CN106884002B - 一种稳定的结肠上皮细胞培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种稳定的结肠上皮细胞培养方法。本发明所提供的培养方法包括如下步骤：将结肠组织剪碎，并加入消化液中进行消化，所述消化液中包含IV型胶原酶和透明质酸酶；将上清转移至离心管离心，离心后弃去上清，并使用完全培养基重悬细胞，并将细胞接种培养；培养至瓶底细胞覆盖率≥70%时消化、离心，并重悬于完全培养基中，传代培养后，即得结肠上皮细胞。本发明的成年大鼠结肠上皮细胞制备与培养方法，采用Ⅳ型胶原酶和透明质酸酶联合消化，并探索了最佳的消化时间，最终得到较纯的大鼠结肠上皮细胞。

Description

一种稳定的结肠上皮细胞培养方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种稳定的结肠上皮细胞培养方法。

背景技术

结肠上皮细胞是结肠黏膜屏障的主要结构基础，不仅能阻止细菌、内毒素进入体循环，还能分泌多种细胞因子，促进结肠黏膜损伤后的修复及促进免疫耐受。结肠上皮细胞受损及功能的缺失会导致多种疾病的产生。目前，对肠上皮细胞的离体实验研究多采用细胞株进行，如：colorectal cancer cell line(Caco2)、human colon adenocarcinoma(HT-29)、intestinal epithelial cells(IEC-6)等，这些细胞株或来源于肿瘤细胞，或经过永生化处理，在形态及功能方面和正常结肠上皮细胞存在差异，不利于机体生理病理反应及药物作用的分析。原代细胞具有直接来源于机体组织，生物性状尚未发生变化的优势，然而分离培养技术是一个难题，限制了其应用。因此，建立可靠稳定的结肠上皮细胞分离、纯化及原代培养方法，对研究结肠上皮的生理病理机制及相关疾病的发病机制和治疗具有重要的意义。

国外文献[Baten A,akamoto K,Shamsuddin A M.Long-term culture of normalhuman colonic epithelial cells in vitro[J].FASEB J,1992,6(9):2726-2734]报道大鼠结肠上皮细胞体外分离纯化所采用的消化酶主要是胰酶+EDTA的组合，但胰酶消化法对细胞损伤大，所获得的细胞很难存活并分裂增殖，对纤维结缔组织也无能为力，因此，酶消化法逐渐被淘汰。此外，Bartsch I等人[Bartsch I,Zschaler I,Haseloff M,et alEstablishment of a long-term culture system f or rat colon epithelial cells[J].In Vitro Cell Dev Biol Anim,2004,40(8-9):278-284]报道采用EDTA分离获得了比较纯的肠上皮细胞，但翟荣林等人[翟荣林,王国斌,蔡开琳,田元,许飞.正常SD新生大鼠结肠上皮细胞体外分离的培养与鉴定研究[J].中华肿瘤防治杂志,2008,15(18):1365-1367]认为单纯应用EDTA并不能获得良好的分离效果，所获得的细胞贴壁能力和活性均不理想，并且不能克服结肠上皮细胞生长的难题。多篇文献[Evans GS,Flint N,Somers AS,EydenB,Potten CS.The development of a method for the preparation of rat intestinalepithelial cell primary cultures[J].Cell Sci,1992,101:219-231.

W,Weber S,Birkner S.Primary cell cultures of bovine colon epithelium:isolationand cell culture of colonocytes[J].Toxicol In Vitro,2000,14:435-445]表明胶原酶作用温和，且能抑制成纤维细胞的生长，因此在肠上皮细胞的分离中常和不同的酶联合运用，可分离获取较多的肠上皮细胞。上述文献中分离肠上皮细胞实验多采用新生大鼠，虽分离效果较好但不利于疾病模型的建立，无法为探讨发病机制提供途径。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种稳定的结肠上皮细胞培养方法，用于解决现有技术中的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种稳定的结肠上皮细胞培养方法，包括如下步骤：

1)将结肠组织剪碎，并加入消化液中进行消化，所述消化液中包含IV型胶原酶和透明质酸酶；

优选的，所述结肠上皮细胞为哺乳动物结肠上皮细胞，所述步骤1中的结肠组织为对应的哺乳动物结肠组织。

更优选的，所述哺乳动物为大鼠(拉丁名：Rattus norvegicus)。

进一步优选的，所述哺乳动物为SD大鼠(拉丁名：Sprague-Dawley)。

从哺乳动物内获取结肠组织的方法对于本领域技术人员来说是公知的现有技术，本领域技术人员可根据实际情况选择合适的方法获取哺乳动物的结肠组织。

进一步优选的，所述步骤1中，结肠组织通过如下步骤获得：首先，麻醉成年大鼠，消毒后放入超净台内，无菌条件下打开大鼠腹腔，找到自肛门向近端5～10cm的大鼠结肠，将肠系膜组织剥离干净，完全游离出结肠，剪下后浸泡在含抗生素的处理液中，将结肠剪开，用含抗生素的处理液中漂洗以去除结肠内容物。在本发明一实施例中，所述含抗生素的处理液为含抗生素的无菌PBS。

优选的，所述步骤1中，所述消化液为中IV型胶原酶和透明质酸酶的水溶液，消化液中IV型胶原酶和透明质酸酶的重量比为4.5～5.5:1，消化时间为1.5～2.5h，更优选的，所述消化液为中IV型胶原酶和透明质酸酶的水溶液，消化液中IV型胶原酶和透明质酸酶的重量比为4.9～5.1:1，消化时间为1.8～2.2h。

优选的，所述步骤1中，消化液中IV型胶原酶和透明质酸酶的总浓度为0.36～0.44wt％，更优选为0.38～0.42wt％。

在本发明一实施例中，所述IV型胶原酶为Sigma C5138-100MG IV型胶原酶，所述透明质酸酶为Sigma H4272-30MG透明质酸酶。

所述步骤1中，本领域技术人员可根据细胞种类，在确定了消化液以后，选取合适的消化条件，在本发明一实施例中，所述步骤1中的消化的具体条件为：37℃、5％CO₂，每1mm³结肠组织使用6～9ml消化液，消化过程中对消化体系震荡摇匀，优选为每隔15～20min震荡一次。

2)将上清转移至离心管离心，离心后弃去上清，并使用完全培养基重悬细胞，并将细胞接种培养。

所述步骤2、3中，完全培养基包括基础培养基和血清，本领域技术人员可根据实际情况选择合适的完全培养基，在本发明一实施例中，所述完全培养基的基础培养基为DMEM，血清为胎牛血清，其中血清的质量百分比含量为10％。

3)培养至瓶底细胞覆盖率≥70％时消化、离心，并重悬于完全培养基中，传代培养后，即得结肠上皮细胞。

优选的，所述步骤3中，培养至瓶底细胞覆盖率≥70％的过程中，需换液、洗去残留未消化的组织块。

优选的，所述步骤3中，消化为胰酶消化。

本领域技术人员可根据细胞种类选取合适培养条件，在本发明一实施例中，所述步骤3中的培养的具体条件为：37℃、5％CO₂，培养体系的体积为6～8ml。

优选的，所述步骤3中，培养18～32h后换液，洗去残留未消化的组织块，继续培养3～5天后换液，换液后继续培养，至瓶底细胞覆盖率≥70％时胰酶消化。

优选的，所述步骤3中，培养至瓶底细胞覆盖率≥90％时消化、离心。

优选的，所述步骤3中，传代培养时选取上皮细胞纯度较高的孔进行传代。

更优选的，所述步骤3中，传代培养具体包括如下步骤：

A)计数后将细胞铺板，培养7～10天；

本领域技术人员可选择合适的孔板和对细胞进行培养，在本发明一优选实施例中，所述步骤A中采用48孔板，每孔接种5000个细胞。

本领域技术人员可根据细胞种类选取合适培养条件，在本发明一实施例中，所述步骤A中的培养的具体条件为：37℃、5％CO₂，培养体系的体积为6～8ml。

B)观察各孔细胞，选取上皮细胞纯度较高的孔中的细胞消化、离心，并重悬于完全培养基中；

优选的，所述步骤B中，消化为胰酶消化。

重复步骤A和B，至上皮细胞纯度达到目标纯度。

更优选的，所述步骤3中，重复步骤A和B，至培养孔中上皮细胞纯度≥90％。

进一步优选的，所述步骤3中，重复步骤A和B三次，即可获得上皮细胞纯度≥90％的培养孔。在本发明一实施例中，所述步骤3中，重复步骤A和B三次，即可获得没有成纤维细胞、且上皮细胞纯度≥90％的培养孔。

本发明的成年大鼠结肠上皮细胞制备与培养方法，经过反复实验摸索，采用Ⅳ型胶原酶和透明质酸酶联合消化，并探索了最佳的消化时间；传代培养时用胰酶进行消化传代，并不断选取较纯的孔进行传代，最终得到较纯的大鼠结肠上皮细胞。此外，本发明所提供的培养方法亦可应用于疾病大鼠细胞，是一种可靠稳定的结肠上皮细胞原代培养方法，可为探讨相关疾病的病机提供研究途径。

附图说明

图1显示为正常大鼠细胞培养结果示意图。

图2显示为模型大鼠细胞培养结果示意图。

图3显示为正常大鼠结肠上皮细胞爬片SP免疫组化鉴定示意图。

图4显示为模型大鼠结肠上皮细胞爬片SP免疫组化鉴定示意图。

图5显示为阴性对照SP免疫组化鉴定示意图。

图6显示为正常大鼠结肠上皮细胞核染色示意图。

图7显示为正常大鼠结肠上皮细胞质CK-19染色示意图。

图8显示为正常大鼠结肠上皮细胞染色示意图。

图9显示为模型大鼠结肠上皮细胞核染色示意图。

图10显示为模型大鼠结肠上皮细胞质CK-19染色示意图。

图11显示为模型大鼠结肠上皮细胞染色示意图。

图12显示为大鼠结肠上皮细胞生长曲线示意图。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989 and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987 and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

本发明实施例中，发明人以克罗恩病为模型组，分别制备了正常组和模型组的结肠上皮细胞并进行原代培养。模型组的造模方法如下：①采用成年SD大鼠，造模前24h禁食不禁水；②大鼠称质量后，使用2wt％戊巴比妥钠30mg/kg腹腔注射麻醉；③TNBS灌肠溶液制备：将无水乙醇加双蒸水，配制成50％(体积比)的乙醇，再将5wt％TNBS(三硝基苯磺酸)与50％(体积比)乙醇以2:1比例混合体积比配制成TNBS灌肠液；④灌肠：模型组大鼠以TNBS溶液3ml/kg灌肠；正常组大鼠用生理盐水3ml/kg灌肠。灌肠器插入肛门约6～8cm注入灌肠液。大鼠体位为头朝下，拔出灌肠器后再持续倒立1min左右，以防灌肠液溢出。每隔7d重复灌肠1次，共灌肠4次分别建立正常组和克罗恩病大鼠模型组。

实施例1

成年大鼠结肠上皮细胞的分离、纯化及原代培养：

1)首先，腹腔注射10％水合氯醛(5ml/kg)麻醉成年SD大鼠(分别包括正常大鼠和模型大鼠)，75％的酒精浸泡消毒15min后放入超净台内，无菌条件下打开大鼠腹腔，找到自肛门向近端5～10cm的大鼠结肠，将肠系膜组织剥离干净，完全游离出结肠，剪下后浸泡在含青、链霉素(青霉素的工作浓度为100U/ml，链霉素的工作浓度为0.1mg/ml)的无菌PBS中。

2)将结肠剪开，用含抗生素的无菌PBS漂洗5～10遍以去除结肠内容物。

3)用无菌眼科剪将组织剪碎至体积为1mm³左右，加入7ml 0.4％Ⅳ型胶原酶：透明质酸酶＝5:1的消化液中，置于37℃、5％CO₂培养箱消化2h左右，边消化边震荡摇匀以便消化更充分，一般间隔15～20min震荡一次。

4)消化完毕，小心转移上清至离心管中，1000rpm，离心10min，弃上清，沉淀主要成分为肠上皮细胞团块和未消化的组织小块，用含10％胎牛血清(GIBCO胎牛血清)的DMEM重悬细胞，接种于培养皿中，37℃、5％CO₂培养箱中培养。24h后换液，洗去残留未消化的组织块，继续培养。

5)倒置显微镜镜下观察，细胞不多，有纤维细胞。继续培养3～5天后，镜下可见较多成纤维细胞，结肠上皮细胞较少。换液后继续培养。

6)大鼠结肠上皮细胞的纯化：细胞经培养5～7天后，倒置显微镜下观察上皮细胞生长情况，其长至瓶底的90％时(总培养天数一般为9～13天)，胰酶消化，选用培养板进行传代培养。

实施例2

成年大鼠结肠上皮细胞的传代培养：

经过上述步骤进行原代培养的大鼠结肠上皮细胞(分别包括正常大鼠和模型大鼠)，从5％CO₂培养箱中取出细胞培养皿，在倒置显微镜下观察细胞铺满培养皿的90％便可进行传代培养。按照如下步骤进行传代培养，进一步纯化结肠上皮细胞，具体步骤如下：将细胞用0.25％胰酶消化，离心，完全培养基(DMEM+10％胎牛血清)重悬，计数。取1×10³/ml细胞，铺48孔板，继续培养7天左右。镜下观察，有3～5孔细胞几乎没有成纤维细胞，大部分是上皮细胞，将这3～5孔细胞消化传代，一般7天左右扩到12孔板，继续培养7天左右，镜下观察，2孔细胞较纯，几乎都是上皮细胞，将2孔细胞消化下来，计数，再铺一个48孔板，继续培养7～10天左右。镜下观察，有3孔细胞都是上皮细胞。将3孔细胞继续培养，使之增殖到一定数量，取一部分细胞，分别进行SP免疫组化和免疫荧光鉴定。在倒置显微镜下观察传代细胞形态基本一致，贴壁铺展开后表现为多角形、短梭形或鹅卵石样，是典型的上皮细胞源性特征(正常大鼠和模型大鼠的培养结果分别见图1-2)。

实施例3

成年大鼠结肠上皮细胞的鉴定：

采用单克隆抗体cytokeratin-19(CK-19)分别进行SP免疫组化染色和免疫荧光鉴定大鼠结肠上皮细胞。

(1)SP免疫组化鉴定，具体步骤如下：

1)取实施例2制备获得的正常大鼠细胞和模型大鼠结肠上皮细胞分别制作细胞爬片，24h后进行免疫细胞组织化学染色鉴定。

2)PBS冲洗标本3次，各1min。

3)4％多聚甲醛固定15min。

4)PBS冲洗标本3次，各2min。

5)滴加3％BSA封闭液，室温孵育30min，甩去多余液体。

6)加3％H₂O₂，阻断内源性过氧化物酶，湿盒孵育10min。

7)PBS冲洗2～3次，每次5min。

8)滴加1:200一抗鼠源性单抗CK-19(Santa Cruz,sc-53003)，室温孵育2h(阴性对照不加一抗)。

9)PBS冲洗2～3次，每次5min。

10)滴加1:500辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗(羊抗鼠IgG多克隆抗体，为长岛公司广谱二抗)，室温孵育1h。

11)PBS冲洗2～3次，每次5min。

12)显色：DAB显色5～10min，在显微镜下掌握染色程度。

13)自来水冲洗10min终止反应。

14)复染：苏木精复染2min，盐酸酒精分化。

15)自来水冲洗10～15min。

16)脱水：75％酒精、85％酒精、95％酒精、100％酒精梯度脱水，各3min。

17)透明：二甲苯透明3min×2次。

18)中性树胶封片镜检。

每张爬片中随机选取3个区域，在高倍镜下计数每个视野下的阳性细胞数和细胞总数，汇总计算出百分率。CK-19阳性反应为细胞胞质染成黄褐色。正常大鼠细胞和模型大鼠结肠上皮细胞爬片中，均只有<5％的细胞染色阴性，主要是成纤维样细胞；>95％的细胞染色阳性，表明为上皮细胞源性(见图3-5)。

(2)免疫荧光鉴定，结肠上皮细胞质CK-19染色具体步骤如下：

1)在孔板中加入对应大小的细胞爬片。将正常大鼠细胞和模型大鼠结肠上皮细胞消化成单个细胞，分别接种到对应的孔板中，37℃，5％CO₂培养过夜。

2)取出培养皿，用PBS(pH7.4)洗2次，每次2ml。

3)加入4％多聚甲醛室温固定15min；PBS/0.05％Tween20，洗涤2次，每次5min。

4)封闭：5％BSA，室温封闭2h；吸去皿中的洗涤液，用镊子取出盖玻片(细胞爬片)，有细胞的一面朝上，放在吸水纸上；加一抗稀释液(1:200稀释的CK19一抗，种类同实施例3第一部分)；置湿盒内，4℃，过夜或室温孵育1h。

5)洗涤，PBS/0.05％Tween20，洗涤2次，每次5min；加二抗稀释液(1:500稀释的羊抗鼠FITC标记二抗，碧云天公司A0568)，37℃，1h；洗涤，PBS/0.05％Tween20，洗涤2次，每次5min。

6)取干净的载玻片一块，作上标记，滴一滴mounting solution(含DAPI)，约15～20μl；用镊子取出盖玻片，边缘搭在纸巾上吸去多余液体，细胞面朝下，贴在载玻片上，不要有气泡。

7)盖玻片的边缘四周刷上无色指甲油，待干；擦去盖玻片上表面析出的PBS盐份；避光保存在干燥的容器内。

8)荧光显微镜观察，在荧光显微镜下可以观察到，绝大多数细胞胞浆呈现出亮绿色荧光，为CK-19表达阳性的结肠上皮细胞，胞核呈现蓝色荧光(图6-11)(绿色荧光FITC波长488nm，蓝色荧光DAPI波长340nm)。其中，图8和图11分别为正常大鼠和模型大鼠结肠上皮细胞核染色和CK-19染色叠加示意图。

实施例4

成年大鼠结肠上皮细胞的活性(生长曲线)检测：

经过上述传代培养的正常大鼠与模型大鼠结肠上皮细胞通过CCK-8法检测细胞的生长曲线，具体步骤如下：

1)将处于对数生长期的正常组和模型组的细胞株(实施例2制备获得的正常大鼠细胞和模型大鼠结肠上皮细胞)，胰蛋白酶消化，稀释细胞使其浓度为1～5×10⁴个细胞/ml培养液，分别取100μl至96孔培养板，每种细胞每块板接种3个同样的孔作为复孔，1～5×10³个细胞/孔，以100μl培养液做空白对照，37℃培养过夜；

2)按1:10体积比混合Cell Counting Kit-8(CCK-8)和无血清必需基本培养基DMEM，混合液按每孔100μl加入待测孔中，37℃，5％CO₂孵育1h；

3)用微板分光光度计测定450nm波长吸光度，记录每块板的数值。

正常大鼠与模型大鼠结肠上皮细胞的生长曲线见图12。

实施例5

成年大鼠结肠上皮细胞的分离、纯化及原代培养：

1)首先，腹腔注射10％水合氯醛(5ml/kg)麻醉成年SD大鼠(分别包括正常大鼠和模型大鼠)，75％的酒精浸泡消毒15min后放入超净台内，无菌条件下打开大鼠腹腔，找到自肛门向近端5～10cm的大鼠结肠，将肠系膜组织剥离干净，完全游离出结肠，剪下后浸泡在含青、链霉素(青霉素的工作浓度为100U/ml，链霉素的工作浓度为0.1mg/ml)的无菌PBS中。

2)将结肠剪开，用含抗生素的无菌PBS漂洗5～10遍以去除结肠内容物。

3)用无菌眼科剪将组织剪碎至体积为1mm³左右，加入9ml 0.36％Ⅳ型胶原酶：透明质酸酶＝4.5:1的消化液中，置于37℃、5％CO₂培养箱消化2.5h左右，边消化边震荡摇匀以便消化更充分，一般间隔15～20min震荡一次。

4)消化完毕，小心转移上清至离心管中，1000rpm，离心10min，弃上清，沉淀主要成分为肠上皮细胞团块和未消化的组织小块，用含10％胎牛血清(GIBCO胎牛血清)的DMEM重悬细胞，接种于培养皿中，37℃、5％CO₂培养箱中培养。16h后换液，洗去残留未消化的组织块，继续培养。

5)倒置显微镜镜下观察，细胞不多，有纤维细胞。继续培养3～5天后，镜下可见较多成纤维细胞，结肠上皮细胞较少。换液后继续培养。

6)大鼠结肠上皮细胞的纯化：细胞经培养5～7天后，倒置显微镜下观察上皮细胞生长情况，其长至瓶底的90％时，胰酶消化，选用培养板进行传代培养。

成年大鼠结肠上皮细胞的传代培养：

经过上述步骤进行原代培养的大鼠结肠上皮细胞(分别包括正常大鼠和模型大鼠)，从5％CO₂培养箱中取出细胞培养皿，在倒置显微镜下观察细胞铺满培养皿的90％便可进行传代培养。按照如下步骤进行传代培养，进一步纯化结肠上皮细胞，具体步骤如下：将细胞用0.25％胰酶消化，离心，完全培养基(DMEM+10％胎牛血清)重悬，计数。取1×10³/ml细胞，铺48孔板，继续培养7天左右。镜下观察，有3～5孔细胞几乎没有成纤维细胞，大部分是上皮细胞，将这3～5孔细胞消化传代，一般7天左右扩到12孔板，继续培养7天左右，镜下观察，2孔细胞较纯，几乎都是上皮细胞，将2孔细胞消化下来，计数，再铺一个48孔板，继续培养7～10天左右。镜下观察，有4孔细胞都是上皮细胞。将4孔细胞继续培养，使之增殖到一定数量，取一部分细胞，分别进行SP免疫组化和免疫荧光鉴定，实验结果与实施例1所得细胞相近，在倒置显微镜下观察传代细胞形态与实施例1培养所得细胞基本一致。

实施例6

成年大鼠结肠上皮细胞的分离、纯化及原代培养：

1)首先，腹腔注射10％水合氯醛(5ml/kg)麻醉成年SD大鼠(分别包括正常大鼠和模型大鼠)，75％的酒精浸泡消毒15min后放入超净台内，无菌条件下打开大鼠腹腔，找到自肛门向近端5～10cm的大鼠结肠，将肠系膜组织剥离干净，完全游离出结肠，剪下后浸泡在含青、链霉素(青霉素的工作浓度为100U/ml，链霉素的工作浓度为0.1mg/ml)的无菌PBS中。

2)将结肠剪开，用含抗生素的无菌PBS漂洗5～10遍以去除结肠内容物。

3)用无菌眼科剪将组织剪碎至体积为1mm³左右，加入6ml 0.44％Ⅳ型胶原酶：透明质酸酶＝5.5:1的消化液中，置于37℃、5％CO₂培养箱消化1.5h左右，边消化边震荡摇匀以便消化更充分，一般间隔15～20min震荡一次。

4)消化完毕，小心转移上清至离心管中，1000rpm，离心10min，弃上清，沉淀主要成分为肠上皮细胞团块和未消化的组织小块，用含10％胎牛血清(GIBCO胎牛血清)的DMEM重悬细胞，接种于培养皿中，37℃、5％CO₂培养箱中培养。32h后换液，洗去残留未消化的组织块，继续培养。

5)倒置显微镜镜下观察，细胞不多，有纤维细胞。继续培养3～5天后，镜下可见较多成纤维细胞，结肠上皮细胞较少。换液后继续培养。

6)大鼠结肠上皮细胞的纯化：细胞经培养5～7天后，倒置显微镜下观察上皮细胞生长情况，其长至瓶底的90％时，胰酶消化，选用培养板进行传代培养。

成年大鼠结肠上皮细胞的传代培养：

经过上述步骤进行原代培养的大鼠结肠上皮细胞(分别包括正常大鼠和模型大鼠)，从5％CO₂培养箱中取出细胞培养皿，在倒置显微镜下观察细胞铺满培养皿的90％便可进行传代培养。按照如下步骤进行传代培养，进一步纯化结肠上皮细胞，具体步骤如下：将细胞用0.25％胰酶消化，离心，完全培养基(DMEM+10％胎牛血清)重悬，计数。取1×10³/ml细胞，铺48孔板，继续培养7天左右。镜下观察，有3～5孔细胞几乎没有成纤维细胞，大部分是上皮细胞，将这3～5孔细胞消化传代，一般7天左右扩到12孔板，继续培养7天左右，镜下观察，2孔细胞较纯，几乎都是上皮细胞，将2孔细胞消化下来，计数，再铺一个48孔板，继续培养7～10天左右。镜下观察，有3孔细胞都是上皮细胞。将3孔细胞继续培养，使之增殖到一定数量，取一部分细胞，分别进行SP免疫组化和免疫荧光鉴定，实验结果与实施例1所得细胞相近，在倒置显微镜下观察传代细胞形态与实施例1培养所得细胞基本一致。

综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (9)

1.一种稳定的哺乳动物结肠上皮细胞培养方法，包括如下步骤：

1)将结肠组织剪碎，并加入消化液中进行消化，所述消化液为IV型胶原酶和透明质酸酶的水溶液，所述消化液中的溶质由IV型胶原酶和透明质酸酶组成，消化液中IV型胶原酶和透明质酸酶的重量比为4.5～5.5:1，消化液中IV型胶原酶和透明质酸酶的总浓度为0.36～0.44wt％；

2)将上清转移至离心管离心，离心后弃去上清，并使用完全培养基重悬细胞，并将细胞接种培养；

3)培养至瓶底细胞覆盖率≥70％时消化、离心，并重悬于完全培养基中，传代培养后，即得结肠上皮细胞；

所述哺乳动物为成年大鼠；

所述步骤1)中，消化时间为1.5～2.5h。

2.如权利要求1所述的结肠上皮细胞培养方法，其特征在于，所述大鼠为疾病成年大鼠。

3.如权利要求1所述的结肠上皮细胞培养方法，其特征在于，所述步骤1)中的消化的具体条件为：每1mm³结肠组织使用6～9ml消化液，消化过程中对消化体系震荡摇匀。

4.如权利要求1所述的结肠上皮细胞培养方法，其特征在于，所述步骤2)、3)中，所述完全培养基包括基础培养基和血清，所述基础培养基为DMEM，所述血清为胎牛血清。

5.如权利要求1所述的结肠上皮细胞培养方法，其特征在于，所述步骤3)中，培养至瓶底细胞覆盖率≥70％的过程中，需换液、洗去残留未消化的组织块；

所述消化为胰酶消化。

6.如权利要求5所述的结肠上皮细胞培养方法，其特征在于，培养至瓶底细胞覆盖率≥90％时消化、离心。

7.如权利要求5所述的结肠上皮细胞培养方法，其特征在于，所述培养的具体条件为：37℃、5％CO₂，培养体系的体积为6～8ml；

培养18～32h后换液，洗去残留未消化的组织块，继续培养3～5天后换液，换液后继续培养，至瓶底细胞覆盖率≥70％时胰酶消化。

8.如权利要求1所述的结肠上皮细胞培养方法，其特征在于，所述步骤3)中，所述传代培养具体包括如下步骤：

A)计数后将细胞铺板，培养7～10天；

B)观察各孔细胞，选取上皮细胞纯度较高的孔中的细胞消化、离心，并重悬于完全培养基中；

重复步骤A)和B)，至上皮细胞纯度达到目标纯度。

9.如权利要求8所述的结肠上皮细胞培养方法，其特征在于，所述步骤A)中的培养的具体条件为：37℃、5％CO₂，培养体系的体积为6～8ml；

所述步骤B)中，消化为胰酶消化；

重复步骤A)和B)，至培养孔中上皮细胞纯度≥90％。

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