CN114317442A - 一种建立乳腺类器官或/和乳腺癌类器官的培养基及方法和应用 - Google Patents
一种建立乳腺类器官或/和乳腺癌类器官的培养基及方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114317442A CN114317442A CN202210017259.1A CN202210017259A CN114317442A CN 114317442 A CN114317442 A CN 114317442A CN 202210017259 A CN202210017259 A CN 202210017259A CN 114317442 A CN114317442 A CN 114317442A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- organoid
- culture medium
- breast cancer
- breast
- tissue
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 210000002220 organoid Anatomy 0.000 title claims abstract description 79
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 title claims abstract description 38
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 19
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 title claims description 45
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 title claims description 44
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 title abstract description 15
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 claims abstract description 24
- JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N hydrocortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N 0.000 claims abstract description 22
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 20
- 102100028412 Fibroblast growth factor 10 Human genes 0.000 claims abstract description 13
- 102100028071 Fibroblast growth factor 7 Human genes 0.000 claims abstract description 13
- 101000917237 Homo sapiens Fibroblast growth factor 10 Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 101001060261 Homo sapiens Fibroblast growth factor 7 Proteins 0.000 claims abstract description 13
- VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 17β-estradiol Chemical compound OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 0.000 claims abstract description 12
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims abstract description 12
- PWKSKIMOESPYIA-BYPYZUCNSA-N L-N-acetyl-Cysteine Chemical compound CC(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O PWKSKIMOESPYIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims abstract description 12
- 229960004308 acetylcysteine Drugs 0.000 claims abstract description 12
- 102000045246 noggin Human genes 0.000 claims abstract description 12
- 108700007229 noggin Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 claims abstract description 12
- 229960005309 estradiol Drugs 0.000 claims abstract description 11
- 229960000890 hydrocortisone Drugs 0.000 claims abstract description 11
- 229930182833 estradiol Natural products 0.000 claims abstract description 10
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims abstract description 9
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 claims abstract description 8
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 claims abstract description 8
- DFPAKSUCGFBDDF-ZQBYOMGUSA-N [14c]-nicotinamide Chemical compound N[14C](=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-ZQBYOMGUSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 claims abstract description 8
- -1 B27 Chemical compound 0.000 claims abstract description 6
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 claims abstract description 6
- 102000048238 Neuregulin-1 Human genes 0.000 claims abstract description 3
- 108090000556 Neuregulin-1 Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 21
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 claims description 16
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 16
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims description 12
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 11
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 7
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 4
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 2
- 230000000973 chemotherapeutic effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 claims description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 2
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 31
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N Nicotinamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 9
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 9
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 8
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 7
- 108010087230 Sincalide Proteins 0.000 description 7
- 238000010609 cell counting kit-8 assay Methods 0.000 description 7
- 239000000306 component Substances 0.000 description 7
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 7
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 7
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N sincalide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C1=CC=C(OS(O)(=O)=O)C=C1 IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 101000825960 Homo sapiens R-spondin-3 Proteins 0.000 description 5
- 102100022766 R-spondin-3 Human genes 0.000 description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 5
- 229960003966 nicotinamide Drugs 0.000 description 5
- 235000005152 nicotinamide Nutrition 0.000 description 5
- 239000011570 nicotinamide Substances 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N Fluorouracil Chemical compound FC1=CNC(=O)NC1=O GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 4
- 229960002949 fluorouracil Drugs 0.000 description 4
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 4
- 239000008096 xylene Substances 0.000 description 4
- QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 5,5-dimethyl-2,4-dioxo-1,3-oxazolidine-3-carboxamide Chemical compound CC1(C)OC(=O)N(C(N)=O)C1=O QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZDZOTLJHXYCWBA-VCVYQWHSSA-N N-debenzoyl-N-(tert-butoxycarbonyl)-10-deacetyltaxol Chemical compound O([C@H]1[C@H]2[C@@](C([C@H](O)C3=C(C)[C@@H](OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)OC(C)(C)C)C=4C=CC=CC=4)C[C@]1(O)C3(C)C)=O)(C)[C@@H](O)C[C@H]1OC[C@]12OC(=O)C)C(=O)C1=CC=CC=C1 ZDZOTLJHXYCWBA-VCVYQWHSSA-N 0.000 description 3
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 3
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 3
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 3
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L cisplatin Chemical compound N[Pt](N)(Cl)Cl DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 229960004316 cisplatin Drugs 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 229960003668 docetaxel Drugs 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 235000014103 egg white Nutrition 0.000 description 3
- 210000000969 egg white Anatomy 0.000 description 3
- SDUQYLNIPVEERB-QPPQHZFASA-N gemcitabine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1C(F)(F)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 SDUQYLNIPVEERB-QPPQHZFASA-N 0.000 description 3
- 229960005277 gemcitabine Drugs 0.000 description 3
- 230000007773 growth pattern Effects 0.000 description 3
- 238000007490 hematoxylin and eosin (H&E) staining Methods 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 3
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 239000003560 cancer drug Substances 0.000 description 2
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 230000000857 drug effect Effects 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 2
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012605 2D cell culture Methods 0.000 description 1
- NGHVIOIJCVXTGV-ALEPSDHESA-N 6-aminopenicillanic acid Chemical compound [O-]C(=O)[C@H]1C(C)(C)S[C@@H]2[C@H]([NH3+])C(=O)N21 NGHVIOIJCVXTGV-ALEPSDHESA-N 0.000 description 1
- NGHVIOIJCVXTGV-UHFFFAOYSA-N 6beta-amino-penicillanic acid Natural products OC(=O)C1C(C)(C)SC2C(N)C(=O)N21 NGHVIOIJCVXTGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010006223 Breast discharge Diseases 0.000 description 1
- 206010006272 Breast mass Diseases 0.000 description 1
- 208000030453 Drug-Related Side Effects and Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 229940126560 MAPK inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 102000010780 Platelet-Derived Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010038512 Platelet-Derived Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 206010070863 Toxicity to various agents Diseases 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000315 carcinogenic Toxicity 0.000 description 1
- 238000003570 cell viability assay Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 229940044683 chemotherapy drug Drugs 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 102000038379 digestive enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108091007734 digestive enzymes Proteins 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- DZGCGKFAPXFTNM-UHFFFAOYSA-N ethanol;hydron;chloride Chemical compound Cl.CCO DZGCGKFAPXFTNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 238000003801 milling Methods 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 238000004264 monolayer culture Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 102000002574 p38 Mitogen-Activated Protein Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108010068338 p38 Mitogen-Activated Protein Kinases Proteins 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 108091006082 receptor inhibitors Proteins 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 102000000568 rho-Associated Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108010041788 rho-Associated Kinases Proteins 0.000 description 1
- 238000013341 scale-up Methods 0.000 description 1
- 238000001338 self-assembly Methods 0.000 description 1
- 238000010008 shearing Methods 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000002723 toxicity assay Methods 0.000 description 1
- 231100000820 toxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 230000005760 tumorsuppression Effects 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种建立乳腺类器官或/和乳腺癌类器官的培养基及方法和应用，属于生物医药技术领域，所述培养基为含有如下组分的DMEM/F12完全培养基：雌二醇、氢化可的松、R‑Spondin 3、Neuregulin 1、FGF7、FGF10、rh‑EGF、PDGF、Noggin、A83‑01、Wnt3a、Y‑27632、SB202190、B27、N‑乙酰半胱氨酸、烟酰胺、GlutaMax、胎牛血清、青霉素/链霉素双抗，所述培养基用于建立乳腺类器官或/和乳腺癌类器官，可以加快乳腺或/和乳腺癌细胞的增殖与自组装能力，加快类器官的建立以及提高类器官建立的成功率。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种建立乳腺类器官或/和乳腺癌类器官的培养基及方法和应用。
背景技术
乳腺癌是乳腺上皮细胞在多种致癌因子的作用下，发生增殖失控的现象。疾病早期常表现为乳房肿块、乳头溢液、腋窝淋巴结肿大等症状，晚期可因癌细胞发生远处转移，出现多器官病变，直接威胁患者的生命。乳腺癌常被称为“粉红杀手”，其发病率位居女性恶性肿瘤的首位，男性乳腺癌较为少见。目前抗乳腺癌的药物水平不均衡，有效的药物十分昂贵且治疗效果不太理想，药物筛选水平层次不齐，缺乏一个能够高度模拟体内微环境的评估系统，类器官培养越来越多地用于实验模拟人类癌症，以期定制个性化药物和预测药物反应。乳腺癌也不例外，但原发性乳腺癌尤其存在一些固有的困难，活检中经常存在残留的非恶性细胞，近来，类器官技术已被用于生成大量乳腺癌类器官，相较于2D的细胞培养，类器官的三维培养更能体现肿瘤组织在体内的生长环境，不管在结构、还是亚细胞种类都高度还原了肿瘤器官的原生态。
类器官是由多能干细胞或器官祖细胞分化，并自组装成有结构和功能的完整哺乳动物器官，类器官技术在研究广泛的对象方面潜力巨大，包括发育生物学、疾病病理学、细胞生物学、再生机制、精准医疗以及药物毒性和药效试验等。对于这些应用以及其他应用，类器官培养实现了对现有2D培养方法和动物模型系统的高信息量的互补，是二维培养和活体模型之间的重要桥梁，其较单层细胞培养模型更具生理学相关性，同时比活体模型更容易操纵监测信号通路和基因组编辑。类器官的价值在于它们能够自组织成最小的生物单位，表现出与原始组织相似的功能和复杂性。类器官的可操作性预示着类器官将为广泛的基础研究提供出色的模型系统，包括表达谱研究和体内难以获得的稀有细胞谱系的分析。
类器官在抗肿瘤药物筛选领域表现出了巨大的潜力，药物的筛选测试展示了药物对类器官最直观的表现，高度模拟了药物对器官的效果。因此，亟需一种可以加快乳腺癌细胞的增殖与自组装能力，加快类器官的建立以及提高类器官建立的成功率的培养方法，为乳腺癌类器官的培养提供了多样性。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种建立乳腺类器官或/和乳腺癌类器官的培养基；本发明的目的之二在于基于所述培养基建立乳腺类器官或/和乳腺癌类器官的方法；本发明的目的之三在于提供所述培养基在乳腺癌类器官或/和乳腺类器官筛选抗乳腺癌药物中的应用。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1、一种建立乳腺类器官或/和乳腺癌类器官的培养基
所述培养基为含有如下组分的DMEM/F12完全培养基：雌二醇、氢化可的松、R-Spondin3、Neuregulin 1、FGF7、FGF10、rh-EGF、PDGF、Noggin、A83-01、Wnt3a、Y-27632、SB202190、B27、N-乙酰半胱氨酸、烟酰胺、GlutaMax、胎牛血清、青霉素/链霉素双抗。
本发明优选的，所述组分的浓度如下：雌二醇10nM-1000nM、氢化可的松0.1-100μg/ml、R-Spondin 3 100-500ng/ml、Neuregulin 1 1-10nM、FGF7 1-10ng/ml、FGF10 10-100ng/ml、rh-EGF1-10ng/ml、PDGF 1-10ng/ml、Noggin 50-500ng/ml、A83-01 100-1000nM、Wnt3a 1-5nM、Y-276321-10μM、SB202190 100-1000ng、B27 10ng/ml、N-乙酰半胱氨酸1-5nM、烟酰胺1-10nM、GlutaMax 1-5nM、胎牛血清体积分数10％、青霉素/链霉素双抗体积分数1％。
2、基于权利要求1或2所述培养基建立乳腺类器官或/和乳腺癌类器官的方法，包括以下步骤：
(1)将获得的乳腺组织或乳腺癌组织制备成单细胞悬液；
(2)将步骤(1)制备的单细胞悬液加入3D培养基质胶重悬，然后接种于培养装置中，加入权利要求1或2所述的培养基，培养箱中扩大培养。
本发明优选的，步骤(1)中，所述乳腺组织或乳腺癌组织的来源于哺乳动物。
本发明优选的，步骤(1)中，所述乳腺组织或乳腺癌组织制备成单细胞悬液具体过程是经过剪碎、研磨、过滤得到。
本发明进一步优选的，步骤(1)中，所述剪碎后组织大小为1cm×1cm。
本发明进一步优选的，步骤(1)中，所述过滤为使用200目的滤网过滤。
本发明优选的，步骤(2)中，扩大培养中每三天更换一次培养基。
3、所述培养基在乳腺癌类器官或/和乳腺类器官筛选抗乳腺癌药物中的应用。
本发明优选的，所述药物包含化疗药物、放疗或/和靶向药物。
本发明的有益效果在于：本发明公开了一种建立乳腺类器官或/和乳腺癌类器官的培养基及方法和应用，所述培养基为含有如下组分的DMEM/F12完全培养基：雌二醇、氢化可的松、R-Spondin 3、Neuregulin 1、FGF7、FGF10、rh-EGF、PDGF、Noggin、A83-01、Wnt3a、Y-27632、SB202190、B27、N-乙酰半胱氨酸、烟酰胺、GlutaMax、胎牛血清、青霉素/链霉素双抗，所述培养基用于建立乳腺类器官或/和乳腺癌类器官，可以加快乳腺或/和乳腺癌细胞的增殖与自组装能力，提高类器官的建立以及提高类器官建立的成功率。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为配方1-3的培养基培养乳腺癌类器官14天生长形态图(100倍)；
图2为配方1-3的培养基培养乳腺癌类器官培养14天的生长曲线图；
图3为对比配方1不含重要生长因子PDGF的培养基培养乳腺癌类器官14天生长形态图(100倍)；
图4为对比配方1不含重要生长因子PDGF的培养基培养乳腺癌类器官14天的生长曲线图；
图5为对比配方2不含重要生长因子Wnt3a、FGF 7、FGF 10、PDGF、rh-EGF的培养基培养乳腺癌类器官14天的生长形态图；
图6为对比配方2不含重要生长因子Wnt3a、FGF 7、FGF 10、PDGF、rh-EGF的培养基培养乳腺癌类器官14天的生长曲线图；
图7为配方1-3的培养基培养乳腺类器官的3天、5天、10天的生长形态图(100倍)；
图8为配方1-3的培养基培养乳腺癌类器官的第14天HE染色图(400倍)；
图9为乳腺癌类器官筛选抗肿瘤药物的CCK-8肿瘤抑制率图；
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
本发明实施例中涉及的培养基组分雌二醇(β-estradiol),购自Sigma公司、氢化可的松(hydrocortisone),购自Sigma公司、R-Spondin 3，购自R&D公司；Neuregulin 1，购自Peprotech公司；FGF7，购自Peprotech公司；FGF10，购自Peprotech公司；rh-EGF，购自Peprotech公司；PDGF，购自Peprotech公司；Noggin，购自Peprotech公司；A83-01，购自Tocris公司；Wnt3a，购自Gibco公司；Y-27632，购自Abmole公司；SB202190，购自Sigma公司；B27，购自Gibco公司；N-Acetylcysteine，购自Gibco公司；Nicotinamide，购自Sigma公司；GlutaMax，购自Sigma公司；FBS，购自Gibco公司；Penicillin/Streptomycin，购自Gibco公司；DMEM/F12，购自Gibco公司。
实施例1、建立乳腺类器官或/和乳腺癌类器官的培养基
按下述浓度将各组分加入到DMEM/F12培养基中，得到用于培养乳腺癌类器官的培养基A：
配方1：雌二醇100nM，氢化可的松50μg/ml、R-Spondin 3(250ng/ml)、Neuregulin1(5nM)、FGF7(5ng/ml)、FGF10(50ng/ml)、rh-EGF(5ng/ml)、PDGF(血小板衍生生长因子，5ng/ml)、Noggin(100ng/ml)、A83-01(TGF-βI型受体抑制剂，500nM)、Wnt3a(5nM)、Y-27632(蛋白激酶p160ROCK抑制剂，5μM)、SB202190(p38 MAPK抑制剂，500ng)、B27(10ng/ml)、N-乙酰半胱氨酸(N-Acetylcysteine，5nM)、烟酰胺(Nicotinamide，10nM)、GlutaMax添加剂(5nM)、胎牛血清(FBS，10％)、青链霉素(Penicillin/Streptomycin，1％)。
配方2：雌二醇10nM，氢化可的松0.1μg/ml、R-Spondin 3(100ng/ml)、Neuregulin1(1nM)、FGF7(1ng/ml)、FGF10(10ng/ml)、rh-EGF(1ng/ml)、PDGF(1ng/ml)、Noggin(50ng/ml)、A83-01(100nM)、Wnt3a(1nM)、Y-27632(1μM)、SB202190(100ng)、B27(10ng/ml)、N-Acetylcysteine(1nM)、Nicotinamide(1nM)、GlutaMax添加剂(1nM)、FBS(10％)、Penicillin/Streptomycin(1％)。
配方3：雌二醇1000nM，氢化可的松100μg/ml、R-Spondin 3(500ng/ml)、Neuregulin1(10nM)、FGF7(10ng/ml)、FGF10(100ng/ml)、rh-EGF(10ng/ml)、PDGF(10ng/ml)、Noggin(500ng/ml)、A83-01(1000nM)、Wnt3a(5nM)、Y-27632(10μM)、SB202190(1000ng)、B27(10ng/ml)、N-Acetylcysteine(5nM)、Nicotinamide(10nM)、GlutaMax添加剂(5nM)、FBS(10％)、Penicillin/Streptomycin(1％)。
对比配方1：与上述配方区别是培养基中不含生长因子PDGF，各组分具体含量如下：R-Spondin 3(250ng/ml)、Neuregulin 1(5nM)、FGF 7(5ng/ml)、FGF 10(50ng/ml)、rh-EGF(5ng/ml)、Noggin(100ng/ml)、A83-01(500nM)、Wnt3a(5M)、Y-27632(5μM)、SB202190(500ng)、B27(10ng/ml)、N-Acetylcysteine(5nM)、Nicotinamide(10nM)、GlutaMax(5nM)、FBS(10％)、Penicillin/Streptomycin(1％)、DMEM/F12。
对比配方2：与上述配方区别是培养基中不含FGF 7、FGF 10、rh-EGF、PDGF、Wnt3a，各组分具体含量如下：R-Spondin 3(250ng/ml)、Neuregulin 1(5nM)、Noggin(100ng/ml)、A83-01(500nM)、Y-27632(5μM)、SB202190(500ng)、B27(10ng/ml)、N-Acetylcysteine(5nM)、Nicotinamide(10nM)、GlutaMax(5nM)、FBS(10％)、Penicillin/Streptomycin(1％)、DMEM/F12。
实施例2、建立乳腺类器官或/和乳腺癌类器官的方法
本实施例中乳腺样本、乳腺癌样本均来自重庆市人民医院。
使用实施例1的培养基建立乳腺类器官或/和乳腺癌类器官的方法，具体操作步骤如下：
1)乳腺癌组织的获取
采集后将获得的乳腺癌组织/乳腺组织采用50ml的DMEM/F12+FBS(10％)+Penicillin/Streptomycin(1％)进行浸泡。
2)乳腺癌类器官的培养
(1)将得到的乳腺癌样本浸泡于1％的Penicillin/Streptomycin(青链霉素)中1h，将浸泡的乳腺癌样本取出，用一次性手术刀将细胞剪碎，剪碎的组织大约为1cm×1cm；用碾磨棒将1cm×1cm的乳腺癌手术样本碾碎，制备成为单细胞悬液。
(2)将单细胞悬液吸出，用200目的细胞滤网过滤2-3次，将多余的残留组织去除，加入PBS清洗3次，再加入matrigel重悬细胞，接种于6孔板中；在六孔板中加入培养基A培养细胞，放置于37℃的培养箱中，每三天更换一次培养基，观察细胞的形态，光学显微镜下拍照记录，培养至14天。
配方1～3的培养基A培养1天，3天，5天，7天，10天和14天的结果如图1所示。类器官体积和细胞数量统计结果如图2所示，结果显示，培养过程中细胞逐渐增多，培养至第2天可形成类器官，培养至第4天类器官细胞数量快速增加，至7天呈对数增长；同时培养过程中类器官逐渐变大，培养至14天最大能达到900μm。
对比配方1不含重要生长因子PDGF的结果如图3所示，类器官体积和细胞数量统计结果如图4所示，相比较于配方1-3含PDGF的类器官，第三天只有少量的类器官生成，直到第10天才能生成大量类器官，对比配方1生成类器官的大小和细胞数量的增长速率明显低于配方1-3。
对比配方2不含重要生长因子Wnt3a、FGF 7、FGF 10、PDGF、rh-EGF的结果如图5所示，类器官体积和细胞数量统计结果如图6所示，培养至14天生成的类器官极少。
配方1～3的培养基培养乳腺类器官的3天、5天、10天的生长形态图如图7所示，表明配方1～3的培养基也可以用于乳腺类器官的培养。
实施例3、乳腺癌类器官HE染色
将生长状态良好的类器官放入离心管内，200g转速离心10min，弃置部分上清液，在离心管内加入2ml蛋清，轻摇混匀，在蛋清液中悬浮细胞团，再加入5倍蛋清混合液体积的80％酒精，混匀，200g转速离心10min，去除上清液，加入10％甲醛固定3h。
使用4％多聚甲醛溶液浸泡组织样本，48h后采用石蜡包埋并切片。
HE染色步骤如下：二甲苯(Ⅰ)15min；二甲苯(Ⅱ)15min；无水乙醇(Ⅰ)5min；无水乙醇(Ⅱ)5min；95％乙醇3min；80％乙醇2min；70％乙醇2min；蒸馏水5min；苏木精染色液6min；自来水冲洗1min；1％盐酸乙醇1-2s；自来水冲洗10-30s；0.2％氨水返蓝6min；自来水冲洗10-30s；0.5％伊红染色液1-3min；蒸馏水冲洗1-2s；70％乙醇1min；80％乙醇1min；95％乙醇2min；无水乙醇(Ⅰ)3min；二甲苯(Ⅰ)10min；二甲苯(Ⅱ)10min。结果如图8所示。结果显示，乳腺癌类器官形成细胞团，且与乳腺癌细胞具有高度的形态一致性。
实施例4、乳腺癌类器官评估药物效果的CCK-8毒性实验
1)制作标准曲线(用于测定细胞具体数量)
(1)先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，然后接种细胞到培养板内。
(2)按比例(例如：1/2比例)依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度，一般要做3-5个细胞浓度梯度，每个浓度建议3-6个复孔。
(3)接种后培养2-4小时使细胞贴壁，然后加CCK-8试剂培养一定时间后测定OD值，制作出一条以细胞数量为横坐标(X轴)，OD值为纵坐标(Y轴)的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量，使用此标准曲线的前提是实验的条件要一致，便于确定细胞的接种数量以及加入CCK-8后的培养时间。
2)细胞活性检测
(1)在96孔板中接种细胞悬液100μL/孔，将培养板放在培养箱中37℃，5％CO2预培养一段时间。
(2)向每孔加入10μL CCK-8溶液，注意不要在孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数。
(3)将培养板在培养箱内孵育1-4小时。
(4)用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
(5)若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10μL 0.1M的HCL溶液或者1％w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定，吸光度不会发生变化。
3)细胞增殖-毒性检测
(1)在第七天，加入消化酶消化Matrigel，在96孔板中配制100μL的细胞悬液。将培养板放在培养箱37℃，5％CO2预培养24小时。
(2)向培养板加入10μL不同浓度的化疗药物和靶向药物，包括但不限于5-氟尿嘧啶、顺铂、多西他赛、吉西他滨。
(3)将培养板在培养箱孵育一段适当的时间(例如：6、12、24或48小时)。
(4)向每孔加入10μL CCK-8溶液，注意不要再孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数。
(5)将培养板在培养箱内孵育1-4小时。
(6)用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
(7)若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10μL 0.1M的HCL溶液或者1％w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定，吸光度不会发生变化。
(8)最终计算出5-氟尿嘧啶、顺铂、多西他赛、吉西他滨、生理盐水对肿瘤类器官的抑制率。
注意：如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK-8之前更换新鲜培养基(除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基)，去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可，结果如图9所示，相比较于生理盐水，5-氟尿嘧啶、顺铂、多西他赛、吉西他滨对乳腺癌类器官都有一定的抑制作用，且5-氟尿嘧啶对肿瘤类器官的抑制率最高，高达83％。
所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
Claims (10)
1.一种建立乳腺类器官或/和乳腺癌类器官的培养基，其特征在于：所述培养基为含有如下组分的DMEM/F12完全培养基：雌二醇、氢化可的松、R-Spondin 3、Neuregulin 1、FGF7、FGF10、rh-EGF、PDGF、Noggin、A83-01、Wnt3a、Y-27632、SB202190、B27、N-乙酰半胱氨酸、烟酰胺、GlutaMax、胎牛血清、青霉素/链霉素双抗。
2.根据权利要求1所述建立乳腺类器官或/和乳腺癌类器官的培养基，其特征在于，所述组分的浓度如下：雌二醇10nM-1000nM、氢化可的松0.1-100μg/ml、R-Spondin 3100-500ng/ml、Neuregulin 1 1-10nM、FGF7 1-10ng/ml、FGF10 10-100ng/ml、rh-EGF 1-10ng/ml、PDGF 1-10ng/ml、Noggin 50-500ng/ml、A83-01 100-1000nM、Wnt3a 1-5nM、Y-27632 1-10μM、SB202190 100-1000ng、B27 10ng/ml、N-乙酰半胱氨酸1-5nM、烟酰胺1-10nM、GlutaMax 1-5nM、胎牛血清体积分数10％、青霉素/链霉素双抗体积分数1％。
3.基于权利要求1或2所述培养基建立乳腺类器官或/和乳腺癌类器官的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将获得的乳腺组织或乳腺癌组织制备成单细胞悬液；
(2)将步骤(1)制备的单细胞悬液加入3D培养基质胶重悬，然后接种于培养装置中，加入权利要求1或2所述的培养基，培养箱中扩大培养。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述乳腺组织或乳腺癌组织的来源于哺乳动物。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述乳腺组织或乳腺癌组织制备成单细胞悬液具体过程是经过剪碎、研磨、过滤得到。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述剪碎后组织大小为1cm×1cm。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述过滤为使用200目的滤网过滤。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，扩大培养中每三天更换一次培养基。
9.权利要求1或2任一项所述培养基在乳腺癌类器官或/和乳腺类器官筛选抗乳腺癌药物或治疗方案中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述药物及治疗方案包含化疗药物和靶向药物、放疗。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210017259.1A CN114317442A (zh) | 2022-01-07 | 2022-01-07 | 一种建立乳腺类器官或/和乳腺癌类器官的培养基及方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210017259.1A CN114317442A (zh) | 2022-01-07 | 2022-01-07 | 一种建立乳腺类器官或/和乳腺癌类器官的培养基及方法和应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114317442A true CN114317442A (zh) | 2022-04-12 |
Family
ID=81024546
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210017259.1A Pending CN114317442A (zh) | 2022-01-07 | 2022-01-07 | 一种建立乳腺类器官或/和乳腺癌类器官的培养基及方法和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114317442A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115261326A (zh) * | 2022-07-29 | 2022-11-01 | 复旦大学附属中山医院青浦分院(上海市青浦区中心医院) | 建立乳腺癌及癌旁类器官模型的培养基及培养方法 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20060110542A (ko) * | 2005-04-20 | 2006-10-25 | 김종빈 | 유방 조직에서 유래된 줄기 세포, 이의 제조방법 및이로부터 분화된 세포 |
| CN101993852A (zh) * | 2009-08-13 | 2011-03-30 | 中国医学科学院基础医学研究所 | 乳腺干细胞的培养基、培养方法及富含乳腺干细胞的混合物 |
| US20170342385A1 (en) * | 2014-11-27 | 2017-11-30 | Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen | Culture medium for expanding breast epithelial stem cells |
| CN109837242A (zh) * | 2019-03-21 | 2019-06-04 | 陕西茵莱生物科技有限公司 | 一种用于科研实验的体外物质的培养方法 |
| CN111575237A (zh) * | 2020-05-22 | 2020-08-25 | 江苏信安佳医疗科技有限公司 | 一种乳腺癌无支架类器官专用培养基及培养方法 |
-
2022
- 2022-01-07 CN CN202210017259.1A patent/CN114317442A/zh active Pending
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20060110542A (ko) * | 2005-04-20 | 2006-10-25 | 김종빈 | 유방 조직에서 유래된 줄기 세포, 이의 제조방법 및이로부터 분화된 세포 |
| CN101993852A (zh) * | 2009-08-13 | 2011-03-30 | 中国医学科学院基础医学研究所 | 乳腺干细胞的培养基、培养方法及富含乳腺干细胞的混合物 |
| US20170342385A1 (en) * | 2014-11-27 | 2017-11-30 | Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen | Culture medium for expanding breast epithelial stem cells |
| CN109837242A (zh) * | 2019-03-21 | 2019-06-04 | 陕西茵莱生物科技有限公司 | 一种用于科研实验的体外物质的培养方法 |
| CN111575237A (zh) * | 2020-05-22 | 2020-08-25 | 江苏信安佳医疗科技有限公司 | 一种乳腺癌无支架类器官专用培养基及培养方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| SUMANTA CHATTERJEE等: "Paracrine Crosstalk between Fibroblasts and ER+ Breast Cancer Cells Creates an IL1b-Enriched Niche that Promotes Tumor Growth", 《ISCIENCE》, vol. 19, 27 October 2019 (2019-10-27), pages 388 - 401 * |
| 焦慧等: "乳腺癌类器官研究进展及临床应用前景", 《中国组织工程研究》, vol. 25, no. 7, 20 August 2020 (2020-08-20), pages 1122 - 1128 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115261326A (zh) * | 2022-07-29 | 2022-11-01 | 复旦大学附属中山医院青浦分院(上海市青浦区中心医院) | 建立乳腺癌及癌旁类器官模型的培养基及培养方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Zhang et al. | Optimization of the formation of embedded multicellular spheroids of MCF-7 cells: How to reliably produce a biomimetic 3D model | |
| Auerbach et al. | Assays for angiogenesis: a review | |
| Doyle et al. | Effect of calcium alginate on cellular wound healing processes modeled in vitro | |
| CN106190980A (zh) | 一种基于人食管癌组织用于体外培养食管癌肿瘤类器官的专用培养基及培养方法 | |
| CN107217039B (zh) | 肿瘤组织3d培养方法及培养液 | |
| Wang et al. | Developing multi-cellular tumor spheroid model (MCTS) in the chitosan/collagen/alginate (CCA) fibrous scaffold for anticancer drug screening | |
| US20050014255A1 (en) | Stem cells for clinical and commercial uses | |
| CN111057680A (zh) | 用于肺部肿瘤细胞的培养基和三维培养方法 | |
| CN104531620A (zh) | 肺癌干细胞条件3d培养方法 | |
| CN114426949B (zh) | 一种建立胰腺或胰腺癌类器官的培养基及方法和应用 | |
| CN113278586A (zh) | 一种用于培养甲状腺癌类器官的培养基和培养方法 | |
| CN114317442A (zh) | 一种建立乳腺类器官或/和乳腺癌类器官的培养基及方法和应用 | |
| CN115011560A (zh) | 一种脑胶质瘤类器官、培养基及培养方法 | |
| TWI666448B (zh) | 一種預測藥物療效的方法 | |
| Smith et al. | Use of an efficient method for culturing human mammary epithelial cells to study adriamycin sensitivity | |
| KR20190035524A (ko) | 나노섬유 기반 장기간 초대 간세포 3차원 배양시스템 및 배양방법 | |
| Mazzocchi et al. | Pleural effusion aspirate for use in 3D lung cancer modeling and chemotherapy screening | |
| CN114478706A (zh) | 用于三维培养纤维网状结构多肽及其应用 | |
| Shin et al. | Angiogenic stem cell delivery platform to augment post-infarction neovasculature and reverse ventricular remodeling | |
| CN116590232A (zh) | 一种甲状腺癌类器官、培养基及培养方法 | |
| CN109136165A (zh) | 一种自组装短肽在皮肤组织创伤中快速修复的应用 | |
| EP4098739A1 (en) | Scaffold derived from decellularized organ tissue, for organ organoid culture and transplantation, and production method therefor | |
| CN114958756A (zh) | 一种用于前列腺癌类器官培养的培养液及其制备方法 | |
| KR20080097183A (ko) | 내피 세포를 함유하는 미소응집체 | |
| CN114958754A (zh) | 用于三维培养类器官纳米纤维gc水凝胶及其应用和培养直肠癌类器官的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |