ES2916580T3 - Andamios de biomatriz - Google Patents

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Yunfang Wang
Lola Cynthia Mcadams Reid
Andrew Zhuang Wang
Mitsuo Yamauchi
Cai-Bin Cui
Michael Edward Werner
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Abstract

Un método para producir un andamio de biomatriz a partir de un tejido biológico que se selecciona del grupo que consiste en pulmón tiroides, piel, páncreas, vasos sanguíneos, vejiga, riñones, cerebro, árbol biliar, duodeno, aorta abdominal, vena ilíaca, corazón e intestinos, que comprenden: a) perfundir u homogeneizar el tejido biológico con un primer medio basal, en donde la osmolalidad de dicho primer medio es de 250 mOsm/kg a 350 mOsm/kg y dicho primer medio no contiene suero y está a pH neutro; después b) perfundir el tejido biológico o extraer el homogeneizado de la etapa (a) con un tampón delipidante que comprenda desoxicolato de sodio y fosfolipasa A2 en dicho primer medio; después c) perfundir el tejido biológico o extraer el homogeneizado de la etapa (b) con un tampón a un pH neutro y que comprende una concentración de sal de NaCl 2,0 M a 5,0 M, la concentración elegida para mantener los colágenos insolubles identificados en el tejido biológico; después d) perfundir el tejido biológico o extraer el homogeneizado de la etapa (c) con RNasa y DNasa en un tampón y después e) enjuagar el tejido biológico u homogeneizado de la etapa (d) con un segundo medio que está a pH neutro, no contiene suero y tiene una osmolalidad de 250 mOsm/kg a 350 mOsm/kg, lo que produce de esta manera un andamio de biomatriz intacto u homogeneizado a partir del tejido biológico, dicho andamio de biomatriz retiene al menos el 95 % de sus colágenos originales y la mayoría de los mayoría de los componentes de la matriz asociados a colágeno y los factores de crecimiento, hormonas y citocinas unidos a la matriz del tejido biológico.

Description

DESCRIPCIÓN
Andamios de biomatriz
Antecedentes de la invención
La capacidad de usar células diferenciadas ex vivo o en programas clínicos tales como las terapias celulares depende de la capacidad de mantener las células con un fenotipo adulto y completamente funcional o de poder restringir el linaje de células madre o progenitoras ("madre/progenitoras") para lograr ese fenotipo adulto. La revolución en curso en la investigación con células madre ha hecho posible la identificación y el aislamiento de las poblaciones de células madre/progenitoras, que incluye de tejidos embrionarios, fetales y postnatales1. La capacidad de identificar y aislar las células madre/progenitoras para todos los tipos de células adultas y de expandirlos y diferenciarlos aumenta en gran medida el potencial para su uso para programas de investigación farmacéutica y otros programas industriales, para investigaciones académicas y para programas clínicos tales como terapias basadas en células e ingeniería de tejidos2.
Los métodos actuales para mantener las células diferenciadas o restringir el linaje de células madre a un destino adulto ex vivo son parcialmente exitosos e involucran la siembra de las células sobre o incluidas en un sustrato de componente(s) de una matriz extracelular y en un medio comprendido de hormonas específicas, factores de crecimiento y nutrientes adaptados para el fenotipo adulto deseado. Para las células madre muy primitivas, tales como los células madre embrionarias (ES) o madre pluripotentes inducidas (iPS) o las derivadas de forma postnatal que pueden ir a múltiples destinos adultos, tales como las células madre mesenquimales (MSC) o las células madre derivadas de líquido amniótico (AFSC), las células madre se someten a una mezcla de señales solubles y/componentes de la matriz extracelular y se deben tratar con múltiples conjuntos de estas señales durante semanas. Típicamente, el fenotipo adulto que se logra es distinto con cada preparación y tiene una expresión excesiva o insuficiente de ciertos genes específicos para adultos y/o una regulación aberrante de uno o más de los genes específicos de tejido adulto.
La matriz extracelular se secreta por las células, es adyacente a ellas en una o más de sus superficies y se ha entendido durante mucho tiempo que es el soporte estructural de las células7. Es un andamio extraordinariamente complejo compuesto por una variedad de moléculas biológicamente activas que están altamente reguladas y son críticas para determinar la morfología, el crecimiento y la diferenciación de las células unidas8. La expresión génica específica de tejidos en células cultivadas mejora al cultivar las células en extractos de matriz o componentes de matriz purificados9. Sin embargo, los componentes individuales de la matriz, solos o en combinación, son incapaces de recapitular la compleja química y arquitectura de la matriz de un tejido. Esto se relaciona con el hecho de que los componentes de la matriz están en gradientes asociados con zonas de tejido natural y con estructuras histológicas tales como los vasos sanguíneos. Esta complejidad de la matriz tisular se logra de una manera más fácil mediante extracciones que descelularizan un tejido y dejan atrás la matriz como un residuo1011. Sin embargo, los protocolos actuales de descelularización resultan en pérdidas importantes de algunos de los componentes de la matriz debido al uso de enzimas o tampones que degradan la matriz que solubilizan los componentes de la matriz. Se conoce del estado de la técnica (Ross y otros., J.AM. Soc. Nephrol 2009, 20, 11, 2338-2347 y Shupe, Organogenesis, 2010, 6, 2, 134-136) cómo usar tratamientos con SDS y un Tritón o con SDS solo (documento WO2010/039823). Sin embargo, estos detergentes agresivos pueden dañar la matriz extracelular.
La presente invención proporciona andamios de biomatriz y métodos para hacer dichos andamios de biomatriz. Los métodos de esta invención dan como resultado la producción de un extracto específico de tejido enriquecido en la mayoría de los colágenos del tejido y con componentes de la matriz que se unen y hormonas unidas a la matriz, factores de crecimiento y citocinas que de manera colectiva producen efectos de diferenciación más reproducibles y potentes en células maduras y en la restricción del linaje de las poblaciones de células madre/progenitoras.
Resumen de la invención
La presente invención proporciona, en un aspecto, un método para producir un andamio de biomatriz a partir de tejido biológico seleccionado del grupo que consiste en pulmón, tiroides, piel, páncreas, vasos sanguíneos, vejiga, riñones, cerebro, árbol biliar, duodeno, aorta abdominal, vena ilíaca, corazón e intestinos, que comprende las etapas de: a) perfundir el tejido biológico u homogeneizar el tejido biológico con un primer medio, en donde la osmolalidad de dicho primer medio es de aproximadamente 250 mOsm/kg a aproximadamente 350 mOsm/kg y dicho primer medio no contiene suero y es a pH neutro, entonces b) perfundir el tejido biológico o extraer el homogeneizado de la etapa (a) con un tampón delipidante que comprende desoxicolato de sodio y fosfolipasa A2 en dicho primer medio; después c) perfundir el tejido o extraer el homogeneizado de la etapa (b) con un tampón a un pH neutro y que comprende una concentración de sal de aproximadamente NaCl 2,0 M a aproximadamente 5,0 M, la concentración elegida para mantener los colágenos insolubles identificados en el tejido biológico; después d) perfundir el tejido o extraer el homogeneizado de la etapa (c) con RNasa y DNasa en un tampón y entonces e) enjuagar el tejido o el homogeneizado de la etapa (d) con un segundo medio que tiene un pH neutro, no contiene suero y tiene una osmolalidad de aproximadamente 250 mOsm/kg a aproximadamente 350 mOsm/kg, lo que produce de esta manera un andamio de biomatriz intacto u homogeneizado a partir del tejido biológico, dicho andamio de biomatriz que comprende al menos el 95 % de sus colágenos originales y la mayoría de los componentes de la matriz asociados al colágeno y los factores de crecimiento, hormonas y citocinas unidos a la matriz del tejido biológico.
En una modalidad, el medio basal se selecciona del grupo que consiste en medio RPMI 1640, DME/F12, DME, F12, de Waymouth y de William.
En una modalidad, el segundo medio comprende al menos uno de los constituyentes presentes en el fluido intersticial.
En una modalidad, el tampón delipidante de la etapa (b) comprende de 20 unidades/l a 50 unidades/l de fosfolipasa A2 y desoxicolato de sodio al 1 % en el primer medio.
En una modalidad, el tampón de la etapa (c) comprende además, un inhibidor de proteasas, en donde opcionalmente el inhibidor de proteasas es un inhibidor de tripsina de soja.
En una modalidad, el tampón de la etapa (d) comprende además, un inhibidor de proteasas, en donde opcionalmente el inhibidor de proteasas es un inhibidor de tripsina de soja.
En una modalidad, todos los medios y tampones de las etapas (a) hasta (e) están libres de una cantidad detectable de una enzima que degrada los componentes de la matriz extracelular.
En una modalidad, el método comprende además la esterilización del andamio de biomatriz, en donde opcionalmente la etapa de esterilización comprende la irradiación gamma del andamio de biomatriz. En un aspecto, la presente invención proporciona un andamio de biomatriz producido por el método de la invención.
En un aspecto, la presente invención proporciona un método para producir un cultivo celular, que comprende: a) producir un andamio de biomatriz de acuerdo con el método de la invención; b) poner en contacto el andamio de biomatriz de la etapa (a) con el medio de cultivo celular en un aparato de cultivo; y c) sembrar el andamio de biomatriz de la etapa (b) con células, para producir de esta manera un cultivo celular. En una modalidad, en el método para producir un cultivo celular, la etapa (b) comprende congelar el andamio de biomatriz de la etapa, preparar una sección congelada del andamio de biomatriz como un sustrato de cultivo celular y poner en contacto el sustrato de cultivo celular con el medio de cultivo celular en un aparato de cultivo.
En una modalidad, en el método para producir un cultivo celular, la etapa (b) comprende triturar la biomatriz hasta un polvo, que es opcionalmente llevado a cabo en un molino congelador a temperaturas de nitrógeno líquido o cercanas, recubrir al menos parte de un aparato de cultivo con el polvo para producir un sustrato de cultivo celular y poner en contacto el sustrato de cultivo celular con el medio de cultivo celular en un aparato de cultivo.
El andamio de biomatriz que comprende colágenos, fibronectinas, lamininas, nidógeno/entactina, elastina, proteoglicanos, glicosaminoglicanos, factores de crecimiento, citocinas o cualquiera de sus combinaciones, al ser todos parte del andamio de biomatriz se describen en la presente descripción.
En aspectos adicionales, la presente invención proporciona un método para producir un cultivo celular, que comprende: a) producir un andamio de biomatriz de acuerdo con los métodos de esta invención; b) poner en contacto el andamio de biomatriz de la etapa con el medio de cultivo celular en un aparato de cultivo y c) sembrar el andamio de biomatriz de la etapa (b) con células, para producir de esta manera un cultivo celular.
En la presente descripción se proporciona también un método para producir un cultivo celular, que comprende: a) producir un andamio de biomatriz de acuerdo con los métodos de esta invención; b) congelar el andamio de biomatriz de la etapa (a); c) preparar una sección congelada a partir del andamio de biomatriz de la etapa (b) como un sustrato de cultivo celular; d) poner en contacto el sustrato de cultivo celular de la etapa (c) con el medio de cultivo celular en un aparato de cultivo y e) sembrar el sustrato de cultivo celular de la etapa (d) con células, para producir de esta manera un cultivo celular.
Además, la presente invención proporciona un método para producir un cultivo celular, que comprende: a) producir un andamio de biomatriz de acuerdo con los métodos de esta invención; b) triturar el andamio de biomatriz de la etapa (a) hasta un polvo (por ejemplo, en algunas modalidades, después de congelar el andamio de biomatriz de la etapa (a); c) recubrir al menos parte de un aparato de cultivo con el polvo de la etapa (b) para producir un sustrato de cultivo celular; d) poner en contacto el sustrato de cultivo celular de (c) con el medio de cultivo celular en el aparato de cultivo y e) sembrar el sustrato de cultivo celular de (d) con células, para producir de esta manera un cultivo celular. En modalidades particulares de este método, la trituración del andamio de biomatriz se puede llevar a cabo, por ejemplo, en un molino congelador en o temperaturas próximas a la del nitrógeno líquido.
Se describe en la presente descripción el uso del andamio de biomatriz específico de tejido producido por un método de esta invención para facilitar la diferenciación de células madre embrionarias o células pluripotentes inducidas hacia un destino específico, así como también el uso del andamio de biomatriz específico de tejido producido por un método de esta invención para facilitar la diferenciación de células madre derivadas de líquido amniótico o células madre mesenquimales de médula ósea, tejido adiposo, o cualquier tejido fetal o postnatal o cualquier célula madre determinada (por ejemplo, pulmón, intestino, árbol biliar, riñón, piel, corazón) hacia un destino adulto específico. También se describe en la presente descripción un método para mejorar y acelerar la diferenciación de células madre y/o progenitoras a células maduras, que comprende producir un cultivo celular de acuerdo con los métodos de esta invención, en donde las células son células madre y el medio de cultivo celular se formula para células maduras, lo que mejora y acelera de esta manera la diferenciación de células madre y/o progenitoras a células maduras.
Se describe un método para suministrar células a un sujeto, que comprende sembrar el andamio de biomatriz producido por un método de esta invención con células y entonces trasplantar el andamio de biomatriz sembrado con las células en el sujeto.
Adicionalmente se describe en la presente descripción un método para identificar el potencial metastásico de células tumorales en un tipo de tejido, que comprende a) producir un andamio de biomatriz de acuerdo con los métodos de esta invención; b) poner en contacto el andamio de biomatriz de (a) con medio de cultivo celular en un aparato de cultivo; c) sembrar el andamio de biomatriz de (b) con células tumorales; d) mantener el andamio de biomatriz de (c) en condiciones de cultivo y e) monitorear el crecimiento de las células tumorales en el andamio de biomatriz de (d), en donde el crecimiento de las células tumorales en el andamio de biomatriz identifica que las células tumorales pueden colonizar in vivo el tipo de tejido del que se produjo el andamio de biomatriz, identificar de esta manera el potencial metastásico de las células tumorales en el tipo de tejido.
Además, se describe un método para identificar una célula tumoral como sensible a un tratamiento antitumoral, que comprende: a) producir un andamio de biomatriz de acuerdo con los métodos de esta invención; b) poner en contacto el andamio de biomatriz de (a) con medio de cultivo celular en un aparato de cultivo; c) sembrar el andamio de biomatriz de (b) con células tumorales; d) mantener el andamio de biomatriz de (c) en condiciones de cultivo; e) aplicar el tratamiento antitumoral a las células tumorales en el andamio de biomatriz y f) monitorear el crecimiento de las células tumorales en el andamio de biomatriz de (e), en donde la ausencia de crecimiento de células tumorales y/o la muerte de células tumorales en el andamio de biomatriz de (e) identifica las células tumorales como sensibles al tratamiento antitumoral.
Se describe un injerto tumoral para el trasplante en un animal hospedero, que comprende: a) producir un andamio de biomatriz de acuerdo con los métodos de esta invención; b) poner en contacto el andamio de biomatriz de (a) con medio de cultivo celular en un aparato de cultivo; sembrar el andamio de biomatriz de (b) con células tumorales; d) mantener el andamio de biomatriz de (c) en condiciones de cultivo y e) establecer una población de las células tumorales en el andamio de biomatriz de (d), lo que produce de esta manera un injerto tumoral para el trasplante en el animal hospedero. En algunas modalidades, este método puede comprender, además, la etapa de trasplantar el injerto tumoral en el animal hospedero.
Se describe un método para producir partículas virales de un virus dependiente del linaje, que comprende a) producir un andamio de biomatriz de acuerdo con los métodos de esta invención; b) poner en contacto el andamio de biomatriz de (a) con medio de cultivo celular en un aparato de cultivo; c) sembrar el andamio de biomatriz de (b) con células de un tipo y etapa de linaje que pueden ser infectadas con el virus dependiente de linaje; d) infectar las células de (c) con el virus dependiente del linaje; e) mantener las células infectadas en el andamio de biomatriz en condiciones de cultivo y f) recoger las partículas virales producidas en las células infectadas, lo que produce de esta manera partículas virales del virus dependiente del linaje.
La presente invención también proporciona un método para producir un organoide formado por recelularización de un andamio de biomatriz, que comprende a) producir un andamio de biomatriz de acuerdo con los métodos de esta invención; b) poner en contacto el andamio de biomatriz de (a) con medio de cultivo celular en un aparato de cultivo; c) sembrar el andamio de biomatriz de (b) con células del mismo tipo de tejido que el tejido biológico usado para preparar el andamio de biomatriz; d) mantener las células en el andamio de biomatriz en condiciones de cultivo, de manera que se forman organoides a partir de las células, lo que produce de esta manera un organoide formado por recelularización del andamio de biomatriz.
En la presente descripción se describe además, un método para producir una proteína de interés en células cultivadas en un andamio de biomatriz, que comprende: a) producir un andamio de biomatriz de acuerdo con los métodos de esta invención; b) poner en contacto el andamio de biomatriz de (a) con medio de cultivo celular en un aparato de cultivo; c) sembrar el andamio de biomatriz de (b) con células que producen la proteína de interés; d) mantener las células de (c) en el andamio de biomatriz en condiciones de cultivo y f) recoger la proteína de interés producida por las células de (d), lo que produce de esta manera una proteína de interés en células cultivadas en un andamio de biomatriz.
Lo anterior y otros aspectos de la presente invención se describirán ahora con más detalle con respecto a otras modalidades descritas en la presente descripción. Se apreciará que la invención puede incorporarse en diferentes formas y no se debe interpretar como limitada a las modalidades expuestas en la presente descripción. Más bien, estas modalidades se proporcionan de manera que esta descripción será exhaustiva y completa y transmitirá completamente el alcance de la invención para los expertos en la técnica.
Breve descripción de las figuras
Figuras 1A-E1. Preparación de andamio de biomatriz de hígado de rata. (A) Proceso de descelularización de cuatro etapas comprendido por lavado por fusión, delipidación con PLA2 y SDC, lavados con alto contenido de sal y tratamiento con nucleasa para la eliminación de ácidos nucleicos. (B-D) Cuatro etapas en la preparación del andamio de biomatriz de rata. (B) Después del lavado por perfusión con medio basal durante 10 minutos el hígado se vuelve pálido; (C) durante la delipidación, el hígado se vuelve parcialmente transparente debajo de GC (D) el andamio intacto final parece transparente a los 40 minutos de perfusión; (E) andamio de biomatriz mostrado a poco aumento. (E1) La visualización del andamio perfundido con partículas de dextrano marcadas con rodamina demuestra un flujo progresivo desde los vasos grandes a las ramas finas de los vasos sanguíneos a lo largo de los canales sin fugas, lo que indica vasculatura patente en los andamios. La tinción correspondiente de hematoxilina y eosina (H&E) del andamio de biomatriz en diferentes etapas demostró que las estructuras histológicas tales como los vasos sanguíneos y la matriz en forma de encaje que envuelven el parénquima se conservan, mientras que las células se eliminan. La estructura de la tríada portal hepática normal de rata, que consiste de la vena porta (PV), la arteria hepática (HA) y el conducto biliar (BD) (B1); las fibras de la matriz se hacen evidentes a medida que las células se eliminan de forma gradual durante el proceso de descelularización (C1); región de la tríada portal hepática descelularizada, comparar (B1) con la que se muestra (D1); D2 y D3 en la que se eliminan todas las células del andamio de matriz, pero se conservan las estructuras de la malla, tales como los vasos sanguíneos, el GC y la matriz en forma de encaje que rodea la muralla de células parenquimatosas.
Figuras 2A-H. Imágenes de TEM (A-C) y SEM (D-H) de andamios de biomatriz de hígado de rata. (A) Poco aumento de vaso sanguíneo (BV) con una pared gruesa (W). El colágeno tipo I (punta de flecha grande) es numeroso y contiene secciones transversales de fibras individuales que no absorben tinciones de metales pesados (puntos blancos, puntas de flecha pequeñas). (B) El mayor aumento de la pared de un vaso muestra membrana basal (flecha grande), elastina amorfa (*) y fibras elásticas asociadas, un remanente raro de vesícula de membrana (punta de flecha pequeña), una fibra con bandas de colágeno tipo I (punta de flecha) y fibrillas pequeñas (flechas pequeñas). Las fibrillas pequeñas probablemente son de fibrilina (colágeno tipo VI) que se asocia de forma estrecha con y ayuda a organizar el colágeno tipo I. (C) Gran aumento de colágeno tipo I con patrón de bandas de 64 nm (flechas). (D) Poco aumento de un vaso con pared delgada (BV) y la pared de un vaso más grande (W). (E) A mayor aumento, la pared del vaso grande (W) está festoneada, consistente con la arteria hepática de una tríada portal, véase (A). Debajo de la pared hay numerosos conjuntos de colágeno tipo I (flecha grande) unidos por fibrillas de colágeno reticulares (tipo III) (flechas pequeñas) delgadas y ramificadas largas. (F) Un conjunto grande de colágeno tipo I tiene fibras paralelas características (flecha grande) asociadas con una variedad de fibras más pequeñas (flecha) y fibras nodulares o con cuentas (punta de flecha). (G) Malla-3D de fibras grandes/pequeñas interconectadas en un plano que forma un perímetro tal como a un sinusoide hepático. (H). Mayor aumento de la malla que muestra una variedad de fibras (flechas): Colágeno tipo III (mayor diámetro recto), fibras elásticas o colágeno tipo VI.
Figuras 3A-B. Análisis químico de los colágenos y expresión de los componentes de la matriz extracelular (ECM) en los andamios de biomatriz. (A) El contenido de tres aminoácidos, todos se encontraron en los colágenos: hidroxiprolina (Hyp), hidroxilisina (Hyl) y glicina (Gly). Los números representan los residuos de cada aminoácido/1000 aminoácidos. Los datos indican el aumento drástico en el contenido de colágeno en el proceso de descelularización que va de <0,2 % en el hígado a más de 15 % en los andamios de biomatriz. (B) La tinción inmunohistoquímica de las moléculas de la matriz en los andamios de biomatriz, muestra la distribución en los andamios de biomatriz de hígado de laminina (LAM), sulfato de heparán (HS), colágeno tipo III (COL3) y fibronectina (FN) y proteínas de membrana basal típicas en asociación con restos de vasos sanguíneos. A mayor aumento, se pueden observar los miembros principales de la membrana basal, que incluyen colágeno tipo IV (COL4), entactina (Ent; también llamada nidógeno), laminina (LAM) y perlecán (Per), una forma de HS-PG en la porción de los andamios cerca de las tríadas portales.
Figuras 4A-D. Patrón de componentes de eCm desde la tríada portal hasta la vena central en los andamios de biomatriz. Comparación histológica de la tríada portal (zona 1) hasta la vena central (zona 3) del hígado normal (A) y el andamio de biomatriz de hígado (B); ambas son secciones teñidas con hematoxilina/eosina. (C) El modelo que ilustra un sistema de células madre y linaje madurativo en el hígado con componentes de la matriz representativos mostró que forman patrones asociados con la zonación hepática. Los componentes se enumeran en orden de abundancia a partir de los hallazgos de inmunohistoquímica. Las etapas de linaje conocidas dentro de los hígados humanos comienzan periportalmente en la zona 1 (alrededor de las tríadas portales) y el progreso en la maduración termina con células apoptóticas en la zona 3. La química de matriz conocida identificada en el nicho de células madre del hígado se comprende de hialuronanos, colágeno tipo III, una forma de laminina que se une a integrinaa6p4 y una forma débilmente sulfatada de CS-PG43,44. Justo fuera del nicho de células madre se encuentran el colágeno tipo IV, CS-PG y HS-PG normalmente sulfatados y formas de laminina que se unen a integrina ap1. Se ha documentado que los HP-PG se ubican de forma pericentral única4546. (D) El estudio de los componentes de la matriz y su ubicación en el hígado frente a los de los andamios de biomatriz, datos que se resumen a partir de los hallazgos de inmunohistoquímica (N/D=no evaluados.* Encontrado por otros que están exclusivamente cerca de las venas centrales). La mayoría de los componentes del citoesqueleto se pierden durante los lavados, los residuos de algunas, pero no todas, las proteínas citoesqueléticas están presentes. Los andamios carecen de cantidades detectables de tubulina, desmina y actina (ensayos de faloidina). Sin embargo, hay cantidades trazas de citoqueratinas dispersas aleatoriamente en los andamios; cantidades trazas de a-actina del músculo liso alrededor de los restos de los vasos sanguíneos en las tríadas portales y bajos niveles de vimentina en todas partes.
Figuras 5E-I. Caracterización de hHpSC en andamios de biomatriz de hígado frente a colágeno tipo 1. Las imágenes de contraste de fase (A-D) muestran los cambios morfológicos de las colonias de hHpSC derivadas del mismo hígado y cultivadas en el medio de Kubota sin suero y en el plástico de cultivo de tejidos (A), una de las condiciones para la autorreplicación, frente a las condiciones de diferenciación del medio de diferenciación sin suero para el hígado, y en el colágeno tipo I (B) frente a los andamios de biomatriz de hígado bovinos (C-E). Los cultivos funcionales y completamente viables no duraron más de ~2 semanas en colágenos tipo I. Por el contrario, los de los andamios de biomatriz de hígado fueron viables y sanos y con un repertorio completo de funciones que duran al menos un mes. Los cultivos pasaron a células en los días 7-12 con aumento de la relación citoplasmática/nuclear y marcada expresión de glucógeno (C) y entonces a aquellas con morfología clásica de hepatocitos poligonales intercalados por canalículos biliares claros (D), una morfología de cultivo que persistió a partir de entonces, como se indicó en el cultivo representativo en el día 24 (E). Los ensayos de RT-PCR muestran cambios en la expresión génica de hHpSC en condiciones de autorreplicación en plástico de cultivo (F) frente a en andamios de biomatriz de hígado de rata en el día 7 (G). Se comparó la expresión de los marcadores de hHpSC, que incluyen CXCR4 y EpCAM; genes hepatocíticos tempranos que incluyen CK19 (KRT19), HNF6, FOXA2, Af P y bajos niveles de albúmina; marcadores hepatocíticos maduros que incluyen altos niveles de albúmina (ALB), transferrina (TF), CYP450-3A4, tirosina aminotransferasa (TAT) y glucosa-6-fosfatasa (G6PC) y genes colangiocíticos, que incluyen CFTR, gamma glutamil transpeptidasa (GGT1), intercambio aniónico 2 (AE2) y transportador apical de ácido biliar dependiente de sodio (ASBT). Ensayos bioquímicos que miden la urea (H) sintetizada en cultivos sobre colágeno tipo I frente a andamios de biomatriz de hígado de rata y la actividad de CYP450-3A4 (I) en cultivos sobre colágeno tipo I frente a andamios de biomatriz preparados a partir de hígado de rata o bovino. La Tabla 7 proporciona un resumen de las medidas cuantitativas que comparan la adherencia, la viabilidad, el crecimiento, la vida útil del cultivo y la expresión génica específica de tejidos de hHpSC recién aisladas, en condiciones de cultivo para la autorreplicación (colágeno tipo III) o en condiciones de diferenciación en el colágeno I, frente a los andamios de biomatriz de hígado.
Figuras 6A-D. Tinción de inmunofluorescencia del linaje celular restringido de hHpSC en andamios de biomatriz. (A) Teñido con marcador específico hepático:albúmina (Alb, gris claro) y marcador de superficie de células madre hepáticas: EpCAM (blanco). Nótese que las células sembradas en el andamio de biomatriz no expresan EpCAM. Barra de escala=200mm. (B) Teñido con el marcador hepático temprano a-fetoproteína (AFP, gris claro) y con un anticuerpo contra un marcador de colangiocito humano, la citoqueratina 19 (CK19, blanco) que a este nivel de expresión es indicativo de colangiocitos maduros. El anticuerpo para el ensayo de CK19 es específico de humanos y no tiñó el residuo en CK19 de rata en los andamios que no se sembraron con células. La expresión de AFP es baja pero aún evidente en el día 7. Barra de escala=200jm. (C) Teñido con Alb (gris claro) y marcador de células estrelladas hepáticas, a- actina de músculo liso (ASMA, blanco). La expresión de albúmina y ASMA es un indicio fuerte de la presencia de hepatocitos y células estrelladas en maduración. Barra de escala=100|jm. (D) Teñido con proteína hepática funcional CYP450-3A4 (gris claro) y marcador específico de colangiocitos, receptor de secretina (SR, blanco) que muestran que los hepatocitos y los colangiocitos en maduración son funcionales y expresan los marcadores clásicos para estos dos tipos de células. Barra de escala=200jm.
Figuras 7A-D. Estabilidad de hepatocitos humanos maduros completamente funcionales, en andamios de biomatriz. Se sembraron hepatocitos humanos adultos en el medio de diferenciación y sobre colágeno tipo I (A,B) frente a andamios de biomatriz de hígado bovino (C) que se pulverizaron de forma criogénica, se dispersaron en el medio y se dejaron sedimentar sobre las placas. Las células en colágeno tipo I son completamente viables y en su pico de diferenciación de 7-12 días (A-se muestra a los 7 días); comienzan a deteriorarse después de ~2 semanas, y a los 20 días (B) están muertos, moribundos y no funcionales. Por el contrario, las sembradas sobre los andamios de biomatriz de hígado (C) son funcionales durante al menos 8 semanas (todavía no se evalúan tiempos más largos); aquí se muestran después de 21 días en cultivo en andamios de biomatriz de hígado pulverizados. Ensayos de CYP450-3A4 en cultivos de dos preparaciones separadas de células hepáticas humanas adultas crioconservadas sembradas sobre andamios de biomatriz frente a en colágeno tipo I y ensayadas el día 12 (D). La muestra ZHep-007 es representativa de las muestras crioconservadas con buena unión después de la descongelación; la muestra ZL-013 es representativa de los lotes que tienen poca o ninguna unión después de la descongelación. Por lo tanto, incluso estas muestras de inferior calidad se pueden unir a los andamios de biomatriz y permanecer viables a largo plazo. En ambas muestras analizadas, los niveles de P450 son mayores cuando se cultivan en andamios de biomatriz de hígado. Con tiempo sobre los andamios de biomatriz, los lotes de células crioconservadas de inferior calidad mejorarán.
Figura 8. Activación de fosfolipasa A2 con desoxicolato de sodio para producir lisolecitina. Principio del protocolo: La fosfolipasa A2 (PLA2) activada con desoxicolato de sodio degradará el fosfoglicérido que se ubica en la membrana citoplasmática y la membrana mitocondrial a lisolecitina, un surfactante poderoso, que induce la necrosis celular.
Figura 9. Análisis de la composición de colágeno de hígados de rata frente a andamios de biomatriz de hígado de rata. La composición de aminoácidos de la biomatriz (negro) y del hígado completo (gris claro) se presenta en forma de un diagrama de rosa. Se usa una abreviatura de tres letras para cada aminoácido que se analiza. Triptófano y cisteína no se analizaron. Los números indican los residuos de aminoácidos/1000.
Figuras 10A-C. Análisis de ácidos nucleicos del andamio de biomatriz de hígado de rata. Foto de contraste de fase (A) y tinción fluorescente con DAPI (B) del portaobjetos con biomatriz de hígado y ensayos cuantitativos de ADN y ARN totales a partir de tejido hepático de rata fresco frente al andamio de biomatriz (C).
Figuras 11A-C. Tinción del andamio de biomatriz después de la siembra de hHpSC sobre el andamio de biomatriz. El ensayo de vivas (calceína- AM, blanco)/muertas (bromuro de etidio o EtD-Br1, gris claro) indica que las colonias de hHpSC eran viables en las secciones de andamio de biomatriz pero no se absorbía el colorante en el medio de las colonias (A,B) durante los primeros días debido a las bombas conocidas en las células madre (por ejemplo, MDR1) que eliminan los colorantes vitales. En (B) la imagen de fluorescencia se fusiona con la fase uno para indicar que el centro de la colonia contiene células. En el día 7, las células en toda la colonia se diferenciaron y absorbieron el colorante vital en casi todas las células en toda la colonia (C).
Figuras 12A-F. Comparación de hepatocitos de rata que se cultivaron en colágeno tipo I con hepatocitos de rata que se cultivaron en andamios de biomatriz de hígado de rata. Hepatocitos de rata adultos que se cultivaron en colágeno tipo I y andamio de biomatriz en el día 3 (A,C) y el día 10 (B,D). Se unieron dentro de varios minutos en los andamios de biomatriz de hígado y sobrevivieron durante todo el tiempo que se evaluó, más de 8 semanas (C,D); no se evaluaron períodos de tiempo más largos. Los cultivos son muy tridimensionales en los andamios de biomatriz. Ensayo de síntesis de urea (E) y de viabilidad celular (F) en el día 1, 3, 5, 7, 10, 14, 21 y 28, n=3. Figuras 13A-D. Comparación de un páncreas humano con un andamio de biomatriz pancreática humana. Páncreas humano (A) frente a andamio de biomatriz pancreática humana (B-D) incrustado en parafina, cortado en secciones y teñido con hematoxilina y eosina (H&E). Las estructuras de los islotes se describen en B. Las regiones acinares de los andamios de biomatriz pancreática se muestran en C y D.
Figura 14. Comparación de componentes de la matriz representativos y un componente del citoesqueleto, vimentina, que se encuentra en tejido pancreático humano frente a andamios de biomatriz pancreática de rata. Otros componentes del citoesqueleto (desmina, tubulina, actina) no se encontraron en cantidades detectables o se encontraron en cantidades trazas (citoqueratinas). Las líneas discontinuas rodean los islotes, nótese que el sindecano 1 y el colágeno tipo VI son positivos de forma fuerte en los islotes tanto en el tejido de páncreas como en los andamios de biomatriz. El sindecano 1 se encuentra solo en los islotes (línea discontinua) pero no en las Células acinares (flechas); el colágeno tipo III se encuentra más enriquecido en las Células acinares y alrededor de los vasos sanguíneos (flechas), pero no en los islotes.
Figuras 15A-C. Tinción histológica e inmunohistoquímica del andamio de biomatriz de duodeno humano. (A) Lado exterior y luminal del andamio de biomatriz de duodeno humano. Las estructuras multicapa entre el tejido normal (B) y el andamio de biomatriz (C) se compararon en secciones teñidas con H&E y los resultados muestran que los andamios retuvieron la vellosidad y los vasos sanguíneos en las capas de mucosa y submucosa. Los paneles inferiores muestran que la tinción inmunohistoquímica del andamio de biomatriz de duodeno humano indicó cantidades variables de proteínas de la matriz extracelular retenidas en el andamio. Figuras 16A-D. Comparación de un tejido de vesícula biliar humana con un andamio de biomatriz de vesícula biliar humana. Tejido de vesícula biliar humana (A, B) frente a andamios de biomatriz (C,D) que se prepararon a partir de este. El tejido y los andamios de biomatriz se incrustaron en parafina, se cortaron en secciones y se tiñeron con hematoxilina y eosina.
Figuras 17 A-B. Las líneas celulares de tumores de colon HT29 (A) y SW480 (B) se sembraron en andamios de biomatriz y se formaron colonias de células comprendidas por cientos a miles de células y que eran bastante 3-dimensionales.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se describirá ahora más detalladamente a continuación. Sin embargo, esta invención puede realizarse de diferentes formas y no se debe interpretar como limitada a las modalidades expuestas en la presente descripción. Más bien, estas modalidades se proporcionan para que esta descripción sea exhaustiva y completa y transmitirá de forma completa el alcance de la invención para los expertos en la técnica.
La terminología usada en la descripción de la invención en la presente descripción tiene el propósito de describir solo modalidades particulares y no pretende ser limitante de la invención. Como se usa en la descripción de la invención y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el/la" pretenden incluir también las formas plurales, a menos que el contexto claramente lo indique de cualquier otra manera.
A menos que se defina de cualquier otra manera, todos los términos (que incluyen términos técnicos y científicos) usados en la presente descripción tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Se entenderá además que los términos, tales como los que se definen en los diccionarios usados comúnmente, se deben interpretar como que tienen un significado que es consistente con su significado en el contexto de la presente solicitud y la técnica en cuestión y no se deben interpretar en un sentido idealizado o excesivamente formal a menos que así se defina expresamente en la presente descripción. La terminología usada en la descripción de la invención en la presente descripción es solamente con el propósito de describir modalidades particulares y no pretende ser limitante de la invención.
También, como se usa en la presente descripción, "y/o" se refiere a y abarca cualquiera y todas las combinaciones posibles de uno o más de los elementos enumerados asociados, así como también la ausencia de combinaciones cuando se interpreta en la alternativa ("o").
A menos que el contexto lo indique de cualquier otra manera, se pretende específicamente que las diversas características de la invención descrita en la presente descripción puedan usarse en cualquier combinación. Además, la presente invención también contempla que en algunas modalidades de la invención, cualquier característica o combinación de características expuestas en la presente descripción puede ser excluida u omitida. Para ilustrar, si la especificación establece que un complejo comprende los componentes A, B y C, se pretende específicamente que cualquiera de A, B o C, o sus combinaciones, se pueda omitir y negar de forma singular o en cualquier combinación.
Como se usa en la presente descripción, la frase de transición "que consiste esencialmente en' (y variantes gramaticales) se debe interpretar en el sentido de que abarca los materiales o etapas mencionadas "y los que no afectan materialmente la(s) característica(s) básica(s) y novedosa(s)" de la invención reivindicada. Véase, In re Herz, 537 F.2d 549, 551-52, 190 U.S.P.Q. 461, 463 (CCPA 1976) (énfasis en el original); véase también MPEP § 2111.03. Por lo tanto, el término "que consiste esencialmente en' como se usa en la presente descripción no se debe interpretar como equivalente a "que comprende."
El término "aproximadamente", como se usa en la presente descripción, cuando se refiere a un valor medible tal como una cantidad o concentración (por ejemplo, el porcentaje de colágeno en las proteínas totales en el andamio de biomatriz) y similares, pretende abarcar variaciones del 20 %, 10 %, 5 %, 1 %, 0,5 % o incluso el 0,1 % de la cantidad especificada.
La presente invención está dirigida al descubrimiento y desarrollo de un andamio de biomatriz que tiene mejoras y ventajas inesperadas respecto a los andamios de tejido descelularizado que se conocen en la actualidad, algunos ejemplos de la mejora y ventaja son el uso del andamio de biomatriz de esta invención para mantener de manera eficiente las células maduras y/o para restringir el linaje y/o diferenciar células madre a destinos maduros y/o para mantener tales células maduras como funcionales durante un período de tiempo extendido. A modo de ejemplo adicional, el uso de los andamios de biomatriz de esta invención reduce el tiempo para producir células de destinos maduros de aproximadamente tres a seis semanas o más a aproximadamente una a dos semanas. Los andamios de biomatriz de esta invención se producen mediante el uso de protocolos específicos que emplean el equilibrio apropiado de concentración de sal y fuerza iónica (diferentes colágenos tienen diferentes constantes de solubilidad (23)) para un tejido dado, para permitir la retención de los colágenos naturales presentes en ese tejido en forma insoluble, lo que da lugar a un andamio de biomatriz que retiene un alto por ciento de colágenos naturales que proporcionan señales para dirigir la restricción del linaje y la diferenciación. Por el contrario, los andamios descelularizados que se producen de acuerdo con los protocolos conocidos no emplean tal equilibrio de concentración de sal y fuerza iónica para permitir la retención de un alto por ciento de estos colágenos naturales y la mayoría de estos colágenos naturales se pierden cuando se usan estos protocolos conocidos. Además, los andamios de biomatriz de esta invención permiten la producción de virus y/o patógenos dependientes del linaje (por ejemplo, dependientes de la diferenciación) en cantidades suficientes para el uso experimental y/o terapéutico (por ejemplo, para la producción de vacunas).
Por lo tanto, en una modalidad, la presente invención proporciona un método para producir un andamio de biomatriz a partir de tejido biológico, seleccionado del grupo que consiste en pulmón, tiroides, piel, páncreas, vasos sanguíneos, vejiga, riñones, cerebro, árbol biliar, duodeno, aorta abdominal, vena ilíaca, corazón e intestinos, que comprende las etapas de: a) perfundir el tejido biológico u homogeneizar el tejido biológico con un primer medio, en donde la osmolalidad de dicho primer medio es de aproximadamente 250 mOsm/kg a aproximadamente 350 mOsm/kg y dicho primer medio no contiene suero y está a pH neutro; después b) perfundir el tejido biológico o extraer el homogeneizado de la etapa (a) con un tampón delipidante que comprenda desoxicolato de sodio y fosfolipasa A2 en dicho primer medio; después c) perfundir el tejido o extraer el homogeneizado de la etapa (b) con un tampón a pH neutro y que comprenda una concentración de sal de NaCl de aproximadamente 2,0 M a aproximadamente 5,0 M, la concentración elegida para mantener los colágenos insolubles identificados en el tejido biológico; después d) perfundir el tejido o extraer el homogeneizado de la etapa (c) con RNasa y DNasa en un tampón y entonces e) enjuagar el tejido o el homogeneizado de la etapa (d) con un segundo medio que tiene un pH neutro, no contiene suero y tiene una osmolalidad de aproximadamente 250 mOsm/kg a aproximadamente 350 mOsm/kg, lo que produce de esta manera un andamio de biomatriz intacto u homogeneizado a partir del tejido biológico, dicho andamio de biomatriz que comprenda al menos el 95 % (por ejemplo, 98 %, 99 %, 100 %) de los colágenos y de la mayoría de los componentes de la matriz asociados a colágeno y de los factores de crecimiento, hormonas y citocinas que se unen a la matriz del tejido biológico no procesado. En la presente descripción también se proporciona un andamio de biomatriz producido por cualquiera de los métodos de esta invención.
"Andamio de biomatriz" como se usa en la presente descripción se refiere a un extracto de tejido aislado que se enriquece en la matriz extracelular, como se describe en la presente descripción, que retiene muchos o la mayoría de los colágenos y los factores que se unen al colágeno que se encuentran naturalmente en el tejido biológico. En algunas modalidades de forma esencial todos los colágenos y factores que se unen al colágeno se retienen y en otras modalidades el andamio de biomatriz comprende todos los colágenos conocidos por estar en el tejido. El andamio de biomatriz puede comprender al menos aproximadamente 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o 100 % de los colágenos, componentes de la matriz asociados a colágeno, y/o factores de crecimiento, hormonas y/o citocinas que se unen a la matriz, en cualquier combinación, que se encuentran en el tejido biológico natural. En algunas modalidades, el andamio de biomatriz comprende al menos el 95 % de los colágenos y la mayoría de los componentes de la matriz asociados a colágeno y factores de crecimiento, hormonas y/o citocinas que se unen a la matriz del tejido biológico. Como se describió en la presente descripción, "la mayoría de los componentes de la matriz que se asocian al colágeno y los factores de crecimiento, hormonas y/o citocinas que se unen a la matriz del tejido biológico" se refiere al andamio de biomatriz que retiene aproximadamente el 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o 100 % de los componentes de la matriz asociados al colágeno y factores de crecimiento, hormonas y/o citocinas que se unen a la matriz que se encuentran en el tejido biológico natural (por ejemplo, sin procesar).
Los colágenos ilustrativos incluyen todos los tipos de colágeno, tales como, pero no se limitan a, los colágenos tipo I hasta tipo XXIX. El andamio de biomatriz puede comprender al menos aproximadamente 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más de uno o más de los colágenos que se encuentran en el tejido biológico natural y/o puede tener uno o más de los colágenos presentes a una concentración que es al menos aproximadamente 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más de la que se encuentra en el tejido biológico natural. La cantidad de colágeno en el andamio de biomatriz se puede determinar mediante diversos métodos conocidos en la técnica y como se describe en la presente descripción, tales como, pero no se limitan a, determinar el contenido de hidroxiprolina.
Los componentes de la matriz asociados a colágeno ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, moléculas de adhesión; proteínas de adhesión; L- y P-selectina; molécula asociada al crecimiento de unión a heparina (HB-GAM); repetición de trombospondina tipo I (TSR); amiloide P (AP); lamininas; nidógenos/entactinas; fibronectinas; elastinas; vimentinas; proteoglicanos (PG); sulfato de condroitina-PG (CS-PG); sulfato de dermatán-PG (DS-PG); miembros de la familia de proteoglicanos pequeños ricos en leucina (SLRP) tales como biglicano y decorinas; heparina-PG (HP-PG); sulfato de heparán-PG (HS-PG) tales como glipicanos, sindecanos y perlecanos; y glicosaminoglicanos (GAG) tales como hialuronanos, sulfatos de heparán, sulfatos de condroitina, sulfatos de queratina y heparinas. En algunas modalidades, el andamio de biomatriz comprende, consiste en, o consiste esencialmente en colágenos, fibronectinas, lamininas, nidógenos/entactinas, elastinas, proteoglicanos, glicosaminoglicanos, factores de crecimiento, hormonas y citocinas (en cualquier combinación) que se unen a diversos componentes de la matriz. El andamio de biomatriz puede comprender al menos aproximadamente el 50 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más de uno o más de los componentes de la matriz asociados al colágeno, hormonas y/o citocinas que se encuentran en el tejido biológico natural y/o puede tener uno o más de estos componentes presentes en una concentración que es al menos aproximadamente el 50 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más de la que se encuentra en el tejido biológico natural. En algunas modalidades, el andamio de biomatriz comprende todos o la mayoría de los componentes de la matriz asociados a colágeno, hormonas y/o citocinas que se conocen por estar en el tejido. En otras modalidades el andamio de biomatriz comprende, consiste esencialmente en, o consiste en uno o más de los componentes de la matriz asociados a colágeno, hormonas y/o citocinas a concentraciones cercanas a las que se encuentran en el tejido biológico natural (por ejemplo, aproximadamente 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 100 % de la concentración que se encuentra en el tejido natural).
Los factores de crecimiento ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, factores de crecimiento de fibroblastos (FGF), factores de crecimiento nervioso (NGF), factores de crecimiento epidérmico (EGF), factores de crecimiento transformantes, factores de crecimiento de hepatocitos (HGF), factores de crecimiento derivados de plaquetas (PDGF), factores de crecimiento similares a la insulina (IGF), proteínas de unión a IGF, factores de crecimiento de fibroblastos básicos y factores de crecimiento endotelial vascular (VEGF). Las citocinas ilustrativas incluyen, pero no se limitan a, interleucinas, linfocinas, monocinas, factores estimulantes de colonias, quimiocinas, interferones y factor de necrosis tumoral (TNF). El andamio de biomatriz puede comprender al menos aproximadamente el 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 100 % o más (en cualquier combinación) de uno o más de los factores de crecimiento y/o citocinas unidos a la matriz que se encuentran en el tejido biológico natural y/o puede tener uno o más de estos factores de crecimiento y/o citocinas (en cualquier combinación) presentes a una concentración que es al menos aproximadamente el 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 100 % o más de la que se encuentra en el tejido biológico natural. En algunas modalidades el andamio de biomatriz comprende niveles fisiológicos o niveles casi fisiológicos de muchos o la mayoría de los factores de crecimiento, hormonas y/o citocinas que se unen a la matriz que se conocen por estar en el tejido natural y/o que se detectan en el tejido y en otras modalidades, el andamio de biomatriz comprende uno o más de los factores de crecimiento, hormonas y/o citocinas que se unen a la matriz a concentraciones cercanas a las concentraciones fisiológicas que se encuentran en el tejido biológico natural (por ejemplo, que difieren en no más de aproximadamente el 30 %, 25 %, 20 %, 25 %, 20 %, 15 %, 10 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 % en comparación). La cantidad o concentración de los factores de crecimiento o citocinas presentes en el andamio de biomatriz puede determinarse mediante diversos métodos que se conocen en la técnica y como se describe en la presente descripción, tales como, pero no se limitan a, diversos ensayos de anticuerpos y ensayos de factores de crecimiento.
"Tejido biológico", como se usa en la presente descripción, se refiere a cualquier tejido de un organismo vivo o muerto o cualquier tejido derivado de un organismo vivo o muerto. El término "tejido biológico natural" y variaciones del mismo, como se usa en la presente descripción, se refiere al tejido biológico tal y como existe en su estado natural o sin modificar en el organismo. Los andamios de biomatriz de la presente invención se pueden preparar a partir de cualquier tejido biológico. El tejido biológico puede incluir cualquier tejido individual (por ejemplo, una colección de células que pueden estar interconectadas) o un grupo de tejidos que constituyen un órgano o parte o región del cuerpo de un organismo. El tejido puede comprender un material celular homogéneo o puede ser una estructura combinada tal como la que se encuentra en regiones del cuerpo que incluyen el tórax que puede incluir, por ejemplo, tejido pulmonar, tejido esquelético y/o tejido muscular. Los tejidos biológicos ilustrativos de esta invención incluyen, pero no se limitan a, hígado, pulmón, tiroides, piel, páncreas, vasos sanguíneos, vejiga, riñones, cerebro, árbol biliar, duodeno, aorta abdominal, vena ilíaca, corazón e intestinos, que incluyen cualquiera de sus combinaciones. El organismo (es decir, el sujeto) con el que se asocia o del cual se deriva el tejido biológico puede ser cualquier animal, que incluye mamíferos y no mamíferos tales como invertebrados.
Los sujetos ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, mamíferos, tales como, pero no se limitan a, seres humanos, ratones, ratas, hurones, hámsteres, conejos, cobayas, cerdos, porcinos, perros, gatos, caballos, vacas, ovejas, monos y chimpancés, y no mamíferos tales como, pero no se limitan a, aves, reptiles y animales invertebrados. El sujeto puede ser de cualquier edad y/o tamaño. El tejido biológico puede ser sano, enfermo y/o tener mutaciones genéticas. En algunas modalidades, los andamios de biomatriz de la presente invención son específicos de tejidos en su composición química y funcionalidad, es decir, los andamios de biomatriz son representativos o comparables al tejido biológico del cual se crearon en términos de su composición química y funcionalidad.
En algunas modalidades, la histología natural y las vasculaturas patentes se mantienen en los andamios de biomatriz. Esto puede incluir los restos reconocibles de las entidades histológicas principales del tejido biológico, tales como, pero no se limitan a, vasos sanguíneos y otra vasculatura de cualquier tejido; conductos biliares y cápsula de Glisson (GC) del hígado; conductos pancreáticos, islotes y acinos del páncreas; bronquios, tráquea y alveolos de los pulmones, etcétera. En otras modalidades la composición química del andamio de biomatriz coincide con la histología (por ejemplo, la matriz alrededor de los vasos sanguíneos es distinta a la de los hepatocitos). En algunas modalidades, la composición química del andamio de biomatriz está en un gradiente que se correlaciona con la histología. Por ejemplo, cuando el tejido biológico es el hígado, el andamio de biomatriz puede retener el gradiente en la composición química de la matriz en correlación con las zonas acinares hepáticas 1-3 desde la tríada portal hasta la vena central y con entidades histológicas tales como los canales vasculares y la cápsula de Glisson (GC). Ejemplos adicionales incluyen, pero no se limitan a, vasos sanguíneos donde la composición química de la matriz alrededor de los vasos sanguíneos está saturada con altos niveles de colágenos en red (por ejemplo, tipo IV y tipo VI), elastinas y formas de HS-PG; alrededor de los hepatocitos en la zona periportal (zona 1), donde las lamininas son altas en concentración junto con una mezcla de CS-PG y HS-PG, mientras que alrededor de la zona pericentral (zona 3), hay hepatocitos rodeados por una mezcla de HS-PG y HP-PG; asociados con los conductos biliares donde existen altos niveles de colágeno tipo I, hay fibronectinas y formas de CS-PG y DS-PG. Hay gradientes paralelos en la composición química de la matriz en cada tejido.
Hay una serie de medios de enjuague, tales como el primer y el segundo medio y tampones que pueden usarse en la presente invención. En particular, puede usarse cualquier medio o tampón de enjuague que mantenga los colágenos y los factores que se unen (por ejemplo, componentes de la matriz, factores de crecimiento y citocinas) en un estado insoluble. Cuando se elige un medio o tampón, la concentración de sal, el pH y la fuerza iónica deben ser adecuados para mantener los colágenos y/o la mayoría o muchos de los componentes de la matriz unidos al colágeno y otros factores (por ejemplo, en virtud de sus conexiones químicas directas o indirectas con los colágenos) en un estado insoluble. La Tabla 1 proporciona intervalos de concentración molar de cloruro de sodio para diversos tipos de colágeno para ayudar al experto en la técnica a proporcionar medios y tampones que garanticen que los colágenos, los componentes de la matriz asociados a colágeno y los factores de crecimiento y citocinas que se unen a la matriz permanezcan insolubles. Deyl y otros. ("Preparative procedures and purity assessment of collagen proteins" Journal of Chromatography B 790 (2003) 245-275) proporcionan, de forma adicional, información sobre la composición química de colágeno que puede facilitar la identificación de las condiciones óptimas para mantener los colágenos y los factores que se unen en un estado insoluble.
La Tabla 1 demuestra que el pH es una variable que funciona junto con la concentración de sal para definir la solubilidad. Al tener altas concentraciones de sal, el pH puede ser neutro. En algunas de las modalidades de la presente invención, la concentración de sal elegida es una que mantiene todos los colágenos del tejido en un estado insoluble, no solo uno de los colágenos del tejido en un estado insoluble. Por ejemplo, los colágenos conocidos en hígado fetal son aquellos insolubles en concentraciones de sal de NaCl de aproximadamente 4,5 M y los que en tejido hepático adulto son insolubles en concentraciones de sal de NaCl de aproximadamente 3,4 M- 3,5 M.
La osmolalidad de cualquiera de los medios y/o tampones de enjuague puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 200 mOsm/kg a aproximadamente 400 mOsm/kg, de aproximadamente 250 mOsm/kg a aproximadamente 350 mOsm/kg, de aproximadamente 275 mOsm/kg a aproximadamente 325 mOsm/kg o de aproximadamente 300 mOsm/kg a aproximadamente 325 mOsm/kg, que incluye, sin limitación, cualquier valor dentro de estos intervalos que no se mencione explícitamente en la presente descripción. El agua destilada y los tampones diluidos (por ejemplo, con osmolalidad < 100 mOsm/kg) darán como resultado en la pérdida de cantidades significativas de colágeno, componentes de la matriz asociados a colágeno y factores de crecimiento y citocinas que se unen a la matriz. Por lo tanto, en algunas modalidades de los métodos de esta invención, no se incluyen agua destilada y tampones diluidos.
Como un experto en la técnica reconocería, la osmolalidad es una expresión de concentración osmótica de soluto por masa, mientras que la osmolaridad es por volumen de solvente. Por lo tanto, la conversión de osmolaridad a osmolalidad se puede realizar mediante la multiplicación por la densidad en masa. La osmolalidad puede medirse mediante el uso de un osmómetro que mide las propiedades coligativas, tales como la depresión del punto de congelación, la presión de vapor y la elevación del punto de ebullición.
La osmolaridad es la medida de la concentración de soluto, definida como el número de osmoles (Osm) de soluto por litro (l) de solución (osmol/l u Osm/l). La osmolaridad de una solución se expresa de forma usual como Osm/l. Mientras que la molaridad mide el número de moles de soluto por unidad de volumen de solución, la osmolaridad mide el número de osmoles de partículas de soluto por unidad de volumen de solución. La osmolalidad es una medida de los osmoles de soluto por kilogramo de solvente (osmol/kg o Osm/kg).
La molaridad y la osmolaridad no se usan comúnmente en la osmometría porque dependen de la temperatura. Esto se debe a que el agua cambia su volumen con la temperatura. Sin embargo, si la concentración de solutos es muy baja, la osmolaridad y la osmolalidad se consideran equivalentes.
La osmolaridad de una solución puede calcularse a partir de la siguiente expresión:
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donde p es el coeficiente osmótico, que representa el grado de no idealidad de la solución; n es el número de partículas (por ejemplo, iones) en las que se disocia una molécula; C es la concentración molar del soluto y el índice i representa la identidad de un soluto particular. En el caso más sencillo, p es el grado de disociación del soluto. Entonces, p está entre 0 y 1 donde 1 indica el 100 % de disociación. Sin embargo, p también puede ser mayor que 1 (por ejemplo, para la sacarosa). Para las sales, los efectos electrostáticos provocan que p sea menor que 1 aunque se produzca el 100 % de disociación.
La perfusión del tejido biológico con cualquier medio o tampón puede llevarse a cabo mediante la inyección del medio o tampón a través de la vasculatura relevante del tejido biológico. Por ejemplo, si el tejido biológico es el hígado, entonces el medio o tampón puede perfundirse a través de la vena porta del hígado. Alternativamente, el medio o tampón puede verterse sobre el tejido biológico y/o se deja difundir a través del tejido biológico. Por ejemplo, el tejido biológico se puede sumergir y/o dializar en el medio o tampón lo que permite que el medio o tampón difunda a través del tejido biológico. Mientras se sumerge y/o se dializa en el medio o tampón, la solución y el tejido biológico se pueden agitar, tal como en un balancín y/o revolver. En algunas modalidades el medio y los tampones perfunden a través de la vasculatura relevante del tejido biológico.
Alternativamente, el tejido puede homogeneizarse en el medio inicial y los tampones y medios que se usan a partir de entonces son para la extracción del homogeneizado. Las versiones homogeneizadas de los andamios de biomatriz se preparan a partir de órganos grandes (por ejemplo, de tejidos de vaca o cerdo), después se pulverizan en polvo a temperaturas de nitrógeno líquido y el polvo se usa en placas para estudios en cultivo.
En algunas modalidades el primer medio y/o el segundo medio es un medio basal, tal como, pero no se limitan a, medio RPMI 1640, DME/F12, DME, F12, BME, DMEM, de Waymouth o de William. Otros medios basales ilustrativos se conocen en la técnica y están disponibles comercialmente. El primer medio y/o el segundo medio pueden comprender, consistir de forma esencial en, o consistir en componentes que se combinan para mantener insolubles la mayoría de los colágenos y como moléculas naturales, como se describe en la presente descripción (por ejemplo, por la combinación particular de osmolalidad y fuerza iónica así como también la ausencia de suero). El primer medio y/o el segundo medio pueden comprender, consistir en, o consistir de forma esencial en constituyentes presentes o similares o que imitan a los presentes en el fluido intersticial, tales como, pero no se limitan a, agua; sales tales como, pero no se limitan a, sales inorgánicas; vitaminas; minerales; aminoácidos tales como, pero no se limitan a, glicina, serina, treonina, cisteína, asparagina y/o glutamina; azúcares; ácidos grasos, coenzimas; hormonas y neurotransmisores. En determinadas modalidades donde el primer medio y/o el segundo medio comprenden constituyentes presentes o similares o que imitan a los presentes en el fluido intersticial, los constituyentes pueden producir una osmolalidad aproximadamente equivalente a la osmolalidad del medio basal disponible comercialmente o producir una osmolalidad de aproximadamente 250 mOsm/kg a aproximadamente 350 mOsm/kg. En algunas modalidades el primer medio y/o el segundo medio incluyen medios que están sin suero, comprenden constituyentes presentes en fluido intersticial y/o tienen una osmolalidad de aproximadamente 250 mOsm/kg a aproximadamente 350 mOsm/kg. Tales medios también pueden estar a pH neutro. La composición específica del primer medio y/o el segundo medio se determina, en modalidades particulares, por las constantes de insolubilidad de los colágenos del tejido biológico que se usa para fabricar el andamio de biomatriz, como debería conocer un experto en la técnica.
El tampón delipidante debería ser efectivo y suave. El tampón delipidante puede comprender, consistir en, o consistir esencialmente en detergentes o surfactantes, medio basal, sales y/o lipasas. Cuando se eligen componentes para el tampón delipidante, se deben evitar los detergentes fuertes (por ejemplo, dodecilsulfato de sodio; Tritón X-100) para minimizar la pérdida de componentes de la matriz. Los detergentes ilustrativos de esta invención incluyen, pero no se limitan a, los detergentes aniónicos, tales como las sales de ácido desoxicólico, ácido 1-heptanesulfónico, N-laurilsarcosina, lauril sulfato, ácido 1-octano sulfónico y ácido taurocólico; detergentes catiónicos tales como cloruro de benzalconio, cetilpiridinio, cloruro de metilbencetonio y bromuro de decametonio; detergentes zwitteriónicos tales como, betaínas de alquilo, betaínas de alquil amidoalquilo, N-dodecil-N,N-dimetil-3-amonio-1-propanosulfonato y fosfatidilcolina y detergentes no iónicos tales comoa-D-glucopiranósido de n-decilo, p-D-maltopiranósido de n-decilo, P-D-maltósido de n-dodecilo, p-D-glucopiranósido de n-octilo, ésteres de sorbitán, p-D-maltósido de n-tetradecilo, tritones, Nonidet-P-40, Poloxamer 188, y cualquiera de los detergentes del grupo Tween; lauril sulfato de sodio; y desoxicolato de sodio.
Las lipasas ilustrativas incluyen, pero no se limitan a, fosfolipasas tales como fosfolipasa A2, lipasa pancreática humana, esfingomielinasas, lipasa lisosomal, lipasa endotelial y lipasa hepática. En los métodos de la invención, el tampón delipidante comprende desoxicolato de sodio y fosfolipasa A2. Esta combinación, en algunas modalidades, puede comprender de aproximadamente 20 a aproximadamente 50 unidades/l de fosfolipasa A2 y aproximadamente 1 % de desoxicolato de sodio preparados en un medio basal de pH neutro y sin suero que puede ser, por ejemplo, el primer medio. La combinación de desoxicolato de sodio y fosfolipasa A2 degrada rápidamente el fosfoglicérido que se ubica en la membrana citoplasmática y la membrana mitocondrial a lisolecitina, un surfactante poderoso, que puede inducir necrosis y citólisis. Como reconocerá un experto en la técnica, la cantidad y el tipo de lipasa y/o detergente pueden depender del tejido biológico.
La etapa de perfundir el tejido biológico con el tampón delipidante se lleva a cabo, en algunas modalidades, hasta que el tejido se vuelve transparente. En otras modalidades la etapa de perfundir el tejido biológico con el tampón delipidante se lleva a cabo hasta que la efusión se vuelve clara. En algunas modalidades la etapa de delipidación se lleva a cabo hasta que el tejido se vuelve transparente y la efusión se vuelve clara.
En algunas modalidades se evita la exposición prolongada de los andamios de biomatriz a enzimas de las células rotas ya que puede disminuir en gran medida el contenido de elastina y el contenido de glicosaminoglicanos tales como, sulfatos de heparán, sulfatos de condroitina, sulfatos de dermatán y heparinas, que son sitios en los que se unen las citocinas y los factores de crecimiento. La exposición a las enzimas de las células rotas se puede evitar, por ejemplo, durante la delipidación y/o los lavados posteriores después de la delipidación. En algunas modalidades, el uso de un inhibidor de proteasas y/o un control cuidadoso del pH, la temperatura y/o el tiempo se puede emplear para limitar la actividad de las proteasas y/u otras enzimas de las células rotas.
Los inhibidores de proteasas ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, inhibidores de proteasas de serina tales como, pero no se limitan a, antipaína, aprotinina, quimostatina, elastatinal, fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), APMSF, TLCK, TPCK, leupeptina e inhibidor de tripsina de soja; proteasas de cisteína tales como, pero no se limitan a, IAA (ácido indolacético) y E-64; inhibidores de la proteasa aspártica tales como, pero no se limitan a, pepstatina y VdLPFFVdL; metaloproteasas tales como, pero no se limitan a, EDTA, 1,10-fenantrolina y fosforamodón; exopeptidasas tales como, pero no se limitan a, amastatina, bestatina, diprotina A y diprotina B; tiol proteasas; a-2-macroglobulina, inhibidor de la tripsina de la soja o de la haba; inhibidor de la proteasa pancreática; ovostatina de la clara de huevo; cistatina de la clara de huevo y combinaciones de inhibidores de proteasas, comúnmente denominados "cóctel de inhibición de la proteasa" por los proveedores comerciales de dichos inhibidores.
El pH del andamio de biomatriz, tampones y/o medios puede mantenerse de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 9,0, de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 8,5, de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 8,0 o de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 8,0. En algunas modalidades, el andamio de biomatriz, los tampones, y/o los medios se mantienen a un pH de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 8,0 o se mantienen a un pH de aproximadamente 7,3 a aproximadamente 7,5, que incluye sin limitación, cualquier valor que se abarca dentro de estos intervalos pero que no se menciona de forma explícita en la presente descripción. En otras modalidades el andamio de biomatriz, los tampones y/o los medios se mantienen a pH neutro. La temperatura del andamio de biomatriz (por ejemplo, durante y/o después de la preparación), los tampones y/o los medios puede ser de aproximadamente 0 °C a aproximadamente 30 °C, de aproximadamente 5 °C a aproximadamente 25 °C, o de aproximadamente 10 °C a aproximadamente 20 °C, que incluye sin limitación, cualquier valor que se abarca dentro de estos intervalos pero que no se menciona de forma explícita en la presente descripción. En algunas modalidades, la temperatura se mantiene a aproximadamente 20 °C. El tiempo para perfundir el tejido biológico con cualquier medio o tampón puede ser de aproximadamente 5 horas o menos, aproximadamente 3 horas o menos, aproximadamente 1 hora o menos, aproximadamente 30 minutos o menos, o aproximadamente 15 minutos o menos. En algunas modalidades la etapa de perfundir el tejido biológico con el tampón delipidante es de aproximadamente 30 minutos o menos. En algunas modalidades donde se usan pH ácidos, las concentraciones de sal para mantener insolubles los colágenos y los componentes asociados a colágeno pueden ser diferentes; las concentraciones pueden determinarse por la bibliografía existente sobre la composición química del colágeno mediante la elección de concentraciones de sal que mantienen la insolubilidad de los colágenos.
Los tampones ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, cloruro de sodio, lactato de sodio, acetato de sodio, fosfato de sodio, citrato de sodio, borato de sodio, gluconato de sodio, tampones de citrato, tampones de bis\tris, tampones de fosfato, fosfato de potasio, citrato/dextrosa, bicarbonato de sodio, cloruro de amonio, ácido 3-{[tris(hidroximetil)metil]amino}propanosulfónico, tris(hidroximetil)metilamina, N-tris(hidroximetil)metilglicina, ácido 4-2-hidroxietil-1-pipera-zinanosulfónico y ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico.
En algunas modalidades el tampón de esta invención (por ejemplo, el tampón usado en la etapa c) descrita en la presente descripción) puede comprender una sal en una concentración de aproximadamente 2,0 M a aproximadamente 5,0 M, de aproximadamente 2,5 M a aproximadamente 5,0 M, de aproximadamente 3,0 M a aproximadamente 4,5 M, o de aproximadamente 3,0 M a aproximadamente 4,0 M, que incluyen, sin limitación, cualquier valor que se abarca dentro de estos intervalos pero no recitado explícitamente en la presente descripción. Por ejemplo, en algunas modalidades el tampón utilizado en los métodos de la presente invención puede comprender una sal tal como, cloruro de sodio en una concentración de NaCl de aproximadamente 2,0 M a aproximadamente NaCl 4,5 M. En otras modalidades, tales como las de hígados adultos, el tampón utilizado puede comprender NaCl de aproximadamente 3,4 M a aproximadamente 3,5 M. En modalidades tales como las de hígado fetal, el tampón utilizado puede comprender una sal tal como, cloruro de sodio en una concentración de aproximadamente 4,0 M a aproximadamente 4,50 M. En algunas modalidades, la perfusión del tejido biológico con un lavado con sal, tal como el de la etapa c) de los métodos ilustrativos descritos en la presente descripción, se lleva a cabo hasta que el perfusato (es decir, el fluido usado para la perfusión, tal como el fluido que se ha inyectado a través de la vasculatura) es negativo para proteínas por densidad óptica (OD) a 280 nm.
Cualquiera de los medios y/o tampones de la presente invención puede comprender un inhibidor de proteasas. Algunos inhibidores de proteasas ilustrativos se describieron anteriormente. En algunas modalidades, el tampón tal como, el de la etapa (c) de los métodos ilustrativos descritos en la presente descripción comprende un inhibidor de proteasas, tal como el inhibidor de tripsina de soja. En otras modalidades, el tampón de la etapa (d) comprende uno o más inhibidores de proteasas, tales como un inhibidor de tripsina de soja.
Los medios y/o tampones de la presente invención pueden comprender una o más nucleasas, que en algunas modalidades pueden prepararse en los tampones estándar recomendados por los proveedores comerciales de estas enzimas. Por ejemplo, el tampón de la etapa d) comprende RNasa y DNasa. La perfusión con nucleasas elimina los residuos de ácidos nucleicos. En otras modalidades, el tampón de la etapa d) comprende RNasa, DNasa y uno o más inhibidores de proteasas. En algunas modalidades la perfusión del tejido biológico con una o más nucleasas se lleva a cabo hasta que el perfusato (es decir, el fluido usado para la perfusión, tal como el fluido que se ha inyectado a través de la vasculatura) es negativo para ácidos nucleicos por densidad óptica (OD) a 260 nm. En algunas modalidades, las nucleasas eliminan 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 100 % de los ácidos nucleicos en el tejido biológico.
El segundo medio (por ejemplo, medio de enjuague final) puede ser cualquier medio que garantice que los colágenos y los factores unidos (por ejemplo, componentes de la matriz, factores de crecimiento y citocinas) permanecerán insolubles, como se describió anteriormente. Los medios de enjuague final ilustrativos se describieron anteriormente en referencia al primer medio y no contienen suero, a pH neutro y con una osmolalidad de 250-350 mOsm/kg. Por ejemplo, en algunas modalidades el segundo medio comprende un medio basal. En algunas modalidades, el segundo medio es un medio basal sin suero. En otras modalidades, el segundo medio es un medio sin suero, definido hormonalmente (HDM) que comprende hormonas, factores de crecimiento, lípidos y albúmina sérica y se adapta a la necesidad de las células a cultivar. Un segundo medio ilustrativo es el medio de Kubota (Kubota y Reid, PNAS 97:12132-12137, 2000), que se diseña para células madre hepáticas, hepatoblastos y otras progenitoras. En determinadas modalidades, el segundo medio puede o no comprender suplementación con suero o un factor derivado de suero, tal como, pero no se limita a, albúmina sérica humana. En algunas modalidades, el enjuague del tejido con el segundo medio elimina los residuos del tampón delipidante y las nucleasas. En otras modalidades el lavado con el segundo medio y/o cualquier tampón o medio posterior equilibra el andamio de biomatriz con el medio o tampón. En algunas modalidades, el primer medio y el segundo medio pueden ser iguales y en algunas modalidades, el primer medio y el segundo medio pueden ser diferentes, lo que produce de esta manera un andamio de biomatriz a partir del tejido biológico.
En algunas modalidades, uno o más de los medios y/o tampones utilizados en la preparación del andamio de biomatriz están libres de (es decir, no contienen una cantidad detectable de) una o más enzimas que degradan los componentes de la matriz extracelular. En otras modalidades, todos los medios y tampones utilizados en la preparación del andamio de biomatriz están libres de (es decir, no contienen una cantidad detectable de) una o más enzimas que degradan los componentes de la matriz extracelular. Las enzimas ilustrativas incluyen, pero no se limitan a, colagenasas; proteasas; glicosidasas tales como heparinasa, heparitinasa, condroitinasa e hialuronidasa y elastasas.
La esterilización del tejido biológico, el homogeneizado y/o el andamio de biomatriz de esta invención se puede llevar a cabo por cualquier método que se conoce en la técnica, con la salvedad de que se deben evitar los métodos que usan un factor que puede unirse al andamio de biomatriz (por ejemplo, óxido de etileno). Los métodos de esterilización ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, irradiación gamma, esterilización con plasma por descarga luminiscente de radiofrecuencia (RFGD), esterilización con haz de electrones y esterilización con dióxido de carbono supercrítico. En algunas modalidades, la esterilización del tejido, el homogeneizado y/o el andamio de biomatriz se lleva a cabo con radiación gamma a aproximadamente 5000 rads. Si los andamios se van a usar de forma inmediata para la recelularización, y si se usaron procedimientos estériles en el proceso de descelularización (especialmente después de la extracción con alto contenido de sales), entonces puede no ser necesaria la esterilización.
El almacenamiento del andamio de biomatriz se puede llevar a cabo mediante cualquier método conocido en la técnica. En algunas modalidades (por ejemplo, cuando el andamio se va a usar intacto), el andamio de biomatriz puede almacenarse a aproximadamente 4 °C y en otras modalidades (por ejemplo, cuando el andamio se va a dispersar en secciones, el andamio de biomatriz se congela, por ejemplo, a aproximadamente -80 °C.
En algunas modalidades, el andamio de biomatriz comprende, consiste en, o consiste esencialmente en colágenos, fibronectinas, lamininas, nidógeno/entactina, elastina, proteoglicanos, glicosaminoglicanos y cualquiera de sus combinaciones, todos son parte del andamio de biomatriz (por ejemplo, unidos al andamio de biomatriz). En algunas modalidades, el andamio de biomatriz carece de una cantidad detectable de un colágeno, fibronectina, laminina, nidógeno/entactina, elastina, proteoglicano, glicosaminoglicano y cualquiera de sus combinaciones.
Los andamios de biomatriz que se producen mediante el método de la presente invención han demostrado ser sustratos de diferenciación potentes para las células y pueden usarse para muchos tipos de células, tales como, pero no se limitan a, cualquier célula madura o para diversas poblaciones de células madre. Entre ellas se incluyen, por ejemplo, células madre embrionarias (ES), células madre pluripotentes inducidas (iPS), células madre de la capa germinal (por ejemplo, células madre endodérmicas definitivas), células madre determinadas (por ejemplo, células madre hepáticas, pulmonares, pancreáticas o intestinales), células madre hepáticas humanas (hHpSC), células madre perinatales (por ejemplo, células madre derivadas del líquido amniótico (AFSC)), células madre mesenquimales (MSC) tales como las procedentes de la médula ósea o del tejido adiposo, progenitores comprometidos, células adultas de cualquier tipo de tejido, células enfermas, células tumorales, células maduras, células parenquimatosas, células estrelladas, colangiocitos, células del árbol biliar tales como las que no son colangiocitos, hepatocitos, células renales, células uroteliales, células mesenquimales, células musculares lisas o esqueléticas, miocitos (células madre musculares), fibroblastos, condrocitos, adipocitos, fibromioblastos, células endoteliales, células ectodérmicas, que incluyen las células dúctiles y las de la piel, células neurales, células de los islotes, células presentes en el intestino, osteoblastos, otras células que forman hueso o cartílago y cualquiera de sus combinaciones. Estas células pueden ser normales o enfermas.
En algunas modalidades, los andamios de biomatriz se usan para estudios biológicos, farmacéuticos, genéticos, moleculares y/o virológicos de células, ya sean recién aisladas de tejido o de células madre de linaje restringido. En otras modalidades, los andamios de biomatriz se usan para órganos implantables y vascularizados producidos por ingeniería de tejidos, tales como, pero no se limitan a, el hígado. Otros usos ilustrativos de los andamios de biomatriz incluyen, pero no se limitan a, fabricación de proteínas, pruebas de toxicidad de fármacos, desarrollo de fármacos, detección de anticuerpos y/o producción de virus para preparaciones vacunales de virus. La producción de virus de virus dependientes del linaje (por ejemplo, virus del papiloma y la hepatitis C) se puede lograr mediante la siembra de poblaciones de células madre en un andamio de biomatriz específico de tejido y después el cultivo en un medio que funciona en combinación con el andamio de biomatriz para inducir de forma completa la diferenciación de las células. Los viriones maduros se producirán cuando las células maduren completamente. Siempre que el virus en sí no afecte la viabilidad celular, las células maduras infectadas con el virus se pueden mantener durante al menos ocho semanas lo que ofrece un medio para generar grandes cantidades de virus con un sistema de cultivo estable.
Los andamios de biomatriz pueden usarse intactos, tal como pero no se limitan a, el uso para cultivos 2-D y/o 3-D para células. En algunas modalidades, los andamios de biomatriz pueden usarse en combinación con un medio específico para la diferenciación en cultivos 2-D y/o 3-D para líneas celulares, tales como, pero no se limitan a, células normales o enfermas de cualquier etapa del linaje madurativo desde células madre hasta células en etapa tardía.
Alternativamente, los andamios de biomatriz se pueden congelar. Estas secciones congeladas se pueden preparar y usar como sustratos. Los andamios de biomatriz se pueden congelar de forma rápida en hielo seco y se preparan secciones congeladas con un criostato, se colocan sobre aparatos de cultivo (por ejemplo, placas, matraces, tela, transpocillos, etcétera), se esterilizan y rehidratan en medio antes de sembrar las células. En algunas modalidades, el andamio de biomatriz que se congela de esta invención se puede cortar en secciones.
En algunas modalidades, se produce un cultivo celular, que comprende: a) producir un andamio de biomatriz de acuerdo con los métodos de esta invención; b) poner en contacto el andamio de biomatriz de la etapa (a) con el medio de cultivo celular en un aparato de cultivo y c) sembrar el andamio de biomatriz de la etapa (b) con células, para producir de esta manera un cultivo celular.
En algunas modalidades, se produce un cultivo celular, que comprende: a) producir un andamio de biomatriz de la presente invención; b) congelar el andamio de biomatriz de la etapa (a); c) preparar una sección congelada del andamio de biomatriz de la etapa a como un sustrato de cultivo celular; d) poner en contacto el sustrato de cultivo celular de la etapa (c) con el medio de cultivo celular en un aparato de cultivo y e) sembrar el sustrato de cultivo celular de la etapa (d) con células, para producir de esta manera un cultivo celular.
En otras modalidades, los andamios de biomatriz se pueden triturar hasta un polvo. Un método para triturar el andamio de biomatriz hasta un polvo comprende triturar el andamio de biomatriz hasta un polvo en un molino congelador a temperaturas en o cerca de las temperaturas de nitrógeno líquido. Otros aparatos para triturar a temperaturas de nitrógeno líquido o equivalentes (por ejemplo, congelación con hielo seco) se conocen en la técnica. El polvo se puede llevar a temperatura ambiente a la cual adquiere la consistencia de una pintura que se puede aplicar sobre los aparatos de cultivo mediante el uso de una brocha estéril o un aparato equivalente. El polvo o las placas se pueden esterilizar.
Por lo tanto, en algunas modalidades se produce un cultivo celular que comprende: a) producir un andamio de biomatriz de la presente invención; b) triturar el andamio de biomatriz de la etapa (a) hasta un polvo; c) recubrir un aparato de cultivo con el polvo de la etapa (b) para producir un sustrato de cultivo celular; d) poner en contacto el sustrato de cultivo celular de (c) con el medio de cultivo celular en el aparato de cultivo y e) sembrar el sustrato de cultivo celular de (d) con células, para producir de esta manera un cultivo celular. En algunas modalidades de este método, la trituración de la biomatriz se puede llevar a cabo en un molino congelador (por ejemplo, trituración criogénica) en o cerca de la temperatura del nitrógeno líquido.
En algunas modalidades, antes de sembrar las células para el cultivo celular, se añade una porción del medio al aparato de cultivo ya que las células pueden unirse en segundos. Las células, en algunas modalidades se unen en segundos a minutos para células adultas normales y en minutos a unas pocas horas para diversos tipos de células madre. En algunas modalidades, la unión de las células puede depender de cómo se dispersan los andamios de biomatriz para usar en cultivos. El medio celular puede ser cualquier medio que sea adecuado para producir un cultivo celular. En algunas modalidades el medio de cultivo celular comprende al menos un constituyente presente en el fluido intersticial, en donde la osmolalidad de dicho medio es de aproximadamente 250 mOsm/kg a aproximadamente 350 mOsm/kg, en donde dicho medio no contiene suero y en donde el pH es neutro. En otras modalidades, el medio de cultivo celular puede ser un medio basal, tal como pero no se limitan a, RPMI-1640, DME/F12, medio de Ham, medio de Kubota, etcétera.
Los cultivos celulares producidos con los andamios de biomatriz, en algunas modalidades, comprenden, consisten esencialmente o consisten en, el mismo tipo de células que las células del tejido biológico que se usó para hacer el andamio de biomatriz. Los ejemplos no limitantes de las células de esta invención incluyen células madre embrionarias (ES), células madre pluripotentes inducidas (iPS), células madre determinadas, células madre perinatales, células madre derivadas de líquido amniótico (AFSC), células madre mesenquimales (MSC) de cualquier fuente, progenitores comprometidos o células adultas de cualquier tipo de tejido, células maduras, células normales, células enfermas, células tumorales y cualquiera de sus combinaciones. Los ejemplos no limitantes adicionales incluyen células hepáticas, células parenquimatosas, células estrelladas, células endoteliales, hepatocitos, colangiocitos, células del árbol biliar que no son colangiocitos y células pancreáticas.
En algunas modalidades, las células madre primitivas (ya sean ES, iPS, MSC o AFSC) restringirán el linaje de las células, al menos parcialmente, al tipo de tejido que se usó para fabricar el andamio de biomatriz. Las células madre determinadas de una capa germinal dada se restringirán al tipo de tejido que se usó para hacer el andamio de biomatriz cuando el andamio se prepara a partir de un tejido derivado de esa capa germinal y se puede diferenciar de forma parcial al destino adulto si está en un andamio de un tejido derivado de una capa germinal diferente. Por lo tanto, la capacidad de las células adultas de diferenciarse completamente se puede encontrar determinada por el tipo de tejido del andamio de biomatriz. En paralelo, el destino de las células madre puede encontrarse determinado de manera parcial o completa por el tipo de tejido del andamio de biomatriz o el destino de las células madre puede encontrarse determinado completamente por el tipo de tejido del andamio de biomatriz. En algunas modalidades, las células del cultivo celular son de un tipo diferente que las células del tejido biológico que se usó para preparar el andamio de biomatriz. Como se describió en detalle anteriormente, los tipos ilustrativos de células que pueden usarse en la producción de un cultivo celular incluyen, pero no se limitan a, células madre embrionarias, células madre pluripotentes inducidas, células madre mesenquimales, células madre derivadas del líquido amniótico, células madre determinadas, células maduras, células normales, células enfermas, células tumorales y cualquiera de sus combinaciones. Estas células pueden ser de cualquier tejido biológico como se describe en la presente descripción.
En algunas modalidades, los andamios de biomatriz inducen un crecimiento lento o detención del crecimiento correlacionado con la diferenciación de las células normales, ya sean células madre o células maduras. Las células maduras, en algunas modalidades, se diferencian completamente en horas y permanecen diferenciadas de manera estable durante al menos ocho semanas después de eso. En algunas modalidades, las células adultas (es decir, células completamente maduras) se adhieren a los andamios en minutos y retienen su diferenciación completa después de eso durante más de ocho semanas. Las células madre, en algunas modalidades, experimentan algunas divisiones y entonces pasan a la detención del crecimiento y se diferencian completamente. Las células madre permanecen de manera estable en la detención del crecimiento, viables y completamente diferenciadas durante al menos ocho semanas. En algunas modalidades, las células madre sembradas sobre andamios de biomatriz pasan a la detención del crecimiento o disminuyen su crecimiento, pierden los marcadores de células madre y se diferencian a células maduras funcionales en aproximadamente una semana, con retención de fenotipos y viabilidades estables durante al menos ocho semanas o más (por ejemplo, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o 100 % de viabilidad durante un período de tiempo prolongado (por ejemplo, al menos una semana, al menos dos semanas, al menos tres semanas, al menos cuatro semanas, al menos cinco semanas, al menos seis semanas, al menos siete semanas, al menos ocho semanas, al menos nueve semanas, al menos diez semanas, al menos 11 semanas, al menos 12 semanas, al menos 13 semanas, al menos 14 semanas, al menos 15 semanas, al menos 16 semanas, al menos un mes, al menos dos meses, al menos tres meses, al menos cuatro meses, al menos cinco meses, al menos seis meses, al menos siete meses, al menos ocho meses, al menos nueve meses, al menos diez meses, al menos 11 meses, al menos un año, etcétera).
El andamio de biomatriz se puede usar para diferenciar células madre embrionarias (ES) y/o inducir células madre pluripotentes (IPS) a un destino específico. Por ejemplo, en algunas modalidades un andamio de biomatriz específico de tejido se usa para facilitar que las células madre embrionarias en diferenciación o las células pluripotentes inducidas sigan un destino específico.
El andamio de biomatriz se puede usar para diferenciar células madre derivadas del líquido amniótico (AFSC) o células madre mesenquimales (MSC) de médula ósea o de tejido adiposo o de cualquier tejido fetal o postnatal o cualquier célula madre determinada (por ejemplo, de pulmón, intestino, árbol biliar, riñón, piel, corazón, etcétera) hacia un destino adulto específico. Los andamios de biomatriz producidos mediante los métodos de la presente invención pueden usarse para aumentar y acelerar la diferenciación de células madre a células maduras mediante la producción de un cultivo celular.
En la presente descripción se describe un método para aumentar y/o acelerar la diferenciación de células madre y/o progenitoras a células maduras, que comprende producir un cultivo celular de acuerdo con los métodos de esta invención, en donde las células son células madre y el medio de cultivo celular se formula para células maduras para aumentar y/o acelerar de esta manera la diferenciación de células madre y/o progenitoras a células maduras. El medio de cultivo celular puede ser cualquier medio que se formula para células maduras. Los constituyentes en el medio son distintos para cada tipo de célula. Diferenciación significa que las condiciones provocan que las células maduren a tipos de células adultas que producen productos génicos específicos de adultas. Las células empleadas en estos métodos pueden ser células adultas de cualquier tipo o células madre o progenitoras, cuyos ejemplos no limitantes incluyen células madre embrionarias, células madre pluripotentes inducidas, células madre de capas germinales, células madre determinadas, células madre perinatales, células madre derivadas del líquido amniótico, células madre mesenquimales, células amplificadoras transitorias o progenitoras comprometidas de cualquier tipo de tejido.
Las células sembradas sobre los andamios de biomatriz (por ejemplo, andamios de biomatriz intactos, secciones de andamios o andamios de biomatriz en polvo mezclados en/sobre otros materiales implantables) se pueden trasplantar a animales o humanos como un método para injertar células in vivo. En algunas modalidades se proporciona un método para suministrar células a un sujeto que comprende poner en contacto el sujeto con el andamio de biomatriz de la presente invención, donde el andamio de biomatriz comprende células. En otras modalidades se proporciona un método para suministrar células a un sujeto que comprende sembrar el andamio de biomatriz de la presente invención con células y entonces trasplantar el andamio de biomatriz sembrado con las células en el sujeto. En algunas modalidades, un andamio de biomatriz que no se ha sembrado con ninguna célula se puede trasplantar a un sujeto.
En algunas modalidades, el andamio de biomatriz puede usarse como un injerto que se puede usar para regenerar el tejido u órgano en el sujeto.
Los andamios de biomatriz producidos mediante el método de la presente invención pueden usarse para establecer órganos bioartificiales, que pueden ser útiles para programas analíticos y/o clínicos. Los andamios de biomatriz pueden usarse, además, para identificar productos génicos específicos o facetas de estados patológicos. En algunas modalidades los andamios de biomatriz se preparan a partir de tejidos de animales mutantes y subsecuentemente usado para definir factor(es) relevante(s) asociado(s) con la(s) mutación(ciones). En otras modalidades los andamios de biomatriz se preparan a partir de tejidos enfermos y se usan para definir cambios en la matriz relevantes para la enfermedad.
Otros ejemplos no limitantes de usos de los andamios de biomatriz de esta invención incluyen: 1) uso del andamio para el cultivo de células malignas con el fin de definir el potencial metastásico (la capacidad de las células tumorales para formar colonias de células en crecimiento en un tipo determinado de andamio de biomatriz es predictiva de la capacidad de las células para hacer metástasis en el tejido a partir del cual se preparó ese andamio; 2) colocación de injertos de tejido en el andamio para ser usados para el trasplante en un sujeto); 3) producción de organoides formados por recelularización de andamios para ser usados como dispositivos de asistencia, como, por ejemplo, un organoide de hígado que entonces se conecta a un sujeto con insuficiencia hepática; 4) uso del andamio para la fabricación de proteínas (las células del andamio producen un factor que se puede aislar del medio y/o de las células y entonces purificado; y 5) uso del andamio para la producción de virus dependientes del linaje; por ejemplo, para la producción de virus que requieren células diferenciadas para producir suficientes partículas para su uso como vacuna.
Así, la presente invención proporciona un método para identificar el potencial metastásico de células tumorales en un tipo de tejido, que comprende a) producir un andamio de biomatriz de acuerdo con los métodos de esta invención; b) poner en contacto el andamio de biomatriz de (a) con medio de cultivo celular en un aparato de cultivo; c) sembrar el andamio de biomatriz de (b) con células tumorales; mantener el andamio de biomatriz de (c) en condiciones de cultivo y e) monitorear el crecimiento de las células tumorales en el andamio de biomatriz de (d), en donde el crecimiento de las células tumorales en el andamio de biomatriz identifica que las células tumorales pueden colonizar in vivo el tipo de tejido del que se produjo el andamio de biomatriz, identificar de esta manera el potencial metastásico de las células tumorales en el tipo de tejido.
También se proporciona en la presente descripción un método para identificar una célula tumoral como sensible a un tratamiento antitumoral, que comprende a) producir un andamio de biomatriz de acuerdo con los métodos de esta invención; b) poner en contacto el andamio de biomatriz de (a) con medio de cultivo celular en un aparato de cultivo; c) sembrar el andamio de biomatriz de (b) con células tumorales; d) mantener el andamio de biomatriz de (c) en condiciones de cultivo; e) aplicar el tratamiento antitumoral a las células tumorales en el andamio de biomatriz; y f) monitorear el crecimiento de las células tumorales en el andamio de biomatriz de (e), en donde la ausencia de crecimiento de células tumorales y/o la muerte de células tumorales en el andamio de biomatriz de (e) identifica las células tumorales como sensibles al tratamiento antitumoral. Los ejemplos no limitantes de tratamiento antitumoral incluyen agentes quimioterapéuticos, anticuerpos, terapia de radiación, inmunoterapia, terapia hormonal, etcétera, como bien se conoce en la técnica. En algunas modalidades, las células tumorales de un sujeto se pueden sembrar sobre diferentes andamios de biomatriz de esta invención y exponerse a tratamientos antitumorales respectivos. De acuerdo con los resultados de estos análisis respectivos de diferentes tratamientos antitumorales, se puede seleccionar un tratamiento antitumoral que es eficaz contra las células tumorales del sujeto y ese tratamiento antitumoral se puede administrar al sujeto para tratar el tumor del sujeto.
En modalidades adicionales, la presente invención proporciona un método para producir un injerto tumoral para el trasplante en un animal hospedero, que comprende: a) producir un andamio de biomatriz de acuerdo con los métodos de esta invención; b) poner en contacto el andamio de biomatriz de (a) con medio de cultivo celular en un aparato de cultivo; c) sembrar el andamio de biomatriz de (b) con células tumorales; d) mantener el andamio de biomatriz de (c) en condiciones de cultivo; y e) establecer una población de las células tumorales en el andamio de biomatriz de (d), lo que produce de esta manera un injerto tumoral para el trasplante en el animal hospedero. En algunas modalidades, este método puede comprender, además, la etapa de trasplantar el injerto tumoral en el animal hospedero. En diversas modalidades, el injerto tumoral puede ser singénico, alogénico o xenogénico al animal hospedero.
También se proporciona en la presente descripción un método para producir partículas virales de un virus dependiente del linaje, que comprende a) producir un andamio de biomatriz de acuerdo con los métodos de esta invención; b) poner en contacto el andamio de biomatriz de (a) con medio de cultivo celular en un aparato de cultivo; c) sembrar el andamio de biomatriz de (b) con células de un tipo y etapa de linaje que pueden ser infectadas con el virus dependiente de linaje; d) infectar las células de (c) con el virus dependiente del linaje; e) mantener las células infectadas en el andamio de biomatriz en condiciones de cultivo y f) recoger las partículas virales producidas en las células infectadas, lo que produce de esta manera partículas virales del virus dependiente del linaje.
Los ejemplos no limitantes de un virus dependiente del linaje de esta invención incluyen virus de la hepatitis C, virus de la hepatitis B, norovirus, virus del papiloma humano y cualquier otro virus que se conoce en la actualidad o que se identifique más adelante como dependiente del linaje. Por dependiente del linaje se entiende que la célula en la que está presente el virus debe madurar o diferenciarse a una etapa particular antes de que el virus se pueda replicar exitosamente en la célula y producir partículas virales, como se conoce en la técnica.
Además, la presente invención proporciona un método para producir un organoide formado por recelularización de un andamio de biomatriz, que comprende: a) producir un andamio de biomatriz de acuerdo con los métodos de esta invención; b) poner en contacto el andamio de biomatriz de (a) con medio de cultivo celular en un aparato de cultivo; c) sembrar el andamio de biomatriz de (b) con células del mismo tipo de tejido que el tejido biológico que se usó para preparar el andamio de biomatriz; y d) mantener las células en el andamio de biomatriz en condiciones de cultivo, mediante lo cual se forman organoides a partir de las células, lo que produce de esta manera un organoide formado por recelularización del andamio de biomatriz. Este método puede comprender, además, la etapa de poner en contacto el organoide que se produjo en las etapas (a) a la (d) con un sujeto, para el uso como un dispositivo auxiliar, como se conoce en la técnica. En este método puede usarse cualquier tipo de célula que puede usarse para producir el andamio de biomatriz de esta invención. En algunas modalidades, las células son células hepáticas.
La presente invención proporciona, adicionalmente, un método para producir una proteína de interés en células cultivadas en un andamio de biomatriz, que comprende: a) producir un andamio de biomatriz de acuerdo con los métodos de esta invención; b) poner en contacto el andamio de biomatriz de (a) con medio de cultivo celular en un aparato de cultivo; c) sembrar el andamio de biomatriz de (b) con células que producen la proteína de interés; d) mantener las células de (c) en el andamio de biomatriz en condiciones de cultivo; y e) recoger la proteína de interés producida por las células de (d), lo que produce de esta manera una proteína de interés en células cultivadas en un andamio de biomatriz. Este método puede comprender la etapa adicional de purificar la proteína de interés recolectada en la etapa (f). La proteína de interés de esta invención puede ser cualquier proteína producida por una célula, ya sea de un gen endógeno y/o como una proteína recombinante, en una cantidad que puede recolectarse de las células en cultivo y/o del medio de cultivo. Numerosos ejemplos de tales proteínas de interés se conocen en la técnica.
La presente invención se explica en mayor detalle en los siguientes ejemplos no limitantes.
Ejemplos
Ejemplo 1. La restricción del linaje de células madre hepáticas humanas a los destinos maduros se hace eficiente por andamios de biomatriz específicos de tejidos
Resumen. Los protocolos actuales para la diferenciación de células madre hacen uso de múltiples tratamientos de señales solubles y/o factores de la matriz y típicamente dan lugar a una diferenciación parcial a células maduras con un sub expresión o sobre expresión de genes específicos de tejidos adultos. En la presente invención, se desarrolló una estrategia para la diferenciación rápida y eficiente de células madre mediante el uso de sustratos de andamios de biomatriz, extractos específicos de tejido enriquecidos en matriz extracelular y factores de crecimiento y citocinas que se asocian, en combinación con un medio libre de suero, definido de forma hormonal (HDM) adaptado para el tipo de célula adulta de interés. Los estudios descritos en la presente descripción demuestran la eficacia de los andamios de biomatriz de esta invención en la diferenciación de células madre hepáticas humanas (hHpSC) a destinos maduros y en el mantenimiento de células parenquimatosas maduras como completamente funcionales durante largos períodos de tiempo. Los andamios de biomatriz se prepararon mediante un novedoso protocolo de descelularización por perfusión en cuatro etapas mediante el uso de condiciones diseñadas para mantener todos los tipos de colágeno insolubles. Los andamios mantuvieron la histología natural, vasculaturas permeables y aproximadamente 1 % de las proteínas tisulares pero > 95 % de sus colágenos, la mayoría de los componentes de la matriz asociados a colágeno del tejido y niveles fisiológicos de factores de crecimiento y citocinas unidos a la matriz. Los colágenos aumentaron desde niveles casi indetectables hasta >15 % de las proteínas del andamio con el resto que incluye lamininas, fibronectinas, elastina, nidógeno/entactina, proteoglicanos, y citocinas y factores de crecimiento que se unen a la matriz en patrones que se correlacionan con la histología. Las células madre hepáticas humanas (hHpSC), sembradas en andamios de biomatriz de hígado y en un HDM que se adapta para células hepáticas adultas, perdieron los marcadores de células madre y se diferenciaron a células parenquimatosas maduras funcionales en aproximadamente una semana, que permanecieron viables y con fenotipos de células maduras estables durante más de ocho semanas. Por lo tanto, los andamios de biomatriz de esta invención pueden usarse para estudios biológicos y farmacéuticos de células madre de linaje restringido, para el mantenimiento de células maduras y para tejidos u órganos implantables y vascularizados producidos por ingeniería de tejidos.
Procedimientos de descelularización. Después de la anestesia con ketamina-xilazina, se abrió la cavidad abdominal de la rata y se insertó una manga con una cánula en la vena porta para perfundir todo el hígado. (1) La perfusión se realiza con RPMI 1640 durante 10 minutos; seguido de (2) delipidación con una lipasa (por ejemplo, 20-50 unidades de fosfolipasa A2--PLA2) combinada con un detergente suave tal como desoxicolato de sodio (SDC) al 1 % durante aproximadamente 30-60 minutos hasta que el tejido se vuelve transparente y la efusión se vuelve clara, (3) se realiza la perfusión con lavados con alto contenido de sal (para hígados fetales: 4,5 M de NaCl y para hígados adultos 3,4 M-3,5 M de NaCl) hasta que el perfusato es negativo para proteínas por densidad óptica (OD) a 280 nm; (4) perfusión con nucleasas (DNasa, RNasa) en RPMI 1640 hasta que el perfusato es negativo para ácidos nucleicos por OD 260; y (5) enjuague final con RPMI 1640 durante 2 horas o más.
Los andamios de biomatriz se congelan de forma rápida en hielo seco y se preparan secciones congeladas con un criostato, se colocan en placas de cultivo celular de 24 pocillos, se esterilizan por irradiación gamma (5000 rads) y se rehidratan en medio (KM) durante 30 minutos antes de sembrar las células. Las secciones de andamios de biomatriz cubrieron ~95 % de la superficie de los pocillos en la placa de 24 pocillos.
Un método alternativo para distribuir los andamios de biomatriz sobre las placas de cultivo consistió en pulverizarlos hasta un polvo mediante el uso de un molino congelador lleno con nitrógeno líquido. El polvo pulverizado, cuando se lleva a temperatura ambiente, adquiere la consistencia de la pintura, y se puede recubrir sobre cualquier superficie, tal como placas, portaobjetos, tela, filtros u otras superficies usados para adherir células y/o cultivo celular. La pulverización de los andamios elimina los gradientes de componentes y señales de la matriz, pero la mezcla de componentes presentes aún provoca potentes efectos de diferenciación. Los andamios también pueden usarse intactos y volver a sembrarse con células en la preparación de órganos que se producen por ingeniería de tejidos para el trasplante in vivo o para cultivos 3-D.
Se desarrollaron métodos alternativos para el uso con hígados porcinos y bovinos. Los hígados porcinos y bovinos se obtuvieron de una instalación de procesamiento de carne (CT) certificada por el USDA. Véase el ejemplo 3 para un resumen de un protocolo representativo. Cada hígado se inspeccionó por el USDA y recibió el sello del USDA antes de salir de la instalación. Los hígados se transportaron en medio ESP-Gro (Gigacyte, Branford, CT; # de catálogo 1101-250). Los hígados recibidos en el laboratorio se pesaron, se documentaron de forma fotográfica y se prepararon para la perfusión. Después de triturar, la mezcla se descongeló y se diluyó a una relación medio:biomatriz de 1:48. Esta suspensión de biomatriz se usó entonces para recubrir placas. Después del secado, la biomatriz se lavó tres veces y entonces se aplicaron las células. Las células hepáticas adultas se unieron en 10 minutos a las placas. Las madres/progenitoras pueden demorar más tiempo (algunas horas). Sin embargo, tanto para madres/progenitoras como para células hepáticas adultas, esencialmente 100 % de las células viables se adhieren.
Medios y soluciones. Todos los medios se esterilizaron por filtración (filtro de 0,22-mm) y se mantuvieron en la oscuridad a 4 °C antes del uso. Para mantener los colágenos estables en la biomatriz, el pH del medio de perfusión para la preparación de andamios de biomatriz se mantuvo a 7,5-8,0. Se usó RPMI-1640 (Gibco/Invitrogen, Carlsbad, CA) como el medio basal para la preparación de andamios de biomatriz y para cultivos de hepatocitos o de células madre hepáticas. Todos los reactivos excepto los señalados se obtuvieron de Sigma (St. Louis, MO).
Medios de perfusión para la preparación de andamios de biomatriz.
(1) . Lavado de perfusión y enjuague de perfusión: medio basal libre de suero (por ejemplo, RPMI-1640);
(2) . Perfusión con detergente: 36 unidades/l de PLA2 más SDC al 1 %;
(3) . Perfusión con alto contenido de sal: 3,4 M de NaCl con inhibidor de tripsina de soja a 0,1 mg/ml;
(4) . Perfusión con nucleasas: RNasa 5 mg/100 ml, DNasa 1 mg/100 ml e inhibidor de tripsina de soja a 0,1 mg/ml (por ejemplo, preparado en RPMI 1640).
Medio de Kubota. El KM se diseñó originalmente para hepatoblastos47 y en la actualidad se ha descubierto ser efectivo para progenitoras hepáticas humanas48 y para otras progenitoras endodérmicas que incluyen las del árbol biliar (Wang y otros. "Multipotent stem/progenitor cells in human biliary tree give rise to hepatocytes, cholangiocytes and pancreatic islets" Hepatology, 2011, en prensa) y páncreas (Wang, Y Reid L, datos no publicados). Consiste en cualquier medio basal (que aquí es RPMI 1640) sin cobre, bajo en calcio (0,3 mM), 10-9. M de selenio, BSA al 0,1 %, 4,5 mM de nicotinamida, 0,1 nM de sulfato de zinc heptahidratado (de Specpure, Johnson Matthew Chemicals, Royston, Inglaterra), 10-8 M de hidrocortisona,5 Mg/ml transferrina/Fe, 5 mg/ml insulina, 10 mg/ml, lipoproteína de alta densidad y una mezcla de ácidos grasos libres que se añade unida a albúmina sérica humana purificada.
Para diferenciar las células a un destino adulto, puede usarse un medio definido de forma hormonal (HDM), sin suero, adaptado al tipo de célula adulta que se desea. Por ejemplo, se usó un HDM para el destino hepático adulto que consiste en KM suplementado además con calcio para lograr una concentración de 0,6 mM, 10-12 M de cobre, 1 nM de triyodotironina (T3), glucagón 7 ng/ml, FGF 20 ng/ml, galactosa 2 g/l, 10 ng/ml de oncostatina M (OSM), 10 ng/ml de factor de crecimiento epidérmico (EGF), 20 ng/ml de factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) y 10-8 M de hidrocortisona.
Las células se sembraron en este HDM libre de suero si se sembraron en los andamios; en circunstancias en las que se usaron enzimas para el procesamiento de células o tejidos, después el HDM se suplementó con FBS al 5 % (HyClone, Waltham, MA) durante algunas horas y entonces se cambió a HDM libre de suero. En los experimentos de control paralelos, los cultivos se mantuvieron en el HDM con FBS al 5 %, pero se descubrió que la presencia de suero provocaba que las células perdieran las funciones diferenciadas con el tiempo. Los requisitos de factores solubles son menores que los normales para los cultivos en otros sustratos dado que muchos de los factores están unidos a los andamios de biomatriz. Los requisitos de factores solubles son menores que los normales para los cultivos en otros sustratos dado que muchos de los factores están unidos a los andamios de biomatriz.
Caracterización de árboles vasculares intactos en los andamios de biomatriz de hígado. Las ramificaciones y los restos de matriz en ramificación de la vasculatura que incluyen la red de capilares en el andamio de biomatriz de hígado de rata se visualizaron mediante microscopía óptica y de fluorescencia, respectivamente. Se introdujeron partículas de dextrano de 250 kDa marcadas con rodamina en el andamio de biomatriz de hígado a través del remanente de la vena porta para comprobar la integridad de los restos de matriz del sistema de vasculatura en los andamios de biomatriz. Se preparó una película mediante el uso de un microscopio de disección de fluorescencia Leica MZ16FA (motorizado).
Procesamiento del hígado fetal humano. Los tejidos hepáticos fetales fueron proporcionados por una agencia acreditada (Advanced Biological Resources, San Francisco, CA) a partir de fetos entre 16-20 semanas de edad gestacional que se obtuvieron por interrupciones de embarazo electivas. El protocolo de investigación se revisó y aprobó por la Junta de Revisión Institucional para Estudios de Investigación en Seres Humanos en la Universidad de Carolina del Norte en Chapel Hyll. Las suspensiones de células hepáticas humanas fetales se prepararon como se describió anteriormente4849. Brevemente, el procesamiento se realizó en RPMI 1640 suplementado con albúmina sérica bovina al 0,1 %, I nM de selenio y antibióticos. El tampón de procesamiento enzimático contenía colagenasa tipo IV a 300 U/ml y desoxirribonucleasa a 0,3 mg/ml a 32 °C con agitación frecuente durante 15-20 minutos. Las suspensiones enriquecidas se prensaron a través de una malla de calibre 75 y se centrifugaron a 1200 RPM durante 5 minutos antes de la re-suspensión. La viabilidad celular calculada por exclusión con azul de tripán fue sistemáticamente mayor que 95 %.
Enriquecimiento de hHpSC y cultivo en andamios de biomatriz. Se usaron dos métodos para la purificación o enriquecimiento de hHpSC:
1) Selección en cultivo. Aproximadamente 3x105 células se sembraron en una placa de cultivo de tejidos de 10 cm y en KM. El medio se cambió cada 3 días. Las colonias se formaron en 5-7 días y se observaron hasta 3 meses. Las colonias se escogieron de forma manual después de 14-18 días mediante el uso de un microscopio invertido (1X-FLAIII; Olympus, Japón y Melville, NY).
2) La inmunoselección magnética de subpoblaciones de progenitoras hepáticas multipotentes (hHpSC y hHB) se logró mediante la selección de células positivas para la molécula de adhesión celular epitelial (EpCAM, CD326) mediante el uso de tecnologías de inmunoselección con micro-esferas magnéticas con el sistema MACS de Miltenyi Biotech (Bergisch Gladbach, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante50. Brevemente, las células disociadas se incubaron con anticuerpo contra EpCAM unido a micro-esferas magnéticas durante 30 minutos a 4 °C y se separaron mediante el uso de un sistema de separación por columna magnética de Miltenyi de acuerdo con los procedimientos recomendados por el fabricante.
Los cultivos se sembraron con 250 colonias de hHpSC, o 5X105 hHpSC enriquecidas o 2,5X105 hepatocitos adultos primarios. El medio se reemplazó diariamente y el medio recolectado se almacenó a -20 °C para el análisis posterior. Las células cultivadas en placas de 24 pocillos recubiertas con colágeno tipo I sirvieron como control.
Aislamiento de hepatocitos de rata adultos. Las suspensiones recién aisladas de hepatocitos de rata se obtuvieron a partir de ratas Lewis machos adultos de 3 meses de edad (Charles River Laboratories, Wilmington, MA) que pesan 200-250 g. Se usó un método de perfusión en dos etapas mejorado como se describió anteriormente49 para el aislamiento y purificación de los hepatocitos de rata. El hígado se perfundió durante 10-15 minutos con un tampón libre de calcio que contenía EGTA y entonces colagenasa en un tampón que contiene calcio durante 10-15 minutos. Después el hígado se disoció mecánicamente al presionar el hígado digerido a través de estopilla y entonces por filtración secuencial de la suspensión de células a través de tamices de tamaño de malla decreciente. Las células se lavaron dos veces y entonces se sedimentaron a 50 g. La viabilidad se definió mediante el recuento de las células después de la tinción con azul de tripán. De forma rutinaria, 200-300 millones se aislaron células por rata con una viabilidad de 89-96 % y una pureza >99 %.
Aislamiento y cultivo celular hepáticas adultas humanas. Las suspensiones de células hepáticas humanas frescas se obtuvieron de CellzDirect (en la actualidad una parte de Invitrogen, RTP, NC). Las suspensiones se procesaron mediante métodos de CellzDirect, después se re-suspendieron en medio HeptoMAIN (# de catálogo 1103-250; GigaCyte, Branford, CT) se sembraron a 1,88 X 105 células/cm2 en placas de múltiples pocillos recubiertas con andamios de biomatriz de hígado o sobre colágeno tipo I (1 mg/ml; Meridian # de catálogo A33704H).
Análisis de la composición química de colágeno. La cantidad de colágeno en los andamios de biomatriz se evaluó en base al contenido de hidroxiprolina (hyp). Las muestras de hígados completos y de andamios de biomatriz se pulverizaron, se lavaron y se liofilizaron. Después, las alícuotas se hidrolizaron y se sometieron a análisis de aminoácidos51, y el contenido de colágeno por proteína total se calculó en base al valor de hyp de 300 residuos/colágeno.
Análisis cuantitativo del contenido de ADN y ARN. Para evaluar el ADN total restante en la biomatriz de hígado descelularizada, tanto el tejido hepático de rata fresco como la biomatriz descelularizada se pesaron, se cortaron y digirieron con Proteinasa K y se aisló el ADN celular total52. Para evaluar el ARN total restante en la biomatriz de hígado descelularizada, el tejido hepático de rata fresco y la biomatriz de hígado de rata descelularizada se pesaron y entonces se homogeneizaron en solución de TRIzol (Invitrogen), y se aisló el ARN celular total.
Ensayos de factores de crecimiento. Las muestras de hígado de rata, andamios de biomatriz de hígado de rata, tejido de conducto biliar humano y andamios de biomatriz de conducto biliar humano (dos muestras cada uno) se enviaron a RayBiotech, Inc (Norcross, Georgia) para el análisis de los factores de crecimiento. Las muestras se homogeneizaron, se prepararon como lisados, y entonces se analizaron con 1 mg/ml de proteína, lo que produjo fluorescencia, definida en unidades de intensidad de fluorescencia (FIU). Los ensayos semicuantitativos de factores de crecimiento se realizaron mediante el uso de matrices de ® factores de crecimiento humanos RayBio®, Series G 1. Las FIU se redujeron por las de los controles negativos para la unión no específica y se normalizaron con respecto a la concentración de proteínas. Los datos de los duplicados se promediaron. Se usaron cuatro matrices lo que permitió el estudio de ~40 factores de crecimiento. Aunque el ensayo se desarrolló para factores de crecimiento humanos, existe suficiente superposición en la reacción cruzada con factores de crecimiento de rata para permitir el uso tanto para muestras de rata como humanas.
Microscopía electrónica de transmisión y de barrido (TEM y SEM). Para la TEM, los andamios de biomatriz se enjuagaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se fijaron en glutaraldehído al 3 %/cacodilato de sodio 0,1, pH 7,4 durante la noche. Después de tres enjuagues con tampón de cacodilato de sodio, los andamios de biomatriz se fijaron durante 1 hora en tetróxido de osmio al 1 %/tampón de cacodilato de sodio 0,1. Después del enjuague en agua desionizada, se deshidrató y se incrustó en resina epoxi Polybed 812 (Polysciences, Niles, IL). Los andamios de biomatriz se cortaron en secciones perpendiculares al sustrato a 70 nm mediante el uso de una cuchilla de diamante. Las secciones ultra-finas se recolectaron en rejillas de cobre de 200 mesh y se tiñeron con acetato de uranilo acuoso al 4 % durante 15 minutos, seguido de citrato de plomo de Reynolds durante 7 minutos. Las muestras se observaron mediante el uso de un microscopio electrónico de transmisión LEO EM910 que funciona a 80 kV (LEO Electron Microscopy, Oberkochen, Alemania). Las imágenes digitales se adquirieron mediante el uso de una cámara digital CCD Gatan Orius SC1000 y el programa informático Digital Micrograph 3.11.0 (Gatan, Pleasanton, CA).
Para la SEM, después de la fijación y los enjuagues, los andamios de biomatriz se deshidrataron y se transfirieron en etanol al 100 % al secador de punto crítico de Balzers CPD -020 (Bal-Tec AG, Balzers, Suiza) y se secaron mediante el uso de dióxido de carbono como el solvente de transición. La matriz se montó en soportes de aluminio para especímenes con lengüetas adhesivas de carbono y se recubrió con metal de oro y paladio (aleación 60:40) con un grosor de 10 nm mediante el uso de un metalizador de muestras Hummer X (Anatech, Worcester MA). Las muestras se examinaron mediante el uso de un instrumento Zeiss Supra 55 FESEM a un voltaje de aceleración de 5 kV y las imágenes digitales se adquirieron mediante el uso del programa informático Zeiss SmartSEM (Carl Zeiss SMT, Alemania y Thornwood, NY).
Inmunocitoquímica e inmunohistología. Para la tinción por fluorescencia de las células cultivadas en andamios de biomatriz, las células se fijaron con paraformaldehído al 4 % (PFA) durante 20 minutos a temperatura ambiente, se enjuagaron con HBSS, se bloquearon con suero de cabra al 10 % en HBSS durante 2 horas y se enjuagaron. Las células fijadas se incubaron con anticuerpos primarios a 4 °C durante la noche, se lavaron, se incubaron durante 1 hora con anticuerpos secundarios específicos de isotipo etiquetados, se lavaron, se tiñeron por contraste con 4',6-diamidino- 2-fenildol (DAPI) para la visualización de los núcleos celulares y se observaron mediante el uso de un microscopio invertido Leica DMIRB (Leica, Houston, TX).
Para la inmunohistoquímica, los andamios de biomatriz se fijaron en PFA al 4 % durante la noche y se almacenaron en etanol al 70 %. Se incrustaron en parafina y se cortaron en secciones de 5 pm. Las secciones se desparafinaron y los antígenos se recuperaron. Las peroxidasas endógenas se bloquearon por incubación durante 30 minutos en solución de H2O2 al 0,3 %. Después de bloquear con suero de caballo al 10 %, se aplicó el anticuerpo primario a 4 °C durante la noche; el anticuerpo secundario y la tinción con ABC se realizaron mediante el uso del kit RTU Vectastain (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Se usó Vector Nova RED como sustrato. Las secciones se deshidrataron, se fijaron y se incrustaron en medio de montaje Eukitt (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA), y se analizaron mediante el uso de un microscopio invertido. Los anticuerpos que se usaron para las secciones de hígado y para los cultivos se enumeran en la Tabla 4.
Análisis de reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR). Las hHpSC se cultivaron en placas de cultivo celular y las colonias se transfirieron al andamio de biomatriz. Después del cultivo adicional durante 7 días, las colonias se lisaron para RT-PCR. El ARN total se extrajo mediante el uso de un estuche RNeasy Plus Mini (Qiagen GmbH, Valencia CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La transcripción inversa se llevó a cabo con el sistema de síntesis de primera cadena SuperScript para RT-PCR (Invitrogen, Carlsbad, CA). El kit de mezcla maestra HotStarTaq (Qiagen) se usó para la PCR. Los cebadores de PCR se enumeraron en la Tabla 5.
Ensayo VIVAS/MUERTAS y ensayo de viabilidad celular. Se usó un kit de ensayo de viabilidad VIVAS/MUERTAS (Molecular Probes/Invitrogen, Carlsbad, CA) para los ensayos de adhesión y proliferación. Las hHpSC o los hepatocitos se incubaron con dos sondas, calceína-AM (Vivas, gris claro) y homodímero de etidio-1 (EtDd-1, Muertas), para la actividad esterasa intracelular y la integridad de la membrana plasmática, respectivamente. Se observaron especímenes bajo un estereomicroscopio Olympus SZX12 de fluorescencia (OLYMPUS, Japón y Melville, NY). Un kit de ensayo de viabilidad celular de resazurina (Biotium, Hayward, CA) se usó de acuerdo con el manual del fabricante. Brevemente, se añadió 10 % de solución de resazurina en medio de cultivo y se incubó a 37 °C durante la noche. La absorbancia OD570-OD600 se obtuvo mediante el uso de un lector de microplacas de detección múltiple Biotek Synergy HT (Winooski, VT) y se representó gráficamente la curva de viabilidad. Todos los experimentos se llevaron a cabo tres veces mediante el uso de un mínimo de tres muestras por condición experimental.
Ensayos funcionales específicos hepáticos. La actividad de CYP4503A4 se detectó mediante el uso de un sistema de cribado P450-Glo™ (Promega, Madison, WI). Brevemente, las células cultivadas se incubaron con medio que contenía el sustrato luminogénico CYP3A4, luciferina-PPXE para CYP, durante 4 horas a 37 °C. La detección y análisis de luciferina se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante con un contador Wallace Victor2 Multilabel (en la actualidad parte de Perkins/Elmer en Waltham, MA). La secreción de albúmina cuantitativa se realizó mediante el uso de un kit de ELISA de cuantificación de albúmina humana (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX). Para los ensayos de síntesis de urea, las células se incubaron con 2 mM de amonio durante 24 horas y el sobrenadante se recolectó y analizó con el kit de ensayo de urea Quantichrom (Biotest Systems, Hayward, CA). El sobrenadante de una muestra para cada condición de cultivo se analizó por triplicado y el experimento se repitió 3 veces.
Análisis estadístico. Los experimentos se repitieron al menos 2-3 veces con muestras duplicadas o triplicadas para cada condición. Se presentan los datos de experimentos representativos, mientras que se observaron tendencias similares en múltiples ensayos. Todas las barras de error representan el S.E.M.
Los andamios de biomatriz se preparan con un protocolo de cuatro etapas novedoso. Los andamios de biomatriz se prepararon mediante el uso de un protocolo que comprende delipidación seguida de extracciones con alto contenido de sal y mediante el uso de métodos de perfusión (Figura 1). En los métodos se proporciona una presentación detallada del protocolo. Esto se logra mediante un novedoso protocolo de cuatro etapas: 1) delipidación suave; 2) lavados con tampones con concentraciones de sal de aproximadamente 2,0 M a aproximadamente 5,0 M (por ejemplo, 2,0 M-2,5 M, 2,6M-3,0 M; 3,1M-3,5 M, 3,6M-4,0 M, 4,1M-4,5 M; 4,6M-5,0 M), concentraciones de sal conocidas por mantener los colágenos en un estado insoluble23 (la concentración exacta y el pH de los tampones está dictado por los tipos de colágeno en el tejido), concentraciones conocidas por mantener los colágenos en un estado insoluble23; 3) tratamiento con nucleasa para eliminar los ácidos nucleicos residuales; y 4) enjuagues con un medio basal para eliminar los residuos de detergente, sal y nucleasa, así como para equilibrar los componentes de la matriz con el medio (Figura 1A).
Las elecciones de los medios de enjuague o los tampones para las nucleasas pueden ser cualquiera de una serie de opciones siempre que la concentración de sal y la fuerza iónica sean tales que mantengan los componentes de la matriz en un estado insoluble. En la elección del método de delipidación es crítico que este sea efectivo y no obstante suave. Se eligió una combinación de desoxicolato de sodio (SDC) y fosfolipasa A2 (PLA2) para degradar de forma rápida el fosfoglicérido que se ubica en la membrana citoplasmática y la membrana mitocondrial a lisolecitina, un poderoso surfactante, que puede inducir necrosis y citólisis. La fórmula reactiva se muestra en la Figura 8. Se evitaron los detergentes fuertes, tales como dodecilsulfato de sodio (SDS) o Tritón-X 100, que podrían disolver algunos componentes de la matriz tales como los glicosaminoglicanos (véase la reseña de Gilbert y otros. "Decellularization of tissues and organs" Biomaterials 27: 3675-3683 (2006)).
Se evitó la exposición prolongada de los andamios a las enzimas de las células rotas durante la delipidación y los lavados con alto contenido de sal, debido a que pueden disminuir en gran medida el contenido de elastina y el contenido de glicosaminoglicanos (GAG) tales como sulfatos de heparán (HS), sulfatos de condroitina (CS), sulfatos de dermatán (DS) y heparinas (HP), que son sitios en los que se unen las citocinas y los factores de crecimiento24. Se usó el inhibidor de tripsina de soja y un control cuidadoso del pH (7,5-8,0), la temperatura (20 °C) y el tiempo (30­ 60 minutos) para limitar la actividad de las proteasas que se derivan de las células rotas.
Se perfundió el tejido completo a través de la vasculatura relevante (por ejemplo, la vena porta en el hígado), lo que permitió aislar de forma rápida (en pocas horas) un andamio de biomatriz con una pérdida mínima de los componentes de la matriz. La rapidez del aislamiento se debe a la etapa inicial con el detergente que delipida el tejido en aproximadamente 30-60 minutos (no horas o días como en los protocolos que usaron otros). Los andamios de biomatriz resultantes son translúcidos o blancos (Figura 1). Por otra parte, mediante el uso de este método de perfusión, se mantuvieron los canales principales de la vasculatura, la vena porta y hepática y la mayoría de las ramificaciones vasculares en el hígado, lo que aumentó la eficiencia de la descelularización. Las partículas de dextrano etiquetadas con rodamina fluorescente perfundidas a través de los andamios de biomatriz permanecieron dentro de los restos de la vasculatura lo que demuestra que son patentes (Figura IE) Hay un flujo progresivo sin fugas del colorante desde los vasos grandes hasta las ramificaciones de vasos sanguíneos finos a lo largo de los canales. Este hecho ayudará a la revascularización de los andamios como un medio para preparar tejidos producidos por ingeniería de tejidos para el cultivo tridimensional y/o para la implantación ex vivo.
Cuando se cortan en secciones, los andamios retienen la estructura histológica del tejido original, que incluye los restos reconocibles de las principales entidades histológicas tales como los vasos sanguíneos, los conductos biliares y la cápsula de Glisson (GC) (Figura 1). Compare las Figuras 1B1 y 1D1, en las que una sección del tejido hepático se compara con la de un andamio de biomatriz. Los restos de matriz de la pared de células parenquimatosas consistían en una red similar a un encaje (Figuras 1D2-1D3).
El colágeno, las proteínas asociadas y las citocinas unidas al colágeno se mantienen en los andamios de biomatriz. La cantidad de colágeno en los andamios de biomatriz se evaluó por análisis de aminoácidos mediante métodos que se usaron previamente25. Debido a que la hidroxiprolina (Hyp) es exclusiva de los colágenos y las proteínas colagenosas, la composición de colágeno con relación a la proteína total se expresó como residuos de Hyp por 1000 aminoácidos. Los resultados demostraron que el contenido de colágeno aumentó desde niveles casi indetectables, es decir, menos de 0,2 residuos de hidroxiprolina (Hyp)/1000 en hígado, hasta ~13 residuos de Hyp/1000 en andamios de biomatriz. Esto indica que la delipidación y los lavados con alto contenido de sal descritos con anterioridad, no eliminaron los colágenos, lo que deja casi todos los colágenos en los andamios de biomatriz. La detección de niveles significativos de hidroxilisina (Hyl), otro aminoácido asociado al colágeno, y niveles más altos de glicina (Gly) en el andamio de biomatriz respalda nuestra conclusión de que el colágeno está de forma notable enriquecido en los andamios de biomatriz (Figuras 2A, 9 y Tabla 2).
Mediante el uso de estudios inmunohistoquímicos y ultraestructurales, se pudo identificar en los andamios todas las formas conocidas de colágenos que se encuentran in situ en hígado que incluyen colágenos fibrilares (colágeno tipos I, III y V, 10-30 nm de diámetro para las fibrillas y 500-3000 nm para las fibras ensambladas) y filamentos en forma de cuentas (posiblemente tipo VI). Esas fibras y filamentos están presentes en la capa de tejido conectivo subcapsular que se encuentra debajo de la capa mesotelial. Aunque las estructuras típicas de las membranas basales no se encontraron a lo largo de los sinusoides desde las tríadas portales hasta las venas centrales, se encontró que el colágeno tipo IV y algunas fibrillas pequeñas unidas forman entramados 3D porosos similares a una red, que sirven como andamio para las células parenquimatosas (Figura 2). Los haces de colágeno tipo I se pueden observar como la estructura principal de los andamios a los cuales se adhieren otros tipos de colágeno, glicoproteínas y proteoglicanos. En el espacio de Disse se encontraron pequeños haces de colágeno tipo I y fibras de los tipos de colágeno III y VI así como algunas del tipo V, que es más abundante cerca de las tríadas portales y las venas centrales. Los datos inmunohistoquímicos representativos se presentan en la Figura 3B, y un resumen de los componentes de la matriz y su ubicación en el tejido hepático normal frente a los que están en los andamios de biomatriz se enumeran en la Figura 4D. Los primeros estudios en el desarrollo de los protocolos para la preparación de andamios de biomatriz indicaron que la mayoría de los componentes del citoesqueleto se pierden en los lavados. Aun así, los andamios se evaluaron por inmunohistoquímica y no se encontró evidencia de tubulina, desmina o actina, cantidades mínimas de citoqueratinas 18 y 19 y bajos niveles de vimentina diseminada en todos los andamios.
La matriz que se asocia con los conductos biliares y porciones de los sistemas vasculares hepáticos (vasos arteriales y venosos) consiste en estructuras de membrana basal típicas y por lo tanto es bastante distinta de las capas delgadas de la matriz que se asocia con las estructuras vasculares que se encuentran en los sinusoides. La laminina, la entactina/nidógeno, el perlecán y el colágeno tipo IV se encuentran en la tríada portal, mientras que solo se encuentran perlecán y algún colágeno tipo IV en el espacio de Disse. Hay presencia de cantidades enormes de elastina hidrófoba ondulada; se entrecruza y forma láminas y fibras restringidas principalmente al tejido conectivo subcapsular, regiones portales y paredes arteriales. Las fibronectinas son ubicuas y predominan en toda la matriz hepática y son especialmente abundantes en el espacio de Disse, donde forman filamentos finos o depósitos granulares (Figuras 2 y 3).
La inmunohistoquímica indica que los proteoglicanos conocidos en el tejido se conservan en los andamios de biomatriz (Figuras 3B, 4D). Entre los proteoglicanos heterogéneos identificados, se encontró sindecano intercalado y continuo a lo largo de los sinusoides, y perlecán es más puntuado en el espacio de Disse. Las formas de HS-PG y CS-PG se encuentran en todos los restos de los sinusoides en los andamios de biomatriz y en patrones que se correlacionan con la zonificación conocida del tejido hepático.
Los proteoglicanos y otros componentes de la matriz son depósitos importantes de citocinas y factores de crecimiento que se unen estrechamente a sus GAG26. La mayoría de los factores de crecimiento y hormonas se encuentran en los andamios de biomatriz cerca de las concentraciones que se encuentran en el tejido original. En la Tabla 6 se proporcionan los datos de los lisados de hígados de rata frente a los andamios de biomatriz de hígado de rata, y en la Tabla 3, se proporcionan datos paralelos del tejido de conducto biliar humano frente a los andamios de biomatriz de conducto biliar. Curiosamente, hubo algunos ejemplos (por ejemplo, bFGF) que se enriquecieron fuertemente en andamios de biomatriz de hígado sobre los que se encuentran en los lisados hepáticos. Los factores de crecimiento y las citocinas unidos son distintos de manera cualitativa y cuantitativa entre los andamios del hígado frente al tejido de conducto biliar, lo que implica tanto especificidad de tejido como especificidad de especie. Alternativamente, puede deberse, en parte, al hecho de que los andamios de conducto biliar se prepararon, por necesidad, mediante agitación del tejido en los tampones en un balancín y no por perfusión a través de la vasculatura.
La composición química de los andamios de biomatriz se correlaciona con la histología. Una característica significativa de este nuevo protocolo es la retención de la composición química de la matriz en patrones que se correlacionan con las zonas acinares hepáticas 1-3 desde la tríada portal hasta la vena central y con entidades histológicas tales como los canales vasculares y la cápsula de Glisson (GC) como se muestra en las Figuras 4A-C. La composición química periportal de la matriz en la zona 1 es similar a la que se encuentra en hígados fetales y consiste, en parte, en colágeno tipo III, laminina y formas de CS-PG. Transita a una composición química de la matriz diferente en la zona acinar media (zona 2) y las zonas pericentrales (zona 3) y termina con una matriz muy estable con altos niveles de colágeno tipo IV y HP-PG27.
Una gran variedad de proteínas (por ejemplo, factores de crecimiento y hormonas, proteínas de la coagulación, diversas enzimas) se conocen por su unión a la matriz y se mantienen de manera estable mediante la unión a los patrones discretos y específicos de sulfatación en los GAG o a otros componentes de la matriz24. Por lo tanto, la composición química de la matriz transita desde su punto de inicio en el nicho de células madre con una composición química de la matriz lábil asociada con un alto nivel de recambio y sulfatación mínima a composiciones químicas de la matriz estables y que tienen cantidades crecientes de sulfatación con progresión hacia la zona pericentral. Se espera que el mantenimiento de la arquitectura natural y la composición química de la matriz que se correlaciona con la histología faciliten la recelularización en los procesos de ingeniería de tejidos al guiar a las células a sitios específicos en los andamios de biomatriz y/o proporcionar la mezcla adecuada de señales para dirigir la expansión y/o diferenciación a células maduras.
El andamio de biomatriz se puede preparar a partir de diferentes tejidos y especies. Los andamios de biomatriz se pueden preparar de forma fácil a partir de cualquier tejido, normal o enfermo y de cualquier especie. En las Figuras 13-16 se muestran andamios de biomatriz de páncreas, árbol biliar y duodeno humanos y de páncreas de rata y porcino. En las figuras 5-7 y la Figura 12 se muestran los efectos de andamios de biomatriz de hígado de rata o bovino en células hepáticas. Además, se han preparado andamios de biomatriz a partir de la aorta abdominal, la vena ilíaca humana y de intestino de rata y de cerdo. Los estudios histológicos, ultraestructurales e inmunohistoquímicos de los andamios de biomatriz indican una especificidad de tejido notable, pero no una especificidad de especie, en su estructura, composición química y funciones.
Los andamios de biomatriz indujeron y/o mantuvieron la diferenciación de las células. La siembra de hHpSC en placas con secciones de andamios de biomatriz de hígado y en HDM adaptado para células hepáticas adultas dio lugar a la adhesión de esencialmente el 100 % de las células viables en pocas horas en los andamios de biomatriz; ya sea intactos o después de la pulverización criogénica. Las colonias de células que se formaron inicialmente en las secciones de los andamios retuvieron parte de su fenotipo de células madre ya que las células en el centro de las colonias pudieron resistir la tinción con colorantes (Figura 11) y expresaban marcadores clásicos de progenitoras hepáticas, tales como el receptor 4 de quimiocinas (motivo C-X-C) (CXCR4) y la molécula de adhesión celular epitelial (EpCAM) (Figura 5). Se dividieron una o dos veces y entonces transitaron a la detención del ciclo celular y a morfologías 3-dimensionales (3-D) similares a un cordón típicas de cultivos de células parenquimatosas maduras (Figuras 5 y 6 para la diferenciación de las células madre; compare con la Figura 7 y la Figura 12). El HDM que se usó no requirió todas las citocinas o factores de crecimiento habituales, ya que estos están presentes unidos a los andamios de biomatriz. La transición a la detención del crecimiento se correlacionó con la tinción en todas las colonias con colorantes de viabilidad (Figura 12), con pérdida de la expresión de EpCAM y CXCR4 y con un aumento estable en la expresión de genes hepatocíticos y colangiocíticos específicos de adultos tales como urea y citocromo P4503A4. (Figura 5).
Los hepatocitos normales de rata adultos y humanos adultos se sembraron sobre colágeno tipo I o en andamios de biomatriz de hígados de rata o bovinos y en HDM para células adultas. Las células parenquimatosas adultas pudieron adherirse a los andamios en 10 minutos (incluso en medio libre de suero) frente a horas en colágeno tipo I, permanecieron en detención del crecimiento desde el punto de adhesión; y permanecieron viables y funcionales de forma completa durante más de 8 semanas en los andamios frente a solo aproximadamente ~2 semanas en colágeno tipo I. (Figuras 7 y 12). Los niveles de las funciones de las células hepáticas maduras en los andamios de biomatriz durante semanas demostraron ser iguales o similares a los hallazgos de otros de hepatocitos adultos recién aislados28. Las distinciones dramáticas son que los cultivos en colágeno tipo I se deterioran rápidamente después de 2 semanas, mientras que los de andamios de biomatriz permanecieron estables morfológica y funcionalmente durante el tiempo que se mantuvieron los cultivos (hasta ahora ~ 8 semanas).
Los andamios de biomatriz contienen la mayoría de los componentes de la matriz extracelular del tejido y las citocinas y factores de crecimiento unidos a la matriz que proporcionan un conjunto combinado de señales químicas que pueden usarse como un andamio insoluble y estable con una capacidad extraordinaria de inducir las hHpSC a los destinos hepáticos adultos así como también de mantener las células adultas completamente diferenciadas durante semanas. Al comparar los tipos existentes de extractos de matriz preparados por investigadores con los del andamio de biomatriz de la presente invención, está claro que los tratamientos físicos, enzimáticos y químicos tienen efectos sustanciales sobre la composición, el comportamiento mecánico y las respuestas del huésped a los andamios biológicos derivados de la descelularización de tejidos y órganos naturales, y en consecuencia, tienen implicaciones importantes para sus aplicaciones in vitro e in vivo. Todos los demás métodos existentes para la preparación de sustratos o andamios dan lugar a la eliminación de una gran porción de los componentes de la matriz a través del uso de enzimas que degradan la matriz16 o el uso de tampones que disuelven las principales porciones de la matriz11. Los métodos físicos (por ejemplo, congelación instantánea y agitación) pueden funcionar para preparar extractos de matriz a partir de tejidos con una estructura en capas tales como la dermis (por ejemplo, SIS, BSM)29 pero no son útiles para órganos con estructuras tisulares complejas tales como el hígado. Por el contrario, nuestro método para andamios de biomatriz resultó en la pérdida de la mayoría de las proteínas celulares, pero de forma esencial preservó todos o al menos la mayoría de los colágenos y componentes que se asocian al colágeno, incluidas las citocinas, hormonas y factores de crecimiento unidos a la matriz.
La matriz extracelular se incrusta en una bicapa lipídica en mosaico, que incluso en el organismo más simple es un ambiente complejo, heterogéneo y dinámico. El método de delipidación es una faceta crítica del protocolo. Los métodos comunes que se usan para la descelularización de tejidos involucran detergentes iónicos tales como SDC y dodecilsulfato de sodio (SDS). El SDC es relativamente más suave que el SDS, tiende a provocar menos ruptura de la arquitectura tisular natural y es menos efectivo para solubilizar las membranas celulares citoplasmáticas y nucleares30. No existen informes sobre la descelularización de tejidos mediante el uso de forma única del SDC. Muchos estudios han hecho uso de un detergente no iónico fuerte (por ejemplo, Tritón X-100)31 o detergentes zwitteriónicos (por ejemplo, 3-(3-colamidopropil)dimetilamonio]-1-propanosulfonato, CHAPS)32. Por el contrario, nuestro método de usar una combinación de s Dc y PLA2 delipidó el tejido de manera rápida y suave.
Hasta el momento se han identificado al menos veintinueve tipos de colágenos (I-XXIX) en vertebrados con roles funcionales en la adhesión celular, la diferenciación, el crecimiento, el desarrollo y la integridad estructural de los tejidos3334. Se conoce que los principales componentes estructurales en la matriz, los colágenos, permanecen insolubles en altas concentraciones de sal y a pH neutro3536, un hallazgo que es la base de nuestra estrategia en la preparación de andamios de biomatriz. La estrategia tiene las ventajas añadidas de que los colágenos permiten la conservación de los componentes de la matriz unidos a ellos, tales como lamininas y fibronectinas (FN), proteoglicanos (PG) pequeños ricos en leucina y GAG que a su vez conservan las citocinas, los factores de crecimiento o los receptores de superficie celular que se unen a ellos.
Los andamios de biomatriz son únicos en su profunda capacidad de inducir la diferenciación rápida y consistente de células madre/progenitoras tales como hHpSC a destinos adultos y de mantener esas células de linaje restringido y de mantener esas células de linaje restringido o también mantener las células adultas sembradas en los andamios, como células viables y completamente funcionales durante muchas semanas (> 8 semanas).
La diferenciación de células madre, tales como células madre embrionarias (ES), células madre pluripotentes inducidas (iPS) o formas variables de células madre mesenquimales (MSC) a tipos de células hepáticas completamente maduras requiere múltiples conjuntos de señales (solubles y de la matriz) presentadas en etapas, con la inducción mediante un conjunto requiere la sensibilización para responder a un conjunto diferente, y puede tomar muchas semanas, hasta 6 semanas de cultivo, para generar células que tienen el destino hepático adulto37. Por otra parte, la restricción del linaje de las MSC a los destinos hepáticos proporciona resultados inconsistentes con las células adultas que tienen fenotipos mixtos de hepatocitos y MSC. La diferenciación de las células madre embrionarias, las células iPS y las células madre embrionarias da lugar a células similares a los hepatocitos que expresan algunos, pero nunca todos, los principales genes específicos del hígado; con variabilidad en los genes que se observan; y los niveles de proteína de los genes hepáticos expresados suelen ser bajos40 o altos para un gen hepático e insignificantes para otros41.42 Por el contrario, la diferenciación de las hHpSC en los andamios de biomatriz dio lugar a que esencialmente todas las células expresaran un fenotipo adulto clásico y con actividades de urea, albúmina y CYP450 a niveles que son casi normales después de una semana en cultivo.
Las células similares a hepatocitos de cualquiera de estas precursoras y diferenciadas mediante protocolos distintos a los andamios de biomatriz, expresan algunos, pero nunca todos, los principales genes específicos del hígado, con variabilidad en qué genes se observan, y los niveles de proteína de los genes hepáticos son usualmente bajos o altos para un gen hepático e insignificantes para otros. Por razones desconocidas, los resultados son diferentes entre preparaciones. Se espera que el uso de los andamios de biomatriz de esta invención de lugar a una diferenciación más rápida de estas poblaciones de células madre y con mayor consistencia en el logro de células con un fenotipo adulto estable.
La diferenciación de poblaciones de células madre determinadas, tales como hHpSC en los andamios de biomatriz resultó en que esencialmente todas las células expresaran un repertorio clásico de genes adultos y con actividades de urea, albúmina y CYP450 a niveles casi normales en 1 a 2 semanas en cultivo y con estabilidad de ese fenotipo durante muchas semanas. Por lo tanto, los andamios de biomatriz de la presente invención tienen el potencial de facilitar en gran medida la diferenciación de poblaciones de células madre determinadas a un fenotipo hepático adulto.
La capacidad de diferenciar células madre en los andamios de biomatriz para lograr células y tejidos maduros y funcionales ofrece considerables oportunidades para programas académicos, industriales y clínicos al permitir el uso de tipos de células bien diferenciadas para cada tipo de estudio analítico, y, lo que es más fascinante, permitir la generación de tejidos, o incluso órganos, implantables y revascularizados que podrían usarse para programas clínicos y de investigación básica.
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Ejemplo 2. Uso de andamios de biomatriz para cultivos de líneas celulares tumorales o cultivos primarios de tumores
Los andamios de biomatriz de esta invención pueden usarse para producir cultivos de líneas de células tumorales o de cultivos primarios de tumores. La capacidad para hacer esto significa que se puede evaluar la sensibilidad del tumor de un paciente a varias terapias en un ensayo ex vivo.
Los andamios de biomatriz de esta invención también pueden usarse como sustratos para injertos de tumores (ya sean singénicos, alogénicos o xenogénicos) trasplantados en huéspedes.
Los andamios de biomatriz de esta invención también pueden usarse para evaluar el potencial metastásico de un tumor. Las células tumorales se siembran a densidades celulares bajas sobre sustratos de andamios de biomatriz de varios tejidos. Las células tumorales se unirán y sobrevivirán en muchos tipos de andamios de biomatriz. Crecerán y formarán colonias preferentemente en algunos de ellos. Su capacidad para formar colonias en un tipo específico de andamio de biomatriz es predictiva de la habilidad de las células tumorales para colonizar el tejido a partir del cual se preparó el andamio de biomatriz.
Los cánceres colorrectales que habían hecho metástasis en el hígado se resecaron y el tejido se preparó como cultivos primarios en el medio de Kubota e incluso en varios sustratos. En la Tabla 9 se muestran hallazgos de seis pacientes. Algunos de los pacientes tenían tumores que también habían hecho metástasis a los pulmones. Las células se cultivaron en plástico de cultivo de tejidos, placas recubiertas con colágeno tipo I ("colágeno") o placas recubiertas con andamios de biomatriz de colon, hígado o pulmón de rata. Todos los pocillos se sembraron con 20 000 células/pocillo en placas de 96 pocillos y se alimentaron con medio de Kubota. Las células se adhirieron y sobrevivieron en todos los sustratos (véase las Figuras 17A- B). Sin embargo, pudieron crecer y formar colonias mejor en determinados sustratos. Las condiciones que soportan el mayor número de colonias se correlacionan con la capacidad de crecimiento de las células in vivo en aquellos tejidos particulares a partir de los cuales se preparó un andamio. La cantidad de matriz o componentes de la matriz resultó ser una variable en la obtención de colonias. En la Tabla 8 se muestra la cantidad de matriz/pocillo necesaria para observar colonias. De forma evidente, la cantidad necesaria del colon, el lugar del tumor primario, fue la menor. Los datos importantes están resaltados en negrita.
Lo anterior es ilustrativo de la presente invención, y no se debe interpretar como limitante de la misma. La invención se define por las siguientes reivindicaciones.
-
Figure imgf000028_0001
Estos datos son representativos de las condiciones de insolubilidad de los tipos de colágeno. Se debe identificar los tipos de colágeno dentro de un tejido y a continuación usar la concentración de sal más alta identificada para esos colágenos en el tejido y como tal la de los tampones que se usaron para preparar los andamios de biomatriz. Por ejemplo, para la piel, se usaría un tampón a pH neutro y con una concentración de sal de 4,0 M, una concentración de sal que mantendría los colágenos insolubles tipo I y III. Por el contrario, para la placenta, se usaría un tampón a pH neutro y 4,5 M de sal para mantener insoluble tanto el colágeno tipo IV como el tipo V.
Los tipos de colágenos presentes en un tejido son distintos a las diferentes edades de un huésped. Por ejemplo, los hígados fetales tienen altos niveles de colágenos tipo III, IV y V (que requieren concentraciones de sal superiores a 4,0 M), mientras que los hígados adultos tienen una mezcla de colágenos tipo I, III, IV, V, VI y XVIII (que requieren concentraciones de sal más bajas). Por lo tanto, la concentración de sal necesaria para una preparación de andamio de biomatriz está dictada por el repertorio de colágenos que son dominantes en el tejido. Véase la referencia 23 del ejemplo 1 para más detalles.
Figure imgf000029_0001
 Tabla 3. Análisis de factores de crecimiento unidos a andamios de biomatriz de conducto biliar
Figure imgf000030_0001
continuación
Figure imgf000031_0002
Tabla 4. Anticuerpos usados
Nombre del anticuerpo Huésped e isotipo Empresa Núm. de
catálogo Dilución Anticuerpos primarios contra componentes de la matriz extracelular
1. colágeno 1 IgG1 de ratón Sigma C2456 1/2000 2. colágeno 3A1 IgG1 de ratón Sigma C7805 1/2000 3. colágeno 4A1 IgG de cabra Santa Cruz sc-9302 1/50 4. colágeno 5A1 IgG de conejo Santa Cruz sc-20648 1/50 5. colágeno 6 IgG de conejo Santa Cruz Sc-20649 1/50 6. sulfato de condroitina IgM de ratón Sigma C8035 1/200 7. Elastina IgG de conejo Abcam ab21610 1/200 8. entactina (nidógeno 1) IgG de rata GeneTex GTX72367 1/200 9. sulfato de heparán IgM de ratón Seiko, Japón 270426 1/200 10. HS-PG: perlecán IgG2a de ratón Neo
Marcadores RT-794 1/200 11. HS-PG: sindecano-1 IgG de cabra R&D AF2780 1/100 12. Fibronectina IgG1 de ratón Sigma F7387 1/200
13.
Figure imgf000031_0001
Laminina IgG1 de ratón Sigma L8271 1/1000
Anticuerpos primarios para otras proteínas
1. AFP IgG de conejo Biológicos
Novus NB100-1611 1/200 2. Albúmina IgG de conejo Biológicos
Novus NB 600-570 1/200 3. ASMA IgG2a de ratón Sigma A2547 1/300 4. Ck18 IgG2b de ratón Sigma SAB3300016
5. hCK19 IgG2a de ratón Abcam ab7754 1/250 6. CK19 IgG de conejo Abcam Ab52625 1/200 7. CYP3A4 IgG de ratón Abnova H00001576- B01P 1/200 8. Desmina IgG de conejo Abcam Ab8592 1/200 9. EpCAM IgG1 de ratón Neomarcadores MS-181 1/200 10. receptor de secretina IgG de conejo Santa Cruz sc-26633 1/100 11. PAN CK IgG1 de ratón Abcam ab-7753 1/300 12. Tubulina-a IgG1 de ratón Neomarcadores MS-581 1/1000 13. Vimentina IgG1 de ratón Abcamm Ab8978 1/200 Anticuerpos secundarios o colorantes para la tinción de células por fluorescencia o inmunohistoquímica de tejidos 1. Alexa Fluor® 488/594 de cabra anti-IgG 1 o 2a de ratón o
anti IgG de conejo________________________________ Sondas moleculares 1/500 (continuación)
Anticuerpos o colorantes secundarios para la tinción de células fluorescentes o la inmunohistoquímica tisular . sistema VECTASTAIN® ABC Vector Laboratories
. ESTUCHE NovaRED™ SUBSTRATE Vector Laboratories
. Faloidina 488 Sondas moleculares 1/500
Figure imgf000033_0001
Figure imgf000034_0001
 Tabla 6. Análisis de factores de crecimiento unidos a los andamios de biomatriz de hígado Andamios de Nombre Nombre completo de la citocina Hígados
de rata biomatriz de Porcentaje rata bFGF Factor de crecimiento de fibroblastos básico 100,06 394,14 394 EGF Factor de crecimiento epidérmico 74,81 76,02 102 EGF R Receptor del factor de crecimiento epidérmico 92,81 81,64 88 FGF-4 Factor de crecimiento de fibroblastos-4 15,06 13,21 88 FGF-6 Factor de crecimiento de fibroblastos-6 4,81 3,77 78 FGF-7 Factor de crecimiento de fibroblastos-7 10,06 6,32 63 GCSF Factor estimulante de colonias de granulocitos 348,06 338,20 97 GDNF Factor neurotrófico derivado de la glía 81,31 43,59 54 GM-CSF Factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos 133,56 105,38 79 HB-EGF Factor de crecimiento epidérmico de unión a heparina 44,56 38,23 86
IGFBP-1 Proteínas de unión al factor de crecimiento similar a la
insulina 1 67,81 70,40 104
IGFBP-3 Proteínas de unión al factor de crecimiento similar a la
insulina 3 140,81 201,90 143
IGFBP-4 Proteínas de unión al factor de crecimiento similar a la
insulina 4 83,56 58,92 71 IGFBP-6 Proteínas de unión al factor de crecimiento similar a la
insulina 6 91,81 72,19 79 IGF-I Factor de crecimiento similar a la insulina-I 1,56 1,98 127 IGF-I SR Factor de crecimiento similar a la insulina-I 7,31 3,51 48 IGF-II Factor de crecimiento similar a la insulina-2 3749,06 3482,52 93 M-CSF Factor estimulante de colonias de macrófagos 170,31 134,68 79 M-CSF R Receptor del factor estimulante de colonias de macrófagos 70,56 50,47 72 NT-3 Neurotrofina-3 25,56 5,03 20 NT-4 Neurotrofina-4 55,06 43,59 79 PDGF R a Receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas alfa 10,56 21,11 200
PDGF R b Receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas
beta 113,81 85,46 75 PDGF-AA Factor de crecimiento derivado de plaquetas AA 62,06 106,40 171 PDGF-AB Factor de crecimiento derivado de plaquetas AB 19,31 19,34 100 PDGF-BB Factor de crecimiento derivado de plaquetas BB 9,56 1423 149
PIGF Biosíntesis de anclaje de glicano fosfatidilinositol, clase F 4,81 8,36 174
SCF Factor-1 derivado de células estromales 2,06 42,56 2064 SCF R Receptor del factor derivado de células estromales 17,06 17,80 104 TGF-a Factor de crecimiento transformador alfa 21,31 21,63 102 TGF-b Transformación del factor de crecimiento beta 330,31 342,77 104 TGF-b 2 factor de crecimiento transformador-beta 2 134,06 152,34 114 TGF-b 3 Factor de crecimiento transformador beta 3 1,06 0,18 17 VEGF Factor de crecimiento endotelial vascular 70,56 94,14 133 VEGF R2 Receptor 2 del factor de crecimiento endotelial vascular 13,56 11,93 88 VEGF R3 Receptor 3 del factor de crecimiento endotelial vascular 459,56 46,91 10
T l 7. Pr i l l l m r h i h m n hH l i l mi n n liv
Figure imgf000035_0001
Figure imgf000036_0001
Figure imgf000036_0002

Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Un método para producir un andamio de biomatriz a partir de un tejido biológico que se selecciona del grupo que consiste en pulmón tiroides, piel, páncreas, vasos sanguíneos, vejiga, riñones, cerebro, árbol biliar, duodeno, aorta abdominal, vena ilíaca, corazón e intestinos, que comprenden:
a) perfundir u homogeneizar el tejido biológico con un primer medio basal, en donde la osmolalidad de dicho primer medio es de 250 mOsm/kg a 350 mOsm/kg y dicho primer medio no contiene suero y está a pH neutro; después
b) perfundir el tejido biológico o extraer el homogeneizado de la etapa (a) con un tampón delipidante que comprenda desoxicolato de sodio y fosfolipasa A2 en dicho primer medio; después
c) perfundir el tejido biológico o extraer el homogeneizado de la etapa (b) con un tampón a un pH neutro y que comprende una concentración de sal de NaCl 2,0 M a 5,0 M, la concentración elegida para mantener los colágenos insolubles identificados en el tejido biológico; después
d) perfundir el tejido biológico o extraer el homogeneizado de la etapa (c) con RNasa y DNasa en un tampón y después
e) enjuagar el tejido biológico u homogeneizado de la etapa (d) con un segundo medio que está a pH neutro, no contiene suero y tiene una osmolalidad de 250 mOsm/kg a 350 mOsm/kg,
lo que produce de esta manera un andamio de biomatriz intacto u homogeneizado a partir del tejido biológico, dicho andamio de biomatriz retiene al menos el 95 % de sus colágenos originales y la mayoría de los mayoría de los componentes de la matriz asociados a colágeno y los factores de crecimiento, hormonas y citocinas unidos a la matriz del tejido biológico.
2. El método de la reivindicación 1, en donde el medio basal se selecciona del grupo que consiste en medio RPMI 1640, DME/F12, DME, F12, de Waymouth y de William.
3. El método de la reivindicación 1 o 2, en donde el segundo medio comprende al menos uno de los constituyentes presentes en el fluido intersticial.
4. El método de cualquier reivindicación anterior, en donde el tampón delipidante de la etapa (b) comprende de 20 unidades/l a 50 unidades/l de fosfolipasa A2 y desoxicolato de sodio al 1 % en el primer medio.
5. El método de cualquier reivindicación anterior, en donde el tampón de la etapa (c) comprende además un inhibidor de proteasas, opcionalmente en donde el inhibidor de proteasas es un inhibidor de tripsina de soja.
6. El método de cualquier reivindicación anterior, en donde el tampón de la etapa (d) comprende además un inhibidor de proteasas, opcionalmente en donde el inhibidor de proteasas es un inhibidor de tripsina de soja.
7. El método de cualquier reivindicación anterior, en donde todos los medios y tampones de las etapas (a) hasta la (e) están libres de una cantidad detectable de una enzima que degrada los componentes de la matriz extracelular.
8. El método de cualquier reivindicación anterior que comprende además la esterilización del andamio de biomatriz, opcionalmente en donde la etapa de esterilización comprende la irradiación gamma del andamio de biomatriz.
9. Un andamio de biomatriz que se produce por el método de cualquiera de las reivindicaciones 1 -8.
10. Un método para producir un cultivo celular, que comprende:
a) producir un andamio de biomatriz de acuerdo con el método de cualquiera de las reivindicaciones 1-8; b) poner en contacto el andamio de biomatriz de la etapa (a) con el medio de cultivo celular en un aparato de cultivo; y
c) sembrar el andamio de biomatriz de la etapa (b) con células, para producir de esta manera un cultivo celular.
11. El método de la reivindicación 10, en donde la etapa (b) comprende
congelar el andamio de biomatriz de la etapa (a), preparar una sección congelada del andamio de biomatriz como sustrato de cultivo celular y poner en contacto el sustrato de cultivo celular con el medio de cultivo celular en un aparato de cultivo.
12. El método de la reivindicación 10 en donde la etapa (b) comprende
triturar la biomatriz a un polvo, que se lleva a cabo opcionalmente en un molino congelador en o cerca de temperaturas de nitrógeno líquido, recubrir al menos parte de un aparato de cultivo con el polvo para producir un sustrato de cultivo celular y poner en contacto el sustrato de cultivo celular con el medio de cultivo celular en el aparato de cultivo.
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