KR102107057B1

KR102107057B1 - 간 유래 줄기세포를 포함하는 간 오가노이드의 제조방법 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102107057B1
Application number: KR1020180114363A
Authority: KR
Inventors: 유종만; 한수정
Original assignee: 오가노이드사이언스 주식회사
Priority date: 2018-09-21
Filing date: 2018-09-21
Publication date: 2020-05-07
Also published as: KR20200034496A

Abstract

간 유래 줄기세포를 포함하는 오가노이드의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것으로, 상기 방법에 의해 제조된 오가노이드는 세포 및 동물실험을 대체할 수 있는 모델로서 체내 약물 대사 효소인 시토크롬 P450을 활성화시켰는바 약물대사 플랫폼으로 이용할 수 있다.

Description

간 유래 줄기세포를 포함하는 간 오가노이드의 제조방법 및 이의 용도{Method for preparing liver organoid comprising stem cell derived from liver and use thereof}

간 유래 줄기세포를 포함하는 간 오가노이드의 제조방법에 관한 것이다.

오가노이드는 줄기세포나 장기세포에서 분리한 세포를 배양하거나 재조합하여 만든 미니장기로서, 각 해당 기관과 매우 유사한 구조와 기능을 가지는 것을 기반으로 하여 실제 조직과 최대한 가깝게 분화가 가능하다는 특징이 있다.

한편, 최근 재생의학이나 세포 치료제로써 오가노이드의 연구가 활발하게 진행되고 있다. 실질적인 약물 대사반응 등의 시도는 동물실험에서 주로 이루어 지고 있으나, 인간과 동물의 유전자 구조가 100% 같지 않기 때문에 동물에게 아무런 반응이 없는 물질도 인간에게 치명적일 수 있으며, 동물의 권리 침해에 대한 문제가 있다. 또한, 2차원으로 배양된 세포는 불멸화(immortalized)된 세포로서 약물 대사 정도에 있어 실제 장기와 차이가 있는바 정확한 실험이 어렵다는 문제가 있다. 또한, 약물대사를 평가하는 데 있어 가장 우수한 방법은 사람의 장기세포를 직접 이용하는 것이나 조직을 구하는데 한계가 있으며 체외 증식이 어려워 많은 양을 얻는데 어려움이 있다.

일 양상은 간 유래 줄기세포를 3차원 배양하는 단계; 및 상기 3차원 배양을 통해 형성된 오가노이드에 시토크롬 P450(cytochrome P450) 유도제를 처리하는 단계를 포함하는 시토크롬 P450이 활성화된 간 오가노이드의 제조방법을 제공하는 것이다.

다른 양상은 상기 방법에 의해 제조된 간 오가노이드를 제공하는 것이다.

다른 양상은 간 유래 줄기세포를 포함하는, 시토크롬 P450이 활성화된 간 오가노이드를 제공하는 것이다.

다른 양상은 상기 간 오가노이드에 시험 물질을 접촉시키는 단계; 상기 시험 물질이 처리된 간 오가노이드를 암 세포와 공배양(co-culture)하는 단계; 및 공배양한 암 세포의 세포 사멸 수준을 대조군의 세포 사멸 수준과 비교하는 단계를 포함하는 암 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

일 양상은 간 유래 줄기세포를 3차원 배양하는 단계; 및 상기 3차원 배양을 통해 형성된 오가노이드에 시토크롬 P450(cytochrome P450) 유도제를 처리하는 단계를 포함하는 시토크롬 P450이 활성화된 간 오가노이드의 제조방법을 제공한다.

본 명세서 내 용어 "오가노이드(organoid)"는 3D 입체구조를 가지는 세포를 의미하며, 동물 등에서 수집, 취득하지 않은 인공적인 배양 과정을 통해 제조한 간과 유사한 모델을 의미한다. 이를 구성하는 세포의 유래는 제한되지 않는다. 2D 배양과는 달리, 3D 세포 배양은 체외에서 세포가 모든 방향으로 성장할 수 있는바, 상기 오가노이드는 생체 내에서 상호작용 하고 있는 장기를 유사하게 모사하여 질병의 치료제 개발 등에 이용될 수 있다. 또한, 상기 간 유래 줄기세포를 오가노이드로 배양함으로써 기존의 동물 모델의 한계인 인간의 생리학적 및 진화적 차이를 극복할 수 있고, 2D 세포 배양 시스템을 이용할 경우 발생하는 간 세포의 형성 과정 및 복잡한 병리학적 과정을 밝히는 데 활용될 수 있다.

일 구체예에 따른 방법은 간 유래 줄기세포를 3차원 배양하는 단계를 포함한다.

본 명세서 내 용어 "줄기세포"는 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell, iPSC)일 수 있으며, 인위적인 리프로그래밍(reprogramming) 과정을 통해 전분화능(pluripotency)을 가지도록 유도된 세포를 의미한다. 구체적으로, 상기 간 유래 줄기세포는 간으로부터 분리된 간관(hepatic duct)으로부터 유래된 것일 수 있다. 상기 간관은 간에서 분비되는 쓸개즙을 쓸개로 보내는 관으로 담당관과 합류하여 총담관이 되어 십이지장으로 통하는 관으로 이른바 간외 담로의 최초의 부분을 의미한다.

다른 구체예에 다른 방법은 상기 3차원 배양을 통해 형성된 오가노이드에 시토크롬 P450(cytochrome P450) 유도제를 처리하는 단계를 포함한다. 상기 시토크롬 P450은 색소 단백질인 헴단백질(hemoprotein)의 하나로, 세포 내 다양한 종류의 크고 작은 분자를 기질로 하여 효소 반응을 일으키는 효소 단백질이며, 약물의 대사 반응을 수행할 수 있다. 상기 유도제는 덱사메타손(dexamethasone), β-나프토플라본(β-naphthoflavone, BNF), 1,4-bis-2-(3,5-디클로로피리딜옥시)-벤젠(1,4-bis-2-(3, 5-dichloropyridyloxy)-benzene, TCPOBOP), 카바마제핀(canamazepine) 또는 이들의 조합일 수 있다. 구체적으로, 상기 유도제에 의해 오가노이드의 시토크롬 P450을 활성화시킴으로써 시트크롬 P450 패밀리 유전자의 발현이 증가될 수 있다. 상기 시토크롬 P450 패밀리 유전자는 Cyp2b10, Cyp3a13, Cyp2c37, Cyp3a11, Cyp1a1, Cyp1a2, 및 Cyp2a12일 수 있다. 즉, 상기 오가노이드에서 시토크롬 P450이 활성화됨으로써 약물 대사 활성이 증진된 오가노이드를 제조할 수 있다.

다른 양상은 상기 방법에 의해 제조된 간 오가노이드를 제공한다.

상기 간 오가노이드는 시토크롬 P450이 활성화된 것이며, 상기 효소의 활성 증진으로 인하여 약물 대사 활성이 증진될 수 있다.

종래에는 불멸화(immortalized)된 세포를 사용하여 2차원 배양하였는바, 약물 대사 반응에 대한 연구 및 임상을 적용하는 데 있어 비교적 정확하지 않은 결론이 도출되지 않는다는 문제점이 있었다. 반면, 일 양상에 따른 방법에 의해 제조된 오가노이드는 생체 조직의 특성을 지니고 있을 뿐만 아니라 안정성이 높아졌다는 이점이 있다. 따라서, 상기 오가노이드를 약물 대사반응의 플랫폼으로 활용할 수 있어 약물 부작용, 안전성 및 상호작용을 정확하게 예측할 수 있으므로 약물의 임상 시험 성공 가능성을 높일 수 있다.

다른 양상은 간 유래 줄기세포를 포함하는, 시토크롬 P450이 활성화된 간 오가노이드를 제공한다. 상기 간 오가노이드는 간에서 분리된 간관으로부터 유래된 줄기세포를 3차원 배양하여 제작할 수 있다. 또한, 상기 간 오가노이드는 간 유래 줄기세포를 3차원 배양한 후, 시토크롬 P450 유도제를 처리함으로써 시토크롬 P450의 활성이 증진된 오가노이드로 제작한 것일 수 있다. 일 구체예에서는, 상기 시토크롬 P450 유전자의 발현이 증가된 오가노이드에 항암제를 처리하여 췌장암 세포 또는 대장암 세포주와 공배양한 후, 상기 암 세포의 세포 사멸 수준을 확인함으로써 상기 오가노이드의 약물 대사 활성이 증진됨을 확인하였다.

따라서, 상기 오가노이드는 체내 약물 대사에 관여하는 대표적인 효소인 시토크롬 P450 유전자의 발현을 증가시킴으로써 실제 간과 유사한 약물 대사 반응을 보이는 바, 신약 개발을 위한 임상 시험에 있어 세포 실험 또는 동물 실험을 대체할 수 있다.

다른 양상은 상기 간 오가노이드에 시험 물질을 접촉시키는 단계; 상기 시험 물질이 처리된 간 오가노이드를 암 세포와 공배양(co-culture)하는 단계; 및 공배양한 암 세포의 세포 사멸 수준을 대조군의 세포 사멸 수준과 비교하는 단계를 포함하는 암 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다. 상기 간 오가노이드의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다.

일 구체예에 따른 방법은 상기 방법으로 제조된 간 오가노이드에 시험 물질을 접촉시키는 단계를 포함한다. 상기 시험 물질은 항암제일 수 있으며, 예를 들어, 도세탁셀, 젬시타빈, 또는 5-플루우라실일 수 있다.

본 명세서 내 용어 "항암제"란 암 세포를 파괴하는 기작을 갖는 약물 또는 화학제제를 의미하며, 대부분의 항암제는 세포에 다발성 손상을 일으키고 세포를 더 이상 복제되지 않도록 하는 작용을 하며, 암의 전이, 이동성을 억제하는 역할을 할 수 있다.

다른 구체예에 따른 방법은 상기 시험 물질이 처리된 간 오가노이드를 암 세포와 공배양 하는 단계를 포함한다. 상기 암 세포는 대장암 세포, 췌장암 세포, 결장암 세포, 직장암 세포, 소장암 세포 또는 간암 세포일 수 있다. 상기 간 오가노이드는 시토크롬 P450이 활성화됨에 따라 약물 대사 활성이 증진되었으므로, 암 세포와 공배양할 경우 항암제에 대한 세포의 대사 활성이 증진되는 이점이 있다.

다른 구체예에 따른 방법은 공배양한 암 세포의 세포 사멸 수준을 대조군의 세포 사멸 수준과 비교하는 단계를 포함한다. 상기 암 세포의 세포 사멸 수준이 대조군 세포와 비교하여 증가하는 경우, 처리한 시험 물질은 암 치료제, 즉 항암자엔 것으로 판단할 수 있다.

본 명세서 내 용어, "대조군"이란, 간 오가노이드와 공배양하지 않은 세포를 의미하며, 암 치료용 시험 물질을 처리한 암 세포와 세포 사멸 수준을 비교하기 위해 사용된다. 이때, 상기 암은 대장암, 결장암, 직장암, 소장암, 췌장암, 또는 간암일 수 있다. 즉, 일 양상에 따라 제조된 간 오가노이드는 약물대사 반응에 관여하는 시토크롬 P450의 활성이 증진됨에 따라 항암제의 대사 활성을 확인할 수 있으므로 다양한 암 종의 치료제를 스크리닝하기 위한 플랫폼으로 이용될 수 있다.

일 양상에 따른 방법으로 제조된 오가노이드는 관(duct) 유래 간 세포를 3차원 배양함으로써 간과 매우 유사한 구조로 되어 있는바, 세포 및 동물실험을 대체할 수 있는 모델로 사용할 수 있다. 또한, 상기 오가노이드는 무한 증식이 가능하여 적은 양의 조직만으로도 많은 양의 세포를 얻을 수 있을 뿐만 아니라 체내 약물 대사 효소인 시토크롬 P450을 활성화시킴으로써 약물대사 반응의 플랫폼으로 이용할 수 있다.

도 1은 일 구체예에 따라 제조된 오가노이드의 약물 대사반응 시스템의 개요를 나타낸 그림이다.
도 2는 실시예 1의 방법으로 제작한 미분화된 간 오가노이드 및 분화된 간 오가노이드를 현미경으로 관찰한 사진이다.
도 3a~도 3c는 간 조직 및 간 오가노이드에서 시토크롬 P450의 발현을 확인한 그래프이다.
도 4a는 실시예 2-1의 방법으로 제작한 간 오가노이드에서 시토크롬 P450 패밀리 Cyp1a의 활성을 측정한 그래프이고, 도 4b는 실시예 2-1의 방법으로 제작한 간 오가노이드에서 시토크롬 P450 패밀리 Cyp3a의 활성을 측정한 그래프이다.
도 5a~도 5d는 시토크롬 P450 유도제를 처리한 간 오가노이드에서 발현되는 시토크롬 P450 패밀리 유전자의 발현 양상을 나타낸 그래프이다.
도 6은 일 구체예에 따라 제조된 오가노이드의 항암 활성(1)을 확인한 결과로, 도 6a는 실시예 3-2의 공배양 방법을 나타낸 모식도이고, 도 6b는 젬시타빈을 처리하고 오가노이드를 췌장암 세포주 배양 배지로 옮겨 2~3일 동안 추가 배양한 후 현미경으로 관찰한 사진이며, 도 6c는 췌장암 세포주를 염색하여 세포 사멸을 측정한 결과를 현미경으로 관찰한 사진이다.
도 7은 일 구체예에 따라 제조된 오가노이드의 항암 활성을 확인한 결과로, 도 7a는 도세탁셀을 처리하고 오가노이드를 대장암 세포주 배양 배지로 옮겨 2~3일 동안 추가 배양한 후 현미경으로 관찰한 사진이며, 도 7b는 대장암 세포주를 염색하여 세포사멸을 측정한 결과를 현미경으로 관찰한 사진이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 간 오가노이드의 제작

1-1. 마우스 간으로부터 관 분리 및 배양

7-9 주령된 마우스에서 간 조직을 분리하여 깨끗하게 씻어준 후, 2~5㎜ 길이로 잘게 자른다. 이후, 소화 버퍼(digestion buffer)(세척배지(wash medium) 내 디스파제(dispase) 및 콜라게나아제(collagenase) 0.125㎎/㎖, DNase 0.1㎎/㎖ 포함)에 넣고 37℃에서 약 40분 간 인큐베이션 과정을 진행하였다. 이때, 상기 세척 배지는 DMEM(high glucose)에 1% Fetal bovine serum 과 1% 페니실린(Penicillin)/스트렙토마이신(streptomycin)을 혼합한 것이다. 이후, 세척 배지를 추가하여 조직에서 소화 과정을 중지시키고, 원심분리를 수행하여 조직으로부터 떨어져 나온 세포(ductal structure)를 수득하였다. 상기 세포의 적정량을 마트리겔과 1;1로 혼합하여 배양하였다.

1-2. 3차원 배양

Advanced DMEM F/12에 HEPES, 클루타막스(glutamax), N-아세틸시스테인(N-acetylcysteine)이 보충된 1 B-27, 5% R-spondin 순화배지(conditioned medium), 50ng/㎖ EGF, 100ng/㎖ noggin, 50ng/㎖ HGF, 200ng/㎖ FGF10, 10mM nicotinamid, 및 10nM gastrin을 함께 사용하여 간 오가노이드 배양 배지를 준비하였다. 이후, 상기 실시예 1-1에서 배양한 관 구조(ductal structure)를 9일 동안 분화 배지(differentiation medium)에서 3차원 배양하여 간 오가노이드를 제작하였다. 대조군으로는 비히클(vehicle)에서 상기 세포를 배양하여 미분화 간 오가노이드를 제작하였다.

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 미분화된 오가노이드는 계속해서 성장하는 반면, 분화된 오가노이드의 크기는 더 이상 증가하지 않음을 확인할 수 있었다.

1-3. 시토크롬 P450의 발현 확인

상기 실시예 1-2에서 제작한 오가노이드 및 간 조직에서의 시토크롬 P450(cytochrome P450, CYP450) 발현 여부를 확인하였다. 구체적으로, 상기 오가노이드 및 간 조직에서 RNA 추출 키트를 사용하여 total RNA를 추출한 후 역전사효소를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 이후, 상기 cDNA를 주형으로 하여 RT-PCR를 수행하였다.

그 결과, 도 3a 내지 도 3c에 나타난 바와 같이, 오가노이드와 비교하여 간 조직에서 CYP3-11, CYP1A1, CYP1A2, CYP2A12, CYP2C27의 발현이 우세한 것을 확인할 수 있었다. 반면, 간 조직과 비교하여 오가노이드에서 CYP3A13의 발현이 우세한 것을 알 수 있었다. 즉, 오가노이드 및 간 조직에서 시토크롬 P450 패밀리 유전자의 발현은 유의적인 차이를 나타내지 않는 것을 확인할 수 있다.

실시예 2. 시토크롬 P450 활성 확인

2-1. 시토크롬 P450 활성 유도

상기 실시예 1에서 제작한 오가노이드에 대하여 시토크롬 P450(cytochrome P450, CYP450) 유도제를 처리하였다. 구체적으로, CPY450 유도제인 덱사메타손(dexamethasone, Dex)을 각각 1μM 및 10μM, 및 β-나프토플라본(β-naphthoflavone, BNF)을 각각 1μM 및 10μM, 1,4-bis-2-(3,5-디클로로피리딜옥시)-벤젠(1,4-bis-2-(3, 5-dichloropyridyloxy)-benzene, TCPOBOP) 을 각각 1μM 및 10μM 상기 오가노이드에 하루 동안 처리하여 CYP450의 활성을 유도하였다.

2-2. 시토크롬 P450 활성 측정

상기 실시예 2-1에서 유도제를 처리하여 분화시킨 오가노이드에 CYP 기질(substrate)을 24시간 동안 각각 처리하여 microplate reader로 형광발현을 측정함으로써 CYP450 활성도를 측정하였다. 대조군으로는 CYP450 효소가 존재하지 않는 HEK293 세포주를 음성대조군으로 사용하였고, 비교예로 실시예 1에서 제작한 미분화 또는 분화된 간 오가노이드를 사용하였다.

그 결과, 도 4a 및 도 4b에 나타나 바와 같이, 음성대조군과 비교하여 본 발명의 방법으로 제작한 간 오가노이드에서 CYP450의 활성이 유의적으로 높은 것을 확인할 수 있었다. 특히, CYP450 유도제를 처리하여 분화시킨 오가노이드에서 유도제를 처리하지 않은 오가노이드에 비해 CYP450의 활성이 유의적으로 높은 것을 확인할 수 있었다. 즉, CYP450은 약물 대사반응에 관여하는 효소로서, 상기 효소의 활성이 유도된 간 오가노이드는 약물 대사반응의 플랫폼으로 사용될 수 있다.

2-3. 시토크롬 P450 활성에 따른 유전자 발현 확인

상기 실시예 2-1에서 제작한 CYP450이 유도된 오가노이드에서 CYP450 패밀리 유전자의 발현 여부를 확인하기 위하여 Quantitative PCR을 수행하였다. 구체적으로, 세포에서 RNA를 분리하여 cDNA를 합성한 후, SYBR 그린 Ⅰ, cDNA 및 각각의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였으며, 사용된 프라이머의 정보는 하기 표 1에 나타난 바와 같다.

음성대조군으로는 상기 실시예 1에서 제작한 미분화 또는 분화된 간 오가노이드를 사용하였다.

서열번호	유전자	프라이머
서열번호 1	mouse GAPDH	정방향	5'- AACTTTGGCATTGTGGAAGG -3'
서열번호 2	mouse GAPDH	역방향	5'- ACACATTGGGGGTAGGAACA -3'
서열번호 3	mouse Cyp3a11	정방향	5'- TGGTCAAACGCCTCTCCTTGCTG-3'
서열번호 4	mouse Cyp3a11	역방향	5'- ACTGGGCCAAAATCCCGCCG-3'
서열번호 5	mouse Cyp1a1	정방향	5'- AGATCCAGGAGGAACTAGAC-3'
서열번호 6	mouse Cyp1a1	역방향	5'- CTCTCCGATGCACTTTCGCTTGC-3'
서열번호 7	mouse Cyp1a2	정방향	5'- AAGATCCATGAGGAGCTGGA-3'
서열번호 8	mouse Cyp1a2	역방향	5'- TCCCCAATGCACCGGCGCTTTCC-3'
서열번호 9	mouse Cyp2a12	정방향	5'- CCTGCTACTAATGAAGCATC-3'
서열번호 10	mouse Cyp2a12	역방향	5'- TTGTCATCCAGGAAGTGCTG-3'
서열번호 11	mouse Cyp2b10	정방향	5'- TGAAGCTTTTCTGCCCTTCT-3'
서열번호 12	mouse Cyp2b10	역방향	5'- TGGAGACATGCAATAGGAGG-3'
서열번호 13	mouse Cyp2c37	정방향	5'- ATACTCTATATTTGGGCAGG-3'
서열번호 14	mouse Cyp2c37	역방향	5'- GTTCCTCCACAAGGCAAC-3'
서열번호 15	mouse Cyp3a13	정방향	5'- GACCTGATCCCAAACTTTTCC-3'
서열번호 16	mouse Cyp3a13	역방향	5'- TCCTTCTCCTAATCCCTGCC-3'

그 결과, 도 5a 내지 도 5d에 나타난 바와 같이, 음성대조군과 비교하여 본 발명의 방법으로 제작한 간 오가노이드에서 CYP450 패밀리 유전자의 발현이 유의적으로 증가한 것을 확인할 수 있었다. 특히, 도세탁셀을 처리한 오가노이드의 경우, Cyp3a11의 발현이 유의적으로 증가하였고, BNF를 처리한 오가노이드의 경우, Cyp1a1, Cyp1a2 및 Cyp3a13의 발현이 유의적으로 증가하였으며, TCPOBOP를 처리한 오가노이드의 경우, Cyp2c37 및 Cyp2a12의 발현이 유의적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 즉, 시토크롬 P450 유도제는 간 오가노이드에서 약물 대사 반응에 관여하는 유전자의 발현을 증가시킴으로써, 효소 활성을 증가시킬 수 있다.

실시예 3. 오가노이드의 항암 활성 측정(1)

3-1. 인간 췌장암 세포의 분리 및 배양

수술을 한 췌장암 환자의 암 조직 부분을 얻어서 혈관과 지방 등을 제거하고 조직을 2~5㎜ 길이로 잘게 잘랐다. 이후, 세척 배지로 조직이 깨끗해질 때까지 세척 과정을 반복하였다. 5㎎/㎖ 콜라게나아제 II를 advanced DMEM F/12에 HEPES, 클루타막스(glutamax), 및 N-아세틸시스테인(N-acetylcysteine)이 보충된 배지에 추가하여 37℃ 수조(water bath)에서 약 40-50분간 인큐베이션 하면서, 5-10분 간격으로 가볍게 태핑(tapping)을 해주었다. 이후, 현미경 하에서 버퍼를 조금 채취하여 관 구조를 확인하고, 원심분리를 200 x g에서 10분 간 시행하여 세포를 수득하였다. 세척 배지로 펠렛을 여러 번 세척한 후, 마트리겔과 1:1 비율로 혼합하여 췌장암 배양 배지에 배양하였다. 상기 배양 배지는 Advanced DMEM F/12에 HEPES, 글루타막스(glutamax), N-아세틸시스테인(N-acetylcysteine)이 보충된 1N2, 1 B-27, 5% R-spondin 조건 배지(onditioned medium), 30% Wnt 조건 배지, 50ng/㎖ EGF, 100ng/㎖ 노긴(noggin), 5μM A83-01, 200ng/㎖ FGF10, 10mM 티코틴아미드(nicotinamid), 10nM 가스트린(gastrin)을 혼합하여 사용한다.

3-2. 마우스 간 오가노이드 및 인간 췌장암 세포 공배양

상기 실시예 2-1에서 덱사메타손 1μM을 처리하여 제작한 분화된 간 오가노이드에 대표적인 췌장암 항암제인 젬시타빈(gemcitabine)을 1ng/㎖를 처리하여 인서트(insert) 위에서 하루 동안 배양하였다. 이후, 각각의 상기 실시예 3-1의 췌장암 세포주 배양배지로 옮겨 2~3일 동안 추가로 공배양하였다, 이후, propidium iodide(PI) 1㎍/㎖과 calcein AM 5μM을 이용하여 상기 공배양한 간 오가노이드 및 췌장암 세포주를 15~30분 동안 염색한 후 세포주의 세포사멸을 측정함으로써 젬시타빈의 독성 여부를 확인하였다. 비교예로는 상기 1-2에서 제작한 미분화된 간 오가노이드와 분화된 오가노이드를 사용하였다.

그 결과, 도 6b에 나타난 바와 같이, 공배양 후 마우스 간 오가노이드는 인서트 내에 유지되어 있었고, 인간 췌장암 세포 오가노이드는 미분화된 군에서 유의적으로 세포 사멸이 증가한 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 6c에 나타난 바와 같이, 미분화된 오가노이드의 경우 대부분 세포 사멸이 일어난 것을 확인 할 수 있는 반면, 분화 및 시토크롬 P450이 유도된 오가노이드에서 생존 세포를 더 많이 관찰할 수 있었다.

실시예 4. 오가노이드의 항암 활성 측정(2)

4-1. 대장암 세포 배양

대장암 유래 세포주인 HT29를 RPMI 1640 배지에 10% FBS와 1% 페니실린(penicillin)/스트렙토마이신(streptomycin)이 추가된 배지에서 배양하였다. 75T 플라스크 기준으로 3-4일간 배양한 후, 세포가 70%의 융합(confluence)을 보이면 Trypsin-EDTA를 처리하여 세포를 떼어내었다. 이후, 튜브에 세포가 포함된 배지를 900rpm에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 수득하였다. 상기 튜브에서 상층액을 제거하고 세포 배양이 가능한 양의 배지를 추가하여 마트리겔과 1:1 비율로 혼합하여 배양하였다.

4-2. 간 오가노이드 및 대장암 세포의 공배양

실시예 2-1에서 제조한 오가노이드에, 대표적인 항암제인 도세탁셀(docetaxel)을 각각 0, 1, 3, 5, 및 10 nM의 농도로 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 이후, 상기 배양한 오가노이드를 상기 실시예 3-1의 HT29 세포주 배양 배지로 옮겨 2~3일 동안 추가로 공배양하였다. 이후, propidium iodide(PI) 1㎍/㎖과 calcein AM 5μM을 이용하여 상기 HT29 세포주를 15~30분 동안 염색한 후 세포주의 세포사멸을 측정함으로써 도세탁셀의 독성 여부를 확인하였다. 음성대조군으로는 대장암 세포를 사용하였고 비교예로는 상기 1-2에서 제작한 미분화된 간 오가노이드와 분화된 오가노이드를 사용하였다.

그 결과, 도 7a에 나타난 바와 같이, 음성대조군 및 미분화된 간 오가노이드(비교예)에서 세포 형태(morphology)가 유의적으로 변화한 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 7b에 나타난 바와 같이, 음성대조군 및 비교예의 경우, 세포 사멸이 적게 관찰된 반면, 시토크롬 P450이 유도된 오가노이드의 경우, 세포 사멸이 많이 관찰되었다. 특히, 상기 오가노이드에 처리한 도세탁셀의 농도가 증가할수록 세포사멸이 유의적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

즉, 상기 오가노이드는 시토크롬 P405이 활성화됨에 따라 약물의 대사 반응이 증진될 수 있으므로, 항암제의 효과가 증대될 수 있다. 또한, 실제 간과 유사한 약물 대사 반응을 나타낼 수 있으므로 약물대사 플랫폼으로 활용할 수 있다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> CHA University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Method for preparing liver organoid comprising stem cell derived from liver and use thereof <130> PN121907 <160> 16 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of mouse GAPDH <400> 1 aactttggca ttgtggaagg 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of mouse GAPDH <400> 2 acacattggg ggtaggaaca 20 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of mouse Cyp3a11 <400> 3 tggtcaaacg cctctccttg ctg 23 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of mouse Cyp3a11 <400> 4 actgggccaa aatcccgccg 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of mouse Cyp1a1 <400> 5 agatccagga ggaactagac 20 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of mouse Cyp1a1 <400> 6 ctctccgatg cactttcgct tgc 23 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of mouse Cyp1a2 <400> 7 aagatccatg aggagctgga 20 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of mouse Cyp1a2 <400> 8 tccccaatgc accggcgctt tcc 23 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of mouse Cyp2a12 <400> 9 cctgctacta atgaagcatc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of mouse Cyp2a12 <400> 10 ttgtcatcca ggaagtgctg 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of mouse Cyp2b10 <400> 11 tgaagctttt ctgcccttct 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of mouse Cyp2b10 <400> 12 tggagacatg caataggagg 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of mouse Cyp2c37 <400> 13 atactctata tttgggcagg 20 <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of mouse Cyp2c37 <400> 14 gttcctccac aaggcaac 18 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of mouse Cyp3a13 <400> 15 gacctgatcc caaacttttc c 21 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of mouse Cyp3a13 <400> 16 tccttctcct aatccctgcc 20

Claims

간관 유래 줄기세포를 3차원 배양하는 단계; 및
상기 3차원 배양을 통해 형성된 오가노이드에 시토크롬 P450(cytochrome P450) 유도제를 처리하는 단계를 포함하며,
상기 유도제는 β-나프토플라본(β-naphthoflavone, BNF)이고,
상기 오가노이드는 시토크롬 P450 패밀리 유전자의 발현이 증가된 것이며,
상기 시토크롬 P450 패밀리 유전자는 Cyp2b10, Cyp3a13, Cyp2c37, Cyp3a11, Cyp1a1 및 Cyp2a12로 구성된 군에서 선택되는 것인
시토크롬 P450이 활성화된 간 오가노이드의 제조방법.
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청구항 1의 방법으로 제조된 간 오가노이드.
청구항 6에 있어서, 시토크롬 P450가 활성화된 것인 간 오가노이드.
청구항 6에 있어서, 약물 대사 활성이 증진된 것인 간 오가노이드.
간관 유래 줄기세포를 포함하는, 시토크롬 P450이 활성화된 간 오가노이드.
청구항 6의 간 오가노이드에 시험 물질을 접촉시키는 단계;
상기 시험 물질이 처리된 간 오가노이드를 암 세포와 공배양(co-culture)하는 단계; 및
공배양한 암 세포의 세포 사멸 수준을 대조군의 세포 사멸 수준과 비교하는 단계를 포함하는 암 치료제의 스크리닝 방법.
청구항 10에 있어서, 상기 암 세포의 세포 사멸이 증가하는 경우, 암 치료제의 후보 물질로 결정하는 것인 방법.
청구항 10에 있어서, 상기 시험 물질은 도세탁셀, 젬시타빈, 및 5-플루우라실로 구성된 군에서 선택되는 것인 방법.
청구항 10에 있어서, 상기 암은 대장암, 결장암, 직장암, 소장암, 췌장암, 또는 간암인 것인 방법.