CN111979183A - 一种基于肝脏类器官模型的药物肝毒性评价方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种基于肝脏类器官模型的药物肝毒性评价方法，包括：步骤一，小鼠肝脏类器官模型的建立：(1)取小鼠肝脏组织，依次进行清洗、剪切、消化、裂解及过滤处理，获得小鼠肝脏干细胞沉淀；(2)将小鼠肝脏干细胞制胶后采用培养基培养，获得肝脏类器官模型；步骤二，将肝脏类器官模型进行药物处理：将待测药物设置成多个浓度梯度，然后将肝脏类器官模型给予不同浓度梯度下的药物刺激，并在不同时间点收集类器官样本，观察其形态学变化并检测肝功能指标。本发明提供了一种更加准确的体外检测药物肝毒性的方法，周期短，操作简便，可代替传统细胞系模型和动物模型，用于临床前新药开发及临床药物肝毒性评估。

Description

一种基于肝脏类器官模型的药物肝毒性评价方法
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种基于肝脏类器官模型的药物肝毒性评价方法。
背景技术
肝脏独特的代谢功能和与胃肠道的关系使其成为药物和外源物质毒性的重要靶标。从出生到青春期，肝脏代谢活性的变化对同种毒素有不同的敏感性。肝脏药物代谢，往往是不平衡的有毒代谢物的产生和解毒过程，可以影响肝毒性的程度。在严重毒性的情况下，患者可能会发生肝衰竭。药物性肝损伤是目前新药开发中由于安全性导致药物撤市的最常见的不良事件，在批准上市后发现的肝毒性也限制了许多药物的使用。如果存在一种体外模型可准确识别大量的具有高度特异性的肝毒性药物，对人类和实验动物而言无疑是一种巨大的福音。
经典的评价药物不良反应的模型有体外二维培养的人原代肝细胞系和体内动物模型。然而，2D培养的人细胞系很容易失去其原始功能，并且其形态、生物功能、遗传等方面的表现和人体生理差异极大，有研究证实，2D和3D培养的细胞对于药物的反应差异明显，动物模型由于药物代谢与人类代谢的潜在差异而具有局限性。因此，临床前安全评价模型的缺陷，是目前新药临床试验失败和上市后召回的重要原因。在临床前药物开发中，迫切需要有人细胞和个性化的体外模型来进行药物功效和毒性试验。肝癌细胞系和动物模型目前仍是药物代谢和毒性测试的“金标准”，但它们的实用性和长期培养能力十分有限。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在提供一种基于肝脏类器官模型的药物肝毒性评价方法以获得更加准确的药物毒性数据。本发明的技术方案为：
一种基于肝脏类器官模型的药物肝毒性评价方法，包括以下步骤：
步骤一，小鼠肝脏类器官模型的建立：
(1)取小鼠肝脏组织，依次进行清洗、剪切、消化及过滤处理，获得小鼠肝脏干细胞；
(2)将小鼠肝脏干细胞制胶后采用培养基培养，获得肝脏类器官模型；
步骤二，将肝脏类器官模型进行药物处理：
将待测药物设置成多个浓度梯度，然后将肝脏类器官模型给予不同浓度梯度下的药物刺激，并在不同时间点收集类器官样本，观察其形态学变化并检测肝功能指标。
进一步地，所述清洗处理包括：采用含1％青链双抗的生理盐水反复进行数次，直至剔除明显的脂肪组织。
进一步地，所述消化处理包括：①将剪切好的组织分散在生理盐水中，离心去上清后往沉淀中加入胶原酶、分散酶与DNaseI，于37℃震荡消化30min，加入含1％青链双抗的生理盐水终止消化，静置，收集细胞沉淀；②继续往沉淀内加入胶原酶、分散酶与DNaseI，于37℃震荡消化2h，加入含1％双抗的青链生理盐水终止消化，静置沉淀，收集上清。
进一步地，所述过滤处理包括：将消化处理获得的上清液经100μm的滤网过滤，收集滤液，将滤液于室温下1000～1200rpm离心5min，收集肝脏干细胞沉淀。
进一步地，所述将小鼠肝脏干细胞沉淀制胶，具体包括：通过Advanced DMEM/F12重悬过滤后的细胞沉淀，取Matrigel胶于4℃融化过夜，与细胞悬液充分混匀后静置。
进一步地，所述将小鼠成体干细胞沉淀制胶后采用培养基培养，具体包括：采用以下终浓度组分组成的培养基：不含Vit-A的B27，1-2X；EGF，45-55ng/ml；Gastrin，8-12nM；HGF，50-55ng/ml；N-acetylcysteine，1-2mM；R-spondin 1，90-110ng/ml；FGF10，100-120ng/ml；Nicotinamide，10-12mM；FGF7，40-60ng/ml；A83-01，10-15nM；Y-27632，10-15μM；CHIR99021，1-5uM；Oncostatin M，10-15ng/ml；Glutamax，1-2X；青霉素链霉素混合液，1-3X；HEPES，0.5-0.8mM，加入至制得的胶中，于37℃、5％CO2浓度下培养7-12天，期间每间隔3-4天更换一次所述培养基。
优选地，所述将肝脏类器官模型进行药物处理，还包括：将肝脏类器官模型给予0.1％DMSO处理作为空白对照，在不同时间点收集该空白对照的类器官样本，观察形态学变化并检测肝功能指标。
进一步地，所述检测肝功能指标包括：
1)药物处理7天后使用Promega
Figure BDA0002625303620000031
3D Cell Viability Assay试剂盒检测药物处理组和空白对照组的细胞活力。
2)药物处理3天后使用Promega P450-GloTMAssays试剂盒检测细胞色素P450代谢酶CYP3A4。
3)药物处理3天后使用BiovisionAspartateAminotransferase(AST or SGOT)ActivityColorimetric Assay Kit试剂盒检测药物处理组和空白对照组的谷草转氨酶AST。
4)药物处理3天后使用BiovisionAlanine Aminotransferase(ALT or SGPT)ActivityColorimetric/FluorometricAssay Kit试剂盒检测药物处理组和空白对照组的谷丙转氨酶ALT。
进一步地，采用所述肝功能指标进行肝损伤判断的标准为：
1)药物处理组与空白对照组细胞活力值之间的P<0.05时，药物对类器官造成轻度肝损伤，反之，则无损伤作用；药物处理组与空白对照组细胞活力值之间的P<0.01时，药物对类器官造成中度肝损伤；药物处理组与空白对照组细胞活力值之间的P<0.001时，药物对类器官造成重度肝损伤。药物对细胞的杀伤力最直观的体现为细胞数量的变化，因此，细胞活力的大小可直观反应药物对细胞的抑制程度的高低。
2)药物处理组与空白对照组CYP3A4之间的P<0.05时，药物对类器官造成轻度肝损伤，反之，则无损伤作用；药物处理组与空白对照组CYP3A4之间的P<0.01时，药物对类器官造成中度肝损伤；药物处理组与空白对照组CYP3A4之间的P<0.001时，药物对类器官造成重度肝损伤。CYP3A4为人体细胞色素P450代谢酶之一，是生理代谢过程中的关键酶，CYP3A4合成的多少决定了肝脏解毒能力的高低，CYP3A4合成的显著下降预示了肝功能损害程度越高。
3)药物处理组与空白对照组谷丙转氨酶ALT之间的P<0.05时，药物对类器官造成轻度肝损伤，反之，则无损伤作用；药物处理组与空白对照组谷丙转氨酶ALT之间的P<0.01时，药物对类器官造成中度肝损伤；药物处理组与空白对照组谷丙转氨酶ALT之间的P<0.001时，药物对类器官造成重度肝损伤。临床上，药物性肝损伤可分为肝细胞损伤型、胆汁淤积型和混合型。肝细胞损伤型以谷丙转氨酶(ALT)升高和(或)谷草转氨酶(AST)明显升高为主要表现，ALT和AST升高多少反映了肝细胞的损伤程度。因此，检测AST和ALT的变化是十分必要的。
4)药物处理组与空白对照组谷草转氨酶AST之间的P<0.05时，药物对类器官造成轻度肝损伤，反之，则无损伤作用；药物处理组与空白对照组谷草转氨酶AST之间的P<0.01时，药物对类器官造成中度肝损伤；药物处理组与空白对照组谷草转氨酶AST之间的P<0.001时，药物对类器官造成重度肝损伤。
本发明的有益效果是：
1)本发明方法建立的小鼠肝脏类器官模型无需额外诱导分化过程，明显提高原代培养的成功率和类器官数量，并且大大降低了建模的人工成本，更加有利于该模型在肝毒性评价中的应用。
2)采用本发明的方法在体外进行药物性肝损伤评价中能够准确预测药物不良反应的发生，降低新药开发成本，最关键是可以减少由药物给患者带来的不良后果。
3)本发明提供了一种更加准确的体外检测药物肝毒性的方法，其周期短，操作简便，可代替传统细胞系模型和动物模型，用于临床前新药开发及临床药物肝毒性评估。
附图说明
图1为本发明实施例1培养得到的小鼠肝脏类器官光学显微镜图。
图2为实施例1磷酸氯喹处理后小鼠肝脏类器官细胞活力值的变化。
图3为实施例1磷酸氯喹处理前后小鼠肝脏类器官细胞色素P450代谢酶CYP3A4、谷丙转氨酶ALT和谷草转氨酶AST的变化。
图4为实施例2米托蒽醌处理后小鼠肝脏类器官细胞活力值的变化。
图5为实施例2米托蒽醌处理前后小鼠肝脏类器官细胞色素P450代谢酶CYP3A4、谷丙转氨酶ALT和谷草转氨酶AST的变化。
具体实施方式
在本发明的描述中，需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面结合附图和具体的实施例对本发明做进一步详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
实施例1
本实施例提供一种基于肝脏类器官模型的磷酸氯喹肝毒性评价方法，包括以下步骤：
1、小鼠肝脏类器官模型的建立：
1)样本清洗：用含1％双抗的生理盐水对小鼠肝脏组织进行数次清洗，剔除明显的脂肪组织。
2)样本剪切：将组织剪成约0.5mm^3小块。
3)组织消化：①将剪切好的组织分散在生理盐水中，离心去上清后往沉淀中加入胶原酶、分散酶与DNaseI，于37℃震荡消化30min，加入含1％青链双抗的生理盐水终止消化，静置，收集细胞沉淀；②继续往沉淀内加入胶原酶、分散酶与DNaseI，于37℃震荡消化2h，加入含1％双抗的青链生理盐水终止消化，静置沉淀，收集上清。
4)过滤：①将步骤3)收集的上清经100μm的滤网过滤，收集滤液，室温下1100rpm离心5min收集细胞沉淀，用100μLAdvanced DMEM/F12培养基重悬细胞沉淀。
5)制胶：取120ul Matrigel胶(4℃融化过夜)，与细胞悬液充分混匀，滴到6cm平皿内，每滴约40ul，静置2min，倒扣在细胞培养箱内。
6)待充分凝固后加入小鼠肝脏类器官培养基，培养基的组成为：不含Vit-A的B27，1X；EGF，50ng/ml；Gastrin，10nM；HGF，50ng/ml；N-acetylcysteine，1mM；R-spondin 1，100ng/ml；FGF10，100ng/ml；Nicotinamide，10mM；FGF7，50ng/ml；A83-01，10nM；Y-27632，10μM；CHIR99021，3uM；Oncostatin M，10ng/ml；Glutamax，1X；青霉素链霉素混合液，1X；HEPES，0.5mM。以上成分均溶于Advanced DMEM/F12培养基中，于37℃、5％CO2浓度下培养7天，期间每间隔3天更换一次培养基。在光学显微镜下的类器官形态结构如图1所示，类器官呈圆形或椭圆形，类器官壁较厚。
2、磷酸氯喹对小鼠肝脏类器官的影响
1)去掉肝脏类器官中的培养基，加入0.25％的胰酶后吹散胶滴，于37℃消化3min，转移至预冷的Advanced DMEM/F12中，离心弃上清，收集细胞沉淀，用Advanced DMEM/F12重悬沉淀后进行细胞计数，根据各指标检测试剂盒要求的细胞数制成胶滴分别种胶，待充分凝固后加入小鼠肝脏类器官培养基培养24h。
2)检测细胞活力：空白对照组加入0.1％DMSO，药物处理组分别加入3uM、15uM、30uM、45uM、60uM、75uM磷酸氯喹，7天后使用Promega
Figure BDA0002625303620000071
3DCellViabilityAssay试剂盒检测细胞活力。结果如图2所示，磷酸氯喹对小鼠肝脏类器官的半数致死剂量为38.54uM。氯喹目前被证实能有效抑制SARS-CoV-2(COVID-19)，其半数有效剂量为EC50＝1.13μM，因此，从结果来看，磷酸氯喹的使用剂量仍在安全范围之内。
3)检测细胞色素P450代谢酶CYP3A4和转氨酶AST、ALT：空白对照组加入0.1％DMSO，药物处理组加入45uM磷酸氯喹，3天后使用Promega P450-GloTMAssays试剂盒检测细胞色素P450代谢酶CYP3A4；用Biovision Aspartate Aminotransferase(AST or SGOT)ActivityColorimetric Assay Kit试剂盒检测转氨酶AST；用Biovision AlanineAminotransferase(ALT or SGPT)ActivityColorimetric/FluorometricAssay Kit试剂盒检测转氨酶ALT。如图3所示，与对照组相比，45uM的磷酸氯喹处理3天后，小鼠肝脏类器官CYP3A4活性明显下降，而AST水平明显上调，ALT表达水平没有明显变化。说明高浓度的磷酸氯喹可降低肝细胞解毒能力，造成中等水平肝损伤。
实施例2
本实施例提供一种基于肝脏类器官模型的米托蒽醌肝毒性评价方法，包括以下步骤：
1、小鼠肝脏类器官模型的建立：
1)样本清洗：用含1％双抗的生理盐水对小鼠肝脏组织进行数次清洗，剔除明显的脂肪组织。
2)样本剪切：将组织剪成约0.5mm^3小块。
3)组织消化：①将剪切好的组织分散在生理盐水中，离心去上清后往沉淀中加入胶原酶、分散酶与DNaseI，于37℃震荡消化30min，加入含1％青链双抗的生理盐水终止消化，静置，收集细胞沉淀；②继续往沉淀内加入胶原酶、分散酶与DNaseI，于37℃震荡消化2h，加入含1％双抗的青链生理盐水终止消化，静置沉淀，收集上清。
4)过滤：①将步骤3)收集的上清经100μm的滤网过滤，收集滤液，室温下1100rpm离心5min收集细胞沉淀，用100μLAdvanced DMEM/F12培养基重悬细胞沉淀。
5)制胶：取120ul Matrigel胶(4℃融化过夜)，与细胞悬液充分混匀，滴到6cm平皿内，每滴约40ul，静置2min，倒扣在细胞培养箱内。
6)待充分凝固后加入小鼠肝脏类器官培养基，培养基的组成为：不含Vit-A的B27，1X；EGF，50ng/ml；Gastrin，10nM；HGF，50ng/ml；N-acetylcysteine，1mM；R-spondin 1，100ng/ml；FGF10，100ng/ml；Nicotinamide，10mM；FGF7，50ng/ml；A83-01，10nM；Y-27632，10μM；CHIR99021，3uM；Oncostatin M，10ng/ml；Glutamax，1X；青霉素链霉素混合液，1X；HEPES，0.5mM。以上成分均溶于Advanced DMEM/F12培养基中，于37℃、5％CO2浓度下培养7天，期间每间隔3天更换一次培养基。
2、米托蒽醌对小鼠肝脏类器官的影响
1)去掉肝脏类器官中的培养基，加入0.25％的胰酶后吹散胶滴，于37℃消化3min，转移至预冷的Advanced DMEM/F12中，离心弃上清，收集细胞沉淀，用Advanced DMEM/F12重悬沉淀后进行细胞计数，根据各指标检测试剂盒要求的细胞数制成胶滴分别种胶，待充分凝固后加入小鼠肝脏类器官培养基培养24h。
2)检测细胞活力：空白对照组加入0.1％DMSO，药物处理组分别加入0.0032uM、0.016uM、0.08uM、0.4uM、2uM、10uM米托蒽醌，7天后使用Promega
Figure BDA0002625303620000091
3D CellViabilityAssay试剂盒检测细胞活力。结果如图4所示，米托蒽醌对小鼠肝脏类器官的半数致死剂量为0.1922uM。
3)检测细胞色素P450代谢酶CYP3A4和转氨酶AST、ALT：空白对照组加入0.1％DMSO，药物处理组加入2uM米托蒽醌，3天后使用PromegaP450-GloTMAssays试剂盒检测细胞色素P450代谢酶CYP3A4；用Biovision Aspartate Aminotransferase(AST or SGOT)Activity Colorimetric Assay Kit试剂盒检测转氨酶AST；用BiovisionAlanineAminotransferase(ALT or SGPT)Activity Colorimetric/Fluorometric Assay Kit试剂盒检测转氨酶ALT。如图5所示，与对照组相比，2uM米托蒽醌处理3天后，小鼠肝脏类器官CYP3A4活性明显降低，而AST水平明显上调，ALT表达水平没有明显变化。说明低浓度的米托蒽醌就能明显降低肝细胞解毒能力，造成轻度肝损伤。
对比例1
本对比例提供的药物评价模型为现有的Huh-7细胞系，通过该模型对磷酸氯喹肝毒性进行评价的方法，包括以下步骤：
1)Huh-7细胞培养至90％汇合度后进行细胞传代并计数，根据各指标检测试剂盒要求的细胞数分别接种细胞，于37℃，5％CO2环境下培养24h。
2)检测细胞活力：空白对照组加入0.1％DMSO，药物处理组分别加入3uM、15uM、30uM、45uM、60uM、75uM磷酸氯喹，7天后使用细胞增殖及毒性检测试剂盒(CCK-8)检测细胞活力。结果：磷酸氯喹对Huh-7细胞的半数致死剂量为17.00uM。该数据和实施例1的数据相差一倍以上。类器官是指利用干细胞体外培养出的3D细胞培养物，与来源器官拥有高度相似的组织学特征，并能重现该器官的生理功能。而肝脏具有很强的再生修复能力，由此推测，在药物作用下，由于类器官结构较传统细胞系复杂，对药物的反应更接近于正常的生理状态，解毒能力更优于传统2D细胞系。
综上所述，本发明在对药物肝毒性评价过程中，不但观测了细胞活力值，还检测了谷丙转氨酶和谷草转氨酶的变化，以及代谢酶CYP3A4的变化水平。由于肝脏代谢过程非常复杂，不同的药物由于作用机制的差异也会出现不同的药物反应，利用这四种特征性指标的结果综合评价药物的肝毒性，更加符合人体生理变化过程，避免造成假阳性。并且周期短，操作简便，可代替传统细胞系模型和动物模型，用于临床前新药开发及临床药物肝毒性评估。采用本发明的方法在体外进行药物性肝损伤评价中能够准确预测药物不良反应的发生，降低新药开发成本，最关键是可以减少由药物给患者带来的不良后果。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (9)

1.一种基于肝脏类器官模型的药物肝毒性评价方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一，小鼠肝脏类器官模型的建立：
(1)取小鼠肝脏组织，依次进行清洗、剪切、消化及过滤处理，获得小鼠肝脏干细胞；
(2)将小鼠肝脏干细胞制胶后采用培养基培养，获得肝脏类器官模型；
步骤二，将肝脏类器官模型进行药物处理：
将待测药物设置成多个浓度梯度，然后将肝脏类器官模型给予不同浓度梯度下的药物刺激，并在不同时间点收集类器官样本，观察其形态学变化并检测肝功能指标。
2.根据权利要求1所述的一种基于肝脏类器官模型的药物肝毒性评价方法，其特征在于：所述清洗处理包括：采用含1％青链双抗的生理盐水反复进行数次，直至剔除明显的脂肪组织。
3.根据权利要求1所述的一种基于肝脏类器官模型的药物肝毒性评价方法，其特征在于：所述消化处理包括：①将剪切好的组织分散在生理盐水中，离心去上清后往沉淀中加入胶原酶、分散酶与DNaseI，于37℃震荡消化30min，加入含1％青链双抗的生理盐水终止消化，静置，收集细胞沉淀；②继续往沉淀内加入胶原酶、分散酶与DNaseI，于37℃震荡消化2h，加入含1％双抗的青链生理盐水终止消化，静置沉淀，收集上清。
4.根据权利要求1所述的一种基于肝脏类器官模型的药物肝毒性评价方法，其特征在于：所述过滤处理包括：将消化处理获得的上清液经100μm的滤网过滤，收集滤液，将滤液于常温下1000～1200rpm离心5min，收集肝脏干细胞沉淀。
5.根据权利要求1所述的一种基于肝脏类器官模型的药物肝毒性评价方法，其特征在于：所述将小鼠肝脏干细胞沉淀制胶，具体包括：通过Advanced DMEM/F12重悬过滤后的细胞沉淀，取Matrigel胶于4℃融化过夜，与细胞悬液充分混匀后静置。
6.根据权利要求5所述的一种基于肝脏类器官模型的药物肝毒性评价方法，其特征在于：所述将小鼠肝脏干细胞沉淀制胶后采用培养基培养，具体包括：采用以下终浓度组分组成的培养基：不含Vit-A的B27，1-2X；EGF，45-55ng/ml；Gastrin，8-12nM；HGF，50-55ng/ml；N-acetylcysteine，1-2mM；R-spondin1，90-110ng/ml；FGF10，100-120ng/ml；Nicotinamide，10-12mM；FGF7，40-60ng/ml；A83-01，10-15nM；Y-27632，10-15μM；CHIR99021，1-5uM；OncostatinM，10-15ng/ml；Glutamax，1-2X；青霉素链霉素混合液，1-3X；HEPES，0.5-0.8mM，加入至制得的胶中，于37℃、5％CO2浓度下培养7-12天，期间每间隔3-4天更换一次所述培养基。
7.根据权利要求1所述的一种基于肝脏类器官模型的药物肝毒性评价方法，其特征在于：所述将肝脏类器官模型进行药物处理，还包括：将肝脏类器官模型给予0.1％DMSO处理作为空白对照，在不同时间点收集该空白对照的类器官样本，观察形态学变化并检测肝功能指标。
8.根据权利要求7所述的一种基于肝脏类器官模型的药物肝毒性评价方法，其特征在于：所述检测肝功能指标包括：
1)药物处理7天后使用Promega CellTiter-
Figure FDA0002625303610000021
3D Cell Viability Assay试剂盒检测药物处理组和空白对照组的细胞活力。
2)药物处理3天后使用Promega P450-GloTM Assays试剂盒检测细胞色素P450代谢酶CYP3A4
3)药物处理3天后使用Biovision Aspartate Aminotransferase(AST or SGOT)ActivityColorimetric Assay Kit试剂盒检测药物处理组和空白对照组的谷草转氨酶AST。
3)药物处理3天后使用Biovision Alanine Aminotransferase(ALT or SGPT)ActivityColorimetric/Fluorometric Assay Kit试剂盒检测药物处理组和空白对照组的谷丙转氨酶ALT。
9.根据权利要求8所述的一种基于肝脏类器官模型的药物肝毒性评价方法，其特征在于：采用所述肝功能指标进行肝损伤判断的标准为：
1)药物处理组与空白对照组细胞活力值之间的P<0.05时，药物对类器官造成轻度肝损伤，反之，则无损伤作用；药物处理组与空白对照组细胞活力值之间的P<0.01时，药物对类器官造成中度肝损伤；药物处理组与空白对照组细胞活力值之间的P<0.001时，药物对类器官造成重度肝损伤。药物对细胞的杀伤力最直观的体现为细胞数量的变化，因此，细胞活力的大小可直观反应药物对细胞的抑制程度的高低。
2)药物处理组与空白对照组CYP3A4之间的P<0.05时，药物对类器官造成轻度肝损伤，反之，则无损伤作用；药物处理组与空白对照组CYP3A4之间的P<0.01时，药物对类器官造成中度肝损伤；药物处理组与空白对照组CYP3A4之间的P<0.001时，药物对类器官造成重度肝损伤。CYP3A4为人体细胞色素P450代谢酶之一，是生理代谢过程中的关键酶，CYP3A4合成的多少决定了肝脏解毒能力的高低，CYP3A4合成的显著下降预示了肝功能损害程度越高。
3)药物处理组与空白对照组谷丙转氨酶ALT之间的P<0.05时，药物对类器官造成轻度肝损伤，反之，则无损伤作用；药物处理组与空白对照组谷丙转氨酶ALT之间的P<0.01时，药物对类器官造成中度肝损伤；药物处理组与空白对照组谷丙转氨酶ALT之间的P<0.001时，药物对类器官造成重度肝损伤。临床上，药物性肝损伤可分为肝细胞损伤型、胆汁淤积型和混合型。肝细胞损伤型以谷丙转氨酶(ALT)升高和(或)谷草转氨酶(AST)明显升高为主要表现，ALT和AST升高多少反映了肝细胞的损伤程度。因此，检测AST和ALT的变化是十分必要的。
4)药物处理组与空白对照组谷草转氨酶AST之间的P<0.05时，药物对类器官造成轻度肝损伤，反之，则无损伤作用；药物处理组与空白对照组谷草转氨酶AST之间的P<0.01时，药物对类器官造成中度肝损伤；药物处理组与空白对照组谷草转氨酶AST之间的P<0.001时，药物对类器官造成重度肝损伤。
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