ES2626145T3 - Andamios de biomatriz para dispersión a escala industrial - Google Patents

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Richard Harold Malavarca
Yunfang Wang
Lola Cynthia Mcadams Reid
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Abstract

Un método para producir un andamio de biomatriz a partir de tejido hepático de mamífero para su dispersión a escala industrial sobre un aparato de cultivo; el método comprende: a) perfundir el tejido hepático u homogeneizar el tejido hepático con un tampón que comprende una concentración de sal de 3,5 M de NaCl a 4,5 M de NaCl, después b) perfundir el tejido hepático o extraer el homogeneizado de la etapa (a) con un tampón de deslipidación que comprende desoxicolato sódico y fosfolipasa A2 en un primer medio, en donde la osmolalidad de dicho primer medio es de 250 mOsm/kg a 350 mOsm/kg y dicho primer medio está libre de suero y a pH neutro; después c) perfundir el tejido o extraer el homogeneizado de la etapa (b) con un tampón a un pH neutro y que comprende una concentración de sal de 2,0 M de NaCl a 5,0 M de NaCl, la concentración elegida para mantener insolubles los colágenos identificados en el tejido biológico; después d) perfundir el tejido o extraer el homogeneizado de la etapa (c) con RNAasa y DNAasa en un tampón; y después e) enjuagar el tejido u homogeneizado de la etapa (d) con un segundo medio que está a pH neutro, está libre de suero y tiene una osmolalidad de 250 mOsm/kg a 350 mOsm/kg, para producir de esta manera un andamio de biomatriz intacto u homogeneizado del tejido hepático, dicho andamio de biomatriz retiene al menos 95 % de sus colágenos originales y la mayoría de los componentes de la matriz asociados al colágeno y los factores de crecimiento, hormonas y citocinas unidos a la matriz del tejido biológico; f) diluir el andamio de biomatriz en medio basal; g) congelar el andamio de biomatriz de (f); h) pulverizar el andamio de biomatriz de (g) mediante trituración criogénica hasta obtener partículas de biomatriz que tienen un tamaño en el intervalo de 1 μm a 100 μm; i) descongelar las partículas de biomatriz de (h) en suspensión en medio basal; y j) dispersar las partículas de biomatriz de la etapa (i) sobre un aparato de cultivo, para producir de esta manera un andamio de biomatriz a partir de tejido biológico para su dispersión a escala industrial sobre un aparato de cultivo.

Description

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Andamios de biomatriz para dispersion a escala industrial Campo de la invencion
Esta invencion se refiere a andamios de biomatriz y metodos para producir andamios de biomatriz y su uso en diversas aplicaciones como andamios intactos o como andamios que se seccionan o pulverizan y se dispersan de diversas maneras para usos experimentales y clfnicos especfficos.
Antecedentes de la invencion
La capacidad de utilizar celulas diferenciadas ex vivo o en programas clfnicos tales como terapias celulares depende de la capacidad de mantener a las celulas con un fenotipo adulto y completamente funcionales o de ser capaces de restringir el linaje a las celulas madre o progenitoras ("madre/progenitoras") para lograr ese fenotipo adulto. La revolucion en curso en la investigacion con celulas madre ha hecho posible la identificacion y aislamiento de poblaciones de celulas madre/progenitoras, que incluyen las de tejidos embrionarios, fetales y posnatales1. La capacidad de identificar y aislar las celulas madre/progenitoras para todos los tipos de celulas adultas y de expandirlas y diferenciarlas aumenta enormemente el potencial para utilizarlas en programas de investigacion farmaceuticos e industriales, en investigaciones academicas y en programas clfnicos tales como terapias basadas en celulas, e ingenierfa de tejidos2.
Los metodos actuales para mantener las celulas diferenciadas o restringir el linaje de las celulas madre a un destino adulto ex vivo tienen un exito parcial e implican sembrar las celulas o incorporarlas en un sustrato de uno o mas componentes de la matriz extracelular y en un medio compuesto de hormonas especfficas, factores de crecimiento y nutrientes adaptados para el fenotipo adulto deseado. Para las celulas madre muy primitivas, tales como las celulas madre embrionarias (ES) o las celulas madre pluripotentes inducidas (iPS) o las derivadas de manera postnatal, que pueden seguir multiples destinos adultos, tales como celulas madre mesenquimales (MSC) o celulas madre derivadas de lfquido amniotico (AFSC), las celulas madre se someten a una mezcla de senales solubles y/ componentes de la matriz extracelular y deben tratarse con multiples conjuntos de estas senales durante semanas. Tfpicamente, el fenotipo adulto que se logra es distinto con cada preparacion y tiene sobre o baja expresion de determinados genes especfficos para adultos y/o regulacion aberrante de uno o mas de los genes especfficos de tejidos adultos.
La matriz extracelular es secretada por las celulas, esta adyacente a ellas en una o mas de sus superficies, y desde hace tiempo se ha entendido como el soporte estructural para las celulas7. Es un andamio extraordinariamente complejo compuesto de una variedad de moleculas biologicamente activas que estan muy reguladas y son fundamentales para determinar la morfologfa, el crecimiento y la diferenciacion de las celulas unidas8. La expresion genica especffica de tejidos en celulas cultivadas se mejora mediante el cultivo de las celulas en extractos de matriz o componentes purificados de la matriz9. Sin embargo, los componentes individuales de la matriz, solos o en combinacion, son incapaces de recapitular la qufmica y la arquitectura complejas de una matriz del tejido. Esto se relaciona con el hecho de que los componentes de la matriz se encuentran en gradientes asociados con zonas tisulares naturales y con estructuras histologicas tales como vasos sangufneos. Esta complejidad de la matriz tisular se logra mas facilmente mediante extracciones que descelularizan un tejido y dejan atras la matriz como residuo10,11. Sin embargo, los actuales protocolos de descelularizacion dan como resultado perdidas importantes de algunos de los componentes de la matriz debido al uso de enzimas que degradan la matriz o tampones que solubilizan los componentes de la matriz. De la tecnica anterior (Ross y otros J.AM. Soc. Nephrol 2009, 20, 11, 2338-2347 y Shupe Organogenesis, 2010, 6, 2, 134-136) se conoce el uso de tratamientos tanto con SDS como Triton o SDS solos (WO2010/039823). Sin embargo, estos detergentes duros pueden danar la matriz extracelular.
La presente invencion proporciona andamios de biomatriz y metodos para obtener y utilizar tales andamios de biomatriz. Los metodos de esta invencion dan como resultado la produccion de un extracto de especificidad tisular, enriquecido mayoritariamente de los colagenos del tejido y con componentes de union a la matriz y hormonas, factores de crecimiento y citocinas unidos a la matriz que en conjunto producen efectos de diferenciacion mas reproducibles y potentes tanto en celulas maduras como en la restriccion del linaje de poblaciones de celulas madre/progenitoras.
Resumen de la invencion
La presente invencion proporciona un metodo para producir un andamio de biomatriz a partir de tejido hepatico de mamffero para la dispersion (por ejemplo, dispersion a escala industrial que emplea volumenes como se describe, por ejemplo en los protocolos que se exponen en el Ejemplo 2) sobre un aparato de cultivo, el metodo comprende: a) perfundir el tejido hepatico u homogeneizar el tejido hepatico con un tampon que comprende una concentracion de sal de aproximadamente 3,5 M de NaCl a aproximadamente 4,5 M de NaCl; b) perfundir el tejido hepatico o extraer el homogeneizado de la etapa (a) con un tampon de deslipidacion que comprende desoxicolato sodico y
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fosfolipasa A2 en un primer medio, en donde la osmolalidad de dicho primer medio es de aproximadamente 250 mOsm/kg a aproximadamente 350 mOsm/kg y dicho primer medio esta libre de suero y a pH neutro; despues
c) perfundir el tejido o extraer el homogeneizado de la etapa (b) con un tampon a un pH neutro y que comprende una concentracion de sal de 2,0 M de NaCl a 5,0 M de NaCl, la concentracion elegida para mantener insolubles los colagenos identificados en el tejido hepatico; despues
d) perfundir el tejido o extraer el homogeneizado de la etapa (c) con RNAasa y DNAasa en un tampon; y despues
e) enjuagar el tejido u homogeneizado de la etapa (d) con un segundo medio que esta a pH neutro, esta libre de suero y tiene una osmolalidad de aproximadamente 250 mOsm/kg a 350 mOsm/kg,
para producir de esta manera un andamio de biomatriz intacto u homogeneizado a partir del tejido biologico, dicho andamio de biomatriz comprende al menos el 95 % de los colagenos y la mayorfa de los componentes de la matriz asociados al colageno y factores de crecimiento, hormonas y citocinas unidos a la matriz del tejido biologico;
f) diluir el andamio de biomatriz en medio basal;
g) congelar el andamio de biomatriz de (f) a aproximadamente -80 °C;
h) pulverizar el andamio de biomatriz de (g) mediante trituracion criogenica hasta obtener partfculas de biomatriz cuyo tamano esta en el intervalo de aproximadamente 1 pm a aproximadamente 100 pm;
i) descongelar las partfculas de biomatriz de (h) en suspension en medio basal; y
j) dispersar las partfculas de biomatriz de la etapa (i) sobre un aparato de cultivo, para producir de esta manera un andamio de biomatriz a partir de tejido biologico para la dispersion (por ejemplo, dispersion a escala industrial como se describe en la presente) sobre un aparato de cultivo.
La presente invencion describe ademas andamios de biomatriz producidos por los metodos de esta invencion.
Lo anterior y otros aspectos de la presente invencion se describiran ahora en mas detalle con respecto a otras modalidades descritas en la presente. Debe comprenderse que esta invencion puede llevarse a cabo en formas diferentes y no debe interpretarse como limitada a las modalidades expuestas en la presente. Mas bien, estas modalidades se proporcionan para que esta descripcion sea exhaustiva y completa, y refleje completamente el alcance de la invencion a los expertos en la tecnica.
Breve descripcion de las figuras
Figuras 1A-E1. Preparacion de andamios de biomatriz hepatica de rata. (A) Proceso de descelularizacion en cuatro etapas que comprende lavado por perfusion, deslipidacion con PLA2 y SDC, lavados con alto contenido de sal, y tratamiento con nucleasa para eliminacion de acidos nucleicos. (B-D) Cuatro etapas en la preparacion de andamio de biomatriz de rata. (B) Despues del lavado por perfusion con medio basal durante 10 minutos el hfgado se vuelve palido; (C) durante la deslipidacion, el hfgado se vuelve parcialmente transparente bajo GC (D) el andamio final intacto se observa transparente a los 40 minutos de perfusion; (E) Andamio de biomatriz mostrado a bajo aumento. (E1) La visualizacion de un andamio perfundido con partfculas de dextrano marcadas con rodamina demuestra el flujo progresivo desde los vasos grandes a las ramas de los vasos sangufneos finos a traves de los canales sin fugas, lo que indica la vasculatura evidente en los andamios. La tincion correspondiente con hematoxilina y eosina (H&E) del andamio de biomatriz en diferentes etapas demostro que las estructuras histologicas tales como los vasos sangufneos y la matriz tipo encaje que envuelve el parenquima se conservan, mientras que las celulas se eliminan. La estructura normal de la trfada portal hepatica en la rata que consiste en la vena porta (PV), la arteria hepatica (HA) y el conducto biliar (BD) (B1); las fibras de la matriz se vuelven evidentes a medida que las celulas se eliminan gradualmente durante el proceso de descelularizacion (C1); region de la trfada portal descelularizada, comparar (B1) con la de (D1); D2 y D3 muestran que todas las celulas se eliminan del andamio de matriz, pero se conservan las estructuras de malla tales como los vasos sangufneos, GC y la matriz tipo encaje que rodea la muralia de celulas parenquimatosas.
Figuras 2A-H. Imagenes de TEM (A-C) y SEM (D-H) de andamios de biomatriz de hfgado de rata. (A) Imagen a poco aumento de un vaso sangufneo (BV) con una pared gruesa (W). El colageno tipo I (punta de flecha grande) es abundante y contiene secciones transversales de fibras individuales que no absorben tinciones de metales pesados (puntos blancos, puntas de flecha pequenas). (B) El mayor aumento de la pared de un vaso muestra la membrana basal (flecha grande), elastina amorfa (*) y fibras elasticas asociadas, un resto raro de vesfculas con membrana (punta de flecha pequena), una fibra con bandas de colageno tipo I (punta de flecha) y fibrillas pequenas (flechas pequenas). Las fibrillas pequenas son probablemente fibrilina (colageno tipo VI) que se asocia estrechamente con el colageno tipo I y ayuda a organizarlo. (C) Imagen a gran aumento del colageno tipo I con un patron de bandas de 64 nm (flechas). (D) Imagen a bajo aumento de un vaso con pared delgada (BV) y la pared de un vaso mas grande (W). (E) A mayor aumento, la pared del vaso grande (W) es festoneada, consistente con la arteria hepatica de una trfada portal, ver (A). Debajo de la pared hay numerosos haces de colageno tipo I (flecha grande) unidos por fibrillas de colageno delgadas, reticulares (tipo III), largas y ramificadas (flechas pequenas). (F) Un gran haz de colageno tipo I tiene fibras paralelas caracterfsticas (flecha grande) asociadas con una variedad de fibras mas pequenas (flecha) y fibras nodulares o en forma de cuentas (punta de flecha). (G) Malla 3D de fibras grandes/pequenas interconectadas en un plano que forma un lfmite tal como para un sinusoide hepatico. (H). Imagen a mayor aumento
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de la malla que muestra una variedad de fibras (flechas): Colageno tipo III (mayor diametro recto), fibras elasticas o colageno tipo VI.
Figuras 3A-B. Analisis qufmico de colagenos y expresion de componentes de la matriz extracelular (ECM) en los andamios de biomatriz. (A) El contenido de tres aminoacidos, los cuales se encuentran en los colagenos: hidroxiprolina (Hyp), hidroxilisina (Hyl) y glicina (Gly). Los numeros representan los residuos de cada aminoacido/1000 aminoacidos. Los datos indican el drastico aumento en el contenido de colageno en el proceso de descelularizacion que va de <0,2 % en el hfgado a mas del 15 % en los andamios de biomatriz. (B) La tincion inmunohistoqufmica de moleculas de la matriz en andamios de biomatriz, muestra una distribucion en los andamios de biomatriz hepatica de laminina (LAM), sulfato de heparan (HS), colageno tipo III (COL3) y fibronectina (FN) y protefnas tfpicas de la membrana basal en asociacion con restos de vasos sangufneos. A mayor aumento, pueden observarse los miembros principales de la membrana basal, que incluyen colageno tipo IV (COL4), entactina (Ent, denominada ademas nidogeno), laminina (LAM) y perlecan (Per), una forma de HS-PG en la porcion de los andamios cercana a las trfadas portales.
Figuras 4A-D. Patron de los componentes de ECM desde la trfada portal hasta la vena central en andamios de biomatriz. Comparacion histologica desde la trfada portal (zona 1) hasta la vena central (zona 3) de un hfgado normal (A) y un andamio de biomatriz hepatica (B); ambas son secciones tenidas con hematoxilina/eosina. (C) El modelo que ilustra una celula madre y un sistema de linaje de maduracion en el hfgado con componentes representativos de la matriz que muestra la formacion de patrones asociados con la zonificacion hepatica. Los componentes se enumeran en orden de abundancia a partir de los hallazgos de inmunohistoqufmica. Las etapas de linaje conocidas dentro de los hfgados humanos comienzan periportalmente en la zona 1 (alrededor de las trfadas portales) y progresan en la maduracion para terminar con celulas apoptoticas en la zona 3. La qufmica conocida de la matriz identificada en el nicho de celulas madre del hfgado esta compuesta de hialuronanos, colageno tipo III, una forma de laminina que se une a la integrina a6p4 y una forma sulfatada debilmente de CS-PG43,44. Justo fuera del nicho de celulas madre se encuentra el colageno tipo IV, normalmente con CS-PG sulfatados y HS-PG y formas de laminina que se unen a la integrina ap1. Se ha documentado que los HP-PG se ubican exclusivamente de manera pericentral45,46. (D) El estudio de los componentes de la matriz y su ubicacion en el hfgado frente a los de los andamios de biomatriz, datos resumidos de los hallazgos de inmunohistoqufmica (N/D = no analizado. *Otros han informado que se encuentran exclusivamente cerca de las venas centrales). La mayorfa de los componentes del citoesqueleto se pierden durante los lavados, quedan presentes residuos de algunas, pero no de todas, las protefnas citoesqueleticas. Los andamios no tienen cantidades detectables de tubulina, desmina y actina (ensayos de faloidina). Sin embargo, existen cantidades trazas de citoqueratinas diseminadas al azar en los andamios; cantidades traza de a-actina del musculo liso alrededor de restos de vasos sangufneos en las trfadas portales; y niveles bajos de vimentina en todas partes.
Figuras 5E-I. Caracterizacion de hHpSC sobre andamios de biomatriz hepatica frente a hHpSC sobre colageno tipo 1. Las imagenes de contraste de fase (A-D) muestran los cambios morfologicos de las colonias de hHpSC derivadas del mismo hfgado y cultivadas en medio de Kubota libre de suero y sobre plastico de cultivo de tejido (A), una de las condiciones para la autorreplicacion, frente a las condiciones de diferenciacion del medio de diferenciacion libre de suero para el hfgado, y sobre colageno tipo I (B) frente a los andamios de biomatriz hepatica bovina (C-E). Los cultivos funcionales y completamente viables no duraron mas de ~2 semanas en colagenos tipo I. Por el contrario, aquellas en andamios de biomatriz hepatica estaban viables y sanas y con un repertorio completo de funciones que duraron al menos un mes. Los cultivos indujeron una transicion en las celulas hacia los dfas 7-12 con un aumento de la relacion citoplasmica/nuclear y una expresion marcada de glucogeno (C) y despues a unas con morfologfa clasica de hepatocitos poligonales intercalados por canalfculos biliares claros (D), una morfologfa de cultivo que persistio despues, segun lo indicado en el cultivo representativo en el dfa 24 (E). Los ensayos de RT-PCR muestran cambios en la expresion genica de hHpSC en condiciones de autorreplicacion en plastico de cultivo (F) frente a andamios de biomatriz hepatica de rata en el dfa 7 (G). Se comparo la expresion de los marcadores de hHpSC, que incluyen CXCR4 y EpCAM; genes hepatocfticos tempranos que incluyen CK19 (KRT19), HNF6, FOXA2, AFP y niveles bajos de albumina; marcadores hepatocfticos maduros que incluyen niveles altos de albumina (ALB), transferrina (TF), CYP450-3A4, tirosina aminotransferasa (TAT) y glucosa-6-fosfatasa (G6PC) y genes colangiocfticos, que incluyen CFTR, gamma glutamil transpeptidasa (GGT1) intercambiador anionico 2 (AE2) y transportador de acido biliar dependiente de sodio apical (ASBT). Ensayos bioqufmicos que miden la urea (H) sintetizada en cultivos sobre colageno tipo I frente a andamios de biomatriz hepatica de rata y actividad de CYP450-3A4 (I) en cultivos sobre colageno tipo I frente a andamios de biomatriz preparados a partir de hfgados de rata o de bovino. La Tabla 7 proporciona un resumen de las medidas cuantitativas que comparan la union, la viabilidad, el crecimiento, la duracion de la vida del cultivo y la expresion genica con especificidad tisular de hHpSC recien aisladas, en condiciones de cultivo para la autorreplicacion (colageno tipo III) o en condiciones de diferenciacion sobre colageno I, frente a andamios de biomatriz hepatica.
Figuras 6A-D. Tincion de inmunofluorescencia de celulas con restriccion del linaje a partir de hHpSC sobre andamios de biomatriz. (A) Tincion con marcador especffico hepatico:albumina (Alb, gris claro) y marcador de la superficie de celulas madre hepaticas: EpCAM (blanco). Observese que las celulas sembradas sobre el andamio de biomatriz no expresan EpCAM. Barra de escala = 200 pm. (B) Tincion con el marcador hepatico temprano a-fetoprotefna (AFP, gris claro) y con un anticuerpo contra el marcador de colangiocitos humanos, la citoqueratina 19 (CK19, blanco) que
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a este nivel de expresion es indicativa de colangiocitos maduros. El anticuerpo para el ensayo de CK19 es especffico de humanos y no tino el residuo en la CK19 de rata en los andamios no sembrados con celulas. La expresion de AFP es baja pero todavfa evidente en el dfa 7. Barra de escala = 200 pm. (C) Tincion con Alb (gris claro) y marcador de celulas estrelladas hepaticas, a-actina del musculo liso (ASMA, blanco). La expresion de albumina y ASMA es una fuerte indicacion de la presencia de hepatocitos maduros y celulas estrelladas. Barra de escala = 100 pm. (D) Tincion con protefna hepatica funcional CYP450-3A4 (gris claro) y marcador especffico de colangiocitos, receptor de secretina (SR, blanco) que muestra que los colangiocitos y hepatocitos maduros son funcionales y expresan los marcadores clasicos para estos dos tipos celulares. Barra de escala = 200 pm.
Figuras 7A-D. Estabilidad de hepatocitos humanos maduros y completamente funcionales sobre andamios de biomatriz. Hepatocitos humanos adultos sembrados en el medio de diferenciacion y sobre colageno tipo I (A,B) frente a andamios de biomatriz hepatica bovina (C) que se pulverizaron criogenicamente, se dispersaron en el medio y se dejaron sedimentar sobre las placas. Las celulas sobre el colageno tipo I son totalmente viables y en su maximo de diferenciacion de 7-12 dfas (A - mostradas a los 7 dfas); comienzan a deteriorarse despues de ~2 semanas, y hacia los 20 dfas (B) mueren, estan en un proceso de muerte y no son funcionales. Por el contrario, las sembradas sobre andamios de biomatriz hepatica (C) son funcionales durante al menos 8 semanas (aun no se han evaluado tiempos mas largos); aquf se muestra despues de 21 dfas en cultivo sobre andamios de biomatriz hepatica pulverizados. Ensayos de CYP450-3A4 en cultivos de dos preparaciones separadas de celulas hepaticas humanas adultas criopreservadas, sembradas sobre andamios de biomatriz frente a colageno tipo I y sometidas al ensayo en el dfa 12 (D). La muestra ZHep-007 es representativa de muestras criopreservadas con buena adherencia despues de la descongelacion; la muestra ZL-013 es representativa de los lotes que tienen mala o ninguna adherencia despues de la descongelacion. Por lo tanto, incluso estas muestras de menor calidad son capaces de unirse a los andamios de biomatriz y permanecer viables a largo plazo. En ambas muestras sometidas al ensayo, los niveles de P450 son mayores cuando se cultivan sobre andamios de biomatriz hepatica. Con el tiempo sobre los andamios de biomatriz, los lotes de celulas criopreservadas de menor calidad mejoraran.
Figura 8. Activacion de la fosfolipasa A2 por desoxicolato sodico para producir lisolecitina. Principio del protocolo: La fosfolipasa A2 (PLA2) activada por desoxicolato sodico degradara el fosfoglicerido ubicado en la membrana citoplasmatica y la membrana mitocondrial a lisolecitina, un potente tensoactivo, que induce necrosis celular.
Figura 9. Analisis de la composicion de colageno de hfgados de rata frente a andamios de biomatriz hepatica de rata. La composicion de aminoacidos de la biomatriz (negro) y del hfgado entero (gris claro) presentada en forma de un diagrama de rosa. Se utiliza una abreviatura de tres letras para cada aminoacido analizado. El triptofano y la cistefna no se analizaron. Los numeros indican los residuos de aminoacidos/1000.
Figuras 10A-C. Analisis de acidos nucleicos del andamio de biomatriz hepatica de rata. Foto de contraste de fase (A) y tincion fluorescente con DAPI (B) de la lamina de biomatriz hepatica, y ensayos cuantitativos en ARN y ADN total de tejido hepatico fresco de rata frente al andamio de biomatriz (C).
Figuras 11A-C. Tincion del andamio de biomatriz despues de sembrar hHpSC sobre el andamio de biomatriz. El ensayo Vivas (calcefna-AM, blanco)/Muertas (bromuro de etidio o EtD-Bn, gris claro) indica que las colonias de hHpSC eran viables en secciones del andamio de biomatriz, pero no incorporaron el colorante en el centro de las colonias (A,B) durante los primeros dfas debido a las bombas conocidas en las celulas madre (por ejemplo, MDR1) que eliminan los colorantes vitales. En (B) la imagen de fluorescencia se fusiona con la de fase para indicar que el centro de la colonia contiene celulas. En el dfa 7, las celulas a lo largo de la colonia se habfan diferenciado e incorporado el colorante vital en casi todas las celulas a lo largo de la colonia (C).
Figuras 12A-F. Comparacion de hepatocitos de rata cultivados sobre colageno tipo I con respecto a hepatocitos de rata cultivados sobre andamios de biomatriz hepatica de rata. Hepatocitos adultos de rata cultivados sobre colageno tipo I y andamio de biomatriz en el dfa 3 (A,C) y el dfa 10 (B,D). Las celulas se unieron en cuestion de varios minutos a los andamios de biomatriz hepatica y sobrevivieron durante todo el tiempo ensayado, mas de 8 semanas (C,D); no se analizaron perfodos de tiempo mas largos. Los cultivos son muy tridimensionales en los andamios de biomatriz. Sfntesis de urea (E) y ensayo de viabilidad celular (F) en los dfas 1, 3, 5, 7, 10, 14, 21 y 28, n = 3.
Figuras 13A-D. Comparacion de un pancreas humano con un andamio de biomatriz pancreatica humana. Pancreas humano (A) vs andamio de biomatriz pancreatica humana (B-D) embebidos en parafina, cortados y tenidos con Hematoxilina y Eosina (H & E). Las estructuras de los islotes se han delineado en B. Las regiones acinares de los andamios de biomatriz pancreatica se muestran en C y D.
Figura 14. Comparacion de los componentes representativos de la matriz y un componente del citoesqueleto, la vimentina, que se encuentra en el tejido pancreatico humano frente a andamios de biomatriz pancreatica de rata. Otros componentes del citoesqueleto (desmina, tubulina, actina) no se encontraron en cantidades detectables o se encontraron en cantidades traza (citoqueratinas). Las lfneas discontinuas rodean los islotes, donde se observa que sindecano1 y el colageno tipo VI son fuertemente positivos en los islotes tanto en el tejido pancreatico como en los andamios de biomatriz. Sindecano 1 se encuentra solo en los islotes (lfnea discontinua), pero no en las celulas acinares (flechas); el colageno tipo III es mas abundante en las celulas acinares y alrededor de los vasos sangufneos (flechas), pero no en los islotes.
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Figuras 15A-C. Tincion histologica e inmunohistoqufmica de andamio de biomatriz de duodeno humano. (A) Lado exterior y del lumen del andamio de biomatriz de duodeno humano. Las estructuras de multiples capas entre el tejido normal (B) y el andamio de biomatriz (C) se compararon en secciones tenidas con H & E, y los resultados muestran que los andamios retuvieron las vellosidades y vasos sangufneos en las capas de la mucosa y la submucosa. Los paneles inferiores muestran que la tincion inmunohistoqufmica del andamio de biomatriz de duodeno humano indico cantidades variables de protefnas de la matriz extracelular retenidas en el andamio.
Figuras 16A-D. Comparacion de un tejido de vesfcula biliar humana con un andamio de biomatriz de vesfcula biliar humana. Tejido de la vesfcula biliar humana (A,B) frente a andamios de biomatriz (C,D) preparados a partir de este. El tejido y los andamios de biomatriz se embebieron en parafina, se cortaron y tineron con hematoxilina y eosina.
Figura 17. Ejemplo de preparacion de una solucion de biomatriz para una dilucion de 1:24. 30 ml x 3 = 90 ml. 30 ml de biomatriz + 90 ml de Solucion 5 = 120 ml de solucion de biomatriz para una dilucion de 1:24.
Descripcion detallada de la invencion
La presente invencion se describira ahora mas en detalle de aquf en adelante. Esta invencion puede, sin embargo, realizarse en formas diferentes y no debe interpretarse como limitada a las modalidades expuestas en la presente. Mas bien, estas modalidades se proporcionan para que esta descripcion sea exhaustiva y completa, y refleje completamente el alcance de la invencion a los expertos en la tecnica.
La terminologfa que se usa en la descripcion de la invencion en la presente es con el proposito de describir modalidades particulares unicamente y no se pretende que sean limitativas de la invencion. Tal como se usa en la descripcion de la invencion y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el/la" pretenden incluir las formas plurales tambien, a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
A menos que se defina de cualquier otra manera, todos los terminos (que incluyen los terminos tecnicos y cientfficos) usados en la presente descripcion tienen el mismo significado que entiende comunmente un experto en la tecnica a la que pertenece esta invencion. Se comprendera ademas que los terminos, tales como los definidos en los diccionarios utilizados comunmente, deben interpretarse como que tienen un significado que es consistente con su significado en el contexto de la presente solicitud y la tecnica relevante y no deben interpretarse en un sentido idealizado o excesivamente formal, a menos que asf se defina expresamente en la presente descripcion. La terminologfa que se usa en la descripcion de la invencion en la presente es con el proposito de describir modalidades particulares unicamente y no se pretende que sean limitativas de la invencion.
Ademas, como se usa en la presente descripcion, "y/o" se refiere y abarca a todas y cada una de las combinaciones posibles de uno o mas de los elementos enumerados asociados, asf como la falta de combinaciones cuando se interpreta en la alternativa ("o").
A menos que el contexto lo indique de cualquier otra manera, se pretende especfficamente que las diversas caracterfsticas de la invencion descritas en la presente puedan utilizarse en cualquier combinacion. Por otra parte, la presente invencion contempla ademas que en algunas modalidades de la invencion, cualquier caracterfstica o combinacion de caracterfsticas expuestas en la presente descripcion pueden excluirse u omitirse. Para ilustrar, si la descripcion establece que un complejo comprende los componentes A, B y C, esta especfficamente destinado que cualquiera de A, B o C, o una combinacion de estos, puede omitirse y rechazarse individualmente o en cualquier combinacion.
Como se usa en la presente descripcion, la frase de transicion "que consiste esencialmente en" (y variantes gramaticales) ha de interpretarse que abarca los materiales o etapas citados y "los que no afectan materialmente la(s) caracterfstica(s) basica(s) y novedosas de la invencion reivindicada. Ver, In re Herz, 537 F.2d 549, 551-52, 190 U.S.P.Q. 461, 463 (CcPA 1976) (enfasis en el original); ver ademas MPEP § 2111.03. Por lo tanto, el termino "que consiste esencialmente en" como se usa en la presente descripcion no debe interpretarse como equivalente de "que comprende".
El termino "aproximadamente", como se usa en la presente descripcion cuando se refiere a un valor medible tal como una cantidad o concentracion (por ejemplo, el porcentaje de colageno en las protefnas totales en el andamio de biomatriz) y similares, esta destinado a abarcar variaciones del 20 %, 10 %, 5 %, 1 %, 0,5 %, o incluso 0,1 % de la cantidad especificada.
La presente invencion esta dirigida al descubrimiento y desarrollo de un andamio de biomatriz que tiene mejoras y ventajas inesperadas sobre los andamios de tejido descelularizado ahora conocidos, donde algunos ejemplos de la mejora y ventaja son el uso del andamio de biomatriz de esta invencion para, de manera eficiente, mantener celulas maduras y/o restringir el linaje y/o diferenciar celulas madre a destinos maduros y/o mantener dichas celulas maduras como funcionales durante un perfodo de tiempo prolongado. Como otro ejemplo, el uso de los andamios de biomatriz de esta invencion reduce el tiempo para producir celulas de destinos maduros de aproximadamente tres a seis semanas o mas a aproximadamente una a dos semanas. Los andamios de biomatriz de esta invencion se
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producen mediante el uso de protocolos especfficos que emplean el equilibrio apropiado de concentracion de sal y fuerza ionica (diferentes colagenos tienen diferentes constantes de solubilidad (23)) para un tejido dado, para permitir la retencion de colagenos nativos presentes en ese tejido en forma insoluble, lo que produce un andamio de biomatriz que retiene un alto por ciento de colagenos nativos que proporcionan senales para conducir a la restriccion del linaje y la diferenciacion. Por el contrario, los andamios descelularizados producidos de acuerdo con protocolos conocidos no emplean tal equilibrio de concentracion de sal y fuerza ionica para permitir la retencion de un alto por ciento de estos colagenos nativos y la mayorfa de estos colagenos nativos se pierden cuando se usan estos protocolos conocidos. Ademas, los andamios de biomatriz de esta invencion permiten la produccion de virus y/o agentes patogenos dependientes del linaje (por ejemplo, dependientes de la diferenciacion) en cantidades suficientes para uso experimental y/o terapeutico (por ejemplo, para la produccion de vacunas).
Por lo tanto, en una modalidad, la presente invencion proporciona un metodo para producir un andamio de biomatriz a partir de tejido biologico, que comprende las etapas de: a) perfundir el tejido biologico u homogeneizar el tejido biologico con un primer medio, en donde la osmolalidad de dicho primer medio es de aproximadamente 250 mOsm/kg a aproximadamente 350 mOsm/kg y dicho primer medio esta libre de suero y a pH neutro; despues b) perfundir el tejido biologico o extraer el homogeneizado de la etapa (a) con un tampon de deslipidacion que comprende lipasas y/o detergentes en dicho primer medio; despues c) perfundir el tejido o extraer el homogeneizado de la etapa (b) con un tampon a un pH neutro y que comprende una concentracion de sal de aproximadamente 2,0 M de NaCl a aproximadamente 5,0 M, la concentracion elegida para mantener insolubles a los colagenos identificados en el tejido biologico; despues d) perfundir el tejido o extraer el homogeneizado de la etapa (c) con RNAasa y DNAasa en un tampon; y despues e) enjuagar el tejido u homogeneizado de la etapa (d) con un segundo medio que esta a pH neutro, esta libre de suero y tiene una osmolalidad de aproximadamente 250 mOsm/kg a aproximadamente 350 mOsm/kg, para producir de esta manera un andamio de biomatriz intacto u homogeneizado del tejido biologico, dicho andamio de biomatriz comprende al menos 95 % (por ejemplo, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 %, 100 %) de los colagenos y la mayorfa de los componentes de la matriz asociados al colageno y factores de crecimiento, hormonas y citocinas unidos a la matriz del tejido biologico sin procesar. En la presente invencion se proporciona ademas un andamio de biomatriz producido mediante cualquiera de los metodos de esta invencion.
"Andamio de biomatriz", como se usa en la presente descripcion, se refiere a un extracto tisular aislado enriquecido en matriz extracelular, como se describe en la presente, que retiene muchos o la mayorfa de los colagenos y factores unidos al colageno encontrados naturalmente en el tejido biologico. En algunas modalidades se retienen esencialmente todos los colagenos y factores unidos al colageno y en otras modalidades el andamio de biomatriz comprende todos los colagenos que se conoce que estan en el tejido. El andamio de biomatriz puede comprender al menos aproximadamente 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o 100 % de los colagenos, componentes de la matriz asociados al colageno, y/o factores de crecimiento, hormonas y/o citocinas unidos a la matriz, en cualquier combinacion, encontrados en el tejido biologico natural. En algunas modalidades el andamio de biomatriz comprende al menos 95 % de los colagenos y la mayorfa de los componentes de la matriz asociados al colageno y factores de crecimiento, hormonas y/o citocinas unidos a la matriz del tejido biologico. Como se describe en la presente, "la mayorfa de los componentes de la matriz asociados al colageno y factores de crecimiento, hormonas y/o citocinas unidos a la matriz del tejido biologico" se refiere a que el andamio de biomatriz retiene aproximadamente 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o 100 % de los componentes de la matriz asociados al colageno y factores de crecimiento, hormonas y/o citocinas unidos a la matriz encontrados en el tejido biologico natural (por ejemplo, sin procesar).
Los colagenos ilustrativos incluyen todos los tipos de colageno, tales como, pero sin limitacion, colagenos tipo I a tipo XXIX. El andamio de biomatriz puede comprender al menos aproximadamente 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o mas de uno o mas de los colagenos encontrados en el tejido biologico natural y/o pueden tener uno o mas de los colagenos presentes en una concentracion que es al menos aproximadamente 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o mas de los encontrados en el tejido biologico natural. La cantidad de colageno en el andamio de biomatriz puede determinarse mediante diversos metodos conocidos en la tecnica y como se describen en la presente descripcion, tales como, pero sin limitacion, la determinacion del contenido de hidroxiprolina.
Los componentes ilustrativos de la matriz asociada al colageno incluyen, pero sin limitacion, moleculas de adhesion; protefnas de adhesion; L- y P-selectina; molecula asociada al crecimiento de union a la heparina (HB-GAM); repeticion de trombospondina tipo I (TSR); amiloide P (AP); lamininas; nidogenos/entactinas; fibronectinas; elastinas; vimentinas; proteoglicanos (PG); sulfato de condroitina-PG (CS-PG); sulfato de dermatan-PG (DS-PG); miembros de la familia de proteoglicanos pequenos ricos en leucina (SLRP), tales como biglicano y decorinas; heparina-PG (HP- PG); sulfato de heparan-PG (HS-PG) tales como glipicanos, sindecanos y perlecanos; y glicosaminoglicanos (GAG) tales como hialuronanos, sulfatos de heparan, sulfatos de condroitina, sulfatos de queratina y heparinas. En algunas modalidades, el andamio de biomatriz comprende, consiste o consiste esencialmente en colagenos, fibronectinas, lamininas, nidogenos/entactinas, elastinas, proteoglicanos, glicosaminoglicanos, factores de crecimiento, hormonas y citocinas (en cualquier combinacion) unidos a diversos componentes de la matriz. El andamio de biomatriz puede comprender al menos aproximadamente 50 %, 70 %, 75 %, un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o mas de uno o mas de las hormonas, citocinas y/o componentes de la matriz asociados al colageno que se encuentran en el tejido biologico natural y/o puede tener uno o mas de estos componentes presentes en una
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concentracion que es al menos aproximadamente 50 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o mas de la que se encuentra en el tejido biologico natural. En algunas modalidades, el andamio de biomatriz comprende todos o la mayor parte de las hormonas citocinas y/o componentes de la matriz asociados al colageno, que se conoce que estan en el tejido. En otras modalidades, el andamio de biomatriz comprende, consiste esencialmente o consiste en uno o mas de las hormonas, citocinas y/o componentes de la matriz asociados al colageno en concentraciones que estan cercanas a las encontradas en el tejido biologico natural (por ejemplo, aproximadamente 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 100 % de la concentracion encontrada en el tejido natural).
Los factores de crecimiento ilustrativos incluyen, pero sin limitacion, factores de crecimiento de fibroblastos (FGF), factores de crecimiento nervioso (NGF), factores de crecimiento epidermico (EGF), factores de crecimiento transformantes, factores de crecimiento de hepatocitos (HGF), factores de crecimiento derivados de plaquetas (PDGF), factores de crecimiento similares a la insulina (IGF), protefnas de union a IGF, factores basicos de crecimiento de fibroblastos y factores de crecimiento endotelial vascular (VEGF). Las citocinas ilustrativas incluyen, pero sin limitacion, interleucinas, linfocinas, monocinas, factores estimulantes de colonias, quimiocinas, interferones y factor de necrosis tumoral (TNF). El andamio de biomatriz puede comprender al menos aproximadamente 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 100 % o mas (en cualquier combinacion) de uno o mas de los factores de crecimiento unidos a la matriz y/o citocinas encontradas en el tejido biologico natural y/o puede tener uno o mas de estos factores de crecimiento y/o citocinas (en cualquier combinacion) presentes a una concentracion que es al menos aproximadamente 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o 100 % o mas de la encontrada en el tejido biologico natural. En algunas modalidades, el andamio de biomatriz comprende niveles fisiologicos o niveles cercanos a los fisiologicos de muchos o la mayorfa de los factores de crecimiento unidos a la matriz, hormonas y/o citocinas conocidas por estar en el tejido natural y/o detectadas en el tejido, y en otras modalidades el andamio de biomatriz comprende uno o mas de los factores de crecimiento, hormonas y/o citocinas unidos a la matriz, a concentraciones que estan cercanas a las concentraciones fisiologicas encontradas en el tejido biologico natural (por ejemplo, que se diferencian en no mas de aproximadamente 30 %, 25 %, 20 %, 25 %, 20 %, 15 %, 10 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 % en comparacion). La cantidad o concentracion de factores de crecimiento o citocinas presentes en el andamio de biomatriz puede determinarse por diversos metodos conocidos en la tecnica y como se describen en la presente, tales como, pero sin limitacion, diversos ensayos de anticuerpos y ensayos de factores de crecimiento.
"Tejido biologico" como se usa en la presente descripcion se refiere a cualquier tejido de un organismo vivo o fallecido o cualquier tejido derivado de un organismo vivo o fallecido. El termino "tejido biologico natural" y variaciones de este, como se usan en la presente descripcion, se refieren al tejido biologico tal como existe en su estado natural o no modificado en el organismo. Los andamios de biomatriz de la presente invencion pueden prepararse a partir de cualquier tejido biologico. El tejido biologico puede incluir cualquier tejido individual (por ejemplo, una coleccion de celulas que pueden estar interconectadas) o un grupo de tejidos que constituyen un organo o parte o region del cuerpo de un organismo. El tejido puede comprender un material celular homogeneo o puede ser una estructura compuesta tal como la que se encuentra en regiones del cuerpo que incluyen el torax que, por ejemplo, puede incluir tejido pulmonar, tejido esqueletico y/o tejido muscular.
Los tejidos biologicos ilustrativos de esta invencion incluyen hfgado, pulmon, tiroides, piel, pancreas, vasos sangufneos, vejiga, rinones, cerebro, arbol biliar, duodeno, aorta abdominal, vena ilfaca, corazon e intestinos, que incluyen cualquier combinacion de estos. El organismo (es decir, el sujeto) con el cual se asocia o del cual se deriva el tejido biologico puede ser cualquier mamffero. Los sujetos ilustrativos incluyen mamfferos, tales como seres humanos, ratones, ratas, hurones, hamsteres, conejos, cobayos, cerdos, porcinos, perros, gatos, caballos, vacas, ovejas, monos y chimpances. El sujeto puede ser de cualquier edad y/o tamano. El tejido biologico puede estar sano, enfermo y/o tener mutaciones geneticas. En algunas modalidades, los andamios de biomatriz de la presente invencion son especfficos de tejidos en su naturaleza qufmica y funcionalidad, es decir, los andamios de biomatriz son representativos o comparables con el tejido biologico a partir del cual se crearon en terminos de su naturaleza qufmica y funcionalidad.
En algunas modalidades, la histologfa original y las vasculaturas evidentes se mantienen en los andamios de biomatriz. Esto puede incluir los restos reconocibles de las entidades histologicas principales del tejido biologico, tales como, pero sin limitacion, vasos sangufneos y otra vasculatura para cualquier tejido; conductos biliares y capsula de Glisson (GC) del hfgado; conductos pancreaticos, islotes y acinos del pancreas; bronquios, traquea y alveolos de los pulmones, etcetera. En otras modalidades, la qufmica del andamio de biomatriz coincide con la histologfa (por ejemplo, la matriz alrededor de los vasos sangufneos es distinta de la que rodea a los hepatocitos). En algunas modalidades la qufmica del andamio de biomatriz esta en un gradiente que se correlaciona con la histologfa. Por ejemplo, cuando el tejido biologico es el hfgado, el andamio de biomatriz puede retener el gradiente en la qufmica de la matriz que se correlaciona con las zonas acinares hepaticas 1-3 desde la trfada portal a la vena central y con entidades histologicas tales como los canales vasculares y la capsula de Glisson (GC). Otros ejemplos incluyen, pero sin limitacion, vasos sangufneos donde la qufmica de la matriz alrededor de los vasos sangufneos esta repleta de altos niveles de colagenos en red (por ejemplo, tipo IV y tipo VI), elastinas y formas de HS-PG; alrededor de los hepatocitos en la zona periportal (zona 1), donde las lamininas estan en alta concentracion junto con una mezcla de CS-PG y HS-PG, mientras que alrededor de la zona pericentral (zona 3), los hepatocitos estan rodeados por una mezcla de HS-PG y HP-PG; asociados con los conductos biliares donde existen altos niveles de
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colageno tipo I, fibronectinas y formas de CS-PG y DS-PG. En todos los tejidos existen gradientes paralelos en la quimica de la matriz.
Una serie de medios de enjuague, tales como el primer y el segundo medio, y tampones pueden utilizarse en la presente invention. En particular, puede usarse cualquier medio de enjuague o tampon que mantenga los colagenos y los factores unidos (por ejemplo, componentes de la matriz, factores de crecimiento y citocinas) en un estado insoluble. Cuando se elige un medio o tampon, la concentration de sal, el pH y la fuerza ionica deben ser adecuados para mantener los colagenos y/o la mayoria o la mayor parte de los componentes de la matriz unidos al colageno y otros factores (por ejemplo, en virtud de sus conexiones quimicas directa o indirectamente con los colagenos) en un estado insoluble. La Tabla 1 proporciona intervalos de concentracion molar del cloruro de sodio para diversos tipos de colageno para ayudar a un experto en la tecnica a proporcionar medios y tampones que aseguren que los colagenos, los componentes de la matriz asociados al colageno y los factores de crecimiento y citocinas unidos a la matriz permanezcan insolubles. Deyl y otros ("Preparative procedures and purity assessment of collagen proteins" Journal of Chromatography B 790 (2003) 245-275), adicionalmente, proporcionan information sobre la qufmica del colageno que puede facilitar la identification de las condiciones optimas para mantener los colagenos y los factores unidos en un estado insoluble.
La Tabla 1 demuestra que el pH es una variable que actua junto con la concentracion de sal para definir la solubilidad. Cuando se tienen altas concentraciones de sal, el pH puede ser neutro. En algunas modalidades de la presente invencion, la concentracion de sal elegida es la que mantiene todos los colagenos del tejido en un estado insoluble, no solo uno de los colagenos del tejido en un estado insoluble. Por ejemplo, los colagenos conocidos en el higado fetal son los insolubles en concentraciones de sal de 4,5 M de NaCl y los de tejido hepatico adulto que son insolubles en concentraciones de sal de aproximadamente 3,4 M-3,5 M de NaCl.
La osmolalidad de cualquiera de los medios de enjuague y/o tampones puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 200 mOsm/kg a aproximadamente 400 mOsm/kg, de aproximadamente 250 mOsm/kg a aproximadamente 350 mOsm/kg, de aproximadamente 275 mOsm/kg a aproximadamente 325 mOsm/kg, o de aproximadamente 300 mOsm/kg a aproximadamente 325 mOsm/kg, que incluyen, pero sin limitation, cualquier valor dentro de estos intervalos no citado explicitamente en la presente. El agua destilada y los tampones diluidos (por ejemplo, con osmolalidad <100 mOsm/kg) produciran la perdida de cantidades significativas de colageno, componentes de la matriz asociados al colageno y factores de crecimiento y citocinas unidos a la matriz. Por lo tanto, en algunas modalidades de los metodos de esta invencion, no se incluyen agua destilada ni tampones diluidos.
Como reconocera un experto en la tecnica, la osmolalidad es una expresion de la concentracion osmotica de un soluto por masa, mientras que la osmolaridad es por volumen del disolvente. Por lo tanto, la conversion de osmolaridad a osmolalidad puede realizarse mediante la multiplication por la densidad de masa. La osmolalidad puede medirse mediante el uso de un osmometro que mide las propiedades coligativas, tales como la depresion del punto de congelation, la presion de vapor, y la elevation del punto de ebullition.
La osmolaridad es la medida de la concentracion de soluto, definida como el numero de osmoles (Osm) de soluto por litro (L) de solution (osmol/L u Osm/L). La osmolaridad de una solution se expresa usualmente como Osm/L. Mientras la molaridad mide el numero de moles de soluto por unidad de volumen de solucion, la osmolaridad mide el numero de osmoles de particulas del soluto por unidad de volumen de la solucion. La osmolalidad es una medida de los osmoles de soluto por kilogramo de disolvente (osmol/kg u Osm/kg).
La molaridad y la osmolaridad no se utilizan comunmente en osmometria porque son dependientes de la temperatura. Esto se debe a que el agua cambia su volumen con la temperatura. Sin embargo, si la concentracion de solutos es muy baja, la osmolaridad y la osmolalidad se consideran equivalentes.
La osmolaridad de una solucion puede calcularse a partir de la siguiente expresion:
osmol/L = ^ ifii n.iC.i
donde q es el coeficiente osmotico, que explica el grado de no idealidad de la solucion; n es el numero de particulas (por ejemplo iones) en las que se disocia una molecula; C es la concentracion molar del soluto; y el indice i representa la identidad de un soluto particular. En el caso mas simple q es el grado de disociacion del soluto. Entonces, q esta entre 0 y 1, donde 1 indica el 100 % de disociacion. Sin embargo, q tambien puede ser mayor que 1 (por ejemplo, para la sacarosa). Para las sales, los efectos electrostaticos provocan que q sea menor que 1 incluso si se produce 100 % de disociacion.
La perfusion del tejido biologico con cualquier medio o tampon puede lograrse al forzar el medio o tampon a traves de la vasculatura relevante del tejido biologico. Por ejemplo, si el tejido biologico es el hfgado, entonces el medio o tampon pueden perfundirse a traves de la vena porta del hfgado. Alternativamente, el medio o tampon pueden
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verterse sobre el tejido biologico y/o dejar que difundan a traves del tejido biologico. Por ejemplo, el tejido biologico puede sumergirse y/o dializarse en el medio o tampon, para permitir que el medio o tampon difundan a traves del tejido biologico. Mientras se sumergen y/o se dializan en el medio o tampon, la solucion y el tejido biologico pueden sacudirse, tal como sobre un balancfn, y/o agitarse. En algunas modalidades los medios y tampones se perfunden a traves de la vasculatura relevante del tejido biologico.
Alternativamente, el tejido puede homogeneizarse en el medio inicial y los tampones y medios usados despues de esto son para la extraccion del homogeneizado. Las versiones homogeneizadas de los andamios de biomatriz se preparan a partir de organos grandes (por ejemplo, de tejidos de vaca o porcino), despues se pulverizan hasta obtener un polvo a temperaturas del nitrogeno lfquido y el polvo se usa en placas para estudios de cultivo.
En algunas modalidades, el primer medio y/o el segundo medio es un medio basal, tal como, pero sin limitacion, medio RPMI 1640, DME/F12, DME, F12, bMe, DMEM, Waymouth o William. En la tecnica se conocen otros medios basales ilustrativos y estan disponibles comercialmente. El primer medio y/o el segundo medio pueden comprender, consistir esencialmente o consistir en componentes que se combinan para mantener la mayorfa de los colagenos insolubles y como moleculas nativas, como se describe en la presente descripcion (por ejemplo, mediante la combinacion particular de la osmolalidad y la fuerza ionica asf como la ausencia de suero). El primer medio y/o el segundo medio pueden comprender, consistir, o consistir esencialmente en los constituyentes presentes o similares o que imitan a los presentes en el fluido intersticial tales como, pero sin limitacion, agua; sales tales como, pero sin limitacion, sales inorganicas; vitaminas; minerales; aminoacidos tales como, pero sin limitacion, glicina, serina, treonina, cistefna, asparagina y/o glutamina; azucares; acidos grasos; coenzimas; hormonas; y neurotransmisores. En determinadas modalidades donde el primer medio y/o el segundo medio comprenden constituyentes presentes o similares o que imitan a los presentes en el fluido intersticial, los constituyentes pueden producir una osmolalidad aproximadamente equivalente a la osmolalidad del medio basal disponible comercialmente o producir una osmolalidad de aproximadamente 250 mOsm/kg a aproximadamente 350 mOsm/kg. En algunas modalidades, el primer medio y/o el segundo medio incluyen medios que estan libres de suero, comprenden constituyentes presentes en el fluido intersticial, y/o tienen una osmolalidad de aproximadamente 250 mOsm/kg a aproximadamente 350 mOsm/kg. Tales medios tambien pueden estar a pH neutro. La composicion especffica del primer medio y/o el segundo medio se determina, en modalidades particulares, por las constantes de insolubilidad de los colagenos del tejido biologico utilizado para obtener el andamio de biomatriz, como conocera un experto en la tecnica.
El tampon de deslipidacion de la presente invencion debe ser eficaz y sin embargo suave. El tampon de deslipidacion puede comprender, consistir o consistir esencialmente en detergentes o tensoactivos, medio basal, sales y/o lipasas. Al elegir los componentes para el tampon de deslipidacion, deben evitarse detergentes duros (por ejemplo, dodecilsulfato de sodio, Triton X-100) para minimizar la perdida de componentes de la matriz. Los detergentes ilustrativos de esta invencion incluyen detergentes anionicos, tales como sales del acido desoxicolico, acido 1-heptanosulfonico, N-laurilsarcosina, laurilsulfato, acido 1-octanosulfonico y acido taurocolico; detergentes cationicos tales como cloruro de benzalconio, cetilpiridinio, cloruro de metilbenzetonio y bromuro de decametonio; detergentes zwitterionicos tales como alquil betafnas, alquil amidoalquil betafnas, N-dodecil-N,N-dimetil-3-amonio-1- propanosulfonato y fosfatidilcolina; y detergentes no ionicos tales como n-decil a-D-glucopiranosido, n-decil p-D- maltopiranosido, n-dodecil p-D-maltosido, n-octil p-D-glucopiranosido, esteres de sorbitan, n-tetradecil p-D- maltosido, tritones, Nonidet-P-40, Poloxamero 188 y cualquiera de los grupos de detergentes Tween; lauril sulfato sodico; y desoxicolato sodico. En algunas modalidades, el tampon de deslipidacion comprende desoxicolato sodico.
Las lipasas ilustrativas incluyen fosfolipasas tales como fosfolipasa A2, lipasa pancreatica humana, esfingomielinasas, lipasa lisosomal, lipasa endotelial y lipasa hepatica. En algunas modalidades, el tampon de deslipidacion comprende fosfolipasa A2. En otras modalidades, el tampon de deslipidacion comprende desoxicolato sodico y fosfolipasa A2. Esta combinacion, en algunas modalidades, puede comprender de aproximadamente 20 a aproximadamente 50 unidades/l de fosfolipasa A2 y aproximadamente 1 % de desoxicolato sodico preparado en un medio basal de pH neutro y libre de suero, que puede ser, por ejemplo, el primer medio. La combinacion de desoxicolato sodico y fosfolipasa A2 degrada rapidamente el fosfoglicerido ubicado en la membrana citoplasmatica y la membrana mitocondrial a lisolecitina, un tensoactivo potente, que puede inducir necrosis y citolisis. Como reconocera un experto en la tecnica, la cantidad y el tipo de lipasa y/o detergente pueden depender del tejido biologico.
La etapa de perfusion del tejido biologico con el tampon de deslipidacion se lleva a cabo, en algunas modalidades, hasta que el tejido se vuelve transparente. En otras modalidades, la etapa de perfusion del tejido biologico con el tampon de deslipidacion se lleva a cabo hasta que la efusion se vuelve clara. En algunas modalidades, la etapa de deslipidacion se lleva a cabo hasta que el tejido se vuelve transparente y la efusion se vuelve clara.
En algunas modalidades se evita la exposicion prolongada de los andamios de biomatriz a las enzimas de las celulas lisadas, ya que puede disminuir en gran medida el contenido de elastina y el contenido de glicosaminoglicanos tales como sulfatos de heparan, sulfatos de condroitina, sulfatos de dermatan y heparinas, que son sitios en los que se unen las citocinas y los factores de crecimiento. La exposicion a las enzimas de las celulas lisadas puede evitarse, por ejemplo, durante la deslipidacion y/o los lavados posteriores despues de la deslipidacion.
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En algunas modalidades, puede emplearse el uso de un inhibidor de proteasas y/o un control cuidadoso del pH, la temperature y/o el tiempo para limitar la actividad de las proteasas y/u otras enzimas de las celulas lisadas.
Los inhibidores de proteasas ilustrativos incluyen, pero sin limitacion, inhibidores de serina proteasas tales como, pero sin limitacion, antipafna, aprotinina, quimostatina, elastatinal, fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), APMSF, TLCK, TPCK, leupeptina e inhibidor de tripsina de soja; cistefna proteasas tales como, pero sin limitacion, IAA (acido indolacetico) y E-64; inhibidores de proteasa aspartica tales como, pero sin limitacion, pepstatina y VdLPFFVdL; metaloproteasas tales como, pero sin limitacion, EDTA, 1,10-fenantrolina y fosforamodon; exopeptidasas tales como pero sin limitacion amastatina, bestatina, diprotina A y diprotina B; tiol proteasas; a-2-macroglobulina, inhibidor de tripsina de soja o haba; inhibidor de proteasa pancreatico; ovostatina de clara de huevo; cistatina de clara de huevo; y combinaciones de inhibidores de proteasas, denominados comunmente como un "coctel de inhibicion de proteasas" por los proveedores comerciales de tales inhibidores.
El pH del andamio de biomatriz, los tampones, y/o los medios puede mantenerse a de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 9,0, de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 8,5, de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 8,0, o de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 8,0. En algunas modalidades, el andamio de biomatriz, los tampones, y/o los medios se mantienen a un pH de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 8,0 o se mantienen a un pH de aproximadamente 7,3 a aproximadamente 7,5, que incluye sin limitacion, cualquier valor comprendido dentro de estos intervalos pero no citado explfcitamente en la presente descripcion. En otras modalidades, el andamio de biomatriz, los tampones y/o los medios se mantienen a pH neutro. La temperatura del andamio de biomatriz (por ejemplo, durante y/o despues de la preparacion), los tampones y/o los medios puede ser de aproximadamente 0 °C a aproximadamente 30 °C, de aproximadamente 5 °C a aproximadamente 25 °C, o de aproximadamente 10 °C a aproximadamente 20 °C, que incluyen, pero sin limitacion, cualquier valor comprendido dentro de estos intervalos pero no citado explfcitamente en la presente descripcion. En algunas modalidades la temperatura se mantiene a aproximadamente 20 °C. El tiempo de perfusion del tejido biologico con cualquier medio
0 tampon puede ser de aproximadamente 5 horas o menos, aproximadamente 3 horas o menos, aproximadamente
1 hora o menos, aproximadamente 30 minutos o menos, o aproximadamente 15 minutos o menos. En algunas modalidades, la etapa de perfusion del tejido biologico con el tampon de deslipidacion es de aproximadamente 30 minutos o menos. En algunas modalidades en las que se usan pH acidos, las concentraciones de sal para mantener insolubles a los colagenos y los componentes asociados al colageno pueden ser diferentes; las concentraciones pueden determinarse por la literatura existente sobre la qufmica del colageno mediante la eleccion de concentraciones de sal que mantienen la insolubilidad de los colagenos.
Los tampones ilustrativos incluyen, pero sin limitacion, cloruro sodico, lactato sodico, acetato sodico, fosfato sodico, citrato sodico, borato sodico, gluconato sodico, tampones citrato, tampones bis\tris, tampones fosfato, fosfato potasico, citrato/dextrosa, bicarbonato sodico, cloruro de amonio, acido 3- {[tris(hidroximetil)metil]amino}propanosulfonico, tris(hidroximetil)metilamina, N-tris(hidroximetil)metilglicina, acido 4,2- hidroxietil-1-piperazinoetanosulfonico y acido 3-(N-morfolino)propanosulfonico.
En algunas modalidades, el tampon de esta invencion (por ejemplo, el tampon usado en la etapa © descrita en la presente descripcion) puede comprender una sal en una concentracion de aproximadamente 2,0 M o mas. Por ejemplo, en algunas modalidades la sal puede estar en una concentracion de aproximadamente 2,0 M a aproximadamente 5,0 M, de aproximadamente 2,5 M a aproximadamente 5,0 M, de aproximadamente 3,0 M a aproximadamente 4,5 M, o de aproximadamente 3,0 M a aproximadamente 4,0 M, que incluyen, pero sin limitacion, cualquier valor comprendido dentro de estos intervalos, pero no citado explfcitamente en la presente descripcion. Por ejemplo, en algunas modalidades el tampon utilizado en los metodos de la presente invencion puede comprender una sal tal como cloruro sodico en una concentracion de aproximadamente 2,0 M de NaCl a aproximadamente 4,5 M de NaCl. En otras modalidades, tales como las de hfgados adultos, el tampon utilizado puede comprender de aproximadamente 3,4 M a aproximadamente 3,5 M de NaCl. En modalidades tales como las del hfgado fetal, el tampon utilizado puede comprender una sal tal como cloruro sodico en una concentracion de aproximadamente 4,0 M a aproximadamente 4,50 M. En algunas modalidades la perfusion del tejido biologico con un lavado con sal, tal como el de la etapa c) de los metodos ilustrativos descritos en la presente, se lleva a cabo hasta que el perfusado (es decir, el lfquido usado para la perfusion, tal como el lfquido que se ha forzado a traves de la vasculatura) es negativo para protefnas segun se determina por densidad optica (DO) a 280 nm.
Cualquiera de los medios y/o tampones de la presente invencion puede comprender un inhibidor de proteasas. Los inhibidores de proteasas ilustrativos se describen anteriormente. En algunas modalidades, el tampon tal como el de la etapa (c) de los metodos ilustrativos descritos en la presente comprende un inhibidor de proteasas, tal como un inhibidor de tripsina de soja. En otras modalidades, el tampon de la etapa (d) comprende uno o mas inhibidores de proteasas, tales como un inhibidor de tripsina de soja.
Los medios y/o tampones de la presente invencion pueden comprender una o mas nucleasas, que en algunas modalidades pueden prepararse en los tampones estandar recomendados por los proveedores comerciales de estas enzimas. Por ejemplo, en algunas modalidades, el tampon de la etapa d) comprende una o mas nucleasas, tales como, pero sin limitacion, RNAasa y DNAasa. La perfusion con nucleasas elimina residuos de acidos nucleicos. En otras modalidades, el tampon de la etapa d) comprende RNAasa, DNAasa y uno o mas inhibidores de proteasas. En algunas modalidades la perfusion del tejido biologico con una o mas nucleasas se lleva a cabo hasta que el
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perfusado (es decir, el liquido usado para la perfusion, tal como el ifquido que se ha forzado a traves de la vasculatura) es negativo para acidos nucleicos segun se determina por densidad optica (DO) a 260 nm. En algunas modalidades, las nucleasas eliminan el 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 100 % de los acidos nucleicos en el tejido biologico.
El segundo medio (por ejemplo, el medio de enjuague final) puede ser cualquier medio que asegure que los colagenos y factores unidos (por ejemplo, componentes de la matriz, factores de crecimiento y citocinas) permaneceran insolubles, como se describio anteriormente. Los medios de enjuague finales ilustrativos se han descrito anteriormente con referencia al primer medio y estan libres de suero, a pH neutro y con una osmolalidad de 250-350 mOsm/kg. Por ejemplo, en algunas modalidades el segundo medio comprende un medio basal. En algunas modalidades, el segundo medio es un medio basal libre de suero. En otras modalidades, el segundo medio es un medio hormonalmente definido, libre de suero (HDM) que comprende hormonas, factores de crecimiento, lfpidos y albumina serica y se adapta a las necesidades de las celulas a cultivar. Un segundo medio ilustrativo es el medio de Kubota (Kubota y Reid, PNAS 97:12132-12137, 2000), que esta disenado para celulas madre hepaticas, hepatoblastos y otros progenitores. En determinadas modalidades, el segundo medio puede o no comprender la suplementacion con suero o un factor derivado de suero, tal como, pero sin limitacion, albumina serica humana. En algunas modalidades, el enjuague del tejido con el segundo medio elimina los residuos del tampon de deslipidacion y las nucleasas. En otras modalidades, el lavado con el segundo medio y/o cualquier tampon o medio posteriores equilibra el andamio de biomatriz con el medio o tampon. En algunas modalidades, el primer medio y el segundo medio pueden ser los mismos y en algunas modalidades, el primer medio y el segundo medio pueden ser diferentes, para producir de esta manera un andamio de biomatriz a partir del tejido biologico.
En algunas modalidades uno o mas de los medios y/o tampones utilizados en la preparacion del andamio de biomatriz estan libres (es decir, no contienen una cantidad detectable) de una o mas enzimas que degradan los componentes de la matriz extracelular. En otras modalidades, todos los medios y tampones utilizados en la preparacion del andamio de biomatriz estan libres (es decir, no contienen una cantidad detectable) de una o mas enzimas que degradan los componentes de la matriz extracelular. Las enzimas ilustrativas incluyen, pero sin limitacion, colagenasas; proteasas; glicosidasas tales como heparinasa, heparitinasa, condroitinasa e hialuronidasa; y elastasas.
La esterilizacion del tejido biologico, del homogenado y/o del andamio de biomatriz de esta invencion puede realizarse mediante cualquier metodo conocido en la tecnica, con la advertencia de que deben evitarse metodos que utilicen un factor que pueda unirse al andamio de biomatriz (por ejemplo oxido de etileno). Los metodos de esterilizacion ilustrativos incluyen, pero sin limitacion, irradiacion gamma, descargas luminiscentes de radiofrecuencia (RFGD) esterilizacion por plasma, esterilizacion por haz de electrones y esterilizacion por dioxido de carbono supercrftico. En algunas modalidades, la esterilizacion del tejido, del homogeneizado y/o del andamio de biomatriz se realiza con irradiacion gamma a aproximadamente 5000 rads. Si los andamios se usaran inmediatamente para la recelularizacion, y si se usaron procedimientos esteriles en el proceso de descelularizacion (especialmente despues de la extraccion con alto contenido de sal), puede que la esterilizacion no sea necesaria.
El almacenamiento del andamio de biomatriz puede realizarse mediante cualquier metodo conocido en la tecnica. En algunas modalidades (por ejemplo, cuando el andamio es para usarse intacto), el andamio de biomatriz puede almacenarse a aproximadamente 4 °C y en otras modalidades (por ejemplo, cuando el andamio es para dispersarse en la secta, el andamio de biomatriz se congela, por ejemplo, a aproximadamente -80 °C.
En algunas modalidades, el andamio de biomatriz comprende, consiste, o consiste esencialmente en colagenos, fibronectinas, lamininas, nidogeno/entactina, elastina, proteoglicanos, glicosaminoglicanos y cualquier combinacion de estos, todos los cuales forman parte del andamio de biomatriz (por ejemplo, unidos al andamio de biomatriz). En algunas modalidades, el andamio de biomatriz carece de una cantidad detectable de un colageno, fibronectina, laminina, nidogeno/entactina, elastina, proteoglicano, glicosaminoglicano y cualquier combinacion de estos.
Los andamios de biomatriz de la presente invencion han demostrado ser potentes sustratos de diferenciacion para las celulas y pueden usarse para muchos tipos celulares, tales como, pero sin limitacion, cualquier celula madura o para diversas poblaciones de celulas madre. Estas incluyen, por ejemplo, celulas madre embrionarias (ES), celulas madre pluripotentes inducidas (iPS), celulas madre de la capa germinal (por ejemplo, celulas madre endodermicas definitivas), celulas madre determinadas (por ejemplo, celulas madre hepaticas, pulmonares, pancreaticas o intestinales) celulas madre hepaticas humanas (hHpSC), celulas madre perinatales (por ejemplo, celulas madre derivadas de liquido amniotico (AFSC)), celulas madre mesenquimales (MSC) tales como de la medula osea o del tejido adiposo, progenitores comprometidos, celulas adultas de cualquier tipo de tejido, celulas enfermas, celulas tumorales, celulas maduras, celulas parenquimatosas, celulas estrelladas, colangiocitos, celulas del arbol biliar tales como las que no son colangiocitos, hepatocitos, celulas de rinon, celulas uroteliales, celulas mesenquimales, celulas de musculo liso o esqueletico, miocitos, (celulas madre de musculo), fibroblastos, condrocitos, adipocitos, fibromioblastos, celulas endoteliales, celulas ectodermicas, que incluyen celulas ductiles y cutaneas, celulas neurales, celulas de los islotes, celulas presentes en el intestino, osteoblastos, otras celulas que forman hueso o cartilago, y cualquier combinacion de estas. Estas celulas pueden ser normales o enfermas.
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En algunas modalidades, los andamios de biomatriz se usan para estudios biologicos, farmaceuticos, geneticos, moleculares y/o virologicos de las celulas, ya sea recien aisladas a partir de un tejido o a partir de celulas madre con restriccion del linaje. En otras modalidades los andamios de biomatriz se usan para organos implantados, vascularizados y modificados, tales como, pero sin limitacion, el hfgado. Otros usos ilustrativos para los andamios de biomatriz incluyen, pero sin limitacion, produccion de protefnas, pruebas de toxicidad de farmacos, desarrollo de farmacos, tamizaje de anticuerpos y/o produccion de virus para preparaciones de vacunas de virus. La produccion de virus dependientes del linaje (por ejemplo, virus del papiloma y hepatitis C) puede lograrse mediante la siembra de poblaciones de celulas madre en un andamio de biomatriz de especificidad tisular y despues cultivar en un medio que actua en combinacion con el andamio de biomatriz para inducir completamente la diferenciacion de las celulas. Los viriones maduros se produciran cuando las celulas maduren completamente. Mientras el virus en si no afecte la viabilidad celular, las celulas maduras infectadas con el virus pueden mantenerse durante al menos ocho semanas lo que ofrece un medio para generar grandes cantidades de virus con un sistema de cultivo estable.
Los andamios de biomatriz pueden usarse intactos, tales como, pero sin limitacion, para usarse en cultivos celulares 2-D y/o 3-D. En algunas modalidades, los andamios de biomatriz pueden usarse en combinacion con un medio especffico para la diferenciacion en cultivos 2-D y/o 3-D para lfneas celulares, tales como, pero sin limitacion, celulas normales o enfermas de cualquier etapa de maduracion del linaje a partir de las celulas madre a celulas en etapa tardfa.
Alternativamente, los andamios de biomatriz pueden congelarse. Estas secciones congeladas pueden prepararse y utilizarse como sustratos. Los andamios de biomatriz pueden congelarse rapidamente en hielo seco y las secciones congeladas preparadas con un criostato, pueden colocarse sobre aparatos de cultivo (por ejemplo, placas, matraces, tela, transwells, etcetera), esterilizarse y rehidratarse en un medio antes de sembrar las celulas. En algunas modalidades, el andamio de biomatriz congelado de esta invencion puede seccionarse.
En algunas modalidades se produce un cultivo celular, que comprende: a) producir un andamio de biomatriz de acuerdo con los metodos de esta invencion; b) poner en contacto el andamio de biomatriz de la etapa (a) con medio de cultivo celular en un aparato de cultivo; y c) sembrar el andamio de biomatriz de la etapa (b) con celulas, para producir de esta manera un cultivo celular.
En algunas modalidades se produce un cultivo celular, que comprende: a) producir un andamio de biomatriz de la presente invencion; b) congelar el andamio de biomatriz de la etapa (a); c) preparar una seccion congelada del andamio de biomatriz de la etapa (b) como un sustrato de cultivo celular; d) poner en contacto el sustrato de cultivo celular de la etapa (c) con un medio de cultivo celular en un aparato de cultivo; y e) sembrar el sustrato de cultivo celular de la etapa (d) con celulas, para producir de esta manera un cultivo celular.
En otras modalidades los andamios de biomatriz pueden triturarse hasta obtener un polvo. Un metodo de triturar el andamio de biomatriz hasta obtener un polvo comprende triturar el andamio de biomatriz hasta obtener un polvo en un molino con congelacion a temperaturas del nitrogeno lfquido o cercanas a esta. En la tecnica se conocen otros aparatos para triturar a temperaturas del nitrogeno lfquido o equivalentes (por ejemplo, congelacion con hielo seco). El polvo puede llevarse a temperatura ambiente a la cual adquiere la consistencia de una pintura con la que se puede recubrir los aparatos de cultivo mediante el uso de un cepillo de pintura esterilizado o un aparato equivalente. El polvo o las placas pueden esterilizarse.
Por lo tanto, en algunas modalidades se produce un cultivo celular que comprende: a) producir un andamio de biomatriz de la presente invencion; b) triturar el andamio de biomatriz de la etapa (a) hasta obtener un polvo; c) recubrir un aparato de cultivo con el polvo de la etapa (b) para producir un sustrato de cultivo celular; d) poner en contacto el sustrato de cultivo celular de (c) con medio de cultivo celular en el aparato de cultivo; y e) sembrar el sustrato de cultivo celular de (d) con celulas, para producir de esta manera un cultivo celular. En algunas modalidades de este metodo, la trituracion de la biomatriz puede llevarse a cabo en un molino con congelacion (por ejemplo, trituracion criogenica) a la temperatura del nitrogeno lfquido o cercana a esta.
En algunas modalidades antes de sembrar las celulas para el cultivo celular, se anade una porcion del medio al aparato de cultivo ya que las celulas pueden unirse en segundos. Las celulas, en algunas modalidades, se unen en cuestion de segundos a minutos para las celulas adultas normales y en cuestion de minutos a algunas horas para diversos tipos de celulas madre. En algunas modalidades la fijacion de las celulas puede depender de como se dispersan los andamios de biomatriz para su uso en los cultivos. El medio celular puede ser cualquier medio que sea adecuado para producir un cultivo celular. En algunas modalidades, el medio de cultivo celular comprende al menos un constituyente presente en el fluido intersticial, en donde la osmolalidad de dicho medio es de aproximadamente 250 mOsm/kg a aproximadamente 350 mOsm/kg, en donde dicho medio esta libre de suero y en donde el pH es neutro. En otras modalidades, el medio de cultivo celular puede ser un medio basal, tal como, pero sin limitacion, RPMI-1640, DME/F12, medio de Ham, medio de Kubota, etcetera.
Los cultivos celulares producidos con los andamios de biomatriz, en algunas modalidades, comprenden, consisten esencialmente, o consisten en el mismo tipo de celulas que las celulas del tejido biologico que se utilizo para fabricar
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el andamio de biomatriz. Los ejemplos no limitantes de las celulas de esta invencion incluyen celulas madre embrionarias (ES), celulas madre pluripotentes inducidas (iPS), celulas madre determinadas, celulas madre perinatales, celulas madre derivadas de lfquido amniotico (AFSC), celulas madre mesenquimales (MSC) de cualquier fuente, progenitores comprometidos o celulas adultas de cualquier tipo de tejido, celulas maduras, celulas normales, celulas enfermas, celulas tumorales y cualquier combinacion de estas. Los ejemplos no limitantes adicionales incluyen celulas hepaticas, celulas parenquimatosas, celulas estrelladas, celulas endoteliales, hepatocitos, colangiocitos, celulas del arbol biliar que no son colangiocitos y celulas pancreaticas.
En algunas modalidades, las celulas madre primitivas (ES, iPS, MSC o AFSC) restringiran el linaje de las celulas, al menos parcialmente, al tipo de tejido utilizado para fabricar el andamio de biomatriz. Las celulas madre determinadas de una capa germinal dada limitaran su linaje al tipo de tejido utilizado para obtener el andamio de biomatriz cuando el andamio se prepara a partir de un tejido derivado de esa capa germinal y pueden diferenciarse parcialmente al destino adulto si estan sobre un andamio a partir de un tejido derivado de una capa germinal diferente. Por lo tanto, la capacidad de las celulas adultas de diferenciarse completamente puede determinarse por el tipo de tejido del andamio de biomatriz. Paralelamente, el destino de las celulas madre puede estar parcial o totalmente determinado por el tipo de tejido del andamio de biomatriz o el destino de las celulas madre puede estar completamente determinado por el tipo de tejido del andamio de biomatriz. En algunas modalidades, las celulas del cultivo celular son de un tipo diferente que las celulas del tejido biologico utilizado para obtener el andamio de biomatriz. Como se describio con detalle anteriormente, los tipos celulares ilustrativos que pueden usarse en la produccion de un cultivo celular incluyen, pero sin limitacion, celulas madre embrionarias, celulas madre pluripotentes inducidas, celulas madre mesenquimales, celulas madre derivadas de lfquido amniotico, celulas madre determinadas, celulas maduras, celulas normales, celulas enfermas, celulas tumorales y cualquier combinacion de estas. Estas celulas pueden ser de cualquier tejido biologico como se describe en la presente descripcion.
En algunas modalidades los andamios de biomatriz inducen un crecimiento lento o detencion del crecimiento correlacionado con la diferenciacion de las celulas normales, ya sean celulas madre o celulas maduras. Las celulas maduras, en algunas modalidades, se diferencian completamente en cuestion de horas y permanecen diferenciadas de manera estable durante al menos ocho semanas despues. En algunas modalidades, las celulas adultas (es decir, las celulas completamente maduras) se unen a los andamios en cuestion de minutos y mantienen su diferenciacion completa despues de eso por mas de ocho semanas. Las celulas madre, en algunas modalidades, sufren unas pocas divisiones y despues entran en detencion del crecimiento y se diferencian completamente. Las celulas madre permanecen estables en la detencion del crecimiento, viables y totalmente diferenciadas durante al menos ocho semanas. En algunas modalidades, las celulas madre sembradas sobre andamios de biomatriz entran en detencion del crecimiento o ralentizan el crecimiento, pierden los marcadores de celulas madre y se diferencian a celulas maduras funcionales en aproximadamente una semana, que retienen fenotipos estables y viabilidades durante al menos ocho semanas o mas (por ejemplo, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o 100 % de viabilidad durante un perfodo de tiempo prolongado (por ejemplo, al menos una semana, al menos dos semanas, al menos tres semanas, al menos cuatro semanas, al menos cinco semanas, al menos seis semanas, al menos siete semanas, al menos ocho semanas, al menos nueve semanas, al menos diez semanas, al menos 11 semanas, al menos 12 semanas, al menos 13 semanas, al menos 14 semanas, al menos 15 semanas, al menos 16 semanas, al menos un mes, al menos dos meses, al menos tres meses, al menos cuatro meses, al menos cinco meses, al menos seis meses, al menos siete meses, al menos ocho meses, al menos nueve meses, al menos diez meses, al menos 11 meses, al menos un ano, etcetera).
En otras modalidades, el andamio de biomatriz se utiliza para diferenciar celulas madre embrionarias (ES) y/o inducir celulas madre pluripotente (IPS) a un destino especffico. Por ejemplo, en algunas modalidades se utiliza un andamio de biomatriz con especificidad tisular para facilitar la diferenciacion de celulas madre embrionarias o celulas pluripotentes inducidas hacia un destino especffico.
En determinadas modalidades de la presente invencion, el andamio de biomatriz se utiliza para diferenciar celulas madre derivadas de lfquido amniotico (AFSC) o celulas madre mesenquimales (MSC) de la medula osea o del tejido adiposo o de cualquier tejido fetal o postnatal o cualquier celula madre determinada (por ejemplo, de pulmon, intestino, arbol biliar, rinon, piel, corazon, etcetera) hacia un destino adulto especffico. En algunas modalidades, los andamios de biomatriz de la presente invencion se usan para potenciar y acelerar la diferenciacion de celulas madre a celulas maduras mediante la produccion de un cultivo celular.
En otras modalidades, la presente invencion proporciona un metodo para aumentar y/o acelerar la diferenciacion de celulas madre y/o progenitores a celulas maduras; el metodo comprende producir un cultivo celular de acuerdo con los metodos de esta invencion, en donde las celulas son celulas madre y el medio de cultivo celular se formula para celulas maduras, para potenciar y/o acelerar de esta manera la diferenciacion de celulas madre y/o progenitores a celulas maduras. El medio de cultivo celular puede ser cualquier medio que se formule para celulas maduras. Los constituyentes en el medio son distintos para cada tipo celular. La diferenciacion significa que las condiciones provocan que las celulas maduren a tipos celulares adultos que producen productos genicos especfficos de adultos. Las celulas empleadas en estos metodos pueden ser celulas adultas de cualquier tipo o celulas madre o progenitores, cuyos ejemplos no limitantes incluyen celulas madre embrionarias, celulas madre pluripotentes inducidas, celulas madre de la capa germinal, celulas madre determinadas, celulas madre perinatales, celulas madre
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derivadas de liquido amniotico, celulas madre mesenquimatosas, celulas amplificadoras de transito o progenitores comprometidos de cualquier tipo de tejido.
Las celulas sembradas en los andamios de biomatriz (por ejemplo, andamios de biomatriz intactos, secciones de andamios o andamios de biomatriz en polvo mezclados en/sobre otros materiales implantables) pueden trasplantarse a animales o seres humanos como un metodo de injerto de celulas in vivo. En algunas modalidades se proporciona un metodo para suministrar celulas a un sujeto, el metodo comprende poner en contacto al sujeto con el andamio de biomatriz de la presente invencion, en donde el andamio de biomatriz comprende las celulas. En otras modalidades se proporciona un metodo para suministrar celulas a un sujeto; el metodo comprende sembrar el andamio de biomatriz de la presente invencion con celulas y despues trasplantar el andamio de biomatriz sembrado con las celulas al sujeto. En algunas modalidades, un andamio de biomatriz que no se ha sembrado con ninguna celula puede trasplantarse a un sujeto.
En algunas modalidades, el andamio de biomatriz puede utilizarse como un injerto que puede usarse para regenerar el tejido u organo en el sujeto.
Los andamios de biomatriz de la presente invencion pueden utilizarse para establecer organos bioartificiales, que pueden ser utiles para programas analfticos y/o clfnicos. Los andamios de biomatriz pueden usarse, ademas, para identificar productos genicos especfficos o facetas de estados patologicos. En algunas modalidades, los andamios de biomatriz se preparan a partir de tejidos de animales mutantes y posteriormente se usan para definir factor(es) relevante(s) asociado(s) con la(s) mutacion(es). En otras modalidades, los andamios de biomatriz se preparan a partir de tejidos patologicos y se usan para definir cambios en la matriz relevantes para la enfermedad.
Los ejemplos adicionales no limitantes de usos de los andamios de biomatriz de esta invencion incluyen: 1) uso del andamio para cultivar celulas malignas para definir su potencial metastasico (la capacidad de las celulas tumorales para formar colonias crecientes de celulas en un tipo dado de andamio de biomatriz es predictiva de la capacidad de las celulas para hacer metastasis al tejido del que se preparo ese andamio; 2) colocar injertos de tejido en el andamio para utilizarse para el trasplante en un sujeto); 3) produccion de organoides formados por recelularizacion de andamios para utilizarse como dispositivos auxiliares, tales como, por ejemplo, un organoide hepatico que despues se conecta a un sujeto con insuficiencia hepatica; 4) el uso del andamio para la produccion de protefnas (las celulas en el andamio producen un factor que puede aislarse del medio y/o de las celulas y despues purificarse, y 5) el uso del andamio para la produccion de virus dependientes del linaje; por ejemplo, para la produccion de virus que requieren celulas diferenciadas para producir partfculas suficientes para su uso como vacuna.
Por lo tanto, la presente invencion proporciona un metodo para identificar el potencial metastasico de celulas tumorales en un tipo de tejido, que comprende a) producir un andamio de biomatriz de acuerdo con los metodos de esta invencion; b) poner en contacto el andamio de biomatriz de (a) con medio de cultivo celular en un aparato de cultivo; c) sembrar el andamio de biomatriz de (b) con celulas tumorales; d) mantener el andamio de biomatriz de (c) en condiciones de cultivo; y e) controlar el crecimiento de las celulas tumorales en el andamio de biomatriz de (d), en donde el crecimiento de celulas tumorales en el andamio de biomatriz identifica que las celulas tumorales pueden colonizar in vivo el tipo de tejido del que se produjo el andamio de biomatriz, lo que identifica de esta manera el potencial metastasico de las celulas tumorales en el tipo de tejido.
En la presente descripcion se proporciona, ademas, un metodo para identificar una celula tumoral como sensible a un tratamiento antitumoral, que comprende: a) producir un andamio de biomatriz de acuerdo con los metodos de esta invencion; b) poner en contacto el andamio de biomatriz de (a) con medio de cultivo celular en un aparato de cultivo; c) sembrar el andamio de biomatriz de (b) con celulas tumorales; d) mantener el andamio de biomatriz de (c) en condiciones de cultivo; e) aplicar el tratamiento antitumoral a las celulas tumorales en el andamio de biomatriz; y f) controlar el crecimiento de las celulas tumorales en el andamio de biomatriz de (e), en donde la falta de crecimiento de las celulas tumorales y/o la muerte de las celulas tumorales en el andamio de biomatriz de (e) identifica las celulas tumorales como sensibles al tratamiento antitumoral. Los ejemplos no limitantes de tratamiento antitumoral incluyen agentes quimioterapeuticos, anticuerpos, terapia de radiacion, inmunoterapia, terapia hormonal, etcetera, como se conoce bien en la tecnica. En algunas modalidades, las celulas tumorales de un sujeto pueden sembrarse en diferentes andamios de biomatriz de esta invencion y exponerse a tratamientos antitumorales respectivos. De acuerdo con los resultados de estos respectivos analisis de diferentes tratamientos antitumorales, se puede seleccionar un tratamiento antitumoral que sea eficaz contra las celulas tumorales del sujeto y el tratamiento antitumoral que pueda administrarse al sujeto para tratar el tumor del sujeto.
En otras modalidades, la presente invencion proporciona un metodo para producir un injerto tumoral para el trasplante a un animal huesped; el metodo comprende: a) producir un andamio de biomatriz de acuerdo con los metodos de esta invencion; b) poner en contacto el andamio de biomatriz de (a) con medio de cultivo celular en un aparato de cultivo; c) sembrar el andamio de biomatriz de (b) con celulas tumorales; d) mantener el andamio de biomatriz de (c) en condiciones de cultivo; y e) establecer una poblacion de las celulas tumorales en el andamio de biomatriz de (d), para producir de esta manera un injerto tumoral para el trasplante al animal huesped. En algunas modalidades, este metodo puede comprender ademas la etapa de trasplantar el injerto tumoral en el animal huesped. En diversas modalidades, el injerto tumoral puede ser singenico, alogenico o xenogenico con respecto al animal huesped.
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En la presente invencion se proporciona ademas un metodo para producir partfculas virales de un virus dependiente del linaje; el metodo comprende: a) producir un andamio de biomatriz de acuerdo con los metodos de esta invencion; b) poner en contacto el andamio de biomatriz de (a) con medio de cultivo celular en un aparato de cultivo; c) sembrar el andamio de biomatriz de (b) con celulas de un tipo y una etapa del linaje que pueden ser infectadas con el virus dependiente del linaje; d) infectar las celulas de (c) con el virus dependiente del linaje; e) mantener las celulas infectadas en el andamio de biomatriz en condiciones de cultivo; y f) recolectar partfculas virales producidas en las celulas infectadas, para producir de esta manera partfculas virales del virus dependiente del linaje.
Los ejemplos no limitantes de un virus dependiente del linaje de esta invencion incluyen virus de la hepatitis C, virus de la hepatitis B, norovirus virus del papiloma humano y cualquier otro virus conocido actualmente o identificado mas tarde como dependiente del linaje. Por dependiente del linaje se entiende que la celula en la que esta presente el virus debe madurar o diferenciarse a una etapa particular antes que el virus pueda replicarse con exito en la celula y producir partfculas virales, como se conoce en la tecnica.
Ademas, la presente invencion proporciona un metodo para producir un organoide formado por recelularizacion de un andamio de biomatriz; el metodo comprende: a) producir un andamio de biomatriz de acuerdo con los metodos de esta invencion; b) poner en contacto el andamio de biomatriz de (a) con medio de cultivo celular en un aparato de cultivo; c) sembrar el andamio de biomatriz de (b) con celulas del mismo tipo tisular que el tejido biologico usado para preparar el andamio de biomatriz; y d) mantener las celulas en el andamio de biomatriz en condiciones de cultivo, con lo que se forman organoides a partir de las celulas, para producir de esta manera un organoide formado por recelularizacion del andamio de biomatriz. Este metodo puede comprender ademas la etapa de poner en contacto el organoide producido por las etapas (a) a (d) con un sujeto, para usar como un dispositivo auxiliar, como se conoce en la tecnica. Cualquier tipo de celula que pueda usarse para producir el andamio de biomatriz de esta invencion puede usarse en este metodo. En algunas modalidades, las celulas son celulas hepaticas.
La presente invencion proporciona adicionalmente un metodo para producir una protefna de interes en celulas cultivadas en un andamio de biomatriz; el metodo comprende: a) producir un andamio de biomatriz de acuerdo con los metodos de esta invencion; b) poner en contacto el andamio de biomatriz de (a) con medio de cultivo celular en un aparato de cultivo; c) sembrar el andamio de biomatriz de (b) con celulas que producen la protefna de interes; d) mantener las celulas de (c) en el andamio de biomatriz en condiciones de cultivo; y e) recolectar la protefna de interes producida por las celulas de (d), para producir de esta manera una protefna de interes en celulas cultivadas en un andamio de biomatriz. Este metodo puede comprender la etapa adicional de purificar la protefna de interes recolectada en la etapa (f). La protefna de interes de esta invencion puede ser cualquier protefna producida por una celula, ya sea a partir de un gen endogeno y/o como una protefna recombinante, en una cantidad que pueda recolectarse de las celulas en cultivo y/o el medio de cultivo. Numerosos ejemplos de tales protefnas de interes se conocen en la tecnica.
La presente invencion se explica con mas detalle en los siguientes ejemplos no limitantes.
Ejemplos
Ejemplo 1. La restriccion del linaje de celulas madre hepaticas humanas a los destinos maduros se hace eficiente mediante andamios de biomatriz con especificidad tisular.
Resumen. Los protocolos actuales para la diferenciacion de celulas madre hacen uso de multiples tratamientos de senales solubles y/o factores de la matriz y producen tfpicamente la diferenciacion parcial a celulas maduras con subexpresion o sobreexpresion de genes especfficos de tejidos adultos. En la presente invencion, se desarrollo una estrategia para la diferenciacion rapida y eficaz de celulas madre mediante el uso de sustratos de andamios de biomatriz, extractos especfficos de tejidos enriquecidos en matriz extracelular y factores de crecimiento y citocinas asociados, en combinacion con un medio hormonalmente definido y libre en suero (HDM) adaptado para el tipo de celulas adultas de interes. Los estudios descritos en la presente demuestran la eficacia de los andamios de biomatriz de esta invencion en la diferenciacion de celulas madre hepaticas humanas (hHpSC) a destinos maduros y en el mantenimiento de celulas parenquimatosas maduras como completamente funcionales durante largos perfodos de tiempo. Los andamios de biomatriz se prepararon por un novedoso protocolo de descelularizacion de cuatro etapas mediante el uso de condiciones disenadas para mantener insolubles a todos los tipos de colageno. Los andamios mantuvieron la histologfa nativa, vasculatura evidente y aproximadamente el 1 % de las protefnas tisulares, pero > 95 % de sus colagenos, la mayor parte de los componentes de la matriz asociados al colageno del tejido y los niveles fisiologicos de factores de crecimiento y citocinas unidos a la matriz. Los colagenos aumentaron de niveles casi indetectables a > 15 % de las protefnas del andamio con el resto que incluye lamininas, fibronectinas, elastina, nidogeno/entactina, proteoglicanos y citocinas y factores de crecimiento unidos a la matriz en patrones correlacionados con la histologfa. Las celulas madre hepaticas humanas (hHpSC), sembradas en los andamios de biomatriz hepatica y en un HDM adaptado para celulas hepaticas adultas, perdieron los marcadores de celulas madre y se diferenciaron a celulas parenquimatosas maduras y funcionales en aproximadamente una semana, permaneciendo viables y con fenotipos de celulas maduras estables para mas de ocho semanas. Por lo tanto, los andamios de biomatriz de esta invencion pueden usarse para estudios biologicos y farmaceuticos de celulas madre
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restringidas al linaje, para el mantenimiento de celulas maduras y para tejidos u organos modificados, vascularizados e implantables.
Procedimientos para la descelularizacion. Despues de la anestesia con ketamina y xilacina, se abrio la cavidad abdominal de la rata y se inserto un manguito con una canula en la vena porta para perfundir todo el hfgado. (1) La perfusion se realiza con RPMI 1640 durante 10 minutos; seguido de (2) deslipidacion con una lipasa (por ejemplo, 20-50 unidades de fosfolipasa A2--PLA2) combinada con un detergente suave tal como desoxicolato sodico al 1 % (SDC) durante aproximadamente 30-60 minutos hasta que el tejido se vuelve transparente y la efusion se vuelve clara; (3) la perfusion con lavados con alto contenido de sal (para hfgados fetales: 4,5 M de NaCl y para hfgados adultos 3,4 M-3,5 M de NaCl) se realiza hasta que el perfusado sea negativo para protefnas segun se determina por densidad optica (DO) a 280 nm; (4) perfusion con nucleasas (DNAasa, RNAasa) en RPMI 1640 hasta que el perfusado sea negativo para acidos nucleicos segun se determina por DO 260; y (5) enjuague final con RPMI 1640 durante 2 horas o mas.
Los andamios de biomatriz se congelan rapidamente en hielo seco y se preparan secciones congeladas con un criostato, se colocan en placas de cultivo celular de 24 pocillos, se esterilizan por irradiacion gamma (5000 rads) y se rehidratan en medio (KM) durante 30 minutos antes de sembrar las celulas. Las secciones de andamios de biomatriz cubrieron ~95 % de la superficie de los pocillos en la placa de 24 pocillos.
Un metodo alternativo para distribuir los andamios de biomatriz en las placas de cultivo consistio en pulverizarlo hasta obtener un polvo mediante el uso de un molino con congelacion lleno con nitrogeno lfquido. El polvo pulverizado, cuando se lleva a temperatura ambiente, adquiere la consistencia de una pintura, y con el puede recubrirse cualquier superficie, tal como placas, portaobjetos, tela, filtros u otras superficies utilizadas para unir celulas y/o cultivo de celulas. La pulverizacion de los andamios elimina los gradientes de los componentes y las senales de la matriz, pero la mezcla de componentes presentes todavfa produce potentes efectos de diferenciacion. Los andamios pueden usarse ademas intactos y volver a sembrarse con celulas en la preparacion de organos modificados para el trasplante in vivo o para cultivos 3-D.
Se desarrollaron metodos alternativos para usar con hfgados porcinos y bovinos. Los hfgados de cerdo y bovino se obtuvieron de una instalacion de procesamiento de carne certificada por el USDA (CT). Ver el Ejemplo 3 para un esquema de un protocolo representativo. Cada hfgado se inspecciono por USDA y recibio el sello USDA antes de salir de la instalacion. Los hfgados se transportaron en medio ESP-Gro (Gigacyte, Branford, CT, num. de catalogo 1101-250). Los hfgados recibidos en el laboratorio se pesaron, se fotografiaron y se prepararon para la perfusion. Despues de triturar, la mezcla se descongelo y se diluyo a una relacion de medio:biomatriz de 1:48. Esta suspension de biomatriz se uso despues para recubrir las placas. Despues de secar, la biomatriz se lavo tres veces y despues se aplicaron las celulas. Las celulas hepaticas adultas se unieron en 10 minutos a las placas. Las celulas madre/progenitores pueden tomar mas tiempo (unas pocas horas). Sin embargo, tanto para las celulas madre/progenitores como las celulas hepaticas adultas, esencialmente el 100 % de las celulas viables se adhieren.
Medios y soluciones. Todos los medios se filtraron de manera esteril (filtro de 0,22 pm) y se mantuvieron en la oscuridad a 4 °C antes de su uso. Para mantener los colagenos estables en la biomatriz, el pH del medio de perfusion para la preparacion de los andamios de biomatriz se mantuvo a 7,5 - 8,0. Se utilizo RPMI-1640 (Gibco/Invitrogen, Carlsbad, CA) como medio basal para la preparacion de los andamios de biomatriz y para los cultivos de hepatocitos o celulas madre hepaticas. Todos los reactivos excepto los indicados se obtuvieron de Sigma (St. Louis, MO).
Medios de perfusion para la preparacion de andamios de biomatriz.
(1) . Lavado por perfusion y enjuague por perfusion: medio basal libre de suero (por ejemplo, RPMI-1640);
(2) . Perfusion con detergente: 36 unidades/l de PLA2 mas 1 % de SDC;
(3) . Perfusion con alto contenido de sal: NaCl 3,4 M con inhibidor de tripsina de soja a 0,1 mg/ml;
(4) . Perfusion con nucleasas: RNAasa a 5 mg/100 ml, DNAasa a 1 mg/100 ml e inhibidor de la tripsina de soja a 0,1 mg/ml (por ejemplo, preparado en RPMI 1640).
Medio de Kubota. El KM se diseno originalmente para hepatoblastos47 y ahora se ha encontrado que es eficaz para los progenitores hepaticos humanos48 y para otros progenitores endodermicos, que incluyen los del arbol biliar (Wang y otros, "Multipotent stem/progenitor cells in human biliary tree give rise to hepatocytes, cholangiocytes and pancreatic islets" Hepatology, 2011, en prensa) y pancreas (Wang, Y y Reid L, datos no publicados). Consiste en cualquier medio basal (en este caso RPMi 1640) sin cobre, bajo contenido de calcio (0,3 mM), selenio 10-9 M, BSA al 0,1 %, nicotinamida 4,5 mM, sulfato de zinc heptahidrato 0,1 nM (de Specpure, Johnson Matthew Chemicals, Royston, Inglaterra), hidrocortisona 10-8 M, transferrina/Fe 5 pg/ml, insulina 5 pg/ml, lipoprotefna de alta densidad a 10 pg/ml y una mezcla de acidos grasos libres que se anaden unidos a la albumina serica humana purificada.
Para diferenciar las celulas a un destino adulto, puede utilizarse un medio hormonalmente definido, libre de suero (HDM) adaptado al tipo deseado de celulas adultas. Por ejemplo, se utilizo un HDM para el destino hepatico adulto que consistfa en KM suplementado adicionalmente con calcio para alcanzar una concentracion de 0,6 mM, cobre 10' 12 M, triyodotironina (t3) 1 nM, glucagon 7 ng/ml, FGF 20 ng/ml, galactosa 2 g/l, oncostatina M (OSM) 10 ng/ml,
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factor de crecimiento epidermico (EGF) 10 ng/ml, factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) 20 ng/ml e hidrocortisona 10-8 M.
Las celulas se sembraron en este HDM libre de suero en caso de sembrarse en los andamios; en circunstancias en las que se usaron enzimas para procesar las celulas o los tejidos, entonces el HDM se suplemento con FBS al 5 % (HyClone, Waltham, MA) durante unas pocas horas y despues se cambio a HDM libre de suero a continuacion. En paralelo, los experimentos de control, los cultivos se mantuvieron en el HDM con 5 % de FBS en todo el estudio, pero se encontro que la presencia de suero provoco que las celulas perdieran funciones diferenciadas con el tiempo. Las necesidades de factores solubles son menores que las normales para los cultivos en otros sustratos porque muchos de los factores estan unidos a los andamios de biomatriz. Las necesidades de factores solubles son menores que las normales para los cultivos en otros sustratos porque muchos de los factores estan unidos a los andamios de biomatriz.
Caracterizacion de arboles vasculares intactos en los andamios de biomatriz hepatica. Los restos en la matriz de la ramificacion y derivacion de la vasculatura que incluyen la red de capilares en el andamio de biomatriz hepatica de rata se han visualizado por microscopfa optica y de fluorescencia, respectivamente. Se inyectaron partfculas de dextrano de 250 kDa marcadas con rodamina en el andamio de biomatriz hepatica a traves del resto de la vena porta para comprobar la integridad de los restos del sistema vascular en la matriz en los andamios de biomatriz. Se preparo una pelfcula mediante el uso de un microscopio de diseccion de fluorescencia Leica MZ16FA (motorizado). Procesamiento de hfgado fetal humano. Los tejidos hepaticos fetales se proporcionaron por una agencia acreditada (Advanced Biological Resources, San Francisco, CA) de fetos entre 16-20 semanas de edad gestacional obtenidos por interrupciones electivas del embarazo. El protocolo de investigacion se reviso y aprobo por la Junta de Revision Institucional para Estudios de Investigacion en Humanos en la Universidad de Carolina del Norte en Chapel Hill. Se prepararon suspensiones de celulas hepaticas humanas fetales como se describio anteriormente48,49 Brevemente, el procesamiento se llevo a cabo en RPMI 1640 suplementado con albumina de suero bovino al 0,1 %, selenio 1 nM y antibioticos. El tampon de procesamiento enzimatico contenfa colagenasa tipo IV a 300 U/ml y desoxirribonucleasa a 0,3 mg/ml a 32 °C con agitacion frecuente durante 15-20 min. Las suspensiones enriquecidas se presionaron a traves de una malla de calibre 75 y se centrifugaron a 1200 RPM durante 5 minutos antes de la resuspension. La viabilidad celular estimada por exclusion de azul de tripan fue habitualmente superior al 95 %.
Enriquecimiento de hHpSC y cultivo en andamios de biomatriz. Se usaron dos metodos para la purificacion o enriquecimiento de hHpSC:
1) Seleccion de cultivos. Se sembraron aproximadamente 3 x 105 celulas en una placa de cultivo de tejidos de 10 cm y en KM. El medio se cambio cada 3 dfas. Las colonias se formaron en cuestion de 5-7 dfas y se observaron durante y hasta 3 meses. Las colonias Se recolectaron manualmente despues de 14-18 dfas mediante el uso de un microscopio invertido (1X-FLAIII, Olympus, Japon y Melville, NY).
2) La inmunoseleccion magnetica de subpoblaciones de progenitores hepaticos multipotentes (hHpSC y hHB) se logro mediante la seleccion de celulas positivas para la molecula de adhesion de celulas epiteliales (EpCAM, CD326) mediante el uso de tecnologfas de inmunoseleccion por perlas magneticas con el sistema MACS de Miltenyi Biotech (Bergisch Gladbach, Alemania) segun las instrucciones del fabricante50. En resumen, las celulas disociadas se incubaron con anticuerpo para EpCAM unido a microperlas magneticas durante 30 min a 4 °C, y se separaron mediante el uso de un sistema de separacion en columna magnetica de Miltenyi segun los procedimientos recomendados por el fabricante.
Los cultivos se sembraron con 250 colonias de hHpSC, o 5 x 105 hHpSC enriquecidas o 2,5 x 105 hepatocitos adultos primarios. El medio se reemplazo diariamente y el medio recolectado se almaceno a -20 °C para un analisis posterior. Las celulas cultivadas en placas de 24 pocillos recubiertas con Colageno tipo I sirvieron como control.
Aislamiento de hepatocitos adultos de rata. Las suspensiones recien aisladas de hepatocitos de rata se obtuvieron a partir de ratas Lewis macho adultas de 3 meses de edad (Charles River Laboratories, Wilmington, MA) que pesaban de 200 a 250 g. Se utilizo un metodo mejorado de perfusion en dos etapas como se describio anteriormente49 para el aislamiento y la purificacion de los hepatocitos de rata. El hfgado se perfundio durante 10-15 minutos con un tampon libre de calcio que contenfa EGTA y despues colagenasa en un tampon que contenfa calcio durante 10-15 minutos. Despues el hfgado se disocio mecanicamente presionando el hfgado digerido a traves de una tela de queso y despues se filtro secuencialmente la suspension celular a traves de tamices con tamano de la malla cada vez menores. Las celulas se lavaron dos veces y despues se sedimentaron a 50 g. La viabilidad se definio mediante el conteo de las celulas despues de la tincion con azul de tripan. Rutinariamente, se aislaron 200-300 millones de celulas por rata con una viabilidad del 89-96 % y una pureza > 99 %.
Aislamiento y cultivo de celulas hepaticas humanas adultas. Las suspensiones de celulas hepaticas humanas frescas se obtuvieron de CellzDirect. (ahora una parte de Invitrogen, RTP, NC). Las suspensiones se procesaron mediante metodos de CellzDirect y despues se resuspendieron en medio HeptoMAIN (num. de catalogo 1103-250; GigaCyte, Branford, CT), se sembraron a 1,88 x 105 celulas/cm2 en placas de multiples pocillos recubiertas con andamios de biomatriz hepatica o sobre colageno tipo I (1 pg/ml, Meridian num. de catalogo A33704H).
Analisis qufmico del colageno. La cantidad de colageno en los andamios de biomatriz se evaluo en base al
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contenido de hidroxiprolina (hyp). Las muestras de hfgados enteros y de andamios de biomatriz se pulverizaron, lavaron y liofilizaron. Las alfcuotas se hidrolizaron despues y se sometieron a analisis de aminoacidos51, y el contenido de colageno por protefna total se estimo sobre la base del valor de hyp de 300 residuos/colageno.
Analisis cuantitativo del contenido de ADN y ARN. Para evaluar el ADN total que permanecfa en la biomatriz hepatica descelularizada, tanto el tejido hepatico fresco de rata como la biomatriz descelularizada se pesaron, cortaron y digirieron con proteinasa K y se aislo el ADN celular total52. Para evaluar el ARN total que permanecfa en la biomatriz hepatica descelularizada, tanto el tejido hepatico fresco de rata como la biomatriz hepatica descelularizada de rata se pesaron y despues se homogeneizaron en solucion de TRIzol (Invitrogen), y se aislo el ARN celular total.
Ensayos de factores de crecimiento. Las muestras de hfgados de rata, andamios de biomatriz hepatica de rata, tejido del conducto biliar humano y andamios de biomatriz de conducto biliar humano (dos muestras de cada uno) se enviaron a RayBiotech, Inc (Norcross, Georgia) para el analisis de los factores de crecimiento. Las muestras se homogeneizaron, se prepararon como lisados y despues se sometieron a ensayo con 1 mg/ml de protefna, que produce fluorescencia, definida en unidades de intensidad fluorescente (FIU). Los ensayos semicuantitativos de factores de crecimiento se realizaron mediante el uso de las Matrices para Factores de Crecimiento Humanos RayBio®, Serie G 1. Las FIU se redujeron con respecto a la de los controles negativos en cuanto a la union no especffica y se normalizaron con respecto a la concentracion de protefnas. Los datos de los duplicados se promediaron. Se utilizaron cuatro matrices que permitieron el estudio de ~40 factores de crecimiento. Aunque el ensayo se desarrollo para factores de crecimiento humanos, hay suficiente solapamiento en reaccion cruzada con los factores de crecimiento de rata para permitir el uso tanto de muestras de rata como humanas.
Microscopfa electronica de transmision y barrido (TEM y SEM). Para TEM, los andamios de biomatriz se enjuagaron con solucion salina tamponada con fosfato (PBS) y se fijaron en glutaraldehfdo al 3 %/cacodilato sodico 0,1, pH 7,4 durante la noche. Despues de tres enjuagues con tampon de cacodilato sodico, los andamios de biomatriz se fijaron posteriormente durante 1 hora en tampon de tetroxido de osmio al 1 %/cacodilato sodico 0,1. Despues de enjuagar en agua desionizada, se deshidrato y se embebio en resina epoxica Polybed 812 (Polysciences, Niles, IL). Los andamios de biomatriz se cortaron perpendicular al sustrato a 70 nm mediante el uso de una cuchilla de diamante. Las secciones ultrafinas se recogieron en rejillas de cobre con malla 200 y se tineron con acetato de uranilo acuoso al 4 % durante 15 minutos, seguido por citrato de plomo de Reynolds durante 7 minutos. Las muestras se visualizaron mediante el uso de un microscopio electronico de transmision LEO EM910 que funciona a 80 kV (LEO Electron Microscopy, Oberkochen, Alemania). Las imagenes digitales se adquirieron mediante el uso de una camara digital CCD SC1000 Orius de Gatan y Digital Micrograph 3.11.0 (Gatan, Pleasanton, CA).
Para SEM, despues de la fijacion y los enjuagues, los andamios de biomatriz se deshidrataron y se transfirieron en etanol al 100 % al secador de punto crftico CPD -020 Balzers (Bal-Tec AG, Balzers, Suiza) y se secaron mediante el uso de dioxido de carbono como disolvente de transicion. La matriz se monto sobre soportes de muestra de aluminio con lenguetas adhesivas de carbono y se recubrio con un espesor de 10 nm de metal oro-paladio (aleacion 60:40) mediante el uso de un recubridor por pulverizacion Hummer X (Anatech, Worcester MA). Las muestras se examinaron mediante el uso de un Zeiss Supra 55 FESEM a un voltaje de aceleracion de 5 kV y se adquirieron imagenes digitales mediante el uso del programa informatico SmartSEM de Zeiss (Carl Zeiss SMT, Alemania y Thornwood, NY).
Inmunocitoqufmica e inmunohistologfa. Para la tincion fluorescente de las celulas cultivadas en los andamios de biomatriz, las celulas se fijaron con paraformaldehfdo al 4 % (PFA) durante 20 minutos a temperatura ambiente, se enjuagaron con HBSS, se bloquearon con suero de cabra al 10 % en HBSS durante 2 h y se enjuagaron. Las celulas fijadas se incubaron con anticuerpos primarios a 4 °C durante la noche, se lavaron, se incubaron durante 1 h con anticuerpos secundarios especfficos del isotipo y marcados, se lavaron, se contratineron con 4',6-diamidino-2- fenilindol (DAPI) para visualizar los nucleos celulares y se observaron mediante el uso de un microscopio invertido Leica DMIRB (Leica, Houston, TX).
Para la inmunohistoqufmica, los andamios de biomatriz se fijaron en PFA al 4 % durante la noche y se almacenaron en etanol al 70 %. Se embebieron en parafina y se cortaron en secciones de 5 pm. Las secciones se desparafinaron, y los antfgenos se recuperaron. Las peroxidasas endogenas se bloquearon mediante incubacion durante 30 minutos en una solucion de H2O2 al 0,3 %. Despues de bloquear con suero de caballo al 10 %, se aplico el anticuerpo primario a 4 °C durante la noche; el anticuerpo secundario y la tincion ABC se realizaron mediante el uso del kit rTu Vectastain (Vector Laboratories, Burlingame, CA). El vector Nova RED se uso como sustrato. Las secciones se deshidrataron, fijaron y embebieron en medio de montaje Eukitt (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA), y se analizaron mediante el uso de un microscopio invertido. Los anticuerpos utilizados para las secciones de hfgado y para los cultivos se enumeran en la Tabla 4.
Analisis de la reaccion en cadena de la polimerasa con transcripcion inversa (RT-PCR). Las hHpSC se cultivaron en placas de cultivo celular, y las colonias se transfirieron sobre un andamio de biomatriz. Despues de otro cultivo durante 7 dfas, las colonias se lisaron para RT-PCR. El ARN total se extrajo mediante el uso de un Mini kit RNeasy Plus (Qiagen GmbH, Valencia, CA) segun las instrucciones del fabricante. La transcripcion inversa se llevo a cabo
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con el sistema de sfntesis de primera cadena Superscript para RT-PCR (Invitrogen, Carlsbad, CA). Se utilizo el Kit Master Mix HotStarTaq (Qiagen) para la PCR. Los cebadores de PCR se enumeran en la Tabla 5.
Ensayo LIVE/DEAD y ensayo de viabilidad celular. Se utilizo un kit para el ensayo de viabilidad LIVE/DEAD (Molecular Probes/Invitrogen, Carlsbad, CA) para los ensayos de adhesion y proliferacion. Las hHpSC o los hepatocitos se incubaron con dos sondas, calcefna-AM (Live, gris claro) y homodfmero-1 de etidio (EtdD-1, Dead), para la actividad de esterasa intracelular y la integridad de la membrana plasmatica, respectivamente. Los especfmenes se observaron bajo un estereoscopio de fluorescencia Olympus SZX12 (OLYMPUS, Japon y Melville, NY). Se utilizo un kit para el ensayo de viabilidad celular de resazurina (Biotium, Hayward, CA) segun el manual del fabricante. Brevemente, se anadio 10 % de solucion de resazurina al medio de cultivo y se incubo a 37 °C durante la noche. La absorbancia DO570-DO600 se obtuvo mediante el uso de un lector de microplacas con deteccion multiple Biotek Synergy HT (Winooski, VT) y se obtuvo la curva de viabilidad. Todos los experimentos se realizaron tres veces mediante el uso de un mfnimo de tres muestras por condicion experimental.
Ensayos funcionales especfficos hepaticos. La actividad de CYP450 3A4 se detecto mediante el uso de un sistema de tamizaje P450-GloTM™ (Promega, Madison, WI). Brevemente, las celulas cultivadas se incubaron con medio que contenfa el sustrato luminogenico CYP3A4, luciferina-PPXE para CYP, durante 4 horas a 37 °C. La deteccion y analisis de luciferina se realizo segun las instrucciones del fabricante con un contador Wallace Victor2 Multilabel (ahora parte de Perkins/Elmer en Waltham, MA). La cuantificacion de la secrecion de albumina se realizo mediante el uso de un kit de cuantificacion de ELISA para albumina humana (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX). Para los ensayos de sfntesis de urea, las celulas se incubaron con amonio 2 mM durante 24 horas y el sobrenadante se recogio y se ensayo con el kit de ensayo para urea Quantichrom (Bioessay Systems, Hayward, CA). El sobrenadante de una muestra para cada condicion de cultivo se ensayo por triplicado y el experimento se repitio 3 veces.
Analisis estadfstico. Los experimentos se repitieron al menos 2-3 veces con muestras duplicadas o triplicadas para cada condicion. Se presentan datos de experimentos representativos, mientras que se observaron tendencias similares en los multiples ensayos. Todas las barras de error representan la S.E.M.
Los andamios de biomatriz se preparan con un novedoso protocolo de cuatro etapas. Los andamios de biomatriz se prepararon mediante el uso de un protocolo que comprende deslipidacion seguida por extracciones con alto contenido de sal y mediante el uso de metodos de perfusion (Figura 1). Una presentacion detallada del protocolo se proporciona en los metodos. Esto se logra mediante un novedoso protocolo de cuatro etapas: 1) deslipidacion suave; 2) lavados con tampones con concentraciones de sal de aproximadamente 2,0 M a aproximadamente 5,0 M (por ejemplo, 2,0 M - 2,5 M, 2,6 M - 3,0 M, 3,1 M - 3,5 M, 3,6 M - 4,0 M, 4,1 M - 4,5 M, 4,6 M - 5,0 M), concentraciones de sal que se conoce que mantienen los colagenos en un estado insoluble23 (la concentracion exacta y el pH de los tampones esta dictada por los tipos de colageno en el tejido), concentraciones que se conoce que mantienen los colagenos en un estado insoluble23; 3) tratamiento con nucleasa para eliminar acidos nucleicos residuales; y 4) enjuagues con un medio basal para eliminar los residuos de detergente, sales y nucleasas, asf como para equilibrar los componentes de la matriz con el medio (Figura 1A).
Las elecciones de los medios de enjuague o de los tampones para las nucleasas pueden ser cualquiera de un numero de opciones siempre y cuando la concentracion de sal y la fuerza ionica sean tales que mantengan los componentes de la matriz en un estado insoluble. En la eleccion del metodo de deslipidacion es fundamental que sea eficaz y sin embargo suave. Se selecciono una combinacion de desoxicolato sodico (SDC) y Fosfolipasa A2 (PLA2) para degradar rapidamente el fosfoglicerido ubicado en la membrana citoplasmatica y la membrana mitocondrial a lisolecitina, un potente tensoactivo, que puede inducir necrosis y citolisis. La formula reactiva se muestra en la Figura 8. Evitamos los detergentes duros, tales como el dodecilsulfato sodico (SDS) o el Triton-X 100, que podrfan disolver algunos componentes de la matriz como los glicosaminoglicanos (Ver la resena de Gilbert y otros, "Decellularization of tissues and organs" Biomaterials 27:3675-3683 (2006)).
Evitamos una exposicion prolongada de los andamios a las enzimas de las celulas lisadas durante la deslipidacion y los lavados con alto contenido de sal, porque pueden disminuir en gran medida el contenido de elastina y el contenido de glicosaminoglicanos (GAG) tales como sulfatos de heparan (HS), sulfatos de condroitina (CS), sulfatos de dermatan (DS) y heparinas (HP), que son sitios en los que se unen las citocinas y los factores de crecimiento24. Se utilizo un inhibidor de la tripsina de soja y un control cuidadoso del pH (7,5 - 8,0), la temperatura (20 °C) y el tiempo (30-60 min) para limitar la actividad de las proteasas derivadas de las celulas lisadas.
Se perfundio todo el tejido a traves de la vasculatura relevante (por ejemplo, la vena porta en el hfgado), lo que permitio aislar rapidamente (en pocas horas) un andamio de biomatriz con perdida minima de los componentes de la matriz. La rapidez del aislamiento se debe a la etapa inicial con detergente que deslipida el tejido en aproximadamente 30-60 minutos (no horas o dfas como en los protocolos utilizados por otros). Los andamios de biomatriz resultantes son traslucidos o blancos (Figura 1). Ademas, mediante el uso de este metodo de perfusion, se mantuvieron los canales de la vasculatura primaria, vena porta y hepatica y la mayor parte de las ramas vasculares en el hfgado, lo que aumento la eficacia de la descelularizacion. Las partfculas fluorescentes de dextrano marcadas con rodamina, perfundidas a traves de los andamios de biomatriz permanecieron dentro de los restos de la
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vasculatura lo que demuestra su presencia (Figura 1E). Existe un flujo progresivo del colorante desde los vasos grandes a las ramas finas de los vasos sangumeos a lo largo de los canales sin fugas. Este hecho sera util en la revascularizacion de los andamios como un medio para preparar los tejidos modificados para el cultivo tridimensional y/o para la implantacion ex vivo.
Cuando se cortan, los andamios retienen la estructura histologica del tejido original, que incluye los restos reconocibles de las entidades histologicas principales tales como los vasos sangumeos, los conductos biliares y la capsula de Glisson (GC) (Figura 1). Comparar las Figuras 1B1 y 1D1, en donde una seccion del tejido hepatico se contrasta con la de un andamio de biomatriz. Los restos de matriz de la muralia de celulas parenquimatosas consistieron en una red tipo encaje (Figuras 1D2-1D3).
El colageno, las protemas asociadas al colageno y las citocinas unidas se mantienen en los andamios de biomatriz. La cantidad de colageno en los andamios de biomatriz se evaluo mediante el analisis de aminoacidos por metodos utilizados previamente25. Dado que la hidroxiprolina (Hyp) es unica para los colagenos y las protemas colagenas, la composicion de colageno en relacion con la protema total se expreso como residuos de Hyp por cada 1000 aminoacidos. Los resultados demostraron que el contenido de colageno aumento desde niveles casi indetectables, es decir, menos de 0,2 residuos de hidroxiprolina (Hyp)/1000 en el tngado, a ~ 13 residuos de Hyp/1000 en los andamios de biomatriz. Esto indica que la deslipidacion y los lavados con alto contenido de sal, descritos anteriormente, no eliminaron los colagenos, dejando casi todos los colagenos en los andamios de biomatriz. La deteccion de niveles significativos de hidroxilisina (Hyl), otro aminoacido asociado al colageno y niveles mas altos de glicina (Gly) en los andamios de biomatriz apoya nuestra conclusion de que el colageno se enriquece marcadamente en los andamios de biomatriz (Figuras 2A, 9 y Tabla 2).
Mediante los estudios inmunohistoqmmicos y ultraestructurales, pudimos identificar en los andamios todas las formas conocidas de los colagenos encontrados en el tngado in situ, que incluyen colagenos fibrilares (colageno tipo I, III y V, 10-30 nm de diametro para las fibrillas y 500-3000 nm para fibras ensambladas) y filamentos en cuentas (posiblemente tipo VI). Esas fibras y filamentos estan presentes en la capa de tejido conectivo subcapsular situada debajo de la capa mesotelial. Aunque las estructuras tfpicas de las membranas basales no se encontraron a lo largo de los sinusoides desde las tnadas portales a las venas centrales, encontramos que el colageno tipo IV y algunas pequenas fibrillas unidas forman estructuras reticulares tridimensionales porosas, semejantes a redes, que sirven de andamio para las celulas parenquimatosas (Figura 2). Los haces de colageno tipo I pueden observarse como la estructura principal de los andamios a los que se unen otros tipos de colageno, glicoprotemas y proteoglicanos. En el espacio de Disse encontramos pequenos haces de colageno tipo I y fibras de colageno tipo III y VI asf como algun tipo V, el cual es mas abundante cerca de las tnadas portales y venas centrales. Los datos representativos de inmunohistoqmmica se presentan en la Figura 3B, y un resumen de los componentes de la matriz y su ubicacion en el tejido hepatico normal frente a los de los andamios de biomatriz se enumeran en la Figura 4d. Los primeros estudios en el desarrollo de los protocolos para la preparacion de andamios de biomatriz indicaron que la mayor parte de los componentes del citoesqueleto se pierden en los lavados. Sin embargo, evaluamos los andamios mediante inmunohistoqmmica y no encontramos evidencia de tubulina, desmina o actina, cantidades traza de citoqueratinas 18 y 19, y bajos niveles de vimentina dispersos a lo largo de los andamios.
La matriz asociada con los conductos biliares y las porciones de los sistemas vasculares hepaticos (vasos arteriales y venosos) consiste en estructuras tfpicas de la membrana basal y por lo tanto es bastante distintiva de las capas delgadas de la matriz asociada con las estructuras vasculares encontradas en los sinusoides. En la tnada portal se encuentra laminina, entactina/nidogeno, perlecan y colageno tipo IV, mientras que en el Espacio de Disse solo se encuentra perlecan y algo de colageno tipo IV. Estan presentes cantidades enormes de elastina ondulada e hidrofoba; esta se reticula y forma laminas y fibras restringidas principalmente al tejido conectivo subcapsular, regiones portales y paredes arteriales. Las fibronectinas son ubicuas y prevalecen en toda la matriz hepatica y son especialmente abundantes en el espacio de Disse, donde forman filamentos finos o depositos granulares (Figuras 2 y 3).
La inmunohistoqmmica indica que los proteoglicanos conocidos en el tejido se conservan en los andamios de biomatriz (Figuras 3B, 4D). Entre los proteoglicanos heterogeneos identificados, el sindecano se encontro intercalado y de manera continua a lo largo de los sinusoides, y el perlecan es mas puntual en el espacio de Disse. Las formas de HS-PG y CS-PG se encuentran a lo largo de los restos de los sinusoides en los andamios de biomatriz y en patrones que se correlacionan con la zonacion conocida del tejido hepatico.
Los proteoglicanos y otros componentes de la matriz son depositos importantes de citocinas y factores de crecimiento que se unen estrechamente a sus GAG26. La mayona de los factores de crecimiento y las hormonas se encuentran en los andamios de biomatriz en concentraciones cercanas a las encontradas en el tejido original. En la Tabla 6 se proporcionan los datos de los lisados de hngados de rata frente a los andamios de biomatriz hepatica de rata, y en la Tabla 3, se proporcionan datos paralelos de tejido de conducto biliar humano frente a andamios de biomatriz de conducto biliar. Curiosamente, hubo algunos ejemplos (por ejemplo, bFGF) con un fuerte enriquecimiento en los andamios de biomatriz hepatica sobre el que se encontro en los lisados hepaticos. Los factores de crecimiento y las citocinas unidas tienen diferencias cualitativas y cuantitativas entre los andamios de tejido hepatico con respecto a los de conducto biliar, lo que implica especificidad tisular o especificidad de especie. Alternativamente, puede deberse, en parte, al hecho de que los andamios de conductos biliares se prepararon, por
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necesidad, mediante agitacion del tejido en los tampones sobre un balancfn y no mediante perfusion a traves de la vasculatura.
La qufmica de los andamios de biomatriz se correlaciona con la histologfa. Una caracterfstica importante de este nuevo protocolo es la retencion de la qufmica de la matriz en los patrones que se correlacionan con las zonas acinares hepaticas 1-3 de la trfada portal a la vena central y con entidades histologicas como los canales vasculares y la Capsula de Glisson (GC) como se muestra en las Figuras 4A-C. La qufmica de la matriz periportalmente en la zona 1 es similar a la encontrada en los hfgados fetales y consiste, en parte, en colageno tipo III, laminina y formas de CS-PG. Esta transita a una qufmica diferente de la matriz en las zonas medio acinar (zona 2) y pericentral (zona
3) que termina con una matriz muy estable con altos niveles de colageno tipo IV y HP-PG27.
Se sabe que una gran variedad de protefnas (por ejemplo, factores de crecimiento y hormonas, protefnas de coagulacion, diversas enzimas) se unen a la matriz y se mantienen establemente mediante la union a los patrones de sulfatacion discretos y especfficos en los GAG u otros componentes de la matriz24. Por lo tanto, la qufmica de la matriz transita desde su punto de inicio en el nicho de celulas madre que tiene una qufmica de matriz labil asociada con alta tasa de recambio y minima sulfatacion a una qufmica de matriz estable y que tiene cantidades crecientes de sulfatacion con progresion hacia la zona pericentral. Esperamos que el mantenimiento de la arquitectura natural y la qufmica de la matriz en correlacion con la histologfa facilitara la recelularizacion en los procesos de ingenierfa tisular al dirigir a las celulas a sitios especfficos en los andamios de biomatriz y/o proporcionar la mezcla adecuada de senales para conducir a la expansion y/o diferenciacion a celulas maduras.
El andamio de biomatriz puede prepararse a partir de diferentes tejidos y especies. Los andamios de biomatriz pueden prepararse facilmente a partir de cualquier tejido, normal o patologico y de cualquier especie. En las Figuras 13-16 se muestran andamios de biomatriz de pancreas, arbol biliar y duodeno humanos y de pancreas de rata y porcino. En las Figuras 5-7 y la Figura 12 se muestran efectos de andamios de biomatriz hepatica de bovino o de rata sobre las celulas hepaticas. Ademas, los andamios de biomatriz se han preparado a partir de aorta abdominal, vena ilfaca humanas y a partir de intestino de rata y cerdo. Los estudios histologicos, ultraestructurales e inmunohistoqufmicos en los andamios de biomatriz indican una marcada especificidad tisular, pero no especificidad de especie, en su estructura, composicion qufmica y funciones.
Los andamios de biomatriz indujeron y/o mantuvieron la diferenciacion de las celulas. La siembra de hHpSC en placas con secciones de andamios de biomatriz hepatica y en HDM adaptado para celulas hepaticas adultas dio como resultado que esencialmente el 100 % de las celulas viables se unieron en unas pocas horas a los andamios de biomatriz; ya sea intactos o despues de una pulverizacion criogenica. Las colonias de celulas que inicialmente se formaron en las secciones de los andamios retuvieron parte de su fenotipo de celulas madre, ya que las celulas en el centro de las colonias eran capaces de resistir la tincion con colorantes (Figura 11) y expresaron marcadores clasicos de progenitores hepaticos, tales como el receptor 4 de quimiocinas (motivo C-X-C) (CXCR4) y la molecula de adhesion de celulas epiteliales (EpCAM) (Figura 5). Se dividieron una o dos veces y despues transitaron a detencion del ciclo celular y morfologfas similares a un cordon tridimensional (3-D), tfpicas de cultivos de celulas parenquimatosas maduras (Figuras 5 y 6 para la diferenciacion de celulas madre; comparar con la Figura 7 y la Figura 12). El HDM utilizado no requirio todas las citocinas o factores de crecimiento habituales, ya que estos estan presentes unidos a los andamios de biomatriz. La transicion a la detencion del crecimiento se correlaciono con la tincion en todas las colonias con colorantes de viabilidad (Figura 12), con perdida de la expresion de EpCAM y CXCR4 y con un aumento constante en la expresion de genes hepatocfticos y colangiocfticos especfficos de adultos tal como la urea y el citocromo P450 3A4. (Figura 5).
Los hepatocitos normales adultos humanos y adultos de rata se sembraron sobre andamios de colageno tipo I o de biomatriz hepatica a partir de hfgado de rata o de bovino y en HDM para celulas adultas. Las celulas parenquimatosas adultas fueron capaces de fijarse a los andamios en 10 minutos (incluso en medio libre de suero) frente a horas en el colageno tipo I, permanecieron en detencion del crecimiento a partir del punto de union; y se mantuvieron viables y totalmente funcionales durante mas de 8 semanas en los andamios frente a solo aproximadamente ~2 semanas en el colageno tipo I. (Figuras 7 y 12). Los niveles de funciones de las celulas hepaticas maduras en los andamios de biomatriz durante semanas resultaron ser los mismos o similares a los hallados en otros de hepatocitos adultos recien aislados28. Las diferencias drasticas son que los cultivos sobre colageno tipo I se deterioran rapidamente despues de 2 semanas, mientras que los de los andamios de biomatriz permanecen estables morfologica y funcionalmente mientras se mantengan los cultivos (hasta ahora ~8 semanas).
Los andamios de biomatriz contienen la mayor parte de los componentes de la matriz extracelular del tejido y las citocinas y factores de crecimiento unidos a la matriz que proporcionan un conjunto compuesto de senales qufmicas que pueden usarse como un andamio insoluble y estable con una extraordinaria capacidad para inducir hHpSC a destinos hepaticos adultos, asf como mantener las celulas adultas completamente diferenciadas durante semanas. Al comparar los tipos existentes de extractos de matriz preparados por los investigadores con los de andamios de biomatriz de la presente invencion, esta claro que los tratamientos ffsicos, enzimaticos y qufmicos tienen efectos sustanciales sobre la composicion, el comportamiento mecanico y las respuestas del huesped a los andamios biologicos derivados de la descelularizacion de tejidos y organos nativos, y en consecuencia, tienen implicaciones importantes para sus aplicaciones in vitro e in vivo. Todos los otros metodos existentes para la preparacion de
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sustratos o andamios dan como resultado la eliminacion de una gran parte de los componentes de la matriz ya sea mediante el uso de enzimas degradantes de la matriz16 o mediante el uso de tampones que disuelven las porciones principales de la matriz11. Los metodos ffsicos (por ejemplo, congelacion rapida y agitacion) pueden utilizarse para preparar extractos de matriz a partir de tejidos con una estructura estratificada tal como la dermis (por ejemplo, SIS, BSM)29, pero no son utiles para organos con estructuras tisulares complejas como el hfgado. Por el contrario, nuestro metodo para obtener andamios de biomatriz dio como resultado la perdida de la mayorfa de las protefnas celulares pero conservo esencialmente todos o al menos la mayorfa de los colagenos y los componentes asociados al colageno, que incluyen citocinas, hormonas y factores de crecimiento unidos a la matriz.
La matriz extracelular esta embebida en una bicapa lipfdica en mosaico, que incluso en el organismo mas simple es un ambiente complejo, heterogeneo y dinamico. El metodo de deslipidacion es una faceta crftica del protocolo. Los metodos utilizados comunmente para la descelularizacion de tejidos implican detergentes ionicos tales como SDC y dodecilsulfato sodico (SDS). El SDC es relativamente mas suave que el SDS, tiende a provocar menos alteracion a la arquitectura tisular nativa y es menos eficaz para solubilizar las membranas celulares tanto citoplasmaticas como nucleares30. No existen informes de descelularizacion tisular con el uso de SDC solo. Muchos estudios han utilizado detergentes no ionicos duros (por ejemplo, Triton X-100)31 o detergentes zwitterionicos (por ejemplo, 3-(3- colamidopropil)dimetilamonio]-1-propanosulfonato, CHAPS)32. Por el contrario, nuestro metodo donde se utiliza una combinacion de SDC y PLA2 logra la deslipidacion del tejido rapida y suavemente.
Al menos veintinueve tipos de colagenos (I-XXIX) se han identificado hasta ahora en vertebrados, donde tienen papeles funcionales en la adhesion celular, diferenciacion, crecimiento, desarrollo tisular e integridad estructural33,34. Se conoce que los principales componentes estructurales en la matriz, los colagenos, permanecen insolubles en altas concentraciones de sal y a pH neutro35,36, un hallazgo que es la base de nuestra estrategia en la preparacion de andamios de biomatriz. La estrategia tiene las ventajas anadidas de que los colagenos permiten la preservacion de los componentes de la matriz unidos a ellos, tales como lamininas y fibronectinas (FN), proteoglicanos ricos en leucina (PG) y GAG que a su vez preservan las citocinas, factores de crecimiento o receptores de la superficie celular que estan unidos a ellos.
Los andamios de biomatriz son unicos en su gran capacidad para inducir una diferenciacion rapida y consistente de las celulas madre/progenitoras tales como hHpSC a destinos adultos y para mantener aquellas celulas restringidas a un linaje y para mantener aquellas celulas restringidas a un linaje o tambien para mantener celulas adultas sembradas en los andamios, como celulas viables y plenamente funcionales durante muchas semanas (> 8 semanas).
La diferenciacion de las celulas madre, tales como celulas madre embrionarias (ES), celulas madre pluripotentes inducidas (iPS) o diversas formas de celulas madre mesenquimales (MSC) a tipos de celulas hepaticas completamente maduras, requiere multiples conjuntos de senales presentes (solubles y en la matriz) en etapas, con induccion por un conjunto de cebado necesario para responder a un conjunto diferente, y puede necesitar muchas semanas, hasta 6 semanas de cultivo, para generar celulas que tienen el destino hepatico adulto37. Ademas, la restriccion del linaje de las MSC a los destinos hepaticos produce resultados inconsistentes con celulas adultas que tienen fenotipos mezclados de hepatocitos y MSC. La diferenciacion de las celulas ES, celulas iPS y MSC da como resultado celulas similares a hepatocitos que expresan algunos, pero nunca todos, los principales genes especfficos del hfgado; con variabilidad en cuales son los genes se observan; y los niveles de protefna para los genes hepaticos expresados son generalmente bajos40 o altos para un gen hepatico e insignificantes para otros41,42 Por el contrario, la diferenciacion de las hHpSC en los andamios de biomatriz dio como resultado que esencialmente todas las celulas expresaron un fenotipo adulto clasico y con actividades de urea, albumina y CYP450 a niveles casi normales despues de una semana en cultivo.
Las celulas similares a hepatocitos a partir de cualquiera de estos precursores y diferenciadas mediante otros protocolos distintos a los andamios de biomatriz, expresan algunos, pero nunca todos, los principales genes especfficos del hfgado, con variabilidad en los genes que se observan y con niveles de protefna para los genes hepaticos generalmente mas bajos o altos para un gen hepatico e insignificantes para otros. Por razones desconocidas, los resultados son diferentes de preparacion en preparacion. Se espera que la utilizacion de los andamios de biomatriz de esta invencion de como resultado una diferenciacion mas rapida de estas poblaciones de celulas madre y con mayor consistencia en el logro de celulas con un fenotipo adulto estable.
La diferenciacion de determinadas poblaciones de celulas madre, tales como hHpSC en andamios de biomatriz dio como resultado que esencialmente todas las celulas expresan un repertorio clasico de genes adultos y con actividades de urea, albumina, y CYP450 a niveles casi normales en 1 a 2 semanas en cultivo y con estabilidad de ese fenotipo durante muchas semanas. Por lo tanto, los andamios de biomatriz de la presente invencion tienen el potencial de facilitar en gran medida la diferenciacion de determinadas poblaciones de celulas madre a un fenotipo hepatico adulto.
La capacidad de diferenciar las celulas madre en los andamios de biomatriz para lograr celulas y tejidos maduros y funcionales ofrece oportunidades considerables para los programas academicos, industriales y clfnicos que permiten el uso de tipos de celulas bien diferenciadas para cada tipo de estudio analftico y, lo mas emocionante, permite la
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generacion de tejidos o incluso organos implantables, revascularizados que pudieran utilizarse para la investigacion basica y programas clmicos.
Referencias para el ejemplo 1
1. Lanza, R. y otros, Handbook of Stem Cells, Vol. 2 volumenes. (Elsevier Academic Press, New York City; 2004).
2. Vacanti, J.P. & Langer, R. Tissue engineering: the design and fabrication of living replacement devices for surgical reconstruction and transplantation. Lancet 354 Suppl 1, S132-34 (1999).
3. *Schmelzer, E. y otros, Human hepatic stem cells from fetal and postnatal donors. Journal of Experimental Medicine 204, 1973-1987 [*igual contribucion como primeros autores;** igual contribucion como autores principales]
(2007) .
4. Zhang, L., Theise, N., Chua, M. & Reid, L.M. Human hepatic stem cells and hepatoblasts: Symmetry between Liver Development and Liver Regeneration. Hepatology 48, 1598-1607 (2008).
5. Kubota, H. & Reid, L.M. Clonogenic hepatoblasts, common precursors for hepatocytic and biliary lineages, are lacking classical major histocompatibility complex class I antigens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 97, 12132-12137 (2000).
6. Wauthier, E.y otros, Hepatic stem cells and hepatoblasts: identification, isolation and ex vivo maintenance Methods for Cell Biology (Methods for Stem Cells) 86, 137-225 (2008).
7. Rhodes, J.M. & Simons, M. The extracellular matrix and blood vessel formation: not just a scaffold. Journal of Cell and Molecular Medicine 11, 176-205 (2007).
8. Chen, S.S., Fitsgerald, W., Zimmerberg, J., Kleinman, H.K. & Margolis, L. Cell-cell and cell-extracellular matrix interactions regulation embryonic stem cell differentiation. Stem Cells 25, 553-561 (2007).
9. Daley, W.P., Peters, S.B. & Larsen, M. Extracellular matrix dynamics in development and regenerative medicine. Journal of Cell Science 21, 255-264 (2008).
10. Chun, S.Y.y otros, Identification and characterization of bioactive factors in bladder submucosa matrix. Biomaterials 28, 4251-4256 (2007).
11. Huber, J.E., Spievack, A., Simmons-Byrd, A., Ringel, R.L. & Badylak, S. Extracellular matrix as a scaffold for laryngeal reconstruction. Ann Otol Rhinol Laryngol 112, 428-433 (2003).
12. Liotta, L.A., Lee, C.W. & Morakis, D.J. New method for preparing large surfaces of intact human basement membrane for tumor invasion studies. Cancer Letters 11, 141-152 (1980).
13. Kleinman, H.K., McGarvey, M.L., Hassell, J.R. & Martin, G.R. Formation of a supramolecular complex is involved in the reconstitution of basement membrane components. Biochemistry 22, 4969-4974 (1983).
14. Vlodavsky, I., Levi, A., Lax, I., Fuks, Z. & Schlessinger, J. Induction of cell attachment and morphological differentiation in a pheochromocytoma cell line and embryonal sensory cells by the extracellular matrix. Developmental Biology (Orlando) 93, 285-300 (1982).
15. Gospodarowicz, D., Delgado, D. & Vlodavsky, I. Permissive effect of the extracellular matrix on cell proliferation in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 77, 4094-4098 (1980).
16. Badylak, S.F. The extracellular matrix as a scaffold for tissue reconstruction. Semin Cell Dev Biol 13, 377-383 (2002).
17. Gilbert, T.W.y otros, Collagen fiber alignment and biaxial mechanical behavior of porcine urinary bladder-derived extracellular matrix. Biomaterials 16 (2008).
18. Lee, M., Chang, P.C. & Dunn, J.C. Evaluation of small intestinal submucosa as scaffolds for intestinal tissue engineering. Journal of Surgical Research 147, 168-171 (2008).
19. Martin, N.D.y otros, In vivo behavior of decellularized vein allografts. Journal of Surgical Research 129, 17-23 (2005).
20. Ott, H.C. y otros, Perfusion-decellularize matrix using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine 14, 213-221 (2008).
21. Macchianni, P. y otros, Clinical transplantation of a tissue-engineered airway. Lancet 372, 2023-2030 (2008).
22. Franklin, M.E., Jr. y otros, The use of porcine small intestinal submucosa as a prosthetic material for laparoscopic hernia repair in infected and potentially contaminated fields: long-term follow-up. Surgical Endoscopy 22, 1941-1946
(2008) .
23. Miller, E.J. & Rhodes, R.K. Preparation and characterization of the different types of collagen. Methods in Enzymology 82, Part A, 33-64 (1982).
24. Yayon, A., Klagsbrun, M., Esko, J.D., Leder, P. & Ornitz, D.M. Cell surface, heparin-like molecules are required for binding of basic fibroblast growth factor to its high affinity receptor. Cell Molecular Life Science 64, 841-848 (1991).
25. Yamuchi, M. & Shiba, M. Lysine hydroxylation and cross-linking of collagen. Methods in Molecular Biology 446, 95-108 (2008).
26. Liu, Y., Cai, S., Shu, X.Z., Shelby, J. & Prestwich, G.D. Release of basic fibroblast growth factor from a crosslinked glycosaminoglycan hydrogel promotes wound healing. Wound Repair Regen 15, 245-251 (2007).
27. Martinez-Hernandez, A., Delgado, F.M. & Amenta, P.S. The extracellular matrix in hepatic regeneration. Localization of collagen types I, III, IV, laminin, and fibronectin [published erratum appears in Lab Invest 1991 Aug;65(2):257]. Laboratory Investigation 64, 157-166 (1991).
28. LeCluyse, E.L. Human hepatocyte culture systems for the in vitro evaluation of cytochrome P450 expression and regulation. Eur J Pharm Sci 13, 343-368. (2001).
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45
50
55
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29. Brown, B., Lindberg, K., Reing, J., Stolz, D.B. & Badylak, S.F. The basement membrane component of biologic scaffolds derived from extracellular matrix. Tissue Engineering 12, 519-526 (2006).
30. Seddon, A.M., Curnow, P. & Booth, P.J. Membrane proteins, lipids and detergents, not just a soap opera. Biochimica Biophysica Acta 1666, 105-117 (2004).
31. Ozeki, M. y otros, Evaluation of decellularized esophagus as a scaffold for cultured esophageal epithelial cells. Journal of Biomedical Materials. Research A 79, 771-778 (2006).
32. Rieder, E. y otros, Decellularization protocols of porcine heart valves differ importantly in efficiency of cell removal and susceptibility of the matrix to decellularization with human vascular cells. Journal of Thoracic Cardiovascular Surgery 127, 399-405 (2004).
33. Olsen, B.R. & Ninomiya, Y. Collagens: Guidebook to the Extracellular Matrix and Adhesion Proteins. (Oxford University Press, Oxford; 1993).
34. Yurchenco, P.D. & O'Rear, J.J. Basement membrane assembly. Methods Enzymol 245, 489-518 (1994).
35. Seyer, J.M., Hutcheson, E.T. & Kang, A.H. Collagen polymorphism in normal and cirrhotic human liver. J Clin Invest 59, 241-248 (1977).
36. Traub, W. & Piez, K.A. The chemistry and structure of collagen. Advances in Protein Chemistry 25, 243-352 (1971).
37. D'Amour, K.A. y otros, Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology 24, 1392-1401 (2006).
38. Pittenger, M.F. y otros, Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science 284, 143-147. (1999).
39. Kazemnejad, S. y otros, Biochemical and molecular characterization of hepatocyte-like cells derived from human bone marrow mesenchymal stem cells on a novel three-dimensional biocompatible nanofibrous scaffold. Journal of Gastroenterology and Hepatology 24, 278-287 (2009).
40. Lysy, P.A., Smets, F., Najimi, M. & Sokal, E.M. Leukemia inhibitory factor contributes to hepatocyte-like differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells. Differentiation 76, 1057-1067 (2008).
41. Campard, D., Lysy, P.A., Najimi, M. & Sokal, E.M. Native Umbilical Cord Matrix Stem Cells Express Hepatic Markers and Differentiate Into Hepatocyte-like Cells. Gastroenterology 134, 833-848 (2008).
42. Song, Z. y otros, Efficient generation of hepatocyte-like cells from human induced pluripotent stem cells. Cell Research, In press. Epub on September 8th (2009).
43. Hayes, A., Tudor, D., Nowell, M., Caterson, B. & Hughes, C. Unique forms of chondroitin sulfate proteoglycans in stem cell niches. Journal of Histochemistry and Cytochemistry 56, 125-138. (2007).
44. Couvelard, A. y otros, Expression of integrins during liver organogenesis in humans. Hepatology 27, 839-847 (1998).
45. Lyon, M., Deakin, J.A. & Gallagher, J.T. Liver heparan sulfate structure. A novel molecular design. Journal of Biological Chemistry 269, 11208-11215 (1994).
46. Vongchan, P. y otros, Structural characterization of human liver heparan sulfate. Biochim Biophys Acta 1721, 1-8 (2005).
47. Wauthier, E. y otros, Hepatic stem cells and hepatoblasts: identification, isolation and ex vivo maintenance Methods for Cell Biology (Methods for Stem Cells) 86, 137-225 (2008).
48. Kubota, H. & Reid, L.M. Clonogenic hepatoblasts, common precursors for hepatocytic and biliary lineages, are lacking classical major histocompatibility complex class I antigens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 97, 12132-12137 (2000).
49. *Schmelzer, E. y otros, Human hepatic stem cells from fetal and postnatal donors. Journal of Experimental Medicine 204, 1973-1987 [*co-equal first authors;**co-equal senior authors] (2007).
50. Schmelzer, E., Wauthier, E. & Reid, L.M. Phenotypes of pluripotent human hepatic progenitors. Stem Cell 24, 1852-1858 (2006).
51. Yamauchi, M. & Shiiba, M. Lysine hydroxylation and cross-linking of collagen. Methods Molecular Biology 446, 95-108 (2008).
52. Gilbert y otros, Quantification of DNA in biologic scaffold materials. Journal of Surgical Research 152:135-139
(2009).
Ejemplo 2. Metodos para la dispersion a escala industrial de andamios de biomatriz.
Otros metodos para dispersar los andamios de biomatriz sobre placas despues de la pulverizacion se desarrollaron en GigaCyte, LLC (Branford, CT). Estos pueden usarse con andamios de biomatriz de cualquier tejido que incluye mamfferos grandes (por ejemplo, tejidos humanos, porcinos y bovinos, etcetera). Los tejidos de cerdo y bovino se obtuvieron de una instalacion de procesamiento de carne certificada por el USDA, y se transportaron en medio RPMI 1640. Este medio puede ser cualquier medio con una composicion que imite los constituyentes del fluido intersticial y con una osmolalidad que esta en el intervalo de 250-350 mOsm/Kg. Los tejidos se procesan despues como se describe en la presente para generar andamios de biomatriz.
Estos metodos incluyen un procesamiento adicional de los andamios de biomatriz para la reduccion a partfculas de tamano micrometrico en suspension para recubrir las placas mediante automatizacion. En un ejemplo no limitante, el proceso incluye homogenizacion del andamio de biomatriz en una solucion con alto contenido de sal para asegurar que los colagenos permanezcan insolubles. Un tampon de deslipidacion modificado compuesto de fosfolipasa A2 a 36 unidades/L mas desoxicolato sodico al 1 % e inhibidor de tripsina de soja a 0,1 mg/ml se anade a una relacion de
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1:1 de tampon:homogeneizado, lo que da como resultado que el material de biomatriz flotante suba hacia la superficie donde se recolecta para su posterior procesamiento. El material de biomatriz se procesa adicionalmente para la eliminacion del tampon de deslipidacion y se lava con solucion de nucleasas para eliminar las nucleasas: RNAasa 5 mg/100 ml, DNAasa 1 mg/100 ml e inhibidor de tripsina de soja 0,1 mg/ml. Despues el material de biomatriz se procesa adicionalmente en tampon con alto contenido de sal (>3,4 M de NaCl) para asegurar la eliminacion de todos los residuos, para mantener los colagenos insolubles y ademas para minimizar la actividad proteasa. El material de biomatriz se procesa adicionalmente para eliminar la alta concentracion de sal, para prepararlo para la reduccion del tamano de partfculas, mediante el lavado del material de biomatriz en medio basal que contiene agentes antimicrobianos/antimicoticos, gentamicina y tampon HEPES. Despues el material de biomatriz se procesa adicionalmente para reducir el tamano de partfculas del material de biomatriz a partfculas de tamano micrometrico (intervalo de 1 a 100 pm) en suspension, a cualquier dilucion, optimamente a 1:6, en medio basal que contiene agentes antimicrobianos/antimicoticos, gentamicina y tampon HEPES, se congela a -80 °C, y despues se pulveriza mediante trituracion criogenica. Si la biomatriz no se diluye antes de triturar, la matriz es demasiado grumosa para recubrir las placas uniformemente. Esta es una etapa clave para permitir la trituracion y recubrimiento uniforme de las placas. Las partfculas de biomatriz pueden estar en suspension a cualquier dilucion pero optimamente 1:6. Las partfculas de biomatriz se descongelan y se recubren las placas usadas para la diferenciacion de celulas madre. Las partfculas de biomatriz pueden diluirse adicionalmente a cualquier dilucion, optimamente 1:24 en medio basal que contiene agentes antimicrobianos/antimicoticos, gentamicina y tampon HEPES y recubrir las placas usadas para el mantenimiento a largo plazo de los tipos celulares diferenciados totalmente derivados de celulas madre, o recien aislados primariamente y criopreservados, o para diferenciar cualquier fuente de celulas madre a hepatocitos. La esterilizacion de las placas recubiertas con biomatriz puede realizarse, por ejemplo, con radiacion gamma (5,000 rads) y almacenarse a 4 °C (o congelado a -80 °C) hasta su uso. Las siembra de las celulas sobre la biomatriz no requieren medio que contenga suero para la union pero el medio que contiene suero puede usarse para aplicar las celulas a la biomatriz. La composicion de partfculas de biomatriz de cualquier tejido puede usarse para recubrir placas y otros aparatos.
Como otro ejemplo, la presente invencion proporciona un metodo para producir un andamio de biomatriz a partir de tejido biologico para dispersion a escala industrial sobre un aparato de cultivo; el metodo comprende: a) producir un andamio de biomatriz de acuerdo con cualquiera de los metodos de esta invencion como se describe en la presente; b) diluir el andamio de biomatriz de (a) en medio basal; c) congelar el andamio de biomatriz de (b) a aproximadamente -80 °C; d) pulverizar el andamio de biomatriz de (c) mediante trituracion criogenica para obtener partfculas de la biomatriz que tienen un tamano en el intervalo de aproximadamente 1 pm a aproximadamente 100 pm (por ejemplo, aproximadamente 1 pm, 2 pm, 5 pm, 10 pm, 15 pm, 20 pm, 25 pm, 30 pm, 40 pm, 50 pm, 60 pm, 70 pm, 80 pm, 90 pm, 95 pm 100 pm, 110 pm, 120 pm, 150 pm, 200 pm, etcetera); e) descongelar las partfculas de biomatriz de (d) en suspension en medio basal; y f) dispersar las partfculas de la biomatriz de la etapa (e) sobre un aparato de cultivo, para producir de esta manera un andamio de biomatriz a partir de tejido biologico para dispersion a escala industrial sobre un aparato de cultivo. En algunas modalidades, este metodo puede comprender ademas la etapa de esterilizar las partfculas de biomatriz, lo que puede llevarse a cabo, por ejemplo por irradiacion gamma.
En algunas modalidades de los metodos descritos anteriormente, el andamio de biomatriz de la etapa (b) puede diluirse a aproximadamente una relacion de 1:6 (por ejemplo, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, etcetera) en medio basal. En algunas modalidades, las partfculas de biomatriz de la etapa (e) pueden diluirse a aproximadamente a 1:24 (por ejemplo, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:21, 1:22, 1:23, 1:24, 1:25, 1:26, 1:27: 1:28, 1:29, 1:30, etcetera) en medio basal.
Esquema de protocolo ilustrativo usado para hfgado adulto Inhibidor de tripsina de soja 1000x
• Concentracion final 0,1 mg/ml Solucion de transporte de tejidos
• Medio basal tal como RPMI 1640 o solucion salina tamponada con fosfato con calcio y magnesio
• Solucion de agentes antibioticos/antimicoticos 100x (Gibco #15240-112)
• Gentamicina (25 ug/ml) (Gibco # 15710-072)
Solucion 1: Solucion para mezclado de tejido
• 3,4 M de NaCl
• Inhibidor de tripsina de soja 0,1 mg/ml (Gibco # 17075-029)
Solucion 2: Solucion de deslipidacion
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• Una mezcla de la Solucion 1 con PBS 1:1 (c/Ca y Mg); las relaciones alternativas son 1:2, 1:3, 1:4) o alternativamente un medio basal tal como RPMI 1640
• Desoxicolato de sodio al 0,1 % (Sigma D6750-100g)
• Fosfolipasa A2 a 36 u/L (Sigma P9279-25mg)
• Inhibidor de tripsina de soja a 0,1 mg/ml (Gibco # 17075-029)
Solucion 3: Solucion de Nucleasas
• Medio basal tal como RPMI 1640
• RNAasa a 5 mg/100 ml (Sigma R6513-1g)
• DNAasa a 1 mg/100 ml (DN25-1g)
• Inhibidor de tripsina de soja a 0,1 mg/ml
Solucion 4: Solucion con alto contenido de sal
• 3 M de NaCl
Solucion 5: Solucion de eliminacion de la sal y trituracion
• William's E
• Agente Antibiotico/Antimicotico (100x)
• Gentamicina (30 ug/ml)
Etapas en el proceso de aislamiento de biomatriz para organos grandes
1. Homogeneizacion del tejido en alto contenido de sal
2. Descelularizacion y deslipidacion
3. Eliminacion de nucleasas
4. Lavado con alto contenido de sal
5. Eliminacion de la sal
6. Reduccion del tamano de partfculas de biomatriz
7. Revestimiento de las placas con biomatriz
Proceso de aislamiento de biomatriz
1.0 Adquisicion de tejidos
1.1 Obtener el tejido del organo de una instalacion certificada e inspeccionada por el USDA
1.2 Transportar el tejido del organo desde la instalacion del USDA al laboratorio de GigaCyte en un recipiente plastico en solucion de transporte de tejidos
1.3 Preparar el tejido para la perfusion u homogeneizacion
1.3.1 Se prefiere la homogeneizacion para la aplicacion in vitro en placas de multiples pocillos
2.0 Homogeneizacion de tejidos
2.1 Asepticamente, cortar el tejido en piezas pequenas (~3 x 3 cm) con bisturf quirurgico num. 22 y colocar en solucion de transporte de tejidos para eliminar la sangre
2.2 Enjuagar las piezas de tejido 3-4 veces en solucion de transporte de tejidos para eliminar la sangre tanto como sea posible
2.3 Homogeneizar ~ 400 g de tejido en igual volumen de Solucion 1 hasta que la mezcla este homogenea (~3-5 min.)
2.4 Verter la solucion del tejido homogeneizado en frasco tipo rodillo de 2 L para la descelularizacion
2.5 Repetir para el grupo completo de piezas de tejido
3.0 Descelularizacion y Deslipidacion
3.1 Anadir igual volumen de Solucion 2 al tejido homogeneizado en frasco tipo rodillo
3.2 Mezclar bien mediante inversion del frasco varias veces, despues dejar asentar durante 15-30 minutos
3.3 El material de matriz flotante subira a la superficie lo que crea una separacion diferente del material de matriz ligero encima de la solucion coloreada del hfgado
3.4 Retirar con pipeta el material de matriz flotante y transferir a otro frasco tipo rodillo
3.5 Juntar la matriz de las multiples homogenizaciones
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3.6 Transferir ~375 ml de material de matriz a un frasco de centrffuga de 750 ml, anadir igual volumen de Solucion 2 a cada frasco y agitar vigorosamente durante ~ 1 minuto para asegurar la descelularizacion y deslipidacion completas
3.7 Sedimentar por centrifugacion a velocidad alta (3750 RPM) durante 10 minutos, despues eliminar el sobrenadante
3.8 Repetir este proceso 1 vez mas (2 veces en total)
4.0 Eliminacion de nucleasas
4.1 Eliminar el sobrenadante despues del lavado de descelularizacion final, con el cuidado de no alterar el sedimento de biomatriz
4.2 Anadir igual volumen de Solucion 3 a cada frasco y agitar vigorosamente durante ~ 1 min. para asegurar que todo el material esta en suspension y la eliminacion completa de las nucleasas
4.3 Sedimentar por centrifugacion a velocidad alta (3750 RPM) durante 10 minutos, despues eliminar el sobrenadante
4.4 Repetir este proceso 1 vez mas. (2 veces en total)
5.0 Lavado con alto contenido de sal
5.1 Eliminar el sobrenadante despues del lavado final con nucleasas, con el cuidado de no alterar el sedimento de biomatriz
5.2 Anadir igual volumen de Solucion 4 a cada frasco y agitar vigorosamente con el cuidado de asegurar que todo el material este en suspension
5.3 Sedimentar por centrifugacion a velocidad alta (3750 RPM) durante 10 minutos, despues eliminar el sobrenadante
5.3.1 En esta fase la biomatriz no sedimenta bien y queda flotante despues de la centrifugacion.
5.3.2 Retirar con pipeta el sobrenadante y pasar a traves de un filtro de nailon para recolectar el material
flotante
5.3.3 Regresar la matriz flotante recogida al frasco de centrffuga
5.4 Repetir este proceso al menos 2 veces antes de parar 5.4.1 El sobrenadante es de color ligeramente bronceado a claro despues del lavado final de sal
5.5 Despues del 2do lavado con alto contenido de sal es un buen punto de parada si es tarde en el dfa.
5.6 Verter los contenidos de todos los frascos de centrffuga en un frasco tipo rodillo y completar con Solucion 4, despues poner la biomatriz a 4 °C durante la noche.
5.7 Al siguiente dfa continuar con los lavados de sal restantes
5.8 Agitar vigorosamente el frasco con biomatriz para mezclar bien el material de biomatriz, despues transferir la biomatriz a los frascos de centrffuga y continuar con otros 3-4 lavados de sal
5.9 Condensar la biomatriz en tan pocos frascos como sea posible llenando cada uno hasta un maximo de la mitad para permitir los lavados de sal
6.0 Eliminacion de la sal
6.1 Eliminar el sobrenadante despues del lavado de sal final con el cuidado de no alterar el sedimento de biomatriz
6.2 Anadir igual volumen de Solucion 5 y agitar vigorosamente para asegurar que todo el material de biomatriz este en suspension
6.3 Sedimentar por centrifugacion a velocidad alta (3750 RPM) durante 10 minutos
6.4 Eliminar el sobrenadante y anadir igual volumen de Solucion 5, despues agitar vigorosamente.
6.5 Repetir 2 veces (3 veces en total) para asegurar que el sobrenadante esta limpio
6.5.1 La biomatriz sedimentara mas apretadamente con cada centrifugacion
6.5.2 El sobrenadante debe estar limpio sin ningun color despues del lavado final
6.6 Despues del lavado final con Solucion 5 registrar el volumen de sedimentos de matriz de cada frasco
6.7 Transferir y juntar todos los sedimentos de biomatriz en un nuevo frasco tipo rodillo
6.8 Medir el volumen de material de biomatriz
6.9 Diluir la biomatriz unida a 1:6 con Solucion 5
6.9.1 Calcular la cantidad de Solucion 5 requerida
6.9.1.1 Ejemplo: 200 ml de biomatriz x 6 = 1200
6.9.1.2 Anadir 1L de Solucion 5 a 200 ml de biomatriz para una suspension de biomatriz de 1:6
6.10 Obtener alfcuotas de 30 ml de la suspension 1:6 de biomatriz en bolsas de congelacion marcadas
previamente
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6.11 Congelar las bolsas de biomatriz a -80 °C y almacenar hasta la trituracion
6.12 Preparar la "hoja de datos de trituracion del lote de biomatriz" para el nuevo lote de biomatriz
6.12.1 Registrar el numero de bolsas producidas a partir de este nuevo grupo
6.12.2 Cada bolsa es una trituracion separada del mismo lote
6.13 El material de biomatriz producido a partir de este grupo se considera un lote
6.14 Asignar un numero de lote al grupo
7.0 Reduccion del tamano de partfculas de biomatriz
7.1 Preparar el molino de trituracion (Spex Sample Prep 6870) con LN2 y camara de trituracion refrigerada
7.2 Retirar la bolsa de biomatriz congelada del congelador
7.3 Romper en piezas pequenas
7.4 Transferir las piezas de biomatriz congeladas a una camara del molino de trituracion enfriada previamente
7.5 Triturar en 2 corridas (una corrida es una trituracion de 12 x 2 minutos cada una seguida de enfriamiento por 2 minutos) 48 minutos cada una en un crio-molino
7.6 Transferir la biomatriz triturada a un frasco de 100 ml marcada previamente con el numero de lote y el numero de la bolsa (el numero de la bolsa identifica la fecha de la trituracion)
7.7 Mantener congelado a -80 °C hasta que este listo para recubrir las placas
8.0 Preparar la biomatriz para recubrir las placas
8.1 Descongelar un frasco de biomatriz por metodo de descongelacion rapida en bano de agua a 37 °C
8.2 Medir la suspension de biomatriz descongelada (debe ser ~30 ml ± 2 ml)
8.3 Diluir a 1:24 con Solucion 5 (ver la Figura 17)
8.3.1 Calcular el volumen de la Solucion 5 para anadir a la suspension de biomatriz a 1:6
8.3.1.1 Multiplicar el volumen de la suspension de biomatriz x 3
8.3.1.2 Anadir ese volumen a la suspension de 1:6 para una dilucion de 1:24
8.4 Recubrir las placas inmediatamente (dejar que el conjunto de biomatriz diluido de lugar a un aglomerado)
9.0 Revestir las placas con biomatriz
9.1 Determinar el numero de placas a recubrir. Consultar la Tabla 8 para los volumenes de siembra
• Retirar asepticamente las placas del empaque y organizarlas en la campana de flujo laminar
• Transferir el volumen apropiado de la suspension de biomatriz en cada pocillo mediante el uso de una pipeta multicanal cuando sea apropiado. Consultar la Tabla 1 para el volumen de siembra
• Asegurar que la suspension este uniformemente distribuida en el pocillo, si es necesario, golpee suavemente la placa pero no la retire de la superficie plana de la campana.
• Dejar que las placas permanezcan en reposo durante la noche
• La primera accion a realizar el dfa siguiente es retirar la solucion de cada pocillo
o Manipular las placas con cuidado para que el recubrimiento de la matriz no se altere o Inclinar la placa hacia usted sin retirar el borde de la placa de la superficie de la campana. Esto estabiliza la placa para evitar movimientos bruscos que produzcan que la biomatriz salga de la placa o Utilizando un aparato de succion con una pipeta de punta fina, aspirar toda la solucion de cada pocillo.
jNO TOQUE LA SUPERFICIE DE LA MATRIZ CON LA PIPETA!!! o Colocar suavemente la placa hacia abajo, retirar la tapa y dejar secar completamente (~2 horas)
■ Mover la placa mientras esta humeda altera el recubrimiento de la biomatriz
■ No mueva las placas hasta que la matriz este seca
o Cuando este completamente seca, cambie la tapa y examine la calidad o Colocar las placas que tienen un recubrimiento liso en una bolsa de placas o Sellar la bolsa y aplicar la etiqueta o Esterilizar mediante irradiacion gamma (5000 rads) o Almacenar las placas recubiertas a 4 °C
o Enviar las placas recubiertas en paquetes de 5 en paquete con hielo
1.0 Utilizacion de las placas de biomatriz
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1.1 Retirar asepticamente la placa del empaque y colocarla en su lugar en el gabinete de seguridad biologica
1.2 Agregar medio a cada pocillo y colocar en la incubadora durante al menos 2 horas antes del uso
1.3 Cuando esten listas para sembrar las celulas, retirar el medio de rehidratacion y lavar con medio de cultivo de tejidos una vez
1.4 Anadir las celulas
Tabla 1: Intervalos de concentraciones molares de NaCl para los colagenos tipo I-V.
Tipo de colageno
Fuente Intervalo de concentracion molar de NaCl para la precipitacion (por lo tanto, insolubilidad a la concentracion especificada y/o a concentraciones superiores a la indicada)
pH acido
pH neutro
I
Piel 0,7-0,9 2,6
I Trfmero
Piel 0,7-0,9 4,0
III
Piel 0,7-0,9 1,5-1,7
IV
Placenta 1,2 1,7-2,0
V
Amnios y corion; placenta 1,2 3,6-4,5
Referencia: Paul Bornstein y Helene Sage (1980) Structurally Distinct Collagen Types. Annual Review of Biochemistry. 49:957-1003.
Estos datos son representativos de las condiciones para la insolubilidad de los tipos de colagenos. Se deben identificar los tipos de colageno dentro de un tejido y despues usar la concentracion de sal mas alta identificada para esos colagenos en el tejido y como la de los tampones usados para preparar los andamios de biomatriz. Por ejemplo, para la piel, se utilizarfa un tampon a pH neutro y con una concentracion de sal de 4,0 M, una concentracion de sal que mantendrfa insolubles a los colagenos tipo I y III. Por el contrario, para la placenta, se utilizarfa un tampon a pH neutro y sal a 4,5 M para mantener insoluble tanto al colageno tipo IV como el tipo V.
Los tipos de colagenos presentes en un tejido son distintos en las diferentes edades de un huesped. Por ejemplo, los hfgados fetales tienen niveles altos de colagenos tipo III, IV y V (que requieren concentraciones de sal superiores a 4,0 M), mientras que los hfgados adultos tienen una mezcla de colagenos tipo I, III, IV, V, VI y XVIII (que requieren concentraciones de sal mas bajas). Por lo tanto, la concentracion de sal necesaria para la preparacion de un andamio de biomatriz esta dictada por el repertorio de colagenos que son dominantes en el tejido. Ver la referencia 23 del Ejemplo 1 para mas detalles.
Tabla 2. Analisis del contenido de colageno en andamio de biomatriz hepatica
Aminoacidos
ANDAMIOS DE BIOMATRIZ (N = 4) TEJIDO HEP ATI CO (N = 3)
Muestra 1
Muestra 2 Muestra 3 Muestra 4 PROMEDIO SD Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3 PROMEDIO SD
Res/1000
Res/1000
Res/1000
Res/1000
Res/1000 Res/1000 Res/1000
Hyp
10,0 13,8 15,3 12,1 12.3 2,3 0,0* 0,0* 0,0* 0,0* 0.0*
Asp
32,7 77,1 73,4 35,5 80.9 3,9 93,0 94,5 90,3 92,8 1,8
Thr
52,6 51,1 45,6 52,4 50,4 3,3 52,2 51,0 53,7 52,3 1,3
Ser
56,5 53,7 61,9 62,4 53,6 4,2 57,7 57,0 62,0 58,9 2,7
Glu
112,0 107,0 117,4 113,1 113,6 5,2 123,9 122,0 130,1 125,4 4,2
Pro
52,3 52,2 55,7 51,6 52,9 1,9 46,6 45,9 46,4 46,3 0,4
Gly
113,7 134,0 125,4 109,4 121,9 10,4 38,2 S4,6 89,1 87,3 2,4
Ala
38,3 36,1 39,5 S3,6 36,9 2,6 79,0 73,2 90,6 82,6 7,0
Val
64,3 57,2 54,8 65,9 60.6 5,4 71,6 71,3 70,1 71,0 0,3
Mel
21,7 20,6 20,7 20,4 20.3 0,6 21,4 21,4 21,7 21,5 0,2
lie
51,3 47,7 47,4 41,7 47,2 4,2 49,6 50,1 42,3 47,3 4,3
Leu
92,7 33,8 109,7 S7,5 93,4 11,5 93,3 95,1 92,7 93,9 1,2
Tyr
30,3 26,9 22,4 23,1 27.0 3,5 31,3 32,1 27,5 30,5 2,6
Phe
45,5 40,7 42,4 42,3 42.3 2,0 47,3 51,0 43,7 47,5 3,7
His
21,0 18,8 13,2 21,8 13,7 3,9 21,3 21,5 24,1 22,5 1,4
Hyl
1.0 1,8 1.6 4.3 2,2 1,5 0,0** 0,0** 0,0** ■H O o" 0,0*'
Lys
40,6 70,0 49,8 66,2 56.7 13,8 74,6 73,5 73,0 75,3 2,3
Arg
57,5 57,6 48,7 46,1 52.5 6,0 47,0 46,0 42,1 45,0 2,6
Nota: * menor que 0,2 res/1000; ** no detectado.
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Tabla 3. Analisis de factores de crecimiento unidos a los andamios de biomatriz de conducto biliar
NOMBRE
NOMBRE COMPLETO DE LA CITOCINA Conductos biliares humanos Andamios de biomatriz de conducto biliar humano %
bFGF
Factor de crecimiento de fibroblastos basico 58299 126 0%
b-NGF
Factor de crecimiento nervioso (polipeptido beta) 516 81 16%
EGF
Factor de crecimiento epidermico 91 108 119%
EGF R
Receptor del factor de crecimiento epidermico 479 145 30%
FGF-4
Factor de crecimiento de fibroblastos 4 31 36 116%
FGF-6
Factor de crecimiento de fibroblastos 6 14 17 121%
FGF-7
Factor de crecimiento de fibroblastos 7 149 23 15%
GCSF
Factor estimulante de colonias de granulocitos 207 233 113%
GDNF
Factor neurotrofico derivado de la glia 53 49 92%
GM-CSF
Factor estimulante de colonias de macrofagos y granulocitos 108 97 90%
HB-EGF
Factor de crecimiento epidermico de union a heparina 28 23 82%
IGFBP-1
Protefnas 1 de union al factor de crecimiento similar a la insulina 431 61 14%
IGFBP-2
Protefnas 2 de union al factor de crecimiento similar a la insulina 255 20 8%
IGFBP-3
Protefnas 3 de union al factor de crecimiento similar a la insulina 77 54 70%
IGFBP-4
Protefnas 4 de union al factor de crecimiento similar a la insulina 81 58 72%
IGFBP-6
Protefnas 6 de union al factor de crecimiento similar a la insulina 783 107 14%
IGF-I
Factor de crecimiento similar a la insulina I 18 6 33%
IGF-I SR
Factor de crecimiento similar a la insulina I 89 25 28%
IGF-II
Factor de crecimiento similar a la insulina 2 2873 3945 137%
M-CSF
Factor estimulante de colonias de macrofagos 149 105 70%
M-CSF R
Receptor del factor estimulante de colonias de macrofagos 358 71 20%
NT-3
Neurotrofina 3 71 71 100%
NT-4
Neurotrofina 4 75 58 77%
PDGF R a
Receptor alfa del factor de crecimiento derivado de plaquetas 104 63 61%
PDGF R b
Receptor beta del factor de crecimiento derivado de plaquetas 489 110 22%
PDGF-AA
Factor de crecimiento derivado de plaquetas AA 114 52 46%
PDGF-AB
Factor de crecimiento derivado de plaquetas AB 87 65 75%
PDGF-BB
Factor de crecimiento derivado de plaquetas BB 155 75 48%
PIGF
Biosfntesis del anclaje glicosilfosfatidilinositol, clase F 146 14 10%
SCF
Factor derivado de celulas estromales 1 39 22 56%
SCF R
Receptor del factor derivado de celulas estromales 159 31 19%
TGF-a
Factor de crecimiento transformante alfa 52 25 48%
10
15
20
TGF-b
Factor de crecimiento transformante beta 234 277 118%
TGF-b 2
Factor de crecimiento transformante beta 2 103 121 117%
TGF-b 3
Factor de crecimiento transformante beta 3 28 16 57%
VEGF
Factor de crecimiento vascular endotelial 74 35 47%
VEGF R2
Receptor del factor de crecimiento endotelial vascular 2 108 33 31%
VEGF R3
Receptor del factor de crecimiento endotelial vascular 3 45 40 89%
Tabla 4. Anticuerpo utilizado
Nombre del anticuerpo
Huesped e isotipo Companfa Num. de catalogo Dilucion
Anticuerpos primarios para los componentes de la matriz extracelular
1.
Colageno 1 IgG1 de raton Sigma C2456 1/2000
2.
Colageno 3A1 IgG1 de raton Sigma C7805 1/2000
3.
Colageno 4A1 IgG de cabra Santa Cruz sc-9302 1/50
4.
Colageno 5A1 IgG de conejo Santa Cruz sc-20648 1/50
5.
Colageno 6 IgG de conejo Santa Cruz Sc-20649 1/50
6.
sulfato de condroitina IgM de raton Sigma C8035 1/200
7.
Elastina IgG de conejo Abcam ab21610 1/200
8.
entactina (nidogeno 1) IgG de rata GeneTex GTX72367 1/200
9.
sulfato de heparan IgM de raton Seiko, Japon 270426 1/200
10.
HS-PG: perlecan IgG2a de raton NeoMarkers RT-794 1/200
11.
HS-PG: sindecano-1 IgG de cabra R&D AF2780 1/100
12.
Fibronectina IgG1 de raton Sigma F7387 1/200
13.
Laminina IgG1 de raton Sigma L8271 1/1000
Anticuerpos primarios para otras protefnas
1.
AFP IgG de conejo Novus Biologicals NB100-1611 1/200
2.
Albumina IgG de conejo Novus Biologicals NB 600-570 1/200
3.
ASMA IgG2a de raton Sigma A2547 1/300
4.
Ck18 IgG2b de raton Sigma SAB3300016 1/400
5.
hCK19 IgG2a de raton Abcam ab7754 1/250
6.
CK19 IgG de conejo Abcam Ab52625 1/200
7.
CYP3A4 IgG de raton Abnova H00001576-B01P 1/200
8.
Desmina IgG de conejo Abcam Ab8592 1/200
9.
EpCAM IgG1 de raton NeoMarkers MS-181 1/200
10.
receptor de secretina IgG de conejo Santa Cruz sc-26633 1/100
11.
PAN CK IgG1 de raton Abcam ab-7753 1/300
12.
Tubulina-a IgG1 de raton Neomarkers MS-581 1/1000
13.
Vimentina IgG1 de raton Abcam Ab8978 1/200
5
10
15
20
25
30
35
Anticuerpos secundarios o colorantes para tincion fluorescente de celulas o inmunohistoqufmica tisular
1.
Alexa Fluor® 488/594 anticuerpo de cabra anti-IgG 1 o 2a de raton o anti-IgG de conejo Sondas moleculares 1/500
2.
Sistema ABC VECTASTAIN® Vector Laboratories
3.
KIT DE SUBSTRATO NovaRED™ Vector Laboratories
4.
Faloidina 488 Sondas moleculares 1/500
Tabla 5. Cebadores utilizados para RT-PCR
Num.
Nombre Nombre completo Acceso al GenBank Secuencia (5' -> 3') Tm Tamano del am|alicdn
1
CXCR-4 quimocina (motivo C-X-C) receptor 4 AJ224869 T ACAC CGAG GAAATG GGCTCA 63 112
AGAT GAT GGAGTAGAT GGTGGG 60.4
2
EpCAM molecula de adhesion de celulas epiteliales NM 002354 ATAACCTGCTCTGAGCGAGTG 61.6 104
TGAAGTGCAGTCCG CAAACT 62.3
3
KRT19 queratina 19 NM 002276 AC CAAGTTT G AGACG GAAC AG 60.2 181
CCCTCAGCGTACTGATTTCCT 61.3
4
HNF6 factor nuclear de hepatocitos 3, alfa NM 004498 ATGTGGAAGTGGCTGCAGGA 60.7 105
TGTGTTGCCTCTATCCTTCCC 61.2
5
F0XA2 forkhead boxA2 NM 021784 G CGACC C CAAGAC CTACAG 61.7 162
GGTT CT GCCGGTAGAAGGG 61.7
6
PROX1 prospero homeobox 1 NM 002763 TT GACATT GGAGTGAAAAG GAC G 61 100
T G CT C AGAAC CTTGGGGATTC 61.8
7
AFP alfa-feto proteins NM 001134 CTTG CACACAAAAAG C CCACT 61.9 138
GGGATGCCTTCTTGCTATCTCAT 61.8
8
ALB albumina M12523 TTTATGCCCCGGAACT CCTTT 61.4 90
ACAGGCAGGCAGCTTTAT CAG 62.4
9
TF transferrin a NM 001063 CCTCCTACCTTGATTG CAT CAG 60.2 137
TTTTGACCCATAGAACTCTGCC 60
10
CYP3A4 citocromo P450, familia 3, subfamilia A, polipeptido 4 NM 017460 AAGTCGCCT CGAAGATACACA 60.9 174
AAGGAGAGAACACT GCTCGTG 61.7
11
TAT tirosina aminotransferasa NM 000353 TTTGGGACCCTGTACCATTGT 61 102
G CATT GGACTTGAGGAAGCTC 61
12
G6PC g I licos a-6-fosfatasa, s u b u n idad cata 11 ti ca NM 000151 T C AGG G AAAG ATAAAG C CGAC C 61.8 105
AGGTAGATTCGTGACAGACAGAC 61.1
(continuacion)
Niim.
Nombre Nombre completo Acceso al GenBank Secuenda (5’ -> 3’) Tm Tamano del amplicon
13
CFTR regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis cfstica NM 000492 AAAAGGCCAGCGTT GT CT CC 63 170
T GAAGCCAGCT CT CTATCCCA 62.1
14
GGT1 gamma-glutamiltransferasa 1 J05235 GGGGAGAT CGAGGGCTAT GAG 63 150
GAT GACGGT CCGCTT GTTTT C 61.8
15
AE2 SLC4A2 NM 003040 GCCAAGGGCGCAGATT CTT 63 103
CCAGGGT GCGGT GAAGTT C 62.9
16
ASBT SLC10A2 NM 000452 TGTGTTGGCTTCCTCTGTCAG 62 115
GGCAGCAT CCTATAAT GAGCAC 60.9
17
GAPDH gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa NM 002046 CAT GAGAAGTAT GACAACAGCCT 60 113
AGT CCTT CCACGATACCAAAGT 608
co
CD
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Tabla 6. Analisis de factor de crecimiento unido a andamios de biomatriz hepatica
Nombre
Nombre completo de la citocina Hfgados de rata Andamios de biomatriz de rata Por ciento
bFGF
Factor de crecimiento de fibroblastos basico 100,06 394,14 394
EGF
Factor de crecimiento epidermico 74,81 76,02 102
EGF R
Receptor del factor de crecimiento epidermico 92,81 81,64 88
FGF-4
Factor de crecimiento de fibroblastos 4 15,06 13,21 88
FGF-6
Factor de crecimiento de fibroblastos 6 4,81 3,77 78
FGF-7
Factor de crecimiento de fibroblastos 7 10,06 6,32 63
GCSF
Factor estimulante de colonias de granulocitos 348,06 338,20 97
GDNF
Factor neurotrofico derivado de la glia 81,31 43,59 54
GM-CSF
Factor estimulante de colonias de macrofagos y granulocitos 133,56 105,38 79
HB-EGF
Factor de crecimiento epidermico de union a heparina 44,56 38,23 86
IGFBP-1
Protefnas 1 de union al factor de crecimiento similar a la insulina 67,81 70,40 104
IGFBP-3
Protefnas 3 de union al factor de crecimiento similar a la insulina 140,81 201,90 143
IGFBP-4
Protefnas 4 de union al factor de crecimiento similar a la insulina 83,56 58,92 71
IGFBP-6
Protefnas 6 de union al factor de crecimiento similar a la insulina 91,81 72,19 79
IGF-I
Factor de crecimiento similar a la insulina I 1,56 1,98 127
IGF-I SR
Factor de crecimiento similar a la insulina I 7,31 3,51 48
IGF-II
Factor de crecimiento similar a la insulina 2 3749,06 3482,52 93
M-CSF
Factor estimulante de colonias de macrofagos 170,31 134,68 79
M-CSF R
Receptor del factor estimulante de colonias de macrofagos 70,56 50,47 72
NT-3
Neurotrofina 3 25,56 5,03 20
NT-4
Neurotrofina 4 55,06 43,59 79
PDGF R a
Receptor alfa del factor de crecimiento derivado de plaquetas 10,56 21,11 200
PDGF R b
Receptor beta del factor de crecimiento derivado de plaquetas 113,81 85,46 75
PDGF-AA
Factor de crecimiento derivado de plaquetas AA 62,06 106,40 171
PDGF-AB
Factor de crecimiento derivado de plaquetas AB 19,31 19,34 100
PDGF-BB
Factor de crecimiento derivado de plaquetas BB 9,56 14,23 149
PIGF
Biosfntesis del anclaje glicosilfosfatidilinositol, clase F 4,81 8,36 174
SCF
Factor derivado de celulas estromales 1 2,06 42,56 2064
SCF R
Receptor del factor derivado de celulas estromales 17,06 17,80 104
TGF-a
Factor de crecimiento transformante alfa 21,31 21,63 102
TGF-b
Factor de crecimiento transformante beta 330,31 342,77 104
TGF-b 2
Factor de crecimiento transformante beta 2 134,06 152,34 114
TGF-b 3
Factor de crecimiento transformante beta 3 1,06 0,18 17
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
VEGF
Factor de crecimiento vascular endotelial 70,56 94,14 133
VEGF R2
Receptor del factor de crecimiento endotelial vascular 2 13,56 11,93 88
VEGF R3
Receptor del factor de crecimiento endotelial vascular 3 459,56 46,91 10
Tabla 7. Propiedades de las celulas madre hepaticas humanas (hHpSC) despues del aislamiento y en cultivo
Propiedades
hHpSC- recien aisladas Condiciones de autorreplicacion (Dfa 12) Condiciones de Diferenciacion (Dfa 12)
KM y TCP o colageno tipo III
DM y colageno tipo I DM y andamios de biomatriz
Tiempo necesario para adherirse
” 4-5 horas en TCP; ~ 3 horas en colageno tipo III 7-12 horas ~ 3 horas
% de adherencia de celulas viables
” 60-80 % en TCP y ~ 100 % en colageno tipo III ~ 100 %
Morfologfa de las colonias
Colonias bidimensionales (monocapa) Cordones de celulas; algo cuboidal Cordones de celulas; muy tridimensional
Tiempo de duplicacion (tasa de division)
Una division cada ~ 36 horas en TCP y ~ 2426 horas en colageno tipo III Una division cada ~ 4050 horas con transicion a la detencion del crecimiento hacia los 710 dfas Solo unas pocas divisiones con transicion a la detencion del crecimiento hacia ~5 dfas
Duracion de la viabilidad
> 6 meses (permanecen como celulas madre) ~ 2 semanas > 8 semanas como celulas diferenciadas (no probado aun por mas tiempo)
Porcentaje de celulas que expresan el marcador especificado
EpCAM
100 % Presente en membranas de colangiocitos pequenos; ninguna expresion en absoluto en hepatocitos maduros
NCAM
>80 % Ninguno
CD133/1
90 % Ninguno
SOX 17
100 % Ninguno
CK 8/18, E- cadherina
100 % 100 %
CK19
90 % Presente en los colangiocitos pero no en los hepatocitos
a-fetoprotefna
Ninguna; En caso de haberla, es debido a contaminacion con hepatoblastos Expresion moderada en la mayorfa de las celulas a los 10-12 dfas La expresion en los primeros 2-3 dfas, disminuye drasticamente despues de eso, sin expresion a partir del dfa 7 en adelante.
P450
Ninguno o niveles insignificantes 100 % (~ 18 000 RLU)* 100 % (~ 35 000 RLU)*
Urea sintetizada
Ninguno ~ 2,5 mg/dl ~ 7 mg/dl

Claims (12)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    65
    REIVINDICACIONES
    1. Un metodo para producir un andamio de biomatriz a partir de tejido hepatico de mamffero para su dispersion a escala industrial sobre un aparato de cultivo; el metodo comprende:
    a) perfundir el tejido hepatico u homogeneizar el tejido hepatico con un tampon que comprende una concentracion de sal de 3,5 M de NaCl a 4,5 M de NaCl, despues
    b) perfundir el tejido hepatico o extraer el homogeneizado de la etapa (a) con un tampon de deslipidacion que comprende desoxicolato sodico y fosfolipasa A2 en un primer medio, en donde la osmolalidad de dicho primer medio es de 250 mOsm/kg a 350 mOsm/kg y dicho primer medio esta libre de suero y a pH neutro; despues
    c) perfundir el tejido o extraer el homogeneizado de la etapa (b) con un tampon a un pH neutro y que comprende una concentracion de sal de 2,0 M de NaCl a 5,0 M de NaCl, la concentracion elegida para mantener insolubles los colagenos identificados en el tejido biologico; despues
    d) perfundir el tejido o extraer el homogeneizado de la etapa (c) con RNAasa y DNAasa en un tampon; y despues
    e) enjuagar el tejido u homogeneizado de la etapa (d) con un segundo medio que esta a pH neutro, esta libre de suero y tiene una osmolalidad de 250 mOsm/kg a 350 mOsm/kg, para producir de esta manera un andamio de biomatriz intacto u homogeneizado del tejido hepatico, dicho andamio de biomatriz retiene al menos 95 % de sus colagenos originales y la mayorfa de los componentes de la matriz asociados al colageno y los factores de crecimiento, hormonas y citocinas unidos a la matriz del tejido biologico;
    f) diluir el andamio de biomatriz en medio basal;
    g) congelar el andamio de biomatriz de (f);
    h) pulverizar el andamio de biomatriz de (g) mediante trituracion criogenica hasta obtener partfculas de biomatriz que tienen un tamano en el intervalo de 1 pm a 100 pm;
    i) descongelar las partfculas de biomatriz de (h) en suspension en medio basal; y
    j) dispersar las partfculas de biomatriz de la etapa (i) sobre un aparato de cultivo, para producir de esta manera un andamio de biomatriz a partir de tejido biologico para su dispersion a escala industrial sobre un aparato de cultivo.
  2. 2. El metodo de conformidad con la reivindicacion 1, que comprende ademas la etapa de esterilizar el andamio de biomatriz, opcionalmente en donde la etapa de esterilizacion se lleva a cabo mediante irradiacion gamma.
  3. 3. El metodo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en donde el andamio de biomatriz de (f) se diluye a una relacion de 1:6 en el medio basal.
  4. 4. El metodo de conformidad con cualquier reivindicacion precedente, en donde las partfculas de biomatriz de (i) se diluyen a una relacion de 1:24 en el medio basal.
  5. 5. El metodo de conformidad con cualquier reivindicacion precedente, en donde el primer medio comprende sales, minerales, aminoacidos, vitaminas, y azucares.
  6. 6. El metodo de conformidad con cualquier reivindicacion precedente, en donde el primer medio es un medio basal, opcionalmente en donde el medio basal se selecciona del grupo que consiste en medio RPMI 1640, DME/F12, DME, F12, medio de Waymouth y medio de William.
  7. 7. El metodo de conformidad con cualquier reivindicacion precedente, en donde el segundo medio comprende al menos uno de los constituyentes presentes en el fluido intersticial.
  8. 8. El metodo de conformidad con cualquier reivindicacion precedente, en donde el tampon de deslipidacion de la etapa (b) comprende de 20 unidades/l a 50 unidades/l de fosfolipasa A2 y desoxicolato sodico al 1 % en el primer medio.
  9. 9. El metodo de conformidad con cualquier reivindicacion precedente, en donde la concentracion de sal del tampon de la etapa (c) es de 3,4 M de NaCl a 3,5 M de NaCl cuando se usa para la preparacion de un andamio a partir de un hfgado adulto y es de 4,0 M de NaCl a 4,5 M de NaCl cuando se usa para la preparacion de un andamio a partir de un hfgado fetal.
  10. 10. El metodo de conformidad con cualquier reivindicacion precedente, en donde el tampon de la etapa (c) comprende ademas un inhibidor de proteasa, opcionalmente en donde el inhibidor de proteasa es un inhibidor de tripsina de soja.
  11. 11. El metodo de conformidad con cualquier reivindicacion precedente, en donde el tampon de la etapa (d) comprende ademas un inhibidor de proteasa, opcionalmente en donde el inhibidor de proteasa es un inhibidor de tripsina de soja.
  12. 12. El metodo de conformidad con cualquier reivindicacion precedente, en donde todos los medios y tampones de las etapas (a) a la (e) estan libres de una cantidad detectable de una enzima que degrade los componentes de la matriz extracelular.
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Families Citing this family (41)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
HUE032727T2 (en) * 2010-07-02 2017-10-30 Marsha Lynn Roach Biometric skeletons for industrial scale dispersion
NL2009145C2 (en) * 2012-07-06 2014-01-07 Xeltis B V Implant.
CN103536967B (zh) * 2012-07-10 2016-04-13 上海微创医疗器械（集团）有限公司 一种制备细胞外基质支架材料的脱细胞方法
US9533013B2 (en) 2013-03-13 2017-01-03 University Of North Carolina At Chapel Hill Method of treating pancreatic and liver conditions by endoscopic-mediated (or laparoscopic-mediated) transplantation of stem cells into/onto bile duct walls of particular regions of the biliary tree
BR112015023642A2 (pt) * 2013-03-15 2017-07-18 Miromatrix Medical Inc uso de perfusão de fígado descelularizado para permitir recelularização de célula
JP6123018B2 (ja) * 2013-03-15 2017-04-26 ニューテック メディカル インコーポレイテッド 胎盤物質由来の製剤並びにその製造方法及び使用方法
HUE042704T2 (hu) * 2013-04-08 2019-07-29 Regentys Corp Eljárás és készítmény gyulladásos bélbetegség kezelésére kolektómia nélkül
MX2016001247A (es) 2013-07-30 2016-08-17 Musculoskeletal Transplant Foundation Matrices derivadas de tejido suave acelular y metodos para preparar las mismas.
CN103432627B (zh) 2013-08-26 2015-03-25 北京瑞健高科生物科技有限公司 一种制备动物脱细胞组织基质材料的方法及其制备的组织基质材料
GB201409858D0 (en) * 2014-06-03 2014-07-16 Ucl Business Plc Human liver scaffolds
CN104288837B (zh) * 2014-09-11 2016-04-13 杨淑珍 一种脱细胞真皮基质及其制备方法和用途
JP6495468B2 (ja) 2015-02-27 2019-04-03 ソーク インスティチュート フォー バイオロジカル スタディーズ リプログラミング前駆体組成物およびその使用方法
CN104928241B (zh) * 2015-03-27 2018-04-13 北京康爱瑞浩生物科技股份有限公司 一种增强型nk细胞的活化方法及细胞制备方法
EP3307874A4 (en) * 2015-06-12 2019-04-24 Agency For Science, Technology And Research DERIVATION OF HEPATIC STEM CELLS AND TYPES OF HEPATIC CELLS AND ASSOCIATED USES THEREOF
US10912864B2 (en) 2015-07-24 2021-02-09 Musculoskeletal Transplant Foundation Acellular soft tissue-derived matrices and methods for preparing same
US11052175B2 (en) 2015-08-19 2021-07-06 Musculoskeletal Transplant Foundation Cartilage-derived implants and methods of making and using same
CN106884002B (zh) * 2015-12-15 2021-03-19 上海市针灸经络研究所 一种稳定的结肠上皮细胞培养方法
CN105833353B (zh) * 2016-05-09 2018-04-20 拜欧迪赛尔（北京）生物科技有限公司 一种生物工程脱细胞真皮基质的制备及用途
US20170369849A1 (en) * 2016-05-11 2017-12-28 The University Of North Carolina At Chapel Hill Compositions and methods for bioengineered tissues
EP3936610A1 (en) * 2016-05-25 2022-01-12 Salk Institute for Biological Studies Compositions and methods for organoid generation and disease modeling
RU2019103382A (ru) * 2016-07-12 2020-08-11 Те Юниверсити Оф Норт Каролина Эт Чепел Хилл Биоматриксные скаффолды, предназначенные для применения при диагностировании и моделировании рака
CN106362212A (zh) * 2016-10-21 2017-02-01 华中科技大学同济医学院附属协和医院 一种用于去除组织细胞的亲脂性去细胞溶液、试剂盒和方法
GB2555787A (en) * 2016-11-07 2018-05-16 Landberg Goran Diagnostic methods
CA3054334C (en) 2016-11-30 2023-09-26 Bruker Daltonik Gmbh Preparation of living, microbial samples and microorganisms for subsequent mass spectrometric measurement and evaluation
IL296689A (en) * 2017-06-12 2022-11-01 Univ North Carolina Chapel Hill Patch graft assemblies for cell transplantation
BR112020001838A2 (pt) * 2017-07-31 2020-07-28 Alexandre Do Canto Zago dispositivo e método para promover a rápida endotelização das hastes do stent e da parede do vaso.
EP3470096A1 (en) * 2017-10-13 2019-04-17 Erasmus University Medical Center Rotterdam Elastin reduction allowing recellularization of cartilage implants
CN111492223B (zh) * 2017-12-29 2023-07-25 豪夫迈·罗氏有限公司 组织样品制备系统
EP3813896A4 (en) * 2018-05-14 2022-01-26 Roosterbio, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS RELATING TO EXTRACELLULAR MATERIAL FROM HYPERTONIC CELL SOLUTIONS
CN108753687B (zh) * 2018-06-22 2021-04-16 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 微肝组织培养模型、其构建方法及其应用
CN108753686B (zh) * 2018-06-22 2021-06-22 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 组织工程肝脏模型、其构建方法及其应用
CN109735490A (zh) * 2019-03-06 2019-05-10 福建省海西细胞生物工程有限公司 一种脂肪干细胞提取方法
CN110257335B (zh) * 2019-04-10 2020-09-29 首都医科大学附属北京天坛医院 单层或多层的3d脑胶质瘤细胞培养模型及其构建方法和应用
JP2022533144A (ja) 2019-05-16 2022-07-21 レスメド・プロプライエタリー・リミテッド 医療デバイスにおける双方向通信
WO2021045374A1 (ko) * 2019-09-04 2021-03-11 한국생명공학연구원 증식 가능한 간 오가노이드 분화용 배지 조성물 및 이를 이용한 간 오가노이드의 제조방법
CN110559485B (zh) * 2019-09-25 2021-02-02 北京大清生物技术股份有限公司 一种生物组织基质材料及其制备方法与应用
DE102019130568A1 (de) 2019-11-13 2021-05-20 Aesculap Ag Chirurgischer Fräser mit verbesserter Spanabfuhr
CN111110919A (zh) * 2019-12-30 2020-05-08 广东泓志生物科技有限公司 大网膜脱细胞基质材料的制备方法及软骨组织的构建方法
CN111760072B (zh) * 2020-08-24 2022-09-23 鲁峰 脂肪来源的真皮内填充物及其制备和应用
CN114748208B (zh) * 2022-04-15 2024-01-12 柔脉医疗(深圳)有限公司 一种可原位检测多种化学、生物成分的组织工程支架
CN115948331A (zh) * 2022-10-17 2023-04-11 中国人民解放军西部战区总医院 一种从小鼠胆囊中分离获取间充质干细胞的方法

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19569C (de) ANNA ERBER in Brieg Neuerungen an der unter Nr. 17581 patentirten Handlaterne
EP0682671A4 (en) 1993-02-01 1998-01-14 Seq Ltd METHOD AND DEVICES FOR SEQUENCING DNA.
US5695998A (en) 1995-02-10 1997-12-09 Purdue Research Foundation Submucosa as a growth substrate for islet cells
US6149891A (en) * 1995-05-31 2000-11-21 Israel Humanitarian Foundation Ltd. X-ray contrast medium and method for protecting against harmful effects thereof
US20020177551A1 (en) 2000-05-31 2002-11-28 Terman David S. Compositions and methods for treatment of neoplastic disease
AU2001284968B2 (en) * 2000-08-16 2006-12-21 Duke University Decellularized tissue engineered constructs and tissues
ES2549161T3 (es) 2001-02-14 2015-10-23 Anthrogenesis Corporation Placenta post-parto de mamífero, su uso y células madre placentarias de la misma
JP4426285B2 (ja) 2001-06-28 2010-03-03 クック・バイオテック・インコーポレーテッド 腎被膜コラーゲンを含有する移植片プロテーゼ用具
US20040187877A1 (en) * 2002-12-04 2004-09-30 Badylak Stephen F. Method for repair of liver tissue
CN100412188C (zh) * 2003-02-21 2008-08-20 Uab研究基金会 生物活性天然生物基质组合物
AU2004253508A1 (en) 2003-06-25 2005-01-13 Acell, Inc. Conditioned matrix compositions for tissue restoration
ES2564044T3 (es) * 2003-06-27 2016-03-17 DePuy Synthes Products, Inc. Células posparto derivadas de tejido del cordón umbilical y métodos de preparación y uso de las mismas
BRPI0611739A2 (pt) * 2005-06-10 2011-12-20 Celgene Corp colágeno de atelopeptìdeo, composição, método e kit para aumentar, avolumar ou substituir tecido de um mamìfero, e, processos para preparar e para reticular colágeno de atelopeptìdeo, e para reduzir a quantidade de partìculas virais em uma composição de colágeno
WO2007018165A1 (ja) * 2005-08-10 2007-02-15 Toray Industries, Inc. スポンジ状構造体および粉末、ならびにそれらの製造方法
US9944900B2 (en) * 2006-01-18 2018-04-17 Hemacell Perfusion Pulsatile perfusion extraction method for non-embryonic pluripotent stem cells
US8241908B2 (en) 2006-05-16 2012-08-14 Becton, Dickinson And Company Extracellular matrix coated surface for culturing cells
US8685107B2 (en) 2007-07-03 2014-04-01 Histogenics Corporation Double-structured tissue implant and a method for preparation and use thereof
DK2349292T3 (en) * 2008-09-30 2017-06-26 Univ California COMPOSITIONS comprising decellularized extracellular matrix obtained from cardiac tissue
EP2393914B1 (en) * 2009-02-04 2017-01-04 Yale University Tissue engineering of lung
US9277999B2 (en) * 2009-02-27 2016-03-08 University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education Joint bioscaffolds
WO2012005760A1 (en) * 2010-06-30 2012-01-12 Miromatrix Medical Inc. Use of perfusion decellularized organs for matched recellularization
HUE032727T2 (en) * 2010-07-02 2017-10-30 Marsha Lynn Roach Biometric skeletons for industrial scale dispersion

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