TW202043459A

TW202043459A - 調節萬能性幹細胞之潛能的方法及應用

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Publication number: TW202043459A
Application number: TW108147958A
Authority: TW
Inventors: 仁呂; 陳薇如
Original assignee: 中央研究院
Priority date: 2018-12-26
Filing date: 2019-12-26
Publication date: 2020-12-01
Also published as: EP3902909A1; WO2020139914A1; CN113811601A; US20220090023A1; EP3902909A4; JP2022515848A

Abstract

本發明涉及透過調節足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)的表現以調節萬能性幹細胞(PSCs)潛能的方法及其應用。

Description

調節萬能性幹細胞之潛能的方法及應用

相關申請。本案根據35 U.S.C §119主張於2018年12月26日申請的美國臨時申請案第62/784,942號之權益，其全部內容透過引用合併於本文。

本發明涉及一種透過調節足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)的表現以及膽固醇來調節萬能性幹細胞(pluripotent stem cells，PSCs)潛能的方法及其應用。

由早期胚胎的內部細胞團產生的人類胚胎幹細胞(Human embryonic stem cells，hESCs)具有無限增殖的能力，並分化為內胚層、中胚層以及外胚層，並可能分化為除胎盤以外的所有細胞類型(Thomson等人，1998年)。人類胚胎幹細胞(hESCs)的行為類似於上皮細胞，並被聲稱處於啟動狀態(Brons等人，2007年；Kumari, 2016年；Nichols與Smith，2009年；Tesar等人，2007年)。切換培養基可將啟動狀態的胚胎幹細胞(ESCs)改變為類初始狀態。初始幹細胞分化程度較低，能夠在小鼠中形成嵌合體(Chan等人，2013年；Gafni等人，2013年；Guo等人，2016年；Takashima等人，2014年；Takeda等人，2000年；Theunissen等人，2014年；Wang等人，2014年；Ware等人，2014年)。2017年發表在《細胞與自然》(Cell and Nature)上的兩篇論文聲稱透過在4至7種化學物質的存在下培養細胞獲得擴增萬能性幹細胞(extended pluripotent stem cells，EPSCs)(Yang等人，2017年a；Yang等人，2017年b)。擴增萬能性幹細胞(EPSCs)的行為類似於胚胎的2至4個細胞階段。相較於初始幹細胞，它們以更高的效率促成內部細胞團，且還可在小鼠模型中分佈於滋養外胚層(Yang等人，2017年a；Yang等人，2017年b)。

胚胎幹細胞(ESCs)在再生醫學中具有巨大的潛力，但它也引起了免疫排斥的問題。誘導型萬能性幹細胞(Induced pluripotent stem cells，iPSCs)透過Oct4、Sox2、Myc，以及Klf4 (或Oct4、Nanog、Sox2，以及Lin28)將體細胞轉變為類胚胎幹細胞(ESCs)的細胞，成為再生醫學中一種有前景的方法(Okita等人，2007年；Park等人，2008年；Takahashi等人，2007年；Wernig等人，2007年；Yu與Thomson，2008年；Zhao與Daley，2008年)。相較於胚胎幹細胞(ESCs)，誘導型萬能性幹細胞(iPSCs)具有相同的特徵，它可以無限擴散，具有萬能性，並在異位注射後形成畸胎瘤。誘導型萬能性幹細胞(iPSCs)正在進行針對黃斑部失養症、帕金森氏症以及心臟病患者的臨床試驗。

關於萬能性幹細胞(PSCs)更新，在許多論文中，已經研究了轉錄因子，例如Oct4、Sox2、Nanog、Klf4，以及c-Myc (Dunn等人，2014年；Hu等人，2009年；Jaenisch與Young, 2008年；Jiang等人，2008年；Kagey等人，2010年；Leeb等人，2010年；Silva等人，2009年；van den Berg等人，2010年；Young, 2011)。但是，跨膜蛋白尚未被詳細研究。在小鼠胚胎幹細胞(ESCs)或人類胚胎幹細胞(hESCs)中僅研究了EpCAM (Kuan等人，2017)、上皮鈣黏蛋白(E-cadherin) (Chen等人，2011)，以及C9ORF135等少數因子(Zhou等人，2017)。

TRA-1-60與TRA-1-81被廣泛使用，為未分化人類胚胎幹細胞(hESCs)的黃金標準標記(Andrews, 2011年；Muramatsu與Muramatsu, 2004年)。TRA-1-60與TRA-1-81為足糖萼蛋白(podocalyxin) (PODXL，亦稱為足糖萼蛋白類蛋白1、MEP21、PCLP1、Gp200/GCTM-2，以及血栓黏蛋白)的聚醣抗原決定位。值得注意的是，TRA-1-60可用於從部分重新編程的細胞中識別出完全重新編程的誘導型萬能性幹細胞(iPSCs)(Chan等人，2009年)。相較之下，習知的轉錄因子NANOG則不能用於標記完全重新編程的細胞(Chan等人，2009年)。PODXL在未分化狀態的人類胚胎幹細胞(hESCs)中高度表現(Brandenberger等人，2004年；Cai等人，2006年；Kang等人，2016年)。其表現量與持家基因肌動蛋白一樣高(Kang等人，2016年)。PODXL表現量高於核心轉錄因子以及OCT4、SOX2以及NANOG。抗PODXL的細胞毒性抗體可以殺死致癌的未分化胚胎幹細胞(ESCs)/誘導型萬能性幹細胞(iPSCs) (Choo等人，2008年；Kang等人，2016年；Tan等人，2009年)。

但是，膽固醇在人類萬能性幹細胞(hPSCs)中的重要性仍不明確。

在本發明中意外地發現，萬能性幹細胞(PSCs)的潛能可透過調節足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)的表現來調節。足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)對於擴增性萬能性幹細胞(EPSCs)與誘導型萬能性幹細胞(iPSCs)的重新編程極為重要。透過微陣列結果，我們發現膽固醇的生合成途徑在足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)的下游，以維持人類胚胎幹細胞(hESCs)/誘導型萬能性幹細胞(iPSCs)/擴增性萬能性幹細胞(EPSCs)的更新。相較於纖維母細胞、骨髓間質幹細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs)以及人類胚胎幹細胞(hESCs)衍生的神經幹細胞(neural stem cells，NSCs)，其為三種分化的細胞類型，胚胎幹細胞(ESCs)對膽固醇抑制劑辛伐他汀/AY9944/MβCD更為敏感。足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)-膽固醇途徑在致癌基因c-MYC與不朽化基因端粒酶(TERT)的上游。足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)以及膽固醇也調節脂質筏的形成。這些數據顯示，足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)為一種可在胚胎幹細胞(ESCs)/誘導型萬能性幹細胞(iPSCs)更新中協調從膜傳遞的膽固醇代謝的蛋白質。

因此，於一方面，本發明提供一種調節萬能性幹細胞潛能之方法，其包含將該幹細胞暴露於有效量的足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)調節劑。

於一些具體實施例中，該調節劑為足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)拮抗劑。特定而言，本文所述之足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)拮抗劑可有效下調萬能性幹細胞的潛能。

於一些具體實施例中，該足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)拮抗劑為抗足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)抗體，靶向足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)的干擾核酸，或抑制足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)的小分子。

於一些具體實施例中，該足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)拮抗劑為膽固醇合成的抑制劑。

於一些具體實施例中，該幹細胞在不含膽固醇的培養基中培養。

於一些其他具體實施例中，該調節劑為足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)激動劑。特定而言，如本文所述之足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)激動劑可有效上調萬能性幹細胞，如胚胎幹細胞(ESCs)/誘導型萬能性幹細胞(iPSCs)/擴增性萬能性幹細胞(EPSCs)的能力。

於另一方面，本發明提供一種製備分化細胞之方法，包含 (a) 使未分化的萬能性幹細胞接受適於分化的條件，以產生包含分化細胞與未分化的萬能性幹細胞的細胞群； (b) 透過將該細胞群暴露於有效量的足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)拮抗劑或膽固醇合成抑制劑以去除未分化的萬能性幹細胞；以及 (c) 可視需要地培養剩餘的分化細胞。

於一些具體實施例中，該未分化的萬能性幹細胞係選自由胚胎幹細胞(ESCs)、誘導型萬能性幹細胞(iPSCs)，以及擴增性萬能性幹細胞(EPSCs)所組成之群組。

於一些具體實施例中，該分化的細胞係選自由下列所組成之群組：成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、內皮細胞、神經元細胞、寡樹突神經膠質細胞、星狀神經膠細胞、微膠質細胞、肝細胞、心臟細胞、肺細胞、腸細胞、血球細胞、胃細胞、卵巢細胞、子宮細胞、膀胱細胞、腎細胞、眼細胞、耳細胞、口腔細胞，以及成體幹細胞(所有分化的細胞類型)。

還提供本文所述之足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)調節劑用於實施本發明之方法之用途，包括調節萬能性幹細胞之潛能的方法以及製備分化細胞之方法。還提供包含如本文所述之足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)調節劑的組合物，該足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)調節劑係用於進行本發明之方法，包括用於調節萬能性幹細胞之潛能的方法以及用於製備分化細胞之方法。

本發明還提供一種在有需要的個體中治療畸胎瘤之方法，包含對該個體施用有效量的足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)拮抗劑或膽固醇合成抑制劑。

本發明進一步提供一種上調萬能性幹細胞潛能之方法，包含誘導該幹細胞中足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)之表現。

於一些具體實施例中，透過(a)將包含編碼足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)的基因的重組核酸序列引入該幹細胞，以及(b)在允許足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)表現的條件下培養該幹細胞，以誘導足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)之表現。

於一些具體實施例中，足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)激動劑，例如，化學物質、生長因子、細胞內蛋白，可上調足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)之表現。

於一些具體實施例中，本文所述之萬能性幹細胞可為擴增性多能幹細胞(EPSCs)、胚胎幹細胞(ESCs)及/或誘導性多能幹細胞(iPSCs)。

於另一方面，本發明提供一種用於提高胚胎中的嵌合效率之方法，包含使非人類宿主的受精胚胎與人類擴增性萬能性幹細胞(hEPSCs)接觸，該人類擴增性萬能性幹細胞包含編碼足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)的重組多核苷酸，並培養與該人類擴增性多能幹細胞(hEPSCs)接觸的該宿主胚胎，其中該足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)過度表現，以形成嵌合胚胎。

於一些具體實施例中，透過將該人類擴增性萬能性幹細胞(hEPSCs)注入該宿主胚胎中而進行該接觸。

於一些具體實施例中，該宿主胚胎產自動物(如狗、貓等)、農場動物(如牛、綿羊、豬、馬等)或實驗室動物(如大鼠、小鼠、天竺鼠等)。

於一些具體實施例中，該方法進一步包含將該嵌合胚胎移植至與該非人類宿主相同物種的假性懷孕非人類雌性受體動物中，以允許產生後代，並可視需要地從該後代獲得人源化器官。

此外，於本發明中發現膽固醇可提高如皮膚細胞，例如纖維母細胞，等體細胞的重新編程效率。因此，本發明提供一種產生誘導型萬能性幹細胞(iPSCs)之方法，包含在允許一定比例的皮膚細胞去分化為誘導型萬能性幹細胞(iPSCs)的條件下培養體細胞，其中該條件包含一含有膽固醇的培養基。於一些具體實施例中，例如透過以重組核酸引入對該體細胞進行遺傳工程，以過度表現一種或多種重新編程因子，例如，OSKM，其包括Oct4、Sox2、Klf4，以及cMyc。還提供膽固醇用於處理體細胞以透過重新編程從中產生誘導型萬能性幹細胞(iPSCs)之用途。還提供一種組合物，例如，包含膽固醇與基本培養基的培養基組合物，該培養基可用於處理體細胞以透過重新編程從中產生誘導型萬能性幹細胞(iPSCs)。

於下面的描述中闡述了本發明之一或多個具體實施例的細節。透過以下幾個具體實施例的詳細描述以及所附申請專利範圍，本發明之其他特徵或優點將變得顯而易見。

除非另有定義，否則本文使用的所有技術及科學術語具有與本發明所屬領域的技術人員通常理解的相同含義。

1. 定義

如本文所用，單數形式的「一」、「一個」以及「該」包括複數指示物，除非上下文另外明確指出。因此，例如，提及「一種組成分」包括本領域技術人員已知的多個這樣的組成分及其等同物。

術語「包括(動詞)」或「包括(動名詞)」通常以包括(動詞)/包括(動名詞)的意義使用，其表示允許存在一種或多種特徵、成分，或組成分。術語「包含(動詞)」或「包含(動名詞)」涵蓋術語「包含(動詞)」或「由...組成(動名詞)」。

如本文所用，術語「約」係指與其一起使用的數字的數值的正負5%。

如本文所用，術語「萬能性幹細胞（pluripotent stem cell）」或「未分化的幹細胞（undifferentiated stem cell）」係指能夠自我更新以及多能的細胞。術語「萬能性（pluripotent）」係指細胞分化為所有細胞譜系的能力。具體而言，萬能性細胞包括可以分化為三個主要胚層的細胞：內胚層、外胚層以及中胚層。通常，未分化的萬能性幹細胞為胚胎幹細胞(ESCs)，其可以源自胚胎來源，例如，胚前、胚胎受精後第8天之前的胚。未分化的萬能性幹細胞還可以包括誘導型萬能性幹細胞(IPSCs)，其透過插入一個或多個特定基因或透過以化學物質刺激而從非多能細胞(例如體細胞)人工衍生而來。誘導型萬能性幹細胞被認為與萬能性幹細胞(例如胚胎幹細胞)相同，因為誘導型萬能性幹細胞具有兩個獨特的特徵，即自我更新能力以及萬能性。未分化的萬能性幹細胞還包括擴增性多能幹細胞(EPSCs)。胚胎注射後，擴增性多能幹細胞(EPSCs)可以分化為滋養外胚層以及內部細胞團。胚胎幹細胞(ESCs)與誘導性多能幹細胞(IPSCs)能夠形成畸胎瘤。還已知人類胚胎幹細胞(ESCs)、誘導性多能幹細胞(IPSCs)或擴增性多能幹細胞(EPSCs)表現某些細胞標記，例如Nanog、Oct4、Sox2、TRA-1-60、TRA-1-81、鹼性磷酸酶。

如本文所用，術語「潛能（potency）」通常可包括細胞分化為其他細胞類型的能力。細胞可分化成的細胞類型越多，其潛能就越高。於某些情況下，術語「潛能」通常還可包括細胞的自我更新能力及/或生長/增殖/存活能力。

如本文所用，術語「擴展的細胞潛能」係指幹細胞分化為至少一種細胞類型的能力比相應的細胞高。

如本文所用，術語「擴增性多能幹細胞(extended pluripotent stem cells, EPSCs)」係指萬能性幹細胞，其相較於衍生自其的胚胎幹細胞(ESCs)以及誘導性多能幹細胞(iPSCs)而言，具有提升的在體內產生胚外譜系的能力 (Yang等人，2017年a；Yang等人，2017年b)。擴增性多能幹細胞(EPSCs)是透過以4至7種化學藥品處理胚胎幹細胞(ESCs)/誘導性多能幹細胞(iPSCs)所產生的(Yang等人，2017a；Yang等人，2017b)。具體而言，擴增性多能幹細胞(EPSCs)模仿胚胎的兩個到四個細胞階段，並可促進內部細胞團以及滋養外胚層(胎盤)。相較於初始幹細胞，擴增性多能幹細胞(EPSCs)具有在內部細胞團中形成嵌合體的卓越能力。可以初始誘導培養基產生人類初始幹細胞(Chan等人，2013年；Gafni等人，2013年；Guo等人，2016年；Takashima等人，2014年；Takeda等人，2000年；Theunissen等人，2014年；Wang等人，2014年；Ware等人，2014年)。初始及擴增性多能幹細胞(EPSCs)均可在小鼠模型中促成嵌合現象，但不能在常規培養基中培養原始的人類胚胎幹細胞(ESCs)/誘導性多能幹細胞(iPSCs)。

如本文所用，「調節幹細胞的潛能」一詞可包括上調或下調細胞潛能的一或多個特定特徵。例如，當與未以這種方法處理的相同細胞相比時，上調幹細胞的潛能可包括透過上調方法(例如，使細胞與足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)激動劑接觸)來增強萬能性及/或促進細胞的自我更新能力/生長/增殖/存活，以及下調幹細胞的潛能可包括透過下調方法(例如，使細胞與足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)拮抗劑接觸)降低萬能性及/或抑制細胞的自我更新能力/生長/增殖/存活。

如本文所用，術語「分化」係指將萬能性幹細胞分化為富含特定形式或功能的細胞的後代的過程。分化為一個相對過程。成熟的體細胞例如成骨細胞(骨)、軟骨細胞(軟骨)、脂肪細胞(脂肪)、肝細胞(肝)、內皮細胞、神經元細胞、寡樹突神經膠質細胞、星狀神經膠細胞、微膠質細胞、肝細胞、心臟細胞、肺細胞、腸細胞、血球細胞、胃細胞、卵巢細胞、子宮細胞、膀胱細胞、腎細胞、眼細胞、耳細胞、口腔細胞、成體幹細胞(所有分化的細胞類型)可最終分化，在自發下已經喪失了分化為不同細胞類型的能力條件。

如本文所用，術語「去除」或「消除」當用於未分化的萬能性幹細胞時，係指將這些細胞與原始樣品中的其他成分或樣品中經過一或更多處理步驟後殘留的成分單離或分離。例如，其他組成分可包括其他細胞，特別是分化的細胞。目標細胞的去除或消除可包括透過施加如本文所用之化合物來殺死、抑制或耗盡樣品中的目標細胞，例如使樣品中例如分化的細胞之類的其他組成分富集。殺死目標細胞可包括引起對細胞的凋亡或細胞毒性。抑制或耗盡目標細胞可包括數量、比例、增殖或活性(多能的能力或腫瘤形成活性)減少的量為一可測量。去除可為部分去除，亦可為完全去除。如本文所用，例如，基本上不含未分化的萬能性幹細胞的樣品或培養物可包含小於約10%，約5%，小於約4%，小於約3%，小於約2%，少於約1%或無法檢測到的未分化萬能性幹細胞。

如本文所用，術語「培養物」係指與培養基一起培養的一群細胞。該細胞可繼代。細胞培養物可以是從動物組織分離後尚未繼代的原代培養物，或者可以繼代多次(一次或多次繼代培養)。

如本文所用，本文所用之術語「個體」包括人類與非人類動物，例如伴侶動物(例如狗、貓等)、農場動物(例如牛、綿羊、豬、馬等)，或實驗動物(例如大鼠、小鼠、天竺鼠等)。

如本文所用，本文所用之術語「治療」係指將包含一種或多種活性劑的組合物應用於或施用於患有疾病、該疾病的症狀或狀況，或該疾病的進展的個體，目的在於治癒、治愈、緩解、減輕、改變、補救、改善、增進或影響該疾病、該疾病的症狀或狀況、由該疾病引起的殘疾，或該疾病的進展。

如本文所用，本文所用之術語「有效量」係指在經治療的細胞或個體中賦予生物學效應的活性成分的量。該有效量可根據各種原因而改變，例如治療途徑及頻率、體重及接受該活性成分的細胞或個體的種類。

足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)是一種屬於CD34家族的細胞表面糖蛋白，由足糖萼蛋白類蛋白1基因(PODXL )編碼。具體而言，人類足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)包含SEQ ID NO: 1所示之胺基酸序列，而編碼人類PODXL的足糖萼蛋白類蛋白1基因(PODXL )包含SEQ ID NO: 2的核酸序列。

如本文所用，足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)的調節劑係指當處理細胞時可上調或下調細胞中足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)表現的試劑、物質或分子。具體而言，足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)激動劑包括一試劑、一物質或一分子，當處理細胞時，與對照細胞(未處理激動劑)相比，可上調(增強)細胞中的足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)表現量。足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)拮抗劑包括一試劑、一物質或一分子，當處理細胞時，與對照細胞(未處理拮抗劑)相比，可下調(降低)細胞中足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)表現量。

根據本發明，首次發現足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)調節劑可用於調節萬能性幹細胞的潛能。於一些具體實施例中，足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)激動劑用於上調(增強)萬能性幹細胞的潛能。於一些具體實施例中，將編碼足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)的重組核酸分子引入幹細胞中以在該些細胞中過度表現足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)，然後該些細胞表現出萬能性幹細胞的上調(增強)潛能。

在其他具體實施例中，足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)拮抗劑用於下調(降低)萬能性幹細胞的潛能。具體而言，足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)拮抗劑可為抗足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)抗體、以足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)為目標的干擾核酸，或抑制足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)的化合物。於某些特定情況下，本文所用之足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)拮抗劑為一膽固醇合成的抑制劑。

於特定的具體實施例中，本發明之方法係透過將培養物樣品暴露於有效量的足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)拮抗劑中以除去培養樣品中未分化的萬能性幹細胞。

於特定的具體實施例中，本發明之方法係製備分化的細胞，其中在適於分化的條件下培養未分化的萬能性幹細胞，以產生包含分化細胞與未分化的萬能性幹細胞的細胞群，並透過將該細胞群暴露於有效量的足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)拮抗劑或膽固醇合成抑制劑以清除/殺死該未分化的萬能性幹細胞；然後可視需要地，將剩餘的分化細胞培養於合適的條件下，例如，可容許達到供細胞療法的足夠細胞量。

於一些具體實施例中，未分化的萬能性幹細胞選自由胚胎幹細胞(ESCs)以及誘導型萬能性幹細胞(IPSCs)所組成之群組。較佳地，該萬能性幹細胞來自人類。可使用本領域已知的技術從人類胚泡細胞獲得人類胚胎幹細胞(ESCs)。可透過分離及培養合適的體細胞供體細胞，例如人類纖維母細胞或血球細胞，並使用本領域已知的技術進行基因工程，以製備人類誘導型萬能性幹細胞(IPSCs)。

於一些具體實施例中，根據本發明的適合於培養未分化的萬能性幹細胞及/或分化的細胞的培養基為本領域可獲得的，例如DMEM、MEM、DMEM/F12，或具有20%胎牛血清或IMEM的培養基，或20%敲除血清。可以在正常條件下進行培養，例如於37^o C、1-5% CO₂ 下進行。可透過添加促進對所需細胞譜系分化的培養基成分來促進分化。於某些具體實施例中，本文所用之適合的培養基是不含膽固醇的商業培養基。

於一些具體實施例中，該培養基包含DMEM/F12、AlbuMAX I、N2補充劑、非必需胺基酸(nonessential amino acids, NEAA)。

於一些具體實施例中，該培養基可包含有利於擴增性多能幹細胞(EPSCs)誘導的一種或多種生長因子及/或培養補充劑。培養補充劑的實例包括但不限於N2、B27、DMEM/F12、神經基礎培養基、GlutaMAX、非必需胺基酸、γ-巰基乙醇，以及基因敲除血清替代品、重組人類LIF、CHIR 99021、IWR-1-endo、(S)-(+)-馬來酸二甲雙茚酯、鹽酸米諾環素，以及Y-27632。

透過以一足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)拮抗劑治療，殘餘的未分化萬能性幹細胞可被選擇性地殺死並從它們的分化後代中除去，進而在除去殘餘的未分化萬能性幹細胞後，包含分化後代的樣品可用於降低腫瘤發生風險的細胞治療中。特別是，以足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)拮抗劑處理後的活的未分化萬能性幹細胞的量比對照(例如未經這種處理的相同細胞)少約10%，20%，30%，40%，50%，60 %，70%，80%或90%。更具體而言，清除已完成；亦即，在這種處理後未分化的萬能性幹細胞被完全殺死，且未檢測到殘留的未分化萬能性幹細胞。

另外，本發明還提供一種在有需要的個體中治療畸胎瘤之方法，包括對該個體施用有效量的足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)拮抗劑或膽固醇合成抑制劑。

於一些具體實施例中，足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)拮抗劑或膽固醇合成抑制劑選自由下列所組成之群組：辛伐他汀(simvastatin) [(1S,3R,7S,8S,8aR)-1,2,3,7,8,8a-六氫-3,7-二甲基-8-[2-[(2R,4R)-四氫-4-羥基-6-氧代-2H-吡喃-2-基]乙基]-1-萘基-2,2-二甲基丁酸酯]、AY9944 (反式-N,N-雙[2-氯苯基甲基]-1,4-環己烷二甲胺二鹽酸鹽)、MBCD (甲基-β-環糊精甲基-β-環糊精環麥芽七糖，甲基醚)、普拉卡汀(pracastatin)、阿托伐他汀(atorvastatin)、匹伐他汀(pitavastatin)、羅伐沙米(rovasimibe)、VULM 1457、 YM750、U 18666A、CI 976、富馬酸酯Ro 48-8071、AK 7、BMS 795311、Lalistat 1、阿托伐他汀(Atorvastatin)、瑞舒伐他汀(rosuvastatin)、氟伐他汀(fluvastatin)、洛伐他汀(Lovastatin)、SB 204990、Filipin III、GGTI 298、Torcetrapib、Orli stat、ezetimibe、阿利珠單抗(Alirocumab)、依洛尤單抗(Evolocumab)、波可西單抗 (Bococitumab)、菸酸、氨氯地平(amlodipine)。辛伐他汀

AY9944

甲基-β-環糊精

根據本發明，發現足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)的活化可增強幹細胞，特別是擴增性多能幹細胞(EPSCs)的潛能，因此可以更有效的方式製備嵌合胚胎。

於特定具體實施例中，本發明之方法係製備嵌合胚，其包括使非人類宿主的受精胚胎與包含編碼足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)的重組多核苷酸的人類擴增性多能幹細胞(EPSCs)接觸，並培養該與該人類擴增性多能幹細胞(hEPSCs)接觸的宿主胚胎，其中該足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)過度表現以形成嵌合胚。具體而言，將該人類擴增性多能幹細胞(EPSCs)注射到該宿主受精胚胎中。可將所製備的嵌合胚胎移植到與該宿主相同物種的假性懷孕的非人類雌性受體動物中，以產生後代，並可從其後代中收集一器官，然後可以針對治療之目的將該器官移植至一有需要的個體中。

本發明還提供一種足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)調節劑之用途，例如，足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)激動劑或足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)拮抗劑或組合物，例如一種用於進行本發明方法之培養基組合物，包括一種調節萬能性幹細胞潛能之方法以及一種製備分化細胞之方法。

本發明進一步提供一種產生誘導性多能幹細胞(iPSCs)之方法，包括在允許一定比例的皮膚細胞去分化為誘導性多能幹細胞(iPSCs)的條件下培養體細胞，其中該條件包含一含有膽固醇的培養基。於一些具體實施例中，例如透過引入一重組核酸以對該體細胞進行遺傳工程，以過度表現一種或多種重新編程因子，例如OSKM，其包括Oct4、Sox2、Klf4，以及cMyc。還提供膽固醇用於處理體細胞以透過重新編程從中產生誘導性多能幹細胞(iPSCs)之用途。還提供一種組合物，例如，包含膽固醇與基本培養基之培養基組合物，該培養基組合物可用於治療體細胞以透過重新編程從中產生誘導型萬能幹細胞(iPSCs)。特別是，該膽固醇以有效地將體細胞重新編程為誘導性多能幹細胞(iPSCs)的量存在於該組合物中。

透過以下實施例進一步說明本發明，提供這些實施例是為了說明而非限制。根據本發明，本領域技術人員應當理解，可以在所公開的具體實施例中進行許多改變，並且在不脫離本發明的精神及範圍的情況下仍可獲得相似或相似的結果。

實施例

除了在腫瘤轉移中具有良好特徵的功能外，跨膜糖蛋白足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL，也稱為足糖萼蛋白類蛋白1、PCLP1、MEP21、Gp200/GCTM-2，以及血栓黏蛋白)在人類萬能性幹細胞(hPSCs)中的功能尚不清楚。於本文中，我們證明了未分化的人類萬能性幹細胞(hPSCs)中足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)的敲低顯著抑制了目前阻止c-MYC與端粒酶蛋白表現的自我更新能力。值得注意的是，在敲低足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)時，誘導性多能幹細胞(iPSCs)以及擴增性多能幹細胞(EPSCs)的誘導或重新編程被嚴重阻斷。一致地，足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)的上調促進了人類萬能性幹細胞(hPSCs)的更新，增強了c-MYC與端粒酶的表現，並促進了誘導性多能幹細胞(iPSCs)/擴增性多能幹細胞(EPSCs)的形成。在微陣列分析中，足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)的過度表現會活化HMGCR表現，進而控制膽固醇的生合成。我們發現足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)還上調SREBP1/2表現。值得注意的是，人類萬能性幹細胞(hPSCs)對膽固醇抑制劑及脂質筏破壞更敏感，這會導致自我更新及生存能力受到抑制。膽固醇可以劑量依賴性完全緩解sh PODXL敲低調節的萬能性喪失。膽固醇還明顯拯救了被shRNA下調的TERT、c-MYC以及HMGCR的表現。我們的數據強調了足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)在調節膽固醇代謝以控制人類萬能性幹細胞(hPSCs)自我更新中的重要性。

1. 材料與方法

1.1 原始人類萬能性幹細胞 (hPSCs) 的培養

HUES6 (S6)細胞株是從Douglas A. Melton博士的實驗室(哈佛大學，美國，麻州，波士頓市)獲得的禮物(Cowan等人，2004年)。WA09 (H9)細胞則是由WiCells公司(美國，威士康辛州，麥迪遜市)獲得的(Thomson等人，1998年)。誘導性多能幹細胞(iPSCs)-0102與誘導性多能幹細胞(iPSCs)-0207細胞株則來自食品工業研究與發展研究所(台灣)。

對於無滋養層的實驗，將細胞培養在化學成分確定的培養基(Essential 8培養基)中。

1.2 人類擴增性多能幹細胞 (EPSCs) 的培養

將人類擴增性多能幹細胞(EPSCs)在N2B27-LCDM培養基中於37^o C、5% CO₂ 的環境下培養。400 mL的N2B27-LCDM培養基包括193 mL DMEM/F12 (Thermo Fisher Scientiﬁc公司，型號11330-032)、193 mL Neurobasal (Thermo Fisher Scientiﬁc公司，型號21103-049)、2 mL氮氣補充劑(Thermo Fisher Scientiﬁc公司，型號17502-048)、4 mL B27補品(Thermo Fisher Scientiﬁc公司，型號12587-010)、1% GlutaMAX (Thermo Fisher Scientiﬁc公司，型號35050-061)、1%非必需胺基酸(Thermo Fisher Scientiﬁc公司，型號11140-050)、0.1 mM巰基乙醇(Sigma公司，型號M3148)以及5%敲除血清替代品(Thermo Fisher Scientiﬁc公司，型號A3181502)重組人類LIF (10 ng/ml，Peprotech公司，型號300-05)、CHIR 99021 (1μM；LC實驗室，型號C-6556)，IWR-1-endo (1μM；Abmole公司，型號M2782)，(S)-(+)-馬來酸二甲茚(DiM，2μM；Tocris公司，型號1425)以及鹽酸米諾環素(MiH，2μM；Tocris公司，型號3268)、Y-27632 (2uM，LC實驗室，型號Y-5301)。人類擴增性多能幹細胞(EPSCs)在絲裂黴素C滅活的小鼠胚胎纖維母細胞(mouse embryonic ﬁbroblasts, MEF)(每平方公分3*10⁴ 個細胞)上繼代。

對於無滋養層的條件，在慢病毒轉導之前，將人類萬能性幹細胞(hPSCs)在不含5% KSR的N2B27-LCDM培養基中培養1天。

1.3 胚狀體形成

為了形成胚狀體(embryoid bodies, EBs)，將人類胚胎幹細胞(hESCs)分離，並將細胞團在不含bFGF的人類萬能性幹細胞(hPSC)培養基中繼代13天。

1.4 Alamar 藍分析與台盼藍排除法

將人類胚胎幹細胞(hESCs)以Essential 8培養基(Thermo Fisher Scientiﬁc公司，型號A1517001)於37^o C下培養5小時，該培養基含有15%的Alamar藍。透過測量波長570 nm與600 nm處的吸光度以計算活性。為了以台酚藍分析法計算細胞數，以胰蛋白酶處理細胞，並將懸浮的細胞混合0.2%台酚藍(1∶1)，並以血球細胞計數器計數。

1.5 結晶紫染色法

在室溫下，將人類胚胎幹細胞(hESCs)以4%(v/v)低聚甲醛固定10分鐘。細胞以0.1%結晶紫染色10分鐘。以PBS洗滌後，加入萃取溶液。在波長590 nm處測量吸光度。

1.6 鹼性磷酸酶活性與染色分析

透過在培養基中添加鹼性磷酸酶(ALP)基質，對硝基苯基磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate, pNPP)(Sigma公司，型號N7653)，計算鹼性磷酸酶(ALP)的活性。將培養盤於37^o C下培養少於5分鐘，然後在波長405 nm處測量吸光度。對於鹼性磷酸酶(ALP)染色，首先以PBS洗滌人類萬能性幹細胞(hPSCs)，並以4%甲醛作為固定劑。固定3分鐘後，將細胞以1X PBS洗滌，並以鹼性磷酸酶(ALP)染色劑(Sigma公司)染色。然後將細胞進一步以PBS洗滌。

1.7 慢病毒生產以及人類胚胎幹細胞 (hESCs) 轉導

如先前所述進行慢病毒生產，並進行一些修改(Huang等人，2014年)。簡而言之，接種HEK293T細胞(每10 cm培養皿750萬個)。然後使用以下質體(19.2 μg)轉染細胞。足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)、shPODXL (shPODXL＃1：TRCN0000310117，5′-ACGAGCGGCTGAAGGACAAAT-3′ (SEQ ID NO: 3)；shPODXL＃2：TRCN0000117019，5′-GTCGTCAAAGAAATCACTATT-3ˊ (SEQ ID NO: 4))的cDNA(國家RNAi核心設施，台灣台北)以及載體對照。加入15.6 μg輔助質體(pCMV-dR8.91: pMD.G = 10:1 (w/w))。24小時後，以含有1% BSA的新鮮培養基更換培養基。收集上清液，並透過0.45 µm濾膜進行過濾。針對慢病毒轉導，將細胞接種在基質膠預包覆的培養盤上，與慢病毒在8 µg/ml硫酸魚精蛋白存在下培養。

1.8 重新編程體細胞以產生人類誘導性多能幹細胞 (hiPSCs)

將人類包皮纖維母細胞(ATCC® CRL-2097™)與pRRL.PPT.SF.hOKSM.idTomato.preFRT慢病毒共感染，該慢病毒獲自Axel Schambach博士(Warlich等人，2011年)，且具有足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)過度表現或shRNA慢病毒。感染後1-3天，每天以誘導培養基(DMEM，10% FBS，250 µM丁酸鈉以及50 µg/ml抗壞血酸)更換細胞。感染後第4天，將細胞繼代至基質膠包覆的培養盤上。將細胞以誘導培養基培養6天，並以250 µM丁酸鈉以及50 µg/ml抗壞血酸換成一半的誘導培養基與一半的mTeSR1培養基(STEM CELL公司，型號85850)。在第7至16天，轉染的細胞每天以mTeSR1培養基更換。

1.9 sgRNA 設計以及次選殖

進行了MIT CRISPR設計(http://crispr.mit.edu)以設計具有較少脫靶作用的sgRNA。sgRNA設計用於以足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)基因座的5'UTR和內含子1處的序列作為目標。sgRNA1位於TSS位點的-205處。sgRNA2位於TSS位點的-58處，而sgRNA3位於TSS位點的+460處。以BbsI切割Cas9 sgRNA載體(Addgene公司，型號68463)並以凝膠純化。將包括以sgRNA序列為目標的一對寡核苷酸變性，退火並連接到Cas9 sgRNA載體中。

1.10 基因組缺失分析

將HEK293T細胞與sgRNA對(sgNRA1 + sgRNA3)與(sgRNA2 + sgRNA3)以及野生型Cas9質體共轉染。轉染3天後，收集基因組DNA。為了進行基因分型，將100 ng基因組DNA添加到25 µl PCR反應混合物(KAPA HiFi Hotstart PCR)中。

1.11 誘導型萬能性幹細胞 (iPSCs) 中的誘導性 CRISPR 株生產

在Bruce R. Conklin的實驗室(Mandegar等人，2016年)生產並獲得在AAV位點穩定整合了Doxycyline誘導型Cas9的誘導型誘導性多能幹細胞株(iPSCs) (CRISPRn Gen 1C 誘導性多能幹細胞株)。24小時後，添加有(2 µM)或沒有強力黴素的新鮮StemFlex培養基(作為溶劑對照組)，持續24小時以誘導Cas9基因表現。然後使用TransIT®-LT1轉染試劑(Mirus Bio公司，MIR 2304)將誘導性多能幹細胞株(iPSCs)與不同對的sgRNA (sgRNA1 + sgRNA3或sgRNA2 + sgRNA3)以及表現保米黴素(Blasticidin)的載體(pLAS3W-GFP-Blasticidin)共轉染。轉染24小時後，將培養基切換為E8培養基。以2.5 µg/ml保米黴素(Blasticidin)篩選細胞1天，然後在含有或不含有強力黴素的情況下每天以5 µg/ml保米黴素(Blasticidin)更換培養基。

1.12 RNA 萃取和即時定量 PCR (qRT-PCR)

總RNA以TOOLSmart RNA Extractor (Biotools公司，DPT-BD24)純化。以Super Script III系統(Invitrogen公司，型號18080051)進行反轉錄。使用KAPA SYBR FAST PCR Master Mix (KAPA Biosystems公司，型號KR0389)與ABI7900序列檢測系統進行即時定量PCR。使用delta-delta CT法對數據進行定量。針對HPRT mRNA含量對照組將樣品標準化。

1.13 西方墨點分析

全細胞蛋白萃取物自人類萬能性幹細胞(hPSCs)純化或使用具有蛋白酶抑制劑混合物(Roche公司，型號04693132001)的RIPA裂解緩衝液(1% NP40，50 mM Tris，pH 8.0、150 mM NaCl，2 mM EDTA)。透過Bio-Rad Bradford蛋白質分析法定量蛋白質濃度。將等量的蛋白質進行10% SDS-PAGE凝膠電泳，然後轉印至0.22 µm PVDF膜上(Millipore公司，型號ISEQ00010)。將轉印物在室溫下於5% BSA/TBST中阻隔1小時。將轉印物與在5% BSA/TBST中的一級抗體於4^o C下培養整夜。這些抗體包括：抗足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)(1:1000；Santa Cruz公司，型號sc-23904)，抗TRA-1-60 (1:1000，Santa Cruz公司，型號sc-21705)，抗TRA-1-81 (1: 500，Santa Cruz公司，型號sc-21706)，抗c-MYC (1:1000；Abcam公司，型號ab32072)，抗OCT4 (1:1000；Cell Signaling Technology公司)，抗KLF4 (1:1000；Abcam公司，型號ab72543)，抗TERT (1:1000；Abcam公司，型號ab183105)，抗HMGCR (1:1000；Abcam公司，型號ab174830)，抗SREBP1 (1:500；Santa Cruz公司，型號sc-13551)，抗SREBP2 (1: 1000；Abcam公司，型號ab30682)，抗Flotillin-1 (1:1000；BD Biosciences，610821)，抗CD49B (1:1000；Abcam公司，型號ab133557)，抗CD49F (1:500；Millipore，217657)，抗整合素β1 (1:500；Santa Cruz公司，型號sc-13590)，抗組蛋白3 (1:1000；Abcam公司，型號ab1791)，抗HDAC2 (1:1000，Santa Cruz公司，型號sc-81599)，抗GAPDH (1:5000；Abcam公司，型號ab9485)，抗β-微管蛋白 (1:5000；Sigma，SAB4200715)，抗β-肌動蛋白 (1:5000；Sigma，A1978)。轉印物以TBS/0.2% Tween-20洗滌3次。轉印物與特定的二級抗體反應：抗兔IgG，連接HRP的抗體(1:10000；Jackson Immuno Research公司，型號711-036-150)，抗小鼠IgG，連接HRP的抗體(1:10000；Jackson Immuno Research公司，型號711-036-152)，抗小鼠IgM，連接HRP的抗體(1:1000；Millipore公司，型號AP128P)於4^o C作用整夜。以TBS/0.2% Tween-20洗滌3次後，以ECL溶液使轉印膜顯影(Thermo Fisher Scientific公司，型號34095)。

1.14 膽固醇定量

膽固醇含量透過Amplex Red膽固醇分析(Molecular Probes公司)進行測量。樣品在反應緩衝液中稀釋，然後與Amplex Red工作溶液(1:1)(300 µM Amplex Red，2 U/ml膽固醇氧化酶，2 U/ml膽固醇酯酶，以及2 U/ml辣根過氧化物酶)反應。樣品在37^o C下反應30分鐘。在波長590 nm處檢測吸光度。使用標準膽固醇溶液計算膽固醇值，並透過Bradford蛋白質分析(Bio-Rad公司)進行蛋白質含量標準化。

1.15 流式細胞儀

人類胚胎幹細胞(hESCs)透過Accutase解離。按照製造商的說明對細胞進行染色(eBioscience公司，型號88-8005-72)。簡而言之，將細胞(5x10⁵ 個)懸浮於100 μl 1X結合緩衝液中，然後以2.5 μl Annexin V-FITC染色。於室溫下反應20分鐘後，將細胞與2.5 µl PI溶液培養10分鐘。然後將細胞以PBS稀釋並以流式細胞儀分析。

1.16 微陣列與基因本體 (Gene Ontology ， GO) 定義分析

根據GeneSpring GX 11分析已公開之數據陣列(於表2中列出)以及GFP及足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)過度表現的陣列。列出了具有超過2倍變化與低於0.5倍變化的候選基因。以DAVID程式進行基因本體(GO)定義分析。

1.17 骨髓間質幹細胞 (BMMSCs) 與神經幹細胞 (NSCs) 之培養

將人類骨髓間質幹細胞(BMMSCs)(Lonza公司)在MSC NutriStem XF培養基(內容物已定義、無異種、無血清的培養基)中培養，並在Corning CellBIND培養盤上以抑制劑處理培養3天。使用Gibco PSC神經誘導培養基(無血清培養基)將人類神經幹細胞(NSCs)與H9人類胚胎幹細胞(hESCs)進行分化7天。然後將神經幹細胞(NSCs)重新鋪在基質膠包覆的培養盤上，並與每種抑制劑一起補充3天。

1.18 以膽固醇治療

播種CRL2097細胞(第9代)並以慢病毒載體(OSKM)加上終濃度(0、0.5x、1x、2x、5x、8x)的膽固醇進行感染，膽固醇係從500x濃縮的SyntheChol® NS0補充劑(型號S5442，Sigma公司)中稀釋。病毒轉導4天後，將細胞重新鋪在基質膠包覆的6孔培養盤上，細胞數為每孔27,000個。2天後細胞附著，在重新編程過程中持續提供膽固醇。為了更好地評估膽固醇對誘導型萬能性幹細胞(iPSCs)生成的影響，將無血清的E8培養基(含有250 μM丁酸鈉，50 μg/ml維生素C)用於誘導型萬能性幹細胞(iPSCs)的生成。

1.19 統計分析

數據表示為平均值±SD/平均值±SEM。P值係使用雙尾學生氏非配對t檢驗或單因子變異數分析(One-way ANOVA)計算的，P >0.05表示數據有顯著差異。所有圖形與統計分析均使用GraphPad Prism 5軟體建立。

2. 結果

2.1 人類萬能性幹細胞 (hPSCs) 生長與萬能性需要足糖萼蛋白類蛋白 1 (PODXL)

為了研究足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)在人類早期胚胎中的表現模式，我們檢查了植入前階段足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL) mRNA的相對含量。我們使用的數據集與之前的研究不同(Kang等人，2016年)。我們還發現足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)轉錄本從單細胞階段到4個細胞階段的富集(柱狀圖，圖1A)。從8個細胞階段到囊胚，表現量適中(柱狀圖，圖1A)。足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)的表現模式顯著不同於其他幹細胞關鍵標記，例如OCT4、LIN28A、SOX2、NANOG以及KLF4，僅在8個細胞階段後才大量表現(柱狀圖，圖1A，以及數據未顯示)。有趣的是，從單細胞階段到囊胚，相較於總檢測基因，足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)、OCT4以及LIN28A屬於高表現的轉錄本(接近100%)(點，圖1A)。相反地，Sox2、Nanog以及KLF4在單細胞階段至四個細胞階段表現量低，而在8個細胞階段後大量表現至100%。由於足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)在早期胚胎中大量表現，因此足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)可能在早期發育中具有關鍵作用，特別是在單細胞至四個細胞階段。

為了揭示萬能性幹細胞(PSCs)與分化細胞中的足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)表現模式，我們分析了具有數十個陣列的全局轉錄組表現模式。分層聚類熱圖顯示，足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)轉錄本在萬能性幹細胞(PSCs)中大量表現，並在分化細胞中表現量低很多(數據未顯示)。同樣地，在蛋白質含量上，足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)表現富集在兩個未分化的人類胚胎幹細胞(hESCs)株HUES6與H9中。在萬能性間質幹細胞中表現量降低，而在纖維母細胞中表現量則低很多(圖1B)。以另一種足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)抗體TRA-1-60識別足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)上的一個糖基抗原決定位，結果一致(圖1C)。此外，透過西方墨點分析，足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)含量在擴增性萬能性幹細胞(EPSCs)與致敏狀態的人類胚胎幹細胞(hESCs)(HUES6與H9)中表現量更豐富，在分化的胚胎幹細胞(ESCs)衍生的胚胎體(EB)與纖維母細胞(CRL-2097)中顯著降低(圖1D)。因此，我們的數據顯示足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)在人類萬能性幹細胞(PSCs)中大量表現。

為檢查足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)在人類萬能性幹細胞(hPSCs)中的功能，我們使用了兩種不同的shRNA來敲低足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)。在HUES6細胞中，該細胞在兩次shRNA敲除後分化(圖1E)。相對細胞數(Alamar藍分析法與結晶紫分析法)以及幹細胞標記鹼性磷酸酶(ALP)均顯著下調(圖1E)。一致地，在H9細胞與誘導型萬能性幹細胞(iPSCs)-0207細胞中，shRNA也殲滅了胚胎幹細胞(ESCs)的更新(圖1F)。僅在慢病毒敲除3天後，表現shPODXL的人類胚胎幹細胞(hESCs)即下調了c-MYC與端粒酶(TERT)，這對於細胞擴增以及永生化極為重要(圖1G)。透過膜聯蛋白V-碘化丙啶(Propidium Iodine，PI)分析，相較於shRFP對照的人類胚胎幹細胞(hESCs)，表現shPODXL的細胞凋亡增加(圖1H)。因此，足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)敲低觸發了細胞凋亡並抑制人類萬能性幹細胞(hPSCs)的更新。

為了研究足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)在誘導型萬能性幹細胞(iPSCs)重新編程中的功能作用，將人類初代包皮纖維母細胞CRL2097與shPODXL以及四個因子(OKSM)共同感染。在轉導後的第16天計算出誘導型萬能性幹細胞(iPSCs)集落(圖1I)。相較於shRFP對照，shPODXL感染的細胞集落少很多 (圖1I)。該數據顯示足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)的下調抑制了重新編程。

在先前的數據中，足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)表現在合子中富集到胚胎中的4細胞胚胎(圖1A)。因此，我們假設足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)可能在胚胎發生的早期階段在維持幹性上具有關鍵作用。為了驗證此一假設，我們使用shPODXL來下調HUES6與H9衍生的擴增性萬能性幹細胞(EPSCs)中的足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)基因。擴增性萬能性幹細胞(EPSCs)是由Yang等人(Yang等人，2017年b)發表的化學混合物產生的。以shRNA敲除足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)後，我們發現擴增性萬能性幹細胞(EPSCs)的集落大小與集落數目均減少(圖1J)。

2.2 過度表現足糖萼蛋白類蛋白 1 (PODXL) 可恢復處理 shPODXL 所誘導的萬能性以及 c-MYC 與端粒酶表現之下降

為了排除shRNA的脫靶效應，我們在表現shPODXL的細胞中過度表現足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)。在表現shPODXL的細胞中足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)的過度表現挽救了相對細胞數及幹細胞標記物的減少(圖2A)。值得注意的是，足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)的過度表現恢復了由shPODXL表現引起的人類胚胎幹細胞(hESCs)擴展標記c-MYC與端粒酶的下調(圖2A)。因此，shPODXL誘導的表現型變化是由足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)表現的喪失所引起的。shRNAs並未產生脫靶效應。

2.3 足糖萼蛋白類蛋白 1 (PODXL) 足以進行初始狀態及擴展狀態的人類萬能性幹細胞 (hPSCs) 更新

透過西方墨點分析證明了HUES6細胞中足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)的過度表現(圖2B)。有趣的是，足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)過度表現後，相對細胞數(結晶紫分析、Alamar藍分析、台酚藍排除分析)以及幹細胞標記物(鹼性磷酸酶(ALP)活性)均增加(圖2B)。足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)還可增加c-MYC與端粒酶的表現(圖2B)。為了研究足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)在重新編程中的功能作用，將人類包皮纖維母細胞與足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)慢病毒與四個因子(OKSM)共同感染。在轉導後的第16天計算誘導型萬能性幹細胞(iPSCs)集落數目(圖2C)。值得注意的是，與GFP對照相比，足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)的過度表現可提高重新編程效率(圖2C)。該數據暗示足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)在從體細胞誘導的萬能性的建立中具有關鍵作用。

Yang等人報導了以四種化學物質從引發的胚胎幹細胞中衍生出擴增性萬能性幹細胞(EPSCs)，這四種化學物質可使細胞發育成胚胎及胚外譜系(Yang等人，2017年b)。在轉錄組譜中，這些擴增性萬能性幹細胞(EPSCs)在4細胞階段部分模擬了胚胎(Yang等人，2017年b)。因此，為了測試足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)在擴增性萬能性幹細胞(EPSCs)重新編程中的功能，我們在N2B27-LCDM培養基(衍生出擴增性萬能性幹細胞(EPSCs)的混合物)中培養了人類萬能性幹細胞(hPSCs)(Yang等人，2017年b)。在足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)過度表現後，我們發現相較於GFP對照，圓頂狀選殖株數量有所增加(圖2D)。一致地，異位足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)表現後，集落大小及集落數目顯著增加(圖2E)。相較於GFP對照，足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)過度表現使H9-擴增性萬能性幹細胞(EPSCs)中的相對細胞數增加了8.8倍，而HUES6-擴增性萬能性幹細胞(EPSCs)中的相對細胞數增加了5.6倍(圖2F)。幹細胞標記物鹼性磷酸酶(ALP)活性在H9-擴增性萬能性幹細胞(EPSCs)中也增加了8.1倍，在HUES6-擴增性萬能性幹細胞(EPSCs)中增加了2.3倍(圖2F)。這表示足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)可促進擴增性萬能性幹細胞(EPSCs)的擴展。如果我們先透過在人類胚胎幹細胞(hESCs)中過度表現足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)來檢查擴增性萬能性幹細胞(EPSCs)的啟動，然後轉移到擴增性萬能性幹細胞(EPSCs)培養基中，則相較於GFP對照組，圓頂形集落數也增加了(圖2G)。這顯示足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)可以增強擴增性萬能性幹細胞(EPSCs)形成的啟動。綜上所述，我們的數據清楚地顯示，足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)是維持始發萬能性以及擴展萬能性的起始及獲得的關鍵因素。

2.4 足糖萼蛋白類蛋白 1 (PODXL) 透過 HMGCR 與 SREBP 調節膽固醇含量及 c-MYC 含量

為了定位由足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)觸發的早期訊號，在過度表現足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL) 3天後的細胞中進行cDNA微陣列分析。透過David功能工具(Huang da等人，2009年a、b)，在上調的基因集中，膽固醇的生合成途徑顯著豐富(數據未顯示)。在下調的基因集中，富集了RNA代謝過程及形態發生的調控(數據未顯示)。我們發現38個基因被上調了兩倍以上，而26個基因被下調了兩倍以上(數據未顯示)。在上調的基因中，它包含六個與膽固醇相關的基因-3-羥基-3-甲基戊二醯輔酶A合酶1 (3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase，HMGCS1 )、7-脫氫膽固醇還原酶(7-dehydrocholesterol reductase，DHCR7 )、角鯊烯環氧酶(squalene epoxidase，SQLE )、蛋白質轉化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin 9型(protein convertase subtilisin/kexin type 9，PCSK9 )、胰島素誘導的基因1 (insulin induced gene 1，INSIG1 )、羥甲基戊二醯輔酶A還原酶(hydroxymethylglutaryl-CoA reductases，HMGCR )(變化高達1.6倍)(數據未顯示)。同時，下調的基因集包括分化相關基因-TBX3、TGFB2、ZEB2、GATA6、GATA3、FOXE1 (數據未顯示)。這一結果強烈顯示足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)可能正向調控膽固醇的生合成途徑。

為瞭解足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)如何影響膽固醇體內恆定途徑，我們進行了qRT-PCR。足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)敲低後，一些膽固醇相關基因被下調(圖3A)。對於膽固醇的合成，我們決定研究限速酶HMGCR。在shPODXL感染後，HMGCR轉錄量及蛋白質含量降低，而在足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)過度表現後，HMGCR轉錄量及蛋白質含量升高(圖3A)。另外，在過度表現shPODXL或足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)的病毒感染後，細胞總膽固醇含量成比例地下調或上調(圖3B)。這些數據顯示足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)含量影響細胞膽固醇含量。為了證明HMGCR的重要性，使用兩種不同的shRNA來敲低HMGCR。HMGCR基因敲低的細胞已分化，其外表型看起來類似於shPODXL處理(圖3C)。一致地，還觀察到shHMGCR人類胚胎幹細胞(hESCs)中相對細胞數量及幹細胞標記物表現降低(圖3C)。值得注意的是，HMGCR的下調也會降低c-MYC與TERT的表現量(圖3C)。

SREBP2為內源性膽固醇生合成的主要調節劑。它活化了多種膽固醇合成基因的表現，例如HMGCR 、HMGCS1 、甲羥戊酸激酶(mevalonate kinase，MVK )(Horton等人，2002年；Madison，2016年)。SREBP1a還可驅動所有組織中的膽固醇合成途徑(Horton等人，2002年；Madison，2016年)。HMGCR為膽固醇生合成中的限速酶。在先前報告中HMGCR的表現受SREBP2與SREBP1調控。接下來，我們要檢查足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)是否可調節SREBP2或SREBP1的表現量。在shPODXL轉導物中的SREBP1與SREBP2的mRNA含量降低(圖3A)。透過西方墨點分析，在啟動狀態的人類胚胎幹細胞(hESCs)-HUES6 (圖3D)以及HUES6衍生的擴增性萬能性幹細胞(EPSCs)(圖3D)中，足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)的下調降低了SREBP2與SREBP1的蛋白表現量。一致地，足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)的過度表現增加了SREBP1與SREBP2的蛋白含量(圖3D)。

接下來，我們檢查轉錄因子SREBP2與SREBP1是否與暗示其活性的DNA結合。顯然地，在shPODXL人類胚胎幹細胞(hESCs)中，SREBP2與SREBP1的染色質結合率均降低，顯示SREBP2與SREBP1與DNA的結合降低(圖3E)。儘管如此，足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)過度表現時，SREBP2與SERBP1的染色質結合率均增加(圖3E)。在我們之前的數據中證明，足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)為c-MYC表現所必需的(圖1H及圖3A)。在足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)敲低後，我們觀察到c-MYC含量在細胞質、可溶性核部分，以及染色質結合部分中被下調(圖3E)。足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)過度表現後，胞質液及染色質結合部分的c-MYC含量增加(圖3E)。先前的報告顯示SREBP2活化c-MYC表現以驅動前列腺癌(prostate cancer，PCa)的幹性與轉移(Li等人，2016年)。綜上所述，基於先前的報導(Li等人，2016年)(Horton等人，2002年；Madison，2016年)以及我們的發現，我們假設足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)-SREBP訊號可以調節人類萬能性幹細胞(hPSCs)中的HMGCR與c-Myc表現。

2.5 膽固醇對於人類萬能性幹細胞 (hPSCs) 的萬能性與生存極為重要

為了檢查膽固醇對萬能性的功能作用，使用膽固醇抑制劑辛伐他汀、AY9944、甲基-β-環糊精(Methyl-β-cyclodextrin，MBCD)來抑制膽固醇的生合成(圖4A)。辛伐他汀為美國食品藥物管理局(Food and Drug Administration，FDA)批准的抑制HMGCR的處方藥，已被廣泛用於治療心血管疾病(Zhou與Liao，2009年)。HMGCR為膽固醇生合成的限速酶。他汀類藥物的副作用很少，也沒有個體產生細胞毒性之副作用的報導。AY9944抑制Δ7-脫氫膽固醇還原酶(Δ7-dehydrocholesterol reductase，DHCR7)，並降低膽固醇含量(Wassila Gaoua，2000年)。甲基-β-環糊精(MBCD)直接剝奪了細胞膽固醇(Mahammad與Parmryd，2015年)(圖4A)。在我們的研究中，我們發現細胞形態在24小時內發生了變化。膽固醇抑制劑治療3天後，相對細胞數量與幹細胞標記物表現顯著降低(圖4B，數據未顯示)。此外，透過西方墨點分析，辛伐他汀下調了TERT、c-MYC、HMGCR以及足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)表現量(圖4B)。接下來，我們想知道萬能性幹細胞(PSCs)是否更依賴膽固醇途徑。因此，我們比較了三種萬能性幹細胞(PSCs)以及三種體細胞纖維母細胞中膽固醇抑制劑的敏感性。比較原代人類包皮纖維母細胞(CRL-2097)、人類包皮纖維母細胞株(BJ-5Ta)，以及胎兒肺纖維母細胞株(IMR-90)。相較於纖維母細胞CRL-2097、IMR-90以及BJ-5Ta，HUES6與H9細胞中所有三種抑制劑的IC50都低得多(表1)。辛伐他汀、AY9944、MBCD的IC50在初代纖維母細胞中分別比HUES6細胞高52倍、31倍以及2倍(表1)。人類萬能性幹細胞(hPSCs)顯示出比人類骨髓間質幹細胞(hBMMSCs)更高的敏感性，分別為163倍(辛伐他汀)、53倍(AY9944)，以及2.65倍(MBCD)(表1)。同樣地，人類萬能性幹細胞(hPSCs)還顯示出比人類神經幹細胞(hNSCs)更高的敏感性，分別為568倍(辛伐他汀)、251倍(AY9944)，以及2.44倍(MBCD)(表1)。因此，膽固醇抑制劑可用於消除未分化的人類萬能性幹細胞(hPSCs)，並保留分化的細胞。

表1 三種細胞生長抑制劑的IC50分析

	抑制劑
細胞株	辛伐他汀(µM)	AY9944 (µM)	MBCD
HUES6	0.16	0.31	1.35
H9	0.02	0.07	1.13
hBMSC	8.97	10.05	3.29
hNSC	31.25	41.69	3.02
BJ-5Ta_無血清	1.96	10.99	2.34
BJ-5Ta_有血清	4.36	15.25	3.77
CRL-2097_無血清	4.35	9.86	2.60
CRL-2097_有血清	5.44	24.81	3.86
IMR-90_無血清	5.46	8.15	2.64
IMR-90_有血清	4.13	12.62	2.81

這些結果顯示，相較於體細胞纖維母細胞，人類萬能性幹細胞(hPSCs)對膽固醇合成的抑制作用更為敏感。

為了揭示膽固醇是否為足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)的下游目標，我們首先將足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)過度表現了一天。然後分別以膽固醇抑制劑辛伐他汀、AY9944以及MBCD處理細胞。人類胚胎幹細胞(hESCs)中足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)的過度表現增強了細胞生長以及鹼性磷酸酶(ALP)活性(圖4C)。但是，辛伐他汀、AY9944以及MBCD以劑量依賴的方式抑制了自我更新的這種上調(圖4C)。該結果顯示膽固醇為足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)的下游效應物。

2.6 膽固醇可以拯救 shPODXL 外表型並提高誘導型萬能性幹細胞 (iPSCs) 重新編程效率

為了檢查膽固醇是否為足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)的主要下游，進行了膽固醇拯救實驗。出乎意料的是，膽固醇補充劑可防止形態變化，相對細胞數減少以及足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)敲除引起的鹼性磷酸酶(ALP)活性降低(圖5A)。另外，在足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)敲低六天後，透過添加膽固醇也可以基本上恢復人類萬能性幹細胞(hPSCs)的細胞凋亡(圖5B)。此外，透過在下調足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)的細胞中添加膽固醇，可以挽救c-MYC、TERT、HMGCR、足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)、TRA-1-60的表現量(圖5B)。綜上所述，這些數據顯示足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)主要透過膽固醇調節人類萬能性幹細胞(hPSCs)的更新。

此外，膽固醇可以透過OSKM四個因子提高重新編程效率(總AP陽性，7.62倍)。參見圖6。

2.7 足糖萼蛋白類蛋白 1 (PODXL) 的誘導性 CRISPR/Cas9 敲除抑制人類萬能性幹細胞 (hPSCs) 的自我更新

為了排除shRNA的脫靶，我們使用誘導性CRISPR/Cas9編輯法敲除了人類萬能性幹細胞(hPSCs)基因組中的足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)(圖7)。可誘導的誘導型萬能性幹細胞(iPSCs)株是透過將強力黴素誘導系統穩定整合到AAV基因座中而產生的(Mandegar等人，2016年)。然後，透過轉導sgRNA加上強力黴素的存在，基因組將會被切割。在我們引入了兩對sgRNA (sgRNA1 + 2)以及(sgRNA 1 + 3)之後(圖7)，我們去除了外顯子1。我們發現，相較於溶劑對照，添加多西環素3天可減少細胞集落大小並降低鹼性磷酸酶(ALP)活性(圖7)。強力黴素表現5天後，幾乎找不到細胞集落，這顯示敲除的足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)對人類萬能性幹細胞(hPSCs)的自我更新具有強烈的抑制作用(圖7)。這也表示，shRNA結果不是由於脫靶效應所引起的。

3. 討論

除了經過充分研究的多種轉錄調節因子以及支持染色質狀態的表觀遺傳調控因子對於維持萬能性幹細胞(PSCs)自我更新的獨特狀態非常重要(Jaenisch與Young，2008年)之外，幾乎沒有發現跨膜蛋白在人類萬能性幹細胞(hPSCs)更新中的功能作用。於此，我們提供的證據顯示，表面標記物足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)在自我更新的初始萬能性幹細胞(PSCs)以及擴增性萬能性幹細胞(EPSCs)中具有重要的作用。據我們所知，這是第一次被研究，強調了膽固醇訊號在萬能性幹細胞(PSCs)中的重要性並定義了其分子機制。

c-MYC對於增殖、抗凋亡以及幹細胞更新極為重要(Chappell與Dalton，2013年；Scognamiglio等人，2016年；Varlakhanova等人，2011年；Varlakhanova等人，2010年；Wilson等人，2004年)。有趣的是，人類誘導性多能幹細胞(iPSCs)的產生受到MYC抑制劑的抑制(Asaf Zviran，2019年)，這顯示Myc對於誘導型萬能性幹細胞(iPSCs)重新編程極為重要。儘管MYC家族成員在早期發育過程中功能冗餘，但由於細胞週期受阻以及細胞向原始內胚層與中胚層譜系的分化，在萬能性幹細胞(PSCs)中同時敲除c-MYC與N-MYC會導致自我更新障礙及萬能性喪失(Smith等人，2010年)。此外，c-MYC可以活化端粒酶反轉錄酶(telomerase reverse transcriptase，TERT)，這對於維持萬能性幹細胞(PSCs)的端粒延長以及永生化特性極為重要(Wu等人，1999年)。我們注意到足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)特別調節人類萬能性幹細胞(hPSCs)中的c-MYC與TERT表現(圖1G與圖2B)。有趣的是，我們發現足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)對於建立初始的萬能性極為重要也足夠(圖1I與圖2C)。

足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)基因敲低損害了人類誘導型萬能性幹細胞(iPSCs)的生成(圖1I)，這也揭示了足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)在建立萬能性方面的早期關鍵作用。同時，在人類擴增性萬能性幹細胞(EPSCs)中敲低足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)也會減少細胞集落大小與集落數(圖1J)，而強迫足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)表現會增加細胞集落大小與集落數(圖2E與圖2D)。另外，在擴展的萬能性重新編程中，強迫足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)表現可進一步提高圓頂形狀的集落形成效率(圖2G)，顯示足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)足以建立擴展的萬能性。若簡言之，則需要足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)來建立初始的萬能性以及擴展的萬能性，這顯示其與MYC及TERT在人類早期胚胎發育中的獨特作用。

為了排除shRNA脫靶的問題，強制異位足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)表現可以挽救shPODXL誘導的表型(圖2A)。此外，我們還使用誘導型CRISPR/Cas9基因組編輯方法敲除了誘導型萬能性幹細胞(iPSCs)中的足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)(圖7)。如預期的那樣，我們發現敲除的誘導型PODXK對細胞生長與萬能性有害(圖7)。然而，一份報告顯示，穩定地敲除人類胚胎幹細胞(hESCs)內襯的足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)對幹細胞萬能性沒有影響，但會導致類足細胞的連接組織缺陷(Freedman等人，2015年)。最近，有幾篇報導顯示，遺傳補償作為緩衝生物體抵抗基因丟失的機制而存在，否則會損害生存(Rossi等人，2015年；Sztal等人，2018年)。這些可能引起對補償性網絡的活化以緩衝單細胞選殖中有害的足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)損失的擔憂。這可以解釋誘導型選殖以及穩定型選殖中的差異。因此，仍然需要確認在細胞培養選擇壓力下，足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)基因敲除穩定選殖株是否觸發了補償網絡。

膽固醇不僅在固醇激素以及維生素D的產生中具有重要作用，而且在訊號轉導與脂質筏形成中也具有重要作用。但是，關於掌握萬能性幹細胞(PSCs)中膽固醇代謝與更新之間關係的數據有限。一篇論文報導辛伐他汀透過調節RhoA/ROCK依賴的細胞訊號傳導而損害了小鼠胚胎幹細胞(ESCs)的自我更新，並且與膽固醇無關(Lee等人，2007年)。令人驚訝的是，在我們的研究中，我們發現足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)可透過調節主調節劑SREBP1/SREBP2以及膽固醇生合成途徑HMGCR的限速酶來調節膽固醇含量與脂質筏形成(圖3)。我們還注意到膽固醇合成途徑中的幾個基因轉錄物，例如HMGCR、HMGCS1、SQLE、LDLR、SCD、PCSK9、SCAP，在萬能性幹細胞(PSCs)中上調(圖3A)。重要的是，要注意，辛伐他汀與AY9944阻斷膽固醇途徑或MBCD清除膽固醇會嚴重影響人類萬能性幹細胞(hPSCs)的自我更新能力(圖4A與圖4B)。相較於纖維母細胞，人類萬能性幹細胞(hPSCs)對膽固醇剝奪更敏感(圖4C)。在先前的報導中，他汀類藥物僅對核型異常的人類胚胎幹細胞(hESCs)有毒，而不能殺死具有正常核型的萬能性幹細胞(PSCs) (Gauthaman等人，2009年)。然而，在存在基因敲除血清(KSR)的情況下，將其細胞以大量bFGF (16 ng/ml)培養，該基因在培養基中含有高含量的膽固醇(20%KSR相當於約1.408 μg/ml的膽固醇)(Garcia-Gonzalo與Izpisua Belmonte，2008年；Zhang等人，2016年)。相反地，我們的細胞是以化學定義的E8培養基培養的，E8培養基如今已在幹細胞領域廣泛使用。我們對我們的細胞進行了核型分析，並且在H9與HUES6細胞中核型都是正常的(數據未顯示)。因此，我們認為我們的結果與以前的結果之間的差異是由於培養基造成的。由於胚胎只能從血液擴散中獲得膽固醇，因此據說可以與之接觸的膽固醇數量很少。該數據證實了膽固醇的生合成與未分化的萬能性幹細胞(PSCs)的幹性有關。

兩者合計，我們的數據顯示足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)在人類初始與擴展的萬能性幹細胞(PSCs)中大量表現，具有跨膜蛋白的作用，透過SREBP1/SREBP2-HMGCR-c-MYC-TERT訊號來促進自我更新。鑑於足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)具有活化c-MYC、TERT、膽固醇途徑、促進生長以及防止細胞凋亡的強大能力，人們很容易推測，癌症幹細胞在腫瘤的發生及發展中也可能表現出對足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)的類似依賴性。同樣地，由於足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)具有支持初始與擴展萬能性的特性，因此在再生醫學中具有理想的無限潛力，並為將來的抗癌治療提供了有效的標的。序列資訊人類足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)的胺基酸序列(SEQ ID NO: 1) MRCALALSALLLLLSTPPLLPSSPSPSPSPSQNATQTTTDSSNKTAPTPASSVTIMATDTAQQSTVPTSKANEILASVKATTLGVSSDSPGTTTLAQQVSGPVNTTVARGGGSGNPTTTIESPKSTKSADTTTVATSTATAKPNTTSSQNGAEDTTNSGGKSSHSVTTDLTSTKAEHLTTPHPTSPLSPRQPTSTHPVATPTSSGHDHLMKISSSSSTVAIPGYTFTSPGMTTTLLETVFHHVSQAGLELLTSGDLPTLASQSAGITASSVISQRTQQTSSQMPASSTAPSSQETVQPTSPATALRTPTLPETMSSSPTAASTTHRYPKTPSPTVAHESNWAKCEDLETQTQSEKQLVLNLTGNTLCAGGASDEKLISLICRAVKATFNPAQDKCGIRLASVPGSQTVVVKEITIHTKLPAKDVYERLKDKWDELKEAGVSDMKLGDQGPPEEAEDRFSMPLIITIVCMASFLLLVAALYGCCHQRLSQRKDQQRLTEELQTVENGYHDNPTLEVMETSSEMQEKKVVSLNGELGDSWIVPLDNLTKDDLDEEEDTHL 人類足糖萼蛋白類蛋白 1 (PODXL) 基因的核苷酸序列(SEQ ID NO: 2) ATGCGCTGCGCGCTGGCGCTCTCGGCGCTGCTGCTACTGTTGTCAACGCCGCCGCTGCTGCCGTCGTCGCCGTCGCCGTCGCCGTCGCCCTCCCAGAATGCAACCCAGACTACTACGGACTCATCTAACAAAACAGCACCGACTCCAGCATCCAGTGTCACCATCATGGCT ACAGATACAGCCCAGCAGAGCACAGTCCCCACTTCCAAGGCCAACGAAATCTTGGCCTCGGTCAAGGCGACCACCCTTGGTGTATCCAGTGACTCACCGGGGACTACAACCCTGGCTCAGCAAGTCTCAGGCCCAGTCAACACTACCGTGGCTAGAGGAGGCGGCTCAGG CAACCCTACTACCACCATCGAGAGCCCCAAGAGCACAAAAAGTGCAGACACCACTACAGTTGCAACCTCCACAGCCACAGCTAAACCTAACACCACAAGCAGCCAGAATGGAGCAGAAGATACAACAAACTCTGGGGGGAAAAGCAGCCACAGTGTGACCACAGACCTCACATCCACTAAGGCAGAACATCTGACGACCCCTCACCCTACAAGTCCACTTAGCCCCCGACAACCCACTTCGACGCATCCTGTGGCCACCCCAACAAGCTCGGGACATGACCATCTTATGAAAATTTCAAGCAGTTCAAGCACTGTGGCTATCCCTGGCTACACCTTCACAAGCCCGGGGATGACCACCACCCTACTAGAGACAGTGTTTCACCATGTCAGCCAGGCTGGTCTTGAACTCCTGACCTCGGGTGATCTGCCCACCTTGGCCTCCCAAAGTGCTGGGATTACAGCGTCATCGGTTATCTCGCAAAGAACTCAACAGACCTCCAGTCAGATGCCAGCCAGCTCTACGGCCCCTTCCTCCCAGGAGACAGTGCAGCCCACGAGCCCGGCAACGGCATTGAGAACACCTACCCTGCCAGAGACCATGAGCTCCAGCCCCACAGCAGCATCAACTACCCACCGATACCCCAAAACACCTTCTCCCACTGTGGCTCATGAGAGTAACTGGGCAAAGTGTGAGGATCTTGAGACACAGACACAGAGTGAGAAGCAGCTCGTCCTGAACCTCACAGGAAACACCCTCTGTGCAGGGGGCGCTTCGGATGAGAAATTGATCTCACTGATATGCCGAGCAGTCAAAGCCACCTTCAACCCGGCCCAAGATAAGTGCGGCATACGGCTGGCATCTGTTCCAGGAAGTCAGACCGTGGTCGTCAAAGAAATCACTATTCACACTAAGCTCCCTGCCAAGGATGTGTACGAGCGGCTGAAGGACAAATGGGATGAACTAAAGGAGGCAGGGGTCAGTGACATGAAGCTAGGGGACCAGGGGCCACCGGAGGAGGCCGAGGACCGCTTCAGCATGCCCCTCATCATCACCATCGTCTGCATGGCATCATTCCTGCTCCTCGTGGCGGCCCTCTATGGCTGCTGCCACCAGCGCCTCTCCCAGAGGAAGGACCAGCA GCGGCTAACAGAGGAGCTGCAGACAGTGGAGAATGGTTACCATGACAACCCAACACTGGAAGTGATGGAGACCTCTTCTGAGATGCAGGAGAAGAAGGTGGTCAGCCTCAACGGGGAGCTGGGGGACAGCTGGATCGTCCCTCTGGACAACCTGACCAAGGACGACCTGGATGAGGAGGAAGACACACACCTCTAG參考資料 Almeida, P.F., Pokorny, A., and Hinderliter, A. 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無

當結合附圖閱讀時，將更好地理解上述發明內容及以下對本發明之詳細描述。為了說明本發明，在附圖中示出了目前較佳的具體實施例。然而，應當理解的事，本發明不限於所示之精確佈置及手段。

於圖式中：

圖 1A-1J. 足糖萼蛋白類蛋白 1 (PODXL) 對於人類萬能性幹細胞 (hPSCs) 自我更新及生存力極為重要，且足糖萼蛋白類蛋白 1 (PODXL) 的表現量與人類胚胎狀態有關。圖 1A 所示為足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)表現量從胚胎的單一細胞階段到4個細胞階段的富集。相較之下，關鍵幹性基因，OCT4、NANOG、SOX2，以及LIN28A的表現在桑葚胚(morula)及囊胚(blastocyst)期達到高峰。數據係從GEO數據集GSE18290計算得出的。圖 1B-1C 所示為，透過FACS分析，以抗足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)抗體(圖1B)與Tra-1-60抗體(圖1C)檢測，相較於間質幹細胞及纖維母細胞，人類胚胎幹細胞(hESCs)中足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)表現充足。Tra-1-60抗體識別足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)的乙二醇抗原決定位。圖 1D 所示為，相較於間質幹細胞及纖維母細胞(CRL-2097)，足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)在人類胚胎幹細胞(hESCs)中表現更為豐富。西方墨點分析顯示足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)在常規培養的胚胎幹細胞(ESCs)及擴增性萬能性幹細胞(EPSCs)中過度表現，但在分化的胚胎幹細胞(ESCs)(EB)或纖維母細胞中表現下調(2097)。圖 1E 所示為shP6ODXL阻止S6細胞自我更新。shPODXL轉導子誘導的形態變化使用了被shRFP慢病毒感染的HUES6人類胚胎幹細胞(hESCs)(作為陰性對照)以及針對足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)的兩種不同shRNA(shPODXL＃1、shPODXL＃2)的明場圖像。比例尺所示為200 μm。足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)的敲低減少了相對細胞數。在shRNA處理的S6人類胚胎幹細胞(hESCs)中進行Alamar藍分析。透過以單因子變異數分析(one-way ANOVA)比較shRFP人類胚胎幹細胞(hESCs)來計算P值(*p>0.05, **p > 0.01, ***p > 0.001)。足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)的敲低抑制了胚胎幹細胞(ESCs)中萬能性標記的表現。完成了鹼性磷酸酶(Alkaline phosphatase，ALP)活性分析。透過Alamar藍分析(AB)針對相對細胞數計算鹼性磷酸酶(ALP)含量。透過以單因子變異數分析比較shRFP人類胚胎幹細胞(hESCs)來計算P值(*p>0.05, **p > 0.01, ***p > 0.001)。圖 1F 所示為shP6ODXL阻擋H9細胞與誘導型萬能性幹細胞(iPSCs)-0207的自我更新。足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)的敲低降低了相對細胞數。在shRNA處理的S6人類胚胎幹細胞(hESCs)中進行Alamar藍分析。透過以單因子變異數分析比較shRFP人類胚胎幹細胞(hESCs)來計算P值(*p>0.05, **p > 0.01, ***p > 0.001)。足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)的敲低抑制了胚胎幹細胞(ESCs)中萬能性標記的表現。完成了鹼性磷酸酶(ALP)活性分析。透過Alamar藍分析(AB)針對相對細胞數計算鹼性磷酸酶(ALP)含量。透過以單因子變異數分析比較shRFP人類胚胎幹細胞(hESCs)來計算P值(*p>0.05, **p > 0.01, ***p > 0.001)。圖 1G 所示為西方墨點分析證明慢病毒感染HUES6細胞3天後c-MYC與TERT降低。圖 1H 所示為表現shPODXL的人類胚胎幹細胞(hESCs)透過膜聯蛋白V-PI的FACS分析染色證明了細胞凋亡/壞死。以shRFP及shPODXL慢病毒感染細胞6天。定量結果。繪製透過流式細胞儀測量的HUES6細胞凋亡百分比。誤差棒代表四重複的標準偏差。透過以單因子變異數分析比較shRFP人類胚胎幹細胞(hESCs)來計算P值(*p>0.05, **p > 0.01, ***p > 0.001)。圖 1I 所示為足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)的下調降低了誘導型萬能性幹細胞(iPSCs)形成效率。在第0天，以表現Oct4、c-Myc、KLF4以及Sox2，RFP或足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)的慢病毒處理人類包皮纖維母細胞。在第16天進行鹼性磷酸酶(ALP)分析。進行鹼性磷酸酶(ALP)活性分析。計數染成紅色的鹼性磷酸酶(ALP)陽性集落。透過以單因子變異數分析比較shRFP人類胚胎幹細胞(hESCs)來計算P值(*p>0.05, **p > 0.01, ***p > 0.001)。圖 1J 所示為，足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)的敲低減少了擴展性萬能性幹細胞的集落大小與集落數。慢病毒對shRNA感染的HUES6衍生的擴增性萬能性幹細胞(EPSCs)進行6天的明場圖像。透過以單因子變異數分析比較shRFP人類胚胎幹細胞(hESCs)來計算P值(*p>0.05, **p > 0.01, ***p > 0.001)。

圖 2A-2G. 足糖萼蛋白類蛋白 1 (PODXL) 能夠促進初始的及擴展的萬能性。圖 2A 所示為足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)的過度表現挽救了抑制自我更新能力的shPODXL。進行Alamar藍分析、鹼性磷酸酶活性分析，以及西方墨點分析(圖2A)。透過以單因子變異數分析比較shRFP人類胚胎幹細胞(hESCs)來計算P值(*p>0.05, **p > 0.01)。圖 2B 所示為足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)的過度表現上調了HUES6細胞的相對細胞數及幹細胞更新能力。進行西方墨點分析、Alamar藍分析、結晶紫分析，台酚藍排除分析以及鹼性磷酸酶活性分析。慢病毒感染3天後，計算足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)或GFP過度表現的人類胚胎幹細胞(hESCs)。透過進行未配對的學生氏t檢驗來計算P值(*p>0.05, **p > 0.01, ***p > 0.001)。圖 2C 所示為足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)提高了誘導性多能幹細胞(iPSCs)的形成效率。上圖列出了產生誘導型萬能性幹細胞(iPSCs)的標準程序。於第0天，以表現Oct4、KLF4、Sox2、c-Myc以及GFP或足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)的慢病毒載體感染人類包皮纖維母細胞。於第16天收穫細胞並進行分析。進行鹼性磷酸酶(ALP)活性並計算重新編程的鹼性磷酸酶(ALP)陽性集落。透過進行未配對的學生氏t檢驗來計算P值(*p>0.05, **p > 0.01, ***p > 0.001)。圖 2D 所示為足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)表現的擴增性萬能性幹細胞(EPSCs)表現出更多的集落圓頂形狀。過度表現足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)的擴增性萬能性幹細胞(EPSCs)的標準程序(上圖)。在第4天沒有滋養層的人類擴增性萬能性幹細胞(hEPSCs)的明場圖像。圖 2E 所示為在人類擴增性萬能性幹細胞(hEPSCs)中過度表現足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)增加了集落數及集落大小。以藥物篩選細胞6天。透過Image Pro軟體計算集落大小並進行三重複試驗。透過進行未配對的學生氏t檢驗來計算P值(*p>0.05, **p > 0.01, ***p > 0.001)。圖 2F 所示為在沒有滋養細胞的擴增性萬能性幹細胞(EPSCs)培養條件下足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)的過度表現上調了細胞數及鹼性磷酸酶(ALP)活性。透過進行未配對的學生氏t檢驗來計算P值(*p>0.05, **p > 0.01, ***p > 0.001)。圖 2G 所示為足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)的過度表現改善了擴增性萬能性幹細胞(EPSCs)中的圓頂形狀細胞的形成。透過進行未配對的學生氏t檢驗來計算P值(**p > 0.01)。

圖 3A-3E. 足糖萼蛋白類蛋白 1 (PODXL) 透過調節 SREBPs/HMGCR 增加細胞膽固醇含量。圖 3A 所示為膽固醇合成HMGCR的限速酶的表現隨足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)的上調或下調而改變。透過三重複試驗的RT-qPCR分析，足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)下調的人類胚胎幹細胞(hESCs)中HMGCR以及一些膽固醇相關基因的mRNA表現量降低。透過以單因子變異數分析針對shRFP人類胚胎幹細胞(hESCs)來計算P值(*p>0.05, **p > 0.01, ***p > 0.001)。在過度表現足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)的人類胚胎幹細胞(hESCs)中，HMGCR mRNA表現量增加。以三重複試驗進行QRT-PCR分析。透過進行未配對的學生氏t檢驗針對RFP人類胚胎幹細胞(hESCs)計算P值(*p>0.05, **p > 0.01, ***p > 0.001)。西方墨點分析顯示過度表現足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)的人類胚胎幹細胞(hESCs)中HMGCR、c-MYC以及TERT的表現量增加。慢病毒轉導後3天進行西方墨點分析。西方墨點分析顯示，在人類擴增性多能幹細胞(hEPSCs)培養條件下，在shPODXL轉導的HUES6細胞中HMGCR、c-MYC被下調。慢病毒轉導後進行西方墨點6天。圖 3B 所示為膽固醇含量隨足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)的上調或下調而改變。在shPODXL轉導的人類胚胎幹細胞(hESCs)中，膽固醇含量被下調。透過Amplex Red分析套組檢查細胞膽固醇含量。透過以單因子變異數分析針對shRFP人類胚胎幹細胞(hESCs)來計算P值(*p>0.05, **p > 0.01, ***p > 0.001)。過度表現足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)的人類胚胎幹細胞(hESCs)中的膽固醇含量上調。透過進行未配對的學生氏t檢驗針對RFP人類胚胎幹細胞(hESCs)計算P值(*p>0.05, **p > 0.01, ***p > 0.001)。圖 3C 所示為shHMGCR抑制人類胚胎幹細胞(hESCs)的自我更新。shHMGCR慢病毒轉導的HUES6細胞與H9細胞的明場圖像。該病毒感染了4天。在shHMGCR感染的人類胚胎幹細胞(hESCs)中，西方墨點分析顯示，HMGCRc-MYC、TERT減少。結晶紫分析、鹼性磷酸酶分析。Alamar藍分析顯示，shHMGCR的自我更新能力降低。透過以單因子變異數分析針對shRFP人類胚胎幹細胞(hESCs)來計算P值(*p>0.05, **p > 0.01, ***p > 0.001)。圖 3D 所示為西方墨點分析顯示，在擴增性多能幹細胞(EPSCs)培養物中足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)的上調及下調後，SREBP1、SREBP2、HMGCR表現量改變。(上圖)西方墨點分析顯示足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)的下調抑制了在常規培養基中培養的人類胚胎幹細胞(hESCs)中SREBP1與SREBP2的表現。(左下圖)足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)的敲低下調了HMGCR、SREBP1、SREBP2以及c-Myc的表現。(右下圖)足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)表現的上調增加了HMGCR、SREBP1、SREBP2、端粒酶以及c-Myc表現。圖 3E 所示為，隨著足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)的下調及上調，結合染色質的SREBP1與SREBP2的含量發生變化。(上圖) SREBP1、SREBP2以及c-MYC蛋白的次細胞定位。於第3天將shPODXL與shRFP病毒轉導人類胚胎幹細胞(hESCs)。組蛋白3(H3)、HDAC2以及β-TUBULIN (β-TUB)被作為染色質結合的可溶性核與細胞質組成分的標記物。(下圖)西方墨點分析在第3天證明足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)過度表現人類胚胎幹細胞(hESCs)中SREBP1、SREBP2以及c-MYC蛋白的次細胞定位。

圖 4A-4C. 膽固醇對於人類萬能性幹細胞 (hPSCs) 更新極為重要。圖 4A 所示為膽固醇生合成的示意圖。在足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)過度表現的細胞中，膽固醇合成酶(HMGCS1、HMGCR、SQLE、DHCR7)、膽固醇含量傳感器(INIS1G1)，以及LDLR抑制劑(PCSK9)差異表現。辛伐他汀阻斷HMGCR的酶活性，而AY9944抑制DHCR7酶的活性。MBCD可去除脂質筏中的膽固醇。圖 4B 所示為辛伐他汀、AY9944以及MBCD阻斷了人類胚胎幹細胞(hESCs)的更新。(左圖)在HUES6人類胚胎幹細胞(hESCs)中，辛伐他汀、AY9944以及MBCD處理3天會影響鹼性磷酸酶的活性。(右圖)西方墨點分析顯示辛伐他汀可阻斷TERT、c-MYC、HMGCR、足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)、TRA-1-60、TRA-1-81的表現。圖 4C 所示為三種抑制劑阻斷了足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)調節的幹細胞標記物的表現。三種抑制劑處理3天後檢查Alamar藍分析以及鹼性磷酸酶活性。相對於GFP對照人類胚胎幹細胞(hESCs)，進行學生氏未配對t檢驗(*p>0.05, **p > 0.01, ***p > 0.001)。

圖 5A-5B. 膽固醇添加可在足糖萼蛋白類蛋白 1 (PODXL) 敲低細胞中挽救人類胚胎幹細胞 (hESCs) 的更新。圖 5A 所示為膽固醇恢復了shPODXL敲低的相對細胞數與幹細胞標記物表現。在添加膽固醇的足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)下調的HUES6人類胚胎幹細胞(hESCs)中進行Alamar藍分析以及鹼性磷酸酶(ALP)活性4天。圖 5B 所示為膽固醇的添加減少了足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)敲除人類胚胎幹細胞(hESCs)中的細胞凋亡。以三重複試驗對膜聯蛋白V/PI陽性細胞進行定量(左下圖)。透過以單因子變異數分析針對shRFP人類胚胎幹細胞(hESCs)來計算P值(*p>0.05, **p > 0.01, ***p > 0.001)。(右下圖)膽固醇恢復shPODXL的表現，降低了c-MYC/TERT的表現。西方墨點分析在足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)基因敲除的HUES6 人類胚胎幹細胞(hESCs)中進行，並添加膽固醇4天。

圖 6. 添加膽固醇可促進誘導性多能幹細胞 (iPSCs) 的重新編程效率。 種下CRL2097細胞(第9代)並以含有終濃度膽固醇(0、0.5x，1x，2x，5x，8x)的慢病毒載體(OSKM)進行感染，將其從500x濃縮的SyntheChol® NS0補充劑(S5442，Sigma公司)中稀釋。進行鹼性磷酸酶分析以分析重新編程效率。

圖 7. 誘導型 CRISPR/Cas9 足糖萼蛋白類蛋白 1 (PODXL) 基因敲除誘導性多能幹細胞 (iPSCs) 阻止了 PSC 的自我更新。 (上圖)此分析中使用的sgRNA位置的定位。sgRNA以序列位於足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)基因座的5’UTR以及內含子1為目標。從基因組缺失了大小為537 bp的外顯子1。垂直箭頭指出sgRNA1、sgRNA2以及sgRNA3的目標位置。透過在分別篩選3天及5天的誘導型足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)敲除細胞藥物中計算透過Alamar藍分析法測量的相對細胞數。誘導型足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)中幹細胞標記物的表現分別敲除了3天選擇的細胞藥物。進行鹼性磷酸酶(ALP)分析。

無

Claims

一種調節萬能性幹細胞之潛能的方法，包含將該幹細胞暴露於有效量的足糖萼蛋白類蛋白1 (PODXL)調節劑中。
如請求項1之方法，其中該調節劑為PODXL拮抗劑。
如請求項1之方法，其中該PODXL拮抗劑有效於下調該萬能性幹細胞的潛能。
如請求項2之方法，其中該PODXL拮抗劑為抗PODXL抗體、靶向PODXL的干擾核酸，或抑制PODXL的小分子。
如請求項2之方法，其中該PODXL拮抗劑為膽固醇合成的抑制劑。
如請求項2之方法，其中該幹細胞係培養於不含膽固醇的培養基。
如請求項1之方法，其中該調節劑為PODXL激動劑。
如請求項1之方法，其中該PODXL激動劑有效於上調萬能性幹細胞的潛能。
一種製備分化細胞之方法，包含 (a) 使未分化的萬能性幹細胞接受適於分化的條件，以產生細胞群，其包含分化細胞與未分化的萬能性幹細胞群； (b) 透過將該細胞群暴露於有效量的PODXL拮抗劑或膽固醇合成抑制劑，以去除該未分化的萬能性幹細胞；以及 (c) 可視需要地培養該剩餘的分化細胞。
如請求項9之方法，其中該PODXL拮抗劑為抗PODXL抗體、靶向PODXL的干擾核酸，或抑制PODXL的小分子。
如請求項9之方法，其中該PODXL拮抗劑或膽固醇合成抑制劑選自由下列所組成之群組：辛伐他汀(simvastatin) [(1S,3R,7S,8S,8aR)-1,2,3,7,8,8a-六氫-3,7-二甲基-8-[2-[(2R,4R)-四氫-4-羥基-6-氧代-2H-吡喃-2-基]乙基]-1-萘基-2,2-二甲基丁酸酯]、AY9944 (反式-N,N-雙[2-氯苯基甲基]-1,4-環己烷二甲胺二鹽酸鹽)、MBCD (甲基-β-環糊精甲基-β-環糊精環麥芽七糖，甲基醚)、普拉卡汀(pracastatin)、阿托伐他汀(atorvastatin)、匹伐他汀(pitavastatin)、羅伐沙米(rovasimibe)、VULM 1457、 YM750、U 18666A、CI 976、富馬酸酯Ro 48-8071、AK 7、BMS 795311、Lalistat 1、阿托伐他汀(Atorvastatin)、瑞舒伐他汀(rosuvastatin)、氟伐他汀(fluvastatin)、洛伐他汀(Lovastatin)、SB 204990、Filipin III、GGTI 298、Torcetrapib、奧利司他(Orli stat)、依澤替米貝(ezetimibe)、阿利珠單抗(Alirocumab)、依洛尤單抗(Evolocumab)、波可西單抗 (Bococitumab)、菸酸、及氨氯地平(amlodipine)。
如請求項9之方法，其中該未分化的萬能性幹細胞選自由胚胎幹細胞(embryonic stem cells，ESCs)、誘導型萬能性幹細胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)，以及擴增性萬能性幹細胞(extended pluripotent stem cells，EPSCs)所組成之群組。
如請求項9之方法，其中該分化的細胞係選自由下列所組成之群組：成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、內皮細胞、神經元細胞、寡樹突神經膠質細胞、星狀神經膠細胞、微膠質細胞、肝細胞、心臟細胞、肺細胞、腸細胞、血球細胞、胃細胞、卵巢細胞、子宮細胞、膀胱細胞、腎細胞、眼細胞、耳細胞、口腔細胞，以及成體幹細胞(所有分化的細胞類型)。
如請求項9之方法，其中該細胞係培養於不含膽固醇的培養基。
一種於有需要的個體中治療畸胎瘤之方法，包含向該個體施用有效量的PODXL拮抗劑或膽固醇合成抑制劑。
如請求項15之方法，其中該PODXL拮抗劑或膽固醇合成抑制劑選自由下列所組成之群組：辛伐他汀(simvastatin) [(1S,3R,7S,8S,8aR)-1,2,3,7,8,8a-六氫-3,7-二甲基-8-[2-[(2R,4R)-四氫-4-羥基-6-氧代-2H-吡喃-2-基]乙基]-1-萘基-2,2-二甲基丁酸酯]、AY9944 (反式-N,N-雙[2-氯苯基甲基]-1,4-環己烷二甲胺二鹽酸鹽)、MBCD (甲基-β-環糊精甲基-β-環糊精環麥芽七糖，甲基醚)、普拉卡汀(pracastatin)、阿托伐他汀(atorvastatin)、匹伐他汀(pitavastatin)、羅伐沙米(rovasimibe)、VULM 1457、 YM750、U 18666A、CI 976、富馬酸酯Ro 48-8071、AK 7、BMS 795311、Lalistat 1、阿托伐他汀(Atorvastatin)、瑞舒伐他汀(rosuvastatin)、氟伐他汀(fluvastatin)、洛伐他汀(Lovastatin)、SB 204990、Filipin III、GGTI 298、Torcetrapib、奧利司他(Orli stat)、依澤替米貝(ezetimibe)、阿利珠單抗(Alirocumab)、依洛尤單抗(Evolocumab)、波可西單抗 (Bococitumab)、菸酸、及氨氯地平(amlodipine)。
一種上調萬能性幹細胞之潛能的方法，包含誘導該幹細胞中PODXL的表現。
如請求項17之方法，其中該PODXL的表現係透過以下步驟誘導：(a) 將編碼PODXL的重組多核苷酸引入該幹細胞，以及 (b) 在允許該PODXL表現的條件下培養該幹細胞。
一種製備嵌合胚胎之方法，包含使非人類宿主的受精胚胎與人類擴增性萬能性幹細胞(hEPSCs)接觸，該人類擴增性萬能性幹細胞包含編碼PODXL的重組多核苷酸，以及培養該與PODXL過度表現之hEPSCs接觸的該宿主胚胎，以形成嵌合胚胎。
如請求項19之方法，其中該hEPSCs係經注入該宿主胚胎中而進行接觸。
如請求項19之方法，進一步包含將該嵌合胚胎移植至與該非人類宿主相同物種的假性懷孕非人類雌性受體動物中，以允許產生後代，並可視需要地從該後代獲得器官。
一種產生誘導型萬能性幹細胞(iPSCs)之方法，包含在允許一定比例的體細胞去分化為誘導型萬能性幹細胞(iPSCs)的條件下培養體細胞，其中該條件包括包含膽固醇的培養基。
如請求項22之方法，其中該體細胞為皮膚細胞，例如，纖維母細胞。
一種如請求項1至14中任一項之PODXL調節劑之用途，其用於進行如請求項1至14中任一項之方法，或用於製造用於進行該方法之組合物。
一種膽固醇的用途，其係用於處理體細胞以透過重新編程從其產生誘導型萬能性幹細胞(iPSCs)，或在製備用於處理體細胞以產生誘導型萬能性幹細胞(iPSCs)的組合物。
一種用於進行如請求項1至14中任一項之方法的組合物，其包含PODXL調節劑。
如請求項26之組合物，其為培養基組合物，並包含用於細胞培養的基本培養基。
一種用於處理體細胞以透過重新編程從該體細胞產生誘導型萬能性幹細胞(iPSCs)之組合物，包含膽固醇。
如請求項28之組合物，其為用於細胞培養的培養基組合物，且包含基礎培養基。