WO2017200111A1 - ヒト由来細胞を含むヘテロスフェロイド - Google Patents

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木澤　秀樹
光元 張
Original Assignee
株式会社サイフューズ
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids

Definitions

  • the present invention relates to a heterospheroid characterized by containing human-derived cells, and a liver-like structure formed by laminating the spheroids.
  • Non-Patent Document 1 Khetani S. R. et al. Nat. Biotechnol. 26: 120-126 (2008), Non-Patent Document 2: Ohkura T. et al. et al. , Drug Metab. Pharmacokinet. 29: 373-378 (2014)].
  • An object of the present invention is to provide a heterospheroid containing human-derived cells, a liver-like structure in which the heterospheroid is laminated, and a method for producing the structure.
  • the present inventor simply co-cultured human hepatocytes with human-derived cells such as human tendon cells, and did not use mouse-derived fibroblasts, but a highly functional human
  • the present inventors have succeeded in producing a liver model and have completed the present invention.
  • a human liver type heterospheroid obtained by aggregating human hepatocytes and human-derived cells other than human hepatocytes, wherein the human-derived cells other than human hepatocytes are human hepatic stellate cells, human lung fibroblasts , Human aortic outer membrane fibroblasts, human periodontal ligament fibroblasts, human intestinal myofibroblasts, human tendon cells, human astrocytes, human neonatal skin fibroblasts, human synovial stromal cells, human brain capillaries Pericytes, human kidney mesangial cells, human cardiac fibroblasts, human aortic vascular smooth muscle cells.
  • Human osteoblasts normal human skeletal muscle cells, human dental pulp stem cells, human nucleus pulposus cells, human annulus cells, human ligament cells, human chondrocytes, human bile duct epithelial cells, human sinusoidal endothelial cells and human umbilical vein endothelial cells
  • the spheroid which is any cell selected from the group consisting of: (2) A human liver-like three-dimensional structure in which the spheroids according to (1) are laminated. (3) A method for producing a human liver-like three-dimensional structure, comprising laminating the spheroids according to (1). (4) The method according to (3), wherein the lamination of spheroids is performed by piercing the spheroids into needles. (5) A human liver model comprising the three-dimensional structure according to (2).
  • the present invention provides heterospheroids containing human-derived cells such as human tendon cells, and liver-like structures in which the heterospheroids are laminated.
  • the present invention also provides a method for producing a liver-like structure characterized by laminating the heterospheroids. According to the present invention, it is possible to accurately evaluate human-specific toxicity and metabolites without considering the influence of a mouse-specific metabolic system that has been a concern in a co-culture system using human hepatocytes and mouse fibroblasts.
  • a human liver model that can be easily implemented can be provided.
  • FIG. 1 is a diagram showing a comparison of CYP3A4 gene expression in co-cultured spheroids of Hep and various cells.
  • FIG. 2 is a graph showing the influence of the cell mixing ratio on CYP3A4 gene expression in heterospheroids containing human hepatocytes and various human-derived cells.
  • FIG. 3 is a diagram showing the influence of the cell mixing ratio on spheroid formation by co-culture of Hep and NHOST.
  • FIG. 4 is a diagram showing the influence of the cell mixing ratio on spheroid formation by co-culture of Hep and TEN.
  • FIG. 5 is a graph showing the influence of the cell mixing ratio on spheroid formation by co-culture of Hep and HBMPC.
  • FIG. 1 is a diagram showing a comparison of CYP3A4 gene expression in co-cultured spheroids of Hep and various cells.
  • FIG. 2 is a graph showing the influence of the cell mixing ratio on CYP3A4
  • FIG. 6 is a diagram showing the influence of the cell mixing ratio on spheroid formation by co-culture of Hep and IHBEC.
  • FIG. 7 is a diagram showing the influence of the cell mixing ratio on spheroid formation by co-culture of Hep and SEC.
  • FIG. 8 shows the influence of the cell mixing ratio on spheroid formation by co-culture of Hep and HUVEC.
  • FIG. 9 is a diagram showing spheroid formation by co-culture of Hep and NIH30 and culture of Hep alone.
  • FIG. 10 is a diagram showing five types of liver-like structures containing Hep and human-derived cells prepared using regenova.
  • FIG. 10 is a diagram showing five types of liver-like structures containing Hep and human-derived cells prepared using regenova.
  • FIG. 12 is a diagram showing a comparison of expression levels of Phase I drug metabolism-related genes in liver structures containing Hep and human-derived cells.
  • FIG. 13 is a diagram showing a comparison of expression levels of Phase II drug metabolism-related genes in liver structures including Hep and human-derived cells.
  • FIG. 14 is a diagram showing a comparison of expression levels of Phase III drug metabolism-related genes in liver structures containing Hep and human-derived cells.
  • FIG. 12 is a diagram showing a comparison of expression levels of Phase I drug metabolism-related genes in liver structures containing Hep and human-derived
  • FIG. 15 is a diagram showing a comparison of expression levels of transcription factors, nuclear receptors, extracellular matrix, and liver-specific genes in liver structures including Hep and human-derived cells.
  • FIG. 18 is a diagram showing expression levels of various genes (CYP3A4, GAPDH, OATP1B1, and OATP1B3) in a liver structure (Day 30) containing Hep and TEN.
  • FIG. 19 is a diagram showing CYP3A4 activity and intracellular ATP level in a liver structure containing Hep and TEN.
  • the present invention relates to a heterospheroid containing hepatocytes and human-derived cells.
  • the present invention also relates to a liver-like structure in which the heterospheroid is laminated.
  • the cells contained in the heterospheroid of the present invention are human-derived hepatocytes and human-derived cells other than hepatocytes, and do not include mouse-derived cells. In the present invention, it suffices to co-culture human hepatocytes and human-derived cells such as human tendon cells, whereby a human liver model that has acquired high liver function can be prepared.
  • the hepatocytes (also referred to as Hepatocytes; Hep) used in the present invention are human-derived cells, and biopsyed hepatocytes, commercially available frozen hepatocytes, etc. are used.
  • ES cells iPS cells
  • hepatocytes induced to differentiate from living cells using reagents, genes, mRNA, microRNA, etc. can be used.
  • human-derived cells which are the second cells used in the present invention, are not particularly limited regardless of normal or pathological origin.
  • human hepatic stellate cells human lung fibroblasts, human aortic outer membrane fibroblasts, human periodontal ligament fibroblasts, human intestinal myofibroblasts, human tendon cells, human astrocytes, human neonatal skin fibroblasts , Human synovial stromal cells, human brain capillary pericytes, human renal mesangial cells, human cardiac fibroblasts, human aortic vascular smooth muscle cells, human osteoblasts, normal human skeletal muscle cells, human dental pulp stem cells, human Examples include nucleus pulposus cells, human annulus cells, human ligament cells, human chondrocytes, human bile duct epithelial cells, human sinusoidal endothelial cells, and human umbilical vein endothelial cells.
  • These second cells can be prepared from commercially available cells as well as from human tissues by enzymes or physical treatments.
  • the concentration of the first cells in the medium can be 1 ⁇ 10 4 cells / ml to 15 ⁇ 10 4 cells / ml, preferably 5 ⁇ 10 4 cells / ml.
  • the second cell is adjusted so that the above ratio is obtained, and both are mixed.
  • “mixing” is not particularly limited as long as the first cell and the second cell can come into contact with each other. For example, (i) a cell suspension of each cell is mixed with other cells.
  • the present invention includes an embodiment in which one cell is adhered or precipitated to a culture container, all or a part of the medium is removed, and a cell suspension of another cell is added to the culture solution.
  • a medium generally used for culturing hepatocytes can be employed as the first cell culture medium.
  • examples of such a medium include DMEM, RPMI-1640, DMEM / F12, Williams' Medium E and the like.
  • commercially available hepatocyte culture medium (Primary Hepatocyte Maintenance Supplements (CM series, Life Technologies)) etc. are mentioned.
  • the medium for the second cell is appropriately selected according to the type of each cell.
  • the culture medium of human osteoblasts is OGM Bullet Kit (Lonza)
  • the culture medium of normal human tendon cells is Tenocite Growth Medium (Zenbio)
  • normal human brain capillary pericytes HBMPC
  • the culture medium is CSC Complete Recombinant Medium (Cell Systems Corporation)
  • the culture medium of normal human biliary epithelial cells is Intra-Hepatic Biary Epithelial Cell Growth Medium (Census).
  • Primrow I Applied Biological Materials Inc.
  • normal human umbilical cord Culture medium pulse vascular endothelial cells can be used, such as EGM-2Bullet Kit (Lonza).
  • the first cell and the second cell are cultured or maintained in a medium suitable for each cell, and are prepared as necessary.
  • various antibiotics, fetal bovine serum, etc. can be added to a culture medium as needed.
  • the first hepatocytes and the second normal cells aggregate to form cell aggregates, that is, heterospheroids.
  • the ability to form spheroids can be examined by morphological inspection using an optical microscope. Whether or not the spheroid has a predetermined function may be determined by using gene expression in the spheroid as an index.
  • the gene used as an index is not particularly limited, but it is preferable to use a liver function-related gene, a drug metabolism-related gene, or the like.
  • drugs related to drug metabolism include CYP1A2, CYP2A6, CYP2B6, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP3A4, CYP2E1, GTM1, GSTT1, SULT2A1, UGT1A1, UGT2B4, BCRP Is preferred.
  • liver function-related genes include HNF1A, HNF3A, HNF4A, HNF6, PROX1, CEBPA, CAR, and ALB.
  • the gene related to drug metabolism and the gene related to liver function are not limited to these.
  • the gene expression can be confirmed by a general method such as RT-PCR or Northern blotting alone or in combination.
  • a method for producing a three-dimensional structure of a cell by placing cells in an arbitrary three-dimensional space is known (WO2008 / 123614).
  • a needle-like body is arranged in a sword mountain shape on a substrate, and the needle-like body is placed by piercing a cell mass.
  • a three-dimensional structure (three-dimensional structure) is produced by laminating spheroids using the above method. Since an automatic stacking robot for realizing the above method is already known (Bio 3D printer “Regenova” (registered trademark), Cyfuse Co., Ltd.), the three-dimensional structure is preferably manufactured using this robot.
  • the number and arrangement shape of the spheroids are not particularly limited and are arbitrary.
  • a liver-like three-dimensional structure can be constructed when heterospheroids are stacked.
  • This three-dimensional structure can be used for various tests as a liver model.
  • the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the present invention is not limited to these examples.
  • the real-time PCR reaction using cDNA as a template was performed using Power SYBR Green PCR Master Mix (4367659, Life Technologies), and the apparatus was StepOnePlus Real Time PCR System (Applied Biosystems).
  • the quantification of individual gene expression was carried out by an absolute quantification method, and the CYP3A4 gene expression level was shown as a value corrected by the GAPDH gene expression level.
  • Table 2 shows the sequences of primers for quantifying the expression of each gene of CYP3A4 and GAPDH and the size of Amplicon.
  • the standard DNA for absolute quantification was used after purification of Amplicon amplified with these primers using a QIAquick Gel Extraction Kit (28704, QIAGEN) after agarose gel electrophoresis.
  • NIH3T3 No. As a result of examining the expression level of the CYP3A4 gene in this way, NIH3T3 No. In addition to 30 clones, relatively high CYP3A4 gene expression was observed in human cells in co-culture with HBMPC, TEN and DPSC (FIG. 1).
  • Hep human hepatocytes
  • medium A Primary Hepatocyte Maintenance Supplements (CM4000, Life Technologies including MicroTechnologies) ] was suspended at 1 ⁇ 10 4 cells / 100 ⁇ l / well, dispensed into each well of a commercially available non-adhesive 96-well plate, and cultured in a CO 2 incubator for about 45 minutes.
  • various human-derived cells [normal human osteoblasts (NOST), normal human tendon cells (TEN), normal human brain pericytes (HBMPC), normal human bile duct epithelial cells (IHBEC), normal humans Sinus endothelial cells (SEC) and normal human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)] are cultured in their respective dedicated media (Table 3), then 0, 0.17, 0.5, 1.0, and 1. It added to each well containing Hep so that it might become 5 * 10 ⁇ 4 > cells / 100microliter / well.
  • the plate was centrifuged at 100 ⁇ g and room temperature for 20 seconds, and cultured in a CO 2 incubator. After 2 days, 100 ⁇ l of the medium was removed from each well of the plate, and instead, 100 ⁇ l of a medium (medium AX) containing an equal amount of medium for each human cell and medium A was added, and further in a CO 2 incubator. Cultured for 28 days. During this time, half of the amount was exchanged with the medium AX at intervals of twice a week.
  • medium AX medium containing an equal amount of medium for each human cell and medium A
  • the expression level of CYP3A4 gene after 30 days is particularly high when Hep and TEN are combined, High when the ratio of Hep to TEN was 0.5: 0.5 and 0.5: 0.17 (FIG. 2).
  • the condition of higher hepatocyte content per spheroid that is, the condition of 0.5: 0.17, which is closer to the in vivo liver, was used.
  • spheroid formation was confirmed in any of the co-cultures with human-derived cells (FIGS. 3-8).
  • liver structure containing Hep and various human-derived cells was performed as follows. That is, referring to the cell mixture ratio (0.5: 0.17) described in Examples 1 and 2 for Hep and various human-derived cells, Hep and the spheroid size can be stacked with Regenova. Spheroids were prepared by mixing various human-derived cells to 1 ⁇ 10 4 cells / well and 0.3 ⁇ 10 4 cells / well, respectively.
  • These spheroids are used in 26, 26, or 9 x 9 swords, and have 9, 18, and 27 heterospheroids that are 3x3x1, 3x3x2, 3x3x3 in height, width, and height.
  • the three-dimensional structure comprised by this was produced (FIGS. 10A-E, immediately after lamination).
  • the culture of the structure is carried out for 4 days while circulating the medium in the circulation incubator using a commercially available roller pump in a circulation incubator (CC1004) containing 200 ml of medium AX in the state of being stabbed in Kenzan. Performed in a CO2 incubator. Then, the three-dimensional structure with a needle hole was obtained by removing the structure produced on the sword mountain (FIGS. 10A-E, immediately after removal). Next, shaking culture was performed in a CO2 incubator in a state where this structure was placed in a sterile flat-bottom self-supporting tube (60.542S, assist) containing 1 ml of AX medium. Thereafter, the culture was continued twice a week by exchanging the whole amount with the AX medium. By the above method, a spherical liver-like structure having a diameter of about 1.5 to 2.5 mm was obtained 2-3 days after removal of Kenzan. This shape was maintained even after culturing for 30 days (FIG. 10A-E.Day30).
  • CYP3A4 gene expression levels in liver-like structures containing Hep and various human-derived cells Based on the method described in Example 3, after culturing liver structures containing various human-derived cells for 30 days, five types of liver structures The CYP3A4 gene expression level was examined for (Fig. 11). As a result, the expression level of CYP3A4 gene was highest in the liver structure containing TEN (Hep / TEN) and higher than that in the liver structure containing NIH30 used as a control (Hep / NIH30). At this time, when the expression level of GAPDH serving as a standard for the number of cells was also examined, NOST and TEN showed high values.
  • Phase I drug metabolism-related genes Comparison of expression levels of Phase I drug metabolism-related genes in liver-like structures containing Hep and various human-derived cells Based on the method described in Example 3, the liver after culturing liver structures containing various human-derived cells for 30 days The expression levels of Phase I drug metabolism-related genes (CYP1A2, CYP2A6, CYP2B6, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP2E1 and CYP3A4) were examined for the structures (FIG. 12). As a result, in the combination of Hep / TEN, higher expression was confirmed in all CYPs except CYP2E1 than in NIH30 used as a control.
  • the gene expression levels (copy / spheroid) of CYP3A4 (FIG. 16) and GAPDH (FIG. 17) at the time were measured.
  • Hep: TEN 1: 0.5 and the medium replacement condition is 22.
  • liver structures containing Hep and TEN Evaluation of liver structures containing Hep and TEN was performed as follows. That is, spheroids containing Hep and TEN at a mixing ratio of 1: 0.5 ( ⁇ 10 4 cells / well) were cultured under the four types of medium exchange conditions selected in Example 10, and circulated after being layered with Regenova. A structure was prepared by culturing. Expression levels of various genes (CYP3A4, GAPDH, OATP1B1, OATP1B3) were examined 30 days after the spheroid production date (FIG. 18). As a result, the expression of any gene is no. The highest value was obtained under the condition of 2.
  • the CYP3A4 activity per structure at Day 20 and Day 30 showed an activity value of about 20-30% at Day 0.
  • the amount of intracellular ATP per structure at Day 20 and Day 30 was about 1.3 times that at Day 0.

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  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
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Abstract

ヒト肝細胞と、ヒト肝細胞以外のヒト由来細胞とを混合し凝集させたヒト肝臓型スフェロイド、及び前記スフェロイドを積層することを特徴とする、ヒト肝臓様立体構造体の製造方法。

Description

ヒト由来細胞を含むヘテロスフェロイド
　本発明は、ヒト由来細胞を含むことを特徴とするヘテロスフェロイド、及び当該スフェロイドを積層してなる肝臓様構造体に関する。
　製薬企業では、多額の費用と時間を要する臨床試験において、毒性や代謝物の試験の対象となる創薬候補化合物を絞り込むためのｉｎ　ｖｉｔｒｏヒト肝臓モデルのニーズが高い。そして、臨床試験での毒性を予測可能なヒト肝臓モデルは、創薬研究を効率化、加速化するツールとして期待されている。
　現在、既存のｉｎ　ｖｉｔｒｏヒト肝臓モデルの中で機能的に優れた方法の一つとして、肝細胞をマウス線維芽細胞と共培養して高機能化する方法が知られている［非特許文献１：Ｋｈｅｔａｎｉ　Ｓ．Ｒ．ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：１２０−１２６（２００８）、非特許文献２：Ｏｈｋｕｒａ　Ｔ．ｅｔ　ａｌ．，Ｄｒｕｇ　Ｍｅｔａｂ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．２９：３７３−３７８（２０１４）］。
　しかしながら、これらの方法は、ヒト肝細胞をマウス線維芽細胞と共培養するという細胞系であり、ヒト肝細胞以外にマウス由来細胞を含む。このため、薬物の毒性試験や代謝物の評価において、マウス特有の代謝系の影響を考慮する必要があった。この際、対照としてマウス由来細胞のみをネガティブコントロールに用いる方法が採用されているが、共培養がもたらすマウス細胞への影響が考慮されていないため、厳密には正確なネガティブコントロールと言い難く、得られた薬物評価結果へのマウス細胞の影響を完全には排除できなかった。
Ｋｈｅｔａｎｉ　Ｓ．Ｒ．ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：１２０−１２６（２００８）． Ｏｈｋｕｒａ　Ｔ．ｅｔ　ａｌ．，Ｄｒｕｇ　Ｍｅｔａｂ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．２９：３７３−３７８（２０１４）．
　本発明は、ヒト由来細胞を含むヘテロスフェロイド、及び当該ヘテロスフェロイドが積層された肝臓様構造体、並びに当該構造体の製造方法を提供することを目的とする。
　本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、ヒト肝細胞をヒト腱細胞などのヒト由来細胞と共培養するだけで、マウス由来線維芽細胞を用いずに高機能なヒト肝臓モデルを作製することに成功し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）ヒト肝細胞と、ヒト肝細胞以外のヒト由来細胞とを凝集させたヒト肝臓型ヘテロスフェロイドであって、ヒト肝細胞以外のヒト由来細胞が、ヒト肝星細胞、ヒト肺線維芽細胞、ヒト大動脈外膜線維芽細胞、ヒト歯周靱帯線維芽細胞、ヒト腸筋線維芽細胞、ヒト腱細胞、ヒトアストロサイト、ヒト新生児皮膚線維芽細胞、ヒト滑膜間質細胞、ヒト脳毛細血管周皮細胞、ヒト腎メサンギウム細胞、ヒト心臓線維芽細胞、ヒト大動脈血管平滑筋細胞。ヒト骨芽細胞、正常ヒト骨格筋細胞、ヒト歯髄幹細胞、ヒト髄核細胞、ヒト線維輪細胞、ヒト靱帯細胞、ヒト軟骨細胞、ヒト胆管上皮細胞、ヒト類洞内皮細胞及びヒト臍帯静脈血管内皮細胞からなる群から選択されるいずれかの細胞である前記スフェロイド。
（２）（１）に記載のスフェロイドが積層された、ヒト肝臓様立体構造体。
（３）（１）に記載のスフェロイドを積層することを特徴とする、ヒト肝臓様立体構造体の製造方法。
（４）スフェロイドの積層は、スフェロイドを針状体に突き刺すことにより行われるものである（３）に記載の方法。
（５）（２）に記載の立体構造体を含む、ヒト肝臓モデル。
　本発明により、ヒト腱細胞などのヒト由来細胞を含むヘテロスフェロイド、及び当該ヘテロスフェロイドが積層された肝臓様構造体が提供される。また、本発明により前記ヘテロスフェロイドを積層することを特徴とする肝臓様構造体の製造方法が提供される。本発明によれば、ヒト肝細胞とマウス線維芽細胞を用いた共培養系で懸念されていたマウス特有の代謝系の影響を考慮することなく、ヒト特異的な毒性や代謝物の評価を正確かつ簡便に実施可能なヒト肝臓モデルを提供することが出来る。
　図１は、Ｈｅｐと各種細胞との共培養スフェロイドにおけるＣＹＰ３Ａ４遺伝子発現の比較を示す図である。
　図２は、ヒト肝細胞と各種ヒト由来細胞を含むヘテロスフェロイドにおけるＣＹＰ３Ａ４遺伝子発現におよぼす細胞混合比率の影響を示す図である。
　図３は、ＨｅｐとＮＨＯＳＴとの共培養によるスフェロイド形成におよぼす細胞混合比率の影響を示す図である。
　図４は、ＨｅｐとＴＥＮとの共培養によるスフェロイド形成におよぼす細胞混合比率の影響を示す図である。
　図５は、ＨｅｐとＨＢＭＰＣとの共培養によるスフェロイド形成におよぼす細胞混合比率の影響を示す図である。
　図６は、ＨｅｐとＩＨＢＥＣとの共培養によるスフェロイド形成におよぼす細胞混合比率の影響を示す図である。
　図７は、ＨｅｐとＳＥＣとの共培養によるスフェロイド形成におよぼす細胞混合比率の影響を示す図である。
　図８は、ＨｅｐとＨＵＶＥＣとの共培養によるスフェロイド形成におよぼす細胞混合比率の影響を示す図である。
　図９は、ＨｅｐとＮＩＨ３０との共培養、及びＨｅｐのみの培養によるスフェロイド形成を示す図である。
　図１０は、レジェノバを用いて作製したＨｅｐとヒト由来細胞を含む５種類の肝臓様構造体を示す図である。
　図１１は、Ｈｅｐと各種ヒト由来細胞を含む肝臓構造体におけるＣＹＰ３Ａ４およびＧＡＰＤＨ遺伝子発現量の比較を示す図である（Ｄａｙ　３０，ＩＨＢＥＣのみｎ＝４、他はｎ＝２）。
　図１２は、Ｈｅｐとヒト由来細胞を含む肝臓構造体におけるＰｈａｓｅ　Ｉ薬物代謝関連遺伝子発現量の比較を示す図である。
　図１３は、Ｈｅｐとヒト由来細胞を含む肝臓構造体におけるＰｈａｓｅ　ＩＩ薬物代謝関連遺伝子発現量の比較を示す図である。
　図１４は、Ｈｅｐとヒト由来細胞を含む肝臓構造体におけるＰｈａｓｅ　ＩＩＩ薬物代謝関連遺伝子発現量の比較を示す図である。
　図１５は、Ｈｅｐとヒト由来細胞を含む肝臓構造体における転写因子、核内受容体、細胞外基質および肝臓特異的遺伝子の発現量の比較を示す図である。
　図１６は、７２通りの条件でＨｅｐ／ＴＥＮを含むスフェロイドを２９日間培養した後のＣＹＰ３Ａ４の遺伝子発現量を示す図である［Ｈｅｐ：ＴＥＮ＝１：０．１（Ａ）、１：０．３（Ｂ）、１：０．５（Ｃ）（×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）］。
　図１７は、７２通りの条件でＨｅｐ／ＴＥＮを含むスフェロイドを２９日間培養した後のＧＡＰＤＨの遺伝子発現量を示す図である［Ｈｅｐ：ＴＥＮ＝１：０．１（Ａ）、１：０．３（Ｂ）、１：０．５（Ｃ）（×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）］。
　図１８は、ＨｅｐとＴＥＮを含む肝臓構造体（Ｄａｙ　３０）における各種遺伝子（ＣＹＰ３Ａ４、ＧＡＰＤＨ、ＯＡＴＰ１Ｂ１、ＯＡＴＰ１Ｂ３）の発現量を示す図である。
　図１９は、ＨｅｐとＴＥＮを含む肝臓構造体におけるＣＹＰ３Ａ４活性と細胞内ＡＴＰ量を示す図である。
　本発明は、肝細胞とヒト由来細胞とを含むヘテロスフェロイドに関する。また本発明は、当該ヘテロスフェロイドが積層された肝臓様構造体に関する。本発明のヘテロスフェロイドに含まれる細胞はヒト由来肝細胞及び肝細胞以外のヒト由来細胞であり、マウス由来の細胞が含まれない。本発明においては、ヒト肝細胞と、ヒト腱細胞などのヒト由来細胞とを共培養するだけでよく、これにより、高い肝機能を獲得したヒト肝臓モデルを作製することができる。
１．培養条件
（１）細胞及び混合比
　本発明においては、ヒト由来肝細胞（第一の細胞）と、当該肝細胞以外のヒト由来細胞（第二の細胞）とを共培養することにより、当該肝細胞とヒト由来細胞とが混合したスフェロイドを作製する。作製されたスフェロイドには種類の異なる細胞が混合されているため、このスフェロイドを「ヘテロスフェロイド」という。但し、本明細書では単に「スフェロイド」ともいう。
　本発明において使用する肝細胞（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ；Ｈｅｐともいう）は、ヒト由来の細胞であり、生検された肝細胞、市販の凍結肝細胞などが用いられるが、その他にも、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、生体由来細胞等から試薬、遺伝子、ｍＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ等を用いて分化誘導させた肝細胞などを用いることができる。
　他方、本発明において用いられる第二の細胞であるヒト由来細胞は、正常、病態の由来を問わず特に限定されるものではない。例えば、ヒト肝星細胞、ヒト肺線維芽細胞、ヒト大動脈外膜線維芽細胞、ヒト歯周靱帯線維芽細胞、ヒト腸筋線維芽細胞、ヒト腱細胞、ヒトアストロサイト、ヒト新生児皮膚線維芽細胞、ヒト滑膜間質細胞、ヒト脳毛細血管周皮細胞、ヒト腎メサンギウム細胞、ヒト心臓線維芽細胞、ヒト大動脈血管平滑筋細胞、ヒト骨芽細胞、正常ヒト骨格筋細胞、ヒト歯髄幹細胞、ヒト髄核細胞、ヒト線維輪細胞、ヒト靱帯細胞、ヒト軟骨細胞、ヒト胆管上皮細胞、ヒト類洞内皮細胞及びヒト臍帯静脈血管内皮細胞などが挙げられる。これらの第二の細胞は、市販の細胞のほか、ヒト組織から酵素または物理的な処理によって調製することができる。
　本発明において、ヘテロスフェロイドを作製するための細胞の混合比は、第一の細胞（肝細胞）１に対して第二の細胞（ヒト由来正常細胞）が０．１７~１．５である。すなわち、第一の細胞：第二の細胞＝１：０．１７~１．５であり、１：０．３の細胞比とすることが好ましい。ここで、第一細胞の培地中の濃度は、１×１０４個／ｍｌ~１５×１０４個／ｍｌ、好ましくは５×１０４個／ｍｌとすることができ、この細胞数に対して、上記比率となるように第二の細胞を調整し、両者を混合する。
　ここで「混合」とは、第一の細胞と第二の細胞とが接触し得る状況にあれば特に限定されるものではなく、例えば、（ｉ）それぞれの細胞の細胞懸濁液を他の１つの容器に入れて混合する態様、（ｉｉ）第一の細胞及び第二の細胞の一方の培養容器中に他方の細胞の細胞懸濁液を添加する態様などがある。
　本発明においては、一方の細胞を培養容器に接着又は沈殿させておいて培地の全部又は一部を取り除き、他の細胞の細胞懸濁液をその培養液に添加する態様が含まれる。
（２）培地
　本発明において、第一の細胞の培養培地は、一般に肝細胞の培養に使用される培地を採用することができる。そのような培地としては、例えばＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｗｉｌｌｉａｍｓ’Ｍｅｄｉｕｍ　Ｅなどが挙げられる。また、市販の肝細胞培養培地（Ｐｒｉｍａｒｙ　Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ　Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ（ＣＭシリーズ、Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社））などが挙げられる。
　また、第二の細胞の培地としては、それぞれの細胞の種類に応じて適宜選択される。例えば、ヒト骨芽細胞（ＮＨＯＳＴ）の培養培地はＯＧＭ　Ｂｕｌｌｅｔ　Ｋｉｔ（Ｌｏｎｚａ）、正常ヒト腱細胞（ＴＥＮ）の培養培地はＴｅｎｏｃｙｔｅ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｚｅｎｂｉｏ）、正常ヒト脳毛細血管周皮細胞（ＨＢＭＰＣ）の培養培地はＣＳＣ　Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｃｅｌｌ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、正常ヒト胆管上皮細胞（ＩＨＢＥＣ）の培養培地はＩｎｔｒａ−Ｈｅｐａｔｉｃ　Ｂｉｌｉａｒｙ　Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｚｅｎｂｉｏ）、正常ヒト類洞内皮細胞（ＳＥＣ）の培養培地はＰｒｉｇｒｏｗ　Ｉ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍａｔｅｒｉａｌｓ　Ｉｎｃ．）、正常ヒト臍帯静脈血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の培養培地はＥＧＭ−２Ｂｕｌｌｅｔ　Ｋｉｔ（Ｌｏｎｚａ）などを使用することができる。
　上記第一の細胞及び第二の細胞は、それぞれの細胞に適した培地中で培養又は維持し、要時調製する。なお、培地には、必要に応じて各種抗生物質、ウシ胎児血清などを添加することができる。
　このようにして培養を継続すると、第一の肝細胞と第二の正常細胞とは集合して細胞凝集体、すなわちヘテロスフェロイドを形成する。
３．測定及び選抜指標
　スフェロイドの形成能は、光学顕微鏡による形態検査により調べることができる。　また、スフェロイドが所定の機能を有するか否かは、スフェロイド中の遺伝子発現を指標とすればよい。指標とする遺伝子は特に限定されるものではないが、肝機能関連遺伝子、薬物代謝関連遺伝子などを利用することが好ましい。薬物代謝関連遺伝子としては、例えばＣＹＰ１Ａ２，ＣＹＰ２Ａ６，ＣＹＰ２Ｂ６，ＣＹＰ２Ｃ９，ＣＹＰ２Ｃ１９，ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｅ１、ＧＳＴＭ１、ＧＳＴＴ１、ＳＵＬＴ２Ａ１、ＵＧＴ１Ａ１、ＵＧＴ２Ｂ４、ＢＣＲＰ、ＢＳＥＰ、ＭＲＰ２、ＭＡＴＥ１、ＭＲＰ６、ＭＤＲ１、ＮＴＣＰ、ＯＣＴ１などが好ましい。また、肝機能関連遺伝子としてはＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ３Ａ、ＨＮＦ４Ａ、ＨＮＦ６、ＰＲＯＸ１、ＣＥＢＰＡ、ＣＡＲ、ＡＬＢなどが挙げられる。
　但し、薬物代謝関連遺伝子及び肝機能関連遺伝子はこれらに限定されるものではない。
　遺伝子発現の確認方法は、一般的手法、例えばＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロッティングなどを単独で、又は適宜組み合わせて行うことができる。
４．肝臓様構造体の製造
　細胞を任意の３次元空間に配置することにより、細胞の立体構造体を作製する方法が知られている（ＷＯ２００８／１２３６１４号）。この方法は、基板に針状体を剣山状に配置させて、その針状体に細胞塊を突き刺すことにより配置させるというものである。
　本発明においては、上記方法を利用してスフェロイドを積層させて立体構造体（３次元構造体）を作製する。既に上記方法を実現するための自動積層ロボットが知られているので（バイオ３Ｄプリンター「レジェノバ」（登録商標）、株式会社サイフューズ）、立体構造体は、このロボットを用いて作製することが好ましい。
　スフェロイドの配置数及び配置形状は特に限定するものではなく、任意である。
　第二の細胞として前記細胞を使用すると、ヘテロスフェロイドを積層したときに肝臓様立体構造体を構築することができる。この立体構造体は、肝臓モデルとして各種試験に使用することができる。
　以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
Ｈｅｐと各種細胞との共培養スフェロイドにおけるＣＹＰ３Ａ４遺伝子発現の比較
　ヒト肝細胞（Ｈｅｐ）を解凍後、培地Ａ［Ｐｒｉｍａｒｙ　Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ　Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ（ＣＭ４０００，Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むＷｉｌｌｉａｍｓ’Ｍｅｄｉｕｍ　Ｅ］に１×１０４ｃｅｌｌｓ／１００μｌ／ｗｅｌｌになるように懸濁し、市販の非接着性９６−ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅの各ウェルに添加して４５分間程度ＣＯ２インキュベータ中で培養した。このＨｅｐを撒いたウェルに、あらかじめそれぞれの市販専用培地中で培養した各種ヒト由来細胞（表１）の懸濁液を１．０×１０４ｃｅｌｌｓ／１００μｌ／ｗｅｌｌになるように添加した。その後、１００×ｇ，室温２０秒の条件でプレート遠心し、ＣＯ２インキュベータ中で３日間培養した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　このようにして作製したＨｅｐと各種ヒト細胞を含むヘテロスフェロイドをエッペンチューブ１本当たり４個ずつ回収し、培養上清を除去した後、各チューブにＴＲＩＺＯＬ　Ｒｅａｇｅｎｔ（１５５９６０１８，Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を５００μｌずつ添加して３０分間ｖｏｒｔｅｘ　ｍｉｘｅｒで攪拌した。次に各チューブに１００μｌずつクロロホルムを添加して１分間転倒混和した後、遠心分離（１４，０００ｒｐｍ，３０ｍｉｎ，４℃）した。ここで２層に分離したうちの上層を回収し、ＲＮｅａｓｙ　９６　Ｋｉｔ（７４１８１，ＱＩＡＧＥＮ）を用いてｔｏｔａｌ　ＲＮＡを精製した。ｔｏｔａｌ　ＲＮＡからのｃＤＮＡ合成はＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ　ＲＴ　Ｒｅａｇｅｎｔ　Ｋｉｔ（ＰＲ０３７Ａ，Ｔａｋａｒａ　ｂｉｏ）を用いて行った。
　ｃＤＮＡを鋳型としたリアルタイムＰＣＲ反応はＰｏｗｅｒ　ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（４３６７６５９，Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて行い、装置はＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ　Ｒｅａｌ　Ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた。個々の遺伝子発現の定量は絶対定量法により行い、ＣＹＰ３Ａ４遺伝子発現量はＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量で補正した値として示した。
　ＣＹＰ３Ａ４とＧＡＰＤＨの各遺伝子発現定量用のプライマーの配列とＡｍｐｌｉｃｏｎのサイズを表２に示す。絶対定量用のスタンダードＤＮＡはこれらプライマーを用いて増幅したＡｍｐｌｉｃｏｎをアガロースゲル電気泳動後にＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（２８７０４，ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製して用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　このようにしてＣＹＰ３Ａ４遺伝子発現量を調べた結果、ＮＩＨ３Ｔ３　Ｎｏ．３０クローン以外に、ヒト細胞ではＨＢＭＰＣ、ＴＥＮおよびＤＰＳＣとの共培養で比較的高いＣＹＰ３Ａ４遺伝子の発現が認められた（図１）。
Ｈｅｐと各種ヒト由来細胞を含むヘテロスフェロイドにおけるＣＹＰ３Ａ４遺伝子発現におよぼす細胞混合比率の影響
　ヒト肝細胞（Ｈｅｐ）を解凍後、培地Ａ［Ｐｒｉｍａｒｙ　Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ　Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ（ＣＭ４０００，Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むＷｉｌｌｉａｍｓ’Ｍｅｄｉｕｍ　Ｅ］に１×１０４ｃｅｌｌｓ／１００μｌ／ｗｅｌｌになるように懸濁し、市販の非接着性９６−ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅの各ウェルに分注して４５分時間程度ＣＯ２インキュベータ中で培養した。この間に、あらかじめ各種ヒト由来細胞［正常ヒト骨芽細胞（ＮＨＯＳＴ）、正常ヒト腱細胞（ＴＥＮ）、正常ヒト脳毛細血管周皮細胞（ＨＢＭＰＣ）、正常ヒト胆管上皮細胞（ＩＨＢＥＣ）、正常ヒト類洞内皮細胞（ＳＥＣ）および正常ヒト臍帯静脈血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）］をそれぞれの専用培地（表３）中で培養した後、０、０．１７、０．５、１．０、および１．５×１０４ｃｅｌｌｓ／１００μｌ／ｗｅｌｌになるようにＨｅｐが入った各ウェルに添加した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　その後、１００×ｇ，室温２０秒の条件でプレート遠心し、ＣＯ２インキュベータ中で培養した。２日間経過後にプレートの各ウェルより培地を１００μｌずつ除去し、代りに各種ヒト細胞毎の専用培地と培地Ａを等量ずつ含む培地（培地ＡＸ）を１００μｌずつ添加してＣＯ２インキュベータ中でさらに２８日間培養した。この間、週２回の間隔で培地ＡＸを用いて半量交換を実施した。
　このようにしてＨｅｐと各種ヒト由来細胞を含むヘテロスフェロイドにおけるＣＹＰ３Ａ４遺伝子発現におよぼす細胞混合比率の影響を調べた結果、３０日後でのＣＹＰ３Ａ４遺伝子発現量はＨｅｐとＴＥＮの組み合わせのとき特に高く、中でもＨｅｐとＴＥＮの比が０．５：０．５および０．５：０．１７のときに高かった（図２）。
　以下の実験では、これらのうちスフェロイド当りの肝細胞含有率がより高い条件、すなわちｉｎ　ｖｉｖｏの肝臓により近い組成である０．５：０．１７の条件を用いることとした。
　Ｈｅｐと各種ヒト由来細胞を含むヘテロスフェロイドにおけるスフェロイド形成能におよぼす細胞混合比率の影響
　実施例２記載の条件でＨｅｐと各種ヒト由来細胞との共培養を５日間行ったときのヘテロスフェロイドの形成能とサイズにおよぼす細胞混合比率の影響を調べた。スフェロイド写真の結果は図３~９に示す。
　その結果、いずれのヒト由来細胞との共培養においてもＨｅｐのみ（図９）と比べてスフェロイド形成能は向上した。実施例１で良好な結果を示した細胞比率＝０．５：０．１７の条件のとき、培養３日目ではＩＨＢＥＣ（図６）とＨＵＶＥＣ（図８）でスフェロイドの形成は不十分だったものの、培養６日目ではいずれのヒト由来細胞との共培養においてもスフェロイドの形成が確認された（図３−８）。しかしながら、細胞比率＝０．５：０．１７の条件ではいずれのヒト由来細胞との共培養においてもスフェロイドサイズが小さかった（４００μｍ付近）。したがって、レジェノバで積層する際には、混合比を維持しながら積層可能なスフェロイドサイズ（少なくとも４５０μｍ以上）になるように細胞数を増やす必要があることが分かった。
　Ｈｅｐと各種ヒト由来細胞を含むヘテロスフェロイドを用いた肝臓様構造体の作製
バイオ３Ｄプリンター「レジェノバ」を用いてＨｅｐと各種ヒト由来細胞を含む肝臓構造体の作製を以下の様にして実施した。すなわち、Ｈｅｐと各種ヒト由来細胞を含むヘテロスフェロイドを実施例１および２で記載の細胞混合比（０．５：０．１７）を参考にし、レジェノバで積層可能なスフェロイドサイズにするためにＨｅｐと各種ヒト由来細胞をそれぞれ１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌと０．３×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように混合してスフェロイド作製を行った。これらスフェロイドを２６×２６剣山または９×９剣山を用いて縦、横、高さが３×３×１、３×３×２、３×３×３である９、１８、２７個のヘテロスフェロイドで構成される三次元構造体を作製した（図１０Ａ−Ｅ、積層直後）。
　構造体の培養は、剣山に刺したままの状態で２００ｍｌの培地ＡＸを入れた循環培養器（ＣＣ１００４）中にて、市販ローラーポンプを用いて循環培養器内の培地を循環させながら、４日間ＣＯ２インキュベータ内にて行った。その後、剣山上で作製された構造体を抜去することで、針穴の空いた三次元構造体が得られた（図１０Ａ−Ｅ、抜去直後）。
　次に、この構造体を１ｍｌのＡＸ培地が入った滅菌平底自立型チューブ（６０．５４２Ｓ，アシスト）に入れた状態で、ＣＯ２インキュベータ内にて振盪培養を行った。これ以降、週２回、ＡＸ培地で全量交換を行うことで培養を継続して行った。
　以上の方法により、剣山抜去後２−３日で直径約１．５−２．５ｍｍの球状の肝臓様構造体が得られた。この形状はこの３０日間培養後でも維持されていた（図１０Ａ−Ｅ．Ｄａｙ３０）。
　Ｈｅｐと各種ヒト由来細胞を含む肝臓様構造体におけるＣＹＰ３Ａ４遺伝子発現量の比較
　実施例３記載の方法に基づき、各種ヒト由来細胞を含む肝臓構造体を３０日間培養した後、５種類の肝臓構造体についてＣＹＰ３Ａ４遺伝子発現量を調べた（図１１）。その結果、ＣＹＰ３Ａ４遺伝子発現量はＴＥＮを含む肝臓構造体（Ｈｅｐ／ＴＥＮ）で最も高く、コントロールとして用いたＮＩＨ３０を含む肝臓構造体（Ｈｅｐ／ＮＩＨ３０）よりも高い値を示した。このとき、細胞数の目安となるＧＡＰＤＨの発現量についても調べたところ、ＮＨＯＳＴとＴＥＮで高値を示した。
Ｈｅｐと各種ヒト由来細胞を含む肝臓様構造体におけるＰｈａｓｅ　Ｉ薬物代謝関連遺伝子の発現量の比較
実施例３記載の方法に基づき、各種ヒト由来細胞を含む肝臓構造体を３０日間培養した後の肝臓構造体についてＰｈａｓｅ　Ｉ薬物代謝関連遺伝子（ＣＹＰ１Ａ２，ＣＹＰ２Ａ６，ＣＹＰ２Ｂ６，ＣＹＰ２Ｃ９，ＣＹＰ２Ｃ１９，ＣＹＰ２Ｄ６，ＣＹＰ２Ｅ１およびＣＹＰ３Ａ４）の発現量を調べた（図１２）。
　その結果、Ｈｅｐ／ＴＥＮの組み合わせのとき、ＣＹＰ２Ｅ１を除くすべてのＣＹＰで、コントロールとして用いたＮＩＨ３０のときよりも高い発現が確認された。
Ｈｅｐと各種ヒト由来細胞を含む肝臓様構造体におけるＰｈａｓｅ　ＩＩ薬物代謝関連遺伝子の発現量の比較
　実施例３記載の方法に基づき、各種ヒト由来細胞を含む肝臓構造体を３０日間培養した後の肝臓構造体についてＰｈａｓｅ　ＩＩ薬物代謝関連遺伝子（ＧＳＴＭ１，ＧＳＴＴ１，ＳＵＬＴ２Ａ１，ＵＧＴ１Ａ１およびＵＧＴ２Ｂ４）の発現量を調べた（図１３）。その結果、Ｈｅｐ／ＴＥＮの組み合わせのとき、調べたすべてのＰｈａｓｅ　ＩＩ薬物代謝関連遺伝子でＮＩＨ３０のときよりも高い発現が確認された。
Ｈｅｐと各種ヒト由来細胞を含む肝臓様構造体におけるＰｈａｓｅ　ＩＩＩ薬物代謝関連遺伝子の発現量の比較
　実施例３記載の方法に基づき、各種ヒト由来細胞を含む肝臓構造体を３０日間培養した後の肝臓構造体についてＰｈａｓｅ　ＩＩＩ薬物代謝関連遺伝子（ＢＣＲＰ，ＢＳＥＰ，ＭＲＰ２，ＭＡＴＥ１，ＭＲＰ６，ＭＤＲ１，ＮＣＴＰおよびＯＣＴ１）の発現量を調べた（図１４）。その結果、Ｈｅｐ／ＴＥＮの組み合わせのとき、調べたすべてのＰｈａｓｅ　ＩＩＩ薬物代謝関連遺伝子でＮＩＨ３０のときよりも高い発現が確認された。
Ｈｅｐと各種ヒト由来細胞を含む肝臓様構造体における転写因子、核内受容体、細胞外基質関連遺伝子および肝臓特異的遺伝子の発現量の比較
　実施例３記載の方法に基づき、各種ヒト由来細胞を含む肝臓構造体を３０日間培養した後の肝臓構造体について転写因子（ＨＮＦ１Ａ，ＨＮＦ３Ａ，ＨＮＦ４Ａ，ＨＮＦ６，ＰＲＯＸ１およびＣＥＢＰＡ）、核内受容体（ＣＡＲ）、細胞外基質関連遺伝子（ＣＯＬ１Ａ２）および肝臓特異的遺伝子（ＡＬＢ）の発現量を調べた（図１５）。その結果、Ｈｅｐ／ＴＥＮの組み合わせのとき、調べた範囲内でＨＮＦ３Ａ以外のすべての転写因子、核内受容体、細胞外基質関連遺伝子および肝臓特異的遺伝子でＮＩＨ３０のときよりも高い発現が確認された。
　したがって、まだ検討の余地はあるものの、現段階では５種類のヒト由来細胞の中でＨｅｐとＴＥＮを含む肝臓構造体で実施例５−８に記載した３０遺伝子の大半で最も発現が高いことがわかった。
　ＨｅｐとＴＥＮとの共培養によるスフェロイド作製の条件検討
　実施例５においてＨｅｐと各種ヒト由来細胞を共培養した構造体においてＨｅｐ／ＴＥＮの組み合わせのときにＣＹＰ３Ａ４の発現が最も高かった。そこで、Ｈｅｐ／ＴＥＮの組み合わせで共培養したときのスフェロイド作製条件の最適化を行った。このとき、ＨｅｐとＴＥＮとの細胞混合比は実施例４に基づき３通りの条件［Ｈｅｐ：ＴＥＮ＝１：０．１、１：０．３、１：０．５（×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）］を用い、これらの各細胞混合比に対し、表４に記載の２４通りの培地交換条件（計３×２４＝７２通りの条件）でスフェロイド作製を行い、細胞播種日より２９日目の時点でのＣＹＰ３Ａ４（図１６）とＧＡＰＤＨ（図１７）の遺伝子発現量（ｃｏｐｙ／ｓｐｈｅｒｏｉｄ）を測定した。
　その結果、Ｈｅｐ：ＴＥＮ＝１：０．５で培地交換条件が２、４、９のときにＧＡＰＤＨ遺伝子の発現が顕著に高く、Ｈｅｐ：ＴＥＮ＝１：０．５で培地交換条件が２２のときＣＹＰ３Ａ４遺伝子の発現が顕著に高かった。以上の結果よりＨｅｐ：ＴＥＮ＝１：０．５で培地交換条件が２、４、９、２２の４つの条件を選択して以降の実験を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
ＨｅｐとＴＥＮを含む肝臓構造体におけるＣＹＰ３Ａ４、ＧＡＰＤＨ、ＯＡＴＰ１Ｂ１およびＯＡＴＰ１Ｂ３遺伝子発現レベル
　ＨｅｐとＴＥＮを含む肝臓構造体の評価を以下の様にして実施した。すなわち、ＨｅｐとＴＥＮを１：０．５（×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）の混合比で含むスフェロイドを実施例１０で選択された４通りの培地交換条件で培養し、レジェノバで積層した後で循環培養することにより構造体を作製した。スフェロイド作製日から３０日後に各種遺伝子（ＣＹＰ３Ａ４、ＧＡＰＤＨ、ＯＡＴＰ１Ｂ１、ＯＡＴＰ１Ｂ３）の発現量を調べた（図１８）。その結果、どの遺伝子の発現もＮｏ．２の条件で最も高い値を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
ＨｅｐとＴＥＮを含む肝臓構造体におけるＣＹＰ３Ａ４活性の経時変化
　実施例１１で選ばれたＮｏ．２の条件で構造体を作製し、Ｄａｙ０、２０、３０の時点でＣＹＰ３Ａ４活性と細胞内ＡＴＰ量を測定した（図１９）。
　その結果、Ｄａｙ２０とＤａｙ３０での構造体当りのＣＹＰ３Ａ４活性は、Ｄａｙ０のときの２０−３０％程度の活性値を示した。Ｄａｙ２０とＤａｙ３０での構造体当りの細胞内ＡＴＰ量は、Ｄａｙ０のときの１．３倍程度の値が維持されていた。
配列番号１~４：合成ＤＮＡ

Claims (5)

  1. ヒト肝細胞と、ヒト肝細胞以外のヒト由来細胞とを凝集させたヒト肝臓型ヘテロスフェロイドであって、ヒト肝細胞以外のヒト由来細胞が、ヒト肝星細胞、ヒト肺線維芽細胞、ヒト大動脈外膜線維芽細胞、ヒト歯周靱帯線維芽細胞、ヒト腸筋線維芽細胞、ヒト腱細胞、ヒトアストロサイト、ヒト新生児皮膚線維芽細胞、ヒト滑膜間質細胞、ヒト脳毛細血管周皮細胞、ヒト腎メサンギウム細胞、ヒト心臓線維芽細胞、ヒト大動脈血管平滑筋細胞。ヒト骨芽細胞、正常ヒト骨格筋細胞、ヒト歯髄幹細胞、ヒト髄核細胞、ヒト線維輪細胞、ヒト靱帯細胞、ヒト軟骨細胞、ヒト胆管上皮細胞、ヒト類洞内皮細胞及びヒト臍帯静脈血管内皮細胞からなる群から選択されるいずれかの細胞である前記スフェロイド。
  2. 請求項１に記載のスフェロイドが積層された、ヒト肝臓様立体構造体。
  3. 請求項１に記載のスフェロイドを積層することを特徴とする、ヒト肝臓様立体構造体の製造方法。
  4. スフェロイドの積層は、スフェロイドを針状体に突き刺すことにより行われるものである請求項３に記載の方法。
  5. 請求項２に記載の立体構造体を含む、ヒト肝臓モデル。
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WO2020171220A1 (ja) * 2019-02-22 2020-08-27 株式会社サイフューズ ヒト肝臓様立体構造体、肝毒性を評価する方法およびヒト肝臓様複合体

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