CN114292736A - 基于微纳时空传感与类器官芯片的多参数药物检测仪器 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于微纳时空传感与类器官芯片的多参数药物检测仪器，该仪器系统由培养箱内外两部分组成。在细胞培养箱内，微纳传感芯片端(包含多通道类器官阻抗检测传感芯片，类器官代谢离子检测传感芯片，心脏损伤标志物检测芯片，多通道心脏类器官电位‑阻抗联合检测芯片)通过排针建立电气连接并固定在屏蔽测量盒内的芯片端转接电路版上，在细胞培养箱外由数据采集卡、主控电路、类器官阻抗检测电路、电位‑阻抗联合检测电路、电化学检测电路构成传感器信号检测电路端，锂电池模块实现对检测电路供电，计算机实现检测信号的采集和实时显示药物对各个类器官的影响。

Description

基于微纳时空传感与类器官芯片的多参数药物检测仪器

技术领域

本发明属于药物检测领域，具体涉及一种基于微纳时空传感与类器官芯片的多参数药物检测仪器。

背景技术

目前存在的临床前药物筛选模型分四类：整体动物水平模型、组织器官水平模型、体外3D细胞模型和体外2D细胞模型。体外动物模型作为一种广泛使用的模型具有能直观反映药物作用的优势，但是很重要的一点是人与动物之间存在生物学差异，一些生物学限制削弱了昂贵耗时的动物模型的可预测性。2D细胞测定方法(cell assay)一直是药物发现过程中的重要支柱，它具有简单、快速且经济高效的特征，可以用来避免进行大规模且成本密集型的动物实验，虽能提供快速和可重复的响应。但是它依赖于2D细胞培养，难以模拟在体肿瘤的微环境与空间结构和异质性。

体外3D细胞模型可以更准确地表示细胞在组织中时的实际微环境，且更能够反映在体细胞反应。2013年Science首次将类器官定义为由干细胞或者前体细胞分化发育产生、具有器官特异性的细胞种群，其能模拟人体器官的功能，细胞种群在其中的空间分布也和人体器官相似，体外类器官模型比体外3D细胞模型更接近于在体情况，实验结果更有效。

组织工程学的进展，新生物材料的开发和创新技术的发展，这些都极大地影响了体外类器官模型的制造。从体外类器官模型培养物的遗传分析获得的数据比从动物模型获得的数据与人体组织特征的关联更好，因此在体外和体内模型中药物反应的可靠性之间的相关性方面，可以将基于类器官的癌症模型作为动物实验与人体实验之间的桥梁。同时，使用体外类器官癌症模型可以替代传统的筛查方法，并满足高通量自动化系统与高内涵成像分析的需求，能够从两个方面解决抗肿瘤药物开发耗时久，成本高、成功率低的问题。一是，可以减少临床前试验阶段所需的动物数量，从而降低药物测试过程的总体成本。同时，在预测药物功效和毒性方面更加可靠，降低了药物从市场撤回的风险，能够提早撤销候选药物。

国家对药品安全和检测的高度重视，新化合物进入市场概率为万分之一，每年约85％药物因安全问题而撤回。目前国际上目前国际上药物筛查主要是依据药效学方法，建立离体细胞和实验动物的模型。上述方法的缺点是效率低、与人体差异性大等，且目前还没有仪器可以用于类器官模型的多参数药物检测。

研制基于微纳时空传感与类器官芯片的多参数药物检测仪器，实现通过对类器官的生化参数的高通量实时动态检测，辅助药物筛选，提高药物检测的准确性和筛选效率，为分子筛选、药物优化、动物实验以及临床实验等提供科学的生化评价参数，提高药物化合物的筛选效率和成功率。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种基于微纳时空传感与类器官芯片的多参数药物检测仪器，可对体外类器官模型生理参数进行同时检测和分析。本发明的核心部件传感芯片采用MEMS技术加工，采用微流控技术和信号处理技术研制基于微纳时空传感与类器官的高通量多参数药物评价装置，能够长时间评估药物的作用效果。

本发明解决其技术问题所采取的技术方案是：一种基于微纳时空传感与类器官芯片的多参数药物检测仪器，包括检测仪器培养箱以及放置在培养箱中的检测仪器屏蔽箱，所述检测仪器屏蔽箱上具有芯片转接电路板，所述芯片转接电路板上通过排针排母安装有多通道类器官阻抗检测传感芯片、代谢离子(K⁺、Na⁺、Ca²⁺)检测传感芯片、心脏损伤标志物检测传感芯片和多通道心脏类器官电位-阻抗联合检测传感芯片；所述代谢离子(K⁺、Na⁺、Ca²⁺)检测传感芯片经过恒电位电路以及电流-电压转换电路实现检测信号的电流电压转换与放大处理；

所述多通道类器官阻抗检测传感芯片由体外构建的肺癌类器官、肝癌类器官和小肠类器官与多通道阻抗检测传感芯片耦合构建而成；

所述多通道心脏类器官电位-阻抗联合检测传感芯片，选用心肌细胞与血管内皮细胞共同构建体外3D心肌细胞模型；同时将构建的3D心肌细胞模型与阻抗-电位联合检测芯片耦合，共同构建多通道心脏类器官电位-阻抗联合传感检测芯片。

所述代谢离子(K⁺、Na⁺、Ca²⁺)检测传感芯片，通过在微纳加工的LAPS芯片上划分区域并修饰Na⁺、Ca²⁺和K⁺敏感膜，同时Si基上沉积的绝缘层Si₃N₄作为H⁺敏感材料，来构建离子敏LAPS(ISLAPS)芯片，即代谢离子(K⁺、Na⁺、Ca²⁺)检测传感芯片。

所述心脏损伤标志物检测传感芯片，通过在微纳加工得到的玻璃基上电极表面修饰mAb-SH/AuNPs/MXene@PAMAM材料来构建。

各传感芯片的检测信号通过信号连接线传输至主控电路；所述主控电路上连接有多通道类器官阻抗检测电路、多通道心脏类器官电位-阻抗联合检测电路和心脏损伤标志物检测电路以及数据采集卡；各检测电路实现对应传感芯片的检测信号的处理，与电流电压转换与放大处理后的代谢离子(K⁺、Na⁺、Ca²⁺)检测传感芯片检测信号，共同传输到数据采集卡采集；数据采集卡采集后的信号传输至上位机处理并显示保存；

利用多通道心脏类器官电位-阻抗联合检测传感芯片，记录3D心肌细胞模型的胞外场电位波形和阻抗数据，提取频率、幅值和波峰波谷，计算场电位幅值，发放频率，上升时间和场电位时程来评估抗癌药物的心脏毒副作用；利用多通道类器官阻抗检测传感芯片来实时监测肺癌类器官、人源肝脏类器官和小肠类器官的生长状态，同时将抗癌药物刺激后的阻抗数据值转换为IC50半抑制浓度，来定量评估抗癌药物的有效性以及肝脏毒性。利用代谢离子(K⁺、Na⁺、Ca²⁺)检测传感芯片对类器官生长微环境中的K⁺、Na⁺、Ca²⁺进行检测，评估抗癌药物作用过后类器官生长环境中离子浓度变化；利用没有心脏损伤标志物检测传感芯片检测心脏类器官生长环境中的cTnT蛋白浓度以评估待筛选药物的心脏毒性。

进一步地，所述检测仪器培养箱为多通道心脏类器官电位-阻抗联合检测传感芯片中的3D心肌细胞以及多通道类器官阻抗传感芯片中的肺癌类器官、肝类器官、小肠类器官提供生长环境；二氧化碳气瓶提供气体环境。

进一步地，4类传感芯片之间的流路连接参照人体血液循环系统中，肺癌患者口服化疗药物后，药物在体内的代谢过程(依次经过肠道、肝脏、心脏和肺癌部位)；首先多通道类器官阻抗检测传感芯片中培养有小肠类器官和肝类器官的传感腔依次连接，接着连接多通道心脏类器官电位-阻抗联合检测传感芯片和心脏损伤标志物检测传感芯片，最后依次连接多通道类器官阻抗检测传感芯片中培养有肺癌类器官的培养腔和代谢离子(K⁺、Na⁺、Ca²⁺)检测传感芯片；上述四类芯片各传感单元通过硅胶微孔管来实现流体通路连接。

进一步地，所述检测仪器的流路连接均通过硅胶微孔管来实现；培养箱内各样品池首先与管路分配器连接，接着管路分配器的出液口连接有电磁阀，然后依次连接流阻调节计和微流体流速传感器，微流体流速传感器出液口连接多通道类器官阻抗检测传感芯片中培养有小肠类器官腔体入液口，经过各传感芯片后，最终废液流入废液池进行收集。

进一步地，类器官阻抗芯片检测电路包括有微控制器MCU、直接数字频率合成器DDS模块、AD采样模块、滤波模块、DC-DC降压模块和LDO线性稳压电源模块；

所述微控制器MCU与直接数字频率合成器DDS模块之间通过I²C协议进行通讯，根据设定频率和幅值产生的正弦激励信号滤波后施加到多通道类器官阻抗传感芯片的工作电极；多通道类器官阻抗传感芯片检测到的信号经过滤波模块处理后由AD采样模块采样，经过微控制器MCU采集后传输给上位机；所述上位机与微控制器MCU之间通过USB串口通讯，微控制器MCU与AD采样模块之间通过SPI协议进行通讯；所述多通道类器官阻抗芯片检测电路通过USB供电后，经由DC-DC降压模块和LDO线性稳压模块后给类器官阻抗芯片检测电路中其他电气元件供电。

进一步地，所述多通道心脏类器官电位-阻抗联合检测电路由屏蔽电路模块、前置低噪放大模块、带阻滤波模块、二级放大模块、高通滤波模块、低通滤波模块、电压跟随模块、电流-电压转换模块、激励衰减模块和信号缓冲模块构成；

所述多通道心脏类器官电位-阻抗联合检测电路进行阻抗测量时，NI数据采集卡产生激励信号通过激励衰减模块和信号缓冲模块施加在多通道心脏类器官电位-阻抗联合检测传感芯片上，传感芯片产生的响应信号经由屏蔽电路模块、电流-电压转换模块、高通滤波模块和电压跟随模块处理过后由NI数据采集卡采集；所述多通道心脏类器官电位-阻抗联合检测电路进行电位测量时，多通道心脏类器官电位-阻抗联合检测传感芯片上的电位信号通过前置低噪放大模块放大，带阻滤波模块滤波，二级放大模块进一步放大，最后通过低通滤波模块和电压跟随模块由数据采集卡采集。

进一步地，所述检测仪器屏蔽箱中具有聚焦光路、恒电位电路模块和电流-电压转换电路模块，且检测仪器屏蔽箱上插有离子敏光寻址电位传感器(ISLAPS)芯片，培养箱外部具有激光驱动模块和信号发生模块；

所述聚焦光路模块由带尾纤的激光二极管、激光准直器、45°反射棱镜、扩束器和非球面透镜组成，带尾纤的激光二极管与激光驱动模块连接，同时激光二极管的尾纤与激光准直器耦合，使光纤的出射光准直，45°反射棱镜与光纤准直器安装在同一水平轴上，扩束器和非球面透镜依次安装在垂直轴上，光的传播顺序依次通过上述元件；代谢离子(K⁺、Na⁺、Ca²⁺)检测模块中，激光驱动模块(Thorlabs,USA)和信号发生器调制激光二极管产生激光，经由聚焦光路模块，激光聚焦在ISLAPS芯片背面作为代谢离子(K⁺、Na⁺、Ca²⁺)检测传感芯片的激励信号源；所述恒电位电路模块调节代谢离子(K⁺、Na⁺、Ca²⁺)检测传感芯片的参比电极电位等于设定值，且保证无电流流过参比电极；所述电流-电压转换模块将流过代谢离子(K⁺、Na⁺、Ca²⁺)检测传感芯片的工作电极电流转换为电压，并被数据采集卡采集；采用数字(软件)锁相，通过乘法器和低通滤波器对设定频率的信号进行检测；所述ISLAPS芯片，通过在LAPS器件表面修饰离子敏感膜来实现对K⁺、Na⁺、Ca²⁺的检测。

进一步地，所述心脏损伤标志物检测电路由恒电位电路模块、电流-电压转换电路模块和低通滤波与放大模块构成；所述恒电位模块调节心脏损伤标志物检测传感芯片的参比电极电位等于设定值，且保证无电流流过参比电极；所述电流-电压转换模块将流过心脏损伤标志物检测传感芯片的工作电极电流转换为电压，经过和低通滤波与放大模块后被数据采集卡采集。

本发明的有益效果：

本发明的多参数药物检测仪器检测电路采用模块化设计思路，不同功能模块的电路单独制板，便于后续增加检测参数，以及扩展测量仪器的通量；模拟电路部分均实现信号的调理和滤波等功能，数据采集功能选用商用的数据采集卡来实现，方便灵活增减的配置通量和设计实验；信号的预处理电路放置在培养箱内的检测仪器屏蔽箱内，保证nA级电流信号和uV级电压信号能够被采集到，后续的信号检测电路放置在培养箱外的仪器盒内，减少检测电路板受培养箱内湿度环境的影响，延长仪器使用寿命。本发明多参数药物检测仪器具有非侵入性，实时检测和分析的优点，通过上位机软件实时控制下位机电路和流路系统，实现一体化自动化分析。

本发明的多参数药物检测仪器通过微纳传感器技术、微流控技术和信息处理技术研制基于微纳时空传感与人体类器官芯片的高通量多参数药物评价装置，探究细胞水平、类器官水平和人体器官芯片水平的药物筛选模型。该方案具有递进式、更快速和全面反映被筛药物生物活性的综合评价，可通过一次试验获得多个参数的高内涵信息，能够进行高通量、高效率和低成本地药物筛选，减少药物筛选的周期。

附图说明

图1是本发明药物检测仪器的结构示意图；

图2是本发明类器官芯片转接电路板的结构示意图；

图3是本发明4类传感检测芯片在仪器上的安装示意图

图4是本发明4类传感检测芯片结构示意图；

图5是本发明信号前级处理电路结构示意图；

图6是本发明聚焦光路系统结构示意图；

图7是检测仪器屏蔽箱结构示意图；

图8是流路控制系统工作示意图；

图9是本发明多通道类器官阻抗检测电路原理图；

图10是检测电路端仪器安装示意图；

图11是本发明类器官电位-阻抗联合检测电路原理图；

图12是本发明类器官代谢离子检测模块系统示意图；

图13是本发明心脏损伤标志物检测电路原理图；

图14是本发明检测电路端仪器安装后的结构示意图；

图15是本发明主控电路机械结构示意图；

图16是类器官电位-阻抗联合检测电路结构示意图；

图17肺癌类器官LCO-1培养3、7天时的显微镜下照片；

图18肝类器官传代前后显微镜下照片；

图19小肠类器官不同培养阶段形态；

图20光打印3D支架接种心肌细胞前后的显微镜下照片；

图21病人来源肺癌类器官和HCC827来源类器官受到AC0010作用后的阻抗变化；

图22为传感器接种3D原代心肌模型前(A)后(B)仪器测得信号；

图23为肝癌类器官和空白组在5天内的四种离子浓度变化，以及去除空白组变化的差分结果；

图24为由ELISA试剂盒和免疫传感器测得的cTnT蛋白浓度的相关性曲线。

图1中：1、多通道压力控制器，2、多通道微阀控制器，3、激光驱动器，4、信号发生器，5、单模光纤，6、流路控制系统进液端，7、流路控制系统出液端，8、类器官传感检测芯片端，9、细胞培养箱，10、流路系统管路分配器，11、储样试管(超纯水)，12、储样试管(药物溶液)，13、储样试管(培养基溶液)，14、聚焦光路系统，15、微流体流速传感器，16、流阻调节器，17、电磁阀，18、恒电位电路和I-V转换电路模块，19、检测仪器屏蔽箱，20、类器官芯片转接电路板，21、废液缸，22、NI数据采集卡，23、空气压缩泵，24、计算机，25、主控电路，26、锂电池，27、类器官阻抗检测电路板，28、阻抗-电位联合检测电路板，29、电化学检测电路板(离子和蛋白)，30、培养箱外仪器

图2中：20.1、D-SUB78公接口，20.2、代谢离子(K⁺、Na⁺、Ca²⁺)检测传感芯片接口，20.3、心脏损伤标志物检测传感芯片接口，20.4、多通道类器官阻抗检测传感芯片接口，20.5、多通道心脏类器官电位-阻抗联合检测传感芯片接口，20.6、卧式5.08直流电源接口，20.7、数据采集卡的模拟输出接口，20.8、射频接口，20.9、数据采集卡的模拟输入接口；

图3、4中：8.1、多通道类器官阻抗检测传感芯片，8.2、多通道心脏类器官电位-阻抗联合检测传感芯片，8.3、心脏损伤标志物检测传感芯片，8.4、代谢离子(K⁺、Na⁺、Ca²⁺)检测传感芯片；

图7中：19.1、检测仪器屏蔽箱顶壳，19.2、LDO电路模块，19.3、恒电位和电流-电压转换模块，19.4、激光聚焦光路模块，19.5、微小电流放大模块，19.6、直流稳压电源，19.7、流阻调节器，19.8、电磁阀，19.9、微流体流速传感器；

图10中：30.1、12V锂电池组，30.2、多通道类器官阻抗检测电路，30.3多通道心脏类器官电位-阻抗联合检测电路，30.4、数据采集卡，30.5、主控电路板，30.6、仪器外壳；

具体实施方式

以下结合附图及具体实例对本发明作详细描述，但并不限制本发明。

图1是本发明药物检测仪器系统的结构示意图。它由培养箱内外两部分组成，培养箱内包含带检测仪器屏蔽箱19，传感芯片端8通过排针插拔的方式安装在类器官芯片转接电路板20上。仪器系统的前端信号处理模块均安装在19内，19放置在细胞培养箱9内。

药物筛检测器系统的流体控制，通过空气压缩泵23压缩气体并输送给多通道压力控制器1，压力控制器各通道输出气压至储样试管，多个储样试管11、12、13等的液体通过管路分配器选定通路后流入流路系统的进液端，多通道压力控制器1同时接收流阻传感器16的输出数据来实时调整输出气压的大小，实现流路系统流速的PID控制。流阻调节计16可手动调节系统流阻，从而将系统流速控制在更低水平。多通道电磁阀控制器2配合电磁阀15实现多通道流路的通断控制，流路系统中的液体灌注类器官传感检测芯片端8中的所有功能芯片，最终经由流路控制系统出液端7将废液排弃至废液缸21内。培养箱9能够提供各类器官生长代谢所需要的温度、湿度和二氧化碳浓度环境。

图2为类器官传感检测芯片的转接电路板的结构示意图。多通道类器官阻抗检测传感芯片通过接口20.4固定在转接电路板上，多通道心脏类器官电位-阻抗联合检测传感芯片通过接口20.5固定在电路板上，代谢离子(K⁺、Na⁺、Ca²⁺)检测传感芯片通过接口20.2固定在电路板上，心脏损伤标志物检测传感芯片通过接口20.3固定在电路板上。20.7为数据采集卡的模拟输出接口；20.9为数据采集卡的模拟输入接口；20.8的射频接口通过屏蔽线与代谢离子(K⁺、Na⁺、Ca²⁺)检测传感芯片和心脏损伤标志物检测传感芯片连接；20.6为卧式5.08直流电源接口。所有数据接口均走线汇集到D-SUB78公接口20.1处，并通过一根D-SUB78公对公线缆与主控电路板28连接。

图3为类器官传感检测芯片在仪器中的安装示意图，8.1为多通道类器官阻抗检测传感芯片，8.2为多通道心脏类器官电位-阻抗联合检测传感芯片，8.3为心脏损伤标志物检测传感芯片，8.4为代谢离子(K⁺、Na⁺、Ca²⁺)检测传感芯片。芯片的接口处皆焊接排针来建立电气连接，并通过插拔的方式安装在类器官芯片转接电路板20上。采用模块化设计思路，设计实验时，可以根据所要检测参数种类自由插拔对应功能的检测芯片。图4为类器官传感检测芯片的封装示意图。多通道类器官阻抗检测传感芯片8.1采用PMMA层-类器官阻抗检测芯片-PDMS层-PMMA层三明治夹心结构，底层和顶层的PMMA板四条边附近通过激光切割了M3的通孔，通过螺栓螺母来固定，传感芯片上的测量腔为PET材质，它通过环氧树脂粘胶固定在传感单元处，PDMS层联合双层PMMA层实现测量腔体的密封。多通道心脏类器官电位-阻抗联合检测传感芯片8.2采用芯片-PMMA腔-PDMS盖结构，PMMA腔体通过紫外光固化胶粘接在玻璃基的芯片上，并使用环氧树脂粘胶做防漏液加固；实验时将培养有心肌细胞的PEGDA-GelMA的支架放置在培养腔内，然后安装倒模得到的PDMS盖子进行密封；心脏损伤标志物检测传感芯片8.3和代谢离子(K⁺、Na⁺、Ca²⁺)检测传感芯片8.4通过O₂等离子体表面处理过后的芯片与PDMS测量腔键合得到。

图7为培养箱内检测仪器屏蔽箱结构示意图。LDO电路板模块19.2、心脏损伤标志物检测电路模块19.3和激光聚焦光路模块19.4通过M3铜柱固定在倒U形支架上；LDO电路模块19.2将锂电池+12V供电转换为±5V后，给心脏损伤标志物检测电路模块上的的运算放大器和芯片供电；19.3包含恒电位模块与电流-电压转换模块，可将心脏损伤标志物检测传感芯片8.3上工作电极测得得电流信号经跨阻放大器转换为电压信号并低通滤波和放大后给数据采集卡采集；激光聚焦光路模块19.4固定有光纤准直器，45°反射镜和聚焦透镜，将激光控制器调制的激光聚焦在代谢离子检测芯片ISLAPS 8.4上，并作为ISLAPS传感芯片的激励源。微小电流(nA级)放大模块19.5实现对ISLAPS芯片工作电极上电流的放大；直流稳压电源19.6固定在3D打印的ABS树脂支架上，它输出直流电压用于给微小电流放大模块供电；仪器系统采用水-电分离的设计思路，流体控制模块中的阻调节器19.7、电磁阀19.8和微流体流速传感器19.9固定在仪器系统的底层，与仪器上层的电路板隔离开来，以免漏液时损坏电路模块。LDO电路模块和电化学测量电路板模块的结构如图5所示，激光聚焦光路模块的支架结构图如图6所示，圆形环扣和方形卡槽分别用于固定激光准直器和45°反射镜。

图8是流路控制系统工作示意图。该系统是通过上位机LabVIEW软件控制多通道压力控制器各个通道的空气压力输出，利用空气压力推动样品池中的液体依次进入后续的电磁阀、流阻调节计、微流体流速传感器和类器官检测传感芯片。微流体流速传感器与多通道压力控制器相连，它将通过传感器液体的流速实时反馈给压力控制器和上位机，上位机通过比较反馈值和目标值，实时控制压力控制器调整输出气压压力值，从而实现流路系统中流速的PID控制(控制范围为0-7uL/min)；电磁阀与多通道阀控制器相连，上位机软件控制多通道阀控制器的输出电压来控制电磁阀，从而实现流路的通断控制；管路分配器与上位机相连，可以通过程序切换选通所需加样的样品池，实现流路系统的自动化灌注；废液池用于收集流路系统中的代谢废液。

图10为检测电路端仪器安装示意图，安装后的结构示意图如图14所示。12V锂电池组30.1安装在仪器架内，用于给仪器的部分电路模块供电；多通道类器官阻抗检测电路板30.2使用铜柱固定在仪器架上，用于检测肺癌类器官、肝类器官和小肠类器官的活性；多通道心脏类器官电位-阻抗联合检测电路板30.3如图10所示安装，用于检测体外3D心肌模型的活性和胞外场电位信号；数据采集卡30.4安装在仪器底部，将各模块电路处理过后得信号采集并传输至上位机LabVIEW；主控电路板30.5固定在仪器外壳背面，外壳开口处正好露出DB78接口，且与培养箱检测芯片端仪器上的DB78接口通过一根DB78信号线缆相连，实现检测信号的传输；主控电路将各类传感器的检测信号传输给各个功能模块，实现对传感器信号的检测和处理来实现对各个模块的控制，图15是本发明主控电路机械结构示意图；仪器外壳30.6用于固定仪器各功能模块。

图9是本发明多通道类器官阻抗检测电路原理图。电路版上部分芯片由USB接口的+5V供电，通过DC-DC和LDO线性稳压模块，可以得到给STM32微处理器供电的+3.3V电压。通过微处理器作为控制单元，直接数字频率合成器DDS产生设定频率(1KHz、10KHz、25KHz)的正弦信号，经信号调理电路滤波后作为激励信号施加到类器官阻抗传感芯片的工作电极上；电流信号经跨阻放大器转换为电压信号被AD采样模块采集，并传输给微控制器MCU；通过快速傅里叶变换FFT提取信号幅值，然后通过标定的校准曲线计算阻抗真实值，即可以得到该传感单元的类器官阻抗。激励信号频率选频由上位机LabVIEW程序通过USB串口通讯发送给下位机16进制指令来设定。因类器官阻抗信号的时间分辨率小，采取时分复用的方式依次访问类器官阻抗芯片的各个通道来实现多通道实时检测。

图11为多通道心脏类器官电位-阻抗联合检测电路。阻抗检测时，数据采集卡模拟输出(AO)通道产生(1KHz、10KHz、25KHz)的正弦激励信号，通过信号衰减和跟随器缓冲施加到电位-阻抗联合检测芯片的工作电极上，参比电极上的电流信号通过前置低噪放大模块中的跨阻放大器转换为电压信号，经带阻滤波和二级放大，在通过低通滤波和电压跟随，电压信号被数据采集卡采集。电位信号采集时，微电极阵列上电压信号经I-V转换过后，由高通滤波模块滤波后最终由NI数据采集卡的模拟输入(AI)通道采集。该模块主要用于体外3D心肌细胞模型的活性和电位检测，并用于评估待检测药物的心脏毒性。图16是多通道心脏类器官电位-阻抗联合检测电路结构示意图。

图12为是类器官代谢离子检测模块系统示意图。激光驱动器驱动带尾纤的激光二极管发射波长685nm的激光，并由信号发生器产生10KHz的正弦信号进行调制；激光经光纤准直器准直，45°反射镜反射，激光扩束器扩束，最终由非球面透镜聚焦在ISLAPS芯片的背面作为传感器检测的激励；采用电化学三电极，使用PDMS微腔进出液口不锈钢导管分别连接到参比电极和对电极，工作电极连接到ISLAPS芯片背面的欧姆接触处；参比电极和对电极连接到恒电位模块；数据采集卡的AO通道输出直流偏置电压给对电极和参比电极上，流过工作电极的电流信号通过微小电流放大模块转换为电压信号并被数据采集卡采集，采样速率为100K Sample/s；传感器响应信号与激励信号具有相同频率特征，采用数字锁相的方法，通过上位机LabVIEW进行提取；ISLAPS芯片上的四个区域分别修饰有Na⁺、Ca²⁺和K⁺敏感膜，Si基上沉积的绝缘层Si₃N₄可作为H⁺敏感材料；二轴电动位移台通过控制光斑“S形”运动来实现ISLAPS的寻址，实现类器官代谢微环境中的Na⁺、Ca²⁺、K⁺和H⁺的检测。

图13是本发明心脏损伤标志物检测电路原理图。数据采集卡模拟输出通道AO输出直流电压给传感芯片的参比电极和对电极，工作电极上的电流信号经电流-电压转换模块转换为电压信号，经低通滤波和放大后被数据采集卡采集。传感转导机制是微分脉冲伏安法(DPV)，采用DPV来收集对不同浓度cTnT的响应。当目标生物分子被特异性识别并捕获到mAb-SH/AuNPs/MXene@PAMAM/SPCE表面时，会形成绝缘阻挡层并导致氧化还原探针扩散受阻。这种行为也阻碍了电子在电极/溶液界面上的转移，最终导致DPV峰的降低。因此，捕获并固定在修饰电极上的蛋白质靶标越多，DPV峰值电流下降得越多。

本发明的多参数药物检测仪器工作原理是：将3种类器官(肝、肺、小肠)使用Matrigel混合构建体外类器官模型，并接种在多通道3D阻抗检测传感芯片的不同培养腔内，其中多通道3D阻抗检测传感芯片的构建方法参考已授权专利，专利号CN201910313816.2，一种用于抗肿瘤药物筛选的高通量3D细胞阻抗传感器及检测方法；3D细胞阻抗传感器的传感单元以玻璃作为传感器基底，在基底上固定有一对垂直竖立且正对放置的金对电极，其通过激光精密切割获得并物理弯折90°得到，金电极厚度为100μm，边长为2mm×5mm的长方形结构，长边与基底平行并通过物理弯折成90°的结构，一端为2mm×1mm，另一端为2mm×4mm，其中，2mm×1mm的金电极作为工作电极，2mm×4mm的金电极作为引线，垂直金对电极的间距为6mm；金对电极背面与培养腔内壁固定连接，培养腔固定在基底上，PCB板上固定若干个传感单元，采用导电银胶对传感单元和PCB转接板上的焊盘进行电气连接；构建的体外类器官模型接种在培养腔内，与垂直金对电极接触，将待测药物加入至细胞培养腔中，实时监测类器官阻抗指标。将人源的心肌细胞接种在光固化制备的3D心肌支架上，构建人源的3D心肌模型，并接种到阻抗-电位联合检测传感芯片上，其中阻抗-电位联合检测芯片中的微腔传感单元与电极构建方法共同参考已授权专利，专利号CN201811474716.X，一种用于3D细胞活性及增殖能力实时监测的微腔阻抗传感器及制备方法，以及已公开专利，专利号CN202110244911.9，一种用于3D心肌细胞胞外电位检测的高通量微腔电位传感器及检测方法，最终得到微腔尺寸300μm×300μm，深度100μm，坡度57.3°，电极尺寸为100μm×50μm；阻抗检测方法参考专利CN201811474716.X，电位检测方法参考专利号CN202110244911.9；采用PDMS浇筑模具，脱模后作为芯片的培养腔，激光切割PMMA材料制作芯片夹具，共同构成封闭的培养腔；心脏损伤标志物检测传感芯片，通过在微纳加工得到的玻璃基上电极表面修饰mAb-SH/AuNPs/MXene@PAMAM材料来构建；该传感芯片电极表面材料修饰方法参考已公开专利，专利号CN202110212922.9，一种基于AuNPs/MXene@PAMAM的3D纳米复合材料免疫传感器的制备方法；代谢离子(K⁺、Na⁺、Ca²⁺)检测传感芯片，心脏损伤标志物检测传感芯片的测量腔通过使用氧等离子体处理后将其与传感芯片表面键合在一起，使用打孔器(Φ＝0.5mm；World Precision Instruments,USA)在各培养腔两端打孔，作为进液口和出液口，芯片之间通过在每个培养腔单元的进出液口插入不锈钢导管(Insert,USA)作为耦合器件来连接硅胶微孔管(Cole-Parmer,USA)，从而来实现芯片间流路的连接搭建；4种芯片的测量引脚通过焊接排针引出，通过插拔的方式固定在检测仪器屏蔽箱内的芯片转接电路板(电路板上焊接有排母)上；由多通道阀控制器控制电磁阀的开闭，以此来控制流路系统的通断；多通道压力控制器接收微流体流量传感器的检测数据反馈来控制每个通道的输出压强，通过PID控制算法来动态控制流路系统中每个单独流路的液体流速，以此针对不同的应用场景设置不同的流速；管路分配器控制选取不同种液体(超纯水、培养基、含药物的培养基)来实现培养基自动灌注、药物自动进样和系统的自动清洗，实现仪器的自动化；整个检测仪器屏蔽箱均放在细胞培养箱中，提供类器官生长代谢所需的37℃恒温环境以及5％浓度CO₂气体环境；多通道类器官阻抗检测传感芯片的类器官阻抗信号由DB78信号线缆传输给主控电路后由多通道类器官阻抗检测电路检测，多通道心脏类器官电位-阻抗联合检测传感芯片的电位和阻抗信号由DB78信号线传输给主控电路后由多通道心脏类器官电位-阻抗联合检测电路检测，代谢离子(K⁺、Na⁺、Ca²⁺)检测传感芯片信号由检测仪器屏蔽箱内的电流-电压转换模块处理后由DB78信号线传输给数据采集卡采集，心脏损伤标志物检测传感芯片的检测信号由DB78信号线传输给主控板电路后由心脏损伤标志物检测电路处理后由数据采集卡采集。本发明的多参数药物检测仪器主要测量对象为类器官，在长时间的检测中需要保证类器官模的生理活性，因此该仪器的检测仪器屏蔽箱放置于培养箱内，其能够提供类器官培养所需的温度、湿度和气体环境。类器官培养时的培养基灌注、药物筛选时药物分子的添加均通过流路系统来实现；流路的通断控制通过电磁阀实现；培养基和各种药物溶液的切换通过管路分配器来实现；流路系统的流速调节和控制通过流量传感器、流阻调计和压力控制器来闭环控制。

本发明的多参数药物检测仪器集成了多通道类器官阻抗检测传感芯片、代谢离子(K⁺、Na⁺、Ca²⁺)检测传感芯片、心脏损伤标志物检测传感芯片和多通道心脏类器官电位-阻抗联合检测传感芯片四个模块传感芯片，利用耦合器件和硅胶微孔管来连接各模块并构成流路系统。利用多通道心脏类器官电位-阻抗联合检测传感芯片上的微电极阵列和使用光固化3D打印机制备得到的3D心肌支架(所使用的材料为8％的聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)和12％的甲基丙烯酸酐化明胶(GelMA)混合而成，具有良好的打印性能和机械模量)构建体外3D心肌细胞模型。随后在支架上接种心肌细胞与血管内皮细胞，共培养两周后获得3D心肌模型。，并记录其体外模型的波形，采用算法提取频率、幅值和波峰波谷检测，计算场电位幅值(Field Potential Amplitude，FPA，波峰与波谷电位差值)，发放频率(Firing Rate，FR由波谷之间时间间隔计算)，上升时间(场电位起点与波峰的时间差)和场电位时程(Field Potential Duration，FPD)等来评估抗癌药物的心脏毒副作用。利用多通道类器官阻抗检测传感芯片来实时监测肺癌类器官、人源肝脏类器官和小肠类器官的生长状态，同时将抗癌药物刺激后的阻抗数据值转换为IC₅₀半抑制浓度(Median inhibitoryconcentration，用来衡量药物诱导凋亡的能力)，来定量评估抗癌药物的有效性以及肝脏毒性。利用代谢离子检测传感芯片对类器官生长微环境中的K⁺、Na⁺、Ca²⁺进行检测，评估抗癌药物作用过后类器官芯片微环境中离子浓度变化；利用心脏损伤标志物检测传感芯片检测流路系统培养基中的cTnT蛋白浓度以评估待筛选药物的心脏毒性。利用显微镜明场光学图像和荧光图像来量化类器官尺寸大小和生长状态。

下面给出本发明应用实例

本发明中的肺癌类器官的病人组织均取自浙江大学医学院附属邵逸夫医院且病人均进过病理诊断后确诊。

将肺癌组织剪碎至4mm直径大小，使用预冷的PBS缓冲液清洗3遍后，使用LiberaseTM(Sigma)消化1小时，随后再使用TrypLE Express(Invitrogen)消化10分钟，消化过程在37℃下进行。将组织消化成单细胞，与基质胶混合，接种到24孔板中。培养环境为含有5％CO2的37℃培养箱中，每3天更换培养基。能够稳定传代的类器官LCO-1的生长状况见图17。在培养7天后，能够观察到肺癌类器官的体积迅速增大，在第7天直径接近300um。并且在传代和冻存后仍然能够进行活跃的增殖。

将肝组织剪碎至1mm³大小，使用预冷的PBS缓冲液清洗以去除残余的血细胞和脂肪。消化液为含有2.5mg/mL胶原酶D和0.1mg/mL的DNase I的EBSS缓冲液。使用消化液在37℃下进行消化，大约30分钟后，每10分钟观察消化程度，当80～100％组织被消化成单细胞时终止消化，使用培养基中和消化液并反复吹打组织，将组织上离散的细胞吹落，反复数次。使用70μm细胞筛进行过滤，随后在300g速度下离心5分钟，使用培养基重悬。使用低粘附24孔板用于培养，每孔接种50ul基质胶和大约1000个肝细胞，37℃孵育10分钟使基质胶凝固。培养环境为含有5％CO2的37℃培养箱中；显微镜下对肝类器官进行观察，肝类器官呈泡状，类器官中心存在一个空腔(图18)，培养两周后直径可达800um，并且在传代后也可以维持类器官的形状。

将4周大的小鼠的小肠取出，用1X PBS把肠子的内含物冲出，把肠子剪开，在PBS中洗涤多次，用载玻片把小肠绒毛刮掉，把剩余部分剪成2-4mm的小块，与2mM EDTA/PBS培养30分钟，离心(500g，5min)收集隐窝部分，与明胶混合，转到培养板上，加培养基(AdvancedDMEM/F12，1μg/ml R-spondin，100ng/ml Noggin,50ng/ml EGF)。小肠类器官培养第1、3、5、8天的明场图片见图19。

固化3D打印选用聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)和12％的甲基丙烯酸酐化明胶(GelMA)的混合物，PEGDA具备良好的机械性能和可打印性，GelMA则可以进一步提高可打印性并提高支架的生物相容性。图20显示了支架在接种心肌细胞前后的显微镜下照片，证实了支架具有良好的生物相容性。

采用多通道类器官阻抗检测传感芯片测量种植于培养腔内的肺癌类器官、肝类器官和小肠类器官。以肺癌类器官为例分别采用(1KHz、10KHz、25KHz)的，30mV的激励刺激垂直金电极间的肺癌类器官，图21数据显示对于病人来源肺癌类器官和HCC827来源类器官，有着不同的阻抗值响应，结果证明本仪器可用于类器官阻抗监测。

采用多通道心脏类器官电位-阻抗联合检测传感芯片测量种植于培养腔内的的3D心肌细胞模型。心肌细胞贴附与支架生长，图22A为该传感芯片未接种3D心肌细胞模型时的信号噪声模式(20μV)，说明我们的检测仪器有较好的信噪比，图22B为接种3D心肌细胞模型后采集到得信号，可以观察到明显胞外场电位发放的信号模式，实验证明本仪器可以用于检测体外3D心肌细胞模型的电位信号。

采用代谢离子(K⁺、Na⁺、Ca²⁺)检测传感芯片，即修饰离子敏感膜的ISLAPS芯片测量类器官微环境中代谢离子。使用多参数ISLAPS检测系统在5天内测量培养过肝癌类器官的培养基与不用于培养的空白培养基中四种离子的pX值，图23结果显示培养基的pH值在1～4天内逐渐下降，但在第5天有所回升，pNa，pK和pCa值在缓慢上升，即钠钾钙三种离子的浓度在逐渐下降，这可能是由于类器官吸收培养液中的无机盐导致。实验证明本仪器可以用于检测体外类器官模型的代谢离子变化。

采用心脏损伤标志物检测传感芯片检测心脏损伤标志物蛋白，用于评估药物的心脏毒性。图24结果显示，由ELISA试剂盒和免疫传感器测得的cTnT蛋白浓度的相关很高。实验证明本仪器可以用于检测体溶液中cTnT蛋白浓度。

上述实施例用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种基于微纳时空传感与类器官芯片的多参数药物检测仪器，其特征在于：包括检测仪器培养箱以及放置在培养箱中的检测仪器屏蔽箱，所述检测仪器屏蔽箱上具有芯片转接电路板，所述芯片转接电路板上通过排针排母安装有多通道类器官阻抗检测传感芯片、代谢离子(K⁺、Na⁺、Ca²⁺)检测传感芯片、心脏损伤标志物检测传感芯片和多通道心脏类器官电位-阻抗联合检测传感芯片；所述代谢离子(K⁺、Na⁺、Ca²⁺)检测传感芯片经过恒电位电路以及电流-电压转换电路实现检测信号的电流电压转换与放大处理；

所述多通道类器官阻抗检测传感芯片由体外构建的肺癌类器官、肝癌类器官和小肠类器官与多通道3D阻抗检测传感芯片耦合构建而成；

所述多通道心脏类器官电位-阻抗联合检测传感芯片，选用3D打印构建聚合物支架，并选用心肌细胞与血管内皮细胞共同构建体外3D心肌细胞模型；同时将构建的3D心肌细胞模型与阻抗-电位联合检测传感芯片耦合，共同构建多通道心脏类器官电位-阻抗联合传感检测芯片；

所述代谢离子(K⁺、Na⁺、Ca²⁺)检测传感芯片，通过在微纳加工的LAPS芯片上划分区域并修饰Na⁺、Ca²⁺和K⁺敏感膜，同时Si基上沉积的绝缘层Si₃N₄作为H⁺敏感材料，构建离子敏LAPS(ISLAPS)芯片，即代谢离子(K⁺、Na⁺、Ca²⁺)检测传感芯片；

所述心脏损伤标志物检测传感芯片，通过在微纳加工得到的玻璃基上电极表面修饰mAb-SH/AuNPs/MXene@PAMAM材料来构建；

各传感芯片的检测信号通过信号连接线传输至主控电路；所述主控电路上连接有多通道类器官阻抗检测电路、多通道心脏类器官电位-阻抗联合检测电路和心脏损伤标志物检测电路以及数据采集卡；各检测电路实现对应传感芯片的检测信号的处理，与电流电压转换与放大处理后的代谢离子(K⁺、Na⁺、Ca²⁺)检测传感芯片检测信号，共同传输到数据采集卡采集；数据采集卡采集后的信号传输至上位机处理并显示保存；

利用多通道心脏类器官电位-阻抗联合检测传感芯片，记录3D心肌细胞模型的胞外场电位波形和阻抗数据，提取频率、幅值和波峰波谷，计算场电位幅值，发放频率，上升时间和场电位时程来评估抗癌药物的心脏毒副作用；利用多通道类器官阻抗检测传感芯片来实时监测肺癌类器官、人源肝脏类器官和小肠类器官的生长状态，同时将抗癌药物刺激后的阻抗数据值转换为IC₅₀半抑制浓度，来定量评估抗癌药物的有效性以及肝脏毒性。利用代谢离子(K⁺、Na⁺、Ca²⁺)检测传感芯片对类器官生长微环境中的K⁺、Na⁺、Ca²⁺进行检测，评估抗癌药物作用过后类器官生长环境中离子浓度变化；利用心脏损伤标志物检测传感芯片检测心脏类器官生长环境中的cTnT蛋白浓度以评估待筛选药物的心脏毒性。

2.根据权利要求1所述的一种基于微纳时空传感与类器官芯片的多参数药物检测仪器，其特征在于：所述检测仪器培养箱为多通道心脏类器官电位-阻抗联合检测传感芯片中的3D心肌细胞以及多通道类器官阻抗传感芯片中的肺癌类器官、肝类器官、小肠类器官提供生长环境；二氧化碳气瓶提供气体环境。

3.根据权利要求1所述的一种基于微纳时空传感与类器官芯片的多参数药物检测仪器，其特征在于：4类传感芯片之间的流路连接参照人体血液循环系统中，肺癌患者口服化疗药物后，药物在体内的代谢过程(依次经过肠道、肝脏、心脏和肺癌部位)；首先多通道类器官阻抗检测传感芯片中培养有小肠类器官和肝类器官的传感腔依次连接，接着连接多通道心脏类器官电位-阻抗联合检测传感芯片和心脏损伤标志物检测传感芯片，最后依次连接多通道类器官阻抗检测传感芯片中培养有肺癌类器官的培养腔和代谢离子(K⁺、Na⁺、Ca^{2 +})检测传感芯片；上述四类芯片各传感单元通过硅胶微孔管来实现流体通路连接。

4.根据权利要求3所述的一种基于微纳时空传感与类器官芯片的多参数药物检测仪器，其特征在于：所述检测仪器的流路连接均通过硅胶微孔管来实现；培养箱内各样品池首先与管路分配器连接，接着管路分配器的出液口连接有电磁阀，然后依次连接流阻调节计和微流体流速传感器，微流体流速传感器出液口连接多通道类器官阻抗检测传感芯片中培养有小肠类器官腔体入液口，经过各传感芯片后，最终废液流入废液池进行收集。

5.根据权利要求1所述的一种基于微纳时空传感与类器官芯片的多参数药物检测仪器，其特征在于：类器官阻抗芯片检测电路包括有微控制器MCU、直接数字频率合成器DDS模块、AD采样模块、滤波模块、DC-DC降压模块和LDO线性稳压电源模块；

所述微控制器MCU与直接数字频率合成器DDS模块之间通过I²C协议进行通讯，根据设定频率和幅值产生的正弦激励信号滤波后施加到多通道类器官阻抗传感芯片的工作电极；多通道类器官阻抗传感芯片检测到的信号经过滤波模块处理后由AD采样模块采样，经过微控制器MCU采集后传输给上位机；所述上位机与微控制器MCU之间通过USB串口通讯，微控制器MCU与AD采样模块之间通过SPI协议进行通讯；所述多通道类器官阻抗芯片检测电路通过USB供电后，经由DC-DC降压模块和LDO线性稳压模块后给类器官阻抗芯片检测电路中其他电气元件供电。

6.根据权利要求1所述的一种基于微纳时空传感与类器官芯片的多参数药物检测仪器，其特征在于：所述多通道心脏类器官电位-阻抗联合检测电路由屏蔽电路模块、前置低噪放大模块、带阻滤波模块、二级放大模块、高通滤波模块、低通滤波模块、电压跟随模块、电流-电压转换模块、激励衰减模块和信号缓冲模块构成；

所述多通道心脏类器官电位-阻抗联合检测电路进行阻抗测量时，数据采集卡产生激励信号通过激励衰减模块和信号缓冲模块施加在多通道心脏类器官电位-阻抗联合检测传感芯片上，传感芯片产生的响应信号经由屏蔽电路模块、电流-电压转换模块、高通滤波模块和电压跟随模块处理过后由NI数据采集卡采集；所述多通道心脏类器官电位-阻抗联合检测电路进行电位测量时，多通道心脏类器官电位-阻抗联合检测传感芯片上的电位信号通过前置低噪放大模块放大，带阻滤波模块滤波，二级放大模块进一步放大，最后通过低通滤波模块和电压跟随模块由数据采集卡采集。

7.根据权利要求1所述的一种基于微纳时空传感与类器官芯片的多参数药物检测仪器，其特征在于，所述检测仪器屏蔽箱中具有聚焦光路、恒电位电路模块和电流-电压转换电路模块，且检测仪器屏蔽箱上安装有离子敏光寻址电位传感器(ISLAPS)芯片，培养箱外部具有激光驱动模块和信号发生模块；

所述聚焦光路模块由带尾纤的激光二极管、激光准直器、45°反射棱镜、扩束器和非球面透镜组成，带尾纤的激光二极管与激光驱动模块连接，同时激光二极管的尾纤与激光准直器耦合，使光纤的出射光准直，45°反射棱镜与光纤准直器安装在同一水平轴上，扩束器和非球面透镜依次安装在垂直轴上，光的传播顺序依次通过上述元件；代谢离子(K⁺、Na⁺、Ca²⁺)检测模块中，激光驱动模块和信号发生器调制激光二极管产生激光，经由聚焦光路模块，激光聚焦在ISLAPS芯片背面作为代谢离子(K⁺、Na⁺、Ca²⁺)检测传感芯片的激励信号源；所述恒电位电路模块调节代谢离子(K⁺、Na⁺、Ca²⁺)检测传感芯片的参比电极电位等于设定值，且保证无电流流过参比电极；所述电流-电压转换模块将流过代谢离子(K⁺、Na⁺、Ca²⁺)检测传感芯片的工作电极电流转换为电压，并被数据采集卡采集；采用数字锁相方法，即通过乘法器和低通滤波器对设定频率的信号进行检测；所述ISLAPS芯片，通过在LAPS器件表面修饰离子敏感膜来实现对K⁺、Na⁺、Ca²⁺的检测。

8.根据权利要求1所述的一种基于微纳时空传感与类器官芯片的多参数药物检测仪器，其特征在于，所述心脏损伤标志物检测电路由恒电位电路模块、电流-电压转换电路模块和低通滤波与放大模块构成；所述恒电位模块调节心脏损伤标志物检测传感芯片的参比电极电位等于设定值，且保证无电流流过参比电极；所述电流-电压转换模块将流过心脏损伤标志物检测传感芯片的工作电极电流转换为电压，经过和低通滤波与放大模块后被数据采集卡采集。

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