KR20220102581A - 오가노이드 배양을 위한 탈세포 지방 조직 유래 지지체 및 이의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 탈세포 지방 조직 유래 지지체 및 이의 제조방법에 관한 것으로 본 발명의 지지체는 다양한 장기 오가노이드 배양에 적용이 가능하므로 범용성이 우수하여 다양한 분야에서 활용될 수 있으며 버려지는 인간 폐지방으로부터 제조가 가능하기 때문에 막대한 부가가치 창출이 가능하며, 기존 매트리젤을 대체하여 신약 개발, 약물 독성 및 유효성 평가, 환자 맞춤형 약물 선별 등 의료 산업 분야에 광범위하게 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 오가노이드 배양을 위한 탈세포 지방 조직 유래 지지체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
기존의 2차원 세포 배양법은 실제 생체 내 미세환경을 구현하는데 한계가 있기 때문에 배양 효율이 낮으며 따라서 2D 세포주는 체외 모델로서 한계가 있다. 이러한 한계점을 개선하기 위한 새로운 방안으로 최근 3차원 오가노이드 배양 기술이 큰 각광을 받고 있는데 오가노이드는 신약 스크리닝, 약물 독성 평가, 질환 모델링, 세포 치료제, 조직공학 등 다양한 임상적 적용이 가능한 조직 유사체로서 전 세계적으로 급격하게 성장하고 있는 기술이다. 오가노이드는 삼차원 구조체 내에 인체의 특정 장기 및 조직을 구성하는 다양한 세포로 이루어져 있을 뿐만 아니라 그들 간의 복합적인 상호 작용을 구현할 수 있기 때문에 단순 2D 세포주 모델이나 동물 모델과 같은 기존에 주로 이용되던 약물 평가 모델과 비교해서 훨씬 정확한 체외 모델 플랫폼으로 적용이 가능하다.
전세계적으로 다양한 장기 유래 오가노이드 플랫폼들이 구축되었고 현재까지도 관련 연구가 활발히 진행중인데, 현재까지 오가노이드를 배양하기 위해 배양 지지체로서 공통적으로 매트리젤 (Matrigel) 제품을 이용하고 있다. 하지만 매트리젤은 쥐의 육종암 조직에서 추출한 성분이기 때문에, 제품의 품질을 균일하게 유지하기 어려우며 고가이고 동물성 감염균 및 바이러스 전이 등 안전성 측면에서 문제가 있어 오가노이드 배양 시스템으로서 매트리젤은 해결해야 하는 많은 문제점을 가지고 있다. 특히, 암 조직 유래의 소재로서 특정 조직 오가노이드 배양을 위해 필요한 최적의 미세환경을 제공해 주지 못한다. 매트리젤을 대체하기 위한 고분자 기반 하이드로젤 개발 연구가 일부 진행되어 왔으나 아직까지 매트리젤을 대체할만한 수준의 소재는 보고된 바 없다.
한편, 인체 지방 조직은 매년 수 백톤 이상이 폐기되는 실정이므로 이를 잘 활용하면 높은 경제성을 가지는 오가노이드 배양용 매트릭스 소재로 활용이 가능할 것으로 기대가 되며, 장기 유형에 관계없이 다양한 오가노이드를 배양할 수 있는 범용성 있는 지지체는 막대한 경제적 수익 창출이 가능할 것으로 기대가 된다.
본 발명에서는 지방 조직의 탈세포 공정을 통해 지방 조직 특이적 세포외기질 성분으로 구성된 하이드로젤 매트릭스 제작하고 이를 오가노이드 배양에 적용하였다. 기존 장기 탈세포 방법과 비교하여 본 발명에서는 탈세포 공정에서 원료가 되는 조직을 작은 덩어리로 자르는 등의 과정을 포함하는 탈세포화 처리를 하였기 때문에 더욱 효과적으로 세포를 제거하고, 인체 지방 조직에 풍부하게 존재하는 세포외기질 성분 및 성장인자가 잘 보존되어 다양한 장기 유형의 오가노이드의 효율적인 생장 및 분화를 유도할 수 있음을 확인하여 기존 매트리젤을 대체할 수 있는 범용성이 높은 배양 매트릭스로서의 가능성을 검증하였다.
본 발명의 일 양상은 지방 조직 유래 세포외기질 (Adipose Extracellular Matrix; AEM)을 포함한 오가노이드 배양 및 이식용 지지체를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 다른 일 양상은 1) 분리된 지방 조직을 파쇄하는 단계; 및 2) 상기 파쇄된 지방 조직에 Triton X-100 및 수산화암모늄을 처리하여 탈세포하여 탈세포된 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM)을 제조하는 단계를 포함하는 오가노이드 배양 및 이식용 지지체 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 다른 일 양상은 상기 지지체 또는 상기 제조방법에 의해 제조된 지지체에서 오가노이드를 배양하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
이하에서는 첨부한 도면을 참조하여 본 발명을 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 따라서 여기에서 설명하는 실시예로 한정되는 것은 아니다. 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 구비할 수 있다는 것을 의미한다.
달리 정의되지 않는 한, 분자 생물학, 미생물학, 단백질 정제, 단백질 공학, 및 DNA 서열 분석 및 당업자의 능력 범위 안에서 재조합 DNA 분야에서 흔히 사용되는 통상적인 기술에 의해 수행될 수 있다. 상기 기술들은 당업자에게 알려져 있고, 많은 표준화된 교재 및 참고저서에 기술되어 있다.
본 명세서에 달리 정의되어 있지 않으면, 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 당업계에 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 바와 같은 의미를 가진다.
본 명세서에 포함되는 용어를 포함하는 다양한 과학적 사전이 잘 알려져 있고, 당업계에서 이용가능하다. 본 명세서에 설명된 것과 유사 또는 등가인 임의의 방법 및 물질이 본원의 실행 또는 시험에 사용되는 것으로 발견되나, 몇몇 방법 및 물질이 설명되어 있다. 당업자가 사용하는 맥락에 따라, 다양하게 사용될 수 있기 때문에, 특정 방법학, 프로토콜 및 시약으로 본 발명이 제한되는 것은 아니다. 이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
본 발명에서는 일련의 화학적 및 물리적 처리를 통해서 대량의 인간 지방 조직으로부터 탈세포 지지체를 제작할 수 있는 공정을 개발하였고 이를 다양한 장기 오가노이드 배양에 성공적으로 이용하였다.
본 발명에서 개발된 지방 조직 유래 탈세포 지지체는 세포만 제거되고 주요 세포외기질 성분으로 구성되어 있기 때문에 체내 이식 시 면역 반응을 야기하지 않고 생체적합성이 매우 우수할 것으로 기대되었고, 실제로 단백질체 분석을 통해 탈세포 지방 조직 유래 지지체는 다양한 세포외기질 성분 및 관련 단백질들을 풍부하게 함유하고 있는 것을 확인하였다. 따라서 개발된 탈세포 지방 조직 유래 지지체에서 각종 오가노이드의 형성, 발달 및 유지가 가능하다.
실제로 본 발명에서 제작된 탈세포 지방 조직 유래 하이드로젤 지지체를 이용하여 다양한 장기 오가노이드가 형성되고 성장함을 확인하였고, 세포외기질 지지체 농도를 여러 조건에서 테스트하여 각 오가노이드 배양에 최적화된 농도를 선별하였다.
그 결과 개발된 탈세포 지방 조직 유래 지지체에서 유사한 양상으로 여러 장기 오가노이드가 배양 가능함을 확인했으며 각 장기를 구성하는 조직 세포로의 분화도 이루어지는 것을 확인하였다. 이러한 결과를 통해서 탈세포 지방 조직 유래 지지체가 기존 매트리젤을 대체할 수 있는 배양 매트릭스로서의 가능성을 가지고 있음을 검증하였으며, 본 발명의 지지체는 장기 유형에 관계없이 범용적인 오가노이드 배양 매트릭스로서의 적용 가능성을 확인하였다.
본 발명의 일 양상은 지방 조직 유래 세포외기질 (Adipose Extracellular Matrix; AEM)을 포함한 오가노이드 배양 및 이식용 지지체를 제공한다.
상기 "세포외기질 (extracellular matrix)"은 포유류 및 다세포 생물 (multicellular organisms)에서 발견된 조직의 탈세포화를 통해 제조된 세포 성장용 자연 지지체를 의미한다. 상기 세포외기질은 투석 또는 가교화를 통해 더 처리할 수 있다.
상기 세포외기질은 콜라겐(collagens), 엘라스틴 (elastins), 라미닌 (laminins), 글리코스아미노글리칸 (glycosaminoglycans), 프로테오글리칸 (proteoglycans), 항균제 (antimicrobials), 화학유인물질 (chemoattractants), 시토카인 (cytokines), 및 성장 인자에 제한되지 않는, 구조형 및 비구조형 생체 분자 (biomolecules)의 혼합물일 수 있다.
상기 세포외기질은 포유 동물에 있어서 다양한 형태로서 약 90%의 콜라겐을 포함할 수 있다. 다양한 생체 조직에서 유래한 세포외기질은 각각의 조직에 필요한 고유 역할 때문에 전체 구조체 및 조성이 상이할 수 있다.
상기 "유래 (derive)", "유래된 (derived)"은 유용한 방법에 의해 언급한 원천으로부터 수득한 성분을 의미한다.
본 발명의 일 구체예로 상기 지방 조직 유래 세포외기질은 Triton X-100 및 수산화암모늄을 혼합한 용액을 이용하여 제조된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예로 상기 지지체 내 상기 지방 조직 유래 세포외기질의 농도는 1 mg/mL 내지 10 mg/mL, 구체적으로는 2 mg/mL 내지 7 mg/mL 일 수 있다. 상기 지방 세포외기질의 농도의 예시로, 2 mg/mL 내지 7 mg/mL, 2 mg/mL 내지 6 mg/mL, 2 mg/mL 내지 5 mg/mL, 2 mg/mL 내지 4 mg/mL, 2 mg/mL 내지 3 mg/mL, 3 mg/mL 내지 7 mg/mL, 3 mg/mL 내지 6 mg/mL, 3 mg/mL 내지 5 mg/mL, 3 mg/mL 내지 4 mg/mL, 4 mg/mL 내지 7 mg/mL, 4 mg/mL 내지 6 mg/mL, 4 mg/mL 내지 5 mg/mL, 5 mg/mL 내지 7 mg/mL, 5 mg/mL 내지 6 mg/mL, 6 mg/mL 내지 7 mg/mL 일 수 있고, 일 실시예로 1 mg/mL, 2 mg/mL, 3 mg/mL, 4 mg/mL, 5 mg/mL, 6 mg/mL 또는 7 mg/mL일 수 있다. 상기 범위외의 농도로 포함될 경우, 본 발명이 목적하는 효과를 얻을 수 없다.
더욱 구체적으로 상기 지방 조직 유래 세포외기질의 농도는 배양되는 오가노이드 종류에 따라 결정될 수 있으며, 일 예시로, 소장 오가노이드일 경우 4 mg/mL, 폐 오가노이드일 경우 7 mg/mL, 췌장 오가노이드일 경우 5 mg/mL, 위 오가노이드일 경우 7 mg/mL, 신장 오가노이드일 경우 5 mg/mL, 조직 유래 간 (담관) 오가노이드일 경우 3 mg/mL, 대장 오가노이드일 경우 5 mg/mL, 심장 오가노이드일 경우 7 mg/mL일 수 있으며 유도만능줄기세포 (hiPSC) 유래 간 오가노이드일 경우 7 mg/mL일 수 있다.
상기 지지체는 탈세포화하여 수득한 지방 조직 유래 세포외기질을 기반으로 제조한 3차원 하이드로젤을 포함하며, 오가노이드 배양에 효과적으로 활용될 수 있다.
상기 탈세포화된 지방 조직은 다양한 세포의 증식, 분화 및 기능성을 증진시킬 수 있는 세포외기질 성분을 포함하므로, 오가노이드의 생장, 발달 및 기능성을 증진시키는데 매우 효율적이다.
상기 "오가노이드 (organoid)"는 조직 또는 전분화능줄기세포에서 유래된 세포를 3D 형태로 배양하여 인공장기와 같은 형태로 제작한 초소형 생체기관을 의미한다.
상기 오가노이드는 줄기세포에서 발생하고 생체 내 상태와 유사한 방식으로 자가-조직화 (또는 자가-패턴화)하는 장기 특이적 세포를 포함한 삼차원 조직 유사체로서 제한된 요소 (Ex. growth factor) 패터닝에 의해 특정 조직으로 발달할 수 있다.
상기 오가노이드는 세포의 본래 생리학적 특성을 가지며, 세포 혼합물 (한정된 세포 유형뿐만 아니라 잔존 줄기 세포, 근접 생리학적 니치 (physiological niche)를 모두 포함) 원래의 상태를 모방하는 해부학적 구조를 가질 수 있다. 상기 오가노이드는 3차원 배양 방법을 통해 세포와 세포의 기능이 더욱 잘 배열되고, 기능성을 가지는 기관 같은 형태와 조직 특이적 기능을 가질 수 있다.
본 발명의 상기 지지체는 지방 조직 유래로 세포외기질을 포함하고 있고, 이는 다른 조직 유래 세포외기질에 비하여 범용성이 높아 다양한 오가노이드 배양에 사용할 수 있으며 배양 가능한 오가노이드의 일 예시로 소장 오가노이드, 폐 오가노이드, 췌장 오가노이드, 위 오가노이드, 신장 오가노이드, 간 오가노이드, 식도 오가노이드, 담관 오가노이드, 대장 오가노이드 및 심장 오가노이드, 중 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 다른 일 양상은 1) 분리된 지방 조직을 파쇄하는 단계; 및 2) 상기 파쇄된 지방 조직에 Triton X-100 및 수산화암모늄을 처리하여 탈세포하여 탈세포된 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM)을 제조하는 단계를 포함하는 오가노이드 배양 및 이식용 지지체 제조방법을 제공한다.
상기 1) 단계는 분리된 지방 조직을 파쇄하는 단계로, 상기 지방 조직은 공지의 동물에서 분리된 것일 수 있고, 상기 동물의 구체적인 예시로, 소, 돼지, 원숭이, 인간 등일 수 있다. 또한 본 발명에서는 상기 분리된 지방 조직을 파쇄한 뒤 탈세포 처리하기 때문에 탈세포의 효율이 높다. 분리된 지방 조직을 파쇄하는 방법은 공지의 방법으로 이루어질 수 있다. 본 발명은 상기 지방 조직을 파쇄하여 탈세포 공정을 거쳤기 때문에 더 효율적이고 높은 수준의 세포 제거가 가능하다.
상기 2) 단계는 상기 파쇄된 지방 조직에 Triton X-100 및 수산화 암모늄을 처리하여 탈세포하여 탈세포된 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM)을 제조하는 단계이다. 본 발명은 Triton X-100 및 수산화암모늄을 처리하여, 조직 손상을 최소화함으로써 지방 조직 내의 다양한 단백질들이 더 많이 보존될 수 있다, 구체적인 예시로 파쇄된 지방 조직을 Triton X-100 및 수산화암모늄과 함께 교반하고, Dnase I (2000 KU) 3시간 및 isopropanol 36시간 교반하면서 탈세포 공정이 이루어질 수 있다.
본 발명의 일 구체예로 상기 2) 단계 이후 3) 상기 탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM)을 동결건조 하여 동결건조 지방 조직 유래 세포외기질을 제조하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.
상기 3) 단계는 상기 탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM)을 동결건조 하여 동결건조 지방 조직 유래 세포외기질을 제조하는 단계이다. 상기 동결건조 지방 조직 유래 세포외기질은 멸균을 위해 건조 후 전자 빔, 감마 방사선, 에틸렌 옥사이드 가스 또는 초임계 이산화탄소에 노출시킬 수 있다.
본 발명의 일 구체예로 상기 3) 단계 이후 4) 상기 동결건조 지방 조직 유래 세포외기질을 하이드로젤 형태의 오가노이드 배양 및 이식용 지지체로 형성하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.
상기 4) 단계는 상기 동결건조 지방 조직 유래 세포외기질을 하이드로젤 형태의 오가노이드 배양 및 이식용 지지체로 형성하는 단계이다. 상기 단계는 젤화 (gelation)를 통해 이루어질 수 있으며, 구체적으로는 상기 동결건조 지방 조직 유래 세포외기질을 펩신 용액에 용해시켜 용액화 한 뒤 pH를 조정하여 하이드로젤화하는 것일 수 있다. 상기 탈세포 지방 조직 유래 세포외기질을 가교시켜 3차원 하이드로젤 형태의 지지체를 제작할 수 있고, 겔화된 지지체는 실험, 스크리닝 뿐만 아니라 오가노이드 배양과 관련된 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.
상기 "하이드로젤"은 졸-겔 상변이를 통해 물을 분산매로 하는 액체가 굳어 유동성을 상실하고 다공성 구조를 이루는 물질로서, 3차원 망목 구조와 미결정 구조를 갖는 친수성 고분자가 물을 함유하여 팽창함으로써 형성될 수 있다.
상기 젤화는 동결건조 지방 조직 유래 세포외기질을 산성 용액에서 펩신 또는 트립신과 같은 단백질 분해 효소로 용액화하고, pH를 조정, 구체적으로 10X PBS와 1 M NaOH를 이용하여 중성 pH와 1X PBS 버퍼의 전해질 상태로 맞추고 37℃의 온도에서 30분 동안 이루어지는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 일 양상은 상기 지지체 또는 상기 제조방법에 의해 제조된 지지체에서 오가노이드를 배양하는 방법을 제공한다.
기존의 매트리젤 기반 배양 시스템은 동물 암조직 유래의 추출물로서 배치 간의 차이가 크고 실제 조직의 미세환경을 모사해주지 못하고, 오가노이드로 분화, 발달되는 효율이 미흡한 반면, 상기 지지체는 조직 유사 환경을 조성할 수 있으므로 다양한 오가노이드 배양에 있어서 적합하다.
상기 배양은 적합한 조건에서 세포를 유지 및 성장시키는 과정을 의미하며, 적합한 조건은 예컨대, 세포가 유지되는 온도, 영양소 가용성, 대기 CO2 함량 및 세포 밀도를 의미할 수 있다.
서로 다른 유형의 세포를 유지, 증식, 확대 및 분화시키기 위한 적절한 배양 조건은 당해 기술분야에 공지되어 있고, 문서화 되어있다. 상기 오가노이드 형성에 적합한 조건은 세포 분화 및 다세포 구조의 형성을 용이하게 하거나 허용하는 조건일 수 있다.
본 발명의 지지체를 이용하면 오가노이드의 효율적인 배양이 가능하므로 여러가지 문제점을 가지고 있는 기존 매트리젤을 대체하여 신약 개발, 약물 독성 및 유효성 평가, 환자 맞춤형 약물 선별 등 의료 산업 분야에 광범위하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다. 이를 통해 보건사회적으로 국민의 삶의 질 향상과 더불어 경제/산업적으로도 큰 부가가치를 창출할 것이라고 전망한다.
본 발명에서 개발된 지지체는 다양한 장기 오가노이드 배양에 적용이 가능하므로 범용성이 우수하여 다양한 분야에서 활용될 수 있으며 버려지는 인간 폐지방 조직으로부터 제조가 가능하기 때문에 막대한 부가가치 창출이 가능할 것으로 기대된다.
도 1은 탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (Adipose Extracellular Matrix; AEM) 제작 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 오가노이드 배양을 위한 탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM) 분석결과를 나타낸 것이다.
도 3 및 4는 탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM)의 생체적합성 평가 결과를 나타낸 것이다.
도 5 내지 7은 탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM)의 단백체 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM)의 농도에 따른 물성 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 장(소장) 오가노이드 배양을 위한 탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM) 하이드로젤의 최적 농도 선정 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM) 하이드로젤의 농도에 따른 장(소장) 오가노이드 배양 양상 비교 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 폐 오가노이드 배양을 위한 탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM) 하이드로젤의 최적 농도 선정 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM) 하이드로젤의 농도에 따른 폐 오가노이드 배양 양상 비교 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 췌장 오가노이드 배양을 위한 탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM) 하이드로젤의 최적 농도 선정 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM) 하이드로젤의 농도에 따른 췌장 오가노이드 배양 양상 비교 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 위 오가노이드 배양을 위한 탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM) 하이드로젤의 최적 농도 선정 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM) 하이드로젤의 농도에 따른 위 오가노이드 배양 양상 비교 결과를 나타낸 것이다.
도 17은 신장 오가노이드 배양을 위한 탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM) 하이드로젤의 최적 농도 선정 결과를 나타낸 것이다.
도 18은 탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM) 하이드로젤의 농도에 따른 신장 오가노이드 배양 양상 비교 결과를 나타낸 것이다.
도 19는 간(담관) 오가노이드 배양을 위한 탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM) 하이드로젤의 최적 농도 선정 결과를 나타낸 것이다.
도 20은 탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM) 하이드로젤의 농도에 따른 간(담관) 오가노이드 배양 양상 비교 결과를 나타낸 것이다.
도 21은 식도 오가노이드 배양을 위한 탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM) 하이드로젤의 최적 농도 선정 결과를 나타낸 것이다.
도 22는 탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM) 하이드로젤의 농도에 따른 식도 오가노이드 배양 양상을 비교한 결과이다.
도 23은 탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM) 하이드로젤을 이용한 장(대장) 오가노이드 배양 결과를 나타낸 것이다.
도 24는 인간 유도만능줄기세포 (Human-induced Pluripotent Stem Cell; hiPSC) 유래 간 오가노이드 배양을 위한 탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM) 하이드로젤의 최적 농도 선정 결과를 나타낸 것이다.
도 25는 탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM) 하이드로젤의 농도에 따른 인간 유도만능줄기세포 (Human-induced Pluripotent Stem Cell; hiPSC) 유래 간 오가노이드 배양 양상 비교 결과를 나타낸 것이다.
도 26은 탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM) 하이드로젤을 이용한 심장 오가노이드 배양 결과를 나타낸 것이다.
도 27은 탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM) 하이드로젤에서 제작된 심장 오가노이드의 기능성 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 오가노이드 배양을 위한 탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM) 분석결과를 나타낸 것이다.
도 3 및 4는 탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM)의 생체적합성 평가 결과를 나타낸 것이다.
도 5 내지 7은 탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM)의 단백체 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM)의 농도에 따른 물성 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 장(소장) 오가노이드 배양을 위한 탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM) 하이드로젤의 최적 농도 선정 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM) 하이드로젤의 농도에 따른 장(소장) 오가노이드 배양 양상 비교 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 폐 오가노이드 배양을 위한 탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM) 하이드로젤의 최적 농도 선정 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM) 하이드로젤의 농도에 따른 폐 오가노이드 배양 양상 비교 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 췌장 오가노이드 배양을 위한 탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM) 하이드로젤의 최적 농도 선정 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM) 하이드로젤의 농도에 따른 췌장 오가노이드 배양 양상 비교 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 위 오가노이드 배양을 위한 탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM) 하이드로젤의 최적 농도 선정 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM) 하이드로젤의 농도에 따른 위 오가노이드 배양 양상 비교 결과를 나타낸 것이다.
도 17은 신장 오가노이드 배양을 위한 탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM) 하이드로젤의 최적 농도 선정 결과를 나타낸 것이다.
도 18은 탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM) 하이드로젤의 농도에 따른 신장 오가노이드 배양 양상 비교 결과를 나타낸 것이다.
도 19는 간(담관) 오가노이드 배양을 위한 탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM) 하이드로젤의 최적 농도 선정 결과를 나타낸 것이다.
도 20은 탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM) 하이드로젤의 농도에 따른 간(담관) 오가노이드 배양 양상 비교 결과를 나타낸 것이다.
도 21은 식도 오가노이드 배양을 위한 탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM) 하이드로젤의 최적 농도 선정 결과를 나타낸 것이다.
도 22는 탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM) 하이드로젤의 농도에 따른 식도 오가노이드 배양 양상을 비교한 결과이다.
도 23은 탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM) 하이드로젤을 이용한 장(대장) 오가노이드 배양 결과를 나타낸 것이다.
도 24는 인간 유도만능줄기세포 (Human-induced Pluripotent Stem Cell; hiPSC) 유래 간 오가노이드 배양을 위한 탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM) 하이드로젤의 최적 농도 선정 결과를 나타낸 것이다.
도 25는 탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM) 하이드로젤의 농도에 따른 인간 유도만능줄기세포 (Human-induced Pluripotent Stem Cell; hiPSC) 유래 간 오가노이드 배양 양상 비교 결과를 나타낸 것이다.
도 26은 탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM) 하이드로젤을 이용한 심장 오가노이드 배양 결과를 나타낸 것이다.
도 27은 탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM) 하이드로젤에서 제작된 심장 오가노이드의 기능성 분석 결과를 나타낸 것이다.
이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (Adipose Extracellular Matrix; AEM) 제작 (도 1)
탈세포 처리를 통해 인간 지방 조직에서 세포를 제거하고 세포외기질로 구성된 지지체 (Adipose Extracellular Matrix; AEM)를 제작하였다. 본 발명에서 적용한 탈세포 공정은 인체 지방 조직을 작은 덩어리로 자르거나 음압을 이용해 흡입된 지방을 채취하여 탈세포화 처리를 하였기 때문에 더 효과적으로 세포를 제거할 수 있다.
(A) 오가노이드 배양을 위한 탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 지지체 (AEM)의 제작 모식도를 나타낸 것이다.
(B) 인간 지방 조직 (Native human adipose tissue)에 일련의 화학적 처리 (37℃ 에서 1M sodium chloride (NaCl) 2시간, 상온에서 1% Triton X-100와 0.1% ammonium hydroxide (NH4OH) 18시간, Dnase I (2000 KU) 3시간 및 isopropanol 36시간 연속적인 교반을 통한 물리적인 자극을 가함으로써 세포를 효과적으로 제거하여 탈세포 지방 조직 (Decellularized human adipose tissue)을 제작하고 이를 동결 건조하여 AEM을 수득하였다.
(C) 동결 건조된 형태의 AEM 10 mg에 6 mg/mL 농도의 펩신 용액 (돼지 위 점막 유래 펩신 파우더 6 mg을 0.02 M HCl 1 mL에 녹인 용액) 1 mL을 처리하여 48시간 동안 상온에서 교반하여 용액화 과정을 진행한 뒤 10Х PBS와 NaOH를 첨가하여 세포 배양에 적합한 pH와 전해질 농도로 맞춘 후 37 ℃온도 조건에서 30분 동안 하이드로젤 형성을 유도하였다.
오가노이드 배양을 위한 탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM) 분석 (도 2)
(A) 인간 지방 조직의 탈세포 과정 전 (Native tissue)과 탈세포 과정 후 (Decellularized tissue) 헤마톡실린 & 에오신 염색 (H&E)을 진행하여 탈세포 과정 이후 세포 성분이 모두 제거되어 세포외기질 성분만 남아 있는 것을 확인하였고, Masson's trichrome 염색을 통하여 탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM)에 collagen 성분 또한 잘 보존되는 것을 확인하였다. 또한, Alcian blue 염색을 통해서 AEM에 glycosaminoglycan 성분이 잘 보존되어 유지되는 것을 확인하였다.
(B) 탈세포 공정 후 지방 조직 내에 fibronectin과 laminin과 같은 세포외기질 성분 중 큰 비중을 차지하며 중요한 역할을 담당하는 주요 단백질들이 잘 보존되어 있는지 확인하기 위해 면역염색을 실시하였다. AEM에서 fibronectin과 laminin이 잘 유지되어 있음을 확인하였다. 또한, 탈세포 과정 후에 DAPI로 염색되는 핵이 사라진 것을 관찰하여 세포 성분이 제거되었음을 다시 확인하였다.
(C) 형성된 3차원 AEM 하이드로젤 내부 미세구조를 주사전자현미경 (scanning electron microscope; SEM)을 이용하여 분석하였다. AEM 하이드로젤은 나노 섬유 기반의 미세 다공성 내부 구조를 가지는 것을 확인하였다. 따라서 다양한 오가노이드의 배양에 적합한 삼차원 미세환경을 제공해 줄 수 있을 것으로 예측되었다.
탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM)의 생체적합성 평가 -1 (in vitro) (도 3)
탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM)이 면역세포에 미치는 영향을 평가하기 위해 AEM 하이드로젤을 대식세포 (Raw 264.7)와 함께 배양하고 면역반응이 유발되었을 때 대식세포에 의해 분비되는 염증성 사이토카인 TNF-α (종양괴사인자)의 양을 ELISA 방법을 이용하여 측정하였다.
AEM 하이드로젤은 어떤 처리도 하지 않은 경우와 유사하게 미미한 수준의 TNF-α 분비를 유발함을 확인함으로써 AEM 하이드로젤을 체내 적용시 염증반응을 유발하지 않을 것으로 예측되었다.
탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM)의 생체적합성 평가 -2 (in vivo) (도 4)
탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM)의 이식용 소재로서의 적용 가능성을 확인하기 위해 마우스의 피하에 AEM 하이드로젤을 이식한 뒤 일주일간 면역반응 및 염증반응 여부를 확인하였다.
H&E 조직학 염색을 통해 AEM 하이드로젤이 이식된 부위에 조직 괴사 및 면역세포의 침윤 (infiltration) 등 비정상적인 염증 반응이 일어나지 않은 것을 확인하였다. 또한, 면역세포 중 비만세포 (mast cell)의 세포질을 자적색으로 염색하는 톨루이딘 블루 (Toluidine blue) 염색을 통해 AEM 하이드로젤이 이식된 조직 부위에서 비만세포는 발견되지 않은 것을 확인하였다.
즉, AEM 하이드로젤 이식 시에 조직 손상이나 면역 반응이 일어나지 않은 것을 확인하였고, 따라서 AEM은 배양용 소재뿐 아니라 오가노이드 이식용 소재로서도 적용 가능함을 확인하였다.
탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM)의 단백체 분석-1 (도 5)
탈세포 인간 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM)에 함유된 단백질 성분을 확인하기 위해 질량분석기를 이용한 단백체 분석 (Proteomics)을 실시하였다.
(A) AEM의 대부분이 매트리좀 단백질 (Matrisome proteins)로 구성되어 있는 것을 확인하였으며, 대조군인 매트리젤 (MAT) 또한 거의 대부분이 매트리좀 단백질로 이루어져 있는 것을 확인하였다.
(B) AEM에는 다양한 종류의 콜라겐 (Collagens), 글리코프로틴 (Glycoproteins), 프로테오글리칸 (Proteoglycans) 등의 세포외기질 성분들이 골고루 포함되어 있고, 이 외에도 세포외기질을 조절해주는 다양한 관련 단백질들도 함께 함유되어 있는 것을 확인하였다. 반면 MAT에는 글리코프로틴만 지지체의 대부분을 구성하고 있는 것을 확인하였다.
(C) 히트맵 (heatmap)을 통해 AEM과 MAT의 세포외기질 단백질 차이를 분석해 보았을 때 발현량 분포가 두 지지체 간에 큰 차이를 나타내는 것을 확인하였다. 특히, AEM에서는 전반적으로 모든 세포외기질 카테고리에서 다양한 단백질들이 높은 수준으로 검출되었으나, MAT에서는 주요 글리코프로틴과 기타 일부 세포외기질 관련 단백질 외에는 대부분 낮은 수준의 발현이 관찰되었다.
(D) MAT보다 AEM에서 더 많이 검출된 단백질들의 유전자 온톨로지 (Gene ontology)를 분석해보면 extracellular structure organization (세포외구조 구성), extracellular matrix organization (세포외기질 구성), collagen fibril organization (콜라겐 섬유 구성), tissue development (조직 발달) 등 오가노이드 형성에 주요한 역할을 담당하는 세포 기작 (Biological process)들이 주로 확인되었다.
탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM)의 단백체 분석-2 (도 6)
(A) AEM과 MAT의 유사도를 비교하기 위해 주성분 분석 (Principal component analysis; PCA)을 진행하였다. 이를 통해 AEM 샘플들과 MAT 샘플들은 유사도가 낮아서 분석 그래프에서 서로 멀리 떨어져 있는 것을 관찰함으로써 AEM과 MAT는 상당히 다른 성분으로 구성되어 있음을 확인하였다.
(B) 탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM)과 매트리젤 (MAT)에서 검출된 ECM 단백질들 중 가장 발현율이 높은 단백질 10개를 추려서 정량 분석을 진행하였다. MAT에서는 Top 10 ECM 성분 중 글리코프로틴 단백질이 8개이며, 그 중 4개가 MAT의 90% 이상을 차지하는 것을 확인하였다. 그러나 AEM의 Top 10 ECM 성분은 콜라겐 단백질 4개, 글리코프로틴 단백질 3개, 프로테오글리칸 단백질 3개로 보다 다양하게 구성되어 있으며, AEM 내 고르게 비중을 차지하는 것을 확인하였다.
(C) AEM과 MAT의 구성성분 비교 결과, MAT은 대부분 글리코프로틴으로만 이루어진 반면, AEM은 콜라겐, 글리코프로틴, 프로테오글리칸, 그리고 그 외에 세포외기질과 관련된 단백질들로 골고루 구성되어 있음을 확인하였다. 이는 AEM이 MAT 보다 오가노이드 배양에 있어서 보다 다양한 세포외기질 미세환경을 제공해 줄 수 있음을 보여준다.
탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM)의 단백체 분석-3 (도 7)
(A) 탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM)에서 추출된 전체 단백질에 대한 유전자 온톨로지 (Gene ontology; GO) 분석을 진행한 뒤 유사한 기능을 가지는 단백질들을 Multidimensional Scaling (MDS) 알고리즘을 통해 클러스터링 하였다. AEM을 구성하는 단백질들의 유전자 온톨로지 분석 결과, 이들과 관련된 세포 기작 (Biological process)이 주로 세포의 기본적인 기능에 중요한 역할을 담당할 수 있는 것들로 이루어져 있으며, 특히 세포외기질의 구조화 및 물질대사, 세포 및 조직 발달과 같은 기작들은 다양한 오가노이드의 효율적인 분화 발달에 큰 기여를 할 것으로 예측된다.
(B) AEM의 전체 단백질에 대해 서로 간의 상호작용을 분석한 뒤 클러스터링 하였다. 단백질들 중 대다수는 세포의 구조적 지지 및 부착을 담당하는 세포외기질의 구조 및 조성에 관여하는 기작을 담당하는 네트워크를 형성하며, 나머지는 지질 및 에너지 대사와 관련된 네트워크를 형성하였다. 이는 AEM이 인간 지방 유래이기 때문이며, 추후 오가노이드 배양 시 구조 발달뿐 아니라 다양한 세포 에너지 대사 작용에 도움을 줄 것으로 예상된다.
(C) AEM에서 검출된 단백질들 중 다른 조직에서보다 지방 조직에서 최소 4배 이상 더 많이 발현되는 단백질들의 유전자 온톨로지 분석 결과 지질 대사 및 지방 세포 관련 기작들이 많이 검출되는 것을 확인하였다.
탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM)의 농도에 따른 물성 분석 (도 8)
(A) 탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM)의 농도 별 물성 차이를 알아보기 위해 다양한 농도 조건 (3, 5, 7 mg/mL)에서 하이드로젤을 형성한 뒤 0.1-10 Hz 범위의 주파수 (Frequency)에서 탄성계수 (G′, Elastic modulus) 및 점성계수 (G″, Viscous modulus)를 회전형 유량계로 측정하였다. 모든 주파수 영역에서 액체상을 나타내는 점성계수에 비해 고체상을 나타내는 탄성계수가 높게 관찰됨을 확인하였으며, 이는 AEM 하이드로젤의 내부 구조가 안정적인 고분자 네트워크로 구성되어 있음을 보여주는 결과이다.
(B) AEM의 각 농도 별 평균 탄성계수과 대조군 매트리젤(MAT)의 평균 탄성계수를 비교하였다. AEM 농도가 증가할수록 기계적 물성도 향상되는 것을 확인하였고, 7 mg/mL 농도의 AEM 하이드로젤은 MAT보다 높은 기계적 물성을 가지는 것을 확인하였다.
장(소장) 오가노이드 배양을 위한 탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM) 하이드로젤의 최적 농도 선정 (도 9)
탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM) 하이드로젤을 소장 오가노이드 배양에 적용 시 최적의 하이드로젤 농도를 선정하기 위해 AEM 농도 별로 하이드로젤을 제작하고 소장 오가노이드를 배양하였다. 매트리젤 (MAT)은 대조군으로 이용하였다. 마우스의 소장 윗부분을 채취하여 장 줄기세포가 존재하는 크립트 (crypt) 부분을 분리하고 해당 크립트 조직을 각 하이드로젤 내에서 3차원 배양하여 소장 오가노이드 형성을 유도하였다. 배양 6일차에 각 AEM 농도 조건에서 형성된 소장 오가노이드의 형태와 형성 효율을 매트리젤에서 형성된 소장 오가노이드와 비교하였다.
(A) 2, 4, 6 mg/mL 농도 조건의 AEM 하이드로젤에서 배양된 소장 오가노이드가 대조군으로 이용한 매트리젤에서 배양된 소장 오가노이드와 유사한 형태로 형성되는 것을 확인하였다.
(B) 농도 별 (2, 4, 6 mg/mL) AEM 하이드로젤 및 매트리젤에서 배양된 소장 오가노이드 형성 효율을 비교했을 때 오가노이드 형성 효율은 4 mg/mL 농도 조건에서 가장 높은 것을 확인하였다.
탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM) 하이드로젤의 농도에 따른 장(소장) 오가노이드 배양 양상 비교 (도 10)
(A) 각 농도 별로 제작된 AEM 하이드로젤에서 6일간 배양된 소장 오가노이드의 유전자 발현양을 정량적 PCR (qPCR) 분석을 통해 비교해 보았을 때, 줄기세포능 (stemness)과 관련된 유전자인 Lgr5와 Axin2는 매트리젤 그룹에 비해 AEM 하이드로젤 그룹에서 유의미하게 증가를 하는 것을 확인하였다. 그리고 분화 (differentiation) 관련 마커인 Lyz1는 AEM 하이드로젤 그룹과 매트리젤 그룹이 통계적으로 유의미한 차이를 보이지 않았으며 Muc2는 AEM 하이드로젤에서 배양된 소장 오가노이드에서 더 증가된 발현 양상을 보였다. 전반적으로 AEM 농도가 높을수록 모든 마커의 발현이 증가하는 것을 확인하였다. 오가노이드 형성 효율 및 qPCR 결과를 토대로 소장 오가노이드 배양을 위한 최적의 AEM 하이드로젤 농도는 4 mg/mL 조건으로 결정하였다.
(B) 6일차에 AEM 하이드로젤 (4 mg/mL)에서 배양된 소장 오가노이드에 대한 면역염색을 통해 줄기세포능과 관련된 LGR5, 밀착 연접 (tight-junction)과 관련된 ECAD, 장 오가노이드를 이루는 세포 중 하나인 술잔 세포 (goblet cell)를 염색하는 MUC2 모두 다 매트리젤에서 배양된 소장 오가노이드 수준으로 잘 발현되는 것을 확인하였다.
상기한 결과들을 통해 탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM) 하이드로젤을 이용한 삼차원 배양을 통해 장(소장) 오가노이드의 형성 및 발달을 유도할 수 있음을 확인하였다.
폐 오가노이드 배양을 위한 탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM) 하이드로젤의 최적 농도 선정 (도 11)
탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM) 하이드로젤을 폐 오가노이드 배양에 적용 시 최적의 하이드로젤 농도를 선정하기 위해 AEM 농도 별로 하이드로젤을 제작하고 폐 오가노이드를 배양하였다. 매트리젤 (MAT)은 대조군으로 이용하였다. 마우스의 폐 조직에서 추출한 줄기세포들을 각 하이드로젤 내 삼차원 배양하여 폐 오가노이드 형성을 유도하였다. 배양 7일차에 각 조건에서 폐 오가노이드의 형태와 형성 효율을 비교 분석하였다.
(A) 3, 5, 7 mg/mL 농도 조건의 AEM 하이드로젤에서 배양된 폐 오가노이드가 대조군으로 이용된 매트리젤에서 배양된 폐 오가노이드와 비슷한 형태로 형성되는 것을 확인하였다.
(B) 농도 별 (3, 5, 7 mg/mL) AEM 하이드로젤 및 매트리젤에서 배양된 장 오가노이드 형성 효율을 비교했을 때 모든 농도의 AEM 하이드로젤에서 대조군인 매트리젤에 비해서 낮은 오가노이드 형성 효율을 보였다.
탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM) 하이드로젤의 농도에 따른 폐 오가노이드 배양 양상 비교 (도 12)
폐 세기관지 조직 관련 4가지 유전자 발현을 정량적 PCR (qPCR)을 통해 비교 분석하였다. 각 농도 별로 제작된 AEM 하이드로젤에서 7일간 배양된 폐 오가노이드와 대조군으로 매트리젤에서 배양된 폐 오가노이드를 비교하였다. Basal cell 관련 유전자인 Krt5는 매트리젤 그룹에 비해 모든 농도의 AEM 하이드로젤 그룹에서 19배 이상 높은 발현율을 보여주는 것을 확인하였다. Club cell 관련 유전자인 Scgb1a1과 Goblet cell 관련 유전자인 Muc5ac 또한 모든 농도의 AEM 하이드로젤 그룹에서 더 높게 발현됨을 확인하였다. Ciliated cell 관련 유전자인 Foxj1은 매트리젤 그룹과 모든 AEM 하이드로젤 조건에서 비슷한 수준의 발현양을 보였다. qPCR 결과를 토대로 최적의 AEM 농도는 7 mg/mL 조건으로 선정하여 이후 폐 오가노이드 배양에 적용하였다.
AEM 하이드로젤 (7 mg/mL)과 매트리젤에서 배양된 오가노이드에서 폐 조직에 존재하는 세포 종류인 goblet cell (MUC5AC)과 ciliated cell (α-tubulin)이 모두 관찰됨을 확인하였고 세포 증식과 관련된 KI67 단백질이 발현됨을 관찰하여 폐 오가노이드 내 세포가 일부 증식하고 있음을 확인하였다. 또한, cytoskeleton 관련 F-actin 염색을 통해 AEM 하이드로젤에서 배양된 오가노이드 내 세포들이 유기적으로 연결된 구조체를 형성하고 있는 것을 확인하였다.
이러한 결과를 통해 탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM) 하이드로젤을 이용하면 폐 오가노이드 형성 효율은 다소 낮지만 형성된 오가노이드의 분화 및 발달은 촉진시킬 수 있음을 확인하였다.
췌장 오가노이드 배양을 위한 탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM) 하이드로젤의 최적 농도 선정 (도 13)
탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM) 하이드로젤을 췌장 오가노이드 배양에 적용 시 가장 최적의 지지체 농도를 선정하기 위해 AEM 농도 별로 하이드로젤을 제작하고 췌장 오가노이드를 배양하였다. 마우스의 췌장 조직에서 추출한 췌관세포를 각 하이드로젤 내에서 삼차원 배양하여 췌장 오가노이드 형성을 유도하였다. 배양 7일차에 각 AEM 농도 조건에서 형성된 췌장 오가노이드의 형태를 매트리젤 (MAT)에서 형성된 췌장 오가노이드와 비교하였다.
(A) 모든 농도 조건의 AEM 하이드로젤에서 췌장 오가노이드가 형성되는 것을 확인하였다. 오가노이드 형태 및 모양을 분석했을 때 5 mg/mL 및 7 mg/mL 농도의 AEM 하이드로젤 지지체에서 배양된 췌장 오가노이드가 대조군으로 적용한 매트리젤에서 배양된 췌장 오가노이드와 유사한 형태로 성장하는 것을 확인하였다.
(B) 췌장 오가노이드 형성 효율을 비교해 보았을 때 AEM 하이드로젤 (3 mg/mL 및 5 mg/mL)을 이용한 배양과 매트리젤을 이용한 배양이 큰 차이가 없는 것을 확인함으로써 인간 지방 조직 유래 AEM 하이드로젤이 췌장 오가노이드 배양을 위한 매트리젤 대체재로서 적용 가능함을 확인하였다.
탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM) 하이드로젤의 농도에 따른 췌장 오가노이드 배양 양상 비교 (도 14)
탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM) 하이드로젤을 췌장 오가노이드 배양에 적용 시 최적의 농도를 선별하기 위해 세가지 농도별로 제작된 AEM 하이드로젤에서 췌장 오가노이드를 배양하였다. 매트리젤 (MAT)은 대조군으로 이용하였다.
(A) 각 농도 별로 제작된 AEM 하이드로젤에서 7일간 배양된 췌장 오가노이드의 유전자 발현양을 정량적 PCR (qPCR) 분석을 통해 비교해 보았을 때, 줄기세포능 (stemness)과 관련된 유전자인 Lgr5는 매트리젤에서 배양된 췌장 오가노이드와 비교하여 통계적으로 비슷한 수준을 보이는 반면 췌장 분화 유전자인 Pdx1과 Foxa2는 AEM 그룹에서 유의미하게 증가하는 것을 확인하였다. 형성 효율 및 qPCR 결과를 토대로 췌장 오가노이드 배양을 위한 최적의 AEM 하이드로젤 농도는 5 mg/mL 조건으로 결정하여 이후 췌장 오가노이드 배양에 적용하였다.
(B) 배양 7일차에 췌장 오가노이드에 대한 면역염색을 실시하여 대조군인 매트리젤에서 배양된 췌장 오가노이드와 췌장 마커 발현 수준을 비교하여 보았을 때, AEM 하이드로젤 (5 mg/mL 농도)에서 배양된 췌장 오가노이드에서도 매트리젤 그룹과 유사한 수준으로 췌장 조직 특이적 마커들인 SOX9 (pancreatic duct progenitor marker)과 KRT19 (pancreatic duct marker)이 잘 발현되는 것을 확인하였다.
이러한 결과를 통해 탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM) 하이드로젤을 이용한 삼차원 배양을 통해 매트리젤 수준으로 췌장 오가노이드의 형성 및 발달을 유도할 수 있음을 검증하였다.
위 오가노이드 배양을 위한 탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM) 하이드로젤의 최적 농도 선정 (도 15)
탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM) 하이드로젤을 위 오가노이드 배양에 적용 시 가장 최적의 농도를 선정하기 위해 AEM 농도 별로 하이드로젤을 제작하고 위 오가노이드를 배양하였다. 마우스의 위 조직으로부터 가장 기능적인 단위체인 위샘 (stomach gland) 조직을 추출하고 이를 각 하이드로젤 내에서 삼차원 배양하여 위 오가노이드 형성을 유도하였다. 배양 5일차에 각 AEM 농도 조건에서 형성된 위 오가노이드의 형태와 형성 효율을 매트리젤 (MAT)에서 형성된 위 오가노이드와 비교하였다.
(A) 모든 농도 조건의 AEM 하이드로젤에서 배양된 위 오가노이드가 대조군으로 이용한 매트리젤에서 배양된 오가노이드와 유사한 형태로 형성되는 것을 확인하였다.
(B) 각 AEM 농도 별로 위 오가노이드 형성 효율을 비교해 보았을 때 AEM 하이드로젤을 이용한 배양의 경우 대부분의 농도에서 매트리젤에 비해서 형성 효율이 낮지만 7 mg/mL 농도의 AEM 하이드로젤에서 다른 농도에 비해서 가장 높은 형성 효율을 보여줌을 확인하였다.
탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM) 하이드로젤의 농도에 따른 위 오가노이드 배양 양상 비교 (도 16)
탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM) 하이드로젤을 위 오가노이드 배양에 적용 시 최적의 하이드로젤 농도를 선별하기 위해 AEM 농도별로 제작된 하이드로젤에서 위 오가노이드를 배양하였다.
(A) 각 농도 별로 제작된 AEM 하이드로젤에서 5일간 배양된 위 오가노이드의 유전자 발현양을 정량적 PCR (qPCR) 분석을 통해 비교해 보았을 때, 줄기세포능과 관련된 유전자인 Lgr5와 위 조직의 특정 세포 종류에서 발현하는 유전자인 Pgc (chief cell), Gif (parietal cell) 모두 7 mg/mL 농도의 AEM 하이드로젤 그룹에서 발현이 가장 증가하는 경향을 보였다. 오가노이드 형성 효율 및 qPCR 결과를 토대로 위 오가노이드 배양을 위한 최적의 AEM 하이드로젤 농도는 7 mg/mL 조건으로 결정하였다.
(B) 마찬가지로 5일차에 AEM 하이드로젤 (7 mg/mL 농도)에서 배양된 위 오가노이드에 대한 면역염색을 통해 위 조직 세포 마커인 HK (parietal cell)와 줄기세포 증식과 관련된 KI67, 밀착 연접 (tight-junction)과 관련된 ECAD, 세포 골격 (cytoskeleton)을 이루는 F-actin 등 다양한 마커가 매트리젤에서 배양된 위 오가노이드와 마찬가지로 잘 발현됨을 확인하였다.
이러한 결과를 통해 탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM) 하이드로젤을 이용한 삼차원 배양을 통해 위 오가노이드의 형성 및 발달을 유도할 수 있음을 확인하였다.
신장 오가노이드 배양을 위한 탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM) 하이드로젤의 최적 농도 선정 (도 17)
탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM) 하이드로젤을 신장 오가노이드 배양에 적용 시 가장 최적의 농도를 선정하기 위해 AEM 농도 별로 하이드로젤을 제작하고 신장 오가노이드를 배양하였다. 마우스의 신장 tubular fragment를 추출한 뒤 각 농도의 AEM 하이드로젤에서 삼차원 배양을 진행하여 신장 오가노이드의 형성을 유도하였다. 배양 7일차에 계대 배양을 진행하고 5일동안 추가 배양하여, 총 배양 12일차에 각 AEM 농도 조건에서 형성된 신장 오가노이드의 형태와 형성 효율을 확인하였다. 매트리젤 (MAT)은 대조군으로 이용하였다.
(A) 모든 농도 조건의 AEM 하이드로젤에서 신장 오가노이드가 형성되었으나, 5 mg/mL 농도 조건에서 대조군으로 이용한 매트리젤에서 배양된 오가노이드와 가장 유사한 형태로 형성되는 것을 확인하였다.
(B) 계대배양 직후 (0일차) 및 계대배양 시점을 기준으로 5일차의 오가노이드 수를 각각 측정한 후 이를 비율로 나타내어 형성효율을 측정하였다. AEM 하이드로젤에서의 형성효율이 전반적으로 매트리젤에 비해 낮지만, 5 mg/mL 농도의 AEM 하이드로젤에서 가장 높은 형성효율을 확인하였다.
탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM) 하이드로젤의 농도에 따른 신장 오가노이드 배양 양상 비교 (도 18)
탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM) 하이드로젤을 신장 오가노이드 배양에 적용 시 최적의 하이드로젤 농도를 선별하기 위해 AEM 농도별로 제작된 하이드로젤에서 신장 오가노이드를 배양하였다. 매트리젤 (MAT)은 대조군으로 이용하였다.
(A) 각 농도 별로 제작된 AEM 하이드로젤에서 12일간 배양된 신장 오가노이드의 유전자 발현양을 정량적 PCR (qPCR) 분석을 통해 비교해 보았을 때, 신장의 특정세포에서 발현하는 유전자인 Aqp1 (proximal tubule cell)은 AEM의 농도가 증가할수록 낮아지는 경향을 보이지만 모든 농도의 AEM에서 매트리젤 그룹 보다 높은 것을 확인하였다. 또한 stemness와 관련된 Pax8 (renal progenitor cell)은 대체로 매트리젤 그룹과 유사한 발현 수준을 보이는 것으로 확인되었다. 오가노이드 형성 효율, 오가노이드 형태 및 qPCR 결과를 토대로 신장 오가노이드 배양을 위한 최적의 AEM 하이드로젤 농도는 5 mg/mL 조건으로 결정하였다.
(B) 배양 12일 차에 면역염색을 통해 마커 발현 분석을 진행해 보았을 때, AEM 하이드로젤 (5 mg/mL 농도)에서 배양된 신장 오가노이드에서 신장 특이적인 분화 마커인 CALB1 (distal tubule cell)이 대조군인 매트리젤에서 배양한 오가노이드와 비슷한 수준으로 잘 발현이 되는 것을 확인하였다. 또한, cytoskeleton 관련 F-actin 염색을 통해 AEM 하이드로젤에서 배양된 신장 오가노이드 내 세포들이 유기적으로 연결된 구조체를 형성하고 있는 것을 확인하였다.
이러한 결과를 통해 탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM) 하이드로젤을 이용한 삼차원 배양을 통해 신장 오가노이드의 형성 및 발달을 유도할 수 있음을 확인하였다.
간(담관) 오가노이드 배양을 위한 탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM) 하이드로젤의 최적 농도 선정 (도 19)
탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM) 하이드로젤을 간(담관) 오가노이드 배양에 적용 시 가장 최적의 농도를 선정하기 위해 AEM 농도 별로 하이드로젤을 제작하고 간 오가노이드를 배양하였다. 마우스의 간 조직에서 추출한 담관세포를 각 농도의 AEM 하이드로젤 내에서 삼차원 배양하여 간 오가노이드 형성을 유도하였다. 배양 7일차에 각 AEM 농도 조건에서 형성된 간 오가노이드의 형태와 형성 효율을 매트리젤 (MAT)에서 형성된 간 오가노이드와 비교하였다.
(A) 모든 농도 조건의 AEM 하이드로젤에서 배양된 간 오가노이드가 대조군으로 이용한 매트리젤에서 배양된 오가노이드와 유사한 형태로 형성되는 것을 확인하였다.
(B) 각 AEM 하이드로젤 농도별로 간 오가노이드 형성 효율을 비교해 보았을 때 AEM 하이드로젤을 이용한 배양의 경우 대부분의 농도에서 매트리젤에 비해서 형성 효율이 낮지만 3 mg/mL 농도의 AEM 하이드로젤에서 다른 농도에 비해서 가장 높은 형성 효율을 보여줌을 확인하였다.
탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM) 하이드로젤의 농도에 따른 간(담관) 오가노이드 배양 양상 비교 (도 20)
탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM) 하이드로젤을 간(담관) 오가노이드 배양에 적용 시 최적의 하이드로젤 농도를 선별하기 위해 AEM 농도별로 제작된 하이드로젤에서 간 오가노이드를 배양하였다. 매트리젤 (MAT)은 대조군으로 이용하였다.
각 농도 별로 제작된 AEM 하이드로젤에서 7일간 배양된 간 오가노이드의 유전자 발현양을 정량적 PCR (qPCR) 분석을 통해 비교해 보았을 때, 분화 관련 마커 중 담관 마커인 Krt19과 간 분화 마커인 Krt18은 7 mg/mL 농도 외에는 대조군인 매트리젤 그룹과 비슷하거나 높은 양상을 보였으며, 간 분화 마커인 Foxa3는 모두 매트리젤 그룹 보다 발현이 증가하는 경향을 보였다. 위의 결과를 토대로 간 오가노이드 배양에 최적화된 AEM 하이드로젤 농도는 3 mg/mL 조건으로 결정하였다.
이러한 결과들을 통해 탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM) 하이드로젤을 이용한 삼차원 배양을 통해 간(담관) 오가노이드의 형성 및 발달을 유도할 수 있음을 확인하였다.
식도 오가노이드 배양을 위한 탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM) 하이드로젤의 최적 농도 선정 (도 21)
탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM) 하이드로젤을 식도 오가노이드 배양에 적용 시 가장 최적의 지지체 농도를 선정하기 위해 AEM 농도 별로 하이드로젤을 제작하고 식도 오가노이드를 배양하였다.
마우스 식도 조직의 근육층을 제거한 뒤 효소 처리 과정을 통해 줄기세포를 추출하고 AEM 하이드로젤에서 배양을 시도하였다. 배양 9일차에 각 AEM 하이드로젤 농도 조건에서 형성된 식도 오가노이드의 형태를 매트리젤 (MAT)에서 형성된 식도 오가노이드와 비교하였을 때 5 mg/mL 농도 조건의 AEM 하이드로젤에서 매트리젤과 가장 유사한 형태를 가지는 식도 오가노이드가 형성됨을 확인하였다.
탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM) 하이드로젤의 농도에 따른 식도 오가노이드 배양 양상 비교 (도 22)
탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM) 하이드로젤을 식도 오가노이드 배양에 적용 시 최적의 하이드로젤 농도를 선별하기 위해 AEM 농도별로 제작된 하이드로젤에서 식도 오가노이드를 배양하였다. 매트리젤 (MAT)은 대조군으로 이용하였다.
(A) 두 가지 농도로 제작된 AEM 하이드로젤에서 9일간 배양된 식도 오가노이드의 유전자 발현양을 정량적 PCR (qPCR) 분석을 통해 비교해 보았을 때, 식도의 기저층 (basal layer)에서 발현되는 유전자인 Krt14의 발현이 모든 농도 조건의 AEM 그룹에서 대조군인 매트리젤 그룹보다 유의미하게 증가하였고 기저상층 (suprabalsal layer)에서 발현되는 Krt13과 Krt4는 5 mg/mL 농도 조건의 AEM 그룹에서 매트리젤 그룹보다 높은 발현 양상을 보였다. 이를 통해 추후 식도 오가노이드 배양을 위한 AEM 최적 농도는 5 mg/mL 조건으로 결정하였다.
(B) 배양 9일 차에 면역염색을 통해 마커 발현 분석을 진행해 보았을 때, AEM 하이드로젤 (5 mg/mL 농도)에서 배양된 식도 오가노이드에서 기저층에서 발현되는 단백질인 Cytokeratin 14 (CK14)가 대조군인 매트리젤에서 배양된 오가노이드와 비슷한 수준으로 잘 발현되는 것을 확인하였다. 또한, 기저상층에서 발현되는 단백질인 Cytokeratin 13 (CK13) 도 두 그룹에서 비슷한 수준으로 발현되는 것을 확인하였다.
이러한 결과를 통해 탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM) 하이드로젤을 이용한 삼차원 배양을 통해 식도 오가노이드의 형성 및 발달을 유도할 수 있음을 확인하였다.
탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM) 하이드로젤을 이용한 장(대장) 오가노이드 배양 (도 23)
탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM) 하이드로젤에 대장 오가노이드를 배양하였다. 마우스의 대장을 수득해 크립트 (crpyt)를 분리하여 대장 줄기세포를 얻고, 이를 매트리젤과 5 mg/mL 농도의 AEM 하이드로젤에서 3차원 배양하여 대장 오가노이드 형성을 유도하였다. 배양 7일차에 매트리젤과 AEM 하이드로젤에서 형성된 오가노이드의 형태를 비교하였다.
AEM 하이드로젤에서 배양된 대장 오가노이드가 대조군으로 적용한 매트리젤에서 배양된 대장 오가노이드와 유사한 형태로 형성되는 것을 확인하였다.
이러한 결과를 통해 탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM) 하이드로젤을 이용한 삼차원 배양을 통해 장(대장) 오가노이드의 형성 및 발달을 유도할 수 있음을 확인하였다.
인간 유도만능줄기세포 (Human-induced Pluripotent Stem Cell; hiPSC) 유래 간 오가노이드 배양을 위한 탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM) 하이드로젤의 최적 농도 선정 (도 24)
탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM) 하이드로젤을 인간 유도만능줄기세포 (Human-induced Pluripotent Stem Cell; hiPSC) 유래 간 오가노이드 배양에 적용 시 가장 최적의 지지체 농도를 선정하기 위해 AEM 농도 별로 하이드로젤을 제작하고 hiPSC 유래 간 오가노이드를 배양하였다.
인간 유도만능줄기세포로부터 간 오가노이드 형성을 위해 필요한 세포 (인간 유도만능줄기세포 유래 간 내배엽 세포, 혈관내피세포, 중간엽줄기세포)를 10:7:2의 비율로 맞추어 AEM 하이드로젤 내에 배양을 진행하였다. 24시간 내 세포들이 뭉치면서 간 오가노이드가 형성되고 3일이 지나면 오가노이드가 더욱 단단하게 응축되면서 뭉치면서 자라게 되었다.
오가노이드 형태 및 모양을 분석했을 때 5 mg/mL 및 7 mg/mL 농도의 AEM 하이드로젤 지지체에서 배양된 hiPSC 유래 간 오가노이드가 대조군으로 적용한 매트리젤에서 배양된 hiPSC 유래 간 오가노이드와 가장 유사한 형태로 성장하는 것을 확인하였다.
탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM) 하이드로젤의 농도에 따른 인간 유도만능줄기세포 (Human-induced Pluripotent Stem Cell; hiPSC) 유래 간 오가노이드 배양 양상 비교 (도 25)
두가지 농도로 제작된 AEM 하이드로젤에서 5일간 배양된 인간 유도만능줄기세포 (hiPSC) 유래 간 오가노이드의 유전자 발현양을 정량적 PCR (qPCR) 분석을 통해 비교해 보았을 때, 간 분화 관련 마커 (early hepatocyte marker)인 Afp 발현은 매트리젤에서 배양된 간 오가노이드와 비교하여 통계적으로 비슷한 수준을 보이는 반면 Hnf4a 발현은 AEM 하이드로젤 그룹에서 더 높은 것을 확인하였다. 또다른 간 분화 관련 마커 (mature hepatocyte marker)인 Alb 발현 또한 매트리젤 그룹과 비슷한 수준을 보이는 것을 확인하였으며, 혈관 관련 마커인 Pecam1은 AEM 하이드로젤에서 배양된 오가노이드에서 높은 발현율을 보였다.
따라서 오가노이드의 형태 및 qPCR 결과를 토대로 hiPSC 유래 간 오가노이드 배양을 위한 최적의 AEM 하이드로젤 농도는 7 mg/mL 조건으로 결정하였다.
이러한 결과를 통해 탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM) 하이드로젤을 이용한 삼차원 배양을 통해 매트리젤과 유사한 수준으로 인간 유도만능줄기세포 (Human-induced Pluripotent Stem Cell; hiPSC) 유래 간 오가노이드의 형성 및 발달을 유도할 수 있음을 검증하였다.
탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM) 하이드로젤을 이용한 심장 오가노이드 배양 (도 26)
탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM) 하이드로젤에 인간 유도만능줄기세포 (Human-induced Pluripotent Stem Cell; hiPSC) 유래의 심근세포 (cardiomyocyte)를 삼차원 배양하여 심장 오가노이드를 제작하였다. 이를 위해 3Х105 심근세포를 7 mg/mL 농도의 15 μL AEM 하이드로젤 내에 캡슐화하여 이틀간 배양하였다.
(A) 그 결과 배양 2일만에 AEM 하이드로젤의 수축과 함께 크기가 작아지며 심근세포가 구조화된 심장 오가노이드를 형성하는 것을 확인하였다.
(B) 형성된 심장 오가노이드는 심근세포간의 상호작용으로 서로 강하게 접합된 조직과 같은 구조를 지니고 있음을 확인하였다.
탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM) 하이드로젤에서 제작된 심장 오가노이드의 기능성 분석 (도 27)
탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM) 하이드로젤에서 제작된 인간 유도만능줄기세포 (hiPSC) 유래 심장 오가노이드의 자발적인 수축 활동에 대해 분석하였다.
(A) 15초 동안 심장 오가노이드의 자발적인 박동 세기 및 (B) 박동 속도에 대한 정량 분석을 진행하였을 때 규칙적인 박동을 보여주는 것을 확인하였다.
(C) 심근조직의 주요 기능인 수축 관련 분석을 위해 최고 피크 도달 시간, 완화 시간, 수축 지속 시간, 심박동 간격에 대한 정량 분석을 진행하였을 때 AEM 하이드로젤에서 제작된 심장 오가노이드가 이러한 심장 조직과 유사한 기능들을 잘 구현하는 것을 확인하였다.
이러한 결과를 통해 탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM) 하이드로젤을 이용한 삼차원 배양을 통해 인간 유도만능줄기세포 (hiPSC) 유래 심장 오가노이드의 형성 및 기능적인 발달을 유도할 수 있음을 검증하였다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
Claims (8)
- 지방 조직 유래 세포외기질 (Adipose Extracellular Matrix; AEM)을 포함한 오가노이드 배양 및 이식용 지지체.
- 제1항에 있어서,
상기 지방 조직 유래 세포외기질은 Triton X-100 및 수산화암모늄을 혼합한 용액을 이용하여 제조된 것인, 지지체.
- 제1항에 있어서,
상기 지지체 내 상기 지방 조직 유래 세포외기질의 농도는 1 mg/mL 내지 10 mg/mL인, 지지체.
- 1) 분리된 지방 조직을 파쇄하는 단계; 및
2) 상기 파쇄된 지방 조직에 Triton X-100 및 수산화암모늄을 처리하여 탈세포하여 탈세포된 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM)을 제조하는 단계
를 포함하는 오가노이드 배양 및 이식용 지지체 제조방법.
- 제4항에 있어서,
상기 2) 단계 이후 3) 상기 탈세포 지방 조직 유래 세포외기질 (AEM)을 동결건조 하여 동결건조 지방 조직 유래 세포외기질을 제조하는 단계를 더 포함하는 오가노이드 배양 및 이식용 지지체 제조방법.
- 제5항에 있어서,
상기 3) 단계 이후 4) 상기 동결건조 지방 조직 유래 세포외기질을 하이드로젤 형태의 오가노이드 배양 및 이식용 지지체로 형성하는 단계를 더 포함하는 오가노이드 배양 및 이식용 지지체 제조방법.
- 제 6항에 있어서,
상기 4) 단계는 상기 동결건조 지방 조직 유래 세포외기질을 펩신 용액에 용해시켜 용액화 한 뒤 pH를 조정하여 하이드로젤화 하는 것인 오가노이드 배양 및 이식용 지지체 제조방법.
- 제1항의 지지체 또는 제4항의 제조방법에 의해 제조된 지지체에서 오가노이드를 배양하는 방법.
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020220003802A KR20220102581A (ko) | 2021-01-11 | 2022-01-11 | 오가노이드 배양을 위한 탈세포 지방 조직 유래 지지체 및 이의 제조방법 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP4261273A1 (ko) |
| KR (1) | KR20220102581A (ko) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20200034496A (ko) | 2018-09-21 | 2020-03-31 | 오가노이드사이언스 주식회사 | 간 유래 줄기세포를 포함하는 간 오가노이드의 제조방법 및 이의 용도 |
-
2022
- 2022-01-11 EP EP22736921.2A patent/EP4261273A1/en active Pending
- 2022-01-11 KR KR1020220003802A patent/KR20220102581A/ko unknown
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20200034496A (ko) | 2018-09-21 | 2020-03-31 | 오가노이드사이언스 주식회사 | 간 유래 줄기세포를 포함하는 간 오가노이드의 제조방법 및 이의 용도 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP4261273A1 (en) | 2023-10-18 |
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