgcacaa cgccaagacc aagcctagag aggaacagtt ccagagcacc 240
tacagagtgg tgtccgtgct gacagtgctg caccaggatt ggctgaacgg caaagagtac 300
aagtgcaagg tgtccaacaa gggcctgcct agcagcatcg agaaaaccat ctccaaggcc 360
aagggccagc caagagagcc ccaggtttac acactgcctc caagccaaga ggaaatgacc 420
aagaatcagg tgtccctgac atgcctggtc aagggcttct acccctccga tatcgccgtg 480
gaatgggaga gcaatggcca gcctgagaac aactacaaga ccacacctcc tgtgctggac 540
agcgacggca gtttcttcct gtatagtaga ctcaccgtgg ataaatcaag atggcaagag 600
ggcaacgtgt tcagctgcag cgtgatgcac gaggccctgc acaaccacta cacccagaaa 660
agcctgagcc tgtctctggg caag 684
<210> 285
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>间隔子(IgG4铰链) (nt)
<400> 285
gaatctaagt acggaccgcc ctgcccccct tgccct 36
<210> 286
<211> 229
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链-CH2-CH3间隔子(aa)
<400> 286
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly Lys
225
<210> 287
<211> 117
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28细胞外结构域间隔子(nt)
<400> 287
attgaagtta tgtatcctcc tccttaccta gacaatgaga agagcaatgg aaccattatc 60
catgtgaaag ggaaacacct ttgtccaagt cccctatttc ccggaccttc taagccc 117
<210> 288
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28细胞外结构域间隔子(aa)
<400> 288
Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn
1 5 10 15
Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu
20 25 30
Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro
35
<210> 289
<211> 2028
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗GPRC5D CAR
<400> 289
Ala Thr Gly Cys Cys Gly Cys Thr Gly Cys Thr Gly Cys Thr Ala Cys
1 5 10 15
Thr Gly Cys Thr Gly Cys Cys Cys Cys Thr Gly Cys Thr Gly Thr Gly
20 25 30
Gly Gly Cys Ala Gly Gly Gly Gly Cys Thr Cys Thr Ala Gly Cys Thr
35 40 45
Thr Cys Thr Thr Cys Thr Gly Ala Gly Cys Thr Gly Ala Cys Cys Cys
50 55 60
Ala Ala Gly Ala Thr Cys Cys Thr Gly Cys Cys Gly Thr Gly Thr Cys
65 70 75 80
Thr Gly Thr Gly Gly Cys Thr Cys Thr Gly Gly Gly Cys Cys Ala Gly
85 90 95
Ala Cys Ala Gly Thr Gly Cys Gly Gly Ala Thr Thr Ala Cys Cys Thr
100 105 110
Gly Thr Cys Ala Gly Gly Gly Cys Gly Ala Thr Ala Gly Cys Cys Thr
115 120 125
Gly Ala Gly Ala Ala Gly Cys Thr Ala Cys Thr Ala Cys Gly Cys Cys
130 135 140
Ala Gly Cys Thr Gly Gly Thr Ala Thr Cys Ala Gly Cys Ala Gly Ala
145 150 155 160
Ala Gly Cys Cys Thr Gly Gly Ala Cys Ala Gly Gly Cys Thr Cys Cys
165 170 175
Cys Gly Thr Gly Cys Thr Gly Gly Thr Cys Ala Thr Cys Thr Ala Cys
180 185 190
Gly Gly Cys Ala Ala Gly Ala Ala Cys Ala Ala Cys Ala Gly Ala Cys
195 200 205
Cys Cys Ala Gly Cys Gly Gly Cys Ala Thr Cys Cys Cys Cys Gly Ala
210 215 220
Thr Ala Gly Ala Thr Thr Cys Ala Gly Cys Gly Gly Ala Ala Gly Cys
225 230 235 240
Ala Gly Cys Thr Cys Thr Gly Gly Cys Ala Ala Thr Ala Cys Cys Gly
245 250 255
Cys Cys Ala Gly Cys Cys Thr Gly Ala Cys Ala Ala Thr Thr Ala Cys
260 265 270
Thr Gly Gly Cys Gly Cys Cys Cys Ala Gly Gly Cys Cys Gly Ala Ala
275 280 285
Gly Ala Thr Gly Ala Gly Gly Cys Cys Gly Ala Cys Thr Ala Cys Thr
290 295 300
Ala Cys Thr Gly Cys Ala Ala Cys Ala Gly Cys Ala Gly Ala Gly Ala
305 310 315 320
Cys Ala Gly Cys Thr Cys Cys Gly Gly Cys Ala Ala Thr Cys Cys Thr
325 330 335
Cys Cys Thr Gly Thr Gly Gly Thr Thr Thr Thr Thr Gly Gly Cys Gly
340 345 350
Gly Ala Gly Gly Cys Ala Cys Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly Ala Cys
355 360 365
Ala Gly Thr Gly Cys Thr Gly Gly Gly Ala Ala Gly Thr Ala Gly Ala
370 375 380
Gly Gly Thr Gly Gly Cys Gly Gly Ala Gly Gly Ala Thr Cys Thr Gly
385 390 395 400
Gly Cys Gly Gly Cys Gly Gly Ala Gly Gly Ala Ala Gly Cys Gly Gly
405 410 415
Ala Gly Gly Cys Gly Gly Cys Gly Gly Ala Thr Cys Thr Cys Thr Thr
420 425 430
Gly Ala Ala Ala Thr Gly Gly Cys Thr Cys Ala Gly Gly Thr Gly Cys
435 440 445
Ala Gly Cys Thr Gly Gly Thr Gly Gly Ala Ala Thr Cys Ala Gly Gly
450 455 460
Cys Gly Gly Thr Gly Gly Ala Cys Thr Thr Gly Thr Thr Cys Ala Cys
465 470 475 480
Cys Cys Thr Gly Gly Cys Gly Gly Ala Ala Gly Cys Cys Thr Gly Ala
485 490 495
Gly Ala Cys Thr Gly Thr Cys Thr Thr Gly Thr Gly Cys Cys Gly Cys
500 505 510
Cys Ala Gly Cys Gly Gly Cys Thr Thr Cys Ala Cys Cys Thr Thr Cys
515 520 525
Ala Gly Ala Thr Cys Cys Cys Ala Cys Ala Gly Cys Ala Thr Gly Ala
530 535 540
Ala Cys Thr Gly Gly Gly Thr Cys Cys Gly Ala Cys Ala Gly Gly Cys
545 550 555 560
Cys Cys Cys Thr Gly Gly Cys Ala Ala Ala Gly Gly Cys Cys Thr Thr
565 570 575
Gly Ala Ala Thr Gly Gly Gly Thr Gly Thr Cys Cys Ala Gly Cys Ala
580 585 590
Thr Cys Ala Gly Cys Ala Gly Cys Gly Ala Cys Ala Gly Cys Ala Cys
595 600 605
Cys Thr Ala Cys Ala Cys Cys Thr Ala Cys Thr Ala Thr Gly Cys Cys
610 615 620
Gly Ala Cys Ala Gly Cys Gly Thr Gly Ala Ala Gly Gly Gly Cys Ala
625 630 635 640
Gly Ala Thr Thr Cys Ala Cys Cys Ala Thr Cys Thr Cys Cys Ala Gly
645 650 655
Ala Gly Ala Cys Ala Ala Cys Gly Cys Cys Ala Ala Gly Ala Ala Cys
660 665 670
Ala Gly Cys Cys Thr Gly Thr Ala Cys Cys Thr Gly Cys Ala Gly Ala
675 680 685
Thr Gly Ala Ala Cys Thr Cys Cys Cys Thr Gly Ala Gly Ala Gly Cys
690 695 700
Cys Gly Ala Gly Gly Ala Cys Ala Cys Cys Gly Cys Cys Gly Thr Gly
705 710 715 720
Thr Ala Cys Thr Ala Cys Thr Gly Thr Gly Cys Thr Ala Gly Ala Ala
725 730 735
Gly Thr Gly Gly Cys Gly Gly Cys Cys Ala Gly Thr Gly Gly Ala Ala
740 745 750
Gly Thr Ala Cys Thr Ala Cys Gly Ala Cys Thr Ala Thr Thr Gly Gly
755 760 765
Gly Gly Cys Cys Ala Gly Gly Gly Cys Ala Cys Cys Cys Thr Gly Gly
770 775 780
Thr Cys Ala Cys Ala Gly Thr Thr Ala Gly Cys Thr Cys Thr Gly Ala
785 790 795 800
Gly Thr Cys Thr Ala Ala Ala Thr Ala Cys Gly Gly Ala Cys Cys Gly
805 810 815
Cys Cys Thr Thr Gly Thr Cys Cys Thr Cys Cys Thr Thr Gly Thr Cys
820 825 830
Cys Cys Gly Cys Thr Cys Cys Thr Cys Cys Thr Gly Thr Thr Gly Cys
835 840 845
Cys Gly Gly Ala Cys Cys Thr Thr Cys Cys Gly Thr Gly Thr Thr Cys
850 855 860
Cys Thr Gly Thr Thr Thr Cys Cys Thr Cys Cys Ala Ala Ala Gly Cys
865 870 875 880
Cys Thr Ala Ala Gly Gly Ala Cys Ala Cys Cys Cys Thr Gly Ala Thr
885 890 895
Gly Ala Thr Cys Ala Gly Cys Ala Gly Gly Ala Cys Cys Cys Cys Thr
900 905 910
Gly Ala Ala Gly Thr Gly Ala Cys Cys Thr Gly Cys Gly Thr Gly Gly
915 920 925
Thr Gly Gly Thr Gly Gly Ala Thr Gly Thr Gly Thr Cys Cys Cys Ala
930 935 940
Ala Gly Ala Gly Gly Ala Thr Cys Cys Cys Gly Ala Gly Gly Thr Gly
945 950 955 960
Cys Ala Gly Thr Thr Cys Ala Ala Cys Thr Gly Gly Thr Ala Thr Gly
965 970 975
Thr Gly Gly Ala Cys Gly Gly Cys Gly Thr Gly Gly Ala Ala Gly Thr
980 985 990
Gly Cys Ala Cys Ala Ala Cys Gly Cys Cys Ala Ala Gly Ala Cys Cys
995 1000 1005
Ala Ala Gly Cys Cys Thr Ala Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Ala Cys
1010 1015 1020
Ala Gly Thr Thr Cys Cys Ala Gly Ala Gly Cys Ala Cys Cys Thr Ala
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Cys Ala Gly Ala Gly Thr Gly Gly Thr Gly Thr Cys Cys Gly Thr Gly
1045 1050 1055
Cys Thr Gly Ala Cys Ala Gly Thr Gly Cys Thr Gly Cys Ala Cys Cys
1060 1065 1070
Ala Gly Gly Ala Thr Thr Gly Gly Cys Thr Gly Ala Ala Cys Gly Gly
1075 1080 1085
Cys Ala Ala Ala Gly Ala Gly Thr Ala Cys Ala Ala Gly Thr Gly Cys
1090 1095 1100
Ala Ala Gly Gly Thr Gly Thr Cys Cys Ala Ala Cys Ala Ala Gly Gly
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Gly Cys Cys Thr Gly Cys Cys Thr Ala Gly Cys Ala Gly Cys Ala Thr
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Cys Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Cys Cys Ala Thr Cys Thr Cys Cys
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Ala Ala Gly Gly Cys Cys Ala Ala Gly Gly Gly Cys Cys Ala Gly Cys
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Cys Ala Ala Gly Ala Gly Ala Gly Cys Cys Cys Cys Ala Gly Gly Thr
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Gly Cys Cys Cys Gly Thr Gly Cys Ala Gly Ala Cys Cys Ala Cys Ala
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Cys Ala Ala Gly Ala Gly Gly Ala Ala Gly Ala Thr Gly Gly Cys Thr
1635 1640 1645
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1650 1655 1660
Cys Gly Ala Gly Gly Ala Ala Gly Ala Ala Gly Ala Ala Gly Gly Cys
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Thr Ala Thr Cys Ala Gly Cys Ala Gly Gly Gly Cys Cys Ala Ala Ala
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Ala Gly Ala Gly Ala Ala Gly Ala Gly Thr Ala Cys Gly Ala Cys Gly
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Gly Ala Cys Gly Gly Ala Ala Gly Ala Ala Thr Cys Cys Thr Cys Ala
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Ala Gly Ala Gly Gly Gly Cys Cys Thr Gly Thr Ala Thr Ala Ala Thr
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Gly Ala Gly Cys Thr Gly Cys Ala Gly Ala Ala Ala Gly Ala Cys Ala
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Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Met Phe Trp Val
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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Glu Met Ala Gln Val Gln
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Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly Ser Leu Arg
850 855 860
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885 890 895
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Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met
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Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser
930 935 940
Gly Gly Gln Trp Lys Tyr Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
945 950 955 960
Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
965 970 975
Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
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Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
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1010 1015 1020
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
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Phe Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
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Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly
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Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
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Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
1125 1130 1135
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1140 1145 1150
Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe
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1170 1175 1180
Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Met Phe Trp Val Leu Val Val Val
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Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile
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Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys
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Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys
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Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val
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Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn
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Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val
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Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg
1330 1335 1340
Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys
1345 1350 1355 1360
Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
1365 1370
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<211> 4122
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 密码子趋异的BCMA-GPRC5D CAR(nt)
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aagctgatga tctacgagga cagcaagagg cccagcggcg tgtccaatag attcagcggc 240
agcaagagcg gcaacaccgc cagcctgaca attagcggac tgcaggccga ggacgaggcc 300
gattactact gcagcagcaa cacccggtcc agcacactgg tttttggcgg aggcaccaag 360
ctgacagtgc tgggatctag aggtggcgga ggatctggcg gcggaggaag cggaggcggc 420
ggatctcttg aaatggctga agtgcagctg gtgcagtctg gcgccgagat gaagaaacct 480
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tactggatgc ggcaggcccc tggacaggga ctcgaatcta tgggctggat caaccccaat 600
agcggcggca ccaattacgc ccagaaattc cagggcagag tgaccatgac cagagacacc 660
agcatcagca ccgcctacat ggaactgagc cggctgagat ccgacgacac cgccatgtac 720
tactgcgcca gatctcagcg cgacggctac atggattatt ggggccaggg aaccctggtc 780
accgtgtcca gcgagtctaa atacggaccg ccttgtcctc cttgtcccgc tcctcctgtt 840
gccggacctt ccgtgttcct gtttcctcca aagcctaagg acaccctgat gatcagcagg 900
acccctgaag tgacctgcgt ggtggtggat gtgtcccaag aggatcccga ggtgcagttc 960
aactggtatg tggacggcgt ggaagtgcac aacgccaaga ccaagcctag agaggaacag 1020
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ggcaaagagt acaagtgcaa ggtgtccaac aagggcctgc ctagcagcat cgagaaaacc 1140
atctccaagg ccaagggcca gccaagagag ccccaggttt acacactgcc tccaagccaa 1200
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cctgtgctgg acagcgacgg cagtttcttc ctgtatagta gactcaccgt ggataaatca 1380
agatggcaag agggcaacgt gttcagctgc agcgtgatgc acgaggccct gcacaaccac 1440
tacacccaga aaagcctgag cctgtctctg ggcaagatgt tctgggtgct cgtggtcgtt 1500
ggcggagtgc tggcctgtta cagcctgctg gttaccgtgg ccttcatcat cttttgggtc 1560
aagcggggca gaaagaagct gctctacatc ttcaagcagc ccttcatgcg gcccgtgcag 1620
accacacaag aggaagatgg ctgctcctgc agattccccg aggaagaaga aggcggctgc 1680
gagctgagag tgaagttcag cagatccgcc gacgctccag cctatcagca gggccaaaac 1740
cagctgtaca acgagctgaa cctggggaga agagaagagt acgacgtgct ggataagcgg 1800
agaggcagag atcctgaaat gggcggcaag cccagacgga agaatcctca agagggcctg 1860
tataatgagc tgcagaaaga caagatggcc gaggcctaca gcgagatcgg aatgaagggc 1920
gagcgcagaa gaggcaaggg acacgatgga ctgtaccagg gcctgagcac cgccaccaag 1980
gatacctatg acgcactgca catgcaggcc ctgccaccta gacttgaagg tggtggcgaa 2040
ggcagaggca gcctgcttac atgcggagat gtggaagaga accccggacc tagaatgccg 2100
ctgctgctac tgctgcccct gctgtgggca ggggctctag cttcttctga gctgacccaa 2160
gatcctgccg tgtctgtggc tctgggccag acagtgcgga ttacctgtca gggcgatagc 2220
ctgagaagct actacgccag ctggtatcag cagaagcctg gacaggctcc cgtgctggtc 2280
atctacggca agaacaacag acccagcggc atccccgata gattcagcgg aagcagctct 2340
ggcaataccg cctccctgac aattactggc gcccaggccg aagatgaggc cgactactac 2400
tgcaacagca gagacagctc cggcaatcct cctgtggtgt ttggaggcgg aaccaaactg 2460
accgtgctgg gcagcagagg tggaggtgga agcggcggtg gaggctccgg aggaggcgga 2520
agccttgaga tggcacaggt gcagctggtg gaatcaggcg gtggacttgt tcaccctggc 2580
ggaagcctga gactgtcttg tgccgccagc ggcttcacct tccggtccca cagcatgaac 2640
tgggtccgac aggcccctgg caaaggcctt gaatgggtgt ccagcatcag cagcgacagc 2700
acctacacct actatgccga cagcgtgaag ggcagattca ccatctccag agacaacgcc 2760
aagaacagcc tgtacctgca gatgaactcc ctgagagccg aggacaccgc cgtgtactac 2820
tgtgctagaa gtggcggcca gtggaagtac tacgactatt ggggacaggg caccctggtc 2880
acagttagct ctgaatccaa atacggtcct ccatgccctc catgcccagc tccacccgtt 2940
gctggaccaa gcgtgtttct gttcccacca aagcccaagg atacactcat gattagcaga 3000
accccagaag tgacatgtgt cgtcgtggac gtttcccaag aggaccctga ggtccagttt 3060
aactggtatg tggatggagt ggaggtgcat aatgctaaga ctaagccaag agaagagcag 3120
tttcagtcca cctatagagt ggtctccgtg ctcaccgtgc tgcatcagga ctggctcaat 3180
ggcaaggaat ataagtgtaa agtctccaac aaaggactgc catccagcat cgaaaagacc 3240
attagcaagg ccaaaggaca gcctagagag cctcaggtct acactctgcc tccctcccaa 3300
gaagagatga ctaagaacca ggtctctctg acctgcctgg tgaagggatt ctacccttcc 3360
gacattgctg tggagtggga gtccaatgga cagccagaga ataactataa gactacacca 3420
cccgtgctcg atagcgacgg ctcattcttt ctgtactctc ggctgacagt ggacaagagc 3480
agatggcagg agggaaacgt ctttagctgc tccgtgatgc atgaggctct gcataaccac 3540
tatacccaga agtctctgtc cctgagcctc ggcaaaatgt tttgggtgct ggtggtggtc 3600
ggaggcgtgc tggcttgcta ttccctgctg gtcacagtgg ccttcattat cttctgggtg 3660
aaacggggaa gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 3720
actactcaag aagaggatgg ctgtagctgc cggtttcccg aagaagagga aggaggatgt 3780
gaactgcggg tgaagttctc cagaagcgcc gacgcccctg cctaccagca gggacagaat 3840
cagctgtata acgaactgaa cctgggcaga agggaggaat acgacgtcct ggacaagaga 3900
cgaggccggg accccgagat gggcggaaag cctcggcgga agaaccccca ggaaggcctg 3960
tacaacgaac tgcagaagga caagatggct gaagcttact ccgagatcgg catgaaagga 4020
gagcggaggc ggggcaaggg ccacgacggc ctgtatcagg gcctgtccac cgccacaaag 4080
gatacctacg atgccctcca tatgcaggct ctgcctccaa ga 4122
<210> 300
<211> 4122
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 原始BCMA-GPRC5D CAR(nt)
<400> 300
atggtgctgc agacccaggt gttcatcagc ctgctgctgt ggatctctgg cgcctatgga 60
cagtctgccc tgacacagcc tgccagcgtt agtgctagtc ccggacagtc tatcgccatc 120
agctgtaccg gcaccagctc tgacgttggc tggtatcagc agcaccctgg caaggcccct 180
aagctgatga tctacgagga cagcaagagg cccagcggcg tgtccaatag attcagcggc 240
agcaagagcg gcaacaccgc cagcctgaca attagcggac tgcaggccga ggacgaggcc 300
gattactact gcagcagcaa cacccggtcc agcacactgg tttttggcgg aggcaccaag 360
ctgacagtgc tgggatctag aggtggcgga ggatctggcg gcggaggaag cggaggcggc 420
ggatctcttg aaatggctga agtgcagctg gtgcagtctg gcgccgagat gaagaaacct 480
ggcgcctctc tgaagctgag ctgcaaggcc agcggctaca ccttcatcga ctactacgtg 540
tactggatgc ggcaggcccc tggacaggga ctcgaatcta tgggctggat caaccccaat 600
agcggcggca ccaattacgc ccagaaattc cagggcagag tgaccatgac cagagacacc 660
agcatcagca ccgcctacat ggaactgagc cggctgagat ccgacgacac cgccatgtac 720
tactgcgcca gatctcagcg cgacggctac atggattatt ggggccaggg aaccctggtc 780
accgtgtcca gcgagtctaa atacggaccg ccttgtcctc cttgtcccgc tcctcctgtt 840
gccggacctt ccgtgttcct gtttcctcca aagcctaagg acaccctgat gatcagcagg 900
acccctgaag tgacctgcgt ggtggtggat gtgtcccaag aggatcccga ggtgcagttc 960
aactggtatg tggacggcgt ggaagtgcac aacgccaaga ccaagcctag agaggaacag 1020
ttccagagca cctacagagt ggtgtccgtg ctgacagtgc tgcaccagga ttggctgaac 1080
ggcaaagagt acaagtgcaa ggtgtccaac aagggcctgc ctagcagcat cgagaaaacc 1140
atctccaagg ccaagggcca gccaagagag ccccaggttt acacactgcc tccaagccaa 1200
gaggaaatga ccaagaatca ggtgtccctg acatgcctgg tcaagggctt ctacccctcc 1260
gatatcgccg tggaatggga gagcaatggc cagcctgaga acaactacaa gaccacacct 1320
cctgtgctgg acagcgacgg cagtttcttc ctgtatagta gactcaccgt ggataaatca 1380
agatggcaag agggcaacgt gttcagctgc agcgtgatgc acgaggccct gcacaaccac 1440
tacacccaga aaagcctgag cctgtctctg ggcaagatgt tctgggtgct cgtggtcgtt 1500
ggcggagtgc tggcctgtta cagcctgctg gttaccgtgg ccttcatcat cttttgggtc 1560
aagcggggca gaaagaagct gctctacatc ttcaagcagc ccttcatgcg gcccgtgcag 1620
accacacaag aggaagatgg ctgctcctgc agattccccg aggaagaaga aggcggctgc 1680
gagctgagag tgaagttcag cagatccgcc gacgctccag cctatcagca gggccaaaac 1740
cagctgtaca acgagctgaa cctggggaga agagaagagt acgacgtgct ggataagcgg 1800
agaggcagag atcctgaaat gggcggcaag cccagacgga agaatcctca agagggcctg 1860
tataatgagc tgcagaaaga caagatggcc gaggcctaca gcgagatcgg aatgaagggc 1920
gagcgcagaa gaggcaaggg acacgatgga ctgtaccagg gcctgagcac cgccaccaag 1980
gatacctatg acgcactgca catgcaggcc ctgccaccta gacttgaagg tggtggcgaa 2040
ggcagaggca gcctgcttac atgcggagat gtggaagaga accccggacc tagaatgccg 2100
ctgctgctac tgctgcccct gctgtgggca ggggctctag cttcttctga gctgacccaa 2160
gatcctgccg tgtctgtggc tctgggccag acagtgcgga ttacctgtca gggcgatagc 2220
ctgagaagct actacgccag ctggtatcag cagaagcctg gacaggctcc cgtgctggtc 2280
atctacggca agaacaacag acccagcggc atccccgata gattcagcgg aagcagctct 2340
ggcaataccg ccagcctgac aattactggc gcccaggccg aagatgaggc cgactactac 2400
tgcaacagca gagacagctc cggcaatcct cctgtggttt ttggcggagg caccaagctg 2460
acagtgctgg gaagtagagg tggcggagga tctggcggcg gaggaagcgg aggcggcgga 2520
tctcttgaaa tggctcaggt gcagctggtg gaatcaggcg gtggacttgt tcaccctggc 2580
ggaagcctga gactgtcttg tgccgccagc ggcttcacct tcagatccca cagcatgaac 2640
tgggtccgac aggcccctgg caaaggcctt gaatgggtgt ccagcatcag cagcgacagc 2700
acctacacct actatgccga cagcgtgaag ggcagattca ccatctccag agacaacgcc 2760
aagaacagcc tgtacctgca gatgaactcc ctgagagccg aggacaccgc cgtgtactac 2820
tgtgctagaa gtggcggcca gtggaagtac tacgactatt ggggccaggg caccctggtc 2880
acagttagct ctgagtctaa atacggaccg ccttgtcctc cttgtcccgc tcctcctgtt 2940
gccggacctt ccgtgttcct gtttcctcca aagcctaagg acaccctgat gatcagcagg 3000
acccctgaag tgacctgcgt ggtggtggat gtgtcccaag aggatcccga ggtgcagttc 3060
aactggtatg tggacggcgt ggaagtgcac aacgccaaga ccaagcctag agaggaacag 3120
ttccagagca cctacagagt ggtgtccgtg ctgacagtgc tgcaccagga ttggctgaac 3180
ggcaaagagt acaagtgcaa ggtgtccaac aagggcctgc ctagcagcat cgagaaaacc 3240
atctccaagg ccaagggcca gccaagagag ccccaggttt acacactgcc tccaagccaa 3300
gaggaaatga ccaagaatca ggtgtccctg acatgcctgg tcaagggctt ctacccctcc 3360
gatatcgccg tggaatggga gagcaatggc cagcctgaga acaactacaa gaccacacct 3420
cctgtgctgg acagcgacgg cagtttcttc ctgtatagta gactcaccgt ggataaatca 3480
agatggcaag agggcaacgt gttcagctgc agcgtgatgc acgaggccct gcacaaccac 3540
tacacccaga aaagcctgag cctgtctctg ggcaagatgt tctgggtgct cgtggtcgtt 3600
ggcggagtgc tggcctgtta cagcctgctg gttaccgtgg ccttcatcat cttttgggtc 3660
aagcggggca gaaagaagct gctctacatc ttcaagcagc ccttcatgcg gcccgtgcag 3720
accacacaag aggaagatgg ctgctcctgc agattccccg aggaagaaga aggcggctgc 3780
gagctgagag tgaagttcag cagatccgcc gacgctccag cctatcagca gggccaaaac 3840
cagctgtaca acgagctgaa cctggggaga agagaagagt acgacgtgct ggataagcgg 3900
agaggcagag atcctgaaat gggcggcaag cccagacgga agaatcctca agagggcctg 3960
tataatgagc tgcagaaaga caagatggcc gaggcctaca gcgagatcgg aatgaagggc 4020
gagcgcagaa gaggcaaggg acacgatgga ctgtaccagg gcctgagcac cgccaccaag 4080
gatacctatg acgcactgca catgcaggcc ctgccaccta ga 4122
<210> 301
<211> 1374
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GPRC5D-BCMA CAR (aa)
<400> 301
Met Pro Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Trp Ala Gly Ala Leu Ala
1 5 10 15
Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln
20 25 30
Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala
35 40 45
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
50 55 60
Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
65 70 75 80
Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu
85 90 95
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn Pro
100 105 110
Pro Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ser Arg
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu
130 135 140
Glu Met Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val His
145 150 155 160
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
165 170 175
Arg Ser His Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
180 185 190
Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Ser Asp Ser Thr Tyr Thr Tyr Tyr Ala
195 200 205
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
210 215 220
Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
225 230 235 240
Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Gly Gln Trp Lys Tyr Tyr Asp Tyr Trp
245 250 255
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
260 265 270
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe
275 280 285
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
290 295 300
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val
305 310 315 320
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
325 330 335
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
340 345 350
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
355 360 365
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
370 375 380
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
385 390 395 400
Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
405 410 415
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
420 425 430
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
435 440 445
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
450 455 460
Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
465 470 475 480
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Met Phe
485 490 495
Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu
500 505 510
Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys
515 520 525
Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr
530 535 540
Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly
545 550 555 560
Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala
565 570 575
Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg
580 585 590
Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu
595 600 605
Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn
610 615 620
Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
625 630 635 640
Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
645 650 655
Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala
660 665 670
Leu Pro Pro Arg Leu Glu Gly Gly Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu
675 680 685
Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg Met Val Leu Gln
690 695 700
Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser Gly Ala Tyr Gly
705 710 715 720
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Ala Ser Pro Gly Gln
725 730 735
Ser Ile Ala Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Trp Tyr
740 745 750
Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr Glu Asp Ser
755 760 765
Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly
770 775 780
Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala
785 790 795 800
Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Asn Thr Arg Ser Ser Thr Leu Val Phe Gly
805 810 815
Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser
820 825 830
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Glu Met Ala Glu Val
835 840 845
Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Met Lys Lys Pro Gly Ala Ser Leu
850 855 860
Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ile Asp Tyr Tyr Val
865 870 875 880
Tyr Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Ser Met Gly Trp
885 890 895
Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly
900 905 910
Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu
915 920 925
Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg
930 935 940
Ser Gln Arg Asp Gly Tyr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
945 950 955 960
Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
965 970 975
Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
980 985 990
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
995 1000 1005
Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val
1010 1015 1020
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
1025 1030 1035 1040
Phe Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
1045 1050 1055
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly
1060 1065 1070
Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
1075 1080 1085
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr
1090 1095 1100
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
1105 1110 1115 1120
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
1125 1130 1135
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
1140 1145 1150
Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe
1155 1160 1165
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
1170 1175 1180
Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Met Phe Trp Val Leu Val Val Val
1185 1190 1195 1200
Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile
1205 1210 1215
Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys
1220 1225 1230
Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys
1235 1240 1245
Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val
1250 1255 1260
Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn
1265 1270 1275 1280
Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val
1285 1290 1295
Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg
1300 1305 1310
Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys
1315 1320 1325
Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg
1330 1335 1340
Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys
1345 1350 1355 1360
Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
1365 1370
<210> 302
<211> 4122
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 密码子趋异的GPRC5D-BCMA CAR(nt)
<400> 302
atgccgctgc tgctactgct gcccctgctg tgggcagggg ctctagcttc ttctgagctg 60
acccaagatc ctgccgtgtc tgtggctctg ggccagacag tgcggattac ctgtcagggc 120
gatagcctga gaagctacta cgccagctgg tatcagcaga agcctggaca ggctcccgtg 180
ctggtcatct acggcaagaa caacagaccc agcggcatcc ccgatagatt cagcggaagc 240
agctctggca ataccgcctc cctgacaatt actggcgccc aggccgaaga tgaggccgac 300
tactactgca acagcagaga cagctccggc aatcctcctg tggtgtttgg aggcggaacc 360
aaactgaccg tgctgggcag cagaggtgga ggtggaagcg gcggtggagg ctccggagga 420
ggcggaagcc ttgagatggc acaggtgcag ctggtggaat caggcggtgg acttgttcac 480
cctggcggaa gcctgagact gtcttgtgcc gccagcggct tcaccttccg gtcccacagc 540
atgaactggg tccgacaggc ccctggcaaa ggccttgaat gggtgtccag catcagcagc 600
gacagcacct acacctacta tgccgacagc gtgaagggca gattcaccat ctccagagac 660
aacgccaaga acagcctgta cctgcagatg aactccctga gagccgagga caccgccgtg 720
tactactgtg ctagaagtgg cggccagtgg aagtactacg actattgggg acagggcacc 780
ctggtcacag ttagctctga atccaaatac ggtcctccat gccctccatg cccagctcca 840
cccgttgctg gaccaagcgt gtttctgttc ccaccaaagc ccaaggatac actcatgatt 900
agcagaaccc cagaagtgac atgtgtcgtc gtggacgttt cccaagagga ccctgaggtc 960
cagtttaact ggtatgtgga tggagtggag gtgcataatg ctaagactaa gccaagagaa 1020
gagcagtttc agtccaccta tagagtggtc tccgtgctca ccgtgctgca tcaggactgg 1080
ctcaatggca aggaatataa gtgtaaagtc tccaacaaag gactgccatc cagcatcgaa 1140
aagaccatta gcaaggccaa aggacagcct agagagcctc aggtctacac tctgcctccc 1200
tcccaagaag agatgactaa gaaccaggtc tctctgacct gcctggtgaa gggattctac 1260
ccttccgaca ttgctgtgga gtgggagtcc aatggacagc cagagaataa ctataagact 1320
acaccacccg tgctcgatag cgacggctca ttctttctgt actctcggct gacagtggac 1380
aagagcagat ggcaggaggg aaacgtcttt agctgctccg tgatgcatga ggctctgcat 1440
aaccactata cccagaagtc tctgtccctg agcctcggca aaatgttttg ggtgctggtg 1500
gtggtcggag gcgtgctggc ttgctattcc ctgctggtca cagtggcctt cattatcttc 1560
tgggtgaaac ggggaagaaa gaaactcctg tatatattca aacaaccatt tatgagacca 1620
gtacaaacta ctcaagaaga ggatggctgt agctgccggt ttcccgaaga agaggaagga 1680
ggatgtgaac tgcgggtgaa gttctccaga agcgccgacg cccctgccta ccagcaggga 1740
cagaatcagc tgtataacga actgaacctg ggcagaaggg aggaatacga cgtcctggac 1800
aagagacgag gccgggaccc cgagatgggc ggaaagcctc ggcggaagaa cccccaggaa 1860
ggcctgtaca acgaactgca gaaggacaag atggctgaag cttactccga gatcggcatg 1920
aaaggagagc ggaggcgggg caagggccac gacggcctgt atcagggcct gtccaccgcc 1980
acaaaggata cctacgatgc cctccatatg caggctctgc ctccaagact cgagggcggc 2040
ggagagggca gaggaagtct tctaacatgc ggtgacgtgg aggagaatcc cggccctagg 2100
atggtgctgc agacccaggt gttcatcagc ctgctgctgt ggatctctgg cgcctatgga 2160
cagtctgccc tgacacagcc tgccagcgtt agtgctagtc ccggacagtc tatcgccatc 2220
agctgtaccg gcaccagctc tgacgttggc tggtatcagc agcaccctgg caaggcccct 2280
aagctgatga tctacgagga cagcaagagg cccagcggcg tgtccaatag attcagcggc 2340
agcaagagcg gcaacaccgc cagcctgaca attagcggac tgcaggccga ggacgaggcc 2400
gattactact gcagcagcaa cacccggtcc agcacactgg tttttggcgg aggcaccaag 2460
ctgacagtgc tgggatctag aggtggcgga ggatctggcg gcggaggaag cggaggcggc 2520
ggatctcttg aaatggctga agtgcagctg gtgcagtctg gcgccgagat gaagaaacct 2580
ggcgcctctc tgaagctgag ctgcaaggcc agcggctaca ccttcatcga ctactacgtg 2640
tactggatgc ggcaggcccc tggacaggga ctcgaatcta tgggctggat caaccccaat 2700
agcggcggca ccaattacgc ccagaaattc cagggcagag tgaccatgac cagagacacc 2760
agcatcagca ccgcctacat ggaactgagc cggctgagat ccgacgacac cgccatgtac 2820
tactgcgcca gatctcagcg cgacggctac atggattatt ggggccaggg aaccctggtc 2880
accgtgtcca gcgagtctaa atacggaccg ccttgtcctc cttgtcccgc tcctcctgtt 2940
gccggacctt ccgtgttcct gtttcctcca aagcctaagg acaccctgat gatcagcagg 3000
acccctgaag tgacctgcgt ggtggtggat gtgtcccaag aggatcccga ggtgcagttc 3060
aactggtatg tggacggcgt ggaagtgcac aacgccaaga ccaagcctag agaggaacag 3120
ttccagagca cctacagagt ggtgtccgtg ctgacagtgc tgcaccagga ttggctgaac 3180
ggcaaagagt acaagtgcaa ggtgtccaac aagggcctgc ctagcagcat cgagaaaacc 3240
atctccaagg ccaagggcca gccaagagag ccccaggttt acacactgcc tccaagccaa 3300
gaggaaatga ccaagaatca ggtgtccctg acatgcctgg tcaagggctt ctacccctcc 3360
gatatcgccg tggaatggga gagcaatggc cagcctgaga acaactacaa gaccacacct 3420
cctgtgctgg acagcgacgg cagtttcttc ctgtatagta gactcaccgt ggataaatca 3480
agatggcaag agggcaacgt gttcagctgc agcgtgatgc acgaggccct gcacaaccac 3540
tacacccaga aaagcctgag cctgtctctg ggcaagatgt tctgggtgct cgtggtcgtt 3600
ggcggagtgc tggcctgtta cagcctgctg gttaccgtgg ccttcatcat cttttgggtc 3660
aagcggggca gaaagaagct gctctacatc ttcaagcagc ccttcatgcg gcccgtgcag 3720
accacacaag aggaagatgg ctgctcctgc agattccccg aggaagaaga aggcggctgc 3780
gagctgagag tgaagttcag cagatccgcc gacgctccag cctatcagca gggccaaaac 3840
cagctgtaca acgagctgaa cctggggaga agagaagagt acgacgtgct ggataagcgg 3900
agaggcagag atcctgaaat gggcggcaag cccagacgga agaatcctca agagggcctg 3960
tataatgagc tgcagaaaga caagatggcc gaggcctaca gcgagatcgg aatgaagggc 4020
gagcgcagaa gaggcaaggg acacgatgga ctgtaccagg gcctgagcac cgccaccaag 4080
gatacctatg acgcactgca catgcaggcc ctgccaccta ga 4122
<210> 303
<211> 4122
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 原始GPRC5D-BCMA CAR(nt)
<400> 303
atgccgctgc tgctactgct gcccctgctg tgggcagggg ctctagcttc ttctgagctg 60
acccaagatc ctgccgtgtc tgtggctctg ggccagacag tgcggattac ctgtcagggc 120
gatagcctga gaagctacta cgccagctgg tatcagcaga agcctggaca ggctcccgtg 180
ctggtcatct acggcaagaa caacagaccc agcggcatcc ccgatagatt cagcggaagc 240
agctctggca ataccgccag cctgacaatt actggcgccc aggccgaaga tgaggccgac 300
tactactgca acagcagaga cagctccggc aatcctcctg tggtttttgg cggaggcacc 360
aagctgacag tgctgggaag tagaggtggc ggaggatctg gcggcggagg aagcggaggc 420
ggcggatctc ttgaaatggc tcaggtgcag ctggtggaat caggcggtgg acttgttcac 480
cctggcggaa gcctgagact gtcttgtgcc gccagcggct tcaccttcag atcccacagc 540
atgaactggg tccgacaggc ccctggcaaa ggccttgaat gggtgtccag catcagcagc 600
gacagcacct acacctacta tgccgacagc gtgaagggca gattcaccat ctccagagac 660
aacgccaaga acagcctgta cctgcagatg aactccctga gagccgagga caccgccgtg 720
tactactgtg ctagaagtgg cggccagtgg aagtactacg actattgggg ccagggcacc 780
ctggtcacag ttagctctga gtctaaatac ggaccgcctt gtcctccttg tcccgctcct 840
cctgttgccg gaccttccgt gttcctgttt cctccaaagc ctaaggacac cctgatgatc 900
agcaggaccc ctgaagtgac ctgcgtggtg gtggatgtgt cccaagagga tcccgaggtg 960
cagttcaact ggtatgtgga cggcgtggaa gtgcacaacg ccaagaccaa gcctagagag 1020
gaacagttcc agagcaccta cagagtggtg tccgtgctga cagtgctgca ccaggattgg 1080
ctgaacggca aagagtacaa gtgcaaggtg tccaacaagg gcctgcctag cagcatcgag 1140
aaaaccatct ccaaggccaa gggccagcca agagagcccc aggtttacac actgcctcca 1200
agccaagagg aaatgaccaa gaatcaggtg tccctgacat gcctggtcaa gggcttctac 1260
ccctccgata tcgccgtgga atgggagagc aatggccagc ctgagaacaa ctacaagacc 1320
acacctcctg tgctggacag cgacggcagt ttcttcctgt atagtagact caccgtggat 1380
aaatcaagat ggcaagaggg caacgtgttc agctgcagcg tgatgcacga ggccctgcac 1440
aaccactaca cccagaaaag cctgagcctg tctctgggca agatgttctg ggtgctcgtg 1500
gtcgttggcg gagtgctggc ctgttacagc ctgctggtta ccgtggcctt catcatcttt 1560
tgggtcaagc ggggcagaaa gaagctgctc tacatcttca agcagccctt catgcggccc 1620
gtgcagacca cacaagagga agatggctgc tcctgcagat tccccgagga agaagaaggc 1680
ggctgcgagc tgagagtgaa gttcagcaga tccgccgacg ctccagccta tcagcagggc 1740
caaaaccagc tgtacaacga gctgaacctg gggagaagag aagagtacga cgtgctggat 1800
aagcggagag gcagagatcc tgaaatgggc ggcaagccca gacggaagaa tcctcaagag 1860
ggcctgtata atgagctgca gaaagacaag atggccgagg cctacagcga gatcggaatg 1920
aagggcgagc gcagaagagg caagggacac gatggactgt accagggcct gagcaccgcc 1980
accaaggata cctatgacgc actgcacatg caggccctgc cacctagact cgagggcggc 2040
ggagagggca gaggaagtct tctaacatgc ggtgacgtgg aggagaatcc cggccctagg 2100
atggtgctgc agacccaggt gttcatcagc ctgctgctgt ggatctctgg cgcctatgga 2160
cagtctgccc tgacacagcc tgccagcgtt agtgctagtc ccggacagtc tatcgccatc 2220
agctgtaccg gcaccagctc tgacgttggc tggtatcagc agcaccctgg caaggcccct 2280
aagctgatga tctacgagga cagcaagagg cccagcggcg tgtccaatag attcagcggc 2340
agcaagagcg gcaacaccgc cagcctgaca attagcggac tgcaggccga ggacgaggcc 2400
gattactact gcagcagcaa cacccggtcc agcacactgg tttttggcgg aggcaccaag 2460
ctgacagtgc tgggatctag aggtggcgga ggatctggcg gcggaggaag cggaggcggc 2520
ggatctcttg aaatggctga agtgcagctg gtgcagtctg gcgccgagat gaagaaacct 2580
ggcgcctctc tgaagctgag ctgcaaggcc agcggctaca ccttcatcga ctactacgtg 2640
tactggatgc ggcaggcccc tggacaggga ctcgaatcta tgggctggat caaccccaat 2700
agcggcggca ccaattacgc ccagaaattc cagggcagag tgaccatgac cagagacacc 2760
agcatcagca ccgcctacat ggaactgagc cggctgagat ccgacgacac cgccatgtac 2820
tactgcgcca gatctcagcg cgacggctac atggattatt ggggccaggg aaccctggtc 2880
accgtgtcca gcgagtctaa atacggaccg ccttgtcctc cttgtcccgc tcctcctgtt 2940
gccggacctt ccgtgttcct gtttcctcca aagcctaagg acaccctgat gatcagcagg 3000
acccctgaag tgacctgcgt ggtggtggat gtgtcccaag aggatcccga ggtgcagttc 3060
aactggtatg tggacggcgt ggaagtgcac aacgccaaga ccaagcctag agaggaacag 3120
ttccagagca cctacagagt ggtgtccgtg ctgacagtgc tgcaccagga ttggctgaac 3180
ggcaaagagt acaagtgcaa ggtgtccaac aagggcctgc ctagcagcat cgagaaaacc 3240
atctccaagg ccaagggcca gccaagagag ccccaggttt acacactgcc tccaagccaa 3300
gaggaaatga ccaagaatca ggtgtccctg acatgcctgg tcaagggctt ctacccctcc 3360
gatatcgccg tggaatggga gagcaatggc cagcctgaga acaactacaa gaccacacct 3420
cctgtgctgg acagcgacgg cagtttcttc ctgtatagta gactcaccgt ggataaatca 3480
agatggcaag agggcaacgt gttcagctgc agcgtgatgc acgaggccct gcacaaccac 3540
tacacccaga aaagcctgag cctgtctctg ggcaagatgt tctgggtgct cgtggtcgtt 3600
ggcggagtgc tggcctgtta cagcctgctg gttaccgtgg ccttcatcat cttttgggtc 3660
aagcggggca gaaagaagct gctctacatc ttcaagcagc ccttcatgcg gcccgtgcag 3720
accacacaag aggaagatgg ctgctcctgc agattccccg aggaagaaga aggcggctgc 3780
gagctgagag tgaagttcag cagatccgcc gacgctccag cctatcagca gggccaaaac 3840
cagctgtaca acgagctgaa cctggggaga agagaagagt acgacgtgct ggataagcgg 3900
agaggcagag atcctgaaat gggcggcaag cccagacgga agaatcctca agagggcctg 3960
tataatgagc tgcagaaaga caagatggcc gaggcctaca gcgagatcgg aatgaagggc 4020
gagcgcagaa gaggcaaggg acacgatgga ctgtaccagg gcctgagcac cgccaccaag 4080
gatacctatg acgcactgca catgcaggcc ctgccaccta ga 4122
<210> 304
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> huCD33信号肽(nt)
<400> 304
atgccgctgc tgctactgct gcccctgctg tgggcagggg ctctagct 48
<210> 305
<211> 684
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 密码子趋异的长间隔子(nt)
<400> 305
gaatccaaat acggtcctcc atgccctcca tgcccagctc cacccgttgc tggaccaagc 60
gtgtttctgt tcccaccaaa gcccaaggat acactcatga ttagcagaac cccagaagtg 120
acatgtgtcg tcgtggacgt ttcccaagag gaccctgagg tccagtttaa ctggtatgtg 180
gatggagtgg aggtgcataa tgctaagact aagccaagag aagagcagtt tcagtccacc 240
tatagagtgg tctccgtgct caccgtgctg catcaggact ggctcaatgg caaggaatat 300
aagtgtaaag tctccaacaa aggactgcca tccagcatcg aaaagaccat tagcaaggcc 360
aaaggacagc ctagagagcc tcaggtctac actctgcctc cctcccaaga agagatgact 420
aagaaccagg tctctctgac ctgcctggtg aagggattct acccttccga cattgctgtg 480
gagtgggagt ccaatggaca gccagagaat aactataaga ctacaccacc cgtgctcgat 540
agcgacggct cattctttct gtactctcgg ctgacagtgg acaagagcag atggcaggag 600
ggaaacgtct ttagctgctc cgtgatgcat gaggctctgc ataaccacta tacccagaag 660
tctctgtccc tgagcctcgg caaa 684
<210> 306
<211> 184
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA蛋白质(Uniprot Q02223)
<400> 306
Met Leu Gln Met Ala Gly Gln Cys Ser Gln Asn Glu Tyr Phe Asp Ser
1 5 10 15
Leu Leu His Ala Cys Ile Pro Cys Gln Leu Arg Cys Ser Ser Asn Thr
20 25 30
Pro Pro Leu Thr Cys Gln Arg Tyr Cys Asn Ala Ser Val Thr Asn Ser
35 40 45
Val Lys Gly Thr Asn Ala Ile Leu Trp Thr Cys Leu Gly Leu Ser Leu
50 55 60
Ile Ile Ser Leu Ala Val Phe Val Leu Met Phe Leu Leu Arg Lys Ile
65 70 75 80
Asn Ser Glu Pro Leu Lys Asp Glu Phe Lys Asn Thr Gly Ser Gly Leu
85 90 95
Leu Gly Met Ala Asn Ile Asp Leu Glu Lys Ser Arg Thr Gly Asp Glu
100 105 110
Ile Ile Leu Pro Arg Gly Leu Glu Tyr Thr Val Glu Glu Cys Thr Cys
115 120 125
Glu Asp Cys Ile Lys Ser Lys Pro Lys Val Asp Ser Asp His Cys Phe
130 135 140
Pro Leu Pro Ala Met Glu Glu Gly Ala Thr Ile Leu Val Thr Thr Lys
145 150 155 160
Thr Asn Asp Tyr Cys Lys Ser Leu Pro Ala Ala Leu Ser Ala Thr Glu
165 170 175
Ile Glu Lys Ser Ile Ser Ala Arg
180
<210> 307
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 密码子趋异的huCD28跨膜结构域(nt)
<400> 307
atgttttggg tgctggtggt ggtcggaggc gtgctggctt gctattccct gctggtcaca 60
gtggccttca ttatcttctg ggtg 84
<210> 308
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 密码子趋异的4-1BB细胞外结构域(nt)
<400> 308
aaacggggaa gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60
actactcaag aagaggatgg ctgtagctgc cggtttcccg aagaagagga aggaggatgt 120
gaactg 126
<210> 309
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 密码子趋异的CD3ζ细胞外结构域(nt)
<400> 309
cgggtgaagt tctccagaag cgccgacgcc cctgcctacc agcagggaca gaatcagctg 60
tataacgaac tgaacctggg cagaagggag gaatacgacg tcctggacaa gagacgaggc 120
cgggaccccg agatgggcgg aaagcctcgg cggaagaacc cccaggaagg cctgtacaac 180
gaactgcaga aggacaagat ggctgaagct tactccgaga tcggcatgaa aggagagcgg 240
aggcggggca agggccacga cggcctgtat cagggcctgt ccaccgccac aaaggatacc 300
tacgatgccc tccatatgca ggctctgcct ccaaga 336
<210> 310
<211> 732
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-55 scFv (nt)
<400> 310
cagtctgccc tgacacagcc tgccagcgtt agtgctagtc ccggacagtc tatcgccatc 60
agctgtaccg gcaccagctc tgacgttggc tggtatcagc agcaccctgg caaggcccct 120
aagctgatga tctacgagga cagcaagagg cccagcggcg tgtccaatag attcagcggc 180
agcaagagcg gcaacaccgc cagcctgaca attagcggac tgcaggccga ggacgaggcc 240
gattactact gcagcagcaa cacccggtcc agcacactgg tttttggcgg aggcaccaag 300
ctgacagtgc tgggatctag aggtggcgga ggatctggcg gcggaggaag cggaggcggc 360
ggatctcttg aaatggctga agtgcagctg gtgcagtctg gcgccgagat gaagaaacct 420
ggcgcctctc tgaagctgag ctgcaaggcc agcggctaca ccttcatcga ctactacgtg 480
tactggatgc ggcaggcccc tggacaggga ctcgaatcta tgggctggat caaccccaat 540
agcggcggca ccaattacgc ccagaaattc cagggcagag tgaccatgac cagagacacc 600
agcatcagca ccgcctacat ggaactgagc cggctgagat ccgacgacac cgccatgtac 660
tactgcgcca gatctcagcg cgacggctac atggattatt ggggccaggg aaccctggtc 720
accgtgtcca gc 732
<210> 311
<211> 750
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 密码子趋异的GPRC5D scFv(nt)
<400> 311
tcttctgagc tgacccaaga tcctgccgtg tctgtggctc tgggccagac agtgcggatt 60
acctgtcagg gcgatagcct gagaagctac tacgccagct ggtatcagca gaagcctgga 120
caggctcccg tgctggtcat ctacggcaag aacaacagac ccagcggcat ccccgataga 180
ttcagcggaa gcagctctgg caataccgcc tccctgacaa ttactggcgc ccaggccgaa 240
gatgaggccg actactactg caacagcaga gacagctccg gcaatcctcc tgtggtgttt 300
ggaggcggaa ccaaactgac cgtgctgggc agcagaggtg gaggtggaag cggcggtgga 360
ggctccggag gaggcggaag ccttgagatg gcacaggtgc agctggtgga atcaggcggt 420
ggacttgttc accctggcgg aagcctgaga ctgtcttgtg ccgccagcgg cttcaccttc 480
cggtcccaca gcatgaactg ggtccgacag gcccctggca aaggccttga atgggtgtcc 540
agcatcagca gcgacagcac ctacacctac tatgccgaca gcgtgaaggg cagattcacc 600
atctccagag acaacgccaa gaacagcctg tacctgcaga tgaactccct gagagccgag 660
gacaccgccg tgtactactg tgctagaagt ggcggccagt ggaagtacta cgactattgg 720
ggacagggca ccctggtcac agttagctct 750
<210> 312
<211> 2399
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA-41BB CAR
<400> 312
ccatatgaga tcttatatgg ggcacccccg ccccttgtaa acttccctga ccctgacata 60
acaagagtta ctaacagccc ctctctccaa gctcacttac aggctctcta cttagtccag 120
cacgaagtct ggagacctct ggcggcagcc taccaagaac aactggaccg accggtggta 180
cctcaccctt accgagtcgg cgacacagtg tgggtccgcc gacaccagac taagaaccta 240
gaacctcgct ggaaaggacc ttacacagtc ctgctgacca cccccaccgc cctcaaagta 300
gacggcatcg cagcttggat acacgccgcc cacgtgaagg ctgccgaccc cgggggtgga 360
ccatcctcta gactgccatg gtgctgcaga cccaggtgtt catcagcctg ctgctgtgga 420
tctctggcgc ctatggacag tctgccctga cacagcctgc cagcgttagt gctagtcccg 480
gacagtctat cgccatcagc tgtaccggca ccagctctga cgttggctgg tatcagcagc 540
accctggcaa ggcccctaag ctgatgatct acgaggacag caagaggccc agcggcgtgt 600
ccaatagatt cagcggcagc aagagcggca acaccgccag cctgacaatt agcggactgc 660
aggccgagga cgaggccgat tactactgca gcagcaacac ccggtccagc acactggttt 720
ttggcggagg caccaagctg acagtgctgg gatctagagg tggcggagga tctggcggcg 780
gaggaagcgg aggcggcgga tctcttgaaa tggctgaagt gcagctggtg cagtctggcg 840
ccgagatgaa gaaacctggc gcctctctga agctgagctg caaggccagc ggctacacct 900
tcatcgacta ctacgtgtac tggatgcggc aggcccctgg acagggactc gaatctatgg 960
gctggatcaa ccccaatagc ggcggcacca attacgccca gaaattccag ggcagagtga 1020
ccatgaccag agacaccagc atcagcaccg cctacatgga actgagccgg ctgagatccg 1080
acgacaccgc catgtactac tgcgccagat ctcagcgcga cggctacatg gattattggg 1140
gccagggaac cctggtcacc gtgtccagcg agtctaaata cggaccgcct tgtcctcctt 1200
gtcccgctcc tcctgttgcc ggaccttccg tgttcctgtt tcctccaaag cctaaggaca 1260
ccctgatgat cagcaggacc cctgaagtga cctgcgtggt ggtggatgtg tcccaagagg 1320
atcccgaggt gcagttcaac tggtatgtgg acggcgtgga agtgcacaac gccaagacca 1380
agcctagaga ggaacagttc cagagcacct acagagtggt gtccgtgctg acagtgctgc 1440
accaggattg gctgaacggc aaagagtaca agtgcaaggt gtccaacaag ggcctgccta 1500
gcagcatcga gaaaaccatc tccaaggcca agggccagcc aagagagccc caggtttaca 1560
cactgcctcc aagccaagag gaaatgacca agaatcaggt gtccctgaca tgcctggtca 1620
agggcttcta cccctccgat atcgccgtgg aatgggagag caatggccag cctgagaaca 1680
actacaagac cacacctcct gtgctggaca gcgacggcag tttcttcctg tatagtagac 1740
tcaccgtgga taaatcaaga tggcaagagg gcaacgtgtt cagctgcagc gtgatgcacg 1800
aggccctgca caaccactac acccagaaaa gcctgagcct gtctctgggc aagatgttct 1860
gggtgctcgt ggtcgttggc ggagtgctgg cctgttacag cctgctggtt accgtggcct 1920
tcatcatctt ttgggtcaag cggggcagaa agaagctgct ctacatcttc aagcagccct 1980
tcatgcggcc cgtgcagacc acacaagagg aagatggctg ctcctgcaga ttccccgagg 2040
aagaagaagg cggctgcgag ctgagagtga agttcagcag atccgccgac gctccagcct 2100
atcagcaggg ccaaaaccag ctgtacaacg agctgaacct ggggagaaga gaagagtacg 2160
acgtgctgga taagcggaga ggcagagatc ctgaaatggg cggcaagccc agacggaaga 2220
atcctcaaga gggcctgtat aatgagctgc agaaagacaa gatggccgag gcctacagcg 2280
agatcggaat gaagggcgag cgcagaagag gcaagggaca cgatggactg taccagggcc 2340
tgagcaccgc caccaaggat acctatgacg cactgcacat gcaggccctg ccacctaga 2399
<210> 313
<211> 2028
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GPRC5D-41BB CAR
<400> 313
atgccgctgc tgctactgct gcccctgctg tgggcagggg ctctagcttc ttctgagctg 60
acccaagatc ctgccgtgtc tgtggctctg ggccagacag tgcggattac ctgtcagggc 120
gatagcctga gaagctacta cgccagctgg tatcagcaga agcctggaca ggctcccgtg 180
ctggtcatct acggcaagaa caacagaccc agcggcatcc ccgatagatt cagcggaagc 240
agctctggca ataccgccag cctgacaatt actggcgccc aggccgaaga tgaggccgac 300
tactactgca acagcagaga cagctccggc aatcctcctg tggtttttgg cggaggcacc 360
aagctgacag tgctgggaag tagaggtggc ggaggatctg gcggcggagg aagcggaggc 420
ggcggatctc ttgaaatggc tcaggtgcag ctggtggaat caggcggtgg acttgttcac 480
cctggcggaa gcctgagact gtcttgtgcc gccagcggct tcaccttcag atcccacagc 540
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gtgtcccaag aggatcccga ggtgcagttc aactggtatg tggacggcgt ggaagtgcac 1800
aacgccaaga ccaagcctag agaggaacag ttccagagca cctacagagt ggtgtccgtg 1860
ctgacagtgc tgcaccagga ttggctgaac ggcaaagagt acaagtgcaa ggtgtccaac 1920
aagggcctgc ctagcagcat cgagaaaacc atctccaagg ccaagggcca gccaagagag 1980
ccccaggttt acacactgcc tccaagccaa gaggaaatga ccaagaatca ggtgtccctg 2040
acatgcctgg tcaagggctt ctacccctcc gatatcgccg tggaatggga gagcaatggc 2100
cagcctgaga acaactacaa gaccacacct cctgtgctgg acagcgacgg cagtttcttc 2160
ctgtatagta gactcaccgt ggataaatca agatggcaag agggcaacgt gttcagctgc 2220
agcgtgatgc acgaggccct gcacaaccac tacacccaga aaagcctgag cctgtctctg 2280
ggcaagatgt tctgggtgct cgtggtcgtt ggcggagtgc tggcctgtta cagcctgctg 2340
gttaccgtgg ccttcatcat cttttgggtc aagcggggca gaaagaagct gctctacatc 2400
ttcaagcagc ccttcatgcg gcccgtgcag accacacaag aggaagatgg ctgctcctgc 2460
agattccccg aggaagaaga aggcggctgc gagctgagag tgaagttcag cagatccgcc 2520
gacgctccag cctatcagca gggccaaaac cagctgtaca acgagctgaa cctggggaga 2580
agagaagagt acgacgtgct ggataagcgg agaggcagag atcctgaaat gggcggcaag 2640
cccagacgga agaatcctca agagggcctg tataatgagc tgcagaaaga caagatggcc 2700
gaggcctaca gcgagatcgg aatgaagggc gagcgcagaa gaggcaaggg acacgatgga 2760
ctgtaccagg gcctgagcac cgccaccaag gatacctatg acgcactgca catgcaggcc 2820
ctgccaccta ga 2832
<210> 318
<211> 1560
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BCMA del CAR
<400> 318
atggtgctgc agacccaggt gttcatcagc ctgctgctgt ggatctctgg cgcctatgga 60
cagtctgccc tgacacagcc tgccagcgtt agtgctagtc ccggacagtc tatcgccatc 120
agctgtaccg gcaccagctc tgacgttggc tggtatcagc agcaccctgg caaggcccct 180
aagctgatga tctacgagga cagcaagagg cccagcggcg tgtccaatag attcagcggc 240
agcaagagcg gcaacaccgc cagcctgaca attagcggac tgcaggccga ggacgaggcc 300
gattactact gcagcagcaa cacccggtcc agcacactgg tttttggcgg aggcaccaag 360
ctgacagtgc tgggatctag aggtggcgga ggatctggcg gcggaggaag cggaggcggc 420
ggatctcttg aaatggctga agtgcagctg gtgcagtctg gcgccgagat gaagaaacct 480
ggcgcctctc tgaagctgag ctgcaaggcc agcggctaca ccttcatcga ctactacgtg 540
tactggatgc ggcaggcccc tggacaggga ctcgaatcta tgggctggat caaccccaat 600
agcggcggca ccaattacgc ccagaaattc cagggcagag tgaccatgac cagagacacc 660
agcatcagca ccgcctacat ggaactgagc cggctgagat ccgacgacac cgccatgtac 720
tactgcgcca gatctcagcg cgacggctac atggattatt ggggccaggg aaccctggtc 780
accgtgtcca gcgagtctaa atacggaccg ccttgtcctc cttgtcccgc tcctcctgtt 840
gccggacctt ccgtgttcct gtttcctcca aagcctaagg acaccctgat gatcagcagg 900
acccctgaag tgacctgcgt ggtggtggat gtgtcccaag aggatcccga ggtgcagttc 960
aactggtatg tggacggcgt ggaagtgcac aacgccaaga ccaagcctag agaggaacag 1020
ttccagagca cctacagagt ggtgtccgtg ctgacagtgc tgcaccagga ttggctgaac 1080
ggcaaagagt acaagtgcaa ggtgtccaac aagggcctgc ctagcagcat cgagaaaacc 1140
atctccaagg ccaagggcca gccaagagag ccccaggttt acacactgcc tccaagccaa 1200
gaggaaatga ccaagaatca ggtgtccctg acatgcctgg tcaagggctt ctacccctcc 1260
gatatcgccg tggaatggga gagcaatggc cagcctgaga acaactacaa gaccacacct 1320
cctgtgctgg acagcgacgg cagtttcttc ctgtatagta gactcaccgt ggataaatca 1380
agatggcaag agggcaacgt gttcagctgc agcgtgatgc acgaggccct gcacaaccac 1440
tacacccaga aaagcctgag cctgtctctg ggcaagatgt tctgggtgct cgtggtcgtt 1500
ggcggagtgc tggcctgtta cagcctgctg gttaccgtgg ccttcatcat cttttgggtc 1560
<210> 319
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T2A
<400> 319
ctcgagggcg gcggagaggg aaggggatcc ctcctgacct gtggcgacgt cgaggaaaat 60
cctggcccca gg 72
<210> 320
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 连接物
<400> 320
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
Claims (255)
1.一种嵌合抗原受体，其包含：
(1)特异性结合人G蛋白偶联受体C类5族成员D(GPRC5D)的细胞外抗原结合结构域，其中该细胞外抗原结合结构域包含：
(i)重链可变(VH)区，其包含与SEQ ID NO:21、23、25、27、29、31或33中所示的氨基酸序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列；和
(ii)轻链可变(VL)区，其包含与SEQ ID NO:22、24、26、28、30、32、34、63、64、65、66、67、68或69中所示的氨基酸序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列；
(2)长度为至少125个氨基酸的间隔子；
(3)跨膜结构域；和
(4)细胞内信号转导区。
2.一种嵌合抗原受体，其包含：
(1)特异性结合人G蛋白偶联受体C类5族成员D(GPRC5D)的细胞外抗原结合结构域，其中该细胞外抗原结合结构域包含：
(i)重链可变(VH)区，其包含选自SEQ ID NO:21、23、25、27、29、31和33的VH区氨基酸序列内所包含的重链互补决定区1(CDR-H1)、重链互补决定区2(CDR-H2)和重链互补决定区3(CDR-H3)；和
(ii)轻链可变(VL)区，其包含选自SEQ ID NO:22、24、26、28、30、32、34、63、64、65、66、67、68和69的VL区氨基酸序列内所包含的轻链互补决定区1(CDR-L1)、轻链互补决定区2(CDR-L2)和轻链互补决定区3(CDR-L3)；
(2)长度为至少125个氨基酸的间隔子；
(3)跨膜结构域；和
(4)细胞内信号转导区。
3.一种嵌合抗原受体，其包含：
(1)特异性结合人G蛋白偶联受体C类5族成员D(GPRC5D)的细胞外抗原结合结构域，其中该细胞外抗原结合结构域包含：
(i)重链可变(VH)区，其包括：含选自SEQ ID NO:75、78、80、82、90、93、95、97、105、108、110、112、120、123、125、127、135、138、140、142、152、162、165、167和169的氨基酸序列的CDR-H1；(b)含选自SEQ ID NO:76、79、81、83、91、94、96、98、106、109、111、113、121、124、126、128、136、139、141、143、150、153、154、155、163、166、168和170的氨基酸序列的CDR-H2；和(c)含选自SEQ ID NO:77、84、92、99、107、114、122、129、137、144、151、156、164和171的氨基酸序列的CDR-H3；和
(ii)轻链可变(VL)区，其包括：含选自SEQ ID NO:85、88、100、103、115、118、130、133、145、148、157、160、172和174的氨基酸序列的CDR-L1；(b)含选自SEQ ID NO:86、89、101、104、116、119、131、134、146、149、158和161的氨基酸序列的CDR-L2；和(c)含选自SEQ IDNO:87、102、117、132、147、159、173、175和297的氨基酸序列的CDR-L3；
(2)长度为至少125个氨基酸的间隔子；
(3)跨膜结构域；和
(4)细胞内信号转导区。
4.权利要求2或权利要求3所述的嵌合抗原受体，其中该细胞外抗原结合结构域包含：
(i)重链可变(VH)区，其包含与SEQ ID NO:21、23、25、27、29、31或33中所示的氨基酸序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列；和
(ii)轻链可变(VL)区，其包含与SEQ ID NO:22、24、26、28、30、32、34、63、64、65、66、67、68或69中所示的氨基酸序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。
5.权利要求1至4中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该间隔子的长度在125个与300个之间或在约125个与约300个之间、在125个与250个之间或在约125个与约250个之间、在125个与230个之间或在约125个与约230个之间、在125个与200个之间或在约125个与约200个之间、在125个与180个之间或在约125个与约180个之间、在125个与150个之间或在约125个与约150个之间、在150个与300个之间或在约150个与约300个之间、在150个与250个之间或在约150个与约250个之间、在150个与230个之间或在约150个与约230个之间、在150个与200个之间或在约150个与约200个之间、在150个与180个之间或在约150个与约180个之间、在180个与300个之间或在约180个与约300个之间、在180个与250个之间或在约180个与约250个之间、在125个与300个之间或在约125个与约300个之间、在180个与230个之间或在约180个与约230个之间、在180个与200个之间或在约180个与约200个之间、在200个与300个之间或在约200个与约300个之间、在200个与250个之间或在约200个与约250个之间、在200个与230个之间或在约200个与约230个之间、在230个与300个之间或在约230个与约300个之间、在230个与250个之间或在约230个与约250个之间、或在250个与300个之间或在约250个与约300个之间。
6.权利要求1至5中任一项所述的嵌合抗原受体，其中：
该间隔子的长度是、或者至少是约130个、140个、150个、160个、170个、180个、190个、200个、210个、220个、221个、222个、223个、224个、225个、226个、227个、228个或229个氨基酸，或其长度在任何前述两个数值之间；或
该间隔子的长度是约、或者至少是约130个、140个、150个、160个、170个、180个、190个、200个、210个、220个、221个、222个、223个、224个、225个、226个、227个、228个或229个氨基酸，或其长度在任何前述两个数值之间。
7.权利要求1至6中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该间隔子包含免疫球蛋白的一部分。
8.权利要求1至7中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该间隔子包含铰链区、CH2区和CH3区的序列。
9.权利要求8所述的嵌合抗原受体，其中：
该铰链区包含IgG4铰链区和/或IgG2铰链区的全部或一部分，其中该IgG4铰链区任选为人IgG4铰链区且该IgG2铰链区任选为人IgG2铰链区；
该CH2区包含IgG4 CH2和/或IgG2 CH2的全部或一部分，其中该IgG4CH2任选为人IgG4CH2且该IgG2 CH2任选为人IgG2 CH2；和/或
该CH3区包含IgG4 CH3和/或IgG2 CH3的全部或一部分，其中该IgG4CH3任选为人IgG4CH3且该IgG2 CH3任选为人IgG2 CH3。
10.权利要求8或权利要求9所述的嵌合抗原受体，其中该铰链区、CH2和CH3包含来自人IgG4的铰链的全部或一部分、CH2的全部或一部分和CH3的全部或一部分。
11.权利要求8或权利要求9所述的嵌合抗原受体，其中该铰链区、该CH2和该CH3中的一个或多个是嵌合的且包含来自人IgG4和人IgG2的铰链、CH2和CH3。
12.权利要求1至11中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该间隔子包含IgG4/2嵌合铰链区或与人IgG4铰链相比包含至少一个氨基酸置换的经修饰的IgG4铰链区；IgG2/4嵌合CH2区；和IgG4 CH3区。
13.权利要求1至12中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该间隔子是或包含(i)SEQ IDNO:17中所示的序列；(ii)与SEQ ID NO:17具有至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的SEQ ID NO:17的功能变体；或(iii)长度为至少125个氨基酸的(i)或(ii)的连续部分。
14.权利要求1至13中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该间隔子是或包含SEQ ID NO:17中所示的序列。
15.权利要求1至14中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该间隔子是或包含由SEQ IDNO:74中所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
16.权利要求1至15中任一项所述的嵌合抗原受体，其中：
该VH区包含SEQ ID NO:21中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:21具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；且该VL区包含SEQ ID NO:22中所示的氨基酸序列或与SEQ IDNO:22具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；
该VH区包含SEQ ID NO:21中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:21具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；且该VL区包含SEQ ID NO:63中所示的氨基酸序列或与SEQ IDNO:63具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；
该VH区包含SEQ ID NO:23中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:23具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；且该VL区包含SEQ ID NO:24中所示的氨基酸序列或与SEQ IDNO:24具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；
该VH区包含SEQ ID NO:23中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:23具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；且该VL区包含SEQ ID NO:64中所示的氨基酸序列或与SEQ IDNO:64具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；
该VH区包含SEQ ID NO:25中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:25具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；且该VL区包含SEQ ID NO:26中所示的氨基酸序列或与SEQ IDNO:26具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；
该VH区包含SEQ ID NO:25中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:25具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；且该VL区包含SEQ ID NO:65中所示的氨基酸序列或与SEQ IDNO:65具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；
该VH区包含SEQ ID NO:27中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:27具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；且该VL区包含SEQ ID NO:28中所示的氨基酸序列或与SEQ IDNO:28具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；
该VH区包含SEQ ID NO:27中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:27具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；且该VL区包含SEQ ID NO:66中所示的氨基酸序列或与SEQ IDNO:66具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；
该VH区包含SEQ ID NO:29中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:29具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；且该VL区包含SEQ ID NO:30中所示的氨基酸序列或与SEQ IDNO:30具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；
该VH区包含SEQ ID NO:29中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:29具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；且该VL区包含SEQ ID NO:67中所示的氨基酸序列或与SEQ IDNO:67具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；
该VH区包含SEQ ID NO:31中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:31具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；且该VL区包含SEQ ID NO:32中所示的氨基酸序列或与SEQ IDNO:32具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；
该VH区包含SEQ ID NO:31中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:31具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；且该VL区包含SEQ ID NO:68中所示的氨基酸序列或与SEQ IDNO:68具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；
该VH区包含SEQ ID NO:33中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:33具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；且该VL区包含SEQ ID NO:34中所示的氨基酸序列或与SEQ IDNO:34具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；或
该VH区包含SEQ ID NO:33中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:33具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；且该VL区包含SEQ ID NO:69中所示的氨基酸序列或与SEQ IDNO:69具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列。
17.权利要求1至16中任一项所述的嵌合抗原受体，其中：
该VH区包含分别含有SEQ ID NO:80、81和77的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2、和CDR-H3，且该VL区分别包含SEQ ID NO:85、86和87的氨基酸序列；
该VH区包含分别含有SEQ ID NO:95、96、92的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2、和CDR-H3，且该VL区包含分别含有SEQ ID NO:100、101和102的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3；
该VH区包含分别含有SEQ ID NO:110、111和107的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2、和CDR-H3，且该VL区包含分别含有SEQ ID NO:115、116和117的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3；
该VH区包含分别含有SEQ ID NO:125、126和122的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2、和CDR-H3，且该VL区包含分别含有SEQ ID NO:130、131和132的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3；
该VH区包含分别含有SEQ ID NO:140、141和137的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2、和CDR-H3，且该VL区包含分别含有SEQ ID NO:145、146和147的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3；
该VH区包含分别含有SEQ ID NO:140、154和151的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2、和CDR-H3，且该VL区包含分别含有SEQ ID NO:157、158和159的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3；
该VH区包含分别含有SEQ ID NO:167、168和164的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2、和CDR-H3，且该VL区包含分别含有SEQ ID NO:172、86、173的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3；或
该VH区包含分别含有SEQ ID NO:169、170和171的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2、和CDR-H3，且该VL区包含分别含有SEQ ID NO:174、89和297的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3。
18.权利要求1至17中任一项所述的嵌合抗原受体，其中：
该VH区和该VL区包含分别如SEQ ID NO:21和22中所示的氨基酸序列，或分别如SEQ IDNO:21和63中所示的氨基酸序列；
该VH区和该VL区包含分别如SEQ ID NO:23和24中所示的氨基酸序列，或分别如SEQ IDNO:23和64中所示的氨基酸序列；
该VH区和该VL区包含分别如SEQ ID NO:25和26中所示的氨基酸序列，或分别如SEQ IDNO:25和65中所示的氨基酸序列；
该VH区和该VL区包含分别如SEQ ID NO:27和28中所示的氨基酸序列，或分别如SEQ IDNO:27和66中所示的氨基酸序列；
该VH区和该VL区包含分别如SEQ ID NO:29和30中所示的氨基酸序列，或分别如SEQ IDNO:29和67中所示的氨基酸序列；
该VH区和该VL区包含分别如SEQ ID NO:31和32中所示的氨基酸序列，或分别如SEQ IDNo:31和68中所示的氨基酸序列；或
该VH区和该VL区包含分别如SEQ ID NO:33和34中所示的氨基酸序列，或分别如SEQ IDNo:33和69中所示的氨基酸序列。
19.权利要求1至18中任一项所述的嵌合抗原受体，其中：
该VH区包含SEQ ID NO:21中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:21具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；且该VL区包含SEQ ID NO:22中所示的氨基酸序列或与SEQ IDNO:22具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；
该VH区包含SEQ ID NO:21中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:21具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；且该VL区包含SEQ ID NO:63中所示的氨基酸序列或与SEQ IDNO:63具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；
该VH区包含SEQ ID NO:23中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:23具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；且该VL区包含SEQ ID NO:24中所示的氨基酸序列或与SEQ IDNO:24具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；
该VH区包含SEQ ID NO:23中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:23具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；且该VL区包含SEQ ID NO:64中所示的氨基酸序列或与SEQ IDNO:64具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；
该VH区包含SEQ ID NO:27中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:27具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；且该VL区包含SEQ ID NO:28中所示的氨基酸序列或与SEQ IDNO:28具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；
该VH区包含SEQ ID NO:27中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:27具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；且该VL区包含SEQ ID NO:66中所示的氨基酸序列或与SEQ IDNO:66具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；
该VH区包含SEQ ID NO:31中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:31具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；且该VL区包含SEQ ID NO:32中所示的氨基酸序列或与SEQ IDNO:32具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；或
该VH区包含SEQ ID NO:31中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:31具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；且该VL区包含SEQ ID NO:68中所示的氨基酸序列或与SEQ IDNO:68具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列。
20.权利要求1至19中任一项所述的嵌合抗原受体，其中：
该VH区包含分别含有SEQ ID NO:80、81和77的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2、和CDR-H3，且该VL区包含分别含有SEQ ID NO:85、86和87的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3；
该VH区包含分别含有SEQ ID NO:95、96、92的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2、和CDR-H3，且该VL区包含分别含有SEQ ID NO:100、101和102的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3；
该VH区包含分别含有SEQ ID NO:125、126和122的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2、和CDR-H3，且该VL区包含分别含有SEQ ID NO:130、131和132的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3；或
该VH区包含分别含有SEQ ID NO:140、154和151的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2、和CDR-H3，且该VL区包含分别含有SEQ ID NO:157、158和159的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3。
21.权利要求1至20中任一项所述的嵌合抗原受体，其中：
该VH区和该VL区包含分别如SEQ ID NO:21和22中所示的氨基酸序列，或分别如SEQ IDNo:21和63中所示的氨基酸序列；
该VH区和该VL区包含分别如SEQ ID NO:23和24中所示的氨基酸序列，或分别如SEQ IDNo:23和64中所示的氨基酸序列；
该VH区和该VL区包含分别如SEQ ID NO:27和28中所示的氨基酸序列，或分别如SEQ IDNo:27和66中所示的氨基酸序列；或
该VH区和该VL区包含分别如SEQ ID NO:31和32中所示的氨基酸序列，或分别如SEQ IDNo:31和68中所示的氨基酸序列。
22.权利要求1至21中任一项所述的嵌合抗原受体，其中：
该VH区包含SEQ ID NO:27中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:27具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；且该VL区包含SEQ ID NO:28中所示的氨基酸序列或与SEQ IDNO:28具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；或
该VH区包含SEQ ID NO:27中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:27具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列；且该VL区包含SEQ ID NO:66中所示的氨基酸序列或与SEQ IDNO:66具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％一致性的氨基酸序列。
23.权利要求1至22中任一项所述的嵌合抗原受体，其包括含SEQ ID NO:27中所示的VH区氨基酸序列内所包含的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的重链可变(VH)区；和含SEQ ID NO:28或66中所示的VL区氨基酸序列内所包含的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的轻链可变(VL)区。
24.权利要求1至23中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该VH区分别包含SEQ ID NO:125、126和122的氨基酸序列，且该VL区分别包含SEQ ID NO:130、131和132的氨基酸序列。
25.权利要求1至23中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该VH区分别包含SEQ ID NO:127、128和129的氨基酸序列，且该VL区分别包含SEQ ID NO:133、134和132的氨基酸序列。
26.权利要求1至23中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该VH区分别包含SEQ ID NO:120、121和122的氨基酸序列，且该VL区分别包含SEQ ID NO:130、131和132的氨基酸序列。
27.权利要求1至23中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该VH区分别包含SEQ ID NO:123、124和122的氨基酸序列，且该VL区分别包含SEQ ID NO:130、131和132的氨基酸序列。
28.权利要求1至23中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该VH区和该VL区包含分别如SEQID NO:27和28中所示的氨基酸序列，或分别如SEQ ID NO:27和66中所示的氨基酸序列。
29.权利要求1至28中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该细胞外抗原结合结构域是单链抗体片段。
30.权利要求1至29中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该单链抗体片段是或包含单链可变片段(scFv)。
31.权利要求1至30中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该VH区和该VL区通过柔性连接物接合。
32.权利要求31所述的嵌合抗原受体，其中该连接物包含氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:52)。
33.权利要求1至32中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该VH区在该VL区的氨基末端。
34.权利要求1至33中任一项所述的嵌合抗原受体，其中：
该细胞外抗原结合结构域包含选自SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11和13的氨基酸序列，或与选自SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11和13的氨基酸序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列；和/或
该细胞外抗原结合结构域由选自SEQ ID No:257、259、261、263、265、267和269的核苷酸序列或与选自SEQ ID No:257、259、261、263、265、267和269的核苷酸序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的核苷酸序列编码。
35.权利要求1至34中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该细胞外抗原结合结构域包含选自SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11和13的氨基酸序列。
36.权利要求1至34中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该细胞外抗原结合结构域包含选自SEQ ID NO:1、3、7和11的氨基酸序列或与选自SEQ ID NO:1、3、7和11的氨基酸序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。
37.权利要求1至36中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该抗原结合结构域包含选自SEQ ID NO:1、3、7和11的氨基酸序列。
38.权利要求1至34或37中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该抗原结合结构域包含SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。
39.权利要求1至38中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该抗原结合结构域包含SEQ IDNO:7中所示的氨基酸序列。
40.权利要求1至32中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该VH区在该VL区的羧基末端。
41.权利要求1至32和40中任一项所述的嵌合抗原受体，其中：
该细胞外抗原结合结构域包含选自SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12和14的氨基酸序列或与选自SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12和14的氨基酸序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列；和/或
该细胞外抗原结合结构域由选自SEQ ID No:258、260、262、264、266、268和270的核苷酸序列或与选自SEQ ID No:258、260、262、264、266、268和270的核苷酸序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的核苷酸序列编码。
42.权利要求1至32、40和41中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该细胞外抗原结合结构域包含选自SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12和14的氨基酸序列。
43.权利要求1至32、40和41中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该细胞外抗原结合结构域包含选自SEQ ID NO:2、4、8和12的氨基酸序列或与选自SEQ ID NO:2、4、8和12的氨基酸序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。
44.权利要求1至32或40至43中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该细胞外抗原结合结构域包含选自SEQ ID NO:2、4、8和12的氨基酸序列。
45.权利要求1至32、40、41和43中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该抗原结合结构域包含SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。
46.权利要求1至32或40至45中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该细胞外抗原结合结构域包含SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列。
47.权利要求1至46中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该细胞内信号转导区包含细胞内细胞质信号转导结构域。
48.权利要求47所述的嵌合抗原受体，其中该细胞内信号转导结构域是或包含CD3-zeta(CD3ζ)链或其功能变体或信号转导部分的细胞质信号转导结构域。
49.权利要求47或48中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该细胞内信号转导结构域是或包含SEQ ID NO:20中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:20具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸。
50.权利要求47至49中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该细胞内信号转导区进一步包含共刺激信号转导区。
51.权利要求50所述的嵌合抗原受体，其中该共刺激信号转导区包含CD28、4-1BB或ICOS或其信号转导部分的细胞内信号转导结构域。
52.权利要求50或51中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该共刺激信号转导区包含CD28的细胞内信号转导结构域。
53.权利要求50至52中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该共刺激信号转导区是或包含SEQ ID NO:46中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:46中所示的序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。
54.权利要求50或51中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该共刺激信号转导区包含4-1BB的细胞内信号转导结构域。
55.权利要求50、51和54中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该共刺激信号转导区是或包含SEQ ID NO:19中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:19中所示的序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。
56.权利要求50至55中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该共刺激信号转导区在该跨膜结构域与该细胞内信号转导区之间。
57.权利要求1至56中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该跨膜结构域是或包含来自CD4、CD28或CD8的跨膜结构域。
58.权利要求1至57中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该跨膜结构域是或包含来源于CD28的跨膜结构域。
59.权利要求1至58中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该跨膜结构域是或包含SEQ IDNO:18中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:18中所示的序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。
60.一种嵌合抗原受体，其包含：
(1)特异性结合人G蛋白偶联受体C类5族成员D(GPRC5D)的细胞外抗原结合结构域，其中该细胞外抗原结合结构域包含：
(i)重链可变(VH)区，其包含与SEQ ID NO:27中所示的氨基酸序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列；和
(ii)轻链可变(VL)区，其包含与SEQ ID NO:28或66中所示的氨基酸序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列；
(2)间隔子，其包含IgG4/2嵌合铰链或经修饰的IgG4铰链；IgG2/4嵌合CH2区；和IgG4CH3区，任选地其长度为约228个氨基酸；或SEQ ID NO:17中所示的间隔子；
(3)来自人CD28的跨膜结构域；和
(4)细胞内信号转导区，其包含CD3-zeta(CD3ζ)链的细胞质信号转导结构域和T细胞共刺激分子的细胞内信号转导结构域。
61.权利要求60所述的嵌合抗原受体，其中：
该VH区包含SEQ ID NO:27中所示的VH区氨基酸序列内所包含的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；且该VL区包含SEQ ID NO:28或66中所示的VL区氨基酸序列内所包含的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；或
该VH区包括分别含SEQ ID NO:125、126和122的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该VL区包括分别含SEQ ID NO:130、131和132的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；
该VH区包括分别含SEQ ID NO:120、121和122的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该VL区包括分别含SEQ ID NO:130、131和132的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；或
该VH区包括分别含SEQ ID NO:123、124和122的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该VL区包括分别含SEQ ID NO:130、131和132的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
62.一种嵌合抗原受体，其包含：
(1)特异性结合人G蛋白偶联受体C类5族成员D(GPRC5D)的细胞外抗原结合结构域，其中该细胞外抗原结合结构域包含：
含SEQ ID NO:27中所示的VH区氨基酸序列内所包含的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的VH区；和含SEQ ID NO:28或66中所示的VL区氨基酸序列内所包含的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的轻链可变(VL)区；或
包括分别含SEQ ID NO:125、126和122的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的VH区，和包括分别含SEQ ID NO:130、131和132的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的VL区；
包括分别含SEQ ID NO:120、121和122的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的VH区，和包括分别含SEQ ID NO:130、131和132的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的VL区；或
包括分别含SEQ ID NO:123、124和122的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的VH区，和包括分别含SEQ ID NO:130、131和132的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的VL区；
(2)间隔子，其包含IgG4/2嵌合铰链或经修饰的IgG4铰链；IgG2/4嵌合CH2区；和IgG4CH3区，任选地其长度为约228个氨基酸；或SEQ ID NO:17中所示的间隔子；
(3)来自人CD28的跨膜结构域；和
(4)细胞内信号转导区，其包含人CD3-zeta(CD3ζ)链的细胞质信号转导结构域和人CD28或人4-1BB的细胞内信号转导结构域。
63.权利要求60至62中任一项所述的嵌合抗原受体，其中：
该细胞外抗原结合结构域包含SEQ ID NO:27中所示的VH区氨基酸序列和SEQ ID NO:28或66中所示的VL区氨基酸序列；和/或
该细胞外抗原结合结构域包含SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8中所示的scFv。
64.权利要求60至63中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该跨膜结构域是或包含SEQID NO:18中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:18具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。
65.权利要求60至64中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该细胞内信号转导区包含(a)SEQ ID NO:20中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:20具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列；和(b)SEQ ID NO:46中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:46中所示的序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。
66.权利要求60至65中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该细胞内信号转导区是或包含SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:46中所示的序列。
67.权利要求60至64中任一项所述的嵌合抗原受体，其中该细胞内信号转导区包含(a)SEQ ID NO:20中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:20具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列，和(b)SEQ ID NO:19中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:19中所示的序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。
68.一种多核苷酸，其包含编码权利要求1至67中任一项所述的嵌合抗原受体的核苷酸序列。
69.权利要求68所述的多核苷酸，其中编码间隔子的核酸包含至少一个经修饰的剪接供体和/或剪接受体位点，该经修饰的剪接供体和/或受体位点包含对应于SEQ ID NO:73中所示的序列中所包含的参考剪接供体位点和/或参考剪接受体位点的一个或多个核苷酸修饰。
70.权利要求69所述的多核苷酸，其中该一个或多个核苷酸修饰包含氨基酸取代。
71.权利要求69和70中任一项所述的多核苷酸，其中：
该参考剪接供体和/或参考剪接受体位点的剪接位点预测分数为至少或至少约0.4分、至少或至少约0.5分、至少或至少约0.6分、至少或至少约0.70分、至少或至少约0.75分、至少或至少约0.80分、至少或至少约0.85分、至少或至少约0.90分、至少或至少约0.95分、至少或至少约0.99分、或至少或至少约1.0分；和/或
该参考剪接供体和/或参考剪接受体位点涉及剪接事件的概率预测为至少或至少约40％、至少或至少约50％、至少或至少约60％、至少或至少约70％、至少或至少约75％、至少或至少约80％、至少或至少约85％、至少或至少约90％、至少或至少约95％、至少或至少约99％、或至少或至少约100％。
72.权利要求69至71中任一项所述的多核苷酸，其中：
该参考剪接供体位点包含序列aatctaagtacggac(SEQ ID NO:176)、tcaactggtacgtgg(SEQ ID NO:177)、acaattagtaaggca(SEQ ID NO:178)和/或accacaggtgtatac(SEQ ID NO:179)；和/或
该参考剪接受体位点包含序列aagtttctttctgtattccaggctgaccgtggataaatctc(SEQID NO:180)和/或gggcaacgtgttctcttgcagtgtcatgcacgaagccctgc(SEQ ID NO:181)。
73.权利要求69至72中任一项所述的多核苷酸，其中：
该参考剪接供体位点包含序列tcaactggtacgtgg(SEQ ID NO:177)；和/或
该参考剪接受体位点包含序列aagtttctttctgtattccaggctgaccgtggataaatctc(SEQID NO:180)。
74.权利要求69至73中任一项所述的多核苷酸，其中该一个或多个核苷酸修饰是沉默修饰，和/或相较于SEQ ID NO:73产生简并密码子，和/或不会改变所编码的间隔子的氨基酸序列。
75.权利要求69至74中任一项所述的多核苷酸，其中：
该经修饰的剪接供体位点示于agtctaaatacggac(SEQ ID NO:182)、tcaactggtatgtgg(SEQ ID NO:183)、accatctccaaggcc(SEQ ID NO:184)和/或gccccaggtttacac(SEQ ID NO:185)中；和/或
该经修饰的剪接受体位点示于cagtttcttcctgtatagtagactcaccgtggataaatcaa(SEQID NO:186)、gggcaacgtgttcagctgcagcgtgatgcacgaggccctgc(SEQ ID NO:187)和/或cgccttgtcctccttgtcccgctcctcctgttgccggacct(SEQ ID NO:188)中。
76.权利要求69至75中任一项所述的多核苷酸，其中该经修饰的剪接供体位点示于tcaactggtatgtgg(SEQ ID NO:183)中和/或该经修饰的受体位点示于cagtttcttcctgtatagtagactcaccgtggataaatcaa(SEQ ID NO:186)和/或cgccttgtcctccttgtcccgctcctcctgttgccggacct(SEQ ID NO:188)中。
77.权利要求69至76中任一项所述的多核苷酸，其中该间隔子由SEQ ID NO:74中所示的核苷酸序列编码。
78.权利要求68至77中任一项所述的多核苷酸，其中当在细胞中表达时，相较于自参考多核苷酸转录的信使RNA(mRNA)的异质性，由该多核苷酸转录的RNA、任选的该mRNA展现减小的异质性，该参考多核苷酸编码与该多核苷酸所编码相同的氨基酸序列，其中该参考多核苷酸的不同之处在于在编码该间隔子的核酸中存在一个或多个剪接供体位点和/或一个或多个剪接受体位点，和/或相较于该多核苷酸包含一个或多个核苷酸修饰，和/或包含SEQID NO:73中所示的间隔子。
79.权利要求68至78中任一项所述的多核苷酸，其中该多核苷酸经密码子优化以用于在人类细胞中表达。
80.权利要求68至78中任一项所述的多核苷酸，其中该嵌合抗原受体是第一嵌合抗原受体且该多核苷酸进一步包含编码第二嵌合抗原受体的核苷酸序列。
81.权利要求80所述的多核苷酸，其中该第一嵌合抗原受体和该第二嵌合抗原受体通过一个或多个多顺反子组件分隔开。
82.权利要求81所述的多核苷酸，其中该一个或多个多顺反子组件是或包含核糖体跳跃序列，任选其中该核糖体跳跃序列是T2A、P2A、E2A或F2A组件。
83.权利要求82所述的多核苷酸，其中编码该一个或多个多顺反子组件的核苷酸序列是编码子趋异的。
84.权利要求82或权利要求83所述的多核苷酸，其中编码该一个或多个多顺反子组件的核苷酸序列是或包含SEQ ID NO:319中所示的序列。
85.权利要求80至84中任一项所述的多核苷酸，其中该第二嵌合抗原受体(CAR)包含特异性结合多发性骨髓瘤上表达或与多发性骨髓瘤相关的第二抗原的细胞外抗原结合结构域。
86.权利要求85所述的多核苷酸，其中该第二CAR进一步包含间隔子、跨膜结构域和细胞内信号转导区。
87.权利要求85或权利要求86所述的多核苷酸，其中该第二抗原选自B细胞成熟抗原(BCMA)、CD38、CD138、CS-1、BAFF-R、TACI和FcRH5。
88.权利要求85至87中任一项所述的多核苷酸，其中该第二抗原是BCMA。
89.权利要求85至88中任一项所述的多核苷酸，其中该第二CAR包含：
(1)特异性结合BCMA的细胞外抗原结合结构域，其中该细胞外抗原结合结构域包含：
(i)重链可变(VH)区，其包含与SEQ ID NO:189、191、193、195或197中所示的氨基酸序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列；和
(ii)轻链可变(VL)区，其包含与SEQ ID NO:190、192、194、196或198中所示的氨基酸序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列；
(2)间隔子，任选为包含IgG4/2嵌合铰链或经修饰的IgG4铰链；IgG2/4嵌合CH2区；和IgG4 CH3区的间隔子，任选地其长度为约228个氨基酸，或SEQ ID NO:17中所示的间隔子；
(3)跨膜结构域；和
(4)细胞内信号转导区。
90.权利要求89所述的多核苷酸，其中该第二CAR的VH区包含SEQ ID NO:189、191、193、195或197中所示的VH区氨基酸序列内所包含的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；且该第二CAR的VL区包含SEQ ID NO:190、192、194、196或198中所示的VL区氨基酸序列内所包含的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
91.权利要求85至88中任一项所述的多核苷酸，其中该第二CAR包含：
(1)特异性结合BCMA的细胞外抗原结合结构域，其中该细胞外抗原结合结构域包含：
(i)重链可变(VH)区，其包括含选自SEQ ID NO:199、202、206、209、212和215的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR-H1)；(b)含选自SEQ ID NO:200、203、207、和210的氨基酸序列的重链互补决定区2(CDR-H2)；和(c)含选自SEQ ID NO:201、204、205、208、和211的氨基酸序列的重链互补决定区3(CDR-H3)；和
(ii)轻链可变(VL)区，其包括含选自SEQ ID NO:218、221、224、227、和230的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR-L1)；(b)含选自SEQ ID NO:219、222、225、228、和231中的任一个的氨基酸序列的轻链互补决定区2(CDR-L2)；和(c)含选自SEQ ID NO:220、223、和226的氨基酸序列的轻链互补决定区3(CDR-L3)；
(2)间隔子，任选为包含IgG4/2嵌合铰链或经修饰的IgG4铰链；IgG2/4嵌合CH2区；和IgG4 CH3区的间隔子，任选地其长度是或是约228个氨基酸，或SEQ ID NO:17中所示的间隔子；
(3)跨膜结构域；和
(4)细胞内信号转导区。
92.权利要求89至91中任一项所述的多核苷酸，其中：
该第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:199、200和201的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:218、219和220的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；
该第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:202、203、204的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:221、222和223的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；
该第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:199、200、205的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:224、225和226的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；
该第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:206、207、208的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:227、228和229的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；或
该第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:209、210和211的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:230、231和232的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
93.权利要求89至91中任一项所述的多核苷酸，其中：
该第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:209、210和211的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:230、231和232的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
94.权利要求89至93中任一项所述的多核苷酸，其中：
该第二CAR的VH区和VL区包含(a)分别如SEQ ID NO:189和SEQ ID NO:190中所示的氨基酸序列，或(b)与SEQ ID NO:189具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列和与SEQID NO:190具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列；
该第二CAR的VH区和VL区包含(a)分别如SEQ ID NO:191和SEQ ID NO:192中所示的氨基酸序列，或(b)与SEQ ID NO:191具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列和与SEQID NO:192具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列；
该第二CAR的VH区和VL区包含(a)分别如SEQ ID NO:193和SEQ ID NO:194中所示的氨基酸序列，或(b)与SEQ ID NO:193具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列和与SEQID NO:194具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列；
该第二CAR的VH区和VL区包含(a)分别如SEQ ID NO:195和SEQ ID NO:196中所示的氨基酸序列，或(b)与SEQ ID NO:195具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列和与SEQID NO:196具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列；或
该第二CAR的VH区和VL区包含(a)分别如SEQ ID NO:197和SEQ ID NO:198中所示的氨基酸序列，或(b)与SEQ ID NO:197具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列和与SEQID NO:198具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。
95.权利要求89至94中任一项所述的多核苷酸，其中：
该第二CAR的VH区和VL区分别包含SEQ ID NO:189和SEQ ID NO:190中所示的氨基酸序列；
该第二CAR的VH区和VL区包含SEQ ID NO:191和SEQ ID NO:192中所示的氨基酸序列；
该第二CAR的VH区和VL区包含SEQ ID NO:193和SEQ ID NO:194中所示的氨基酸序列；
该第二CAR的VH区和VL区包含SEQ ID NO:195和SEQ ID NO:196中所示的氨基酸序列；或
该第二CAR的VH区和VL区分别包含SEQ ID NO:197和SEQ ID NO:198中所示的氨基酸序列。
96.权利要求89至95中任一项所述的多核苷酸，其中该VH区在该VL区的氨基末端。
97.权利要求89至95中任一项所述的多核苷酸，其中该VH区在该VL区的羧基末端。
98.权利要求89至97中任一项所述的多核苷酸，其中该第二CAR的抗原结合结构域包含选自SEQ ID NO:237、238、239、240和241的氨基酸序列或与选自SEQ ID NO:237、238、239、240和241的氨基酸序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。
99.权利要求89至98中任一项所述的多核苷酸，其中该第二CAR的抗原结合结构域包含选自SEQ ID NO:237、238、239、240和241的氨基酸序列。
100.权利要求89至99中任一项所述的多核苷酸，其中：
该第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:209、210和211的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:230、231和232的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；和/或
该第二CAR的VH区和VL区分别包含SEQ ID NO:197和SEQ ID NO:198中所示的氨基酸序列；和/或
该第二CAR的细胞外抗原结合结构域包含SEQ ID NO:241中所示的氨基酸序列或与SEQID NO:241中所示的序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。
101.权利要求86至100中任一项所述的多核苷酸，其中该第二CAR的跨膜结构域是或包含来自CD4、CD28或CD8的跨膜结构域，任选为来自人CD4、人CD28或人CD8的跨膜结构域。
102.权利要求86至101中任一项所述的多核苷酸，其中：
该第二CAR的跨膜结构域是或包含来自人CD28的跨膜结构域；和/或
该第二CAR的跨膜结构域是或包含SEQ ID NO:18中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:18具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。
103.权利要求86至102中任一项所述的多核苷酸，其中该第二CAR的细胞内信号转导区包含细胞内信号转导结构域。
104.权利要求103所述的多核苷酸，其中该第二CAR的细胞内信号转导结构域是或包含CD3-zeta(CD3ζ)链或其功能变体或信号转导部分、任选为人CD3ζ链的细胞质信号转导结构域。
105.权利要求103或104中任一项所述的多核苷酸，其中该第二CAR的细胞内信号转导区包含SEQ ID NO:20中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:20具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。
106.权利要求103至105中任一项所述的多核苷酸，其中该第二CAR的细胞内信号转导区进一步包含共刺激信号转导区。
107.权利要求106所述的多核苷酸，其中该第二CAR的共刺激信号转导区包含CD28、4-1BB或ICOS、或其信号转导部分、任选为人CD28、人4-1BB或人ICOS的细胞内信号转导结构域。
108.权利要求80至107中任一项所述的多核苷酸，其中该第一嵌合抗原受体和该第二嵌合抗原受体中的至少一个包含细胞内信号转导区，该细胞内信号转导区包含4-1BB或其信号转导部分、任选为人4-1BB的细胞内信号转导结构域。
109.权利要求106或108中任一项所述的多核苷酸，其中该第二CAR的共刺激信号转导区包含4-1BB或其信号转导部分、任选为人4-1BB的细胞内信号转导结构域。
110.权利要求106至108中任一项所述的多核苷酸，其中该第二CAR的共刺激信号转导区包含：
人CD28的细胞内信号转导结构域；和/或
SEQ ID NO:46中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:46中所示的序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。
111.权利要求106至109中任一项所述的多核苷酸，其中该第二CAR的共刺激信号转导区包含：
人4-1BB的细胞内信号转导结构域；和/或
SEQ ID NO:19中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:19中所示的序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。
112.一种多核苷酸，其包含：
(i)编码第一嵌合抗原受体(CAR)的第一核酸序列，该第一CAR包含第一抗原结合结构域；和
(ii)编码第二嵌合抗原受体(CAR)的第二核酸序列，该第二CAR包含第二抗原结合结构域；
其中该第一CAR和该第二CAR各自包含以下：(a)该第一抗原结合结构域或该第二抗原结合结构域、(b)间隔子、(c)跨膜结构域和(d)包含细胞内信号转导结构域和共刺激信号转导区的细胞内信号转导区；
其中该第一CAR中(b)至(d)中的一个或多个与该第二CAR中(b)至(d)中相同的一个或多个包含一致氨基酸序列；且
其中编码该第一CAR中(b)至(d)中该一个或多个的核苷酸序列在序列方面不同于编码该第二CAR中(b)至(d)中该相同的一个或多个的核苷酸序列。
113.一种多核苷酸，其包含：
(i)编码第一嵌合抗原受体(CAR)的第一核酸序列，该第一CAR包含能够结合至GPRC5D或BCMA之一的第一抗原结合结构域和
(ii)编码第二嵌合抗原受体(CAR)的第二核酸序列，该第二CAR包含能够结合至GPRC5D或BCMA中的另一个的第二抗原结合结构域；
其中该第一CAR和该第二CAR各自包含以下：(a)该第一抗原结合结构域或该第二抗原结合结构域、(b)间隔子、(c)跨膜结构域和(d)包含细胞内信号转导结构域和共刺激信号转导区的细胞内信号转导区；
其中该第一CAR中(b)至(d)中的一个或多个与该第二CAR中(b)至(d)中相同的一个或多个包含一致氨基酸序列；且
其中编码该第一CAR中(b)至(d)中该一个或多个的核苷酸序列在序列方面不同于编码该第二CAR中(b)至(d)中该相同的一个或多个的核苷酸序列。
114.权利要求80至113中任一项所述的多核苷酸，其中编码该第一嵌合抗原受体的核苷酸序列和编码该第二嵌合抗原受体的核苷酸序列中的至少一个是密码子趋异的。
115.一种多核苷酸，其包含(i)编码第一嵌合抗原受体(CAR)的第一核酸序列、(ii)编码第二嵌合抗原受体(CAR)的第二核酸序列和(iii)编码多顺反子组件的核苷酸序列，其中编码该第一CAR的第一核酸和编码该第二CAR的第二核酸由该多顺反子组件分隔开；
其中该第一CAR包含结合至GPRC5D的第一抗原结合结构域，任选其中该第一抗原结合结构域由SEQ ID NO:311中所示的核苷酸序列编码；由SEQ ID NO:305中所示的核苷酸编码的间隔子；由SEQ ID NO:307中所示的核苷酸序列编码的跨膜结构域；以及包含由SEQ IDNO:309中所示的核苷酸序列编码的细胞内信号转导结构域和由SEQ ID NO:308中所示的核苷酸序列编码的共刺激信号转导区的细胞内信号转导区；
其中该第二CAR包含结合至BCMA的第二抗原结合结构域，任选其中该第二抗原结合结构域由SEQ ID NO:310中所示的核苷酸序列编码；由SEQ ID NO:74中所示的核苷酸编码的间隔子；由SEQ ID NO:56中所示的核苷酸序列编码的跨膜结构域；以及包含由SEQ ID NO:58中所示的核苷酸序列编码的细胞内信号转导结构域和由SEQ ID NO:60中所示的核苷酸序列编码的共刺激信号转导结构域区的细胞内信号转导区；
且其中编码该第一CAR的第一核酸序列相对于编码该第二CAR的第二核酸序列位于该多核苷酸的5'端。
116.一种多核苷酸，其包含(i)编码第一嵌合抗原受体(CAR)的第一核酸序列、(ii)编码第二嵌合抗原受体(CAR)的第二核酸序列和(iii)编码多顺反子组件的核苷酸序列，其中编码该第一CAR的第一核酸和编码该第二CAR的第二核酸由该多顺反子组件分隔开；
其中该第一CAR包含结合至BCMA的第一抗原结合结构域，任选其中该第一抗原结合结构域由SEQ ID NO:310中所示的核苷酸序列编码；由SEQ ID NO:74中所示的核苷酸编码的间隔子；由SEQ ID NO:56中所示的核苷酸序列编码的跨膜结构域；以及包含由SEQ ID NO:58中所示的核苷酸序列编码的细胞内信号转导结构域和由SEQ ID NO:60中所示的核苷酸序列编码的共刺激信号转导结构域区的细胞内信号转导区；
其中该第二CAR包含结合至GPRC5D的第二抗原结合结构域，任选其中该第二抗原结合结构域是由SEQ ID NO:311中所示的核苷酸序列编码；由SEQ ID NO:305中所示的核苷酸编码的间隔子；由SEQ ID NO:307中所示的核苷酸序列编码的跨膜结构域；以及包含由SEQ IDNO:309中所示的核苷酸序列编码的细胞内信号转导结构域和由SEQ ID NO:308中所示的核苷酸序列编码的共刺激信号转导区的细胞内信号转导区；
且其中编码该第一CAR的第一核酸序列相对于编码该第二CAR的第二核酸序列位于该多核苷酸的5'端。
117.权利要求80至116中任一项所述的多核苷酸，其中编码该第一嵌合抗原受体的核苷酸序列和编码该第二嵌合抗原受体的核苷酸序列具有不超过约30个、不超过约20个或不超过约10个序列同源的连续碱基对。
118.一种载体，其包含权利要求68至117中任一项所述的多核苷酸。
119.权利要求118所述的载体，其是病毒载体。
120.一种细胞，其包含权利要求1至67中任一项所述的嵌合抗原受体。
121.权利要求120所述的细胞，其中该嵌合抗原受体是第一嵌合受体且该细胞进一步包括含编码第二嵌合抗原受体的核苷酸的多核苷酸。
122.一种细胞，其包含权利要求68至117中任一项所述的多核苷酸。
123.一种细胞，其包含权利要求68至79中任一项所述的多核苷酸，该多核苷酸是第一多核苷酸，且该细胞包括含编码第二嵌合抗原受体(CAR)的核苷酸序列的第二多核苷酸。
124.权利要求121或权利要求123所述的细胞，其中该第二嵌合抗原受体(CAR)包含特异性结合多发性骨髓瘤上表达或与多发性骨髓瘤相关的第二抗原的细胞外抗原结合结构域。
125.权利要求124所述的细胞，其中该第二CAR进一步包含间隔子、跨膜结构域和细胞内信号转导区。
126.权利要求124或权利要求125所述的细胞，其中该第二抗原选自B细胞成熟抗原(BCMA)、CD38、CD138、CS-1、BAFF-R、TACI和FcRH5。
127.权利要求124至126中任一项所述的细胞，其中该第二抗原是BCMA。
128.权利要求121至127中任一项所述的细胞，其中该第二CAR包含：
(1)特异性结合BCMA的细胞外抗原结合结构域，其中该细胞外抗原结合结构域包含：
(i)重链可变(VH)区，其包含与SEQ ID NO:189、191、193、195或197中所示的氨基酸序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列；和
(ii)轻链可变(VL)区，其包含与SEQ ID NO:190、192、194、196或198中所示的氨基酸序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列；
(2)间隔子，任选为包含IgG4/2嵌合铰链或经修饰的IgG4铰链；IgG2/4嵌合CH2区；和IgG4 CH3区的间隔子，任选地其长度是或是约228个氨基酸，或SEQ ID NO:17中所示的间隔子；
(3)跨膜结构域；和
(4)细胞内信号转导区。
129.权利要求128所述的细胞，其中该第二CAR的VH区包含SEQ ID NO:189、191、193、195或197中所示的VH区氨基酸序列内所包含的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；且该VL区包含SEQ IDNO:190、192、194、196或198中所示的VL区氨基酸序列内所包含的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
130.权利要求121至127中任一项所述的细胞，其中该第二CAR包含：
(1)特异性结合BCMA的细胞外抗原结合结构域，其中该细胞外抗原结合结构域包含：
(i)重链可变(VH)区，其包括含SEQ ID NO:199、202、206、或209中所示的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR-H1)；(b)含SEQ ID NO:200、203、207、210、213或216中所示的氨基酸序列的重链互补决定区2(CDR-H2)；和(c)含SEQ ID NO:201、204、205、208、或211中所示的氨基酸序列的重链互补决定区3(CDR-H3)；和
(ii)轻链可变(VL)区，其包括含SEQ ID NO:218、221、224、227、或230中所示的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR-L1)；(b)含SEQ ID NO:219、222、225、228、或231中所示的氨基酸序列的轻链互补决定区2(CDR-L2)；和(c)含SEQ ID NO:220、223、或226中所示的氨基酸序列的轻链互补决定区3(CDR-L3)；
(2)间隔子，任选为包含IgG4/2嵌合铰链或经修饰的IgG4铰链；IgG2/4嵌合CH2区；和IgG4 CH3区的间隔子，任选地其长度为约228个氨基酸，或SEQ ID NO:17中所示的间隔子；
(3)跨膜结构域；和
(4)细胞内信号转导区。
131.权利要求128至130中任一项所述的细胞，其中：
该第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:199、200和201的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:218、219和220的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；
该第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:202、203、204的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:221、222和223的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；
该第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:199、200、205的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:224、225和226的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；
该第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:206、207、208的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:227、228和229的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；或
该第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:209、210和211的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:230、231和232的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
132.权利要求128至131中任一项所述的细胞，其中：
该第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:209、210和211的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:230、231和232的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
133.权利要求128至132中任一项所述的细胞，其中：
该第二CAR的VH区和VL区包含(a)分别如SEQ ID NO:189和SEQ ID NO:190中所示的氨基酸序列，或(b)与SEQ ID NO:189具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列和与SEQID NO:190具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列；
该第二CAR的VH区和VL区包含(a)分别如SEQ ID NO:191和SEQ ID NO:192中所示的氨基酸序列，或(b)与SEQ ID NO:191具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列和与SEQID NO:192具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列；
该第二CAR的VH区和VL区包含(a)分别如SEQ ID NO:193和SEQ ID NO:194中所示的氨基酸序列，或(b)与SEQ ID NO:193具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列和与SEQID NO:194具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列；
该第二CAR的VH区和VL区包含(a)分别如SEQ ID NO:195和SEQ ID NO:196中所示的氨基酸序列，或(b)与SEQ ID NO:195具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列和与SEQID NO:196具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列；或
该第二CAR的VH区和VL区包含(a)分别如SEQ ID NO:197和SEQ ID NO:198中所示的氨基酸序列，或(b)与SEQ ID NO:197具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列和与SEQID NO:198具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。
134.权利要求128至133中任一项所述的细胞，其中：
该第二CAR的VH区和VL区分别包含SEQ ID NO:189和SEQ ID NO:190中所示的氨基酸序列；
该第二CAR的VH区和VL区包含SEQ ID NO:191和SEQ ID NO:192中所示的氨基酸序列；
该第二CAR的VH区和VL区包含SEQ ID NO:193和SEQ ID NO:194中所示的氨基酸序列；
该第二CAR的VH区和VL区包含SEQ ID NO:195和SEQ ID NO:196中所示的氨基酸序列；或
该第二CAR的VH区和VL区分别包含SEQ ID NO:197和SEQ ID NO:198中所示的氨基酸序列。
135.权利要求128至134中任一项所述的细胞，其中该单链抗体片段是或包含单链可变片段(scFv)。
136.权利要求128至135中任一项所述的细胞，其中该第二CAR的VH区在该第二CAR的VL区的氨基末端。
137.权利要求128至135中任一项所述的细胞，其中该第二CAR的VH区在该第二CAR的VL区的羧基末端。
138.权利要求128至137中任一项所述的细胞，其中该第二CAR的抗原结合结构域包含选自SEQ ID NO:237、238、239、240和241的氨基酸序列或与选自SEQ ID NO:237、238、239、240和241的氨基酸序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。
139.权利要求128至138中任一项所述的细胞，其中该抗原结合结构域包含选自SEQ IDNO:237、238、239、240和241的氨基酸序列。
140.权利要求128至139中任一项所述的细胞，其中：
该第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:209、210和211的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:230、231和232的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；和/或
该第二CAR的VH区和VL区分别包含SEQ ID NO:197和SEQ ID NO:198中所示的氨基酸序列；和/或
该抗原结合结构域包含SEQ ID NO:241中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:241中所示的序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。
141.权利要求125至140中任一项所述的细胞，其中该第二CAR的跨膜结构域是或包含来自CD4、CD28或CD8，任选来自人CD4、人CD28或人CD8的跨膜结构域。
142.权利要求125至141中任一项所述的细胞，其中该第二CAR的细胞内信号转导区进一步包含共刺激信号转导区。
143.权利要求142所述的细胞，其中该共刺激信号转导区包含CD28、4-1BB或ICOS，或其信号转导部分，任选人CD28、人4-1BB或人ICOS的细胞内信号转导结构域。
144.权利要求142或权利要求143所述的细胞，其中该共刺激信号转导区包含4-1BB或其信号转导部分，任选人4-1BB的细胞内信号转导结构域。
145.一种组合物，其包含权利要求1至67中任一项所述的嵌合抗原受体。
146.一种组合物，其包含权利要求120至144中任一项所述的细胞或复数个权利要求120至144中任一项所述的细胞。
147.权利要求143所述的组合物，其中该组合物包含CD4+和CD8+T细胞，且CD4+T细胞与CD8+T细胞的比率为约1:3至3:1，任选为约1:2至2:1。
148.一种组合物，其包含：
复数个包含第一嵌合抗原受体的第一细胞，该第一嵌合抗原受体是权利要求1至67中任一项所述的嵌合抗原受体或由权利要求68至79中任一项所述的多核苷酸编码；和
复数个包含第二嵌合抗原受体的第二细胞。
149.权利要求148所述的组合物，其中该第二嵌合受体包含特异性结合多发性骨髓瘤上表达或与多发性骨髓瘤相关的第二抗原的细胞外抗原结合结构域。
150.权利要求148或权利要求49所述的组合物，其中该第二CAR含有结合第二抗原的细胞外抗原结合结构域、间隔子、跨膜结构域和细胞内信号转导区。
151.权利要求149或权利要求150所述的组合物，其中该第二抗原选自B细胞成熟抗原(BCMA)、CD38、CD138、CS-1、BAFF-R、TACI和FcRH5。
152.权利要求149至151中任一项所述的组合物，其中该第二抗原是BCMA。
153.权利要求148至152中任一项所述的组合物，其中该第二CAR包含：
(1)特异性结合BCMA的细胞外抗原结合结构域，其中该细胞外抗原结合结构域包含：
(i)重链可变(VH)区，其包含与SEQ ID NO:189、191、193、195或197中所示的氨基酸序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列；和
(ii)轻链可变(VL)区，其包含与SEQ ID NO:190、192、194、196或198中所示的氨基酸序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列；
(2)间隔子，任选为包含IgG4/2嵌合铰链或经修饰的IgG4铰链；IgG2/4嵌合CH2区；和IgG4 CH3区的间隔子，任选地其长度为约228个氨基酸，或SEQ ID NO:17中所示的间隔子；
(3)跨膜结构域；和
(4)细胞内信号转导区。
154.权利要求153所述的组合物，其中该第二CAR的VH区包含SEQ ID NO:189、191、193、195或197中所示的VH区氨基酸序列内所包含的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；且该VL区包含SEQID NO:190、192、194、196或198中所示的VL区氨基酸序列内所包含的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
155.权利要求148至152中任一项所述的组合物，其中该第二CAR包含：
(1)特异性结合BCMA的细胞外抗原结合结构域，其中该细胞外抗原结合结构域包含：
(i)重链可变(VH)区，其包括含SEQ ID NO:199、202、206、或209中所示的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR-H1)；(b)含SEQ ID NO:200、203、207、或210中所示的氨基酸序列的重链互补决定区2(CDR-H2)；和(c)含SEQ ID NO:201、204、205、208、或211中所示的氨基酸序列的重链互补决定区3(CDR-H3)；和
(ii)轻链可变(VL)区，其包括含SEQ ID NO:218、221、224、227、或230中所示的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR-L1)；(b)含SEQ ID NO:219、222、225、228、或231中所示的氨基酸序列的轻链互补决定区2(CDR-L2)；和(c)含SEQ ID NO:220、223、或226中所示的氨基酸序列的轻链互补决定区3(CDR-L3)；
(2)间隔子，任选为包含IgG4/2嵌合铰链或经修饰的IgG4铰链；IgG2/4嵌合CH2区；和IgG4 CH3区的间隔子，任选地其长度为约228个氨基酸，或SEQ ID NO:17中所示的间隔子；
(3)跨膜结构域；和
(4)细胞内信号转导区。
156.权利要求153至155中任一项所述的组合物，其中：
该第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:199、200和201的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:218、219和220的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；
该第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:202、203、204的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:221、222和223的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；
该第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:199、200、205的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:224、225和226的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；
该第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:206、207、208的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:227、228和229的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；或
该第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:209、210和211的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:230、231和232的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
157.权利要求153至156中任一项所述的组合物，其中：
该第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:209、210和211的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:230、231和232的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
158.权利要求153至157中任一项所述的组合物，其中：
该第二CAR的VH区和VL区包含(a)分别如SEQ ID NO:189和SEQ ID NO:190中所示的氨基酸序列，或(b)与SEQ ID NO:189具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列和与SEQID NO:190具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列；
该第二CAR的VH区和VL区包含(a)分别如SEQ ID NO:191和SEQ ID NO:192中所示的氨基酸序列，或(b)与SEQ ID NO:191具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列和与SEQID NO:192具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列；
该第二CAR的VH区和VL区包含(a)分别如SEQ ID NO:193和SEQ ID NO:194中所示的氨基酸序列，或(b)与SEQ ID NO:193具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列和与SEQID NO:194具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列；
该第二CAR的VH区和VL区包含(a)分别如SEQ ID NO:195和SEQ ID NO:196中所示的氨基酸序列，或(b)与SEQ ID NO:195具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列和与SEQID NO:196具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列；或
该第二CAR的VH区和VL区包含(a)分别如SEQ ID NO:197和SEQ ID NO:198中所示的氨基酸序列，或(b)与SEQ ID NO:197具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列和与SEQID NO:198具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。
159.权利要求153至158中任一项所述的组合物，其中：
该第二CAR的VH区和VL区分别包含SEQ ID NO:189和SEQ ID NO:190中所示的氨基酸序列；
该第二CAR的VH区和VL区包含SEQ ID NO:191和SEQ ID NO:192中所示的氨基酸序列；
该第二CAR的VH区和VL区包含SEQ ID NO:193和SEQ ID NO:194中所示的氨基酸序列；
该第二CAR的VH区和VL区包含SEQ ID NO:195和SEQ ID NO:196中所示的氨基酸序列；或
该第二CAR的VH区和VL区分别包含SEQ ID NO:197和SEQ ID NO:198中所示的氨基酸序列。
160.权利要求153至159中任一项所述的组合物，其中该第二CAR的VH区在该第二CAR的VL区的氨基末端。
161.权利要求153至159中任一项所述的组合物，其中该第二CAR的VH区在该第二CAR的VL区的羧基末端。
162.权利要求153至161中任一项所述的组合物，其中该第二CAR的抗原结合结构域包含选自SEQ ID NO:237、238、239、240和241的氨基酸序列或与选自SEQ ID NO:237、238、239、240和241的氨基酸序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。
163.权利要求153至162中任一项所述的组合物，其中该第二CAR的抗原结合结构域包含选自SEQ ID NO:237、238、239、240和241的氨基酸序列。
164.权利要求153至163中任一项所述的组合物，其中：
该第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:209、210和211的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:230、231和232的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；和/或
该第二CAR的VH区和VL区分别包含SEQ ID NO:197和SEQ ID NO:198中所示的氨基酸序列；和/或
该抗原结合结构域包含SEQ ID NO:241中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:241中所示的序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。
165.权利要求150至164中任一项所述的组合物，其中该第二CAR的跨膜结构域是或包含来自CD4、CD28或CD8，任选为来自人CD4、人CD28或人CD8的跨膜结构域。
166.权利要求150至165中任一项所述的组合物，其中：
该第二CAR的跨膜结构域是或包含来自人CD28的跨膜结构域；和/或
该第二CAR的跨膜结构域是或包含SEQ ID NO:18中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:18具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。
167.权利要求150至166中任一项所述的组合物，其中该细胞内信号转导区含有细胞内细胞质信号转导结构域，其中该细胞内信号转导结构域能够在T细胞中诱导初级活化信号，是T细胞受体(TCR)组分和/或含有免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)。
168.权利要求167所述的组合物，其中该细胞内信号转导结构域是或包含CD3-zeta(CD3ζ)链或其功能变体或信号转导部分、任选为人CD3ζ链的细胞质信号转导结构域。
169.权利要求150至168中任一项所述的组合物，其中该第二CAR的细胞内信号转导区进一步包含共刺激信号转导区。
170.权利要求169所述的组合物，其中该第二CAR的共刺激信号转导区包含CD28、4-1BB或ICOS，或其信号转导部分，任选人CD28、人4-1BB或人ICOS的细胞内信号转导结构域。
171.权利要求148至170中任一项所述的组合物，其中该第一嵌合抗原受体和该第二嵌合抗原受体中的至少一个包含细胞内信号转导区，该细胞内信号转导区包含4-1BB或其信号转导部分、任选为人4-1BB的细胞内信号转导结构域。
172.权利要求169至171中任一项所述的组合物，其中该第二CAR的共刺激信号转导区包含4-1BB或其信号转导部分、任选为人4-1BB的细胞内信号转导结构域。
173.权利要求148至172中任一项所述的组合物，其中该复数个第一细胞包含T细胞，任选其中这些T细胞包含CD4+和CD8+T细胞，任选其中CD4+T细胞与CD8+T细胞的比率为约1:3至3:1，任选为1:2至2:1。
174.权利要求148至173中任一项所述的组合物，其中该复数个第二细胞包含T细胞，任选其中这些T细胞包含CD4+和CD8+T细胞，任选其中CD4+T细胞与CD8+T细胞的比率为约1:3至3:1，任选为约1:2至2:1。
175.权利要求148至174中任一项所述的组合物，其中该组合物中包含的该第一复数个细胞与该第二复数个细胞的比率为约1:3至3:1，任选为约1:2至2:1，任选为约1:1。
176.权利要求148至175中任一项所述的组合物，其中该组合物中包含表达该第一嵌合抗原受体的该第一复数个细胞和表达该第二嵌合抗原受体的该第二复数个细胞，该第一复数个细胞与该第二复数个细胞的比率为约1:3至3:1，任选为约1:2至2:1，任选为约1:1。
177.权利要求145至176中任一项所述的药物组合物，其用于治疗患有疾病或病况的受试者，任选其中该疾病或病况是癌症。
178.一种药物组合物，其用于治疗疾病或病况，任选为癌症，所述药物组合物包含权利要求120至144中任一项所述的细胞作为活性成分。
179.一种药物组合物，其用于治疗疾病或病况，任选为癌症，所述药物组合物包含权利要求145-176、233或234中任一项所述的组合物作为活性成分。
180.一种药物组合物，其用于治疗疾病或病况，任选为癌症，所述药物组合物包含以下组合物作为活性成分：包括第一剂量的包含为权利要求1-67中任一项所述的嵌合抗原受体或由权利要求68-79中任一项所述的多核苷酸编码的第一嵌合抗原受体的复数个第一细胞的组合物，和包括第二剂量的复数个包含第二嵌合抗原受体的第二细胞的组合物。
181.一种治疗方法，其包含向患有疾病或病症的受试者给予包含一定剂量的权利要求120至144中任一项所述的细胞的组合物或权利要求145至180、233或234中任一项所述的组合物。
182.权利要求120至144中任一项所述的细胞用于治疗疾病或病况的用途，任选地其中所述疾病或病况是癌症。
183.权利要求145至180、233或234中任一项所述的组合物用于治疗疾病或病况的用途，任选地其中所述疾病或病况是癌症。
184.权利要求120至144中任一项所述的细胞在制备用于治疗疾病或病况的药物中的用途，任选地其中所述疾病或病况是癌症。
185.权利要求145至180、233或234中任一项所述的组合物在制备用于治疗疾病或病况的药物中的用途，任选地其中所述疾病或病况是癌症。
186.权利要求181至185中任一项所述的方法或权利要求177至180中任一项所述的用于所述用途的药物组合物，其中该细胞剂量包含在约1.0×107个表达CAR的T细胞与1.2×109个表达CAR的T细胞之间、在约1.0×107个表达CAR的T细胞与6.5×108个表达CAR的T细胞之间、在约1.5×107个表达CAR的T细胞与6.5×108个表达CAR的T细胞之间、在约1.5×107个表达CAR的T细胞与6.0×108个表达CAR的T细胞之间、在约2.5×107个表达CAR的T细胞与6.0×108个表达CAR的T细胞之间、在约5.0×107个表达CAR的T细胞与6.0×108个表达CAR的T细胞之间、在约1.25×107个表达CAR的T细胞与1.2×109个表达CAR的T细胞之间、在约1.5×107个表达CAR的T细胞与1.2×109个表达CAR的T细胞之间、在约5.0×107个表达CAR的T细胞与4.5×108个表达CAR的T细胞之间、或在约1.5×108个表达CAR的T细胞与3.0×108个表达CAR的T细胞之间，各自包括端点在内。
187.权利要求181至186中任一项所述的方法或权利要求177至180中任一项所述的用于所述用途的药物组合物，其中该细胞剂量包含在或包含约1.5×107个表达CAR的T细胞、包含在或包含约2.5×107个表达CAR的T细胞、包含在或包含约5.0×107个表达CAR的T细胞、包含在或包含约7.5×107个表达CAR的T细胞、包含在或包含约1.5×108个表达CAR的T细胞、包含在或包含约2.25×108个表达CAR的T细胞、包含在或包含约3.0×108个表达CAR的T细胞、包含在或包含约4.5×108个表达CAR的T细胞、包含在或包含约6.0×108个表达CAR的T细胞、包含在或包含约8.0×108个表达CAR的T细胞、包含在或包含约1.2×109个表达CAR的T细胞。
188.一种治疗方法，其包含：
向患有疾病或病症的受试者给予包含第一剂量的复数个第一细胞的组合物，该复数个第一细胞包含第一嵌合抗原受体，该第一嵌合抗原受体是权利要求1至67中任一项所述的嵌合抗原受体或由权利要求68至79中任一项所述的多核苷酸编码；和
向该受试者给予包含第二剂量的复数个第二细胞的组合物，该复数个第二细胞包含第二嵌合抗原受体。
189.包括第一剂量的包含为权利要求1-67中任一项所述的嵌合抗原受体或由权利要求68-79中任一项所述的多核苷酸编码的第一嵌合抗原受体的复数个第一细胞的组合物、和包括第二剂量的复数个包含第二嵌合抗原受体的第二细胞的组合物用于治疗疾病或病况的用途，任选地其中所述疾病或病况是癌症。
190.包括第一剂量的包含为权利要求1-67中任一项所述的嵌合抗原受体或由权利要求68-79中任一项所述的多核苷酸编码的第一嵌合抗原受体的复数个第一细胞的组合物、和包括第二剂量的复数个包含第二嵌合抗原受体的第二细胞的组合物在制备用于治疗疾病或病况的药物中的用途，任选地其中所述疾病或病况是癌症。
191.权利要求188至190中任一项所述的方法，其中该复数个第一细胞的第一剂量和该复数个第二细胞的第二剂量独立地包含在或在约1.0×107个表达CAR的T细胞与或与约1.5×109个表达CAR的T细胞之间、在或在约1.0×107个表达CAR的T细胞与或与约6.5×108个表达CAR的T细胞之间、在或在约1.25×107个表达CAR的T细胞与或与约0.6×108个表达CAR的T细胞之间、在或在约1.5×107个表达CAR的T细胞与或与约6.5×108个表达CAR的T细胞之间、在或在约1.5×107个表达CAR的T细胞与或与约6.0×108个表达CAR的T细胞之间、在或在约2.5×107个表达CAR的T细胞与或与约2.25×108个表达CAR的T细胞之间、在或在约2.5×107个表达CAR的T细胞与或与约6.0×108个表达CAR的T细胞之间、在或在约5.0×107个表达CAR的T细胞与或与约6.0×108个表达CAR的T细胞之间、在或在约7.5×107个表达CAR的T细胞与或与约1.5×108个表达CAR的T细胞之间、在或在约2.5×107个表达CAR的T细胞与或与约1.2×109个表达CAR的T细胞之间、在或在约5.0×107个表达CAR的T细胞与或与约4.5×108个表达CAR的T细胞之间，或在或在约1.5×108个表达CAR的T细胞与或与约3.0×108个表达CAR的T细胞之间，各自包括端点在内。
192.权利要求188至190中任一项所述的方法或用途或权利要求180所述的用于所述用途的药物组合物，其中该第二嵌合受体包含特异性结合多发性骨髓瘤上表达或与多发性骨髓瘤相关的第二抗原的细胞外抗原结合结构域。
193.权利要求192所述的方法，其中该第二抗原选自B细胞成熟抗原(BCMA)、CD38、CD138、CS-1、BAFF-R、TACI和FcRH5。
194.权利要求188至193中任一项所述的方法或用途或用于所述用途的药物组合物，其中该第二抗原是BCMA。
195.权利要求188至194中任一项所述的方法或用途或用于所述用途的药物组合物，其中该第二CAR包含：
(1)特异性结合BCMA的细胞外抗原结合结构域，其中该细胞外抗原结合结构域包含：
(i)重链可变(VH)区，其包含与SEQ ID NO:189、191、193、195或197中所示的氨基酸序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列；和
(ii)轻链可变(VL)区，其包含与SEQ ID NO:190、192、194、196或198中所示的氨基酸序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列；
(2)间隔子，任选为包含IgG4/2嵌合铰链或经修饰的IgG4铰链；IgG2/4嵌合CH2区；和IgG4 CH3区的间隔子，任选地其长度为约228个氨基酸，或SEQ ID NO:17中所示的间隔子；
(3)跨膜结构域；和
(4)细胞内信号转导区。
196.权利要求195所述的方法或用途或用于所述用途的药物组合物，其中该第二CAR的VH区包含SEQ ID NO:189、191、193、195或197中所示的VH区氨基酸序列内所包含的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；且该VL区包含SEQ ID NO:190、192、194、196或198中所示的VL区氨基酸序列内所包含的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
197.权利要求188至196中任一项所述的方法或用途或用于所述用途的药物组合物，其中该第二CAR包含：
(1)特异性结合BCMA的细胞外抗原结合结构域，其中该细胞外抗原结合结构域包含：
(i)重链可变(VH)区，其包括含选自SEQ ID NO:199、202、206、和209的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR-H1)；(b)含选自SEQ ID NO:200、203、207、和210的氨基酸序列的重链互补决定区2(CDR-H2)；和(c)含选自SEQ ID NO:201、204、205、208、和211的氨基酸序列的重链互补决定区3(CDR-H3)；和
(ii)轻链可变(VL)区，其包括含选自SEQ ID NO:218、221、224、227、和230的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR-L1)；(b)含选自SEQ ID NO:219、222、225、228、和231、234的氨基酸序列的轻链互补决定区2(CDR-L2)；和(c)含选自SEQ ID NO:220、223、和226的氨基酸序列的轻链互补决定区3(CDR-L3)；
(2)间隔子，任选为包含IgG4/2嵌合铰链或经修饰的IgG4铰链；IgG2/4嵌合CH2区；和IgG4 CH3区的间隔子，任选地其长度为约228个氨基酸，或SEQ ID NO:17中所示的间隔子；
(3)跨膜结构域；和
(4)细胞内信号转导区。
198.权利要求195至197中任一项所述的方法或用途或用于所述用途的药物组合物，其中：
该第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:199、200和201的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:218、219和220的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；
该第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:202、203、204的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:221、222和223的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；
该第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:199、200、205的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:224、225和226的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；
该第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:206、207、208的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:227、228和229的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；或
该第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:209、210和211的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:230、231和232的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
199.权利要求195至198中任一项所述的方法或用途或用于所述用途的药物组合物，其中：
该第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:209、210和211的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:230、231和232的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
200.权利要求195至199中任一项所述的方法或用途或用于所述用途的药物组合物，其中：
该第二CAR的VH区和VL区包含(a)分别如SEQ ID NO:189和SEQ ID NO:190中所示的氨基酸序列，或(b)与SEQ ID NO:189具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列和与SEQID NO:190具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列；
该第二CAR的VH区和VL区包含(a)分别如SEQ ID NO:191和SEQ ID NO:192中所示的氨基酸序列，或(b)与SEQ ID NO:191具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列和与SEQID NO:192具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列；
该第二CAR的VH区和VL区包含(a)分别如SEQ ID NO:193和SEQ ID NO:194中所示的氨基酸序列，或(b)与SEQ ID NO:193具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列和与SEQID NO:194具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列；
该第二CAR的VH区和VL区包含(a)分别如SEQ ID NO:195和SEQ ID NO:196中所示的氨基酸序列，或(b)与SEQ ID NO:195具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列和与SEQID NO:196具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列；或
该第二CAR的VH区和VL区包含(a)分别如SEQ ID NO:197和SEQ ID NO:198中所示的氨基酸序列，或(b)与SEQ ID NO:197和SEQ ID NO:198具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。
201.权利要求195至200中任一项所述的方法或用途或用于所述用途的药物组合物，其中：
该第二CAR的VH区和VL区分别包含SEQ ID NO:189和SEQ ID NO:190中所示的氨基酸序列；
该第二CAR的VH区和VL区包含SEQ ID NO:191和SEQ ID NO:192中所示的氨基酸序列；
该第二CAR的VH区和VL区包含SEQ ID NO:193和SEQ ID NO:194中所示的氨基酸序列；
该第二CAR的VH区和VL区包含SEQ ID NO:195和SEQ ID NO:196中所示的氨基酸序列；或
该第二CAR的VH区和VL区分别包含SEQ ID NO:197和SEQ ID NO:198中所示的氨基酸序列。
202.权利要求195至201中任一项所述的方法或用途或用于所述用途的药物组合物，其中该第二CAR的VH区在该VL区的羧基末端。
203.权利要求195至202中任一项所述的方法或用途或用于所述用途的药物组合物，其中该第二CAR的抗原结合结构域包含选自SEQ ID NO:237、238、239、240和241的氨基酸序列或与选自SEQ ID NO:237、238、239、240和241的氨基酸序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。
204.权利要求195至203中任一项所述的方法或用途或用于所述用途的药物组合物，其中该第二CAR的抗原结合结构域包含选自SEQ ID NO:237、238、239、240和241的氨基酸序列。
205.权利要求195至204中任一项所述的方法或用途或用于所述用途的药物组合物，其中：
该第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:209、210和211的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:230、231和232的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；和/或
该第二CAR的VH区和VL区分别包含SEQ ID NO:197和SEQ ID NO:198中所示的氨基酸序列；和/或
该第二CAR的抗原结合结构域包含SEQ ID NO:241中所示的氨基酸序列或与SEQ IDNO:241中所示的序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。
206.权利要求188至205中任一项所述的方法或用途或用于所述用途的药物组合物，其中该第一嵌合抗原受体和该第二嵌合抗原受体中的至少一种包括含4-1BB或其信号转导部分、任选为人4-1BB的细胞内信号转导结构域的细胞内信号转导区。
207.权利要求195至206中任一项所述的方法或用途或用于所述用途的药物组合物，其中该第二CAR的跨膜结构域是或包含来自CD4、CD28或CD8、任选为来自人CD4、人CD38或人CD8的跨膜结构域。
208.权利要求195至207中任一项所述的方法或用途或用于所述用途的药物组合物，其中：
该第二CAR的跨膜结构域是或包含来自人CD28的跨膜结构域；和/或
该第二CAR的跨膜结构域是或包含SEQ ID NO:18中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:18具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。
209.权利要求195至208中任一项所述的方法或用途或用于所述用途的药物组合物，其中该第二CAR的细胞内信号转导区包含细胞内信号转导结构域。
210.权利要求209所述的方法或用途或用于所述用途的药物组合物，其中该第二CAR的细胞内信号转导结构域是或包含CD3-zeta(CD3ζ)链或其功能变体或信号转导部分、任选为人CD3ζ链的细胞质信号转导结构域。
211.权利要求209或210所述的方法或用途或用于所述用途的药物组合物，其中该第二CAR的细胞内信号转导区包含SEQ ID NO:20中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:20具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。
212.权利要求209至211中任一项所述的方法或用途或用于所述用途的药物组合物，其中该第二CAR的细胞内信号转导区进一步包含共刺激信号转导区。
213.权利要求212所述的方法或用途或用于所述用途的药物组合物，其中该第二CAR的共刺激信号转导区包含CD28、4-1BB或ICOS，或其信号转导部分，任选人CD28、人4-1BB或人ICOS的细胞内信号转导结构域。
214.权利要求212或权利要求213所述的方法或用途或用于所述用途的药物组合物，其中该第二CAR的共刺激信号转导区包含4-1BB或其信号转导部分、任选为人4-1BB的细胞内信号转导结构域。
215.权利要求212或权利要求213所述的方法或用途或用于所述用途的药物组合物，其中该第二CAR的共刺激信号转导区包含：
人CD28的细胞内信号转导结构域；和/或
SEQ ID NO:46中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:46中所示的序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。
216.权利要求212至214中任一项所述的方法或用途或用于所述用途的药物组合物，其中该第二CAR的共刺激信号转导区包含：
人4-1BB的细胞内信号转导结构域；和/或
SEQ ID NO:19中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:19中所示的序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。
217.权利要求181至216中任一项所述的方法或用途或用于所述用途的药物组合物，其中该疾病或病症与GPRC5D的表达相关。
218.权利要求217所述的方法或用途或用于所述用途的药物组合物，其中该疾病或病症进一步与B细胞成熟抗原(BCMA)的表达相关。
219.权利要求181至218中任一项所述的方法或用途或用于所述用途的药物组合物，其中该疾病或病症是B细胞相关病症。
220.权利要求181至219中任一项所述的方法或用途或用于所述用途的药物组合物，其中与BCMA相关的该疾病或病症是自体免疫性疾病或病症。
221.权利要求220所述的方法或用途或用于所述用途的药物组合物，其中该自体免疫性疾病或病症是全身性红斑性狼疮症(SLE)、狼疮性肾炎、发炎性肠病、类风湿性关节炎、ANCA相关血管炎、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、自体免疫性血小板减少症、却格司氏病(Chagas'disease)、格雷夫氏病(Grave's disease)、韦格纳氏肉芽肿病(Wegener's granulomatosis)、结节性多动脉炎、休格连氏症候群(Sjogren's syndrome)、寻常性天疱疮、硬皮病、多发性硬化、牛皮癣、IgA肾病变、IgM多发性神经病、血管炎、糖尿病、雷诺氏症候群(Reynaud's syndrome)、抗磷脂症候群、古巴士德氏病(Goodpasture's disease)、川崎病(Kawasaki disease)、自体免疫性溶血性贫血、重症肌无力或进行性丝球体肾炎。
222.权利要求181至221中任一项所述的方法或用途或用于所述用途的药物组合物，其中该疾病或病症是癌症。
223.权利要求222所述的方法或用途或用于所述用途的药物组合物，其中该癌症是表达GPRC5D的癌症。
224.权利要求222或权利要求223所述的方法或用途或用于所述用途的药物组合物，其中该癌症是浆细胞恶性病，且该浆细胞恶性病是多发性骨髓瘤(MM)或浆细胞瘤。
225.权利要求222至224中任一项所述的方法或用途或用于所述用途的药物组合物，其中该癌症是多发性骨髓瘤(MM)。
226.权利要求225所述的方法或用途或用于所述用途的药物组合物，其中该癌症是复发性/难治性多发性骨髓瘤。
227.权利要求181至226中任一项所述的方法或用途或用于所述用途的药物组合物，其中：
在给予BCMA靶向疗法后、任选在给予包含特异性结合BCMA的CAR的T细胞后，受试者是难治疗的或已经复发；或
该方法包括选择在给予BCMA靶向疗法后、任选在给予包含特异性结合BCMA的CAR的T细胞后难治疗或已经复发的受试者进行治疗。
228.权利要求181至187和191至227中任一项所述的方法或用途或用于所述用途的药物组合物，其中在给予该剂量的细胞之前，该受试者已预先接受用于治疗该疾病或病症的BCMA靶向疗法的给予。
229.权利要求188至228中任一项所述的方法或用途或用于所述用途的药物组合物，其中在给予该第一剂量的细胞和该第二剂量的细胞之前，该受试者已预先接受用于治疗该疾病或病症的BCMA靶向疗法的给予。
230.权利要求228或权利要求229所述的方法或用途或用于所述用途的药物组合物，其中该BCMA靶向疗法包括含T细胞的组合物，这些T细胞包含特异性结合BCMA的CAR。
231.权利要求228至230中任一项所述的方法或用途或用于所述用途的药物组合物，其中在给予BCMA靶向疗法后、任选在给予包含特异性结合BCMA的CAR的T细胞后，该受试者是难治疗的或已经复发。
232.权利要求181至231中任一项所述的方法或用途或用于所述用途的药物组合物，其中该受试者包含在先前给予之后展现BCMA抗原或抗原决定簇损失、BCMA下调和/或BCMA阴性肿瘤细胞的多发性骨髓瘤细胞。
233.权利要求146或权利要求147所述的组合物，其中该组合物包含复数个细胞，其中这些细胞的至少一部分包含特异性结合GPRC5D的第一CAR，这些细胞的一部分包含特异性结合在多发性骨髓瘤上表达或与多发性骨髓瘤相关的第二抗原的第二CAR，任选其中该第二抗原是BCMA，且这些细胞的一部分包含该第一CAR和该第二CAR两者。
234.权利要求233所述的组合物，其中表达该第一CAR的细胞与表达该第二CAR的细胞的比率为自或自约1:3至3:1，任选为1:2至2:1，任选是或是约1:1。
235.一种组合，其包含：
复数个包含第一嵌合抗原受体的第一细胞，该第一嵌合抗原受体是权利要求1至67中任一项所述的嵌合抗原受体和/或由权利要求68至79中任一项所述的多核苷酸编码；和
复数个包含第二嵌合抗原受体的第二细胞。
236.权利要求235所述的组合，其中该第二嵌合受体包含特异性结合多发性骨髓瘤上表达或与多发性骨髓瘤相关的第二抗原的细胞外抗原结合结构域。
237.权利要求236所述的组合，其中该第二抗原选自由B细胞成熟抗原(BCMA)、CD38、CD138、CS-1、BAFF-R、TACI和FcRH5组成的群组。
238.权利要求236或权利要求237所述的组合，其中该第二抗原是BCMA。
239.权利要求235至238中任一项所述的组合，其中该第二CAR包含：
(1)特异性结合BCMA的细胞外抗原结合结构域，其中该细胞外抗原结合结构域包含：
(i)重链可变(VH)区，其包含与SEQ ID NO:189、191、193、195或197中所示的氨基酸序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列；和
(ii)轻链可变(VL)区，其包含与SEQ ID NO:190、192、194、196或198中的任一个中所示的氨基酸序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列；
(2)间隔子，任选为包含IgG4/2嵌合铰链或经修饰的IgG4铰链；IgG2/4嵌合CH2区；和IgG4 CH3区的间隔子，任选地其长度为约228个氨基酸，和/或SEQ ID NO:17中所示的间隔子；
(3)跨膜结构域；和
(4)细胞内信号转导区。
240.权利要求239所述的组合，其中该VH区包含SEQ ID NO:189、191、193、195或197中所示的VH区氨基酸序列内所包含的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；且该VL区包含SEQ ID NO:190、192、194、196或198中所示的VL区氨基酸序列内所包含的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
241.权利要求235至240中任一项所述的组合，其中该第二CAR包含：
(1)特异性结合BCMA的细胞外抗原结合结构域，其中该细胞外抗原结合结构域包含：
(i)重链可变(VH)区，其包括含SEQ ID NO:199、202、206、或209中所示的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR-H1)；(b)含SEQ ID NO:200、203、207、或210中所示的氨基酸序列的重链互补决定区2(CDR-H2)；和(c)含SEQ ID NO:201、204、205、208、211、214或217中所示的氨基酸序列的重链互补决定区3(CDR-H3)；和
(ii)轻链可变(VL)区，其包括含SEQ ID NO:218、221、224、227、230、233或235中所示的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR-L1)；(b)含SEQ ID NO:219、222、225、228、或231中所示的氨基酸序列的轻链互补决定区2(CDR-L2)；和(c)含SEQ ID NO:220、223、或226中所示的氨基酸序列的轻链互补决定区3(CDR-L3)；
(2)间隔子，任选为包含IgG4/2嵌合铰链或经修饰的IgG4铰链；IgG2/4嵌合CH2区；和IgG4 CH3区的间隔子，任选地其长度为约228个氨基酸，和/或SEQ ID NO:17中所示的间隔子；
(3)跨膜结构域；和
(4)细胞内信号转导区。
242.权利要求239至241中任一项所述的组合，其中：
该第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:199、200和201的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:218、219和220的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；
该第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:202、203、204的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:221、222和223的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；
该第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:199、200、205的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:224、225和226的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；
该第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:206、207、208的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:227、228和229的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；或
该第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:209、210和211的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:230、231和232的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
243.权利要求239至242中任一项所述的组合，其中：
该第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:209、210和211的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:230、231和232的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
244.权利要求240至243中任一项所述的组合，其中：
该第二CAR的VH区和VL区包含(a)分别如SEQ ID NO:189和SEQ ID NO:190中所示的氨基酸序列，或(b)与SEQ ID NO:189具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、至少或至少约99％、或至少或至少约100％序列一致性的氨基酸序列和与SEQ ID NO:190具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列；
该第二CAR的VH区和VL区包含(a)分别如SEQ ID NO:191和SEQ ID NO:192中所示的氨基酸序列，或(b)与SEQ ID NO:191具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列和与SEQID NO:192具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列；
该第二CAR的VH区和VL区包含(a)分别如SEQ ID NO:193和SEQ ID NO:194中所示的氨基酸序列，或(b)与SEQ ID NO:193具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列和与SEQID NO:194具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列；
该第二CAR的VH区和VL区包含(a)分别如SEQ ID NO:195和SEQ ID NO:196中所示的氨基酸序列，或(b)与SEQ ID NO:195具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列和与SEQID NO:196具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列；或
该第二CAR的VH区和VL区包含(a)分别如SEQ ID NO:197和SEQ ID NO:198中所示的氨基酸序列，或(b)与SEQ ID NO:197具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列和与SEQID NO:198具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。
245.权利要求239至244中任一项所述的组合，其中：
该第二CAR的VH区和VL区分别包含SEQ ID NO:189和SEQ ID NO:190中所示的氨基酸序列；
该第二CAR的VH区和VL区包含SEQ ID NO:191和SEQ ID NO:192中所示的氨基酸序列；
该第二CAR的VH区和VL区包含SEQ ID NO:193和SEQ ID NO:194中所示的氨基酸序列；
该第二CAR的VH区和VL区包含SEQ ID NO:195和SEQ ID NO:196中所示的氨基酸序列；或
该第二CAR的VH区和VL区分别包含SEQ ID NO:197和SEQ ID NO:198中所示的氨基酸序列。
246.权利要求239至245中任一项所述的组合，其中该抗原结合结构域包含SEQ ID NO:237、238、239、240或241中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:227、238、239、240或241中所示的氨基酸序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。
247.权利要求239至246中任一项所述的组合，其中该抗原结合结构域包含SEQ ID NO:237、238、239、240或241中所示的氨基酸序列。
248.权利要求239至247中任一项所述的组合，其中：
该第二CAR的VH区包括分别含SEQ ID NO:209、210和211的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且该第二CAR的VL区包括分别含SEQ ID NO:230、231和232的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；和/或
该第二CAR的VH区和VL区分别包含SEQ ID NO:197和SEQ ID NO:198中所示的氨基酸序列；和/或
该抗原结合结构域包含SEQ ID NO:241中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:241中所示的序列具有至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、或至少或至少约99％序列一致性的氨基酸序列。
249.权利要求235至248中任一项所述的组合，其中该第一嵌合抗原受体和该第二嵌合抗原受体中的至少一种包括含4-1BB或其信号转导部分、任选为人4-1BB的细胞内信号转导结构域的细胞内信号转导区。
250.一种套组，其包含权利要求235至249中任一项所述的组合和使用说明书，任选其中该说明书是关于任选根据权利要求174至216中任一项所述的方法或用途或用于所述用途的药物组合物给予一定剂量的该第一复数个细胞和该第二复数个细胞。
251.一种制品，其包含权利要求235至249中任一项所述的组合或权利要求250所述的套组。
252.权利要求251所述的制品，其包括含一定剂量的该复数个第一细胞的第一容器和含一定剂量的该复数个第二细胞的第二容器，任选其中该第一容器和该第二容器独立地为小瓶或袋子。
253.权利要求235至249中任一项所述的组合用于治疗疾病或病况的用途，任选地其中所述疾病或病况是癌症。
254.权利要求235至249中任一项所述的组合在制备用于治疗疾病或病况的药物中的用途，任选地其中所述疾病或病况是癌症。
255.一种药物组合物，其用于治疗疾病或病况、任选为癌症，所述药物组合物包含权利要求235至249中任一项所述的组合作为活性成分。
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