KR102348063B1 - 증식 가능한 간 오가노이드 분화용 배지 조성물 및 이를 이용한 간 오가노이드의 제조방법 - Google Patents

증식 가능한 간 오가노이드 분화용 배지 조성물 및 이를 이용한 간 오가노이드의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 증식 가능한 간 오가노이드 분화용 배지 조성물 및 이를 이용한 간 오가노이드 제조방법에 관한 것으로, 본 발명의 배지 조성물을 이용하여 제조한 간 오가노이드는 여러 번의 계대배양을 거쳐도 성숙 간 세포의 특성을 유지하는 증식 가능성을 나타내므로, 독성 예측, 재생 및 염증 반응 예측, 약물 스크리닝 및 간 지방증과 같은 질병에 대한 모델링에 있어서 유용하게 활용될 것이다.

Description

증식 가능한 간 오가노이드 분화용 배지 조성물 및 이를 이용한 간 오가노이드의 제조방법{MEDIA COMPOSITION FOR DIFFERENTIATION OF EXPANDABLE LIVER ORGANOIDS AND METHOD FOR PRODUCING LIVER ORGANOIDS USING THE SAME}
본 발명은 증식 가능한 간 오가노이드 분화용 배지 조성물 및 이를 이용한 간 오가노이드 제조방법에 관한 것이다.
전임상 약물 개발에서 약물 효능 및 독성 시험을 위해서는 인간 세포-기반 및 개인화된 시험관 내 간 모델이 요구된다. 간은 생체 내에서 본래 재생 가능성을 갖는 대표적인 기관이지만, 간 대사를 평가하기 위한 최적 표준(gold standard)으로 간주되는 일차 인간 간 세포(primary human hepatocytes, PHHs)는 in vitro에서 증식 능력 및 장기 기능성이 상실된다는 한계가 있다.
PHHs의 이러한 한계를 극복하기 위하여 유전자 변형, 조직 공학 기술과 결합된 3차원(3D) 배양 및 한정된(defined) 배지 조성을 포함한 다양한 접근법이 개발되었다. 그러나, 본래 간 기능을 재현하기 위한 대안적이고 지속 가능한 세포 공급원의 개발은 여전히 과제로 남아있다.
한편, 줄기 세포는 간 세포의 유용한 대안적인 공급원이며, 간 세포는 만능 줄기 세포(pluripotent stem cells, PSCs)로부터 다양한 방법으로 수득될 수 있다. PSCs로부터 생성된 간 스페로이드(spheroids) 또는 오가노이드(organoids)가 줄기 세포-기반 시험관 내 3D 간 모델로 주목 받고 있으나, 증식능과 기능성을 유지하는 것이 어렵다. 다른 대안인, 조직-유래 간 오가노이드는 인간 조직에 대한 접근성 및 좁은 분화 가능성이라는 한계가 존재한다.
따라서, 인간 배아 줄기 세포(human embryonic stem cells, hESCs) 및 유도 만능 줄기 세포(induced pluripotent stem cells, iPSCs)를 포함하는 PSCs로부터 유래된 증식 가능하고 보다 성숙한 간 오가노이드를 생성할 수 있는 방법의 개발이 요구되는 상황이다.
본 발명자들은 상기 종래 기술의 문제점을 개선하고자 예의 노력한 결과, 본 발명에 의해 생성된 간 오가노이드가 2D 분화된 간 세포와 비교하여 보다 성숙한 표현형을 나타내며, 67회 이상까지 계대배양이 가능하고, 여러 번의 계대배양을 거쳐도 간 세포의 특성을 유지하는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다. 따라서, 본 발명은 독성, 재생 및 염증 반응 예측, 약물 스크리닝 및 간 지방증과 같은 질병에 대한 모델링에 적합한 인간 간 오가노이드를 재현 가능하게 제공한다.
본 발명의 목적은 67회 이상까지 계대배양이 가능하고, 여러 번의 계대배양을 거쳐도 성숙 간 세포의 특성을 유지하는, 증식 가능한 간 오가노이드 분화용 배지 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은, 상기 배지 조성물을 이용하여 증식 가능한 간 오가노이드를 제조하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 방법에 의해 제조된 증식 가능한 간 오가노이드를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 간 오가노이드를 이용하는 간 독성 약물의 스크리닝 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 간 오가노이드를 이용하는 지방간 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 bFGF(basic fibroblast growth factor), 온코스타틴 M(oncostatin M, OSM) 및 ITS(insulin-transferrin-selenium)를 포함하는 간 오가노이드 분화용 배지 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 줄기 세포로부터 분화된 간 내배엽 세포 또는 간 세포를 상기 배지 조성물에서 배양하는 단계를 포함하는, 간 오가노이드의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제조된 간 오가노이드를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 간 오가노이드에 시험 물질을 접촉시키는 단계 및 상기 간 오가노이드에서 세포 생존률 또는 산소 소모율(Oxygen Consumption Rate, OCR)을 측정하는 단계를 포함하는, 간 독성 약물의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 간 오가노이드를 지방간 오가노이드로 제조하는 단계 및 상기 지방간 오가노이드에 지방간 치료제 후보 물질을 처리하는 단계를 포함하는, 지방간 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 배지 조성물을 이용하여 제조한 간 오가노이드는 2D 분화된 간 세포와 비교하여 보다 성숙한 간 세포의 특성을 나타내며, 조직 유래 간 오가노이드와 비교하여 수득하기 용이하고, 67회 이상까지 계대배양이 가능하며, 여러 번의 계대배양을 거쳐도 성숙 간 세포의 특성을 유지하는 증식 가능성을 나타내므로, 독성, 재생 및 염증 반응 예측, 약물 스크리닝 및 간 지방증과 같은 질병에 대한 모델링에 있어서 유용하게 활용될 것이다.
도 1은 만능 줄기 세포로부터 간 오가노이드를 제조하는 과정을 나타내는 모식도이다.
도 2는 분화를 시작하기 전의 PSC의 형태(왼쪽), 성숙 간 세포의 2D 단일 층(중간) 및 3D 간 오가노이드(오른쪽)의 이미지이고, 화살표는 2D 세포 위에 부유하는 3D 오가노이드를 나타낸다.
도 3은 생성된 3D 간 오가노이드(왼쪽) 및 이의 확대 이미지(오른쪽)이다.
도 4는 HM 배지에서 제조한 간 오가노이드의 추가 분화를 위한 프로토콜의 최적화 과정을 나타내는 모식도이다.
도 5는 각 분화 조건에서의 ALB 및 CYP3A4의 발현량을 측정한 결과이다. * p <0.05 및 *** p <0.001.
도 6은 현탁액 배양 또는 마트리겔에서 배양된 오가노이드의 형태를 나타내는 이미지이다.
도 7은 HM 배지에서 제조한 간 오가노이드의 각 계대배양 과정에서 계산된 누적 세포 수를 나타낸다. 데이터는 평균 ± SEM이다(n=3).
도 8은 HM 배지에서 제조한 간 오가노이드의 증식 가능성 및 특성을 확인하기 위해, 각각의 표지된 항체로 염색한 면역 형광 이미지이다.
도 9는 iPSCs, 간 내배엽 분화 세포(HE), 2D 성숙 간세포(MH) 및 오가노이드에서 각 세포 특이적 유전자 마커의 mRNA 발현 수준을 측정한 결과이다. 데이터는 평균 ± SEM (n = 3)이며, Student's t-test로 분석하였다. * p <0.05; ** p <0.01; 및 *** p <0.001.
도 10은 HM 배지에서 제조한 간 오가노이드의 특성을 분석하기 위하여, 각각의 표지된 항체로 염색한 면역 형광 이미지이다.
도 11은 HM 배지에서 제조한 간 오가노이드의 ALB에 대한 FACS 분석한 결과이다.
도 12는 HM 조건, EM 조건 및 DM 조건에서 제조한 오가노이드의 이미지이다.
도 13은 HM 조건, EM 조건 및 DM 조건에서 제조한 오가노이드에서 특정 마커의 mRNA 발현 수준을 일차 인간 간세포(PHH) 및 인간 간 조직과 비교한 결과이다. 데이터는 평균 ± SEM (n = 3)이며, Student's t-test로 분석하였다. * p <0.05; ** p <0.01; 및 *** p <0.001.
도 14는 각각의 표지된 항체로 염색된 EM 조건 오가노이드(상부) 및 DM 조건 오가노이드(하부)의 면역 형광 이미지이다.
도 15는 EM 조건 및 DM 조건에서 제조한 오가노이드의 ALB에 대한 FACS 분석한 결과이다.
도 16은 HM 조건 및 DM 조건에서 제조한 오가노이드를 과요오드산-쉬프(PAS)로 염색한 이미지이다.
도 17은 HM 조건 및 DM 조건에서 제조한 오가노이드를 인도시아닌 그린(ICG)과 함께 15분 동안 배양한 후의 이미지이다.
도 18은 2D 분화된 MH, HM 조건 및 DM 조건에서 제조한 오가노이드 및 PHH에서 알부민(ALB) 및 α1-항트립신(antitrypsin)(AAT)의 분비량과 요소(urea) 생산량을 정량화하여 비교한 결과이다. 정량은 24 시간에 걸쳐 백만 세포 당 ml 배양 배지 당 양으로 계산하였다. 데이터는 평균 ± SEM (n = 3)이며 Student's t-test로 분석하였다. * p <0.05; ** p <0.01; 및 *** p <0.001. Clever's 그룹에 의해 보고된 인간 간 조직 유래 오가노이드의 수치는 가로 막대로 표시하였다.
도 19는 HM 조건 및 DM 조건에서 제조한 오가노이드에서 CDFDA로 염색된 담즙 관-유사 구조(bile canaliculi-like structures)의 형광 이미지이다.
도 20은 2D 분화된 MH와 HM 조건 오가노이드에서 CYP 패밀리의 유전자 발현 수준을 비교한 결과이다. * p <0.05; ** p <0.01; 및 *** p <0.001.
도 21은 10 μM 니페디핀(NIF) 유도가 있거나 없는 2D 분화 된 MH, HM 조건 및 DM 조건에서 제조한 오가노이드에서 CYP3A4의 mRNA 발현량을 비교한 결과이다. 데이터는 평균 ± SEM (n = 3)이며 Student's t-test로 분석하였다. ** p <0.01; 및 *** p <0.001.
도 22는 2D 분화된 MH, HM 조건 및 DM 조건에서 제조한 오가노이드 및 PHH에서 NIF-유도된 CYP3A4 효소 활성을 비교한 결과이다. 결과는 백만 세포 당 ml 당 상대 발광 단위(relative luminescence units; RLU)로 제시하였다. 데이터는 평균 ± SEM (n = 3)이며 Student's t-test로 분석하였다. *** p <0.001.
도 23은 12시간 동안의 니페디핀 처리 후 2D 분화된 MH, HM 조건 및 DM 조건에서 제조한 오가노이드에 의해 대사되지않고 남은 잔류 니페디핀의 상대적 수준을 비교한 결과이다. 데이터는 평균 ± SEM (n = 3)이며 Student's t-test로 분석하였다. * p <0.05; ** p <0.01; 및 *** p <0.001.
도 24는 2D 분화된 MH와 HM 조건의 오가노이드에 테스토스테론 처리 후 12시간 동안 대사되어 생성되는 6β-하이드록시테스토스테론의 상대적 수준을 비교한 결과이다. 데이터는 평균 ± SEM (n = 3)이다.
도 25는 CYP3A4 및 CYP1A2/2E1 매개 간 독성 약물 등을 6일 동안 처리한 후 2D 분화된 MH(상부) 및 HM-조건의 오가노이드(하부)의 이미지이다.
도 26은 2D 분화된 MH 및 HM-조건의 오가노이드에 각 약물을 6일 동안 처리한 후 세포 수로 독성 농도(TC50)를 측정한 결과이다. 데이터는 평균 ± SEM (n = 3)이다.
도 27은 2D 분화된 MH 및 HM-조건의 오가노이드에서 각 농도의 트로바플록사신으로 6일 동안 처리한 후 세포 수를 측정한 결과이다. 데이터는 평균 ± SEM (n = 3)이며 Student's t-test로 분석하였다. ** p <0.01; 및 *** p <0.001.
도 28은 2D 분화된 MH 및 HM-조건의 오가노이드에서 각 농도의 트로바플록사신 및 레보플록사신으로 6일 동안 처리한 후 세포 수를 측정한 결과이다. 데이터는 평균 ± SEM (n = 3)이며 Student's t-test로 분석하였다. ** p <0.01; 및 *** p <0.001.
도 29는 0.8 μM 의 트로바플록사신 및 레보플록사신을 6일 동안 처리한 후 측정한 OCR 결과이다. 데이터는 평균 ± SEM (n = 5)이며 Student's t-test로 분석하였다. * p <0.05.
도 30은 4 μM 의 트로바플록사신 및 레보플록사신을 6일 동안 처리한 후 측정한 OCR 결과이다. 데이터는 평균 ± SEM (n = 5)이며 Student's t-test로 분석하였다. * p <0.05.
도 31은 본 발명의 일 실시예에 따른 간 오가노이드에서 독성 손상에 의한 회복 기능을 확인하기 위한 실험 과정을 나타내는 모식도이다.
도 32는 대조군, 7일 동안 APAP 처리한 오가노이드(APAP) 및 60시간 동안 APAP 처리 후 배지 교환한 오가노이드(Recover)의 2일, 4일 및 7일 차에 형태를 관찰한 이미지이다.
도 33은 대조군, 7일 동안 APAP 처리한 오가노이드(APAP) 및 60시간 동안 APAP 처리 후 배지 교환한 오가노이드(Recover)에서 크기를 측정하여 비교한 결과이다. 데이터는 평균 ± SEM (n = 20)이며 Student's t-test로 분석하였다. * p <0.05 및 ** p <0.01.
도 34는 대조군, 7일 동안 APAP 처리한 오가노이드(APAP) 및 60시간 동안 APAP 처리 후 배지 교환한 오가노이드(Recover)에서 ROS 검출을 위해 다이하이드로에티듐으로 염색된 오가노이드의 형광 이미지 및 각각의 표지된 항체로 염색된 오가노이드의 면역 형광 이미지이다.
도 35는 도 31에 표시된 각각의 조건에서 ATP 함량을 측정하여 비교한 결과이다. 데이터는 평균 ± SEM (n = 3)이며 Student's t-test로 분석하였다. ** p <0.01 및 *** p <0.001.
도 36은 도 31에 표시된 각각의 조건에서 GHS/GSSG 비율을 측정하여 비교한 결과이다. 데이터는 평균 ± SEM (n = 3)이며 Student's t-test로 분석하였다. ** p <0.01 및 *** p <0.001.
도 37은 7일 동안 APAP 처리한 오가노이드(APAP injury) 및 60시간 동안 APAP 처리 후 배지 교환한 오가노이드(APAP recover)에서 표시된 각각의 날짜에 염증 반응 관련 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정한 결과이다. 데이터는 평균 ± SEM (n = 3)이며 Student's t-test로 분석하였다. * p <0.05; ** p <0.01; 및 *** p <0.001.
도 38은 BSA, FA(올레이트 및 팔미테이트), FA + 이토목시르(CPT1 억제제), FA + L-카르티닌 및 FA + 메트포르민을 각각 처리한 HM 조건의 오가노이드의 형태를 나타내는 이미지(상단 패널), 지질 방울(사각형으로 표시된 부분)의 확대 이미지(가운데 패널) 및 Nile red로 염색된 공초점 형광 이미지(하단 패널)이다.
도 39는 BSA, FA(올레이트 및 팔미테이트), FA + 이토목시르(CPT1 억제제), FA + L-카르티닌 및 FA + 메트포르민을 각각 처리한 HM 조건의 오가노이드를 Nile red로 염색한 후 상대적 Nile red 강도를 측정한 결과이다. 데이터는 평균 ± SEM (n = 3)이며 Student 's t-test로 분석하였다. * p <0.05.
도 40은 BSA, FA(올레이트 및 팔미테이트), FA + 이토목시르(CPT1 억제제), FA + L-카르티닌 및 FA + 메트포르민을 각각 처리한 HM 조건의 오가노이드에서 트리글리세라이드 농도를 측정한 결과이다. 데이터는 평균 ± SEM (n = 3)이며 Student 's t-test로 분석하였다. ** p <0.01 및 *** p <0.001.
도 41은 BSA, FA(올레이트 및 팔미테이트), FA + 이토목시르(CPT1 억제제)및 FA + L-카르티닌을 각각 처리한 HM 조건의 오가노이드에서 OCR을 측정한 결과이다. 데이터는 평균 ± SEM (n = 5)이고 Student's t-test로 분석하였다. * p <0.05 및 *** p <0.001.
도 42는 지방간 치료제를 스크리닝 하기 위하여, 오토파지 라이브러리로부터 지방 축적을 억제시키는 약물을 스크리닝한 결과이며, 지방증 유도된 간 오가노이드에 가장 효과가 우수한 4가지 약물(Everolimus, Scriptaid, Tacedinaline 및 KU-0063794)을 각각 처리한 간 오가노이드의 형태를 나타내는 이미지(상부) 및 Nile red로 염색된 공초점 이미지(하단)이다.
도 43은 Everolimus, Scriptaid, Tacedinaline 및 KU-0063794를 각각 처리한 지방증 유도된 간 오가노이드에서 CD36, SREBP 및 CPT1의 mRNA 발현량을 비교한 결과이다. 데이터는 평균 ± SEM (n = 3)이며 Student's t-test로 분석하였다. * p <0.05; ** p <0.01; 및 *** p <0.001.
도 44는 Everolimus, Scriptaid, Tacedinaline 및 KU-0063794를 각각 처리한 지방증 유도된 간 오가노이드에서 트리글리세라이드 농도를 측정한 결과이다. 데이터는 평균 ± SEM (n = 3)이며 Student 's t-test로 분석하였다. * p <0.05; ** p <0.01; 및 *** p <0.001.
도 45는 종래 프로토콜에 따라 PSC로부터 분화한 2D MH(a 조건), PSC로부터 분화한 간 내배엽 세포를 MH 배지(b 조건), HM 배지(c 조건), EM 배지(d 조건) 또는 DM 배지(e 조건)에서 3D 배양하여 생성된 오가노이드 대표 적인 이미지이다.
도 46은 각 조건에서 제조한 오가노이드의 크기를 비교한 결과이다. * p <0.05; ** p <0.01; 및 *** p <0.001.
도 47은 각 조건에서 제조한 오가노이드의 수를 비교한 결과이다. * p <0.05; ** p <0.01; 및 *** p <0.001.
도 48은 각 조건에서 제조한 오가노이드의 계대배양 가능 횟수를 나타낸다.
도 49는 1회 계대배양(p1) 이후의 각 조건에서 생성된 오가노이드의 이미지이다.
도 50은 각각의 조건에서 제조한 오가노이드의 간 세포 특이적 마커(ALB, HNF4A) 및 간 전구체 특이적 마커(AFP, CK19)의 발현량을 비교한 결과이다. * p <0.05 및 *** p <0.001.
도 51은 2회 계대배양(p2) 이후의 각 조건에서 생성된 오가노이드의 이미지이다.
도 52는 2회 계대배양(p2) 및 3회 계대배양(p3) 이후의 각 조건에서 생성된 오가노이드의 ALB 발현량을 비교한 결과이다. * p <0.05 및 *** p <0.001.
도 53은 간 오가노이드의 추가 분화를 위하여 HM 조건(c 조건) 및 EM 조건(d 조건)에서 생성된 오가노이드를 EM+BMP7 및 DM에서 순차적으로 배양하는 과정을 나타낸 모식도 및 이를 통하여 분화된 오가노이드의 이미지이다.
도 54는 각 조건에서 추가 분화된 오가노이드의 ALB 및 CYP3A4 발현량을 비교한 결과이다.
도 55는 PSCs로부터 분화된 간 내배엽 세포를 HM 배지에서 배양하여 제조한 간 오가노이드의 계대배양 별 이미지이다.
도 56은 PSCs로부터 분화된 간 내배엽 세포를 HM 배지에서 배양하여 제조한 간 오가노이드의 동결 및 해동 후 이미지와 생존률을 나타내는 것이다.
도 57은 PSCs로부터 분화된 간 내배엽 세포를 HM 배지에서 배양하여 제조한 간 오가노이드를 40회의 계대배양(p40) 및 50회의 계대배양(p50) 한 후에 핵형을 분석한 결과이다.
도 58은 PSCs로부터 분화된 간 내배엽 세포를 HM 배지에서 배양하여 제조한 간 오가노이드의 계대배양 별 간 세포 특이적 마커(ALB)와 간 전구체 특이적 마커(AFP) 발현량을 확인한 결과이다.
도 59는 간 오가노이드 제조 과정에서 bFGF, Oncostatin M(OSM), ITS 각각 또는 이의 조합을 제거하는 경우, 3일 차(상부) 및 9일 차(하부)에 생성된 간 오가노이드의 이미지이다.
도 60은 간 오가노이드 제조 과정에서 bFGF, OSM, ITS 각각 또는 이의 조합을 제거하는 조건 별로 3일 차 또는 9일 차에 생성되는 오가노이드의 수를 비교한 결과이다.
도 61은 간 오가노이드 제조 과정에서 bFGF, OSM, ITS 각각 또는 이의 조합을 제거하는 조건 별로 9일 차에 생성되는 오가노이드의 크기를 비교한 결과이다.
도 62는 후기 계대배양한(p40~p45) 간 오가노이드의 배양 과정에서 bFGF, OSM, ITS 각각 또는 이의 조합을 제거하는 조건 별로 누적되는 세포 수를 비교한 결과이다.
이하, 본 발명에 대하여 상세히 설명하도록 한다.
간 오가노이드 분화용 배지 조성물
본 발명은 일 측면에서, bFGF(basic fibroblast growth factor), 온코스타틴 M(oncostatin M, OSM) 및 ITS(insulin-transferrin-selenium)를 포함하는 간 오가노이드 분화용 배지 조성물에 관한 것이다.
본 명세서에서 용어 "bFGF(basic fibroblast growth factor)"는 염기성 섬유아세포 성장 인자로서, 다양한 세포의 증식을 촉진하거나 분화를 유도하는 기능이 있는 것으로 알려져 있으며, 세포 표면의 염기성 섬유아세포 성장인자 수용체에 결합하여 활성을 나타낸다.
본 명세서에서 용어 "온코스타틴 M(oncostatin M)"은 인간 대식 세포주를 PMA(phorbol 12-mystristate 13-acetate)로 자극하는 경우 분비되는 단백질로서, 조혈 과정, 면역 반응, 대사 과정 등에서 중요한 역할을 하는 사이토카인 (cytokine)이다.
본 명세서에서 용어 "ITS(insulin-transferrin-selenium)"은 인슐린-트렌스퍼린-셀레늄으로서, 여러 포유류 종의 배아 및 줄기 세포의 in vitro 배양을 위한 첨가물로 사용된다. 인슐린은 글루코스와 아미노산의 흡수를 촉진하는 폴리펩티드 호르몬이며, 유사분열 촉진 효과(mitogenic effects)를 나타낼 수 있다. 다수의 포유동물 종들의 착상 전 배아(preimplantation embryos)에 대한 in vitro 연구에 따르면 난관(oviduct)과 자궁(uterus)은 세포 증식과 착상 전 배아의 분화를 자극하는 성장 인자를 포함한다. 인슐린 및 인슐린-유사 성장 인자들은 배의 성장 및 대사에 중요한 역할을 한다. 트랜스퍼린은 철 운반 단백질이며, 배지로부터 금속을 제거하는 해독 단백질(detoxifying protein)이기도 하다. 철은 필수 미량 원소(trace element)이지만, 자유 형(free form)에서는 독성을 나타낼 수 있다. 배양 중 세포에 영양을 공급하기 위해서는 혈청 내 트랜스퍼린에 결합되어 제공되어야 한다. 셀레늄(Se)은 여러 생리 작용을 위한 필수 미량 원소이며, 일반적으로 아셀렌산나트륨(sodium selenite)의 형태로 배양 배지에 첨가되어, 자유라디칼 생산을 감소시키고 지질 과산화를 억제함으로써 산화적 손상으로부터 세포를 보호하는 역할을 한다.
본 명세서에서 용어 "오가노이드(organoid)"는 장기유사체라고도 불리며, 성체 줄기 세포(adult stem cell, ASC), 배아 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포(iPSC)로부터 자가 재생 및 자가 조직화를 통해 형성된 3차원 세포 집합체를 의미한다. 오가노이드는 실제 조직의 해부 구조를 모방하는 소형의 단순화된 형태를 갖는 생체 외 3차원 기관(organ)으로, 환자의 조직으로부터 오가노이드를 구축함으로써 환자의 유전 정보를 기반으로 한 질병 모델링, 반복시험을 통한 약물 스크리닝 등을 가능하게 한다.
본 명세서에서 용어 "간 오가노이드 분화용"은 줄기세포, 간 내배엽 세포, 간 세포 등의 시작 세포가 분화 또는 증식하여 간 오가노이드를 생성하기 위한 용도를 의미한다. 상기 간 오가노이드의 생성은 간 오가노이드의 증식, 생존 및 분화 등과 같이 간 오가노이드를 만들고 유지할 수 있는 모든 행위를 포함한다.
본 명세서에서 용어 "배지"는 in vitro에서 간 오가노이드의 증식, 생존 및 분화를 지지할 수 있게 하는 배지를 의미하고, 해당 분야에서 사용되는 간 오가노이드의 배양 및 분화에 적합한 통상의 배지를 모두 포함한다. 세포의 종류에 따라 배지의 종류와 배양 조건이 적절히 선택될 수 있다.
구체적으로, 상기 배지는 일반적으로 탄소원, 질소원 및 미량 원소 성분을 함유하는 세포 배양 최소 배지(cell culture minimum medium, CCMM)를 포함할 수 있다. 상기 세포 배양 최소 배지에는, 예를 들어, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), F-10, F-12, DMEM/F12, Advanced DMEM/F12, α-MEM(α-Minimal essential Medium), IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI1640, 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 배지는 페니실린(penicillin), 스트렙토마이신(streptomycin), 겐타마이신(gentamicin) 또는 이들의 2 이상의 혼합물 등의 항생제를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 간 오가노이드의 분화 및 배양을 위하여 Advanced DMEM/F-12 배지를 기본 배지로 사용할 수 있다.
또한, 상기 배지 조성물은 PS, GlutaMAX, HEPES, N2 supplement, N-아세틸시스테인(N-Acetylcysteine), [Leu15]-Gastrin I, 표피 성장 인자(epidermal growth factor, EGF), 간 세포 증식 인자(Hepatocyte Growth Factor, HGF), 비타민 A가 없는 B27 supplement, A83-01, 니코틴아마이드(Nicotinamide), 포스콜린(Forskolin), 덱사메타손(dexamethasone) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나를 더 포함할 수 있다.
한편, 성인 간 조직으로부터 분리된 간 세포를 3D 형태의 간 오가노이드로 증식 및 분화시키기 위한 EM(Expansion Medium) 및 DM(Differentiation Medium) 배지가 공지되어 있다(논문 [Broutier L, et al. Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation. Nat Protoc 2016; 11:1724-1743] 참조).
본 발명자들은 상기 EM 배지에서 고가의 배지 첨가물인 R-스폰딘(spondin)을 제외하고, 섬유아세포 성장 인자 10(FGF 10)을 대신하여 bFGF를 첨가하고, 온코스타틴 M(oncostatin M, OSM), 인슐린-트랜스페린-셀레늄(insulin-transferrin-selenium, ITS) 및 덱사메타손(dexamethasone)을 추가적으로 첨가하여 HM(Hepatic Medium) 배지를 조성하였다(표 1).
본 발명의 일 실시예에서, 줄기 세포로부터 분화된 간 내배엽 세포를 HM 배지, EM 배지, DM 배지에서 각각 3D 배양하여 간 오가노이드를 제조하고, 이를 계대배양하였다. 그 결과, DM 배지에서 제조한 간 오가노이드는 3회 이상의 계대배양이 불가능하였으나, HM 배지에서 제조한 간 오가노이드는 67회 이상의 계대배양이 가능하였다. 또한, HM 배지에서 제조한 간 오가노이드는 여러 번의 계대 배양을 거쳐도 핵형이 그대로 유지되고, 성숙 간 세포의 특성을 유지하는 것을 확인하였다.
즉, 본 발명에 따른 간 오가노이드 분화용 배지는 기존에 공지된 EM 배지와 비교하여, 고가의 R-spondin 없이도 간 오가노이드의 증식, 분화 능력이 현저하게 증가할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에서, 기존에 공지된 간 오가노이드 배양 배지(MH 배지, EM 배지 및 DM 배지)와 구분되는 성분인 bFGF, OSM 및 ITS가 간 오가노이드 생성 과정에 미치는 효과를 확인한 결과, 세 가지 성분 모두 존재하는 경우에 생성되는 간 오가노이드의 개수가 증가할 수 있으며, 계대배양 과정에서도 세포 증식능이 가장 높을 수 있다.
간 오가노이드의 제조방법
본 발명의 다른 측면은, 줄기 세포로부터 분화된 간 내배엽 세포 또는 간 세포를 상기 배지 조성물에서 배양하는 단계를 포함하는, 간 오가노이드의 제조방법에 관한 것이다.
배지 조성물은 상기에 기재된 바와 동일하다.
본 명세서에서 용어 "줄기 세포(stem cell)"는 적합한 환경 및 자극을 통해 각종 세포로 분화할 수 있는 능력 및 자가 증식 능력을 갖고 있는 세포로서, 성체 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포 또는 배아 줄기 세포일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 줄기 세포는 인간 유도 만능 줄기 세포 또는 인간 배아 줄기 세포일 수 있다.
구체적으로, 상기 인간 유도 만능 줄기 세포는 인간 포피 섬유아세포 또는 인간 간 섬유아세포를 리프로그래밍하여 제조될 수 있으며, 상기 인간 배아 줄기 세포는 H1 세포주 또는 H9 세포주일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 배지 조성물에서 배양하는 단계는 상기 간 내배엽 세포 또는 간 세포를 3차원(3D) 배양하여 간 오가노이드로 분화하는 단계를 포함할 수 있다.
한편, 본 발명자들은 기존에 공지된 줄기 세포로부터 간 세포를 수득하는 프로토콜에 약간의 변형을 가하여, PSC를 단계적으로 완전 내배엽(DE), 간 내배엽(HE), 미성숙 간 세포(IH) 및 성숙 간 세포(MH)로 분화시켰으며(도 1의 Previous protocol 참조), 성숙 간 세포까지의 분화는 2D 배양 과정으로 수행하였다.
다음으로, 성숙 간 세포로의 분화 과정에서 2D 단일 층 위에 3D 형태의 간 오가노이드가 생성되면 이를 수집하여 HM 배지(표 1)에서 3D 배양하여 간 오가노이드를 제조하였다(도 1의 New protocol I 참조).
또한, 본 발명의 다른 구현예에서 상기 간 오가노이드는 BMP7이 보충된 EM 배지에서 배양한 후, DM 배지에서 순차적으로 배양하는 단계를 포함할 수 있다. EM 배지 및 DM 배지에서의 순차적인 배양을 통하여 제조된 간 오가노이드는 보다 성숙한 간 세포의 특성을 나타낼 수 있다.
한편, 도 1의 New protocol I의 방법으로 제조된 간 오가노이드는 증식 가능하고, 성숙 간 세포의 특성을 나타냈으나, 2D 단일 층 위에 생성된 3D 형태의 간 오가노이드를 수집하는 과정이 번거로울 수 있고, 분화 조건에 따라서 간 오가노이드 생성 효율이 달라질 수 있음을 확인하였다. 또한, 간 세포 분화 과정에서 사용되는 배지인 Hepatocyte Culture Medium(Lonza; CC-3198)은 이를 구성하는 성분이 명확하게 공지되어 있지 않다. 이에, 본 발명자들은 보다 간단한 방법으로, 성분이 명확하게 정의된 배지 상에서 간 오가노이드의 대량 생산을 가능할 수 있는 제조방법을 개발하였다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, PSC를 간 내배엽 세포로 분화시킨 후 분화된 간 내배엽 세포로부터 직접 간 오가노이드를 제조할 수 있다. 구체적으로, PSC를 간 내배엽 세포로 분화시키는 과정은 기존에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 분화된 간 내배엽 세포를 단일 세포로 분리하고, 마트리겔에 내포하여 고체화 시킨 후 HM 배지에서 3D 배양하여 간 오가노이드를 생성할 수 있다(도 1의 New protocol II 참조).
또한, 본 발명의 다른 구현예에서 상기 간 오가노이드는 BMP7이 보충된 EM 배지에서 배양한 후, DM 배지에서 순차적으로 배양하는 단계를 포함할 수 있다.
제조방법에 의해 제조된 간 오가노이드
본 발명은 또 다른 측면에서, 상기 제조방법으로 제조된 간 오가노이드에 관한 것이다.
본 발명의 일 구현예에서, 간 세포 특이적 유전자의 발현량 및 기능성 평가에 있어서, 만능 줄기 세포로부터 2D 배양하여 제조한 간 내배엽 세포 및 간 세포와 비교하여, 상기 제조된 간 오가노이드는 보다 성숙한 간 세포의 특성을 나타낼 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 간 오가노이드는 냉동 및 해동 과정 후에도 형태를 유지하면서, 높은 생존율을 나타낼 수 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 간 오가노이드는 67회 이상의 계대배양을 거쳐도 증식할 수 있고, 정상 핵형을 그대로 유지하며, 성숙 간 세포로서의 특성 및 기능을 유지할 수 있다. 즉, 상기 간 오가노이드는 증식 가능한 오가노이드이다.
본 발명에 있어서, 상기 간 오가노이드는 10회 이상 100회 이하, 20회 이상 95회 이하, 30회 이상 90회 이하, 40회 이상 85회 이하, 50회 이상 80회 이하, 55회 이상 75회 이하 또는 60회 이상 70회 이하의 계대배양이 가능할 수 있다.
간 독성 약물 스크리닝 방법
본 발명은 또 다른 측면에서, 상기 간 오가노이드에 시험 물질을 접촉시키는 단계; 및 상기 간 오가노이드에서 세포 생존률 또는 산소 소모율을 측정하는 단계를 포함하는, 간 독성 약물의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 용어 "시험 물질 "은 통상적인 선정 방식에 따라 간 관련 질환의 예방 또는 치료의 가능성을 지닌 것으로 추정되거나 또는 무작위적으로 선정된 개별적인 핵산, 단백질, 기타 추출물 또는 천연물, 또는 화합물 등이 될 수 있다.
본 발명에 있어서, 간 독성 약물의 스크리닝 방법은 상기 간 오가노이드에 시험 물질을 처리하여 세포 생존률 또는 산소 소모율을 측정함으로써, 시험 물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하는 방식으로 수행될 수 있다.
구체적으로, 상기 간 오가도이드에 시험 물질을 처리한 경우에, 세포 생존률이 감소하거나 산소 소모율이 감소하는 경우에, 상기 시험 물질이 간 독성 물질로 판단하는 방식으로 수행될 수 있다. 상기 산소 소모율은 미토콘드리아의 기능성을 판단하기 위한 것으로, 산소 소모율 감소를 통하여 미토콘드리아의 호흡이 감소되었음을 확인할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 독성 약물에 대한 민감도 및 정확도를 세포 생존률 및 산소 소모율을 통하여 2D 분화된 MH와 비교한 결과, 상기 간 오가노이드가 현저하게 높은 것을 확인할 수 있다.
지방간 치료제의 스크리닝 방법
본 발명은 또 다른 측면에서, 상기 간 오가노이드를 지방간 오가노이드로 제조하는 단계; 및 상기 지방간 오가노이드에 지방간 치료제 후보 물질을 처리하는 단계를 포함하는, 지방간 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 간 오가노이드를 지방간 오가노이드로 제조하는 단계는 간 오가노이드에 지방산을 투여하는 것을 포함할 수 있다.
상기 지방산은 올레이트, 팔미테이트 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 지방간 치료제의 스크리닝 방법은 상기 간 오가노이드에 시험 물질을 처리한 경우에, 시험 물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여, i) 포도당 생성 작용 및 지방 생성 작용에 관여하는 유전자 및 단백질의 발현이 현저히 감소, ii) 세포 내 중성지방 염색 및 트리글리세라이드 양이 현저히 감소 또는 iii) 글루코스 흡수 능력이 증가되는 경우에 해당 후보 물질을 지방간 치료제로 판단하는 방식으로 수행될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 간 오가노이드에 올레이트 및 팔미테이트를 처리한 경우, 트리글리세라이드의 농도가 증가하고, OCR은 감소하는 것을 통하여 간 지방증으로 유도된 것을 확인할 수 있다.
이러한 스크리닝 방법에 의하여 선택된 물질은 이후의 지방간 예방 또는 치료제 개발 과정에서 선도 물질(leading compound)로 작용하게 되며, 선도 물질을 변형시키고 최적화함으로써, 새로운 지방간의 예방 또는 치료제를 개발할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 이들 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
I. 만능 줄기 세포(PSCs)로부터 간 내배엽 세포의 제조
실시예 1. 만능 줄기 세포의 제조
실시예 1.1. 인간 포피 섬유아세포 유래 iPSCs의 제조
인간 포피 섬유아세포(Human foreskin fibroblasts; HFF)(CRL-2097)는 American Type Culture Collection(ATCC)에서 구입하였다. CRL-2097 HFFs를 2Х105 cells/웰로 6-웰 플레이트에 접종하고, 2일 차에 CytoTune®-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit(Thermo Fisher; A16517)를 사용하여 센다이 바이러스(Sendai virus)로 형질도입하였다. 3일 차에 신선한 섬유아세포 배양 배지(10% 소태아혈청, 1% NEAA, 1 mM L-글루타민 및 0.1 mM b-메르캅토에탄올을 함유하는 DMEM)로 교체한 후, 9일 차에 6-웰 플레이트에서 1 x 105 cells/웰로 MEF 피더(feeder) 층에 옮겼다. 다음 날, 배지를 PSC 배지로 교체하고, 매일 신선한 배지로 바꾸어 주었다. 재프로그래밍화 약 22일 차에 iPSC 콜로니를 선택하였다.
실시예 1.2. 인간 간 섬유아세포 유래 iPSCs의 제조
인간 간 섬유아세포(Human liver fibroblasts; HLF)는 인간 간 조직으로부터 분리되었으며, 이는 충남대학교 병원 임상시험 심사위원회(IRB File No. CNUH 2016-03-018)에 의해 승인되었다. 모든 환자로부터 사전 동의를 받았다. 신선한 인간 간 생검(fresh human liver biopsies) 시료를 차가운 PBS(phosphate buffer saline)로 세척하여 혈액을 제거한 후, 제4형 콜라겐분해효소(300 units/ml, Thermo Fisher; 17104-019)를 처리하였다. 조직을 예리한 외과용 칼날로 잘게 썰고 37℃에서 30분 동안 배양하였다. 분해된 간 조직(digested liver tissues)을 차가운 PBS로 세척한 후 70 μm 스트레이너(strainer)(SPL Life Sciences; 93070)로 여과하였다. 수집된 세포를 10% 소태아혈청(FBS, RMBIO; FBS-BBT-5XM)을 포함하는 차가운 PBS로 세척한 후, 세포를 예열된 10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(PS, Thermo Fisher; 15140-122)이 보충된 최소 필수 배지(minimal essential medium; MEM, Thermo Fisher; 11095-080)에 재현탁하였다.
HLFs는 Neon Transfection System(Thermo Fisher; MPK5000)를 사용하여 리프로그래밍하였다. 구체적으로, 제조사의 지시에 따라 1650 V, 20 밀리세컨드(milliseconds) 및 1회 pulse의 조건 하에서 pCXLE-hOCT4-shp53(2.5 ㎍), pCXLE-hSK(2 ㎍) 및 PCXLE-hUL(2 ㎍) 플라스미드 DNA 칵테일(cocktail)을 전기천공법으로 형질도입하였다. 형질도입 후에 세포를 마트리겔(Matrigel)™(Corning; 354234)이 코팅된 접시에 접종하고 10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(PS, Thermo Fisher; 15140-122)이 보충된 최소 필수 배지(minimal essential medium; MEM, Thermo Fisher; 11095-080)에서 배양하였다. 다음날, 배지를 mTeSR™1으로 교체하였다. 리프로그래밍화 약 22일 차에 iPSC 콜로니를 선택하였다.
실시예 1.3. 인간 배아 줄기 세포의 준비
인간 배아 줄기 세포주 H1(WiCell Research Institute, WA01) 및 H9(WiCell Research Institute, WA09)를 20% 넉아웃 혈청 대체물(SR, Thermo Fisher; 10828-028), 1% PS, 0.1 mM 2-메르캅토에탄올(mercaptoethanol)(Thermo Fisher; 21985-023), 1% 비-필수 아미노산(Thermo Fisher; 11140), 1% GlutaMax I(Thermo Fisher; 35050-079) 및 10 ng/ml bFGF(PeproTech; 100-18B)를 포함하는 DMEM/F12 배지(Thermo Fisher; 11330) 또는 마트리겔-코팅된 플레이트의 mTeSR™1(Stem Cell Technologies; 85850)에 있는 γ-조사된(irradiated) 마우스 배아 섬유 아세포(MEF) 피더(feeder) 상에서 37℃, 5% CO2로 유지하였다. PSC 콜로니는 23G 바늘(BD bioscience; 302006)로 긁어 내거나 제4형 콜라겐분해효소(Invitrogen; 17104-019)로 처리하여 작은 덩어리로 분할한 후 매주 새로운 피더로 옮겼다.
실시예 2. 만능 줄기 세포로부터 간 내배엽 세포의 제조
논문 [Si-Tayeb K, et al. Hepatology 2010; 51:297-305], [Takebe T, et al. Nature 2013; 499:481-484] 및 [Takebe T, et al. Nat Protoc 2014; 9:396-409]에 기재되어 있는 프로토콜을 수정한 방법에 따라, 실시예 1.1, 1.2 및 1.3에서 준비한 만능 줄기 세포(PSCs)를 간 내배엽(Hepatic endoderm, HE) 세포로 분화시켰다. 도 1을 참조하면, PSC →DE→HE의 분화 과정에 해당한다.
우선, 상기 PSCs를 완전 내배엽(definitive endoderm, DE) 세포로 분화시키기 위해 PSCs를 3일 동안 마트리겔 코팅된 접시의 20% 넉아웃 혈청 대체물(SR, Thermo Fisher; 10828-028), 1% PS, 0.1 mM 2-메르캅토에탄올(mercaptoethanol)(Thermo Fisher; 21985-023), 1% 비-필수 아미노산(Thermo Fisher; 11140), 1% GlutaMax I(Thermo Fisher; 35050-079) 및 10 ng/ml bFGF(PeproTech; 100-18B)를 포함하는 DMEM/F12 배지(Thermo Fisher; 11330)에서 배양한 후, 인슐린이 없는 1ХB27(Thermo Fisher; A1895601) 및 100 ng/ml 인간 액티빈(activin) A(PeproTech; 120-14e)이 보충된 RPMI 1640(Thermo Fisher; 11875-093) 배지로 교환하여 6일 동안 배양하였다.
다음으로, 완전 내배엽 세포를 간 내배엽(Hepatic endoderm, HE) 세포로 분화시키기 위해, 1ХB27(Thermo Fisher; 17504-044), 10 ng/ml bFGF, 및 20 ng/ml 인간 BMP-4(PeproTech; 120-05ET)이 보충된 RPMI 1640 배지로 교환하여 저산소 조건에서 4일 동안 배양하였다.
II. 간 세포 성숙(Hepatic maturation) 과정을 포함하는 간 오가노이드의 제조
실시예 3. 간 오가노이드의 제조
실시예 3.1. 종래 프로토콜에 따른 성숙 간 세포로의 분화
간 내배엽 세포로부터 간 세포의 분화를 위해, 실시예 2에서 얻어진 간 내배엽 세포 각각의 배지를 MH(Mature Hepatocytes) 배지로 교환하였다. MH 배지는 EGF를 포함하지 않고, 2.5% FBS, 100 nM 덱사메타손(dexamethasone)(Sigma-Aldrich; D4902), 20 ng/ml OSM(R&D system; 295-OM-050) 및 10 ng/ml HGF(PeproTech; 100-39)가 보충된 Hepatocyte Culture Medium(Lonza; CC-3198)와 Endothelial Cell Growth Medium-2(Lonza; CC-3162)를 1:1로 희석하여 제조하였고, 그 조성을 표 1에 기재하였다. 저산소 조건에서 4일 동안 배양하여 미성숙 간 세포(Immature Hepatocytes, IH)로 분화시킨 후, 정상 산소 조건에서 8일 동안 추가 배양하여 성숙 간 세포(Mature Hepatocytes, MH)로 분화시켰다. 도 1을 참조하면, HE→IH→MH의 분화 과정에 해당한다.
실시예 3.2. HM 배지를 이용한 간 오가노이드 제조
실시예 2에서 얻어진 간 내배엽 세포 각각을 MH 배지에서 2D 배양한 지 대략 9 내지 12일이 경과한 후에, 3D 형태의 간 오가노이드가 성숙 간 세포의 2D 단일 층 위에 나타났으며(도 2), 실질 간 세포의 것과 유사한 입방 세포(cuboidal cell) 형태가 구형 구조의 표면에서 명확하게 나타났다(도 3). 생성된 3D 형태의 간 오가노이드를 수집한 후 마트리겔에 내포하여(embedded) 고체화하였다.
또한, 오가노이드의 자가 재생 가능성과 성숙 간 세포의 특성을 강화하기 위하여, 논문 [Broutier L, et al. Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation. Nat Protoc 2016; 11:1724-1743]에 공지된 Hans Clever's 그룹의 EM(Expansion Medium) 배지에서 R-스폰딘(spondin) 및 섬유아세포 성장 인자 10(FGF 10)을 제외하고, 염기성 섬유아세포 성장 인자(basic broblast growth factor, bFGF), 온코스타틴 M(oncostatin M, OSM), 인슐린-트랜스페린-셀레늄(insulin-transferrin-selenium, ITS) 및 덱사메타손(dexamethasone)을 추가적으로 첨가하여 HM(Hepatic Medium) 배지를 조성하였다(표 1). 그리고 나서, 고체화한 오가노이드를 HM 배지에서 3D 배양하여 간 오가노이드를 제조하였다(도 1).
실시예 3.3. HM 배지에서 제조한 간 오가노이드의 추가 분화
HM 배지에서 제조한 간 오가노이드의 추가적인 분화를 위하여, 논문 [Broutier L, et al. Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation. Nat Protoc 2016; 11:1724-1743]에 공지된 Hans Clever's 그룹의 EM(Expansion Medium) 및/또는 DM(Differentiation Medium) 배지에서 순차적으로 배양하였다.
한편, 추가 분화 과정의 최적화를 위하여, 다양한 조건에서 배양한 결과, DM 배지에서 배양하기 전에 EM 배지에 BMP7을 첨가하는 것이 간 세포 특이적 마커인 ALB 및 약물 대사 및 독성에서 중요한 역학을 하는 CYP3A4의 발현을 증가시키는 가장 효과적인 조건인 것을 확인하였다(도 4 및 도 5, e 조건). 구체적으로, 20 ng/ml BMP7(PeproTech; 120-03)이 보충된 EM 배지에서 2 내지 3일 동안 배양하고, DM 배지에서 추가로 6일 동안 배양하였다.
또한, HM 배지에서 제조한 간 오가노이드의 조건을 "HM"으로 지정하고, HM 배지에서 제조한 간 오가노이드를 6일 동안 EM 배지에서 추가 배양한 조건을 "EM"으로 지정하고, HM 배지에서 제조한 간 오가노이드를 EM 배지 및 BMP7과 함께 2일 동안 배양한 후, 6일 동안 DM 배지에서 배양하는 조건을 "DM"으로 지정하였다.
MH, HM, EM 및 DM 배지 각각의 조성은 하기 표 1에 기재된 바와 같다.
Reagent Company Catalog No. MH HM EM DM
Working Conc.
HGM(ΔEGF) Lonza CC-3198 0.5x 　 　 　
EGM-2 Lonza CC-3162 0.5x 　 　 　
FBS Corning 35-015-CV 2.5% 　 　 　
Advanced DMEM/F12 Thermo Fisher 12634028 　 1x 1x 1x
PS Thermo Fisher 15140122 　 1% 1% 1%
GlutaMAX Thermo Fisher 35050079 　 1% 1% 1%
HEPES Thermo Fisher 15630080 　 10 mM 10 mM 10 mM
N2 supplement Thermo Fisher 17502048 　 1x 1x 1x
N-Acetylcysteine Sigma-Aldrich A9165 　 1 mM 1 mM 1 mM
[Leu15]-Gastrin I human Sigma-Aldrich G9145 　 10 nM 10 nM 10 nM
Recombinant human EGF Peprotech AF-100-15 　 50 ng/ml 50 ng/ml 50 ng/ml
Recombinant human HGF Peprotech 100-39 10 ng/ml 25 ng/ml 25 ng/ml 25 ng/ml
B27 supplement w/o Vit A Thermo Fisher 12587010 　 1x 1x -
B27 supplement w Vit A Thermo Fisher 17504044 　 - - 1x
A83-01 Tocris 2939 　 5 μM 5 μM 0.5 μM
Nicotinamide Sigma-Aldrich N0636 　 10 mM 10 mM -
Forskolin Sigma-Aldrich F3917 　 10 μM 10 μM -
Recombinant human R-spondin R&D 4645-RS-025 　 - 1 ㎍/ml -
Recombinant human FGF10 Peprotech 100-26 　 - 100 ng/ml -
Recombinant human FGF-basic Peprotech 100-18B 　 10 ng/ml - -
Oncostatin M R&D 295-OM 20 ng/ml 10 ng/ml - -
ITS Thermo Fisher 41400045 　 5 ㎍/ml - -
Dexamethasone Sigma-Aldrich D4902 100 nM 100 nM - 3 μM
DAPT Sigma-Aldrich D5942 　 - - 10 μM
Recombinant human BMP7 Peprotech 120-03 　 - - 25 ng/ml
Recombinant human FGF19 Peprotech 100-32 　 - - 100 ng/ml
실험예 1. 간 오가노이드의 증식능 평가
실시예 3.2에서 얻어진 간 오가노이드(CRL-2097 유래)를 HM 배지에서 통상적으로 유지하였고, 배지는 3일마다 교체하였다. 또한, 간 오가노이드는 7일마다 물리적으로 계대배양하였다. 간 오가노이드를 차가운 PBS로 세척하여 마트리겔을 제거하고 해부 현미경 하에서 수술용 칼을 이용하여 작은 조각으로 분할하였다. 계대배양한 오가노이드를 마트리겔에서 1:3 내지 1:10의 비율로 재현탁하였다. 대안적으로, 오가노이드는 Gentle Cell Dissociation Reagent(Stem Cell Technology; ST07174)으로 약 15회 피펫팅함으로써 화학적으로 계대배양하였다.
그 결과, HM 배지에서 제조한 간 오가노이드는 현탁액 및 마트리겔 모두에서 자가 재생이 가능하였다(도 6).
한편, 간 오가노이드를 37℃에서 TrypLE Express(Thermo Fisher Scientific; 12605-010)를 이용하여 단일 세포로 분리하고, 트리판 블루(trypan blue)로 염색한 후, Countess II Automated Cell Counter(Thermo fisher; AMQAX1000)를 사용하여 각 계대배양에서 세포 수를 카운트(count)하였다. 누적 세포 수는 다음 식을 사용하여 계산하였다: C(n) = [y(n)/y(n-1)] x C(n-1) (이전 계대배양에서의 세포 수/이전 계대배양에서의 접종 세포 수) x 이전 계대배양에서의 누적 세포 수.
그 결과, HM 배지에서 제조한 간 오가노이드는 여러 번의 계대배양을 거쳐도 증식 가능하였다(도 7).
또한, 간 오가노이드를 면역 세포 화학 분석하기 위하여, 실온(RT)에서 15분 동안 PBS 중 4% 파라포름알데하이드(PFA)(Biosesang; P2031)로 고정시키고, 15분 동안 실온의 0.25% Triton X-100에서 투과화하였다. 샘플을 실온에서 1시간 동안 4% 소 혈청 알부민(BSA)/PBS로 블록킹(blocking)한 후, 4℃에서 밤새도록 1차 항체와 함께 배양하였다. 샘플을 PBS 중의 0.05% Tween-20(Sigma-Aldrich; P9416)으로 세척한 다음, 실온에서 1시간 동안 Alexa Fluor® 접합된 2차 항체와 함께 배양하였다. DAPI 시약(Sigma-Aldrich; D5942)을 사용하여 핵을 염색하고, 형광 이미지는 Olympus 현미경 또는 Zeiss 공초점 현미경으로 촬영하였다. 사용된 항체는 하기 표 2에 기재된 바와 같다.
Antibodies Catalog No. Company Dilution
anti-E-cadherin 610181 BD biosciences 1:200
anti-ALB A80-129a Bethyl lab 1:100
anti-Ki67 Ab15580 Abcam 1:100
그 결과, HM 배지에서 제조한 간 오가노이드의 E-카드헤린(cadherin)-염색된 상피 세포는 ALB의 강한 발현과 함께 Ki67-양성인 증식 가능한 상태를 나타냈다(도 8).
실험예 2. 간 오가노이드의 특성 분석
실험예 2.1. HM 배지에서 제조한 간 오가노이드
실시예 3.2에서 얻어진 간 오가노이드(CRL-2097 유래)의 특성을 실시예 1에서 얻어진 iPSCs, 실시예 2에서 얻어진 간 내배엽 세포(HE) 및 실시예 3.1에서 얻어진 2D 분화된 성숙 간 세포(2D MH)와 비교하였다.
각 세포-특이적 마커의 유전자 발현 수준을 비교하기 위하여, RNA를 추출 하고 정량적 실시간 중합 효소 연쇄 반응(qRT-PCR)을 수행하였다. 총 RNA는 TRIzol 시약(Thermo Fisher; 15596018) 또는 RNeasy Mini Kit(Qiagen; 74134)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 정제하였다. 역전사는 TOP Script™ RT DryMIX, dT18 plus(Ezynomics; RT200)를 사용하여 수행하였다. 정량적 실시간 PCR은 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems) 상에서 유전자 특이적 프라이머로 Fast SYBR® Green Master Mix(Applied Biosystems; 4385614)를 사용하여 수행하였다. 사용된 프라이머 서열은 하기 표 3에 기재된 바와 같다.
프라이머 염기서열 서열번호
NANOG_F GCAGAAGGCCTCAGCACCTA 1
NANOG_R AGGTTCCCAGTCGGGTTCA 2
LGR5_F GACTTTAACTGGAGCACAGA 3
LGR5_R AGCTTTATTAGGGATGGCAA 4
FOXA2_F TGGGAGCGGTGAAGATGGAAGGGCAC 5
FOXA2_R TCATGCCAGCGCCCACGTACGACGAC 6
SOX17_F CGCTTTCATGGTGTGGGCTAAGGACG 7
SOX17_R TAGTTGGGGTGGTCCTGCATGTGCTG 8
HNF1B_F GCCCACACACCACTTACTTCG 9
HNF1B_R GTCCGTCAGGTAAGCAGGGAC 10
HNF4A_F GGCCAAGTACATCCCAGCTTT 11
HNF4A_R CAGCACCAGCTCGTCAAGG 12
SOX9_F GGAAGTCGGTGAAGAACGGG 13
SOX9_R TGTTGGAGATGACGTCGCTG 14
CK19_F CGCGGCGTATCCGTGTCCTC 15
CK19_R AGCCTGTTCCGTCTCAAACTTGGT 16
ALB_F TTTATGCCCCGGAACTCCTTT 17
ALB_R AGTCTCTGTTTGGCAGACGAA 18
TTR_F TGGGAGCCATTTGCCTCTG 19
TTR_R AGCCGTGGTGGAATAGGAGTA 20
CK18_F GAGCTGCTCCATCTGTAGGG 21
CK18_R CACAGTCTGCTGAGGTTGGA 22
RBP4_F GAGTTCTCCGTGGACGAGAC 23
RBP4_R TCCAGTGGTCATCATTTCCTTTC 24
2D MH와 비교해보면, 간 오가노이드는 만능성 마커인 NANOG의 발현이 낮았고, 성체 줄기 세포 마커 LGR5의 발현을 유지하였으며, 유사하거나 더 높은 수준의 관성(ductal) 마커 SOX9 및 CK19와 MH 마커 ALB, TTR, CK18 및 RBP4를 발현하였다(도 9).
상피 마커(E-카드헤린 및 ZO1), 간 세포 마커(HNF4A, ALB, AAT 및 PEPCK), 담즙 염 유출 운반 단백질(bile salt efux transporter)(MRP4), 관성 마커(CK19 및 SOX9) 및 성체 줄기 세포 마커(LGR5)의 발현을 단백질 수준에서 실험예 1에 기재된 방법으로 면역 세포 화학 분석한 결과, 높은 발현을 나타냈다(도 10). 사용된 항체는 하기 표 4에 기재된 바와 같다.
Antibodies Catalog No. Company Dilution
anti-E-cadherin 610181 BD biosciences 1:200
anti-ALB A80-129a Bethyl lab 1:100
anti-ZO1 40-2200 Thermo 1:100
anti-HNF4a 3113s Cell signaling technology 1:200
anti-MRP4 ab15602 abcam 1:100
anti-AAT ab9373 Abcam 1:200
anti-CK19 ab9221 Abcam 1:300
anti-PEPCK sc-32879 Santacruz 1:100
anti-LGR5 TA503316 Origene 1:100
anti-SOX9 ab5535 Abcam 1:250
anti-PEPCK sc-32879 Santacruz 1:100
또한, 간 오가노이드에서 ALB+ 성숙 간 세포 집단을 정량화하기 위하여, FACS(Fluorescence activated cell sorter) 분석을 하였다. 간 오가노이드를 37℃에서 10분 동안 TrypLE(Thermo Fisher; 12605-010)를 사용하여 단일 세포로 분리한 다음, 30-㎛ 메쉬(Miltenyi Biotech; 130-098-458)를 통해 여과하였다. 단일 세포를 면역 염색 프로토콜에 따라 고정, 투과화 및 차단하였다. 단일 세포를 표 4에 기재된 ALB 특이적 항체로 염색한 후 BD Accuri™C6(BD Biosciences)로 분석하였다.
그 결과, 간 오가노이드에서 ALB+ 성숙 간 세포 집단이 38.63%를 차지하였다(도 11).
실험예 2.2. 추가 분화된 간 오가노이드
실시예 3.3의 HM, EM 및 DM 조건에서 배양된 간 오가노이드의 형태를 비교한 결과, EM 조건의 오가노이드는 HM 조건의 오가노이드와 비교하여 확대된 구형 구조를 나타내고, DM 조건의 오가노이드는 HM 조건의 오가노이드와 비교하여 더 작고 패킹된(packed) 형태를 나타냈다(도 12).
각 조건 오가노이드의 성숙 간 세포 특이적 마커와 관성 마커 발현량을 비교하기 위하여, 실험예 2.1에 기재된 방법으로 qRT-PCR을 수행하였다. 사용된 프라이머 서열은 하기 표 5에 기재된 바와 같다.
프라이머 염기서열 서열번호
ALB_F TTTATGCCCCGGAACTCCTTT 17
ALB_R AGTCTCTGTTTGGCAGACGAA 18
TTR_F TGGGAGCCATTTGCCTCTG 19
TTR_R AGCCGTGGTGGAATAGGAGTA 20
CK19_F CGCGGCGTATCCGTGTCCTC 15
CK19_R AGCCTGTTCCGTCTCAAACTTGGT 16
CYP3A4_F CTTCATCCAATGGACTGCATAAAT 25
CYP3A4_R TCCCAAGTATAACACTCTACACAGACAA 26
그 결과, DM 조건의 오가노이드는 PHH 및 인간 간 조직과 비교하여 ALB, TTR 및 사이토크롬 p450-3A4(CYP3A4)과 같은 성숙 간 세포 마커 및 관성 마커 CK19를 유의한 수준으로 발현하였다(도 13).
또한, EM 조건 및 DM 조건에서 배양된 오가노이드의 상피 마커(E-카드헤린 및 ZO1), 간 세포 마커(HNF4A, ALB, AAT 및 PEPCK), 담즙 염 유출 운반 단백질(MRP2), 관성 마커(CK19 및 SOX9) 및 성체 줄기 세포 마커(LGR5) 발현량을 단백질 수준에서 실험예 1에 기재된 방법으로 면역 세포 화학 분석하였다. 사용된 항체는 하기 표 6에 기재된 바와 같다.
Antibodies Catalog No. Company Dilution
anti-E-cadherin 610181 BD biosciences 1:200
anti-ALB A80-129a Bethyl lab 1:100
anti-ZO1 40-2200 Thermo 1:100
anti-HNF4a 3113s Cell signaling technology 1:200
anti-MRP2 ALX-801-016 Enzo Life Sciences, Inc. 1:100
anti-AAT ab9373 Abcam 1:200
anti-CK19 ab9221 Abcam 1:300
anti-PEPCK sc-32879 Santacruz 1:100
anti-LGR5 TA503316 Origene 1:100
anti-SOX9 ab5535 Abcam 1:250
anti-PEPCK sc-32879 Santacruz 1:100
그 결과, 두 조건 모두에서 E-카드헤린, HNF4A, ZO1 및 PEPCK의 높은 발현 수준을 나타냈다. 구체적으로, DM 조건의 간 오가노이드는 EM 조건의 간 오가노이드와 비교하여, ALB, AAT 및 MRP2의 발현은 증가한 반면에, CK19, LGR5 및 SOX9의 발현은 감소하였다(도 14).
또한, EM 및 DM 조건의 간 오가노이드에서 ALB+ 성숙 간 세포 집단을 정량화하기 위하여, 실험예 2.1에 기재된 방법으로 FACS 분석을 하였다.
그 결과, ALB+ 성숙 간 세포 집단은 EM 조건에서 53.85% 및 DM 조건에서 79.44%를 차지하였다(도 15).
이를 통하여, HM 조건의 오가노이드를 DM 배지에서 추가 배양하는 경우에 보다 성숙한 간 세포로 분화되는 것을 확인하였다.
실험예 3. 간 오가노이드의 기능성 평가
글리코겐 저장을 분석하기 위해, 실시예 3.3에서 얻어진 각 오가노이드를 4% 파라포름알데하이드(Biosesang; P2031)로 고정시키고, 30% 수크로스로 동결 보호(cryo-protected)하고, 동결조직 포매제(optimal-cutting-temperature (OCT) 화합물)(Sakura Finetek; 4583) 내에서 동결하였다. 냉동된 구획을 -20℃에서 동결 마이크로톰(cryostat microtome)(Leica)을 사용하여 10 ㎛의 두께로 슬라이스하였다. 구획화된 샘플은 제조사의 지시에 따라 과요오드산-쉬프(periodic acid-schiff, PAS)(IHC World; IW-3009)로 염색하였다.
또한, 인도시아닌 그린(ICG) 흡수 및 방출을 분석하기 위해, 오가노이드를 차가운 PBS로 세척하여 마트리겔을 제거하고, 1 mg/ml ICG(Sigma; I2633)와 함께 37℃, 5% CO2에서 15분 동안 배양하였다. 현미경으로 ICG 흡수 사진을 촬영하고, 오가노이드를 PBS로 부드럽게 3번 세척한 후, 새로운 배지를 첨가하였다. 그리고 나서, 37℃, 5% CO2에서 에서 1시간 동안 배양한 후, ICG 방출 사진을 현미경으로 촬영하였다.
그 결과, PAS 염색 및 인간 간 이식을 위한 기능성 평가로서 사용되는 ICG 흡수는 HM 및 DM 조건의 오가노이드에서 강하게 검출되었다(도 16 및 도 17).
ALB, AAT 분비량 및 요소(urea)의 생산량을 정량화하기 위해, 배지를 교체한지 48시간 후에 배지를 수집하고, 제조사의 지시에 따라 Human Albumin ELISA Kit(Bethyl Laboratories; E80-129), Human Alpha-1-Antitrypsin ELISA Quantitation Kit(GenWaybio; GWB-1F2730), 또는 Urea Assay Kit(Cell Biolabs, Inc.; STA-382)를 사용하여 분석하였다. 흡광도는 Spectra Max M3 마이크로플레이트 리더기(Molecular Devices)로 측정하였고, 데이터는 세포 수로 정규화하였다.
ALB의 분비량을 비교한 결과, 2D MH 또는 HM 조건에서 배양된 오가노이드와 비교하여, DM 조건의 오가노이드에서 PHH와 유사한 수준으로 월등하게 증가하였다(도 18 왼쪽). AAT의 분비량은 2D MH 또는 PHH보다 HM 또는 DM 조건의 오가노이드에서 현저하게 증가하였다(도 18 가운데). 또한, 요소 생산량도 HM 또는 DM 조건의 오가노이드에서 현저하게 증가하였다(도 18 오른쪽).
한편, 기능적인 극성화(functional polarization) 분석을 위해, 마트리겔로부터 오가노이드를 분리하고, 10 ㎍/ml CDFDA(Sigma; 21884) 및 1 ㎍/ml Hoechst 33342(Invitrogen; 62249)가 보충된 배양 배지에서 37℃, 5% CO2로 30분 동안 배양하였다. 오가노이드를 칼슘 및 마그네슘이 포함된 차가운 PBS로 2번 부드럽게 세척하였다. 배양 배지를 첨가한 후, 37℃, 5% CO2에서 공초점 현미경으로 형광 이미지를 수득하였다.
그 결과, 담즙 관-유사 구조를 갖는 편광된 상피 세포는 CDFDA 염색에 의해 HM 및 DM 조건의 오가노이드에서 선명하게 검출되었으며(도 19), 이는 2D 단일 층 배양 시스템에서는 검출되기 어려운 것으로 공지되어 있다. 이를 통하여, HM 또는 DM 조건에서 배양된 간 오가노이드는 기능적으로 성숙 간 세포 유사 특성을 나타내는 것을 확인하였다.
실험예 4. 간 오가노이드의 약물 대사 분석
약물 대사 및 독성에 중요한 CYP3A4, 1A2, 2A6 및 2E1을 포함하는 CYP 패밀리의 유전자 발현 수준을 비교하기 위하여, 실험예 2.1에 기재된 방법으로 qRT-PCR을 수행하였다. 사용된 프라이머 서열은 하기 표 7에 기재된 바와 같다.
프라이머 염기서열 서열번호
CYP3A4_F CTTCATCCAATGGACTGCATAAAT 25
CYP3A4_R TCCCAAGTATAACACTCTACACAGACAA 26
CYP3A7_F AAACTTGGCCGTGGAAACCT 27
CYP3A7_R CAGCATAGGCTGTTGACAGTC 28
CYP1A2_F CTTCGCTACCTGCCTAACCC 29
CYP1A2_R GACTGTGTCAAATCCTGCTCC 30
CYP2A6_F CAGCACTTCCTGAATGAG 31
CYP2A6_R AGGTGACTGGGAGGACTTGAGGC 32
CYP2E1_F TTGAAGCCTCTCGTTGACCC 33
CYP2E1_R CGTGGTGGGATACAGCAA 34
그 결과, 2D MH 배양된 오가노이드와 비교하여 HM 조건의 오가노이드에서 CYP3A4, 1A2, 2A6 및 2E1의 발현량이 현저하게 증가하였다(도 20). 특히, CYP 매개 약물 대사의 주요 비율을 차지하는 CYP3A4에 대응하는 태아 유전자인 CYP3A7의 발현은 2D MH에서의 발현과 비교하여 HM 조건의 오가노이드에서 현저하게 감소하였는데(도 20), 이는 HM 조건의 오가노이드가 보다 성숙한 간 세포의 특성을 나타내는 것을 의미한다.
한편, 추가적인 약물 대사 연구를 위해, 각 조건에서 배양된 오가노이드에 10 μM 니페디핀(nifedipin)(Sigma; N7634)을 48시간 동안 처리하여 CYP3A4의 발현을 유도하였다. 그리고 나서, 실험예 2.1에 기재된 방법으로 qRT-PCR을 수행하여 CYP3A4의 발현량을 측정하였다.
그 결과, CYP3A4 발현량은 2D MH 및 HM 조건의 오가노이드와 비교하여 DM 조건의 오가노이드에서 가장 높고, 니페디핀으로 유도한 경우에 월등하게 증가하였다(도 21).
또한, CYP3A4의 활성을 측정하기 위해, 각 조건에서 배양된 오가노이드에 20 μM 리팜피신(rifampicin)(Sigma; R7382), 100 μM 아세트아미노펜(acetaminophen; APAP)(Sigma; A5000) 및 10 μM 니페디핀을 48시간 동안 처리하여 CYP3A4의 활성을 유도하였다. 그리고 나서, CYP3A4의 아류형(subtype)-특이적 기질과 함께 3시간 동안 배양한 후 P450-Glo Assay Kit(Promega; V9002 for 3A4 and V8422 for 1A2)를 이용하여 CYP3A4의 활성을 측정하였다. 데이터는 세포 수로 정규화하였다.
그 결과, 니페디핀으로 유도한 경우에, HM 또는 DM 조건의 오가노이드 모두에서 PHH와 유사한 수준의 CYP3A4 활성이 나타났다(도 22).
한편, 2D 분화된 성숙 간 세포, HM 및 DM 조건의 오가노이드에 10 μM 니페디핀으로 48시간 동안 유도한 다음, 니페디핀 또는 테스토스테론을 첨가 하였다. 처리 후, 지정된 시점에 100 ㎕의 상등액을 수득하고, 나머지 니페디핀 또는 생성된 6β-하이드록시테스토스테론(6β-hydroxytestosterone)을 액체 크로마토그래피 전자분무 이온화 직렬 질량 분광계(liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry)(LC-ESI/MS/MS, Agilent 1200 HPLC 및 Turbo VTM Ion Spray source를 갖춘 4000 QTRAP LC-MS/MS system)로 측정하였다. 부분 표본(Aliquots)(100 ㎕)은 샘플 분석을 위한 내부 표준으로서 카바마제핀(carbamazepine)을 포함하는 2배 부피의 아세토나이트릴(acetonitrile)로 희석한 후 96-웰 플레이트에 옮겼다.
그 결과, 상등액에 남아있는 니페디핀의 잔존량이 2D MH 배양된 오가노이드와 비교하여 HM 또는 DM 조건의 오가노이드에서 감소하였으며(도 23), 이는 2D 배양된 오가노이드와 비교하여, 3D 배양된 오가노이드의 해독 기능이 우수한 것을 의미한다.
더욱이, HM 조건의 오가노이드는 테스토스테론을 6β-하이드록시테스토스테론으로 직접 하이드록실화하였으며(도 24), 이는 HM 조건의 오가노이드가 CYP3A4 매개의 기능적으로 성숙한 약물 대사 활성을 나타내는 것을 의미한다.
실험예 5. 간 오가노이드를 이용한 약물 독성 결과 예측
2D 분화된 성숙 간 세포(2D MH) 및 HM 조건의 오가노이드(HM)를 24-웰 플레이트에 접종하였다. 각각의 약물(트로글리타존(Troglitazone), APAP 아세트아미노펜(acetaminophen) 로테논(Rotenone) 및 덱사메타손(dexamethasone)) 은 다이메틸-설폭사이드(dimethyl sulfoxide)(Sigma; D2650)로 100배 Cmax부터 연속적으로 희석하였다. 접종 3일 후, 상기 약물을 6일 동안 매일 첨가하였고, 독성은 Countess II FL(Life Technology)를 사용하여 세포 수를 계산하여 평가하였다. 그리고 나서, 오가노이드를 PBS로 세척하고, 공초점 현미경으로 형광 이미지를 촬영하였다. 상대적 강도는 동일한 영역에서 ZEN program(Zeiss)을 이용하여 측정하였다.
2D MH와 HM 조건의 오가노이드에 CYP3A4 및 CYP1A2/2E1 매개 간 독성 약물(트로글리타존(Troglitazone)(TRC; T892500) 및 APAP 아세트아미노펜(acetaminophen)(Sigma; A5000)) 및 대조군 화합물로서 2D MH 및 오가노이드에서 세포 독성을 나타내는 로테논(Rotenone; Santa Cruz; sc-203242) 및 안전한 덱사메타손(dexamethasone)을 처리한 결과, 트로글리타존 및 APAP에 대한 독성 반응은 2D 및 3D 모델에서 상이하였다(도 25).
세포 생존률에 기초하여 독성 농도(TC50)를 측정한 결과, 2D MH와 비교하여 오가노이드에서 독성 민감도가 현저하게 증가한 것을 확인하였다(도 26).
다음으로, 구조적으로 관련된 항생제인 트로바플록사신(trovafloxacin)(Sigma; PZ0015)과 레보플록사신(Levofloxacin)(Sigma; 28,266)이 2D MH와 HM 조건의 오가노이드에 미치는 효과를 비교하였다. 트로바플록사신은 간 부전으로 인한 환자 사망이라는 부작용이 있는 것으로 보고되었으며, 레보플록사신은 트로바플록사신의 비-독성 유사체이다.
그 결과, Cmax 농도(4.1 μM) 이하인 0.8 μM 및 4 μM의 트로바플록사신을 처리한 HM 조건의 오가노이드에서는 세포 수가 현저하게 감소하여 독성이 검출되었으나, 2D MH에서는 세포 수의 변화가 거의 없었다(도 27). 모든 약물에 대해 간 오가노이드가 민감하게 독성을 나타내는 것은 아니며, 비-독성 유사체인 레보플록사신은 Cmax 농도(23.8 μM)까지 독성이 없으며, 처리한 최고 농도 (100 μM)에서만 독성을 나타냈으며, 이는 오가노이드에서 세포 생존율의 36% 감소를 나타냈다(도 28).
미토콘드리아 독성의 실시간 모니터링을 위하여 OCR(Oxygen Consumption Rate, 산소 소모율)을 측정하였다. 오가노이드를 측정 2일 전에 XFe 96-웰 플레이트(Agilent; 102416-100)에 접종하였다. 프로브 카트리지는 37℃의 CO2가 없는 배양기에서 밤새 조정하였다. 분석 날에, 따뜻한 분석 배지(1 mM 글루타민, 1 mM 피루빈산 및 OCR 측정을 위한 17.5 mM 글루코즈가 보충된 Agilent Seahorse XF base medium(102353-100))로 배양 배지를 제거 및 세척하고, 분석 배지를 첨가하였다. 배양 접시는 37℃의 CO2가 없는 배양기에 1시간 동안 두고, 제조사의 지시에 따라 Seahorse XFe96 Flux Analyzer을 사용하여 OCR 측정을 수행하였다.
OCR 측정을 위하여 ATP 합성 억제제(1.5μM 올리고마이신, ETC complex V 억제제), uncoupler(1μM FCCP) 및 complex I 억제제(0.5μM 로테논) + complex III 억제제(0.5μM 안티마이신 A)를 지정된 시점에 순차적으로 첨가하였다. 측정값은 Cell Counting Kit-8(Dogindo; CK04-01)으로 측정한 생존 세포 수로 정규화하였다.
그 결과, 0.8 μM(도 29) 및 4 μM (도 30)와 같은 적은 용량의 트로바플록사신을 처리한 경우에, 오가노이드에서 OCR의 감소를 통하여 미토콘드리아 호흡의 손상을 명확하게 나타냈다.
이를 통하여, HM 조건의 간 오가노이드가 인간 간 조직 고유의 약물 독성에 대한 감수성 및 정확도를 나타내므로, 약물 독성을 평가하기 위한 간 모델로서 사용될 수 있음을 확인하였다.
실험예 6. 간 오가노이드의 재생 및 염증 반응 분석
HM 조건의 오가노이드는 접종 후 2일 차에 60시간 동안 20 mM APAP로 처리하고, 배지는 회복을 위해 새로운 HM 배지로 교환하거나 7일 차까지 20 mM 의 APAP를 연속적으로 처리하였다. Olympus IX83 inverted microscope을 사용하여 5% CO2, 37℃에서 30분 간격으로 타임 랩스(Time-lapsed) 이미지를 촬영하였다. 오가노이드의 직경은 타임 랩스 이미지로부터 지정된 시점에서 ImageJ program을 사용하여 측정하였다. 형광 이미지는 공초점 현미경으로 촬영하였다. 또한, ROS 검출을 위한 7.5 μM 다이하이드로에티듐(dihydroethidium)(Sigma; D7008), GSH 함량(content) 측정을 위한 30 μM 모노클로로비메인(monochlorobimane)(Sigma; 69899) 및 핵 염색을 위한 2.5 μM Syto11(Thermo Fisher; S7573)과 함께 30분 동안 배양하였다.
고용량 APAP로 처리한 후 HM 조건의 오가노이드의 회복 가능성과 염증 반응을 분석하였다(도 31). 20 mM의 APAP를 매일 처리하고 7일 후, 오가노이드는 심각한 형태학적 손상을 나타내었지만, APAP를 2일 차에 60시간 동안 처리한 후 4.5일 차에 새로운 HM 배지로 교환한 오가노이드는 7일 차에 회복하는 것을 확인하였다(도 32). 오가노이드의 크기를 측정한 결과에서도 APAP를 60시간 동안 처리한 후 4.5일 차에 새로운 HM 배지로 교환한 오가노이드는 7일차에 회복하는 것을 확인하였다(도 33).
또한, ROS의 검출 여부 및 세포의 염증 반응에 관여하는 단백질인 HMGB1 (high-mobility group protein 1), 세포의 증식성을 나타내는 마커인 ki67, 상피 마커인 E-카드헤린, 자가포식(autophagy) 마커인 LC3B 및 미토콘드리아 마커 Tom20의 발현을 단백질 수준에서 실험예 1에 기재된 방법으로 면역 세포 화학 분석하였다. 사용된 항체는 하기 표 8에 기재된 바와 같다.
Antibodies Catalog No. Company Dilution
anti- HMGB1 Ab79823 Abcam 1:200
anti-Ki67 Ab15580 Abcam 1:100
anti-E-cadherin 610181 BD biosciences 1:200
anti-LC3B #2775 Cell signaling technology 1:200
anti-Tom20 sc-17764 Santacruz 1:100
그 결과, APAP 처리시 증가된 ROS(reactive oxygen species, 활성 산소)가 검출되었고, HMGB1의 발현은 감소하면서, 세포질로의 이동이 나타났으며, Ki67, E-카드헤린 및 Tom20도 발현량이 감소하였다. 하지만, 새로운 HM 배지로 교환한 후에는 대조군과 유사한 수준으로 다시 회복하는 것을 확인하였다(도 34). 한편, LC3B의 발현은 5일 동안 APAP를 처리한 경우보다 60시간 동안 APAP를 처리한 경우에 더 강력하게 유도되었으며(도 34), 이는 ATP 함량(도 35) 및 GSH(glutathione, 글루타티온)/GSSG(Glutathione disulfide, 산화 글루타티온) 비율(도 36)과 유사한 패턴을 나타냈다.
APAP를 7일 동안 매일 처리한 오가노이드와 APAP를 2일 차에 60시간 동안 처리한 후 4.5일 차에 새로운 HM 배지로 교환한 오가노이드에서 염증 반응 관련 단백질 발현량을 비교하기 위하여, 실험예 2.1에 기재된 방법으로 qRT-PCR을 수행하였으며, 발현량을 기저 수준과 비교하여 표현하였다. 사용된 프라이머 서열은 하기 표 9에 기재된 바와 같다.
프라이머 염기서열 서열번호
IL-1β_F AATCTGTACCTGTCCTGCGTGTT 35
IL-1β_R TGGGTAATTTTTGGGATCTACACT 36
IL-6_F GGTACATCCTCGACGGCATCT 37
IL-6_R GTGCCTCTTTGCTGCTTTCAC 38
IL-8_F CTTGGCAGCCTTCCTGATTT 39
IL-8_R TTCTTTAGCACTCCTTGGCAAAA 40
IL-10_F GCCTAACATGCTTCGAGATC 41
IL-10_R TGATGTCTGGGTCTTGGTTC 42
TNFα_F GGAGAAGGGTGACCGACTCA 43
TNFα_R CTGCCCAGACTCGGCAA 44
FasL_F TCTGGAATGGGAAGACACC 45
FasL_R CACATCTGCCCAGTAGTGC 46
그 결과, APAP를 60시간 동안 처리한 후 4.5일 차에 새로운 HM 배지로 교환한 오가노이드에서는 항 염증성 매개체 IL-10의 발현이 현저하게 증가하였으나, APAP를 7일 동안 처리한 오가노이드에서는 염증 매개체인 IL-1β, IL-6, IL-8 및 병리학적 매개체인 TNF-α와 FasL의 발현이 강하게 유도되었다(도 37).
이를 통하여, HM 조건의 간 오가노이드는 간 독성 손상 후 재생 및 염증성 반응을 이해하기 위한 간 모델로서 사용될 수 있음을 확인하였다.
실험예 7. 간 오가노이드를 이용한 지방간 모델링
HM 조건의 오가노이드를 지방간 오가노이드로 유도하기 위해 24-웰 플레이트에 접종하였다. 접종 3일후, 12% fatty acid-free BSA(Sigma; A8806)과 결합된 0.5 mM 올레이트(oleate)(Sigma; O7501) 및 0.25 mM 팔미테이트(palmitate)(Sigma; P9767)를 3일 동안 첨가하였고, 축적된 지방 방울(lipid droplets)의 이미지를 현미경으로 관찰하였다. Nile red 염색을 위해, 샘플을 PBS로 세척하고 4% PFA로 4℃에서 밤새 고정하였다. 오가노이드를 PBS로 세척하고 10 μg/ml Nile red 용액(Thermo Fisher; N1142)을 실온에서 5분 동안 처리하였다. 형광 이미지는 공초점 현미경으로 촬영하였다.
트리글리세라이드(triglycerides) 농도 분석을 위해, 지방증(steatosis)-유도된 오가노이드를 제조사의 지시에 따라 triglyceride assay kit(Abcam; ab65336)를 사용하여 분석하였다. 오가노이드는 1 ml 5% NP-40 용액을 이용하여 80 내지 100℃로 가열된 조건에서 5분 동안 균질화하였다. 펠렛(pellets)은 분석을 시작하기 전 희석수로 10배 희석하였다. 흡광도는 SpectraMax microplate reader를 이용하여 570 nm에서 측정하였다.
약물 스크리닝을 위해, 자가포식 라이브러리(Selleckchem; L2600)에서 10 μM 농도의 화학 물질 151종을 간 지방증 유도 기간 동안 오가노이드에 처리하였다. 그 후 오가노이드를 Nile red로 염색하고 공초점 현미경으로 형광 이미지를 분석하였다.
한편, 간 지방증 유도에 미치는 영향을 확인하기 위하여, HM 조건의 오가노이드에 BSA, FA, FA + 이토목시르(etomoxir), FA + L-카르니틴 및 FA + 메트포르민(metformin)을 각각 처리하고 그 결과를 비교하였다.
β-산화를 위하여 미토콘드리아 막으로 지방산(FA)을 수송하는 카르니틴 셔틀(carnitine shuttle)을 차단하는, CPT1(carnitine palmitoyltransferase-1)의 비가역적 억제제인, 이토목시르를 추가적으로 처리하는 경우에, 지방증 유도가 촉진되는 것을 확인하였다. 즉, FA + 이토목시르 처리는 명시야 현미경 및 Nile red 염색에 의해 관찰되는 세포 내 지질 방울의 상당한 축적을 나타냈다(도 38 및 도 39).
세포 내 트리글리세라이드 농도는 BSA 대조군 또는 FA 단독 처리군과 비교하여 FA + 이토목시르 처리에 의해 크게 증가하였다(도 40). 기능적으로, OCR로 측정한 미토콘드리아 호흡은 FA + 이토목시르 처리에 의해 현저하게 감소하였다(도 41). 반대로, FA + L-카르니틴 처리군은 FA 단독 처리군과 비교하여 미토콘드리아의 카르니틴 셔틀을 촉진함으로써 지질 축적은 현저하게 감소하고, 미토콘드리아 호흡이 회복되는 것을 확인하였다. 또한, FA와 간 지방증을 감소시키는 항 당뇨병 약인 메트포르민을 함께 처리한 결과, 지질 축적은 약간 감소하였으나, 트리글리세라이드의 농도는 감소시키지 못하였다.
약물 스크리닝을 통하여 간 지방증의 표현형과 지질 축적을 억제할 수 있는 상위 4종의 화합물(에베로리무스(Everolimus), 스크립타이드(Scriptaid), 타케딘알린(Tacedinaline) 및 KU-0063794)을 확인하였다(도 42).
4종의 화합물을 처리한 경우에 간 지방산 트랜스로카제(translocase)인 CD36, 지방산 생성 관련 인자 SREBP 및 β-산화와 관련된 CPT1의 발현 수준을 비교하기 위하여, 실험예 2.1에 기재된 방법으로 qRT-PCR을 수행하였다. 사용된 프라이머 서열은 하기 표 10에 기재된 바와 같다.
프라이머 염기서열 서열번호
CD36_F AGATGCAGCCTCATTTCCAC 47
CD36_R GCCTTGGATGGAAGAACAAA 48
SREBP_F TCAGCGAGGCGGCTTTGGAGCAG 49
SREBP_R CATGTCTTCGATGTCGGTCAG 50
CPT1_F CCTACCACGGGTGGATGTTC 51
CPT1_R CAACATGGGTTTTCGGCCTG 52
CD36와 SREBP의 발현량은 4종의 화합물을 처리한 경우에 모두 감소하였으나, CPT1은 4종의 화합물을 처리한 경우에 모두 증가하였다(도 43). 또한, 트리글리세라이드의 농도도 상위 4종의 화합물을 처리한 경우에 감소하였다(도 44).
이를 통하여, HM 조건의 간 오가노이드는 지방간 모델로서 유도할 수 있고, 이는 지방간 치료제의 스크리닝을 위한 간 모델로서 사용될 수 있음을 확인하였다.
III. 간 내배엽 세포로부터 간 오가노이드의 직접 분화
실시예 4. 배지에 따른 간 오가노이드의 제조
CRL-2097 유래 인간 iPSCs로부터 완전 내배엽(DE) 세포를 거쳐 분화된 실시예 2의 간 내배엽(HE) 세포를 단일 세포로 분리하고, MH 배지(b 조건), HM 배지(c 조건), EM 배지(d 조건) 및 DM 배지(e 조건) 각각에서 3D 배양하여 간 오가노이드를 제조하였다(도 1의 New protocol II 참조).
3D 배양을 시작한지 25일 후, 각 배지에서 배양된 오가노이드의 이미지를 촬영하고(도 45), 생성된 오가노이드의 크기(도 46) 및 개수(도 47)를 정량화하여, 실시예 3.1의 종래 프로토콜에 따라 제조한 2D 성숙 간 세포(MH)와 비교하였다(a 조건).
그 결과, 종래의 2D 방법(a 조건)과 비교하여, 각각의 배지에서 3D 배양한 오가노이드 크기는 모두 증가하였고, 개수는 HM 배지에서는 2.5배, EM 배지에서는 3.3배 증가한 것을 확인하였다.
실험예 8. 간 오가노이드의 증식능 평가
대조군으로서 실시예 3.2에서 얻어진 간 오가노이드를 HM 배지에서 계대배양하고, MH 배지(b 조건), HM 배지(c 조건), EM 배지(d 조건) 또는 DM 배지(e 조건)에서 각각 제조한 간 오가노이드를 계대배양하였다. 그 결과, MH 배지에서 제조한 간 오가노이드는 2회(p2)이상, DM 배지에서 제조한 간 오가노이드는 3회(p3) 이상 계대배양한 경우에 증식 불가능한 것을 확인하였다(도 48).
대조군, MH 배지, HM 배지, EM 배지 및 DM 배지에서 각각 제조한 간 오가노이드를 1회(p1) 및 2회 계대배양한 후 이미지를 촬영하였다(도 49 및 도 51). 또한, p1에서 간 세포 특이적 마커인 ALB, HNF4A와 태아 간/전구체 특이적 마커인 AFP, CK19의 발현량을 비교하기 위하여, 실험예 2.1에 기재된 방법으로 qRT-PCR을 수행하였다. 사용된 프라이머 서열은 하기 표 11에 기재된 바와 같다.
프라이머 염기서열 서열번호
ALB_F TTTATGCCCCGGAACTCCTTT 17
ALB_R AGTCTCTGTTTGGCAGACGAA 18
AFP_F AGCTTGGTGGTGGATGAAAC 53
AFP_R CCCTCTTCAGCAAAGCAGAC 54
CK19_F CGCGGCGTATCCGTGTCCTC 15
CK19_R AGCCTGTTCCGTCTCAAACTTGGT 16
HNF4A_F GGCCAAGTACATCCCAGCTTT 55
HNF4A_R CAGCACCAGCTCGTCAAGG 56
그 결과, HM 배지에서 제조한 간 오가도이드의 ALB 및 HNF4A 발현은 대조군과 유사하고, AFP 및 CK19의 발현량은 대조군 대비 각각 3배, 2배 감소함을 확인하였다(도 50). 이는 간 내배엽으로부터 HM 배지를 이용하여 간 오가노이를 제조하는 경우에, 대조군의 간 오가노이드가 나타내는 미성숙 간 세포 특성을 감소시킨 것을 의미한다.
한편, DM 배지에서 제조한 간 오가노이드의 경우, p1에서 다른 조건들과 비교하여 ALB 발현량이 가장 높았으나, 계대배양이 진행될수록 ALB 발현량이 대조군 대비 현저히 감소하였으며, HM 배지 및 EM 배지에서 제조한 간 오가도이드의 경우에는 대조군과 유사하게 유지되는 것을 확인하였다(도 52).
또한, HM 배지 및 EM 배지에서 제조한 간 오가도이드를 25 ng/ml BMP7를 포함하는 EM 배지에서 이틀 동안 배양한 후, DM 배지에서 6일 동안 배양하여 추가 분화 시켰을 때(도 53), 대조군과 유사한 수준으로 ALB 및 CYP3A4이 발현되는 것을 통하여 성숙 간 세포로서의 기능성을 확인하였다(도 54).
실험예 9. 간 오가노이드의 특성 분석
HM 배지에서 제조한 간 오가노이드는 67회의 계대배양(p67)을 거쳐도 여전히 증식하고 있는 것을 확인하였다(도 55).
또한, HM 배지에서 제조한 간 오가노이드의 동결 및 해동 과정 후의 변화를 확인하였다. 구체적으로, 냉동 보존을 위해 계대배양한 간 오가노이드를 mFreSR(Stem Cell Technology; 05855)와 혼합하였고, 냉동/해동은 표준 절차에 따라 수행하였다. 해동 후, 배지에 10 μM Y-27632(Tocris; 1254)를 3일 동안 첨가하였다. 그리고 나서, 생존하고 있는 세포 수를 카운트하였다.
그 결과, 동결 및 해동 과정 후에도 간 오가노이드의 형태를 유지하며, 세포 생존률이 73 ± 2.56% 수준으로 유지되는 것을 확인하였다(도 56).
한편, p50에서도 정상 핵형을 유지하는 것을 확인하였고(도 57), p50까지 간 세포 특이적 마커인 ALB 발현은 유지되고, 태아/전구체 마커인인 AFP 발현은 감소함을 확인하였다(도 58). 이는, 여러 번의 계대배양을 거쳐도 성숙한 간 세포로서의 기능성을 유지하는 것을 의미한다.
실험예 10. HM 배지의 특성 분석
본 발명에 의한 HM 배지에서 제조한 간 오가노이드는 고가의 R-spondin 없이도 증식, 분화 능력이 EM 배지에서 제조한 간 오가노이드와 유사한 수준임을 확인하였으며, 표 1에 기재된 바와 같이, 기존에 공지된 간 오가노이드 배양 배지(MH 배지, EM 배지 및 DM 배지)와 구분되는 구성요소인 bFGF, OSM, ITS에 대하여 그 효과를 확인하기 위한 실험을 하였다.
간 오가노이드의 증식 가능한 특성에 영향을 미치는 주요 구성요소를 찾기 위하여, 오가노이드 생성 과정 중(도 59) 또는 후기의 계대배양 과정(도 62)에서, bFGF, OSM, ITS 각각 또는 이의 조합을 제거하면서 그 결과를 확인하였다.
오가노이드 생성 과정에서 bFGF, OSM, ITS 각각 단독으로 제거하는 경우에는 초기 단계에서 큰 영향을 미치지 않았고, 두 성분씩 제거하는 경우에 오가노이드 생성 효율이 감소하였다(도 60, 3일 차), 즉, 오가노이드 생성 초기 단계에서는 세 가지 구성요소가 서로 기능적으로 보완적인 관계인 것을 확인하였다.
한편, 오가노이드 생성 과정에서 9일 차에는 모든 조건에서 대조군 대비 생성되는 오가노이드의 수가 감소하였다(도 60, 9일 차). 즉, 오가노이드 생성 과정에서 세 가지 성분 중 하나라도 없는 경우에는 오가노이드의 생성이 억제되는 것을 확인하였다. 그러나, 생성되는 오가노이드의 크기에는 영향을 미치지 않았다(도 61)
후기의 계대배양 과정(p40~p45)인 오가노이드를 6주 동안 배양하는 과정에서 각 성분을 제거한 결과, #3(-OSM), #5(-bFGF, OSM), #7(-OSM, ITS), #8(-bFGF, OSM, ITS) 조건에서 대조군과 비교하여 유의적인 세포 증식 억제가 나타타는 것을 확인하였다(도 62). 특히, 세 가지 성분을 모두 제거한 경우에, 대조군과 비교하여 가장 유의적인 증식 억제 효과를 나타냈으며, 세 가지 성분 중에서는 OSM이 가장 중요한 구성요소일 것으로 예측된다.
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> MEDIA COMPOSITION FOR DIFFERENTIATION OF EXPANDABLE LIVER ORGANOIDS AND METHOD FOR PRODUCING LIVER ORGANOIDS USING THE SAME <130> FPD-201911-0003C <150> KR 10-2019-0109378 <151> 2019-09-04 <160> 56 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NANOG_F <400> 1 gcagaaggcc tcagcaccta 20 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NANOG_R <400> 2 aggttcccag tcgggttca 19 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LGR5_F <400> 3 gactttaact ggagcacaga 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LGR5_R <400> 4 agctttatta gggatggcaa 20 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FOXA2_F <400> 5 tgggagcggt gaagatggaa gggcac 26 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FOXA2_R <400> 6 tcatgccagc gcccacgtac gacgac 26 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOX17_F <400> 7 cgctttcatg gtgtgggcta aggacg 26 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOX17_R <400> 8 tagttggggt ggtcctgcat gtgctg 26 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HNF1B_F <400> 9 gcccacacac cacttacttc g 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HNF1B_R <400> 10 gtccgtcagg taagcaggga c 21 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HNF4A_F <400> 11 ggccaagtac atcccagctt t 21 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HNF4A_R <400> 12 cagcaccagc tcgtcaagg 19 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOX9_F <400> 13 ggaagtcggt gaagaacggg 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOX9_R <400> 14 tgttggagat gacgtcgctg 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CK19_F <400> 15 cgcggcgtat ccgtgtcctc 20 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CK19_R <400> 16 agcctgttcc gtctcaaact tggt 24 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALB_F <400> 17 tttatgcccc ggaactcctt t 21 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALB_R <400> 18 agtctctgtt tggcagacga a 21 <210> 19 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TTR_F <400> 19 tgggagccat ttgcctctg 19 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TTR_R <400> 20 agccgtggtg gaataggagt a 21 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CK18_F <400> 21 gagctgctcc atctgtaggg 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CK18_R <400> 22 cacagtctgc tgaggttgga 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RBP4_F <400> 23 gagttctccg tggacgagac 20 <210> 24 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RBP4_R <400> 24 tccagtggtc atcatttcct ttc 23 <210> 25 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYP3A4_F <400> 25 cttcatccaa tggactgcat 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18 <210> 35 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1beta_F <400> 35 aatctgtacc tgtcctgcgt gtt 23 <210> 36 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1beta_R <400> 36 tgggtaattt ttgggatcta cact 24 <210> 37 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6_F <400> 37 ggtacatcct cgacggcatc t 21 <210> 38 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6_R <400> 38 gtgcctcttt gctgctttca c 21 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-8_F <400> 39 cttggcagcc ttcctgattt 20 <210> 40 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-8_R <400> 40 ttctttagca ctccttggca aaa 23 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-10_F <400> 41 gcctaacatg cttcgagatc 20 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-10_R <400> 42 tgatgtctgg gtcttggttc 20 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNFalpha_F <400> 43 ggagaagggt gaccgactca 20 <210> 44 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNFalpha_R <400> 44 ctgcccagac tcggcaa 17 <210> 45 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FasL_F <400> 45 tctggaatgg gaagacacc 19 <210> 46 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FasL_R <400> 46 cacatctgcc cagtagtgc 19 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD36_F <400> 47 agatgcagcc tcatttccac 20 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD36_R <400> 48 gccttggatg gaagaacaaa 20 <210> 49 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SREBP_F <400> 49 tcagcgaggc ggctttggag cag 23 <210> 50 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SREBP_R <400> 50 catgtcttcg atgtcggtca g 21 <210> 51 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CPT1_F <400> 51 cctaccacgg gtggatgttc 20 <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CPT1_R <400> 52 caacatgggt tttcggcctg 20 <210> 53 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AFP_F <400> 53 agcttggtgg tggatgaaac 20 <210> 54 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AFP_R <400> 54 ccctcttcag caaagcagac 20 <210> 55 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HNF4A_F <400> 55 ggccaagtac atcccagctt t 21 <210> 56 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HNF4A_R <400> 56 cagcaccagc tcgtcaagg 19

Claims (15)

  1. bFGF(basic fibroblast growth factor), 온코스타틴 M(oncostatin M, OSM) 및 ITS(insulin-transferrin-selenium)를 포함하는 간 오가노이드 분화용 배지 조성물로서, 상기 배지 조성물은 줄기세포에서 분화된 간 내배엽(hepatic endoderm) 또는 간 세포(Hepatocyte)로부터 간 오가노이드로의 분화를 위한 것인 배지 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 DMEM(Dulbeco's Modified Eagle's Media), F-10, F-12, DMEM/F12, Advanced DMEM/F12, α-MEM(Minimum Essential Medium), IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium), BME(Basal Medium Eagle) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 배지를 포함하는 것인, 간 오가노이드 분화용 배지 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 PS, GlutaMAX, HEPES, N2 supplement, N-아세틸시스테인(N-Acetylcysteine), [Leu15]-Gastrin I, 표피 성장 인자(epidermal growth factor, EGF), 간 세포 증식 인자(Hepatocyte Growth Factor, HGF), 비타민 A가 없는 B27 supplement, A83-01, 니코틴아마이드(Nicotinamide), 포스콜린(Forskolin), 덱사메타손(dexamethasone) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나를 더 포함하는 것인, 간 오가노이드 분화용 배지 조성물.
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서,
    상기 간 오가노이드는 증식 가능한 것인, 간 오가노이드 분화용 배지 조성물.
  6. 줄기 세포로부터 분화된 간 내배엽 세포 또는 간 세포를 제1항 내지 제3항 및 제5항 중 어느 한 항에 기재된 배지 조성물에서 배양하는 단계를 포함하는, 간 오가노이드의 제조방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 줄기 세포는 인간 배아 줄기 세포(human embryonic stem cells, hESCs) 또는 인간 유도 만능 줄기 세포(human induced pluripotent stem cells, hiPSCs)인 것인, 간 오가노이드의 제조방법.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 배지 조성물에서 배양하는 단계는 상기 간 내배엽 세포 또는 간 세포를 3차원 배양하여 간 오가노이드로 분화하는 단계를 포함하는 것인, 간 오가노이드의 제조방법.
  9. 제6항에 있어서,
    상기 간 내배엽 세포는 단일 세포(single cell)로 분리된 후 매트릭스(matrix)에 내포(embedded)되어 간 오가노이드로 분화되는 것인, 간 오가노이드의 제조방법.
  10. 제6항에 있어서,
    상기 간 오가노이드는 67회 이상 계대배양이 가능한 것인, 간 오가노이드의 제조방법.
  11. 제6항에 있어서,
    상기 간 오가노이드는 증식 가능한 것인, 간 오가노이드의 제조방법.
  12. 제6항의 제조방법으로 제조된 간 오가노이드.
  13. 제12항의 간 오가노이드에 시험 물질을 접촉시키는 단계; 및
    상기 간 오가노이드에서 세포 생존률 또는 산소 소모율(Oxygen Consumption Rate, OCR)을 측정하는 단계를 포함하는, 간 독성 약물의 스크리닝 방법
  14. 제12항의 간 오가노이드를 지방간 오가노이드로 제조하는 단계; 및
    상기 지방간 오가노이드에 지방간 치료제 후보 물질을 처리하는 단계를 포함하는, 지방간 치료제의 스크리닝 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 간 오가노이드를 지방간 오가노이드로 제조하는 단계는 간 오가노이드에 지방산을 투여하는 것을 포함하는 것인, 지방간 치료제의 스크리닝 방법.
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113201592A (zh) * 2021-04-15 2021-08-03 南昌五元生物科技有限公司 一种鉴定肿瘤类器官的方法
KR20230000033A (ko) * 2021-06-23 2023-01-02 연세대학교 산학협력단 위 세포 배양용 조성물
WO2023085931A1 (en) * 2021-11-11 2023-05-19 Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen Hepatic organoids

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201111244D0 (en) * 2011-06-30 2011-08-17 Konink Nl Akademie Van Wetenschappen Knaw Culture media for stem cells
EP2412800A1 (en) * 2010-07-29 2012-02-01 Koninklijke Nederlandse Akademie van Wetenschappen Liver organoid, uses thereof and culture method for obtaining them
CA2794473A1 (en) * 2010-02-03 2011-08-11 National Cancer Center Induced hepatic stem cell and process for production thereof, and applications of the cell
JP2013539960A (ja) * 2010-07-02 2013-10-31 ザ ユニバーシティ オブ ノース カロライナ アット チャペル ヒル 工業規模の散布のためのバイオマトリックス足場
US10913933B2 (en) * 2013-02-13 2021-02-09 Wake Forest University Health Sciences Bioengineered liver constructs and methods relating thereto
JP2015008686A (ja) * 2013-06-28 2015-01-19 三菱レイヨン株式会社 肝臓細胞又はその前駆細胞に由来する細胞の状態を評価する方法、並びに、その方法に用いるプローブ又はプローブセット及びマイクロアレイ
US20180258400A1 (en) * 2015-09-15 2018-09-13 Agency For Science, Technology And Research (A*Star) Derivation of liver organoids from human pluripotent stem cells

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Biomaterials, vol.182, pp.299~311(2018)*
Stem Cells International, vol.2016, Article ID 3038764, 11 pages(2016)*

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