PT2588027T - Estruturas de biomatriz para dispersão à escala industrial - Google Patents

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PT2588027T
PT2588027T PT118015049T PT11801504T PT2588027T PT 2588027 T PT2588027 T PT 2588027T PT 118015049 T PT118015049 T PT 118015049T PT 11801504 T PT11801504 T PT 11801504T PT 2588027 T PT2588027 T PT 2588027T
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tissue
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PT118015049T
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Lynn Roach Marsha
Wang Yunfang
Cynthia Mcadams Reid Lola
Harold Malavarca Richard
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Univ North Carolina Chapel Hill
Lynn Roach Marsha
Harold Malavarca Richard
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Description

DESCRIÇÃO ESTRUTURAS DE BIOMATRIZ PARA DISPERSÃO À ESCALA INDUSTRIAL Campo da invenção
Esta invenção refere-se a estruturas de biomatriz e a métodos de produção de estruturas de biomatriz e sua utilização em diversas aplicações como estruturas intactas ou como estruturas que são seccionados ou pulverizados e dispersos de várias maneiras para usos experimentais e clínicos específicos.
Antecedentes da invenção A capacidade de utilizar células diferenciadas ex vivo ou em programas clínicos, tais como, terapias celulares depende da capacidade de manter as células com um fenótipo adulto e totalmente funcional ou ser capaz de limitar a linhagem de células estaminais ou progenitores ("estaminais/ progenitores") para atingir esse fenótipo adulto. A revolução em andamento da pesquisa com células estaminais tornou possível a identificação e isolamento de populações de células estaminais /progenitoras, incluindo as de tecidos embrionários, fetais e pós-natal1. A capacidade de identificar e isolar as estaminais/progenitores para todos os tipos de células adultas e expandir e diferenciá-las aumenta grandemente o potencial para as utilizar para programas de investigação farmacêutica e outros programas de investigação industrial, para investigações académicas e para programas clínicos, tais como, terapias baseadas em células e manipulação de tecidos2.
Os métodos correntes para manter células diferenciadas ou de células estaminais de restrição de linhagem a um destino adulto ex vivo são parcialmente bem sucedidos e envolvem o plaqueamento das células sobre ou incorporadas num substrato de um componente (s) de matriz extracelular e num meio compreendido por hormonas especificas, fatores de crescimento e nutrientes adaptados para o fenótipo adulto desejado. Para células estaminais muito primitivas, tais como, as células estaminais embrionárias (ES) ou as raízes pluripotentes induzidas (iPS) ou derivadas do pós-natal que podem ir para múltiplos destinos adultos, tais como células-estaminais mesenquimais ou células estaminais derivadas de líquido amniótico), as células estaminais são submetidas a uma mistura de sinais solúveis e/componentes de matriz extracelular e devem ser tratadas com múltiplos conjuntos destes sinais durante semanas. Tipicamente, o fenótipo adulto alcançado é distinto em cada preparação e está acima ou abaixo da expressão de certos genes específicos de adultos e/ou regulação aberrante dum ou mais genes específicos de tecidos de adultos. A matriz extracelular é segregada pelas células, é adjacente a elas numa ou mais das suas superfícies, e tem sido entendida há muito tempo como sendo o suporte estrutural das células7. É uma estrutura extraordinariamente complexa composta de uma variedade de moléculas biologicamente ativas que são altamente reguladas e críticas para determinar a morfologia, do crescimento e diferenciação das células unidas8. A expressão de genes específicos de tecidos em células cultivadas é melhorada pela cultura das células em extratos de matriz ou componentes de matriz purificados9. Contudo, os componentes individuais da matriz, sozinhos ou em combinação, são incapazes de recapitular a quimica e a arquitetura de matrizes complexas de um tecido. Isto está relacionado com o facto de os componentes da matriz estarem em gradientes associados a zonas de tecido natural e a estruturas histológicas tais como vasos sanguíneos. Esta complexidade da matriz de tecido é mais facilmente alcançada por extrações que descelularizam um tecido e deixam para trás a matriz como um resíduo10' 11. No entanto, os protocolos de descelularização acuais resultam em perdas importantes de algumas das componentes da matriz devido ao uso de enzimas ou tampões de degradação da matriz que solubilizam os componentes da matriz. É conhecido a partir da técnica anterior (Ross et al., J. Soc. Nephrol 2009, 20, 11, 2338-2347 e Shupe Organogenesis, 2010, 6, 2, 134-136) utilizar tratamentos com SDS e um Triton ou SDS sozinho (W02010/ 039823) . No entanto, estes detergentes ásperos podem danificar a matriz extracelular. A presente invenção proporciona estruturas de biomatriz e métodos de fabrico e utilização de tal estrutura de biomatriz. Os métodos desta invenção resultam na produção de um extrato específico de tecido enriquecido numa maioria dos colagénios do tecido e com componentes de matriz ligados e hormonas ligadas à matriz, fatores de crescimento e citoquinas que coletivamente produzem efeitos de diferenciação mais reproduzíveis e potentes sobre ambas as células maduras e na restrição de linhagem de populações de células estaminais/progenitoras.
Sumário da invenção A presente invenção proporciona, num aspeto, um método de produção de uma estrutura de biomatriz a partir de tecido hepático de mamífero para dispersão (por exemplo, dispersão 'Aa escala industrial utilizando volumes como descrito, por exemplo, nos protocolos estabelecidos no Exemplo 2) em aparelhos de cultura compreendendo: a) perfusão ou homogeneização do tecido hepático com um tampão compreendendo uma concentração de sal a partir de cerca de 3,5 M de NaCl a cerca de 4,5 M de NaCl; b) perfusão do tecido biológico ou extração do homogeneizado do passo (a) com um tampão de deslipificação compreendendo deoxilato de sódio e fosfolipase A2 num primeiro meio, em que a osmolidade do dito primeiro meio é de cerca de 250 mOsm/kg a cerca de 350 mOsm/kg e o dito primeiro meio é livre de soro e a um pH neutro; depois c) perfusão do tecido ou extração do homogeneizado do passo (b) com um tampão a um pH neutro e compreendendo uma concentração de sal de cerca de 2,0 M NaCl a cerca de 5,0 M, a concentração escolhida para manter os colagénios insolúveis identificados no tecido biológico; depois d) perfusão do tecido ou extração do homogeneizado do passo (c) com ARNase e ADNase num tampão; e depois e) enxaguar o tecido ou homogeneizado do passo (d) com um segundo meio que está a pH neutro, está isento de soro e tem uma osomolidade de cerca de 250 mOsm/kg a cerca de 350 mOsm/kg, f) diluir a estrutura de biomatriz em meio basal; g) congelar a estrutura de biomatriz do passo (f) a cerca de - 8 0 ° C ; h) pulverizar a estrutura de biomatriz do passo (g) através de moagem criogénica em partículas de biomatriz variando em tamanho de cerca de 1 pm a cerca de 100 pm; i) descongelar as partículas de biomatriz do passo (h) em meio basal; e j) dispersar as partículas de biomatriz do passo (i) num aparelho de cultura, produzindo, deste modo, uma estrutura de biomatriz de tecido biológico para dispersão (por exemplo, dispersão à escala industrial, como aqui descrito) num aparelho de cultura. A presente invenção descreve, ainda, estruturas de biomatriz produzidas através dos métodos desta invenção.
Este e outros aspetos da presente invenção serão agora descritos em mais detalhe em relação a outras formas de realização aqui descritas. Será apreciado que a invenção pode ser realizada de diferentes formas e não deve ser construída para limitar as formas de realização aqui estabelecidas. Em vez disso, essas formas de realização são fornecidas de modo a que esta descrição seja precisa e completa, e abrange completamente o âmbito da invenção para os peritos na técnica.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
Figuras 1A-E1. Preparação de estrutura de biomatriz de fígado de rato. (A) Processo de decelularização em quatro passos compreendendo uma lavagem de perfusão, delipidação com PLA2 e SDC, lavagens com sal elevado e tratamento de nucleasse para a remoção de ácido nucleico(B-D). Quatro etapas na preparação da estrutura de biomatriz de rato. (B) após perfusão lavar com meio basal durante 10 minutos o fígado fica pálido; (C) durante a deslipidação, o fígado torna-se parcialmente transparente sob GC (D) a estrutura intacta final parece transparente a 40 minutos de perfusão; (E) a estrutura de biomatriz mostrada com baixa ampliação. (El) A visualização da estrutura perfundida com partículas de dextrano marcadas com rodamina demonstra o fluxo progressivo de grandes vasos para os ramos finos dos vasos sanguíneos ao longo dos canais sem vazamento, indicando a vasculatura patente nas estruturas. Hematoxilina e eosina correspondentes (Η & E) de biomarcador em diferentes estádios demonstraram que as estruturas histológicas como vasos sanguíneos e matrizes em forma de renda envolvendo o parênquima são preservadas, ao passo que as células são removidas. A estrutura da tríada portal hepática normal de rato constituída pela veia porta (PV), artéria hepática (HA) e duto biliar (BD) (Bl); as fibras da matriz tornando-se aparentes à medida que as células são gradualmente removidas durante o processo de descelularização (Cl); Região da tríada portal descelularizada, comparar (Bl) com a de (Dl); D2 e D3 mostram que todas as células são removidas da estrutura de matriz, mas as estruturas de malha são preservadas, tais como os vasos sanguíneos, GC e a matriz em forma de renda que rodeia muralia de células parenquimatosas.
Figuras 2A-H. Imagens de TEM (A-C) e SEM (D-H) de estruturas de biomatriz de fígado de rato. (A) Baixa ampliação do vaso sanguíneo (BV) com uma parede espessa (W). 0 colagénio tipo I (cabeça de flecha grande) é numeroso e contém secções transversais de fibras individuais que não ocupam manchas de metal pesado (pontos brancos, pontas de flecha pequenas) . (B) Maior ampliação da parede de um vaso mostra a membrana basal (seta grande), elastina amorfa (*) e fibras elásticas associadas, um remanescente de vesícula de membrana rara (pequena ponta de seta), uma fibra de colagénio tipo I (cabeça de seta) e pequenas fibrilhas Pequenas setas). As pequenas fibrilas são provavelmente fibrilina (colagénio tipo VI) que se associa estreitamente com e ajuda a organizar o colagénio tipo I. (C) Aumento elevado do colagénio Tipo I com padrão de bandagem de 64 nm (setas) . (D) Baixa ampliação de um vaso com parede fina (BV) e parede de um vaso maior (W) . (E) A maior ampliação, a parede do vaso grande (W) é festonada, consistente com a artéria hepática de uma tríade portal, ver (A) . Debaixo da parede existem numerosos feixes de colagénio de Tipo I (seta grande) ligados por fibrilas de colágeno finas, reticulares (Tipo III) de ramificação longa (setas pequenas). (F) Um grande feixe de colagénio Tipo I possui fibras paralelas características (seta grande) associadas a uma variedade de fibras menores (seta) e fibras nodulares ou frisadas (ponta de seta). (G) malha 3D de fibras grandes/pequenas interligadas num plano que forma uma fronteira tal como uma sinusoide hepática. (H). Maior ampliação da malha mostrando uma variedade de fibras (setas): colagénio tipo III (maior diâmetro reto), fibras elásticas ou colagénio Tipo VI.
Figuras 3A-B. Análise química de colagénios e expressão de componentes de matriz extracelular (ECM) em estruturas de biomatriz. (A) O teor de três aminoácidos, todos encontrados em colagénios: hidroxiprolina (Hyp), hidroxilisina (Hyl) e glicina (Gly). Os números representam os resíduos de cada aminoácido/1000 aminoácidos. Os dados indicam o aumento dramático no conteúdo de colagénio no processo de descelularização, passando de <0,2% no fígado para mais de 15% nas estruturas de biomatriz. (B) A coloração imuno-histoquímica de moléculas de matriz em estruturas de biomatriz, mostra distribuição em estruturas de biomatriz de biomassa de laminina (LAM), sulfato de heparano (HS), colagénio tipo III (COL3) e fibronectina (FN) e proteínas típicas da membrana basal em associação com remanescentes dos vasos sanguíneos. Com maior ampliação, (FN) e proteínas de membrana basal típicas, incluindo colagénio tipo IV (C0L4), entactina (Ent; também chamado de nidogénio) , laminina (LAM) e perlecan (Per), uma forma de HS-PG na porção das estruturas perto das tríades portal.
Figuras 4A-D. Padrão de componentes ECM da tríade portal à veia central em estruturas de biomatriz. Comparação histológica da tríade portal (zona 1) com a veia central (zona 3) do fígado normal (A) e estrutura de biomatriz do fígado (B) ; ambas são secções coradas com hematoxilina/ eosina. (C) 0 modelo gue ilustra uma célula estaminal um sistema de linhagem maturacional no fígado com componentes representativos da matriz mostrados que formam padrões associados à zonação hepática. Os componentes são listados em ordem de abundância a partir dos achados de imuno-histoquímica. Os estádios de linhagem conhecidos no fígado humano começam periportalmente na zona 1 (em torno das tríades portal) e o progresso na maturação termina com as células apoptóticas na zona 3. A química da matriz conhecida identificada nos nichos de células estaminais do fígado, é composto de hialuronans, colagénio tipo III, uma forma de laminina que se liga a oí 6β4 integrina, e uma forma fracamente sulfatada de CS-PG43'44. Apenas fora do nicho de células estaminais são encontrados colagénio Tipo IV, CS-PGs e HS-PGs normalmente sulfatados e formas de ligação da laminina à integrina αβί. HP-PGs foram documentados para ser localizado exclusivamente pericentralmente45'46. (D) 0 levantamento de componentes da matriz e sua localização no fígado versus aqueles em estruturas de biomatriz, dados resumidos a partir de achados de imunohistoquímica (N/D = não testado * encontrado por outros para ser exclusivamente perto de veias centrais). A maioria dos componentes do citoesqueleto são perdidos durante as lavagens, os resíduos de algumas, mas não todas, as proteínas do citoesqueleto estão presentes. As estruturas são desprovidas de quantidades detetáveis de tubulina, desmina e actina (ensaios de faloidina). No entanto, existem quantidades vestigiais de citoqueratinas espalhadas aleatoriamente nas estruturas; vestígios de α-actina do músculo liso em torno dos remanescentes dos vasos sanguíneos nas tríades portal; e baixos níveis de vimentina por toda parte.
Figuras 5E-I. Caracterização de hHpSCs em estruturas de biomatriz de fígado versus colagénio de tipo 1. As imagens de contraste de fase (A-D) mostram as alterações morfológicas de colónias de hHpSC derivadas do mesmo fígado e cultivadas em meio de Kubota livre de soro e em plástico de cultura de tecido (A), uma das condições para autorreplicação, versus nas condições de diferenciação do meio de diferenciação sem soro para o fígado, e no colagénio tipo I (B) versus em estruturas de biomatriz de fígado bovino (C-E). Culturas funcionais e totalmente viáveis não duraram mais do que ~ 2 semanas em colagénios de tipo I. Em contraste, os biomarcadores do fígado foram viáveis e saudáveis e com um repertório completo de funções que duraram pelo menos um mês. As culturas transitaram para as células aos dias 7-12 com aumento da razão citoplasmática/nuclear e expressão marcada de glicogénio (C) e depois com os de morfologia clássica de hepatócitos poligonais intercalados por canalículos claros (D), uma morfologia da cultura que persistiu posteriormente, tal como indicado na cultura representativa ao dia 24 (E) . Os ensaios de RT-PCR mostram as alterações da expressão de genes de hHpSCs sob condições de autorreplicação em plástico de cultura (F) versus em estruturas de biomatriz de fígado de rato no dia 7 (G). Comparou-se a expressão de marcadores de hHpSC, incluindo CXCR4 e EpCAM; Genes hepatociticos precoces incluindo CK19 (KRT19), HNF6, F0XA2, AFP e baixos niveis de albumina; Marcadores hepatociticos maduros incluindo niveis elevados de albumina (ALB), Transferrina (TF), CYP450-3A4, tirosina aminotransferase (TAT) e glicose-6-fosatase (G6PC) e genes colangiociticos, incluindo CFTR, gamma glutamil transpeptidase (GGT1), troca aniónica 2 (AE2) e ácido transportador de sódio apical (ASBT). Ensaios bioquímicos medindo a ureia (H) sintetizada em culturas em colagénio de tipo I versus em matrizes de biomatriz de fígado de rato e atividade (I) de CYP450-3A4 em culturas em colagénio de tipo I versus em estruturas de biomatriz preparados a partir de fígados de rato ou de bovino. A Tabela 7 apresenta um resumo das medidas quantitativas que comparam o apego, a viabilidade, o crescimento, o tempo de vida da cultura e a expressão genética específica de tecido de hHpSCs recentemente isolados, em condições de cultura para autorreplicação (colagénio de tipo III)
Figuras 6A-D. Marcação por imunofluorescência de linhagem de células restrita a hHpSCs em estruturas de biomatriz. (A) Coloração com marcador específico hepático: albumina (Alb, cinza claro) e marcador de superfície de células estaminais hepáticas: EpCAM (branco). Note-se que as células plaqueadas em estruturas de biomatriz não expressam EpCAM. Barra de escala = 200pm. (B) Manchada com o marcador hepático precoce a-fetoproteína (AFP, cinza claro) e com um anticorpo para o marcador de colangiocitos humanos, citoqueratina 19 (CK19, branco) que a este nível de expressão é indicativa de colangiocitos maduros. 0 anticorpo para o ensaio de CK19 é humano-específico e não mancha o resíduo na CK19 de rato nas estruturas não semeadas com células. A expressão de AFP é baixa mas ainda evidente no dia 7. Barra de escala = 200μπι. (C) Colorido com Alb (cinza claro) e marcador de células estreladas hepáticas, A-actina do músculo liso (ASMA, branco) . A expressão de albumina e ASMA é uma forte indicação de que ambos os hepatócitos em maturação e as células estreladas estão presentes. Barra de escala = ΙΟΟμπι. (D) Manchado com proteína hepática funcional CYP450-3A4 (cinza claro) e marcador específico de colangiocitos, recetor de secretina (SR, branco) mostrando que os hepatócitos e colangiocitos de maturação são funcionais e expressam marcadores clássicos para estes dois tipos de células. Barra de escala = 200μιη. branco), mostrando que os hepatócitos e colangiocitos de maturação são funcionais e expressam marcadores clássicos para estes dois tipos de células. Barra de escala = 200pm.
Figuras 7A-D. Estabilidade de hepatócitos humanos plenamente funcionais e maduros em estruturas de biomatriz. Os hepatócitos humanos adultos foram colocados no meio de diferenciação e no colagénio tipo I (A, B) versus em estruturas de biomatriz de fígado bovino (C) que foram criogenicamente pulverizados, dispersos em meio e deixados sedimentar nas placas. As células do colagénio de tipo I são totalmente viáveis e no seu pico de diferenciação de 7-12 dias (A- mostrado a 7 dias); começam a se deteriorar após ~ 2 semanas, e por 20 dias (B) estão mortos, a morrer e não funcionais. Pelo contrário, os revestidos em estruturas de biomatriz de fígado (C) são funcionais durante pelo menos 8 semanas (tempos mais longos ainda não foram avaliados); aqui é mostrado após 21 dias em cultura em estruturas de biomatriz de fígado pulverizado. Ensaios de CYP450-3A4 em culturas de duas preparações separadas de células hepáticas humanas criopreservadas humanas colocadas em estruturas de biomatriz versus colagénio de tipo I e ensaiadas no dia 12 (D) . A amostra ZHep-007 é representativa de amostras criopreservadas com boa ligação após descongelação; A amostra ZL-013 é representativa dos lotes que têm fraca ou nenhuma ligação após a descongelação. Assim, mesmo estas amostras de qualidade mais pobre são capazes de se ligar a estruturas de biomatriz e permanecer viáveis a longo prazo. Em ambas as amostras ensaiadas, os níveis de P450 são mais elevados quando cultivados em estruturas de biomatriz de fígado. Com o tempo nas estruturas de biomatriz, os lotes de células criopreservadas de qualidade mais pobre irão melhorar.
Figura 8. Ativação da fosfolipase A2 por desoxicolato de sódio para produzir lisolecitina. Princípio do protocolo: A fosfolipase A2 (PLA2), ativada pelo desoxicolato de sódio, degradará o fosfoglicérido localizado na membrana citoplasmática e membrana mitocondrial em lisolecitina, um tensioativo poderoso, que induz a necrose celular.
Figura 9. Análise da composição de colagénio de fígados de ratos versus estruturas de biomatriz de fígado de rato. A composição de aminoácidos da biomatriz (preta) e fígado inteiro (cinza claro) apresentou-se sob a forma de um diagrama de rosa. Uma abreviatura de três letras é usada para cada aminoácido analisado. 0 triptofano e a cisteína não foram analisadas. Os números indicam os resíduos de aminoácidos/1000.
Figuras 10A-C. Análise de ácido nucleico de estrutura de biomatriz de fígado de rato. Foto de contraste de fase (A) e coloração DAPI fluorescente (B) do slide de biomatriz de fígado, e ensaios quantitativos sobre ADN total e ARN de tecido de fígado fresco de rato versus estrutura de biomatriz (C) .
Figuras 11A-C. Coloração da estrutura de biomatriz após colocação de hHpSCs sobre a estrutura de biomatriz. Ensaio de vivo (calceína-AM, branco) /morto (brometo de etídio ou ETD-Bri, cinzento claro) indica colónias hHpSCs que eram viáveis em secções da estrutura de biomatriz, mas não tomaram corante no meio das colónias (A, B) para os primeiros dias devido às bombas conhecidas nas células estaminais (por exemplo, MDRl) que eliminam os corantes vitais. Em (B) a imagem de fluorescência é fundida com a fase um para indicar que o centro da colónia contém células. Ao dia 7, as células em toda a colónia tinham diferenciado e tomaram o corante vital em quase todas as células ao longo da colónia (C).
Figuras 12A-F. Comparação de hepatócitos de rato cultivados em colagénio de tipo I a hepatócitos de rato cultivados em estruturas de biomatriz de fígado de rato. Os hepatócitos de rato adultos foram cultivados em colagénio tipo I e estrutura de biomatriz no dia 3 (A, C) e dia 10 (B, D) . Ligaram-se dentro de vários minutos em estruturas de biomatriz de fígado e sobreviveram por tanto tempo quanto testado, mais de 8 semanas (C, D); Períodos de tempo mais longos não foram testados. As culturas são muito tridimensionais nas estruturas de biomatriz. Síntese de ureia (E) e ensaio de viabilidade celular (F) ao dia 1, 3, 5, 7, 10, 14, 21 e 28, n = 3.
Figuras 13A-D. Comparação de um pâncreas humano com uma estrutura de biomatriz pancreática humana. Pâncreas humano (A) versus estrutura de biomatriz pancreática humana (BD) incorporada em parafina, seccionada e corada com hematoxilina e eosina (Η &amp; E). Estruturas de ilhotas foram expostas nos B. As regiões acinares de estruturas de biomatriz pancreáticas são mostrados em C e D.
Figura 14. Comparação de componentes representativos da matriz e um componente do citoesqueleto, vimentina, encontrado no tecido pancreático humano versus estruturas de biomatriz pancreáticas de ratos. Outros componentes do citoesqueleto (desmina, tubulina, actina) não foram encontrados em quantidades detetáveis ou foram encontrados em vestígios (citoqueratinas). As linhas tracejadas circundam ilhotas, note-se que syndecanl e colagénio tipo VI são fortemente positivos nas ilhotas, tanto no tecido pancreático como em estruturas de biomatriz. 0 Syndecan 1 encontra-se apenas nas ilhotas (linha tracejada) mas não nas células acinares (setas); Colagénio tipo III é mais enriquecido em células acinares e em torno de vasos sanguíneos (setas), mas não nas ilhotas.
Figuras 15A-C. Marcação histológica e imuno-histoquimica da estrutura de biomatriz de duodeno humano. (A) Lado externo e lúmen da estrutura de biomatriz do duodeno humano. Compararam-se as estruturas multicamadas entre o tecido normal (B) e a estrutura de biomatriz (C) em secções coradas com Η &amp; E e os resultados mostraram que os estruturas retinham as vilosidades e vasos sanguíneos nas camadas de mucosa e submucosa. Os painéis inferiores mostram a coloração imunohistoquímica da estrutura de biomatriz do duodeno humano indicou quantidades variáveis de proteínas da matriz extracelular retidas na estrutura.
Figuras 16A-D. Comparação de um tecido da vesícula biliar humana com uma estrutura de biomatriz da vesícula biliar humana. Tecido da vesícula biliar humana (A, B) versus estruturas de biomatriz (C, D) preparadas a partir dele. 0 tecido e as estruturas de biomatriz foram incorporadas em parafina, seccionadas e coradas com hematoxilina e eosina.
Figura 17. Exemplo de preparação de uma solução de biomatriz para diluição 1:24. 30 ml x 3 = 90 ml de biomatriz + 90 ml de Solução 5 = 120 ml de solução de biomatriz para diluição 1:24.
Descrição detalhada da invenção A presente invenção será agora descrita mais completamente a seguir. Esta invenção pode, no entanto, ser realizada em formas diferentes e não deve ser interpretada como limitada às formas de realização aqui estabelecidas. Em vez disso, estas formas de realização são proporcionadas de modo que esta descrição seja precisa e completa e irá transmitir completamente o âmbito da invenção para os especialistas na técnica. A terminologia utilizada na descrição da presente invenção é para o propósito de descrever apenas formas de realização particulares e não se pretende que seja uma limitação da invenção. Tal como é usado na descrição da invenção e nas reivindicações anexas, as formas singulares "a", "um" e "o" pretendem incluir também as formas plurais, a menos que o contexto indique claramente o contrário.
Salvo definição em contrário, todos os termos (incluindo termos técnicos e científicos) aqui utilizados têm o mesmo significado que o entendido vulgarmente por um especialista na técnica à qual pertence esta invenção. Deve entender-se ainda que termos, tais como os definidos em dicionários vulgarmente utilizados, devem ser interpretados como tendo um significado que seja consistente com o seu significado no contexto do presente pedido e da arte relevante e não deve ser interpretado de uma forma idealizada ou excessivamente formal, a menos que expressamente assim definido aqui. A terminologia utilizada na descrição da presente invenção é para o propósito de descrever apenas formas de realização particulares e não se pretende que seja uma limitação da invenção.
Também como aqui utilizado, "e/ou" refere-se e engloba qualquer e todas as combinações possíveis de um ou mais dos itens listados associados, assim como a falta de combinações quando interpretada na alternativa ("ou"). A menos que o contexto indique o contrário, pretende-se especificamente que as várias características da invenção aqui descritas possam ser utilizadas em qualquer combinação. Além disso, a presente invenção também contempla que em algumas formas de realização da invenção, qualquer característica ou combinação de características aqui descritas pode ser excluída ou omitida. Para ilustrar, se a especificação indicar que um complexo compreende os componentes A, B e C, pretende-se especificamente que qualquer de A, B ou C, ou uma combinação dos mesmos, possa ser omitido e excluído singularmente ou em qualquer combinação.
Tal como aqui utilizado, a frase de transição "consistindo essencialmente em" (e variantes gramaticais) deve ser interpretada como englobando os materiais ou passos descritos "e aqueles que não afetam materialmente as características básicas e novas" da invenção reivindicada. Ver, In re Herz, 537 F.2d 549, 551-52, 190 USPQ 461, 463 (CCPA 1976) (ênfase no original); Ver também MPEP § 2111.03. Assim, o termo "consistindo essencialmente de" tal como aqui utilizado não deve ser interpretado como equivalente a "compreendendo". 0 termo "cerca de," tal como aqui utilizado, quando se refere a um valor mensurável tal como uma quantidade ou concentração (por exemplo, a percentagem de colagénio no total de proteínas na estrutura de biomatriz) e semelhantes, destina-se a englobar as variações de 20%, 10%, 5%, 1%, 0,5% ou mesmo 0,1% da quantidade especificada. A presente invenção é dirigida à descoberta e desenvolvimento de uma estrutura de biomatriz que tem melhorias e vantagens inesperadas sobre estruturas de tecido descelularizados agora conhecidos, sendo alguns exemplos do aperfeiçoamento e vantagem a utilização da estrutura de biomatriz desta invenção para manter eficientemente células maduras e/ou à linhagem restringem e/ou diferenciam as células estaminais a destinos maduros e/ou mantêm tais células maduras como funcionais durante um período prolongado de tempo. Como outro exemplo, a utilização das estruturas de biomatriz desta invenção reduz o tempo para produzir células de destinos maduros de cerca de três a seis semanas ou mais a cerca de uma a duas semanas. As estruturas de biomatriz desta invenção são produzidos utilizando protocolos específicos que empregam o equilíbrio apropriado de concentração de sal e força iónica (diferentes colagénios têm constantes de solubilidade diferentes (23)) para um dado tecido, para permitir a retenção de colagénios nativos presentes nesse tecido em forma insolúvel, resultando numa estrutura de biomatriz que retém uma alta percentagem de colagénios nativos que fornecem sinais para conduzir a restrição e diferenciação da linhagem. Em contraste, estruturas descelularizados produzidas de acordo com protocolos conhecidos não empregam um tal balanço de concentração de sal e força iónica para permitir a retenção de uma percentagem elevada destes colagénios nativos e a maioria destes colagénios nativos são perdidos quando estes protocolos conhecidos são utilizados. Além disso, as estruturas de matrizes desta invenção permitem a produção de vírus dependentes da linhagem (por exemplo, diferenciação dependente) e/ou patogénios em quantidade suficiente para utilização experimental e/ou terapêutica (por exemplo, para a produção de vacinas).
Deste modo, numa forma de realização, a presente invenção proporciona um método para produzir um estrutura de biomatriz a partir de tecido hepático de mamífero, compreendendo os passos de: a) perfusão ou homogeneização do tecido hepático com um primeiro meio, em que a osmolalidade do referido primeiro meio é de cerca de 250 mOsm/kg a cerca de 350 mOsm/ kg e o referido primeiro meio é isento de soro e a pH neutro; depois b) perfusão do tecido biológico ou extração do homogeneizado do passo (a) com um tampão de deslocamento compreendendo desoxicolato e fosfolipase A2 no referido primeiro meio; c) perfusão do tecido ou extração do homogeneizado do passo (b) com um tampão a um pH neutro e compreendendo uma concentração de sal de cerca de 2,0 M NaCl a cerca de 5,0 M, a concentração escolhida para manter os colagénios insolúveis identificados no tecido biológico; depois d) perfusão do tecido ou extração do homogeneizado do passo (c) com ARNase e ADNase num tampão; e depois e) enxaguar o tecido ou homogenato do passo (d) com um segundo meio que está a pH neutro, está isento de soro e tem uma osomolidade de cerca de 250 mOsm/kg a cerca de 350 mOsm/kg, produzindo deste modo uma estrutura de biomatriz intacta ou homogeneizada do tecido biológico, compreendendo pelo menos 95% (por exemplo, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100%) dos colagénios e a maioria dos componentes de matriz associados ao colagénio e fatores de crescimento ligados à matriz, hormonas e citoquinas do tecido biológico não processado. Também aqui proporcionado é uma estrutura de biomatriz produzido por qualquer dos métodos desta invenção. "Estrutura de biomatriz", tal como aqui utilizado, refere-se a um extrato de tecido isolado enriquecido em matriz extracelular, como aqui descrito, que retém muitos ou a maioria dos colagénios e fatores ligados ao colagénio encontrados naturalmente no tecido biológico. Em algumas formas de realização, essencialmente todos os colagénios e fatores ligados ao colagénio são retidos e noutras formas de realização a estrutura de biomatriz compreende todos os colagénios conhecidos por estarem no tecido. A matriz de biomatriz pode compreender pelo menos cerca de 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%.
Exemplos de colagénios incluem todos os tipos de colagénio, tais como, mas não se limitando a, colagénios de Tipo I a Tipo XXIX. A estrutura de biomatriz pode compreender, pelo menos, cerca de 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou mais de um ou mais dos colagénios encontrados no tecido biológico natural e/ou podem ter um ou mais dos colagénios presentes numa concentração que é, pelo menos, cerca de 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95 %, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou mais do encontrado no tecido biológico natural. A quantidade de colagénio na estrutura de biomatriz pode ser determinada por vários métodos conhecidos na técnica e como aqui descrito, tal como, mas não se limitando a, a determinação do teor de hidroxiprolina.
Exemplos de componentes de matriz associados ao colagénio incluem, mas não estão limitados a, moléculas de adesão; Proteínas de adesão; L- e P-selectina; Molécula associada ao crescimento de ligação à heparina (HB-GAM); Repetição de trombospondina tipo I (TSR); Amiloide P (AP); Lamininas; Nidogénios/entactinas; Fibronectinas; Elas tinas; Vimentinas; Proteoglicanos (PGs); Sulfato de condroitina-PGs (CS-PGs); Dermatan sulfato-PGs (DS-PGs); Membros da família de proteoglicanos ricos em leucina (SLRP), tais como biglicano e decorinas; Heparina-PGs (HP-PGs); Sulfato de heparan-PGs (HS-PGs) tais como glicanos, syndecans e perlecans; e glicosaminoglicanos (GAG) tais como hialuronanos, sulfatos de heparano, sulfatos de condroitina, sulfatos de queratina e heparinas. Em algumas formas de realização, a estrutura de biomatriz compreende, consiste em, ou consiste essencialmente em colagénios, fibronectinas, lamininas, nidogénios/entactinas, Elastinas, proteoglicanos, glicosaminoglicanos, fatores de crescimento, hormonas e citoquinas (em qualquer combinação) ligadas a vários componentes da matriz. A estrutura de biomatriz pode compreender, pelo menos, cerca de 50%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99,5% componentes de matriz associados, hormonas e/ou citoquinas encontradas no tecido biológico natural e/ou podem ter um ou mais destes componentes presentes numa concentração que é, pelo menos, cerca de 50%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou mais do encontrado no tecido biológico natural. Em algumas formas de realização, a estrutura de biomatriz compreende todos ou a maioria dos componentes de matriz associados ao colagénio, hormonas e/ou citoquinas conhecidas por estarem no tecido biológico natural (por exemplo, cerca de 50%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 100% da concentração encontrada no tecido natural).
Os fatores de crescimento exemplificativos incluem, mas não estão limitados a fatores de crescimento de fibroblastos (FGFs), fatores de crescimento nervoso (NGFs), fatores de crescimento epidérmico (EGFs), fatores de crescimento transformadores, fatores de crescimento de hepatócitos (HGFs), fatores de crescimento derivados de plaquetas (PDGFs), fatores de crescimento semelhantes a insulina (IGF) , proteínas de ligação a IGF, fatores de crescimento de fibroblastos básicos e fatores de crescimento endotelial vascular (VEGF) . Exemplos de citoquinas incluem, mas não estão limitadas a interleucinas, linfocinas, monocinas, fatores estimuladores de colónias, quimiocinas, interferões e facto de necrose tumoral (TNF). A estrutura de biomatriz pode compreender, pelo menos, cerca de 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99,5% 100% ou mais (em qualquer combinação) de um ou mais dos fatores de crescimento ligados à matriz e/ou citoquinas encontradas no tecido biológico natural e/ou pode ter um ou mais destes fatores de crescimento e/ou citoquinas (em qualquer combinação) presente a uma concentração que é de, pelo menos, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 100% ou mais do encontrado no tecido biológico natural. Em algumas formas de realização a estrutura de biomatriz compreende níveis fisiológicos ou níveis quase fisiológicos de muitos ou a maioria dos fatores de crescimento ligados à matriz, hormonas e/ou citoquinas conhecidas por estarem no tecido natural e/ou detetadas no tecido e noutras formas de realização a estrutura de biomatriz compreende um ou mais dos fatores de crescimento ligados à matriz, hormonas e/ou citoquinas a concentrações próximas das concentrações fisiológicas encontradas no tecido biológico natural (por exemplo, diferindo em não mais de cerca de 30%, 25%, 20%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5% em comparação). A quantidade ou concentração de fatores de crescimento ou citoquinas presentes na estrutura de biomatriz pode ser determinada por vários métodos conhecidos na arte e como aqui descritos, tais como, mas não limitados a vários ensaios de anticorpos e ensaios de fator de crescimento. "Tecido biológico", tal como aqui utilizado, refere-se a qualquer tecido de um organismo vivo ou falecido ou qualquer tecido derivado de um organismo vivo ou falecido. 0 termo "tecido biológico natural" e suas variações, tal como aqui utilizados, referem-se ao tecido biológico tal como existe no seu estado natural ou não modificado no organismo. As estruturas de biomatriz podem ser preparadas a partir de qualquer tecido biológico. 0 tecido biológico pode incluir qualquer tecido único (por exemplo, uma coleção de células que podem estar interligadas) ou um grupo de tecidos que compõem um órgão ou parte ou região do corpo de um organismo. 0 tecido pode compreender um material celular homogéneo ou pode ser uma estrutura compósita tal como a encontrada em regiões do corpo incluindo o tórax que, por exemplo, pode incluir tecido pulmonar, tecido esquelético e/ou tecido muscular.
Exemplos de tecidos biológicos incluem figado, pulmão, tiroide, pele, pâncreas, vasos sanguíneos, bexiga, rins, cérebro, árvore biliar, duodeno, aorta abdominal, veia ilíaca, coração e intestinos, incluindo qualquer combinação destes. 0 organismo (isto é, sujeito) do qual o tecido biológico está associado ou derivado pode ser qualquer animal, incluindo mamíferos e não mamíferos, tais como, invertebrados.
Os sujeitos exemplificativos incluem, mamíferos, tais como, mas não se limitando a, seres humanos, ratinhos, ratos, furões, hamsters, coelhos, cobaias, porcos, porcinos, cães, gatos, cavalos, vacas, ovelhas, macacos e chimpanzés. Pode ser de qualquer idade e/ou tamanho. 0 tecido biológico pode ser saudável, doente, e/ou ter mutações genéticas. Em algumas formas de realização as estruturas de biomatriz da presente invenção são específicas de tecidos na sua química e funcionalidade, isto é, as estruturas de biomatriz são representativas ou comparáveis ao tecido biológico a partir do qual foram criados em termos de sua química e funcionalidade.
Em algumas formas de realização, a histologia nativa e as vasculaturas patentes são mantidas nas estruturas de biomatriz. Isto pode incluir os restos reconhecíveis das principais entidades histológicas do tecido biológico, tais como, mas não se limitando a, vasos sanguíneos e outra vasculatura para qualquer tecido; duetos biliares e cápsula de Glisson (GC) do fígado; duetos pancreáticos, ilhotas e acini do pâncreas; Brônquios, traqueia e alvéolos dos pulmões, etc. Em outras formas de realização, a química da estrutura de biomatriz é adaptada à histologia (por exemplo, a matriz em torno dos vasos sanguíneos é distinta da que se encontra em torno dos hepatócitos). Em algumas formas de realização, a química da estrutura de biomatriz está num gradiente que está correlacionado com a histologia. Por exemplo, quando o tecido biológico é o fígado, o biomarcador pode reter o gradiente na química da matriz que se correlaciona com as zonas acinares hepáticas 1-3 da tríade portal à veia central e com entidades histológicas como canais vasculares e cápsula de Glisson. Outros exemplos incluem, mas não estão limitados a, vasos sanguíneos onde a quimica da matriz ao redor dos vasos sanguíneos está repleta com níveis elevados de colágenos em rede (por exemplo, tipo IV e tipo VI) , elastinas e formas de HS-PGs; em torno dos hepatócitos na zona periportal (zona 1), onde os laminins são altos em concentração juntamente com uma mistura de CS-PGs e HS-PGs, enquanto em torno da zona pericentral (zona 3), são hepatócitos rodeados por uma mistura de HS-PGs e HP-PGs; associadas às vias biliares onde existem níveis elevados de colagénio tipo I, fibronectinas e formas de CS-PGs e DS-PGs. Existem gradientes paralelos na química da matriz em todos os tecidos.
Existem vários meios de enxaguamento, tais como o primeiro e segundo meios, e tampões que podem ser utilizados na presente invenção. Em particular, pode ser utilizado qualquer meio de enxaguamento ou tampão que mantenha os colagénios e fatores ligados (por exemplo, componentes de matriz, fatores de crescimento e citoquinas) num estado insolúvel. Ao escolher um meio ou tampão, a concentração de sal, o pH e a força iónica devem ser adequados para manter os colagénios e/ou a maioria ou muitos dos componentes da matriz ligados ao colagénio e outros fatores (por exemplo, em virtude de suas conexões químicas diretamente ou indiretamente com os colagénios) num estado insolúvel. A Tabela 1 proporciona intervalos de concentrações molares de cloreto de sódio para vários tipos de colagénio para ajudar um especialista na técnica a fornecer meios e tampões que assegurem que os colagénios, componentes de matriz associados ao colagénio e fatores de crescimento ligados à matriz e citoquinas permaneçam insolúveis. Deyl et al. ("Preparative procedures and purity assessment of collagen proteins", Journal of Chromatography B 790 (2003) 245-275) fornece ainda informação sobre a química do colagénio que pode facilitar a identificação das condições ótimas para a manutenção de colagénios e fatores ligados num estado insolúvel. A Tabela 1 demonstra que o pH é uma variável trabalhando em conjunto com a concentração de sal para definir a solubilidade. Com concentrações elevadas de sal, o pH pode ser neutro. Em algumas formas de realização da presente invenção, a concentração de sal escolhida é aquela que mantém todos os colagénios do tecido num estado insolúvel, não apenas um dos colagénios do tecido num estado insolúvel. Por exemplo, os colagénios conhecidos no fígado fetal são aqueles que são insolúveis em concentrações de sal de cerca de 4,5 M NaCl e aqueles em tecido hepático adulto que são insolúveis em concentrações de sal de cerca de 3,4 M-3,5 M NaCl. A osmolalidade de qualquer meio de enxaguamento e/ou tampões pode ser, por exemplo, de cerca de 200 mOsm/kg a cerca de 400 mOsm/kg, de cerca de 250 mOsm/kg a cerca de 350 mOsm/ kg, de cerca de 275 mOsm/kg a cerca de 325 mOsm/kg, ou de cerca de 300 mOsm/kg a cerca de 325 mOsm/kg, incluindo, sem limitação, quaisquer valores dentro destes intervalos não explicitamente aqui descritos. A água destilada e os tampões diluídos (por exemplo, com osmolalidade <100 mOsm/kg) resultarão na perda de quantidades significativas de colagénio, componentes de matriz associados ao colagénio e fatores de crescimento ligados à matriz e citoquinas. Assim, nalgumas formas de realização dos métodos desta invenção, água destilada e tampões diluídos não estão incluídos.
Como um especialista na técnica reconheceria, a osmolalidade é uma expressão da concentração osmótica de soluto por massa, enquanto a osmolaridade é por volume de solvente. Assim, a conversão de osmolaridade para osmolalidade pode ser feita multiplicando pela densidade de massa. A molaridade e a osmolaridade não são comumente usadas na osmometria porque são dependentes da temperatura. Isto é porque a água muda seu volume com a temperatura. No entanto, se a concentração de solutos é muito baixa, osmolaridade e osmolalidade são consideradas equivalentes. A osmolaridade de uma solução pode ser calculada a partir da seguinte expressão:
onde φ é o coeficiente osmótico, o que explica o grau de não idealidade da solução; n é o número de partículas (por exemplo, iões) nas quais uma molécula se dissocia; C é a concentração molar do soluto; e o índice i representa a identidade de um soluto particular. No caso mais simples φ é o grau de dissociação do soluto. Então, φ está entre 0 e 1, onde 1 indica 100% de dissociação. No entanto, φ pode também ser maior que 1 (por exemplo, para sacarose) . Para sais, os efeitos eletrostáticos levam a que φ seja menor do que 1 mesmo se ocorrer 100% de dissociação. A perfusão do tecido biológico com qualquer meio ou tampão pode ser conseguida forçando o meio ou tampão através da vasculatura relevante do tecido biológico. Por exemplo, se o tecido biológico for o fígado, então o meio ou tampão pode ser perfundido através da veia porta do fígado. Em alternativa, o meio ou tampão pode ser vertido sobre o tecido biológico e/ou deixado difundir através do tecido biológico. Por exemplo, o tecido biológico pode ser submerso e/ou dialisado no meio ou tampão permitindo que o meio ou tampão difundam através do tecido biológico. Enquanto submerso e/ou dialisado no meio ou tampão, a solução e o tecido biológico podem ser balançados, tal como num balancim, e/ou agitados. Em algumas formas de realização, o meio e os tampões são perfundidos através da vasculatura relevante do tecido biológico.
Em alternativa, o tecido pode ser homogeneizado no meio inicial e os tampões e meios utilizados depois disso são para a extração do homogeneizado. As versões homogeneizadas das estruturas de biomatriz são preparadas a partir de grandes órgãos (por exemplo, de tecidos de vaca ou porco), são então pulverizadas em pó a temperaturas de azoto liquido e o pó utilizado em pratos para estudos de cultura.
Em algumas formas de realização, o primeiro meio e/ou o segundo meio é um meio basal, tal como, mas não se limitando a, meio RPMI 1640, DME / F12, DME, F12, BME, DMEM, Waymouth ou William. Outros meios basais exemplificativos são conhecidos na técnica e estão comercialmente disponíveis. O primeiro meio e/ou o segundo meio pode compreender, consistir essencialmente ou consistir em componentes que são combinados para manter a maioria dos colagénios insolúveis e como moléculas nativas, tal como aqui descrito (por exemplo, pela combinação particular de osmolalidade e força iónica, assim como a ausência de soro). O primeiro meio e/ou o segundo meio pode compreender, consistir essencialmente ou consistir em componentes que são combinados para manter a maioria dos colagénios insolúveis e como moléculas nativas, como aqui descrito (por exemplo, pela combinação particular de osmolalidade e força iónica, bem como a ausência de soro). O primeiro meio e/ou o segundo meio pode compreender, consistir ou consistir essencialmente em constituintes presentes ou semelhantes ou imitar os presentes no fluido intersticial, tais como, mas não se limitando a água; sais tais como, mas não limitados a sais inorgânicos; vitaminas; minerais; aminoácidos tais como, mas não limitados a glicina, serina, treonina, cisteina, asparagina e/ou glutamina; açúcares; ácidos gordos; coenzimas; Hormonas; e neurotransmissores. Em certas formas de realização em que o primeiro meio e/ou o segundo meio compreende constituintes presentes ou semelhantes ou imitando os presentes no fluido intersticial, os constituintes podem produzir uma osmolalidade aproximadamente equivalente à osmolalidade do meio basal comercialmente disponível ou produzir uma osmolalidade de cerca de 250 MOsm/kg até cerca de 350 mOsm/kg. Em algumas formas de realização, o primeiro meio e/ou o segundo meio inclui meios que estão livres de soro, compreendem constituintes presentes no fluido intersticial e/ou têm uma osmolalidade de cerca de 250 mOsm/kg a cerca de 350 mOsm/kg. Esses meios também podem estar a pH neutro. A composição específica do primeiro meio e/ou do segundo meio é determinada, em formas de realização particulares, pelas constantes de insolubilidade dos colagénios do tecido biológico utilizado para fazer a estrutura de biomatriz, como será conhecido pelos peritos na técnica. 0 tampão de deslipidação da presente invenção deve ser eficaz e contudo suave. O tampão de deslipidação pode compreender, consistir ou consistir essencialmente em detergentes ou tensioativos, meio basal, sais e/ou lipases. Ao escolher componentes para o tampão de deslipidação, devem ser evitados detergentes ásperos (por exemplo, dodecilsulfato de sódio, TritonX-100) para minimizar a perda de componentes da matriz. Exemplos de detergentes incluem detergentes aniónicos, tais como sais de ácido desoxicólico, ácido 1-heptanossulfónico, N-laurilsarcosina, laurilsulfato, ácido 1-octano sulfónico e ácido taurocólico; detergentes catiónicos tais como cloreto de benzalcónio, cetilpiridinio, cloreto de metilbenzetónio e brometo de decameetónio; detergentes zwitteriónicos tais como alquil betainas, alquil amidoalquil betainas, N-dodecil-N, N-dimetil-3-amónio-l-propanossulfonato, e fosfatidilcolina; e detergentes não iónicos tais como a-D-glucopiranósido de n-decil, p-D-maltopiranósido de n-decil, p-D-maltósido de n-dodecilo, β-D-glucopiranósido de n-octilo, ésteres de sorbitano, -D-maltósido, tritões, Nonidet-P-40, Poloxamer 188 e qualquer um dos grupos Tween de detergentes; laurilsulfato de sódio; e desoxicolato de sódio. Em algumas formas de realização, o tampão de deslipidação compreende desoxicolato de sódio.
Exemplos de lipases incluem fosfolipases tais como fosfolipase A2, lipase pancreática humana, esfingomielinases, lipase lisossómica, lipase endotelial e lipase hepática. Em algumas formas de realização, o tampão de deslipidação compreende fosfolipase A2. Noutras formas de realização, o tampão de deslipidação compreende desoxicolato de sódio e fosfolipase A2. Esta combinação, em algumas formas de realização, pode compreender de cerca de 20 a cerca de 50 unidades/L de fosfolipase A2 e cerca de 1% de desoxicolato de sódio preparado num meio basal de pH neutro e isento de soro, que pode ser, por exemplo, o primeiro meio. A combinação de desoxicolato de sódio e fosfolipase A2 degrada rapidamente o fosfoglicérido localizado na membrana do citoplasma e membrana mitocondrial em lisolecitina, um tensioativo poderoso, que pode induzir necrose e citólise.
Como qualquer perito reconhecerá, a quantidade e o tipo de lipase e/ou detergente podem depender do tecido biológico. 0 passo de perfusão do tecido biológico com o tampão de deslipidação é realizado, em algumas formas de realização, até que o tecido se torne transparente. Noutras formas de realização, o passo de perfusão do tecido biológico com o tampão de deslipidação é levado a cabo até que a efusão se torne clara.
Em algumas formas de realização, evita-se uma exposição prolongada das estruturas de biomatriz a enzimas das células interrompidas uma vez que pode diminuir grandemente o teor de elastina e o teor de glicosaminoglicanos tais como sulfatos de heparano, sulfatos de condroitina, sulfatos de dermatano e heparinas que são locais nos quais as citoquinas e os fatores de crescimento se ligam. A exposição às enzimas das células interrompidas pode ser evitada, por exemplo, durante a deslipidação e/ou as subsequentes lavagens após a deslipidação. Em algumas formas de realização, a utilização de um inibidor de protéase e/ou controlo cuidadoso do pH, da temperatura e/ou do tempo pode ser empregue para limitar a atividade das protéases e/ou outras enzimas das células interrompidas.
Exemplos de inibidores de protéase incluem, mas não estão limitados a, inibidores de serina protéase tais como, mas não se limitando a antipaina, aprotinina, quimostatina, elastatinal, fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF), APMSF, TLCK, TPCK, leupeptina e inibidor de tripsina de soja; protéases de cisteina tais como mas não limitadas a IAA (ácido indoleacético) e E-64; inibidores da protéase aspártica tais como mas não se limitando a pepstatina e VdLPFFVdL; metaloproteases tais como, mas não se limitando a EDTA, 1,10-fenantrolina e fosforamodon; exopeptidases tais como, mas não limitadas a amastatina, bestatina, diprotina A e diprotina B; protéases de tiol; α-2-macroglubolina, inibidor de tripsina de soja ou lima; inibiador da protéase pancreática; ovostatina da clara de ovo; cistatina da clara de ovo e combinação de inibidores da protéase, referidos comummente como "cocktail de inibidor de protéase", através de fornecedores de tais inibidores. 0 pH da estrutura de biomatriz, tampões e/ou meios pode ser mantido a partir de cerca de 6,0 a cerca de 9,0, de cerca de 6,5 a cerca de 8,5, de cerca de 7,0 a cerca de 8,0 ou de cerca de 7,5 a cerca de 8,0. Em algumas formas de realização, a estrutura de biomatriz, tampões e/ou meios são mantidos a um pH de cerca de 7,5 a cerca de 8,0 ou são mantidos a um pH de cerca de 7,3 a cerca de 7,5, incluindo, sem limitação, qualquer valor abrangido nestes intervalos, mas não explicitamente recitado aqui. Noutras formas de realização, a estrutura de biomatriz, tampões e/ou meios são mantidos a pH neutro. A temperatura da estrutura de biomatriz (por exemplo, durante e/ou após a preparação), tampões e/ou meios podem ser de cerca de 0°C a cerca de 30°C, de cerca de 5°C a cerca de 25°C, ou de cerca de 10°C a cerca de 20°C, incluindo, sem limitação, qualquer valor abrangido dentro destas gamas, mas não explicitamente descrito aqui. Em algumas formas de realização, a temperatura é mantida a cerca de 20°C. 0 tempo para perfundir o tecido biológico com qualquer meio ou tampão pode ser de cerca de 5 horas ou menos, cerca de 3 horas ou menos, cerca de 1 hora ou menos, cerca de 30 minutos ou menos, ou cerca de 15 minutos ou menos. Em algumas formas de realização, o passo de perfusão do tecido biológico com o tampão de delipidação é de cerca de 30 minutos ou menos. Em algumas formas de realização em que são utilizados pHs ácidos, as concentrações de sal para manter os colagénios e os componentes associados aos colagénios insolúveis podem ser diferentes; as concentrações podem ser determinadas pela literatura existente sobre química do colagénio, escolhendo concentrações de sal que mantêm a insolubilidade dos colagénios.
Os tampões exemplificativos incluem mas não estão limitados a cloreto de sódio, lactato de sódio, acetato de sódio, fosfato de sódio, citrato de sódio, borato de sódio, gluconato de sódio, tampões citrato, tampões bis\tris, tampões fosfato, fosfato de potássio, citrato/dextrose, bicarbonato de sódio, cloreto de amónio, ácido 3-{[tris (hidroximetil)metil]amino}propanossulfónico, tris (hidroximetil)metilamina, N-tris(hidroximetil) metilglicina, ácido 4-2-hidroxietil-l-piperazinoetanossulfónico e 3-(N-morfolino) propanossulfónico.
Em algumas formas de realização, o tampão desta invenção (por exemplo, o tampão usado no passo © aqui descrito) pode compreender um sal numa concentração de cerca de 2,0 M ou mais. Por exemplo, em algumas formas de realização, o sal pode estar numa concentração desde cerca de 2,0 M até cerca de 5,0 M, desde cerca de 2,5 M até cerca de 5,0 M, desde cerca de 3,0 M até cerca de 4,5 M, ou desde cerca de 3,0 M até cerca de 4,0 M, incluindo, sem limitação, qualquer valor abrangido dentro destas gamas, mas não aqui explicitamente recitado. Por exemplo, em algumas formas de realização o tampão utilizado nos métodos da presente invenção pode compreender um sal tal como cloreto de sódio numa concentração de cerca de 2,0 M de NaCl a cerca de 4,5 M de NaCl. Noutras formas de realização, tais como as de fígados adultos, o tampão utilizado pode compreender desde cerca de 3,4 M até cerca de 3,5 M de NaCl. Em formas de realização tais como as do fígado fetal, o tampão utilizado pode compreender um sal tal como cloreto de sódio numa concentração desde cerca de 4,0 M até cerca de 4,5 M. Em algumas formas de realização a perfusão do tecido biológico com uma lavagem com sal, tal como a da etapa c) dos métodos exemplificativos aqui descritos, é levada a cabo até que o perfusado (isto é, o fluido utilizado para a perfusão, tal como o fluido que Foi forçado através da vasculatura) é negativo para as proteínas por densidade ótica (OD) a 280 nm.
Qualquer dos meios e/ou tampões da presente invenção pode compreender um inibidor de protéase. Exemplos de inibidores de protéase são descritos acima. Em algumas formas de realização, o tampão tal como aquele no passo (c) dos métodos exemplificativos aqui descritos compreende um inibidor de protéase, tal como o inibidor de tripsina de soja. Noutras formas de realização, o tampão do passo (d) compreende um ou mais inibidores de protéase, tais como o inibidor de tripsina de soja.
Os meios e/ou tampões da presente invenção podem compreender uma ou mais nucleases, que em algumas formas de realização podem ser preparadas nos tampões padrão recomendados pelos fornecedores comerciais destas enzimas. Por exemplo, em algumas formas de realização o tampão da etapa d) compreende uma ou mais nucleases, tais como, mas não se limitando a, RNase e DNase. A perfusão com nucleases elimina resíduos de ácidos nucleicos. Noutras formas de realização, o tampão do passo d) compreende RNase, DNase e um ou mais inibidores de protéase. Em algumas formas de realização a perfusão do tecido biológico com uma ou mais nucleases é levada a cabo até que o perfusado (isto é, o fluido utilizado para a perfusão, tal como o fluido que tenha sido forçado através da vasculatura) seja negativo para ácidos nucleicos por densidade ótica (OD) a 260 nm. Em algumas formas de realização, as nuclease eliminam 75%, 80%, 90%, 95%, 98% OU 100% de ácidos nucleicos no tecido biológico. O segundo meio (por exemplo, meio de lavagem final) pode ser qualquer meio que assegure que os colagénios e fatores ligados (por exemplo, componentes de matriz, fatores de crescimento e citoquinas) permanecerão insolúveis, como descrito acima. Meios de enxaguamento finais exemplares são descritos acima em referência ao primeiro meio e estão isentos de soro, a pH neutro e com uma osmolalidade de 250-350 mOsm/kg. Por exemplo, em algumas formas de realização o segundo meio compreende um meio basal. Em algumas formas de realização, o segundo meio é um meio basal isento de soro. Noutras formas de realização, o segundo meio é um meio hormonalmente definido livre de soro (HDM) que compreende hormonas, fatores de crescimento, lípidos e albumina de soro e é adaptado à necessidade das células a cultivar. Um segundo meio exemplar é o meio Kubota (Kubota e Reid, PNAS 97: 12132-12137, 2000), que é projetado para células estaminais hepáticas, hepatoblastos e outros progenitores. Em certas formas de realização, o segundo meio pode ou não compreender suplementação com soro ou um fator derivado de soro, tal como, mas não se limitando a albumina de soro humano. Em algumas formas de realização, o enxaguamento do tecido com o segundo meio elimina resíduos do tampão de deslipidação e das nucleases. Noutras formas de realização, a lavagem com o segundo meio e/ou qualquer tampão ou meio subsequente equilibra a estrutura de biomatriz com o meio ou tampão. Em algumas formas de realização, o primeiro meio e o segundo meio podem ser os mesmos e em algumas formas de realização, o primeiro meio e o segundo meio podem ser diferentes, produzindo assim uma estrutura de biomatriz a partir do tecido biológico.
Em algumas formas de realização, um ou mais dos meios e/ou tampões utilizados na preparação da estrutura de biomatriz estão livres de (ou seja, não contêm uma quantidade detetável de) uma ou mais enzimas que degradam componentes da matriz extracelular. Noutras formas de realização, todos os meios e tampões utilizados na preparação da estrutura de biomatriz estão livres de (ou seja, não contêm uma quantidade detetável de) uma ou mais enzimas que degradam componentes da matriz extracelular. As enzimas exemplares incluem, mas não estão limitadas a colagenases; protéases; glicosidases tais como heparinase, heparitinase, condroitinase e hialuronidase; e elastases. A esterilização do tecido biológico, tecido homogenado e/ou a estrutura de biomatriz de acordo com a presente invenção pode ser realizada por qualquer método conhecido na técnica, com a ressalva de que os métodos que utilizam um fator que pode ligar-se à estrutura de biomatriz (por exemplo, óxido de etileno) devem ser evitados. Exemplos de métodos de esterilização incluem, mas não estão limitados a irradiação gama, esterilização de plasma por descarga de radiofrequência (RFGD), esterilização por feixe de eletrões e esterilização supercritica de dióxido de carbono. Em algumas formas de realização, a esterilização do tecido, homogenado e/ou estrutura de biomatriz é realizada com irradiação gama a cerca de 5000 rads. Se as estruturas forem utilizadas imediatamente para a recelularização e se forem utilizados processos estéreis no processo de descelularização (especialmente após a extração com elevado teor de sal), então a esterilização pode não ser necessária. 0 armazenamento da estrutura de biomatriz pode ser realizado por qualquer método conhecido na técnica. Em algumas formas de realização (por exemplo, quando a estrutura deve ser usada intacta), a estrutura de biomatriz pode ser armazenada a cerca de 4°C e noutras formas de realização (por exemplo, quando a estrutura deve ser dispersa na secção) a estrutura de biomatriz é congelada, por exemplo, a cerca de -80°C.
Em algumas formas de realização, a estrutura de biomatriz compreende, consiste ou consiste essencialmente em colagénios, fibronectinas, lamininas, nidogénio/entactina, elastina, proteoglicanos, glicosaminoglicanos e qualquer combinação destes, sendo todos parte da estrutura de biomatriz (por exemplo, ligado à estrutura de biomatriz). Em algumas formas de realização, a estrutura de biomatriz carece de uma quantidade detetável de um colagénio, fibronectina, laminina, nidogénio/entactina, elastina, proteoglicano, glicosaminoglicano e qualquer combinação destes.
As estruturas de biomatriz da presente invenção provaram ser substratos de diferenciação potentes para células e podem ser utilizados para muitos tipos de células, tais como, mas não se limitando a qualquer célula madura ou para várias populações de células estaminais. Estas incluem, por exemplo, células estaminais embrionárias (ES), células de estaminais pluripotentes induzidas (iPS), células estaminais de camada germinal (por exemplo, células estaminais endodérmicas definitivas), células estaminais determinadas (por exemplo, células estaminais hepáticas, pulmonares, pancreáticas ou intestinais ), células estaminais hepáticas humanas (hHpSCs), células estaminais perinatais (por exemplo, células estaminais derivadas de liquido amniótico (AFSCs)), células estaminais mesenquimais (MSCs), como da medula óssea ou do tecido adiposo, qualquer tipo de tecido, células doentes, células tumorais, células maduras, células parenquimatosas, células estreladas, células de células renais, células uretéricas, células mesenquimais, células musculares lisas ou esqueléticas, miócitos (células estaminais musculares), fibroblastos, condrócitos, adipócitos, fibromioblastos, células endoteliais, células ectodérmicas, incluindo células dúcteis e de pele, células neurais, células de ilhotas, células presentes no intestino, osteoblastos, outras células que formam osso ou cartilagem, e qualquer combinação destas. Estas células podem ser normais ou doentes.
Em algumas formas de realização, as estruturas de biomatriz são utilizadas para estudos biológicos, farmacêuticos, genéticos, moleculares e/ou virológicos de células, isoladas recentemente de tecido ou de células estaminais restritas à linhagem. Noutras formas de realização, as estruturas de biomatriz são utilizadas para órgãos implantáveis, vascularizados e engendrados, tais como, mas não limitados ao fígado. Outros usos exemplares para as estruturas de biomatriz incluem, mas não estão limitados a fabricação de proteínas, testes de toxicidade de fármacos, desenvolvimento de fármacos, rastreio de anticorpos e/ou produção de vírus para preparações de vacinas de vírus. A produção de vírus dependentes de linhagem (por exemplo, Papiloma vírus e hepatite C) pode ser conseguida por revestimento de populações de células estaminais num tecido de estrutura de biomatriz específica e, em seguida, cultura num meio que trabalha em combinação com a estrutura de biomatriz para induzir completamente a diferenciação das células. Os viriões maduros serão produzidos quando as células forem completamente maduras. Desde que o próprio vírus não afete a viabilidade celular, as células maduras infetadas com o vírus podem ser mantidas durante, pelo menos, oito semanas, oferecendo um meio de gerar grandes quantidades de vírus com um sistema de cultura estável.
As estruturas de biomatriz podem ser utilizadas intactas, tais como, mas não se limitando a utilização para culturas de células 2-D e/ou 3-D. Em algumas formas de realização, as estruturas de biomatriz podem ser utilizados em combinação com meio específico para diferenciação em culturas 2-D e/ou 3-D para linhas celulares, tais como, mas não se limitando a, células normais ou doentes de qualquer fase de linhagem maturacional a partir de células estaminais para células em fase tardia.
Em alternativa, as estruturas de biomatriz podem ser congeladas. Estas secções congeladas podem ser preparadas e utilizadas como substratos. As estruturas de biomatriz podem ser rapidamente congeladas em gelo seco e secções congeladas preparadas com um criostato, colocadas em aparelhos de cultura (por exemplo, pratos, frascos, tecidos, placas de poços, etc.) esterilizadas e reidratadas em meio antes de semear células. Em algumas formas de realização, a estrutura de biomatriz congelada desta invenção pode ser seccionada.
Em algumas formas de realização é produzida uma cultura de células, compreendendo: a) produzir uma estrutura de biomatriz de acordo com os métodos desta invenção; b) colocar em contacto a estrutura de biomatriz da etapa (a) com meio de cultura celular num aparelho de cultura; e c) semear a estrutura de biomatriz do passo (b) com células, produzindo deste modo uma cultura celular.
Em algumas formas de realização, é produzida uma cultura de células, compreendendo: a) produzir um estrutura de biomatriz da presente invenção; b) congelar a estrutura de biomatriz da etapa (a); c) preparar uma secção congelada a partir da estrutura de biomatriz do passo (b) como um substrato de cultura de células; d) colocar em contacto o substrato de cultura celular do passo (c) com meio de cultura celular num aparelho de cultura; e e) semear o substrato de cultura de células do passo (d) com células, produzindo deste modo uma cultura de células.
Noutras formas de realização, as estruturas de biomatriz podem ser moidos para um pó. Um método de trituração da estrutura de biomatriz a um pó compreende moer a estrutura de biomatriz a um pó num moinho de congelador a temperaturas até ou perto de temperaturas de azoto liquido. Outro aparelho para moagem em azoto liquido ou temperaturas equivalentes (por exemplo, congelação com gelo seco) são conhecidos na arte. 0 pó pode ser levado para a temperatura ambiente, no qual adquire a consistência de uma tinta que pode ser revestida sobre um aparelho de cultura utilizando uma escova de pintura esterilizada ou um aparelho equivalente. 0 pó ou as placas podem ser esterilizadas.
Assim, em algumas formas de realização é produzida uma cultura de células que compreende: a) a produção de uma estrutura de biomatriz da presente invenção; b) triturar a estrutura de biomatriz do passo (a) a um pó; c) revestir um aparelho de cultura com o pó do passo (b) para produzir um substrato de cultura de células; d) colocar em contacto o substrato de cultura celular de (c) com meio de cultura celular no aparelho de cultura; e e) semear o substrato de cultura celular de (d) com células, produzindo assim uma cultura celular. Em algumas formas de realização deste método, a moagem da biomatriz pode ser realizada num moinho congelador (por exemplo, trituração criogénica) na temperatura do azoto liquido ou perto dela.
Em algumas formas de realização antes da sementeira das células para a cultura de células, uma porção do meio é adicionada ao aparelho de cultura uma vez que as células podem ligar-se em segundos. As células, em algumas formas de realização, ligam-se em segundos a minutos para células adultas normais e em minutos a algumas horas para vários tipos de células estaminais. Em algumas formas de realização, a ligação das células pode depender de como as estruturas de biomatriz são dispersas para utilização em culturas. 0 meio celular pode ser qualquer meio que seja adequado para produzir uma cultura celular. Em algumas formas de realização o meio de cultura celular compreende pelo menos um constituinte presente no fluido intersticial, em que a osmolalidade do referido meio é de cerca de 250 mOsm/kg a cerca de 350 mOsm/kg, em que o referido meio está isento de soro e em que o pH é neutro. Noutras formas de realização, o meio de cultura celular pode ser um meio basal, tal como, mas não limitado a RPMI-1640, DME/F 12, meio de Ham, meio de Kubota, etc.
As culturas de células produzidas com as estruturas de biomatriz, em algumas formas de realização, compreendem, consistem essencialmente ou consistem em o mesmo tipo de células que as células do tecido biológico que foi utilizado para fazer a estrutura de biomatriz. Exemplos não limitativos das células desta invenção incluem células estaminais embrionária (ES), células estaminais pluripotentes induzidas (iPS), células estaminais determinadas, células estaminais perinatais, células estaminais derivadas de liquido amniótico (AFSCs) , células estaminais mesenquimais (MSCs) de qualquer origem, progenitores comprometidos ou células adultas de qualquer tipo de tecido, células maduras, células normais, células doentes, células tumorais e qualquer combinação destas. Exemplos adicionais não limitativos incluem células hepáticas, células parenquimatosas, células estreladas, células endoteliais, hepatócitos, colangiocitos, células da árvore biliar que não são colangiocitos e células pancreáticas.
Em algumas formas de realização, as células estaminais primitivas (SE, iPS, MSC ou AFSC) restringirão as células, pelo menos parcialmente, ao tipo de tecido utilizado para fazer a estrutura de biomatriz. Células estaminais determinadas de uma dada camada germinativa limitarão a linhagem ao tipo de tecido usado para fazer a estrutura de biomatriz quando a estrutura for preparada a partir de um tecido derivado dessa camada germinativa e podem parcialmente diferenciar ao destino adulto se numa estrutura de um tecido derivada de uma camada germinativa diferente. Assim, a capacidade das células adultas se diferenciarem completamente pode ser ditada pelo tipo de tecido da estrutura de biomatriz. Paralelamente, o destino das células estaminais pode ser parcial ou totalmente ditado pelo tipo de tecido da estrutura de biomatriz ou o destino das células estaminais pode ser totalmente ditado pelo tipo de tecido da estrutura de biomatriz. Em algumas formas de realização, as células da cultura celular são de um tipo diferente das células do tecido biológico utilizadas para fazer a estrutura de biomatriz. Como descrito em pormenor acima, os tipos exemplares de células que podem ser utilizados na produção de uma cultura celular incluem, mas não estão limitados a células estaminais embrionárias, células estaminais pluripotentes induzidas, células estaminais mesenquimais, células estaminais derivadas de líquido amniótico, células estaminais determinadas, células maduras, células normais, células doentes, células tumorais e qualquer combinação destas. Estas células podem ser de qualquer tecido biológico tal como aqui descrito.
Em algumas formas de realização, as estruturas de biomatriz induzem crescimento lento ou paragem de crescimento correlacionado com a diferenciação das células normais, quer sejam células estaminais ou células maduras. As células maduras, em algumas formas de realização, tornam-se totalmente diferenciadas dentro de horas e permanecem estavelmente diferenciadas durante, pelo menos, oito semanas. Em algumas formas de realização, as células adultas (isto é, células completamente maduras) ligam-se às estruturas dentro de minutos e retêm a sua diferenciação total depois disso durante mais de oito semanas. Células estaminais, em algumas formas de realização, submetidas a algumas divisões e, em seguida, entrar em paragem de crescimento e diferenciação total. As células estaminais permanecem estavelmente em paragem de crescimento, viáveis e totalmente diferenciadas durante, pelo menos, oito semanas. Em algumas concretizações, as células estaminais semeadas em estruturas de biomatriz entram em paragem de crescimento ou retardam o crescimento, perda de marcadores de células estaminais e diferenciação para células funcionais maduras em aproximadamente uma semana, retendo os fenótipos estáveis e viabilidades por, pelo menos, oito semanas ou mais (por exemplo, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 100% de viabilidade por um extenso período de tempo (por exemplo, pelo menos, uma semana, pelo menos, duas semanas, pelo menos, três semanas, pelo menos, quatro semanas, pelo menos, cinco semanas, pelo menos, seis semanas, pelo menos, sete semanas, pelo menos, oito semanas, pelo menos, nove semanas, pelo menos, dez semanas, pelo menos, 11 semanas, pelo menos, 12 semanas, pelo menos, 13 semanas, pelo menos, 14 semanas, pelo menos, 15 semanas, pelo menos, 16 semanas, pelo menos, um mês, pelo menos dois meses, pelo menos três meses, pelo menos quatro meses, pelo menos cinco meses, pelo menos seis meses, pelo menos sete meses, pelo menos oito meses, pelo menos nove meses, pelo menos dez meses, pelo menos 11 meses, pelo menos um ano, etc.).
Noutras formas de realização, a estrutura de biomatriz é utilizada para diferenciar as células estaminais embrionárias (ES) e/ou induzir células estaminais pluripotentes (IPS) a um destino especifico. Por exemplo, nalgumas formas de realização, uma estrutura de biomatriz especifica de tecido é utilizada para facilitar a diferenciação de células estaminais embrionárias ou células pluripotentes induzidas para um destino especifico.
Em certas formas de realização da presente invenção a estrutura de biomatriz é utilizada para diferenciar células estaminais derivadas de liquido amniótico (AFSCs) ou células estaminais mesenquimais (MSCs) da medula óssea ou do tecido adiposo ou de qualquer tecido fetal ou pós-natal ou quaisquer células estaminais determinadas (por exemplo, pulmão, intestino, árvore biliar, rim, pele, coração, etc.) para um destino especifico para adultos. Em algumas formas de realização, as estruturas de biomatriz da presente invenção são utilizados para aumentar e acelerar a diferenciação de células estaminais para células maduras, produzindo uma cultura de células.
Noutras formas de realização, a presente invenção proporciona um método para aumentar e/ou acelerar a diferenciação de células estaminais e/ou progenitores para células maduras, compreendendo a produção de uma cultura de células de acordo com os métodos desta invenção, em que as células são células estaminais e a cultura celular é formulada para células maduras, aumentando e/ou acelerando a diferenciação de células estaminais e/ou progenitores para células maduras. 0 meio de cultura celular pode ser qualquer meio que seja formulado para células maduras. Os constituintes no meio são distintos para cada tipo de célula. A diferenciação significa que as condições fazem com que as células amadureçam para os tipos de células adultas que produzem produtos génicos específicos para adultos. As células utilizadas nestes métodos podem ser células adultas de qualquer tipo ou células estaminais ou progenitores, exemplos não limitativos das quais incluem células estaminais embrionárias, células estaminais pluripotentes induzidas, células estaminais da camada germinativa, células estaminais determinadas, células estaminais perinatais, células estaminais derivadas do líquido amniótico, células estaminais mesenquimais, células de amplificação ou progenitores comprometidos de qualquer tipo de tecido. Células semeadas em estruturas de biomatriz (por exemplo, estruturas de biomatriz intactas, secções de estruturas ou estruturas de biomatriz em pó misturadas em/sobre outros materiais implantáveis) podem ser transplantadas para animais ou seres humanos, como um método de enxerto de células in vivo. Em algumas formas de realização, é proporcionado um método de distribuição de células a um sujeito compreendendo o contacto do sujeito com a estrutura de biomatriz da presente invenção, em que a estrutura de biomatriz compreende células. Noutras formas de realização, é proporcionado um método de distribuição de células a um indivíduo que compreende a sementeira da estrutura de biomatriz da presente invenção com células e depois o transplante da estrutura de biomatriz semeado com as células no sujeito. Em algumas formas de realização, uma estrutura de biomatriz que não foi semeada com quaisquer células pode ser transplantada para um sujeito.
Em algumas formas de realização, a estrutura de biomatriz pode ser utilizada como um enxerto que pode ser utilizado para regenerar o tecido ou órgão no sujeito.
As estruturas de biomatriz da presente invenção podem ser utilizadas para estabelecer órgãos bio artificiais, que podem ser úteis para programas analíticos e/ou clínicos. As estruturas de biomatriz podem também ser utilizadas para identificar produtos génicos específicos ou facetas de estados patológicos. Em algumas formas de realização, as estruturas de biomatriz são preparadas a partir de tecidos de animais mutantes e subsequentemente utilizados para definir fator (es) relevante (s) associado (s) à (s) mutação (ões). Noutras formas de realização, as estruturas de biomatriz são preparadas a partir de tecidos doentes e utilizados para definir alterações na matriz relevantes para a doença.
Exemplos adicionais não limitativos de utilizações das estruturas de biomatriz desta invenção incluem: 1) utilização da estrutura para cultura de células malignas para definir o potencial metastático (a capacidade das células tumorais de formarem colónias crescentes de células num dado tipo de estrutura de biomatriz é preditiva da capacidade das células de fazer metástases com o tecido a partir do qual essa estrutura foi preparada, 2) colocar enxertos de tecido na estrutura para serem utilizados para transplante num sujeito); 3) produção de organoides formados por recelularização de estruturas para serem usados como dispositivos assistentes, tais como, por exemplo, um organoide de figado que é então ligado a um individuo com insuficiência hepática; 4) utilização do estrutura para a produção de proteínas (as células na estrutura produzem um fator que pode ser isolado a partir do meio e/ou das células e depois purificado; e 5) utilização da estrutura para a produção de vírus dependentes da linhagem; por exemplo, para a produção de vírus que requerem células diferenciadas para produzir partículas suficientes para utilização como vacina.
Deste modo, a presente invenção proporciona um método para identificar o potencial metastático de células tumorais num tipo de tecido, compreendendo a) produção de um estrutura de biomatriz de acordo com os métodos desta invenção; b) colocar em contacto a estrutura de biomatriz de (a) com meio de cultura celular num aparelho de cultura; c) semear a estrutura de biomatriz de (b) com células tumorais; d) manter a estrutura de biomatriz de (c) sob condições de cultura; e) monitorizar o crescimento das células tumorais na estrutura de biomatriz de (d) , em que o crescimento de células tumorais no estrutura de biomatriz identifica que as células tumorais podem colonizar in vivo o tipo de tecido a partir do qual a estrutura de biomatriz foi produzida, identificando desse modo o potencial metastático das células tumorais no tipo de tecido. É também aqui proporcionado um método para identificar uma célula tumoral como sensível a um tratamento anti tumoral, compreendendo: a) produção de uma estrutura de biomatriz de acordo com os métodos desta invenção; b) colocar em contacto a estrutura de biomatriz de (a) com meio de cultura celular num aparelho de cultura; c) semear a estrutura de biomatriz de (b) com células tumorais; d) manter a estrutura de biomatriz de (c) sob condições de cultura; e) aplicar o tratamento anti tumoral às células tumorais na estrutura de biomatriz; e f) monitorizar o crescimento das células tumorais na estrutura de biomatriz de (e), em que a falta de crescimento de células tumorais e/ou a morte de células tumorais na estrutura de biomatriz de (e) identifica as células tumorais como sensíveis ao tratamento anti tumoral. Exemplos não limitativos de tratamento anti tumoral incluem agentes quimioterapêuticos, anticorpos, terapia de radiação, imunoterapia, terapia hormonal, etc., como seria bem conhecido na técnica. Em algumas formas de realização, as células tumorais de um indivíduo podem ser semeadas para diferentes estruturas de biomatriz desta invenção e expostas aos respetivos tratamentos anti tumorais. De acordo com os resultados destas respetivas análises de diferentes tratamentos anti tumorais, pode ser selecionado um tratamento anti tumoral que seja eficaz contra as células tumorais do indivíduo e que o tratamento anti tumoral possa ser administrado ao indivíduo para tratar o tumor do indivíduo.
Em outras formas de realização, a presente invenção proporciona um método para produzir um enxerto de tumor para transplantação num animal hospedeiro, compreendendo: a) produzir um estrutura de biomatriz de acordo com os métodos desta invenção; b) colocar em contacto a estrutura de biomatriz de (a) com meio de cultura celular num aparelho de cultura; c) semear a estrutura de biomatriz de (b) com células tumorais; d) manter a estrutura de biomatriz de (c) sob condições de cultura; e e) estabelecer uma população das células tumorais na estrutura de biomatriz de (d) , produzindo desse modo um enxerto de tumor para transplante no animal hospedeiro. Em várias formas de realização, o enxerto tumoral pode ser singénico, alogénico ou xenogénico para o animal hospedeiro.
Também é proporcionado aqui um método de produção de partículas de vírus de um vírus dependente da linhagem, compreendendo: a) produzir uma estrutura de biomatriz de acordo com os métodos desta invenção; b) entrar em contato com a estrutura de biomatriz de (a) com meio de cultura de células num aparelho de cultura; c) semear a estrutura de biomatriz de (b) com células de um tipo e estágio de linhagem que podem ser infetadas com o vírus dependente da linhagem; d) infetar as células de (c) com o vírus dependente da linhagem; e) manter as células infetadas na estrutura de biomatriz em condições de cultura; e f) recolher partículas de vírus produzidas nas células infetadas, produzindo assim partículas de vírus do vírus dependente da linhagem.
Exemplos não limitativos de um vírus dependente da linhagem desta invenção incluem o vírus da hepatite C, o vírus da hepatite B, o vírus do papiloma humano do norovírus e qualquer outro vírus agora conhecido ou posteriormente identificado como dependente da linhagem. Por dependência de linhagem, pretende-se que a célula em que o vírus esteja presente deve amadurecer ou se diferenciar para uma fase particular antes que o vírus possa replicar com sucesso na célula e produzir partículas de vírus, como é conhecido na técnica.
Além disso, a presente invenção proporciona um método de produção de um organoide formado por recelularização de uma estrutura de biomatriz, compreendendo: a) a produção de uma estrutura de biomatriz de acordo com os métodos desta invenção; b) colocar em contacto a estrutura de biomatriz de (a) com meio de cultura celular num aparelho de cultura; c) semear a estrutura de biomatriz de (b) com células do mesmo tipo de tecido que o tecido biológico utilizado para preparar a estrutura de biomatriz; e d) manter as células na estrutura de biomatriz sob condições de cultura, pelo que, se formam organoides a partir das células, produzindo desse modo um organoide formado por recelularização da estrutura de biomatriz. Este método pode ainda compreender o passo de contactar o organoide produzido pelas etapas (a) a (d) com um sujeito, para utilização como um dispositivo auxiliar, como é conhecido na técnica. Qualquer tipo de célula que possa ser utilizado para produzir a estrutura de biomatriz desta invenção pode ser utilizada neste método. Em algumas formas de realização, as células são células de fígado. A presente invenção proporciona adicionalmente um método para produzir uma proteína de interesse em células cultivadas num estrutura de biomatriz, compreendendo: a) produzir uma estrutura de biomatriz de acordo com os métodos desta invenção; b) colocar em contacto a estrutura de biomatriz de (a) com meio de cultura celular num aparelho de cultura; c) semear a estrutura de biomatriz de (b) com células que produzem a proteína de interesse; d) manter as células de (c) na estrutura de biomatriz sob condições de cultura; e e) recolha da proteína de interesse produzida pelas células de (d) , produzindo deste modo uma proteína de interesse em células cultivadas numa estrutura de biomatriz. Este método pode compreender o passo adicional de purificação da proteína de interesse recolhida no passo (f). A proteína de interesse desta invenção pode ser qualquer proteína produzida por uma célula, quer a partir de um gene endógeno e/ou como uma proteína recombinante, numa quantidade que pode ser recolhida a partir das células em cultura e/ou do meio de cultura. Numerosos exemplos de tais proteínas de interesse são conhecidos na arte. A presente invenção é explicada em maior detalhe nos seguintes exemplos não limitativos.
EXEMPLOS EXEMPLO 1. RESTRIÇÃO DE LINHAGEM DE CÉLULAS EATAMINAIS HEPATICAS HUMANAS A DESTINOS MADUROS É FEITA DE MODO EICIENTE POR ESTRUTURAS DE BIOMATRIZ ESPECÍFICAS DE TECIDOS.
Resumo. Os protocolos atuais para a diferenciação de células estaminais utilizam múltiplos tratamentos de sinais solúveis e/ou fatores de matriz e resultam tipicamente em diferenciação parcial em células maduras com sub ou sobre-expressão de genes específicos de tecidos adultos. Na presente invenção desenvolveu-se uma estratégia para a diferenciação rápida e eficiente de células estaminais utilizando substratos de estruturas de biomatriz, extratos específicos de tecidos enriquecidos em matriz extracelular e fatores de crescimento associados e citoquinas, em combinação com um meio hormonalmente definido sem soro (HDM) adaptado para o tipo de célula adulta de interesse. Os estudos aqui descritos demonstram a eficácia das estruturas de biomatriz da presente invenção na diferenciação de células estaminais hepáticas humanas (hHpSCs) com destinos maduros e na manutenção de células parenquimais maduras como totalmente funcionais durante longos períodos de tempo. As estruturas de biomatriz foram preparadas por um novo protocolo de descelularização de perfusão em quatro passos utilizando condições concebidas para manter todos os tipos de colagénio insolúveis. Os estruturas mantiveram histologia nativa, vasculatura patente e aproximadamente 1% das proteínas teciduais, mas> 95% de seus colagénios, a maioria dos componentes da matriz associada ao colagénio do tecido e níveis fisiológicos de fatores de crescimento ligados à matriz e citoquinas. Os colagénios aumentaram de níveis quase indetetáveis para mais de 15% das proteínas da estrutura com o restante incluindo lamininas, fibronectinas, elastina, nidogénio/entactina, proteoglicanos e citoquinas ligadas à matriz e fatores de crescimento em padrões que se correlacionam com a histologia. As células estaminais hepáticas humanas (hHpSCs), semeadas em estruturas de biomatriz hepáticas e em HDM adaptadas para células hepáticas adultas, perderam marcadores de células estaminais e diferiram para células parenquimatosas maduras e funcionais em aproximadamente uma semana, permanecendo viáveis e com fenótipos de células maduras estáveis para mais de oito semanas. Assim, as estruturas de biomatriz desta invenção podem ser utilizadas para estudos biológicos e farmacêuticos de células estaminais restritas à linhagem, para manutenção de células maduras e para tecidos ou órgãos implantáveis, vascularizados.
Procedimentos para descelularização. Após anestesia com cetamina-xilazina, a cavidade abdominal de rato foi aberta e uma manga com uma cânula foi inserida na veia porta para perfundir todo o fígado. (1) A perfusão é feita com RPMI 1640 durante 10 minutos; seguida de (2) deslipidação com uma lipase (por exemplo, 20-50 unidades de fosfolipase A2 - PLA2) combinada com um detergente suave tal como desoxicolato de sódio a 1% (SDC) durante cerca de 30-60 min até que o tecido se torne transparente e a efusão torna-se clara; (3) perfusão com lavagens com elevado teor de sal (para fígados fetais: 4,5 M de NaCl e fígados adultos 3,4 M-3,5 M de NaCl) até que o perfusado seja negativo para proteínas por densidade ótica (DO) a 280 nm; (4) perfusão com nucleases (DNase, RNase) em RPMI 1640 até o perfusato ser negativo para ácidos nucleicos por OD 260; e (5) lavagem final com RPMI 1640 por 2 horas ou mais.
As estruturas de biomatriz são rapidamente congeladas em gelo seco e secções congeladas preparadas com um criostato, colocadas em placas de cultura de células de 24 poços, esterilizadas por irradiação gama (5000 rads) e reidratadas em meio (KM) durante 30 min antes da semeadura de células. As secções das estruturas de biomatriz cobriram ~ 95% da superfície do poço na placa de 24 poços.
Um método alternativo para distribuir as estruturas de biomatriz em pratos de cultura consistiu em pulverizá-lo para um pó usando um moinho congelador cheio com azoto líquido. 0 pó pulverizado, quando levado à temperatura ambiente, adquire a consistência da tinta, e pode ser revestido sobre qualquer superfície, tal como pratos, lâminas, tecidos, filtros ou outras superfícies utilizadas para ligar células e/ou cultura de células. A pulverização das estruturas elimina os gradientes de componentes e sinais da matriz, mas a mistura de componentes presentes ainda provoca potentes efeitos de diferenciação. As estruturas também podem ser utilizadas intactos e ressemeadas com células na preparação de órgãos manipulados para transplante in vivo ou para culturas 3-D. Métodos alternativos foram desenvolvidos para uso com fígados de suínos e bovinos. Os fígados de suíno e bovino foram obtidos de uma unidade de processamento de carne certificada USDA (CT) . Ver Exemplo 3 para um esboço de um protocolo representativo. Cada fígado foi inspecionado USDA e recebeu o selo USDA antes de sair da instalação. Os fígados foram transportados em meio ESP-Gro (Gigacyte, Branford, CT, catálogo # 1101-250). Os fígados recebidos no laboratório foram pesados, foto-documentados e preparados para perfusão. Após a trituração, a mistura foi descongelada e diluída para uma relação meio: biomatriz de 1:48. Esta pasta de biomatriz foi então utilizada para placas de revestimento. Após secagem, a biomatriz foi lavada três vezes e depois as células foram aplicadas. Células hepáticas adultas ligadas dentro de 10 minutos às placas. As progénies podem levar mais tempo (algumas horas). Contudo, para células estaminais/progenitores de fígado adulto, ligaram-se, essencialmente 100% das células viáveis.
Meio e soluções. Todos os meios foram filtrados por esterilidade (filtro de 0,22 pm) e mantidos no escuro a 4°C antes do uso. Para manter os colagénios estáveis na biomatriz, o pH do meio de perfusão para a preparação da estrutura de biomatriz foi mantido em 7,5-8,0. Utilizou-se RPMI-1640 (Gibco/Invitrogen, Carlsbad, CA) como o meio basal para a preparação de estruturas de biomatriz e para culturas de células estaminais hepáticas ou hepatócitos. Todos os reagentes exceto agueles notados foram obtidos a partir de Sigma (St. Louis, MO).
Meios de perfusão para a preparação de estruturas de biomatriz. (1) . Lavagem por perfusão e enxaguamento de perfusão: meio basal sem soro (por exemplo, RPMI-1640); (2) . Perfusão com detergente: 36 unidades/L de PLA2 mais 1% de SDC; (3) . Perfusão com sal elevado: 3,4 M de NaCl com 0,1 mg/ml de inibidor de tripsina de soja; (4). Perfusão com nucleases: 5 mg/100 ml de RNase, 1 mg/100 ml de DNase e 0,1 mg/ml de inibidor de tripsina de soja (por exemplo, preparado em RPMI 1640).
Meio de Kubota. KM foi projetado originalmente para hepatoblastos 47 e agora foi encontrado eficaz para progenitores hepáticos humanos 48 e para outros progenitores endodérmicos, incluindo os de árvore biliar (Wang et al. "Multipotent stem/progenitor cells in human biliary tree give rise) e pâncreas (Wang, Y and Reid L, dados não publicados). Consiste em qualquer meio basal (aqui sendo RPMI 1640) sem cobre, baixo teor de cálcio (0,3 mM), 10-9 M de selénio, BSA 0,1%, 4,5 mM de nicotinamida, 0,1 nM de hepta-hidrato de sulfato de zinco (de Specpure, Johnson Matthew Chemicals, Royston, Inglaterra), 10-8 M de hidrocortisona, 5 pg/ml de transferrina/Fe, 5 pg/ml de insulina, 10 pg/ml de lipoproteina de alta densidade e uma mistura de ácidos gordos livres que são adicionados ligados para albumina de soro humano purificado.
Para diferenciar as células de um destino adulto, pode ser utilizado um meio sem soro, definido hormonalmente (HDM) adaptado ao tipo de célula adulta desejado. Por exemplo, utilizou-se um HDM para o destino de fígado adulto consistindo em KM suplementado ainda com cálcio para se obter uma concentração de 0,6 mM, IO-12 M de cobre, 1 nM de tri-iodotironina (T3), 7 ng/ml de glucagona, 20 ng/Ml de FGF, 2 g/L de galactose, 10 ng/ml de oncostatina M (OSM), 10 ng/ml de fator de crescimento epidérmico (EGF), 20 ng/ml de fator de crescimento de hepatócitos (HGF) e IO-8 M de hidrocortisona.
As células foram semeadas neste HDM isento de soro se plaqueadas nas estruturas; em circunstâncias em que foram utilizadas as enzimas para processamento de células ou tecidos, então suplementamos o HDM com FBS a 5% (HyClone, Waltham, MA) durante algumas horas e depois muda-se para HDM isento de soro a partir dai. Em paralelo, as experiências de controlo, as culturas foram mantidas no HDM com 5% de FBS, mas descobrimos que a presença de soro levou células a perder funções diferenciadas com o tempo. Os requisitos de fatores solúveis são menores do que o normal para culturas em outros substratos dado que tantos dos fatores estão ligados às estruturas de biomatriz. Os requisitos de fatores solúveis são menores do que o normal para culturas em outros substratos dado que tantos dos fatores estão ligados às estruturas de biomatriz.
Caracterização de árvores vasculares intactas nas estruturas de biomatriz hepáticas. Os restos de matriz ramificante e ramificadora da vasculatura incluindo a rede de capilares na estrutura de biomatriz de fígado de rato foram visualizados por microscopia de luz e fluorescência, respetivamente. Partículas de dextrano de 250 kDa marcadas com rodamina foram injetadas na estrutura de biomatriz de fígado através do remanescente da veia porta para verificar a integridade dos restos de matriz do sistema de vasculatura nas estruturas de biomatriz. Preparou-se um filme utilizando um microscópio de dissecção de fluorescência Leica MZ16FA (motorizado).
Processamento do fígado fetal humano. Os tecidos do fígado fetal foram fornecidos por uma agência credenciada (Advanced Biological Resources, San Francisco, CA) de fetos entre 16-20 semanas de idade gestacional obtidos por terminações de gravidez eletiva. 0 protocolo de pesquisa foi revisto e aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional para Estudos Humanos na Universidade da Carolina do Norte, em Chapei
Hill. As suspensões de células de fígado humano fetal foram preparadas como descrito anteriormente48'49. Resumidamente, o processamento foi conduzido em RPMI 1640 suplementado com albumina de soro bovino a 0,1%, 1 nM de selénio e antibióticos. O tampão de processamento enzimático continha 300 U/ml de colagenase do tipo IV e 0,3 mg/ml de desoxirribonuclease a 32°C com agitação frequente durante 15-20 min. As suspensões enriquecidas foram prensadas através de uma malha de calibre 75 e centrifugadas a 1200 RPM durante 5 min antes da ressuspensão. A viabilidade celular estimada por exclusão com azul de tripano foi rotineiramente superior a 95%.
Enriquecimento de hHpSCs e cultura em estruturas de biomatriz. Utilizamos dois métodos para a purificação ou enriquecimento de hHpSCs: 1) Seleção de cultura. Aproximadamente 3xl05 células foram plaqueadas sobre uma placa de 10 cm de cultura de tecidos e no KM. O meio foi trocado a cada 3 dias. As colónias formaram-se dentro de 5-7 dias e foram observadas durante até 3 meses. Colhemos as colónias manualmente após 14-18 dias utilizando um microscópio invertido (1X-FLAIII, Olympus, Japan e Melville, NY). 2) Imunoseleção magnética de subpopulações progenitoras hepáticas multipotentes (hHpSCs e hHBs) foi conseguida pela seleção de células positivas para a molécula de adesão de células epiteliais (EpCAM, CD326) utilizando tecnologias de imunoestimulação de contas magnéticas com o sistema Miltenyi Biotech MACS (Bergisch Gladbach, Alemanha) seguindo as instruções do fabricante50. Resumidamente, as células dissociadas foram incubadas com anticorpo EpCAM ligado a micro bolas magnéticas durante 30 min a 4°C e foram separadas utilizando um sistema de separação por coluna magnética de Miltenyi seguindo os procedimentos recomendados pelo fabricante.
As culturas foram semeadas com colónias de 250 hHpSC, ou 5 x 105de hHpSCs enriquecidas ou 2,5 χ 105hepatócitos adultos primários. O meio foi substituído diariamente e o meio recolhido foi armazenado a -20°C para análise posterior. As células cultivadas em placas de 24 poços com revestimento de colagénio tipo I serviram como controlo.
Isolamento de hepatócitos de ratos adultos. As suspensões recentemente isoladas de hepatócitos de rato foram obtidas de ratos Lewis machos adultos de 3 meses de idade (Charles River Laboratories, Wilmington, MA) pesando 200-250 g. Utilizou-se um método de perfusão de dois passos melhorado como descrito anteriormente49 para isolamento e purificação de hepatócitos de rato. O fígado foi perfundido durante 10-15 minutos com um tampão isento de cálcio contendo EGTA e depois colagenase num tampão contendo cálcio durante 10-15 minutos. O fígado foi então mecanicamente dissociado por prensagem do fígado digerido através de pano de queijo e depois filtrando sequencialmente a suspensão de células através de peneiras de tamanho de malha de estreitamento. As células foram lavadas duas vezes e depois sedimentadas a 50 g. A viabilidade foi definida contando as células após coloração com azul de tripano. Rotineiramente, 200-300 milhões de células por rato foram isoladas com 89-96% de viabilidade e >99% de pureza.
Isolamento e cultura de células de fígado humano adulto. As suspensões de células hepáticas humanas frescas foram obtidas a partir de CellzDirect. (agora uma parte de Invitrogen, RTP, NC). As suspensões foram processadas por métodos CellzDirect, depois ressuspensas em meio HeptoMAIN (Catálogo # 1103-250; GigaCyte, Branford, CT), colocadas em placas a 1,88 x 105 células/cm2 em placas de multi-poços revestidas com estruturas de biomatriz de figado ou para colagénio do tipo I (1 pg/ml, Meridian Catalog # A33704H).
Análise química do colagénio. A quantidade de colagénio em estruturas de biomatriz foi avaliada com base no teor de hidroxiprolina (hyp). Amostras de fígados inteiros e de estruturas de biomatriz foram pulverizadas, lavadas e liofilizadas. As alíquotas foram então hidrolisadas e submetidas a análise de aminoácidos51 e o teor de colagénio por proteína total foi estimado com base no valor de hip de 300 resíduos/colagénio.
Análise quantitativa do conteúdo de ADN e ARN. Para avaliar o DNA total remanescente na biomatriz hepática decelularizada, tanto o tecido de fígado de rato fresco como a biomatriz decelularizada foram pesados, cortados e digeridos com Proteinase K e o ADN celular total foi isolado52. Para avaliar o ARN total remanescente na biomatriz hepática descelularizada, pesou-se tanto o tecido de fígado de rato fresco como a biomatriz de fígado de rato decelularizada e depois homogeneizou-se em solução de TRIzol (Invitrogen), e isolou-se o ARN celular total.
Ensaios de fatores de crescimento. Amostras de fígados de ratos, estruturas de biomatriz de fígado de rato, tecido de canal biliar humano e estruturas de biomatriz de canal biliar humano (duas amostras cada) foram enviadas para RayBiotech, Inc (Norcross, Georgia) para análise de fatores de crescimento. As amostras foram homogeneizadas, preparadas como lisados, e depois ensaiadas com 1 mg/ml de proteína, produzindo fluorescência, definidas em unidades de intensidade fluorescente (FIUs). Os ensaios de fator de crescimento semi-quantitativos foram realizados utilizando 0 RayBio® Human Growth Factor Arrays, Série G 1. A UIF foi reduzida em que a partir de controlos negativos para a ligação não especifica e normalizada para a proteína de concentração. Os dados dos duplicados foram calculados em média. Foram usadas quatro matrizes permitindo a pesquisa para ~ 40 fatores de crescimento. Embora o ensaio tenha sido desenvolvido para fatores de crescimento humano, existe sobreposição suficiente na reação cruzada para fatores de crescimento de rato para permitir a utilização tanto em amostras de rato como humanas.
Microscopia eletrónica de transmissão e varredura (TEM e SEM) . Para TEM, as estruturas de biomatriz foram enxaguadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e fixadas em glutaraldeído a 3%/cacodilato de sódio 0,1, pH 7,4 durante a noite. Após três lavagens com tampão de cacodilato de sódio, as estruturas de biomatriz foram pós-fixadas durante 1 hora em tampão de tetróxido de ósmio a 1%/0,1 de cacodilato de sódio. Depois de enxaguar em água desionizada, foi desidratada e incorporada em resina epóxida Polybed 812 (Polysciences, Niles, IL). As estruturas de biomatriz foram seccionadas perpendicularmente ao substrato a 70 nm utilizando uma faca de diamante. As secções ultrafinas foram recolhidas em grelhas de cobre de malha 200 e coradas com acetato de uranilo aquoso a 4% durante 15 minutos, seguido por citrato de chumbo de Reynolds durante 7 minutos. As amostras foram visualizadas utilizando um microscópio eletrónico de transmissão LEO EM910 operando a 80kV (LEO Electron Microscopy, Oberkochen, Alemanha). As imagens digitais foram adquiridas usando uma câmara digital Gatan
Orius SC1000 CCD e Digital Micrograph 3.11.0 (Gatan, Pleasanton, CA).
Para SEM, após a fixação e lavagens, as estruturas de biomatriz foram desidratadas e transferidas em etanol 100% para o secador de ponto critico Balzers CPD-020 (Bal-Tec AG, Balzers, Suíça) e secas usando dióxido de carbono como solvente de transição. A matriz foi montada em suportes de espécimes de alumínio com abas adesivas de carbono e revestida com uma espessura de 10 nm de ouro-paládio metálico (liga 60:40) utilizando um revestidor por pulverização Hummer X (Anatech, Worcester MA) . As amostras foram examinadas utilizando um Zeiss Supra 55 FESEM a uma tensão de aceleração de 5 kV e as imagens digitais foram adquiridas utilizando o software Zeiss SmartSEM (Carl Zeiss SMT, Germany e Thornwood, NY).
Imunocito-química e imuno-histologia. Para a coloração fluorescente de células cultivadas em estruturas de biomatriz, as células foram fixadas com paraformaldeído a 4% (PFA) durante 20 min à temperatura ambiente, lavadas com HBSS, bloqueando com 10% de soro de cabra em HBSS durante 2 h e lavadas. As células fixas foram incubadas com anticorpos primários a 4°C durante a noite, lavadas, incubadas durante 1 h com anticorpos secundários específicos isotipo marcados, lavadas, contra coradas com 4', 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) para visualização de núcleos celulares e vistas utilizando um microscópio invertido Leica DMIRB (Leica, Houston, TX).
Para imunohistoquímica, as estruturas de biomatriz foram fixadas em PFA a 4% durante a noite e armazenadas em etanol a 70%. Foram incorporadas em parafina e cortadas em seções de 5 pm. As secções foram desparafinadas, e os antigénios foram recuperados. As peroxidases endógenas foram bloqueadas por incubação durante 30 min em solução de H2O2 a 0,3%. Após bloqueio com 10% de soro de cavalo, o anticorpo primário foi aplicado a 4°C durante a noite; anticorpo secundário e coloração ABC foram realizados utilizando o kit RTU Vectastain (Vector Laboratories, Burlingame, CA) . O Vector Nova RED foi utilizado como substrato. As secções foram desidratadas, fixas e incorporadas em Meios de Montagem Eukitt (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA) e foram analisadas utilizando um microscópio invertido. Os anticorpos utilizados para as secções de figado e para as culturas são listados na Tabela 4.
Reação em cadeia da polimerase de transcrição reversa (RT-PCR) . As hHpSCs são cultivadas em placas de cultura de células, e as colónias foram transferidas para uma estrutura de biomatriz. Após mais cultura durante 7 dias, as colónias foram lisadas para RT-PCR. O ARN total foi extraído utilizando um Kit RNeasy Plus Mini (Qiagen GmbH, Valência CA) de acordo com as instruções do fabricante. Realizou-se a transcrição inversa com o Sistema de Síntese de Primeira Linha Superscript para RT-PCR (Invitrogen, Carlsbad, CA) . HotStarTaq Master Mix Kit (Qiagen) foi utilizado para PCR. Os iniciadores de PCR foram listados na Tabela 5.
Ensaio VIVO/MORTO e ensaio de viabilidade celular. Foi utilizado um kit de ensaio de viabilidade LIVE/DEAD (Molecular Probes / Invitrogen, Carlsbad, CA) para os ensaios de adesão e proliferação. Os hHpSCs ou hepatócitos foram incubados com duas sondas, calceina-AM (Vivo, cinza claro) e homodímero de etídio-1 (EtdD-1, Morto), para a atividade de esterase intracelular e integridade da membrana plasmática, respetivamente. Os espécimes foram observados sob um estereomicroscópio Olympus SZX12 de fluorescência (OLYMPUS, Japão e Melville, NY). Utilizou-se um kit de ensaio de viabilidade de células de resazurina (Biotium, Hayward, CA), seguindo o manual do fabricante. Resumidamente, 10% da solução de resazurina foram adicionados ao meio de cultura e incubados a 37°C de um dia para o outro. Absorvência OD570-ODõoo foi obtida utilizando um leitor Biotek Synergy HT-deteção de múltiplas microplacas (Winooski, VT) e a curva de viabilidade representada graficamente. Todos as experiências foram realizadas três vezes usando um minimo de três amostras por condição experimental.
Ensaios funcionais específicos hepáticos. A atividade de CYP450 3A4 foi detetada utilizando um Sistema de Rastreio P450-Glo® (Promega, Madison, WI). Resumidamente, as células cultivadas foram incubadas com meio contendo o substrato luminogénico CYP3A4, luciferina-PPXE para CYP, durante 4 horas a 37°C. A deteção e análise de luciferina foi realizada de acordo com as instruções do fabricante com um Wallace Victor2 Multilabel Counter (agora parte da Perkins/Elmer em Waltham, MA). A secreção quantitativa de albumina foi realizada utilizando um kit de quantificação de ELISA de albumina humana (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX). Para os ensaios de sintese de ureia, as células foram incubadas com amónio 2 mM durante 24 horas e o sobrenadante foi recolhido e ensaiado com o kit de ensaio de ureia Quantichrom (Bioassay Systems, Hayward, CA) . O sobrenadante a partir duma amostra para cada condição de cultura foi ensaiado em triplicado e a experiência foi reportada três vezes.
Análise estatística. As experiências foram repetidas pelo menos 2-3 vezes com amostras duplicadas ou triplicadas para cada condição. Os dados de experiências representativas são apresentados, enquanto tendências semelhantes foram observadas em ensaios múltiplos. Todas as barras de erro representam SEM.
Estruturas de biomatriz são preparadas com um novo protocolo de quatro passos. As estruturas de biomatriz foram preparadas usando um protocolo composto de deslipidação seguido por extrações de sal alto e usando métodos de perfusão (FIG. 1). Uma apresentação detalhada do protocolo é dada nos métodos. Isto é conseguido por um novo protocolo de quatro passos: 1) delipidação suave; 2) lavagens com tampões com concentrações de sal de cerca de 2,0 M a cerca de 5,0 M (por exemplo, 2,0 M-2,5 M, 2,6 M-3,0 M, 3,1 M-3,5 M, 3,6 M-4,0 M, 4,1 M-4,5 M, 4,6 M-5,0M), concentrações de sal conhecidas por manter os colagénios num estado insolúvel23 (a concentração exata e o pH dos tampões são ditados pelos tipos de colagénio no tecido), concentrações conhecidas para manter os colagénios num estado insolúvel23; 3) tratamento com nuclease para eliminar ácidos nucleicos residuais; e 4) lavagens com um meio basal para eliminar os resíduos de detergente, sal e nuclease assim como para equilibrar os componentes da matriz com o meio (FIG. IA) .
As escolhas dos meios de enxaguamento ou dos tampões para as nucleases podem ser qualquer uma de várias opções, desde que a concentração de sal e a força iónica sejam tais que mantenham os componentes da matriz num estado insolúvel. A escolha do método de delipidação é critica para ser eficaz e contudo suave. Escolhemos uma combinação de desoxicolato de sódio (SDC) e fosfolipase A2 (PLA2) para degradar rapidamente o fosfoglicérido localizado na membrana do citoplasma e membrana mitocondrial em lisolecitina, um tensioativo poderoso, que pode induzir necrose e citólise. A fórmula reativa é mostrada em FIG. 8. Evitamos detergentes agressivos, como o dodecilsulfato de sódio (SDS) ou o Triton-X 100, que pode dissolver alguns componentes da matriz, como os glicosaminoglicanos (ver revisão de Gilbert et al. "Decellularization of tissues and organs" Biomaterials 27:3675-3683 (2006)).
Evitamos a exposição prolongada das estruturas às enzimas das células interrompidas durante a deslipidação e as lavagens com alto teor de sal, porque podem diminuir grandemente o teor de elastina e o conteúdo de glicosaminoglicanos (GAGs), tais como sulfatos de heparano (HS) , sulfatos de condroitina CS) , sulfatos de dermatano (DS) e heparinas (HP) , que são locais onde as citoquinas e fatores de crescimento se ligam24. Usamos inibidor de tripsina de soja e controlo cuidadoso do pH (7,5-8,0), temperatura (20°C) e tempo (30-60 min) para limitar a atividade das protéases derivadas de células rompidas. Nós perfundimos o tecido inteiro através da vasculatura relevante (por exemplo, veia porta no figado), permitindo-nos rapidamente isolar (em poucas horas) uma estrutura de biomatriz com perda minima de componentes da matriz. A rapidez do isolamento é devido ao passo inicial com detergente que delipide o tecido dentro de aproximadamente 30-60 minutos (não horas ou dias, como nos protocolos utilizados por outros). As estruturas de biomatriz resultantes são translúcidas ou brancas (FIG. 1). Além disso, utilizando esse método de perfusão, mantivemos os canais vasculares primários, veias portal e hepática e a maioria dos ramos vasculares no figado, o que aumentou a eficiência de descelularização. As partículas fluorescentes de dextrano marcadas com rodamina perfundidas através das estruturas de biomatriz permaneceram dentro dos remanescentes da vasculatura demonstrando que estão patentes (FIG. IE) . Há um fluxo progressivo do corante de grandes vasos para os ramos de vasos sanguíneos finos ao longo dos canais sem vazamento. Este facto será útil na revascularização das estruturas como um meio de preparação de tecidos manipulados para cultura tridimensional e/ou para implantação ex vivo.
Quando seccionados, as estruturas retêm a estrutura histológica do tecido original, incluindo os remanescentes reconhecíveis das principais entidades histológicas tais como os vasos sanguíneos, canais biliares e a cápsula de Glisson (GC) (FIG. 1). Compare as Figs. 1B1 e 1D1, em que uma secção do tecido do fígado é contrastada com a de uma estrutura de biomatriz. Os restos de matriz das muralia de células parenquimatosas consistiu de uma rede de laço semelhante (Figs. 1D2-1D3).
Colagénio, as proteínas associadas ao colagénio e as citoquinas ligadas são mantidas nas estruturas de biomatriz. A quantidade de colagénio em estruturas de biomatriz foi avaliada por análise de aminoácidos por métodos utilizados anteriormente 25. Uma vez que a hidroxiprolina (Hyp) é única para colagénios e proteínas colagénicas, a composição de colagénio em relação à proteína total foi expressa como resíduos de Hyp por 1000 aminoácidos. Os resultados demonstraram que o teor de colagénio aumentou de níveis quase indetetáveis, isto é, menos de 0,2 resíduos de hidroxiprolina (Hyp)/1000 no fígado, para ~ 13 resíduos de Hyp/1000 em estruturas de biomatriz. Isto indica que a deslipidação e as lavagens com elevado teor de sal, acima descritas, não removem os colagénios, deixando quase todos os colagénios nas estruturas de biomatriz. (Figs. 2A, 9 e Tabela 2).
Através de estudos imunoistoquimicos e ulta estruturais, foi possível identificar nas estruturas todas as formas conhecidas de colagénio encontradas no fígado in situ, incluindo colagénios fibrilares (colagénio de tipos I, III e V, 10-30 nm de diâmetro para fibrilhas e 500-3.000 nm para fibras montadas) e filamentos de contas (possivelmente do tipo VI). Essas fibras e filamentos estão presentes na camada de tecido conjuntivo subcapsular situada sob a camada mesotelial. Embora estruturas típicas de membranas basais não foram encontradas ao longo das sinusoides das tríades portal às veias centrais, descobrimos que o colagénio tipo IV e algumas pequenas fibrilas ligadas formam redes tridimensionais porosas, de rede, servindo de estruturas para as células parenquimatosas (FIG. 2). Os feixes de colagénio tipo I podem ser vistos como a estrutura principal das estruturas aos quais estão ligados outros tipos de colagénio, glicoproteínas e proteoglicanos. No espaço de Disse encontramos pequenos feixes de colagénio tipo I e fibras de colagénio tipo III e VI bem como algum tipo V, que é mais abundante perto de tríades portal e veias centrais. Os dados representativos de imuno-histoquímica estão na FIG. 3B e um resumo dos componentes da matriz e sua localização no tecido hepático normal versus aqueles nas estruturas de biomatriz estão listados na FIG. 4D. Estudos iniciais no desenvolvimento dos protocolos para a preparação de estruturas de biomatriz indicaram que a maior parte dos componentes do citoesqueleto são perdidos nas lavagens. Ainda assim, avaliamos as estruturas por imuno-histoquímica e não encontramos evidência de tubulina, desmina ou actina, vestígios de citoqueratinas 18 e 19 e baixos níveis de vimentina espalhados pelas estruturas. A matriz associada aos duetos biliares e porções dos sistemas vasculares hepáticos (vasos arteriais e venosos) consiste em estruturas de membrana basal tipicas e por isso é bastante distinta das camadas finas da matriz associadas com as estruturas vasculares encontradas nas sinusoides. Laminina, entactina/nidogénio, perlecan e colagénio tipo IV encontram-se na tríade portal, enquanto que apenas perlecan e algum colagénio tipo IV são encontrados no Espaço de Disse. Estão presentes quantidades enormes de elastina ondulada e hidrofóbica; reticula-se e forma folhas e fibras restritas principalmente no tecido conjuntivo subcapsular, regiões portal e paredes arteriais. As fibronectinas são ubíquas e prevalentes em toda a matriz hepática e são especialmente abundantes no Espaço de Disse, onde formam filamentos finos ou depósitos granulares (Figs. 2 e 3). A imuno-histoquímica indica que os proteoglicanos conhecidos no tecido são preservados nas estruturas de biomatriz (Figs. 3B, 4D) . Entre os proteoglicanos heterogéneos identificados, o syndecan foi encontrado intercalado e continuamente ao longo das sinusoides, e o perlecan é mais pontuado no Espaço de Disse. As formas de HS-PGs e CS-PGs são encontradas ao longo dos remanescentes das sinusoides nas estruturas de biomatriz e em padrões correlacionando com a zonação conhecida do tecido hepático.
Os proteoglicanos e outros componentes da matriz são reservatórios importantes para citoquinas e fatores de crescimento que se ligam firmemente aos GAGs26. A maioria dos fatores de crescimento e hormonas são encontrados nas estruturas de biomatriz próximos às concentrações encontradas no tecido original. Na Tabela 6, os dados são dados a partir dos lisados de fígados de rato em relação às estruturas de biomatriz de fígado de rato e na Tabela 3, são proporcionados dados paralelos a partir de tecido de canal biliar humano versus estruturas de biomatriz de canal biliar. Interessantemente, houve alguns exemplos (por exemplo, bFGF) que foram fortemente enriquecidos em estruturas de biomatriz de fígado em relação ao encontrado em lisados hepáticos. Os fatores de crescimento e as citoquinas ligadas são distintos qualitativa e quantitativamente entre as estruturas do fígado versus tecido do dueto biliar, implicando especificidade de tecido ou especificidade de espécie. Em alternativa, pode dever-se, em parte, ao facto de as estruturas das vias biliares serem preparadas, por necessidade, por agitação do tecido nos tampões numa roqueira e não por perfusão através da vasculatura. A química das estruturas de biomatriz correlaciona-se com a histologia. Uma característica significativa deste novo protocolo é a retenção da química da matriz em padrões correlacionados com as zonas acinares hepáticas 1-3 da tríade portal à veia central e com entidades histológicas como os canais vasculares e a Cápsula de Glisson (GC) como mostrado nas Figs. 4A-C. A química da matriz periportal na zona 1 é semelhante à encontrada nos fígados fetais e consiste, em parte, em colagénio tipo III, laminina e formas de CS-PGs. Transaciona-se para uma matriz de química diferente na zona meia acinar (zona 2) e pericentral (zona 3) terminando com uma matriz muito estável com altos níveis de colágeno tipo IV e HP-PGs27.
Conhece-se que uma miríade de proteínas (por exemplo, fatores de crescimento e hormonas, proteínas de coagulação, várias enzimas) se ligam à matriz e são mantidas estavelmente através da ligação aos padrões discretos e específicos de sulfatação nos GAGs ou a outros componentes da matriz24. Assim, a química da matriz transita a partir do seu ponto de partida no nicho de células estaminais com química de matriz lábil associada a alta rotatividade e mínima sulfatação a matrizes estáveis e tendo quantidades crescentes de sulfatação com progressão para a zona pericentral. Espera-se que a manutenção da arquitetura natural e química da matriz correlacionada com a histologia facilitará a recelularização em processos de manipulação de tecidos através de conduzir as células a sítios específicos nas estruturas de biomatriz e/ou fornecendo a mistura adequada de sinais para conduzir a expansão e/ou a diferenciação para células maduras. A estrutura de biomatriz pode ser preparado a partir de diferentes tecidos e espécies. As estruturas de biomatriz podem ser facilmente preparadas a partir de qualquer tecido, normal ou doente e de qualquer espécie. Nas Figs. 13-16 mostramos estruturas de biomatriz de pâncreas humano, árvore biliar e duodeno e de pâncreas de rato e porcino. Nas Figs. 5-7 e FIG. 12 são mostrados efeitos de estruturas de biomatriz de fígado de bovino ou de rato em células hepáticas. Adicionalmente, as estruturas de biomatriz foram preparadas a partir da aorta abdominal humana, veia ilíaca e de intestino de rato e porco. Estudos histológicos, ulta estruturais e imuno-histoquímicos nas estruturas de biomatriz indicam uma marcada especificidade de tecido, mas não especificidade de espécie, na sua estrutura, composição química e funções.
As estruturas de biomatriz induziram e/ou mantiveram a diferenciação de células. A colocação de hHpSCs em pratos com secções de estruturas de biomatriz de fígado e em HDM adaptadas para células de fígado adultas resultou essencialmente em 100% das células viáveis ligadas em poucas horas a estruturas de biomatriz; quer intactas quer após pulverização criogénica. As colónias de células que inicialmente se formaram nas secções das estruturas retinham algum do seu fenótipo de células estaminais, uma vez que as células no centro das colónias eram capazes de resistir à coloração com corantes (FIG. 11) e expressaram marcadores progenitores hepáticos clássicos, tais como recetor de quimiocinas (motivo CXC) 4 (CXCR4) e molécula de adesão de células epiteliais (EpCAM) (FIG. 5). Dividiram-se uma ou duas vezes e depois fizeram a transição para a parada do ciclo celular e para morfologias tridimensionais (3-D) tipo cordão típicas para culturas de células parenquimais maduras (Figs. 5 e 6 para diferenciação de células estaminais; compare com FIG. 7 e FIG. 12) . 0 HDM utilizado não requeria todas as citoquinas ou fatores de crescimento habituais, uma vez que estes estão presentes ligados às estruturas de biomatriz. A transição para a paragem do crescimento correlacionou-se com a coloração em todas as colónias com corantes de viabilidade (FIG. 12), com perda de expressão de EpCAM e CXCR4 e com um aumento constante na expressão de genes hepatocíticos e colangiocíticos específicos de adultos, tais como ureia e citocromo P450 3A4. (FIG. 5).
Colocaram-se hepatócitos normais de ratos adultos e humanos adultos em colagénio tipo I ou em estruturas de biomatriz de fígados de ratos ou bovinos e em HDM para células adultas. As células parenquimais adultas foram capazes de se fixar às estruturas dentro de 10 minutos (mesmo em meio isento de soro) versus em horas no colagénio tipo I, permaneceu em paragem do crescimento a partir do ponto de ligação; e permaneceu viável e totalmente funcional por mais de mais de 8 semanas em estruturas versus apenas cerca de ~ 2 semanas em colagénio tipo I. (Figs. 7 e 12) . Os niveis de funções das células hepáticas maduras em estruturas de biomatriz durante semanas revelaram-se os mesmos ou semelhantes aos achados de outros hepatócitos adultos recentemente isolados28. As distinções dramáticas são que as culturas no colagénio de tipo I deterioram-se rapidamente após 2 semanas, enquanto aquelas em estruturas de biomatriz permanecem estáveis morfologicamente e funcionalmente enquanto as culturas forem mantidas (até agora ~ 8 semanas).
As estruturas de Biomatriz contêm a maior parte dos componentes da matriz extracelular do tecido e citoquinas ligadas à matriz e fatores de crescimento que proporcionam um conjunto composto de sinais químicos que podem ser utilizados como uma estrutura estável e insolúvel com uma extraordinária capacidade para induzir hHpSCs a destinos adultos de fígado, células adultas totalmente diferenciadas por semanas. Ao comparar os tipos existentes de extratos matriciais preparados pelos investigadores com os da estrutura de biomatriz da presente invenção, é claro que tratamentos físicos, enzimáticos e químicos têm efeitos substanciais na composição, comportamento mecânico e respostas do hospedeiro a estruturas biológicos derivados de descelularização de tecidos e órgãos nativos e, consequentemente, têm implicações importantes para as suas aplicações in vitro e in vivo. Todos os outros métodos existentes para a preparação de substratos ou estruturas resultam na remoção de uma grande porção dos componentes da matriz quer através da utilização de enzimas de degradação da matriz16 quer utilizando tampões que dissolvem porções principais da matriz11. Os métodos físicos (por exemplo, congelamento rápido e agitação) podem trabalhar para preparar extratos de matriz de tecidos com uma estrutura em camadas, como derme (por exemplo, SIS, BSM)29' mas não são úteis para órgãos com estruturas de tecido complexas, como fígado. Por contraste, o nosso método para estruturas de biomatriz resultou em perda da maioria das proteínas celulares, mas preservou essencialmente todas, ou pelo menos, a maioria dos colagénios e dos componentes associados ao colagénio incluindo as citoquinas ligadas à matriz, hormonas e fatores de crescimento. A matriz extracelular é incorporada numa bicamada lipídica de mosaico, que mesmo no organismo mais simples é um ambiente complexo, heterogéneo e dinâmico. 0 método de delipidação é uma faceta crítica do protocolo. Os métodos comummente utilizados para descelularização de tecidos envolvem detergentes iónicos tais como SDC e dodecilsulfato de sódio (SDS). A SDC é relativamente mais suave do que a SDS, tende a causar menos interrupção na arquitetura do tecido nativo e é menos eficaz na solubilização das membranas celulares citoplasmáticas e nucleares. Não há relatos de decelularização tissular usando SDC sozinho. Muitos estudos utilizaram um detergente iónico não iónico (por exemplo, Triton X-100)31 ou detergentes zwitteriónicos (por exemplo, 3-(3-colamidopropil) dimetilamónio]-1-propanossulfonato, CHAPS)32. Por contraste, o nosso método de utilização duma combinação SDC e PLA2 delipidou o tecido rápida e suavemente.
Pelo menos vinte e nove tipos de colagénios (I-XXIX) foram identificados até agora em vertebrados com papéis funcionais na adesão celular, diferenciação, crescimento, desenvolvimento de tecidos e integridade estrutural33'34. Sabe-se que os principais componentes estruturais da matriz, os colagénios, permanecem insolúveis em concentrações elevadas de sal e a pH neutro35'36, um achado que é a base da nossa estratégia na preparação de estruturas de biomatriz. A estratégia tem as vantagens adicionais de que os colagénios permitem a preservação dos componentes da matriz ligados a eles, tais como lamininas e fibronectinas (FNs), proteoglicanos ricos em leucina (PGs) e GAGs que por sua vez preservam as citoquinas, fatores de crescimento ou recetores de superfície celular que estão ligados a eles.
As estruturas de biomatriz são únicas na sua profunda capacidade de induzir uma diferenciação rápida e consistente de células estaminais/progenitoras tais como hHpSCs a destinos adultos e manter aquelas células restritas a linhagem e manter aquelas células restritas a linhagem ou manter também células adultas colocadas nas estruturas, como células viáveis e totalmente funcionais durante muitas semanas (> 8 semanas). A diferenciação de células estaminais, como as células estaminais embrionárias (ES), células estaminais pluripotentes induzidas (iPS) ou formas variáveis de células estaminais mesenquimais (MSC) em tipos de células hepáticas totalmente maduras requer múltiplos conjuntos de sinais (solúvel e matriz), com indução por um conjunto necessário de iniciadores para responder a um conjunto diferente, e pode levar muitas semanas, até 6 semanas de cultura, para gerar células com destino de fígado adulto37. Além disso, a restrição de linhagens de MSCs a destinos de fígado dá resultados inconsistentes com células adultas tendo hepatócitos mistos e fenótipos de MSC. A diferenciação de células ES, células iPS e MSC resulta em células semelhantes a hepatócitos que expressam alguns, mas nunca todos, dos principais genes específicos do fígado; com variabilidade na qual os genes são observados; e os níveis de proteína para os genes expressos hepáticos são geralmente baixos40 ou altos para um gene hepático e insignificantes para os outros41'42. Em contraste, a diferenciação dos hHpSCs em estruturas de biomatriz resultou essencialmente em todas as células que expressam um fenótipo clássico de adulto e com atividades de ureia, albumina e CYP450 a níveis que estão próximos do normal após uma semana em cultura.
As células semelhantes a hepatócitos de qualquer um destes precursores e diferenciadas por protocolos diferentes das estruturas de biomatriz, expressam alguns, mas nunca todos, dos principais genes específicos do fígado, com variabilidade em que os genes são observados e com os níveis de proteína para hepáticos sendo os genes geralmente baixos ou altos para um gene hepático e insignificantes para outros. Por razões desconhecidas, os resultados são diferentes de preparação para preparação. Espera-se que a utilização das estruturas de biomatriz da presente invenção resulte numa diferenciação mais rápida destas populações de células estaminais e com maior consistência na obtenção de células com um fenótipo adulto estável. A diferenciação de determinadas populações de células estaminais, tais como hHpSCs em estruturas de biomatriz resultou essencialmente em todas as células que expressam um repertório clássico de genes e com atividades de ureia, albumina e de CYP450 a níveis normais dentro de 1 a 2 semanas em cultura e com estabilidade daquele fenótipo por muitas semanas. Assim, as estruturas de biomatriz da presente invenção têm o potencial de facilitar grandemente a diferenciação de populações de células estaminais determinadas a um fenótipo de fígado de adulto. A capacidade de diferenciar células estaminais em estruturas de biomatriz para alcançar células e tecidos maduros e funcionais oferece oportunidades consideráveis para programas académicos, industriais e clínicos que permitem o uso de tipos de células bem diferenciadas para cada tipo de estudo analítico e, de tecidos implantáveis, revascularizados ou mesmo órgãos que possam ser utilizados para pesquisas básicas e programas clínicos. REFERÊNCIAS PARA O EXEMPLO 1 1. Lanza, R. et al. Handbook of Stem Cells, Vol. 2 volumes. (Elsevier Academic Press, New York City; 2004) . 2. Vacanti, J.P. &amp; Langer, R. Tissue engineering: the design and fabrication of living replacement devices for surgical reconstruction and transplantation. Lancet 354 Suppl 1, SI32-34 (1999). 3. *Schmelzer, E. et al. Human hepatic stem cells from fetal and postnatal donors. Journal of Experimental Medicine 204, 1973-1987 [*co-equal first authors;**co-equal senior authors] (2007) . 4. Zhang, L., Theise, N., Chua, M. &amp; Reid, L.M. Human hepatic stem cells and hepatoblasts: Symmetry between Liver Development and Liver Regeneration. Hepatology 48, 1598-1607 (2008) . 5. Kubota, H. &amp; Reid, L.M. Clonogenic hepatoblasts, common precursors for hepatocytic and biliary lineages, are lacking classical major histocompatibility complex class I antigens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 97, 12132-12137 (2000). 6. Wauthier, E. et al. Hepatic stem cells and hepatoblasts: identification, isolation and ex vivo maintenance Methods for Cell Biology (Methods for Stem Cells) 86, 137-225 (2008). 7. Rhodes, J.M. &amp; Simons, M. The extracellular matrix and blood vessel formation: not just a scaffold. Journal of Cell and Molecular Medicine 11, 176-205 (2007) . 8. Chen, S.S., Fitsgerald, W., Zimmerberg, J., Kleinman, H.K. &amp; Margolis, L. Cell-cell and cell-extracellular matrix interactions regulation embryonic stem cell differentiation. Stem Cells 25, 553-561 (2007). 9. Daley, W.P., Peters, S.B. &amp; Larsen, M. Extracellular matrix dynamics in development and regenerative medicine. Journal of Cell Science 21, 255-264 (2008) . 10. Chun, S.Y. et al. Identification and characterization of bioactive factors in bladder submucosa matrix. Biomaterials 28, 4251-4256 (2007) . 11. 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Podem ser usados com estruturas de biomatriz de qualquer tecido, incluindo mamíferos grandes (por exemplo, tecidos humanos, porcinos e bovinos, etc.). Os tecidos de suínos e bovinos foram obtidos de uma instalação de processamento de carne certificada pelo USDA, foram transportados em RPMI 1640) . Este meio pode ser qualquer meio com uma composição que imite os constituintes do fluido intersticial e com uma osmolalidade na faixa de 250-350 mOsm/Kg. Os tecidos são então processados como aqui descrito para gerar estruturas de biomatriz.
Esses métodos incluem o processamento adicional de andaimes de estruturas de biomatriz para redução em partículas de tamanho μιη em suspensão para placas de revestimento usando automação. Em um exemplo não limitativo, o processo inclui homogeneização da estrutura de biomatriz em solução salina alta para garantir que os colagénios permaneçam insolúveis. Um tampão de delipidação modificado composto por 36 unidades/L de fosfolipase A2 mais 1% de desoxicolato de sódio e 0,1 mg/ml de inibidor de tripsina de soja é adicionado numa proporção de 1:1 tampão: homogeneizado, o que resulta no aumento flutuante do material de biomatriz no topo onde é recolhido para posterior processamento. O material de biomatriz é ainda processado para remoção do tampão de delipidação e lavado com solução de nuclease para remover nucleases: 5mg/lQQml de RNase, lmg/100ml de ADNase e 0,lmg/ml de inibidor de tripsina de soja, O material de biomatrix é depois processado em tampão de sal elevado (3,4M de NaCl) para assegurar a remoção de todos os resíduos, para manter os colagénios insolúveis e também para minimizar a atividade da protéase. O material de biomatriz é ainda processado para remover a alta concentração de sal para se preparar para redução de tamanho de partículas lavando o material de biomatriz em meio basal que contém antimicrobiano/antimicótico, gentamicina e tampão HEPES. O material de biomatriz é então processado para reduzir o tamanho de partícula do material de biomatrix para partículas de tamanho pm {intervalo l-lOOpm) em suspensão, em qualquer diluição, de forma ideal a 1:6, em meio basal que contém antimicrobianos/antimicóticos, gentamicina e tampão HEPES, congelado a -80 °C, e depois pulverizado por moagem criogénica. Se a biomatriz não for diluída antes da moagem da matriz é muito grosseira para revestir placas uniformemente. Este é um passo fundamental para permitir a moagem e até o revestimento de placas. As partículas de biomatriz podem ser suspensas em qualquer diluição, mas otimamente 1:6. As partículas de biomatriz sao descongeladas e revestidas em placas utilizadas para a diferenciação de células estaminais. As partículas de biomatriz podem ser diluídas para qualquer diluição, otimamente 1:24 em meio basal que contem antimicrobianos/antimicoticos, gentamicina e tampao HEPES e revestidos em placas usadas para manutenção a longo prazo de primarias primariamente isoladas, criopreservadas ou derivadas de tipos de células estaminais diferenciadas ou para diferenciar qualquer fonte de células estaminais em hepatócitos. A esterilização das placas revestidas com biomatriz pode ser feita com, por exemplo, irradiação gama (5000 rads) e armazenada a 4°C (ou congelada a -80°C) até o uso. As células de revestimento na biomatriz não requerem meio contendo soro para fixação, mas o meio contendo soro pode ser usado para aplicar células à biomatriz. A composição das partículas de biomatriz de qualquer tecido pode ser usada para revestir placas e outros aparelhos.
Como outro exemplo, a presente invenção proporciona um método de produção de uma estrutura de biomatrix a partir de tecido biológico para dispersão em escala industrial num aparelho de cultura, compreendendo: a) produzir uma estrutura de biomatriz de acordo com qualquer dos métodos desta invenção tal como aqui descrito, b) diluição da estrutura de biomatriz do passo (a) em meio basal; c) congelação da estrutura de biomatriz do passo (b) a cerca de -80°C; d} pulverização da estrutura de biomatrix do passo (c) por moagem criogénica em partículas de biomatriz variando em tamanho de cerca de 1 μιη a cerca de 100 pm (por exemplo, cerca de 1 pm, 2 pm, 5 pm, 10 pm, 15 pm, 20 pm, 25 Mm, 30 pm, 4 0 pm, 50 pm, 60 pm, 70 pm, 80 pm, 90 pm, 95 pm 100 pm, 110 pm, 120 pm, 150 pm, 200 pm, etc,); e) descongelamento das partículas de biomatriz do passo (d) em suspensão em meio basal; e f) dispersar as partículas de biomatriz do passo (e) num aparelho de cultura, produzindo assim uma estrutura de biomatriz de tecido biológico para dispersão em escala industrial em aparelhos de cultura. Em algumas formas de realização, este método pode ainda compreender o passo de esterilizar as partículas de biomatriz, que podem ser realizadas, por exemplo por irradiação gama.
Em algumas formas de realização dos métodos descritos acima, a estrutura de biomatriz do passo (b) pode ser diluído a cerca de uma proporção de 1:6 (por exemplo, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, etc.) em meio basal. Em algumas formas de realização, as partículas de biomatriz do passo (e) podem ser diluídas a cerca de 1:24 {por exemplo, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1: 21, 1:22, 1:23, 1:24, 1:25, 1:26, 1:27: 1:28, 1:29, 1:30, etc.) em meio basal. ESBOÇO DO PROTOCOLO EXEMPLAR USADO PARA FÍGADO ADULTO lOOOx Inibidor de tripsina de soja
Concentração final 0,1 mg/ml
Solução de transporte de tecidos
Meio basal como RPMI 1640 ou solução salina tamponada com fosfato com cálcio e magnésio
Solução antibiótica/antimicótica lOOx (Gibco # 15240-112) Gentamicina (25ug/ml) (Gibco # 15710-072)
Solução 1: solução de mistura de tecidos 3,4 M de NaCl 0,1 mg/ml de inibidor de tripsina de soja (Gibco # 17 075-029)
Solução 2: Solução de delipidação
Uma mistura da solução 1 com PBS 1:1 (p/Ca e Mg); sendo as proporções alternativas 1:2, 1:3, 1:4) ou, em alternativa, um meio basal tal como RPMI 1640 0,1% de desoxicolato de sódio (Sigma D6750-100 g) 36 u/L de fosfolipase A2 (Sigma P9279-25mg) 0,1 mg/ml de inibidor de tripsina de soja (Gibco # 17075- 029)
Solução 3: Solução de nuclease
Meio basal como RPMI 1640 5mg/lG0ml de RNase (Sigma R6513-lg) lmg/100m! DNase (DN25-lg) 0,1 mg/ml de Inibidor de tripsina de soja
Solução 4: Solução salina elevada 3 M de NaCl
Solução 5: Solução de remoção de sal e moagem
William's E
Antibiótico/Antimicótico (lOOx)
Gentamicina (30 yg/ml)
Passos no processo de isolamento de biomatriz para órgãos grandes 1. Homogeneização de tecidos em alto teor de sal 2. Decelularização e delipidação 3. Eliminação de Nuclease 4. Lavagem salina alta 5. Remoção de sal 6. Redução de tamanho de partículas de biomatriz 7. Revestir os pratos com biomatriz
Processo de isolamento de Biomatriz 1.0 Compra de Tecidos
1.1. Obter tecido orgânico de uma unidade certificada e inspecionada pelo USDA 1.2. Transportar o tecido de órgãos da instalação do USDA para o laboratório GigaCyte em recipiente de plástico na Solução de Transporte de Tecidos 1.3. Prepare tecido para perfusão ou homogeneização 1.3.1 A homogeneização é preferida para aplicação in vitro em placas de múltiplos poços 2.0 Homogeneização de tecido 2.1. Assepticamente, corte o tecido em pequenos pedaços (~ 3x3cm) com a lâmina cirúrgica n° 22 e coloque na solução de transporte de tecido para remover o sangue 2.2. Enxagúe os pedaços de tecido 3-4 vezes na Solução de Transporte de Tecidos para remover o máximo de sangue possível 2.3. Homogeneizar o tecido de ~ 4Q0g em volume igual da solução 1 até a mistura homogénea (~ 3-5 min.) 2.4. Despeje a solução de tecido homogeneizada num frasco de rolo de 2L para decelularização 2.5. Repita para todo o lote de peças de tecido 3.0 Decelularização e delipidação 3.1. Adicionar volume igual da solução 2 ao tecido homogeneizado na garrafa de rolo 3.2. Misture bem invertendo a garrafa várias vezes, então deixe-o ajustado por 15 a 30 minutos 3.3. O material da matriz flutuante subirá para o topo criando uma separação distinta do material da matriz leve no topo da solução colorida no figado 3.4. Pipetar o material da matriz flutuante e transferir para outro frasco de rolo 3.5. Lotear a matriz a partir de homogeneizações múltiplas 3.6. Transfira o material de matriz de ~ 375 ml para uma garrafa de centrífuga de 750 ml, adicione o mesmo volume da Solução 2 a cada garrafa e agite vigorosamente durante ~ 1 minuto para garantir a decelularização completa e a delipidação 3.7. Granule por centrifugação a uma velocidade elevada (375QRPM) durante 10 minutos, depois remova o sobrenadante 3.8. Repita este processo 1 vez mais (2 vezes total) 4.0 Remoção de Nuclease 4.1. Retire o sobrenadante após a lavagem final da decelularização, tomando cuidado para não perturbar o sedimento da biomatriz 4.2. Adicione volume igual da Solução 3 a cada garrafa e agite vigorosamente durante ~ 1 min. Para garantir que todo o material esteja em suspensão e remoção completa das nucleases 4.3. Granule por centrifugação a uma velocidade elevada (3750RPM) durante 10 minutos, depois remova o sobrenadante 4.4. Repita esse processo mais uma vez. (total de 2 vezes) 5.0 Lavagem salina elevada 5.1. Retire o sobrenadante após a lavagem final de nuclease, tendo o cuidado de não perturbar o grânulo de biomatriz 5.2. Adicione o volume igual da Solução 4 a cada frasco e agite vigorosamente cuidando que todo o material esteja suspenso 5.3. Granule por centrifugação a uma velocidade elevada (3750RPM) durante 10 minutos, depois remova o sobrenadante 5.3.1. Nesta fase, a biomatrix não granula bem e é dinâmica após a centrifugação. 5.3.2. Pipetar o sobrenadante e passar pelo filtro de nylon para recolher o material flutuante 5.3.3. Retorno da matriz flutuante recolhida na garrafa centrífuga 5.4. Repita este processo, pelo menos, 2 vezes antes de parar 5.4.1 O sobrenadante é ligeiramente bronzeado para limpar a cor após a lavagem salina final 5.5. Após a 2a lavagem salina é um bom ponto de parada se for atrasado no dia. 5.6. Despeje o conteúdo de todas as garrafas de centrífuga numa garrafa de rolo e cubra com a Solução 4, depois coloque a biomatriz em 4°C durante a noite. 5.7. No dia seguinte, continue com as lavagens de sal restantes 5.8. Agite vigorosamente a garrafa de biomatriz para misturar bem o material de biomatriz, então transfira a biomatriz para as garrafas da centrífuga e continue 3-4 mais lavagens com sal 5.9. Condense a biomatriz em tão poucos frascos quanto possíveis, preenchendo cada um o máximo de meio cheio para permitir lavagens com sal 6.0 Remoção de sal 6.1. Retire o sobrenadante após a lavagem salina final, cuidando de não perturbar o grânulo de biomafriz 6.2. Adicione o mesmo volume da Solução 5 e agite vigorosamente para garantir que todo o material da biomatriz esteja em suspensão 6.3. Granule por centrifugação a uma velocidade elevada (3750RPM) por 10 minutos 6.4. Remova o sobrenadante e adicione o mesmo volume de Solução 5 e agite vigorosamente. 6.5. Repita 2 vezes (3 vezes no total} para garantir que o sobrenadante esteja limpo 6.5.1. A biomatriz vai dar um grânulo mais forte com cada rotação 6.5.2. 0 sobrenadante deve ser limpo sem qualquer cor após a lavagem final 6.6. Após a lavagem final com a solução 5, registe o volume dos grânulos da matriz de cada garrafa 6.7. Transferir e juntar todos os grânulos de biomatriz numa nova garrafa de rolo 6.8. Medir o volume do material de biomatriz 6.9. Diluir a biomatriz combinada 1:6 com a Solução 5 6.9.1. Calcular quantidade de Solução 5 necessária 6.9.1.1. Exemplo: 200 ml de biomatriz x 6 = 1200 6.9.1.2. Adicionar 1L de Solução 5 a 200ml de biomatriz para uma suspensão de 1:6 de biomatriz 6.10. Alíquotas de 30ml de suspensão de biomatriz 1:6 em sacos congeladores pré-rotulados 6.11. Congelar sacos de biomatriz a -80°C e armazenar até à moagem 6.12. Prepare "folha de dados de moagem de lote de biomatriz" para o novo lote de biomatriz 6.12.1. Registe o número de sacos produzidos a partir deste novo lote 6.12.2. Cada saco é uma moagem separada do mesmo lote 6.13. O material de biomatriz produzido a partir deste lote é considerado um lote 6.14. Atribuir o número do lote ao lote 7.0 Redução de tamanho de partícula de biomatriz 7.1. Prepare o moinho de moagem (Spex Sample Prep 6870) com LN2 e câmara de moagem 7.2. Remova o saco congelado de biomatrix do congelador 7.3. Parta em pedaços pequenos 7.4 transfira as peças de biomatriz congeladas para a câmara de moagem pré-refrigerada 7.5. Moa 2 vezes (12x2 minutos cada moagem seguido por 2 minutos de arrefecimento) 48 minutos cada em moinho criogénico 7.6. Transferir a biomatriz de terra em garrafa de 100ml pré-rotulada com número de lote e número de saco (o número do saco identifica a data da moagem) 7.7. Manter congelada a -8G°C até estar pronta para revestir placas 8.0 Preparação de biomatrix para placas de revestimento
8.1. Descongelar uma garrafa pelo método de descongelamento rápido de biomatriz em banho-maria a 37°C 8.2. Medir a suspensão da biomatriz descongelada (deve ser ~ 30ml ± 2ml) 8.3. Diluir para 1:24 com a Solução 5 (ver Figura 17) 8.3.1. Calcular o volume da solução 5 para adicionar à suspensão de biomatriz 1:6 8.3.1.1. Multiplicar o volume de suspensão da biomatrix x 3 8.3.1.2. Adicione esse volume à suspensão 1:6 para diluição 1:24 8.4. Revista as placas imediatamente (deixando o conjunto de biomatriz diluído resultar em aglomeração) 9.0. Revestir os pratos com biomatriz 9.1. Determine o número de placas a serem revestidas. Consulte a Tabela 8 para obter volumes de plaqueamento
Retire as placas da embalagem de forma asséptica e organize-se na capa de fluxo laminar.
Transfira o volume apropriado de suspensão de biomatriz em cada poço, utilizando uma pipeta multicanal, quando apropriado. Consulte a Tabela 1 para obter o volume do plaqueamento
Certifique-se de que a suspensão esteja uniformemente distribuída através da placa/poço, se necessário, mas não remova da superfície plana do capô.
Deixe as placas permanecerem intactas durante a noite Primeiro dia, retire a solução de cada poço
Manuseie cuidadosamente as placas para que o revestimento da matriz não seja perturbado
Incline a placa na sua direção sem remover a borda da placa da superfície do capô. Isso estabiliza a placa para evitar movimentos bruscos que farão desaparecer a biomatriz da placa
Usando aparelhos de sucção com pipeta de ponta fina, aspirar a solução inteira de cada poço. NÃO TOQUE A SUPERFÍCIE DA MATRIZ COM PIPETTA!!!
Coloque cuidadosamente o prato de volta, retire a tampa e deixe secar completamente (~ 2 horas)
Mover a placa enquanto molhada perturba o revestimento da biomatriz Não mova as placas até a matriz estar seca
Quando completamente seco, substitua a tampa e examine a qualidade
Coloque placas que tenham revestimento suave na bolsa de placa
Sele a bolsa e aplique a etiqueta Esterilizar por irradiação gama (5000 rads)
Armazene as placas revestidas em 4°C
Armazene as placas revestidas em embalagens de 5 na embalagem de gelo 1.0 Utilização de placas de biomatriz 1.1. Retire a placa da embalagem de forma asséptica e coloque no gabinete de segurança biológica 1.2. Adicione meio a cada poço e coloque em incubadora, pelo menos, 2 horas antes do uso 1.3. Quando estiver pronto para colocar as células, remova o meio de reidratação e lave com um meio de cultura de tecido uma vez 1.4. Adicione as células
Tabela 1: Intervalos de concentração molar de NaCl para tipos de colagénio I-V.
Estes dados são representativos das condições de insolubilidade de tipos de colagénios. É preciso identificar os tipos de colagénio dentro de um tecido e, em seguida, usar a maior concentração de sal identificada para os colagénios no tecido e como a dos tampões usados para a preparação das estruturas de biomatriz. Por exemplo, para a pele, usar-se-ia um tampão a pH neutro e com uma concentração salina de 4,0M, uma concentração de sal que manteria colagénios tipo I e III insolúveis. Em contraste, para a placenta, usar-se-ia um tampão a pH neutro e 4,5M de sal para manter o colagénio tipo IV e tipo IV insolúvel.
Os tipos de colagénios presentes num tecido são distintos em diferentes idades de um hospedeiro. Por exemplo, os fígados fetais têm níveis elevados de colagénios tipo III, IV e V (requerendo concentrações de sal acima de 4,0M), enquanto os fígados adultos possuem uma mistura de colagénios tipo I, III, IV, V, VI e XVIII (que requerem menores concentrações de sal) . Assim, a concentração de sal necessária para uma preparação de estruturas de biomatriz é ditada pelo repertório de colagénios que são dominantes no tecido. Consulte a referência 23 do Exemplo 1 para obter mais detalhes.
Tabela 2. Análises do conteúdo de colagénio em estrutura de biomatriz do fígado
Tabela 3. Análises dos fatores de crescimento ligados a estruturas de biomatriz de duto biliar
Tabela 4. Anticorpos utilizados
Tabela 5. Iniciadores para RT-PCR
Tabela 6. Análises do fator de crescimento Ligado às estruturas de biomatriz do figado
Tabela 7. Propriedades de células estamlnals hepáticas humanas (hHpSCs) após isolamento e em cultura
Tabela 8. Volumes de plaqueamento de biomatriz para placas de multl-poços
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<223> RT-PCR primer <400>S tgtgttgcct ctatccttcc c 21 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <22G> <223> RT-PCR primer <4GQ> 9 gcg accccaa ga cctacag 19 <210> 10 <211>19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RT-PCR primer <400> 10 ggttctgccg gtagaaggg 19 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RT-PCR primer <4G0> 11 ttgacattgg agtgaaaagg acg 23 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RT-PCR primer <400> 12 tgctcagaac cttggggati c 21 <210> 13 <211> 21 <212> DMA <213> Artificial <220 <223> RT-PCR primer <400 13 cttgcacaca aaaagcccac t 21 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Artificiai <220> <223> RT-PCR primer <400> 14 gggatgcctt cttgctatct cat 23 <210 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificiai <220> <223> RT-PCR primer <400> 15 tttatgcccc ggaactcctt t 21 <210 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificiai <220 <223> RT-PCR primer <400> 16 acaggcaggc agctttatca g 21 <210> 17 <211 >22 <212> DNA <213> Artificiai <220 <223> RT-PCR primer <400> 17 cctcctacct tgattgcatc ag 22 <210 18 <211> 22 <212» DNA <213> Artificiai <220> <223» RT-PCR primer <400> 18 ttttgaccca tagaactctg cc 22 <210 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificiai <220 <223» RT-PCR primer <400 19 aagtcgcctc gaagataca c a 21 <210» 20 <211>21 <212> DNA <213> Artificiai <220> <223> RT-PCR primer <400 20 aaggagagaa cactgctcgt g 21 <210> 21 <210 21 <212> DNA <213» Artificiai <220> <223> RT-PCR primer <400> 21 tttgggaccc igtaccattg t 21 <210> 22 <210 21 <212» DNA <213> Artificiai <220> <223> RT-PCR primer <400> 22 gcatiggact tgaggaagct c 21 <210> 23 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <22.Q> <223=· RT'PCR primer <400> 23 tcagggaaag ataaagccga cc 22 <210> 24 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RT-PCR primer <400 24 aggfagattc gtgacagaca gac 23 <210=· 25 <211> 20 <212> DNA <213» Artificiai <22Q> <223=· RT-PCR primer <400> 25 aaaaggccag cgttgtctcc 20 <210> 26 <211> 21 <212» DNA <213> Artificial <220» <223> RT-PCR primer <400=· 26 tgaagccagc ictctatccc a 21 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213» Artificial <220> <223> RT-PCR primer <400> 27 ggggagatcg agggctatga g 21
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Claims (11)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Método de produção de uma estrutura de biomatriz de tecido de figado de mamífero para dispersão em escala industrial num aparelho de cultura, que compreende: a) perfundir o tecido do fígado ou homogeneizar o tecido do fígado com um tampão compreendendo uma concentração de sal de 3,5 M de NaCl até 4,5 M NaCl, depois b) perfundir o tecido do fígado ou extrair o homogeneizado do passo (a) com um tampão de delipidação compreendendo desoxicolato de sódio e fosfolipase A2 num primeiro meio, em que a osmolalidade do referido primeiro meio é de 250 mOsm/kg a 350 mOsm/kg e o dito primeiro meio é livre de soro e pH neutro; depois c) perfundir o tecido ou extrair o homogeneizado do passo (b) com um tampão a um pH neutro e compreender uma concentração de sal de 2,0 M de NaCl até 5,0 M de NaCl, a concentração escolhida para manter os colagénios insolúveis identificados no tecido biológico; depois d) perfundir o tecido ou extrair o homogeneizado do passo (c) com RNase e DNase num tampão; e depois e) enxaguar o tecido ou o homogeneizado do passo (d) com um segundo meio que está em pH neutro, é isento de soro e possui uma osomolidade de 250 mOsm/kg a 350 mOsm/kg, produzindo assim uma estrutura de biomatriz intacta ou homogeneizada de tecido do fígado, retendo a dita estrutura de biomatriz, pelo menos, 95% dos seus colagénios originais e a maioria dos componentes da matriz associados ao colagénio e fatores de crescimento vinculados à matriz, hormonas e citoquinas do tecido biológico; f) diluição da estrutura de biomatriz em meio basal; g) congelamento da estrutura de biomatriz do passo (f); h) pulverização da estrutura de biomatriz do passo (g) por moagem criogénica em partículas de biomatriz variando em tamanho de 1 pm a 100 pm; i) descongelar as partículas de biomatriz do passo (h) em suspensão em meio basal; e j) dispersar as partículas de biomatriz do passo (i) num aparelho de cultura, produzindo assim uma estrutura de biomatriz de tecido biológico para dispersão em escala industrial num aparelho de cultura.
  2. 2. Método da reivindicação 1, compreendendo ainda o passo de esterilizar a estrutura de biomatriz, opcionalmente em que a esterilização do passo é realizada por irradiação gama.
  3. 3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que a estrutura de biomatriz do passo (f) é diluído numa proporção de 1:6 no meio basal,
  4. 4. Método de qualquer reivindicação anterior, em que as partículas de biomatriz do passo (í) são diluídas na proporção de 1:24 no meio basal.
  5. 5. Método de qualquer reivindicação anterior, era que o primeiro meio compreende sais, minerais, aminoácidos, v i t ara i n a. s e a ç ú c a r e a .
  6. 6. Método de qualquer reivindicação anterior, em que o primeiro meio é um meio basal, opcionalmente em que o meio basal é selecionado do grupo que consiste em RPMI 1640, DME/F12, BMS, F12, meio de Waymouth e de William,
  7. 7. Método de qualquer reivindicação anterior, em que o segundo meio compreende, pelo menos, um. d.os constituintes presentes no fluido intersticial.
  8. 8. Método de qualquer reivindicação anterior, em que o tampão de delipidação do passo (b) compreende, de 20 unidades/L a 50 unidades/L de fosfolipase Kl e 1% de desoxicolato de sódio no primeiro meio.
  9. 9. Método de qualquer reivindicação anterior, em que a concentração de sal do tampão do passo (c) é de 3,4 M de NaCl até 3,5 M de NaCl quando utilizado para a preparação da estrutura de um fígado adulto e é de 4,0 M de NaCl até 4,5 M de NaCl quando utilizado para reparação da estrutura de um fígado fetal.
  10. 10. Método de qualquer reivindicação anterior, em que o tampão do passo (c) compreende ainda um inibidor de protéase, opcionalmente em que o inibidor de protéase é um inibidor d.e tripsina de soja. 11v Método de qualquer reivindicação anterior, em que o tampão do passo (d) compreende ainda um inibidor de protéase, opcionalmente em que o inibidor de protéase é um inibidor de tripsina de soja.
  11. 12. Método d.e qualquer reivindicação anterior, em que todos os meios e tampões das etapas {a.) a. (e) estão livres de uma qua.ntid.ade detetável de uma encima que degrada os componentes da matriz extracelular.
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