KR102392423B1 - Wnt 조성물 및 정제 방법 - Google Patents

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Abstract

본원은 리포솜 Wnt 폴리펩티드, 예를 들어 리포솜 Wnt3a 폴리펩티드, 리포솜 Wnt5a 폴리펩티드, 또는 리포솜 Wnt10b 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 이용하여, 골 결손 부위에 사용하기 위한 골 이식재를 생성하기 위한 방법, 공정, 조성물, 및 키트를 개시한다. 또한, 본원은 리포솜 Wnt 폴리펩티드, 예를 들어 리포솜 Wnt3a 폴리펩티드, 리포솜 Wnt5a 폴리펩티드, 또는 리포솜 Wnt10b 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 이용하여, 포유동물 골수 세포를 증강시키기 위한 방법, 공정, 조성물, 및 키트를 개시한다.

Description

WNT 조성물 및 정제 방법{WNT COMPOSITIONS AND METHODS FOR PURIFICATION}
Wnt 단백질은 프리즐드(Frizzled) 및 저밀도 지질단백질 수용체 관련 단백질(LRP: low-dnesity lipoprotein receptor related protein)에 의해 코딩되는 세포 표면 수용체에 결합하는 높은 보존성을 갖는 분비되는 신호전달 분자 패밀리를 형성한다. WNT 유전자 패밀리는 분비되는 신호전달 단백질을 코딩하는 구조적으로 연관된 유전자로 이루어진다. 이들 단백질은 종양발생, 및 배아 발생 과정에서 세포 운명의 조절 및 형태화(patterning)를 포함한 여러 발생 과정에 관련되어 있다. 리간드가 결합되면 연속된 세포 내 현상을 개시하고 최종적으로 β-카테닌 및 DNA 결합 단백질 TCF의 핵 내 활성을 통해 표적 유전자의 전사를 일으킨다(Clevers H, 2004 Wnt Signaling: Ig-norrin the dogma. Curr Biol 14: R436-R437; Nelson & Nusse 2004 Convergence of Wnt, beta-cateine, and cadherin pathways. Science 303: 1483-1487; Gordon & Nusse 2006 Wnt Signaling: Multiple pathways, multiple receptors, and multiple transcription factors. J Biol Chern 281: 22429-22433).
Wnt 단백질은 또한 골 형성 과정과 연관된 매우 다양한 세포 결정에 관여한다. 예를 들어, Wnt 단백질은 중간엽 전구 세포에 골격발생 운명을 결정하는데 영향을 주는 sox9의 발현 수준을 조절한다. Wnt 단백질은 세포를 조골세포 또는 연골세포로 분화시키는데 영향을 준다. 성숙한 동물에서, Wnt 신호전달이 골 질량을 조절한다는 증거가 있다. 예를 들어, 인간 Wnt 공-수용체 LRP5에서 돌연변이는 제1형 골다공증, 및 내골 과골증 또는 상염색체 우성 골경화증을 포함하는 여러 고골량 증후군뿐 아니라, 저골량 질환, 골다공증-가신경교종과 연관된다. Wnt 억제제 Dkkl의 생산 증가는 그의 특징적인 특성 중 하나로서 골재흡수가 증가되는 질환인 다발성 골수종과 연관된다. 더 자세한 내용은 문헌(S. Minear et al., Wnt proteins promote bone regeneration. Sci . Transl . Med . 2, 29ra30 (2010); and Zhao et al., Controlling the in vivo activity of Wnt liposomes, Methods Enzyrnol 465: 331-47 (2009))을 참조한다.
어떤 실시양태에서, 기능적으로 활성인 Wnt3a 폴리펩티드, 및 리포솜을 포함하는 수용액을 포함하는 조성물로서, 상기 기능적으로 활성인 Wnt3a 폴리펩티드가 서열 번호 1에 개시된 아미노산 잔기 209에 해당하는 아미노산 위치에서 지질 변형을 포함하는 것인 조성물을 본원에서 개시한다. 일부 실시양태에서, 기능적으로 활성인 Wnt3a 폴리펩티드는 서열 번호 1에 개시된 아미노산 잔기 77에 해당하는 아미노산 위치에서 지질 변형되지 않는다. 일부 실시양태에서, 기능적으로 활성인 Wnt3a 폴리펩티드는 리포솜 막으로 통합된다. 일부 실시양태에서, 기능적으로 활성인 Wnt3a 폴리펩티드는 리포솜 막으로부터 지질 막의 외부 표면 위로 돌출된다. 일부 실시양태에서, 기능적으로 활성인 Wnt3a 폴리펩티드는 리포솜의 수성 코어로 편입되지 않는다. 일부 실시양태에서, 기능적으로 활성인 Wnt3a 폴리펩티드는 서열 번호 1에 개시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 또는 약 95% 서열 동일성을 포함한다. 일부 실시양태에서, 기능적으로 활성인 Wnt3a 폴리펩티드는 서열 번호 1에 개시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 기능적으로 활성인 Wnt3a 폴리펩티드의 농도는 약 5 ㎍/㎕ 내지 약 15 ㎍/㎕, 또는 약 8 ㎍/㎕ 내지 약 12 ㎍/㎕이다. 일부 실시양태에서, 리포솜을 구성하는 인지질은 약 12개 내지 약 14개 탄소의 테일(tail) 탄소 길이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 리포솜을 구성하는 인지질은 약 10℃ 내지 약 25℃, 약 15℃ 내지 약 25℃, 또는 약 20℃ 내지 약 25℃의 상전이온도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 리포솜은 pH 약 6.5 내지 약 8.0, 약 7.0 내지 약 7.8, 또는 약 7.2 내지 약 7.6에서 순전하 0을 갖는다. 일부 실시양태에서, 인지질은 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DMPC)이다. 일부 실시양태에서, 리포솜은 콜레스테롤을 더 포함한다. 일부 실시양태에서, DMPC와 콜레스테롤의 농도는 약 70:30 내지 약 100:0의 비로 정해진다. 일부 실시양태에서, Wnt3a 폴리펩티드는 포유동물 Wnt3a 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 포유동물은 인간이다. 일부 실시양태에서, 지질 변형은 팔미토일화이다. 일부 실시양태에서, Wnt3a 폴리펩티드는 추가로 글리코실화된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 안정한 조성물이다. 일부 실시양태에서, 조성물은 활성의 실질적인 손실 없이 약 106일까지 안정하다. 일부 실시양태에서, 조성물은 약 1℃ 내지 약 8℃의 온도에서 안정하다. 일부 실시양태에서, 조성물은 질소 하에서 안정하다.
어떤 실시양태에서, 기능적으로 활성인 포유동물 Wnt 폴리펩티드, 및 리포솜을 포함하는 수용액을 포함하는 조성물로서, 리포솜을 구성하는 인지질이 약 10℃ 내지 약 25℃의 상전이온도를 갖는 것인 조성물을 본원에서 개시한다. 또한, 어떤 실시양태에서, 기능적으로 활성인 포유동물 Wnt 폴리펩티드, 및 리포솜을 포함하는 수용액을 포함하는 조성물로서, 리포솜을 구성하는 인지질이 약 12개 내지 약 14개 탄소의 테일 탄소 길이를 갖는 것인 조성물을 본원에서 개시한다. 일부 실시양태에서, Wnt 폴리펩티드는 리포솜 막으로 통합된다. 일부 실시양태에서, Wnt 폴리펩티드는 리포솜 막으로부터 지질 막의 외부 표면 위로 돌출된다. 일부 실시양태에서, Wnt 폴리펩티드는 리포솜의 수성 코어로 편입되지 않는다. 일부 실시양태에서, Wnt 폴리펩티드는 Wnt3a 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, Wnt3a 폴리펩티드는 서열 번호 1에 개시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 또는 약 95% 서열 동일성을 포함한다. 일부 실시양태에서, Wnt3a 폴리펩티드는 서열 번호 1에 개시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, Wnt3a 폴리펩티드는 서열 번호 1에 개시된 아미노산 잔기 209에 해당하는 아미노산 위치에서 지질 변형되고 서열 번호 1에 개시된 아미노산 잔기 77에 해당하는 아미노산 위치에서 지질 변형되지 않는다. 일부 실시양태에서, Wnt 폴리펩티드는 Wnt5a 폴리펩티드 또는 Wnt10b 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, Wnt 폴리펩티드의 농도는 약 5 ㎍/㎕ 내지 약 15 ㎍/㎕, 또는 약 8 ㎍/㎕ 내지 약 12 ㎍/㎕이다. 일부 실시양태에서, 리포솜은 pH 약 6.5 내지 약 8.0에서 순전하 0을 갖는다. 일부 실시양태에서, 리포솜은 pH 약 6.5 내지 약 8.0에서 순 양전하 또는 순 음전하를 갖는다. 일부 실시양태에서, 인지질은 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DMPC)이다. 일부 실시양태에서, 리포솜은 콜레스테롤을 더 포함한다. 일부 실시양태에서, DMPC와 콜레스테롤의 농도는 약 70:30 내지 약 100:0의 비로 정해진다. 일부 실시양태에서, 포유동물은 인간이다. 일부 실시양태에서, 지질 변형은 팔미토일화이다. 일부 실시양태에서, Wnt 폴리펩티드는 추가로 글리코실화된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 안정한 조성물이다. 일부 실시양태에서, 조성물은 활성의 실질적인 손실 없이 약 106일까지 안정하다. 일부 실시양태에서, 조성물은 약 1℃ 내지 약 8℃의 온도에서 안정하다. 일부 실시양태에서, 조성물은 질소 하에서 안정하다.
어떤 실시양태에서, 리포솜 Wnt3a 폴리펩티드의 제조 방법으로서, (a) 포유동물 세포를 포함하는 조정 배지(conditioned media)로부터 Wnt3a 폴리펩티드를 회수하는 단계, (b) 설폰화된 다환 방향족 화합물로 고정화된 이온 교환 컬럼에 Wnt3a 폴리펩티드를 도입하는 단계, (c) 단계 구배를 이용하여 이온 교환 컬럼으로부터 Wnt3a 폴리펩티드를 용리하는 단계, 및 (d) 단계 (c)로부터의 Wnt3a 폴리펩티드를 리포솜의 수용액과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 본원에서 개시한다. 일부 실시양태에서, 접촉은 약 21℃ 내지 약 25℃의 온도에서 일어난다. 일부 실시양태에서, 접촉 시간은 약 30분 내지 약 24시간이다. 일부 실시양태에서, 단계 구배는 제1 구배 및 제2 구배를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 구배는 50mM 염화칼륨을 포함하는 완충액을 포함하고, 제2 구배는 약 150mM 염화칼륨 내지 약 1.5M 염화칼륨을 포함하는 완충액을 포함한다. 일부 실시양태에서, 완충액은 계면활성제를 더 포함한다. 일부 실시양태에서, 계면활성제는 CHAPS 또는 트리톤(Triton) X-100이다. 일부 실시양태에서, 조정 배지는 10% 소 태아 혈청을 10%까지 포함한다. 일부 실시양태에서, 포유동물 세포는 중국 햄스터 난소(CHO: Chinese hamster ovary) 세포이다. 일부 실시양태에서, 단계 (c) 후에 Wnt3a 폴리펩티드의 수율은 약 60% 내지 약 90%이다. 일부 실시양태에서, 리포솜을 구성하는 인지질은 약 12개 내지 약 14개 탄소의 테일 탄소 길이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 리포솜을 구성하는 인지질은 약 10℃ 내지 약 25℃, 약 15℃ 내지 약 25℃, 또는 약 20℃ 내지 약 25℃의 상전이온도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 리포솜은 pH 약 6.5 내지 약 8.0, 약 7.0 내지 약 7.8, 또는 약 7.2 내지 약 7.6에서 순전하 0을 갖는다. 일부 실시양태에서, 인지질은 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DMPC)이다. 일부 실시양태에서, 리포솜은 콜레스테롤을 더 포함한다. 일부 실시양태에서, DMPC와 콜레스테롤의 농도는 약 70:30 내지 약 100:0의 비로 정해진다. 일부 실시양태에서, Wnt3a 폴리펩티드는 서열 번호 1에 개시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 또는 약 95% 서열 동일성을 포함한다. 일부 실시양태에서, Wnt3a 폴리펩티드는 서열 번호 1에 개시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, Wnt3a 폴리펩티드는 서열 번호 1에 개시된 아미노산 잔기 209에 해당하는 아미노산 위치에서 지질 변형되고, 서열 번호 1에 개시된 아미노산 잔기 77에 해당하는 아미노산 위치에서 지질 변형되지 않는다. 일부 실시양태에서, Wnt3a 폴리펩티드는 포유동물 Wnt3a 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 포유동물은 인간이다. 일부 실시양태에서, 조정 배지는 혈청 또는 혈청 대용물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조정 배지는 혈청을 포함한다. 일부 실시양태에서, 혈청은 소 태아 혈청이다. 일부 실시양태에서, 혈청 농도는 조정 배지 중 약 0.1% 내지 약 15%이다. 일부 실시양태에서, 조정 배지는 혈청 대용물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 혈청 대용물은 지질에 기초한 대용물이다. 일부 실시양태에서, 조정 배지는 무혈청 배지이다. 일부 실시양태에서, 지질 변형은 팔미토일화이다. 일부 실시양태에서, Wnt3a 폴리펩티드는 추가로 글리코실화된다. 일부 실시양태에서, Wnt3a 생성물은 원심분리에 의해 샘플 혼합물로부터 분리된다. 일부 실시양태에서, 원심분리 시간은 약 1℃ 내지 약 8℃의 온도에서 1시간까지이다. 일부 실시양태에서, 원심분리후 Wnt3a 생성물은 멸균 1X 인산 완충 식염수(PBS: phosphate buffered saline)에 재현탁된다. 일부 실시양태에서, Wnt3a 생성물은 질소 하에 안정하다. 일부 실시양태에서, Wn3a 생성물은 약 1℃ 내지 약 8℃의 온도에서 안정하다.
어떤 실시양태에서, 리포솜 Wnt 폴리펩티드의 제조 방법으로서, Wnt 폴리펩티드를 포함하는 샘플을 리포솜의 수용액에 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 리포솜을 구성하는 인지질이 약 10℃ 내지 약 25℃의 상전이온도를 갖는 것인 방법을 본원에서 개시한다. 또한, 어떤 실시양태에서, 리포솜 Wnt 폴리펩티드의 제조 방법으로서, Wnt 폴리펩티드를 포함하는 샘플을 리포솜 수용액에 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 리포솜을 구성하는 인지질이 약 12개 내지 약 14개 탄소의 테일 탄소 길이를 갖는 것인 방법을 본원에서 개시한다. 일부 실시양태에서, 접촉은 약 21℃ 내지 약 25℃의 온도에서 일어난다. 일부 실시양태에서, 접촉 시간은 약 6시간 내지 약 24시간이다. 일부 실시양태에서, 방법은 Wnt 폴리펩티드를 리포솜 수용액에 접촉시키는 단계 전에 추가의 정제 단계를 더 포함한다. 일부 실시양태에서, 추가의 정제 단계는 이온 교환 정제 단계, 소수성 정제 단계, 또는 친화성 정제 단계이다. 일부 실시양태에서, 추가의 정제 단계는 이온 교환 정제 단계이다. 일부 실시양태에서, 이온 교환 정제 단계는 샘플을 설폰화된 다환 방향족 화합물로 고정화된 비드 또는 설폰화된 다환 방향족 화합물로 고정화된 컬럼과 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이온 교환 정제 단계는 단계 구배를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이온 교환 정제 완충액은 계면활성제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 계면활성제는 CHAPS 또는 트리톤 X-100이다. 일부 실시양태에서, 추가의 정제 단계는 소수성 정제 단계이다. 일부 실시양태에서, 소수성 정제 단계는 단백질 A 고정화된 비드, 또는 단백질 A 컬럼을 포함한다. 일부 실시양태에서, 추가의 정제 단계 후 Wnt 폴리펩티드의 수율은 약 60% 내지 약 99%이다. 일부 실시양태에서, 방법은 발현 세포주에서 유래된 세포를 포함하는 조정 배지로부터 Wnt 폴리펩티드를 회수하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시양태에서, 발현 세포주는 포유동물 발현 세포주이다. 일부 실시양태에서, 포유동물 발현 세포주는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포주이다. 일부 실시양태에서, 조정 배지는 혈청 또는 혈청 대용물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 혈청은 소 태아 혈청이다. 일부 실시양태에서, 혈청 농도는 조정 배지 중 약 0.1% 내지 약 15%이다. 일부 실시양태에서, 조정 배지는 혈청 대용물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 혈청 대용물은 지질에 기초한 대용물이다. 일부 실시양태에서, 조정 배지는 무혈청 배지이다. 일부 실시양태에서, Wnt 폴리펩티드는 Wnt3a 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, Wnt3a 폴리펩티드는 서열 번호 1에 개시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 또는 약 95% 서열 동일성을 포함한다. 일부 실시양태에서, Wnt3a 폴리펩티드는 서열 번호 1에 개시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, Wnt3a 폴리펩티드는 서열 번호 1에 개시된 아미노산 잔기 209에 해당하는 아미노산 위치에서 지질 변형되고 서열 번호 1에 개시된 아미노산 잔기 77에 해당하는 아미노산 위치에서 지질 변형되지 않는다. 일부 실시양태에서, Wnt 폴리펩티드는 Wnt5a 폴리펩티드 또는 Wnt10b 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 리포솜은 pH 약 6.5 내지 약 8.0, 약 7.0 내지 약 7.8, 또는 약 7.2 내지 약 7.6에서 순전하 0을 갖는다. 일부 실시양태에서, 인지질은 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DMPC)이다. 일부 실시양태에서, 리포솜은 콜레스테롤을 더 포함한다. 일부 실시양태에서, DMPC와 콜레스테롤의 농도는 약 70:30 내지 약 100:0의 비로 정해진다. 일부 실시양태에서, Wnt 폴리펩티드는 포유동물 Wnt 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 포유동물은 인간이다. 일부 실시양태에서, 지질 변형은 팔미토일화이다. 일부 실시양태에서, Wnt 폴리펩티드는 추가로 글리코실화된다. 일부 실시양태에서, Wnt 생성물은 원심분리에 의해 샘플 혼합물로부터 분리된다. 일부 실시양태에서, 원심분리 시간은 약 1℃ 내지 약 8℃의 온도에서 1시간까지이다. 일부 실시양태에서, 원심분리 후 Wnt 생성물은 멸균 1X PBS에 재현탁된다. 일부 실시양태에서, Wnt 생성물은 질소 하에서 안정하다. 일부 실시양태에서, Wnt 생성물은 약 1℃ 내지 약 8℃의 온도에서 안정하다.
어떤 실시양태에서, 단리된 증강된 포유동물 골수 세포 조성물로서, 상기 세포는, 리포솜 Wnt 폴리펩티드로 처리 후, 런엑스2(Runx2), 오스테릭스(Osterix), 오스테오칼신(Osteocalcin), 오스테오폰틴(Osteopontin), 알칼리 포스파타제, 제1형 콜라겐, 엑신2(Axin2), Lef1, 및 Tcf4로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이오마커 중 하나 이상의 증강된 발현 수준을 갖는 것인 조성물을 본원에서 개시한다. 일부 실시양태에서, 포유동물 골수 세포는 설치류 골수 세포이다. 일부 실시양태에서, 설치류 골수 세포는 10월령 초과의 설치류로부터 채취된다. 일부 실시양태에서, 포유동물 골수 세포는 인간 골수 세포이다. 일부 실시양태에서, 인간 골수 세포는 35세 이상의 피험체로부터 얻는다. 일부 실시양태에서, 바이오마커는 오스테오칼신, 오스테오폰틴, 엑신2, Lef1, 및 Tcf4로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 바이오마커는 오스테오칼신 및 오스테오폰틴으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 증강된 발현 수준은 미처리된 포유동물 골수 세포와 비교된다. 일부 실시양태에서, 증강된 발현 수준은 미처리된 포유동물 골수 세포와 비교하여 약 2% 내지 약 20% 또는 약 4% 내지 약 10%이다. 일부 실시양태에서, 포유동물 골수 세포는 또한 리포솜 Wnt 폴리펩티드로 처리 후 SOX9 및 PPARγ로부터 선택되는 바이오마커의 발현 수준이 감소되었다. 일부 실시양태에서, 포유동물 골수 세포에서 감소된 발현 수준은 미처리된 포유동물 골수 세포와 비교된다. 일부 실시양태에서, 골수 세포는 또한 미처리된 포유동물 골수 세포와 비교하여 아폽토시스 수준의 감소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 아폽토시스 수준의 감소는 약 50%이다. 일부 실시양태에서, 포유동물 골수 세포는 미처리된 포유동물 골수 세포와 비교하여 증강된 골형성능을 포함한다. 일부 실시양태에서, 증강된 골형성능은 처리된 포유동물 골수 세포를 이식한 후 골 결손 부위에서 신생 골 성장 수준을 포함한다. 일부 실시양태에서, 신생 골 성장 수준은 미처리되어 이식된 포유동물 골수 세포의 신생 골 성장 수준과 비교된다. 일부 실시양태에서, 처리되어 이식된 포유동물 골수 세포의 신생 골 성장 수준은 미처리되어 이식된 포유동물 골수 세포의 신생 골 성장 수준과 비교하여 약 1% 내지 약 20% 또는 약 5% 내지 약 12%이다. 일부 실시양태에서, 포유동물 골수 세포는 부착성 및 비부착성 골수 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 포유동물 골수 세포는 부착성 골수 세포이다. 일부 실시양태에서, 부착성 골수 세포는 골수 줄기 세포 및 골수 전구 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 부착성 골수 세포는 골수 기질 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 포유동물 골수 세포는 자가 유래 골수 세포이다. 일부 실시양태에서, 자가 유래 골수 세포는 부착성 및 비부착성 골수 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 자가 유래 골수 세포는 부착성 골수 세포이다. 일부 실시양태에서, 자가 유래 골수 세포는 골수 줄기 세포 및 골수 전구 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 자가 유래 골수 세포는 골수 기질 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 포유동물 골수 세포는 동종이계 골수 세포이다. 일부 실시양태에서, 동종이계 골수 세포는 부착성 및 비부착성 골수 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 동종이계 골수 세포는 부착성 골수 세포이다. 일부 실시양태에서, 동종이계 골수 세포는 골수 줄기 세포 및 골수 전구 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 동종이계 골수 세포는 골수 기질 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 리포솜 Wnt 폴리펩티드 처리 후 인간 골수 세포는 35세 미만의 인간 피험체에서 관찰된 바이오마커의 발현 수준을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 리포솜 Wnt 폴리펩티드는 Wnt 폴리펩티드 및 리포솜 수용액을 포함한다. 일부 실시양태에서, 리포솜을 구성하는 인지질은 약 10℃ 내지 약 25℃의 상전이온도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 리포솜을 구성하는 인지질은 약 12개 내지 약 14개 탄소의 테일 탄소 길이를 갖는다. 일부 실시양태에서, Wnt 폴리펩티드는 Wnt3a 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, Wnt3a 폴리펩티드는 서열 번호 1에 개시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 또는 약 95% 서열 동일성을 포함한다. 일부 실시양태에서, Wnt3a 폴리펩티드는 서열 번호 1에 개시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, Wnt3a 폴리펩티드는 서열 번호 1에 개시된 아미노산 잔기 209에 해당하는 아미노산 위치에서 지질 변형되고, 서열 번호 1에 개시된 아미노산 잔기 77에 해당하는 아미노산 위치에서 지질 변형되지 않는다. 일부 실시양태에서, Wnt 폴리펩티드는 Wnt5a 폴리펩티드 또는 Wnt10b 폴리펩티드이다.
어떤 실시양태에서, 35세 이상의 인간 피험체로부터 얻은 포유동물 골수 세포 조성물로서, 상기 포유동물 골수 세포가 리포솜 Wnt 폴리펩티드로 처리 후, 런엑스2, 오스테릭스, 오스테오칼신, 오스테오폰틴, 알칼리 포스파타제, 제1형 콜라겐, 엑신2, Lef1, 및 Tcf4로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이오마커 중 하나 이상의 증강된 발현 수준을 나타내는 것인 조성물을 본원에서 개시한다. 일부 실시양태에서, 바이오마커는 오스테오칼신, 오스테오폰틴, 엑신2, Lef1, 및 Tcf4로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 바이오마커는 오스테오칼신 및 오스테오폰틴으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 증강된 발현 수준은 미처리된 포유동물 골수 세포와 비교된다. 일부 실시양태에서, 증강된 발현 수준은 미처리된 포유동물 골수 세포와 비교하여 약 2% 내지 약 20% 또는 약 4% 내지 약 10%이다. 일부 실시양태에서, 포유동물 골수 세포는 또한 리포솜 Wnt 폴리펩티드로 처리 후 SOX9 및 PPARγ로부터 선택되는 바이오마커의 발현 수준이 감소되었다. 일부 실시양태에서, 포유동물 골수 세포의 감소된 발현 수준은 미처리된 포유동물 골수 세포와 비교된다. 일부 실시양태에서, 골수 세포는 또한 미처리된 포유동물 골수 세포와 비교하여 아폽토시스 수준의 감소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 아폽토시스 수준의 감소는 약 50%이다. 일부 실시양태에서, 포유동물 골수 세포는 미처리된 포유동물 골수 세포와 비교하여 증강된 골형성능을 포함한다. 일부 실시양태에서, 증강된 골형성능은 처리된 포유동물 골수 세포를 이식한 후 골 결손 부위에서 신생 골 성장 수준을 포함한다. 일부 실시양태에서, 신생 골 성장 수준은 미처리되어 이식된 포유동물 골수 세포의 신생 골 성장 수준과 비교된다. 일부 실시양태에서, 처리되어 이식된 포유동물 골수 세포의 신생 골 성장 수준은 미처리되어 이식된 포유동물 골수 세포의 신생 골 성장 수준과 비교하여 약 1% 내지 약 20% 또는 약 5% 내지 약 12%이다. 일부 실시양태에서, 포유동물 골수 세포는 부착성 및 비부착성 골수 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 포유동물 골수 세포는 부착성 골수 세포이다. 일부 실시양태에서, 부착성 골수 세포는 골수 줄기 세포 및 골수 전구 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 부착성 골수 세포는 골수 기질 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 포유동물 골수 세포는 자가 유래 골수 세포이다. 일부 실시양태에서, 자가 유래 골수 세포는 부착성 및 비부착성 골수 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 자가 유래 골수 세포는 부착성 골수 세포이다. 일부 실시양태에서, 자가 유래 골수 세포는 골수 줄기 세포 및 골수 전구 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 자가 유래 골수 세포는 골수 기질 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 포유동물 골수 세포는 동종이계 골수 세포이다. 일부 실시양태에서, 동종이계 골수 세포는 부착성 및 비부착성 골수 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 동종이계 골수 세포는 부착성 골수 세포이다. 일부 실시양태에서, 동종이계 골수 세포는 골수 줄기 세포 및 골수 전구 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 동종이계 골수 세포는 골수 기질 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 리포솜 Wnt 폴리펩티드로 처리 후 인간 골수 세포는 35세 미만의 인간 피험체에서 관찰되는 바이오마커의 발현 수준을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 리포솜 Wnt 폴리펩티드는 Wnt 폴리펩티드 및 리포솜 수용액을 포함한다. 일부 실시양태에서, 리포솜을 구성하는 인지질은 약 10℃ 내지 약 25℃의 상전이온도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 리포솜을 구성하는 인지질은 약 12개 내지 약 14개 탄소의 테일 탄소 길이를 갖는다. 일부 실시양태에서, Wnt 폴리펩티드는 Wnt3a 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, Wnt3a 폴리펩티드는 서열 번호 1에 개시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 또는 약 95% 서열 동일성을 포함한다. 일부 실시양태에서, Wnt3a 폴리펩티드는 서열 번호 1에 개시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, Wnt3a 폴리펩티드는 서열 번호 1에 개시된 아미노산 잔기 209에 해당하는 아미노산 위치에서 지질 변형되고, 서열 번호 1에 개시된 아미노산 잔기 77에 해당하는 아미노산 위치에서 지질 변형되지 않는다. 일부 실시양태에서, Wnt 폴리펩티드는 Wnt5a 폴리펩티드 또는 Wnt10b 폴리펩티드이다.
어떤 실시양태에서, 단리된 포유동물 골수 세포를 리포솜 Wnt 폴리펩티드와 생체 외에서 접촉시키는 단계를 포함하는 공정에 의해 생산되는 포유동물 골수 조성물로서, 상기 접촉 시간이 약 30분 내지 약 4시간인 것인 조성물을 본원에서 개시한다. 일부 실시양태에서, 접촉 온도는 약 0℃ 내지 약 37℃, 또는 약 20℃ 내지 약 25℃이다. 일부 실시양태에서, 공정은 유리 리포솜 Wnt 폴리펩티드를 제거하기 위하여 접촉단계 후에 세척 단계를 더 포함한다. 일부 실시양태에서, 공정은 리포솜 Wnt 폴리펩티드를 골 결손 부위에 이식하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시양태에서, 골수 세포는 미처리된 포유동물 골수 세포와 비교하여 런엑스2, 오스테릭스, 오스테오칼신, 오스테오폰틴, 알칼리 포스파타제, 제1형 콜라겐, 엑신2, Lef1, 및 Tcf4로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이오마커 중 하나 이상의 발현 수준이 증강되었다. 일부 실시양태에서, 바이오마커는 오스테오칼신, 오스테오폰틴, 엑신2, Lef1, 및 Tcf4로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 바이오마커는 오스테오칼신 및 오스테오폰틴으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 증강된 발현 수준은 미처리된 포유동물 골수 세포와 비교하여 약 2% 내지 약 20% 또는 약 4% 내지 약 10%이다. 일부 실시양태에서, 포유동물 골수 세포는 또한 리포솜 Wnt 폴리펩티드로 처리 후 SOX9 및 PPARγ로부터 선택되는 바이오마커의 발현 수준이 감소되었다. 일부 실시양태에서, 포유동물 골수 세포에서 감소된 발현 수준은 미처리된 포유동물 골수 세포와 비교된다. 일부 실시양태에서, 골수 세포는 또한 미처리된 포유동물 골수 세포와 비교하여 아폽토시스 수준의 감소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 아폽토시스 수준의 감소는 약 50%이다. 일부 실시양태에서, 포유동물 골수 세포는 미처리된 포유동물 골수 세포와 비교하여 증강된 골형성능을 포함한다. 일부 실시양태에서, 증강된 골형성능은 처리된 포유동물 골수 세포를 이식한 후 골 결손 부위에서의 신생 골 성장 수준을 포함한다. 일부 실시양태에서, 신생 골 성장 수준은 미처리되어 이식된 포유동물 골수 세포의 신생 골 성장 수준과 비교된다. 일부 실시양태에서, 처리되어 이식된 포유동물 골수 세포의 신생 골 성장 수준은 미처리되어 이식된 포유동물 골수 세포의 신생 골 성장 수준과 비교하여 약 1% 내지 약 20% 또는 약 5% 내지 약 12%이다. 일부 실시양태에서, 포유동물 골수 세포는 부착성 및 비부착성 골수 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 포유동물 골수 세포는 부착성 골수 세포이다. 일부 실시양태에서, 부착성 골수 세포는 골수 줄기 세포 및 골수 전구 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 부착성 골수 세포는 골수 기질 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 포유동물 골수 세포는 자가 유래 골수 세포이다. 일부 실시양태에서, 자가 유래 골수 세포는 대퇴골, 경골, 및/또는 장골능으로부터 채취된다. 일부 실시양태에서, 자가 유래 골수 세포는 부착성 및 비부착성 골수 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 자가 유래 골수 세포는 부착성 골수 세포이다. 일부 실시양태에서, 자가 유래 골수 세포는 골수 줄기 세포 및 골수 전구 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 자가 유래 골수 세포는 골수 기질 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 포유동물 골수 세포는 동종이계 골수 세포이다. 일부 실시양태에서, 동종이계 골수 세포는 부착성 및 비부착성 골수 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 동종이계 골수 세포는 부착성 골수 세포이다. 일부 실시양태에서, 동종이계 골수 세포는 골수 줄기 세포 및 골수 전구 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 동종이계 골수 세포는 골수 기질 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 포유동물 골수 세포는 설치류 골수 세포이다. 일부 실시양태에서, 설치류 골수 세포는 10월령 초과의 설치류로부터 채취된다. 일부 실시양태에서, 포유동물 골수 세포는 인간 골수 세포이다. 일부 실시양태에서, 인간 골수 세포는 35세 이상의 피험체로부터 채취된다. 일부 실시양태에서, 리포솜 Wnt 폴리펩티드로 처리 후 인간 골수 세포는 35세 미만의 피험체에서 관찰되는 바이오마커의 발현 수준을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 리포솜 Wnt 폴리펩티드는 Wnt 폴리펩티드 및 리포솜 수용액을 포함한다. 일부 실시양태에서, 리포솜을 구성하는 인지질은 약 10℃ 내지 약 25℃의 상전이온도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 리포솜을 구성하는 인지질은 약 12개 내지 약 14개 탄소의 테일 탄소 길이를 갖는다. 일부 실시양태에서, Wnt 폴리펩티드는 Wnt3a 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, Wnt3a 폴리펩티드는 서열 번호 1에 개시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 또는 약 95% 서열 동일성을 포함한다. 일부 실시양태에서, Wnt3a 폴리펩티드는 서열 번호 1에 개시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, Wnt3a 폴리펩티드는 서열 번호 1에 개시된 아미노산 잔기 209에 해당하는 아미노산 위치에서 지질 변형되고 서열 번호 1에 개시된 아미노산 잔기 77에 해당하는 아미노산 위치에서 지질 변형되지 않는다. 일부 실시양태에서, Wnt 폴리펩티드는 Wnt5a 폴리펩티드 또는 Wnt10b 폴리펩티드이다.
어떤 실시양태에서, 피험체의 골 결손 치료 방법으로서, (a) 포유동물 골수 세포를 포함하는 샘플을 리포솜 Wnt3a 폴리펩티드와 생체 외에서 접촉시키는 단계, (b) 유리 리포솜 Wnt3a 폴리펩티드를 제거하기 위해 샘플을 세척하는 단계, 및 (c) 리포솜 Wnt3a 폴리펩티드로 처리된 골 이식재를 골 결손 부위에 이식하는 단계를 포함하는 방법을 본원에서 개시한다. 일부 실시양태에서, 접촉 온도는 약 0℃ 내지 약 37℃, 또는 약 20℃ 내지 약 25℃이다. 일부 실시양태에서, 접촉 시간은 약 30분 내지 약 4시간이다. 일부 실시양태에서, 골수 세포는 미처리된 포유동물 골수 세포와 비교하여 런엑스2, 오스테릭스, 오스테오칼신, 오스테오폰틴, 알칼리 포스파타제, 제1형 콜라겐, 엑신2, Lef1, 및 Tcf4로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이오마커 중 하나 이상의 발현 수준이 증강되었다. 일부 실시양태에서, 바이오마커는 오스테오칼신, 오스테오폰틴, 엑신2, Lef1, 및 Tcf4로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 바이오마커는 오스테오칼신 및 오스테오폰틴으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 증강된 발현 수준은 미처리된 포유동물 골수 세포와 비교하여 약 2% 내지 약 20% 또는 약 4% 내지 약 10%이다. 일부 실시양태에서, 포유동물 골수 세포는 또한 리포솜 Wnt3a 폴리펩티드로 처리 후 SOX9 및 PPARγ로부터 선택되는 바이오마커의 발현 수준이 감소되었다. 일부 실시양태에서, 포유동물 골수 세포에서 감소된 발현 수준은 미처리된 포유동물 골수 세포와 비교된다. 일부 실시양태에서, 골수 세포는 또한 미처리된 포유동물 골수 세포와 비교하여 아폽토시스 수준의 감소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 아폽토시스 수준의 감소는 약 50%이다. 일부 실시양태에서, 포유동물 골수 세포는 미처리된 포유동물 골수 세포와 비교하여 증강된 골형성능을 포함한다. 일부 실시양태에서, 증강된 골형성능은 처리된 포유동물 골수 세포를 이식한 후 골 결손 부위에서의 신생 골 성장 수준을 포함한다. 일부 실시양태에서, 신생 골 성장 수준은 미처리되어 이식된 포유동물 골수 세포의 신생 골 성장 수준과 비교된다. 일부 실시양태에서, 처리되어 이식된 포유동물 골수 세포의 신생 골 성장 수준은 미처리되어 이식된 포유동물 골수 세포의 신생 골 성장 수준과 비교하여 약 1% 내지 약 20% 또는 약 5% 내지 약 12%이다. 일부 실시양태에서, 포유동물 골수 세포는 부착성 및 비부착성 골수 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 포유동물 골수 세포는 부착성 골수 세포이다. 일부 실시양태에서, 부착성 골수 세포는 골수 줄기 세포 및 골수 전구 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 부착성 골수 세포는 골수 기질 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 포유동물 골수 세포는 자가 유래 골수 세포이다. 일부 실시양태에서, 자가 유래 골수 세포는 대퇴골, 경골, 및/또는 장골능으로부터 채취된다. 일부 실시양태에서, 자가 유래 골수 세포는 부착성 및 비부착성 골수 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 자가 유래 골수 세포는 부착성 골수 세포이다. 일부 실시양태에서, 자가 유래 골수 세포는 골수 줄기 세포 및 골수 전구 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 자가 유래 골수 세포는 골수 기질 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 포유동물 골수 세포는 동종이계 골수 세포이다. 일부 실시양태에서, 동종이계 골수 세포는 부착성 및 비부착성 골수 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 동종이계 골수 세포는 부착성 골수 세포이다. 일부 실시양태에서, 동종이계 골수 세포는 골수 줄기 세포 및 골수 전구 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 동종이계 골수 세포는 골수 기질 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 포유동물 골수 세포는 설치류 골수 세포이다. 일부 실시양태에서, 설치류 골수 세포는 10월령 초과의 설치류로부터 채취된다. 일부 실시양태에서, 포유동물 골수 세포는 인간 골수 세포이다. 일부 실시양태에서, 인간 골수 세포는 35세 이상의 피험체로부터 채취된다. 일부 실시양태에서, 리포솜 Wnt3a 폴리펩티드로 처리 후 인간 골수 세포는 35세 미만의 피험체에서 관찰되는 바이오마커의 발현 수준을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 리포솜 Wnt3a 폴리펩티드는 Wnt3a 폴리펩티드 및 리포솜 수용액을 포함한다. 일부 실시양태에서, 리포솜을 구성하는 인지질은 약 10℃ 내지 약 25℃의 상전이온도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 리포솜을 구성하는 인지질은 약 12개 내지 약 14개 탄소의 테일 탄소 길이를 갖는다. 일부 실시양태에서, Wnt3a 폴리펩티드는 서열 번호 1에 개시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 또는 약 95% 서열 동일성을 포함한다. 일부 실시양태에서, Wnt3a 폴리펩티드는 서열 번호 1에 개시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, Wnt3a 폴리펩티드는 서열 번호 1에 개시된 아미노산 잔기 209에 해당하는 아미노산 위치에서 지질 변형되고 서열 번호 1에 개시된 아미노산 잔기 77에 해당하는 아미노산 위치에서 지질 변형되지 않는다.
어떤 실시양태에서, 피험체의 골 결손 치료 방법으로서, (a) 포유동물 골수 세포를 포함하는 샘플을 리포솜 Wnt 폴리펩티드와 생체 외에서 접촉시키는 단계, (b) 유리 리포솜 Wnt 폴리펩티드를 제거하기 위해 샘플을 세척하는 단계, 및 (c) 리포솜 Wnt 폴리펩티드로 처리된 골 이식재를 골 결손 부위에 이식하는 단계를 포함하는 방법을 본원에서 개시한다. 일부 실시양태에서, 접촉 온도는 약 0℃ 내지 약 37℃, 또는 약 20℃ 내지 약 25℃이다. 일부 실시양태에서, 접촉 시간은 약 30분 내지 약 4시간이다. 일부 실시양태에서, 골수 세포는 미처리된 포유동물 골수 세포와 비교하여 런엑스2, 오스테릭스, 오스테오칼신, 오스테오폰틴, 알칼리 포스파타제, 제1형 콜라겐, 엑신2, Lef1, 및 Tcf4로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이오마커 중 하나 이상의 발현 수준이 증강되었다. 일부 실시양태에서, 바이오마커는 오스테오칼신, 오스테오폰틴, 엑신2, Lef1, 및 Tcf4로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 바이오마커는 오스테오칼신 및 오스테오폰틴으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 증강된 발현 수준은 미처리된 포유동물 골수 세포와 비교하여 약 2% 내지 약 20% 또는 약 4% 내지 약 10%이다. 일부 실시양태에서, 포유동물 골수 세포는 또한 리포솜 Wnt 폴리펩티드로 처리 후 SOX9 및 PPARγ로부터 선택되는 바이오마커의 발현 수준이 감소되었다. 일부 실시양태에서, 포유동물 골수 세포에서 감소된 발현 수준은 미처리된 포유동물 골수 세포와 비교된다. 일부 실시양태에서, 골수 세포는 또한 미처리된 포유동물 골수 세포와 비교하여 아폽토시스 수준의 감소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 아폽토시스 수준의 감소는 약 50%이다. 일부 실시양태에서, 포유동물 골수 세포는 미처리된 포유동물 골수 세포와 비교하여 증강된 골형성능을 포함한다. 일부 실시양태에서, 증강된 골형성능은 처리된 포유동물 골수 세포를 이식한 후 골 결손 부위에서의 신생 골 성장 수준을 포함한다. 일부 실시양태에서, 신생 골 성장 수준은 미처리되어 이식된 포유동물 골수 세포의 신생 골 성장 수준과 비교된다. 일부 실시양태에서, 처리되어 이식된 포유동물 골수 세포의 신생 골 성장 수준은 미처리되어 이식된 포유동물 골수 세포의 신생 골 성장 수준과 비교하여 약 1% 내지 약 20% 또는 약 5% 내지 약 12%이다. 일부 실시양태에서, 포유동물 골수 세포는 부착성 및 비부착성 골수 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 포유동물 골수 세포는 부착성 골수 세포이다. 일부 실시양태에서, 부착성 골수 세포는 골수 줄기 세포 및 골수 전구 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 부착성 골수 세포는 골수 기질 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 포유동물 골수 세포는 자가 유래 골수 세포이다. 일부 실시양태에서, 자가 유래 골수 세포는 대퇴골, 경골, 및/또는 장골능으로부터 채취된다. 일부 실시양태에서, 자가 유래 골수 세포는 부착성 및 비부착성 골수 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 자가 유래 골수 세포는 부착성 골수 세포이다. 일부 실시양태에서, 자가 유래 골수 세포는 골수 줄기 세포 및 골수 전구 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 자가 유래 골수 세포는 골수 기질 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 포유동물 골수 세포는 동종이계 골수 세포이다. 일부 실시양태에서, 동종이계 골수 세포는 부착성 및 비부착성 골수 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 동종이계 골수 세포는 부착성 골수 세포이다. 일부 실시양태에서, 동종이계 골수 세포는 골수 줄기 세포 및 골수 전구 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 동종이계 골수 세포는 골수 기질 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 포유동물 골수 세포는 설치류 골수 세포이다. 일부 실시양태에서, 설치류 골수 세포는 10월령 초과의 설치류로부터 채취된다. 일부 실시양태에서, 포유동물 골수 세포는 인간 골수 세포이다. 일부 실시양태에서, 인간 골수 세포는 35세 이상의 피험체로부터 채취된다. 일부 실시양태에서, 리포솜 Wnt 폴리펩티드로 처리 후 인간 골수 세포는 35세 미만의 피험체에서 관찰되는 바이오마커의 발현 수준을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 리포솜 Wnt 폴리펩티드는 Wnt 폴리펩티드 및 리포솜 수용액을 포함한다. 일부 실시양태에서, 리포솜을 구성하는 인지질은 약 10℃ 내지 약 25℃의 상전이온도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 리포솜을 구성하는 인지질은 약 12개 내지 약 14개 탄소의 테일 탄소 길이를 갖는다. 일부 실시양태에서, Wnt 폴리펩티드는 Wnt3a 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, Wnt3a 폴리펩티드는 서열 번호 1에 개시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 또는 약 95% 서열 동일성을 포함한다. 일부 실시양태에서, Wnt3a 폴리펩티드는 서열 번호 1에 개시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, Wnt3a 폴리펩티드는 서열 번호 1에 개시된 아미노산 잔기 209에 해당하는 아미노산 위치에서 지질 변형되고 서열 번호 1에 개시된 아미노산 잔기 77에 해당하는 아미노산 위치에서 지질 변형되지 않는다. 일부 실시양태에서, Wnt 폴리펩티드는 Wnt5a 폴리펩티드 또는 Wnt10b 폴리펩티드이다.
어떤 실시양태에서, 리포솜 Wnt 폴리펩티드를 포함하는 골 이식재를 생성하기 위한 키트를 본원에서 개시한다. 일부 실시양태에서, 리포솜 Wnt 폴리펩티드는 기능적으로 활성인 포유동물 Wnt 폴리펩티드, 및 리포솜을 포함하는 수용액을 포함하는 조성물로서, 리포솜을 구성하는 인지질이 약 10℃ 내지 약 25℃의 상전이온도를 갖는 것인 조성물이다. 일부 실시양태에서, 리포솜 Wnt 폴리펩티드는 기능적으로 활성인 포유동물 Wnt 폴리펩티드, 및 리포솜을 포함하는 수용액을 포함하는 조성물로서, 리포솜을 구성하는 인지질이 약 12개 내지 약 14개 탄소의 테일 탄소 길이를 갖는 것인 조성물이다. 일부 실시양태에서, Wnt 폴리펩티드는 리포솜 막으로 통합된다. 일부 실시양태에서, Wnt 폴리펩티드는 리포솜 막으로부터 지질 막의 외부 표면 위로 돌출된다. 일부 실시양태에서, Wnt 폴리펩티드는 리포솜의 수성 코어로 편입되지 않는다. 일부 실시양태에서, Wnt 폴리펩티드는 Wnt3a 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, Wnt3a 폴리펩티드는 서열 번호 1에 개시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 또는 약 95% 서열 동일성을 포함한다. 일부 실시양태에서, Wnt3a 폴리펩티드는 서열 번호 1에 개시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, Wnt3a 폴리펩티드는 서열 번호 1에 개시된 아미노산 잔기 209에 해당하는 아미노산 위치에서 지질 변형되고 서열 번호 1에 개시된 아미노산 잔기 77에 해당하는 아미노산 위치에서 지질 변형되지 않는다. 일부 실시양태에서, Wnt 폴리펩티드는 Wnt5a 폴리펩티드 또는 Wnt10b 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, Wnt 폴리펩티드의 농도는 약 5 ㎍/㎕ 내지 약 15 ㎍/㎕, 또는 약 8 ㎍/㎕ 내지 약 12 ㎍/㎕이다. 일부 실시양태에서, 리포솜은 pH 약 6.5 내지 약 8.0에서 순전하 0을 갖는다. 일부 실시양태에서, 리포솜은 pH 약 6.5 내지 약 8.0에서 순 양전하 또는 순 음전하를 갖는다. 일부 실시양태에서, 인지질은 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DMPC)이다. 일부 실시양태에서, 리포솜은 콜레스테롤을 더 포함한다. 일부 실시양태에서, DMPC와 콜레스테롤의 농도는 약 70:30 내지 약 100:0의 비로 정해진다. 일부 실시양태에서, 포유동물은 인간이다. 일부 실시양태에서, 지질 변형은 팔미토일화이다. 일부 실시양태에서, Wnt 폴리펩티드는 추가로 글리코실화된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 안정한 조성물이다. 일부 실시양태에서, 조성물은 활성의 실질적인 손실 없이 약 106일까지 안정하다. 일부 실시양태에서, 조성물은 약 1℃ 내지 약 8℃의 온도에서 안정하다. 일부 실시양태에서, 조성물은 질소 하에서 안정하다.
어떤 실시양태에서, 리포솜 Wnt3a 폴리펩티드를 포함하는 골 이식재를 생성하기 위한 키트를 본원에서 개시한다. 일부 실시양태에서, 리포솜 Wnt3a 폴리펩티드는 기능적으로 활성인 Wnt3a 폴리펩티드, 및 리포솜을 포함하는 수용액을 포함하는 조성물로서, 상기 기능적으로 활성인 Wnt3a 폴리펩티드가 서열 번호 1에 개시된 아미노산 잔기 209에 해당하는 아미노산 위치에서 지질 변형을 포함하는 것인 조성물이다. 일부 실시양태에서, 기능적으로 활성인 Wnt3a 폴리펩티드는 서열 번호 1에 개시된 아미노산 잔기 77에 해당하는 아미노산 위치에서 지질 변형되지 않는다. 일부 실시양태에서, 기능적으로 활성인 Wnt3a 폴리펩티드는 리포솜 막으로 통합된다. 일부 실시양태에서, 기능적으로 활성인 Wnt3a 폴리펩티드는 리포솜 막으로부 지질 막의 외부 표면 위로 돌출된다. 일부 실시양태에서, 기능적으로 활성인 Wnt3a 폴리펩티드는 리포솜의 수성 코어로 편입되지 않는다. 일부 실시양태에서, 기능적으로 활성인 Wnt3a 폴리펩티드는 서열 번호 1에 개시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 또는 약 95% 서열 동일성을 포함한다. 일부 실시양태에서, 기능적으로 활성인 Wnt3a 폴리펩티드는 서열 번호 1에 개시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 기능적으로 활성인 Wnt3a 폴리펩티드의 농도는 약 5 ㎍/㎕ 내지 약 15 ㎍/㎕, 또는 약 8 ㎍/㎕ 내지 약 12 ㎍/㎕이다. 일부 실시양태에서, 리포솜을 구성하는 인지질은 약 12개 내지 약 14개 탄소의 테일 탄소 길이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 리포솜을 구성하는 인지질은 약 10℃ 내지 약 25℃, 약 15℃ 내지 약 25℃, 또는 약 20℃ 내지 약 25℃의 상전이온도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 리포솜은 pH 약 6.5 내지 약 8.0, 약 7.0 내지 약 7.8, 또는 약 7.2 내지 약 7.6에서 순전하 0을 갖는다. 일부 실시양태에서, 인지질은 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DMPC)이다. 일부 실시양태에서, 리포솜은 콜레스테롤을 더 포함한다. 일부 실시양태에서, DMPC와 콜레스테롤의 농도는 약 70:30 내지 약 100:0의 비로 정해진다. 일부 실시양태에서, Wnt3a 폴리펩티드는 포유동물 Wnt3a 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 포유동물은 인간이다. 일부 실시양태에서, 지질 변형은 팔미토일화이다. 일부 실시양태에서, Wnt3a 폴리펩티드는 추가로 글리코실화된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 안정한 조성물이다. 일부 실시양태에서, 조성물은 활성의 실질적인 손실 없이 약 106일까지 안정하다. 일부 실시양태에서, 조성물은 약 1℃ 내지 약 8℃의 온도에서 안정하다. 일부 실시양태에서, 조성물은 질소 하에서 안정하다.
어떤 실시양태에서, 단리된 증강된 포유동물 골수 세포 조성물을 포함하는 골 이식재를 생성하기 위한 키트를 본원에서 개시한다. 일부 실시양태에서, 단리된 증강된 포유동물 골수 세포 조성물은 35세 이상의 인간 피험체로부터 얻은 포유동물 골수 세포의 조성물로서, 상기 포유동물 골수 세포가 리포솜 Wnt 폴리펩티드로 처리 후, 런엑스2, 오스테릭스, 오스테오칼신, 오스테오폰틴, 알칼리 포스파타제, 제1형 콜라겐, 엑신2, Lef1, 및 Tcf4로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이오마커 중 하나 이상의 증강된 발현 수준을 나타내는 것인 조성물이다. 일부 실시양태에서, 바이오마커는 오스테오칼신, 오스테오폰틴, 엑신2, Lef1, 및 Tcf4로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 바이오마커는 오스테오칼신 및 오스테오폰틴으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 증강된 발현 수준은 미처리된 포유동물 골수 세포와 비교된다. 일부 실시양태에서, 증강된 발현 수준은 미처리된 포유동물 골수 세포와 비교하여 약 2% 내지 약 20% 또는 약 4% 내지 약 10%이다. 일부 실시양태에서, 포유동물 골수 세포는 리포솜 Wnt 폴리펩티드로 처리 후 SOX9 및 PPARγ로부터 선택되는 바이오마커의 발현 수준이 감소된다. 일부 실시양태에서, 포유동물 골수 세포에서 감소된 발현 수준은 미처리된 포유동물 골수 세포와 비교된다. 일부 실시양태에서, 골수 세포는 또한 미처리된 포유동물 골수 세포와 비교하여 아폽토시스 수준의 감소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 아폽토시스 수준의 감소는 약 50%이다. 일부 실시양태에서, 포유동물 골수 세포는 미처리된 포유동물 골수 세포와 비교하여 증강된 골형성능을 포함한다. 일부 실시양태에서, 증강된 골형성능은 처리된 포유동물 골수 세포를 이식한 후 골 결손 부위에서의 신생 골 성장 수준을 포함한다. 일부 실시양태에서, 신생 골 성장 수준은 미처리되어 이식된 포유동물 골수 세포의 신생 골 성장 수준과 비교된다. 일부 실시양태에서, 처리되어 이식된 포유동물 골수 세포의 신생 골 성장 수준은 미처리되어 이식된 포유동물 골수 세포의 신생 골 성장 수준과 비교하여 약 1% 내지 약 20% 또는 약 5% 내지 약 12%이다. 일부 실시양태에서, 포유동물 골수 세포는 부착성 및 비부착성 골수 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 포유동물 골수 세포는 부착성 골수 세포이다. 일부 실시양태에서, 부착성 골수 세포는 골수 줄기 세포 및 골수 전구 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 부착성 골수 세포는 골수 기질 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 포유동물 골수 세포는 자가 유래 골수 세포이다. 일부 실시양태에서, 자가 유래 골수 세포는 부착성 및 비부착성 골수 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 자가 유래 골수 세포는 부착성 골수 세포이다. 일부 실시양태에서, 자가 유래 골수 세포는 골수 줄기 세포 및 골수 전구 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 자가 유래 골수 세포는 골수 기질 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 포유동물 골수 세포는 동종이계 골수 세포이다. 일부 실시양태에서, 동종이계 골수 세포는 부착성 및 비부착성 골수 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 동종이계 골수 세포는 부착성 골수 세포이다. 일부 실시양태에서, 동종이계 골수 세포는 골수 줄기 세포 및 골수 전구 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 동종이계 골수 세포는 골수 기질 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 리포솜 Wnt 폴리펩티드로 처리 후 인간 골수 세포는 35세 미만의 피험체에서 관찰되는 바이오마커의 발현 수준을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 리포솜 Wnt 폴리펩티드는 Wnt 폴리펩티드 및 리포솜 수용액을 포함한다. 일부 실시양태에서, 리포솜을 구성하는 인지질은 약 10℃ 내지 약 25℃의 상전이온도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 리포솜을 구성하는 인지질은 약 12개 내지 약 14개 탄소의 테일 탄소 길이를 갖는다. 일부 실시양태에서, Wnt 폴리펩티드는 Wnt3a 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, Wnt3a 폴리펩티드는 서열 번호 1에 개시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 또는 약 95% 서열 동일성을 포함한다. 일부 실시양태에서, Wnt3a 폴리펩티드는 서열 번호 1에 개시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, Wnt3a 폴리펩티드는 서열 번호 1에 개시된 아미노산 잔기 209에 해당하는 아미노산 위치에서 지질 변형되고, 서열 번호 1에 개시된 아미노산 잔기 77에 해당하는 아미노산 위치에서 지질 변형되지 않는다. 일부 실시양태에서, Wnt 폴리펩티드는 Wnt5a 폴리펩티드 또는 Wnt10b 폴리펩티드이다.
추가의 측면 및 실시양태는 본 개시의 나머지 부분에서 명백할 것이며, 본 발명 내에 포함된다.
[도 1]은 본 발명의 정제 개략도를 나타낸다.
[도 2]는 Wnt3a의 SDS PAGE 및 쿠마씨 블루(Coomassie brilliant blue) 염색 분석을 나타낸다.
[도 3]은 질량 분광분석 데이터를 예시한다.
[도 4]는 L-Wnt3a의 TEM 특성화를 나타낸다. TEM을 이용하여 L-Wnt3a를 가시화하고, 소포의 평균 직경을 계산하였다.
[도 5]는 인간 Wnt3a 및 L-Wnt3a 활성의 정량화를 나타낸다. 생물발광은 이중광 장착된 발광광도계(Berthold)에서 3회 반복한 판독값으로 정량하였다. 인간 Wnt3a(ng/uL; A) 및 L-Wnt3a(B)의 활성은 연속 희석된 Wnt3a 단백질에 의해 생성된 표준 곡선으로부터 정했다.
[도 6]은 4℃에서 L-Wnt3a의 안정성을 나타낸다. 리포솜-Wnt3a 상호작용을 조사하였다. 리포솜 Wnt3a(L-Wnt3a)를 4℃에서 48일까지 인큐베이션하였다. 그 후 인간 L-Wnt3a 폴리펩티드를 활성에 대해 LSL 분석법으로 시험하였다. L-Wnt3a 폴리펩티드는 48일 시험 기간에 걸쳐 활성 손실을 보이지 않았다.
[도 7]은 23℃에서 L-Wnt3a의 안정성을 나타낸다.
[도 8]은 37℃에서 L-Wnt3a의 안정성을 나타낸다. DMPC:콜레스테롤 리포솜과 인간 Wnt3a의 결합을 시험하여 상기 리포솜이 Wnt3a 폴리펩티드에 안정성을 제공하는지를 결정하였다. 여러 시점에서 얻은 데이터를 단일 지수 감쇠에 일치시켰으며, 이것으로 L-Wnt3a는 10시간 후에 37℃에서 활성의 절반을 보유하는 반면(청색 선, 도 8A), Wnt3a는 5분 내에 활성을 잃는다(적색 선, 도 8A)는 것을 보였다. 인간 Wnt3a의 활성 손실은 단백질 분해에 기인한다. Wnt3a + CHAPS 용액에서, 더 작은 분자량 밴드가 면역블롯에서 검출되었다(도 8B). L-Wnt3a 제제의 면역블롯에서는 Wnt3a에 해당하는 더 작은 분자량 밴드가 검출되지 않았다(도 8C).
[도 9]는 현탁 배양 vs 부착 배양에서 배양된 세포로부터 생산된 인간 Wnt3a 폴리펩티드를 예시한다.
[도 10]은 인간 Wnt3a 폴리펩티드 분비의 독시사이클린 농도 의존적 유도를 보여준다. 독시사이클린을 다양한 농도로 배지에 첨가하여 CHO 세포에 의해 생산된 인간 Wnt3a의 양에 영향을 주었다.
[도 11]은 소 태아 혈청을 CHO 세포로부터 인간 Wnt3a 폴리펩티드 분비에 사용하였다는 것을 예시한다.
[도 12]는 배양 기간(일)의 함수로서 CHO 세포로부터 인간 Wnt3a 분비를 나타낸다.
[도 13]은 LSL 세포 리포터 분석법의 견고성, 정확성, 검출 한계 및 특이성을 나타낸다.
[도 14]는 1차 세포를 이용한 L-Wnt3a 용량 반응 곡선을 나타낸다. (A) 마우스 배아 섬유아세포(MEF: mouse embryonic fibroblast)에서, 직선 범위의 유효 농도는 0.025-0.1 ng/㎕ 인간 Wnt3a였다. (B) 골수 유래 줄기 세포 내 L-Wnt3a 활성에서, 직선 범위의 유효 농도는 0.004-0.08 ng/㎕ 범위라는 것을 결정하였다
[도 15]는 상이한 지질 제형에서 인간 Wnt3a 활성을 나타낸다. DMPC 및 콜레스테롤 지질로 CHAPS를 대체하여 Wnt3a 활성을 유지하였으나 MPPC, DPPC, DMPS, DMPG, 및 DMGE와 같은 지질로 제조된 리포솜은 활성을 가지지 않았다.
[도 16]은 슈크로스 밀도 구배를 예시한다.
[도 17]은 리포솜 막에 대한 인간 Wnt3a 친화도를 예시한다. Wnt3a/프리즐드 결합 친화도는 약 3.6nM이었다. Wnt3a/LRP6 결합 친화도는 약 9nM이었다. Wnt3a와 리포솜 막 사이의 결합 친화도는 Wnt3a, 프리즐드(Fz), 및 Lrp6 사이의 풀-다운(pull-down) 분석을 기초로 하여 약 ~6nM이었다.
[도 18]은 리포솜과 인간 Wnt3a 결합 속도론을 나타낸다.
[도 19]는 중성 DMPC 리포솜에 대한 Wnt5a 및 Wnt10b 폴리펩티드 결합을 나타낸다.
[도 20]은 골 이식재의 각각의 구성요소를 나타낸다. 골 이식재는 줄기 및 전구 세포군을 포함한다. [도 20A]는 랫트의 대퇴골, 장골능(도 20B), 및 경골(도 20C)로부터 회수된 BGM의 고모리 염색을 나타낸다. [도 2D]는 명시된 출처로부터 새로 회수된 랫트 BGM의 내인성 골 형성 유전자 발현의 정량 RT-PCR 분석이다. [도 20E]는 실험 설계의 개략도를 보여주며, 여기서 자가 유래 BGM을 랫트의 SRC에 이식한다. [도 20F]는 이식 후 7일에 BrdU 편입을 검출하기 위해 염색된 장골능 BGM의 대표적인 조직 절편을 예시한다. 점선은 BGM에 포함된 해면골 파편을 나타낸다. [도 20G], [도 20H], 및 [도 20I]는 각각 런엑스2, Sox9, 및 PPARγ의 발현이다. [도 20J]는 유골 기질(osteoid matrix)을 검출하기 위해 아닐린 블루로 염색된 BGM의 대표적인 조직 절편을 나타내고, *는 오래된 골 파편(황색 점선)과 대조적으로 신생 골 기질을 나타낸다. 신장 표면은 이 패널 및 [도 20G]에서 흰색 점선으로 표시되어 있다. [도 20K]는 프로테오글리칸이 풍부한 연골(적색)을 검출하기 위한 사프라닌 O/패스트 그린(Safranin O/Fast green) 조직학이며, [도 20L]은 지방세포를 검출하기 위한 고모리 트리크롬 염색이다. 약어: BrdU, 브로모데옥시우리딘; PPARγ, 페록시솜 증식체 활성화 단백질 감마. 기준자: 50μm, *: p<0.05.
[도 21]은 Wnt 반응성인 골 이식재를 나타낸다. [도 21A]는 골막의, [도21B]는 골내막의 면역염색으로 가시화된, 엑신2 CreERT2 ;R26 mTmG 마우스에서 GFP+ ve 세포를 나타낸다. [도 21C]는 명시된 현미경 시야 내에서 전체 세포에 대한 GFP+ ve 세포의 정량이다. [도 21D]는 BGM 내의 GFP+ ve 세포가 형광으로 가시화된 것을 나타낸다. [도 21E]는 BGMyoung(녹색 막대) 및 BGMaged(회색 막대)에서 내인성 엑신2 , Lef1 및 GAPDH 발현의 절대 정량 RT-PCR 결과이다. [도 21F]는 BGMyoung(녹색 막대) 및 BGMaged(회색 막대)에서 Wnt3a, 전체 베타 카테닌, 엑신2, 및 베타 액틴에 대한 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다. 기준자 = 50μm. *: p<0.05.
[도 22]는 BGM의 골형성 분화능이 노화에 따라 감소한다는 것을 보여준다. [도 22A]는 BGMyoung(녹색 막대) 및 BGMaged(회색 막대)에서 알칼리 포스파타제, 오스테릭스, 및 오스테오칼신의 발현에 대한 정량 RT-PCR 분석을 나타낸다. [도 22B]는 SRC에 이식되어 명시야 하에서 가시화된, ACTB - eGFP 마우스에서 회수된 BGM이고 [도 22C]는 형광광을 이용한 BGM에서 GFP 신호의 검출이다. [도 22D]는 BGMyoung(N=5)에서, [도 22E]는 BGMaged(N=5)에서 아닐린 블루(삽도)로 염색된 대표적인 조직 절편이다. 점선은 신장 표면을 나타낸다. [도 22F]는 이식 후 7일에 BGM에 의해 점유된 전체 면적 내에서 알라닌 블루+ ve 픽셀의 조직형태측정 분석을 나타낸다. [도 22G]는 BGMyoung(N=5)에서, [도 22H]는 BGMaged(N=5)에서 ALP 활성을 검출하기 위해 염색된 대표적인 조직 절편을 나타낸다. [도 22I]는 이식 후 7일에 BGM에 의해 점유된 전체 면적 내에서 ALP+ ve 픽셀의 정량을 나타낸다. [도 22J]는 BGMyoung(N=5)에서, [도 22K]는 BGMaged(N=5)에서 GFP에 대해 면역염색된 대표적인 조직 절편을 나타낸다. [도 22L]은 이식 후 7일에 BGM에 의해 점유된 전체 면적 내에 GFP+ve 픽셀의 정량을 나타낸다. 약어: ALP, 알칼리 포스파타제; Oc , 오스테오칼신 . 기준자: 100μm. *: p<0.05; **: p<0.01.
[도 23]은 내인성 Wnt 신호를 필요로 하는 BGM의 골 형성 분화를 나타낸다. [도 23A]는 마우스 IgG2α Fc 단편(Ad-Fc) 또는 [도 23B]는 가용성 Wnt 길항제 Dkk1을 발현하는 아데노바이러스(Ad-Dkk1)로 처리된 BGM에서 ALP 활성에 대해 염색된 대표적인 조직 절편을 나타낸다. [도 23C]는 Ad-Fc 또는 [도 23D]는 Ad-Dkk1로 처리된 BGM에서 PPARγ에 대해 면역염색된 대표적인 조직 절편을 나타낸다. [도 23E]는 Ad-Fc 또는 [도 23F]는 Ad-Dkk1로 처리된 BGM에서 Dlk1에 대해 면역염색된 대표적인 조직 절편을 나타낸다. [도 23G]는 Ad-Fc 또는 [도 23H]는 Ad-Dkk1로 처리된 BGM을 받은 결손 부위에서 골 형성을 검출하기 위한 마이크로-CT 재구성을 나타낸다. 원래 결손은 적색 점선의 원으로 표시되어 있다. [도 23I]는 마이크로-CT 데이터 ±SEM으로부터 계산된 신생 골 부피(N=5)를 나타낸다. [도 23J]는 Ad-Fc 또는 [도 23K]는 Ad-Dkk1로 처리된 BGM을 받은 결손 부위의 대표적인 조직 절편에 대한 아닐린 블루 염색을 나타낸다. [도 23L]은 조직형태측정 분석을 이용한 신생 골부피의 정량을 나타낸다. [도 23I]는 Ad-Fc 또는 [도 23J]는 Ad-Dkk1로 처리된 BM 이식체에서 PPAR-γ 발현이다. *: p<0.05. 기준자: A-B, 200μm, C-F,J-K, 50μm, G-H, 2mm.
[도 24]는 BGMaged의 인간 Wnt3a 활성화 및 그의 골형성 분화능의 회복을 나타낸다. [도 24A]는 L-PBS 또는 L-WNT3A(0.15㎍/ml)로 1시간 동안 처리하고, 그리고 나서 24시간 후에 표적 유전자 발현에 대해 qRT-PCR로 분석되거나, SRC로 바로 이식된 7일 동안 노화(aged) ACTB - eGFP 마우스로부터 유래된 BGM을 나타낸다. [도 24B]는 L-PBS(회색 막대) 또는 L-WNT3A(청색 막대)로 처리된 BGMaged에서 엑신2 및 Lef1 발현에 있어 변화 배수를 나타낸다. [도 24C]는 L-PBS(회색 막대) 또는 L-WNT3A(청색 막대)로 처리된 BGMaged에서 전체 베타 카테닌, 엑신2, 및 베타 액틴의 웨스턴 블롯 분석이다. 이식 후 4일에 SRC로부터 BGMaged을 회수한 후, L-PBS(N=5)(도 24D) 및 L-WNT3A(N=5)(도 24E)의 대표적인 조직 절편을 BrdU 편입에 대해 염색하였다. [도 24F]는 골 이식체의 중간을 중심으로 한 현미경 시야 내에 BrdU+ ve 픽셀의 정량을 나타낸다. [도 24G]는 L-PBS 처리된 샘플(N=5)에서, [도 24H]는 L-WNT3A 처리된 샘플(N=5)에서, 이식 후 7일에 BrdU 편입에 대해 염색된 대표적인 조직 절편을 나타낸다. [도 24I]는 상기와 같이 BrdU+ ve 픽셀의 정량을 나타낸다. [도 24J]는 L-PBS 처리된 샘플(N=5)에서, [도 24K]는 L-WNT3A 처리된 샘플(N=5)에서, 이식 후 7일에 Dlk1 발현에 대해 면역염색된 대표적인 조직 절편을 나타낸다. [도 24L]은 이식 후 7일에 BGM에 의해 점유된 전체 면적 내에서 Dlk1+ ve 픽셀의 정량을 나타낸다. [도 24M]은 L-PBS 처리된 샘플(N=5)에서, [도 24N]은 L-WNT3A 처리된 샘플(N=5)에서, 이식 후 7일에 Oc 발현에 대해 면역염색된 대표적인 조직 절편을 나타낸다. [도 24O]는 Dlk1에 대해 기재된 바와 같이 Oc+ ve 픽셀의 정량을 나타낸다. [도 24P]는 L-PBS 처리된 샘플(N=5)에서, [도 24Q]는 L-WNT3A 처리된 샘플(N=5)에서, 유골 기질을 검출하기 위해 아닐린 블루로 염색된 대표적인 조직 절편을 나타낸다. [도 24R]은 신생 골기질의 조직형태측정 정량을 나타낸다. 약어는 본원의 다른 부분에서와 같이 기재된다. 기준자: 100μm. *: p<0.05; **: p<0.01.
[도 25]는 BGM 줄기 세포의 L-Wnt3a 촉진 및 척추고정술의 개선을 나타낸다. [도 25A]는 인간 MSC 배양물을 명시된 시간 동안 37℃에서 L-PBS 또는 L-WNT3A로 처리하였다는 것과 엑신2 발현에 대한 qRT-PCR을 이용하여 Wnt-반응을 결정하였다는 것을 보여준다. [도 25B]는 마우스 SSC를 37℃에서 12시간 동안 L-PBS 또는 L-WNT3A로 처리하였다는 것과 Wnt 반응을 엑신2 발현에 대한 qRT-PCR로 분석하였다는 것을 보여준다. [도 25C]는 L-PBS(대시 선) 또는 L-WNT3A(0.15 ㎍/mL; 청색 선)로 실온에서 1시간 인큐베이션에 반응한 엑신 2 및 Lef1 발현에 대한 절대 정량 RT-PCR 분석을 나타낸다. 데이터는 24시간에 걸쳐 전체 RNA 함량에 대한 RNA 복제수의 비로서 표현된다. [도 25D]는 랫트 극돌기가 최소 절개에 의해 노출되었으며 장골능으로부터 표준화된 부피의 자가 유래 BGM을 L-PBS 또는 L-WNT3A로 1시간 동안 처리한 후 L4 및 L5 척추뼈의 횡돌기 사이에 이식하였다(도 25E)는 것을 보여준다. [도 25F]는 L-PBS로, [도 25G]는 L-WNT3A로 처리된 이식체(분홍색)에 대해 POD2에 마이크로-CT 영상을 획득하였다는 것을 나타낸다. [도 25H]는 L-PBS(회색)로, [도 25I]는 L-WNT3A(청색)로 처리된 이식체의 골 성장을 평가하기 위하여 POD49에 재차 마이크로-CT 영상을 획득하였다는 것을 나타낸다. [도 25J]는 POD2에 각 이식체의 크기를 POD49의 크기와 비교하여 이식체 성장을 처리군 각각에 대해 부피 배수로서 그래프를 작성하였다는 것을 나타낸다(상기에 언급된 색깔로 표시됨).　약어: L4, 요추 #4, L5,　요추 #5, AP(apical process), 정단돌기, SP(spinous process), 극돌기, TP(transverse process), 횡돌기, POD(post-operation day), 수술 후.
[도 26]은 BGM 부피의 정량을 나타낸다. 경골 및 대퇴골에서 회수된 BGM을 약 ~20㎕씩 5개의 앨리쿼트(aliquot)로 나눈 후 세포, 기질(stroma), 및 골 단편의 이종 혼합물에서 세포 밀도를 정량한 평균으로서 DNA 농도를 평가하였다. 샘플 #1의 DNA 농도를 100으로 설정하고, 다른 4개의 앨리쿼트의 상대적인 DNA 농도를 결정하였다.
[도 27]은 BGM의 생착 효율을 나타낸다. L-Wnt3a 처리는 BGM 생착 효율을 향상시킨다. [도 27A]는 BGMaged의, [도 27B]는 BGMACT의 SRC에서 4일 후 GFP 면역염색을 나타낸다. [도 27C]는 이식 후 4일 BGM에 의해 점유된 전체 픽셀에 대한 GFP+ ve　픽셀의 정량을 나타낸다.　[도 27D]는 BGMaged의, [도 27E]는 BGMACT의 SRC에서 4일 후 TUNEL 염색을 나타낸다. [도 27F]는 이식 후 4일에 BGM에 의해 점유된 전체 면적 내에서 전체 DAPI+ ve 픽셀에 대한 TUNEL+ ve 세포의 정량을 나타낸다. [도 27G]는 BGMaged의, [도 27H]는 BGMACT의 SRC에서 7일 후 TUNEL 염색을 나타낸다. [도 27I]는 이식 후 7일에 BGM에 의해 점유된 전체 면적 내에서 전체 DAPI+ ve 픽셀에 대한 TUNEL+ ve 세포의 정량을 나타낸다. [도 27J]는 BGMaged의, [도 27K]는 BGMACT의 SRC에서 7일 후 BGMaged에서 파골세포를 검출하기 위한 타르트레이트 내성 산성 포스파타제(TRAP: Tartrate resistant acid phosphatase) 활성에 대해 염색된 조직 절편을 나타낸다. [도 27L]은 이식 후 7일에 BGM에 의해 점유된 전체 면적 내에서 전체 TRAP+ ve 픽셀의 정량을 나타낸다. 기준자 = 100μm, **는 p＜0.01를 나타낸다.
본원에서 리포솜 Wnt 폴리펩티드의 생성에 사용하기 위한 조성물, 방법, 공정, 및 키트를 개시한다. 또한, 본원에서, 골 이식재를 생성하기 위한 조성물, 방법, 공정, 및 키트를 개시한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 기능적으로 활성인 포유동물 Wnt 폴리펩티드, 및 리포솜을 포함하는 수용액을 포함하며, 상기 리포솜을 구성하는 인지질은 약 10℃ 내지 약 25℃의 상전이온도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 조성물은 기능적으로 활성인 포유동물 Wnt 폴리펩티드, 및 리포솜을 포함하는 수용액을 포함하며, 상기 리포솜을 구성하는 인지질은 약 12개 내지 약 14개 탄소의 테일 탄소 길이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 조성물은 또한 기능적으로 활성인 Wnt3a 폴리펩티드, 및 리포솜을 포함하는 수용액을 포함하며, 상기 기능적으로 활성인 Wnt3a 폴리펩티드는 서열 번호 1에 개시된 아미노산 잔기 209에 해당하는 아미노산 위치에서 지질 변형을 포함한다.
일부 실시양태에서, 리포솜 Wnt 폴리펩티드의 제조 방법으로서, Wnt 폴리펩티드를 포함하는 샘플을 리포솜 수용액에 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 리포솜을 구성하는 인지질이 약 10℃ 내지 약 25℃의 상전이온도를 갖는 것인 방법을 본원에서 기재한다. 일부 실시양태에서, 리포솜 Wnt 폴리펩티드의 제조 방법으로서, Wnt 폴리펩티드를 포함하는 샘플을 리포솜 수용액에 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 리포솜을 구성하는 인지질이 약 12개 내지 약 14개 탄소의 테일 탄소 길이를 갖는 것인 방법을 본원에서 기재한다. 일부 실시양태에서, 리포솜 Wnt3a 폴리펩티드의 제조 방법으로서, (a) 중국 햄스터 난소(CHO) 세포를 포함하는 조정 배지로부터 Wnt3a 폴리펩티드를 회수하는 단계, (b) 설폰화된 다환 방향족 화합물로 고정화된 이온 교환 컬럼에 Wnt3a 폴리펩티드를 도입하는 단계, (c) 단계 구배를 이용하여 이온 교환 컬럼으로부터 Wnt3a 폴리펩티드를 용리하는 단계, 및 (d) 단계 (c)로부터의 Wnt3a 폴리펩티드를 리포솜 수용액과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 본원에서 기재한다.
일부 실시양태에서, 단리된 증강된 포유동물 골수 세포의 조성물로서, 상기 세포는, 리포솜 Wnt 폴리펩티드로 처리 후, 런엑스2, 오스테릭스, 오스테오칼신, 오스테오폰틴, 알칼리 포스파타제, 제1형 콜라겐, 엑신2, Lef1, 및 Tcf4로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이오마커 중 하나 이상의 증강된 발현 수준을 갖는 것인 조성물을 본원에서 기재한다. 일부 실시양태에서, 35세 이상의 인간 피험체로부터 얻은 포유동물 골수 세포의 조성물로서, 상기 포유동물 골수 세포가 리포솜 Wnt 폴리펩티드로 처리 후, 런엑스2, 오스테릭스, 오스테오칼신, 오스테오폰틴, 알칼리 포스파타제, 제1형 콜라겐, 엑신2, Lef1, 및 Tcf4로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이오마커 중 하나 이상의 증강된 발현 수준을 나타내는 것인 조성물을 본원에서 또한 기재한다.
일부 실시양태에서, 단리된 포유동물 골수 세포를 리포솜 Wnt 폴리펩티드와 생체 외에서 접촉시키는 단계를 포함하는 공정에 의해 제조된 포유동물 골수 조성물로서, 접촉 시간이 약 30분 내지 약 4시간인 것인 조성물을 본원에서 기재한다.
일부 실시양태에서, 피험체의 골 결손 치료 방법으로서, (a) 포유동물 골수 세포를 포함하는 샘플을 리포솜 Wnt 폴리펩티드와 생체 외에서 접촉시키는 단계, (b) 유리 리포솜 Wnt 폴리펩티드를 제거하기 위하여 샘플을 세척하는 단계, 및 (c) 리포솜 Wnt 폴리펩티드로 처리된 골 이식재를 골 결손 부위에 이식하는 단계를 포함하는 방법을 본원에서 기재한다. 또한, 피험체의 골 결손 치료 방법으로서, (a) 포유동물 골수 세포를 포함하는 샘플을 리포솜 Wnt3a 폴리펩티드와 생체 외에서 접촉시키는 단계, (b) 유리 리포솜 Wnt3a 폴리펩티드를 제거하기 위해 샘플을 세척하는 단계, 및 (c) 리포솜 Wnt3a 폴리펩티드로 처리된 골 이식재를 골 결손 부위에 이식하는 단계를 포함하는 방법을 기재한다.
일부 실시양태에서, 골 이식재의 생성 방법으로서, (a) 포유동물 골수 세포를 포함하는 샘플을 리포솜 Wnt 폴리펩티드와 생체 외에서 접촉시키는 단계, (b) 유리 리포솜 Wnt 폴리펩티드를 제거하기 위하여 샘플을 세척하는 단계, 및 (c) 리포솜 Wnt 폴리펩티드로 처리된 골 이식재를 골 결손 부위에 이식하는 단계를 포함하는 방법을 본원에서 기재한다. 또한, 골 이식재의 생성방법으로서, (a) 포유동물 골수 세포를 포함하는 샘플을 리포솜 Wnt3a 폴리펩티드와 생체 외에서 접촉시키는 단계, (b) 유리 리포솜 Wnt3a 폴리펩티드를 제거하기 위해 샘플을 세척하는 단계, 및 (c) 리포솜 Wnt3a 폴리펩티드로 처리된 골 이식재를 골 결손 부위에 이식하는 단계를 포함하는 방법을 본원에서 기재한다.
일부 측면에서, Ser209에서, 또는 Cys77에서 지질 변형이 없을 때 비인간 포유동물 Wnt3a 폴리펩티드의 보존된 해당 Cys에서, 또는 비인간 포유동물 Wnt3a 폴리펩티드의 보존된 해당 Ser에서 지질 변형된 서열 번호 1의 기능적으로 활성인 Wnt3a 폴리펩티드의 약 60% 이상, 또는 약 70% 이상, 또는 약 80% 이상, 또는 약 85% 이상, 또는 약 90% 이상, 또는 약 95% 이상을 포함하는 조성물을 본원에서 기재한다. 일부 실시양태에서, Wnt3A Cys77에 보존된 해당 Cys에서 지질 변형이 없을 때 Wnt3A ser209에 해당하는 보존된 Ser에서 지질 변형된, Wnt3A 이외의 기능적으로 활성인 Wnt 폴리펩티드의 약 60% 이상, 또는 약 70% 이상, 또는 약 80% 이상, 또는 약 85% 이상, 또는 약 90% 이상, 또는 약 95% 이상을 포함하는 조성물을 본원에서 기재한다.
일부 측면에서, Wnt 폴리펩티드는 Wnt3a 또는 그의 기능적으로 활성인 변이체이다. 다른 측면에서, Wnt 폴리펩티드는 인간 Wnt3a 또는 그의 기능적으로 활성인 변이체이다. 또 다른 측면에서, Wnt 폴리펩티드는 서열 번호 1의 Wnt3a 또는 그의 기능적으로 활성인 변이체이다. 또 다른 측면에서, 지질 변형은 팔미토일화이다. 다른 측면에서, Wnt 폴리펩티드는 Wnt3A 이외의 인간 Wnt 단백질, 예를 들어 Wnt1, Wnt2, Wnt2b(또는 Wnt13), Wnt3, Wnt4, Wnt5a, Wnt5b, Wnt6, Wnt7a, Wnt7b, Wnt8a, Wnt8b, Wnt9a(Wnt14, 또는 Wnt14b), Wnt9b(Wnt14b, 또는 Wnt15), Wnt10a, Wnt10b(또는 Wnt12), Wnt11, Wnt-16a, Wnt-16b 폴리펩티드 또는 그의 기능적으로 활성인 변이체이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 Wnt5A 또는 Wnt10b 또는 그의 기능적으로 활성인 변이체이다. 상기 일부 실시양태에서, Wnt 폴리펩티드는 리포솜, 예를 들어 DMPC 및/또는 콜레스테롤을 포함하는 리포솜에 제제화된다.
또 다른 측면에서, 재조합 중국 햄스터 난소(CHO) 세포를 포함하나 제한되지 않는 포유동물 세포 배양물에서 Wnt 폴리펩티드의 정제 방법으로서, Wnt 폴리펩티드를 포함하는 상기 세포의 배양 배지를 겔 여과 정제 단계와 같은 다른 정제 단계 없이 예를 들어 크로마토그래피 컬럼(예를 들어, 블루 세파로스(Blue Sephrose) 이온 교환 컬럼)과 같은 분리 단계를 이용하여 정제하는 단계를 포함하는 것인 방법을 본원에서 기재한다. 일부 실시양태에서, 또한, 황산헤파린 컬럼의 정제 단계 없이 정제를 실시한다. 또 다른 실시양태에서, 세포는 부착성 세포이고 배양 배지는 혈청, 예를 들어 소 태아 혈청(FBS)을 더 포함한다. 추가의 실시양태에서, 정제는 150 mM 내지 1.5 M의 염 구배를 이용하여 블루 세파로스 이온 교환 컬럼과 같은 컬럼에서 실시되며, 상기에서 염은 예를 들어 염화나트륨 또는 염화칼륨일 수 있다. 일부 경우에는, 정제 도식은 DPMC 및/또는 콜레스테롤과 같은 지질을, 예를 들어 90:10 몰:몰 비로 포함할 수 있는 미리 제조된 리포솜을 이용하는 것과 같은 추가의 정제 단계가 뒤따른다. 일부 경우에, 미리 제조된 리포솜의 사용은 Wnt 폴리펩티드의 소수성을 이용하며 겔 여과 및/또는 황산헤파린 컬럼 정제 단계와 같은 추가의 정제 단계의 필요성을 없애준다.
세포가 현탁 세포일 때, 무혈청 조건하에서 배양될 수 있다. 일부 실시양태에서, Wnt 폴리펩티드는 Wnt3a, 예를 들어 인간 Wnt3a, 예를 들어 서열 번호 1의 인간 Wnt3a 또는 그의 기능적으로 활성인 변이체일 수 있거나, Wnt 폴리펩티드는 Wnt3A 이외의 인간 Wnt 폴리펩티드, 예를 들어 Wnt1, Wnt2, Wnt2b(또는 Wnt13), Wnt3, Wnt4, Wnt5a, Wnt5b, Wnt6, Wnt7a, Wnt7b, Wnt8a, Wnt8b, Wnt9a(Wnt14, 또는 Wnt14b), Wnt9b(Wnt14b, 또는 Wnt15), Wnt10a, Wnt10b(또는 Wnt12), Wnt11, Wnt-16a, Wnt-16b 폴리펩티드 또는 그의 기능적으로 활성인 변이체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 Wnt5A 또는 Wnt10b 또는 그의 기능적으로 활성인 변이체이다. 추가의 측면에서, 본 발명은 상기 방법에 의해 정제된 Wnt 조성물에 관한 것이다. 한 실시양태에서, Wnt 조성물은 Wnt3a 또는 그의 기능적으로 활성인 변이체인 Wnt 폴리펩티드를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, Wnt 조성물은 인간 Wnt3a 또는 그의 기능적으로 활성인 변이체인 Wnt 폴리펩티드를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, Wnt 조성물은 서열 번호 1의 인간 Wnt3a 또는 그의 기능적으로 활성인 변이체인 Wnt 폴리펩티드를 포함한다.
일부 측면에서, 리포솜 Wnt 폴리펩티드, 리포솜 Wnt3a 폴리펩티드, 또는 단리된 증강된 포유동물 골수 세포 조성물을 포함하는 골 이식재의 생성을 위한 키트를 본원에서 기재한다.
A. 정의
본 발명을 기재하기에 앞서, 이해해야 할 것은 기재된 특정 방법이 당연히 변화될 수 있기 때문에 본 발명이 그에 제한되지 않다는 것이다. 또한, 본 발명의 범위는 단지 첨부된 청구항에 의해서만 제한될 것이기 때문에, 본원에서 사용된 용어는 단지 특정 실시양태를 기재하기 위한 것이며 제한하고자 하는 것은 아님을 이해해야 한다.
값의 범위가 제공되는 경우, 범위의 상한 및 하한과 언급된 범위 내에서 임의의 다른 언급된 값 또는 사이 값 사이에 각 사이 값은 본문에 명백하게 명시되지 않는다면 하한 단위의 1/10까지 본 발명 내에 포함되는 것으로 이해해야 한다. 상기 더 작은 범위의 상한 및 하한은, 언급된 범위 내에 구체적으로 제외된 어떤 한계 값을 조건으로, 본 발명 내에 포함되는 더 작은 범위 내에 독립적으로 포함될 수 있다. 또한, 본원에서 사용되는 범위 및 양은 "약" 구체적인 값 또는 범위로서 표현될 수 있다. 약은 또한 바로 그 양을 포함한다. 따라서, "약 5 ㎕"는 "약 5 ㎕" 및 "5 ㎕"도 의미한다. 일반적으로 용어 "약"은 양의 ±10% 내에 있는 것으로 예상되는 양을 포함한다.
달리 정의되지 않는다면, 본원에서 사용되는 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 통상의 기술자에게 보편적으로 이해되는 동일한 의미를 갖는다. 문헌(Singleton et al, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J.Wiley & Sons(New York, NY 1994))은 당업자에게 본 출원에 사용되는 많은 용어에 대한 일반적인 안내를 제공한다.
Wnt 폴리펩티드는 배아 발생 과정에서 세포-대-세포 상호작용을 조절하는 높은 보존성을 갖는 분비 신호전달 분자의 패밀리를 형성한다. 본원에서 사용될 때 용어 "Wnt" 또는 "Wnt 유전자 생성물" 또는 "Wnt 폴리펩티드"는 네이티브 서열 Wnt 폴리펩티드, Wnt 폴리펩티드 단편, 키메라 Wnt 폴리펩티드 또는 상기의 기능적으로 활성인 변이체를 포함한다. 용어 "WNT"와 "Wnt"는 본원에서 호환적으로 사용된다. 유사하게, 용어 "WNT3A", "WNT3a", "Wnt3A", 또는 "Wnt3a"는 본원에서 호환적으로 사용된다.
"네이티브(native) 서열" 폴리펩티드는 자연에서 유래된 Wnt 폴리펩티드와 동일한 아미노산 서열을 갖는 것이다. 이러한 네이티브 서열 폴리펩티드는 내인성 Wnt 단백질을 생산하는 세포로부터 단리될 수 있거나 재조합 또는 합성 수단에 의해 생산될 수 있다. 따라서, 네이티브 서열 폴리펩티드는 예를 들어 자연 발생 인간 폴리펩티드, 마우스 폴리펩티드, 또는 다른 어떤 포유동물 종 또는 비-포유동물 종, 예를 들어 드로소필라, 씨, 엘레간스(Drosophila, C. elegans) 등에서 유래된 폴리펩티드의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 어떤 경우에는, "네이티브 서열" 폴리펩티드는 N-말단 메티오닌을 포함하기도 한다. 어떤 경우에는, 네이티브 서열 폴리펩티드는 N-말단 메티오닌을 포함하지 않는다.
용어 "네이티브 서열 Wnt 폴리펩티드"는, 제한없이, 포유동물 Wnt 폴리펩티드, 예를 들어 인간 또는 마우스 Wnt 폴리펩티드를 포함한다. 인간 Wnt 폴리펩티드는 Wnt1, Wnt2, Wnt2b(또는 Wnt13), Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt5a, Wnt5b, Wnt6, Wnt7a, Wnt7b, Wnt8a, Wnt8b, Wnt9a(Wnt14, 또는 Wnt14b), Wnt9b(Wnt14b, 또는 Wnt15), Wnt10a, Wnt10b(또는 Wnt12), Wnt11, Wnt-16a, 또는 Wnt-16b 폴리펩티드를 포함한다. Wnt1는 진뱅크 참조번호(Genbank reference) NP005421.1 및 AAH74799.1로 조회될 수 있다. Wnt2는 진뱅크 참조번호 NP003382.1 및 AAH78170.1로 조회될 수 있다. 일반적으로, Wnt2는 뇌, 시상, 태아와 성인 폐 모두에서, 또는 태반에서 발현될 수 있다. Wnt2B는 두 가지 이소형을 가지며 진뱅크 참조번호는 각각 NP004176.2 및 NP078613.1이다. 이소형 1은 성인 심장, 뇌, 태반, 폐, 전립선, 고환, 난소, 소장 및/또는 결장에서 발현될 수 있다. 성인 뇌에서, 미상핵, 시상하핵 및 시상에서 주로 발견된다. 어떤 경우에는, 태아 뇌, 폐 및 신장에서도 검출된다. 이소형 2는 태아 뇌, 태아 폐, 태아 신장, 미상핵, 고환 및/또는 암세포주에서 발현될 수 있다.
Wnt3 및 Wnt3a는 발생하는 신경관의 형태발생 과정에서 세포-세포 신호전달에 특징적인 역할을 한다. Wnt3은 진뱅크 참조번호 AB060284.1(또한, 진뱅크 번호 BAB61052.1 및 AAI03924.1 참조)을 갖는다. Wnt3a는 서열 번호 1에 개시된 아미노산 서열 및 서열 번호 2에 개시된 핵산 서열을 갖는다. 네이티브 인간 Wnt3a 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 또한 진뱅크 참조번호 NM_033131에, 단백질 서열은 진뱅크 참조번호 NP_149122에 개시되어 있다. Wnt3a 단백질 전구물질은 진뱅크 참조번호 NP_149122.1이다. 네이티브 Wnt3a는 길이가 352개 아미노산 잔기이다. 이것은 아미노산 잔기 1-18인 신호 펩티드를 포함한다. 성숙 단백질은 아미노산 잔기 19-352를 포함한다. 예를 들어, Wnt3A의 Cys77 또는 Ser209는 서열 1에서 나타낸 바와 같이 전장 서열에 비교하여 언급된다. 어떤 경우에는, 용어 "네이티브 인간 Wnt3a" 폴리펩티드는 N-말단 메티오닌(Met)을 갖거나 갖지 않는, 그리고 네이티브 신호 서열을 가지거나 가지지 않는 서열 번호 1의 네이티브 인간 Wnt3a 폴리펩티드를 언급한다.
Wnt4는 진뱅크 참조번호 NP110388.2 및 BAC23080.1을 갖는다. Wnt5a는 진뱅크 참조번호 NP003383.1, 및 NP003383.2를 갖는다. Wnt5b는 진뱅크 참조번호 BAB62039.1 및 AAG38659를 갖는다. Wnt 6은 진뱅크 참조번호 NP006513.1 및 BAB55603.1을 갖는다. Wnt 7a는 진뱅크 참조번호 NP004616.2 및 BAA82509.1을 갖는다. Wnt 7a는 태반, 신장, 고환, 자궁, 태아 폐, 태아 뇌, 또는 성인 뇌에서 발현될 수 있다. Wnt 7b는 진뱅크 참조번호 NP4 78679.1 및 BAB68399.1을 갖는다. Wnt7b는 태아 뇌, 폐 및/또는 신장에서, 또는 성인 뇌, 폐 및/또는 전립선에서 발현될 수 있다. Wnt 8A는 적어도 두 개의 선택적인 전사체, 진뱅크 참조번호 NP 114139.1 및 NP490645.1을 갖는다. Wnt 8B는 전뇌에서 발현될 수 있다. Wnt 8B는 진뱅크 참조번호 NP003384.1을 갖는다. Wnt 10A는 진뱅크 참조번호 AAG45153 및 NP079492.2를 갖는다. Wnt 10B는 대부분의 성인 조직에서, 심장 및 골격근에서 최고 수준으로 검출된다. Wnt 10B는 진뱅크 참조번호 NP003385.2를 갖는다. Wnt 11은 태아 폐, 신장, 성인 심장, 간, 골격근, 및 췌장에서 발현될 수 있다. Wnt 11은 진뱅크 참조번호 NP004617.2를 갖는다. Wnt 14는 진뱅크 참조번호 NP003386.1을 갖는다. Wnt 15는 태아 신장 또는 성인 신장에서 발현될 수 있다. Wnt 15는 뇌에서도 발현될 수 있다. Wnt 15는 진뱅크 참조번호 NP003387.1을 갖는다. Wnt 16는 선택적 이어 맞추기(alternative splicing)에 의해 생산되는 두 가지 이소형, Wnt-16a 및 Wnt-16b을 갖는다. 이소형 Wnt-16a는 췌장에서 발현될 수 있다. 이소형 Wnt-16b은 말초 림프계 기관, 예를 들어, 비장, 맹장, 및 림프절에서, 또는 신장에서 발현될 수 있다. 그러나 Wnt-16b는 골수에서 발현될 수 있다. 진뱅크 참조번호는 Wnt16a 및 Wnt16b에 대해 각각 NP476509.1 및 NP057171.2이다. 열거된 모든 진뱅크, 스위스프롯(SwissProt) 및 기타 데이터베이스 서열은 명백하게 본원에서 참고에 포함된다.
"변이체" 폴리펩티드는 네이티브 서열 폴리펩티드와 100% 미만의 서열 동일성을 가지는 것으로 정의되는 기능적으로 활성인 폴리펩티드를 의미한다. 이러한 변이체는 더 긴 폴리펩티드 또는 더 짧은 폴리펩티드를 포함하는데, 예를 들어 여기서 한 개 이상의 아미노산 잔기가 네이티브 서열의 N- 또는 C 말단에, 또는 네이티브 서열 내에 첨가되고, 약 1개 내지 300개의 아미노산 잔기가 결실된다. 변이체 폴리펩티드는 네이티브 폴리펩티드 서열과 비교하여 한 개 이상의 아미노산 치환을 갖는 폴리펩티드, 또는 폴리펩티드 서열의 유도체를 포함하며, 여기서 아미노산 잔기는 공유적으로 변형되어 얻어진 생성물이 비자연 발생 아미노산을 갖는다.
"기능적으로 활성인" Wnt 폴리펩티드(예를 들어, Wnt3a 폴리펩티드)는 네이티브 서열 Wnt 폴리펩티드에 의해서 직접적으로 또는 간접적으로 유발되거나 수행되는 이펙터 기능을 포함한다. 네이티브 서열 Wnt 폴리펩티드의 이펙터 기능은 β-카테닌의 안정화, 줄기 세포 자기재생의 촉진, C57MG 형질전환 및 제노푸스(Xenopus) 동물 캡(cap) 분석에서 표적 유전자의 유도뿐만 아니라 인간 기형암종 세포에서 표적 유전자 발현을 포함한다. 정제된 Wnt 조성물은 줄기 세포의 유지 및 성장, 조직 재생 등을 포함한 다양한 치료 방법에서의 용도가 모색된다.
어떤 경우에는, 기능적으로 활성인 Wnt 변이체는 네이티브 서열의 Wnt 폴리펩티드와 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 또는 약 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 것이다. 한 실시양태에서 네이티브 서열 Wnt 폴리펩티드는 포유동물(예를 들어, 인간) Wnt 폴리펩티드, 예를 들어 Wnt3a이다.
용어 "아미노산"은 아미노기와 카복실기를 모두 포함하는 분자를 나타낸다. 적합한 아미노산은, 제한 없이, 자연발생 아미노산의 D- 및 L-이성질체뿐만 아니라 유기 합성 또는 기타 대사 경로에 의해 제조되는 비자연 발생 아미노산을 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 아미노산은, 제한 없이, α-아미노산, 천연 아미노산, 비천연 아미노산, 및 아미노산 유사체를 포함한다.
용어 "α-아미노산"은 α-탄소로 지정된 탄소에 결합된 아미노기 및 카복실기 모두를 포함하는 분자를 나타낸다.
용어 "β-아미노산"은 아미노기와 카복실기 모두를 β 배열로 포함하는 분자를 나타낸다.
용어 "자연 발생 아미노산"은 자연에서 합성되는 펩티드에서 보편적으로 발견되고, 한 문자 약어 A, R, N, C, D, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y 및 V로 알려진 20가지 아미노산 중 하나를 나타낸다.
하기 표는 천연 아미노산의 특성을 요약하여 나타낸다.
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"소수성 아미노산"은 소수성이 작은 아미노산 및 소수성이 큰 아미노산을 포함한다. "소수성이 작은 아미노산"은 글리신, 알라닌, 프롤린, 및 그들의 유사체이다. "소수성이 큰 아미노산"은 발린, 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판, 및 그들의 유사체이다. "극성 아미노산"은 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 티로신, 및 그들의 유사체이다. "전하를 띤 아미노산"은 리신, 아르기닌, 히스티딘, 아스파테이트, 글루타메이트, 및 그들의 유사체이다.
용어 "아미노산 유사체"는 아미노산과 구조적으로 유사하고 펩티드 모방체 매크로사이클(peptidomimetic macrocycle)의 형성 시 아미노산을 치환할 수 있는 분자를 나타낸다. 아미노산 유사체는 아미노기 또는 카복시기가 유사한 반응기에 의해 치환(예를 들어 2차 또는 3차 아민으로 1차 아민의 치환, 에스테르로 카복시기의 치환)된 β-아미노산 및 아미노산을 제한 없이 포함한다.
용어 "비천연 아미노산"은 자연에서 합성되는 펩티드에서 보편적으로 발견되고 한 문자 약어 A, R, N, C, D, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y 및 V로 알려진 20가지 아미노산이 아닌 아미노산을 나타낸다. 비천연 아미노산 또는 아미노산 유사체는 하기에 따른 구조를 제한 없이 포함한다.
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Figure 112016024262243-pct00004
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Figure 112016024262243-pct00008
아미노산 유사체는 β-아미노산 유사체를 포함한다. β-아미노산 유사체의 예는 시클릭 β-아미노산 유사체; β-알라닌; (R)-β-페닐알라닌; (R)-1,2,3,4-테트라히드로-이소퀴놀린-3-아세트산; (R)-3-아미노-4-(1-나프틸)-부티르산; (R)-3-아미노-4-(2,4-디클로로페닐)부티르산; (R)-3-아미노-4-(2-클로로페닐)-부티르산; (R)-3-아미노-4-(2-시아노페닐)-부티르산; (R)-3-아미노-4-(2-플루오로페닐)-부티르산; (R)-3-아미노-4-(2-푸릴)-부티르산; (R)-3-아미노-4-(2-메틸페닐)-부티르산; (R)-3-아미노-4-(2-나프틸)-부티르산; (R)-3-아미노-4-(2-티에닐)-부티르산; (R)-3-아미노-4-(2-트리플루오로메틸페닐)-부티르산; (R)-3-아미노-4-(3,4-디클로로페닐)부티르산; (R)-3-아미노-4-(3,4-디플루오로페닐)부티르산; (R)-3-아미노-4-(3-벤조티에닐)-부티르산; (R)-3-아미노-4-(3-클로로페닐)-부티르산; (R)-3-아미노-4-(3-시아노페닐)-부티르산; (R)-3-아미노-4-(3-플루오로페닐)-부티르산; (R)-3-아미노-4-(3-메틸페닐)-부티르산; (R)-3-아미노-4-(3-피리딜)-부티르산; (R)-3-아미노-4-(3-티에닐)-부티르산; (R)-3-아미노-4-(3-트리플루오로메틸페닐)-부티르산; (R)-3-아미노-4-(4-브로모페닐)-부티르산; (R)-3-아미노-4-(4-클로로페닐)-부티르산; (R)-3-아미노-4-(4-시아노페닐)-부티르산; (R)-3-아미노-4-(4-플루오로페닐)-부티르산; (R)-3-아미노-4-(4-요오도페닐)-부티르산; (R)-3-아미노-4-(4-메틸페닐)-부티르산; (R)-3-아미노-4-(4-니트로페닐)-부티르산; (R)-3-아미노-4-(4-피리딜)-부티르산; (R)-3-아미노-4-(4-트리플루오로메틸페닐)-부티르산; (R)-3-아미노-4-펜타플루오로-페닐부티르산; (R)-3-아미노-5-헥센산; (R)-3-아미노-5-헥신산; (R)-3-아미노-5-페닐펜탄산; (R)-3-아미노-6-페닐-5-헥센산; (S)-1,2,3,4-테트라히드로-이소퀴놀린-3-아세트산; (S)-3-아미노-4-(1-나프틸)-부티르산; (S)-3-아미노-4-(2,4-디클로로페닐)부티르산; (S)-3-아미노-4-(2-클로로페닐)-부티르산; (S)-3-아미노-4-(2-시아노페닐)-부티르산; (S)-3-아미노-4-(2-플루오로페닐)-부티르산; (S)-3-아미노-4-(2-푸릴)-부티르산; (S)-3-아미노-4-(2-메틸페닐)-부티르산; (S)-3-아미노-4-(2-나프틸)-부티르산; (S)-3-아미노-4-(2-티에닐)-부티르산; (S)-3-아미노-4-(2-트리플루오로메틸페닐)-부티르산; (S)-3-아미노-4-(3,4-디클로로페닐)부티르산; (S)-3-아미노-4-(3,4-디플루오로페닐)부티르산; (S)-3-아미노-4-(3-벤조티에닐)-부티르산; (S)-3-아미노-4-(3-클로로페닐)-부티르산; (S)-3-아미노-4-(3-시아노페닐)-부티르산; (S)-3-아미노-4-(3-플루오로페닐)-부티르산; (S)-3-아미노-4-(3-메틸페닐)-부티르산; (S)-3-아미노-4-(3-피리딜)-부티르산; (S)-3-아미노-4-(3-티에닐)-부티르산; (S)-3-아미노-4-(3-트리플루오로메틸페닐)-부티르산; (S)-3-아미노-4-(4-브로모페닐)-부티르산; (S)-3-아미노-4-(4-클로로페닐) 부티르산; (S)-3-아미노-4-(4-시아노페닐)-부티르산; (S)-3-아미노-4-(4-플루오로페닐) 부티르산; (S)-3-아미노-4-(4-요오도페닐)-부티르산; (S)-3-아미노-4-(4-메틸페닐)-부티르산; (S)-3-아미노-4-(4-니트로페닐)-부티르산; (S)-3-아미노-4-(4-피리딜)-부티르산; (S)-3-아미노-4-(4-트리플루오로메틸페닐)-부티르산; (S)-3-아미노-4-펜타플루오로-페닐부티르산; (S)-3-아미노-5-헥센산; (S)-3-아미노-5-헥신산; (S)-3-아미노-5-페닐펜탄산; (S)-3-아미노-6-페닐-5-헥센산; 1,2,5,6-테트라히드로피리딘-3-카복실산; 1,2,5,6-테트라히드로피리딘-4-카복실산; 3-아미노-3-(2-클로로페닐)-프로피온산; 3-아미노-3-(2-티에닐)-프로피온산; 3-아미노-3-(3-브로모페닐)-프로피온산; 3-아미노-3-(4-클로로페닐)-프로피온산; 3-아미노-3-(4-메톡시페닐)-프로피온산; 3-아미노-4,4,4-트리플루오로-부티르산; 3-아미노아디프산; D-β-페닐알라닌; β-류신; L-β-호모알라닌; L-β-호모아스파르트산 γ-벤질 에스테르; L-β-호모글루탐산 δ-벤질 에스테르; L-β-호모이소류신; L-β-호모류신; L-β-호모메티오닌; L-β-호모페닐알라닌; L-β-호모프롤린; L-β-호모트립토판; L-β-호모발린; L-Nω-벤질옥시카보닐-β-호모리신; Nω-L-β-호모아르기닌; O-벤질-L-β-호모히드록시프롤린; O-벤질-L-β-호모세린; O-벤질-L-β-호모트레오닌; O-벤질-L-β-호모티로신; γ-트리틸-L-β-호모아스파라긴; (R)-β-페닐알라닌; L-β-호모아스파르트산 γ-t-부틸 에스테르; L-β-호모글루탐산 δ-t-부틸 에스테르; L-Nω-β-호모리신; Nδ-트리틸-L-β-호모글루타민; Nω-2,2,4,6,7-펜타메틸-디히드로벤조푸란-5-설포닐-L-β-호모아르기닌; O-t-부틸-L-β-호모히드록시-프롤린; O-t-부틸-L-β-호모세린; O-t-부틸-L-β-호모트레오닌; O-t-부틸-L-β-호모티로신; 2-아미노시클로펜탄 카복실산; 및 2-아미노시클로헥산 카복실산을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
아미노산 유사체는 알라닌, 발린, 글리신 또는 류신의 유사체를 포함한다. 알라닌, 발린, 글리신, 및 류신의 아미노산 유사체의 예는 α-메톡시글리신; α-알릴-L-알라닌; α-아미노이소부티르산; α-메틸-류신; β-(1-나프틸)-D-알라닌; β-(1-나프틸)-L-알라닌; β-(2-나프틸)-D-알라닌; β-(2-나프틸)-L-알라닌; β-(2-피리딜)-D-알라닌; β-(2-피리딜)-L-알라닌; β-(2-티에닐)-D-알라닌; β-(2-티에닐)-L-알라닌; β-(3-벤조티에닐)-D-알라닌; β-(3-벤조티에닐)-L-알라닌; β-(3-피리딜)-D-알라닌; β-(3-피리딜)-L-알라닌; β-(4-피리딜)-D-알라닌; β-(4-피리딜)-L-알라닌; β-클로로-L-알라닌; β-시아노-L-알라닌; β-시클로헥실-D-알라닌; β-시클로헥실-L-알라닌; β-시클로펜텐-1-일-알라닌; β-시클로펜틸-알라닌; β-시클로프로필-L-Ala-OH.디시클로헥실암모늄 염; β-t-부틸-D-알라닌; β-t-부틸-L-알라닌; γ-아미노부티르산; L-α,β-디아미노프로피온산; 2,4-디니트로-페닐글리신; 2,5-디히드로-D-페닐글리신; 2-아미노-4,4,4-트리플루오로부티르산; 2-플루오로플루오로-페닐글리신; 3-아미노-4,4,4-트리플루오로-부티르산; 3-플루오로-발린; 4,4,4-트리플루오로-발린; 4,5-디히드로-L-leu-OH.디시클로헥실암모늄 염; 4-플루오로-D-페닐글리신; 4-플루오로-L-페닐글리신; 4-히드록시-D-페닐글리신; 5,5,5-트리플루오로-류신; 6-아미노헥산산; 시클로펜틸-D-Gly-OH.디시클로헥실암모늄 염; 시클로펜틸-Gly-OH.디시클로헥실암모늄 염; D-α,β-디아미노프로피온산; D-α-아미노부티르산; D-α-t-부틸글리신; D-(2-티에닐)글리신; D-(3-티에닐)글리신; D-2-아미노카프로산: D-2-인다닐글리신; D-알릴글리신-디시클로헥실암모늄 염; D-시클로헥실글리신; D-노르발린; D-페닐글리신; β-아미노부티르산; β-아미노이소부티르산; (2-브로모페닐)글리신; (2-메톡시페닐)글리신; (2-메틸페닐)글리신; (2-티아조일)글리신; (2-티에닐)글리신; 2-아미노-3-(디메틸아미노)-프로피온산; L-α,β-디아미노프로피온산; L-α-아미노부티르산; L-α-t-부틸글리신; L-(3-티에닐)글리신; L-2-아미노-3-(디메틸아미노)-프로피온산; L-2-아미노카프로산 디시클로헥실-암모늄 염; L-2-인다닐글리신; L-알릴글리신.디시클로헥실 암모늄 염; L-시클로헥실글리신; L-페닐글리신; L-프로파르길글리신; L-노르발린; N-α-아미노메틸-L-알라닌; D-α,γ-디아미노부티르산; L-α,γ-디아미노부티르산; β-시클로프로필-L-알라닌; (N-β-(2,4-디니트로페닐))-L-α,β-디아미노프로피온산; (N-β-1-(4,4-디메틸-2,6-디옥소시클로헥스-1-일리덴)에틸)-D-α,β-디아미노프로피온산; (N-β-1-(4,4-디메틸-2,6-디옥소시클로헥스-1-일리덴)에틸)-L-α,β-디아미노프로피온산; (N-β-4-메틸트리틸)-L-α,β-디아미노프로피온산; (N-β-알릴옥시카보닐)-L-α,β-디아미노프로피온산; (N-γ-1-(4,4-디메틸-2,6-디옥소시클로헥스-1-일리덴)에틸)-D-α,γ-디아미노부티르산; (N-γ-1-(4,4-디메틸-2,6-디옥소시클로헥스-1-일리덴)에틸)-L-α,γ-디아미노부티르산; (N-γ-4-메틸트리틸)-D-α,γ-디아미노부티르산; (N-γ-4-메틸트리틸)-L-α,γ-디아미노부티르산; (N-γ-알릴옥시카보닐)-L-α,γ-디아미노부티르산; D-α,γ-디아미노부티르산; 4,5-디히드로-L-류신; 시클로펜틸-D-Gly-OH; 시클로펜틸-Gly-OH; D-알릴글리신; D-호모시클로헥실알라닌; L-1-피레닐알라닌; L-2-아미노카프로산; L-알릴글리신; L-호모시클로헥실알라닌; 및 N-(2-히드록시-4-메톡시-Bzl)-Gly-OH를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
아미노산 유사체는 아르기닌 또는 리신의 유사체를 포함한다. 아르기닌 및 리신의 아미노산 유사체의 예는 시트룰린; L-2-아미노-3-구아니디노프로피온산; L-2-아미노-3-우레이도프로피온산; L-시트룰린; Lys(Me)2-OH; Lys(N3)―OH; Nδ-벤질옥시카보닐-L-오르니틴; Nω-니트로-D-아르기닌; Nω-니트로-L-아르기닌; α-메틸-오르니틴; 2,6-디아미노헵탄디온산; L-오르니틴; (Nδ-1-(4,4-디메틸-2,6-디옥소-시클로헥스-1-일리덴)에틸)-D-오르니틴; (Nδ-1-(4,4-디메틸-2,6-디옥소-시클로헥스-1-일리덴)에틸)-L-오르니틴; (Nδ-4-메틸트리틸)-D-오르니틴; (Nδ-4-메틸트리틸)-L-오르니틴; D-오르니틴; L-오르니틴; Arg(Me)(Pbf)-OH; Arg(Me)2-OH (비대칭); Arg(Me)2-OH (대칭); Lys(ivDde)-OH; Lys(Me)2-OH.HCl; Lys(Me3)-OH 클로라이드; Nω-니트로-D-아르기닌; 및 Nω-니트로-L-아르기닌을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
아미노산 유사체는 아스파르트산 또는 글루탐산의 유사체를 포함한다. 아스파르트산 및 글루탐산의 아미노산 유사체의 예는 α-메틸-D-아스파르트산; α-메틸-글루탐산; α-메틸-L-아스파르트산; γ-메틸렌-글루탐산; (N-γ-에틸)-L-글루타민; [N-α-(4-아미노벤조일)]-L-글루탐산; 2,6-디아미노피멜산; L-α-아미노수베르산; D-2-아미노아디프산; D-α-아미노수베르산; α-아미노피멜산; 이미노디아세트산; L-2-아미노아디프산; 트레오-β-메틸-아스파르트산; γ-카복시-D-글루탐산 γ,γ-디-t-부틸 에스테르; γ-카복시-L-글루탐산 γ,γ-디-t-부틸 에스테르; Glu(OAll)-OH; L-Asu(OtBu)―OH; 및 피로글루탐산을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
아미노산 유사체는 시스테인 및 메티오닌의 유사체를 포함한다. 시스테인 및 메티오닌의 아미노산 유사체의 예는 Cys(파네실)-OH, Cys(파네실)-OMe, α-메틸-메티오닌, Cys(2-히드록시에틸)-OH, Cys(3-아미노프로필)-OH, 2-아미노-4-(에틸티오)부티르산, 부티오닌, 부티오닌설폭시민, 에티오닌, 메티오닌 메틸설포늄 클로라이드, 셀레노메티오닌, 시스테산, [2-(4-피리딜)에틸]-DL-페니실라민, [2-(4-피리딜)에틸]-L-시스테인, 4-메톡시벤질-D-페니실라민, 4-메톡시벤질-L-페니실라민, 4-메틸벤질-D-페니실라민, 4-메틸벤질-L-페니실라민, 벤질-D-시스테인, 벤질-L-시스테인, 벤질-DL-호모시스테인, 카바모일-L-시스테인, 카복시에틸-L-시스테인, 카복시메틸-L-시스테인, 디페닐메틸-L-시스테인, 에틸-L-시스테인, 메틸-L-시스테인, t-부틸-D-시스테인, 트리틸-L-호모시스테인, 트리틸-D-페니실라민, 시스타티오닌, 호모시스틴, L-호모시스틴, (2-아미노에틸)-L-시스테인, 셀레노-L-시스틴, 시스타티오닌, Cys(StBu)―OH, 및 아세트아미도메틸-D-페니실라민을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
아미노산 유사체는 페닐알라닌 및 티로신의 유사체를 포함한다. 페닐알라닌 및 티로신의 아미노산 유사체의 예는 β-메틸-페닐알라닌, β-히드록시페닐알라닌, α-메틸-3-메톡시-DL-페닐알라닌, α-메틸-D-페닐알라닌, α-메틸-L-페닐알라닌, 1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린-3-카복실산, 2,4-디클로로-페닐알라닌, 2-(트리플루오로메틸)-D-페닐알라닌, 2-(트리플루오로메틸)-L-페닐알라닌, 2-브로모-D-페닐알라닌, 2-브로모-L-페닐알라닌, 2-클로로-D-페닐알라닌, 2-클로로-L-페닐알라닌, 2-시아노-D-페닐알라닌, 2-시아노-L-페닐알라닌, 2-플루오로-D-페닐알라닌, 2-플루오로-L-페닐알라닌, 2-메틸-D-페닐알라닌, 2-메틸-L-페닐알라닌, 2-니트로-D-페닐알라닌, 2-니트로-L-페닐알라닌, 2;4;5-트리히드록시-페닐알라닌, 3,4,5-트리플루오로-D-페닐알라닌, 3,4,5-트리플루오로-L-페닐알라닌, 3,4-디클로로-D-페닐알라닌, 3,4-디클로로-L-페닐알라닌, 3,4-디플루오로-D-페닐알라닌, 3,4-디플루오로-L-페닐알라닌, 3,4-디히드록시-L-페닐알라닌, 3,4-디메톡시-L-페닐알라닌, 3,5,3'-트리요오도-L-티로닌, 3,5-디요오도-D-티로신, 3,5-디요오도-L-티로신, 3,5-디요오도-L-티로닌, 3-(트리플루오로메틸)-D-페닐알라닌, 3-(트리플루오로메틸)-L-페닐알라닌, 3-아미노-L-티로신, 3-브로모-D-페닐알라닌, 3-브로모-L-페닐알라닌, 3-클로로-D-페닐알라닌, 3-클로로-L-페닐알라닌, 3-클로로-L-티로신, 3-시아노-D-페닐알라닌, 3-시아노-L-페닐알라닌, 3-플루오로-D-페닐알라닌, 3-플루오로-L-페닐알라닌, 3-플루오로-티로신, 3-요오도-D-페닐알라닌, 3-요오도-L-페닐알라닌, 3-요오도-L-티로신, 3-메톡시-L-티로신, 3-메틸-D-페닐알라닌, 3-메틸-L-페닐알라닌, 3-니트로-D-페닐알라닌, 3-니트로-L-페닐알라닌, 3-니트로-L-티로신, 4-(트리플루오로메틸)-D-페닐알라닌, 4-(트리플루오로메틸)-L-페닐알라닌, 4-아미노-D-페닐알라닌, 4-아미노-L-페닐알라닌, 4-벤조일-D-페닐알라닌, 4-벤조일-L-페닐알라닌, 4-비스(2-클로로에틸)아미노-L-페닐알라닌, 4-브로모-D-페닐알라닌, 4-브로모-L-페닐알라닌, 4-클로로-D-페닐알라닌, 4-클로로-L-페닐알라닌, 4-시아노-D-페닐알라닌, 4-시아노-L-페닐알라닌, 4-플루오로-D-페닐알라닌, 4-플루오로-L-페닐알라닌, 4-요오도-D-페닐알라닌, 4-요오도-L-페닐알라닌, 호모페닐알라닌, 티록신, 3,3-디페닐알라닌, 티로닌, 에틸-티로신, 및 메틸-티로신을 포함한다.
아미노산 유사체는 프롤린의 유사체를 포함한다. 프롤린의 아미노산 유사체의 예는 3,4-디히드로-프롤린, 4-플루오로-프롤린, 시스-4-히드록시-프롤린, 티아졸리딘-2-카복실산, 및 트랜스-4-플루오로-프롤린을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
아미노산 유사체는 세린 및 트레오닌의 유사체를 포함한다. 세린 및 트레오닌의 아미노산 유사체의 예는 3-아미노-2-히드록시-5-메틸헥산산, 2-아미노-3-히드록시-4-메틸펜탄산, 2-아미노-3-에톡시부탄산, 2-아미노-3-메톡시부탄산, 4-아미노-3-히드록시-6-메틸헵탄산, 2-아미노-3-벤질옥시프로피온산, 2-아미노-3-벤질옥시프로피온산, 2-아미노-3-에톡시프로피온산, 4-아미노-3-히드록시부탄산, 및 α-메틸세린을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
아미노산 유사체는 트립토판의 유사체를 포함한다. 트립토판의 아미노산 유사체의 예는 α-메틸-트립토판; β-(3-벤조티에닐)-D-알라닌; β-(3-벤조티에닐)-L-알라닌; 1-메틸-트립토판; 4-메틸-트립토판; 5-벤질옥시-트립토판; 5-브로모-트립토판; 5-클로로-트립토판; 5-플루오로-트립토판; 5-히드록시-트립토판; 5-히드록시-L-트립토판; 5-메톡시-트립토판; 5-메톡시-L-트립토판; 5-메틸-트립토판; 6-브로모-트립토판; 6-클로로-D-트립토판; 6-클로로-트립토판; 6-플루오로-트립토판; 6-메틸-트립토판; 7-벤질옥시-트립토판; 7-브로모-트립토판; 7-메틸-트립토판; D-1,2,3,4-테트라히드로-노르하르만-3-카복실산; 6-메톡시-1,2,3,4-테트라히드로노르하르만-1-카복실산; 7-아자트립토판; L-1,2,3,4-테트라히드로-노르하르만-3-카복실산; 5-메톡시-2-메틸-트립토판; 및 6-클로로-L-트립토판을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 아미노산 유사체는 라세미체이다. 일부 실시양태에서, 아미노산 유사체의 D 이성질체가 사용된다. 일부 실시양태에서, 아미노산 유사체의 L 이성질체가 사용된다. 다른 실시양태에서, 아미노산 유사체는 R 또는 S 배열에 있는 키랄 중심을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, β-아미노산 유사체의 아미노기(들)은 보호기, 예를 들어 tert-부틸옥시카보닐(BOC기), 9-플루오레닐메틸옥시카보닐(FMOC), 토실 등으로 치환된다. 또 다른 실시양태에서, β-아미노산 유사체의 카복실산 작용기는 예를 들어 그의 에스테르 유도체로서 보호된다. 일부 실시양태에서 아미노산 유사체의 염이 사용된다.
"비필수" 아미노산 잔기는 그의 필수적인 생물학적 또는 생화학적 활성(예를 들어, 수용체 결합 또는 활성화)를 파괴하거나 실질적으로 변경시키지 않으면서 야생형 서열의 폴리펩티드로부터 변경될 수 있는 잔기이다. "필수" 아미노산 잔기는 야생형 서열의 폴리펩티드로부터 변경될 때 결과적으로 폴리펩티드의 필수적인 생물학적 또는 생화학적 활성을 파괴하거나 실질적으로 파괴하는 잔기이다.
"보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 치환된 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기 패밀리는 당 업계에서 정의되어 있다. 이들 패밀리는 염기성 측쇄(예를 들어, K, R, H), 산성 측쇄(D, E), 전하를 띠지 않는 극성 측쇄(예를 들어, G, N, Q, S, T, Y, C), 비극성 측쇄(예를 들어, A, V, L, I, P, F, M, W), 베타-분지형 측쇄(예를 들어, T, V, I) 및 방향족 측쇄(예를 들어, Y, F, W, H)를 포함한다. 따라서, 폴리펩티드 내 예상되는 비필수 아미노산 잔기는, 예를 들어 동일한 측쇄 패밀리 중 또 다른 아미노산 잔기로 치환된다. 허용 가능한 치환의 다른 예로는 등전자성(예를 들어, 메티오닌을 노르류신으로) 또는 다른 특성(예를 들어 페닐알라닌을 2-티에닐알라닌으로, 또는 트립토판을 CI-트립토판으로)에 기초한 치환이다.
B. 상세한 설명
Wnt3a의 분자 클로닝 및 특성화는 문헌(Saitoh et al., Biochem Biophys Res Commun, 2001, 29; 284(5):1168-75)에 기재되었다. 네이티브 인간 Wnt3a는 352개의 아미노산(서열 번호 1)로 이루어진 지질 변형된 성장 인자로서 줄기 세포를 활성화하거나 자기재생을 촉진하는데 효과적이다. 어떤 경우에는, 활성의 Wnt3a 폴리펩티드 또는 다른 Wnt 폴리펩티드는 그의 소수성으로 인해 측정가능한 수준의 동질성을 갖도록 정제하는데 어려움이 있다. 한 측면에서, Wnt 폴리펩티드의 정제 방법이 본원에서 기재된다. 어떤 경우에는, 정제방법은 인간 Wnt 폴리펩티드의 순도 및 수율을 향상시킨다. 일부 실시양태에서, 정제된 Wnt 폴리펩티드는 최적의 치료계획의 일부로서 사용된다. 일부 실시양태에서, 정제된 Wnt 폴리펩티드는 치료 폴리펩티드로서 사용된다.
본원에서 다른 부분에서 기재된 바와 같이, Wnt 폴리펩티드는 높은 보존성을 갖는 분비되는 신호전달 분자 패밀리를 형성한다. Wnt 폴리펩티드는 포유동물, 예를들어 인간 Wnt 폴리펩티드일 수 있다. 일부 실시양태에서, Wnt 폴리펩티드는 Wnt1, Wnt2, Wnt2b(또는 Wnt13), Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt5a, Wnt5b, Wnt6, Wnt7a, Wnt7b, Wnt8a, Wnt8b, Wnt9a(Wnt14, 또는 Wnt14b), Wnt9b(Wnt14b, 또는 Wnt15), Wnt10a, Wnt10b(또는 Wnt12), Wnt11, Wnt-16a, 또는 Wnt-16b 폴리펩티드 서열 또는 그의 기능적으로 활성인 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, Wnt 폴리펩티드는 Wnt3a 폴리펩티드, Wnt5a 폴리펩티드, Wnt10b 폴리펩티드 및 그의 기능적으로 활성인 Wnt 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, Wnt 폴리펩티드는 Wnt3a 폴리펩티드 또는 그의 기능적으로 활성인 변이체이다. 일부 실시양태에서, Wnt 폴리펩티드는 Wnt5a 폴리펩티드 또는 그의 기능적으로 활성인 변이체이다. 일부 실시양태에서, Wnt 폴리펩티드는 Wnt10b 폴리펩티드 또는 그의 기능적으로 활성인 변이체이다. 일부 실시양태에서, Wnt3a 폴리펩티드는 인간 Wnt3a 폴리펩티드 또는 그의 기능적으로 활성인 변이체이다. 어떤 경우에는, 기능적으로 활성인 변이체 Wnt3a 폴리펩티드의 서열 동일성은 네이티브 Wnt3a 폴리펩티드 서열, 예를 들어 인간 Wnt3a 폴리펩티드 서열(예를 들어, 서열 번호 NO:1)과 적어도 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 99% 동일하다. 어떤 경우에는, 기능적으로 활성인 변이체 Wnt3a 폴리펩티드의 서열 동일성은 네이티브 Wnt3a 폴리펩티드 서열, 예를 들어 인간 Wnt3a 폴리펩티드 서열(예를 들어, 서열 번호 NO:1)과 최대 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 100% 동일하다. 어떤 경우에는, Wnt3a 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열 번호 1에 개시된 바와 같거나, Wnt3a 폴리펩티드는 서열 번호 2의 핵산 서열에 의해 코딩된다.
어떤 경우에는, 본원에서 기재된 정제 도식은 간단하고 경제적이다. 어떤 경우에는, 본원에서 기재된 정제 도식으로 기능적으로 활성인 형태의 Wnt 폴리펩티드를 고순도로 정제할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에서 기재된 정제방법으로 재조합 숙주 세포의 배양 배지로부터 Wnt 폴리펩티드를 정제할 수 있다. 어떤 경우에는, 재조합 숙주 세포 또는 발현 세포주는 원핵 숙주 세포 또는 발현 세포주, 효모 숙주 세포 또는 발현 세포주, 곤충 숙주 세포 또는 발현 세포주, 또는 포유동물 숙주 세포 또는 발현 세포주이다.
일부 실시양태에서, 재조합 숙주 세포 또는 발현 세포주는 효모 숙주 세포 또는 발현 세포주이다. 대표적인 효모 숙주 세포는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 효모 균주, 예를 들어 GS115, KM71H, SMD1168, SMD1168H, 및 X-33; 및 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 효모 균주, 예를 들어 INVSc1을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 재조합 숙주 세포 또는 발현 세포주는 곤충 숙주 세포 또는 발현 세포주이다. 대표적인 곤충 세포주는 초파리(Drosophila) S2 세포, Sf9 세포, Sf21 세포, 하이 파이브™(High Five™) 세포, 및 엑스프레스SF+®(expresSF+®) 세포를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 재조합 숙주 세포 또는 발현 세포주는 포유동물 숙주 세포 또는 발현 세포주이다. 어떤 경우에는, 포유동물 세포주는 안정한 세포주, 또는 관심의 유전물질을 자신의 게놈에 편입시켜 많은 세대의 세포 분열 후에 유전물질의 산물을 발현할 수 있는 세포주이다. 일부 실시양태에서, 포유동물 세포주는 현행 우수 제조 관리 기준(Current Good Manufacturing Practices: cGMP)을 준수하는 세포주이다. 대표적인 포유동물 세포주는 293A 세포주, 293FT 세포주, 293F 세포, 293 H 세포, CHO DG44 세포, CHO-S 세포, CHO-K1 세포, Expi293F™ 세포, Flp-In™ T-REx™ 293 세포주, Flp-In™-293 세포주, Flp-In™-3T3 세포주, Flp-In™-BHK 세포주, Flp-In™-CHO 세포주, Flp-In™-CV-1 세포주, Flp-In™-주르캣(Jurkat) 세포주, 프리스타일™(FreeStyle™) 293-F 세포, 프리스타일™ CHO-S 세포, 그립타이트™(GripTite™) 293 MSR 세포주, GS-CHO 세포주, HepaRG™ 세포, T-REx™ 주르캣 세포주, Per.C6 세포, T-REx™-293 세포주, T-REx™-CHO 세포주, 및 T-REx™-헬라(HeLa) 세포주를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 포유동물 세포주는 CHO 세포주이다. 일부 실시양태에서, 포유동물 세포주는 CHO-S 세포주이다. 본원에서 사용되는 "CHO 세포" 또는 "CHO 세포주"는 다양한 유형의 CHO 세포 및 CHO 세포주를 포함하는 총칭이다.
일부 실시양태에서, 포유동물 숙주 세포는 연한천 중에 액상 현탁 배양물로서, 또는 연한천 상에 단층으로 배양된다. 일부 실시양태에서, CHO 세포는 연한천 중에 액상 현탁 배양물로서, 또는 연한천 상에 단층으로 배양된다. 일부 실시양태에서, CHO 세포는 액상 현탁 배양물로 배양된다. 어떤 경우에는, 배양 배지는 혈청을 포함한다. 혈청의 비제한적인 예로는 소 태아 혈청(FBS), 하이클론 페탈클론(HyClone FetalClone) II 및 III, 철분이 보충된 송아지 혈청(ICS), 및 인간 혈소판 용해물이 포함된다. 일부 실시양태에서, 혈청은 FBS이다. 일부 실시양태에서, FBS는 배지 중에 최대 약 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15% 이하로 제공된다. 일부 실시양태에서, FBS는 배지 중에 적어도 약 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15% 이상으로 제공된다.
일부 실시양태에서, 혈청(예를 들어, FBS)은 발현을 유도하고 Wnt 폴리펩티드(예를 들어, Wnt3a 폴리펩티드)를 배양 배지로 분비시키는데 필요하다. 일부 실시양태에서, 혈청은 Wnt 폴리펩티드(예를 들어, Wnt3a에서 Ser 209와 같은 잔기)에 지질 변형에 사용되는 한 가지 이상의 필수 인자를 제공한다. 일부 실시양태에서, 혈청은 Wnt 폴리펩티드(예, Wnt3a)를 소포체(ER)에서 골지체로, 그 후 세포막으로 운반하는데 사용되는 한 가지 이상의 샤페론 단백질 및 친유성 분자를 제공한다.
일부 실시양태에서, 혈청은 지질 구성요소를 제거하기 위해 개질된다. 어떤 경우에는, 그 후 정해진 지질 군을 개질된 혈청에 도입한다. 어떤 경우에는, 박리제(stripping agent), 예를 들어 숯을 사용하여 혈청으로부터 비극성 친유성 물질(예를 들어, 바이러스, 성장인자, 및 호르몬)을 제거한다. 어떤 경우에는, 지질 보충제가 개질된 혈청에 도입된다. 지질 보충제의 비제한적인 예로는 리피드 믹스쳐 1(Lipid Mixture 1)(Sigma-Aldrich), 리피드 믹스쳐 2(Sigma-Aldrich), 리포그로®(Lipogro®)(Rocky Mountain Biologicals), 및 케미컬리 디파인드 리피드 콘센트레이션(Chemically Defined Lipid Concentration)(Life Technologies)가 포함된다.
일부 실시양태에서, 포유동물 숙주 세포(예를 들어, CHO 또는 CHO-S 세포)는 무혈청 배지에서 배양된다. 무혈청 배지의 비제한적인 예로는 CD CHO 배지, CD CHO AGT™ 배지, CD OptiCHO™ 배지, CHO-S-SFM II(히포잔틴 및 티민을 선택적으로 포함), CD 293 AGT™ 배지, 아데노바이러스 발현 배지(AEM: Adenovirus Expression Medium), 프리스타일™ 293 발현 배지, EX-CELL® 302 무혈청 배지, EX-CELL® 325 PF CHO 무혈청 배지, 동물 구성요소 무첨가 EX-CELL® CD CHO-2 배지, EX-CELL® CD CHO-3 배지, 및 동물 구성요소 무첨가 EX-CELL® CDHO DHFR- 배지가 포함된다.
일부 실시양태에서, 무혈청 배지는 한 가지 이상의 추가 보충제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 추가 보충제는 혈청이다. 어떤 경우에는, 혈청은 FBS이다. 어떤 경우에는, FBS는 무혈청 배지 중에 최대 약 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15% 이하로 제공된다. 어떤 경우에는, FBS는 무혈청 배지 중에 적어도 약 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15% 이상으로 제공된다.
일부 실시양태에서, 추가 보충제는 지질 보충제이다. 지질 보충제의 비제한적인 예로는 리피드 믹스쳐 1(Sigma-Aldrich), 리피드 믹스쳐 2(Sigma-Aldrich), 리포그로®(Rocky Mountain Biologicals), 및 케미컬리 디파인드 리피드 콘센트레이션(Life Technologies)이 포함된다. 일부 실시양태에서, 무혈청 배지는 지질 보충제를 포함한다.
일부 실시양태에서, 추가 보충제는 혈청 대용물이다. 일부 실시양태에서, 혈청 대용물은 엑사이트(EXCYTE)(Millipore), 엑사이트 + 인간 혈청 알부민 + AOF ITS(인슐린, 트랜스페린, 및 셀레늄)(Millipore), 인간 혈청 알부민(Millipore), 황산헤파린(Sigma), 본원의 다른 부분에서 기재된 지질로부터 선택되며 DMPC 및 콜레스테롤, 셀-에스(Cell-ess)(Essential Pharmaceuticals) 등에 제한되지 않는다. 어떤 경우에는, 혈청 대용물 존재 시 Wnt 폴리펩티드는 조정 배지로 분비된다. 어떤 경우에는, 혈청 대용물 존재 시 Wnt 폴리펩티드는 조정 배지로 분비되지 않는다. 어떤 경우에는, 혈청 대용물 존재 시 Wnt3a 폴리펩티드는 조정 배지로 분비된다. 어떤 경우에는, 혈청 대용물 존재 시 Wnt3a 폴리펩티드는 조정 배지로 분비되지 않는다.
일부 실시양태에서, 무혈청 배지에 내성을 갖는 발현 벡터가 사용된다. 어떤 경우에는, 발현 벡터는 원하는 전사체의 높은 카피수와 관심 폴리펩티드의 분비를 이끈다. 어떤 경우에는, 발현 벡터는 cGMP에 일치하는 포유동물 세포주와 적합하다. 포유동물 발현 벡터의 비제한적인 예로는 pOptivec 벡터, pTargeT™ 벡터, BacMam pCMV-Dest 벡터, Flp-In™ 코어 시스템, 벡터의 게이트웨이® 스위트(Gateway® suite), 할로태그®(HaloTag®) 벡터, 플렉시®(Flexi®) 벡터, pCMVTNT™ 벡터, 및 pcDNA™4/TO 벡터가 포함된다. 일부 실시양태에서, 발현 벡터는 pOptivec 및 pTargeT™ 벡터로부터 선택된다. pOptivec 벡터는 TOPO® 개조된 이중 시스트론 플라스미드 벡터로서, CMV 프로모터 하류에 포유동물 분비 신호 및 관심 유전자를 포함하는 유전자의 신속한 클로닝을 가능하게 한다. 디히드로엽산 환원효소 선별 마커는 신속한 선별을 가능하게 한다. 어떤 경우에는, 상기 벡터는 CHO-S 세포의 일시적인 형질감염에 사용된다. 어떤 경우에는, pTargeT™ 벡터는 CHO-S 세포의 일시적인 형질감염 및 Wnt 폴리펩티드(예를 들어, Wnt3a)를 발현하는 안정 세포주의 생성에 사용된다.
일부 실시양태에서, 배양 조건의 산성화를 이용하여 Wnt 분비를 돕는다. 어떤 경우에는, 배양 조건의 산성화를 이용하여 Wnt3a 분비를 돕는다. 어떤 경우에는, 산성화는 소포의 산성화를 모방한다. 어떤 경우에는, 산성화는 세포질의 산성화이다. 어떤 경우에는, 산성화는 조정 배지에서 성장하는 세포에 의해 분비되는 산과 같이 자연적으로 발생하거나, 예를 들어 아세트산과 같은 산의 첨가와 같이 인공적으로 발생한다. 어떤 경우에는, 산성화는 Wnt 폴리펩티드의 분비를 돕는다. 어떤 경우에는, 산성화는 Wnt3a 폴리펩티드의 분비를 돕는다.
일부 실시양태에서, 효모 세포, 곤충 세포 또는 포유동물 세포에서 Wnt 폴리펩티드의 발현 방법은 당 업계에 잘 알려진 프로토콜을 따른다. 어떤 경우에는, Wnt 폴리펩티드는 포유동물 세포에서 발현된다. 일부 실시양태에서, 전사 유발제를 사용하여 Wnt 폴리펩티드의 발현을 유도한다. 어떤 경우에는, 전사 유도제는 독시사이클린, 테트라사이클린, 및 쿠머마이신을 포함한다. 어떤 경우에는, 발현은 구성적이거나 폴리펩티드가 유도제 없이 발현된다. 일부 실시양태에서, Wnt 폴리펩티드는 배지로 분비된다. 어떤 경우에는, 조정 배지를 회수하고 첨가제를 첨가하여 Wnt 폴리펩티드의 용해도를 높인다. 어떤 경우에는 첨가제는 계면활성제이다. 어떤 경우에는, 계면활성제는 비이온계 계면활성제, 음이온계 계면활성제, 또는 양쪽성 이온계 계면활성제이다. 대표적인 계면활성제는 Brij-35, Brij-58, 3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트(CHAPS), 3-([3-콜아미도프로필]디메틸암모니오)-2-히드록시-1-프로판설포네이트(CHAPSO), 노닐 페녹시폴리에톡실에탄올(NP-40), 옥틸 글루코시드, 옥틸 티오글루코시드, 소듐 도데실 설페이트(SDS), 트리톤 X-100, 트리톤 X-114, 트윈(Tween) 20, 및 트윈 80을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 계면활성제는 CHAPS 또는 트리톤 X-100이다. 일부 실시양태에서, 계면활성제는 CHAPS이다. CHAPS는 막 단백질의 용해도를 높이는데 유용한 양쪽이온성 계면활성제이다. 일부 실시양태에서, Wnt 폴리펩티드는 또한 글리코실화 및 팔미토일화에 의해 번역 후 변형된다.
팔미토일화는 지방산, 예를 들어 팔미트산을 시스테인, 세린, 및 트레오닌 잔기에 공유적으로 부착하는 것이다. 어떤 경우에는, 팔미토일화는 단백질의 소수성을 증강시키고 그 단백질의 막 결합에 기여한다. 예를 들어, 누스 등(Nusse et al.) 연구자들은 마우스 Wnt3a 단백질을 보존된 시스테인 잔기(C77)에서 S-팔미토일화하였다(Willert et al., Nature, 2003, 423:448-452)는 것과 팔리토일화된 Cys77이 알라닌(C77A)으로 치환된 마우스 Wnt3a 단백질의 변이 형태가 Wnt 신호전달의 활성화 능력에서 감소를 보였으나 배양 배지로 정상적으로 분비되었다는 것을 보고하였다. 또한, 상기 연구는 Cys77 잔기의 팔미토일화가 생물학적 활성에 중요하다는 것을 보여주었다.
일부 실시양태에서, Wnt 폴리펩티드는 시스테인, 세린, 및/또는 트레오닌 잔기에서 팔미토일화된다. 일부 실시양태에서, Wnt3a 폴리펩티드는 시스테인, 세린, 및/또는 트레오닌 잔기에서 팔미토일화된다. 어떤 경우에는, Wnt3a 폴리펩티드는 서열 번호 1에 개시된 C77, S139, S181, S209, 또는 S211에서 팔미토일화된다. 어떤 경우에는, Wnt3a 폴리펩티드는 서열 번호 1에 개시된 C77, S139, S181, S209, 또는 S211로부터 선택되는 한 개 이상의 아미노산 위치에서 팔미토일화된다. 어떤 경우에는, Wnt3a 폴리펩티드는 서열 번호 1에 개시된 C77에서 팔미토일화된다. 어떤 경우에는, Wnt3a 폴리펩티드는 서열 번호 1에 개시된 S209에서 팔미토일화된다. 어떤 경우에는, Wnt3a 폴리펩티드는 서열 번호 1에 개시된 C77 및 S209에서 팔미토일화된다. 어떤 경우에는, Wnt3a 단백질은 서열 번호 1에 개시된 C77에서 팔미토일화되지 않는다. 어떤 경우에는, Wnt3a 단백질은 서열 번호 1에 개시된 S209에서 팔미토일화되지만 서열 번호 1에 개시된 C77에서 팔미토일화되지 않는다.
일부 실시양태에서, 팔미토일화된 잔기를 포함하는 Wnt 폴리펩티드는 기능적으로 활성인 변이체 폴리펩티드, 예를 들어 Wnt3a 네이티브 폴리펩티드(예를 들어, 인간 Wnt3a)의 기능적으로 활성인 변이체이다. 일부 실시양태에서, Wnt3a의 기능적으로 활성인 변이체 폴리펩티드는 서열 번호 1에 개시된 C77, S139, S181, S209, 및 S211로부터 선택되는 팔미토일화된 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, Wnt3a의 기능적으로 활성인 변이체 폴리펩티드는 서열 번호 1에 개시된 S139에서 팔미토일화된 잔기를 갖는다. 일부 실시양태에서, 기능적으로 활성인 변이체 Wnt3a 폴리펩티드는 서열 번호 1에 개시된 S181에서 팔미토일화된 잔기를 갖는다. 일부 실시양태에서, 기능적으로 활성인 변이체 Wnt3a 폴리펩티드는 서열 번호 1에 개시된 S209에서 팔미토일화된 잔기를 갖는다. 일부 실시양태에서, 기능적으로 활성인 변이체 Wnt3a 폴리펩티드는 서열 번호 1에 개시된 S211에서 팔미토일화된 잔기를 갖는다. 일부 실시양태에서, 기능적으로 활성인 변이체 Wnt3a 폴리펩티드는 서열 번호 1에 개시된 S209 및 다른 하나의 잔기에서 팔미토일화된 잔기를 갖는다. 일부 실시양태에서, 다른 하나의 잔기는 C77을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 기능적으로 활성인 변이체 Wnt3a 폴리펩티드는 서열 번호 1에 개시된 S209에서 팔미토일화되지만 서열 번호 1에 개시된 C77에서 팔미토일화되지 않는다.
일부 실시양태에서, 본원에서 기재된 정제 도식은 Wnt1, Wnt2, Wnt2b(또는 Wnt13), Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt5a, Wnt5b, Wnt6, Wnt7a, Wnt7b, Wnt8a, Wnt8b, Wnt9a(Wnt14, 또는 Wnt14b), Wnt9b(Wnt14b, 또는 Wnt15), Wnt10a, Wnt10b(또는 Wnt12), Wnt11, Wnt-16a, 및 Wnt-16b 폴리펩티드로부터 선택되는 Wnt 폴리펩티드에 적합하다. 어떤 경우에는, 본원에서 기재된 정제 도식은 Wnt3a 폴리펩티드, Wnt5a 폴리펩티드, 또는 a Wnt10b 폴리펩티드에 적합하다. 어떤 경우에는, 본원에서 기재된 정제 도식은 Wnt3a 폴리펩티드에 적합하다. 어떤 경우에는, 본원에서 기재된 정제 도식은 Wnt5a 폴리펩티드에 적합하다. 어떤 경우에는, 본원에서 기재된 정제 도식은 Wnt10b 폴리펩티드에 적합하다.
일부 실시양태에서, 본원에서 기재된 정제 도식은 서열 번호 1에 개시된 아미노산 위치 77의 시스테인에 해당하는 시스테인 잔기 또는 서열 번호 1에 개시된 아미노산 위치 209의 세린에 해당하는 세린 잔기에서 팔미토일화된 Wnt3a 폴리펩티드에 적합하다. 일부 실시양태에서, 본원에서 기재된 정제 도식은 서열 번호 1에 개시된 아미노산 위치 77의 시스테인에 해당하는 시스테인 잔기에서 팔미토일화된 Wnt3a 폴리펩티드를 선별한다. 일부 실시양태에서, 본원에서 기재된 정제 도식은 서열 번호 1에 개시된 아미노산 위치 209의 세린에 해당하는 세린 잔기에서 팔미토일화된 Wnt3a 폴리펩티드를 선별한다. 일부 실시양태에서, 본원에서 기재된 정제 도식은 서열 번호 1에 개시된 아미노산 위치 209의 세린에 해당하는 세린 잔기에서 팔미토일화되고 적어도 다른 한 개의 팔미토일화된 잔기를 갖는 Wnt3a 폴리펩티드를 선별한다. 일부 실시양태에서, 적어도 다른 한 개의 팔미토일화된 잔기는 서열 번호 1에 개시된 C77이 아니다. 일부 실시양태에서, 본원에서 기재된 정제 도식은 서열 번호 1에 개시된 아미노산 위치 77의 시스테인에 해당하는 시스테인 잔기에서 팔미토일화된 Wnt3a 폴리펩티드를 선별하지 않는다.
일부 실시양태에서, 본원에서 기재된 정제 도식은 분리 단계를 이용한다. 일부 실시양태에서, 분리 단계는 이온 교환 정제 단계, 소수성 정제 단계, 또는 친화성 정제 단계이다. 어떤 경우에는, 분리 단계는 이온 교환 정제 단계이다. 어떤 경우에는, 이온 교환 정제 단계는 하나 이상의 설폰화된 다환 방향족 화합물로 고정화된 비드를 이용한다. 어떤 경우에는, 이온 교환 정제 단계는 하나 이상의 설폰화된 다환 방향족 화합물로 고정화된 컬럼을 이용한다. 설폰화된 다환 방향족 화합물의 비제한적인 예는 시바크론 블루(Cibacron blue) F3GA이다. 어떤 경우에는, 시바크론 블루 F3GA는 트리아지닐 염료이다. 어떤 경우에는, 트리아지닐 염료로 고정화된 비드 및/또는 컬럼은 이온 교환 정제 단계에서 사용된다. 시바크론 블루 F3GA로 고정화된 크로마토그래피 컬럼의 비제한적인 예는 블루 세파로스 컬럼이다.
일부 실시양태에서, 정제는 설폰화된 다환 방향족 화합물로 고정화된 비드를 사용하여 회분식으로 수행된다. 일반적으로, Wnt 폴리펩티드는 저농도의 염을 포함하는 결합 완충액 중에서 설폰화된 다환 방향족 화합물에 고정화된 비드에 결합된다. 고농도의 염은 단백질과 비드의 비공유 이온 결합을 불안정하게 만듦으로써, Wnt 폴리펩티드의 용리를 가능하게 한다. 일부 실시양태에서, 결합 완충액에 사용되는 염의 농도는 최대 0, 0.01, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 mM 이하이다. 일부 실시양태에서, 결합 완충액에 사용되는 염의 농도는 최소 0, 0.01, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 mM 이상이다. 일부 실시양태에서, 한 가지 이상의 세척 완충액을 사용하여 결합되지 않은 불순물을 제거한다. 일부 실시양태에서, 최대 1, 2, 3, 4, 5회 이상의 세척 단계를 이용한다. 일부 실시양태에서, 최소 1, 2, 3, 4, 5회 이하의 세척 단계를 이용한다. 일부 실시양태에서, 세척 완충액에 사용되는 염의 농도는 최소 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 mM 이상이다. 일부 실시양태에서, 세척 완충액에 사용되는 염의 농도는 최대 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 mM 이하이다. 일부 실시양태에서, 1회 이상의 용리 단계가 이어진다. 일부 실시양태에서, 용리 완충액 중 염의 농도는 최소 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1500, 2000 mM 이상이다. 일부 실시양태에서, 용리 완충액 중 염의 농도는 최대 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1500, 2000 mM 이하이다. 대표적인 염은 염화나트륨, 염화칼륨, 염화마그네슘, 염화칼슘, 인산칼슘, 인산칼륨, 인산마그네슘, 인산나트륨, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄 등을 포함한다. 일부 실시양태에서, 계면활성제가 또한 결합 완충액, 세척 완충액, 및/또는 용리 완충액에 배합된다. 일부 실시양태에서, 계면활성제는 CHAPS 또는 트리톤 X-100이다. 일부 실시양태에서, CHAPS 또는 트리톤 X-100의 비율은 최소 0.01%, 0.1%, 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 4.5%, 5% 이상이다. 일부 실시양태에서, CHAPS 또는 트리톤 X-100의 비율은 최대 0.01%, 0.1%, 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 4.5%, 5% 이하이다. 어떤 경우에는, 완충액의 구성요소, 예를 들어 트리스(히드록시메틸)메틸아민 HCl(트리스-HCl), 3-{[트리스(히드록시메틸)메틸]아미노}프로판설폰산(TAPS), N,N-비스(2-히드록시에틸)글리신(바이신(Bicine)), N-트리스(히드록시메틸)메틸글리신(트리신(Tricine)), 3-[N-트리스(히드록시메틸)메틸아미노]-2-히드록시프로판설폰산(TAPSO), 4-2-히드록시에틸-1-피페라진에탄설폰산(HEPES), 3-(N-모르폴리노)프로판설폰산(MOPS), 피페라진-N,N'-비스(2-에탄설폰산)(PIPES), 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산(MES) 등이 사용된다. 어떤 경우에는, 완충액의 pH는 최소 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9 이상이다. 어떤 경우에는, 완충액의 pH는 최대 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9 이하이다. 일부 실시양태에서, Wnt 폴리펩티드는 Wnt3a 폴리펩티드, Wnt5a 폴리펩티드, 또는 Wnt10b 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, Wnt 폴리펩티드는 Wnt3a 폴리펩티드이다.
일부 실시양태에서, 정제는 설폰화된 다환 방향족 화합물로 고정화된 컬럼을 이용하여 수행된다. 일반적으로, Wnt 폴리펩티드는 저농도의 염을 포함하는 결합 완충액 중에서 설폰화된 다환 방향족 화합물로 고정화된 컬럼에 결합된다. 고농도의 염은 폴리펩티드와 컬럼 비드의 비공유 이온 결합을 불안정하게 만듦으로써, Wnt 폴리펩티드의 용리를 가능하게 한다. 일부 실시양태에서, 결합 완충액에 사용되는 염의 농도는 최대 0, 0.01, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 mM 이하이다. 일부 실시양태에서, 결합 완충액에 사용되는 염의 농도는 최소 0, 0.01, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 mM 이상이다. 일부 실시양태에서, 한 가지 이상의 세척 완충액을 사용하여 결합되지 않은 불순물을 제거한다. 일부 실시양태에서, 최대 1, 2, 3, 4, 5회 이상의 세척 단계를 이용한다. 일부 실시양태에서, 최소 1, 2, 3, 4, 5회 이하의 세척 단계를 이용한다. 일부 실시양태에서, 세척 완충액에 사용되는 염의 농도는 최소 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 mM 이상이다. 일부 실시양태에서, 세척 완충액에 사용되는 염의 농도는 최대 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 mM 이하이다. 일부 실시양태에서, 1회 이상의 용리 단계가 이어진다. 일부 실시양태에서, 용리 완충액 중 염의 농도는 최소 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1500, 2000 mM 이상이다. 일부 실시양태에서, 용리 완충액 중 염의 농도는 최대 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1500, 2000 mM 이하이다. 대표적인 염은 염화나트륨, 염화칼륨, 염화마그네슘, 염화칼슘, 인산칼슘, 인산칼륨, 인산마그네슘, 인산나트륨, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄 등을 포함한다. 일부 실시양태에서, 계면활성제가 또한 결합 완충액, 세척 완충액, 및/또는 용리 완충액에 배합된다. 일부 실시양태에서, 계면활성제는 CHAPS 또는 트리톤 X-100이다. 일부 실시양태에서, CHAPS 또는 트리톤 X-100의 비율은 최소 0.01%, 0.1%, 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 4.5%, 5% 이상이다. 일부 실시양태에서, CHAPS 또는 트리톤 X-100의 비율은 최대 0.01%, 0.1%, 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 4.5%, 5% 이하이다. 어떤 경우에는, 완충액의 구성요소, 예를 들어 트리스(히드록시메틸)메틸아민 HCl(트리스-HCl), 3-{[트리스(히드록시메틸)메틸]아미노}프로판설폰산(TAPS), N,N-비스(2-히드록시에틸)글리신(바이신), N-트리스(히드록시메틸)메틸글리신(트리신), 3-[N-트리스(히드록시메틸)메틸아미노]-2-히드록시프로판설폰산(TAPSO), 4-2-히드록시에틸-1-피페라진에탄설폰산(HEPES), 3-(N-모르폴리노)프로판설폰산(MOPS), 피페라진-N,N'-비스(2-에탄설폰산)(PIPES), 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산(MES) 등이 사용된다. 어떤 경우에는, 완충액의 pH는 최소 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9 이상이다. 어떤 경우에는, 완충액의 pH는 최대 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9 이하이다. 일부 실시양태에서, Wnt 폴리펩티드는 Wnt3a 폴리펩티드, Wnt5a 폴리펩티드, 또는 Wnt10b 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, Wnt 폴리펩티드는 Wnt3a 폴리펩티드이다.
일부 실시양태에서, 분리 단계는 소수성 정제 단계이다. 일부 실시양태에서, 소수성 정제는 소수성 리간드로 고정화된 비드 또는 소수성 리간드로 고정화된 컬럼을 이용한다. 리간드의 비제한적인 예로는 부틸, 옥틸, 페닐, 단백질 A 등이 포함된다.
일부 실시양태에서, 분리 단계는 친화성 정제 단계이다. 일부 실시양태에서, 친화성 정제 단계는 친화성 리간드로 고정화된 비드 또는 친화성 리간드로 고정화된 컬럼을 이용한다. 대표적인 리간드에는 프리즐드 수용체(Fzd) 또는 그의 단편, 및 저밀도 지질단백질 수용체 관련 단백질 6(LRP6), 또는 그의 단편이 포함된다.
일부 실시양태에서, 용리된 Wnt 폴리펩티드의 농도 및 수율은 추가의 정제 단계를 거치기 전에 측정된다. 일부 실시양태에서, 수율은 적어도 약 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 이상이다. 일부 실시양태에서, 수율은 최대 약 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 이하이다. 일부 실시양태에서, 순도는 적어도 약 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 이상이다. 일부 실시양태에서, 순도는 최대 약 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 이하이다.
일부 실시양태에서, 정제된 Wnt 폴리펩티드는 Wnt3a 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 서열 번호 1에 개시된 세린 209에 해당하는 아미노산 잔기에서 팔미토일화를 포함하는 Wnt3a 폴리펩티드가 분리 단계에서 정제된다. 일부 실시양태에서, 서열 번호 1에 개시된 시스테인 77에 해당하는 아미노산 잔기에서 팔미토일화를 포함하는 Wnt3a 폴리펩티드가 분리 단계에서 정제된다. 일부 실시양태에서, 서열 번호 1에 개시된 시스테인 77에 해당하는 아미노산 잔기에서 팔미토일화 및 서열 번호 1에 개시된 세린 209에 해당하는 아미노산 잔기에서 팔미토일화를 포함하는 Wnt3a 폴리펩티드가 분리 단계에서 정제된다. 일부 실시양태에서, 서열 번호 1에 개시된 세린 209에 해당하는 아미노산 잔기에서 팔미토일화 및 적어도 다른 한 개의 아미노산 잔기에서 팔미토일화를 포함하는 Wnt3a 폴리펩티드가 분리 단계에서 정제된다. 일부 실시양태에서, 적어도 다른 한 개의 아미노산 잔기는 서열 번호 1에 개시된 C77이 아니다.
일부 실시양태에서, 용리된 생성물 중에서 세린 209 팔미토일화를 포함하는 Wnt3a 종의 농도는 시스테인 77 팔미토일화를 포함하는 Wnt3a 종보다 높다. 일부 실시양태에서, 두 가지 Wnt3a 종의 농도는 값, 예를 들어 비로 정해진다. 일부 실시양태에서, Wnt3a 세린 209 종 대 Wnt3a 시스테인 77 종의 비는 약 50:50, 약 55:45, 약 60:40, 약 65:35, 약 70:30, 약 75:25, 약 80:20, 약 85:15, 약 90:10, 약 95:5, 약 99:1, 또는 약 100:0이다. 일부 실시양태에서, 용리된 생성물 중에서 세린 209 팔미토일화를 포함하는 Wnt3a의 농도는 시스테인 77 및 세린 209 팔미토일화를 포함하는 Wnt3a 종보다 높다. 일부 실시양태에서, 두 가지 Wnt3a 종의 농도는 값, 예를 들어 비로 정해진다. 일부 실시양태에서, Wnt3a 세린 209 종 대 Wnt3a 시스테인 77/세린 209 종의 비는 약 50:50, 약 55:45, 약 60:40, 약 65:35, 약 70:30, 약 75:25, 약 80:20, 약 85:15, 약 90:10, 약 95:5, 약 99:1, 또는 약 100:0이다.
일부 실시양태에서, 추가의 정제 단계는 미리 제조된 리포솜을 이용하는 단계이다. 일부 실시양태에서, 리포솜은 폴리펩티드 제조물로부터 혈청(FBS)을 제거한다. 일부 실시양태에서, 상기 마지막 단계는 Wnt 폴리펩티드의 소수성을 이용하며, 추가 또는 후속의 정제 단계, 예를 들어 후속의 겔 여과 및/또는 크로마토그래피 정제 단계(예를 들어, 황산헤파린 고정 컬럼)의 필요성을 없애준다.
일부 실시양태에서, 리포솜은 당 업계에 잘 알려진 방법을 이용하여 제조된다. 리포솜은 층판상(lamellar phase) 지질 이중층 및 수성 코어로 구성된 인공적으로 제조된 구형의 소포이다. 여러 가지 유형의 리포솜, 예를 들어 다층판 소포(MLV: multilamellar vesicle), 작은 단층판 리포솜 소포(SUV: small unilamellar vesicle), 큰 단층판 리포솜 소포(LUV: large unilamellar vesicle), 및 달팽이형 소포가 있다. 어떤 경우에는, 리포솜은 인지질로 형성된다. 일부 실시양태에서, 인지질은 디아실글리세리드 구조를 갖는 것 또는 포스포스핑고지질로부터 유래한 것으로 나뉜다. 일부 실시양태에서, 디아실글리세리드 구조는 포스파티딘산(포스파티데이트)(PA), 포스파티딜에탄올아민(세팔린)(PE), 포스파티딜콜린(레시틴)(PC), 포스파티딜세린(PS), 및 포스포이노시티드 예를 들어 포스파티딜이노시톨(PI), 포스파티딜이노시톨 포스페이트(PIP), 포스파티딜이노시톨 비스포스페이트(PIP2), 및 포스파티딜이노시톨 트리포스페이트(PIP3)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 포스포스핑고지질은 세라미드 포스포릴콜린, 세라미드 포스포릴에탄올아민, 및 세라미드 포스포릴지질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 리포솜은 포스파티딜콜린으로부터 형성된다.
일부 실시양태에서, 지질은 또한 상전이온도(Tm), 또는 액정 상태와 겔 상태 사이 계면 온도를 기준으로 선택된다. 일부 실시양태에서, Tm은 머리기 종류, 탄화수소 길이, 불포화도, 및 전하에 의해 좌우된다. 예를 들어, 짧은 지질(8, 10, 또는 12개 테일 탄소쇄 길이를 포함하는 지질)은 4℃ 미만의 온도에서 액정 상태이다. 그러나 상기 단쇄 탄소 지질로 제조된 리포솜은 세포막을 용해시키기 때문에 세포에 독성을 갖는다. 더 긴 탄소쇄 지질로부터 제조된 리포솜은 세포에는 독성이 없으나 전이 온도가 더 높다. 예를 들어, 16개 탄소의 테일 탄소 길이를 갖는 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DPPC)은 약 41℃의 Tm을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본원에서 사용되는 지질은 약 10℃ 내지 약 37℃, 15℃ 내지 약 30℃, 및 18℃ 내지 약 27℃, 또는 21℃ 내지 약 25℃의 Tm을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본원에서 사용되는 지질은 최소 22℃, 23℃, 24℃ 이상의 Tm을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본원에서 사용되는 지질은 최대 22℃, 23℃, 24℃ 이하의 Tm을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본원에서 사용되는 지질은 적어도 약 12, 13, 14개 이상의 테일 탄소 길이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 본원에서 사용되는 지질은 최대 약 12, 13, 14개 이하의 테일 탄소 길이를 갖는다.
일부 실시양태에서, 지질은 또한 리포솜의 순전하를 기준으로 선택된다. 일부 실시양태에서, 리포솜은 pH 약 4.0 내지 약 10.0, 약 5.0 내지 약 9.0, 약 6.5 내지 약 8.0, 약 7.0 내지 약 7.8, 또는 약 7.2 내지 약 7.6에서 순전하 0을 갖는다. 일부 실시양태에서, 리포솜은 pH 약 7.3, 약 7.4, 또는 약 7.5에서 순전하 0을 갖는다. 일부 실시양태에서, 리포솜은 pH 약 4.0 내지 약 10.0, 약 5.0 내지 약 9.0, 약 6.5 내지 약 8.0, 약 7.0 내지 약 7.8, 또는 약 7.2 내지 약 7.6 사이에서 순 양전하를 갖는다. 일부 실시양태에서, 리포솜은 pH 약 7.3, 약 7.4, 또는 약 7.5에서 순 양전하를 갖는다. 일부 실시양태에서, 리포솜은 pH 약 4.0 내지 약 10.0, 약 5.0 내지 약 9.0, 약 6.5 내지 약 8.0, 약 7.0 내지 약 7.8, 또는 약 7.2 내지 약 7.6 사이에서 순 음전하를 갖는다. 일부 실시양태에서, 리포솜은 pH 약 7.3, 약 7.4, 또는 약 7.5에서 순 음전하를 갖는다.
일부 실시양태에서, 지질은 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DMPC), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DPPC), 1-테트라데카노일-2-헥사데카노일-sn-글리세로-3-포스포콜린(MPPC), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포-L-세린(DMPS), 및 1,2-디헥사노일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DMPG)로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 지질은 DMPC이다.
일부 실시양태에서, 추가의 지질이 리포솜으로 제조된다. 일부 실시양태에서, 추가의 지질은 콜레스테롤이다. 어떤 경우에는, DMPC와 같은 포스파티딜콜린과 콜레스테롤의 농도는 비와 같은 값으로 정해진다. 일부 실시양태에서, DMPC와 같은 포스파티딜콜린과 콜레스테롤의 농도 비는 약 50:50, 약 55:45, 약 60:40, 약 65:35, 약 70:30, 약 75:25, 약 80:20, 약 85:15, 약 90:10, 약 95:5, 약 99:1, 또는 약 100:0이다. 일부 실시양태에서, DMPC와 같은 포스파티딜콜린과 콜레스테롤의 농도 비는 약 90:10이다. 일부 실시양태에서, 농도 단위는 몰이다. 일부 실시양태에서, 비는 몰:몰이다.
일부 실시양태에서, Wnt 폴리펩티드는 적어도 약 0.01, 0.015, 0.02, 0.025, 0.03, 0.035, 0.04, 0.045, 0.05, 0.055, 0.06, 0.065, 0.07, 0.075, 0.08, 0.085, 0.09, 0.095, 0.1, 0.15, 0.2, 0.25, 0.3, 0.4, 0.5 ng/㎕ 이상의 농도로 리포솜과 재구성된다. 일부 실시양태에서, Wnt 폴리펩티드는 최대 약 0.01, 0.015, 0.02, 0.025, 0.03, 0.035, 0.04, 0.045, 0.05, 0.055, 0.06, 0.065, 0.07, 0.075, 0.08, 0.085, 0.09, 0.095, 0.1, 0.15, 0.2, 0.25, 0.3, 0.4, 0.5 ng/㎕ 이하의 농도로 리포솜과 재구성된다. 일부 실시양태에서, Wnt 폴리펩티드는 Wnt3a 폴리펩티드, Wnt5a 폴리펩티드, 또는 Wnt10b 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, Wnt 폴리펩티드는 Wnt3a 폴리펩티드이다.
일부 실시양태에서, Wnt 폴리펩티드는 적어도 약 0.1:50, 0.5:30, 1:20, 또는 1:14 이상의 Wnt 폴리펩티드 대 리포솜 비로 리포솜과 재구성된다. 일부 실시양태에서, Wnt 폴리펩티드는 최대 약 0.1:50, 0.5:30, 1:20, 또는 1:14 이하의 Wnt 폴리펩티드 대 리포솜 비로 리포솜과 재구성된다. 어떤 경우에는, 비는 질량 대 질량 비이다. 어떤 경우에는, Wnt 폴리펩티드의 단위는 나노그램 단위이다.
일부 실시양태에서, Wnt 폴리펩티드가 리포솜과 재구성되는 온도는 적어도 약 15℃ 내지 약 37℃, 약 18℃ 내지 약 33℃, 또는 약 20℃ 내지 약 28℃이다. 일부 실시양태에서, 온도는 적어도 약 21℃, 22℃, 23℃, 24℃, 25℃, 26℃, 27℃ 이상이다. 일부 실시양태에서, 온도는 최대 약 21℃, 22℃, 23℃, 24℃, 25℃, 26℃, 27℃ 이하이다. 일부 실시양태에서, Wnt 폴리펩티드는 Wnt3a 폴리펩티드, Wnt5a 폴리펩티드, 또는 Wnt10b 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, Wnt 폴리펩티드는 Wnt3a 폴리펩티드이다.
일부 실시양태에서, Wnt 폴리펩티드는 리포솜 막으로 통합된다. 어떤 경우에는, Wnt 폴리펩티드는 리포솜 막으로부터 지질 막의 표면 위로 돌출된다. 어떤 경우에는, Wnt 폴리펩티드는 리포솜의 수성 코어로 편입되지 않는다. 일부 실시양태에서, Wnt 폴리펩티드는 Wnt3a 폴리펩티드, Wnt5a 폴리펩티드, 또는 Wnt10b 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, Wnt 폴리펩티드는 Wnt3a 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, Wnt3a 폴리펩티드는 리포솜 막으로 통합된다. 어떤 경우에는, Wnt3a 폴리펩티드는 리포솜 막으로부터 지질 막의 표면 위로 돌출된다. 어떤 경우에는, Wnt3a 폴리펩티드는 리포솜의 수성 코어로 편입되지 않는다.
일부 실시양태에서, 리포솜과 재구성된 Wnt 폴리펩티드는 리포솜 Wnt 폴리펩티드 또는 L-Wnt로 언급낸다. 일부 실시양태에서, Wnt 폴리펩티드는 Wnt3a 폴리펩티드, Wnt5a 폴리펩티드, 또는 Wnt10b 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, Wnt 폴리펩티드는 Wnt3a 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 리포솜과 재구성된 Wnt3a 폴리펩티드는 리포솜 Wnt3a 폴리펩티드 또는 L-Wnt3a로 언급된다. 일부 실시양태에서, Wnt 폴리펩티드는 Wnt5a 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 리포솜과 재구성된 Wnt5a 폴리펩티드는 리포솜 Wnt5a 폴리펩티드 또는 L-Wnt5a로 언급된다. 일부 실시양태에서, Wnt 폴리펩티드는 Wnt10b 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 리포솜과 재구성된 Wnt10b 폴리펩티드는 리포솜 Wnt10b 폴리펩티드 또는 L-Wnt10b로 언급된다.
일부 실시양태에서, L-Wnt는 원심분리 단계를 거친 후 인산 완충 식염수(PBS)와 같은 완충액에 현탁된다. 어떤 경우에는, L-Wnt는 질소 하에 보관된다. 어떤 경우에는, L-Wnt는 활성의 실질적인 손실 없이 질소 하에 안정하다. 어떤 경우에는, L-Wnt는 약 1℃ 내지 약 8℃의 온도에서 보관된다. 어떤 경우에는, L-Wnt는 적어도 약 1℃, 2℃, 3℃, 4℃, 5℃, 6℃, 7℃, 8℃ 이상의 온도에서 활성의 실질적인 손실 없이 안정하다. 어떤 경우에는, L-Wnt는 최대 약 1℃, 2℃, 3℃, 4℃, 5℃, 6℃, 7℃, 8℃ 이하의 온도에서 활성의 실질적인 손실 없이 안정하다. 일부 실시양태에서, L-Wnt는 적어도 약 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 115, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 300, 356, 400, 700, 1000일 이상 동안 활성의 실질적인 손실 없이 안정하다. 일부 실시양태에서, L-Wnt는 최대 약 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 115, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 300, 356, 400, 700, 1000일 이하 동안 활성의 실질적인 손실 없이 안정하다.
일부 실시양태에서, L-Wnt3a는 원심분리 단계를 거친 후 인산 완충 식염수(PBS)와 같은 완충액에 현탁된다. 어떤 경우에는, L-Wnt3a는 질소 하에서 보관된다. 어떤 경우에는, L-Wnt3a는 활성의 실질적인 손실 없이 질소 하에서 안정하다. 어떤 경우에는, L-Wnt3a는 약 1℃ 내지 약 8℃의 온도에서 보관된다. 어떤 경우에는, L-Wnt3a는 적어도 약 1℃, 2℃, 3℃, 4℃, 5℃, 6℃, 7℃, 8℃ 이상의 온도에서 활성의 실질적인 손실 없이 안정하다. 어떤 경우에는, L-Wnt3a는 최대 약 1℃, 2℃, 3℃, 4℃, 5℃, 6℃, 7℃, 8℃ 이하의 온도에서 활성의 실질적인 손실 없이 안정하다. 일부 실시양태에서, L-Wnt3a는 적어도 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 300, 356, 400, 700, 1000일 이상 동안 활성의 실질적인 손실 없이 안정하다. 일부 실시양태에서, L-Wnt3a는 최대 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 300, 356, 400, 700, 1000일 이하 동안 활성의 실질적인 손실 없이 안정하다.
어떤 경우에는, 용어 "활성의 실질적인 손실 없이"는 리포솜 Wnt 폴리펩티드의 기능적인 활성이 리포솜이 없는 경우 해당하는 네이티브 Wnt 폴리펩티드의 활성에 가깝다는 것을 나타낸다. 어떤 경우에는, 리포솜 Wnt 폴리펩티드의 리포솜의 기능적 활성은 네이티브 Wnt 폴리펩티드의 기능적 활성과 비교하여 적어도 약 100%, 99%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 60%, 50%, 40% 이상이다. 어떤 경우에는, 리포솜 Wnt 폴리펩티드의 기능적 활성은 네이티브 Wnt 폴리펩티드의 기능적 활성과 비교하여 최대 약 100%, 99%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 60%, 50%, 40% 이하이다. 어떤 경우에는, Wnt 폴리펩티드의 기능적 활성은 예를 들어 질량 분광분석법, 본원의 다른 부분에 기재된 바이오마커 분석법과 연관된 분석법, 이식 수술, 예를 들어 신피막 이식 수술, 척추고정술, ALP, TRAP, 및 TUNEL 염색법, 면역조직화학법, 및 마이크로-CT 분석법 및 이식체 성장 정량법과 같은 분석법을 이용하여 검출된다.
어떤 경우에는, 용어 "안정한"은 접힌 상태에 있으며 접히지 않거나 분해되지 않는 Wnt 폴리펩티드를 언급한다. 어떤 경우에는, 용어 "안정한"은 또한 활성의 실질적인 손실 없이 기능적인 활성을 보유하는 Wnt 폴리펩티드를 언급한다. 어떤 경우에는, 안정성을 측정하는데 사용되는 분석법은 상기에 기재된 방법에 따라 Wnt 폴리펩티드의 활성을 입증하는 분석법이며, 또한 마우스 LSL 세포 기반 분석법과 같은 LSL 세포 기반 분석법을 포함하다.
일부 실시양태에서, 본원에서 기재된 정제방법은 Wnt 폴리펩티드의 소수성 도메인을 이용하며 Wnt 폴리펩티드 입체구조 또는 기능적 활성을 방해하지 않는다. 일부 실시양태에서, Wnt 폴리펩티드는 Wnt3a 폴리펩티드, Wnt5a 폴리펩티드, 또는 Wnt10b 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, Wnt 폴리펩티드는 Wnt3a 폴리펩티드이다. 어떤 경우에는, Wnt3a 폴리펩티드의 소수성 도메인은 서열 번호 1에 개시된 세린 209에 해당하는 세린 잔기에서 팔미토일화를 포함한다.
일부 실시양태에서, 리포솜에 대한 Wnt 폴리펩티드의 친화성은 Wnt 폴리펩티드 결합 파트너에 대한 것보다 낮다. 일부 실시양태에서, Wnt 폴리펩티드는 Wnt3a 폴리펩티드, Wnt5b 폴리펩티드, 또는 Wnt10b 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, Wnt 폴리펩티드는 Wnt3a 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 리포솜에 대한 Wnt3a 폴리펩티드의 친화성은 Wnt3a 폴리펩티드 결합 파트너에 대한 것보다 낮다. 일부 실시양태에서, Wnt3a 폴리펩티드 결합 파트너는 프리즐드 단백질, 그의 단편, LRP6 단백질 및 그의 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 리포솜에 대한 Wnt3a 폴리펩티드의 친화성은 약 4nM 내지 약 50nM, 및 약 4.5nM 내지 약 20nM, 및 약 5nM 내지 약 15nM이다. 일부 실시양태에서, 리포솜에 대한 Wnt3a 폴리펩티드의 친화성은 적어도 약 5.5nM, 6nM, 6.5nM, 7nM, 7.5nM, 8nM, 8.5nM, 9nM, 9.5nM, 10nM, 11nM, 12nM, 13nM, 14nM 이상이다. 일부 실시양태에서, 리포솜에 대한 Wnt3a 폴리펩티드의 친화성은 최대 약 5.5nM, 6nM, 6.5nM, 7nM, 7.5nM, 8nM, 8.5nM, 9nM, 9.5nM, 10nM, 11nM, 12nM, 13nM, 14nM 이하이다. 일부 실시양태에서, 결합 파트너에 대한 Wnt3a 폴리펩티드의 친화성은 약 0.01nM 내지 약 4nM, 약 0.1nM 내지 약 4nM, 또는 약 1nM 내지 약 4nM이다. 어떤 경우에는, 결합 파트너에 대한 Wnt3a 폴리펩티드의 친화성은 적어도 약 1.1nM, 1.3nM, 1.5nM, 1.7nM, 2nM, 2.3nM, 2.5nM, 2.7nM, 3nM, 3.1nM, 3.2nM, 3.3nM, 3.4nM, 3.5nM, 3.6nM, 3.7nM, 3.8nM, 3.9nM 이상이다. 어떤 경우에는, 결합 파트너에 대한 Wnt3a 폴리펩티드의 친화성은 최대 약 1.1nM, 1.3nM, 1.5nM, 1.7nM, 2nM, 2.3nM, 2.5nM, 2.7nM, 3nM, 3.1nM, 3.2nM, 3.3nM, 3.4nM, 3.5nM, 3.6nM, 3.7nM, 3.8nM, 3.9nM 이하이다.
상이한 정제 도식은 정제된 폴리펩티드를 상이한 양으로 생산하다. 일부 실시양태에서, 서열 번호 1에 개시된 시스테인 77에 해당하는 아미노산 잔기에서 팔미토일화를 포함하는 Wnt3a 폴리펩티드는 활성인 형태이다. 일부 실시양태에서, 서열 번호 1에 개시된 세린 209에 해당하는 아미노산 잔기에서 팔미토일화를 포함하는 Wnt3a 폴리펩티드는 활성인 형태이다. 일부 실시양태에서, 서열 번호 1에 개시된 세린 209에 해당하는 아미노산 잔기에서 팔리토일화 및 시스테인 77에 해당하는 아미노산 잔기에서 팔미토일화를 포함하는 Wnt3a 폴리펩티드는 활성인 형태이다. 일부 실시양태에서, 서열 번호 1에 개시된 세린 209에 해당하는 아미노산 잔기에서 팔리토일화 및 시스테인 77에 해당하는 아미노산 잔기에서 팔미토일화를 포함하는 Wnt3a 폴리펩티드는 활성인 형태가 아니다. 일부 실시양태에서, 서열 번호 1에 개시된 시스테인 77에 해당하는 아미노산 잔기에서 팔미토일화를 포함하는 Wnt3a 폴리펩티드는 활성인 형태가 아니다. 일부 실시양태에서, Wnt 폴리펩티드(예를 들어, Wnt3a 폴리펩티드)의 활성을 검출하거나 측정하기 위한 추가의 분석법과 연결된 질량 분석법이 활성 종을 확인하는데 이용된다. 어떤 경우에는, 추가의 분석법은 본원의 다른 부분에 기재된 바이오마커 분석법과 연관된 분석법, 이식 수술, 예를 들어 신피막 이식 수술, 척추고정술, ALP, TRAP, 및 TUNEL 염색법, 면역조직화학법, 및 마이크로-CT 분석법 및 이식체 성장 정량법을 포함한다.
일부 측면에서, 용리된 생성물 중에서 세린 209 팔미토일화를 포함하는 리포솜 Wnt3a 종의 농도는 시스테인 77 팔미토일화를 포함하는 Wnt3a 종보다 높다. 일부 실시양태에서, 두 가지 Wnt3a 종의 농도는 비와 같은 값으로 정해진다. 일부 실시양태에서, Wnt3a 세린 209 종 대 Wnt3a 시스테인 77 종의 비는 약 50:50, 약 55:45, 약 60:40, 약 65:35, 약 70:30, 약 75:25, 약 80:20, 약 85:15, 약 90:10, 약 95:5, 약 99:1, 또는 약 100:0이다. 일부 실시양태에서, 용리된 생성물 중에서 세린 209 팔미토일화를 포함하는 리포솜 Wnt3a 종의 농도는 시스테인 77 및 세린 209 팔미토일화를 포함하는 Wnt3a 종보다 높다. 일부 실시양태에서, 두 가지 Wnt3a 종의 농도는 비와 같은 값으로 정해진다. 일부 실시양태에서, Wnt3a 세린 209 종 대 Wnt3a 시스테인 77/세린 209 종의 비는 약 50:50, 약 55:45, 약 60:40, 약 65:35, 약 70:30, 약 75:25, 약 80:20, 약 85:15, 약 90:10, 약 95:5, 약 99:1, 또는 약 100:0이다.
어떤 경우에는, 본원에서 참고에 기재된 정제 도식을 포함하여 종래의 정제 도식은 두 가지 종의 혼합물(예를 들어, 1:5 단일 변형/활성:이중 변형/불활성)을 생산한다. 본원에서 기재된 정제 도식을 이용하여, 어떤 경우에는, 주된 폴리펩티드 종은 단일 변형된(Ser209에서), 활성인 배열이다. 어떤 경우에는, 본원에서 기재된 정제방법은 Ser209에서 지질 변형을 포함하는 폴리펩티드의 활성인 형태를 주로 포함하는 Wnt3a 조성물을 제공한다. 어떤 경우에는, 본원에서 기재된 정제방법은 다른 폴리펩티드 종, 예를 들어 Cys77 Wnt3a 종에 오염되지 않은 Wnt3a 조성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, 리포솜 Wnt 폴리펩티드의 제조 방법으로서, Wnt 폴리펩티드를 포함하는 샘플을 리포솜 수용액에 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 리포솜을 구성하는 인지질이 약 10℃ 내지 약 25℃의 상전이온도를 갖는 것인 방법이 본원에서 기재된다. 일부 실시양태에서, 리포솜 Wnt 폴리펩티드의 제조 방법으로서, Wnt 폴리펩티드를 포함하는 샘플을 리포솜 수용액에 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 리포솜을 구성하는 인지질이 약 12개 내지 약 14개 탄소의 테일 탄소 길이를 갖는 것인 방법이 본원에서 기재된다. 일부 실시양태에서, Wnt 폴리펩티드는 Wnt3a 폴리펩티드, Wnt5a 폴리펩티드, 또는 Wnt10b 폴리펩티드. 일부 실시양태에서, Wnt 폴리펩티드는 Wnt3a 폴리펩티드이다.
일부 실시양태에서, 리포솜 Wnt3a 폴리펩티드의 제조 방법으로서, (a) 중국 햄스터 난소(CHO) 세포를 포함하는 조정 배지로부터 Wnt3a 폴리펩티드를 회수하는 단계, (b) 설폰화된 다환 방향족 화합물로 고정화된 이온 교환 컬럼에 Wnt3a 폴리펩티드를 도입 단계, (c) 단계 구배를 이용하여 이온 교환 컬럼으로부터 Wnt3a 폴리펩티드를 용리하는 단계, 및 (d) 단계 (c)로부터의 Wnt3a 폴리펩티드를 리포솜 수용액과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법이 본원에서 개시된다.
일부 실시양태에서, 리포솜 Wnt5a 폴리펩티드의 제조 방법으로서, (a) 중국 햄스터 난소(CHO) 세포를 포함하는 조정 배지로부터 Wnt5a 폴리펩티드를 회수하는 단계, (b) 설폰화된 다환 방향족 화합물로 고정화된 이온 교환 컬럼에 Wnt5a 폴리펩티드를 도입하는 단계, (c) 단계 구배를 이용하여 이온 교환 컬럼으로부터 Wnt5a 폴리펩티드를 용리하는 단계, 및 (d) 단계 (c)로부터의 Wnt5a 폴리펩티드를 리포솜 수용액과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법이 본원에서 개시된다.
일부 실시양태에서, 리포솜 Wnt10b 폴리펩티드의 제조 방법으로서, (a) 중국 햄스터 난소(CHO) 세포를 포함하는 조정 배지로부터 Wnt10b 폴리펩티드를 회수하는 단계, (b) 설폰화된 다환 방향족 화합물로 고정화된 이온 교환 컬럼에 Wnt10b 폴리펩티드를 도입하는 단계, (c) 단계 구배를 이용하여 이온 교환 컬럼으로부터 Wnt10b 폴리펩티드를 용리하는 단계, 및 (d) 단계 (c)로부터의 Wnt10b 폴리펩티드를 리포솜 수용액과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법이 본원에서 개시된다.
Wnt 폴리펩티드의 생물학적 활성을 측정하기 위한 기능 분석법은 당 업계에 잘 알려져 있으며 예를 들어 β-카테닌의 활성화, 줄기 세포의 성장 촉진, 비기능 분석 예를 들어 면역염색법, 예를 들어, ELISA, 쿠마씨 또는 은 염색된 겔에서 정량법 등에 존재하는 Wnt 폴리펩티드의 양의 정량법, 및 전체 Wnt에 대한 기능적으로 활성인 Wnt의 비의 분석을 포함할 수 있다. 생물학적 활성에 대한 대표적인 분석법은 Wnt 조성물을 세포, 예를 들어 마우스 L 세포와 접촉시키는 단계, 이어서 β-카테닌을 안정화하기에 충분한 시간, 예를 들어 적어도 약 1시간 동안 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 그 후 세포를 용해시켜 세포 용해물을 SDS PAGE에 의해 분석한다. SDA-PAGE에서 분석된 세포 용해물 구성요소를 계속하여 니트로셀룰로스로 이동시킨 후 β-카테닌에 특이적인 항체로 프로브한다. Wnt 활성 분석을 위한 다른 분석법에는 C57MG 형질전환 및 표적 유전자의 유도를 위한 제노푸스 동물 캡 분석법이 포함된다. 대표적인 추가의 분석법에 대해서 미국 특허 제7,335,643호를 참조한다.
C. 이용방법
골 결손 부위에서 사용하기 위한 골 이식재를 생성하기 위한 방법, 공정, 조성물, 및 키트가 본원에서 개시된다. 또한, 포유동물 골수 세포를 증강시키기 위한 방법, 공정, 조성물, 및 키트가 본원에서 개시된다. 어떤 경우에는, 골 결실은 천연 골의 회복 성장을 촉진하고 유도하는 데 이식 재료가 필요한 골절과 같은 골 손상을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 방법은 골 이식재의 생성방법으로서, (a) 포유동물 골수 세포를 포함하는 샘플을 리포솜 Wnt 폴리펩티드와 생체 외에서 접촉시키는 단계, (b) 유리 리포솜 Wnt 폴리펩티드를 제거하기 위하여 샘플을 세척하는 단계, 및 (c) 리포솜 Wnt 폴리펩티드로 처리된 골 이식재를 골 결손 부위에 이식하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, Wnt 폴리펩티드는 Wnt3a 폴리펩티드, Wnt5a 폴리펩티드, 또는 Wnt10b 폴리펩티드이다.
일부 실시양태에서, Wnt 폴리펩티드는 Wnt3a 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 방법은 골 이식재의 생성방법으로서, (a) 포유동물 골수 세포를 포함하는 샘플을 리포솜 Wnt3a 폴리펩티드와 생체 외에서 접촉시키는 단계, (b) 유리 리포솜 Wnt3a 폴리펩티드를 제거하기 위해 샘플을 세척하는 단계, 및 (c) 리포솜 Wnt3a 폴리펩티드로 처리된 골 이식재를 골 결손 부위에 이식하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, Wnt 폴리펩티드는 Wnt5a 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 방법은 골 이식재의 생성방법으로서, (a) 포유동물 골수 세포를 포함하는 샘플을 리포솜 WNT5a 폴리펩티드와 생체 외에서 접촉시키는 단계, (b) 유리 리포솜 WNT5a 폴리펩티드를 제거하기 위해 세척하는 단계, 및 (c) 리포솜 Wnt5a 폴리펩티드로 처리된 골 이식재를 골 결손 부위에 이식하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, Wnt 폴리펩티드는 Wnt10b 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 방법은 골 이식재의 생성방법으로서, (a) 포유동물 골수 세포를 포함하는 샘플을 리포솜 WNT10b 폴리펩티드와 생체 외에서 접촉시키는 단계, (b) 유리 리포솜 WNT10b 폴리펩티드를 제거하기 위해 세척하는 단계, 및 (c) 리포솜 Wnt10b 폴리펩티드로 처리된 골 이식재를 골 결손 부위에 이식하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 공정은 단리된 포유동물 골수 세포를 리포솜 WNT 폴리펩티드와 생체 외에서 접촉시키는 단계를 포함하는 공정에 의해 생산된 포유동물 골수 조성물로서, 접촉 시간이 약 30분 내지 약 4시간인 것인 조성물에 적용된다. 일부 실시양태에서, Wnt 폴리펩티드는 Wnt3a 폴리펩티드, Wnt5a 폴리펩티드, 또는 Wnt10b 폴리펩티드이다.
일부 실시양태에서, Wnt 폴리펩티드는 Wnt3a 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 공정은 단리된 포유동물 골수 세포를 리포솜 WNT3a 폴리펩티드와 생체 외에서 접촉시키는 단계를 포함하는 공정에 의해 생산된 포유동물 골수 조성물로서, 접촉 시간이 약 30분 내지 약 4시간인 것인 조성물에 적용된다.
일부 실시양태에서, Wnt 폴리펩티드는 Wnt5a 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 공정은 단리된 포유동물 골수 세포를 리포솜 WNT5a 폴리펩티드와 생체 외에서 접촉시키는 단계를 포함하는 공정에 의해 생산된 포유동물 골수 조성물로서, 접촉 시간이 약 30분 내지 약 4시간인 것인 조성물에 적용된다.
일부 실시양태에서, Wnt 폴리펩티드는 Wnt10b 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 공정은 단리된 포유동물 골수 세포를 리포솜 WNT10b 폴리펩티드와 생체 외에서 접촉시키는 단계를 포함하는 공정에 의해 생산된 포유동물 골수 조성물로서, 접촉 시간이 약 30분 내지 약 4시간인 것인 조성물에 적용된다.
일부 실시양태에서, 조성물은 단리된 증강된 포유동물 골수 세포의 조성물로서, 상기 세포는, 리포솜 WNT 폴리펩티드로 처리 후, 런엑스2, 오스테릭스, 오스테오칼신, 오스테오폰틴, 알칼리 포스파타제, 제1형 콜라겐, 엑신2, Lef1, 및 Tcf4로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이오마커 중 하나 이상의 증강된 발현 수준을 보이는 것인 조성물에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 바이오마커는 오스테오칼신, 오스테오폰틴, 엑신2, Lef1, 및 Tcf4로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 바이오마커는 오스테오칼신 및 오스테오폰틴으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, Wnt 폴리펩티드는 Wnt3a 폴리펩티드, Wnt5a 폴리펩티드, 또는 Wnt10b 폴리펩티드이다.
일부 실시양태에서, Wnt 폴리펩티드는 Wnt3a 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 조성물은 단리된 증강된 포유동물 골수 세포의 조성물로서, 상기 세포는, 리포솜 WNT3a 폴리펩티드로 처리 후, 런엑스2, 오스테릭스, 오스테오칼신, 오스테오폰틴, 알칼리 포스파타제, 제1형 콜라겐, 엑신2, Lef1, 및 Tcf4로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이오마커 중 하나 이상의 증강된 발현 수준을 보이는 것인 조성물에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 바이오마커는 오스테오칼신, 오스테오폰틴, 엑신2, Lef1, 및 Tcf4로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 바이오마커는 오스테오칼신 및 오스테오폰틴으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, Wnt 폴리펩티드는 Wnt5a 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 조성물은 단리된 증강된 포유동물 골수 세포의 조성물로서, 상기 세포는, 리포솜 WNT5a 폴리펩티드로 처리 후, 런엑스2, 오스테릭스, 오스테오칼신, 오스테오폰틴, 알칼리 포스파타제, 제1형 콜라겐, 엑신2, Lef1, 및 Tcf4로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이오마커 중 하나 이상의 증강된 발현 수준을 보이는 것인 조성물에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 바이오마커는 오스테오칼신, 오스테오폰틴, 엑신2, Lef1, 및 Tcf4로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 바이오마커는 오스테오칼신 및 오스테오폰틴으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, Wnt 폴리펩티드는 Wnt10b 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 조성물은 단리된 증강된 포유동물 골수 세포의 조성물로서, 상기 세포는, 리포솜 WNT10b 폴리펩티드로 처리 후, 런엑스2, 오스테릭스, 오스테오칼신, 오스테오폰틴, 알칼리 포스파타제, 제1형 콜라겐, 엑신2, Lef1, 및 Tcf4로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이오마커 중 하나 이상의 증강된 발현 수준을 보이는 것인 조성물에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 바이오마커는 오스테오칼신, 오스테오폰틴, 엑신2, Lef1, 및 Tcf4로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 바이오마커는 오스테오칼신 및 오스테오폰틴으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 조성물은 35세 이상의 인간 피험체로부터 얻은 포유동물 골수 세포의 조성물로서, 상기 포유동물 골수 세포가 리포솜 WNT 폴리펩티드로 처리 후, 런엑스2, 오스테릭스, 오스테오칼신, 오스테오폰틴, 알칼리 포스파타제, 제1형 콜라겐, 엑신2, Lef1, 및 Tcf4로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이오마커 중 하나 이상의 증강된 발현 수준을 나타내는 것인 조성물에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 바이오마커는 오스테오칼신, 오스테오폰틴, 엑신2, Lef1, 및 Tcf4로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 바이오마커는 오스테오칼신 및 오스테오폰틴으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, Wnt 폴리펩티드는 Wnt3a 폴리펩티드, Wnt5a 폴리펩티드, 또는 Wnt10b 폴리펩티드이다.
일부 실시양태에서, Wnt 폴리펩티드는 Wnt3a 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 조성물은 35세 이상의 인간 피험체로부터 얻은 포유동물 골수 세포의 조성물로서, 상기 포유동물 골수 세포가 리포솜 Wnt3a 폴리펩티드로 처리 후, 런엑스2, 오스테릭스, 오스테오칼신, 오스테오폰틴, 알칼리 포스파타제, 제1형 콜라겐, 엑신2, Lef1, 및 Tcf4로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이오마커 중 하나 이상의 증강된 발현 수준을 나타내는 것인 조성물에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 바이오마커는 오스테오칼신, 오스테오폰틴, 엑신2, Lef1, 및 Tcf4로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 바이오마커는 오스테오칼신 및 오스테오폰틴으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, Wnt 폴리펩티드는 Wnt5a 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 조성물은 35세 이상의 인간 피험체로부터 얻은 포유동물 골수 세포의 조성물로서, 상기 포유동물 골수 세포가 리포솜 Wnt5a 폴리펩티드로 처리 후, 런엑스2, 오스테릭스, 오스테오칼신, 오스테오폰틴, 알칼리 포스파타제, 제1형 콜라겐, 엑신2, Lef1, 및 Tcf4로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이오마커 중 하나 이상의 증강된 발현 수준을 나타내는 것인 조성물에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 바이오마커는 오스테오칼신, 오스테오폰틴, 엑신2, Lef1, 및 Tcf4로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 바이오마커는 오스테오칼신 및 오스테오폰틴으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, Wnt 폴리펩티드는 Wnt10b 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 조성물은 35세 이상의 인간 피험체로부터 얻은 포유동물 골수 세포의 조성물로서, 상기 포유동물 골수 세포가 리포솜 Wnt10b 폴리펩티드로 처리 후, 런엑스2, 오스테릭스, 오스테오칼신, 오스테오폰틴, 알칼리 포스파타제, 제1형 콜라겐, 엑신2, Lef1, 및 Tcf4로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이오마커 중 하나 이상의 증강된 발현 수준을 나타내는 것인 조성물에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 바이오마커는 오스테오칼신, 오스테오폰틴, 엑신2, Lef1, 및 Tcf4로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 바이오마커는 오스테오칼신 및 오스테오폰틴으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 증강된 발현 수준은 미처리된 포유동물 골수 세포와 비교된다. 어떤 경우에는, 증강된 발현 수준은 미처리된 포유동물 골수 세포와 비교하여 약 1% 내지 약 100%, 약 1% 내지 약 50%, 약 2% 내지 약 20%, 약 3% 내지 약 15%, 또는 약 4% 내지 약 10%이다. 어떤 경우에는, 증강된 발현 수준은 미처리된 포유동물 골수 세포와 비교하여 적어도 약 5%, 5.5% 6%, 6.5%, 7%, 7.5%, 8%, 8.5%, 9%, 9.5% 이상이다. 어떤 경우에는, 증강된 발현 수준은 미처리된 포유동물 골수 세포와 비교하여 최대 약 5%, 5.5% 6%, 6.5% 7%, 7.5%, 8%, 8.5%, 9%, 9.5% 이하이다.
일부 실시양태에서, 포유동물 골수 세포는 또한 리포솜 WNT 폴리펩티드로 처리 후 SOX9 및 PPARγ로부터 선택되는 바이오마커의 감소된 발현 수준을 보인다. 어떤 경우에는, 포유동물 골수 세포에서 감소된 발현 수준은 미처리된 포유동물 골수 세포와 비교된다. 어떤 경우에는, 감소된 발현 수준은 미처리된 포유동물 골수 세포와 비교하여 약 1% 내지 약 100%, 약 2% 내지 약 80%, 약 3% 내지 약 50%, 약 3% 내지 약 30%, 또는 약 4% 내지 약 20%이다.
일부 실시양태에서, 골수 세포는 또한 미처리된 포유동물 골수 세포와 비교하여 아폽토시스 수준의 감소를 포함한다. 어떤 경우에는, 아폽토시스 수준의 감소는 미처리된 포유동물 골수 세포와 비교하여 적어도 약 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200% 이상이다. 어떤 경우에는, 아폽토시스 수준의 감소는 미처리된 포유동물 골수 세포와 비교하여 최대 약 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200% 이하이다.
일부 실시양태에서, 포유동물 골수 세포는 미처리된 포유동물 골수 세포와 비교하여 증강된 골형성능을 포함한다. 일부 실시양태에서, 증강된 골형성능은 처리된 포유동물 골수 세포를 이식한 후 골 결손 부위에서의 신생 골 성장 수준을 포함한다. 어떤 경우에는, 처리되어 이식된 포유동물 골수 세포의 신생 골 성장 수준은 미처리되어 이식된 포유동물 골수 세포의 신생 골 성장 수준과 비교하여 약 1% 내지 약 20% 또는 약 5% 내지 약 12%이다. 어떤 경우에는, 처리되어 이식된 포유동물 골수 세포의 신생 골 성장 수준은 미처리되어 이식된 포유동물 골수 세포의 신생 골 성장 수준과 비교하여 약 1.5배, 약 2배, 약 3배, 약 4배, 약 5배, 약 10배, 약 20배, 약 50배, 약 100배 이상 증가된다.
본원에서 사용되는 골 이식재는 공여자로부터 얻은 세포 조성물을 나타내며, 공여자는 생체 또는 시체일 수 있다. 골 이식재는 복합적인 세포군을 포함하며, 중간엽 줄기 세포와 같은 줄기 세포를 포함하고, 어떤 경우에는, 골세포 및 그의 전구 세포도 포함한다. 어떤 경우에는, 세포는 부착성 골수 세포 또는 비부착성 골수 세포이다. 어떤 경우에는, 골수 세포는 부착성 골수 세포이다. 어떤 경우에는, 부착성 골수 세포는 골수 줄기 세포 또는 골수 전구 세포이다. 어떤 경우에는, 부착성 골수 세포는 골수 기질 세포이다. 일부 실시양태에서, 공여자는 동종이계이다. 어떤 경우에는, 공여자는 수여자에 관하여 자가 유래이다. 골 이식을 위한 세포의 양은 공여자, 수여자, 이식 목적 등에 따라 달라질 수 있다. 골 이식체는 약 103개까지, 약 104개까지, 약 105개까지, 약 106개까지, 약 107개까지, 약 108개까지, 약 109개까지, 약 1010개까지, 또는 그 이상의 세포를 포함한다.
골 이식재는 공여자로부터, 예를 들어 장골능으로부터, 하악 결합부(턱 부위)로부터 얻으며, 대퇴골 및/또는 경골, 비골, 늑골, 전하악지; 척추 뼈의 일부분, 예를 들어 수술 시 제거되는 것, 시체 뼈 등을 확공하고, 흡인하고, 관주하여 얻는다. 어떤 경우에는, 이식 재료는 골수로부터 회수되는데, 예를 들어 적당한 뼈의 골 내막 표면으로부터, 또는 골수 및 작은 골 블록을 포함하는 블록 이식체로부터 긁어낸다. 어떤 경우에는, 동종이식 뼈는 시체, 뼈은행 등으로부터, 예를 들어 고관절 대치술에서 얻은 대퇴골두로부터 얻는다, 어떤 경우에는, 골 이식재는 신선하거나 필요할 때까지 당 업계에 공지된 바와 같이 동결보존된다.
일부 실시양태에서, 골 이식 세포는 유효량의 리포솜 Wnt 폴리펩티드, 예를 들어 L-Wnt3a, L-Wnt5a, 또는 L-Wnt10b의 존재하에서 적합한 배양 배지에 현탁된다. 임의의 적합한 배지, 예를 들어 DMEM, RPMI, PBS, 등이 사용될 수 있다. 세포는 전형적으로 인큐베이션 과정 동안 생존능을 예를 들어 약 104/ml까지, 약 105/ml까지, 약 106/ml까지, 약 107/ml까지 유지하는 농도로 재현탁된다.
어떤 경우에는, 접촉 온도는 약 0℃ 내지 약 37℃, 또는 약 20℃ 내지 약 25℃이다. 일부 실시양태에서, 접촉 온도는 더 낮은데, 예를 들어 약 32℃까지, 약 25℃까지, 약 15℃까지, 약 10℃까지, 약 8℃까지, 약 4℃까지, 약 1℃까지지만, 전형적으로 동결보존을 위해 특별히 준비되지 않는다면 영상온도이다. 어떤 경우에는, 인큐베이션 온도는 적어도 약 20℃, 21℃, 20℃, 21℃, 22℃, 23℃, 24℃, 25℃ 이상이다. 어떤 경우에는, 인큐베이션 온도는 최대 약 20℃, 21℃, 20℃, 21℃, 22℃, 23℃, 24℃, 25℃ 이하이다.
어떤 경우에는, 골 이식재는 Wnt 폴리펩티드와 적어도 약 10 분, 적어도 약 30 분, 적어도 약 1시간, 적어도 약 2시간, 적어도 약 3시간, 그리고 약 36시간까지, 약 24시간까지, 약 18시간까지, 약 15시간까지, 약 12시간까지, 약 8시간까지, 약 6시간까지, 또는 약 4시간까지 접촉시킨다.
Wnt 폴리펩티드의 유효량은 출처, 순도, 제조 방법 등에 따라 달라질 수 있다. 어떤 경우에는, Wnt 폴리펩티드의 유효량은 적어도 약 0.01㎍/ml, 0.05㎍/ml, 0.1㎍/ml, 0.15㎍/ml, 0.2㎍/ml, 0.25㎍/ml, 0.3㎍/ml, 0.35㎍/ml, 0.4㎍/ml, 0.45㎍/ml, 0.5㎍/ml, 0.6㎍/ml, 0.7㎍/ml, 0.8㎍/ml, 0.9㎍/ml, 1.0㎍/ml, 1.5㎍/ml, 2.0㎍/ml, 2.5㎍/ml, 3.0㎍/ml, 3.5㎍/ml, 4.0㎍/ml, 4.5㎍/ml, 5.0㎍/ml, 7.5㎍/ml, 10㎍/ml, 15㎍/ml, 25㎍/ml, 50㎍/ml, 100㎍/ml 이상이다. 어떤 경우에는, Wnt 폴리펩티드의 유효량은 최대 약 0.01㎍/ml, 0.05㎍/ml, 0.1㎍/ml, 0.15㎍/ml, 0.2㎍/ml, 0.25㎍/ml, 0.3㎍/ml, 0.35㎍/ml, 0.4㎍/ml, 0.45㎍/ml, 0.5㎍/ml, 0.6㎍/ml, 0.7㎍/ml, 0.8㎍/ml, 0.9㎍/ml, 1.0㎍/ml, 1.5㎍/ml, 2.0㎍/ml, 2.5㎍/ml, 3.0㎍/ml, 3.5㎍/ml, 4.0㎍/ml, 4.5㎍/ml, 5.0㎍/ml, 7.5㎍/ml, 10㎍/ml, 15㎍/ml, 25㎍/ml, 50㎍/ml, 100㎍/ml 이하이다.
일부 실시양태에서, Wnt 폴리펩티드는 L-Wnt3a이며, Wnt3a 폴리펩티드의 유효량은 적어도 약 0.01㎍/ml, 0.05㎍/ml, 0.1㎍/ml, 0.15㎍/ml, 0.2㎍/ml, 0.25㎍/ml, 0.3㎍/ml, 0.35㎍/ml, 0.4㎍/ml, 0.45㎍/ml, 0.5㎍/ml, 0.6㎍/ml, 0.7㎍/ml, 0.8㎍/ml, 0.9㎍/ml, 1.0㎍/ml, 1.5㎍/ml, 2.0㎍/ml, 2.5㎍/ml, 3.0㎍/ml, 3.5㎍/ml, 4.0㎍/ml, 4.5㎍/ml, 5.0㎍/ml, 7.5㎍/ml, 10㎍/ml, 15㎍/ml, 25㎍/ml, 50㎍/ml, 100㎍/ml 이상이다. 어떤 경우에는, Wnt3a 폴리펩티드의 유효량은 최대 약 0.01㎍/ml, 0.05㎍/ml, 0.1㎍/ml, 0.15㎍/ml, 0.2㎍/ml, 0.25㎍/ml, 0.3㎍/ml, 0.35㎍/ml, 0.4㎍/ml, 0.45㎍/ml, 0.5㎍/ml, 0.6㎍/ml, 0.7㎍/ml, 0.8㎍/ml, 0.9㎍/ml, 1.0㎍/ml, 1.5㎍/ml, 2.0㎍/ml, 2.5㎍/ml, 3.0㎍/ml, 3.5㎍/ml, 4.0㎍/ml, 4.5㎍/ml, 5.0㎍/ml, 7.5㎍/ml, 10㎍/ml, 15㎍/ml, 25㎍/ml, 50㎍/ml, 100㎍/ml 이하이다.
어떤 경우에는, Wnt 폴리펩티드는 L-Wnt5a이며, Wnt5a 폴리펩티드의 유효량은 적어도 약 0.01㎍/ml, 0.05㎍/ml, 0.1㎍/ml, 0.15㎍/ml, 0.2㎍/ml, 0.25㎍/ml, 0.3㎍/ml, 0.35㎍/ml, 0.4㎍/ml, 0.45㎍/ml, 0.5㎍/ml, 0.6㎍/ml, 0.7㎍/ml, 0.8㎍/ml, 0.9㎍/ml, 1.0㎍/ml, 1.5㎍/ml, 2.0㎍/ml, 2.5㎍/ml, 3.0㎍/ml, 3.5㎍/ml, 4.0㎍/ml, 4.5㎍/ml, 5.0㎍/ml, 7.5㎍/ml, 10㎍/ml, 15㎍/ml, 25㎍/ml, 50㎍/ml, 100㎍/ml 이상이다. 어떤 경우에는, Wnt5a 폴리펩티드의 유효량은 최대 약 0.01㎍/ml, 0.05㎍/ml, 0.1㎍/ml, 0.15㎍/ml, 0.2㎍/ml, 0.25㎍/ml, 0.3㎍/ml, 0.35㎍/ml, 0.4㎍/ml, 0.45㎍/ml, 0.5㎍/ml, 0.6㎍/ml, 0.7㎍/ml, 0.8㎍/ml, 0.9㎍/ml, 1.0㎍/ml, 1.5㎍/ml, 2.0㎍/ml, 2.5㎍/ml, 3.0㎍/ml, 3.5㎍/ml, 4.0㎍/ml, 4.5㎍/ml, 5.0㎍/ml, 7.5㎍/ml, 10㎍/ml, 15㎍/ml, 25㎍/ml, 50㎍/ml, 100㎍/ml 이하이다.
어떤 경우에는, Wnt 폴리펩티드는 L-Wnt10b이며, Wnt10b 폴리펩티드의 유효량은 적어도 약 0.01㎍/ml, 0.05㎍/ml, 0.1㎍/ml, 0.15㎍/ml, 0.2㎍/ml, 0.25㎍/ml, 0.3㎍/ml, 0.35㎍/ml, 0.4㎍/ml, 0.45㎍/ml, 0.5㎍/ml, 0.6㎍/ml, 0.7㎍/ml, 0.8㎍/ml, 0.9㎍/ml, 1.0㎍/ml, 1.5㎍/ml, 2.0㎍/ml, 2.5㎍/ml, 3.0㎍/ml, 3.5㎍/ml, 4.0㎍/ml, 4.5㎍/ml, 5.0㎍/ml, 7.5㎍/ml, 10㎍/ml, 15㎍/ml, 25㎍/ml, 50㎍/ml, 100㎍/ml 이상이다. 어떤 경우에는, Wnt10b 폴리펩티드의 유효량은 최대 약 0.01㎍/ml, 0.05㎍/ml, 0.1㎍/ml, 0.15㎍/ml, 0.2㎍/ml, 0.25㎍/ml, 0.3㎍/ml, 0.35㎍/ml, 0.4㎍/ml, 0.45㎍/ml, 0.5㎍/ml, 0.6㎍/ml, 0.7㎍/ml, 0.8㎍/ml, 0.9㎍/ml, 1.0㎍/ml, 1.5㎍/ml, 2.0㎍/ml, 2.5㎍/ml, 3.0㎍/ml, 3.5㎍/ml, 4.0㎍/ml, 4.5㎍/ml, 5.0㎍/ml, 7.5㎍/ml, 10㎍/ml, 15㎍/ml, 25㎍/ml, 50㎍/ml, 100㎍/ml 이하이다.
일부 실시양태에서, 골 이식재는 골 형성능을 증강시키기에 충분한 시간 동안 Wnt 폴리펩티드와 인큐베이션된다. 증강은 다양한 방법, 예를 들어 본원에서 기재된 바이오마커를 사용하여, 예를 들어 엑신2의 발현 증가에 의해, 골 이식재에서 유사분열 활성의 증가에 의해(이식 후 약 2일 내지 약 6일에 측정)), 이식 후 골 형성 증가에 의해, 런엑스2 또는 오스테오칼신의 발현 증가에 의해, 이식 후 아폽토시스 감소에 의해, 또는 이식 후 생성된 골 부피에 의해 측정될 수 있다.
인큐베이션 후, 골 이식재는 예를 들어 척추 뼈, 골절, 치아 지지조직 등의 복구를 위해 통상의 프로토콜에 따라 수여자에게 이식될 수 있다.
일부 실시양태에서, Wnt-처리된 골 이식재를 환자에 다시 이식하기 전에, 유리 리포솜 Wnt 폴리펩티드를 제거하기 위해 세척 단계가 실시된다. 일부 실시양태에서, 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5회 이상 세척이 실시된다. 일부 실시양태에서, 최대 약 1, 2, 3, 4, 5회 이하 세척이 실시된다. 일부 실시양태에서, 예를 들어 인산 완충 식염수와 같은 임의의 적합한 완충액이 사용된다.
어떤 경우에는, 세척 단계 후 잔여 리포솜 Wnt는 최대 약 0.01pg(피코그램), 0.05 pg, 0.1pg, 0.5pg, 1pg, 1.5pg, 2pg, 2.5pg, 3pg, 3.5pg, 4pg, 4.5pg, 5pg, 5.5pg, 6pg 이하이다. 세척 단계 후 잔여 리포솜 Wnt는 적어도 약 0.01 pg(피코그램), 0.05 pg, 0.1pg, 0.5pg, 1pg, 1.5pg, 2pg, 2.5pg, 3pg, 3.5pg, 4pg, 4.5pg, 5pg, 5.5pg, 6pg 이상이다.
어떤 경우에는, Wnt로 골 이식재를 처리하기 위한 본원에서 기재된 방법은 세포에 Wnt 폴리펩티드의 노출 시간, 노출 기간, 노출 농도, 및/또는 독성의 조절을 고려한다. 어떤 경우에는, Wnt3a로 골 이식재를 처리하기 위한 본원에서 기재된 방법은 세포에 Wnt3a 폴리펩티드의 노출 시간, 노출 기간, 노출 농도, 및/또는 독성의 조절을 고려한다.
일부 실시양태에서, Wnt 폴리펩티드, 예를 들어 L-Wnt3a, L-Wnt5a, 또는 L-Wnt10b와의 인큐베이션에 의해 노화된 골 이식체에 골형성능이 회복된다. 어떤 경우에는, 리포솜 Wnt3a 처리는 노화된 골 이식체에서 세포 사멸을 감소시킨다. 어떤 경우에는 이식 후 리포솜 Wnt3a로 처리된 골 이식체는 더 많은 뼈를 생성하였다(p<0.05). 어떤 경우에는, 리포솜 Wnt3a 처리는 이식체에서 세포 생존율을 증강시키고 노화 동물에서 유래된 이식체의 골 형성능을 회복시켰다.
일부 실시양태에서, 포유동물 골수 세포는 인간을 포함한, 그러나 인간에 제한되지는 않는, 임의의 포유동물로부터 얻을 수 있다. 어떤 경우에는, 공여자는 설치류, 예를 들어 마우스, 또는 랫트이다. 어떤 경우에는, 공여자는 토끼이다. 어떤 경우에는, 공여자는 인간이다. 어떤 경우에는, 공여자는 자신이며 골수 세포는 자가 유래이다. 어떤 경우에는, 본원에서 다른 부분에 기재된 바와 같이, 자가 유래 골수 세포는 부착성 및 비부착성 골수 세포를 포함한다. 어떤 경우에는, 자가 유래 골수 세포는 부착성 골수 세포이다. 어떤 경우에는, 자가 유래 골수 세포는 골수 줄기 세포 및 골수 전구 세포를 포함한다. 어떤 경우에는, 자가 유래 골수 세포는 골수 기질 세포를 포함한다. 어떤 경우에는, 공여자는 또 다른 개체이고 골수 세포는 동종이계이다. 어떤 경우에는, 동종이계 골수 세포는 생체 공여자 또는 시체 공여자로부터 얻는다. 어떤 경우에는, 본원에서 다른 부분에서 기재된 바와 같이, 동종이계 골수 세포는 부착성 및 비부착성 골수 세포를 포함한다. 어떤 경우에는, 동종이계 골수 세포는 부착성 골수 세포이다. 어떤 경우에는, 동종이계 골수 세포는 골수 줄기 세포 및 골수 전구 세포를 포함한다. 어떤 경우에는, 동종이계 골수 세포는 골수 기질 세포를 포함한다. 어떤 경우에는, 공여자는 35세 이상의 개체이다. 어떤 경우에는, 35세 이상의 개체로부터 얻은 골수 세포는 늙은 골수 세포 또는 노화(aged) 골수 세포라고 간주한다. 일부 실시양태에서, 공여자는 35세 미만의 개체이다. 어떤 경우에는, 35세 미만의 개체로부터 얻은 골수 세포는 젊은(young) 골수 세포로 간주한다. 어떤 경우에는, 35세 이상의 개체로부터 얻은 골수 세포는 자가 유래 골수 세포 또는 동종이계 골수 세포이다. 어떤 경우에는, 35세 미만의 개체로부터 얻은 골수 세포는 자가 유래 골수 세포 또는 동종이계 골수 세포이다. 본원에서 사용되는 용어 "개체(들)", "피험체(들)", "공여자(들)", 및 "환자(들)"은 본원에서 호환적으로 사용되며 모든 포유동물을 의미하며, 인간에만 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 본원에서 기재된 방법, 조성물, 공정 및 키트 등은 노화 환자, 및 치유능이 감소된 기타 환자, 예를 들어, 흡연자, 당뇨병 환자, 또는 영양결핍 환자로부터 골 이식체를 재활성화하기 위한 임상적으로 적용 가능한 재생 의료 기반 전략을 제공한다.
일부 실시양태에서, 바이오마커, 예를 들어 런엑스2, 오스테릭스, 오스테오칼신, 오스테오폰틴, 알칼리 포스파타제, 제1형 콜라겐, 엑신2, Lef1, Tcf4, SOX9 및 PPARγ의 발현 수준 또는 존재를 결정하는 방법은 당 업계에 잘 알려져 있다. 어떤 경우에는, 바이오마커의 발현 수준 또는 존재는 예를 들어, 유세포 분석법, 면역조직화학법, 웨스턴 블롯, 면역침전법, 자성 비드 선별법, 및 상기 바이오마커 중 어느 한 가지를 발현하는 세포의 정량법에 의해 측정된다. 바이오마커 RNA 또는 DNA 발현 수준은 RT-PCR, Qt-PCR, 미세배열, 노던 블롯, 또는 다른 유사한 기술에 의해 측정될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "바이오마커" 및 "마커"는 호환적으로 사용된다.
본원에서 개시된 바와 같이, 폴리펩티드 또는 뉴클레오티드 수준에서 관심의 바이오마커의 발현 또는 존재를 결정하는 단계는 당 업자에게 공지된 임의의 검출 방법을 이용하여 수행된다. "발현을 검출하는 것" 또는 "~의 수준을 검출하는 것"은 생물학적 샘플 내에 바이오마커 단백질 또는 유전자의 발현 수준 또는 존재를 결정하는 것을 의도한다. 따라서, "발현을 검출하는 것"은 바이오마커가 발현되지 않는다는 것, 검출가능하게 발현되지 않는다는 것, 낮은 수준으로 발현된다는 것, 정상 수준으로 발현된다는 것, 또는 과다 발현된다는 것이 결정되는 경우를 포함한다.
어떤 측면에서, 생물학적 샘플 내에 상기 다양한 바이오마커 및 임상적으로 유용한 어떤 진단 마커의 발현 또는 존재는 예를 들어 면역조직화학 기법, 또는 핵산 기반 기술, 예를 들어 제자리 혼성화 및 RT-PCR을 이용하여 단백질 또는 핵산 수준에서 검출된다. 일부 실시양태에서, 한 가지 이상의 바이오마커의 발현 또는 존재는 핵산 증폭 방법, 핵산 서열분석 방법, 핵산 미세배열(DNA 및 RNA)을 이용하는 방법, 특이적으로 표지된 프로브를 이용하는 제자리 혼성화 방법에 의해 검출된다.
다른 실시양태에서, 한 가지 이상의 바이오마커의 발현 또는 존재의 결정단계는 겔 전기영동법을 통해 수행된다. 한 실시양태에서, 결정 단계는 막으로의 이동 및 특정 프로브와의 혼성화를 통해 수행된다.
다른 실시양태에서, 한 가지 이상의 바이오마커의 발현 또는 존재의 결정 단계는 진단 영상법에 의해 수행된다.
또 다른 실시양태에서, 한 가지 이상의 바이오마커의 발현 또는 존재의 결정 단계는 검출 가능한 고상 기질에 의해 수행된다. 한 실시양태에서, 검출 가능한 고상 기질은 항체로 기능화된 상자성 나노입자이다.
일부 실시양태에서, 바이오마커의 발현은 예를 들어 특정 바이오마커 단백질에 대한 항체를 이용하여 단백질 수준에서 검출된다. 이러한 항체는 웨스턴 블롯, ELISA, 멀티플렉싱법, 면역침전법, 또는 면역조직화학 기법과 같은 다양한 방법에 사용된다. 일부 실시양태에서, 바이오마커의 검출은 ELISA에 의해 달성된다. 일부 실시양태에서, 생물표의 검출은 전기화학 발광법(ECL: electrochemiluminescence)에 의해 달성된다.
일부 실시양태에서, 생물학적 샘플 중에 관심의 바이오마커 단백질의 발현 수준은 바이오마커 단백질 또는 그의 기능적으로 활성인 변이체와 특이적으로 상호작용할 수 있는 결합 단백질에 의해 검출된다. 일부 실시양태에서, 표지된 항체, 그의 결합 부분, 또는 다른 결합 파트너가 사용된다. 본원에서 사용될 때 단어 "표지"는 항체에 직접 또는 간접적으로 접합되어 "표지된" 항체를 생성하는 검출가능 화합물 또는 조성물을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 표지는 그 자체로 검출되거나(예를 들어, 방사성 동위원소 표지 또는 형광 표지), 효소 표지의 경우 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변화를 촉매한다.
바이오마커 단백질을 검출하기 위한 항체는 기원이 단클론 또는 다클론이거나, 합성 또는 재조합으로 생산된다. 복합 단백질, 예를 들어, 결합 단백질(예를 들어 바이오마커 단백질에 특이적으로 결합한 항체)와 결합된 바이오마커 단백질의 양은 당업자에게 공지된 표준 단백질 검출 방법을 이용하여 측정된다. 면역 분석법의 설계, 원리 및 프로토콜에 대한 상세한 내용은 당 업계의 많은 교과서에서 발견된다(예를 들어, 문헌(Ausubel et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology)(Greene Publishing and Wiley-Interscience, NY)); Coligan et al., eds. (1994) Current Protocols in Immunology (John Wiley & Sons, Inc., New York, N.Y.))을 참조한다).
항체를 표지하는데 사용되는 마커의 선별은 적용에 따라 달라질 것이다. 그러나 마커의 선별은 당 업자에게 용이하게 결정될 수 있다. 이러한 표지된 항체는 관심의 임의의 바이오마커 또는 단백질의 존재를 검출하기 위해 면역분석법뿐 아니라 조직학적 용도에도 사용된다. 표지된 항체는 다클론 또는 단클론 항체이다. 게다가, 관심의 단백질을 검출하는데 사용하기 위한 항체는 본원에서 다른 부분에 기재된 바와 같이 방사성 원소, 효소, 발색단 또는 형광단, 또는 비색 태그로 표지된다. 또한, 태그하는 표지의 선택은 원하는 검출 한계에 따라 달라질 것이다. 효소 분석법(ELISA)은 전형적으로 효소 기질과 효소가 태그된 복합체의 상호작용에 의해 형성된 색깔을 띠는 생성물의 검출을 가능하게 한다. 검출 가능한 표지로서 역할을 하는 방사성 핵종에는 예를 들어, I-131, I-123, I-125, Y-90, Re-188, Re-186, At-211, Cu-67, Bi-212, 및 Pd-109가 포함된다. 검출 가능한 표지로서 역할을 하는 효소의 예는 겨자무 과산화효소, 알칼리 포스파타제, 베타-갈락토시다아제, 및 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소가 포함되나 이에 제한되지는 않는다. 발색단은 플루오레신 및 로다민을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 항체는 당 업계에 공지된 방법에 의해 상기 표지에 접합된다. 예를 들어, 효소 및 발색 분자는 커플링제, 예를 들어 디알데히드, 카보이미드, 디말레이미드 등에 의해 항체에 접합된다. 별법으로, 접합은 리간드-수용체 쌍을 통해 일어난다. 적합한 리간드-수용체 쌍의 예는 비오틴-아비딘 또는 비오틴-스트렙타비딘, 및 항원-항체이다.
본원에서 사용되는 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되며 완전 조립된 항체, 항원에 결합할 수 있는 항체 단편(예를 들어, Fab, F(ab')2, Fv, 단쇄 항체, 디아바디, 항체 키메라, 잡종항체, 이중특이적 항체, 인간화 항체 등), 및 상기를 포함하는 재조합 펩티드를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "단클론 항체" 및 "mAb"는 항체의 실질적으로 동종 집단으로부터 얻은 항체를 나타낸다. 즉, 집단을 구성하는 개별 항체가 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 변이를 제외하고는 동일하다.
"네이티브 항체" 및 "네이티브 면역글로불린"은 대개 약 150,000 달톤의 헤테로테트라머의 당단백질로서 2개의 동일한 경쇄(L) 및 두 개의 동일한 중쇄(H)로 이루어진다. 각 경쇄는 한 개의 공유 이황화 결합에 의해 중쇄에 결합되지만, 이황화 결합의 수는 상이한 면역글로불린 이소형의 중쇄 사이에서 다르다. 각 중쇄 및 경쇄는 또한 규칙적인 간격으로 쇄내 이황화 가교를 갖는다. 각 중쇄는 한 쪽 끝에 가변 도메인(VH)에 이어 다수의 불변 도메인을 갖는다. 각 경쇄는 한 끝에 한 개의 가변 도메인(VL) 및 다른 한 끝에 한 개의 불변 도메인을 가지며, 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 첫째 불변 도메인과 나란하며, 경쇄의 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 나란하다. 특정 아미노산 잔기가 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 사이에 공유영역을 형성하는 것으로 생각된다.
용어 "가변"은 가변 도메인의 어떤 부분이 항체 사이의 서열에서 광범위하게 상이하다는 사실을 나타낸다. 가변 영역은 항체 특이성을 부여한다. 그러나 가변성은 항체의 가변 도메인에 걸쳐 고르게 분포되어 있지 않다. 가변성은 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 모두에서 상보성 결정 영역(CDR: complementarity determining regions) 또는 과가변 영역이라고 불리는 세 개의 분절에 집중되어 있다. 가변 도메인의 더 높은 보존성을 갖는 영역은 골격(FR: framework) 영역으로 불린다. 네이티브 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 각각은 대개는 β-병풍 구조 배열을 채택하고 있는 4개의 FR 영역을 포함하며, 이들은 영역은 β-병풍 구조의 일부를 연결하고, 어떤 경우에는, β-병풍 구조의 일부를 형성하는 루프를 형성하는 세 개의 CDR에 의해 연결되어 있다. 각 사슬 내에 CDR은 FR 영역 옆에 아주 근접하게 모여, 다른 사슬의 CDR과 함께 항체의 항원 결합 부위 형성에 기여한다(문헌(Kabat et al. (1991) NIH PubL. No. 91-3242, Vol. I, pages 647-669) 참조). 불변 도메인은 항원과 항체의 결합에 직접적으로 관여하지 않지만, Fc 수용체(FcR) 결합, 항체 의존적 독성에 항체의 관여, 보체 의존적 세포독성의 개시, 및 비만 세포 탈과립과 같은 다양한 이펙터 기능을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "과가변 영역"은 항원 결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 나타낸다. 과가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"(즉, 경쇄 가변 도메인의 잔기 24-34(L1), 50-56(L2), 및 89-97(L3), 및 중쇄 가변 도메인의 31-35(H1), 50-65(H2), 및 95-102(H3)(Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, Md.)) 및/또는 "과가변 루프"의 아미노산 잔기(즉, 경쇄 가변 도메인의 잔기 26-32(L1), 50-52(L2), 및 91-96(L3), 및 중쇄 가변 도메인의 (H1), 53-55(H2), 및 96-101(H3)(Clothia and Lesk, (1987) J. Mol. Biol., 196:901-917))를 포함한다. "골격" 또는 "FR" 잔기는 본원에서 간주되는 과가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다.
"항체 단편"은 완전 항체의 일부분, 바람직하게는 완전 항체의 항원 결합 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, F(ab')2, 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체(Zapata et al. (1995) Protein Eng. 10:1057-1062); 단쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다. 항체의 파파인 절단은 "Fab" 단편으로 불리는 두 개의 동일한 항원 결합 단편을 생성하고, 이들 각각은 단일 항원 결합 부위 및 나머지 "Fc" 단편을 가지며, 그 명칭은 쉽게 결정화할 수 있다는 것을 반영한다. 펩신 처리는 두 개의 항원 결합 부위를 가지며 여전히 항원과 가교를 형성할 수 있는 F(ab')2 단편을 생성한다.
"Fv"는 완전한 항원 인식 및 결합 부위를 포함하는 최소 항체 단편이다. 이 영역은 한 개의 중쇄 가변 도메인과 한 개의 경쇄 가변 도메인이 단단히 비공유적으로 결합된 이중체를 이룬다. 상기 배열로 각 가변 도메인의 세 개의 CDR은 상호작용하여 VH-VL 이중체의 표면에 항원 결합 부위를 한정하다. 총체적으로, 6개의 CDR은 항체에 항원 결합 특이성을 부여한다. 그러나 단일 가변 도메인(또는 항원에 특이적인 세 개의 CDR만을 포함하는 Fv의 절반)도, 전체 결합 부위에 비해 낮은 친화성이긴 하지만 항원을 인식하고 결합하는 능력을 갖는다.
또한, Fab 단편은 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 첫째 불변 도메인(CH1)을 포함한다. Fab 단편은 항체 경첩 영역의 한 개 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카복시 말단에 몇몇 잔기를 첨가하여 Fab' 단편과는 상이하다. Fab'-SH는 본원에서 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)이 유리 티올기를 포함한 Fab'를 나타낸다. Fab' 단편은 F(ab')2 단편의 중쇄 이황화 가교를 환원시킴으로써 생성된다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링도 공지되어 있다.
모든 척추동물 종의 항체(면역글로불린)의 "경쇄"는 불변 도메인의 아미노산 서열을 기준으로 카파(κ) 및 람다(λ)라고 불리는 두 개의 명백하게 구별되는 유형 중 하나로 지정될 수 있다.
중쇄 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 면역글로불린은 상이한 부류로 나뉘어 질 수 있다. 인간 면역글로불린은 5가지의 주요 부류인 IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM이 있으며, 이들 중 몇몇은 하위 부류(이소형), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2로 더 분류될 수 있다. 면역글로불린의 상이한 부류에 해당하는 중쇄의 불변 도메인은 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마, 및 뮤로 불린다. 면역글로불린의 상이한 부류의 서브유닛 구조 및 3차원 배열은 잘 알려져 있다. 상이한 이소형은 상이한 이펙터 기능을 갖는다. 예를 들어, 인간 IgG1 및 IgG3 이소형은 ADCC(antigen dependent cell-mediated cytotoxicity: 항체 의존적 세포 매개 독성) 활성을 갖는다.
일부 실시양태에서, 생물학적 샘플, 예를 들어 조직 샘플 내에 한 가지 이상의 바이오마커 또는 다른 관심 단백질의 발현 또는 존재는 방사면역분석법, 효소면역분석법(ELISA), 경쟁적 결합 효소면역분석법, 점 블롯(예를 들어, 문헌(Promega Protocols and Applications Guide, Promega Corporation (1991)) 참조), 웨스턴 블롯(예를 들어, 문헌(Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Vol. 3, Chapter 18 (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, N.Y.)) 참조), 크로마토그래피, 예를 들어 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC: high performance liquid chromatography), 또는 당 업계에 공지된 기타 분석법에 의해 결정된다. 따라서, 검출 분석법은 예를 들어 면역블로팅, 면역확산, 면역전기영동, 또는 면역침전(이에 제한되지는 않음)과 같은 단계를 수반한다.
일부 실시양태에서, 본원에서 기재된 한 가지 이상의 바이오마커의 발현 및 존재는 또한 핵산 수준에서 결정된다. 발현을 평가하기 위한 핵산 기반 기술은 당 업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 생물학적 샘플 내에 바이오마커 mRNA의 수준을 결정하는 방법을 포함한다. 많은 발현 검출 방법이 단리된 RNA를 이용한다. mRNA 단리에 불리하게 선별하지 않는 임의의 RNA 단리 기술이 RNA의 정제에 이용된다(예를 들어, 문헌(Ausubel et al., ed. (1987-1999) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, New York)) 참조). 추가적으로, 다량의 조직 샘플은 예를 들어 미국 특허 제4,843,155호에 개시된 단일 단계 RNA 단리 방법과 같이 당 업자에게 잘 알려진 기술을 이용하여 용이하게 처리된다.
따라서, 일부 실시양태에서, 바이오마커 또는 기타 다른 단백질의 검출은 핵산 프로브를 이용하여 핵산 수준에서 분석된다. 용어 "핵산 프로브"는 특별히 의도하는 표적 핵산 분자, 예를 들어 뉴클레오티드 전사체에 선택적으로 결합할 수 있는 모든 분자를 나타낸다. 프로브는 당 업자에 의해 합성되거나 적합한 생물학적 제조물로부터 유래된다. 프로브는, 예를 들어, 방사성 표지, 형광 표지, 효소, 화학발광 태그, 비색 태그, 또는 상기에 논의되거나 당 업계에 공지된 기타 표지 또는 태그로 표지되도록 특이적으로 설계된다. 프로브로 이용되는 분자의 예는 RNA 및 DNA를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
예를 들어, 단리된 mRNA는 서던 또는 노던 분석, 중합효소 연쇄 반응 분석 및 프로브 배열을 포함하는, 그러나 이에 제한되지 않는, 혼성화 또는 증폭 분석법에 이용된다. mRNA 수준의 검출 방법은 검출될 유전자에 의해 코딩되는 mRNA와 혼성화하는 핵산 분자(프로브)와 단리된 mRNA를 접촉시키는 단계를 수반한다. 핵산 프로브는 예를 들어 전장의 cDNA 또는 그의 일부분, 예를 들어 최소 7, 15, 30, 50, 100, 250 또는 500개의 뉴클레오티드 길이이면서 엄격한 조건하에서 본원에서 상기에 기재된 바이오마커를 코딩하는 mRNA 또는 게놈 DNA에 특이적을 혼성화하기에 충분한 올리고뉴클레오티드로 구성된다. 프로브와 mRNA의 혼성화는 바이오마커 또는 관심의 기타 표적 단백질이 발현되고 있다는 것을 나타낸다.
일부 실시양태에서, mRNA는 단리된 mRNA를 아가로스 겔 상에 이동시키고 mRNA를 겔로부터 니트로셀룰로스와 같은 막으로 옮김으로써 고상 표면에 고정화되어 프로프와 접촉된다. 또 다른 실시양태에서, 프로브(들)은 예를 들어 유전자 칩 배열에서 고상 표면에 고정되고 mRNA가 프로브(들)와 접촉된다. 당 업자는 바이오마커 또는 관심의 다른 단백질을 코딩하는 mRNA 수준을 검출하는데 사용하기 위해 공지된 mRNA 검출 방법을 용이하게 조정한다.
샘플 내 관심의 mRNA의 수준을 결정하는 또 다른 방법은 예를 들어 RT-PCR(예를 들어, 미국 특허 제 4,683,202호 참조), 리가아제 연쇄 반응법(Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189 193), 자활(self-sustained) 서열 복제(Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878), 전사증폭 시스템(Kwoh et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177), Q-베타 레플리카제(Lizardi et al. (1988) Bio/Technology 6:1197), 회전 환형 복제(rolling circle replication)(미국 특허 제5,854,033호) 또는 다른 모든 핵산 증폭 방법에 의한 생산 증폭 과정, 이어서 당업자에게 잘 알려진 기술을 이용한 증폭된 분자의 검출을 수반한다. 이러한 검출 도식은 핵산 분자가 매우 적은 수로 존재하는 경우 핵산 분자의 검출에 특히 유용하다. 본 발명의 특정 측면에서, 바이오마커 발현은 정량적 형광원 RT-PCR(즉, 택맨O(TaqManO) 시스템에 의해 평가된다.
관심 RNA의 발현 수준은 막 블롯(예를 들어 노던, 점 등과 같은 혼성화 분석에 사용됨) 또는 마이크로웰, 샘플관, 겔, 비드 또는 섬유(또는 결합된 핵산을 포하는 임의의 고상 지지물)을 이용하여 모니터된다. 본원에서 그 전문으로 참고에 포함된 미국 특허 제5,770,722호, 제5,874,219호, 제5,744,305호, 제5,677,195호 및 제5,445,934호를 참조한다. 또한, 발현의 검출은 용액 중에 핵산 프로브를 이용하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 미세배열은 한 가지 이상의 바이오마커의 발현 또는 존재를 결정하는데 사용된다. 미세배열은 상이한 실험 사이에 재현성으로 인해 본 목적에 특히 적합하다. DNA 미세배열은 다수의 유전자의 발현 수준을 동시에 측정하기 위한 방법을 제공한다. 각 배열은 고상 지지체에 부착된 재현가능하게 반복된 캡쳐 프로브로 이루어진다. 표지된 RNA 또는 DNA는 배열상에 상보성 프로브에 혼성화된 후 레이저 스캐닝에 의해 검출된다. 배열상에 각 프로브의 혼성화 세기가 측정되고 상대적인 유전자 발현 수준을 나타내는 정량적인 값으로 전환된다. 본원에서 그 전문으로 참고에 포함된 미국 특허 제6,040,138호, 제5,800,992호 및 제6,020,135호, 제6,033,860호, 및 제6,344,316호를 참조한다. 고밀도의 올리고뉴클레오티드 배열은 특히 샘플 내 다수의 RNA의 유전자 발현 프로파일을 결정하는데 유용하다.
기계 합성법을 이용하는 상기 배열을 합성하기 위한 기술은 예를 들어 본원에서 그 전문으로 참고에 포함된 미국 특허 제5,384,261호에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 배열은 사실상 어떤 모양의 기판에든 또는 심지어 다중의 기판 위에 제조된다. 일부 실시양태에서, 배열은 평면 배열 기판이다. 일부 실시양태에서, 배열은 비드, 겔, 중합체 기판, 광섬유와 같은 섬유, 유리 또는 적합한 모든 기판상의 펩티드 또는 핵산을 포함한다. 미국 특허 제5,770,358호, 제5,789,162호, 제5,708,153호, 제6,040,193호 및 제5,800,992호를 참조하며, 상기 각각은 이로써 본원에서 그 전문으로 포함된다. 일부 실시양태에서, 배열은 모두를 포함한 장치의 진단법 또는 기타 조작법을 허용하는 방식으로 포장된다.
D. 키트/제품
어떤 실시양태에서, 본원에서 기재된 한 가지 이상의 방법, 공정, 및 조성물을 이용하기 위한 키트 및 제품이 본원에서 개시된다. 이러한 키트는 바이알, 관 등과 같은 한 개 이상의 용기를 담기 위해 구분된 칸이 나뉜 캐리어, 상자, 또는 용기를 포함하며, 용기의 각각은 본원에 기재된 방법에 사용되는 개별 요소 중 하나를 포함한다. 적합한 용기는 예를 들어 병, 바이알, 주사기, 및 시험관을 포함한다. 일부 실시양태에서, 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재료로 만들어진다.
본원에서 제공된 제품은 포장재를 포함한다. 포장재의 예는 병, 관, 봉지, 용기, 병, 및 선택된 제형 및 원하는 투여 및 치료의 방식에 적합한 임의의 포장 재를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
예를 들어, 용기(들)은 L-Wnt 폴리펩티드를 포함한다. 이러한 키트는 선택적으로 본원에 기재된 방법에서 그의 용도에 관련된 내용을 확인할 수 있는 설명 또는 라벨 또는 지침서를 포함한다.
키트는 통상적으로 내용물 및/또는 사용 설명을 열거하는 라벨 및 사용 설명서를 포함한 포장 삽입물을 포함한다. 또한, 설명서 세트가 통상적으로 포함될 것이다.
한 실시양태에서, 라벨은 용기 위에 존재하거나 용기와 결합되어 있다. 한 실시양태에서, 라벨을 구성하는 글자, 숫자 또는 다른 부호가 용기 자체에 부착되고, 주조되거나 새겨지는 경우 라벨이 용기 위에 있으며, 라벨이 용기를 담는 용기 또는 캐리어 내에 예를 들어 포장 삽입물로서 존재할 때 라벨은 용기와 결합되어 있다. 한 실시양태에서, 라벨은 내용물이 구체적인 치료 용도에 사용된다는 것을 나타내는데 사용된다. 또한, 라벨은 예를 들어 본원에 기재된 방법에서 내용물의 용도에 대한 지시를 명시한다.
본 발명의 더 상세한 내용은 하기의 비제한적인 실시예에 제공된다.
실시예 1
인간 Wnt3a 폴리펩티드의 생산 및 정제
인간 WNT3A는 성인 줄기 세포를 활성화하고 자기재생 및 생존을 촉진하는데 효과적인 지질 변형된 인간 세포 성장 인자이다. 네이티브 인간 WNT3A 352개 아미노산 폴리펩티드는 번역 후 글리코실화 및 팔미토일화에 의해 변형된다. 소수성 폴리펩티드는 측정 가능한 수준의 동질성으로 정제하는데 어려움이 있을 수 있다.
본원에서 기재되고 [도 1]에 나타낸 바와 같이, 인간 WNT3A는 CHO 세포로부터 분비되고 이온 교환(블루 세파로스) 컬럼을 이용하여 정제된다. 정제 후 재조합 인간 WNT3A는 DMPC 및 콜레스테롤로 이루어진 지질 소포로 재구성된다. 슈크로스 밀도 구배 데이터는 WNT3A와 리포솜 사이의 물리적 결합을 증명해준다. 게다가, 리포솜 인간 Wnt3a 폴리펩티드(L-WNT3A)는 수성의 생리 조건하에서 안정할 수 있다. 어떤 경우에는, 리포솜 구조의 형성은 상기 상호작용을 위한 전제조건은 아니다. 어떤 경우에는, 일정하지 않은 구조적 특성을 갖는 지질이 인간 WNT3A와 상호작용하여 수성 환경에서 폴리펩티드를 안정화시킬 수 있다.
어떤 측면에서, L-WNT3A 제형은 골 치유가 지연되는 고위험도 환자에서 골 결손을 치료하기 위한 시험용 신약(IND: investigational new drug) I상 연구에 사용되려고 한다. 어떤 경우에는, 자가 유래 골 이식재(BGM: bone graft material)를 회수하고 L-WNT3A로 생체 외 처리한 후 세척하고 펠릿을 얻는다. 어떤 경우에는, 생성된 재료, 활성화된 BGM(예를 들어, BGMACT)는 약품으로 간주되어 즉시 사용할 준비가 되어 있다. 어떤 경우에는, L-WNT3A는 환자에 직접 투여되지 않지만 자가 유래 세포를 생체 외에서 활성화하는데 사용될 것이다. 어떤 경우에는, 프로그램의 초기 단계인 경우, 제형은 전신 투여되는 리포솜 단백질 제형에 대한 공인된 미국 식품의약국(FDA: Food and Drug Administration) 기준(순도, 안정성 등)을 충족시킬 것으로 예상된다.
CHO 세포로부터 WNT3A의 생산
인간 WNT3A 폴리펩티드를 중국 햄스터 난소 세포주에 도입하고 32-37℃ 범위의 온도에서 부착성 세포로 배양하였다. 현탁액 중에 배양된 CHO 세포를 시험하여 현탁액 중의 CHO 세포가 WNT3A를 효율적을 분비할 수 있는지를 평가하였다(도 9).
WNT3A로 형질전환된 CHO 세포를 글루타맥스(Glutamax), 항생제, 및 혈청이 첨가된 DMEM에서 배양하였다. WNT3A 플라스미드는 유도성이었으며, 다양한 독시사이클린 농도를 시험하였다(도 10). 독시사이클린 농도로 CHO 세포에 의한 Wnt3a 분비량을 조절할 수 있다는 것이 관찰되었다. 세포는 새로운 세포 앨리쿼트를 사용한 후 10일까지 배양될 수 있었다.
CHO 세포로부터 WNT3A 분비를 위해 소 태아 혈청(FBS)을 사용하였다(도 11).
CHO 세포 배양물로부터 조정 배지(CM)를 수집하고, 모아서, 4℃에서 활성에 손실 없이 2개월까지 보관하였다(도 12).
정제하기 전에, CM을 여과하고(0.22 마이크론 필터) 1% 트리톤X-100을 첨가하였다. CM(40 mL)을 20mM 트리스-Cl pH 7.5 및 1% CHAPS로 평형화된 블루 세파로스컬럼에 적용하였다. 통과액을 수집하고 4배의 컬럼 부피의 20mM 트리스-Cl pH 7.5, 1% CHAPS, 50mM KCl로 세척하였다. 컬럼을 4배의 컬럼 부피의 20mM 트리스-Cl pH 7.5, 1% CHAPS, 100mM KCl로 다시 세척하였다. 그 후 컬럼을 3배의 컬럼 부피의 20mM 트리스-Cl pH 7.5, 1% CHAPS, 150mM KCl로 세척하였으며, 이 세척물로부터 인간 WNT3A를 용리하였다. 컬럼을 4배의 컬럼 부피의 20mM 트리스-Cl pH 7.5, 1% CHAPS, 250mM KCl로 다시 세척하였다. 40mL CM으로부터, 수율은 약 60% 순도의 폴리펩티드 12 ㎍이었다. 다른 정제 도식과 비교하여, 본 방법은 더 높은 순도 및 수율로 WNT3A를 생산하였다. 어떤 경우에는, 순도가 70%였다.
WNT3A 생산 및 리포솜
WNT3A 특성화. SDS-PAGE/웨스턴 블롯. WNT3A 정제 분획의 SDS PAGE 및 쿠마씨 블루 염색 분석물을 수집하여 쿠마씨 브릴리언트 블루(Coomassie brilliant blue) 및 질산은으로 염색된 12% SDS 폴리아크릴아미드 겔에 의해 WNT3A 폴리펩티드 순도를 분석하였다(도 2). 도 2에 나타낸바 같이, 정제 분획을 수집하여 쿠마씨 브릴리언트 블루 및 질산은으로 염색된 12% SDS 폴리아크릴아미드 겔에 의해 WNT3A 폴리펩티드 순도를 분석하였다. 측정된 WNT3A의 순도는 70%였다. 피어스(Pierce) 660 단백질 분석 키트 및 280 nm에서의 흡광도를 이용하여 전체 단백질 농도를 측정하였다. 각 분석에서, BSA 표준 곡선을 만들어 단백질 농도를 추산하였다. WNT3A 폴리펩티드 농도는 정량 웨스턴 블롯 및 WNT3A 표준 곡선을 이용하여 결정하였다.
질량 분광분석. 질량 분석법으로 WNT3A 폴리펩티드가 지질화되고 글리코실화되었다는 것을 입증하였다(도 3). 폴리펩티드는 S209에서 팔미토일화되었다는 것이 관찰되었다.
[도 3]에 나타낸 질량 분광분석을 위한 WNT3A 샘플의 제조 방법은 다음과 같다. 폴리펩티드 샘플을 4x 부피의 -80℃에서 미리 냉각된 아세톤으로 침전시켰다. 샘플을 -80℃에서 하룻밤 동안 보관한 후 10,000 RPM으로 4℃에 10분간 초원심분리하였다. 상청액을 제거하고, 폴리펩티드를 8M 요소 및 프로테아제 맥스(pretease max)(Promega)를 포함하는 용액 중에서 재구성하였다. 샘플을 5mM DTT로 환원시키고 55℃에서 30분간 인큐베이션하였다. 그 후 샘플을 실온으로 냉각시킨 후 아크릴아미드(15mM)을 이용하여 실온에서 30분간 알킬화하였다. 그 후 샘플을 50mM 중탄산암모늄, pH 8.0로 <1M 요소 농도로 희석하고 1㎍의 트립신 프로테아제(Promega)를 첨가하였다. 37℃에서 하룻밤 동안 절단을 실시하였다. 반응을 50% 포름산을 첨가하여 켄치(quench)하고, 펩티드를 즉시 세척하고 C18 마이크로-컬럼(NEST group)에서 농축하였다.
액체 크로마토그래프 및 질량 분석(LCMS: Liquid chromatograph and mass spectrometry). 펩티드를 이동상 A 중에 재구성하였다. 구배를 이용하여 분당 300nL로 흘려주는 워터스 나노어퀴티 LC(Waters NanoAcquity LC)를 80분 내지 120분 길이로 사용하였다. 분석 컬럼을 하우스에 채우고 PEEKE C18 3uM 매트릭스를 이용한 용융 실리카(75uM ID)로 약 15cm 길이로 만들었다. 데이타 의존형(DDA: data dependent mode)으로 설정된 LTQ 오비트랩 벨로스(LTQ Orbitrap Velos) 질량 분석계를 이용하여 강렬한 선구 이온에 대해 MSMS 단편화를 수행하였다. CAD, HCD 및 ETD 단편화 기술을 이용하였다.
데이터베이스 검색 및 분석. 질량 분석계의 원시 화일을 시퀘스트(Sequest)를 이용하여 인간 유니프롯(Uniprot) 데이터베이스를 검색하였다. 다음, STY 인산화, ST hexNac, ST Nac, STC 팔미토일화 등에 제한되지 않는 다양한 변형 배열을 참고하여 WNT3A 서열을 포함하는 사용자 지정 데이터를 생성하고 검색하였다. 시퀘스트 검색된 모든 화일을 데이터 검사(interrogation) 및 반정량 분석을 위해 스캐폴(Scaffold)(Proteome Software)에 업로드하였다.
양성 대조군(스템 알디(StemRD)로부터 구입한 WNT3A 단백질)의 경우, 대략 43% 커버리지(coverage)가 달성되었다. 서열 커버리지 및 고유 펩티드는 황색으로 강조되어있다(도 3A). 변형된 잔기는 녹색으로 나타낸다. 팔미토일화 변형은 C77 잔기에서만 검출되었다(도 3B). 정제된 WNT3A의 경우, ~51% 커버리지가 달성되었다. 서열 커버리지 및 고유 펩티드는 황색으로 강조되어 있다(도 3C). 변형된 잔기는 녹색으로 나타낸다. 팔미토일화 변형은 S211 잔기에서 검출되었고(도 3C, D), 가능성 있는 미리스토일화 변형은 잔기 S139 및 S181에서 검출되었다.
L-WNT3A 제형 및 특성화
양성, 음성, 또는 중성 순전하를 포함하는 리포솜 Wnt3a(L-Wnt3a) 폴리펩티드는 양전하를 띤 지질, 음전하를 띤 지질, 또는 중성 전하를 띤 지질을 정제된 Wnt3a와 실온에서 적어도 약 6시간 내지 약 24시간까지 인큐베이션하여 제조하였다. 지질 대 콜레스테롤의 비는 90:10으로 유지하였다. 인큐베이션 후, L-Wnt3a를 4℃에서 1시간까지 16,000-150,000 x g 범위의 힘으로 원심분리하여 CHAPS 및 기타 불순물과 분리하였다. 그 후 L-Wnt3a 펠릿을 멸균 1X PBS에 재현탁하고 질소 기체로 덮고 4℃에서 보관하였다.
WNT3A와 지질의 상호작용. 다양한 탄소쇄 길이의 지질과 결합될 때, WNT3A는 전하를 띠지 않는 지질과 기능적으로 적절한 상호작용을 증명하였다(도 15). 본 데이터는 WNT3A 폴리펩티드와 리포솜 사이의 결합을 매개하는 것은 주로 소수성 상호작용이라는 것을 시사한다(도 4).
L-WNT3A의 TEM 특성화. TEM을 이용하여 L-WNT3A에 대해 관찰된 직경 범위를 가시화하였다(도 4). L-WNT3A의 모양 및 크기는 엑소솜에 경우 보고된 크기 범위, 예를 들어 20-100 nM에 해당한다. 또한, 본원에서 그 전문으로 참고에 구체적으로 포함된 문헌(Dhamdhere et al. (2014) PLoS ONE 9(1): e83650)을 참조한다.
마우스 LSL 세포 기반 분석. 마우스 LSL 세포를 Wnt-반응성 루시퍼라제 리포터 플라스미드pSuperTOPFlash(Addgene) 및 세포 수에 대한 베타 갈락토시다아제 활성을 정규화하기 위한 LacZ 구성적 발현 구조물 pEF/Myc/His/LacZ(Invitrogen)로 안정적으로 형질감염시켰다. 인간 배아 신장 상피(HEK293T) 세포를 상기 두 가지 플라스미드로 안정적으로 형질감염시켰다. 달리 언급되지 않는다면, 세포(50000개 세포/웰, 96-웰 플레이트)는 10% FBS(Gibco) 및 1% P/S(Cellgro)가 보충된 DMEM 중의 L-WNT3A를 전체 150㎕ 중 10㎕ 농도로 처리하였다. 연속 희석된, 정제 WNT3A 폴리펩티드도 포함되었다.
세포를 37℃, 5% CO2에서 하룻밤 동안 인큐베이션한 후 세척하고, 라이시스 버퍼(Lysis Buffer)(Applied Biosystems)로 용해시키고, 루시퍼라제(luc) 및 β-갈락토시다아제(lac) 발현 수준을 이중광 결합된 리포터 유전자 분석 시스템(Applied Biosysytems)을 이용하여 정량하였다. 생물발광은 이중광 장착 발광광도계(Berthold)에서 3회 반복하여 판독하여 정량하였다. WNT3A(ng/㎕) 및 L-WNT3A(ng/㎕)의 활성을 연속 희석된 WNT3A 폴리펩티드에 의해 생성된 표준 곡선으로부터 정하였다(도 5). 시간 경과와 관련된 실험에서, WNT3A 활성은 퍼센트 활성으로 나타내었다. 퍼센트 활성은 다음과 같이 계산하였다.
Figure 112016024262243-pct00009
안정성 데이터의 요약
LSL 리포터 세포 분석 및 PAGE-웨스턴 블롯 분석을 기초로 하여, 발효에서 얻은 조정 배지는 4℃에서 최소 2개월간 안정하였다. LSL 리포터 세포 분석 및 PAGE-웨스턴 블롯 분석을 기초로 하여, L-WNT3A는 4℃에서 >106일 동안 안정하였다(도 6). LSL 리포터 세포 분석 및 PAGE-웨스턴 블롯 분석을 기초로 하여, 23℃에서 L-WNT3A는 >48시간의 반감기를 보였다(청색 선, 도 7). 네이키드(naked) WNT3A 폴리펩티드는 23℃에서 5분 내에 활성을 잃었다.
LSL 리포터 세포 분석 및 PAGE-웨스턴 블롯 분석을 기초로 하여, 37℃에서 L-WNT3A는 10.5시간의 반감기를 보였다(청색 선, 도 8). 계면활성제를 첨가하여 소수성 폴리펩티드를 안정화시켰음에도, WNT3A는 5분 내에 활성을 잃었다는 것에 주목한다(적색 선, 도　8).
WNT 세포 리포터 분석의 특성화
LSL 리포터 세포주를 이용하여 Wnt 폴리펩티드 및 작용제의 활성을 평가하였다. 하기 리포터 분석을 이용하여 L-WNT3A를 하기와 같이 특성화하였다. 세포를 분석 웰당 5.0x104개로 플레이트하고 WNT3A 및 L-WNT3A의 활성은 LSL 및 HEK293 리포터 세포주를 이용하여 정량하였다. 상기 조건하에, WNT3A 및 L-WNT3A는 Wnt 신호전달의 유사한 활성화능을 보였다(도 13).
검출의 정확도 및 한계: 분석 감도는 R2=0.99이다. [도14A] 및 [도 14B]에서, WNT는 0.1ng/㎕의 최적 농도에 도달하였다는 것을 보였다. 분석의 절사점은 0.025ng/㎕와 0.2ng/㎕였다. LSL 분석은 WNT3A 농도의 의도한 변화에 의해 영향받지 않았다(도 14C). 다양한 WNT3A 농도는 시간에 대해 루시퍼라제 반응이 비례한다는 것을 증명하였으며, 이것으로 분석의 신뢰성을 나타내었다.
특이성은 Wnt 폴리펩티드 작용제로서 Wnt 경로를 활성화하는 WNT 폴리펩티드와 협력작용을 하는 R-스폰딘2를 이용하여 증명하였다. 또한, 분석 특이성은, Wnt 공수용체 Ror2의 존재하에서 경로의 베타 카테닌 매개된 활성화를 억제하는 WNT5A를 이용하여 증명하였다. [도 13D]에 나타낸 바와 같이 두 시약 모두 LSL 리포터 분석에서 활성을 증명하지 못하였다.
[도 13(A, B)]에 나타낸 바와 같이, 세포를 분석 웰당 5.0x104개로 플레이트하고 WNT3A 및 L-WNT3A 활성 모두를 정량하였다. 상기 조건하에서, WNT3A 및 L-WNT3A 모두는 Wnt 신호전달의 유사한 활성화능을 보였다. 분석 감도는 R2=0.99이다. 정제된 인간 WNT3A 폴리펩티드를 양성 대조군으로 사용하였다. (C) LSL 분석은 WNT3A 농도의 의도한 변화에 의해 영향받지 않았다. 다양한 WNT3A 농도로부터 얻은 데이터는 시간에 대해 루시퍼라제 반응이 비례한다는 것을 증명하였으며, 이것으로 분석의 신뢰성을 나타내었다. (D) 특이성은 WNT3A 존재 및 비존재하에서 Rspo2를 첨가하여 증명하였다.
정확도: 분석은 17.2%의 분석 내 및 분석간 변동계수를 보였다.
1차 MEF를 이용한 L-WNT3A 용량 반응 곡선
LSL 및 HEK293T 세포를 Wnt 및 Wnt 작용제에 민감하도록 조작하였기 때문에 용량, 약물 효과, 및 임상 반응 사이의 관계에 의미있는 데이터를 제공하지 못한다. Wnt 자극에 대한 생체 내 세포 반응에 더 근접하게 모방하기 위해서, 마우스 배아 섬유아세포(MEF)를 경로 활성의 기준으로서 Wnt 표적 유전자 엑신2의 발현을 이용하여 분석하였다.
1차 세포에서 직선 범위의 유효 농도는 0.025-0.1 ng/㎕ WNT3A였다(도 14A). 또한, 골수 유래 줄기 세포에서 L-WNT3A 활성을 분석하여 직선 범위의 유효 농도가 0.004-0.08ng/㎕임을 확인하였다(도 14B). 따라서, 1차 세포군은 Wnt 자극에 유의하게 상이한 민감도를 나타내었다.
선택 지질은 CHAPS를 대체하여 WNT3A를 유지할 수 있었다. DMPC 및 콜레스테롤 지질은 CHAPS를 대체하여 WNT3A 활성을 유지할 수 있었다. 다른 지질, 예를 들어 MPPC, DPPC, DMPS, DMPG, 및 DMGE로 제조된 리포솜은 불활성이었다(도 15).
WNT3A의 지질 재구성
많은 단백질은 고온에서 변성되며, 신체 온도에서 이 같은 변성을 피하는 것은 단백질 치료제의 지속기간을 연장하는데 중요하다. 리포솜 포장은 Wnt3a의 생물학적 활성을 보존하고 상기 제형은 다발성 골 손상 적용에 효능을 가질 수 있다. 리포솜에 대한 Wnt3a의 친화도 및 상기 결합의 안정성을 특성화하였다. L-WNT3A에 의한 Wnt 경로의 속도론 및 역학을 증명하였다.
WNT3A와 리포솜 사이의 친화도. 슈크로스 밀도 구배 데이터는 WNT3A 폴리펩티드와 지질 사이의 물리적 결합을 증명하였다(도 16). [도 16]에서 슈크로스 밀도 구배는 WNT3A와 지질 사이의 물리적 결합을 증명하였다. WNT3A 폴리펩티드(도 16A)는 고밀도 분획에 위치하며 상기 고밀도 분획은 또한 WNT 활성을 보였다(도 16B). 웨스턴 분석은 대부분의 WNT3A 폴리펩티드가 상기 고밀도 분획에 위치하였다는 것을 증명하였다(도 16C). 인지질 분석은 상기 고밀도 분획이 대부분의 지질을 포함하였다는 것을 증명하였다(주황색 선, 도 16B). 따라서 WNT3A 단독과 비교할 때(저밀도 분획 2-3에 분리됨, [도 16D,E]) L-WNT3A는 고밀도 분획으로 이동하였으며, 이것으로 WNT3A와 리포솜 사이에서 물질적 결합이며 응집이 아니라는 것이 증명되었다.
WNT3a와 리포솜 사이의 친화도를 추산하였다. Wnt3a/프리즐드 결합 친화도는 약 3.6nM이었다. Wnt3a/리포솜 결합 친화도는 약 9nM이었다. L-Wnt3a와 프리즐드의 경쟁 분석에서, Wnt3a는 리포솜 펠릿에서 관찰되었다(도 17A). 추가의 인큐베이션 후, Wnt3a는 리포솜 펠릿으로부터 분리되어 상청액 중 프리즐드와 우선적으로 결합하였다(도 17B). 따라서 리포솜 막에 대한 Wnt3a의 친화도는 프리즐드에 대한 Wnt3a의 친화도보다 낮았다.
리포솜과 LRP6 사이의 두 번째 경쟁 분석에서, LRP6은 상청액에서 관찰되었다(도 17C). LRP6를 L-Wnt3a의 존재하에서 인큐베이션할 때, LRP6 단백질은 상청액으로부터(도 17C) L-Wnt3a 펠릿(도 17D)으로 이동하였다.
결론: 상기 풀-다운 분석을 기초로 하여, Wnt3a와 리포솜 막 사이의 결합 친화도는 약 6nM로 추산되었다. 또한, 상기 분석으로 리포솜 막에 재구성된 Wnt3a는 그의 수용체 프리즐드 및 LRP6와 상호작용할 수 있는 방식으로 배치된다는 것이 증명되었다.
리포솜과 WNT3A의 결합 속도론
LSL 리포터 세포 분석 및 PAGE-웨스턴 블롯 분석을 기초로 하여, Wnt3a는 리포솜과 신속하게 결합하였으며 본 결합은 폴리펩티드의 활성을 유지하는데 역할을 하였다. 처음에, Wnt3a 활성은 상청액에서 관찰되었다. 약 30분이 경과하면서, Wnt3a 폴리펩티드는 약 3x10-3 nM/sec 속도로 상청액에서 펠릿으로 이동하였다(도 18A). 6시간까지, Wnt3a 활성의 90%가 펠릿에서 관찰되었다. 유사하게, 웨스턴 블롯 분석은 폴리펩티드의 90%가 펠릿에서 확인되었다는 것을 보여주었다. 23℃에서 24시간 후에, 리포솜을 원심분리에 의해 수성 상청액으로부터 분리하였다. 가시적인 폴리펩티드 침전물이 펠릿에서 관찰되지 않았다. 웨스턴 블롯 분석은 대부분의 Wnt3a가 리포솜 펠릿에 있다는 것을 증명하였다(도 18C). [도 18D]는 실험 종료시 상청액 및 펠릿에서 Wnt3a 활성을 나타낸다.
[도 19]는 리포솜과 Wnt5a 및 Wnt10b 상호작용을 나타낸다(도 19).
규모 확대 실험. 냉동 저장된 세포를 15cm 조직 배양 플레이트에 접종하였다. 37℃, 5% CO2에서 3-4일 동안 인큐베이션한 후 세포를 2 x 15cm 플레이트에 4일 동안 1:5 증식시켰다. 이 세포를 20 x 15cm 플레이트로 1:5 더 증식시켰다. 24시간 인큐베이션 후, 세포를 독시사이클린으로 유도하였다. CM을 매 24시간 마다 수집하여 4℃에 보관하였다. CM의 활성을 측정하여 WNT3A의 분비를 확인하였다. 1% 트리톤 X를 1L CM에 첨가하고 0.22μm 필터를 통해 여과시켰다. 그 후, CM을 150ml 블루 세파로스 컬럼에 로딩하였다. 이 실험으로부터, 80㎍의 WNT3A를 KCl 구배로 용리하여, 결과적으로 40%의 총 수율을 얻었다.
재료 및 공급회사
CHO 세포: 인비트로젠(Invitrogen)
플라스미드 벡터: 프로메가(Promega)
지질: 아밴티 폴라 리피드(Avanti Polar Lipids)
블루 세파로스 정제 컬럼:
WNT3A 표준: 스텝 알&디(Stem R&D)
LSL 세포:
초원심분리:
약어
BGM: 골 이식재(bone graft material)
BGMACT: L-WNT3A 활성화된 골 이식재
CHO: 중국 햄스터 난소
CM: 조정 배지(Conditioned media)
Fz: 프리즐드(Frizzled), WNT 수용체
HEK: 인간 배아 신장(Human embryonic kidney)
LSL: 마우스 L 세포
L-WNT3A: 리포솜 WNT3A
MEF: 마우스 배아 섬유아세포(Mouse embryonic fibroblast)
실시예 2
인간 Wnt3a 핵산을 포함하는 플라스미드로 유전적으로 조작된 중국 햄스터 난소(CHO) 세포주를 형질감염시켜 인간 Wnt3a 폴리펩티드를 생산하였다. 리포펙틴 기반 형질감염 방법을 이용하였다. 플라스미드는 독시사이클린 유도성 프로모터의 조절하에 있었다. Wnt3a로 형질전환된 CHO 세포를 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium: 둘베코 수정 이글 배지) + 10% 소 태아 혈청(FBS), 글루타맥스™(글루타민 기본 디펩티드), 항생제(예를 들어, 독시사이클린), G418, 비필수 아미노산, 블라스티시딘 및 혈청을 포함하는 배양 배지 중 부착 또는 현탁 배양물로 약 32-37℃ 범위의 온도에서 배양하였다. CHO 세포에서 분비된 Wnt3a의 양은 부착 또는 현탁 배양물로 배양되었는지에 따라 결정되었다. 독시사이클린을 CHO 세포에 의해 생산되는 인간 Wnt3a의 양을 조절할 수 있는 농도 범위로 배지에 첨가하였다. 배양 배지는 CHO 세포가 Wnt3a를 분비하는 배양 기간에 걸쳐 존재하는 소 태아 혈청(FBS)을 포함하였다. 새로운 앨리쿼트의 세포를 사용한 후 10일까지 세포를 배양할 수 있다.
연속 구배 또는 겔 여과법을 이용한 정제 도식과 비교하여, 본 정제 도식은 단계 구배를 이용하며, 이는 표 1 및 표 2에 나타낸 바와 같이 더 높은 순도와 더 높은 수율을 가져온다. 연속 구배 또는 겔 여과법을 이용하는 정제 도식에서, 연속 염 구배는 150 mM 내지 1.5 M NaCl로 블루 세파로스 컬럼에 흘려준 후, 겔 여과법 및 황산헤파린 컬럼을 거친다. 어떤 경우에는, 본원의 다른 부분에 기재된 바와 같이, 본 도식은 또한 소수성 컬럼(예를 들어, 단백질 A-세파로스 컬럼)과 같은 소수성 정제 단계를 이용한다.
표 1은 본 발명의 정제 단계에 의해 얻은 결과를 나타내고 표 2는 연속 구배 또는 겔 여과 정제 단계를 이용한 정제 도식에 의해 얻은 결과를 나타낸다.
Figure 112016024262243-pct00010
Figure 112016024262243-pct00011
실시예 3
동물
모든 절차는 동물 연구에 대한 스탠포드 위원회(Stanford Committee on Animal Research)가 승인한 프로토콜을 따랐다. 베타-액틴 증강된 녹색 형광 단백질(ACTB-eGFP(Beta-actin-enhanced green fluorescent protein); The Jackson Laboratory, Sacramento, California) 및 CD1 야생형 동계 마우스를 사용하였다. 3개월 미만의 마우스를 젊은 것으로 간주하고, 10개월이 지난 마우스를 노화한 것으로 간주하였다. 엑신2 CreERT /+ 및 R26R mTmG /+ 마우스를 잭슨 랩(Jackson Labs)으로 부터 구입하였다. 노화 야생형 루이스(Lewis) 랫트(찰스 리버스(Charles Rivers, MA)의 "번식종료된 개체")를 AAUC 및 IUPAC 지침에 따른 척추고정술에 이용하였다.
설치류 모델을 위한 골 이식재(BGM)의 수집 및 처리
본 연구에 랫트와 마우스를 모두 사용하였다. 마우스 모델의 사용은 광범위한 분자 분석을 가능하게 하지만, 자가이식은 이들 소형 동물에게는 침습적이기 때문에, 자가이식을 실시할 때는 랫트를 사용하고(예를 들어, [도 20 및 25]), 고등 분자 기술을 이용할 때는 동계 마우스를 사용하였다(도 21-24). 모든 경우에, 골 이식재(BGM)를 대퇴골, 경골 및 장골능로부터, 뼈를 세로를 가르고, 날카로운 도구로 골내막 표면을 부드럽게 긁어내고, 골수 내용물을 수집 접시에 관주하여 회수하였다. 이 방법은 인간에 사용되는 확공기/관주기/흡인기(RIA: reamer/irrigator/aspirator) 기술을 모방하였다.
엑신2 CreERT /+; R26R mTmG /+ 마우스에서 재조합을 유도하기 위해서(도 21), 동물에게 타목시펜을 체중 g당 160㎍로 IP 주사하고 연속 5일 동안 위관영양 공급하였다. 최초 처리 후 7일에 조직을 회수하고, GFP 면역염색법 또는 형광법으로 분석하였다.
신피막(SRC: sub-renal capsule)에 이식하기 위한 BGM 앨리쿼트를 세포 내용물에 있어 등가가 되도록 하기 위해, 3마리의 마우스(한배 새끼)로부터 얻은 BGM를 모은 후 이식 분석에서와 같이 20 ㎕의 앨리쿼트로 나누었다. DNA 함량을 DN이지 티슈 키트(DNeasy Tissue Kit(QIAGEN)로 추출하고 DNA의 상대 농도를 퀀트-iT 피코그린 dsDNA 키트(Quant-iT PicoGreen dsDNA Kit(Invitrogen)) 및 마이크로플레이트 형광 판독기(BERTHOLD, Bad Wildbad, Germany)를 이용하여 측정하였다. DNA 함량의 변동율은 <20%이었다(도 26).
BGMACT를 얻기 위해서, 새로 회수한 BGM을 인산 완충 식염수(L-PBS) 또는 WNT3A(L-WNT3A, L-WNT3A 유효농도 = 0.15㎍/mL)의 리포솜 제형을 포함하는 배양 배지 20㎕에 넣고 23℃에서 1시간 동안 유지시켰다.
정량 역전사 중합연쇄 반응(qRT-PCR: Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction)
조직 샘플을 트리졸(TRIzol) 용액으로 균질화하였다. RNA를 단리하고 역전사를 실시하였다. 프리즘 7900HT 시퀀스 디텍션 시스템(Prism 7900HT Sequence Detection System) 및 파워 SYBR 그린 PCR 마스터 믹스(Power SYBR Green PCR Master Mix)(Applied Biosystems)를 이용하여 실시간 정량 PCR을 수행하였다. 유전자 발현 수준을 △△CT 방법에 의해 결정하고 그의 GAPDH 값에 정규화하였다. 모든 반응은 3회 반복 실시하였으며, 평균 및 표준편차를 계산하였다.
프라이머 서열(5'에서 3'으로)은 다음과 같다. 엑신2, [정방향-TCATTTTCCGAGAACCCACCGC], [역방향-GCTCCAGTTTCAGTTTCTCCAGCC]; Lef1 , [정방향-AGGAGCCCAAAAGACCTCAT], [역방향-CGTGCACTCAGCTATGACAT]; GAPDH, [정방향-ACCCAGAAGACTGTGGATGG [역방향- GGATGCAGGGATGATGTTCT]; ALP [정방향-ACCTTGACTGTGGTTACTGC, [역방향- CATATAGGATGGCCGTGAAGG]; 오스테릭스, [정방향-GGAGACCTTGCTCGTAGATTTC], [역방향- GGGATCTTAGTGACTGCCTAAC]; 오스테오칼신, [정방향- TGTGACGAGCTATCAAACCAG], [역방향- GAGGATCAAGTTCTGGAGAGC].
웨스턴 분석
BGM을 젊은 마우스(N=5) 및 노화 마우스(N=5)로부터 회수한 후 10% 소 태아 혈청(FBS), 100 U/mL 페니실린 및 100 ㎍/mL 스트렙토마이신을 포함하는 둘베코 수정 이글 배지(DEME)에 넣고, 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 24시간 후, 비부착성 세포를 제거하고, 배지를 교체하고, 부착성 세포가 배지 전체를 덮을 때까지 계대하였다. 배지를 3일마다 교환하였다. 일부 실험에서, 3회 계대 후 세포를 L-PBS 또는 L-WNT3A(유효농도 = 0.03㎍/mL)로 처리하였다. 이 실험에서, 세포를 24시간 후에 수집하고 RIPA 완충액을 이용하여 용해시켰다. 웨스턴 분석을 위해 전체 단백질을 추출하였다. Pan-액틴을 내부 대조군으로 사용하여 단백질 완전성을 확인하였다. WNT3A, 비-인산화 β-카테닌, 및 엑신2에 대한 항체를 사용하였다. 통합된 세기를 이미지J(ImageJ)에 의해 분석하여 웨스턴 블롯팅 결과를 정량하였다.
신피막 이식 수술
어떤 경우에는, 신피막 분석법(SRCA: sub-renal capsular assay)을 이용하여 분화능을 분석하였다. 동계 숙주 마우스를 흡입 마취시킨 후, 흉곽 끝 바로 왼쪽 옆구리에 피부 절개를 만들었다. 복막강을 열어 신장을 노출시켰다. 신피막에 작은 절개를 만들고 BGM을 연질 플라스틱 관을 이용하여 신피막 아래에 조심스럽게 놓았다. 그 후 신장을 복막강으로 다시 넣고, 복막 및 피부를 봉합하였다. 부프레노르핀(0.05mg/kg)을 진통을 위해 사용하였다.
BGM을 엑신2 CreERT2 ;R26 mTmG 공여자로부터 수집한 경우, 계속하여 제0일에 시작하여 5일 동안 위관영양 공급에 의해 타목시펜을 숙주에게 제공하였다. SRC 이식체를 명시된 시점에 회수하였다.
Wnt 신호전달의 아데노바이러스 매개된 억제
DKK1 및 음성 대조군 Fc 아데노바이러스 구조물을 생성하였다. 아데노바이러스 구조물을 293T 세포에 형질감염시켰다. 2일 후, 세포를 수집하여, 용해시키고, 원심분리에 의해 침전시켰다. 정제된 아데노바이러스를 앨리쿼트로 만들어 -80℃에 보관하였다. Ad-Dkk1 및 대조군 Ad-Fc와 BGM을 시험관 내에서 2시간 동안 인큐베이션하여 Wnt 억제를 달성한 후, BGM 앨리쿼트를 두개관 결손 부위에 이식하였다.
두개관 임계 크기 결손 수술
마우스를 마취하고, 3-mm 절개를 만들어 두정골을 노출시켰다. 현미 해부 관상톱을 이용하여 2-mm 직경의 원주에 전 두께(full thickness) 결손을 생성하며 경막은 건드리지 않았다. BGM 앨리쿼트를 Ad-Dkk1 및 대조군 Ad-Fc와 2시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후 BGM 앨리쿼트를 두개관 결손 부위에 이식하고 피부를 봉합하였다. 수술에서 회복한 후, 마우스에게 진통을 위해 부프레노르핀을 주었다.
마이크로 컴퓨터 단층촬영(Micro-CT) 분석을 다음과 같이 수행하였다. 마우스를 2% 이소플루란으로 마취하고 복합 양전자 방출 단층 촬영-컴퓨터 단층 촬영 데이터-수집 시스템(Inveon PET-CT)을 사용하여 40μm 해상도로 스캐닝하였다. 데이터를 마이크로뷰(MicroView) 소프트웨어로 분석하였다. 3차원 관심 영역 도구를 이용하여 각 샘플의 구조 및 골 부피를 지정하였다.
재생된 골 부피 비율의 평가(전체 골 부피를 재생한 골 부피로 나누어 계산된 퍼센트[BV/TV, %])는 70 kVp, 55 μA, 200-ms 노출시간, 및 10.5-μm 등방성 복셀 크기의 고해상도-CT(viaCT 40)를 이용하여 실시하였다. 관심 영역은 2 cm 길이였고 결손의 끝에 가까운 250 μm를 시작으로 결손의 반대 끝을 넘어 말단으로 250 μm 연장되어 있었다(전체 직경 1.5 cm). 뼈를 275 mg/cm3 수산화인회석의 역치를 이용하여 연조직으로부터 분절하였다. 스캐닝 및 분석은 공개된 지침을 따랐다.
척추고정술
루이스 랫트를 케타민 70-100 mg/kg 및 자일라진 5-10 mg/kg의 칵테일을 사용하여 마취하였다. 그 후 랫트의 요추 영역을 면도한 후 베타딘을 적신 거즈로 소독하였다. 피부 절개에 앞서, 랫트를 진통제 부프레노르핀 0.02 mg/kg을 SC/IP로 주사하였다. 우선, 골 이식재(BGM)를 장골능으로부터 채취하였다. 간략하게, 좌장골능을 촉진하고 수직의 피하 절개를 만들고, 장골능의 등배 능선에 접근하여 비절개 박리를 통해 노출시켰다. 부착된 근육 및 골막을 들어올리고 0.3g의 BGM을 절골 겸자로 회수하여 소량으로 나누었다. 그 후 횡돌기가 노출되어 있는 동안 BGM을 100㎕의 L-PBS 또는 100㎕의 [0.15㎍/mL] L-Wnt3a와 인큐베이션하였다.
횡돌기를 노출시키기 위해서, 후측방 비절개 박리를 실시하고 젖혀진 척추주위 근육을 견인기로 고정하였다. L4-L5의 횡돌기에서 골막을 벗겨내고 바(bur)로 피질을 제거하였다. BGM을 L4-L5 횡돌기 위와 사이에 발랐다. 척추주변 근육을 흡수성 봉합사로 봉합하고(4-0 비크릴(Vicryl)(Ethicon)) 피부를 비흡수성 단속 봉합사(4-0 나일론(Ethicon))로 봉합하였다. 수술 부위를 항생제 연고로 처리하였다. 10mg/kg 바이트릴(Baytril)을 피하에 전달하였다. 부프레노르핀(0.02 mg/kg)을 수술 후 3일 동안 투여하고, 통증 조절의 필요에 따라 계속하여 투여하였다.
샘플 제조, 조직 처리과정, 조직학
조직을 4% 파라포름알데히드(PFA) 중에 4℃에서 하루밤 동안 고정하였다. 샘플을 19% EDTA 중에서 1일 동안 탈회시켰다. 표본을 상승 에탄올 계열을 통과시켜 탈수하고 파라핀에 함몰시켰다. 8마이크론 두께의 횡단면을 절단하여 조직학을 위한 수퍼프로스트-플러스(Superfrost-plus) 슬라이드 위에 수집하였다. 사프라닌 O, 아닐린 블루 및 고모리 염색을 실시하였다. 조직 절편을 레이카 DM555B 디지털 이미징 시스템(Leica DM5000B digital imaging system)을 이용하여 촬영하였다.
ALP, TRAP 및 TUNEL 염색
알칼리 포스파타제(ALP) 활성은 니트로 블루 테트라졸리움 클로라이드(NBT), 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 포스페이트(BCIP), 및 NTM 완충액(100mM NaCl, 100mM 트리스 pH9.5, 5mM MgCl) 중에 인큐베이션하여 검출하였다. 타르트레이트 내성 산성 포스파타제(TRAP) 활성을 백혈구 산성 포스파타제 염색 키트를 이용하여 제조사의 지시에 따라 관찰하였다. 발색 후에, 슬라이드를 일련의 에탄올로 탈수화하고, 시트리솔브(Citrosolv)로 세척하고, 퍼마운트(Permount) 봉입제로 덮었다. TUNEL 염색을 위해, 절편을 0.1% 트리톤 X-100 및 0.1% 시트르산나트륨을 이용하여 침투성으로 만들고 TUNEL 반응 혼합물(In Situ Cell Death Detection Kit)과 인큐베이션하였다. 절편을 DAPI 봉입제로 표본 제작하여 에피 형광 현미경으로 가시화하였다.
브로모데옥시우리딘(BrdU) 분석을 위해, 마우스에 BrdU 표지 시약(Invitrogen, CA, USA)을 복강 내 주사하고 4시간 후에 안락사시켰다. BrdU 염색 키트를 제조사의 지시에 따라 사용하여 BrdU 검출을 수행하였다.
면역조직화학법
조직 절편을 파라핀 제거하고 PBS 중에 다시 수화하였다. 내인성 과산화효소 활성을 3% 과산화수소로 5분간 켄치한 후, PBS로 세척하였다. 슬라이드를 5% 염소 혈청으로 실온에서 1시간 동안 차단하였다. 적절한 1차 항체를 첨가하고 4℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 샘플을 적절한 비오티닐화된 2차 항체 및 아비딘/비오티닐화 효소 복합체와 인큐베이션하고 DAB 기질 키트로 발색하였다. 사용된 항체는 GFP 및 DLK1, 런엑스2, Sox9 및 PPAR-γ를 포함하였다.
이식체 성장의 마이크로-CT 분석 및 정량
스캐닝 및 분석은 공개된 지침을 따랐다. 랫트를 2% 이소플루란으로 마취하고 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 데이터 수집 시스템(Inveon)으로 52-μm 해상도로 스캐닝하였다. 각 샘플에서 일어난 이식체 성장을 설명하기 위하여, POD2 및 POD49 시점의 스캐닝 데이터를 오시릭스(Osirix) 소프트웨어 버전 5.8으로 내보내 동일한 방향의 세그멘테이션으로 등록하였다. 형성된 신생 골을 이식된 초기 BGM 부피와 비교하였다. 데이터 세트 사이의 차이를 XLStat 소프트웨어 버전에서 만-위트니(Mann-Whitney) 검정법을 이용하여 결정하였다. p-값 <0.05을 통계적으로 유의하다고 간주하였다.
정량 및 통계 분석
GFP, BrdU, TUNEL, DLK1, 오스테오칼신 및 아닐린 블루 염색을 정량하였다. 포토샵(Photoshop) CS5를 이용하여 손상 부위에서 관심 영역(ROI: region of interest)의 픽셀 수를 결정하였다. 마술봉 툴을 이용하여 ROI 내 양의 픽셀영역을 지정하였다. ROI 픽셀에 대한 양의 신호 픽셀의 비율을 퍼센트로 나타내었다. 손상 분위를 가로질러 고르게 간격을 두어 최소 5개 부분을 정량하여 각 샘플의 평균 값을 결정하였다. 5개 샘플을 각 그룹(n=5)에 포함시켰다. 결과는 평균 ± SD로 나타내었다. 스튜던트 t-검정법을 이용하여 본원에서 기재된 차이를 정량하였다. P≤0.05를 유의하다고 간주하였다.
골 이식재는 다발성 줄기 세포/전구 세포군을 포함한다.
어떤 경우에는, 자가이식체를 회수하기 위한 최적의 해부 부위는 공여 부위 이환율 및 골 스톡의 가용성을 포함한 여러 인자에 따라 결정된다. BGM을 변형된 확공기-관주기-흡인기(RIA) 기술을 이용하여 세 군데의 해부 부위로부터 회수하여 대퇴골, 장골능, 및 경골이 눈에 띄게 상이한 조직학적 외양을 갖는 BGM을 생성하였다는 것을 알았다. 조혈 세포 외에도, 젊은 동물에서 회수된 경우에서조차 대퇴골 BGM은 지방세포를 포함하였다(도 20A). 장골능 BGM은 대개 단단하게 부착된 세포로 덮인 해면골조직 단편으로 이루어졌다(도 20B). 경골 유래의 BGM은 상당한 양의 섬유성 간질 및 핵이 제거된 작은 세포를 포함하였다(도 20C). 정량 RT-PCR을 이용하여 내인성 골 형성 유전자 발현을 평가하여 세 가지 출처 중 장골능 BGM이 상당히 높은 수준의 알칼리 포스파타제 및 오스테오칼신을 발현하였다는 것을 확인하였다(도 20D).
어떤 경우에는, 자가이식체의 골 형성 특성은 골 이식재(BGM) 내에 줄기 세포/전구 세포군 및 조골세포에 기인한다고 생각된다. 자가이식체의 골 형성 특성은 BGM을 신피막(SRC) 분석에 이식하여 조사하였다. SRC는 이식된 조직에 혈관 공급을 제공하고 뼈, 피부, 근육, 치아, 기관, 및 종양을 포함한 여러 종류의 조직으로의 분화를 지원한다. BGM을 장골능으로부터 채취한 후 동물의 신피막 아래에 이식하여(도 20A) 거기서 7일 동안 발생하도록 두었다.
BrdU의 편입은 자가 유래 BGM에서 세포의 높은 유사분열 활성을 증명하였다(도 20B). 런엑스2(도 20C), Sox9(도 20D) 및 PPARγ(도 20E)의 면역염색은 BGM에서 세포의 일부분이 골 형성, 연골발생, 및 지방생성과 연관된 유전자 마커를 발현하였다는 것을 증명하였다. 제7일에, BGM 유래 세포의 일부분은 뼈(도 20F), 연골(도 20G), 및 지방(도 20H)으로 분화하였다. 종합적으로, 상기 데이터는 BGM이 세 가지 계통 모두로 분화할 수 있는 줄기 세포/전구 세포를 포함하였다는 것을 증명하였다.
골 이식재에서 Wnt 신호전달은 노화함에 따라 감소한다.
엑신2CreERT2;R26mTmG 리포터 마우스를 이용하여 골막(도 21A) 및 골 내막(도 21B)에서 GFP+ve 전조골세포의 확인을 가능하게 하는 재조합을 유도하였다. 골 내막에서 GFP+ve 세포의 빈도는 ~0.1%였다(도 21C). 또한, GFP+ve 세포는 새로 회수한 BGM에서 확인되었다(도 21D). 따라서, 이종의 BGM에서 세포의 일부분은 Wnt에 반응한다.
젊은 마우스(<3개월)와 노화 마우스(>10개월) 사이에서 BGM의 Wnt 반응 상태를 비교하였다. 절대 정량 RT-PCR은 Wnt 표적 유전자 엑신2 및 Lef1의 발현이 젊은 마우스(BGMyoug; 도 21F)에 비해 노화 마우스(BGMaged)에서 회수한 BGM에서 거의 두배 더 낮다는 것을 증명하였다. 웨스턴 분석은 Wnt3a, 인산화된 베타 카테닌, 및 엑신2 발현이 모두 BGMyoung에 비해 BGMaged에서 유의하게 낮다는 것을 확인하였다. 따라서, BGM의 내인성 Wnt 반응 상태는 노화함에 따라 악화된다.
골 형성 분화능도 노화함에 따라 감소한다.
인간에서, 골 치유 속도는 노화함에 따라 감소한다. 또한, 유사한 노화 관련 감소가 마우스에서 BGM의 골 형성능에서도 발견되었다. 새로 회수된 BGMaged는 새로 회수된 BGMyoung과 비교하여 골 형성 유전자 알칼리 포스파타제, 오스테릭스, 및 오스테오칼신의 발현 수준이 유의하게 낮다는 것을 보였다(도 22A).
골 형성 유전자 발현에 있어 감소가 BGM의 골 형성능에 영향을 주는지를 시험하기 위하여, SRC 분석을 이용하였다. 그러나 마우스에서 자가이식을 실시하는 것은 지나친 외상성을 갖는다. 자가이식을 모방하기 위하여, 동계 공여자와 숙주를 사용하였다. 동계 동물은 매우 근접하게 연관되기 때문에, 그 조직은 면역학적으로 적합하며 조직의 이식은 면역 반응을 유발하지 않는다. ACTB - eGFP 마우스는 공여자로서 역할을 하였고 BGM은 GFP 형광도에 의해 SRC에서 쉽게 확인할 수 있었다(도 22B, 도 22C).
이식 후 7일에, BGM을 회수하고 골 형성의 증거를 분석하였다. 아닐린 블루로 염색된 유골 기질은 BGMyoung에서는 명백하였으나(도 22D) BGMaged에서는 존재하지 않았다(도 22E)([도 22F]에서 정량됨). BGMyoung에서 유골 기질은 ALP 염색에 의해 나타난 바와 같이 무기질 침착을 보였지만(도 22G) BGMaged는 ALP 염색을 보이지 않았다(도 22H)([도 22I]에서 정량됨). 게다가, GFP 면역염색은 BGMyoung(도 22J)와 BGMaged(도 22K) 모두에서 생존 공여 세포 수가 유사하였다는 것을 증명하였다([도 22L]에서 정량됨). 종합적으로 상기 데이터는 BGM의 골 형성 유전자 발현 및 골 형성능이 노화함에 따라 감소한다는 것을 나타내었다.
BGM의 Wnt 신호전달 및 골 형성능
BGM의 내인성 Wnt 반응성 및 골 형성능은 노화함에 따라 감소한다. Wnt 신호전달의 감소가 골형성능에 있어 상기 노화 관련 감소의 원인이 되는지 시험하기 위하여, BGM에서 내인성 Wnt 신호전달을 차단하였다. 또한, Wnt 억제제인 Dkk1의 과다발현을 이용하여 생체 내에서 Wnt 신호전달을 일시적으로 제거하였다. Ad-Dkk1 또는 Ad-Fc(대조군)을 젊은 마우스의 골수강에 전달한 후 24시간 후에 BGMyoung을 회수하여 앨리쿼트를 임계 크기(비-치유)의 골격 결손 부위에 이식하였다.
7일 후, 대조군 BGMyoung이 ALP 활성에 대해 강하게 양성을 보였을 때(도 23A), Ad-Dkk1 처리된 BGMyoung은 최소 활성을 보였다(도 23B). 대신에, Ad-Dkk1 처리된 BGMyoung은 지방생성 단백질 PPAR-γ(도 23C, 도 23D) 및 Dlk1(도 23E, 도 23F)의 광범위한 발현을 보였다. 마이크로-CT(도 23G, 도 23H)([도 23I]에서 정량됨) 및 BGM의 조직형태측정 분석(도 23J, 도 23K)([도 23L]에서 정량됨)에 나타낸 바와 같이 골 형성은 Ad-Dkk1에 의해 억제되었다. 따라서, BGM의 골 형성능은 내인성 Wnt 신호에 의존한다.
BGMaged 에서 내인성 Wnt 신호의 증가는 그의 골 형성능을 회복시킨다.
[도 23J]-[도 23L]은 내인성 Wnt 신호전달이 BGM의 골 형성능을 활성화할 수 있다는 것을 보였다. 또한, Wnt 자극이 BGM 효능을 증강시키기에 충분한지를 시험하였다. BGMaged을 회수하고, L-WNT3A 또는 리포솜 PBS(L-PBS)로 처리한 후, 37℃에서 인큐베이션하였다(도 24A). 절대 qRT-PCR 분석은 엑신2 발현이 약간 상승된 것을 밝혔다(도 24B). Lef1은 L-WNT3A에 반응하여 적당히 상승되었다(도 24B). 웨스턴 분석은 베타 카테닌 및 엑신2 단백질 모두 L-WNT3A에 반응하여 상승되었다는 것을 나타내었다(도 24C).
BGM에서 유사분열 활성은 L-WNT3A 처리에 의해 증가되었다. 이식 후 4일에, L-PBS 처리된 BGMyoung에 비해 L-WNT3A 처리된 BGMyoung에서 세포 증식이 증가되었다(도 24D, 도 24E)([도 24F]에서 정량됨). 세포 주기에 대한 효과는 이식 후 7일까지 일시적이었고, BrdU 편입은 L-PBS와 L-WNT3A 샘플 사이에 동등하였다(도 24G, 도 24H)([도 24F]에서 정량됨)
BGMyoung에서 세포 분화를 평가하였다. 지방생성 단백질 Dlk1의 발현이 더 낮았고(도 24J, 도 24K)([도 24L]에서 정량됨) 골 형성 단백질 오스테오칼신의 발현은 L-WNT3A 처리된 BGMaged에서 더 높았다(도 24M, 도 24N)([도 24O]에서 정량됨). 신생 골 형성은 L-WNT3A 처리된 BGMaged에서만 발견되었다(도 24P, 도 24Q)([도 24R]에서 정량됨). L-WNT3A의 처리는 생착 효율에 영향을 주지 않았지만(도 27A,B)([도 27C]에서 정량됨) 예정 세포사 분석은 L-WNT3A 처리된 BGMaged가 L-PBS 처리된 샘플보다 적은 TUNEL+ ve 세포를 갖는다는 것을 증명하였다(도 27D, 도 27E)([도 27F]에서 정량됨). 또한, 아폽토시스 감소가 이식 후 7일에 관찰되었다(도 27G, 도 27H)([도 27I]에서 정량됨). 신생 골 형성은 파골세포 매개된 골 재형성을 위한 자극으로서 역할을 하였으며 TRAP 활성은 L-WNT3A 처리된 BGMaged 샘플에서 새로 형성된 유골 기질 주변에서 관찰되었다(도 27J, 도 27K)([도 27L]에서 정량됨).
L-WNT3A는 BGMaged에서 줄기 세포를 활성화하고 척추고정술 모델에서 골 생성을 향상시킨다.
또한, 골 형성능에 있어 L-Wnt3A 매개된 급증을 일으키는 BGM 내 세포군을 확인하였다. 표준 절차를 이용하여 BGM으로부터 두 가지 줄기 세포군을 단리하고 L-PBS(대조군) 또는 L-WNT3A를 이용하여 Wnt 반응성을 기준으로 평가하였다.
시간 경과 분석은 L-WNT3A 처리에 대한 줄기 세포의 반응을 밝혔다. L-WNT3A 노출 후 15시간 내에, 엑신2의 4배 활성화가 관찰되었고 36시간에 엑신2의 최대 활성화가 달성되었다(도 25A). 효과는 60시간 시점에서 줄기 세포에서 감소된 엑신2 발현에 의해 나타난 바와 같이 일시적이었다. BGM으로부터 단리된 두 번째 줄기 세포군을 이용하여 줄기 세포가 L-WNT3A에 반응한다는 것을 입증하였다(도 25B).
BGM의 활성화된 상태를 qRT-PCR에 의해 나타냈다. BGMaged를 회수하고, L-WNT3A 또는 L-PBS로 처리한 후, 그의 Wnt 반응 상태에 대해 엑신2 및 Lef1 발현을 이용하여 분석하였다(도 25C). 12시간 내에 Lef1 의 상승이 검출 가능하였다. 24시간 내에 엑신2 및 Lef1 모두가 상승되었다(도 25C). 본 분석은 BGM의 WNT-매개된 활성화 상태를 확인해주며, 이후로 상기 재료를 BGMACT로서 언급한다.
랫트 척추 고정술 모델에서 BGMACT의 치료능력을 또한 시험하였다. 4번째 및 5번째 요추(예를 들어, L4-5)의 횡돌기의 피질을 제거하고(도 25D), 이 절차 동안, 장골능으로부터 자가 유래 BGMaged을 회수하고 L-WNT3A(또는 L-PBS)로 1시간 동안 처리하였다. 그 후 생성된 재료, BGMACT(또는 BGMaged)를 L4-5 돌기 위와 사이에 이식하였다(도 25E). 수술 후 2일에 BGM의 부피를 마이크로-CT로 평가하였다. 이 분석은 BGMaged(도 25F) 및 BGMACT(도 25G)가 처음에 상당한 양의 광물화된 조직을 포함한다는 것을 확인해 주었다(또한 [도 26] 참조).
신생 골 형성 부피를 수술 후 49일에 재평가하였다. 마이크로-CT 데이터의 3차원 재구성은 BGMaged로 처리된 부위에서 골 재생이 거의 일어나지 않았음을 증명하였다(회색, 도 25H). 반면, BGMACT로 처리된 부위는 왕성한 골 형성 및 횡돌기 사이의 고정의 증거를 보였다(청색, 도 25L). L4와 L5 횡돌기 위와 사이에서 신생 골의 부피를 정량하였다. BGMaged과 비교하여, BGMACT는 더 많은 광물화 기질이 생겼다(도 25J). 따라서, L-WNT3A 처리는 노화 동물로부터 자가이식체의 골 형성능을 향상시킨다.
실시예 4
무혈청 CHO 세포에 특이적인 벡터로부터 Wnt3a의 발현
또한, Wnt3a를 분비하는 CHO 현탁액(CHO-S) 세포는 적합한 발현 배지, 예를 들어 인비트로젠(Invitrogen)의 발현 배지 중에 무혈청 조건하에서 배양될 수 있었다. cGMP에 일치하는 CHO-S 세포주 및 두 가지 유형의 벡터를 WNT3A의 클로닝에 사용하였다. 한 가지 벡터는 pOptivec이었으며, 이것은 CMV 프로모터 하류에 포유동물 분비 신호 및 관심 유전자를 포함하는 유전자의 신속한 클로닝을 가능하게 하는 TOPO® 개조된 이중 시스트론 플라스미드이다. 디히드로엽산 환원효소 선별 마커는 신속한 선별을 가능하게 한다. 이 벡터를 CHO-S 세포의 일시적인 형질감염에 사용하였다. 또 다른 벡터는 pTargeT™ 였다. 이 벡터는 CHO-S 세포를 일시적으로 형질감염시키는 데와 Wnt 폴리펩티드(예를 들어, Wnt3a)를 발현하는 안정 세포주를 생성하는데 사용하였다.
CHO 세포 배양물에서 조정 배지(CM)를 유도 후 3일과 13일 사이에 수집하여 모았다. 각 날에 CM 중의 단백질 생산의 분석을 기초로 하여, 상기 범위의 경과 일 수가 배양 조건하에서 최적임이 결정되었다. 상기 조건하에서, 3일과 13일 사이에 높은 단백질 생산이 관찰되었고, 13일 후에 세포가 사멸하기 시작하였다.
실시예 5
지질 규정 대용물로의 혈청의 대체
혈청 내 지질 성분들이 규정된 지질 세트로 대체될 수 있는지를 확인하기 위하여 혈청 내 지질 성분들을 조사하였다. 숯 박리제는 혈청으로부터 비극성 친유성 물질(바이러스, 성장인자, 호르몬)을 제거한다. CHO 세포가 10% FBS 중에서 배양되는 대조군 조건과 비교하여, 숯으로 박리된 FBS에서 배양된 CHO 세포는 Wnt3a를 분비하지 못한다. 이 데이터는 혈청의 친유성 구성요소가 Wnt3a 분비에 필요하다는 결론을 지지해 준다. 콜레스테롤, 토코페롤, 및 비동물 유래된 지방산(이놀레산, 리놀레산, 미리스트산, 올레산, 팔미트산 및 스테아르산)을 포함하는 리피드 믹스 1(Sigma)은 CHO 세포 성장 속도를 향상시키고 DHO 세포에 Wnt3a 분비를 회복시킬 것이다.
실시예 6
혈청 의존성의 단계적 감소
또한, WNT3A 생산을 위해 혈청에 의존하지 않는 과정에 도달하기 위한 방법으로서 연속 배양을 시험한다. CHO 세포 성장은 혈청 감소와 동시에 감소된다. 결과적으로 조정 배지를 수집하기 위한 기간을 변화시키는 것이 중요하다. 어떤 경우에는, 세포는 0.5% FBS로 조정된다.
상기 기재 내용에서 본 발명은 특정 실시양태와 관련하여 예시되지만, 그에 제한되는 것은 아니다. 실제로, 본원에서 제시하고 기재한 것 이외에도 상기 기재 내용으로부터 본 발명의 다양한 변형은 당업자에게 자명할 것이며 이들 변형은 첨부된 청구항의 범위 내에 포함될 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> Jill Helms Girija Dhamdhere <120> Wnt compositions and methods for purification <130> STAN-1128WO <150> 61/885,827 <151> 2013-10-02 <160> 2 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 352 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Pro Leu Gly Tyr Phe Leu Leu Leu Cys Ser Leu Lys Gln Ala 1 5 10 15 Leu Gly Ser Tyr Pro Ile Trp Trp Ser Leu Ala Val Gly Pro Gln Tyr 20 25 30 Ser Ser Leu Gly Ser Gln Pro Ile Leu Cys Ala Ser Ile Pro Gly Leu 35 40 45 Val Pro Lys Gln Leu Arg Phe Cys Arg Asn Tyr Val Glu Ile Met Pro 50 55 60 Ser Val Ala Glu Gly Ile Lys Ile Gly Ile Gln Glu Cys Gln His Gln 65 70 75 80 Phe Arg Gly Arg Arg Trp Asn Cys Thr Thr Val His Asp Ser Leu Ala 85 90 95 Ile Phe Gly Pro Val Leu Asp Lys Ala Thr Arg Glu Ser Ala Phe Val 100 105 110 His Ala Ile Ala Ser Ala Gly Val Ala Phe Ala Val Thr Arg Ser Cys 115 120 125 Ala Glu Gly Thr Ala Ala Ile Cys Gly Cys Ser Ser Arg His Gln Gly 130 135 140 Ser Pro Gly Lys Gly Trp Lys Trp Gly Gly Cys Ser Glu Asp Ile Glu 145 150 155 160 Phe Gly Gly Met Val Ser Arg Glu Phe Ala Asp Ala Arg Glu Asn Arg 165 170 175 Pro Asp Ala Arg Ser Ala Met Asn Arg His Asn Asn Glu Ala Gly Arg 180 185 190 Gln Ala Ile Ala Ser His Met His Leu Lys Cys Lys Cys His Gly Leu 195 200 205 Ser Gly Ser Cys Glu Val Lys Thr Cys Trp Trp Ser Gln Pro Asp Phe 210 215 220 Arg Ala Ile Gly Asp Phe Leu Lys Asp Lys Tyr Asp Ser Ala Ser Glu 225 230 235 240 Met Val Val Glu Lys His Arg Glu Ser Arg Gly Trp Val Glu Thr Leu 245 250 255 Arg Pro Arg Tyr Thr Tyr Phe Lys Val Pro Thr Glu Arg Asp Leu Val 260 265 270 Tyr Tyr Glu Ala Ser Pro Asn Phe Cys Glu Pro Asn Pro Glu Thr Gly 275 280 285 Ser Phe Gly Thr Arg Asp Arg Thr Cys Asn Val Ser Ser His Gly Ile 290 295 300 Asp Gly Cys Asp Leu Leu Cys Cys Gly Arg Gly His Asn Ala Arg Ala 305 310 315 320 Glu Arg Arg Arg Glu Lys Cys Arg Cys Val Phe His Trp Cys Cys Tyr 325 330 335 Val Ser Cys Gln Glu Cys Thr Arg Val Tyr Asp Val His Thr Cys Lys 340 345 350 <210> 2 <211> 2826 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 atggccccac tcggatactt cttactcctc tgcagcctga agcaggctct gggcagctac 60 ccgatctggt ggtcgctggc tgttgggcca cagtattcct ccctgggctc gcagcccatc 120 ctgtgtgcca gcatcccggg cctggtcccc aagcagctcc gcttctgcag gaactacgtg 180 gagatcatgc ccagcgtggc cgagggcatc aagattggca tccaggagtg ccagcaccag 240 ttccgcggcc gccggtggaa ctgcaccacc gtccacgaca gcctggccat cttcgggccc 300 gtgctggaca aagctaccag ggagtcggcc tttgtccacg ccattgcctc agccggtgtg 360 gcctttgcag tgacacgctc atgtgcagaa ggcacggccg ccatctgtgg ctgcagcagc 420 cgccaccagg gctcaccagg caagggctgg aagtggggtg gctgtagcga ggacatcgag 480 tttggtggga tggtgtctcg ggagttcgcc gacgcccggg agaaccggcc agatgcccgc 540 tcagccatga accgccacaa caacgaggct gggcgccagg ccatcgccag ccacatgcac 600 ctcaagtgca agtgccacgg gctgtcgggc agctgcgagg tgaagacatg ctggtggtcg 660 caacccgact tccgcgccat cggtgacttc ctcaaggaca agtacgacag cgcctcggag 720 atggtggtgg agaagcaccg ggagtcccgc ggctgggtgg agaccctgcg gccgcgctac 780 acctacttca aggtgcccac ggagcgcgac ctggtctact acgaggcctc gcccaacttc 840 tgcgagccca accctgagac gggctccttc ggcacgcgcg accgcacctg caacgtcagc 900 tcgcacggca tcgacggctg cgacctgctg tgctgcggcc gcggccacaa cgcgcgagcg 960 gagcggcgcc gggagaagtg ccgctgcgtg ttccactggt gctgctacgt cagctgccag 1020 gagtgcacgc gcgtctacga cgtgcacacc tgcaagtagg caccggccgc ggctccccct 1080 ggacggggcg ggccctgcct gagggtgggc ttttccctgg gtggagcagg actcccacct 1140 aaacggggca gtactcctcc ctgggggcgg gactcctccc tgggggtggg gctcctacct 1200 gggggcagaa ctcctacctg aaggcagggc tcctccctgg agctagtgtc tcctctctgg 1260 tggctgggct gctcctgaat gaggcggagc tccaggatgg ggaggggctc tgcgttggct 1320 tctccctggg gacggggctc ccctggacag aggcggggct acagattggg cggggcttct 1380 cttgggtggg acagggcttc tcctgcgggg gcgaggcccc tcccagtaag ggcgtggctc 1440 tgggtgggcg gggcactagg taggcttcta cctgcaggcg gggctcctcc tgaaggaggc 1500 ggggctctag gatggggcac ggctctgggg taggctgctc cctgagggcg gagcgcctcc 1560 ttaggagtgg ggttttatgg tggatgaggc ttcttcctgg atggggcaga gcttctcctg 1620 accagggcaa ggccccttcc acgggggctg tggctctggg tgggcgtggc ctgcataggc 1680 tccttcctgt gggtggggct tctctgggac caggctccaa tggggcgggg cttctctccg 1740 cgggtgggac tcttccctgg gaaccgccct cctgattaag gcgtggcttc tgcaggaatc 1800 ccggctccag agcaggaaat tcagcccacc agccacctca tccccaaccc cctgtaaggt 1860 tccatccacc cctgcgtcga gctgggaagg ttccatgaag cgagtcgggt ccccaacccg 1920 tgcccctggg atccgagggc ccctctccaa gcgcctggct ttggaatgct ccaggcgcgc 1980 cgacgcctgt gccacccctt cctcagcctg gggtttgacc acccacctga ccaggggccc 2040 tacctgggga aagcctgaag ggcctcccag cccccaaccc caagaccaag cttagtcctg 2100 ggagaggaca gggacttcgc agaggcaagc gaccgaggcc ctcccaaaga ggcccgccct 2160 gcccgggctc ccacaccgtc aggtactcct gccagggaac tggcctgctg cgccccaggc 2220 cccgcccgtc tctgctctgc tcagctgcgc ccccttcttt gcagctgccc agcccctcct 2280 ccctgccctc gggtctcccc acctgcactc catccagcta caggagagat agaagcctct 2340 cgtcccgtcc ctccctttcc tccgcctgtc cacagcccct taagggaaag gtaggaagag 2400 aggtccagcc ccccaggctg cccagagctg ctggtctcat ttgggggcgt tcgggaggtt 2460 tggggggcat caaccccccg actgtgctgc tcgcgaaggt cccacagccc tgagatgggc 2520 cggccccctt cctggcccct catggcggga ctggagaaat ggtccgcttt cctggagcca 2580 atggcccggc ccctcctgac tcatccgcct ggcccgggaa tgaatgggga ggccgctgaa 2640 cccacccggc ccatatccct ggttgcctca tggccagcgc ccctcagcct ctgccactgt 2700 gaaccggctc ccaccctcaa ggtgcgggga gaagaagcgg ccaggcgggg cgccccaaga 2760 gcccaaaaga gggcacaccg ccatcctctg cctcaaattc tgcgtttttg gttttaatgt 2820 tatatc 2826

Claims (293)

  1. 리포솜 Wnt 폴리펩티드의 제조 방법으로서, Wnt 폴리펩티드를 포함하는 샘플을 리포솜의 수용액과 접촉시키는 단계를 포함하며, 리포솜이 중성 인지질 및 콜레스테롤을 포함하고, 중성 인지질이 10℃ 내지 25℃의 상전이온도를 가지고, Wnt 폴리펩티드 대 리포솜의 농도가 중량 대 중량비로 0.1:50, 0.5:30, 1:20 또는 1:14인 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, Wnt 폴리펩티드가 서열 번호 1에 개시된 아미노산 잔기 209에 해당하는 아미노산 위치에서 지질 변형된 것인 제조 방법.
  3. 제2항에 있어서, Wnt 폴리펩티드가 서열 번호 1에 개시된 아미노산 잔기 77에 해당하는 아미노산 위치에서 지질 변형되지 않은 것인 제조 방법.
  4. 제1항에 있어서, 접촉이 15℃ 내지 37℃, 18℃ 내지 33℃, 또는 20℃ 내지 28℃의 온도에서 일어나는 것인 제조 방법.
  5. 제1항에 있어서, 접촉이 21℃ 내지 25℃의 온도에서 일어나는 것인 제조 방법.
  6. 제1항에 있어서, 접촉 시간이 6시간 내지 24시간인 제조 방법.
  7. 제1항에 있어서, Wnt 폴리펩티드는 리포솜 막으로 통합되고, 리포솜 막으로부터 지질 막의 외부 표면 위로 돌출되며, 리포솜의 수성 코어로 편입되지 않는 것인 제조 방법.
  8. 제1항에 있어서, 리포솜을 구성하는 인지질이 12개 내지 14개 탄소의 테일 탄소 길이를 갖는 것인 제조 방법.
  9. 제1항에 있어서, 리포솜이 pH 6.5 내지 8.0, 7.0 내지 7.8, 또는 7.2 내지 7.6에서 순전하 0을 갖는 것인 제조 방법.
  10. 제1항에 있어서, 중성 인지질이 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DMPC)인 제조 방법.
  11. 삭제
  12. 제1항에 있어서, 중성 인지질과 콜레스테롤의 농도가 70:30 내지 90:10의 비로 정해지는 것인 제조 방법.
  13. 제10항에 있어서, DMPC와 콜레스테롤의 농도가 70:30 내지 90:10의 비로 정해지는 것인 제조 방법.
  14. 제1항에 있어서, Wnt 폴리펩티드가 지질 변형을 포함하고, 지질 변형이 팔미토일화인 제조 방법.
  15. 제1항에 있어서, Wnt 폴리펩티드가 추가로 글리코실화된 것인 제조 방법.
  16. 제1항에 있어서, Wnt 폴리펩티드가 포유동물 Wnt 폴리펩티드인 제조 방법.
  17. 제16항에 있어서, 포유동물이 인간인 제조 방법.
  18. 제1항에 있어서, Wnt 폴리펩티드가 Wnt3a 폴리펩티드인 제조 방법.
  19. 제18항에 있어서,
    a) 중국 햄스터 난소(Chinese hamster ovary; CHO) 세포를 포함하는 조정 배지(conditioned media)로부터 Wnt3a 폴리펩티드를 회수하는 단계,
    b) 설폰화된 다환 방향족 화합물이 고정화된 이온 교환 컬럼에 Wnt3a 폴리펩티드를 도입하는 단계,
    c) 단계 구배를 이용하여 이온 교환 컬럼으로부터 Wnt3a 폴리펩티드를 용리하는 단계, 및
    d) 단계 (c)로부터의 Wnt3a 폴리펩티드를 리포솜의 수용액과 접촉시키는 단계
    를 추가로 포함하는 제조 방법.
  20. 제19항에 있어서, 단계 구배가 제1 구배 및 제2 구배를 포함하는 것인 제조 방법.
  21. 제20항에 있어서, 제1 구배가 50 mM 염화칼륨을 포함하는 완충액을 포함하고, 제2 구배가 150 mM 염화칼륨 내지 1.5 M 염화칼륨을 포함하는 완충액을 포함하는 것인 제조 방법.
  22. 제21항에 있어서, 완충액이 계면활성제를 더 포함하는 것인 제조 방법.
  23. 제22항에 있어서, 계면활성제가 CHAPS 또는 트리톤(Triton) X-100인 제조 방법.
  24. 제19항에 있어서, 조정 배지가 혈청 또는 혈청 대용물을 포함하는 것인 제조 방법.
  25. 제24항에 있어서, 조정 배지가 혈청을 포함하는 것인 제조 방법.
  26. 제25항에 있어서, 혈청이 소 태아 혈청인 제조 방법.
  27. 제26항에 있어서, 혈청 농도가 조정 배지 중 0.1% 내지 15%인 제조 방법.
  28. 제24항에 있어서, 조정 배지가 혈청 대용물을 포함하는 것인 제조 방법.
  29. 제28항에 있어서, 혈청 대용물이 지질에 기초한 대용물인 제조 방법.
  30. 제19항에 있어서, 조정 배지가 무혈청 배지인 제조 방법.
  31. 제19항에 있어서, 조정 배지가 10% 이하의 소 태아 혈청을 포함하는 것인 제조 방법.
  32. 제19항에 있어서, 포유동물 세포가 중국 햄스터 난소(CHO) 세포인 제조 방법.
  33. 제19항에 있어서, Wnt3a 폴리펩티드를 이온 교환 컬럼에 도입하기 전에 상기 Wnt3a 폴리펩티드를 비이온성 계면활성제와 인큐베이션하는 것인 제조 방법.
  34. 제33항에 있어서, 비이온성 계면활성제가 NP-40, 옥틸 글루코시드, 옥틸 티오글루코시드, 트리톤 X-100, 트리톤 X-114, 트윈(Tween) 20, 및 트윈 80으로부터 선택되는 것인 제조 방법.
  35. 제33항에 있어서, 비이온성 계면활성제가 옥틸 글루코시드인 제조 방법.
  36. 제33항에 있어서, 비이온성 계면활성제가 옥틸 티오글루코시드인 제조 방법.
  37. 제19항에 있어서, 단계 (c) 후에 Wnt3a 폴리펩티드의 수율이 60% 내지 90%인 제조 방법.
  38. 제19항에 있어서, 상기 방법으로부터의 Wnt3a 생성물이 질소 하에서 안정한 것인 제조 방법.
  39. 제19항에 있어서, 상기 방법으로부터의 Wnt3a 생성물이 1℃ 내지 8℃의 온도에서 안정한 것인 제조 방법.
  40. 포유동물 Wnt 폴리펩티드, 및 리포솜을 포함하는 수용액을 포함하는 조성물로서, 리포솜이 중성 인지질 및 콜레스테롤을 포함하고, 중성 인지질이 10℃ 내지 25℃의 상전이온도를 가지고, Wnt 폴리펩티드 대 리포솜의 농도가 중량 대 중량비로 0.1:50, 0.5:30, 1:20 또는 1:14인 조성물.
  41. 제40항에 있어서, Wnt 폴리펩티드가 서열 번호 1에 개시된 아미노산 잔기 209에 해당하는 아미노산 위치에서 지질 변형된 것인 조성물.
  42. 제41항에 있어서, Wnt 폴리펩티드가 서열 번호 1에 개시된 아미노산 잔기 77에 해당하는 아미노산 위치에서 지질 변형되지 않은 것인 조성물.
  43. 제40항에 있어서, Wnt 폴리펩티드가 리포솜 막으로 통합되는 것인 조성물.
  44. 제40항에 있어서, Wnt 폴리펩티드가 리포솜 막으로부터 지질 막의 외부 표면 위로 돌출되는 것인 조성물.
  45. 제40항에 있어서, Wnt 폴리펩티드가 리포솜의 수성 코어로 편입되지 않는 것인 조성물.
  46. 제40항에 있어서, Wnt 폴리펩티드의 농도가 5 ㎍/㎕ 내지 15 ㎍/㎕, 또는 8 ㎍/㎕ 내지 12 ㎍/㎕인 조성물.
  47. 제40항에 있어서, 리포솜이 pH 6.5 내지 8.0에서 순전하 0을 갖는 것인 조성물.
  48. 제40항에 있어서, 리포솜이 pH 6.5 내지 8.0에서 순 양전하 또는 순 음전하를 갖는 것인 조성물.
  49. 제40항에 있어서, 중성 인지질이 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DMPC)인 조성물.
  50. 삭제
  51. 제49항에 있어서, DMPC와 콜레스테롤의 농도가 70:30 내지 90:10의 비로 정해지는 것인 조성물.
  52. 제40항에 있어서, 중성 인지질과 콜레스테롤의 농도가 70:30 내지 90:10의 비로 정해지는 것인 조성물.
  53. 제40항에 있어서, Wnt 폴리펩티드가 Wnt3a 폴리펩티드인 조성물.
  54. 제40항에 있어서, Wnt 폴리펩티드가 Wnt5a 폴리펩티드 또는 Wnt10b 폴리펩티드인 조성물.
  55. 제40항에 있어서, 포유동물이 인간인 조성물.
  56. 제41항에 있어서, 지질 변형이 팔미토일화인 조성물.
  57. 제40항에 있어서, Wnt 폴리펩티드가 추가로 글리코실화된 것인 조성물.
  58. 제40항에 있어서, 안정한 조성물인 조성물.
  59. 제40항에 있어서, 활성의 실질적인 손실 없이 106일까지 안정한 조성물.
  60. 제40항에 있어서, 1℃ 내지 8℃의 온도에서 안정한 조성물.
  61. 제40항에 있어서, 질소 하에서 안정한 조성물.
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  67. 제40항 내지 제49항 및 제51항 내지 제61항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 골 이식재를 생성하기 위한 키트.
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