KR102577231B1 - 장 오가노이드 배양 및 이식을 위한 탈세포 장 조직 유래 지지체 및 이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 탈세포 장 조직(Intestinal Extracellular Matrix; IEM)을 이용한 장 오가노이드 배양 및 이식용 지지체에 관한 것이다.

Description

장 오가노이드 배양 및 이식을 위한 탈세포 장 조직 유래 지지체 및 이의 제조방법{INTESTINAL EXTRACELLULAR MATRIX-DERIVED SCAFFOLD FOR CULTURE AND TRANSPLANTATION OF INTESTINAL ORGANOID AND PREPARING METHOD THEREOF}

본 발명은 장 오가노이드 배양 및 이식을 위한 탈세포 장 조직 유래 지지체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

줄기세포 기반의 장 오가노이드는 지금까지 구축된 체외 모델 중 인체의 장 조직 구성 및 기능을 가장 효과적으로 구현할 수 있는 모델로서 질환 모델, 신약 개발, 이식 치료 등에 활용될 수 있는 무궁한 잠재력을 가지기 때문에 효율적인 3차원 오가노이드 제작, 배양 및 이식 기술에 대한 많은 관심이 집중되고 있다.

대부분의 장 오가노이드 연구들은 매트리젤(Matrigel)이라는 생쥐의 육종암(sarcoma)에서 추출한 천연 고분자 물질을 기반으로 한 배양 지지체를 이용하고 있다. 매트리젤은 풍부한 세포외기질 성분을 함유하고 있어 다양한 종류의 조직 오가노이드가 성장할 수 있지만 배양 시 조직 특이적 미세환경을 제대로 제공해 주지 못한다는 한계가 있다.

실제 체내에서 장 줄기세포는 조직 특이적인 세포외액(tissue-specific extracellular fluid) 및 조직 특이적인 세포외기질(tissue-specific extracellular matrix)과 끊임없이 상호 작용을 하면서 성장하고 변화한다. 이러한 줄기세포를 이용하여 장 오가노이드를 제작할 때 장 조직 배양액을 통해 조직 특이적인 세포외액 환경을 모사하는 배양 프로토콜은 비교적 정립이 되어 있으나 현재까지도 조직 특이적인 세포외기질 환경을 제공해줄 수 있는 방법에 대해서는 연구가 미미하며 장 오가노이드 배양을 위해 여전히 매트리젤에만 의존하고 있다. 따라서 매트리젤에서 배양된 장 오가노이드는 장 조직 특이적 세포외기질 환경의 부재로 인해 구조와 기능의 발달 및 성숙을 더욱 증진시켜야 할 필요성이 있다.

또한, 매트리젤은 쥐의 육종암에서 추출한 물질이기 때문에 여기서 배양된 오가노이드의 이식 치료 시 동물성 병원균 및 바이러스의 감염, 전이 가능성이 있으며 심각한 면역 반응을 유발할 수 있는 위험성이 있어 오가노이드 이식 등 세포 치료 및 조직재생을 위한 임상 연구에 적용이 어렵다. 또한, 매트리젤은 고가의 제품으로 단가가 높기 때문에 신약 개발을 위한 오가노이드 기반 약물 스크리닝 등 대량으로 배양 지지체가 필요한 경우 활용하기 어렵다. 따라서 현재 매트리젤 의존적 장 오가노이드 배양 방식으로 인해 장 오가노이드의 기초 연구 및 응용 연구가 크게 제한되고 있는 실정이다.

이를 해결하기 위해, 본 발명에서는 돼지 소장을 탈세포하여 장 조직 특이적 세포외기질의 고유한 성분과 특징을 보유한 장 조직 모사 인공 지지체를 개발하였다. 탈세포 장 조직 유래의 하이드로젤 지지체를 이용한 삼차원 장 오가노이드 배양을 통해 장 오가노이드 증식 및 안정적인 유지가 가능하였으며 오가노이드의 분화, 발달 및 기능이 증진됨을 확인하였다.

본 발명에서 개발된 지지체는 돼지 소장에서 세포 성분은 모두 제거된 순수한 장 조직 특이적 세포외기질 성분만을 이용하기 때문에 기존의 오가노이드 배양 지지체인 매트리젤이 가지고 있는 조직 특이성 결여 문제, 감염 및 면역 반응 유발 위험성 등의 문제점을 해결할 수 있다. 돼지 소장 조직은 고가의 매트리젤과 비교해서도 경제성 측면에서도 매우 유리하다.

대한민국 공개특허공보 제10-2017-0143465호

본 발명은 장 조직의 탈세포 공정을 통해 세포를 제거하고 장 조직 특이적 세포외기질만을 그대로 보존하여, 이를 장 오가노이드의 효과적인 삼차원 배양을 위한 인공 지지체로 이용하기 위한 것이다.

그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

이하에서는 첨부한 도면을 참조하여 본 발명을 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 따라서 여기에서 설명하는 실시예로 한정되는 것은 아니다. 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 구비할 수 있다는 것을 의미한다.

달리 정의되지 않는 한, 분자 생물학, 미생물학, 단백질 정제, 단백질 공학, 및 DNA 서열 분석 및 당업자의 능력 범위 안에서 재조합 DNA 분야에서 흔히 사용되는 통상적인 기술에 의해 수행될 수 있다. 상기 기술들은 당업자에게 알려져 있고, 많은 표준화된 교재 및 참고저서에 기술되어 있다.

본 명세서에 달리 정의되어 있지 않으면, 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 당업계에 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 바와 같은 의미를 가진다.

본 명세서에 포함되는 용어를 포함하는 다양한 과학적 사전이 잘 알려져 있고, 당업계에서 이용가능하다. 본 명세서에 설명된 것과 유사 또는 등가인 임의의 방법 및 물질이 본원의 실행 또는 시험에 사용되는 것으로 발견되나, 몇몇 방법 및 물질이 설명되어 있다. 당업자가 사용하는 맥락에 따라, 다양하게 사용될 수 있기 때문에, 특정 방법학, 프로토콜 및 시약으로 본 발명이 제한되는 것은 아니다. 이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명의 일 양상은 탈세포 장 조직 유래 세포외기질 (Intestinal Extracellular Matrix; IEM)을 포함한 지지체 조성물을 제공한다.

상기 “세포외기질(extracellular matrix)”은 포유류 및 다세포 생물(multicellular organisms)에서 발견된 조직의 탈세포화를 통해 제조된 세포 성장용 자연 지지체를 의미한다. 상기 세포외기질은 투석 또는 가교화를 통해 더 처리할 수 있다.

상기 세포외기질은 콜라겐(Collagen), 엘라스틴(elastins), 라미닌(laminins), 글리코스아미노글리칸(glycosaminoglycans), 프로테오글리칸(proteoglycans), 항균제(antimicrobials), 화학유인물질(chemoattractants), 시토카인(cytokines), 및 성장 인자에 제한되지 않는, 구조형 및 비구조형 생체 분자(biomolecules)의 혼합물일 수 있다.

상기 세포외기질은 포유 동물에 있어서 다양한 형태로서 약 90%의 콜라겐을 포함할 수 있다. 다양한 생체 조직에서 유래한 세포외기질은 각각의 조직에 필요한 고유 역할 때문에 전체 구조체 및 조성이 상이할 수 있으며, 본 발명의 일 구체예로, 상기 장 조직은 돼지 장의 모든 점막층, 더욱 구제척으로 돼지 소장 및/또는 대장의 모든 점막층일 수 있다. 이는, 돼지 소장 점막하층만을 사용할 수밖에 없던 종래 기술에 비하여 개선된 점으로, 원료가 비제한적으로 사용되기 때문에 제조 편의성이 증가하고, 제조된 지지체 조성물이 기존 공정보다 더 풍부한 세포외기질 단백질을 보유할 수 있다.

상기 “유래(derive)", "유래된(derived)"은 유용한 방법에 의해 언급한 원천으로부터 수득한 성분을 의미한다.

또한, 본 발명의 일 구체예로, 상기 탈세포 장 조직 유래 세포외기질은 0.01 내지 10 mg/mL, 구체적으로 0.5 내지 8mg/mL 더욱 구제척으로 1mg/mL 내지 5mg/mL, 가장 구체적으로는 1, 2, 3, 4 또는 5mg/mL, 최적화된 구체예로는 2mg/mL로 포함하는 것일 수 있다. 상기 범위 외의 농도로 포함될 경우, 본 발명이 목적하는 효과를 얻을 수 없거나, 제조 또는 활용에 있어서 부적합할 수 있다.

본 발명의 일 구체예로, 상기 조성물은 0.1 내지 1Hz 기준 탄성계수가 1 내지 80 Pa일 수 있고, 상기 조성물이 상기 범위의 탄성계수를 가짐으로써 안정적인 고분자 네트워크를 형성할 수 있다.

상기 지지체 조성물은 탈세포화하여 수득한 장 조직 매트릭스 조성물을 기반으로 제조한 3차원 하이드로젤을 포함하며, 장 오가노이드 배양에 효과적으로 활용될 수 있다.

상기 탈세포화된 장 조직은 실제 조직 특이적 세포외기질 성분을 포함하므로 해당 조직의 물리적, 기계적, 생화학적 환경을 제공할 수 있으며, 장 조직 세포로의 분화 및 조직 특이적 기능성을 증진시키는데 매우 효율적이다.

상기 “오가노이드(organoid)”는 조직 내 성체줄기세포 또는 전분화능줄기세포에서 분화된 세포를 3D 형태로 배양하여 인공장기와 같은 형태로 제작한 초소형 생체기관을 의미한다.

상기 오가노이드는 줄기세포에서 발생하고 생체 내 상태와 유사한 방식으로 자가-조직화(또는 자가-패턴화)하는 장기 특이적 세포를 포함한 삼차원 조직 유사체로서 제한된 요소(Ex. growth factor) 패터닝에 의해 특정 조직으로 발달할 수 있다.

상기 오가노이드는 세포의 본래 생리학적 특성을 가지며, 세포 혼합물(한정된 세포 유형뿐만 아니라 잔존 줄기 세포, 근접 생리학적 니치(physiological niche)를 모두 포함) 원래의 상태를 모방하는 해부학적 구조를 가질 수 있다. 상기 오가노이드는 3차원 배양 방법을 통해 세포와 세포의 기능이 더욱 잘 배열되고, 기능성을 가지는 기관 같은 형태와 조직 특이적 기능을 가질 수 있다.

본 발명의 다른 일 양상은 (a) 분리된 장 조직을 탈세포화하여 탈세포된 장 조직을 제조하는 단계; (b) 상기 탈세포된 장 조직을 건조하여 탈세포 장 조직 유래 세포외기질 (Intestinal Extracellular Matrix; IEM)을 제조하는 단계; 및 (c) 상기 건조된 탈세포 장 조직 유래 세포외기질을 겔화(gelation)하는 단계; 를 포함하는 지지체 조성물 제조방법을 제공한다.

상기 (a) 단계는 분리된 장 조직을 탈세포화하여 탈세포된 장 조직을 제조하는 단계이다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 (a) 단계에서 상기 장 조직은 돼지 장의 모든 점막층, 더욱 구체적으로 돼지 소장 및/또는 대장의 모든 점막층일 수 있다. 전술한 바와 같이 돼지 소장 점막하층만을 사용할 수에 없던 종래 기술에 비하여 개선된 점으로, 원료가 비제한적으로 사용되기 때문에 제조 편의성이 증가하고, 제조된 지지체 조성물이 기존 공정보다 더 풍부한 세포외기질 단백질을 보유할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 (a) 단계에서 상기 장 조직을 탈세포화 용액에서 교반시키는 것일 수 있다.

상기 탈세포와 용액은 장 조직에서 세포를 제거하기 위한 다양한 성분을 포함할 수 있고, 예컨대, 고장성 식염수(hypertonic saline), 과산화 아세트산(peracetic acid), 트리톤 X-100 (Triton X-100), SDS 또는 기타 세제 성분을 포함할 수 있으나, 본 발명의 일 구체예에서 상기 탈세포화 용액은 0.1 내지 5%의 Triton X-100 및 0.01 내지 0.5% 수산화 암모늄, 더욱 구체적으로는 1% Triton X-100 및 0.1% 수산화 암모늄(ammonium hydroxide)을 포함하는 것일 수 있다. 상기와 같은 탈세포화 용액을 사용함으로써, 기존의 공정에 비하여 완화된 조건에서 탈세포를 진행할 수 있어 제조된 지지체 내 DNA를 효과적으로 제거함과 동시에 장 조직 내의 다양한 단백질들이 더 많이 보존될 수 있다.

상기 교반은 24 내지 72시간, 더욱 구체적으로 36 내지 60시간, 가장 구체적으로는 44 내지 52시간, 일 예시로 48시간 동안 이루어지는 것일 수 있고, 이러한 교반 (탈세포) 과정을 통해 장 조직 세포가 95 내지 99.9%, 더욱 구체적으로 96 내지 98%, 가장 구체적으로는 97.68%가 제거된 것일 수 있다. 상기 범위 외의 시간으로 탈세포가 이루어질 경우 제조된 지지체 조성물의 품질이 저하되거나 공정 경제성이 떨어지는 문제점이 있다.

상기 (b) 단계는 상기 탈세포된 장 조직을 건조하여 탈세포 장 조직 유래세포외기질(Intestinal Extracellular Matrix; IEM)을 제조하는 단계이다.

상기 탈세포된 장 조직을 건조하는 방법은 공지의 방법으로 수행될 수 있으며, 자연건조 또는 동결 건조될 수 있고, 멸균을 위해 건조 후 전자 빔 또는 감마 방사선에 의해 에틸렌 옥사이드 가스 또는 초임계 이산화탄소에 노출시킬 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 (b) 단계 이후, 탈세포 장 조직 유래 세포외기질은 0.01 내지 10 mg/mL, 구체적으로 0.5 내지 8mg/mL 더욱 구제척으로 1mg/mL 내지 5mg/mL, 가장 구체적으로는 1, 2, 3, 4 또는 5mg/mL, 최적화된 구체예로는 2mg/mL로 포함하도록 조절하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 범위 외의 농도로 포함될 경우, 본 발명이 목적하는 효과를 얻을 수 없거나, 제조 또는 활용에 있어서 부적합할 수 있다.

상기 건조된 세포외기질은 박리(tearing), 제분(milling), 절단, 분쇄 및 전단 단계를 포함하는 방법에 의해 세분될 수 있다. 상기 세분된 세포외기질은 냉동 상태 또는 냉동 건조 상태에서, 분쇄 또는 제분과 같은 방법에 의해 분말 형상으로 가공될 수 있다.

상기 (c) 단계는 상기 건조된 탈세포 장 조직 유래 세포외기질을 겔화(gelation)하는 단계이다.

상기 겔화를 통해 탈세포 장 조직 유래 세포외기질을 가교시켜 3차원 하이드로젤 형태의 지지체를 제작할 수 있고, 겔화된 지지체는 실험, 스크리닝 뿐만 아니라 오가노이드 배양과 관련된 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.

상기 “하이드로젤”은 졸-겔 상변이를 통해 물을 분산매로 하는 액체가 굳어 유동성을 상실하고 다공성 구조를 이루는 물질로서, 3차원 망목 구조와 미결정 구조를 갖는 친수성 고분자가 물을 함유하여 팽창함으로써 형성될 수 있다.

상기 겔화는 탈세포 장 조직 유래 세포외기질을 산성 용액에서 펩신 또는 트립신과 같은 단백질 분해 효소로 용액화하고, 물: IEM 용액 : PBS 버퍼 : NaOH를 69: 20: 10: 1 비율로 혼합하고 균일하게 섞은 후 37℃의 온도에서 30분 동안 이루어지는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 일 양상은 상기 지지체 조성물 또는 상기 제조방법에 의해 제조된 지지체 조성물에서 장 오가노이드를 배양하는 방법을 제공한다.

기존의 매트리겔 기반 배양 시스템은 동물 암조직 유래의 추출물로서 배치 간의 차이가 크고 실제 장의 환경을 모사해주지 못하고, 장 오가노이드로 분화, 발달되는 효율이 미흡한 반면, 상기 지지체 조성물은 장 조직 유사 환경을 조성할 수 있으므로 장 오가노이드 배양에 있어서 적합하다.

상기 배양은 적합한 조건에서 세포를 유지 및 성장시키는 과정을 의미하며, 적합한 조건은 예컨대, 세포가 유지되는 온도, 영양소 가용성, 대기 CO2 함량 및 세포 밀도를 의미할 수 있다.

서로 다른 유형의 세포를 유지, 증식, 확대 및 분화시키기 위한 적절한 배양 조건은 당해 기술분야에 공지되어 있고, 문서화 되어있다. 상기 오가노이드 형성에 적합한 조건은 세포 분화 및 다세포 구조의 형성을 용이하게 하거나 허용하는 조건일 수 있다.

본 발명에서 개발된 탈세포 장 조직 유래 인공 지지체는 기존의 대표적인 오가노이드 배양용 지지체인 매트리젤이 가지고 있는 한계를 극복한 새로운 장 오가노이드 배양 지지체로서 개발되어, 장 오가노이드 기반의 대규모 신약 스크리닝 플랫폼이나 조직 재생을 위한 세포 치료제 등 다양한 전임상, 임상 연구의 요소 기술로 활용되어 산업적, 경제적 측면에서 고부가가치를 창출하고 의료 신산업의 발전을 도모할 수 있을 것으로 기대된다.

탈세포 장 조직 유래 인공 매트릭스 지지체는 다양한 난치성 장질환 (염증성 장질환, 크론병, 대장암 등)을 체외에서 구현하고 그 기전을 밝히는 질병 모델링 연구 및 이식 치료 플랫폼 구축 등 다양한 분야에서 광범위하게 이용 가능할 것으로 기대된다. 이러한 난치성 장질환은 최근 유병률이 크게 증가하여 많은 연구가 필요한 상황이므로 연구용 시약으로서도 수익 창출이 가능하다. 또한, 장 조직 특이적 세포외기질 미세환경 내에서 장 오가노이드와 장내 미생물 공배양과 연계하여 최근 크게 각광받고 있으나 실질적인 연구가 어려웠던 마이크로바이옴 연구에도 활용될 수 있으므로 무궁한 응용 가능성을 가질 것으로 기대한다.

본 발명에서 개발된 인공 지지체는 인간 유도만능줄기세포 및 배아줄기세포 유래 장 오가노이드와 대장암 유래 3차원 스페로이드 배양에도 적용이 가능하므로 난치성 질환 및 암 환자 맞춤형 질환 모델 구축에 기여하여 정밀의학 플랫폼 기술로서도 활용될 수 있으며 최근 급증하는 정밀의학 시장의 규모를 고려하면 막대한 부가가치 창출이 가능할 것으로 기대된다.

종합적으로 위에서 기술했듯이 장 오가노이드의 응용을 위해서는 기본적으로 매트리젤이라는 배양용 지지체가 필수적으로 요구된다. 매트리젤과 비교하여 본 발명에서 개발된 인공 지지체는 배양 시스템으로서 매트리젤 이상의 기능성을 보여주며 보다 안전하고 비용적인 측면에서도 매우 유리한 장점을 가지고 있음이 검증된다. 기존의 상용화된 매트리젤 배양 지지체와는 달리 사람에게 이식이 가능한 GMP 수준의 제품화가 가능하다. 따라서 이러한 매트리젤 대체 효과로 인한 막대한 경제적 수익 창출이 예측된다.

도 1은 탈세포 장 조직 유래 인공 지지체 제작 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 탈세포 장 조직 유래 하이드로젤 지지체 제작 및 미세구조를 분석한 것이다.
도 3은 탈세포 장 조직 유래 인공 지지체의 성분을 분석한 것이다.
도 4는 본 발명의 탈세포 프로토콜과 기존 프로토콜을 비교한 결과로, 매트릭스 성분 및 물성을 비교한 것이다.
도 5는 본 발명의 탈세포 프로토콜과 기존 프로토콜을 비교한 결과로, 매트릭스 성분 및 물성을 비교한 것이다.
도 6는 본 발명의 탈세포 프로토콜과 기존 프로토콜을 비교한 결과로, 오가노이드 배양 양상을 비교한 것이다.
도 7은 본 발명의 지지체 조성물과 기존 배양 지지체 (매트리젤)의 단백체를 비교 분석한 것이다.
도 8은 본 발명의 지지체 조성물과 기존 배양 지지체 (매트리젤)의 단백체를 비교 분석한 것이다.
도 9는 본 발명의 지지체 조성물과 기존 배양 지지체 (매트리젤)의 단백체를 비교 분석한 것이다.
도 10은 탈세포 장 조직 유래 하이드로젤 지지체의 물성을 분석한 것이다.
도 11은 장 오가노이드 배양을 위한 탈세포 장 조직 유래 하이드로젤 지지체의 최적 농도 결정을 나타낸 것이다.
도 12는 탈세포 장 조직 유래 하이드로젤 지지체에서 배양된 장 오가노이드의 성장 양상을 확인한 것이다.
도 13은 탈세포 장 조직 유래 하이드로젤 지지체에서 배양된 장 오가노이드의 줄기세포 및 분화 마커 발현을 분석한 것이다 (세포 면역염색 분석).
도 14는 탈세포 장 조직 유래 하이드로젤 지지체에서 배양된 장 오가노이드의 줄기세포 및 분화 마커 발현 분석을 분석한 것이다 (정량적 PCR을 통한 유전자 발현 분석).
도 15는 탈세포 장 조직 유래 하이드로젤 지지체에서 배양된 장 오가노이드의 기능성을 검증한 것이다.
도 16은 탈세포 장 조직 유래 하이드로젤 지지체에서 배양된 장 오가노이드의 유전자 발현 프로파일을 분석한 것이다 (RNA-sequencing 분석).
도 17은 탈세포 장 조직 유래 하이드로젤 지지체에서 배양된 장 오가노이드의 유전자 발현 프로파일을 분석한 것이다 (RNA-sequencing 분석).
도 18은 탈세포 장 조직 유래 세포외기질 지지체의 조직 특이적 효과로서 장 오가노이드의 생존 및 발달을 분석한 결과이다.
도 19는 탈세포 조직 유래 지지체의 조직 특이적 세포외기질 성분을 비교 분석한 결과이다.
도 20은 탈세포 장 조직 유래 지지체의 조직 연령에 따른 오가노이드 배양 양상 및 세포외기질을 비교 분석한 결과이다.
도 21은 탈세포 장 조직 유래 하이드로젤 지지체의 장 오가노이드 장기 배양 유지 능력을 검증한 것이다.
도 22는 탈세포 장 조직 유래 생체 모사 인공 지지체의 장기간 냉동보관 가능성을 검증한 것이다.
도 23은 탈세포 장 조직 유래 생체 모사 인공 지지체의 장기간 냉장보관 가능성을 검증한 것이다.
도 24은 장 오가노이드의 생체 내 이식을 위한 지지체로서 탈세포 장 조직 유래 하이드로젤의 적용을 나타낸 것이다.
도 25 및 26은 탈세포 장 조직 유래 하이드로젤을 이용한 장 오가노이드 생체 내 이식 및 생착 유도를 나타낸 것이다.
도 27은 탈세포 장 조직 유래 하이드로젤 지지체에서 인간 유도만능줄기세포 및 배아줄기세포 유래 장 오가노이드 배양 가능성을 확인한 것이다.
도 28은 탈세포 장 조직 유래 하이드로젤 지지체에서의 대장암 유래 3차원 오가노이드 형성 및 배양을 나타낸 것이다.
도 29는 탈세포 장 조직 유래 하이드로젤 지지체를 이용한 오가노이드 동결 보관 가능성을 확인한 결과이다.
도 30은 탈세포 장 조직 유래 하이드로젤 지지체와 미세유체 칩을 이용한 장 오가노이드 대량 배양 가능성을 확인한 결과이다.

본 발명은 장 조직의 탈세포 공정을 통해 세포를 제거하고 장 조직 특이적 세포외기질만을 그대로 보존하여, 이를 장 오가노이드의 효과적인 삼차원 배양을 위한 인공 지지체로 이용하는 기술에 관한 것으로 개발된 탈세포 장조직 매트릭스 기반 하이드로젤은 매트리젤 대체재로서의 가능성을 보여준다.

본 발명의 인공 지지체는 세포 항원이 제거된 순수 세포외기질 성분으로 구성되어 있기 때문에, 이식 시 조직의 염증 반응 및 면역 거부 반응을 야기하지 않고 생체적합성이 우수하며 단가가 저렴하다. 따라서 오가노이드 배양 및 이식 치료에 있어 안전성 및 경제성을 크게 향상시킬 수 있다. 또한, 기존의 상용화된 오가노이드 배양 지지체인 매트리젤과 비교하였을 때, 오가노이드 성장을 위한 조직 특이적 미세환경을 제공해 주기 때문에 오가노이드의 분화, 발달 및 기능을 크게 증진시킬 수 있다. 즉 오가노이드의 고도화에 적합한 배양 시스템을 제공할 수 있다.

탈세포화 장 조직 유래 인공 지지체는 다양한 농도로 제작 및 적용이 가능하며, 각각의 농도에서 모두 장 오가노이드가 형성되고 장 조직을 구성하는 다양한 세포들이 발달될 수 있음을 확인하였다.

또한, 매트리젤 배양과 비교해보았을 때, 탈세포 장 조직 유래 하이드로젤 지지체에서 배양된 장 오가노이드가 형성 효율, 성장 속도, 크기, 세포 발달 및 기능성 측면에서 매트리젤에서 배양된 오가노이드와 유사한 양상을 보였다. 이를 통해, 본 발명에서 개발된 지지체가 매트리젤을 대체할 수 있는 능력을 보유하고 있음을 확인하였다.

장 오가노이드 배양에 있어 다른 종류의 조직(심장, 피부, 림프, 위, 근육)들을 탈세포하여 제작한 인공 매트릭스 지지체와 비교하였을 때 장 조직 유래 지지체가 가장 우수한 효능을 가지고 있음을 확인하였다. 이는 탈세포 기술을 통해 오가노이드 배양을 위한 조직 특이적 매트릭스를 개발해야 하는 중요성에 대해서 시사하는 결과이다. 장 조직 특이적 세포외기질 성분을 보유하고 있는 지지체는 장 오가노이드 배양에 최적화된 미세환경을 제공해 줌을 알 수 있었다.

본 발명의 탈세포 장 조직 지지체를 이용하면 장 오가노이드의 장기 계대 배양이 가능하다. 장기 배양 기간 동안에서도 장 줄기세포 특징 및 분화도가 매트리젤과 유사한 수준으로 일정하게 유지됨을 통해 개발된 지지체가 장 오가노이드의 안정적인 장기 배양을 유지시켜줄 수 있는 효과적인 배양 시스템임을 확인하였다. 또한, 탈세포 장 조직 유래 하이드로젤 용액의 장기간 냉동 (3달 이상) 및 냉장 (1달 이상) 보관 후 사용하였을 때에도 장 오가노이드 배양에 문제없이 사용이 가능함을 확인하여 사용 중 장기간 보관이 가능한 사용자의 편의성이 높은 제품으로 개발 가능하다.

본 발명의 탈세포 장 조직 유래 하이드로젤 지지체는 배양 시스템뿐만 아니라 오가노이드의 생체 내 전달을 위한 이식용 소재로서 적용이 가능하다. 실제로 동물실험을 통해 장 손상 부위 내로 오가노이드 이식 및 생착 유도에 효과적임을 확인하였다. 장 조직 유래의 성체줄기세포 외에도 다양한 줄기세포 (예; 인간 유도만능줄기세포, 배아줄기세포) 유래 장 오가노이드 및 대장암 유래 3차원 스페로이드 배양에도 성공적으로 적용이 가능함을 확인하여 다양한 질환 모델을 구현할 수 있는 체외 모델 시스템을 제공할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 탈세포 장 조직 유래 세포외기질을 포함한 지지체 조성물의 제조

탈세포 장 조직 유래 세포외기질을 포함한 지지체 조성물을 다음과 같이 제조하였다 (도 1 참고).

실시예 1-1. 탈세포 장 조직 유래 세포외기질 (Intestinal Extracellular Matrix; IEM)의 제조

돼지 소장의 모든 점막층을 준비하였고, 상기 장 조직을 1% Triton X-100 및 0.1% 수산화 암모늄(ammonium hydroxide)과 함께 48시간 교반하여 장 조직의 세포만을 제거하여 탈세포 장 조직을 제조하였다.

이후, 탈세포 장 조직을 동결건조, 분쇄하여 탈세포 장 조직 유래 세포외기질 (Intestinal Extracellular Matrix; IEM)을 제조하였다.

실시예 1-2. 지지체 조성물의 제조

상기 탈세포 장 조직 유래 세포외기질 10 mg을 4 mg/ml 펩신 용액 (돼지 위점막 유래 펩신 파우더 4 mg를 0.02 M HCl 1 ml에 녹인 용액)에 48시간 동안 용해시켰다. 물: IEM 용액 : PBS 버퍼 : NaOH를 69: 20: 10: 1 비율로 혼합하고 균일하게 섞은 후 37℃의 온도에서 30분 동안 겔화(gelation)시켜 하이드로젤 형태의 지지체 조성물을 제조하였다.

실험예 1: 탈세포 장 조직 유래 세포외기질의 분석

실시예 1-1.의 탈세포 장 조직 유래 세포외기질을 아래와 같이 분석하였다.

실험예 1-1. 탈세포 장 조직 유래 세포외기질의 탈세포 수준 확인 등

실시예 1-1.에서 제조된 탈세포 장 조직 유래 세포외기질의 탈세포 수준 및 하이드로젤의 형성여부를 확인하였다.

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 실시예 1-1의 탈세포 장 조직은 육안으로도 탈세포화 처리로 세포가 제거되어 조직이 하얗게 변하였으나, 전반적인 장 조직 구조는 그대로 남아있음을 확인할 수 있었고 (도 2(a)), 이를 이용하여 제조된 하이드로젤은 유리 용기에 용액을 담고 겔화 과정 후 뒤집어보았을 때 용액이 흘러내리지 않음을 통해, 온도에 의한 가교 반응으로 하이드로젤의 고형화가 이루어졌음을 확인하였다 (도 2(b)). 그리고, 제조된 하이드로젤을 주사전자현미경 (Scanning electron microscope; SEM)을 이용하여 3차원 IEM 하이드로젤 내부의 미세 구조를 분석했을 때, 콜라겐과 유사한 나노섬유 구조로 구성되어 있음을 확인하였다 (도 2 (C)).

실험예 1-2. 탈세포 장 조직 세포외기질의 성분 분석

실시예 1-1.에서 제조된 탈세포 장 조직 유래 세포외기질의 성분 분석 및 보존 수준을 확인하였다.

구체적으로, 탈세포 전과 후 장 조직에서 각각 DNA 추출하여 비교하고, 1,9- 디메틸메틸렌 블루염료 용액 분석을 통해 글리코사미노글리칸 (GAG) 함량을 비교하였다.

조직학적 분석의 경우, 탈세포 전과 후 조직을 각각 4% 파라포름 알데히드 용액을 이용하여 1일 동안 고정하고, 파라핀에 포매하여 절편화 한 후 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 염색을 진행하였다.

탈세포 장 조직 유래 지지체의 단백체를 분석하기 위해, 제작한 지지체를 용해 완충액 [4 % 도데실 황산나트륨 (SDS), 0.1 M Tris-HCl (pH 7.6) 및 1X 프로테아제 억제제]을 이용하여 용액화 한 뒤, 단백질 성분들을 추출하여 펩타이드 수준으로 분해하였다. 그 후 질량 분석기 (mass spectrometer)와 MaxQuant 소프트웨어를 이용하여, 펩타이드의 종류와 상대적인 값을 검출하였다. 이후 기존 라이브러리를 이용하여, matrisome 등 상세 분류를 진행하였다.

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 탈세포 전 장 조직 (Before)과 탈세포 후 장 조직 (After)의 DNA 잔존량을 비교한 결과 이를 통해 탈세포화 과정을 통해 97.68%의 세포가 효율적으로 제거됨을 확인하였다 (도 3(A)). 탈세포 전 장 조직 (Before)과 탈세포 후 장 조직 (After)의 GAG(glycosaminoglycan) 잔존량을 비교한 결과 탈세포화 후에도 세포외기질 성분은 유지됨을 확인하였다 (도 3(B)). 탈세포 전 장 조직과 탈세포 후 장 조직의 헤마톡실린과 에오신 염색 (H&E staining)을 비교한 결과를 통해 탈세포화 과정 후 조직에서 대부분의 세포핵이 제거되고 세포외기질 성분은 보존됨을 확인하였다 (도 3 (C)). 질량분석법을 이용한 탈세포화 장 조직의 배치 (batch) 별 프로테오믹스 분석 결과 다양한 종류의 장 조직 특이적 세포외기질 성분이 공통적으로 잔존하고 있음을 확인하였다 (도 3 (D)).

실험예 1-3. 본 발명의 탈세포 장 조직 유래 세포외기질과 종래 기술의 비교 (1)

본 발명의 탈세포 장 조직 유래 세포외기질과 종래 기술을 비교하였다. 구체적으로 본 발명에서 개발한 탈세포 공정을 protocol 1, 종래 기술의 탈세포 공정을 protocol 2로 하여 동일한 돼지의 소장을 이용하여 탈세포화 처리를 진행하였다.

구체적으로, 탈세포 전과 후 장 조직에서 각각 DNA 추출하여 비교하고, 1,9- 디메틸메틸렌 블루염료 용액 분석을 통해 글리코사미노글리칸 (GAG) 함량을 비교하였다.

조직학적 분석의 경우, 탈세포 전과 후 조직을 각각 4% 파라포름 알데히드 용액을 이용하여 1일 동안 고정하고, 파라핀에 포매하여 절편화 한 후 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 염색을 진행하였다.

탈세포 장 조직 유래 지지체의 단백체를 분석하기 위해, 제작한 지지체를 용해 완충액 [4 % 도데실 황산나트륨 (SDS), 0.1 M Tris-HCl (pH 7.6) 및 1X 프로테아제 억제제]을 이용하여 용액화 한 뒤, 단백질 성분들을 추출하여 펩타이드 수준으로 분해하였다. 그 후 질량 분석기 (mass spectrometer)와 MaxQuant 소프트웨어를 이용하여, 펩타이드의 종류와 상대적인 값을 검출하였다. 이후 기존 라이브러리를 이용하여, matrisome 등 상세 분류를 진행하였다.

그 결과, 탈세포 처리를 하지 않은 장 조직 (Native)과 본 발명의 프로토콜로 탈세포 처리한 장 조직 (protocol 1), 기존에 보고된 프로토콜로 탈세포 처리한 장 조직(protocol 2)의 DNA 잔존량 비교하였을 때, 두 가지 공정 모두 조직 내 세포를 효율적으로 제거할 수 있음을 확인하였다 (도 4 (a)).

그리고, GAG (glycosaminoglycan) 잔존량을 비교하였을 때, 본 발명의 공정 (protocol 1)을 이용한 경우 Native 조직 수준의 GAG 함량이 보존되지만, 기존의 공정 (protocol 2)을 이용한 경우에는 Native 조직 내 GAG 양과 비교했을 때 약 16% 정도의 함량밖에 보존되지 못했음을 확인하였다 (도 4 (b)).

또한, 헤마톡실린 & 에오신 염색 (H&E staining) 결과를 비교하였을 때 탈세포화 과정 후 조직에서 대부분의 세포핵이 제거되고 세포외기질 성분은 보존됨을 확인하였다 (도 4 (c)).

그리고, 각 세포외기질에서 검출된 단백질 종류 비교하였을 때 본 발명의 프로토콜로 처리한 장 조직에서 더 다양한 종류의 단백질이 잔존해 있음을 확인하였다 (도 4 (d)).

한편, 각각의 프로토콜로 제작한 탈세포 장 조직을 이용하여 5 mg/ml 하이드로젤 지지체를 제작하고 기계적 물성 (modulus)을 비교하였을 때, 같은 농도의 경우에도 본 발명의 프로토콜로 제작한 탈세포 장 조직 유래 하이드로젤 지지체의 물성이 더 우수함을 확인하였다 (도 4 (e)).

이러한 기존에 보고된 프로토콜 (protocol 2)의 경우 이온성 sodium deoxycholate 기반의 탈세포화 용액을 이용하는 반면, 본 발명의 프로토콜은 비이온성 1% Triton X-100과 0.1% ammonium hydroxide를 혼합한 용액을 기반으로 하는 더 완화된 조건을 이용하기 때문에 장 조직 내 단백질을 더 많이 보존할 수 있고 이를 기반으로 제작하는 하이드로젤 지지체의 물성 역시 더 우수함을 확인할 수 있다.

실험예 1-4. 본 발명의 탈세포 장 조직 유래 세포외기질과 종래 기술의 비교 (2)

본 발명의 탈세포 장 조직 유래 세포외기질과 종래 기술을 비교하였다. 구체적으로 본 발명에서 개발한 탈세포 공정을 protocol 1, 장 조직에 최적화되지 않은 일반적인 탈세포 공정을 protocol 3로 하여 동일한 돼지의 소장을 이용하여 탈세포화 처리를 진행하였다.

구체적으로, 탈세포 전과 후 장 조직에서 각각 DNA 추출하여 비교하고, 1,9- 디메틸메틸렌 블루염료 용액 분석을 통해 글리코사미노글리칸 (GAG) 함량을 비교하였다.

조직학적 분석의 경우, 탈세포 전과 후 조직을 각각 4% 파라포름 알데히드 용액을 이용하여 1일 동안 고정하고, 파라핀에 포매하여 절편화 한 후 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 염색을 진행하였다.

탈세포 장 조직 유래 지지체의 단백체를 분석하기 위해, 제작한 지지체를 용해 완충액 [4 % 도데실 황산나트륨 (SDS), 0.1 M Tris-HCl (pH 7.6) 및 1X 프로테아제 억제제]을 이용하여 용액화 한 뒤, 단백질 성분들을 추출하여 펩타이드 수준으로 분해하였다. 그 후 질량 분석기 (mass spectrometer)와 MaxQuant 소프트웨어를 이용하여, 펩타이드의 종류와 상대적인 값을 검출하였다. 이후 기존 라이브러리를 이용하여, matrisome 등 상세 분류를 진행하였다.

탈세포 처리를 하지 않은 장 조직 (Native)과 본 발명의 프로토콜로 탈세포 처리한 장 조직 (protocol 1), 일반적인 프로토콜로 탈세포 처리한 장 조직 (protocol 3)의 DNA 잔존량을 비교한 결과 두 가지 프로토콜 모두 조직 내 세포를 효율적으로 제거할 수 있음을 확인함 (도 5 (a)).

그리고, GAG (glycosaminoglycan) 잔존량을 비교한 결과, 본 발명의 공정 (protocol 1)을 이용했을 때 Native 조직 수준의 GAG 함량이 보존되지만, 일반적인 프로토콜 (protocol 2)을 적용하면 Native 조직 내 GAG 양과 비교했을 때 약 33% 정도의 함량밖에 보존되지 못함을 확인하였다 (도 5 (b)).

또한, 헤마톡실린 & 에오신 염색 (H&E staining) 결과를 비교한 결과, 탈세포화 과정 후 조직에서 대부분의 세포핵이 제거되고 세포외기질 성분은 보존됨을 확인하였다 (도 5 (c)).

검출된 단백질 종류를 비교한 결과 본 발명의 프로토콜로 처리한 장 조직에서 더 많은 종류의 단백질이 보존되어 있음을 확인하였다 (도 5 (d)).

각각의 프로토콜로 제작한 탈세포 장 조직을 이용하여 5 mg/ml 하이드로젤 지지체를 제작하고 기계적 물성 (modulus)을 비교한 결과 같은 농도의 경우에도 본 발명의 프로토콜로 제작한 탈세포 장 조직 유래 하이드로젤 지지체의 물성이 더 우수함을 확인하였다 (도 5 (e)).

이러한 결과들을 통해 비교 프로토콜로 적용한 일반적인 탈세포 공정 (protocol 3)의 경우 Triton X-100과 이온성 sodium deoxycholate을 탈세포 처리에 이용하는 반면, 본 발명의 공정 (protocol 1)은 1% Triton X-100과 0.1% ammonium hydroxide를 혼합한 용액만을 사용하기 때문에 장 조직 내 단백질을 더 많이 보존할 수 있고 이를 기반으로 제작하는 하이드로젤 지지체의 물성 역시 더 우수함을 확인할 수 있다.

실험예 1-5. 본 발명의 탈세포 장 조직 유래 세포외기질과 종래 기술의 비교 (3)

본 발명의 탈세포 장 조직 유래 세포외기질과 종래 기술을 장 오가노이드 배양 양상을 통해 비교하였다. 구체적으로 본 발명에서 개발한 탈세포 공정을 protocol 1, 장 조직에 최적화되지 않은 일반적인 탈세포 공정을 protocol 3로 하여 동일한 돼지의 소장을 이용하여 탈세포화 처리, 하이드로젤 제작하였고, 장 오가노이드 배양 지지체로 이용하는 실험을 진행하였다.

구체적으로, 장 줄기세포들이 내재되어 있는 장 크립트를 추출하여 protocol 1과 protocol 3의 방법으로 제작한 탈세포 장 조직 유래 하이드로젤 내에서 6일 동안 삼차원 배양하였다. 6일째에 형성된 오가노이드의 양상을 확인하고, 그 형성 효율을 정량 하였다.

그 결과, 도 6 (a) 및 6 (b)에서 확인되는 바와 같이 본 발명의 프로토콜로 제작한 탈세포 장 조직 유래 하이드로젤 (protocol 1)과 일반적인 프로토콜로 탈세포 처리하여 제작한 장 조직 유래 하이드로젤 (protocol 3)에서 배양한 장 오가노이드의 형성 양상과 장 오가노이드의 형성 효율을 비교하였을 때, 일반적인 프로토콜 (protocol 3)로 제작한 탈세포 장 조직 유래 지지체에서는 장 오가노이드가 불규칙한 양상으로 자라나고 형성 효율도 낮은 반면, 본 발명의 프로토콜 (protocol 1)로 제작한 탈세포 장 조직 유래 지지체에서는 장 오가노이드가 정상적인 양상으로 형성되고 그 효율 역시 높음을 확인하였다.

이러한 결과를 통해 일반적인 탈세포 공정으로 제작한 세포외기질 하이드로젤은 물성이 약하고 장 조직 고유의 세포외기질 단백질이 많이 소실된 반면, 본 발명의 프로토콜로 제작한 세포외기질 하이드로젤의 경우 물성이 더욱 우수하며 장 조직 고유의 세포외기질 단백질이 풍부하게 존재하기 때문에 본 발명의 탈세포 공정이 장 오가노이드 배양 지지체를 제작하기에 더욱 적합함을 알 수 있다.

실험예 1-6. 본 발명의 탈세포 장 조직 유래 세포외기질과 종래 기술의 단백체 비교분석

본 발명의 탈세포 장 조직 유래 세포외기질과 종래 기술 (매트리젤)의 단백체를 비교 분석하였다.

구체적으로, 탈세포 장 조직 유래 지지체의 단백체를 분석하기 위해, 제작한 지지체를 용해 완충액 [4 % 도데실 황산나트륨 (SDS), 0.1 M Tris-HCl (pH 7.6) 및 1X 프로테아제 억제제]을 이용하여 용액화 한 뒤, 단백질 성분들을 추출하여 펩타이드 수준으로 분해하였다. 그 후 질량 분석기 (mass spectrometer)와 MaxQuant 소프트웨어를 이용하여, 펩타이드의 종류와 상대적인 값을 검출하였고, 이후 기존 라이브러리를 활용해 매트리좀 등의 상세 분류를 진행하였다.

그 결과, 도 7에서 확인되는 바와 같이, 탈세포 장 조직 유래 세포외기질 지지체 (IEM) 내의 매트리좀 단백질 [세포외기질 단백질 (ECM protein) + 세포외기질 성분과 연관된 단백질 (ECM-associated protein)]의 함량비 (원 그래프)와 함량이 가장 많은 매트리좀 단백질 10종과 기존 오가노이드 배양 지지체인 매트리젤 내의 매트리좀 단백질의 함량비 (원 그래프)와 함량이 가장 많은 매트리좀 단백질 10종을 확인하였다 (도 7의 (a), (b))

탈세포 장 조직 유래 세포외기질 지지체 (IEM)에 존재하는 실제 장 조직에 특이적으로 많이 발현되는 단백질 종류 및 매트리젤에 존재하는 실제 장 조직에 특이적으로 많이 발현되는 단백질 종류를 확인하였다 (도 7 (c), (d)).

이를 통해, 탈세포 장 조직 유래 IEM 지지체에는 실제 장 조직에 존재하는 콜라겐 타입 6와 디코린(DCN), 더마토폰틴(DPT), 바이글리칸(BGN) 등의 매트리좀 단백질 함량이 높은 것을 확인함. 또한, 실제 장 조직에 풍부한 매트리좀 단백질 5종과 non-매트리좀 단백질 22종이 함유되어 있음을 확인하였고, 매트리젤은 실제 장 조직과 달리 대부분 glycoprotein으로 이루어져 있고, 실제 장 조직 특이적 단백질은 non-매트리좀 단백질 4종에 불과함을 확인할 수 있다.

이러한 결과를 통해 탈세포 장 조직 유래 IEM 지지체가 기존 매트리젤과 비교하여 장 오가노이드 형성 및 분화에 더욱 적합한 세포외기질 미세환경을 제공해 줄 수 있을 것을 예측할 수 있다.

그리고, 도 8에서 확인되는 바와 같이, 탈세포 장 조직 유래 IEM 지지체와 매트리젤에 함유된 매트리좀 단백질의 종류를 비교한 결과 매트리젤과 비교하여 IEM 지지체에 훨씬 다양한 종류의 매트리좀 단백질 및 매트리좀-연관 단백질이 존재함을 확인하였다 (도 8(a)).

또한, 탈세포 장 조직 유래 IEM 지지체에는 콜라겐이 약 45%로 가장 많고, 프로테오글리칸이 35%, 글리코프로틴이 약 16% 정도 존재함을 확인함. 반면, 기존 배양 지지체인 매트리젤의 경우, 글리코프로틴이 약 96% 정도로 대부분을 차치하며 나머지 단백질들의 양은 1% 내외로 굉장히 적은 것을 확인하였다 (도 8(b)). 즉 IEM 지지체가 매트리젤과 비교하여 장 조직과 보다 유사한 매트리좀 단백질의 구성 비율을 가지고 있음을 확인할 수 있다.

한편, 도 9에서 확인되는 바와 같이, 제작된 탈세포 장 조직 유래 IEM 지지체의 약 59%는 매트리좀 단백질이 아닌 non-매트리좀 단백질들로 구성되어 있는데, 매트리좀 단백질이 아닌 non-매트리좀 단백질들이 어떤 기능을 담당하는지, 생물학적 프로세스의 유전자 온톨로지 (Gene ontology of biological process) 분석을 통해 해당 단백질의 유전자 기능을 분석하였고, IEM 지지체에 포함된 non-매트리좀 단백질들은 세포 구성, 골격 발달 및 구조 형성에 관련된 기능을 주로 담당함을 확인하였다 (도 9(a)).

반면, 매트리젤의 경우 약 12%가 매트리좀 단백질로 구성되어 있으며 그 외에는 대부분 non-매트리좀 단백질들인데, 해당 단백질은 번역 및 RNA, 펩타이드 물질대사에 관련된 기능을 담당함을 알 수 있다 (도 9 (b)).

이러한 결과를 통해, 본 발명에서 제작된 탈세포 장 조직 유래 IEM 지지체에는 실제 장 조직과 유사한 매트리좀 단백질들이 함유되어 있을 뿐 아니라 그 외 포함된 non-매트리좀 단백질들도 세포 구성 요소 생성 및 구조 형성에 관련된 역할을 주로 담당하기 때문에 매트리젤과 비교하여 장 오가노이드의 형성 및 발달에 보다 효과적일 것으로 예측할 수 있다.

실험예 2: 탈세포 장 조직 유래 세포외기질을 포함한 지지체 조성물의 분석

실시예 1-2에서 제조된 지지체 조성물을 아래와 같이 분석하였다.

실험예 2-1. 지지체 조성물의 물성 확인

실시예 1-2. 에서 제조된 지지체 조성물 (하이드로젤)의 물성을 비교, 확인하였다.

구체적으로, 0.1-1 Hz 범위의 주파수 (frequency)에서의 탄성계수 (G', elastic modulus) 및 점성계수 (G'', viscous modulus)를 회전형 유량계 (rheometer)로 측정하여 1~5 mg/ml 농도의 탈세포화 장 조직 유래 세포외기질 성분 기반 하이드로젤 지지체 (IEM 1~5 mg/ml)의 물성을 분석하였다.

그 결과, 가장 저농도인 1 mg/ml IEM 하이드로젤 포함하여 모든 농도의 IEM 하이드로젤들은 30분 간의 가교 반응 후에 내부적으로 안정적인 고분자 네트워크가 형성됨을 (G' > G'') 확인하였다 (도 10 (a)). IEM 농도가 증가할수록 IEM 하이드로젤의 기계적 물성 (modulus)도 증가함을 알 수 있었다 (도 10 (B)).

실험예 2-2. 지지체 조성물의 최적 조건 확인

실시예 1-2. 에서 제조된 지지체 조성물 (하이드로젤)의 최적조건을 확인하였다.

구체적으로, 쥐의 소장 윗부분을 채취하여 내부의 음식물과 융털부분은 제거하고 물리적으로 여러 번 세척 작업을 진행하였고, 추후 EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) 처리와 여러 번의 세척 과정을 통해, 장 줄기세포가 존재하는 크립트 (crypt) 부분을 고효율로 분리하였다. 해당 크립트 조직을 농도별 본 발명 하이드로젤 지지체 및 매트리젤에서 배양하여 3차원 장 오가노이드 발달양상을 비교 확인하였다.

그 결과, 도 11에서 확인되는 바와 같이, 위의 분석들을 통해, 모든 농도의 탈세포화 장 조직 유래 IEM 하이드로젤 지지체에서 장 오가노이드 배양이 가능하지만, 2 mg/ml 농도의 IEM 하이드로젤에서 장 오가노이드의 줄기세포능 및 장 특이적 세포로의 분화능이 가장 우수함을 확인하였다.

실험예 2-3. 지지체 조성물에서 배양된 장 오가노이드의 성장 양상 확인

실시예 1-2.에서 제조된 지지체 조성물 (하이드로젤)에서 배양된 장 오가노이드의 성장 양상을 확인하였다.

구체적으로, 본 발명의 지지체 조성물 (하이드로젤)와 매트리젤에 삼차원 배양한 장 크립트로부터 발달된 장 오가노이드들의 날짜에 따른 성장 양상을 추적 확인하였다 (배양 1일부터 6일까지).

그 결과, 도 12에서 확인되는 바와 같이, 탈세포화 장 조직 유래 IEM 하이드로젤 지지체에서 자라는 장 오가노이드가 매트리젤에서와 비슷한 성장 속도 및 크기로 자라는 것을 확인하였다. 개발된 IEM 하이드로젤 지지체의 장 오가노이드 배양 능력이 상용화된 매트리젤 지지체와 유사함을 알 수 있었다.

실험예 2-4. 지지체 조성물에서 배양된 장 오가노이드의 줄기세포 및 분화 마커 발현 분석 (세포 면역염색 분석)

실시예 1-2.에서 제조된 지지체 조성물 (하이드로젤)에서 배양된 장 오가노이드의 줄기세포 및 분화 마커 발현을 세포 면역염색으로 분석하였다.

구체적으로, 배양한 오가노이드를 4% 파라포름 알데히드에서 1시간 고정하고 0.5% Triton X-100을 1시간 처리한 후, 5% BSA 용액을 이용하여 블로킹 (blocking; 비특이적 단백질 반응 억제)을 진행하였다. 이후 조직 특이적인 안티 바디를 처리하여 세포 면역염색을 진행하였다.

그 결과, 도 13에서 확인되는 바와 같이, 탈세포화 장 조직 유래 IEM 하이드로젤과 매트리젤에서 배양된 장 오가노이드의 줄기세포능 (stemness) 마커 (LGR5, SOX9) 발현 분석을 위한 세포 면역염색 결과 (도 13(A))와 탈세포화 장 조직 유래 IEM 하이드로젤과 매트리젤에서 배양된 장 오가노이드의 분화 (differentiation) 마커 (MUC2, LYZ1, CHGA, VILLIN, ZO1) 발현 분석을 위한 세포 면역염색 결과를 얻었다 (도 13 (B)).

위와 같은 분석을 통해 탈세포화 장 조직 유래 IEM 하이드로젤과 매트리젤에서 각각 배양된 장 오가노이드의 특이적 마커 발현 정도에 차이가 없음을 알 수 있으며 이는 IEM 하이드로젤의 장 오가노이드 증식 및 분화 유도가 매트리젤과 유사함을 확인할 수 있다.

* LGR5, SOX9: intestinal stem cell marker (장 줄기세포 마커) / ECAD: intestinal epithelial marker (장 상피세포 마커)

* MUC2: goblet cell marker (배상세포 마커) / LYZ1: Paneth cell marker (파네스 세포 마커) / CHGA: enteroendocrine cell (장내분비세포 마커) / VILLIN, ZO1: enterocyte marker (장세포 마커)

실험예 2-5. 지지체 조성물에서 배양된 장 오가노이드의 줄기세포 및 분화 마커 발현 분석 (정량적 PCR 분석)

실시예 1-2.에서 제조된 지지체 조성물 (하이드로젤)에서 배양된 장 오가노이드의 줄기세포 및 분화 마커 발현을 정량적 PCR로 분석하였다.

구체적으로, RNA 추출 키트를 사용하여 장 오가노이드에서 mRNA 샘플을 추출하여 cDNA 합성 키트로 추출한 mRNA로부터 cDNA 샘플을 합성하였다. 그 후 조직 특이적 유전자 프라이머를 이용하여 정량적 PCR 분석을 실시하였다.

그 결과, 도 14에 나타난 바와 같이, 탈세포화 장 조직 유래 IEM 하이드로젤과 매트리젤에서 배양된 장 오가노이드의 줄기세포능 (stemness) 마커 발현에 대한 qPCR 분석 데이터를 통해 탈세포화 장 조직 유래 IEM 하이드로젤 지지체에서 배양된 장 오가노이드는 매트리젤에서 배양된 장 오가노이드와 비교하여 줄기세포 (stemness) 마커 발현은 다소 높은 것을 확인할 수 있었다 (도 14 (A)). 이는 IEM 하이드로젤에서 배양된 장 오가노이드의 증식능이 우수함을 알 수 있다.

또한, 탈세포화 장 조직 유래 IEM 하이드로젤과 매트리젤에서 배양된 장 오가노이드의 분화 (differentiation) 마커 발현에 대한 qPCR 분석 데이터를 통해 탈세포화 장 조직 유래 IEM 하이드로젤 지지체에서 배양된 장 오가노이드와 매트리젤에서 배양된 장 오가노이드는 분화 (differentiation) 마커 발현 정도가 유사함을 확인하였다 (도 14 (B)). 이러한 결과를 통해 IEM 하이드로젤 지지체가 상용화된 매트리젤 지지체를 대체할 만큼 오가노이드 분화를 유도할 수 있는 성능을 가지고 있음을 확인할 수 있다.

실험예 2-6. 지지체 조성물에서 배양된 장 오가노이드의 기능성 검증

실시예 1-2.에서 제조된 지지체 조성물 (하이드로젤)에서 배양된 장 오가노이드의 기능성을 검증하였다.

구체적으로, 장 오가노이드 배양액에 5 μM forskolin을 첨가한 후, 시간에 따라 오가노이드 크기의 변화를 정량하였다.

그 결과, 도 15에서 확인되는 바와 같이 장 조직 상피세포에 존재하는 CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) 길항제 (agonist)인 포스콜린 (Forskolin, 이온 채널을 개방하도록 자극하여 수분의 배출을 촉진하는 화학물질) 처리하였을 때, 탈세포화 장 조직 유래 IEM 하이드로젤과 매트리젤에서 배양된 장 오가노이드의 내강이 비슷한 정도로 팽윤하는 것을 알 수 있었다 (도 15 (A)). 탈세포화 장 조직 유래 IEM 하이드로젤과 매트리젤에서 배양된 장 오가노이드에 각각 포스콜린 처리 후 시간에 따른 면적 변화 정량 분석 결과를 통해 탈세포화 장 조직 유래 IEM 하이드로젤에서 배양된 장 오가노이드와 매트리젤에서 배양된 장 오가노이드의 포스콜린 처리에 의한 팽윤 정도가 비슷함을 확인함으로써, 개발된 IEM 하이드로젤 지지체에서 자란 장 오가노이드가 인체 내 전해질과 물의 분비를 조절하는 장 조직 특이적 기능성을 가지고 있음을 확인하였다 (도 15 (B)).

실험예 2-7. 지지체 조성물에서 배양된 장 오가노이드의 유전자 발현 프로파일 분석 (1) (RNA-sequencing 분석)

실시예 1-2.에서 제조된 지지체 조성물 (하이드로젤)에서 배양된 장 오가노이드의 유전자 발현을 프로파일 분석하였다.

구체적으로, 탈세포 장 조직 유래 하이드로젤과 매트리젤에서 키운 오가노이드에서 각각 유전자 정보들을 분류하고, 이 중 2 fold, p-value < 0.05, FDR < 0.1의 통계적 수준에서 서로 차별화되게 발현된 유전자들(DEG)을 분류한 결과 270종의 유전자를 획득하였고 이를 heatmap으로 도식화 하였다. 이로부터 각각의 하이드로젤에서 배양하였을 때 발생된 오가노이드의 형태는 거의 유사하지만 상당히 많은 수의 유전자들이 차별적으로 발현되었음을 확인하였다 (도 16 (A)).

또한, 매트리젤에서 자란 장 오가노이드와 비교하여 탈세포화 장 조직 유래 IEM 하이드로젤에서 배양된 장 오가노이드에서 270개의 DEG 중 213개의 유전자의 발현이 증가하였는데, 세포외기질 관련 유전자들의 증가가 가장 크게 관찰되었다. 270개의 DEG 중 57개의 유전자는 발현이 감소하였는데 산화/환원 반응 및 대사 관련 유전자들의 감소 정도가 가장 크게 관찰되었다 (도 16 (B)).

한편, 매트리젤에서 배양된 장 오가노이드와 비교하여 DEG 중 4배 이상 차이가 나는 유전자들을 선별해 보았을 때, 탈세포화 장 조직 유래 IEM 하이드로젤에서 배양된 장 오가노이드에서 세포외기질, 상처 회복 반응, 세포 증식, 사이토카인 활성 관련 카테고리에 속해 있는 유전자들의 발현이 크게 증가했음을 확인하였다 (도 16 (C)). 이를 통해, 탈세포 장 조직 유래 IEM 하이드로젤이 장 오가노이드의 세포외기질 합성 및 세포 증식 관련 유전자들을 크게 활성화시켰음을 알 수 있었다.

실험예 2-8. 지지체 조성물에서 배양된 장 오가노이드의 유전자 발현 프로파일 분석 (2) (RNA-sequencing 분석)

실시예 1-2.에서 제조된 지지체 조성물 (하이드로젤)에서 배양된 장 오가노이드의 유전자 발현을 프로파일 분석하였다.

구체적으로, 세포외기질 환경 및 세포-매트릭스 상호작용과 관련된 유전자 범주에 해당하는 유전자들을 살펴보았을 때, 매트리젤 그룹보다 탈세포 장 조직 유래 하이드로젤 그룹의 오가노이드에서 발현량이 증가한 유전자 개수가 더 많았고 증가된 정도 역시 더 높은 것을 확인하였다 (도 17 (A)).

탈세포 장 조직 유래 하이드로젤 그룹의 세포외기질 단백질 관련 유전자 (Col4a2, Nid1, Lama3), 세포골격 관련 유전자 (Flna, Gsn, Tuba1), 티아민 흡수에 관여하는 장 상피 유전자 (Tm4sf4)의 발현이 실제 조직과 유사함을 확인하였다. 반면, 매트리젤에서 배양한 오가노이드의 경우, 해당 유전자들의 발현 정도가 실제 조직과는 꽤 차이가 있음을 확인하였다. 또한, 상처 재생, 염증 및 면역 반응에 관련된 유전자 (Procr, Mcpt2, Icam1, Cxcl10, Cxcl16, Timp3)들의 발현도, 탈세포 장 조직 유래 하이드로젤에서 배양된 오가노이드와 실제 조직이 유사함을 확인하였다 (도 17 (B)).

이러한 유전자들은 생리적 조건에서 장벽 항상성을 유지에 관여하는 것들이다. 이를 통해, 본 발명의 하이드로젤 지지체가 손상 상태에 대처하고 조직 항상성을 유지할 수 있는 장 오가노이드의 고유 능력을 잘 보존해준다는 것을 확인할 수 있다.

실험예 2-9. 지지체 조성물에서 배양된 장 오가노이드의 조직 특이적 효과 확인

실시예 1-2.에서 제조된 지지체 조성물 (하이드로젤)에서 배양된 장 오가노이드의 조직 특이적 효과, 구체적으로 장 오가노이드의 생존 및 발달을 분석하였다.

구체적으로, 탈세포 처리된 6종류의 조직 (장, 위, 피부, 림프, 심장, 근육) 유래의 하이드로젤 및 매트리젤에 장 줄기세포가 내재되어 있는 장 크립트를 캡슐화하여 삼차원 배양하였다. 6일동안 배양한 후, 각각의 하이드로젤에서 발생된 오가노이드의 형성 양상을 확인하였다. 탈세포 처리된 3종류의 조직 (장, 위, 피부) 유래 하이드로젤과 매트리젤에서의 오가노이드 형성효율을 측정하고, 각각 오가노이드에서 mRNA를 추출하여 정량적 PCR 방법으로 줄기세포 및 분화 마커 발현을 분석하였다.

그 결과, 도 18에서 확인되는 바와 같이, 탈세포 처리된 6종류의 조직 (장, 위, 피부, 림프, 심장, 근육) 유래의 하이드로젤 및 매트리젤에서 배양된 장 오가노이드 형성 양상 (농도는 모두 2 mg/ml) 을 비교하였을 때 다른 장기 (피부, 림프, 심장, 근육) 유래 탈세포 지지체에서는 장 오가노이드가 제대로 형성이 되지 않음을 관찰하였다. 또한, 장 오가노이드 형성 효율 및 장 오가노이드의 줄기세포 (stemness) 마커 (Lgr5) 및 분화 (differentiation) 마커 (Muc2)에 대한 정량적 PCR (qPCR) 분석을 하였고, 탈세포 피부 조직 유래 하이드로젤에서 배양된 장 오가노이드에서 줄기세포 마커와 분화 마커 발현이 가장 낮음을 확인하였다.

이러한 결과를 통해 다른 조직 유래의 탈세포 지지체와 비교하여 장 조직 유래의 탈세포 지지체에서 장 오가노이드의 형성 및 발달이 보다 우수함을 확인함으로써, 장 조직 특이적 세포외기질에 의해 제공되는 미세환경이 장 오가노이드 배양에 중요한 영향을 미친다는 점을 검증하였다.

* SEM: stomach extracellular matrix, SkEM: skin extracellular matrix, LyEM: lymph node extracellular matrix, HEM: heart extracellular matrix, MEM: muscle extracellular matrix

실험예 2-10. 탈세포 장 조직 유래 지지체의 조직 특이적 세포외기질 성분 비교 분석 (1)

실시예 1-2.에서 제조된 지지체 조성물의 조직 특이적 세포외기질 성분을 비교 분석하였다.

구체적으로, 탈세포 피부 조직 유래 지지체 (SkEM)와 탈세포 장 조직 유래 지지체 (IEM) 내의 세포외기질 단백질 함량 상대 분석을 실시하였다.

그 결과, 도 19에서 확인되는 바와 같이, 장 오가노이드의 형성 및 발달에 있어 라미닌과 피브로넥틴 등의 세포외기질 단백질이 매우 중요한데, 탈세포 피부 조직 유래 지지체와 비교하여 탈세포 장 조직 유래 지지체에 해당 세포외기질 단백질 함량이 더 많은 것을 확인하였다.

또한, 탈세포 피부 조직 유래 지지체에는 콜라겐 타입 1, 3이 많은 반면, 탈세포 장 조직 유래 지지체에는 콜라겐 타입 6, 14가 많았다. 콜라겐 타입 6의 경우, 장 상피세포와 피브로넥틴의 상호작용을 조절하는 중요한 요소라고 알려져 있다.

이를 통해, 장 오가노이드 배양을 위해서 탈세포 장 조직 유래의 지지체를 적용하면 다른 조직 유래 탈세포 지지체와 비교하여 장 조직 특이적 세포외기질 미세환경을 보다 잘 구현해줄 수 있기 때문에 장 오가노이드 배양에 더욱 적합한 매트릭스로서 적용할 수 있음을 확인하였다.

실험예 2-11. 탈세포 장 조직 유래 지지체의 조직 특이적 세포외기질 성분 비교 분석 (2)

실시예 1-2.에서 제조된 지지체 조성물 (하이드로젤)에서 배양된 장 오가노이드의 줄기세포 및 분화마커 발현을 비교 분석하였다.

구체적으로, 100-120 kg 중량의 6개월령 돼지 (Old)와 20 kg 중량의 2개월령 어린 돼지 (Young)에서 각각 소장을 추출하여 탈세포화 공정을 진행하고, 제작된 탈세포 장 조직 유래 지지체에서 배양된 장 오가노이드의 줄기세포 (stemness) 마커 (Lgr5, Axin2, Olfm4) 및 분화 (differentiation) 마커 (Lyz1, Muc2, Chga, Vil1) 발현에 대한 정량적 PCR (qPCR) 분석을 진행하였다.

그 결과, 연령이 낮은 어린 개체로부터 추출된 조직으로 제작한 IEM 지지체에서 장 오가노이드의 줄기세포 유전자가 높게 발현함을 확인하였다 (도 20(A)).

또한, 100-120 kg 중량의 6개월령 돼지 (Old)와 20 kg 중량의 2개월령 어린 돼지 (Young)의 소장으로부터 제작한 탈세포 조직 유래 IEM 지지체 내의 세포외기질 단백질 상대 정량 비교 분석하였다.

그 결과, 어린 개체의 조직으로 제작한 IEM 지지체의 피브로넥틴 함량이 더 높은데, 피브로넥틴은 장 오가노이드의 초기 발달에 매우 중요한 것으로 알려져 있다 (도 20 (B)).

이러한 결과들을 통해 같은 종류의 조직이라도 연령에 따라 조직 내 세포외기질 단백질 함량이 다르며, 연령이 다른 개체의 조직을 이용하여 제작한 탈세포 지지체 역시 마찬가지로 세포외기질 단백질 함량 차이를 가지게 됨을 확인하였다. 따라서, 더 어린 개체의 조직을 이용하여 탈세포 지지체를 제작하고 오가노이드 배양에 적용하면 오가노이드의 성장에 더욱 유리함을 알 수 있다.

실험예 3: 지지체 조성물에서 배양된 장 오가노이드의 활용 가능성 검증

실험예 3-1. 지지체 조성물에서 배양된 장 오가노이드의 장기 배양 유지 능력 검증

실시예 1-2.에서 제조된 지지체 조성물 (하이드로젤)에서 배양된 장 오가노이드의 장기 배양 유지 능력을 검증하였다.

그 결과, 탈세포화 장 조직 유래 IEM 하이드로젤과 매트리젤에서 배양된 장 오가노이드의 장기 계대 배양 데이터 (도 21 (A)) 및 탈세포화 장 조직 유래 IEM 하이드로젤과 매트리젤에서 배양된 P0 (day 6), P2 (day 15), P6 (day 33) 장 오가노이드의 줄기세포 (stemness) 마커 (Lgr5, Axin2, Olfm4) 발현에 대한 qPCR 분석결과를 얻었다 (P = passage number, D = culture day) (도 21 (B)).

이러한 결과를 통해 탈세포화 장 조직 유래 IEM 하이드로젤 지지체에서 배양된 장 오가노이드는 장기 배양 과정 동안 세포 생장이나 형성 양상에 큰 변화가 없으며 줄기세포능 (stemness) 마커 발현이 매트리젤에서 배양되는 장 오가노이드와 비슷하게 일정한 수준으로 유지되는 것을 확인하였다. 따라서 개발된 IEM 하이드로젤 인공 지지체가 장 오가노이드의 안정적인 장기 배양에 적합함을 검증하였다.

실험예 3-2. 장 오가노이드 배양을 위한 지지체 조성물의 냉동보관 가능성 검증

실시예 1-2.에서 제조된 지지체 조성물의 냉동보관 가능성을 검증하였다.

구체적으로, 탈세포화 장 조직 유래 IEM 하이드로젤 pre-gel 용액의 장기간 냉동보관 가능성을 확인하기 위해 장기 냉동보관 후 녹여서 장 오가노이드 배양에 사용하는 실험을 진행하였고 (도 22 (A)), 배양 직전에 바로 제작한 IEM 하이드로젤과 냉동 보관 (-80 ℃) 1달, 2달, 3달 후 다시 녹여서 제작한 탈세포화 장 조직 유래 IEM 하이드로젤에서 배양한 장 오가노이드의 형태를 매트리젤에서 배양한 장 오가노이드와 비교하였다 (도 22 (B)).

그 결과, 도 22에 나타난 바와 같이, 장기 냉동 보관된 IEM 하이드로젤에서도 매트리젤에서와 차이가 없이 장 오가노이드가 잘 형성됨을 확인하였다 (도 22 (B)). 배양 직전에 바로 제작한 IEM 하이드로젤과 냉동 보관 (-80℃) 1달, 2달, 3달 후 녹여서 제작한 탈세포화 장 조직 유래 IEM 하이드로젤에서 배양한 장 오가노이드의 줄기세포 (stemness - Lgr5) 및 분화 (differentiation - Lyz1, Muc2) 마커 발현을 정량 PCR (qPCR) 방법으로 분석했을 때 각 마커의 발현이 큰 차이가 없음을 확인하였다 (도 22 (C)).

이러한 결과들을 통해 탈세포화 장 조직 유래 IEM 하이드로젤 지지체는 제작 후에도 장기간 냉동 보관이 가능하며, 필요할 때 다시 해동하여 사용해도 장 오가노이드 배양을 위한 성능 측면에서 전혀 이상이 없음을 확인하였다. 이는 개발된 하이드로젤 지지체의 제품화를 위해 매우 유리한 장점으로 작용한다.

실험예 3-3. 장 오가노이드 배양을 위한 지지체 조성물의 냉장보관 가능성 검증

실시예 1-2.에서 제조된 지지체 조성물의 냉장보관 가능성을 검증하였다.

구체적으로, 탈세포화 장 조직 유래 IEM 하이드로젤 지지체의 장기간 냉장보관 가능성을 확인하기 위해 냉장보관된 IEM 하이드로젤 pre-gel 용액을 장 오가노이드 배양에 적용하였고 (도 23 (A)), 배양 직전에 바로 제작한 IEM 하이드로젤과 일정 기간 냉장 보관된 탈세포화 장 조직 유래 IEM 하이드로젤에서 배양한 장 오가노이드의 형태를 매트리젤에서 배양한 장 오가노이드와 비교하였다 (도 23 (B)).

그 결과, 도 23에 나타난 바와 같이, 냉장 보관된 IEM 하이드로젤에서도 매트리젤에서와 차이가 없이 장 오가노이드가 잘 형성됨을 확인하였다 (도 23 (B)).

또한, 배양 직전에 바로 제작한 IEM 하이드로젤과 냉장 보관 1주차, 4주차 탈세포화 장 조직 유래 IEM 하이드로젤에서 배양한 장 오가노이드의 줄기세포 (stemness - Lgr5, Axin2) 및 분화 (differentiation - Lyz1, Muc2, Chga) 마커 발현을 정량 PCR (qPCR) 방법으로 분석했을 때 각 마커의 발현이 큰 차이가 없음을 확인하였다 (도 23 (C)).

이러한 결과를 통해 탈세포화 장 조직 유래 IEM 하이드로젤 지지체는 제작 후에도 장기간 냉장 보관이 가능하며, 냉장 보관된 하이드로젤도 장 오가노이드 배양을 위한 성능 측면에서 전혀 이상이 없음을 확인하였고, 이는 개발된 하이드로젤 지지체의 제품화를 위해 매우 유리한 장점으로 작용한다.

실험예 3-4. 지지체 조성물의 장 오가노이드 생체 내 이식 지지체로 적용 가능성 검증

실시예 1-2.에서 제조된 지지체 조성물 (하이드로젤)의 장 오가노이드의 생체 내 이식 지지체로 적용 가능성을 검증하였다.

구체적으로, 형광물질 DiI dye로 표지된 장 오가노이드를 탈세포화 장 조직 유래 IEM 하이드로젤을 이용하여 마우스의 장 손상 부위에 이식하는 실험으로, 마우스의 소장 일부를 수술용 클램프로 고정하고 1% 아세트산 (acetic acid) 40 ㎕를 해당 부위에 주입하여 2분 동안 조직 손상을 유도하였다. 그 후 손상 부위에 이식용 하이드로젤 용액에 오가노이드를 배합하여 주입해주었다 (도 24 (A)).

또한, 생체 내 이식에 적합하도록 탈세포화 장 조직 유래 IEM 하이드로젤의 점도를 조절하기 위해, IEM 하이드로젤과 배양액을 다양한 비율로 혼합한 조건을 장 오가노이드 배양에 적용하였다 (도 24 (B)).

그 결과, 도 24에서 확인되는 바와 같이, 모든 이식용 IEM 하이드로젤 조건에서 장 오가노이드가 잘 생존함을 확인하였다. 기존 문헌에서 오가노이드 이식 시 Matrigel과 배양액을 1:20의 부피비로 혼합하여 이용하기 때문에 추후 이식용 IEM 하이드로젤 조건도 마찬가지로 배양액과 1:20의 혼합비(v/v)를 적용하였다.

실험예 3-5. 지지체 조성물에서 배양된 장 오가노이드의 생체 내 이식 및 생착 유도 검증

실시예 1-2.에서 제조된 지지체 조성물 (하이드로젤)에서 배양된 장 오가노이드의 생체 내 이식 및 생착 유도 가능성을 검증하였다.

구체적으로, 이식용 IEM 하이드로젤 용액 (IEM: medium = 1: 20 비율)을 이용하여 손상된 장 조직 내에 DiI 형광 표지된 장 오가노이드를 이식하였고, 다음 날 이식된 조직 부위에서 DiI 형광이 관찰되어 장 오가노이드가 성공적으로 생착되었음을 확인하였다 (도 25 (A)).

또한, 장 오가노이드가 이식된 부위의 장 조직을 수거하여 형광 발현을 확인해 보았을 때, 장 상피조직 내에 DiI (이식된 장 오가노이드) 형광이 존재함을 확인하였다. 탈세포화 장 조직 유래 IEM 하이드로젤 지지체가 장 오가노이드의 생체 외 배양뿐만 아니라 생체 내 전달 및 이식용 소재로도 적용 가능함을 확인하였다 (도 25 (B)).

한편, 도 26 (A)와 같이 EGFP 발현 마우스 유래 장 오가노이드를 탈세포화 장 조직 유래 IEM 하이드로젤 지지체를 이용하여 장 손상 부위에 이식하는 실험을 수행하였다.

구체적으로, 마우스의 소장 일부를 수술용 클램프로 고정하고 1% 아세트산 (acetic acid) 40 ㎕를 해당 부위에 주입하여 2분 동안 조직 손상을 유도하였다. 그 후 손상 부위에 이식용 하이드로젤 용액에 오가노이드를 배합하여 주입하고 하루 뒤에 확인하였다.

이식 전, EGFP 발현 마우스의 장 줄기세포를 추출하여 제작한 장 오가노이드 전체에서 초록색 형광 (EGFP)이 잘 발현됨을 확인하였다 (도 26 (B)). 이식용 IEM 하이드로젤 용액 (IEM: medium = 1: 20 비율)을 이용하여 장 오가노이드를 장 조직에 이식하였고, 이식 부위를 수거하여 형광 발현을 확인해보았을 때 장 상피조직 내에 EGFP (이식된 EGFP 발현 장 오가노이드) 형광이 검출됨을 확인하였다 (도 26 (C)).

이러한 결과를 통해, 탈세포화 장 조직 유래 IEM 하이드로젤 지지체가 장 오가노이드의 생체 외 배양뿐만 아니라 생체 내 전달 및 이식용 소재로도 적용 가능함을 확인하였다.

실험예 3-6. 지지체 조성물에서 인간 유도만능줄기세포 및 배아줄기세포 유래 장 오가노이드 배양 가능성 확인

실시예 1-2.의 지지체 조성물 (하이드로젤)에서 인간 유도만능줄기세포 및 배아줄기세포 유래 장 오가노이드의 배양 가능성을 확인하였다.

구체적으로, 인간 유도만능줄기세포 및 배아줄기세포를 단일 세포로 배양 접시에 파종한 후, 90% 이상으로 세포가 가득 찬 시점부터 Activin A와 FBS를 첨가함으로써 장 분화를 시작하였다. 그 후 FGF-4와 CHIR99021을 처리하고, mid-hindgut 스페로이드가 형성되면 탈세포화 장 조직 유래 IEM 하이드로젤 또는 매트리젤에 옮겨서 장 오가노이드 배양액을 이용하여 삼차원 배양하였다.

그 결과, 도 27에서 확인되는 바와 같이, 탈세포화 장 조직 유래 IEM 하이드로젤과 매트리젤에서 인간 유도만능줄기세포 (human induced pluripotent stem cell; hiPSC) 및 인간 배아줄기세포(human embryonic stem cell; hESC) 유래 장 오가노이드가 잘 배양될 수 있음을 확인하였다 (배양 7일차 오가노이드 형태 이미지) (도 27 (A)).

탈세포화 장 조직 유래 IEM 하이드로젤과 매트리젤에서 인간 배아줄기세포 (hESC)에서 분화 유도된 장 오가노이드의 세포 생존 분석한 결과 (Live/Dead 분석), 6일 동안 배양했을 때 장 오가노이드 내 세포들이 잘 살아있음을 확인하였다 (도 27 (B)).

탈세포화 장 조직 유래 IEM 하이드로젤 지지체는 생쥐의 장 조직 성체줄기세포 유래 장 오가노이드 뿐만 아니라, 전능성을 가지는 줄기세포 유형인 인간 유도만능줄기세포 및 인간 배아줄기세포에서 분화 유도된 장 오가노이드 형성, 유지 및 성장에도 매우 효과적인 배양 지지체임을 확인하였다. 따라서 줄기세포 유형에 관계없이 다양한 조직, 세포 유래의 장 오가노이드의 배양이 가능한 지지체로 범용성이 매우 높으며 이는 제품화에 유리한 장점을 제공한다. 환자 줄기세포 유래의 장 오가노이드 기반 질환 모델 구축을 위한 배양 시스템의 요소 기술로 IEM 하이드로젤의 적용 가능성이 매우 높음을 확인하였다.

실험예 3-7. 지지체 조성물에서 대장암 유래 3차원 오가노이드 형성 및 배양 가능성 확인

실시예 1-2.의 지지체 조성물 (하이드로젤)에서 대장암 유래 3차원 오가노이드 형성 및 배양 가능성을 확인하였다.

구체적으로, 도 28에 나타난 바와 같이, 탈세포화 장 조직 유래 IEM 하이드로젤과 매트리젤에서의 대장암 유래 세포주 (DLD-1, HT29)로 제작된 3차원 암 오가노이드 (배양 8일차) 형성 양상을 비교한 결과 매트리젤에서와 큰 차이 없이 IEM 하이드로젤에서도 대장암 오가노이드가 잘 형성됨을 확인하였다 (도 28 (A)).

탈세포화 장 조직 유래 IEM 하이드로젤과 매트리젤에서의 대장암 유래 세포주 (DLD-1, HT29)로 제작된 3차원 암 오가노이드 (배양 8일차)의 세포 증식 마커인 Ki67에 대한 면역염색 분석결과 IEM 하이드로젤과 매트리젤 내에서 배양된 대장암 오가노이드 내 세포의 증식능은 큰 차이가 없음을 확인하였다 (도 28 (B)).

이러한 결과들을 통해 탈세포화 장 조직 유래 IEM 하이드로젤 지지체가 줄기세포 유래 장 오가노이드 뿐만 아니라 대장암 세포주로 제작된 암 오가노이드 형성 및 성장에도 매우 효과적인 배양 지지체임을 확인하였다. 대장암 환자 체외 모델 구축을 위한 배양 시스템의 요소 기술로서 IEM 하이드로젤의 적용 가능성이 매우 높다.

실험예 3-8. 지지체 조성물을 이용한 오가노이드 동결 보관 가능성 확인

일반적인 장 오가노이드의 동결 보관은 오가노이드가 배양되던 하이드로젤 (지지체)을 제거하고 오가노이드만을 냉동 배양액을 이용하여 동결한다. 이러한 경우 해동 후 오가노이드를 다시 하이드로젤에 캡슐화하여 배양해야 하는 번거로움이 있으며 이 과정에서 오가노이드 내 세포의 기능 및 활성이 손상될 수 있다.

실시예 1-2.의 지지체 조성물 (하이드로젤)을 이용한 오가노이드의 동결 보관 가능성을 확인하였다.

구체적으로, 탈세포 장 조직 유래 IEM 하이드로젤과 매트리젤에 6일간 배양한 장 오가노이드를 각각의 배양 지지체를 제거하지 않은 채로 동결 보관하였다가, 해동 후 추가적인 지지체 캡슐화 과정 없이 그대로 배양을 시작하였다.

탈세포 장 조직 유래 IEM 하이드로젤과 매트리젤에 각각 캡슐화 상태로 동결 보관 후 해동한 오가노이드의 Live/Dead (생존/사멸) 염색 분석한 결과. IEM 하이드로젤에 캡슐화하여 동결 보관 후 해동한 오가노이드는 대부분 세포가 생존하였고 (초록 형광), 매트리젤에 캡슐화한 채로 동결 보관 후 해동한 오가노이드는 사멸한 세포 (붉은 형광)가 매우 많은 것을 확인하였다 (도 29 (A)).

또한, Live/Dead 염색 후 촬영한 이미지를 정량 분석하였다 (왼쪽: 오가노이드 내 Live+ 세포 영역 (초록 형광) 면적 비교, 오른쪽: 오가노이드 내 Dead+ 세포 영역 (붉은 형광) 면적 비교) (도 29 (B)).

또한, 탈세포 장 조직 유래 IEM 하이드로젤과 매트리젤에 각각 캡슐화한 상태에서 동결 보관하기 전과 후의 오가노이드 형태 이미지를 얻은 결과, 매트리젤에 캡슐화하여 동결 보관한 후 해동한 장 오가노이드는 구조가 많이 부서지고 세포가 사멸한 부분이 많았으나, 탈세포 장 조직 유래 IEM 하이드로젤에 캡슐화하여 동결 보관하고 해동한 장 오가노이드의 경우 구조 및 모양이 동결 보관 이전과 거의 유사한 수준으로 그대로 잘 유지되고 있음을 확인하였다 (도 29 (c)).

탈세포 장 조직 유래 IEM 하이드로젤과 매트리젤에 각각 캡슐화한 상태에서 동결 보관하기 전과 후의 오가노이드 내 세포사멸 유전자(Caspase-3) 발현 qPCR 분석한 결과, 매트리젤에 캡슐화하여 동결 보관한 오가노이드는 해동 후 세포사멸 유전자의 발현이 높아졌으나, 탈세포 장 조직 유래 IEM 하이드로젤에 캡슐화하여 동결 보관한 오가노이드의 경우 동결 전과 후의 차이가 없음을 확인하였다 (도 29 (D)).

이러한 결과들을 통해, 탈세포화 장 조직 유래 IEM 하이드로젤 지지체를 오가노이드 동결 보관에 이용하면 동결된 장 오가노이드를 해동 후 번거로운 과정 없이 바로 배양에 이용할 수 있으며 동결 및 해동 과정 동안의 손상으로부터 오가노이드를 보호해주기 때문에 오가노이드 보관 및 해동 후 배양에 매우 유리한 장점을 얻을 수 있다.

실험예 3-9. 지지체 조성물과 미세유체 칩을 이용한 장 오가노이드 대량 배양 가능성 가능성 확인

실시예 1-2.의 지지체 조성물 (하이드로젤)과 미세유체 칩을 이용한 장 오가노이드 대량 배양 가능성 가능성을 확인하였다.

구체적으로, 미세유체칩은 다중 오가노이드 챔버로 구성되어 오가노이드의 동시 대량 배양이 가능하며 간단한 교반기 (rocker)만을 이용해서도 미세한 배양액 흐름을 오가노이드에 제공할 수 있어 효과적인 동적 배양이 가능하게 된다 (도 30 (A). 이 장치에 본 발명의 지지체를 이용하여 장 오가노이드를 배양하였다.

오가노이드 대량 배양이 가능한 미세유체칩 내에 탈세포 장 조직 유래 IEM 하이드로젤 지지체를 이용하여 장 오가노이드를 배양한 결과 (배양 6일차) (도 30 (B)) 각 챔버마다 많은 장 오가노이드가 형성되어 배양될 수 있음을 확인하였다.

이러한 결과를 통해 탈세포 장 조직 유래 IEM 하이드로젤 지지체 내에 삼차원 배양되는 장 오가노이드는 미세유체 칩 기술과 접목이 되면 조직 특이적 세포외기질 미세환경과 정밀한 미세유체 흐름의 동적 배양이 결합되어 효율적인 오가노이드 대량 생산이 가능함을 알 수 있다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (11)

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5. (a) 분리된 장 조직을 0.1 내지 5%의 Triton X-100 및 0.01 내지 0.5% 수산화 암모늄을 포함하는 탈세포화 용액과 함께 교반시켜 탈세포된 장 조직을 제조하는 단계;
   (b) 상기 탈세포된 장 조직을 건조하여 탈세포 장 조직 유래 세포외기질(Intestinal Extracellular Matrix; IEM)을 제조하는 단계; 및
   (c) 상기 건조된 탈세포 장 조직 유래 세포외기질을 겔화(gelation)하는 단계; 를 포함하는 지지체 조성물 제조방법.
   
6. 제5항에 있어서,
   상기 (a) 단계에서 상기 장 조직은 돼지 장의 모든 점막층인 지지체 조성물의 제조방법.
   
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9. 제5항에 있어서,
   상기 (a) 단계의 탈세포는 장 조직 세포가 95 내지 99.9% 제거된 지지체 조성물 제조방법.
   
10. 제5항에 있어서,
    상기 (b) 단계 이후, 탈세포 장 조직 유래 세포외기질은 0.01 내지 10 mg/mL 로 포함되도록 조절하는 단계를 더 포함하는 것인 지지체 조성물 제조방법.
    
11. 제5항의 제조방법에 의해 제조된 지지체 조성물에서 장 오가노이드를 배양하는 방법.