CN106754908B

CN106754908B - 制备诊断和治疗结肠癌药物的分子靶标及其应用

Info

Publication number: CN106754908B
Application number: CN201710043610.3A
Authority: CN
Inventors: 俞海波; 赵莲; 胡桂; 李夏雨; 王晓艳; 沈守荣; 张学梅; 艾飞艳
Original assignee: Second Xiangya Hospital of Central South University; Third Xiangya Hospital of Central South University
Current assignee: Second Xiangya Hospital of Central South University; Third Xiangya Hospital of Central South University
Priority date: 2017-01-19
Filing date: 2017-01-19
Publication date: 2020-03-24
Anticipated expiration: 2037-01-19
Also published as: CN106754908A

Abstract

本发明公开了一种制备诊断和治疗结肠癌药物的分子靶标及其应用，分子靶标为LINC00657，LINC00657的碱基序列为SEQ ID NO：1。分子靶标LINC00657能准确反映结肠癌的进展情况，进而能够用于结肠癌诊断。同时LINC00657还具有明显促进细胞的增殖和转化能力，可以作为治疗结肠癌的分子靶标。因此，分子靶标LINC00657具有重要的科研理论和临床应用价值，为结肠癌的诊断、治疗或预后判断提供新的线索和依据，可应用于制备诊断和治疗结肠癌药物。

Description

制备诊断和治疗结肠癌药物的分子靶标及其应用

技术领域

本发明涉及分子靶标领域，特别地，涉及一种制备诊断和治疗结肠癌药物的分子靶标及其应用。

背景技术

结肠癌是常见的恶性肿瘤，近年来其发病率和死亡率呈逐渐上升趋势。由于肿瘤的演变是较为复杂的病理过程，给临床的诊断及治疗带来一定的局限性，因此亟需提供一种药物为结肠癌的诊断、治疗或预后判断提供新的线索和依据。

发明内容

本发明提供了一种制备诊断和治疗结肠癌药物的分子靶标及其应用，以解决制备结肠癌诊断和治疗药物的技术问题。

本发明采用的技术方案如下：

本发明一方面提供了一种制备诊断和治疗结肠癌药物的分子靶标，分子靶标为LINC00657，LINC00657的碱基序列为SEQ ID NO：1。

本发明另一方面提供了一种分子靶标在制备诊断和治疗结肠癌药物中的应用，分子靶标为LINC00657。

进一步地，LINC00657应用于制备结肠癌的诊断试剂。

进一步地，LINC00657应用于制备结肠癌的诊断试剂盒。

进一步地，LINC00657应用于制备结肠癌的治疗试剂。

进一步地，LINC00657应用于制备结肠癌的治疗试剂盒。

本发明具有以下有益效果：分子靶标LINC00657能准确反映结肠癌的进展情况，进而能够用于结肠癌诊断。同时LINC00657还具有明显促进细胞的增殖和转化能力，可以作为治疗结肠癌的分子靶标。因此，分子靶标LINC00657具有重要的科研理论和临床应用价值，为结肠癌的诊断、治疗或预后判断提供新的线索和依据，可应用于制备诊断和治疗结肠癌药物。

除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。下面将参照图，对本发明作进一步详细的说明。

附图说明

构成本申请的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1为实施例1中以real-time PCR方法检测LINC00657在正常结肠上皮细胞和结肠癌细胞中的表达结果图；

图2为实施例2中以原位杂交法检测LINC00657在正常结肠上皮与结肠癌细胞中的表达结果图；

图3为实施例3中HT29细胞中转染LINC00657质粒、LINC00657 siRNA质粒和空白质粒后的流式检测结果图；

图4为实施例3中HT29细胞中转染LINC00657质粒、LINC00657 siRNA质粒和空白质粒后的流式检测结果图；

图5为实施例4中LINC00657对裸鼠移植瘤细胞生长的影响图；

图6为实施例4中LINC00657对裸鼠移植瘤细胞的生长曲线图。

可见，不同处理组荷瘤裸鼠肿瘤及肿瘤生长曲线：无酶水(DEPC)处理组；LINC00657 siRNA处理组；结果显示LINC00657siRNA处理组能明显促进肿瘤的增长(P<0.01)。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的实施例进行详细说明，但是本发明可以由权利要求限定和覆盖的多种不同方式实施。

本发明的优选实施例提供了一种制备诊断和治疗结肠癌药物的分子靶标，分子靶标为LINC00657，LINC00657的碱基序列为SEQ ID NO：1。

分子靶标LINC00657为长链非编码RNA，其碱基序列为SEQ ID NO：1，具体为：

进一步地，LINC00657应用于制备结肠癌的诊断试剂。

进一步地，LINC00657应用于制备结肠癌的诊断试剂盒。

进一步地，LINC00657应用于制备结肠癌的治疗试剂。

进一步地，LINC00657应用于制备结肠癌的治疗试剂盒。

实施例1LINC00657在正常结肠上皮细胞和结肠癌细胞中的表达情况

(1)细胞培养及RNA提取

分别取正常结肠上皮细胞系CCD841Con细胞和NCM460细胞系于12％胎牛血清的DMEM培养基中培养。再分别取结肠癌细胞系SW480细胞、SW620细胞、HT29细胞和HCT116细胞培养于10％胎牛血清的1640培养基中。待各培养体系中细胞长满，除去培养基，分别单独收集上述细胞分别加Trizol(5×10⁶细胞/1ml Trizol)吹打混匀，冰上静置5-10min，提取RNA或-70℃保存。

(2)细胞Total RNA(总RNA)提取

各细胞均按如下步骤单独进行操作，分别得到各细胞的Total RNA。

Trizol提取细胞总RNA：加氯仿200μl/mlTrizol于Tube中，用手震荡15-30s，冰上放置5min，4℃12000g离心15min。小心取上层水相入新tube中，加入预冷的异丙醇0.5ml/mlTrizol混匀，-20℃冰箱静置20min，4℃12000g离心10min。弃上清，加入75％DEPC(焦碳酸二乙酯)水稀释的乙醇1-2ml混匀，4℃7500g离心5min。尽量弃上清，室温干燥5-10min，加入DEPC水10-20μl溶解RNA。用DNase-I消化RNA中痕量的DNA测定RNA浓度和纯度，-70℃保存。

(3)RT-PCR(逆转录及PCR扩增)

分别对各细胞中的Total RNA进行逆转录，使用RNA逆转录试剂盒(购于Fermentas公司)，20μL逆转录反应的体系如下：

逆转录程序：42℃60分钟，70℃5分钟。对逆转录产物进行PCR扩增LINC00657 mRNA(扩增LINC00657 mRNA左右引物分别是：Left:5-3cagaggaggtatgcagggag；Right:5-3ggatgtctagctccaagggg)(该引物通过primer5.0软件进行设计，再通过NCBI BALST进行匹配确认该引物为LINC00657特异引物)。20μL反应体系如下：

Component(成份)	Vol/1rxns
		Taq mix(Taq缓冲液)	10μl
LINC00657 left(10uM)prime(左引物)	1μl
		LINC00657 right(10uM)prime(右引物)	1μl
cDNA Sample(cDNA样本)	1μl
		RNase Free H<sub>2</sub>O(无酶水)	To 20μl

LINC00657实时定量PCR反应程序：95℃3分钟，40个循环，95℃12秒，62℃35秒。

实时荧光定量PCR检测LINC00657的表达情况。通过Real-time PCR验证了LINC00657在正常结肠上皮细胞系CCD841Con细胞系和NCM460细胞系、结肠癌SW480细胞、结肠癌SW620细胞系、结肠癌HT29细胞系和结肠癌HCT116细胞系的表达情况，结肠正常上皮细胞CCD841CoN细胞、NCM460细胞作为正常对照组。LINC00657表达水平检测以为内参并将正常对照组标准化为1。实验重复三次取均数。(*)<0.05。结果如图1所示。结果显示：LINC00657在结肠癌细胞系中较正常对照组表达水平上调，差异有统计学意义(*p<0.05，**p<0.01)。并且LINC00657在结肠癌细胞系中表达上调4.3倍(p<0.01)。

实施例2原位杂交检测LINC00657

1)获取结肠癌组织(该组织包含结肠癌组织和癌旁正常组织)的标本，将标本常规脱水、浸蜡、包埋。切片厚度6-8um。

2)石蜡切片经过常规脱蜡至水。60℃条件下，烤片30-60min，趁热放入二甲苯中，静置10min后，转移到另一新的二甲苯中，放置10min；接着置于100％乙醇中，5min，95％乙醇5min，75％乙醇5min，50％乙醇5min，无酶水中3min，最后用PBS洗3次，每次3min。3％H₂O₂，室温5-10min以灭活内源性酶。无酶水洗1min×3。

3)暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3％柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3％柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶)，37℃或是室温消化3-30min(视标本新旧、厚薄自行调整)(15min)。原位杂交用PBS洗5min×3，无酶水洗1min×1。

4)后固定：胃蛋白酶消化后才需要。固定液1％多聚甲醛/0.1M PBS(PH7.2～7.6)，含有1/1000DEPC。室温固定10min，无酶水洗1min×3。

5)预杂交：湿盒的准备，干的杂交盒底部加20％甘油20ml以保持湿度。按每张切片20ul加预杂交液，恒温42℃2-4小时，吸取多余液体，不洗。

6)杂交：将切片分为实验组(即图2所示LINC00657组)和对照组(即图2所示NC组)，其中实验组按每张切片20ul NORAD-h寡核苷酸探针杂交液(该杂交液含与LINC00657结合的探针分子，该杂交探针订制于武汉博士德生物工程有限公司。检测所用的原位杂交试剂盒：敏感性加强型原位杂交检测试剂盒Ⅰ，货号MK1030，该敏感性加强型原位杂交检测试剂盒Ⅰ包括NORAD-h寡核苷酸探针杂交液和寡核苷酸探针杂交液)加在切片上，对照组(NC组)切片按照每张切片20ul寡核苷酸探针杂交液(该杂交液含对照无关序列Nc control，该杂交探针订制于武汉博士德生物工程有限公司。检测所用的原位杂交试剂盒：敏感性加强型原位杂交检测试剂盒Ⅰ，货号MK1030)恒温箱42℃杂交过夜。

7)杂交后洗涤：37℃水温2×SSC(SSC柠檬酸钠缓冲溶液)洗涤5min×2次；37℃0.5×SSC洗涤15min×1次；37℃0.2×SSC洗涤15min×1次(如果有非特异性染色，重复0.2×SSC洗涤15min×1-2次)。

附2×SSC的配制方法：20×SSC：NaCl 175g；柠檬酸三钠88g；dH₂O 1000ml；固定试剂溶解后，dH₂O定容至1000ml，调pH至7.4，高压灭菌。工作液稀释成2×的SSC。其它浓度的SSC可相应配制。

8)滴加封闭液：37℃30min，甩去多余液体，不洗。

9)滴加生物素化鼠抗地高辛：室温120min，原位杂交用PBST 5min×4，勿用其他DAB(3.3'-二氨基联苯胺)显色，苏木精复染，充分水洗，酒精脱水，二甲苯透明，封片。

实验组和对照组的切片除杂交步骤的杂交液不同外，其余步骤相同。取实验组和对照组处理好的切片在显微镜下观察。如图2所示，结肠组织中框内(×100)的区域对应在高倍镜下观察(×200)。观察LINC00657在结肠癌组织(下方深色框区域)和癌旁正常组织(上方浅色区域)中的表达情况。实验组的切片显示Linc00657在肿瘤组织中的表达量较正常癌旁组织中的表达量明显升高，而对照组的切片显示无关序列在肿瘤组织与正常组织表达阴性，对照组良好。综上，可见对组织进行连续切片后原位杂交检测结果显示：在癌旁组织中LINC00657低表达；在结肠癌组织中LINC00657高表达。

实施例3转染及流式检测

准备用于转染后上调细胞内LINC00657的LINC00657质粒、转染后下调细胞内LINC00657的siRNA质粒及空白阴性对照质粒(negative control，NC)(购于山东维真生物科技有限公司)、HT29细胞和SW480细胞。按照下列步骤分别对HT29细胞进行LINC00657质粒转染、LINC00657 siRNA质粒转染和空白质粒转染，以及对SW480细胞进行LINC00657质粒转染、LINC00657 siRNA质粒转染和空白质粒转染，并对上述转染后的相应细胞进行流式检测。

1)转染程序：将细胞分别接种于6孔板中，完全培养基培养细胞。加入5μl的脂质体(lipofectamine2000转染试剂盒，购于Invitrogen公司)到200μl无血清培养基中，混匀静置15min。稀释400ng相应质粒于200μl无血清培养基中，并将上述脂质体与质粒稀释液混合，室温放置30min。待细胞生长至30％密度后，分别用Hank's液与无血清培养基洗涤细胞，将上述混合物加入6孔板中，再加1600μl无血清培养基，放置于CO₂培养箱中，37℃培养6h。弃去上清，加入完全培养基继续培养48h。

2)胰酶消化生长状态良好、70％～80％融合度的贴壁细胞。1500rpm/min，离心5min，收集细胞沉淀。1×PBS洗细胞，1500rpm/min，离心5min，收集细胞。如此重复洗2次。在旋涡震荡器上充分震荡使成为单个细胞悬液，70％预冷乙醇固定。

3)流式细胞仪检测时，用PH7.4的PBS洗涤乙醇固定的细胞，离心后去除固定液，加碘化丙锭(PI)染色液(含50mg/L PI,1g/L Triton X-100，100g/L RNase)混匀，37℃，避光30min。

4)流式细胞仪FAM检测，每次分析1×106各细胞，重复3次，检测细胞的荧光强度进行分析。

LINC00657对细胞周期的影响：A：如图3所示，HT29细胞中转染LINC00657和LINC00657 siRNA后流式检测结果显示：LINC00657能明显促进细胞从G0/G1向S期转换。LINC00657 siRNA能明显抑制细胞从G0/G1向S期转换，实验重复三次取均数，差异有统计学意义，(*)<0.05。B：如图4所示，SW480细胞中转染LINC00657和LINC00657 siRNA后流式检测结果显示：LINC00657能明显促进细胞从G0/G1向S期转换。LINC00657 siRNA能明显抑制细胞从G0/G1向S期转换，实验重复三次取均数，差异有统计学意义，(*)<0.05注：NC组(细胞中转染空白质粒)；LINC00657(细胞中转染LINC00657质粒)；LINC00657 siRNA(细胞中转染LINC00657 siRNA质粒)。

实施例4裸鼠移植瘤实验

1)瘤细胞悬液接种：对数生长期的HT29细胞经胰酶消化后，1500rpm/min，常温离心5min，弃去上清，用PBS离心洗涤2次；计算细胞数；并调整细胞浓度至1×107/ml。

2)准备雄性裸鼠10只，周龄4周，分笼饲养，予以标准饲料及饮水让其自由摄食，小鼠随机分成2实验组与对照组，每组5只。将步骤1的细胞悬浮在生理盐水中，制成细胞悬液，并接种于各组的雄性裸鼠一侧腋部皮下。

3)观察接种细胞后裸鼠一般情况和精神状态，记录移植瘤形成的时间及大小。

4)治疗：待肿瘤长至150mm³时，以10nmol胆固醇修饰siRNA/次/只溶于100μl生理盐水对实验组的小鼠进行瘤内原位多点注射。对照组用10nmol胆固醇修饰无关序列scramble(广州市锐博生物科技有限公司合成)100ul生理盐水进行瘤内原位多点注射，每隔3天注射一次。

5)移植瘤体积、重量及瘤重抑瘤率：治疗后每2天用游标卡尺测各组小鼠移植瘤最长径(L)和最短径(W)，计算肿瘤体积(V)，V＝L×W2×0.52。绘制治疗后移植瘤生长曲线。

6)实验结束时，完整剥离肿瘤，照相，测量其体积及重量。每组分别取部分移植瘤组织用10％的甲醛固定，其余均在液氮超低温冰箱中保存。

LINC00657对裸鼠移植瘤细胞生长的影响。实验结果显示：A：如图5所示，LINC00657 siRNA处理组裸鼠移植瘤较对照组明显小，可见LINC00657 siRNA能明显抑制裸鼠移植瘤细胞的生长。B：如图6所示，裸鼠移植瘤生长曲线结果显示：LINC00657 siRNA能明显抑制裸鼠移植瘤肿瘤细胞的生长速度，差异有统计学意义，(*)<0.05；注：图5和图6中NC组为对照组，LINC00657 siRNA组为实验组。

实施例1通过Real-time PCR检测了LINC00657在正常结肠上皮细胞系CCD841Con细胞系、NCM460细胞系、结肠癌SW480细胞、结肠癌HT29细胞系、结肠癌SW620细胞系和结肠癌HCT116细胞系的表达情况，证明显示LINC00657在结肠癌细胞系中高度表达，其表达上调4.3倍(p<0.01)。实施例2的原位杂交结果同样显示LINC00657在结肠癌组织中较正常结肠组织中的表达量明显上调。实施例3和实施例4在体内与体外对LINC00657的生物学功能进行研究：结果表明：LINC00657可以明显促进结肠癌细胞的增殖，沉默LINC00657后能明显抑制结肠癌肿瘤细胞的增殖与转化能力。综上LINC00657可以作为结肠癌诊断与治疗的分子靶标，分子靶标LINC00657可应用在制备诊断和治疗结肠癌的药物中。进而，分子靶标LINC00657可应用于制备结肠癌的诊断试剂、制备结肠癌的诊断试剂盒、制备结肠癌的治疗试剂、结肠癌的治疗试剂盒。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中南大学湘雅二医院、中南大学湘雅三医院

<120> 分子靶标LINC00657在制备诊断和治疗结肠癌药物中的应用

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 5378

<212> RNA

<213> 人工序列

<223> 分子靶标LINC00657

<400> 1

agttccggtc cggcagagat cgcggagaga cgcagaacgc agcccgctcc tccagggccc 60

tccaggccct ccggccccgg gccggcgggt gaactggggg gccccgggac aggccgagcc 120

ctctgccctg cagataacgg aggcctctgc tgtggctgcc cactggctgt gcccgcccac 180

tggctgtgcc cagaccttga agccgcagcg aacctctctt tcccacccca cctcggtgac 240

taatggcggc cgtggcgtct cccagcccgg accccgccgg cacccgggtc tcccgaccca 300

agcctcgacg aaacccccgc agagccgccg ggacgcagcg cctttgggcg gcgctgggcg 360

tggtgggccg ggaagtatgg cggcagctcg aacgccgcgc ggcggaggcc attaaggcgt 420

ggacggcccg ggaaggcggc ctagggacgc aagcaggctc ggccgcctct ttaggccacg 480

gagccgcgca gatccggttc ccgggtgacc actctgtcgc cattgggcga gacctaccta 540

gtcctgacga caacggacaa aggccttaag gggcctggaa ggtgagcgaa gtcccgaacg 600

acgacgggtg gaacggttag cggccatcgg gcggttggtc ttcattctac cagactttgc 660

tgtcggaaga gagaaatggt agaatgacag gccacgtttg gcccgttgga aatgcccacc 720

accctctggg aagatttact ggccgtttat ggaaggcctg tgtatataat atgaaaaagc 780

tgctctcaac tccaccccaa ccttttaata gaaaacattt gtcacatcta gcccttctag 840

atggaaagag gttgccgacg tatgataaaa tagagttaga aagttacaca tcttgtaaat 900

tctcatttgt ttaaaagaaa tcatagaaaa tacatgtctt ctggagatga cttttggaaa 960

tggagttgtt aagacggcct ctggaagcga tacgtccacg tttgttaagt gggttagatg 1020

acatggagct ggaagacctg agaaggaaga gaagaaggtt ctatgctaga ctggtcatat 1080

ttagaagaca ttttcatatt ctatccattg ttttgtgtgc attttattcc tcactactgt 1140

gtatatagtt gacaatgcta agcttttttg aaatgtctct tctttttaga tgttctgaag 1200

tgcctgatat gttaaaatta gaggtagcaa aatcacattt tgtaaatacc tttttgttac 1260

aattcatagg aaatattttt gggggggaat ggccaaatca cctgttgagt aatactcatt 1320

gtgtttgtgc agtggttcag gggaggagag aggaggggga ggtgcagaga gctctatgcc 1380

atcctgttta cagcgaggca agatgaatca ttatgtctgt gcattttgtt ttacttatct 1440

gtgtatatag tgtacataaa ggacagacga gtcctaattg acaacatcta gtctttctgg 1500

atgttaaaga ggttgccagt gtatgacaaa agtagagtta gtaaactaat atattttgta 1560

cattttgttt tacaagtcct aggaaagatt gtcttctgaa aatttgatgt cttctgggtt 1620

gatggagatg ggaagggttc taggccagaa tgttcacatt tggaagactc tttcaaatta 1680

taactgttgt tacatgtttg cagtttattc aagactgctg tatacatagt agacaaatta 1740

actccttact tgaaacatct agtctatcta gatgtttaga agtgcccgat gtatgttaaa 1800

tgtataggta gtaaaatacc actttgtaaa tatctttttg ctaaaattca taggaaatgc 1860

ttttggaaat tgaattgtga agccaccttt gtgaacagta tagtaatgtc tatacttgtt 1920

caatagttta gaggaggtag gagggaagaa attgcaaaag gtaatattac tagtgtgttc 1980

atacttggac attttcagac accatttttc tatatgtttt gtgcattttg ttttgctctg 2040

tatatagtat atataatgga caaatagtcc taatttttca acatctagtc tctagatgtt 2100

aaagaggttg ccagtgtatg acaaaggagt aaaattagca tattttgtac actttgtgtt 2160

gaaattcgta ggaaaacttg tcttctgtaa agacttttgc ataggaattt gtttgaccat 2220

ctctaagcat tacacgtgcc tgtacttgtc cactggattg aaggcagaga aggaagggag 2280

gagggaatga ttcaaggcca aaatggccac atttagaaga tacctcagat gataaccatt 2340

gttatgtgtg tgcaatttta tttaacagtg ctgtgtatgt ggtggacaag ttatatgaaa 2400

tatctagtct ttctagatat ttggaagtgc ttgatgtatt taaaagtggt agtagaataa 2460

cactttgtaa atagctttta aaaactgatg ggaaatgctg tttggaagtg gaattgttga 2520

accacctggg aggtgggagg gaagaaattg caaatggtgt tttgccattg tttattagaa 2580

aatttcagct taatccattg tgtatatgtt acatgcattt catttaactt tgctatactg 2640

tatatattgt atatataacg gacaaattag tcccgatttt ataatatcta gtctctagat 2700

attaaagagg ttgccaatgt atgacagaag tagagttagt aaactaacac attttgtaca 2760

ctttgttaaa atttgtagaa aggctgtctt ctgaaaagga cttttggaag tgagataaca 2820

tcagctctaa gtgacacgtg cctatatcca tcaggttggt ggtggagagg agttggaagg 2880

aatgaagggt tctagaccag aatgttcgta tttagaagac actatcagat ataaccattg 2940

ttacatgtgt gtagtttatt caaccctact gtgtatatag cggacaaact taagtcctta 3000

tttgaaacat ctagtctttc tagatgttta gaagtgcaca aagtatgtta aaagtagagg 3060

tagtaaataa cacattttgt agctatcctt ttgatatgaa atattgtctt ggaaattgat 3120

caattctctg agcagtaccc attttgatat ttgtgctggt tcagggggaa ggaggagcac 3180

aaagtgcaaa gggctttcta ccagtgtcca gtgtgtttat gaggaggcac attgaccatt 3240

gtcccttatg tctgcatttt catttactgt gctgtgtata tagtgtatat aagcggacat 3300

aggagtccta atttacgtct agtcgatgtt aaaaaggttg ccagtatatg acaaaagtag 3360

aattagtaaa ctactacatt gagtacactt tgtgttaaaa ttcataggga agacttctta 3420

aaaacaagtg aaattgttaa aaccccccct aagcattaca gatggcttat agctgtccac 3480

ggggttggta gaggtgggaa agggaagggt tctaggccag aatgttccta tttagaagac 3540

actcaaatta cagtctgtgt tatgtatgta taccatttat tcaatgctac tgtgtatata 3600

atggaaaact taagtccagt ttgaaacatc tagtctttct aggtgtttaa aagtgtacaa 3660

cggcctgtcg cagtggcgca tgcctgtaat cccagcactt tgggaggccg aggcaggcgg 3720

atcacgaggt caagagatca ggaccatctt ggccaacatg gtgaaacccc atctttacta 3780

aaaatacaaa aattagctgg tcgtggtggt gcccacctgt agccccagtt actcgagagg 3840

ctgaggcagg agaatcgctt gaacttggga ggcggaagtt gcagtgagcc aagatcgcac 3900

cactgcactc cagcctggcg acagagcgag gctccgtttc aaaaaaaaaa gtgcacaatg 3960

taggttaaca gtagagggct taagtaacac ccctctaagc atttgttttc agtacttcct 4020

aggagtggtt gcatttggga atggaattgt taaaacttga tgcttaggag cgaatgcaga 4080

ctattcattg ggtgtttggg gtgggggaag ggggggtggg cagaggaggt atgcagggag 4140

aggggttctg tgctcctgag attagttcag atggtctaac cattgttcta tatgtgcatt 4200

ttagttaata ttgtgtatta aaggataagt cttaatgctc aaagtatgtt aaaaatagat 4260

gtagtaaatc agtccctttg tgaatgtcct tttgttagtt tttaggaagg cctgtcctct 4320

gggagtgacc tttattagtc caccccttgg agctagacat cctgtactta gtcacgggga 4380

tggtggaaga gggagaagag gaagggtgaa gggaagggct ctttgctagt atctccatat 4440

ctagacgatg gttttagatg ataaccacag gtctacaaga gcgtttttag taaagtgcct 4500

gtgttcattg tggacaaagt tattattttg caacatctaa gctttacgaa tggggtgaca 4560

acttatgata aaaactagag ctagtgaatt agcctatttg taaatacctt tgttataatt 4620

gataggatac atcttggaca tggaattgtt aagccacctc tgagcagtgt atgtcaggac 4680

ttgttcatta ggttggcagc agaggggcag aaggaattat acaggtagag atgtatgcag 4740

atgtgtccat atatgtccat atttacattt tgatagccat tgatgtatgc atctcttggc 4800

tgtactataa gaacacatta attcaatgga aatacacttt gctaatattt taatggtata 4860

gatctgctaa tgaattctct taaaaacata ctgtattctg ttgctgtgtg tttcatttta 4920

aattgagcat taagggaatg cagcatttaa atcagaactc tgccaatgct tttatctaga 4980

ggcgtgttgc catttttgtc ttatatgaaa tttctgtccc aagaaaggca ggattacatc 5040

tttttttttt tttttagcag tttgagttgg tgtagtgtat tcttggttat cagaatactc 5100

atatagcttt gggattttga attggtaaat attcatgatg tgtgaaaaat catgatacat 5160

actgtacagt ctcagtccca taaaattgga tgttgtgcct acacacagga tctagaagaa 5220

tatgtcaaac tataaactgc ttgtgattgt gaatgacttt gttctttgct tgtgtttttc 5280

aatttcctat aatgcacata ctaactttta aaaaataaag gttattttaa aagcctgtat 5340

taaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 5378

<210> 2

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

<223> LINC00657 mRNA左引物

<400> 2

cagaggaggt atgcagggag 20

<210> 3

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

<223> LINC00657 mRNA右引物

<400> 3

ggatgtctag ctccaagggg 20

Claims

1.一种分子靶标在制备治疗结肠癌药物中的应用，其特征在于，所述分子靶标为LINC00657，LINC00657的碱基序列为SEQ ID NO：1，通过定量检测LINC00657的表达水平来诊治结肠癌，所述定量检测包括扩增LINC00657 mRNA，扩增LINC00657 mRNA的左右引物分别是：Left:5-3cagaggaggtatgcagggag；Right:5-3ggatgtctagctccaagggg。

2.根据权利要求1所述的分子靶标在制备治疗结肠癌药物中的应用，其特征在于，所述LINC00657应用于制备结肠癌的治疗试剂。

3.根据权利要求1所述的分子靶标在制备治疗结肠癌药物中的应用，其特征在于，所述LINC00657应用于制备结肠癌的治疗试剂盒。