KR20230081737A - 간 오가노이드, 이의 고속 및 대량 제조 방법, 이를 이용한 약물의 효능 및 독성 스크리닝 방법 - Google Patents

간 오가노이드, 이의 고속 및 대량 제조 방법, 이를 이용한 약물의 효능 및 독성 스크리닝 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 간 오가노이드, 이의 고속 및 대량 제조 방법, 이를 이용한 간 관련 질환 약물의 스크리닝 방법, 약물의 체외 독성 스크리닝 방법 등에 관한 것으로서, 상기 제조방법에 따르면 동일한 마이크로 웰 플레이트에서 연속적으로 3차원 분화 과정을 거쳐 간 오가노이드를 고속 대량으로 제조할 수 있으며, 상기 제조방법으로 제조된 대량생산 간 오가노이드는 간세포(solid core part), 담관세포(cystic part), 간성상세포(hepatic stellate cell), 쿠퍼세포(Kuffer cell) 등 실제 간조직과 유사한 수준의 세포조성, 구조, 기능성을 가지고 안정적으로 체외 증식이 가능하다. 또한, 본 발명의 간 오가노이드를 이용한 체외 독성 스크리닝 방법은 간 독성을 보일 수 있는 약물을 사전에 스크리닝함으로써 신약개발의 시간과 비용을 단축시키고 그 효율을 개선시킬 수 있다.

Description

간 오가노이드, 이의 고속 및 대량 제조 방법, 이를 이용한 약물의 효능 및 독성 스크리닝 방법{Liver organoids, high-speed and large-scale manufacturing method thereof, and drug efficacy and toxicity screening methods using the same}
본 발명은 간 오가노이드, 이의 고속 및 대량 제조 방법, 이를 이용한 간 관련 질환 약물의 스크리닝 방법, 약물의 체외 독성 스크리닝 방법 등에 관한 것이다.
간은 물질대사, 콜레스테롤과 담즙산을 포함한 다양한 단백질의 합성, 글리코겐 저장 조절, 독성물질의 분해 등 다양한 기능을 하는 장기이다. 간질환은 국민전체의 5대 사망원인 중 하나로 사회활동이 가장 활발한 40~50대 남성에서 암 다음으로 2위를 차지할 정도로 주요한 질병이다. 실제 우리나라는 OECD 국가들 중 간염, 간암, 간경변증 등의 간질환으로 인한 사망률이 1위로 가장 높고, 간질환으로 인한 요양급여 지출액은 연간 3,550억 원에 이르며 실인원수는 약 166만 명에 달한다.
간은 생체 내에서 내재성 재생능을 갖는 대표적 기관이다. 간질환 기전 연구 및 치료제 개발 등 연구에 동물 모델 또는 종양 유래 간세포가 널리 사용되어 왔으나 인간 간세포와 유전적, 생리적 차이 및 제한된 기능성으로 인해 현재까지 체내 유래 일차 인간 간세포(primary human hepatocytes, PHHs)가 가장 적합한 모델로 평가되어 왔다. 그러나, 체내 유래 일차 인간 간세포는 체외 배양이 어렵고 체외 배양시 증식능력 및 기능성이 상실되며, 접근성이 극히 제한되어 있다는 다양한 한계점을 가진다. 따라서, 안정적 체외 증식능력과 높은 기능성을 가진 새로운 인간 세포-기반 환자 맞춤형 간세포 모델의 구축이 지속적으로 요구되어 왔다.
체내 유래 일차 인간 간세포의 다양한 한계를 극복하기 위해 배아 줄기세포(embryonic stem cell, ESC), 역분화 줄기세포(induced pluripotent stem cell, iPSC)를 비롯한 전능성줄기세포(pluripotent stem cell, PSC) 유래 간세포를 활용한 연구가 진행되었다. 그러나, 줄기세포 기법을 활용하여 생산된 간세포(배아 줄기세포 또는 역분화 줄기세포 유래 분화 간세포와 교차분화 간세포 등)의 경우 역시 제한된 체외 증식성과 실제 간조직과 상이한 기능성으로 인해 그 활용 가능성이 제한적이다.
최근 유용한 대안적인 공급원으로 전능성 줄기세포(PSC)로부터 생성된 간 오가노이드(organoid)가 주목받고 있다. 오가노이드란 줄기세포의 분화능(differentiation), 자기 재생능(self-renewal), 자가 조직화능(self-organization)을 활용하여 3차원 배양을 통해 체내 장기와 유사한 세포조성 및 구조를 재현해 내는 새로운 줄기세포 분화기법으로, 체내 장기와 유사한 환경을 모사함으로써 다양한 질환의 질환 모사 연구 및 치료 약물 스크리닝 연구에 활용 가능한 기술이다. 최근 개발된 간 오가노이드의 경우, 안정적으로 장기간 체외 배양이 가능하며 실제 간조직과 유사한 수준의 세포조성, 구조, 기능성을 보이는 것으로 알려져 있어 차세대 간질환 체외 질환 모델링 연구 및 신약개발 연구에 유용하게 활용될 수 있다.
그러나, 현재까지 간 오가노이드 생산 기술은 대부분 2차원적 분화와 3차원적 분화가 함께 사용되어 표준화 프로토콜 개발이 어렵고 간 오가노이드 대량생산이 어려운 치명적 한계점을 가진다.
이에, 본 발명자들은 간 오가노이드의 분화 전 과정을 최적화하여 3차원 분화를 통한 간 오가노이드 제조방법을 개발하였고, 상기 방법을 기반으로 동일한 마이크로 웰 플레이트에서 연속적으로 진탕과정 없이 전과정을 수행하는 간 3차원 세포집합체 고속 대량 배양방법을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
KR 10-2107057
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 3차원 분화로만 구성된 간 세포집합체의 고효율, 고기능 고속 대량 배양 방법과 상기 배양방법에 의해 제조된 간 3차원 세포집합체를 제공하는 것이다.
본 발명이 이루고자 하는 다른 기술적 과제는 상기 간 3차원 세포집합체를 포함하는 간 3차원 세포집합체 배양 키트를 제공하는 것이다.
본 발명이 이루고자 하는 또 다른 기술적 과제는 상기 간 3차원 세포집합체를 이용하는 간 관련 질환 약물의 스크리닝 방법, 간 관련 질환 치료를 위한 정보제공방법, 및 약물의 체외 독성 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 간 3차원 세포집합체의 고속 대량 배양 방법을 제공한다.
(1) 인간으로부터 분리된 줄기세포로부터 배아체(Embryoid body)를 형성하는 단계;
(2) 상기 배아체로부터 간 조직으로 분화를 유도하여 간 3차원 세포집합체를 형성하는 단계; 및
(3) 상기 간 3차원 세포집합체를 추가로 분화하는 단계.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 (1) 내지 (3) 단계는, 동일한 마이크로 웰 플레이트에서 연속적으로 비진탕 배양하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 (1) 단계에서 초기 시작 세포수는 50 내지 20,000 개, 바람직하게는 50 내지 1,000개로 하여 배아체를 형성하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 250개로 시작할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 (2) 단계는 적어도 20 내지 30 일 내에, 바람직하게는 약 20 일 내에 간 3차원 세포집합체를 형성하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 인간으로부터 분리된 세포는, 인간 배아 줄기세포(human embryonic stem cell, hESC), 역분화 줄기세포(induced pluripotent stem cell, iPSC)를 포함하는 전능성 줄기세포(pluripotent stem cell, PSC), 체내 유래 성체 줄기세포(adult stem cell) 및 교차분화 기술로 생산된 성체줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 3차원 세포집합체 형성 후, 추가적으로 진탕배양을 수행하는 경우 장기간 배양이 가능할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 마이크로 웰 플레이트는, 오목부를 갖는 멀티 웰 플레이트인 것일 수 있으며, 바람직하게는 96 웰 또는 384 웰 마이크로 플레이트일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 간 3차원 세포집합체를 형성하는 단계는, 내배엽 분화 단계 또는 간모세포 분화 단계를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 내배엽 분화 단계는 진정 내배엽(definitive endoderm, DE), 전장 내배엽(foregut endoderm, FE), 및 후방 전장 내배엽(posterior foregut endoderm, PFE)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 내배엽으로 분화하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 간 3차원 세포집합체를 형성하는 단계는, 내배엽 분화 단계 또는 간모세포 분화 단계에서 마트리겔을 한 번 이상 첨가하는 것일 수 있다. 바람직하게는 전장 내배엽 분화 단계, 후방 전장 내배엽 분화 단계, 및 간모세포 분화단계에서 각각 마트리겔을 최종농도 0.1~1%로 첨가하는 것일 수 있으며, 보다 구체적으로 마트리겔을 임베딩(embedding)하는 것이 아니라 배지 내에 첨가하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 배아체를 형성하는 단계는 KSR 20%, FBS 3%, Glutamax 1%, P/S 1%, Y27632 10 μM 및 bFGF 10 ng/ml을 포함하는 DMEM/F12 배지에서 수행되는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 진정 내배엽 분화 단계는, B27 -VA 1%, P/S 1%, NEAA 1%, Activin A 200 ng/ml, BMP4 10 ng/ml, LY294002 10 μM 및 CHIR99021 3 μM을 포함하는 RPMI 1640 배지에서 수행되는 것일 수 있으며, 추가적으로 B27 -VA 1%, P/S 1%, NEAA 1% 및 Activin A 200 ng/ml을 포함하는 RPMI 1640 배지에서 약 3 일간 추가 배양이 수행될 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 전장 내배엽 분화 단계는 B27 -VA 1%, P/S 1%, NEAA 1%, Matrigel 0.5~1%, FGF4 500 ng/ml 및 Dorsomorphin 1 μM를 포함하는 RPMI 1640 배지에서 약 3 일간 수행되는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 후방 전장 내배엽 분화 단계는, B27 -VA 1%, P/S 1%, NEAA 1%, Matrigel 0.5~1%, FGF4 500 ng/ml 및 retinoic acid 2 μM를 포함하는 RPMI 1640 배지에서 약 2 일간 수행되는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 간모세포 분화 단계는 B27 -VA 1%, P/S 1%, NEAA 1%, Matrigel 0.5~1%, BMP4 20 ng/ml 및 bFGF 5 ng/ml을 포함하는 RPMI 1640 배지에서 약 3 일간 수행되는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 간 3차원 세포집합체를 형성하는 단계는, FBS 10%, NEAA 1%, Glutamax 1%, ITS 0.1%, Dexamethasone 10 μM, HGF 50 ng/ml, OSM 20 ng/ml, EGF 50 ng/ml, Nicotineamide 0.5% 및 A83-01 4 ng/ml을 포함하는 DMEM/F12 배지에서 6 내지 10일간 수행되는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 간 3차원 세포집합체를 추가로 분화하는 단계는, 유지 배양액(expansion medium, EM), 분화 배양액(differentiation medium, DM), 또는 이의 혼합 배양액에서 수행되는 것일 수 있으며, 바람직하게는 상기 분화 배양액에서 약 10 내지 15 일간 이루어질 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 유지 배양액(EM)은 B27 1%, N2 1%, Glutamax 1%, HGF 25 ng/ml, EGF 50 ng/ml, N-Acetylcysteine 1 mM, Gastrin 10 nM, Forskolin 10 μM, A83-01 5 μM, Nicotineamide 10 mM, OSM 10 ng/ml, bFGF 10 ng/ml, 및 ITS 5 μg/ml을 포함하는 DMEM/F12 배지를 포함할 수 있고, 상기 분화 배양액(DM)은 B27 1%, N2 1%, Glutamax 1%, HGF 25 ng/ml, EGF 50 ng/ml, N-acetylcysteine 1 mM, Gastrin 10 nM, A83-01 0.5 μM, DAPT 10 μM, BMP7 25 ng/ml 및 FGF19 100 ng/ml을 포함하는 DMEM/F12 배지를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 진정 내배엽 분화 단계는, 50 내지 200 ng/ml의 activin A를, 바람직하게는 200 ng/ml의 activin A를 처리하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 전장 내배엽 분화 단계는, 50 내지 200 ng/ml의 noggin, 바람직하게는 200 ng/ml의 noggin 또는 1 μM의 dorsomorphin을 24 내지 72 시간, 바람직하게는 72 시간동안 처리하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 후방 전장 내배엽 분화 단계는, 0.5 내지 2 μM의 retinoic acid(RA), 바람직하게는 2 μM의 retinoic acid를 24 내지 72 시간, 바람직하게는 48 시간동안 처리하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 간모세포 분화 단계는, bFGF 5 내지 50 ng/ml, 바람직하게는 5 ng/ml의 bFGF; 및 BMP4 10 내지 20 ng/ml, 바람직하게는 20 ng/ml의 BMP4를 처리하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 진정 내배엽 분화 단계에서 OCT4, NANOG의 발현이 감소하고, SOX17, EOMES, CXCR4, FOXA2의 발현이 증가할 수 있다. 상기 전장 내배엽 분화 단계에서 SOX2의 발현이 증가하고 CDX2의 발현이 억제될 수 있다. 상기 후방 전장 내배엽 분화 단계에서 HNF1B, HNF6, ONECUT2의 발현이 증가할 수 있다. 상기 간모세포 분화 단계에서 CK19, EPCAM, AFP, LGR5, ALB, TTR, SOX9, A1AT, HNF4A의 발현이 증가할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 고속 대량 배양 방법에 의해 제조된 간 3차원 세포집합체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 간 3차원 세포집합체를 함유하는 오목 배양부; 및 상기 오목 배양부를 커버하는 커버부를 포함하는, 간 3차원 세포집합체 배양 키트를 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 배양 키트는 보존액을 포함하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 간 관련 질환 약물의 스크리닝 방법을 제공한다.
(1) 간 관련 질환 환자 유래 세포로부터 제1항의 간 3차원 세포집합체를 배양하는 단계;
(2) 상기 간 3차원 세포집합체에 후보물질을 접촉시키는 단계; 및
(3) 상기 후보물질이 처리된 간 3차원 세포집합체에서 간 관련 질환 치료제를 판정하는 단계.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 (3) 단계는 세포생존율(cell viability), 산소소모율(Oxygen Consumption Rate, OCR), 또는 간 관련 질환의 바이오마커의 발현량을 측정하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 간 관련 질환은 간염 바이러스, 단순 지방증, 비알코올성 지방간, 간 염증, 비알코올성 지방간염(NASH), 담즙정체성 간질환, 간섬유화, 간경변, 간부전, 및 간암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 간 3차원 세포집합체를 이용한 약물의 체외 독성 스크리닝 방법을 제공한다.
(1) 제1항의 간 3차원 세포집합체의 고속 대량 배양 방법에 포함되는 어느 하나 이상의 단계에서 3차원 세포집합체에 후보물질을 접촉시키는 단계;
(2) 상기 각 단계에서의 간 3차원 세포집합체에 대하여 후보물질의 존재 및 부존재에 따른 반응을 비교하는 단계; 및
(3) 상기 간 3차원 세포집합체 내에 존재하는 세포의 사멸 여부를 판별하는 단계.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 (3) 단계에서 세포는 간세포(solid core part), 담관세포(cystic part), 간성상세포(hepatic stellate cell), 및 쿠퍼세포(kuffer cell)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 간 오가노이드, 이의 고속 및 대량 제조 방법, 이를 이용한 간 관련 질환 약물의 스크리닝 방법, 약물의 체외 독성 스크리닝 방법 등에 관한 것으로서, 상기 제조방법에 따르면 동일한 마이크로 웰 플레이트에서 연속적으로 3차원 분화 과정을 거쳐 간 오가노이드를 고속 대량으로 제조할 수 있으며, 상기 제조방법으로 제조된 대량생산 간 오가노이드는 간세포(solid core part), 담관세포(cystic part), 간성상세포(hepatic stellate cell), 쿠퍼세포(Kuffer cell) 등 실제 간조직과 유사한 수준의 세포조성, 구조, 기능성을 가지고 안정적으로 체외 증식이 가능하다. 또한, 본 발명의 간 오가노이드를 이용한 체외 독성 스크리닝 방법은 간 독성을 보일 수 있는 약물을 사전에 스크리닝함으로써 신약개발의 시간과 비용을 단축시키고 그 효율을 개선시킬 수 있다.
도 1은 3차원 분화과정으로만 구성된 간 오가노이드 제조방법을 나타낸 것으로서, 인간줄기세포로부터 간세포 분화까지 2차원 분화과정을 거치는 기존 제조방법과 달리, 본 발명의 간 오가노이드 제조방법은 배아체(EB) 형성, 진정 내배엽(DE) 분화, 전장 내배엽(FE) 분화, 후방 전장 내배엽(PFE) 분화, 간 오가노이드 성숙화 등의 과정이 모두 3차원 배양으로 이루어진다는 점과 연속 비진탕 배양을 통한 간 오가노이드 고속, 대량 생산 과정을 나타낸 것이다.
도 2는 진정 내배엽 분화 단계에서 다양한 시작세포 수와 activin 농도에 따른 SOX17, EOMES, CXCR4 유전자의 발현 양상을 나타낸 것이다.
도 3은 전장 내배엽 분화 단계에서 다양한 농도의 noggin 또는 이와 유사한 dorsmorphin 등의 화합물을 24, 48, 72 시간동안 처리했을 때의 SOX2 및 CDX2 유전자의 발현 양상을 나타낸 것이다.
도 4는 후방 전장 내배엽 분화 단계에서 다양한 농도의 retinoic acid(RA)를 24, 48, 72 시간동안 처리했을 때의 HNF1B, HNF6, 및 ONECUT2 유전자의 발현 양상을 나타낸 것이다.
도 5는 간모세포 분화 단계에서 다양한 농도의 bFGF와 BMP4를 처리했을 때의 CK19, EPCAM, AFP, LGR5, ALB, 및 TTR 유전자의 발현 양상을 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명에서 최적화한 분화 조건으로 제조된 간 오가노이드가 미분화단계, 진정 내배엽(DE) 분화 단계, 전장 내배엽(FE) 분화 단계, 후방 전장 내배엽(PFE) 분화 단계, 간모세포(HB) 분화 단계로 진행될 때 각 단계별 마커 유전자들의 발현 양상을 나타낸 것이다.
도 7은 배아줄기세포주 H1 hESC 이외에 다른 배아줄기세포주 H9 hESC와 역분화줄기세포주 hiPSC line 1, 2를 사용하여 최적화 분화 조건의 재현성을 검증한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명에서 최적화한 분화 조건으로 제조된 간 오가노이드의 생산효율 및 형태별 간 오가노이드의 생산비율을 나타낸 것이다.
도 9는 cyst와 solid 파트를 포함하는 간 오가노이드와 solid 파트로만 구성된 간 오가노이드의 유전자 발현양상을 비교한 것이다.
도 10은 cyst와 solid 파트를 포함하는 간 오가노이드(이하 “cyst 간 오가노이드”라고 함)와 solid 파트로만 구성된 간 오가노이드의 계대배양 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 cyst 간 오가노이드의 안정적인 체외증식성을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 cyst 간 오가노이드를 동결, 해동 시 생존성을 검증한 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 cyst 간 오가노이드에서 ALB, SOX9, A1AT, HNF4A, EPCAM, LGR5 유전자의 발현양상을 나타낸 것이다.
도 14는 분화 배양액(DM)에서 성숙화된 cyst 간 오가노이드의 유전자 발현양상을 qPCR을 통해 나타낸 것이다.
도 15는 분화 배양액(DM)에서 성숙화된 cyst 간 오가노이드의 유전자 발현양상을 면역조직염색기법을 통해 나타낸 것이다.
도 16은 성숙화 cyst 간 오가노이드의 xenobiotic 대사와 글리코겐 저장능력을 확인하기 위해 ICG uptake assay 및 PAS 염색을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 17은 성숙화 cyst 간 오가노이드의 CYP3A4 활성도, 전체 담즙산(total bile acid) 생산, 알부민(albumin) 및 요소(urea) 분비를 확인하기 위해 ELISA 분석을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 18은 성숙화 cyst 간 오가노이드의 MRP2, BSEP 등 모세담관 막의 마커 유전자의 발현양상을 나타낸 것이다.
도 19는 96 웰 플레이트에서 3차원 연속배양을 통해 제조한 간 오가노이드의 형태를 전장 내배엽(FE)과 간모세포(HB) 단계에서 살펴본 결과를 나타낸 것이다.
도 20은 96 웰 플레이트에서 3차원 연속배양을 통해 제조한 다양한 시작세포 수에 따른 간 오가노이드의 형태를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 21은 96 웰 플레이트에서 3차원 연속배양을 통해 제조한 다양한 시작세포 수에 따른 간 오가노이드의 생산 효율을 나타낸 것이다.
도 22는 96 웰 플레이트에서 3차원 연속배양을 통한 간 오가노이드 생산에 있어서 마트리겔의 효과를 나타낸 것이다.
도 23은 96 웰 플레이트에서 3차원 연속배양을 통한 간 오가노이드 생산시 마트리겔 농도에 따른 간 오가노이드의 형태적 차이를 나타낸 것이다.
도 24는 실시예 2.1에 따라 대량생산한 간 오가노이드를 유지 배양액(EM), 분화 배양액(DM), 및 EM과 DM의 1:1 혼합 배양액에 각각 배양한 경우 오가노이드의 형태와 유전자 발현양상을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 25는 실시예 2.2에 따라 제조한 성숙화 대량생산 간 오가노이드와 실시예 1.3에 따라 제조한 성숙화 cyst 간 오가노이드, 간 세포주인 HepG2의 ALB, A1AT, TTR, HNF4A, AFP, SOX9, CK19 유전자 발현양상을 비교한 것이다.
도 26은 성숙화 대량생산 간 오가노이드의 세포조성을 분석하고, 이 때 간세포(solid core part)와 담관세포(cystic part)에서 세포 특이적 마커 유전자의 발현양상을 나타낸 것이다.
도 27은 성숙화 대량생산 간 오가노이드 내 간성상세포(hepatic stellate cell)의 존재 여부를 확인하기 위해 면역조직염색기법을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 28은 간독성 약물 처리 시 2D 분화 간세포와 cyst 간 오가노이드의 형태학적 변화를 나타낸 것이다.
도 29는 2D 분화 간세포와 cyst 간 오가노이드에서 간독성 약물에 따른 독성 반응을 TUNEL 염색을 통해 분자생물학적 수준에서 검증한 결과를 나타낸 것이다.
도 30은 2D 분화 간세포와 cyst 간 오가노이드에서 간독성 약물을 저용량, 중간 용량, 고용량 처리 시 반응성을 비교한 것이다.
기존 간 오가노이드 생산 기술은 1) 2차원 및 3차원 분화과정을 포함하며, 무작위적(random)이며 자발적으로(spontaneous) 통제되지 않은(uncontrolled) 간 오가노이드를 생산한다는 점, 2) 최초 96 웰 플레이트에서 6 cm 디쉬 등 다른 배양 포맷으로 이동시킨다는 점, 3) 마트리겔 드롭 임베딩(Matrigel drop embedding) 과정을 거친다는 점, 4) 고가의 분화 촉진인자인 R-spondin을 사용한다는 점, 5) 낮은 분화 효율 및 재현성을 가진다는 점, 6) 대량생산 시스템이 존재하지 않는다는 점 등 다양한 기술적 문제로 인하여 표준화 생산기술 개발이 어려운 상황이다.
이러한 기술적 문제를 해결하고 간 오가노이드 생산공정을 표준화함으로써 신속하게 대량생산하기 위해 본 발명자들은 3차원 분화과정으로만 구성된 간 오가노이드 생산기술을 개발하였고 나아가 마이크로 웰 플레이트에서 연속적으로 비진탕배양을 실시하여 100%에 가까운 효율로 간 오가노이드를 고속, 대량 생산 가능한 분화 기술을 개발하였다.
보다 구체적으로, 인간 전능성줄기세포로부터 간 오가노이드까지 전 분화과정 즉, 배아체(embryoid body, EB) 형성, 진정 내배엽(definitive endoderm, DE) 분화, 전장 내배엽(foregut endoderm, FE) 분화, 후방 전장 내배엽(posterior foregut endoderm, PFE) 분화, 간 오가노이드 성숙화 등 각 분화 단계별 분화 조건 최적화를 위한 연구를 수행하고, 이를 바탕으로 동일한 마이크로 웰 플레이트에서 연속적으로 3차원 분화 과정을 거쳐 간 오가노이드를 대량생산함으로써 본 발명을 완성하였다(도 1).
본 발명에서, “3차원 세포집합체”는 오가노이드일 수 있으며, 본 발명에서 용어 “오가노이드(organoid)”는 인간의 간조직 유래 또는 교차분화 등 다양한 줄기세포기법으로 생산된 성체줄기세포, 배아 줄기세포, 역분화 줄기세포 등을 포함하는 전능성 줄기세포로부터 자가 재생 및 자가 조직화를 통해 형성된 3차원 세포 집합체를 의미한다. 2차원 배양과는 달리, 3차원 세포 배양은 체외에서 세포가 모든 방향으로 성장할 수 있는바, 상기 오가노이드는 생체 내에서 상호작용하고 있는 장기를 유사하게 모사하여 질병의 치료제 개발 등에 이용될 수 있다. 구체적으로 환자의 조직으로부터 오가노이드를 구축함으로써 환자의 유전 정보를 기반으로 한 질병 모델링, 반복시험을 통한 약물 스크리닝 등을 가능하게 한다.
본 발명에서, 용어 "줄기세포"는 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말하며, 만능 줄기세포(totipotent stem cell), 전능성 줄기세포 (pluripotent stem cell), 다분화능 줄기세포(multipotent stem cell) 등으로 분류할 수 있다.
본 발명에서, 용어 "배지"는 in vitro에서 간 오가노이드의 증식, 생존 및 분화를 지지할 수 있게 하는 배지를 의미하고, 해당 분야에서 사용되는 간 오가노이드의 배양 및 분화에 적합한 통상의 배지를 모두 포함한다. 세포의 종류에 따라 배지의 종류와 배양 조건이 적절히 선택될 수 있다. 구체적으로, 상기 배지는 일반적으로 탄소원, 질소원 및 미량 원소 성분을 함유하는 세포 배양 최소 배지(cell culture minimum medium, CCMM)를 포함할 수 있다. 상기 세포 배양 최소 배지에는, 예를 들어, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), F-10, F-12, DMEM/F12, Advanced DMEM/F12, α-MEM(α-Minimal essential Medium), IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI1640, 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
실시예에서 사용한 용어는 단지 설명을 목적으로 사용된 것으로, 한정하려는 의도로 해석되어서는 안 된다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
이하에서, 첨부된 도면을 참조하여 실시예들을 상세하게 설명한다. 그러나, 실시예들에는 다양한 변경이 가해질 수 있어서 특허출원의 권리 범위가 이러한 실시예들에 의해 제한되거나 한정되는 것은 아니다. 실시예들에 대한 모든 변경, 균등물 내지 대체물이 권리 범위에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.
또한, 첨부 도면을 참조하여 설명함에 있어, 도면 부호에 관계없이 동일한 구성 요소는 동일한 참조부호를 부여하고 이에 대한 중복되는 설명은 생략하기로 한다.　 실시예를 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 실시예의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
[실시예]
실시예 1. 3차원 분화로만 구성된 간 오가노이드 생산 기술
1.1 간 오가노이드 제조를 위한 각 분화 단계별 조건 최적화
인간줄기세포로부터 간 오가노이드까지 전 분화과정 즉, 배아체(embryoid body, EB) 형성, 진정 내배엽(definitive endoderm, DE) 분화, 전장 내배엽(foregut endoderm, FE) 분화, 후방 전장 내배엽(posterior foregut endoderm, PFE) 분화, 간 오가노이드 성숙화 등 각 분화 단계별 분화 조건을 최적화한 결과는 다음과 같다.
배아체(EB) 형성 및 진정 내배엽(DE) 분화 조건 최적화를 위해 다양한 시작세포 수(1x103, 5x103, 및 1x104)와 Activin 농도(0, 50, 100, 200 ng/ml)로 분화를 유도하고, 각 조건에서 진정 내배엽(DE) 마커 유전자인 SOX17, EOMES, 및 CXCR4의 발현 양상을 확인하였다. 그 결과, 최초 진정 내배엽(DE) 분화를 위해서는 시작세포 수 1x104 개로 200 ng/ml의 Activin을 처리했을 때 가장 발현량이 높게 나타났으므로, 가장 효율적으로 분화가 이루어짐을 알 수 있다(도 2).
전장 내배엽(FE) 분화 조건 최적화를 위해 mid-hindgut 분화인자인 BMP 억제제인 noggin을 다양한 농도(50, 100, 200 ng/ml)로 24, 48, 72 시간동안 처리하고, 각 조건에서 hindgut endoderm 마커인 CDX2와 SOX2 발현 양상을 확인하였다. 그 결과 200 ng/ml의 noggin을 72 시간동안 처리했을 때 SOX2의 발현량이 가장 높게 나타났으며, CDX2의 발현이 가장 억제되었다. 또한, 소분자 화합물인 dorsmorphin은 noggin 대신 처리한 경우, noggin보다 더 높은 SOX2 발현량을 유도한 바, dorsmorphin이 전장 내배엽(FE) 분화과정에서 noggin을 대신하여 사용될 수 있다는 점을 확인했으며, 그 중 1 μM의 dorsmorphin 처리 시 가장 높은 발현량을 나타내었다(도 3).
후방 전장 내배엽(PFE) 분화 조건 최적화를 위해 후방 전장 내배엽(PFE) 분화에 중요한 인자로 알려진 retinoic acid(RA)를 다양한 농도(0.5, 1, 2 μM)로 24, 48, 72 시간동안 처리하고, 각 조건에서 후방 전장 내배엽(PFE) 마커인 HNF1B, HNF6, 및 ONECUT2 발현 양상을 확인하였다. 그 결과, 후방 전장 내배엽(PFE) 분화를 위해서는 2 μM의 RA를 48 시간동안 처리했을 때 가장 발현량이 높게 나타났으므로, 가장 효율적으로 분화가 이루어짐을 알 수 있다(도 4).
간모세포(hepatoblast, HB) 분화 조건 최적화를 위해 다양한 농도의 bFGF(0, 5, 50 ng/ml)와 BMP4(0, 10, 20 ng/ml)를 처리하고, 각 조건에서 CK19, EPCAM, AFP, LGR5, ALB, 및 TTR 유전자의 발현 양상을 확인하였다. 그 결과, 5 ng/ml의 bFGF와 20 ng/ml의 BMP4를 처리했을 때 가장 발현량이 높게 나타났으므로, 가장 효율적으로 분화가 이루어짐을 알 수 있다(도 5).
상술한 최적화 분화 조건에 따라 간 오가노이드를 제조한 후, qPCR와 면역조직염색을 통해 각 단계별 마커 유전자의 발현을 확인한 결과, 미분화단계, 진정 내배엽(DE) 분화 단계, 전장 내배엽(FE) 분화 단계, 후방 전장 내배엽(PFE) 분화 단계, 간모세포(HB) 분화 단계로 진행될 때 각 단계별 마커 유전자들이 정확하게 활성화 또는 불활성화되는 것을 확인하였다(도 6).
본 발명에서 최적화한 분화 조건의 재현성을 검증하기 위하여 배아줄기세포주 H1 hESC 이외에 다른 배아줄기세포주 H9 hESC와 역분화줄기세포주 hiPSC line 1, 2를 사용하여 간 오가노이드를 제조하였다. 그 결과, 다른 세포주들에서도 유사한 양상이 확인되었으며, 이는 본 발명의 최적화 분화 조건이 재현성을 가짐을 시사한다(도 7).
1.2 최적화 분화 조건에 따라 제조된 간 오가노이드의 특성
본 발명에서 최적화한 분화 조건을 사용한 경우 100% 효율로 간 오가노이드가 생산되었으며, 90%가 간세포(solid core part)를 중심으로 다수의 담관세포(cystic part, cyst)가 감싸고 있는 형태의 간 오가노이드였고, 10%는 간세포(solid core part, solid)만으로 구성된 간 오가노이드였다(도 8).
Cyst가 감싸고 있는 형태의 간 오가노이드(이하, “cyst 간 오가노이드”라고 함)와 solid 만으로 구성된 간 오가노이드는 유전자 발현상으로는 큰 차이가 없이 유사하였으나(도 9), solid 만으로 구성된 간 오가노이드의 경우 계대배양시 증식이 잘 이루어지지 않았다(도 10). 반면, cyst 간 오가노이드는 물리적 혹은 화학적 계대배양시 안정적으로 체외증식이 가능했으며 6개월 이상 (~10 passage) 안정적으로 유지되었다(도 11). 따라서, 이후 실험에서는 cyst 간 오가노이드를 사용하였다.
Cyst 간 오가노이드를 3차례 이상 반복적으로 동결 및 해동한 경우에도 cyst 간 오가노이드는 체외증식성을 잃지 않고 안정적으로 유지되었으며(도 12), 제조된 cyst 간 오가노이드가 ALB, SOX9, A1AT, HNF4A, EPCAM, LGR5 등의 유전자를 발현함을 조직면역염색 기법을 통해 확인하였다(도 13). 즉, 상술한 최적화 분화 조건에서 제조된 간 오가노이드는 전형적인 간 오가노이드의 구조적 특성을 보이며 안정적으로 체외 증식이 가능하므로, 대량의 간 오가노이드가 요구되는 drug library screening 등 대규모 신약개발 연구 등에 활용될 수 있음을 시사한다.
1.3 간 오가노이드 성숙화
제조된 cyst 간 오가노이드를 분화 배양액(differentiation medium, DM)에서 1주일간 성숙화를 유도하고, qPCR과 면역조직염색기법을 통해 유지 배양액(expansion medium, EM)에서 배양된 미성숙 cyst 간 오가노이드와 유전자 발현양상을 비교하였다. DM 유래 cyst 간 오가노이드, 즉 성숙화 cyst 간 오가노이드는 EM 유래 미성숙 cyst 간 오가노이드와 비교하여 다양한 간세포, 담관세포, 간전구세포 마커 유전자를 보다 높은 수준으로 발현하고 있음을 확인하였다(도 14 및 15).
성숙화 cyst 간 오가노이드의 체외 기능성 검증을 위해 ICG uptake assay(xenobiotic 대사)와 PAS 염색(글리코겐 저장)을 실시하였고 ELISA 분석을 통해 CYP3A4 활성도, 전체 담즙산(total bile acid) 생산, 알부민(albumin) 및 요소(urea) 분비를 확인하였다. 그 결과, 성숙화 cyst 간 오가노이드는 미성숙 cyst 간 오가노이드에 비해 xenobiotic 대사와 글리코겐 저장능력이 향상됨을 확인하였고(도 16), CYP3A4 활성도, 전체 담즙산 생산, 알부민 및 요소 분비 능력 역시 향상됨을 확인하였다(도 17). 상기 결과는 본 발명의 cyst 간 오가노이드가 기능적으로 성숙하여 충분한 체외 기능성을 가짐을 시사한다.
담즙의 생산은 간의 주요 기능으로써 간세포에서 생산된 담즙은 모세담관(bile canaliculi)이라는 얇은 튜브 형태의 구조를 통해 담관으로 수송된다. 본 발명의 성숙화 cyst 간 오가노이드는 MRP2, BSEP 등 모세담관 막의 마커를 발현하였으며, 이는 본 발명의 성숙화 cyst 간 오가노이드가 구조적으로도 실제 간조직과 유사함을 의미한다(도 18).
실시예 2. 동일한 마이크로 웰 플레이트에서 연속적으로 3차원 분화하는 간 오가노이드 대량생산 기술
2.1 간 오가노이드 대량생산 제조방법
실시예 1은 최초 96 웰 플레이트에서 시작하지만 진정 내배엽(DE) 단계부터는 6 cm 디쉬 등 다른 배양 포맷으로 이동하고, 마트리겔 드롭 임베딩(Matrigel drop embedding) 과정을 필수적으로 사용한다는 점에서 기존 간 오가노이드 기술의 한계를 포함하고 있다.
오가노이드 생산부터 약물 스크리닝까지 일원화된 전주기적 분화기술 확립을 위해서는 전 과정을 96 웰 플레이트 등 멀티웰 플레이트에서 다른 배양 포맷으로의 이동과 진탕 배양 없이 연속배양 가능한 프로토콜 확립이 요구된다. 또한, 96 웰 플레이트에서는 마트리겔 드롭 임베딩이 현실적으로 어려우므로 이를 생략 또는 대체 가능한 프로토콜의 개발이 필요한 실정이다. 최근 일부 연구진에 의해 자체제작 마이크로 웰 등을 사용한 다양한 장기 특이적 오가노이드 생산이 보고되고 있으나, high-throughput drug screening과 high-content imaging 등에 적합한 기존에 상용화된 웰 플레이트를 이용한 오가노이드 생산은 오가노이드 기술의 상용화를 위해 반드시 필요한 부분이다.
따라서, 본 발명자들은 간 오가노이드 전 분화과정을 진탕 배양 없이 최초 세포를 seeding한 96 웰 플레이트에서 연속적으로 배양가능한 간 오가노이드 제조방법을 개발하였다.
single cell로 dissociation된 배아줄기세포(hESC)를 96 웰 플레이트에 시작세포 수 1x102, 2.5x102, 1x103, 2.5x103, 및 5x103개로 seeding한 후, 실시예 1에서 최적화한 조건으로 단계별 분화를 유도하였다. 전장 내배엽(FE) 분화 단계 및 간모세포(HB) 분화 단계에서 각 시작세포 수별 간 오가노이드의 형태를 살펴본 결과, 시작세포 수에 비례하여 크기 차이는 있었지만 모든 경우에서 구형의 간 오가노이드가 형성됨을 확인하였다(도 19).
그러나, 간 오가노이드 형성 단계에서는 시작세포 수에 따라 매우 상이한 양상을 보였다. 시작세포 수가 1x103 개 이상이 사용된 경우, cyst 형태를 가진 일반적인 간 오가노이드가 매우 드물게 (1x103) 또는 아예 형성이 되지 않았다(2.5x103, 5x103). 한편, 시작세포 수 1x102, 2.5x102 개의 경우, 전형적인 간 오가노이드로의 분화양상을 나타냈다(도 20).
간 오가노이드 생산 효율의 경우, 시작세포 수 2.5x102 개의 경우 100% 효율로 간 오가노이드가 생산되었으며 96 웰 플레이트의 모든 웰에서 전형적인 cyst 형태의 간 오가노이드가 관찰되었다. 한편, 다른 조건에서는 상대적으로 낮은 효율을 보였고, 5x103 개에서는 전형적인 형태의 간 오가노이드가 형성이 되지 않았다(도 21).
마트리겔 임베딩을 하는 기존 방법과 다르게 간 오가노이드의 연속 비진탕 배양을 통한 대량생산시, 마트리겔을 배양액에 직접 첨가하는 방법을 사용하였다(도 1). 최종농도 1%의 마트리겔을 전장 내배엽(FE), 후방 전장 내배엽(PFE), 간모세포(hepatoblast, HB) 단계에 걸쳐 처리하였고, 그 결과 처리하지 않은 군에 비해 마트리겔을 처리한 경우 모든 분화단계에서 월등히 향상된 간 오가노이드의 성장율과 cyst의 형성 효율이 관찰되었다(도 22).
3차원 연속 비진탕 배양시, 마트리겔의 효과를 확인하기 위하여, 다양한 농도의 마트리겔(0%, 0.5%, 1%, 2.5%, 5%)을 전장 내배엽(FE), 후방 전장 내배엽(PFE), 간모세포(HB) 단계에 걸쳐 처리하여 그 효과를 비교하였다. 그 결과 마트리겔을 처리 하지 않거나 고농도(2.5%, 5%)를 처리한 경우 cyst 형태의 간 오가노이드 생성이 관찰되지 않은 반면 저농도(0.5%, 1%)를 처리한 경우 cyst 형태를 가진 간 오가노이드가 효율적으로 형성되었다(도 23). 나아가, 0.5%를 처리한 경우 간모세포(HB) 단계에서도 cyst 형성이 관찰되어 낮은 농도의 마트리겔을 배양액에 바로 첨가해 주는 것이 cyst 형태 간 오가노이드 생산에 보다 효율적임을 확인하였다(도 23).
2.2 대량생산된 간 오가노이드의 배양조건 최적화
실시예 2.1에서 대량생산된 간 오가노이드의 배양조건 최적화를 위해 유지 배양액(EM), 분화 배양액(DM), 및 EM과 DM의 1:1 혼합 배양액에서 각각 배양한 결과, 분화 배양액(DM)에서 배양한 간 오가노이드(이하 “성숙화 대량생산 간 오가노이드”라고 함)에서 대부분의 마커 유전자가 높게 발현하였다(도 24). 상기 결과는 대량생산된 간 오가노이드를 분화 배양액(DM)에서 배양함으로써 간 오가노이드를 기능적으로 성숙화할 수 있음을 시사한다.
2.3 성숙화 대량생산 간 오가노이드의 특성
실시예 2.2의 성숙화 대량생산 간 오가노이드의 유전자 발현양상을 실시예 1.3의 성숙화 cyst 간 오가노이드 및 간 세포주 HepG2와 비교하였다. 그 결과, 대부분의 마커 유전자가 실시예 2.2의 성숙화 대량생산 간 오가노이드에서 가장 높게 발현됨을 확인하였다(도 25). 이는 본 발명의 성숙화 대량생산 간 오가노이드가 간 세포주 및 기존 기술로 생산한 간 오가노이드보다 우수한 특성을 지님을 시사한다.
성숙화 대량생산 간 오가노이드의 세포 조성을 파악하기 위해 면역조직염색 분석을 수행하였다. 그 결과, 형태학적 분석에서 상기 간 오가노이드는 간세포(solid core part)와 담관세포(cystic part)를 동시에 가지고 있음을 확인하였다. 실제 면역조직염색 결과 성숙화 대량생산 간 오가노이드의 간세포 파트는 ALB, NTCP 등을 발현하고(도 26) 담관세포 파트는 ALB, NTCP를 발현하지 않는 것을 확인하였다. 또한, 성숙화 대량생산 간 오가노이드 내에 실제 간조직에 존재하는 비실질세포인 간성상세포(hepatic stellate cell)와 쿠퍼세포(kuffer cell)이 존재하는지 여부를 면역조직염색기법으로 검증하였다. 그 결과, 분화 20~40일 대량생산 간 오가노이드에서 간성상세포 마커인 a-SMA, WT1, Vimentin이 발현됨을 확인하였고 쿠퍼세포의 마커인 CD68이 발현됨을 확인하였다(도 27). 상기 결과들은 성숙화 대량생산 간 오가노이드가 단기간 분화과정으로 실제 간조직과 유사한 세포조성(간세포, 담관세포, 간성상세포, 쿠퍼세포 등)을 가진다는 점을 시사한다.
실시예 3. 간 오가노이드 기반 체외 독성 스크리닝 기술
본 발명의 간 오가노이드를 이용하여 간 오가노이드 기반 체외 독성 스크리닝 연구를 수행하였다. 이를 위해 2D 분화 간세포와 본 발명의 실시예 1.2의 cyst 간 오가노이드에서 낮은 빈도로 간독성을 보이는 약물인 thioridazine HCL과 chloroquine diphosphate 간독성으로 인해 시장에서 철회된 약물인 cyclosporin A, nefazodone, Rac-perhexiline maleate, sulindac, troglitazone, tamoxifen의 독성 반응을 비교 분석하였다. 24 시간 동안 약물에 따라 서로 다른 농도로 각 약물을 처리 후, 2D 분화 간세포와 cyst 간 오가노이드의 형태적 분석을 수행하였다. 6개의 약물 (nefazodone, thioridazine HCL, Rac-perhexiline maleate, chloroquine diphosphate, troglitazone, tamoxifen)을 처리한 경우, 2D 분화 간세포의 세포사멸과 cyst 간 오가노이드의 크기 감소가 관찰되었으며, cyclosporin A와 sulindac을 처리한 경우, 형태적 변화를 관찰할 수 없었다(도 28).
각 약물에 따른 독성 반응을 분자생물학적 수준에서 검증하기 위해 TUNEL 염색을 수행하였다. 그 결과 대부분의 약물이 cyst 간 오가노이드에서 2D 분화 간세포 대비 보다 민감한 독성 반응성을 나타내었다(도 29). Cyclosporin A는 모든 농도에서 cyst 간 오가노이드에서 보다 민감한 독성 반응성을 나타냈으며, nefazodone, thioridazine HCL, Rac-perhexiline maleate, sulindac, 및 chloroquine diphosphate는 낮은 농도 혹은 높은 농도에서 cyst 간 오가노이드에서 2D 분화 간세포 대비 민감한 독성 반응성을 나타내었다.
나아가, troglitazone과 nefazodone과 구조적 유사체이나 독성이 없는 rosiglitazone과 buspirone을 처리한 경우 어떠한 독성을 관찰할 수 없었으며 이는 cyst 간 오가노이드를 통해 정확한 수준으로 약물의 독성을 예측 가능함을 나타낸다(도 28 및 도 29).
결론적으로 cyst 간 오가노이드가 2D 분화 간세포 대비 보다 정확하고 민감한 독성 반응성을 보임을 확인하였다(도 30). 상기 결과는 본 발명의 cyst 간 오가노이드는 물론, 실제 간조직과 유사한 세포조성을 가지는 성숙화 대량생산 간 오가노이드가 약물 후보물질의 독성을 사전에 평가할 수 있는 체외 모델로서 그 활용성을 가진다는 점을 시사한다.
이상과 같이 실시예들이 비록 한정된 도면에 의해 설명되었으나, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기를 기초로 다양한 기술적 수정 및 변형을 적용할 수 있다. 예를 들어, 설명된 기술들이 설명된 방법과 다른 순서로 수행되거나, 및/또는 설명된 시스템, 구조, 장치, 회로 등의 구성요소들이 설명된 방법과 다른 형태로 결합 또는 조합되거나, 다른 구성요소 또는 균등물에 의하여 대치되거나 치환되더라도 적절한 결과가 달성될 수 있다.
그러므로, 다른 구현들, 다른 실시예들 및 특허청구범위와 균등한 것들도 후술하는 청구범위의 범위에 속한다.

Claims (27)

  1. (1) 인간으로부터 분리된 줄기세포로부터 배아체(Embryoid body)를 형성하는 단계;
    (2) 상기 배아체로부터 간 조직으로 분화를 유도하여 적어도 20 내지 30일 내에 간 3차원 세포집합체를 형성하는 단계; 및
    (3) 상기 간 3차원 세포집합체를 추가로 분화하는 단계를 포함하는,
    간 3차원 세포집합체의 고속 대량 배양 방법으로서,
    상기 (1) 내지 (3) 단계는, 동일한 마이크로 웰 플레이트에서 연속적으로 비진탕 배양하는,
    간 3차원 세포집합체의 고속 대량 배양 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 (1) 단계는 초기 시작 세포수를 50개 내지 1,000개로 하여 배아체를 형성하는 것을 특징으로 하는, 간 3차원 세포집합체의 고속 대량 배양 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 인간으로부터 분리된 세포는, 전능성 줄기세포(pluripotent stem cell, PSC) 또는 성체 줄기세포(adult stem cell)인 것인, 간 3차원 세포집합체의 고속 대량 배양 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 간 3차원 세포집합체 형성 후, 추가적으로 진탕배양을 수행하는 경우 장기간 배양이 가능한 것인, 간 3차원 세포집합체의 고속 대량 배양 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 마이크로 웰 플레이트는, 오목부를 갖는 멀티 웰 플레이트인 것인, 간 3차원 세포집합체의 고속 대량 배양 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 간 3차원 세포집합체를 형성하는 단계는, 내배엽 분화 단계 또는 간모세포 분화 단계를 포함하는 것인, 간 3차원 세포집합체의 고속 대량 배양 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 내배엽 분화 단계는 진정 내배엽(definitive endoderm, DE), 전장 내배엽(foregut endoderm, FE), 및 후방 전장 내배엽(posterior foregut endoderm, PFE)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 내배엽으로 분화하는 것을 특징으로 하는, 간 3차원 세포집합체의 고속 대량 배양 방법.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 간 3차원 세포집합체를 형성하는 단계는, 내배엽 분화 단계 또는 간모세포 분화 단계에서 0.1 내지 1%의 마트리겔을 한 번 이상 첨가하는 것을 특징으로 하는, 간 3차원 세포집합체의 고속 대량 배양 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 배아체를 형성하는 단계는, Y27632 및 bFGF를 포함하는 배지에서 수행되는 것을 특징으로 하는, 간 3차원 세포집합체의 고속 대량 배양 방법.
  10. 제7항에 있어서,
    상기 진정 내배엽 분화 단계는, CHIR99021, LY294002, activin A, 및 BMP4를 포함하는 배지에서 수행되는 것을 특징으로 하는, 간 3차원 세포집합체의 고속 대량 배양 방법.
  11. 제7항에 있어서,
    상기 전장 내배엽 분화 단계는, Dorsomorphin 및 FGF4를 포함하는 배지에서 수행되는 것을 특징으로 하는, 간 3차원 세포집합체의 고속 대량 배양 방법.
  12. 제7항에 있어서,
    상기 후방 전장 내배엽 분화 단계는, FGF4 및 retinoic acid를 포함하는 배지에서 수행되는 것을 특징으로 하는, 간 3차원 세포집합체의 고속 대량 배양 방법.
  13. 제6항에 있어서,
    상기 간모세포 분화 단계는, BMP4 및 bFGF를 포함하는 배지에서 수행되는 것을 특징으로 하는, 간 3차원 세포집합체의 고속 대량 배양 방법.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 간 3차원 세포집합체를 형성하는 단계는, ITS, Dexamethasone, HGF, Oncostatin M, EGF, Nicotineamide, 및 A83-01를 포함하는 배지에서 수행되는 것을 특징으로 하는, 간 3차원 세포집합체의 고속 대량 배양 방법.
  15. 제1항에 있어서,
    상기 간 3차원 세포집합체를 추가로 분화하는 단계는, HGF, EGF, N-acetylcysteine, Gastrin, A83-01, DAPT, BMP7, 및 FGF19를 포함하는 배지에서 수행되는 것을 특징으로 하는, 간 3차원 세포집합체의 고속 대량 배양 방법.
  16. 제7항에 있어서,
    상기 진정 내배엽 분화 단계는, 50 내지 200 ng/ml의 activin A를 처리하는 것을 특징으로 하는, 간 3차원 세포집합체의 고속 대량 배양 방법.
  17. 제7항에 있어서,
    상기 전장 내배엽 분화 단계는, 50 내지 200 ng/ml의 noggin 또는 1 μM의 dorsomorphin을 24 내지 72 시간동안 처리하는 것을 특징으로 하는, 간 3차원 세포집합체의 고속 대량 배양 방법.
  18. 제7항에 있어서,
    상기 후방 전장 내배엽 분화 단계는, 0.5 내지 2 μM의 retinoic acid(RA)를 24 내지 72 시간동안 처리하는 것을 특징으로 하는, 간 3차원 세포집합체의 고속 대량 배양 방법.
  19. 제6항에 있어서,
    상기 간모세포 분화 단계는, bFGF 5 내지 50 ng/ml 및 BMP4 10 내지 20 ng/ml를 처리하는 것을 특징으로 하는, 간 3차원 세포집합체의 고속 대량 배양 방법.
  20. 제1항의 간 3차원 세포집합체의 고속 대량 배양 방법에 의해 제조된, 간 3차원 세포집합체.
  21. 제20항의 간 3차원 세포집합체를 함유하는 오목 배양부; 및
    상기 오목 배양부를 커버하는 커버부를 포함하는, 간 3차원 세포집합체 배양 키트.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 간 3차원 세포집합체 배양 키트는, 보존액을 포함하는 것인, 간 3차원 세포집합체 배양 키트.
  23. 하기 단계를 포함하는 간 관련 질환 약물의 스크리닝 방법:
    (1) 간 관련 질환 환자 유래 세포로부터 제1항의 간 3차원 세포집합체를 배양하는 단계;
    (2) 상기 간 3차원 세포집합체에 후보물질을 접촉시키는 단계; 및
    (3) 상기 후보물질이 처리된 간 3차원 세포집합체에서 간 관련 질환 치료제를 판정하는 단계.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 (3) 단계는 세포생존율(cell viability), 산소소모율(Oxygen Consumption Rate, OCR), 또는 간 관련 질환의 바이오마커의 발현량을 측정하는 것을 특징으로 하는, 간 관련 질환 약물의 스크리닝 방법.
  25. 제23항에 있어서,
    상기 간 관련 질환은 간염 바이러스, 단순 지방증, 비알코올성 지방간, 간 염증, 비알코올성 지방간염(NASH), 담즙정체성 간질환, 간섬유화, 간경변, 간부전, 및 간암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 간 관련 질환 약물의 스크리닝 방법.
  26. 하기 단계를 포함하는 간 3차원 세포집합체를 이용한 약물의 체외 독성 스크리닝 방법:
    (1) 제1항의 간 3차원 세포집합체의 고속 대량 배양 방법에 포함되는 어느 하나 이상의 단계에서 3차원 세포집합체에 후보물질을 접촉시키는 단계;
    (2) 상기 각 단계에서의 간 3차원 세포집합체에 대하여 후보물질의 존재 및 부존재에 따른 반응을 비교하는 단계; 및
    (3) 상기 간 3차원 세포집합체 내에 존재하는 세포의 사멸 여부를 판별하는 단계.
  27. 제26항에 있어서,
    상기 (3) 단계에서 세포는 간세포(solid core part), 담관세포(cystic part), 간성상세포(hepatic stellate cell), 및 쿠퍼세포(kuffer cell)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 약물의 체외 독성 스크리닝 방법.

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