CN112080500B - 制备诊断和治疗1型糖尿病药物的分子靶标及其应用 - Google Patents

制备诊断和治疗1型糖尿病药物的分子靶标及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种制备诊断和治疗糖尿病药物的分子靶标及其应用，分子靶标为mIR‑203a，mIR‑203a的碱基序列为SEQ ID NO：1。分子靶标mIR‑203a能准确反映1型糖尿病胰岛功能损伤的进展情况，进而能够用于糖尿病的诊断。同时mIR‑203a还具有明显抑制胰岛β细胞的增殖和促进胰岛β细胞的凋亡能力，可以作为治疗1型糖尿病的分子靶标。因此，分子靶标mIR‑203a具有重要的科研理论和临床应用价值，为1型糖尿病的诊断、治疗或预后判断提供新的线索和依据，可应用于制备诊断和治疗1型糖尿病药物。

Description

制备诊断和治疗1型糖尿病药物的分子靶标及其应用
技术领域
本发明涉及分子靶标领域，特别地，涉及一种制备诊断和治疗1型糖尿病药物的分子靶标及其应用。
背景技术
1型糖尿病是常见的代谢疾病，近年来其发病率和死亡率呈逐渐上升趋势。由于1型糖尿病的演变是较为复杂的病理过程，给临床的诊断及治疗带来一定的局限性，因此亟需提供一种药物为1型糖尿病的诊断、治疗或预后判断提供新的线索和依据。
发明内容
本发明提供了一种制备诊断和治疗1型糖尿病药物的分子靶标及其应用，以解决制备1型糖尿病诊断和治疗药物的技术问题。
本发明采用的技术方案如下：
本发明一方面提供了一种制备诊断和治疗1型糖尿病药物的分子靶标，分子靶标为mIR-203a，mIR-203a的碱基序列为SEQ ID NO：1。
本发明另一方面提供了一种分子靶标在制备诊断和治疗1型糖尿病药物中的应用，分子靶标为mIR-203a，mIR-203a的碱基序列为SEQ ID NO：1。
通过定量检测mIR-203a的表达水平来诊治1型糖尿病。所述定量检测包括扩增mIR-203a RNA。
本发明另一方面提供了一种分子靶标在制备诊断和治疗1型糖尿病药物中的应用，分子靶标抑制剂为mIR-203a抑制剂，mIR-203a抑制剂的碱基序列为SEQ ID NO：2，具体为：5′-CTAGTGGTCCTAAACATTTCAC-3′。
进一步地，mIR-203a应用于制备1型糖尿病的诊断试剂。
进一步地，mIR-203a应用于制备1型糖尿病的诊断试剂盒。
进一步地，mIR-203a应用于制备1型糖尿病的治疗试剂。
进一步地，mIR-203a应用于制备1型糖尿病的治疗试剂盒。
本发明具有以下有益效果：分子靶标mIR-203a能准确反映1型糖尿病的进展情况，进而能够用于1型糖尿病诊断。同时mIR-203a还具有明显抑制胰岛β细胞增殖和促进β细胞凋亡的能力，可以作为治疗1型糖尿病的分子靶标。因此，分子靶标mIR-203a具有重要的科研理论和临床应用价值，为1型糖尿病的诊断、治疗或预后判断提供新的线索和依据，可应用于制备诊断和治疗1型糖尿病药物。
除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。下面将参照图，对本发明作进一步详细的说明。
附图说明
构成本申请的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为实施例1中mIR-203a在正常血糖与高血糖NOD小鼠胰岛中的表达情况图；
图2为实施例1中mIR-203a在正常胰岛与炎症胰岛中的表达情况图；
图3～图6为实施例2中mIR-203a对MIN6细胞凋亡的影响图；
图7～图8为实施例2中mIR-203a对MIN6细胞增殖的影响图；
图9为实施例3中mIR-203a对糖尿病小鼠血糖的影响图。
可见，mIR-203a抑制剂能逆转降低血糖并逆转糖尿病的潜能。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的实施例进行详细说明，但是本发明可以由权利要求限定和覆盖的多种不同方式实施。
本发明的优选实施例提供了一种制备诊断和治疗1型糖尿病药物的分子靶标，分子靶标为mIR-203a，mIR-203a的碱基序列为SEQ ID NO：1。
分子靶标mIR-203a为短链非编码RNA，其碱基序列为SEQ ID NO：1，具体为：
5′-GUGAAAUGUUUAGGACCACUAG-3′。
mIR-203a抑制剂为mIR-203a的反向互补序列，其碱基序列为SEQ ID NO：2，具体为：5′-CTAGTGGTCCTAAACATTTCAC-3′。
本发明具有以下有益效果：分子靶标mIR-203a能准确反映1型糖尿病的进展情况，进而能够用于1型糖尿病诊断。同时mIR-203a还具有明显抑制胰岛β细胞的增殖和促进胰岛β细胞凋亡的能力，可以作为治疗1型糖尿病的分子靶标。因此，分子靶标mIR-203a具有重要的科研理论和临床应用价值，为1型糖尿病的诊断、治疗或预后判断提供新的线索和依据，可应用于制备诊断和治疗1型糖尿病药物。
本发明另一方面提供了一种分子靶标在制备诊断和治疗1型糖尿病药物中的应用，分子靶标为mIR-203a。
进一步地，mIR-203a应用于制备1型糖尿病的诊断试剂。
进一步地，mIR-203a应用于制备1型糖尿病的诊断试剂盒。
进一步地，mIR-203a应用于制备1型糖尿病的治疗试剂。
进一步地，mIR-203a应用于制备1型糖尿病的治疗试剂盒。
实施例1mIR-203a在正常小鼠胰岛β细胞和1型糖尿病小鼠胰岛β细胞中的表达情况
mIR-203a在胰岛β细胞中的表达情况
1)获取1型糖尿病胰腺组织的标本(该组织标本分别为正常小鼠胰腺①和1型糖尿病小鼠胰岛炎期②和1型糖尿病小鼠发病期胰腺组织③)，将标本常规脱水、浸蜡、包埋。切片厚度6-8um。
2)石蜡切片经过常规脱蜡至水。60℃条件下，烤片30-60min，趁热放入二甲苯中，静置10min后，转移到另一新的二甲苯中，放置10min；接着置于100％乙醇中，3min，95％乙醇5min，75％乙醇5min，50％乙醇3min，无酶水中3min，最后用PBS洗3次，每次3min。3％H2O2，室温5-10min以灭活内源性酶。无酶水洗1min×3。
3)暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3％柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3％柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶)，37℃或是室温消化3-30min(视标本新旧、厚薄自行调整)(15min)。原位杂交用PBS洗5min×3，无酶水洗3min×2。
4)后固定：胃蛋白酶消化后才需要。固定液1％多聚甲醛/0.1M PBS(PH7.2～7.6)，含有1/1000DEPC。室温固定10min，无酶水洗1min×3。
5)预杂交：湿盒的准备，干的杂交盒底部加20％甘油20ml以保持湿度。按每张切片20ul加预杂交液，恒温42℃2-4小时，吸取多余液体，不洗。
6)杂交：将切片分为实验组(即图2所示mIR-203a组)和对照组(即图2所示NC组，NC是阴性对照，Scramble为无关序列对照，Insulin是显示胰岛的分子)，其中实验组按每张切片20ul mIR-203a探针杂交液(该杂交液含与mIR-203a结合的探针分子，该杂交探针订制于武汉博士德生物工程有限公司。检测所用的原位杂交试剂盒：敏感性加强型原位杂交检测试剂盒Ⅰ，货号MK1030，该敏感性加强型原位杂交检测试剂盒Ⅰ包括mIR-203a探针杂交液和寡核苷酸探针杂交液)加在切片上，对照组(NC组)切片按照每张切片20ul寡核苷酸探针杂交液(该杂交液含对照无关序列Nc control，该杂交探针订制于武汉博士德生物工程有限公司。检测所用的原位杂交试剂盒：敏感性加强型原位杂交检测试剂盒Ⅰ，货号MK1030)恒温箱42℃杂交过夜(孵育时间尽量达16h)。
7)杂交后洗涤：37℃水温2×SSC(SSC柠檬酸钠缓冲溶液)洗涤5min×2次；37℃0.5×SSC洗涤15min×1次；37℃0.2×SSC洗涤15min×1次(如果有非特异性染色，重复0.2×SSC洗涤15min×1-2次)。
附2×SSC的配制方法：20×SSC：NaCl 175g；柠檬酸三钠88g；dH2O 1000ml；固定试剂溶解后，dH2O定容至1000ml，调pH至7.4，高压灭菌。工作液稀释成2×的SSC。其它浓度的SSC可相应配制。
8)滴加封闭液：37℃30min，甩去多余液体，不洗。
9)滴加生物素化鼠抗地高辛：室温120min，原位杂交用PBST 5min×4，勿用其他缓冲液或蒸馏水洗涤。
10)滴加SABC：37℃孵育20min或室温30min。原位杂交用PBS洗5min×3次。勿用其它缓冲液或蒸馏水洗涤。
11)滴加生物素化过氧化物酶：37℃孵育20min或室温30min。原位杂交用PBS洗5min×4次。
12)DAB(3.3'-二氨基联苯胺)镜下显色，充分水洗；苏木精复染，酒精脱水，二甲苯透明，封片。
13)所有切片均在×100、×200和×400的放大倍数下观察，从每个切片拍摄1-2个典型的胰岛用于分析。
实验组和对照组的切片除杂交步骤的杂交液不同外，其余步骤相同。取实验组和对照组处理好的切片在显微镜下观察。如图2所示，先放大100倍观察，如a所示；再对a的框内组织放大400倍观察，如b和c所示。(a)的图中的左下框中为淋巴细胞浸润的炎症胰岛，右上框中为正常的胰岛；(b)为有淋巴细胞浸润的炎症胰岛染色的放大图像(a中的左下框中的区域放大400倍)，(c)为对应的没有淋巴细胞浸润的胰岛染色的放大图像(a中的右上框的区域放大400倍，NC是阴性对照，Scramble为无关序列对照，Insulin是显示胰岛的分子)。观察mIR-203a在1型糖尿病组织(左下方深色框区域)和正常小鼠胰岛组织(右上方浅色区域)中的表达情况。
图1为mIR-203a在正常血糖与高血糖NOD小鼠胰岛中的表达情况。对胰腺组织进行连续切片后免疫组化和原位杂交结果显示：在胰岛组织中，mIR-203a表达阳性；且在发病NOD小鼠的胰岛中表达上调。“NC”用作胰岛素的对照，“Scramble”用作mIR-203a的对照。观察倍数：×400。
图1中第一行是mIR-203a在正常血糖小鼠胰岛中的表达情况；第二行是mIR-203a在高血糖NOD小鼠胰岛中的表达情况。NC是阴性对照，Scramble为无关序列对照，Insulin是显示胰岛的分子。
图2为mIR-203a在正常胰岛与炎症胰岛中的表达情况。对16周未发病NOD小鼠胰腺组织进行连续切片后，原位杂交结果表明：在同一胰腺组织中，存在淋巴细胞浸润的炎症胰岛中mIR-203a的表达较正常胰岛中表达上调。
实验组的切片显示mIR-203a在1型糖尿病小鼠胰岛β细胞中的表达量较正常小鼠胰岛β细胞中的表达量明显升高，而对照组的切片显示无关序列在肿瘤组织与正常组织表达阴性，对照组良好。综上，可见对组织进行连续切片后原位杂交检测结果显示：在正常小鼠胰岛β细胞组织中mIR-203a低表达；在1型糖尿病胰岛炎和发病小鼠胰岛β细胞中mIR-203a高表达。
实施例2
mIR-203a对胰岛β细胞凋亡的影响
(1)MIN6小鼠胰岛β细胞株培养于高糖DMEM培养基中(含15％FBS、100μg/mL链霉素、100U/mL青霉素及50μMβ巯基乙醇，葡萄糖浓度为4.5g/L)。培养箱条件设置为：温度37℃、5％CO2。每隔2-3天更换一次培养基，待细胞密度达培养瓶底面积80％左右时，按照1：3比例传代。
(2)按照吉玛转染试剂siRNA-mate(GenePharma,Shanghai,China)操作说明书进行miRNA转染：
1)转染前18-24h将MIN6细胞种于孔板中，使得转染时密度达50％左右；
2)在无菌EP管中加入Opti-MEM(6孔板200μL/孔、24孔板50μL/孔)，再加入miRNA模拟物或抑制剂、siRNA(或相应NC)轻轻混匀，再加转染试剂siRNA-mate(6孔板4μL/孔、24孔板1μL/孔)，混匀后室温孵育10min；
3)将孔板中培基更换成37℃预热的完全培基，将转染混合物加入孔板中，轻摇混匀。37℃继续培养细胞36-72h。
(3)Annexin-V-FITC/PI双染色法：使用BD公司FITC Annexin V凋亡检测试剂盒进行染色，根据试剂盒使用说明书操作如下：
1)细胞收集：处理后的MIN6细胞吸去上清后用PBS洗2-3遍，随后用胰酶消化各组细胞，新鲜培基终止消化后，将细胞悬液收集至相应的离心管(操作过程注意动作轻巧，勿用力吹打细胞，避免过度消化，以免人为损伤细胞，带来实验误差)；
2)1000rpm 4℃离心6分钟，弃去上清后用4℃预冷PBS重悬；
3)1000rpm 4℃离心6分钟，再重新用PBS洗一遍后，重悬细胞并计数细胞，取2×105个细胞至流式管中，补充PBS至相同体积后离心；
4)用灭菌双蒸水将10×Biding Buffer稀释为1×工作液，将离心后的细胞去净上清，取100μL Biding Buffer重悬细胞，分别在各管中加入5μL Annexin V染液和5μL PI染液，混匀，室温避光孵育15min；
5)在各管中加入200μL Biding Buffer，轻弹管壁弹散细胞，30min内在流式细胞仪上检测Annexin-V-FITC/PI标记的细胞。
图3～6为mIR-203a对MIN6细胞凋亡的影响图。图3.用mIR-203a模拟物或非特异序列阴性对照(mIR-203a NC)处理MIN6细胞后60h，Annexin-V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡结果表明：上调mIR-203a表达增加MIN6细胞的凋亡比例；图4.mIR-203a抑制剂(mIR-203ainhibitor)或非特异序列阴性对照(mIR-203a inhibitor NC)处理MIN6细胞60h后，Annexin-V-FITC/PI双染法检测结果表明：下调mIR-203a表达减少MIN6细胞的凋亡比例；图5.mIR-203a模拟物及其对照处理MIN6细胞后细胞凋亡流式图；图6.mIR-203a抑制剂及其对照处理MIN6细胞后细胞凋亡流式图(*P<0.05，**P<0.01)。
mIR-203a对胰岛β细胞凋亡的影响
使用同仁公司CCK-8试剂盒(CCK-8；RND Systems,Dojindo,Japan)进行检测，根据其说明书进行如下操作：
1)将消化好后的MIN6细胞制成细胞悬液，以每孔100μL种于96孔板中，恒温培养箱中培养24h，尽量使处理时细胞密度为50-60％；
2)根据实验设计对细胞进行不同处理物(mIR-203a或mIR-203抑制剂处理)处理，更换相应孔的培基；
3)将96孔板置于培养箱中孵育一段适宜时间(0、24、48和72h)；
4)用排枪向每孔中加入10μL CCK-8溶液(注意不要将排枪打到底，避免产生气泡，影响OD值读数)；
5)将96孔板置于恒温培养箱中继续培养2h；
6)打开酶标仪，设置好各处理孔的位置及参数，测定各孔在450nm处的吸光度；将各孔的读数减去加入处理物的空白吸收值后进行比较。
图7～图8为mIR-203a对MIN6细胞增殖的影响。图7.用mIR-203a模拟物或非特异序列阴性对照(mIR-203a NC)处理MIN6细胞后0、24、48和72h后CCK-8检测结果显示；mIR-203a能明显抑制MIN6细胞的增殖；图8.mIR-203a抑制剂(mIR-203a inhibitor)或非特异序列阴性对照(mIR-203a inhibitor NC)处理MIN6细胞0、24、48和72h后CCK-8检测结果显示：mIR-203a可以促进MIN6细胞增殖。(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)。
实施例3
mIR-203a抑制剂对糖尿病小鼠的治疗作用
1.NOD/ShiLtJ小鼠按照安进机构动物护理和使用委员会的标准方案进行护理；
2.当NOD/ShiLtJ小鼠血糖在250-300mg/dL时，并在24小时检测两次都呈高血糖。尾静脉注射2×107mIR-203、mIR-203a抑制剂腺病毒(Sigma,St.Louis,MO,USA)。检测血糖水平变化，结果表明，mIR-203a抑制剂处理组能降低血糖水平并逆转糖尿病发病的潜能。
图9为mIR-203a对糖尿病小鼠血糖的的影响图，为mIR-203a抑制剂腺病毒载体或非特异序列阴性对照腺病毒载体(mIR-203a inhibitor NC)尾静脉处理新发病NOD/ShiLtJ后，对血糖水平的影响，检测结果显示：mIR-203a抑制剂处理组能降低血糖水平并逆转糖尿病发病的潜能。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Figure BDA0002643990490000081
序列表
<110> 中南大学湘雅二医院
<120> 制备诊断和治疗1型糖尿病药物的分子靶标及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gugaaauguu uaggaccacu ag 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctagtggtcc taaacatttc ac 22

Claims (7)

1.一种检测mIR-203a表达水平的试剂在制备诊断1型糖尿病药物中的应用，其特征在于，mIR-203a的碱基序列为SEQ ID NO：1。
2.根据权利要求1所述的检测mIR-203a表达水平的试剂在制备诊断1型糖尿病药物中的应用，其特征在于，通过定量检测mIR-203a的表达水平来诊治1型糖尿病。
3.根据权利要求2所述的检测mIR-203a表达水平的试剂在制备诊断1型糖尿病药物中的应用，其特征在于，所述定量检测包括扩增mIR-203a RNA。
4.根据权利要求1所述的检测mIR-203a表达水平的试剂在制备诊断1型糖尿病药物中的应用，其特征在于，所述mIR-203a应用于制备1型糖尿病的诊断试剂。
5.根据权利要求1所述的检测mIR-203a表达水平的试剂在制备诊断1型糖尿病药物中的应用，其特征在于，所述mIR-203a应用于制备1型糖尿病的诊断试剂盒。
6.一种mIR-203a抑制剂在制备治疗1型糖尿病药物中的应用，其特征在于，
mIR-203a抑制剂的碱基序列为SEQ ID NO：2。
7.根据权利要求6所述的mIR-203a抑制剂在制备治疗1型糖尿病药物中的应用，其特征在于，mIR-203a抑制剂应用于制备1型糖尿病的治疗试剂。
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