KR20190115454A - 포유동물 인슐린 생산 세포의 세포 생성물 및 이를 이용하기 위한 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명의 기술적 목적은 인슐린 생산 세포 수득 기술을 간편화하여, 분화된 세포 배양액 중 기능상 활성인 인슐린 생산 세포를 적어도 70% 수득하는 것이다. 본 방법은 상피 전구 세포를 수득한 다음, 이로써 얻어진 세포를 글루코스 감수성 인슐린 분비가 가능한 췌장 세포로 분화시키는 단계를 포함하는데, 이때의 췌장 분화는 2 단계, 즉 (a) 4일 내지 15일 이내에 적어도 포유동물의 혈청, 글루타민, 표피 성장 인자, 트랜스페린, 아셀렌산나트륨, 레티노산, 이소프로테레놀을 함유하는 배양 배지 중에서 세포를 분화시키는 제1 단계; 및 (b) 4일 내지 15일 이내에 적어도 포유동물의 혈청, 글루타민, 표피 성장 인자, 레티노산, 니코틴아미드, 간세포 성장 인자, 덱사메타손을 함유하는 배양 배지 중에서 세포를 분화시키는 제2 단계로 진행되고; 상기 두 단계에서의 배양은 5% CO₂ 가스 대기 중에 37℃에서 진행된다. 본 발명군은 포유동물의 인슐린 생산 세포와, 인간을 포함하는 포유동물의 췌장 상피 전구 세포의 분화 방법뿐만 아니라, 세포 생성물을 사용하는 진성 당뇨병의 대체 요법을 위한 방법을 포함한다.

Description

포유동물 인슐린 생산 세포의 세포 생성물 및 이를 이용하기 위한 방법

본 발명 군은 재생 의료 및 세포 기술에 관한 것이다.

진성 당뇨병은, 글루코스 흡수 장애에 의해 특징지어지고, 인슐린 호르몬 부족으로 말미암는 내분비계 질환이다. 그 결과 고혈당증에서는 혈중 글루코스 수준이 계속해서 꾸준히 증가하고, 이로 말미암아 임의의 유형의 대사 장애(탄수화물, 지질, 단백질, 무기질, 염수)가 초래된다. 포유동물 체내에서 인슐린은 내분비 기관인 췌장 중 랑게르한스섬(Langerhans islet)이라고 칭하여지는 해부학적 구조물에 모여있는 베타 세포에 의해 생산되는 것으로서, 글루코스 의존적 인슐린 분비 능력을 가지는 것에 의해 특징지어진다. 진성 당뇨병의 주요 유형들로서는 제I형 당뇨병 및 제II형 당뇨병이 있다. 제I형 진성 당뇨병(또는 이용불능성 당뇨병)은, 베타 세포 단백질에 대한 자가반응성 항체 반응에 의해 영향을 받은 면역 세포에 의해 베타가 파괴되고, 이에 따라 인슐린이 부족해져 유발되는 내분비계의 지가면역 질환이다. 청소년, 다시 말해 어린이, 10대, 30세 미만의 사람들에서 이러한 유형의 당뇨병이 가장 흔히 발현된다. 제II형 진성 당뇨병(인슐린 의존적 당뇨병)은 인슐린에 대한 조직 감수성(인슐린 내성)의 감소와 연관된 만성 고혈당증에 의해 특징지어지는 대사 질환이다, 이 질환의 초기 단계에서는 인슐린 분비량은 증가한다. 시간이 경과함에 따라 인슐린 과다분비는 베타 세포를 소진시킨다. 제II형 당뇨병은 모든 진성 당뇨병 사례자들의 85% 내지 90%를 차지하고, 가장 흔하게는 40세 이후의 사람들에서 발병한다[Gavin J.R., Davidson M.B., DeFronzo R.A., Drash A, Gabbe S.G., Genuth S., Harris M.I., Kahn R., Keen H., Knowler W.C., Lebovitz H., Maclaren N.K., Palmer J.P., Raskin P., Rizza R.A., Stern M.P. Report of the Expert Committee on the Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus. Diabetes Care. 2003. 26(1). s5-s20].

당뇨병 및 이의 증상과 후유증의 치료 방법을 개발함에 있어서, 실험 동물의 실험적 당뇨병 실험 모델이 종종 사용된다. 몇몇 모델은 유전적으로 조정된 당뇨병을 발병시킨 실험 마우스의 유전 형질을 기반으로 한다[Antoniou A.N., Elliott J., Rosmarakis E., Dyson P.J. MHC class II Ab diabetogenic residue 57 Asp/non-Asp dimorphism influences T-cell recognition and selection. Immunogenetics. 1998. 47(3) 218-225, Driver J.P., Serreze D.V., Chen Y.G. Mouse models for the study of autoimmune type 1 diabetes: a NOD to similarities and differences to human disease. Semin. Immunopathol. 2011. 33. 67-87].

진성 당뇨병의 또 다른 실험 모델군은 화학 물질에 의한 베타 세포의 선택적 파괴가 수반되는, 화학적으로 유도된 당뇨병 모델로 구현된다. 구체적으로 스트렙토조토신이 적용될 수 있다(즉 베타 세포의 항생제 유도 특이적 괴사)[Lenzen S. The mechanisms of alloxan- and streptozotocininduced diabetes. Diabetologia. 2008. 51(2). 216-226].

진성 당뇨병의 문제점들을 극복하는데 있어서 실현 가능한 방법들 중 한 가지로서는, 인슐린 생산 세포를 인간의 체내에 주입함으로써 글루코스 의존적 인슐린 분비에 대해 사라진 베타 세포의 기능을 보완하여 실현되는 세포 대체 요법(cell replacement therapy)이 있다.

진성 당뇨병 발병 환자에의 인간 또는 동물 공여개체 세포 이식 방법(이종이식법)이 기술된 바 있다. 구체적으로 진성 당뇨병 환자에게 공여개체 랑게르한스섬을 이식하는 방법이 그것이다[Shapiro AM, et al., N. Engl. J. Med. 2006. 355(13). 1318-1330].

그러나 이러한 방법은, 췌장으로부터 유래한 인간 공여개체 세포의 낮은 가용성과, 동물로부터 수득한 물질의 생물 안전성에 관한 풀리지 않은 의문점(예컨대 돼지 세포에서 생성 및/또는 발생될 수 있는 프리온 및/또는 질환에 인간이 감염될 위험)과 연관된 심각한 제약을 가지고 있다. 더욱이 이종계 이식은, 투여된 외래 생물 물질에 반응하여 일어나는 면역계 억제에 대해 면역성을 보여야 한다. 면역 억제에 대한 대안으로서, 생체 적합성 재료로 만들어진 특별한 용기에 외래 세포를 담아서, 면역계 세포가 영양 물질과 인슐인은 받아들이되, 예컨대 문헌[Skinner SJM, et al., InTech. 2011. V. 11. 391-408, US20040197374 A1 dated 07.10.2004]에 기술된 바와 같은 물질은 받아들이지 않도록 만드는 것을 시사하는 다수의 방법이 제안될 수 있다. 그러나 이러한 용기는 섬유 낭을 형성하면서 점차 결합 조직과 함께 과 성장하게 되고, 이로써 시간의 경과에 따라 인슐린의 체내 공급 및 영양 물질의 세포내 공급 효능이 저하되며, 결국에는 세포 사멸이 초래된다.

시험관 내 내분비 췌장 분화를 이용하여 배 줄기세포 또는 유도 만능 세포로부터 인슐린 생산 세포를 수득하기 위한 몇 가지 방법을 이용할 것이 제안되었다. 문헌 WO2002092756 A2 21.11.2002에서, 배 줄기세포는 원천적으로 혈청 대체물, 필수 아미노산, 머캅토에탄올, 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF)를 함유하는 무혈청 배지 중 배양보조세포층에서 배양된다. 그 다음, 세포는 비접착성 표면을 가지는 배양 평판상에서 상기 진술된 바와 같되, bFGF를 함유하지 않는 배지 중 현탁 배양액에 노출된다. 생성된 배 소체들은 해체된 다음, 다음과 같은 인자들, 즉 "인슐린-트랜스페린-셀레나이트" 첨가제, B27 첨가제, N2 첨가제, bFGF, 라미닌 및 니코틴아미드가 보충된 무혈청 배지 중 피브로넥틴으로 덮인 배양 플라스크에 담긴다. 20일 내지 30일 후에 글루코스 의존적 방식으로 인슐린을 분비하는 세포가 유도되고, 안정적인 세포주가 수득된다.

또 다른 방법[Jiang W, et al., Cell Res. 2007. 17(4). 333-344]에는, 배 줄기세포는 무혈청 배지 중에서 배양된 다음, 1% 마트리겔(B&D Biosciences, USA)로 덮인 배양 플라스크에 옮겨 담기게 되고, 배양 배지는 "인슐린-트랜스페린-셀레나이트" 첨가제, 모노티오글리세린, 알부민이 보충된 50% F12 혼합물(F12 Nutriefnt Mixture) 및 50% Iscove 변형 Dulbecco 배지(IMDM)로 교체된다. 이틀 후에 액티빈 A가 세포에 첨가되고, 4일 후에는 레티노산이 첨가된다. 4일 후, 배양 배지는 인슐린-트랜스페린-셀레나이트" 첨가제, 알부민, 염기성 섬유아세포 성장 인자가 보충된 DMEM/F12 1:1로 교체된다. 3일 후 니코틴아미드가 배지에 첨가된다. 5일 후 세포는 배양되어 회전타원체 형태로 성숙되고, 추후 5일 동안 이 상태가 지속된다. 그 결과 C-펩티드, 인슐린, 글루카곤, 글루코스 운반체 2형(GLUT2)을 발현하는 세포가 수득된다. 기술된 방법이 이용되었을 때, 세포 중 15%만이 유효한 췌장 분화를 진행하게 된다.

줄기세포를 인슐린 생산 세포로 분화시키기 위한 방법으로서, 베타 세포 분화에 필요한 유전자, 즉 PDX1, PAX4, PAX6, NGN3, NKX6.1, NKX6.2, NKX2.2, HB9, BETA2, NEUROD, ISI1, HNF1-알파, HNF1-베타, HNF3의 군으로부터 선택되는 유전자 하나 이상 또는 이 유전자들의 조합의 활성화를 목표로 하는 다수의 분화 배지를 사용하는 것을 기반으로 하는 방법이 존재한다[US20050054102 A1 10.03.2005]. 줄기세포는 처음에 비접착성 표면을 가지는 평판에서 배양되어 배 소체를 형성하게 되며, 이후에는 소 태아 혈청, L-글루타민, 필수 아미노산, 표피 성장 인자, 염기성 섬유아세포 성장 인자, 프로게스테론, 폴리스타틴 및/또는 액티빈이 보충된 IMDM 배지 중에서 분화된다. 그 결과 인슐린 생산 세포들 중 적어도 20%가 15일 이내에 수득되지만, 수득된 배양액은 이종의 것이어서, 상이한 유형의 세포를 함유하게 된다. 글루코스 의존적 인슐린 분비가 가능한 기능성 인슐린 생산 세포 수득을 실현시키는, 배 줄기세포 및 만능 줄기세포의 췌장 분화(pancreatic differentiation)에 관한 프로토콜이 기술되어 있다[Pagliuca FW, et al., Cell. 2014. 159(2). 428-439]. 인간 만능 세포의 분화는 다단계 프로토콜에 따라서 28일 내지 33일 이내에 수행된다.

이러한 분화의 결과로서 수득된 세포는 성숙한 베타 세포와 거의 동일하게 글루코스 의존적 인슐린 분비를 높은 수준으로 달성할 수 있다. 이 세포가 실험적 당뇨병을 발병시킨 면역결핍 마우스(SCID/AKITA) 체내에 이식된 후, 세포는 혈중 글루코스 수준을 정상화하였다.

만능 세포(배 줄기세포 및 유도 만능 세포)의 췌장 분화를 기반으로 하는 방법들의 군은 이의 사용을 제한하는 유의미한 단점들을 가지는데: 첫 번째, 대부분의 방법은 낮은 분화 효율(즉 세포의 약 15% 내지 40%만이 인슐린을 합성할 수 있음)을 특징으로 한다. 두 번째, 배 줄기세포가 사용될 때, 이 세포의 원천은 인간 배로부터 유래하는 재료이고, 이의 제조는 윤리적 문제와 연관되어 있다. 세 번째, 생성된 세포 배양액은 오로지 동종이계 이식에만 사용될 수 있는데, 다시 말해서 이러한 세포의 수명은 한정적이고, 삽입된 인슐린 생산 세포를 체내에 유지시키기 위해서는 특별한 노력이 필요하다. 유도 만능성을 보이는 세포는 자기 유래의 것으로서 사용될 수 있지만, 이의 수득 방법에는 시간이 많이 소요되고, 비용도 많이 든다. 마지막으로 배 줄기세포 및 유도 만능 세포는 종양 발생 특성을 보이고, 체내에 도입될 때 기형 종양을 형성하는 경향이 있다.

췌장 조직 이외의 조직에서 췌장 호르몬 생산을 제어하며 유도하기 위한 방법이 공지되어 있다[US6774120 B1 10.08.2004]. 이 방법은 PDX1 유전자(췌장 및 십이지장 호메오박스 1)의 이소성 발현을 달성하는 것을 기반으로 한다. 이 방법에서 PDX1의 mRNA 또는 폴리펩티드가 투여되었을 때, 일시적인 효과가 나타났을 뿐 인슐린의 안정적 합성은 달성되지 않았다. 이와 동시에 외래 DNA가 투여되었을 때에는 의료적 용도에 있어서 어떤 한계를 보였는데, 그 이유는 이 외래 DNA가 돌연변이, 수용개체의 세포 손상 및 발암 형질변형(oncotransformation) 가능성의 위험을 운반하기 때문이다. 수용개체의 체내에 도입된 벡터 구조체의 사용과 연관된 추가의 문제점은, 시간이 경과하고 도입된 DNA가 메틸화됨에 따라서 이 벡터 구조체가 제거될 위험이 있다는 점이다. 이 모든 것은 시간이 경과함에 따라 표적 유전자 발현이 감소하거나 중단되는 결과를 초래한다.

상기 언급된 문제점들을 극복하기 위해서, 용이하게 접근 가능한 인간 세포 유형들, 예컨대 간엽성 세포 또는 상피 세포로부터 인슐린 생산 세포를 유도시키는 것을 규정하는 접근법들이 제안되었다.

간엽성 제대혈 줄기세포를 인슐린 생산 세포로 분화시키는 것에 관한 문헌이 있다[Prabakar KR, et al., Cell Transplant. 2012. 21(6). 1321-1339]. 이 문헌의 저자들은 5개의 단계를 포함하는 분화 프로토콜(총 지속 시간 3주 초과)을 이용하였다. 제1 단계에서, 세포는 액티빈 A 및 Wnt3a(무 날개형 MMTV 통합 부위 과(wingless-type MMTV integration site family)의 3A 일원)가 첨가된 RPMI 배지 중에서 3일 동안 항온처리되었다. 제2 단계에서, 섬유아세포 성장 인자 10(FGF-10) 및 CYC(3-케토-N-아미노에틸-아미노-카프로일-디하이드로신나모일 사이클로파민)가 2% 소 태아 혈청을 함유하는 RPMI 배지에 첨가되었고, 세포는 4일 동안 항온처리되었다. 제3 단계에서, 배지는 레티노산, CYC, FGF10 및 B27 첨가제가 보충된 DMEM으로 교체되고, 세포는 4일 동안 항온처리되었다. 제4 단계에서, DAPT(N-[N-(3,5-디플루오로페나세틸)-L-알라닐]-S-페닐글리신 t-부틸 에스테르) 및 엑센딘 4(Ex4, 엑센딘-4)가, B27 첨가제를 함유하는 DMEM 배지에 첨가되었고, 세포는 3일 동안 항온처리되었다. 제5 단계에서, 세포는 B27 첨가제, Ex4, 간세포 성장 인자(HGF) 및 인슐린 유사 성장 인자 1(IGF1)이 보충된 CMRL 배지 중에서 4일 동안 항온처리되었다. 이로부터 생산된 세포는 시험관 내에서 C-펩티드를 글루코스 의존적으로 분비할 수 있었다. 인간 C-펩티드가 면역결핍 NOD/SCID 마우스에 이식된 후, 이 인간 C-펩티드는 또한 동물 혈청 중에서 검출되었다. 그러나 이 프로토콜은 시간과 노력이 많이 소요되는데, 그 이유는 이때 사용된 간엽성 세포가 췌장 베타 세포가 속하는 선 상피(glandular epithelium)에 속하지 않기 때문이다.

인슐린 생산 세포를 수득하기 위해 저자들이 조직발생학적으로 베타 세포에 가까운 악하 타액선 세포를 이용하였던 문헌도 있다[Sato A, et al., Cloning Stem Cells. 2007. 9(2). 191-205]. 췌장 세포 분화는 10% 소 태아 혈청, 10 mM 니코틴아미드 및 20 ng/ml 표피 성장 인자가 보충된 William E 배지 중 회전타원체 배양에 의해 유도되었다. 그 결과, 배양 6일째 되는 날에 세포는 PDX1, 인슐린 및 C-펩티드를 발현하는 능력을 획득하였다. 세포는 C-펩티드를 글루코스 의존적 방식으로 분비하는 능력도 또한 획득하였다. 그러나 상피 세포 분화 프로토콜은 이 경우에 최적이지 않아서, C-펩티드를 비교적 낮은 수준, 즉 단백질 1 mg당 약 0.5 ng으로 수득하도록 허용하였는데, 이는 미분화 인간 타액선 세포에서의 c-펩티드 백그라운드 발현 수준과 거의 동일한 수준이다.

본 특허의 대상과 가장 유사한 것은 시험관 내에서 배양된 CD49f-양성 인간 타액선 세포로부터 인슐린 양성 세포를 수득하는 방법이다[US7659121 B2 BIOS RES INST INC. 09.02.2010]. 사용된 세포는 인간 타액선의 선상 상피 세포이고, 이 세포는 표피 성장 인자(EGF), 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF) 및 백혈병 억제 인자(LIF)의 존재하에 회전타원체 배양 방법을 통하여 시험관 내 배양으로 인슐린-양성 세포로 분화될 수 있다. 인슐린 양성 세포를 수득하기 위해서, 타액선 세포는 비접착성 조건하에 배양되고, 그 결과 소 태아 혈청 및 글루카곤 유사 펩티드-1(GLP-1)이 보충된 William E 배지 중에 회전타원체가 생성된다. 7일 후, 회전타원체에서 인슐린 발현이 확인되었다. 이 세포는 췌장 병상을 치료하기 위해 사용될 수 있다, 그러나, 이러한 원조 방법은 심각한 단점들을 가지는데; 이 접근법은 세포가 올바른 방향으로 완전히 분화하는 것을 허용하지 않아서, 분화의 초기 단계를 나타내는 글루카곤-양성 세포 및 인슐린-양성 세포의 혼합 배양을 초래한다. 이 연구는, 인슐린을 글루코스 의존적 방식으로 분비할 수 있는 인슐린 생산 세포의 제조를 입증하지 못하고, 이때 사용된 방법의 효능을 입증하는 정량적 데이터도 존재하지 않는다.

그러므로 현 시점에서 용이하게 입수 가능한 원천으로부터 유래한 세포와, 간단하고 오래 걸리지 않는 분화 프로토콜을 이용하여 진성 당뇨병의 대체 세포 치료를 위해 인슐린 생산 세포를 수득하는 것에 관한 문제점은 해결되지 않은 상태이다. 본 발명은 이러한 문제에 대한 해결책이 될 것으로 생각된다.

본 발명은, 상피 전구 세포를 수득한 다음, 추후 이 세포를 글루코스 의존적 인슐린 분비가 가능한 세포로 췌장 분화시키는 단계를 포함하는, 인슐린 생산 포유동물 세포 생성물을 수득하기 위한 방법으로서, 다만 췌장 분화는 하기와 같이 2 단계, 즉

(a) 4일 내지 15일 동안 적어도 포유동물의 혈청, 글루타민, 표피 성장 인자, 트랜스페린, 아셀렌산나트륨, 레티노산, 이소프로테레놀을 함유하는 배양 배지 중에서 세포를 분화시키는 제1 단계; 및

(b) 4일 내지 15일 동안 적어도 포유동물의 혈청, 글루타민, 표피 성장 인자, 레티노산, 니코틴아미드, 간세포 성장 인자, 덱사메타손을 함유하는 배양 배지 중에서 세포를 분화시키는 제2 단계로 진행되는 방법에 관한 것이다. 바람직한 구현예들에서, 제1 단계의 분화 배양 배지는 혈청 2 부피% ~ 20 부피%, 글루타민 1 mM ~ 4 mM, 표피 성장 인자 1 ng/ml ~ 300 ng/ml, 트랜스페린 0.1 mcg/ml ~ 20 mcg/ml, 아셀렌산나트륨 0.1 ng/ml ~ 20 ng/ml, 레티노산 0.1 μM ~ 20 μM, 이소프로테레놀 0.1μM ~ 10 μM을 함유한다.

바람직한 구현예들에서, 제2 단계의 분화 배양 배지는 혈청 2 부피% ~ 20 부피%, 글루타민 1 mM 이상 ~ 4 mM, 표피 성장 인자 1 ng/ml ~ 300 ng/ml, 트랜스페린 0.1 μg/ml 이상, 아셀렌산나트륨 0.1 ng/ml ~ 20 ng/ml, 레티노산 10 nM ~ 20 μM, 니코틴아미드 1 mM ~ 100 mM, 간 세포 성장 인자 1 ng/ml ~ 300 ng/ml, 덱사메타손 0.01μM ~ 5 μM을 함유한다.

몇몇 구현예들에서, 제1 단계의 분화 배양 배지는 추가로 인슐린 유사 성장 인자 1, 섬유아세포 성장 인자 10, 섬유아세포 성장 인자 4 및/또는 각질세포 성장 인자를 포함하되, 이에 한정되는 것은 아니다.

몇몇 구현예들에서, 제2 단계의 배양 배지는 추가로 인슐린 유사 성장 인자 1 및/또는 베타셀룰린을 함유한다.

상피 전구 세포는 타액선, 소장, 위, 간 또는 췌장 생검편으로부터 단리된다.

상기 두 단계에서의 배양은 5% CO₂의 존재하에 온도 37℃의 CO₂ 항온처리기 내에서 수행된다. 몇몇 구현예들에서, 배양은 5% CO₂ 및 5% O₂ 존재하에 수행된다.

몇몇 구현예들에서, 상피 전구 세포는 자체의 바이오매스를 증가시키기 위해 췌장 분화 전에 추가로 배양된다.

공지의 방법들과는 달리, 제안된 분화 방법은 성체로부터 용이하게 수득될 수 있는 상피 전구 세포로부터 인슐린 생산 세포를 제조하는 것이 가능하다. 이러한 세포는 시험관 내 증식이 잘 된 배양액을 형성하고, 용이하게 성장하여 큰 세포 덩어리를 이룰 수 있다. 분화 절차는 간단하고 시간이 많이 소요되지는 않는다.

본 발명의 기술적 성과는 인슐린 생산 세포 제조 기술을 간편화하여, 분화된 세포 배양액 중 기능상 활성인 인슐린 생산 세포를 적어도 70% 수득하는 것에 있으며, 이는 분화에 최적인 조건을 선택함으로써 달성된다. 이로부터 생성된 세포는 글루코스 의존적 방식으로 인슐린을 생산한다.

인간을 포함한 포유동물의 세포 생성물인 인슐린 생산 세포로서, 등장 용액 1 ml 중 적어도 1백만개 세포 또는 등장 용액 1ml 중 1만개 이상의 회전 타원체를 함유하는 세포 생성물도 또한 제공되는데, 이는 본 발명의 방법을 이용하여 수득된다. 주사용 생리 염수의 멸균 용액을 이용한 등장 용액으로서는 인산염 완충 염수, Hank 용액 및 Versene 용액 등이 있다.

본 발명의 세포 생성물은 인간을 포함하여 포유동물을 대상으로 하는 진성 당뇨병 대체 요법 및 이 진성 당뇨병에 관한 과학적 연구에 사용될 수 있다. 당뇨병이 발병한 수용개체의 체내에 5천만 ~ 2억개 세포를 함유하는 세포 생성물을 이식하는 방법을 포함하여 진성 당뇨병 대체 요법을 위한 방법도 제공된다. 본 발명의 몇몇 구현예들에서, 세포 생성물은 1개월 ~ 6개월 간격을 두고 2회 ~ 5회 투여된다. 세포 생성물은 자기 유래 및 동종이계 이식편 선택권 둘 다에 사용될 수 있다. 몇몇 경우들에 있어서, 세포 생성물은 3차원 조건에서 추가로 배양되고, 회전타원체의 형태로 투여된다.

진성 당뇨병이 발병한, 인간을 포함하는 포유동물 체내로 세포 생성물을 투여하는 것은, 혈중 글루코스 수준의 감소, 혈중 글루코스 농도 단속성 감소, 그리고 췌장 랑게르한스섬의 재생을 달성한다.

도 1 및 도 2는, 인간 타액선 상피 전구 세포의, 프로인슐린(proinsulin)에 대한 항체로의 면역세포화학적 염색 결과(도 1) 및 인슐린에 대한 항체로의 면역세포화학적 염색 결과(도 2)를 보여준다. 세포 핵(염료: DAPI)과 세포질 내 프로인슐린(염료: Alexa Fluor 488)이 염색된다.
도 3 및 도 4는, 세포 생성물의 인슐린 분비 세포의, 프로인슐린에 대한 항체로의 면역세포화학적 염색 결과(도 3) 및 인슐린에 대한 항체로의 면역세포화학적 염색 결과(도 4)를 보여준다. 세포 핵(염료: DAPI)과 세포질 내 프로인슐린(염료: Alexa Fluor 488)이 염색된다.
도 5 및 도 6은, 회전타원체 동결절편의, 프로인슐린에 대한 항체로의 면역세포화학적 염색 결과(도 5) 및 인슐린에 대한 항체로의 면역세포화학적 염색 결과(도 6)를 보여준다. 세포 핵(염료: DAPI)과 세포질 내 프로인슐린(염료: Alexa Fluor 488)이 염색된다.
도 7은, 복막내 이식후 3일째 되는 날의, 실험 누드(Nude) 마우스의 췌장 동결절편의 면역세포화학적 염색 결과를 보여준다. 세포 핵(염료: DAPI, 회색 부분: 핵), 즉 인간 핵 세포는 인간 핵에 대한 항체로 염색되고(Alexa Fluor 488, 흰 부분: 핵), 인슐린은 세포질 내에서 염색된다(Alexa Fluor 546).
도 8은, 세포 생성물 이식 후 3일째 되는 날의, 누드 마우스 췌장 동결절편의 면역세포화학적 염색 결과를 보여준다. 세포 핵(염료: DAPI), 즉 인간 핵 세포는 인간 핵에 대한 항체로 염색되고(Alexa Fluor 488, 흰 부분: 핵), 대식세포 마커 CD68은 세포질 내에서 염색된다(Alexa Fluor 546). 동결절편의 두께는 10 μm이다.
도 9, 도 10 및 도 11은, 실험 개시후 40일째 되는 날의, 건강했던 마우스(도 9), 스트렙토조토신 유도성 당뇨병을 발병시킨 마우스(도 10), 그리고 스트렙토조토신 유도성 당뇨병을 발병시키되, 세포 생성물도 이식한 마우스(도 11) 췌장의 조직학적 절편들의 사진을 보여준다. 광학 현미경 하에 헤마톡실린-에오신 염색이 이루어졌으며, 이때 절편의 두께는 5 μm였다.

전술된 바와 같이, 본 발명은 인간을 포함한 포유동물의 상피 전구 세포의 췌장 분화를 위한 방법, 인슐린 생산 세포를 포함하고 진성 당뇨병의 대체 요법 위한 세포 생성물 제제, 그리고 본 발명의 세포 생성물이 체내에 도입될 때 혈중 글루코스 수준을 교정함에 의한, 진성 당뇨병의 대체 요법을 위한 방법을 제공한다.

인간을 포함하여 포유동물의 상피 전구 세포를, 글루코스 의존적 인슐린 분비가 가능한 세포로 분화시키기 위한 방법은 시험관 내에서 췌장을 분화시키는 신규 방법으로서, 하기와 같은 2 단계, 즉

(a) 4일 내지 15일 동안 적어도 다음과 같은 첨가제, 즉 표피 성장 인자, 트랜스페린, 아셀렌산나트륨, 레티노산, 이소프로테레놀의 존재하에 적어도 소 태아 혈청 및 글루타민이 보충된 배양 배지 중에서 세포를 배양하는 제1 단계; 및

(b) 4일 내지 15일 동안 적어도 다음과 같은 첨가제, 즉 표피 성장 인자, 레티노산, 니코틴아미드, 간세포 성장 인자, 덱사메타손의 존재하에 적어도 소 태아 혈청 및 글루타민이 보충된 배양 배지 중에서 세포를 배양하는 제2 단계를 포함한다.

본 세포 생성물은 전술된 바와 같은 췌장 분화에 의해 목록 c-Kit, Sca-1, EpCAM, LGR-5와 같은 마커들 중 하나 이상을 발현하는 인간 상피 전구 세포로부터 수득된 인슐린 생산 세포이다. 세포가 분화된 후, 이 세포는 목록 PDX1, NGN3, MAFA, NKX6.1, PAX4, PAX6 및 인슐린과 같은 마커들 중 하나 이상이 발현됨으로 말미암아 글루코스 의존적 인슐린 분비 능력을 획득하게 되고, 자신의 표현형도 바뀐다. 본 발명의 세포 생성물은 인슐린 생산 세포를 적어도 70% 함유한다.

진성 당뇨병의 대체 요법을 위한 방법은, 진성 당뇨병 발병 환자에게 본 발명의 세포 생성물을 투여하는 단계를 포함한다. 세포 생성물의 투여는, 진성 당뇨병의 사례에 있어서의 혈중 글루코스 수준 감소, 혈중 글루코스 농도의 단속성 감소, 그리고 췌장 랑게르한스섬의 재생을 초래한다.

본 발명이 추가로 기술되기에 앞서, 특정 구현예들의 변형예들이 나올 수 있으며, 이 변형예는 본 발명에 첨부된 특허청구의 범위 안에 여전히 속하므로, 본 발명은 이하 기술된 본 발명의 특정 구현예들에 한정되지 않음이 이해되어야 할 것이다. 사용된 용어는 특정 구현예들을 기술하기 위한 것이지, 이것들을 제한하고자 하는 것은 아님도 또한 이해되어야 할 것이다. 그 대신, 본 발명의 범위는 첨부된 특허청구의 범위에 의해 확립될 것이다.

본 명세서 및 첨부된 특허청구의 범위에 있어서, 단수 형태임을 나타내는 "하나", "하나의" 및 "본"은 내용 중 달리 명확하게 명시되지 않는 한 복수의 대상도 포함하여 나타낸다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당 업자에게 보통 이해되는 바와 동일한 의미를 가진다.

어떠한 값의 범위가 제공되는 경우, 그 사이에 속하는 각각의 값, 내용중 달리 명확하게 명시되지 않는 한 하한치 단위의 소수점 첫째 자리, 해당 범위의 상한치와 하한치 사이, 그리고 진술된 해당 범위 중 기타 임의의 진술된 값 또는 그 사이의 값은 본 발명에 포함된다. 이처럼 그 크기가 더 작은 범위의 상한치 및 하한치는, 진술된 범위 중 특별히 배제된 임의의 한계치에 따라서 독립적으로 크기가 더 작은 범위에 포함될 수 있을 뿐만 아니라 본 발명에 포함되기도 한다. 진술된 범위가 한계치들 중 어느 하나 또는 둘 다를 포함하는 경우, 이처럼 포함된 한계치들 중 어느 하나 또는 둘 다를 배제하는 범위도 또한 본 발명에 포함된다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당 업자에게 보통 이해되는 바와 동일한 의미를 가진다. 본원에 기술된 방법, 장치 및 재료와 유사하거나 동등한 임의의 방법, 장치 및 재료는 본 발명을 실시 또는 시험하는데 사용될 수 있지만, 지금부터는 바람직한 방법, 장치 및 재료가 기술된다.

본원에 언급된 모든 공보들은, 현재 기술된 발명과 연계되어 이용될 수 있는 공보에 기술된 발명의 구성요소를 기술 및 개시하기 위한 목적으로 참조로서 본원에 인용되어 있다.

정의

"마커" 또는 "바이오마커"란 용어는, 특정 세포 유형에 존재하여, 해당 세포 유형을 다른 세포 유형과 구별시켜 주는 단백질 또는 mRNA를 지칭한다. 따라서, 본 발명과 연관된 세포는 특이적인 마커 세트에 의해 특징지어진다.

세포와 관련하여 "전구 (세포)" 또는 "미분화 (세포)" 또는 이와 유사한 용어들은, 임의의 세포 유형으로 분화되도록 결정된(하지만, 완전히 분화되지는 않은) 줄기세포를 지칭한다. 전구 세포는 시험관 내 배양시 증식 가능성이 커지고, 바이오마커를 가져서 자신을 다른 세포 유형과 구별시킨다.

세포와 관련하여 "상피(세포)"란 용어는, 상피 조직(상피)으로부터 유래하는 세포를 지칭하는 것으로서, 이는 기저막, 외부 또는 내부 배지와의 경계에 하나의 층을 이루며 인접하여 위치하고, 또한 대다수의 체내 선을 형성하는 극성 분화 세포의 디페론(differon) 세트이다. 상피 조직 군으로서는 2가지가 존재하는데, 즉 표재성 상피(표면 및 내벽) 및 선상 상피(대부분의 선을 이루는 주요 조직)가 그것들이다.

"디페론"이란 용어는, 몇몇 상이한 유형의 세포 집단, 예컨대 (줄기세포, 분열중인 세포, 단순 이행 세포(simple transit cell))를 포함하여 특정의 분화 주(differentiation line)를 이루는, 즉 부모-자손의 관계에 있는 세포 형태들의 응집체를 지칭한다.

"간엽성"이란 용어는, 중배엽 기원의 세포 유형이 적어도 다음과 같은 마커들, 즉 CD29, CD44, CD73, CD90, CD105를 발현하고, 또한 임의의 배양 조건하에 시험관 내 지방 생성, 연골 생성 및 골형성 분화가 가능한 경우를 지칭한다.

"계대배양" 또는 "계대배양하는 것"이란 용어는, 배양 접시로부터 접착성 세포 배양액을 분리하고(보통은 단백분해 효소 사용), 세포를 현탁 상태로 전환시켜 새로운 배양 접시에 옮긴 다음, 배양하여 접착성 배양액을 형성하기 위한 절차를 지칭한다. 본 발명의 관점에서, 세포 배양과 관련하여"제로("0") 계대배양"이란, 1차 계대배양에 대한 항온처리 기간을 의미하고, "1 계대배양"이란, 1차 계대배양 후 2차 계대배양까지의 항온처리 기간을 의미하며, 이 이후의 회차도 마찬가지이다.

"접착성 배양액"이란 용어는 표면 상태에 접착되어 있는 세포를 지칭한다.

"생검재(bioptate)"란 용어는, 공여개체의 신체를 생검하여 수득된 생물 재료를 지칭한다.

"배양"이란 용어는, 세포의 생존 능력 및 증식 특성을 시험관 내에서 유지하며 진행되는 방법 및 프로토콜 세트를 의미한다.

세포 배양은 배양 배지 중에서 진행된다. 배양 배지는 보통 필수 아미노산, 염, 비타민, 무기질, 미량영양소, 당, 지질 및 뉴클레오티드로 이루어진 조성물을 함유하는 영양 배지이다. 배양 배지는 세포의 영양 및 성장 측면에서의 요구를 충족시키는데 필요한 성분들을 세포에 제공한다. 영양 조성, pH 및 삼투압의 측면에서 상이한 배지는 상이한 세포 유형, 세포들 및 상이한 밀도의 세포 배양을 위해 사용된다. 다수의 배양 배지가 문헌에 기술된 바 있다. 다수의 배지가 시판되고 있는데, 이 배지들의 식별은 명칭에 의해 이루어지고, 몇몇 경우에는 배지의 카탈로그 번호에 의해 이루어지기도 한다. 배양 배지는 요망되는 세포 또는 세포 배양액을 유지시키는데 필요한 임의의 성분이 보충될 수 있다. 예를 들어 성장 인자, 알부민, 글로불린 및 기타 성분을 함유하는 포유동물 혈청, 호르몬, 세포 성장 억제제 또는 성장 자극제가 배지에 첨가될 수 있다.

"상피 전구 세포의 배양"이란 용어는, 상피 전구 세포의 표현형을 변경시키지 않는, 상피 전구 세포의 바이오매스를 증가시키기 위한 배양 과정을 의미한다.

"췌장 분화"란 용어는, 임의의 조건하에서 어떤 세포가 췌장의 배타 세포와 유사하게 되는 결과가 초래되는 세포 배양 과정을 지칭하도록 사용되고 있다. 구체적으로 췌장의 베타 세포는 특징적인 유전자 마커, 예컨대 PDX1, NGN3, MAFA, NKX6.1, PAX4 및 PAX6 등의 발현을 겪게 되고, 세포는 인슐린을 합성하는 능력을 획득하게 된다. 세포에 의한 인슐린 생산을 입증하는 것으로서 승인된 검정들 중 하나로서는, 인슐린 성숙(insulin maturation)이 이루어지는 동안 전구체 분자로부터 생성된 생성물인 C-펩티드를 검출하는 것이 있다. 세포 내 C-펩티드의 존재는, 해당 세포가 인슐린을 생산하고 성숙을 겪는다는 것을 암시한다.

"만능성"이란 용어는, 배엽층 3개 모두(즉 내배엽, 중배엽 및 외배엽)의 유도개체로 분화하는 세포의 능력을 지칭한다. "배 줄기세포"란 용어는, 오랜 시험관 내 배양이 진행되는 동안에 만능 특성을 보유하고, 세포 배양액을 형성하는 배세포의 내부 세포 덩어리로부터 유래하는 세포를 지칭한다. "유도 만능성을 보이는 세포"란 용어는, 후성적 리프로그래밍(epigenetic reprogramming)을 통해 체세포로부터 유래하는, 만능 특성을 보유하게 된 세포를 의미한다.

"회전타원체 배양"이란 용어는, 세포들이, 500개 ~ 10000개의 세포를 함유하는 3차원 구상체로 회합되는 것을 허용하는 비 접착성 조건하에서 이루어지는 시험관 내 세포 배양을 의미한다.

"단리된"이란 용어는, 어떤 분자 또는 어떤 세포가, 해당 분자 또는 해당 세포가 자연 조건에서의 배지 이외의 배지 중에 존재하게 된 상태를 지칭한다.

"등장 용액"이란 용어는, 하기 특성들, 즉 pH 7.3 내지 7.7; 삼투압 280+/-20 mOsm/kg; 완충 용량 1.4 ml 이상을 보장하는 용액을 의미한다.

"합류성 단일층"이란 용어는, 세포들이 배양 플라스크 표면의 97%를 초과하는 만큼을 덮을 때 이루는 단일층을 의미한다.

"세포 생성물"이란 용어는, 전술된 바와 같이 시험관 내 2단계 췌장 분화에 의해 인간을 포함한 포유동물의 상피 전구 세포로부터 수득된 세포 배양액을 의미한다.

췌장 분화를 위한 상피 전구 세포

본 발명의 췌장 분화를 위해 마우스, 래트, 돼지, 토끼 및 인간 등을 비롯한 포유동물의 상피 전구 세포가 사용된다. 상피 전구 세포는 다양한 신체 부분, 즉 타액선, 소장, 위, 간 및 췌장으로부터 유래하는 공여개체 세포로부터 수득될 수 있다.

상피 전구 세포를 함유하는 생검재는, 당 분야에 널리 공지된 방법에 의한 생검 또는 수술 절차에 의해 수득된다. 바람직한 구현예들에서, 생검 중 세포 및/또는 조직의 수집은 생체 내에서 수행된다. 만일 세포의 추가 사용이 의료적 목적을 수반하면, 조직 재료 공여개체는 감염성 질환(HIV, B형 및 C형 간염, 매독)을 가지고 있어서는 안 될뿐만 아니라, 암 질환이 발병해서도 안된다.

수집 직후의 생검재는 멸균 조건하에서 배양 배지 또는 등장 용액 및 항생제를 함유하는 Petri 접시로 옮겨진다. 예를 들어 배양 배지 DMEM/F12 1:1, 199, DMEM, IGLA, 알파-MEM, Ham, F12, IMDM 및 RPMI-1640 등, 또는 등장 용액, 즉 인산염 완충 염수, Hank 용액, 생리 용액, Versene 용액 등이 본 발명을 위해 사용될 수 있다. 등장 용액 제제는 당 분야의 연구자들에게 널리 공지되어 있다. 항생제로서 최종 농도 1 μg/ml ~ 100 μg/ml(예컨대 최종 농도 40 μg/ml)의 겐타마이신, 또는 다른 항생제, 즉 최종 농도 5 U/ml ~ 200 U/ml(예컨대 최종 농도 50 U/ml)만큼의 페니실린, 최종 농도 5 μg/ml ~ 200 μg/ml(에컨대 최종 농도 50 μg/ml)만큼의 스트렙토마이신, 또는 당 분야에 공지된 다른 항생제가 사용된다.

최신 기술에 따르면, 세포 단리 조건의 차이는 추가 세포 배양액 및 분화의 품질에 유의미한 영향을 미치지 않는 것으로 공지되어 있다.

추가의 조작들 모두는 GMP(의약품제조품질관리기준; Good Manufacturing Practice) 요건을 충족하는 멸균 조건하에서 수행된다. 상피 조직은 멸균 기구(메스, 핀셋 등)에 의해 기계적으로 분쇄되어 작은 조각, 예를 들어 크기 약 0.5 mm³ ~ 10 mm³의 조각으로 만들어진다. 그 다음, 조직의 조각들은 등장 용액으로 1회 내지 3회 세척되고, 원심분리에 의해 스핀다운(spin-down)되며, 제IV형 콜라게나아제 0.1 mg/ml ~ 10 mg/ml(최적으로는 콜라게나아제 2 mg/ml)과 함께, 1 mM ~ 4 mM 글루타민을 함유하는 DMEM/F12 1:1 배지 중에서 20분 ~ 60분 동안 항온처리(37℃)된다. 그 다음, 세포 현탁액은 나일론 필터(공극 직경 40 μm ~ 100 μm)를 통과하게 되고, 세포는 다시 원심분리에 의해 스핀다운된다.

세포 원심분리 방법은 당 분야에 널리 공지되어 있는데, 예를 들어 원심분리는 5분 ~ 15분 동안 100 g ~ 400 g에서 수행된다.

그 다음, 상피 전구 세포가 증량된 세포 집단이 선택된다. 당 분야에 공지된 다양한 기술이 이를 위해 사용될 수 있다. 예를 들어 세포는 EpCAM, c-Kit, CD49f, LGR5의 군으로부터 선택되는 마커에 따라 자성 선택법 또는 형광 선택법을 이용하여 분취될 수 있다. 예를 들어 세포는 자성 분리에 의해 수득될 수 있다. 이와 관련하여, 세포 현탁액은 선택되어 자성 입자와 접합된 마커에 대한 항체와 함께 항온처리된다. 통상 세포 공여개체가 속하는 동물 종과 동일한 동물 종으로부터 유래하는 마커 단백질에 대한 항체가 사용된다.

타액선, 간 및 췌장으로부터 유래하는 세포가 선택될 때에는 EpCAM 마커가 지배적으로 사용되고, 소장으로부터 유래하는 세포에 대해서는 LGR5 마커가 사용되며, 위로부터 유래하는 세포에 대해서는 c-Kit 마커가 사용된다.

조작은 항체 제조자의 지침에 따라서 수행된다. 예를 들어 항온처리는 약 4℃의 온도(얼음상)에서 10분 내지 60분, 일반적으로는 15분 내지 40분 동안 항체를, 10⁶개 세포당 0.1 μg ~ 10 μg만큼의 항체의 비율로 사용하여 수행된다. 컬럼상에서 이루어지는 자성 분리는 제조자의 지침에 따라 수행된다. 분취된 세포는 이후 원심분리에 의해 스핀다운되고, 인산염 완충 염수로 세척되며, 배양 성장 배지 중에 재현탁된다.

생성된 세포는 췌장 분화에 사용될 수 있거나, 또는 배양 절차를 통해 계대배양되어 상피 전구 세포의 세포량을 증량시킬 수 있다.

상피 전구 세포의 세포량 증량을 허용하는 세포를 배양하는데 임의의 방법이 사용될 수 있는데, 이를 통해서 이러한 세포 유형의 특징을 이루는 마커 세트 및 이 세포 유형의 표현형이 보존되고, 그 결과 세포 배양액의 균질성과 증식 가능성이 보장된다.

예를 들어 타액선으로부터 유래하는 세포를 배양하기 위해서, 래트 세포에 대해 기술된 방법[Okumura K. et al., Hepatology. 2003. 38. 104-113], 마우스 세포[Hisatomi Y. et al., Hepatology. 2004. 39(3). 667-675], 돼지 세포에 대해 기술된 방법[Matsumoto S., et al., Cloning and Stem Cells. 2007. 9. 176-190], 또는 인간 세포에 대해 기술된 방법[WO 2014092575, 2014년 6월 19일 "Means and methods for obtaining salivary gland stem cells and use thereof", Jang S.I. et al., J. Dent. Res. 2015. 94(2). 304-311, WO2004074465, 2009년 3월 12일 "Human salivary gland-origin stem cell"]이 사용될 수 있다. 예를 들어 출원["Human Salivary Gland Cells Culturing Method", 등록번호 2016139283, 등록일 2016년 10월 6일]에 기술된 방법이 사용될 수 있다. 이 방법에 있어서, 세포는 배양 플라스크 내 PCT 표피 각질 세포 배지 중에서 배양되는데, 이때 37℃ 및 5% CO₂ 존재하에서 이 배양 플라스크에는 세포가 접착되고, 세포가 단일층을 이루게 될 때까지 2일 ~ 4일마다 배지는 교체되어야 한다. 이후로는 희석율 1:3 ~ 1:5에서의 세포 계대배양이 수행되는 것인데, 이때의 계대배양은 EDTA 중 트립신 용액으로써 배양 플라스크 표면으로부터 세포를 분리하는 단계와, 분리된 세포를 새 배양 플라스크에 옮기는 단계, 그리고 옮겨진 세포 배양액의 배지를 배양이 진행되는 동안 2일 ~ 4일마다 교체해주고, 세포가 단일층을 이루게 될 때 희석율 1:3 ~ 1:5 이하에서 계대배양을 계속 진행하는 단계를 수반한다. 본 발명의 바람직한 구현예들에서, 세포는 또한 5% O₂ 존재하에 항온처리된다. 이 방법에 관한 몇몇 구현예들에서, 제조 직후의 세포는, 글루타민(최종 농도 1 mM ~ 4 mM) 및 소 태아 혈청(최종 농도 5% ~ 20%)을 함유하는 DMEM/F12 1:1 배지 중에서 6시간 ~ 48 시간 동안 5% CO₂ 존재하에 항온처리(37℃)된다. 그 다음, 배지는 PCT 표피 각질세포 배지로 교체된다. 추가로 인슐린, 트랜스페린, 아셀렌산나트륨 및 표피 성장 인자(EGF)가 배양 배지에 첨가될 수 있다.

간, 췌장, 소장, 위로부터 유래한 상피 전구 세포를 배양하기 위해, 하기 방법이 사용될 수 있다: 세포는 인산염 완충 염수로 세척된 다음, 배양 배지, 즉 5% ~ 20% 소 태아 혈청, 1% 인슐린-트랜스페린-셀레나이트, 1 mM ~ 4 mM 글루타민 및 1 ng/ml ~ 300 ng/ml 표피 성장 인자(EGF)를 함유하는 DMEM/F12 1:1 중에 재현탁된다. 세포는, 제I형 콜라겐으로 코팅된 배양 플라스크에 1 cm² 당 5x10³개 세포의 양으로 투입되고, 37℃ 및 5% CO₂ 하에 항온처리된다. 배양 배지는 3일마다 교체된다. 몇몇 구현예들에서, 세포가 합류성 단일층을 이루게될 때(보통 단리후 10일 ~ 15일), 세포는 추가 배양 및 세포 덩어리 성장을 위해 계대배양된다. 이를 위해 배양 배지는 제거되고, 세포는 Versene 용액으로 2회 세척된 다음, 배양 플라스크 면적 25 cm² 당 1 ml의 양만큼의 EDTA 중 0.05% ~ 0.25% 트립신 용액으로 5분 동안 항온처리된다. 그 다음, 세포는 인산염 완충 염수에 의해 트립신으로부터 씻기고, 원심분리(200 g)에 의해 5분 ~ 10분 동안 스핀다운되며, 성장 배지 중에 1:3의 비율로 희석된 후, 제I형 콜라겐이 코팅된 새 배양 플라스크에 투입된다.

생성된 세포 배양액은 추가의 췌장 분화를 위해 상피 전구 세포를 함유하여야 한다. 본 발명을 위해서, 상피 전구 세포는 면역염색 또는 PCR 방법을 이용하여 EpCAM, AFP, CD49f, CK18, CK19, LGR5, c-Met의 군으로부터 선택되는 마커 하나 이상에 대해 검출될 수 있다. 상피 전구 세포를 함유하는 균질 배양액, 즉 상피 전구 세포 적어도 70%, 더욱 자주는 상피 전구 세포 적어도 75%, 통상적으로는 상피 전구 세포 80% 이상, 예를 들어 상피 전구 세포 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상을 함유하는 배양액이 의료용으로서 바람직하다.

상피 전구 세포는 증식이 가능해야 한다. 세포 증식 수준은, 예를 들어 광학 현미경을 통해 현미경 시야당 중기 기수 및 세포 표현형의 측면에서 시각적으로 평가될 수 있다. 구체적으로 활발하게 증식중인 배양액은 유사분열 상태인 세포를 적어도 3% ~ 5% 함유한다. 배양액의 자발적 분화의 경우, 유사분열 상태인 세포의 수는 3% ~ 5% 이하로 떨어진다. 뿐만아니라, 미분화이되 활발하게 증식중인 상피 세포는 그 치수가 작으며(10 μm ~ 30 μm), 핵-세포질 비가 크고, 다각형의 형상을 가지며, 돌기가 적고, 자갈 모양의 상피층을 형성한다. 자발적 분화에 있어서 세포는 그 치수가 커지며(50 μm 초과), 자주는 서로 간의 접촉성을 상실하고, 다양한 돌기를 획득하게 되며, 핵-세포질 비는 작아지고, 과립형 세포질을 가지게 된다. 이러한 세포는 종종 핵을 몇 개씩 갖게 된다.

증식 속도는 또한 세포가 합류성 단일층을 이룰 때의 속도로부터 추산될 수 있다. 세포가 합류성 단일층을 이룰 때의 속도는 초기 세포 희석율에 의존적이지만, 활발하게 증식중인 세포의 경우, 그 속도는 분화된 세포의 속도보다 더 빠르다. 예를 들어 세포가 1:3으로 희석되면, 상피 세포가 합류성 단일층을 이룰 때의 속도는 최대한 15일, 보통은 7일 ~ 10일에 이른다. 분화된 배양액에 있어서, 세포는 매우 천천히(15일 초과) 합류성 단일층을 이루거나 합류성 단일층을 전혀 이루지 않는다.

상피 전구 세포의 췌장 분화

본 발명의 방법에 따른 췌장 분화를 위하여, "췌장 분화를 위한 상피 전구 세포" 섹션에 전술된 바와 같이 수득된 단리 상피 전구 세포가 사용된다. 인간을 포함하여 포유동물의 신체로부터 단리된 세포가 사용된다. 몇몇 구현예들에서, 이러한 세포는 앞서 배양 절차가 진행되었던 세포이다.

췌장 분화를 위해, 세포는 포유동물 혈청 및 글루타민이 보충된 배양 배지 중에 투입된다. 0.5 mM 내지 2.5 mM 범위, 통상 1 mM ~ 2 mM 범위, 예를 들어 1.81 mM인 칼슘 이온 농도를 제공하는 임의의 진핵생물 세포 액체 배양 배지가 배양 배지로서 사용될 수 있다. 구체적으로 적합한 배지로서는 DMEM, IMDM, William E 배지, RPMI, 알파-MEM, 199, MEM, BME를 포함한다. 예를 들어 DMEM/F12 1:1 배지가 사용될 수 있다.

저 칼슘 배지는 상피 전구 세포를 미분화 상태로 보존하는데 기여하므로 배양에 적합하지 않다.

포유동물 혈청, 예를 들어 소 태아 혈청 또는 혈청 대체물(KSR, 녹아웃 혈청 대체물(KnockOut Serum Replacement)) 또는 자기유래 혈청이 배지에 최종 농도 2 부피% ~ 20 부피%, 통상 5 부피% ~ 15 부피%, 예를 들어 10 부피%로 첨가된다. 이때 사용된 바와 같은 "포유동물의 혈청"이란 용어는 이의 합성 대체물을 포함한다.

글루타민은 배지에 최종 농도 1 mM 미만, 통상적으로는 1.5 mM ~ 4 mM, 예를 들어 2 mM로 첨가된다. 글루타민 농도가 4 mM 넘게 증가하면, 세포 조건과 췌장 분화 효율에는 눈에 띌만한 변화는 초래되지 않는다.

세포는 상피 세포 접착을 제공하는 플라스크 내에서 배양된다. 예를 들어 배양 플라스크는 제I형 콜라겐으로 예비 코팅된다.

분화의 제1 단계에서, 세포는 표피 성장 인자, 트랜스페린, 아셀렌산나트륨, 레티노산 및 이소프로테레놀의 존재하에 배양된다. 표피 성장 인자는 최종 농도 1 ng/ml ~ 300 ng/ml, 자주는 5 ng/ml ~ 100 ng/ml, 보통 8 ng/ml ~ 15 ng/ml, 예를 들어 10 ng/ml로 사용된다. 트랜스페린은 최종 농도 0.1 μg/ml 미만, 통상 1 μg/ml ~ 20 μg/ml, 예를 들어 5 μg/ml로 사용된다. 아셀렌산나트륨은 최종 농도 0.1 ng/ml ~ 20 ng/ml, 보통 1 ng/ml ~ 10 ng/ml, 예를 들어 5 ng/ml로 사용된다. 레티노산은 최종 농도 0.1 μM ~ 20 μM, 보통 0.5 μM ~ 5 μM, 예를 들어 2 μM로 사용된다. 이소프로테레놀은 최종 농도 0.1 μM ~ 10 μM, 보통 0.2 μM ~ 7 μM, 더욱 자주는 0.5 μM ~ 3 μM, 예를 들어 1 μM로 사용된다.

몇몇 구현예들에서, 시판중인 "인슐린-트랜스페린-셀레나이트" 첨가제는 트랜스페린과 아셀렌산나트륨 대신에 트랜스페린과 아셀렌산나트륨의 필요 농도(예를 들어 1 부피%)를 제공하는 농도로 사용된다. 이 경우, 배양 배지는 또한 인슐린을 함유한다.

몇몇 구현예들에서, 인슐린 유사 성장 인자 1(IGF-1)도 또한 배지에 첨가된다. 인슐린 유사 성장 인자 1의 최종 농도는 300 ng/ml를 초과하지 않는데, 보통은 5 ng/ml ~ 20 ng/ml, 예를 들어 10 ng/ml이다.

몇몇 구현예들에서, 하기 인자들, 즉 섬유아세포 성장 인자 10, 섬유아세포 성장 인자 4 및 각질세포 성장 인자 중 하나도 또한 배지에 첨가된다. 선택된 성장 인자 1의 최종 농도는 300 ng/ml를 넘지 않으며, 보통 5 ng/ml ~ 20 ng/ml, 예를 들어 10 ng/ml이다.

세포는 4일 ~ 15일, 보통은 5일 ~ 10일, 예를 들어 6일 ~ 8일 동안 배양된다. 배양 배지는 1일 ~ 3일마다 새것으로 교체된다.

분화의 제2 단계에서, 세포는 표피 성장 인자, 레티노산, 니코틴아미드, 간세포 성장 인자 및 덱사메타손의 존재하에 배양된다. 표피 성장 인자는 최종 농도 1 ng/ml ~ 300 ng/ml, 자주는 5 ng/ml ~ 100 ng/ml, 보통 8 ng/ml ~ 15 ng/ml, 예를 들어 10 ng/ml로 사용된다. 레티노산은 최종 농도 10 nM ~ 20 μM, 보통 20 nM ~ 1 μM, 예를 들어 100 nM로 사용된다. 니코틴아미드는 최종 농도 1 mM ~ 100 mM, 보통 5 mM ~ 50 mM, 예를 들어 10 mM로 사용된다. 간 세포 성장 인자는 최종 농도 1 ng/ml ~ 300 ng/ml, 자주는 5 ng/ml ~ 100 ng/ml, 보통 10 ng/ml ~ 50 ng/ml, 예를 들어 20 ng/ml로 사용된다. 덱사메타손은 최종 농도 0.01 μM ~ 5 μM, 보통은 0.05 μM ~ 1 μM, 예를 들어 0.1 μM로 사용된다.

몇몇 구현예들에서, 인슐린 유사 성장 인자 1(IGF-1)도 또한 배지에 첨가된다. 인슐린 유사 성장 인자 1의 최종 농도는 300 ng/ml를 넘지 않으며, 보통은 5 ng/ml ~ 20 ng/ml, 예를 들어 10 ng/ml이다.

몇몇 구현예들에서, 베타셀룰린도 또한 배지에 첨가된다. 베타셀룰린의 최종 농도는 300 ng/ml를 넘지 않으며, 보통 5 ng/ml ~ 50 ng/ml, 예를 들어 20 ng/ml이다.

세포는 4일 ~ 15일, 보통 5일 ~ 10일, 예를 들어 6일 ~ 8일 동안 배양된다. 배양 배지는 1일 ~ 3일마다 새것으로 교체된다.

본 방법의 바람직한 구현예들에서, 세포 분화 단계 둘다는 37℃에서 5% CO₂ 존재하에 수행된다. 몇몇 구현예들에서, 분화 단계 둘다는 5% CO₂ 및 5% O₂ 존재하에 수행된다.

진성 당뇨병의 대체 요법을 위한 세포 생성물

분화 전, 상피 전구 세포는 CD49f 및 KRT18 마커와, 목록 c-Kit, Sca-1, EpCAM, LGR-5로부터의 전구 세포 마커들 중 하나 이상을 발현한다. 본 발명의 방법에 따른 췌장 분화 후, 세포 생성물인 세포 중 적어도 99%는 CD49f 및 KRT18 마커를 계속해서 발현한다.

뿐만 아니라, 췌장 분화후의 본 발명의 세포 생성물은 단리된 세포로서, 인슐린을 생산하고, 췌장 베타 세포의 특징을 이루는 마커를 발현하는 세포를 함유한다. 구체적으로 이들 세포는 특징적인 유전자 마커, 예컨대 PDX1, NGN3, MAFA, NKX6.1, PAX4 및 PAX6 등을 발현한다. 세포에 의한 인슐린 생산을 입증하는 것으로 승인된 검정 중 한 가지는 인슐린 성숙 동안에 전구체 분자로부터 생성된 생성물인 인슐린 또는 C-펩티드를 검출하는 것이다. 세포 내 C-펩티드의 존재는, 세포가 인슐린을 생산하고 성숙을 겪게 된다는 것을 암시한다.

본 발명의 세포 생성물은 이와 같은 인슐린 생산 세포를 적어도 70%, 더욱 자주는 인슐린 생산 세포를 75% 미만 함유하고, 통상은 인슐린 생산 세포를 80% 이상, 예를 들어 이러한 세포를 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 함유한다.

인슐린 및/또는 C-펩티드는 세포 생성물에 의해 글루코스 의존적 방식으로 분비되는데, 즉 세포 생성물에 의한 인슐린 및/또는 C-펩티드 분비 수준은 배양 배지 중(세포 생성물 이식 후 신체 내부 배지 또는 완충제 중) 글루코스 농도가 증가함에 따라 증가한다.

효소 연계 면역흡착 검정법(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay; ELISA)은 분비된 인슐린 및/또는 C-펩티드를 검출하는데 사용된다. 이를 위하여, 세포는 글루코스를 함유하지 않는 완충제 중에서 1시간 ~ 2시간 동안 항온처리된다(37℃ 및 5% CO₂). 등장 용액, 예를 들어 Versene 용액, 인산염 완충 염수, 생리 염수, Krebs 완충제(글루코스 불포함)(59 mM NaCl, 2.35 mM KCl, 0.625 mM CaCl₂, 0.6 mM KH₂PO₄, 0, 6 mM MgSO₄*7H₂O, 12.5 mM NaHCO₃ 함유, pH = 7.4)가 완충제로서 사용될 수 있다. 항온처리 후, 등장 용액은 글루코스를 자체적으로 포함하지 않고 외부적으로 상이한 농도의 글루코스가 보충된(0 mM, 2 mM, 5 mM, 15 mM, 20 mM 글루코스), 따뜻한(37℃) Krebs 완충제로 교체된다. 시료들은 37℃ 및 5% CO₂에서 1 시간 동안 항온처리된다. 그 다음, 상청액이 분리되고, 이는 ELISA가 수행될 때까지 -70℃에 보관된다. ELISA는 제조자의 지침에 따라서, 예를 들어 Mercodia 초 감수성 인슐린(Ultrasensitive Insulin) ELISA, # 10-1132-01 및/또는 Mercodia 초 감수성 C-펩티드(Ultrasensitive C-peptide) ELISA, # 10-1141-01을 이용하여 수행된다.

몇몇 구현예들에서, 배양 배지 중 글루코스의 부재 하에 3차원 방식으로 배양된 본 발명의 세포 생성물은 1백만개 세포 당 인슐린 및 C-펩티드 적어도 100 pM, 보통은 인슐린 및 C-펩티드 적어도 150 pM, 더욱 자주는 인슐린 적어도 200 pM 및 C-펩티드 적어도 150 pM을 생산한다. 3차원 방식으로 배양된 본 발명의 세포 생성물은 5 mM 글루코스 존재하에 배양 배지 중에 1백만개 세포 당 인슐린 적어도 280 pM, 그리고 C-펩티드 적어도 180 pM, 보통은 인슐린 적어도 300 pM 및 C-펩티드 적어도 200 pM, 더욱 자주는 인슐린 적어도 320 pM 및 C-펩티드 적어도 200 pM을 생산한다. 3차원 방식으로 배양된 본 발명의 세포 생성물은 15 mM 글루코스 존재하에 배양 배지 중에 1백만개 세포 당 인슐린 및 C-펩티드 적어도 400 pM, 보통은 인슐린 및 C-펩티드 적어도 450 pM, 더욱 자주는 인슐린 및 C-펩티드 적어도 500 pM을 생산한다.

특정 세포 유형에 특이적인 유전자 마커 발현을 검출하기 위해, 이러한 유전자 마커에 의해 암호화되는 선택 단백질에 대한 항체가 사용되는 면역검출법, 또는 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의한 검출법이 사용될 수 있다. PCR 검출의 다양한 변법이 당 분야에 널리 공지되어 있다.

포유동물 인슐린 생산 세포의 세포 생성물 투여 방식

췌장 분화 동안에 본 발명의 방법에 의해서 수득된 세포(세포 생성물)는 세포 증식 및 분화의 생화학 기작 및 분자 기작, 세포간 상호작용, 발암형질변형, 시토카인 발현 연구, 다양한 물질의 세포독성 분석 등에 사용될 수 있다. 본 발명에서 수득된 세포는 체내 변형 세포가 아니므로, 이 세포는 자연 생물 과정 중에 일어나는 유전자 발현, 신호전달 경로를 연구하는데 사용될 수 있다. 그러므로 이 세포는 상피 분화 및 세포간 접촉 기작을 연구하기 위한 모델일 수 있다.

이 세포는 다량으로 수득될 수 있으므로, 다양한 물질을 검정하기 위한 기반, 예를 들어 이 물질이 생물 과정에 미치는 영향을 연구하기 위한 기반으로서 사용될 수 있을 뿐만 아니라 이 물질이 세포 생존 능력에 미치는 영향을 평가하고, 약학 제제의 안전성을 분석하기 위한 기반으로서 사용될 수 있다.

본 발명의 방법에 의해 수득된 세포는 진성 당뇨병의 대체 세포 요법을 위하여 자기유래 또는 동종이계 이식에 사용될 수 있다. 바람직한 구현예들에서, 진성 당뇨병의 대체 세포 요법의 방법은, 세포 공여개체로부터 상피 전구 세포 생검 시료를 취하는 단계, 세포를 배양하여 상피 전구 세포의 바이오매스를 증가시키는 단계, 본 발명의 세포를 대상으로 하는 2단계 췌장 분화, 그리고 진성 당뇨병 발병 수용개체에 세포를 이식하는 단계를 수반한다.

세포 이식은 당 분야에 공지된 방법에 의해 수행되는데, 예를 들어 세포는 현탁액으로서 투여된다. 이와 관련하여, 세포는 필요 과정인 세포량의 증량 및 췌장 분화 후 배양 플라스크 표면으로부터 분리되는데: 배양 배지는 제거되고, 세포는 Versene 용액으로 2회 세척된 다음, 배양 플라스크 면적 25 cm² 당 1 ml의 양만큼의 EDTA 중 0.05% ~ 0.25% 트립신 용액과 함께 5분 동안 항온처리된다. 그 다음, 세포는 인산염 완충 염수로 3회 세척되고, 5분 ~ 10분 동안 원심 분리함으로써 침전되며(200 g), 멸균 등장 용액, 예컨대 주사용 생리 염수 또는 인산염 완충 염수 중에 5십만 ~ 1천만개 세포/ml의 양만큼 희석된다. 세포의 생존 능력이 검증되는데: 즉 생 세포가 적어도 70% 있어야 한다. 세포는 운반된 다음, +4℃에 24시간 이하 동안 보관된다. 세포는 환자당 5천만 ~ 2억개의 양만큼 비장 또는 간문맥 또는 대망에 투여되거나, 또는 시린지를 통한 복부 주사에 의해 췌장 돌출부에 투여된다. 세포는 또한 1개월 ~ 6개월 간격으로 소분되어 1회 투여당 5천만 ~ 2억개의 양만큼 (2회 ~ 5회) 투여될 수 있다. 뿐만 아니라, 세포는 회전타원체로서 투여될 수 있다. 이를 위해서, 분화 10일 ~ 15일째 되는 날에 세포는 배양 플라스크 표면으로부터 분리된 다음, 비접착성 조건하에 췌장 분화의 제2 단계 배지에, 배지 20 μl당 4천 ~ 6천개 세포의 양만큼 투입된다. 세포는 회합된 세포의 집합체인 회전타원체(3천 ~ 6천개의 세포 함유)가 생성되기 전 이러한 조건하에서 3일 ~ 7일 동안 항온처리된다. 그 다음, 회전타원체는 인산염 완충 염수로 3회 세척되고, 원심분리(100 g ~ 200 g)에 의해 5분 ~ 10분 동안 침전된 다음, 멸균 등장 용액, 예를 들어 주사용 생리 염수 또는 인산염 완충 염수 중에 5십만 ~ 1천만개 세포/ml(용액 1 ml당 약 1백개 ~ 5천개 회전타원체)의 양만큼 희석된다. 회전 타원체는 운반된 다음, +4℃에 24시간 이하 동안 보관된다. 회전타원체는 간문맥 또는 비장 또는 대망에 환자당 5천만 ~ 2억개 세포(환자당 약 1만개 ~ 5만개 회전타원체)의 양만큼 투여된다. 회전타원체는 또한 1개월 ~ 6개월 간격으로 소분되어 5천만 ~ 2억개 세포(약 1만개 ~ 5만개 회전타원체)의 양만큼 (2회 ~ 5회) 도입될 수 있다.

몇몇 구현예들에서, 본 발명의 대체 요법의 방법은 췌장 분화 후 세포 생성물 중 세포의 수와 세포의 생존 능력을 인증하는 단계를 포함한다. 몇몇 구현예들에서, 본 발명의 대체 요법의 방법은 세포 생성물 중 마커와 C-펩티드를 검출하는 단계를 포함한다.

세포는 당 분야의 숙련된 전문가들에게 공지된 방법을 이용하여 계수된다. 예를 들어 세포의 수는 세포 표면, 세포 계수기상, 그리고 Gorjaev 챔버나 세포 분취기 내 특이 마커에 대한 표준 항체를 이용하는 유세포분석법에 의해 추산될 수 있다.

세포 생존 능력 인증은 당 분야에 공지된 방법, 예를 들어 트립판 블루에 의한 염색으로써 수행된다. 이와 관련해서 세포는 트립신에 의해 배양 플라스크 표면으로부터 분리된 다음, 인산염 완충 염수로 씻긴 후, 인산염 완충 염수 중에 1십만개 ~ 5백만개 세포/ml의 양만큼 희석된다. 세포 현탁액은 50 μl ~ 200 μl만큼 분취된 다음, 4% 트립판 블루 용액(BioRad, USA)으로 1:1 비로 희석된다. 5분 후, 자동 세포 계수기(BioRad, USA)를 사용하거나 Gorjaev 챔버 내에서 시료 중 생 세포 비율이 산정된다(이때, 생 세포는 트립판 블루로 염색되지 않음). 대안적으로 염색은 비변형 세포막에 침투하지 않는 염료, 예컨대 DAPI 또는 브롬화에티듐으로 수행될 수 있다. 염색된(즉 이 경우에는 비 생존) 세포의 비율 산정은 형광 현미경 또는 유세포형광계에서 시각적으로 수행된다.

하기 실시예들은 예시를 위해 제공되는 것이지, 제한을 위해 제공되는 것은 아니다.

실험 절차

실시예 1. 인간 타액선 상피 전구 세포의 췌장 분화

인간 악하 타액선 생검재는 타석증 때문에 타액선 부분 제거를 위해 예정된 수술이 이루어지는 동안 37세 남성 공여개체로부터 수득하였다. 생검재의 선 조직 부피는 2 cm³에 가까웠다. 생검재를 멸균 조건하에서 DMEM/F12 1:1 배지(Gibco, USA) 및 겐타마이신 40 μg/ml(PanEco, Russia)를 함유하는 Petri 접시로 옮겼다. 모든 추가 조작은 GMP 요건을 충족하는 멸균 조건하에 수행하였다.

타액선 상피 조직을 쌍안 현미경 하에 멸균 기구로 지방과 간엽성 조직으로부터 기계적으로 분리한 다음, 메스에 의해 작은(크기가 약 1 mm³ ~ 5 mm³ 인) 조각들로 잘랐다. 조직의 조각들을 인산염 완충 염수로 2회 세척한 다음, 원심분리(800 ~ 1500 rpm)로 5분 ~ 10분 동안 스핀다운한 다음, 37℃에서 30분 ~ 60분 동안 제IV형 콜라게나아제 용액(Gibco, USA) 2 mg/ml ~ 4 mg/ml의 존재하에 2 mM 글루타민(Invitrogen, USA)과 함께 DMEM/F12 1:1 배지(Gibco, USA) 중 항온처리하였다. 10분 ~ 15분마다 타액선 조각이 담긴 관을 격렬하게 진탕하였다. 항온처리 후, DMEM/F12 1:1 배지(Gibco, USA) 10 ml를 세포에 첨가한 다음, 3분 ~ 5분 동안 활발하게 피펫팅(pipetting)한 후, 공극 직경이 40 μm ~ 100 μm인 나일론 필터에 통과시키고 나서, 세포를 원심분리(1천 ~ 1천500 rpm)로 5분 ~ 10분 동안 스핀다운하였다. 그 다음, EpCAM 마커에 대해 세포 자성 분리를 수행하였는데, 이를 위해 세포 현탁액을 인산염 완충 염수 10 ml로 세척한 다음, 인산염 완충 염수 0.5 ml 중에 재?탁하고 나서, 자동화 세포 계수기(Bio-Rad, USA)를 사용하여 세포 수를 계수하였다. 그 다음, 타액선 세포를, 자성 입자(Miltenyi Biotec GmbH, Germany)에 접합한 항 인간 EpCAM 항체와 함께 15분 ~ 40분 동안 +4℃에서 항온처리하였다. 항체를, 10⁶개 세포당 0.1 μg ~ 5 μg 비율로 첨가하였다. 항온처리 후, 세포를 인산염 완충 염수 10 ml로 세척한 다음, 제조자의 지침에 따라 MiniMACS? 분리기 컬럼(Miltenyi Biotec GmbH, Germany) 상에서 자성 분리를 수행하였다. 분취된 세포를 원심분리(200 g)로 5분 ~ 10분 동안 스핀다운한 다음, 인산염 완충 염수 10 ml로 세척하고 나서, 성장 배지, 즉 1x 인슐린-트랜스페린-셀레나이트 첨가제(Invitrogen, USA), 10 ng/ml 표피 성장 인자(Sigma, USA)를 함유하는 PCT 표피 각질세포 배지(1X, 액체)(CELLnTEC, Switzerland) # CnT-07 중에 재현탁하였다. 세포를, 제I형 콜라겐이 코팅된 배양 플라스크에 5x10³개 세포/1 cm² 양만큼 넣은 다음, 37℃ 및 5% CO₂에서 항온처리하였다. 처음 5일 동안에는 배양 배지를 매일 교체하였으며, 그 다음에는 배양 배지를 3일마다 교체하였다.

(단리 후 10일째 되는 날) 세포가 합류성 단일층을 이루게 되었을 때, 배양 배지를 제거하고, 세포를 Versene 용액(PanEco, Russia)으로 2회 세척한 다음, 배양 플라스크 면적 25 cm² 당 1 ml의 양만큼의 EDTA(Gibco, USA) 중 0.05% 트립신 용액과 함께 5분 동안 항온처리하였다. 그 다음, 세포를 인산염 완충 염수에 의해 트립신으로부터 씻어낸 다음, 원심분리(200 g)로 5분 ~ 10분 동안 침전시켰다.

췌장 분화를 수행하기 위해, 세포를, 10% 소 태아 혈청(HyClone, USA), 1x 인슐린-트랜스페린-셀레나이트 첨가제(Invitrogen, USA), 2mM 글루타민(Invitrogen, USA), 10 ng/ml 표피 성장 인자(Sigma, USA)를 함유하는 DMEM/F12 1:1 배지(Gibco, USA) 중에 1:3의 비율로 재현탁하였는데, 이때 여기에 2 μM 레티노산(Sigma, USA), 1 μM 이소프로테레놀(Sigma, USA), 10 ng/ml 섬유아세포 성장 인자 10(FGF-10)(Life Technologies, USA) 및 10 ng/ml 인슐린 유사 성장 인자 1(IGF-1)(R&D, USA)을 첨가하였으며, 이후 제I형 콜라겐으로 코팅된 새 배양 플라스크에 넣은 다음, 7일 동안 항온처리하였다. 7일 ~ 14일째 되는 날에 세포를 10% 소 태아 혈청(HyClone, USA), 2 mM 글루타민(Invitrogen, USA), 10 ng/ml 표피 성장 인자(Sigma, USA)와 함께 DMEM/F12 1:1 배지(Gibco, USA) 중에 배양하였으며, 이때 여기에 100 nM 레티노산(Sigma, USA), 10 mM 니코틴아미드(Sigma, USA), 10 ng/ml 인슐린 유사 성장 인자 1(IGF-1)(R&D, USA), 20 ng/ml 간세포 성장 인자(HGF)(Gibco, USA) 및 0.1 μM 덱사메타손(Sigma, USA)을 첨가하였다.

항온처리 막바지에 세포로부터 총 RNA를 단리한 다음, 이를 cDNA 합성 및 실시간 정량 PCR에 사용하였다. 총 RNA는 제조자의 지침에 따라 RNeasy 미니 키트(250)(Qiagen, Germany)를 사용하여 단리하였다. 그 다음, 제조자의 지침에 따라 랜덤 프러이머가 사용되는 역전사효소 MMLV RT 키트(Eurogen, Russia)를 사용하여 cDNA 합성을 수행하였다. 그 다음, 제조자의 지침에 따라 CFX96 Touch? 실시간 PCR 검출 시스템(Bio-Rad, USA)에서 표 1에 보인 유전자 특이적 프라이머들과 함께 PCR 혼합물 qPCRmix-HS SYBR(Eurogen, Russia)을 사용하여 정량적 실시간 PCR을 수행하였다. 정량적 PCR 데이터를 GAPDH에 대해 정규화하였다.

PCR 분석은, 인간 타액선 세포의 췌장 분화 후 이 세포에서는 베타 세포 분화에 필요한 핵심 전사 인자, 즉 NGN3, PDX1, MAFA, PAX4, PAX6, NKX6 .1(표 2)의 발현이 증가하였음을 보여주었다. 뿐만 아니라, 췌장 분화 후 RNA 프리프로인슐린(preproinsulin) 발현은 증가하였던 반면에(표 2), 아밀라아제 발현은 감소하였다. 그러므로, 제안된 프로토콜은 상피 세포의 특이적이면서 효과적인 내분비 분화를 보장한다는 결론이 내려졌다.

췌장 분화의 효율을 평가하기 위해, 1차 계대배양 후 타액선의 상피 전구 세포와, 췌장 분화후 세포를 관찰하였다. 세포를 인슐린 및 프로인슐린에 대한 항체로 염색하였다(사용된 항체 목록은 표 3에 나열됨). 염색 48시간 전, 미분화 세포를 제I형 콜라겐 코팅 배양 플라스크에 접종하고 나서, 1x 인슐린-트랜스페린-셀레나이트 보충물(Invitrogen, USA) 및 10 ng/ml 표피 성장 인자(Sigma, USA)를 함유하는 PCT 표피 각질세포 배지(1X, 액체)(CELLnTEC, # CnT-07, Switzerland) 상에서 배양하였던 반면, 분화 세포는 10% 소 태아 혈청(HyClone, USA), 2 mM 글루타민(Invitrogen, USA), 10 ng/ml 표피 성장 인자(Sigma, USA)를 함유하는 DMEM/F12 1:1 배지(Gibco, USA) 상에서 배양하였고, 여기에 100 nM 레티노산(Sigma, USA), 10 mM 니코틴아미드(Sigma, USA), 10 ng/ml 인슐린 유사 성장 인자 1(R&D, USA), 20 ng/ml 간세포 성장 인자(Gibco, USA) 및 0.1 μM 덱사메타손(Sigma, USA)도 첨가하였다. 그 다음, 배양 배지를 제거하고 나서, 세포를 인산염 완충 염수로 세척한 다음, 실온에서 10분 동안 4% 파라포름알데히드(Sigma, USA)로 고정하였다. 세포를 인산염 완충 염수로 3회 세척한 후, 1% 소 태아 혈청(Sigma, USA) 및 0.1% 트리톤 용액(Sigma, USA) 중 항체의 비 특이적 결합 차단을 실온에서 30분 동안 인산염 완충 염수 중에서 실시하였다. 세포를 제조자가 권장하는 희석률(보통은 1:200 ~ 1:500)로 1차 항체와 함께 인산염 완충 염수 중에서 60분 동안 37℃에서 항온처리(또는 +4℃에서 밤새도록 항온처리)하였다. 세포를 37℃에서 인산염 완충 염수로 3회 세척한 다음(1회당 10분씩), 2차 항체(희석률 1:1000)와 함께 40분 ~ 60분 동안 37℃에서 인산염 완충 염수 중에 항온처리하였다. 그 다음 세포를 다시 37℃에서 인산염 완충 염수로 3회 세척하였으며(1회당 10분씩), 이때 1 μg /ml DAPI(Sigma, USA)를 첨가하였다. 세포를 Olympus IX51(Olympus, Japan) 형광 현미경으로 분석하였다.

분화 후, 상피 전구 세포의 초기 배양액 중 프로인슐린 및 인슐린 단백질의 생산량에 비한, 세포 생성물 중 프로인슐린 및 인슐린 단백질의 생산량이 증가되었음이 확인되었다(도 1 ~ 도 4).

인슐린 및 프로인슐린 발현 수준의 변화에 대한 정량 평가를 유세포분석에 의해 수행하였다. 이를 위해서, 배양 배지를 제거한 후, 세포를 Versene 용액(PanEco, Russia)으로 2회 세척한 다음, 0.05% 트립신(Gibco, USA)이 첨가된 EDTA 용액 중에서 5분 동안 항온처리하였다. 트립신 용액을 배양 플라스크 표면적 25 cm² 당 1 ml의 양만큼 첨가하였다. 그 다음, 세포를 인산염 완충 염수로 트립신으로부터 씻어낸 후, 200 g에서 5분 ~ 10분 동안 펠릿으로 만들고 나서, 2% 소 태아 혈청(HyClone, USA)과 함께 인산염 완충 염수 중에서 철저히 재현탁하여, 단일세포 현탁액을 수득하였다. 세포 현탁액을 분취량만큼씩 소분하고 나서(항체 당 1x10⁶개 세포 + 이소타입 대조군), 실온 및 암실에서 제조자가 권장하는 희석률(1:500 ~ 1:1000)로 1차 항체와 함께 60분 동안 항온처리하였다. 그 다음, 세포를 인산염 완충 염수로 3회 세척하였으며(1회당 10분씩), 항체가 형광 색소에 접합된 경우, 이 항체를 암실에서 5분 동안 1% 파라포름알데히드(Sigma, USA)로 고정하였다. 그러고 나서, 세포를 인산염 완충 염수로 3회 세척한 다음, 인산염 완충 염수 1 ml 중에 재현탁한 후, Cell Lab Quanta™ SC MPL 유세포분석기(Beckman Coulter)로 분석하였다. 1차 항체가 형광 색소와 접합하지 않았던 경우에는 1차 항체로부터 세척해 낸 세포를 실온 및 암실에서 60분 동안 2차 항체와 함께 항온처리하였다. 그 다음, 세포를 전술된 바와 같이 1% 파라포름알데히드(Sigma, USA)로 고정한 후, 분석하였다. 유관 이소타입 대조군을 사용하였으며, 적어도 10,000개의 세포를 분석하였다.

유세포분석은, 인간의 타액선 세포 분화 후, 프로인슐린 단백질을 발현하는 세포 비율이 32%에서 77%로 증가하였으며, 단백질 인슐린은 5%에서 88%로 증가하였음을 보여주었다. 개발된 췌장 분화 프로토콜 적용으로 말미암는 유전자 발현 변화는 독특하였으며, 다른 프로토콜 및 다른 세포 유형에 대해서는 기술되어 있지 않다.

다양한 인자의 췌장 분화 효능에 대한 영향력을 관찰하였다. 앞서 기술된 바와 같이 수득한 인간 타액선 세포를 실험에 사용하였다. 췌장 분화를 수행하기 위해, 배양 배지 중 개별 성분들의 농도에 변화를 주었다. 분화의 막바지에, 총 RNA를 세포로부터 단리하였으며, 실시간 정량 PCR에 의해 cDNA 합성 및 효능 분석을 수행하였다. 분화시키지 않았거나 앞서 기술된 프로토콜에 따라 분화시킨 인간 타액선 세포를 대조군 수단으로서 사용하였다.

췌장 분화에 다른 액체 배양 배지가 사용될 가능성을 검정하였다. 하기 배지들, 즉 DMEM(Gibco, USA), IMDM(Gibco, USA), MEM(Gibco, USA), William E 배지(Gibco, USA), RPMI 1640(Gibco, USA), 알파-MEM(Gibco, USA), PCT 표피 각질세포 배지 # CnT-07(1x, 액체)(CELLnTEC, Switzerland)을 사용하였다. PCR 분석 결과, 분화를, 아밀라아제 외분비 마커 발현 수준의 증가가 관찰되었던 표피 각질세포 배지 # CnT-07을 제외한 사용 배양 배지 중에서 수행하였을 때, 내분비 췌장 분화 유전자 마커 발현간에는 유의미한 차이가 없었다. DMEM, IMDM, MEM, William E 배지, RPMI 1640 및 알파-MEM 배지는 췌장 분화를 수행하기 위해 사용될 수 있다는 결론에 이르게 되었다.

분화 배지 중 소 태아 혈청 농도가 2 부피%보다 낮을 때, 세포 내에서는 유사분열 활동이 관찰되지 않았고, 분화 효율은 감소되어, 베타 세포 마커들(PDX1, NGN3, MAFA, NKX6.1, PAX4, PAX6, INS)의 발현 감소가 초래되는 것이 확인되었다. 분화 배지 중 소 태아 혈청 농도가 20 부피%를 넘었을 때, 세포 사멸이 관찰되었다.

배지 중 글루타민 농도가 1 mM 이하로 감소하였을 때, 세포 내 유사분열 활동은 관찰되지 않았고, 세포 단식(cell fasting)의 징후들(즉 크고 밝은 핵, 단백질 합성의 감소)이 보였다. 세포 분화 효능도 또한 감소하였다. 배지 중 글루타민 농도가 4 Mm를 초과하여 증가하였을 때, 세포 행동 및 세포 분화 효능에는 유의미한 변화가 없었으므로, 권장 농도보다 높은 농도를 적용하는 것은 비실용적이다.

표피 성장 인자 농도가 1 ng/ml 이하로 감소하였을 때, 세포의 유사분열 활동과 췌장 분화 효능은 감소하였는데, 이는 베타 세포 마커들(PDX1, NGN3, MAFA, NKX6.1, PAX4, PAX6, INS)의 발현 수준 감소로 표출되었다. 표피 성장 인자 농도가 300 ng/ml를 초과하여 증가하였을 때, 세포의 유사분열 활동과 췌장 분화도 또한 감소하였다.

트랜스페린 농도가 0.1 μg/ml 이하로 감소하였을 때, 세포 생존 능력도 감소하였던 반면에, 이의 농도는 20 μg/ml를 초과하여 증가하였지만, 이러한 증가는 세포에 유의미한 영향을 미치지는 않았다.

아셀렌산나트륨 농도의 0.1 ng/ml 이하로의 감소는, 세포 증식 활동 감소뿐만 아니라, 자발적 분화의 증가를 초래하였는데, 이는 세포 크기 증가, 과립과 같은 세포질의 모양으로 발현되었다. 세포 배양액 분해, 세포 사멸 증가 및 췌장 분화 효율 감소의 징후가 있었다. 아셀렌산나트륨 농도가 20 ng/ml를 초과하게 되면, 췌장 분화 효능의 감소가 초래되었다.

분화의 제1 단계에서 레티노산 농도의 0.1 μM 이하로의 감소와, 레티노산 농도의 20 μM 초과하는 만큼으로의 증가 둘 다는, 상피 세포 췌장 분화 효능의 유의미한 감소를 초래하였는데, 이는 췌장 마커(즉 PDX1, NGN3, MAFA, NKX6.1, PAX4, PAX6, INS) 발현 증가의 거의 완전한 부재에 의해 입증된다. 췌장 분화의 제2 단계에서 레티노산 농도의 10 nM 이하로의 감소와, 레티노산 농도의 20 μM를 초과하는 만큼으로의 증가는 또한 췌장 분화 효능을 유의미하게 감소시켰다.

분화의 제1 단계에 있어 이소프로테레놀 농도의 0.1 μM 이하로의 감소는, 베타-세포 발현에 필요한 PAX4 발현을 유의미하게 감소시켰고, 이로 말미암아 상피 세포의 췌장 분화 효능 감소가 초래되었다. 분화의 제1 단계에 있어 이소프로테레놀 농도의 10 μM 초과하는 만큼으로의 증가는, 분화에 대한 억제 효과를 나타내었고, 이로 말미암아 췌장 마커 발현 수준의 감소가 초래되었다.

분화의 제2 단계에서, 니코틴아미드 농도의 1 mM 이하로의 감소는 췌장 마커(PDX1, NGN3, MAFA, NKX6.1, PAX4, PAX6, INS) 발현 수준의 감소를 초래하였다. 니코틴아미드 농도의 100 mM 초과하는 만큼으로의 증가는 세포 생존 능력을 감소시켰다.

분화의 제2 단계에서 간세포 성장 인자 농도의 1 ng/ml 이하로의 감소뿐만 아니라, 덱사메타손 농도의 0.01 μM 이하로의 감소는 프리프로인슐린(INS) 유전자 발현 수준의 감소를 초래하였다. 간세포 성장 인자 농도의 덱사메타손 300 ng/ml를 초과하는 만큼으로의 증가 또는 5 μM을 초과하는 만큼으로의 증가는 세포 증식을 감소시켰으며, 세포의 생존 능력도 감소시켰다.

분화의 제1 단계에 인슐린-트랜스페린-셀레나이트 첨가제가 사용되었을 경우는, 트랜스페린과 아셀렌산나트륨이 사용되었을 경우에 비해 상피 세포에 의한 췌장 마커 발현에 실질적으로 아무런 영향을 미치지 않았음도 또한 확인되었다.

분화의 제1 단계 및 제2 단계에 있어서 인슐린 유사 성장 인자 1의 배양 배지로의 첨가는 상피 세포 생존 능력을 증가시켰다. 분화의 제1 단계에 섬유아세포 성장 인자 10, 섬유아세포 성장 인자 4 또는 각질세포 성장 인자가 첨가되었을 때, 세포의 생존 능력 증가 및 유사분열 활동성 증가가 관찰되었다. 분화의 제2 단계에 베타셀룰린이 사용되었을 때, 프리프로인슐린 발현에 있어 경미한 증가가 초래되었다. 췌장 분화가 수행될 때 배양 배지에 상기 성분들을 첨가하는 것이 가능하다는 결론이 내려졌다.

혼합 가스가 상피 세포 분화에 미치는 영향을 연구하였는데: 즉 5% CO₂ 존재하에서의 분화 효능뿐만 아니라, 5% CO₂ 및 5% O₂ 존재하에서의 분화 효능을 평가하였다. 췌장 분화는 상기 연구 대상 혼합 가스 둘 다의 존재하에서 일어났는데, 다만 5% CO₂ 및 5% O₂ 존재하에서는 세포 생존 능력이 증가하였지만, 자발적 세포 사멸은 감소하였다. 이러한 이유로 몇몇 구현예들에서 5% CO₂ 및 5% O₂ 혼합 가스 사용이 가능하였다.

분화 단계의 영향력도 또한 연구하였다. 만일 췌장 분화의 제1 단계 및 제2 단계가 4일 미만 지속되면, 세포는 분화할 시간을 확보하지 못해서 췌장 마커, 즉 PDX1, NGN3, MAFA, NKX6.1, PAX6, INS의 발현은 일어나지 않았음이 확인되었다. 만일 췌장 분화의 제1 단계 및 제2 단계가 15일을 초과하여 지속되면, 세포 생존 능력과 세포 증식 활동은 감소하였고, 자발적 사멸은 증가하였다.

실시예 2. 인간의 간, 췌장, 소장 및 위 상피 전구 세포의 췌장 분화

장기 일부를 제거하기 위해 예정된 수술 과정에서 인간의 간, 췌장, 소장 및 위 생검 시료를 채취하였다. 0.5 cm³ ~ 5 cm³의 생검 시료를 무균 상태로, DMEM/F12 1:1 배지(Gibco, USA) 및 40 μg/ml 겐타마이신(PanEco, Russia)이 담긴 Petri 접시에 옮겼다. 모든 추가 조작을 GMP 요건에 부합하는 멸균 조건에서 수행하였다.

장기 생검 시료를 인산염 완충 염수로 3회 세척한 다음, 이를 멸균된 도구(메스, 핀셋)를 사용하여 기계적으로 1 mm³ ~ 5 mm³의 단편으로 조각내었다. 그 다음 조직 단편들을 5분 ~ 10분 동안 분당 800회 ~ 1500회 회전시켜 펠릿으로 만든 다음, 이에 1 mM ~ 4 mM 글루타민(Invitrogen, USA) 함유 DMEM/F12 1:1 배지(Gibco, USA) 중 2 mg/ml ~ 4 mg/ml 제IV형 콜라게나아제(Gibco, USA)를 첨가하며 항온처리하였다(조직 0.5 cm³당 용액 총 1 ml). 조직 단편을 함유하는 관을 10분 ~ 15분마다 활발히 진탕하였다.

그 다음, 3분 ~ 5분 동안의 활발한 피펫팅을 통해 DMEM/F12 1:1 배지(Gibco, USA) 10 ml를 첨가하고 나서, 나일론 필터(공극 직경 40 μm ~ 100 μm)를 통과시켜 침투시킨 다음, 세포를 5분 ~ 10분 동안 분당 800회 ~ 1500회 회전시켜 펠릿으로 만들었다.

세포를 EpCAM 마커에 의해 자성 분리하여, 간 및 췌장 전구 세포를 수득하였다. 이를 위해서 세포 현탁액을 인산염 완충 염수 10 ml로 세척한 다음, 인산염 완충 염수 0.5 ml 중에 재현탁하였으며, 이후 자동화 세포 계수기(Bio-Rad, USA)를 사용하여 세포를 계수하였다. 그 다음, 세포를, 자성 입자(Miltenyi Biotec GmbH, Germany)와 접합시킨 항인간 EpCAM 항체와 함께 +4℃에서 15분 ~ 40분 동안 항온처리하였다. 항체를, 10⁶개 세포 당 0.1 μg ~ 5 μg의 양으로 첨가하였다. 항온처리 후, 세포를 인산염 완충 염수 10 ml로 세척한 다음, 제조자의 지침에 따라 컬럼 MiniMACS^TM 분리기(Miltenyi Biotec GmbH, Germany) 상에서 자성에 의해 분리하였다. 분취한 세포를 200 g에서 5분 ~ 10분 동안 펠릿으로 만들었다.

LGR-5 마커에 의한 형광 활성화 세포 분취를 적용하여 장 전구 세포를 수득하였고, c-Kit 마커에 의한 형광 활성화 세포 분취를 적용하여 위 전구 세포를 수득하였다. 세포 현탁액을 인산염 완충 염수 10 ml로 세척한 후, 인산염 완충 염수 0.5 ml 중에 재현탁하였으며, 그 다음에는 자동화 세포 계수기(Bio-Rad, USA)를 사용하여 세포를 계수하였다. 이후 세포를 Alexa Fluor 488 형광 태그와 접합시킨 항 LGR-5 항체(또는 항 c-Kit 항체 각각)와 함께 +4℃에서 15분 ~ 40분 동안 항온처리하였다. 여기에 항체를 10⁶개 세포 당 0.1 μg ~ 5 μg의 양으로 첨가하였다. 세포를 인산염 완충 염수 10 ml로 세척한 다음, S3e? 세포 분취기(Bio-Rad, USA)를 사용하여 형광 활성화 세포 분취를 수행하였다.

간, 췌장, 장 및 위로부터 분취한 세포를 인산염 완충 염수 10 ml로 세척한 다음, 10% 소 태아 혈청(HyClone, USA), 1x 인슐린-트랜스페린-셀레나이트 보충물(Invitrogen, USA), 2 mM 글루타민(Invitrogen, USA) 및 10 ng/ml 표피 성장 인자(Sigma, USA)를 함유하는 DMEM/F12 1:1 성장 배지(Gibco, USA)에 재현탁하였다. 세포를 제I형 콜라겐으로 코팅된 배양 플라스크에 1cm² 당 5x10³개 세포만큼의 양으로 접종시키고 나서, 37℃ 및 5% CO₂에서 항온처리하되, 다만 3일마다 배지를 교체하였다.

1차 계대배양 동안 인간의 간, 췌장, 소장 및 위 상피 세포가 단일층을 이루게되었을 때, 실시예 1에 기술된 프로토콜에 따라 이 상피 세포를 대상으로 췌장 분화를 수행하였다.

분화 14일째 되는 날에, 실시예 1에 기술된 바와 같이 qRT-PCR 방법을 이용하여 세포로부터의 총 RNA 분리, 상보성 DNA 합성 및 췌장 세포 분화 유전자 마커 분석을 수행하였다. 분화를 수행하지 않았던 대응 인간 상피 세포를 1차 계대배양에서 대조군으로 사용하였다. qPCR 데이터를 GAPDH에 의해 정규화하였다.

인간 상피 세포 췌장 분화 PCR 분석 결과는, 연구 대상이었던 모든 세포 유형에 사용되었던 프로토콜의 효능을 보여주었다(표 6). 내분비 췌장 분화 후, 인슐린 생산 세포에 필요한 전사 인자(NGN3, PDX1, MAFA, PAX4, NKX6 . 1)의 유전자 발현 및 프리프로인슐린 생성의 증가가 관찰되었다. 아밀라아제, 소마토스타틴, 글루카곤, 췌장 폴리펩티드 발현의 유의미한 증가는 없었는데, 이 점은 연구 대상이었던 모든 배양액에 사용된 프로토콜의 특이성을 나타낸다.

실시예 3. 3D 배양 조건에서의 세포 생성물 배양

실시예 1에 기술된 바와 같이 제조된 인슐린 분비 세포의 세포 생성물을 대상으로 췌장 분화를 수행한 후, 이를 Versene 용액(PanEco, Russia)으로 2회 세척하고 나서, EDTA 용액 중에서 항온처리하였는데, 이때 0.05% 트립신(Gibco, USA)을 5분에 걸쳐 첨가하였다. 트립신 용액을, 배양 플라스크 표면적 25 cm² 당 1 ml의 양으로 첨가하였다. 그 다음, 인산염 완충 염수에 의해 세포를 트립신으로부터 씻어낸 다음, 200 g에서 5분 ~ 10분 동안 펠릿으로 만들고 나서, 췌장 분화 제2 단계에서 사용되었던 배지와 동일한 배지 중에 재현탁하였다. 5,000개 세포당 배지 20 μl의 양으로 배지를 첨가하였다. 세포 현탁액 20 μl를 Petri 접시 뚜껑 위에서 피펫팅한 다음, 이 접시를 밀봉하고 나서, 이후 5일 동안 세포를 현적(hanging drops) 방식으로 무균 항온처리하였다(37℃ 및 5% CO₂). 결과적으로 소적 내부에 있던 세포들은 크기 250 μm ~ 500 μm인 회전타원체 형태의 응집체를 형성하였다.

회전타원체에서의 인슐린 및 프로인슐린 발현을 분석하기 위해 면역조직화학 방법을 사용하였다. 회전타원체를 피펫팅하여 시험관에 옮기고 나서, 200 g에서 5분 동안 펠릿으로 만든 다음, 상청액을 제거하고, 잔여물을 배지 중에서 동결시켜 OCT 동결절편(CrioMount Histolab, Sweden)을 제조하였다. Leica CM1900 저온유지장치(Leica, Switzerland)를 사용하여 Super Frost Plus 슬라이드(Menzel, Germany) 상에 동결절편을 준비하였는데, 이때 이 절편의 두께는 10 μm였다. 준비 직후 실온에서 동결절편을 10분 동안 4% 파라포름알데히드(Sigma, USA)로 고정시켰다. 그 다음, 이 동결절편을 인산염 완충 염수로 세척하고 나서, 인슐린 및 프로인슐린에 대한 1차 항체(0.1% 트리톤 용액(Sigma, USA) 중 희석률 1:500) 및 인산염 완충 염수 중 1% 소 태아 혈청(Sigma, USA)과 함께 밤새도록 +4℃에서 항온처리하였다. 동결절편을 37℃에서 인산염 완충 염수로 3회 세척하고 나서(1회당 10분씩), 60분 동안 37℃에서 2차 항체(희석률 1:1000)와 함께 항온처리하였다. 동결절편을 인산염 완충 염수로 3회 세척하고 나서(1회당 10분씩), 세포 핵을 DAPI(Sigma, USA) 1 μg/ml로 5분 동안 염색하였다. 그 다음, 동결절편을 인산염 완충 염수로 세척한 후, 인산염 완충 염수 중 25% 폴리에틸렌글리콜(Sigma, USA) 및 25% 글리세린(Sigma, USA) 매질로 적신 다음 커버 글라스로 눌러 밀봉하였다. 절편을 Keyence BZ-9000 형광현미경(Keyence, Japan) 하에서 분석하였다. 타액선 세포의 회전타원체 동결절편을 대상으로 한 면역조직화학적 염색은, 분화된 상피 세포가 3차원 배양 조건에서 프로인슐린 단백질(도 5) 및 인슐린 단백질(도 6)을 활발하게 발현하였음을 보여주었다.

실시예 1에 기술된 바와 같이, 글루코스 의존적 인슐린 분비에 필요한 유전자 발현 분석을 정량적 실시간 PCR에 의해 수행하였다. 2차원 조건에서 배양하며 췌장 분화한 후의 미분화 상피 전구 세포 및 세포를 대조군으로 사용하였다. 분화를 진행시키지 않았던 인간 상피 전구 세포는 실질적으로 글루코스 의존적 인슐린 분비에 필요한 mRNA 유전자를 발현하지 않았음이 확인되었다. 분화 이후 이러한 유전자의 발현 수준은 증가하였을 뿐만아니라, 더욱이 발현 수준은 3차원 조건하에서 배양된 세포에서 더 높았다(표 5). qPCR 데이터는 GAPDH에 의해 정규화하였다.

회전타원체 배양을 진행시킨 타액선 세포에 대한 효소 연계 면역흡착 검정(ELISA) 방법에 의해, 상이한 농도의 글루코스에 대응하는 인슐린 및 C-펩티드 분비에 관한 연구를 수행하였다. 이를 위해서 전술된 방법에 따라 회전타원체를 제조하였다. 피펫으로 Petri 접시 뚜껑으로부터 회전타원체를 수집한 다음, 이를 200 g에서 5분 동안 펠릿으로 만든 후, 인산염 완충 염수로 3회 세척하여 배지 잔여물을 제거하였다. 그 다음, 37℃에서 2시간 동안 회전타원체를 Krebs-Ringer 완충제(107 mM NaCl(Sigma, USA), 5 mM KCl(Sigma, USA), 3 mM CaCl₂(Sigma, USA), 1 mM MgSO₄*6H₂O(Sigma, USA), 7 mM NaHCO₃(Sigma, USA), 0.1% BSA(Sigma, USA) 및 20 mM HEPES(Sigma, USA), pH=7.6) 중에서 항온처리하였다. 완충제를 제거한 다음, 회전타원체를 4개의 분취액으로 소분한 후, Krebs-링커 완충제 중 글루코스 농도를 상이하게 하여(즉 글루코스 농도를 0 mM, 2 mM, 5 mM 및 15 Mm로 하여) 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 제조자의 지침에 따라, 초 감수성 인슐린 ELISA 키트(Mercodia, Sweden) 및 초 감수성 C-펩티드 ELISA 키트(Mercodia, Sweden)를 사용하는 인슐린 및 C-펩티드 함량에 대한 추가의 ELISA 분석을 위해 상청액을 시험관에 수집하였다. Start Fax-2100 평판 판독기(Awareness Technology, USA)를 사용하여 결과를 분석하였다. 제조자의 지침에 따라서 Bradford 단백질 검정 방법(Thermo Fisher Scientific, Germany)으로 회전타원체를 단백질 함량에 대해 분석하였다. 층 두께 10 mm이고 큐벳트 내 적용 파장 595 nm인 Start Fax-2100 평판 판독기(Awareness Technology, USA)를 사용하여 단백질 양을 측정하였다. 그 다음, 분비된 인슐린 및 C-펩티드 양을 단백질 총량에 의해 정규화하였다. 인간 타액선 세포는 3차원 배양 조건에서의 췌장 분화 후 글루코스 의존적으로 인슐린을 분비하는 능력을 획득하였음이 확인되었다. 인슐린 분비는 배지 중 글루코스 농도가 5 mM에서 15 mM로 증가함에 따라 적어도 2배 증가하여(표 6), 단백질 1 mg당 14.5 ng에 이르렀다. 인슐린과 동 몰량만큼의 C-펩티드가 세포에 의해 동시 분비되었는데, 이 점은 검출된 인슐린의 내인성 원천과, 췌장 분화 후 타액선 세포에 있어서 인슐린의 적절한 성숙을 확인시켜주었다(표 6). 그러므로 인간 타액선 세포는 췌장 분화 후 시험관 내 3차원 배양 조건하에서의 글루코스 의존적 분비 능력을 보유하였다.

실시예 4. 세포 생성물의 기능적 활성 분석

실시예 1에 기술된 바와 같이 1차 계대배양 동안 타액선 세포를 분화시키고 나서, Versene 용액으로 2회 세척한 다음, 실시예 1에 기술된 바와 같이 트립신으로 배양 플라스크 표면으로부터 분리해내고, 200 g에서 5분 동안 펠릿으로 만든 후, 인산염 완충 염수로 3회 세척하고 나서, 자동화 세포 계수기(Bio-Rad, USA)를 사용하여 세포를 계수하였다. 그 다음 인산염 완충 염수를 세포에 5백만개 세포당 완충제 500 μl의 양으로 첨가하였다. 최종 현탁액의 분취액(세포 생성물 중 세포 5백만개 함유)을 멸균 시린지로 면역결핍 누드 마우스에 복막내 주사하였다. 누드 마우스를 대조군으로 사용하였으며, 여기에는 무세포 인산염 완충 염수 500 μl를 주사하였다. 주사 후 3일째 되는 날에 마우스 췌장 몇 개를 검사하였는데: 동물을 이소플루란(Sigma-Aldrich, USA)으로 마취시키고 나서, 동물의 위를 알코올로 처리한 다음, 피부와 복막을 절개하였다. 췌장을 핀셋으로 꺼낸 다음, 배지 중에 담그어 저온보존시켜 OCT 동결절편(CrioMount Histolab, Sweden)을 제조하였다. Leica CM1900 저온유지장치(Leica, Switzerland)를 사용하여 췌장 동결절편(절편 두께 10 μm)을 Super Frost Plus 슬라이드(Menzel, Germany) 상에 제조하였다.

제조 직후, 동결절편을 실온에서 10분 동안 4% 파라포름알데히드(Sigma, USA)로 고정하였다. 그 다음, 동결절편을 인산염 완충 염수로 세척한 후, Alexa Fluor 488 형광색소에 접합시킨 1차 항인간 핵 항체 및 항인슐린(0.3% 트리톤 용액(Sigma, CIIIA) 중 희석률 1:500), 그리고 인산염 완충 염수 중 2% 소 태아 혈청(Sigma, USA)과 함께 밤새도록 +4℃에서 항온처리하였다. 그 다음, 동결절편을 37℃에서 인산염 완충 염수로 3회 세척하였으며(1회당 10분씩), Alexa Fluor^® 546 염소 항토끼 IgG(H+L)(Invitrogen, USA) 2차 항체(인산염 완충 염수 중 희석률 1:1000)와 함께 37℃에서 60분 동안 항온처리하였다. 동결절편을 인산염 완충 염수로 3회 세척한 다음(1회당 10분씩), 세포 핵을 DAPI(Sigma, USA) 1 μg/ml로 5분 동안 염색하였다. 이후, 동결절편을 인산염 완충 염수로 세척한 후, 인산염 완충 염수 중 25% 폴리에틸렌글리콜(Sigma, USA) 및 25% 글리세린(Sigma, USA) 매질에 적셔서 커버 글라스로 눌러 밀봉시켰다. 이 절편을 Keyence BZ-9000 형광 현미경(Keyence, Japan)으로 분석하였다. 각각의 동물군 중 총 5마리의 실험 마우스를 분석하였다. 이식한 세포가 마우스 췌장에서 발견되었는데, 여기에 응집체가 생성되었다(도 7). 인슐린에 대한 항체로 염색을 수행한 결과, 이 세포는 생체 내 인슐린 단백질을 생산할 수 있었음이 확인되었다.

세포 이식 후 7일째 되는 날에 나머지 마우스 혈청 중 인간 인슐린 함량을 분석하였다. 이를 위해서, 인산염 완충 염수 500 μl를 투여한 대조군 마우스와, 분화시킨 인간 타액선 세포 5백만개를 투여한 실험 마우스를 6시간 동안 굶겼다. 그 다음, 대조군 마우스 5마리와 실험 마우스 5마리로부터 혈액 시료를 취하였는데; 즉 이소플루란으로 마우스를 마취한 후, 마우스 흉부를 개방하여 노출시키고, 헤파린 침지 시린지를 사용하여 심장으로부터 혈액 시료(0.5 ml ~ 1 ml)를 채취하였다. 혈액을 헤파린과 함께 시험관에 넣은 후, 10,000 rpm에서 20분 동안 펠릿으로 만들었다. 혈청을 별도의 관들에 수집하고 나서, 추가 분석을 위해 -80℃로 동결시켰다. 게다가 마우스들을 6시간 동안 굶긴 후, 대조군 마우스 5 마리와 실험 마우스 5 마리에 글루코스 용액을, 체중 1 kg당 2 mg의 양으로 복막 내 주사하였다. 글루코스 주사 후 30분 경과시에도 전술된 바와 같이 혈액 시료를 채취하여 혈청을 준비하였다.

제조자의 지침에 따라 초 감수성 인슐린 ELISA 키트(Mercodia, Sweden)를 사용하여 마우스 혈청 중 인간 인슐린에 대한 효소 연계 면역흡착 검정을 수행하였다. 분석을 위해 Start Fax-2100 평판 판독기(Awareness Technology, USA)를 사용하였다. 시험 그룹에 속하는 모든 실험용 마우스의 혈청 중 인간 인슐린을 검출하였다. 분석을 위해 채혈을 수행하기 전 글루코스를 주사한 마우스에서 인슐린의 양은 대략적으로 2배 더 많았음에 주목하여야 할 것이다(표 7).

얻어진 결과는, 췌장 분화후 인간 상피 전구 세포는 체내 주사 후 생체 내에서 글루코스 의존적 방식으로 인슐린을 분비할 수 있었음을 보여준다.

타액선 전구 관 세포는 아밀라아제를 분비하는 외분비 세포로의 분화 가능성을 가진다는 사실이 공지되어 있다. 따라서, 췌장 분화 후 세포의 외분비 분화 능력을 연구하였다. 1차 계대배양시 인간 타액선 세포를 대상으로 실시예 1에 기술된 바와 같이 내분비 췌장 분화를 진행시켰다. 그 다음, 상기 실시예 1에 기술된 방법에 따라서 타액 및 췌장 아밀라아제에 대한 항체로써 세포를 면역조직화학적으로 염색하였다. 뿐만 아니라, 회전타원체 동결절편을 제조한 다음, 이 동결절편을 상기 실시예 3에 기술된 방법을 사용하여 아밀라아제에 대한 항체로 염색하였다. (상기 실시예 3에 기술된 방법에 따라) 인간 타액선 세포 5백만개를 이식한 후 3일째 되는 날에 면역결핍 누드 마우스의 췌장 동결절편을 아밀라아제 및 인간 핵에 대한 항체로 염색하였다.

면역표현형 분석은, 인간 타액선 세포가 플라스틱에서 배양되었건 3차원 배양 조건하에서 배양되었건 간에, 이 인간 타액선 세포에서는 아밀라아제가 검출되지 않았음을 보여주었다. 뿐만아니라 인간 타액선 세포는 면역결핍 누드 마우스에의 이식 후 생체 내 아밀라아제를 생산하는 능력을 획득하지 못하였다. 이러한 결과들은 상피 세포의 내분비 분화 특이성을 나타낸다.

실시예 5. 인간 타액선 세포의 생물 안전성 분석

체내 아밀라아제 농도가 증가하면 건강에 해롭다. 췌장 분화를 거친 인간 세포의 분비 잠재성을 분석하였다. 이를 위해서, 37세 ~ 55세의 남성 공여개체 4명으로부터 타액선 세포 배양액을 수득하였다. 배양액에 SGC-37M, SGC-50M, SGC -51M 및 SGC-55M이라는 명칭을 붙였다. 1차 계대배양시 배양액 4개 모두의 인간 타액선 세포를 12-슬롯 배양 평판에 슬롯 하나당 1백만개 세포의 양만큼 접종하였다. 48시간 후, 배양 배지를 제거한 다음, 슬롯들을 인산염 완충 염수로 3회 세척하고 나서, 세포에 인산염 완충 염수 1 ml를 첨가한 후, 37℃에서 2 시간 동안 추가로 항온처리하였다. 완충제 시료들을 수집하고 나서, 이를 -80℃에서 동결시킨 이후에 ELISA를 실시하였다. 뿐만 아니라, 상기 실시예 1에 기술된 바와 같이 모든 배양액으로부터 유래하는 세포를 대상으로 내분비 췌장 분화를 진행시키고, 실시예 3에 기술된 방법에 의해 회전타원체들을 제조하였다. 유사한 방식으로, 타액선의 분화 세포와 회전타원체로부터 완충제 시료를 수집하였다.

제조자의 지침에 따라서, 모든 시료를 대상으로, 타액 아밀라아제 알파 1 인간 ELISA 키트(MyBioSource, USA)를 사용하는 ELISA 방법에 의해 타액 아밀라아제 함량에 대해, 그리고 췌장 아밀라아제 인간 ELISA 키트를 사용하여 췌장 아밀라아제 함량에 대해 분석하였다. Start Fax-2100 평판 판독기(Awareness Technology, USA)를 사용하여 결과를 분석하였다. 반응의 양성 대조군으로서 인간 혈청(1: 제1 공여개체, 2: 제2 공여개체)을 사용하였다.

ELISA 방법은, 배양액 4개 모두의 타액선 세포에 의한 타액 아밀라아제 및 췌장 아밀라아제의 시험관 내 분비를 규명해내지 못하였다. 아밀라아제 분비는 췌장 세포 분화 이후에도, 그리고 3차원 배양 조건하에서도 확인되지 않았다(표 8). 아밀라아제는 타액선 세포 용해물 중에서도 또한 검출되지 않았다.

인간 상피 세포의 생물 안전성에 관한 생체 내 분석을 위해, 인산염 완충 염수 500 μl 중 5백만개의 현탁 분화 타액선 세포를 면역결핍 누드 마우스에 복막 내 주사하였다. 인산염 완충 염수 500 μl를 주사한 마우스를 대조군으로 사용하였다. 이식 후 7일째 되는 날, 인간 혈청 아밀라아제 함량 분석을 위해 마우스로부터 혈액 시료를 채취하였다. 세포를 수득하고, 이를 이식하며, 마우스로부터 혈청을 수득하기 위한 방법들은 상기 실시예 1 및 실시예 4에 기술되어 있다. ELISA를 위해 타액 아밀라아제 알파 1 인간 ELISA 키트(MyBioSource, USA) 및 췌장 아밀라아제 인간 ELISA 키트(AbCam, UK)를 사용하였으며, 제조자의 지침에 따라서 검정을 수행하였다. Start Fax-2100 평판 판독기(Awareness Technology, USA)를 사용하여 결과를 분석하였다. 반응의 양성 대조군으로서 인간의 혈청(1: 제1 공여개체, 2: 제2 공여개체)을 사용하였다.

누드 마우스 혈청의 효소 연계 면역흡착 검정법(ELISA)은, 분화시킨 인간 타액선 세포 이식후 7일째 되는 날에 마우스 혈청 중 인간 아밀라아제는 존재하지 않았던 반면, 양성 대조군에서는 아밀라아제가 100 ng/ml ~ 150 ng/ml의 양만큼 검출되었음을 규명하였다. 이는, 인간 타액선 세포가 생체 내에서 외분비 방향으로 분화하지 않을 뿐만 아니라, 아밀라아제를 생산하지도 않음을 암시한다.

인간 타액선 세포를 면역결핍 누드 마우스에 이식한 후 3일째되는 날과 7일째되는 날에 마우스 췌장을 대상으로 조직학적 분석을 수행하였다. 이를 위해서, 마우스를 이소플루란(Sigma-Aldrich, USA)으로 마취시킨 다음, 마우스 위를 알코올로 처리하고 나서, 피부와 복막을 절개하였다. 췌장을 핀셋으로 꺼낸 후, +4℃에서 60분 동안 4% 파라포름알데히드(Sigma, USA)로 고정시킨 다음, 조직학적 표본을 제조하는데 사용하였는데; 즉 조직을 알코올(70% 에탄올(Sigma, USA)로 1시간 동안, 96% 에탄올로 1시간 동안, 100% 에탄올로 1시간 동안, 100% 에탄올과 클로로포름(Sigma, USA)(1:1)으로 10분 ~ 15분 동안, 클로로포름으로 10분 ~ 15분 동안)로 탈수시켰다. 그 다음, 조직을 Histomix 파라핀(Biovitrum, Russia) 중에 담그어 1시간 ~ 2시간 동안 침지하여 둔 다음, MICROM 마이크로톰(Carl Zeiss, Germany)을 이용하여 파라핀 블록의 조직학적 절편(절편 두께: 5 μm)을 제조하였다. 이후, 제조물을 탈파라핀(deparaffinization)시켰는데; 즉 자일렌(Sigma, USA) 2분, 100% 에탄올(Sigma, USA) 2분, 96% 에탄올 2분, 70% 에탄올 2분 처리하고 나서, 제조물을 증류수로 헹구었다. 절편을 헤마톡실린(Sigma, USA)으로 5분 동안 염색한 다음, 물로 헹군 후, 에오신(Sigma, USA)으로 40초 동안 염색하였다. 제조물을 물로 3회 헹군 다음, 인산염 완충 염수 중 25% 폴리에틸렌글리콜(Sigma, USA) 및 25% 글리세린(Sigma, USA) 매질로 적셔서 커버 글라스로 눌러 밀봉하였다. Keyence BZ-9000 현미경(Keyence, Japan) 하에 빛을 투과시켜 절편을 분석하였다. 인간 세포가 이식된 누드 마우스의 췌장을 대상으로 한 조직학적 분석은, 이식 후 3일째 되는 날과 7일째 되는 날에 연구 대상인 마우스 췌장 내에서는 인산염 완충 염수가 주사된 대조군 마우스 췌장 내에서에 비해 병리학적 변화(섬유형성 변화 또는 염증 반응)가 일어나지 않았음을 규명하였다.

인간 세포 이식 후 3일째 되는 날에, 염증 반응이 일어났는지 확인하기 위하여 누드 마우스(실험 마우스 10 마리 및 대조군 마우스 10 마리)의 췌장을 대상으로 CD68 대식세포 마커에 대해 관찰하였다. 실시예 4에 기술된 바와 같이 동결절편을 제조한 다음, 이를 인간 핵과 CD68에 대한 항체로 염색하였다. 면역화학적 염색은, 분화된 인간 타액선 세포 이식으로 말미암는 대식세포의 유의미한 침투가 일어나지 않았음을 보여주었다(도 8).

인간 타액선 세포가 췌장 분화후 체내에 이식될 때 종양을 발생시키는 능력을 연구하기 위해, 실시예 4에 기술된 바와 같이 1차 계대배양 동안 인산염 완충 염수 500 μl 중 현탁된 분화 인간 타액선 세포 1천만개를 면역결핍 누드 마우스 10 마리에 피하 이식하였다. 누드 마우스 10 마리를 대조군으로 사용하였으며, 이 대조군 마우스들에는 무세포 인산염 완충 염수 500 μl를 피하 주사하였다. 추후 3개월에 걸쳐 마우스 생존률과 종양 존재 여부를 관찰하였다. 분화 인간 타액선 세포 1천만개를 면역결피 누드 마우스에 피하 이식한 후 관찰 기간 3개월 내내 폐사도 일어나지 않았을 뿐만 아니라, 종양 발생 징후도 확인되지 않았던 것으로 파악되었다.

그러므로 검정된 인간 타액선 세포는 생물 안전성에 관한 요구에 부합한다는 결론을 내릴 수 있는데; 즉 인간 타액선 세포는 종양을 발생시키지 않고, 조직 내 염증 반응 및 병리학적 변화도 일으키지 않으며, 건강에 잠재적으로 유해한 생물 활성 물질을 생성하지도 않는다.

실시예 6. 마우스 내 실험적 당뇨병 교정

C57Black 수컷 마우스(나이: 6 주령 ~ 8 주령, 체중: 20 g ~ 22 g)에서 실험적 당뇨병을 유도하였다. 8시간 동안 금식시킨 다음, 동물에 시트르산염 완충제(Sigma, USA) 200 μl에 희석한 스트렙토조토신(Sigma, USA)을 체중 1 kg당 40 μg의 양으로 즉석 제조하여 (5 연속일 동안) 매일 복막내 주사하였다. 동물의 대조군에는 동량의 시트르산염 완충제(Sigma, USA)(200 μl)를 주사하였다. 보통의 먹이와 수중 10% 글루코스 용액(Sigma, USA)을 동물 먹이를 통해 5일 동안 투여하였다. 이후의 주에는, 동물들을 6시간 동안 금식시킨 다음, OneTouch Ultra 테스트 스트립(Johnson & Johnson, USA)을 이용하는 OneTouch Select(Johnson&Johnson, USA) 혈당측정기로 동물의 혈중 글루코스 수준을 측정하였다. 마우스 혈중 글루코스를 측정하기 위해 꼬리의 끝부분을 조금 절개하여, 여기에서 나오는 혈액 방울을 테스트 스트립에 묻히고, 제조자의 지침에 따라 혈당측정기로 측정을 수행하였다. 스트렙토조토신을 마지막으로 주사한 후 1주 되는 날, 동물의 고혈당증은, 혈중 글루코스 농도 25 mM 초과로 안정적이 되었다. 안정적 고혈당증이 확립되었을 때(즉 스트렙토조토신을 마지막으로 주사한 후 7일째 되는 날), 마우스를 실험군과 대조군으로 나누었다. 이 날을 실험의 "당일(zero day)"로 간주하였다. 실험 당일날, 인산염 완충 염수 500 μl 중 마우스 타액선 세포 5백만개(실시예 1에 기술된 프로토콜에 따라 분화)를 실시예 4에 기술된 바와 같이 시험군 동물에 이식하였다. 무세포 인산염 완충 염수 500 μl를 주사한 당뇨병 동물뿐만 아니라, 무세포 인산염 완충 염수 500 μl를 주사한 건강한 비 당뇨병 동물도 대조군으로 사용하였다.

실험을 시작하고 나서 4주 후에 마우스 혈중 글루코스 동력학을 연구하였는데; 즉 모든 군에 속하는 동물들을 대상으로 혈중 글루코스 수준을 측정하였다(이와 동시에 전술된 방법에 의해 4시간 동안 금식시켰다). 실험 당일에 1차 측정을 수행하였으며, 이후에는 3일마다 측정을 실시하였다. 뿐만아니라 3개의 실험군 모두에 속하는 마우스의 생존률은 2개월 동안 매일 평가하였다.

생존률 분석은, 2개월 동안 건강한(비당뇨병) 마우스는 폐사하지 않았던 반면에, 당뇨병 군에서는 폐사가 관찰되었음을 보여주었다. 결과적으로 관찰 2개월 후 당뇨병 마우스의 약 14%만이 생존하였다. 이와 동시에, 타액선 세포가 이식된 당뇨병 마우스 군 중 동물은 약 69%가 생존하였다(표 9). 그러므로 분화된 타액선 세포의 이식은 실험적 당뇨병을 발병시킨 마우스의 생존률을 유의미하게 증가시켰다.

이 기간 동안 스트렙토조토신 당뇨병이 안정적으로 되었을 때, 실험 동물의 혈중 글루코스 농도를 30일 동안 평가하였다. 실험 개시시(당일(0일)), 무세포 인산염 완충 염수 500 μl가 주사된 대조군 당뇨병 마우스 군과, 세포가 이식된 마우스 실험군에서 글루코스 농도는 약 27 mM이었던 반면에, 건강한 마우스 군에서 글루코스 농도는 약 6 mM이었던 것이 확인되었다. 세포 이식은 동물의 실험적 당뇨병 경과에 양면적 영향을 미쳤는데; 첫 번째, 분화된 타액선 세포가 마우스에 이식된 후 글루코스는, 세포가 이식되지 않은 당뇨병 동물 군에 존재하던 글루코스에 비해 급격하게 증가하지 않았다(표 10). 두 번째, 세포 이식후 동물에서는 혈중 글루코스 농도의 점진적 감소가 관찰되었다. 실험의 막바지(30일)에, 세포가 이식된 마우스에서는 혈중 글루코스 농도의 통계학적으로 유의미한 감소(11 mM로의 감소)가 일어났던 반면에, 세포가 이식되지 않은 당뇨병 마우스에서는 글루코스 농도 수준이 높게(약 22 mM) 유지되었다.

실험 40일째 되는 날, 마우스군 3개 모두에 속하는 마우스의 췌장을 대상으로 조직학적 분석을 수행하였다. 췌장으로부터 유래하는 조직학적 제조물을 상기 실시예 5에 기술된 바와 같이 제조하였다. 마우스 타액선 연속 절편 분석은, 세포 이식을 받지 않은 당뇨병 마우스에서는 섬 분해가 일어났음을 보여주었다(도 10, 화살표로 표시). 뿐만 아니라, 이 동물의 혈관 직경은 증가하였다. 이식 후 40일째 되는 날, 분화된 타액선 세포 5백만개를 이식받은 당뇨병 마우스에서는 섬이 재생되는 것이 관찰되었다(도 11, 화살표로 표시). 이와 동시에 당뇨병을 발병시키지 않은 정상 동물에서는 정상적인 랑게르한스 섬이 관찰되었다(도 9, 화살표로 표시). 그러므로 타액선 세포의 이식은 실험적 당뇨병을 발병시킨 마우스의 생존률을 증가시켰고, 고혈당증을 완화하였으며, 당뇨병 마우스의 혈중 글루코스 농도의 급격한 증가를 감소시켰을 뿐만 아니라, 랑게르한스섬의 재생을 촉진하였다. 일반적으로 분화된 타액선 세포는 스트렙토조토신 유도성 당뇨병 마우스 모델로부터 입증된 실험적 당뇨병 교정에 유의미하게 기여한다는 결론이 내려질 수 있다.

실시예 7. 상피 전구 세포의 배양과, 인슐린 생산 세포의 세포 생성물 획득

타석증 때문에 타액선 일부 제거를 위해 예정된 수술이 이루어지는 동안 부피 2 cm³만큼의 인간 악하 타액선 생검 시료를 수득하였다. 재료 공여개체(남성, 37세)는 감염, 즉 B형 및 C형 간염 바이러스, HIV, 매독균 감염이 발생하지 않은 공여개체였다.

생검 시료를 40 g/ml 겐타마이신(Sigma, USA)을 함유하는 멸균 DMEM/F12 1:1 배지(Gibco, USA) 중에 침지하여 둔 다음, 밀봉된 용기에 담아 실험실로 옮겼다. 추가의 조작들을 GMP(우수의약품제조관리기준) 요건에 부합하는 멸균 조건에서 수행하였다. 생검 시료를 인산염 완충 염수가 담긴 Petri 접시에 침지하여 두었으며, 조직을 멸균 메스 및 핀셋으로 5 mm³의 단편으로 기계적으로 나눈 다음, 지방 조직을 기계적으로 분리하여 제거하였다. 그 다음, 상피 조직 단편을 인산염 완충 염수로 2회 세척한 다음, 200 g에서 5분 동안 펠릿으로 만든 후, 2 mM 글루타민(Invitrogen, USA) 함유 DMEM/F12 1:1 배지(Gibco, USA) 중 제IV형 콜라게나아제(Gibco, USA) 2 mg/ml과 함께 37℃에서 40분 동안 항온처리하였다. 그 다음, 세포 현탁액을 5분 동안 피펫팅한 후, 나일론 필터(공극 직경 100 μm)에 통과시켰으며, 세포를 200 g에서 10분 동안 펠릿으로 만들었다. 세포를 인산염 완충 염수로 2회 세척한 후, 200 g에서 5분 동안 펠릿으로 만들었다. 제조자의 지침에 따라 세포를 자성에 의해 EpCAM 마커(Miltenyi Biotec GmbH, Germany)에 대해 분리하였다. 이를 위하여, 자동화 세포 계수기(Bio-Rad, USA)를 사용해 세포를 계수하고, 인산염 완충 염수에 완충제 1 ml당 5x10⁶개 세포 농도로 재현탁하였다. 세포를 항체와 함께 세포 10⁶개당 항체 5 μg의 양만큼으로 4℃에서 20분 동안 항온처리하였다. 그 다음, 제조자의 지침에 따라 컬럼상에서 세포를 자성에 의해 분리하였다. 분취되어 나온 세포를 200 g에서 5분 ~ 10분 동안 펠릿으로 만든 다음, 인산염 완충 염수로 2회 세척한 후, 1x1x 인슐린-트랜스페린-셀레나이트 보충물(Invitrogen, USA) 및 10 ng/ml 표피 성장 인자(Sigma, USA)를 함유하는 PCT 표피 각질세포 배지(1X, 액체)(CELLnTEC, Switzerland), # CnT-07 중에 재현탁하였다. 세포를 제I형 콜라겐 코팅 배양 플라스크에 1 cm² 당 5x10³개 세포의 양만큼 접종하고 나서, 37℃ 및 5% CO₂에서 항온처리하였다. 처음 5일 동안 배지는 매일 교체하였고, 이후 배양시에는 3일마다 교체하였다. 이 세포들은 "제로 계대배양"된 것들이다. 결과적으로 EpCAM을 발현하는 상피 전구 세포 1천만 개를 2 cm³의 생검 시료로부터 수득하였다.

이 세포는 또한 상피 세포 마커인 KRT18 및 CD49f를 발현하였는데, 이 점은 유세포분석에 의해 확인되었다. 이를 위해, 세포 2백만개를 실온에서 5분 동안 1% 파라포름알데히드(Sigma, USA)로 고정하였으며, 세포를 인산염 완충 염수로 2회 세척한 후, 4개의 분취액(분취액당 1% 소 혈청 알부민(Sigma, USA) 및 0.1% 트리톤(Sigma, USA) 함유 인산염 완충 염수 200 μl 중 5십만개 세포로 이루어짐)으로 나누었다. 그 다음, 항KRT18 1차 항체(AbCam, UK)(희석률 1:500)를 제1 분취액 세포에 첨가하였다. 항CD49f 1차 항체(Millipore, USA)(희석률 1:10)를 제2 분취액 세포에 첨가하였다. 대응하는 이소타입 대조군을, 제3 및 제4 분취액 세포에 첨가하였다. 세포를 항체와 함께 37℃에서 60분 동안 항온처리하였다. 그 다음, 세포를 인산염 완충 염수로 3회 세척한 다음(1회당 10분씩, 37℃), 인산염 완충 염수 200 μl에 재현탁하고 나서, 37℃ 및 암실에서 40분 동안 2차 항체와 함께 항온처리하였다. 세포를 인산염 완충 염수로 3회 세척한 다음(1회당 10분씩, 37℃), 인산염 완충 염수 1 ml에 재현탁하고 나서, Cell Lab Quanta? SC MPL 유세포분석기(Beckman Coulter, USA)로 분석하였다. 유관 이소타입 대조군을 사용하였으며, 적어도 10,000개 세포를 분석하였다. 결과적으로, 수득된 인간 타액선 상피 전구 세포의 99% 초과하는 만큼은 KRT18 마커 및 CD49f 마커를 발현하였다.

배양 10일 후, 제로 계대배양 세포는 3천만개 세포의 양으로 단일층을 이루었다. 세포를 트립신에 의해 배양 플라스크 표면으로부터 분리하였다. 배양 배지를 제거한 다음, 세포를 Versene 용액으로 2회 세척한 후, 37℃에서 5분 동안 항온처리하였는데, 이때 여기에 0.05% 트립신을 배양 플라스크 표면적 25 cm² 당 1 ml의 양으로 첨가하였다. 그 다음, 인산염 완충 염수로써 세포를 트립신으로부터 씻어낸 후, 200 g에서 5분 ~ 10분 동안 펠릿으로 만들었다. 1천5백만개의 세포를 장기 보관을 위해 극저온 동결시키는 한편, 나머지 1천5백만개의 세포는 더 배양하여 세포량을 증량시켰다. 이를 위해 1차 계대배양을 제공하였는데; 즉 세포를 성장 배지에 1:5의 비율로 희석한 다음, 제I형 콜라겐이 코팅된 새 배양 플라스크로 옮겼다. 배양 배지를 3일마다 교체하였다. 7일 후 1차 계대배양 세포는 7천5백만개의 양으로 단일층을 이루었다. 전술된 바와 같이 배양 플라스크 표면으로부터 세포를 트립신으로 분리해낸 다음, 이를 성장 배지 중에 1:3의 비율로 희석하고 나서, 제I형 콜라겐이 코팅된 새 배양 플라스크로 옮겼다. 배양 배지를 3일마다 교체하였다. 7일 후 2차 계대배양 세포는 2억2천5백만개의 양으로 단일층을 이루었다. 이로써 스케일-업(scale-up) 과정을 마쳤으며, 이후 췌장 세포 분화를 진행시켰다.

개발된 프로토콜에 따라 타액선 상피 세포의 췌장 분화를 수행하였는데; 즉 당일 ~ 7일에 세포를 10% 소 태아 혈청(HyClone, USA), 1x 인슐린-트랜스페린-셀레나이트 보충물(Invitrogen, USA), 2 mM 글루타민(Invitrogen, USA), 10 ng/ml 표피 성장 인자(Sigma, USA) 함유 DMEM/F12 1:1 배지(Gibco, USA) 중에서 항온처리하되, 다만 이때 2 μM 레티노산(Sigma, USA), 1 μM 이소프로테레놀(Sigma, USA), 10 ng/ml 섬유아세포성장인자 10(Life Technologies, USA) 및 10 ng/ml 인슐린 유사 성장 인자 1(R&D, USA)을 첨가하였다. 7일 ~ 14일에 세포를 10% 소 태아 혈청(HyClone, USA), 2 mM 글루타민(Invitrogen, USA), 10 ng/ml 표피 성장 인자(Sigma, USA) 함유 DMEM/F12 1:1 배지(Gibco, USA) 중에서 항온처리하되, 다만 이때 100 nM 레티노산(Sigma, USA), 10 mM 니코틴아미드(Sigma, USA), 10 ng/ml 인슐린 유사 성장 인자 1(R&D, USA), 20 ng/ml 간세포 성장 인자(Gibco, USA) 및 0.1 μM 덱사메타손(Sigma, USA)을 첨가하였다.

분화 14일째 되는 날에, 실시예 1에 기술된 바와 같이 세포로부터 총 RNA를 단리하고, 상보성 DNA를 합성한 다음, qRT-PCR 방법을 사용하여 췌장 세포 분화 유전자 마커 분석을 수행하였다. 결과적으로, 분화된 인간 타액선 세포는 베타-세포 마커, 즉 NGN3, PDX1, MAFA, PAX4, NKX6.1 뿐만 아니라 프리프로인슐린을 발현하였다.

(전술된) 유세포분석 방법은, 분화된 인간 타액선 세포의 99%가 KRT18 및 CD49f 상피 세포 마커를 발현하였고, 이 인간 타액선 세포의 89%가 인슐린을 발현하였음을 보여주었다.

글루코스 의존적 인슐린 분비를 분석하기 위해, 분화된 인간 타액선 세포 회전타원체를 실시예 3에 기술된 바와 같이 제조하였으며, 글루코스가 0 mM, 2 mM, 5 mM 및 15 mM 만큼 함유된 Krebs-Ringer 완충제 시료를 수집하여, 이를 실시예 3에 기술된 바와 같이 회전타원체와 함께 1시간 동안 항온처리하였다. 그 다음, 제조자의 지침에 따라 초 감수성 인슐린 ELISA 키트(Mercodia, Sweden) 및 초 감수성 C-펩티드 ELISA 키트(Mercodia, Sweden)를 사용하여 인슐린 및 C-펩티드 함량의 ELISA 분석을 수행하였다. 인슐린과 C-펩티드 분비는 적어도 2배 증가하였고, 완충제 중 글루코스 농도는 5 mM에서 15 mM로 증가하였음이 입증되었다.

3차원 배양한 세포 생성물에 대해 인슐린 ELISA를 수행한 결과, 배지 중 0 mM, 5 mM 및 15 mM이었던 글루코스 농도는 각각 200 pM, 320 pM, 및 550 pM이 되었다.

3차원 배양한 세포 생성물에 대해 C-펩티드 ELISA를 수행한 결과, 배지 중 0 mM, 5 mM 및 15 mM이었던 글루코스 농도는 1백만개 세포당 각각 150 pM, 200 pM 및 580 pM이 되었다.

그러므로, 글루코스 의존적 인슐린 분비가 가능하고, NGN3, PDX1, MAFA, PAX4, NKX6 .1 마커 및 프리프로인슐린을 발현하는 세포를 함유하는 세포 생성물 세포 2억2천5백만개를 수득하였다. 이 생성물은 인슐린, KRT18 및 CD49f를 발현하는 세포 89%와, KRT18 및 CD49f를 발현하는 세포 11%로 이루어졌다.

실시예 8. 돼지 내 실험적 당뇨병 교정

악하 타액선 세포(CSF)를 수득하기 위하여, 동물 오사보(Ossabaw) 미니돼지 주(3월령)를 사용하였다. 일반적인 마취가 이루어지는 가운데, 악하 타액선을 분리한 다음, 이를 40 μg/ml 겐타마이신(Sigma, USA)과 함께 DMEM/F12 1:1 배지(Gibco, USA)가 담긴 멸균 용기에 넣은 후, 4 시간 미만 이내에 생검편을 실험실로 운바하였다. 멸균 조건하에서 후속 작업을 수행하였다. 세척한 선을 10 ml DMEM/F12 1:1(Gibco, USA) 및 40 μg/ml 겐타마이신(Sigma, USA)이 담긴 100 mm 접시에 담고, 막낭(capsule) 뿐만아니라, 혈관 및 지방세포 조직을 조심스럽게 제거하였다. 정제한 선을 10 ml DMEM/F12 1:1(Gibco, USA) 및 40 μg/ml 겐타마이신(Sigma, USA)이 담긴 또 다른 100 mm 접시에 옮기고 나서, 미세 핀셋 2개를 사용하여 선을 가능한 한 작게(2 mm³ 이하의) 조각들로 잘랐다. 슬러리를 15 ml들이 관에 옮겨 담은 후 인산염 완충 염수로 2회 세척하고 나서, 200 g에서 5분 동안 원심분리함으로써 펠릿으로 만들었다. 상청액을 제거한 다음, 펠릿을 2 mM 글루타민(Invitrogen, USA) 및 제IV형 콜라게나아제(Gibco, USA) 2 mg/ml 함유 DMEM/F12 1:1 배지(Gibco, USA)에 조직 1 cm³ 당 용액 3 ml 비율로 재현탁하였다. (세포 현탁액을 10분마다 진탕해주며) 이 현탁액을 CO₂ 항온처리기(37℃) 내에서 1 시간 동안 항온처리하였다. 그 다음, 현탁액을 5분 동안 활발하게 피펫팅한 후, 나일론 필터에 통과시키고 나서, 200 g에서 2분 동안 원심분리함으로써 침전시켰다. 상청액을 제거하고, 세포를, 10% 소 태아 혈청(HyClone, USA), 1x 인슐린-트랜스페린-셀레나이트(Invitrogen, USA), 2 mM 글루타민(Invitrogen, USA), 10 ng/ml 표피 성장 인자(Sigma, USA)를 함유하는 완전 성장 배지 DMEM/F12 1:1(Gibco, USA) 중에 재현탁하였다. 세포를, 제I형 콜라겐 코팅 배양 플라스크에 1 cm²당 5x10³개 세포의 비율로 투입한 다음, 이를 37℃ 및 5% CO₂ 하에서 항온처리하였다. 처음 5일 동안은 배지를 매일 교체하였으며, 이후 배양중에는 배지를 3일마다 교체하였다. 필요한 수만큼의 세포를 수득한 후, 표준 프로토콜에 따라 이 세포를 대상으로 췌장 분화를 진행하였는데; 즉 당일 ~ 7일에 세포를 10% 소 태아 혈청(HyClone, USA), 1x 인슐린-트랜스페린-셀레나이트 보충물(Invitrogen, USA), 2 mM 글루타민(Invitrogen, USA), 10 ng/ml 표피 성장 인자(Sigma, USA) 함유 DMEM/F12 1:1 배지(Gibco, USA) 중에서 항온처리하되, 다만 이때 2 μM 레티노산(Sigma, USA), 1 μM 이소프로테롤올(Sigma, USA), 10 ng/ml 섬유아세포성장인자 10(Life Technologies, USA) 및 10 ng/ml 인슐린 유사 성장 인자 1(R&D, USA)을 첨가하였다. 7일 ~ 14일에 세포를 10% 소 태아 혈청(HyClone, USA), 2 mM 글루타민(Invitrogen, USA), 10 ng/ml 표피 성장 인자(Sigma, USA), 10 mM 니코틴아미드(Sigma, USA), 10 ng/ml 인슐린 유사 성장 인자 1(R & D, USA), 20 ng/ml 간 세포 성장 인자(Gibco, USA) 함유 DMEM/F12 1:1 배지(Gibco, USA) 중에서 항온처리하되, 다만 이때 100 nM 레티노산(Sigma, USA) 및 0.1 μM 덱사메타손(Sigma, USA)을 첨가하였다.

스트렙토조토신 모델을 사용하여 실험적 당뇨병을 유도하였다. 수컷 오사보 미니돼지 주(3월령)을 24시간 금식시킨 후, 시트르산염 완충제 중 스트렙토조토신(Sigma, USA)을, 동물 체중 1 kg 당 125 mg의 용량으로 1회 정맥내 주사하였다(동물: 총 20 마리). 대조군으로서는 시트르산염 완충제는 투여하되 스트렙토조토신은 투여하지 않은 미니돼지를 사용하였다(동물: 총 5 마리, "대조"군). 주사 후 72시간 경과시, 그리고 이후로도 매주 총 4주 동안 금식시킨 미니돼지의 공복시(8시간 금식 후) 글루코스 수준을, OneTouch Select(Johnson & Johnson, USA) 및 OneTouch Ultra(Johnson & Johnson, USA) 검정 스트립을 사용하여 검사하였다. 스트렙토조토신이 주사된 동물들은 혈중 글루코스 수준이 적어도 16.7 mM(300 mg/dl)이었음이 확인되었는데, 이는 스트렙토조토신 주사 동물에서 당뇨병이 발현되었음을 나타낸다. 시트르산염 완충제를 투여받은 대조군 동물은 글루코스 수준이 정상이었다(5 mM ~ 8 mM). 4주 후, 당뇨병을 발병시킨 미니돼지를 무작위로 2개의 군으로 나누었다(각 군당 동물 10마리로 이루어짐). 군 하나에는 세포 이식을 수행하였다("실험"군). 금식 12시간 후, 인산염 완충 염수 5 ml 중 2천만개의 분화 돼지 타액선 세포를 이 동물들의 췌장 돌출부에 복막내 주사하였다. 또 다른 당뇨병 마우스 군에는 인산염 완충 염수 5 ml를 주사하였다("당뇨병"군). 이후 1주일마다 총 8주 동안 행하여진 '8시간 금식' 후 동물 군 3개(기준, 실험, 당뇨병) 모두에 있어서의 혈중 글루코스 수준에 관한 연구를 수행하였다.

대조군에 속하는 동물들은 관찰 기간 내내 혈중 글루코스 수준이 정상(약 5 mM)이었음이 확인되었다. 세포를 이식받은 동물들은, 세포 이식 후 3주째 되는 날부터 혈중 글루코스 수준의 통계학적으로 유의미한 감소를 보였다. 실험의 막바지에 이르기까지 실험 동물의 혈중 글루코스 수준은 정상 값(약 7 mM)에 접근하였다. 당뇨병 군의 동물은 관찰 기간 내내 혈중 글루코스 수준이 높았다(약 18 mM). 따라서, 분화된 돼지 타액선 세포는 미니돼지에 있어서 실험적 스트렙토조토신 당뇨병을 교정할 수 있었다.

Claims (14)

1. 상피 조직 생검편으로부터 상피 전구 세포를 수득한 다음, 이 결과로 얻어진 세포를 글루코스 의존적 인슐린 분비가 가능한 세포로 췌장 분화시키는 단계를 포함하는, 인간 인슐린 생산 세포의 세포 생성물을 수득하기 위한 방법으로서, 상기 췌장 분화는 다음의 두 단계, 즉
   (a) 4일 내지 15일 동안 적어도 다음과 같은 첨가제, 즉 표피 성장 인자, 트랜스페린, 아셀렌산나트륨, 레티노산, 이소프로테레놀의 존재하에 적어도 포유동물 혈청 및 글루타민이 보충된 배양 배지 중에서 세포를 배양하는 제1 단계; 및
   (b) 4일 내지 15일 동안 적어도 다음과 같은 첨가제, 즉 표피 성장 인자, 레티노산, 니코틴아미드, 간세포 성장 인자, 덱사메타손의 존재하에 적어도 포유동물 혈청 및 글루타민이 보충된 배양 배지 중에서 세포를 배양하는 제2 단계;로 진행되고,
   상기 두 단계에서 세포 배양은 5% CO₂의 존재하에 온도 37℃에서 수행되는 방법.
2. 제1항에 있어서,
   상기 제1 단계의 배양 배지는 혈청 2 부피% ~ 20 부피%, 글루타민 1 mM 이상 ~ 4 mM, 표피 성장 인자 1 ng/ml ~ 300 ng/ml, 트랜스페린 0.1 mcg/ml 이상, 아셀렌산나트륨 0.1 ng/ml ~ 20 ng/ml, 레티노산 0.1 μM ~ 20 μM, 이소프로테레놀 0.1 μM ~ 10 μM을 함유하는 방법.
3. 제1항에 있어서,
   상기 제1 단계의 배양 배지는 하기 농도의 하기 성분들, 즉 2 부피% ~ 20 부피%의 혈청, 1 mM 이상의 글루타민, 1 ng/ml ~ 300 ng/ml의 표피 성장 인자, 0.1 mcg/ml 이상의 트랜스페린, 0.1 ng/ml ~ 20 ng/ml의 아셀렌산나트륨, 10 nM ~ 20 μM의 레티노산, 1 mM ~ 100 mM의 니코틴아미드, 1 ng/ml ~ 300 ng/ml의 간 세포 성장 인자, 0.01μM ~ 5 μM의 덱사메타손을 함유하는 방법.
4. 제1항에 있어서,
   상기 제1 단계의 배양 배지는 하기 성분들, 즉 인슐린 유사 성장 인자 1, 섬유아세포 성장 인자 10, 섬유아세포 성장 인자 4, 각질세포 성장 인자 중 적어도 하나를 추가로 함유하는 방법.
5. 제1항에 있어서,
   상기 제2 단계의 배양 배지는 인슐린 유사 인자 1 및/또는 베타셀룰린을 추가로 함유하는 방법.
6. 제1항에 있어서,
   상기 상피 전구 세포는 타액선 또는 장 또는 위 또는 간 또는 췌장으로부터 유래하는 생검 재료로부터 단리되는 방법.
7. 제1항에 있어서,
   상기 배양은 5% O₂가 추가로 존재할 때 수행되는 방법.
8. 제1항에 있어서,
   상피 전구 세포 바이오매스를 증가시키기 위해 췌장 분화 전에 상피 전구 세포 배양이 수행되는 방법.
9. 제1항에 있어서,
   상기 세포 생성물은 3차원 조건하에 추가로 배양되어 회전타원체로 수득되는 방법.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 의하여 수득된 포유동물의 인슐린 생산 세포의 세포 생성물로서, 등장 용액 1 ml 중 적어도 1백만개의 세포 또는 1만개의 회전타원체를 함유하는 세포 생성물.
11. 5천만개 ~ 2억개의 세포를 함유하는, 제10항에 의한 세포 생성물을 진성 당뇨병이 발병한 수용개체의 체내에 이식하는 단계를 수반하는, 진성 당뇨병의 대체 요법을 위한 방법.
12. 제11항에 있어서,
    세포 생성물 이식편은 회전타원체의 형태를 가진다는 점에서 차이가 나는 방법.
13. 제11항에 있어서,
    상기 세포 생성물의 이식은 췌장 돌출부에의 복막내 주사에 의하여 이루어지거나, 또는 비장 또는 간문맥 또는 대망에 투여되어 이루어지는 방법.
14. 제11항에 있어서,
    상기 세포 생성물은 1개월 ~ 6개월의 간격을 두고 2회 ~ 5회 투여되는 방법.

Images