CN117545837A - 用于生长乳腺类器官的培养基和方法 - Google Patents

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Abstract

公开了用于定向形成乳腺类器官的培养基、试剂盒和方法。类器官培养基的实施方式可用于从分离的乳腺上皮细胞偏好/富集腔类器官的形成。改良的类器官培养基的实施方式可用于从分离的乳腺上皮细胞偏好/富集混合谱系类器官的形成，或将腔类器官转化为混合谱系类器官。

Description

用于生长乳腺类器官的培养基和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年4月16日提交的第63/175,686号美国临时申请的优先权权益，该临时申请的内容通过引用以它们的整体并入本文。
领域
本公开涉及细胞培养应用，和更具体地涉及使用乳腺细胞的细胞培养应用，以及仍更具体地涉及与生长包括特定乳腺细胞类型的多细胞结构有关的细胞培养应用。
背景
大约8个美国女性中有1个在其一生的历程中将被诊断患有浸润性乳腺癌。乳腺肿瘤起源于乳腺上皮。乳腺上皮包括一系列分支导管，在哺乳期间，分支导管排出产奶的肺泡。这些导管和肺泡的细胞组织为双层上皮，具有内腔层和外基底层。腔层由两种上皮细胞谱系构成：雌激素受体(ER)表达谱系和乳谱系(milk lineage)。静息乳腺中的乳谱系细胞是将在怀孕期间增殖并产生称为肺泡的囊状结构的细胞。肺泡内壁的细胞(肺泡细胞)将在哺乳期间合成和分泌乳汁。乳腺上皮的基底细胞层包括基底细胞，并且由于这些细胞具有收缩特性(它们将乳汁从乳腺中挤出)，因此也称为肌上皮细胞。
产后腺体中的三种细胞谱系(基底细胞、ER+细胞和乳细胞)中的每一种很大程度上由它们自己的干细胞群维持。ER+谱系表达高水平的腔角蛋白(K)8和18，但不表达基础K5和K14。顾名思义，这些细胞表达高水平的ER以及黄体酮受体(PR)。基底细胞不表达K8或K18，但表达角蛋白K5和K14。乳谱系具有中间表型；在人中，这些乳谱系细胞表达腔角蛋白和基底角蛋白。小鼠的乳谱系具有主要的腔表型，尽管腔角蛋白表达水平较低，但基底角蛋白的转录水平低但可检测。乳谱系不表达ER。
人乳腺肿瘤可基于表型大致分为3种亚型：ER+、HER2扩增型(HER2+)和三阴型(ER-、PR-、HER2-)。三阴型类别可进一步细分为基底样和claudin低。尽管人乳腺肿瘤的细胞起源仍不完全清楚，但一种假设是ER+肿瘤起源于ER+细胞，HER2+肿瘤起源于ER+和乳谱系细胞，基底样肿瘤起源于乳谱系细胞，并且claudin低型肿瘤起源于基底细胞。
体外模型系统将有利于研究基本乳腺生物学问题，并且也有利于理解正常乳腺细胞与乳腺肿瘤细胞之间的差异。此外，系统可有利于化合物筛选测定和毒性研究。
仍然需要用于研究乳腺的正常状态和疾病状态的有效体外模型系统。特别是，仍然需要体外模型系统来研究分离中的乳腺的个体细胞类型，无论是在正常情况还是患病情况下。此外，仍然需要确定的培养条件，包括细胞培养基，以获得概括所研究的特定结构或细胞类型的体外模型系统，无论是在正常状态还是患病状态下。
概要
本公开涉及用于生长乳腺类器官的培养基、试剂盒和方法。更具体地，本公开涉及培养乳腺上皮细胞以可预测且可重复地产生包括所需乳腺细胞类型的乳腺类器官。
在本公开的一个广泛方面中，提供了从分离的乳腺上皮细胞形成乳腺类器官的方法。此类方法可包括将乳腺上皮细胞与不含外源添加的WNT信号传导激动剂和/或BMP信号传导抑制剂之一或两者的类器官培养基接触，并且如果外源添加的WNT信号传导激动剂和/或BMP信号传导抑制剂之一或两者包含在类器官培养基中，则将乳腺上皮细胞在类器官培养基中培养足以形成富含包括比非腔细胞(例如基底细胞、基质细胞等)更多的腔细胞的类器官的第一类器官群的时间。在一个实施方式中，乳腺上皮细胞包括乳腺上皮干细胞或祖细胞。在一个实施方式中，乳腺上皮细胞分离自灵长类动物或啮齿类动物。在一个实施方式中，非腔细胞是基底细胞、基质细胞、造血细胞和内皮细胞中的一种或多种。
在一个实施方式中，腔细胞表达K8。在一个实施方式中，腔细胞共表达K8和K18。在一个实施方式中，基底细胞表达K5。在一个实施方式中，基底细胞共表达K5和K14。
在一个实施方式中，类器官培养基包含基础培养基以及ERBB1配体和/或ERBB4配体之一或两者。在一个实施方式中，ERBB1配体不是EGF或TGFα。在一个实施方式中，ERBB1配体是双调蛋白。在一个实施方式中，ERBB4配体也是不同ERBB受体家族成员的配体。在一个实施方式中，ERBB4配体是调蛋白和/或神经调节蛋白3。
在一个实施方式中，类器官培养基包含BMP信号传导抑制剂但不包含WNT信号传导激动剂。在一个实施方式中，类器官培养基包含WNT信号传导激动剂但不包含BMP信号传导抑制剂。
在一个实施方式中，WNT信号传导激动剂(不包括在类器官培养基中)是R-脊椎蛋白、WNT蛋白质或前述任一种的工程化模拟物。
在一个实施方式中，BMP信号传导抑制剂是蛋白质或小分子。在一个实施方式中，BMP信号传导抑制剂是头蛋白(Noggin)、腱蛋白、卵泡抑素、LDN193189或多索吗啡中的一种或多种。
在一个实施方式中，类器官培养基不含外源添加的性激素。在一个实施方式中，性激素是黄体酮。
在一个实施方式中，类器官包括50％或更多的腔细胞。
在一个实施方式中，方法可进一步包括在改良的类器官培养基中培养第一类器官群，以将第一类器官群转化(subvert)为第二类器官群。
在一个实施方式中，改良的类器官培养基补充有EGF。在一个实施方式中，改良的类器官培养基补充有WNT信号传导激动剂和/或BMP信号传导抑制剂。
在一个实施方式中，如果不向类器官培养基中添加WNT信号传导激动剂和/或BMP信号传导抑制剂之一或两者，则第二类器官群包括更多的基底细胞、更少的腔细胞。
在一个实施方式中，第一类器官群在类器官培养基中可传代5次或更多次。在一个实施方式中，第二类器官群在改良的类器官培养基中可传代5次或更多次。
在一个实施方式中，方法可进一步包括将第一类器官群或第二类器官群与TGF-β抑制剂接触。在一个实施方式中，方法可进一步包括在用TGF-β抑制剂处理时获得ER的核定位。
在一个实施方式中，第一类器官群平均包括大于50％的腔细胞和小于30％的基底细胞。
在本公开的另一个广泛方面中，提供了乳腺类器官培养基配方。此类乳腺类器官培养基包含基础培养基以及ERBB1配体和ERBB4配体之一或两者；并且缺乏外源添加的WNT信号传导激动剂和BMP信号传导抑制剂之一或两者。
在一个实施方式中，类器官培养基包含BMP信号传导抑制剂但不包含WNT信号传导激动剂。在一个实施方式中，类器官培养基包含WNT信号传导激动剂但不包含BMP信号传导抑制剂。
在一个实施方式中，WNT信号传导激动剂(不包括在类器官培养基中)是R-脊椎蛋白、WNT蛋白质或前述任一种的工程化模拟物中的一种或多种。
在一个实施方式中，BMP信号传导抑制剂(不包括在类器官培养基中)是蛋白质或小分子。在一个实施方式中，BMP信号传导抑制剂(不包括在类器官培养基中)是头蛋白、腱蛋白、卵泡抑素、LDN193189或多索吗啡中的一种或多种。
在一个实施方式中，ERBB1配体不是EGF或TGFα。在一个实施方式中，ERBB1配体是双调蛋白。在一个实施方式中，ERBB4配体也是不同ERBB受体家族成员的配体。在一个实施方式中，ERBB4配体是神经调节蛋白1和/或神经调节蛋白3。
在一个实施方式中，类器官培养基不含外源添加的性激素。在一个实施方式中，性激素是黄体酮。
在一个实施方式中，在类器官培养基中培养分离的乳腺上皮细胞富集包括比非腔细胞更多的腔细胞的类器官。
在一个实施方式中，如果分离的乳腺上皮细胞培养在包含外源添加的WNT信号传导激动剂和/或BMP信号传导抑制剂之一或两者的类器官培养基中，则在类器官培养基中培养分离的乳腺上皮细胞富集包括更多的腔细胞和更少的基底细胞的类器官。在一个实施方式中，乳腺上皮细胞包括乳腺上皮干细胞或祖细胞。在一个实施方式中，乳腺上皮细胞分离自灵长类动物或啮齿类动物。
在本公开的另一个广泛方面中，提供了试剂盒(用于配制培养基制剂，诸如本公开的类器官培养基、改良的类器官培养基和ER核定位培养基)。在一个实施方式中，此类试剂盒可包括基础培养基和待添加到基础培养基中的第一腔细胞促进补充物。在一个实施方式中，第一补充物可包含ERBB1配体和/或ERBB4配体之一或两者。在一个实施方式中，第一补充物还可缺乏外源添加的WNT信号传导激动剂和/或BMP信号传导抑制剂之一或两者。
在一个实施方式中，本公开的试剂盒可进一步包含待添加到基础培养基中或待添加到补充有第一补充物的基础培养基中的第二混合谱系促进补充物。在一个实施方式中，第二补充物可包含与第一补充物中的ERBB1配体不同的第二ERBB1配体。在一个实施方式中，第二补充物可进一步包含外源添加的WNT信号传导激动剂和/或BMP信号传导抑制剂之一或两者。
在一个实施方式中，本公开的试剂盒可进一步包括待添加到基础培养基中或待添加到补充有第一补充物和/或第二补充物的基础培养基中的第三ER核定位补充物。在一个实施方式中，第三补充物可包含TGFβ信号传导抑制剂。在一个实施方式中，TGFβ信号传导抑制剂是SB431542、RepSox、A77-01或A83-01。
从以下详细描述中，本发明的其他特征和优点将变得明显。然而，应当理解，虽然详细描述和具体实施例表明本发明的优选实施方式，但仅以示例的方式给出，因为在本发明的精神和范围内的各种改变和修改对于本领域技术人员来说将是从本详细描述中显而易见的。
附图的简要描述
为了更好地理解本文描述的各种实施方式，并且为了更清楚地示出这些各种实施方式可以如何实施，将通过实例参考示出至少一个实例实施方式的附图，并且现在描述该附图。附图并不旨在限制本文描述的教导的范围。
图1显示由未分选的小鼠乳腺上皮细胞形成的类器官的代表性图像。图A)、B)和C)中的图像对应于类器官在包含外源添加的WNT激动剂和BMP信号传导抑制剂的类器官培养基中的连续传代。图D中的图像显示通过共聚焦显微镜拍摄的在用于形成图A)-C)中描绘的类器官的类器官培养基中生成的第2代类器官的图像。对类器官进行K8、K14和核染剂DAPI染色。图A)-C)中的比例尺为500μm，以及图D)中的比例尺为100μm。
图2显示了由分选的小鼠乳腺上皮细胞群形成的类器官的代表性图像。ER+腔细胞(图A和D)、乳细胞(图B和E)以及基底细胞(图C和F)在不含BMP信号传导抑制剂的类器官培养基中培养，并且在RSPO-1的存在或不存在下培养。比例尺为500μm。
图3显示由未分选的小鼠乳腺上皮细胞形成的类器官的代表性图像。图A)中的图像显示在包含WNT激动剂RSPO-1或RSPO-3、或缺乏外源添加的WNT信号传导激动剂的培养基中形成的类器官。比例尺为500μm。图B)中的流式细胞术图显示在图A)的类器官培养基中形成类器官的细胞中的表型。
图4显示由未分选的小鼠乳腺上皮细胞经过连续传代形成的类器官的代表性图像。腔类器官在包含或不包括外源添加的WNT信号传导激动剂的本公开的类器官培养基中增殖。比例尺为500μm。对第2代类器官进行K8、K14和核染剂DAPI染色，并通过共聚焦显微镜成像。比例尺为100μm。
图5显示了由未分选的小鼠乳腺上皮细胞经过连续传代形成的类器官的代表性图像。腔类器官不在本公开的包含或不包含外源添加的BMP信号传导抑制剂的类器官培养基中形成或增殖。比例尺为500μm。对第2代类器官进行K8、K14和核染剂DAPI染色，并通过共聚焦显微镜成像。比例尺为100μm。
图6显示由未分选的小鼠乳腺上皮细胞形成的类器官的代表性流式细胞术图。图A)和B)显示细胞在含R-脊椎蛋白(图A))或不含R-脊椎蛋白(图B))的培养基中培养14天(P0)后类器官的代表性图像。分别通过流式细胞术分析图A)和B)中所示的类器官细胞的EpCAM和CD49f的表达(图C)和D))。流式细胞术数据的总结显示在图E中。结果在n＝8小鼠中证实。比例尺为500μm。
图7显示由未分选的人乳腺上皮细胞形成的类器官的代表性图像。在包含外源添加的RSPO-1、EGF和头蛋白的类器官培养基中形成类器官。图A)中的图像显示捕获多个形成的类器官的更宽的焦点区域。比例尺为500μm。图B)和图C)中的图像分别显示在明视野下或在K8、K14和核染剂DAPI染色后通过共聚焦显微镜成像的单个类器官。比例尺为100μm。
图8显示通过BMP受体调节信号传导对由未分选的人乳腺上皮细胞形成的人类器官的影响。图A)中的流式细胞术图比较了在包含BMP信号传导激动剂(BMP2或BMP4)或拮抗剂(头蛋白或LDN193189)的类器官培养基中形成后的类器官组成。图B)中的流式细胞术图显示了两个不同供体通过BMP受体抑制信号传导对类器官细胞谱系平衡的影响。
图9显示通过BMP受体调节信号传导对由未分选的人乳腺上皮细胞形成的人器官的影响。图A)中的图显示在包含BMP信号传导激动剂(BMP2或BMP4)或拮抗剂(头蛋白或LDN193189)的类器官培养基中形成的类器官中包含的细胞总数。图B)中的柱状图总结了在包含不同BMP信号传导调节剂的类器官培养基中形成的类器官的组成。柱代表2个实验的平均值+/-标准差，标准化为缺乏外源添加的BMP信号传导调节剂的对照。在图C)中，在包含或缺乏BMP信号传导抑制剂的培养基中形成的类器官在K8、K14和核染剂DAPI染色后通过共聚焦显微镜成像。白色箭头表示所选区域对K8鲜明染色。比例尺为50μm。
图10显示经过连续传代获取的腔偏好(biased)的人类器官的图像。类器官分别在包含两种不同BMP信号传导抑制剂的组合的类器官培养基中或在包含每种BMP信号传导抑制剂的培养基中形成。比例尺为500μm。
图11显示Wnt激动对由未分选的人乳腺上皮细胞形成的类器官的影响。图A)中的类器官是在包含或省去WNT信号传导激动剂的类器官培养基中形成的，并且此类器官的组成的代表性流式细胞术图显示在图B)中。比例尺为500μm。图C)中的柱状图总结了在包含不同WNT信号传导激动剂或拮抗剂的培养基中已经形成的类器官组成。柱代表2次实验的平均值+/-标准差，标准化为缺乏外源添加的WNT信号传导调节剂的对照。
图12显示通过各种ERBB受体家族成员调节信号传导对由未分选的人乳腺上皮细胞形成的类器官的影响。图A)中的流式细胞术图显示在不包含ERBB受体家族成员的调节或包含指定的ERBB受体家族配体的类器官培养基中已经形成的类器官组成的比较。图B)中的流式细胞术图显示，对于两个不同供体，类器官培养基(或者不包含ERBB家族成员的外源调节剂，或者包含EGF信号传导抑制剂)对类器官形成的影响。
图13显示通过ERBB家族成员调节信号传导对由未分选的人乳腺上皮细胞形成的类器官的影响。图A)中的图显示在包含ERBB激动剂(AREG、EGF或NRG1)或拮抗剂(厄洛替尼+吉非替尼)的类器官培养基中形成的类器官中包含的细胞总数。图B)中的柱状图总结了在包含不同ERBB受体调节剂的类器官培养基中已经形成的类器官组成。柱代表2次实验的平均值+/-标准差，标准化为缺乏外源添加的ERBB家族信号传导调节剂的对照。
图14显示通过TGFβ调节信号传导对由未分选的人乳腺上皮细胞形成的类器官的影响。图A)中的流式细胞术图显示在不包含TGFβ信号传导调节或包含外源添加的TGFβ1的类器官培养基中已经形成的类器官细胞组成的比较。图B)中的流式细胞术图显示外源添加的TGFβ信号传导抑制剂对类器官形成的影响。
图15显示通过TGFβ抑制信号传导对ER定位的影响。在图A)(人)和图B)(小鼠)中，类器官在本公开的相应类器官培养基中形成，并且然后短暂暴露于不同的TGFβ信号传导抑制剂。K8、K14、ER和核染剂DAPI染色后，通过共聚焦显微镜对类器官进行成像。箭头显示ER和DAPI染色的共定位。
图16显示由未分选的人乳腺上皮细胞形成的第1代、第10天的类器官的代表性图像。类器官在不包含外源添加的RSPO-1、头蛋白、黄体酮或EGF的类器官培养基中形成。图A)中的图像显示捕获多个形成的类器官的更宽的焦点区域。比例尺为100μm。图B)–D)中的图像显示了K8、K14和核染剂DAPI染色后(单独或合并)通过共聚焦显微镜成像的单个形成的类器官。比例尺为50μm。
图17显示由未分选的人乳腺上皮细胞形成的类器官的代表性共聚焦显微镜图像。在包含50ng/ml神经调节蛋白3(NRG3)(A)或100ng/ml抗苗勒管激素(AMH)(B)的类器官培养基中形成腔限制类器官。在包含50ng/ml的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(C)的类器官培养基中形成基底限制类器官。对类器官进行K8、K14和核染剂DAPI染色。比例尺为100μm。
详细说明
本公开涉及用于生长乳腺类器官的培养基和方法。更具体地，本公开涉及操纵乳腺上皮细胞的培养物以可预测且可重复地产生包括所需乳腺细胞类型的乳腺类器官。在一些实施方式中，在本公开的培养基中或通过实施本公开的方法形成的乳腺类器官可在培养基中扩展或传代。
当在本公开中使用时，术语“乳腺类器官”是指概括乳腺上皮的一般组织的多细胞结构或其特定组分，诸如一段乳腺导管或终末导管小叶单位。在一个实施方式中，乳腺类器官包括的特定细胞类型(例如腔细胞)多于任何其他细胞类型(例如基底细胞、内皮细胞、基质细胞、造血细胞等)。在相关的实施方式中，此类乳腺类器官可以大部分或完全包括单一类型的乳腺上皮细胞。在一个实施方式中，乳腺类器官包括各种类型的乳腺上皮细胞的更平衡的混合物。
作为前者的实例，“腔类器官”、“腔限制类器官”或“腔偏好类器官”是包括约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或更多腔细胞的(使用本公开的类器官培养基形成的)乳腺类器官。因此，腔类器官可包括的腔细胞多于非腔细胞。当使用本公开的类器官培养基形成时，此类腔类器官可被称为第一类器官群。在一个实施方式中，腔类器官(或第一类器官群)包括的腔细胞多于如果使用与本文公开的类器官培养基不同配制的培养基时所存在的腔细胞。
作为后者的实例，“混合谱系类器官”或“分支类器官”是包括各种细胞类型(例如基底细胞、腔细胞、基质细胞等)的乳腺类器官。混合谱系类器官可基本上组织为如在正常乳腺组织中观察到的。当使用与本公开的类器官培养基不同配制的培养基形成时，此类混合谱系类器官可被称为第二类器官群。因此，与暴露于本公开的类器官培养基的额相比，第二类器官群的类器官包含至少更多的基底细胞和更少的腔细胞。混合谱系类器官可使用本公开的改良的类器官培养基形成，无论是从分离的乳腺上皮细胞开始还是从第一个类器官群开始。
当在本公开中使用时，术语“乳腺上皮细胞”是指存在于哺乳动物的乳腺中并且可从其分离的那些细胞。在一个实施方式中，乳腺上皮细胞可包括乳腺上皮干细胞或祖细胞。出于本公开的目的，乳腺上皮细胞可作为单细胞悬液、乳腺上皮细胞片段的悬液、乳腺上皮细胞团块或前述任何组合的混合物提供。在一个实施方式中，如果源自多能干细胞，诸如诱导多能干细胞、胚胎干细胞等，则乳腺上皮细胞可以是“乳腺上皮样细胞”。在一个实施方式中，乳腺上皮细胞或乳腺上皮样细胞源自灵长类动物诸如人，或啮齿类动物诸如小鼠。
乳腺上皮细胞通常包含基底细胞(例如，特征在于以下的一种或多种的细胞：K14+、K5+、SMA+、CD49f+和K8-)和腔细胞，腔细胞进一步细分为ER+谱系(例如，特征在于以下的一种或多种的细胞：K8+、ER+、K5-、K14-和CD49f-)和产奶谱系(例如，特征在于以下的一种或多种的细胞：K8+、CD49b+、ALDEFLUOR+)。在一个实施方式中，可基于K8表达(“K8+”)对腔细胞分类。在一个实施方式中，可基于K8和K18共表达对腔细胞分类。在一个实施方式中，可基于K14表达(“K14+”)对基底细胞分类。在一个实施方式中，可基于K14和K5共表达对腔细胞分类。本领域技术人员将知晓基底细胞或腔细胞的特征既不是详尽的也不是排他性的。在一些情况下，不同的标记物可有助于区分各个细胞类型。或者，在一些情况下，不同的细胞类型可能以或多或少相同的水平或不同的水平表达共同的标记物。
基底细胞和腔细胞可能是双能的，到了某种程度上，例如，只要使用适当的培养环境，可在促进基底细胞最终出现的条件下培养分选的腔细胞群，反之亦然。在一个实施方式中，适当的培养环境包括任何适当的补充培养基(如本文进一步描述的)。
哺乳动物上皮细胞的制备可使用已知方法或已知方法的变型来获得。通常，从受试者切除乳腺，并使用手术刀或其他类似手段物理/机械地破坏乳腺。酶消化通常会促进乳腺诸如其结缔组织的进一步解离。
在一个实施方式中，使用手术刀切碎的乳腺组织可在包含胶原酶和透明质酸酶的溶液中轻轻地搅动以分解细胞外基质和结缔组织。然后可对产生的液体级分进行单轮或多轮离心。
如果进行多轮离心，则每轮可以以逐渐升高的离心力和/或更长的持续时间进行，从而在每一步收集沉淀物。在一个实施方式中，两至三轮离心足以分离感兴趣的细胞。例如，在大约100x g下第一次离心约0.5-1分钟后，可在沉淀物中回收包括乳腺上皮细胞片段的较大碎片。在大约200x g下第二次离心约3-5分钟后，可在沉淀物中回收乳腺上皮细胞团块和单个乳腺上皮细胞。并且，在大约400x g下第三次离心约5分钟后，可在沉淀物中回收包括基质细胞的单细胞。
在一些实施方式中，根据沉淀的细胞的外观，可能需要用氯化铵短暂处理以裂解污染的红细胞。
为了生成乳腺上皮细胞的单细胞悬液的目的，第一沉淀物以及如果适用的话第二沉淀物的细胞可通过用含胰蛋白酶的溶液以及然后用DNA酶溶液顺序处理、任选地然后通过37μm过滤器过滤来进一步处理。
在一些实施方式中，培养的乳腺上皮细胞可包括在相对较大的组织片段，诸如在如上所述的消化和过滤之后作为残余物获得的那些中。
在一些实施方式中，培养的乳腺上皮细胞可以是使用如上所述的方法获得的单细胞。
在一些实施方式中，培养的乳腺上皮细胞可以是单细胞和组织片段的混合物，无论是较小(例如，通过37μm过滤器的那些)和/或较大(例如，不通过37μm过滤器的那些)。
然而，可以将处理的乳腺上皮细胞接种并培养在如本文公开的和/或根据本文公开的方法的培养基(例如类器官培养基)中。
培养基
在本公开的一个方面中，提供了用于形成或生长乳腺类器官的细胞培养基(即类器官培养基)。在一个实施方式中，本公开的类器官培养基跨多次传代维持和/或扩展乳腺类器官。在一个实施方式中，类器官培养基可用于从乳腺上皮细胞生长/形成乳腺类器官，并跨多个传代维持/扩展乳腺类器官。
当在本公开中使用时，术语“类器官培养基”是指可用于从乳腺上皮细胞的分离制剂中形成和/或生长和/或扩展乳腺类器官的溶液。此外，此类器官培养基还可用于传代，产生由乳腺上皮细胞的分离制剂形成的乳腺类器官。在一个实施方式中，类器官培养基包含基础培养基并适当地补充有用于培养哺乳动物细胞、特别是原代上皮细胞的添加剂，诸如：一种或多种盐；缓冲物；氨基酸；能量源(例如葡萄糖、丙酮酸盐等)；白蛋白或白蛋白替代物；微量元素；和脂质。另外，类器官培养基可包含一种或多种适当的小分子和/或细胞因子或生长因子或其模拟物，以偏好包括所需谱系的细胞的乳腺类器官(来自乳腺上皮细胞)的形成。在一个实施方式中，此类器官培养基还可促进乳腺类器官的生长/扩展。在具体实施方式中，类器官培养基旨在形成和/或生长和/或扩展腔类器官，如可包含在第一类器官群中。在一个实施方式中，相同的类器官培养基可用于形成/传代人和小鼠腔类器官。在一个实施方式中，可使用不同的类器官培养基来形成/传代人和小鼠腔类器官。
类器官培养基可使用任何已知的和/或商业可得的能够支持上皮细胞(诸如乳腺上皮细胞)培养的基础培养基来配制。例如，在上皮细胞诸如乳腺上皮细胞的培养中常规使用的基础培养基包括DMEM、DMEM/F12、Adv-DMEM和Adv-DMEM/F12等。在一个实施方式中，基础培养基是DMEM、DMEM/F12、Adv-DMEM或Adv-DMEM/F12之任一。
在一方面，如果需要使乳腺上皮细胞的培养物偏好形成包括比以其他方式可能出现的腔细胞更多的腔细胞的腔类器官，则可需要针对该特定目的优化类器官培养基的配方。
在一个实施方式中，类器官培养基包含至少一种分裂素。至少一种分裂素可基于对应于人基因的氨基酸序列。在一个实施方式中，分裂素可基于对应于非人基因(例如啮齿类动物物种)的氨基酸序列。在一个实施方式中，将分裂素的来源(就序列或来源而言)与待培养的分离的乳腺上皮细胞的物种来源相匹配是适当的。在一些实施方式中，不需要将分裂素的来源(就序列或来源而言)与待培养的分离的乳腺上皮细胞的物种来源相匹配。
在一个实施方式中，类器官培养基(用于形成和维持腔类器官)包括ERBB1配体。在一个实施方式中，ERBB1配体不是表皮生长因子(EGF)。在相同或不同的实施方式中，ERBB1配体不是转化生长因子α(TGFα)。因此，在一个实施方式中，ERBB1配体既不是EGF也不是TGFα或功能片段或前述的模拟物。
在一个实施方式中，ERBB1配体是双调蛋白。在此类实施方式中，双调蛋白的浓度可以介于约1μg/mL至0.1ng/mL之间，或介于约500ng/mL至0.5ng/mL之间，或介于约250ng/mL至1ng/mL之间，或介于约125ng/mL至2ng/mL之间，或介于约50ng/mL至3ng/mL之间。
在一个实施方式中，类器官培养基(用于形成和维持腔类器官)包括ERBB4配体。在一个实施方式中，ERBB4配体也是不同ERBB受体家族成员的配体。在此类实施方式中，ERBB4配体也可以是ERBB3配体。
在一个实施方式中，ERBB4配体是调蛋白(又名神经调节蛋白1，二聚化的ERBB3和ERBB4配体)。在此类实施方式中，调蛋白的浓度介于约1μg/mL至0.1ng/mL之间，或介于约500ng/mL至0.5ng/mL之间，或介于约250ng/mL至1ng/mL之间，或介于约125ng/mL至2ng/mL之间，或介于约50ng/mL至3ng/mL之间。在一个实施方式中，ERBB4配体是神经调节蛋白3，并且它可包含在前述浓度范围内的类器官培养基中。
在一个实施方式中，类器官培养基包含ERBB1或ERBB4配体之一。在一个实施方式中，类器官培养基包含ERBB1配体和ERBB4两者。
在一个实施方式中，ERBB4配体可以是β-细胞素、Epigen、上皮调节蛋白、神经调节蛋白1、神经调节蛋白2、神经调节蛋白3、神经调节蛋白4或Tomoregulin。在一些实施方式中，类器官培养基(用于促进和维持基础或混合类器官)包含多于一种ERBB4配体。
在一个实施方式中，ERBB4配体是神经调节蛋白3。在此类实施方式中，神经调节蛋白3的浓度介于约1μg/mL至0.1ng/mL之间，或介于约500ng/mL至0.5ng/mL之间，或介于约250ng/mL至1ng/mL之间，或介于约125ng/mL至2ng/mL之间，或介于约50ng/mL至3ng/mL之间。在一个实施方式中，神经调节蛋白3的浓度为约50ng/mL。
尽管使用蛋白质、肽或小分子配体激活和/或抑制某些信号传导级联可能是重要的，但不激活和/或不抑制其他信号传导级联也可能重要的。
因此，在一个实施方式中，类器官培养基(用于形成和维持腔类器官)不包括外源添加的WNT信号传导激动剂和BMP信号传导调节剂(诸如激活剂或抑制剂)之一或两者。
在一个实施方式中，不包含在类器官培养基中的WNT信号传导激动剂是R-脊椎蛋白、WNT蛋白质或前述任一种的工程化模拟物。尽管WNT信号传导激动剂用于某些上皮类器官的培养中，但发明人已经表明，在本公开的类器官培养基中包含WNT信号传导激动剂对于形成腔类器官、促进腔类器官的生长和维持腔类器官可能是可有可无的或有害的。在类器官培养基中包含WNT信号传导激动剂也可以促进/维持混合谱系类器官的形成/生长。
在一个实施方式中，从类器官培养基中排除的R-脊椎蛋白是R-脊椎蛋白1、R-脊椎蛋白2、R-脊椎蛋白3或R-脊椎蛋白4中的一种或多种。在一个实施方式中，从类器官培养基中排除的R-脊椎蛋白是R-脊椎蛋白1、R-脊椎蛋白2、R-脊椎蛋白3或R-脊椎蛋白4中的每一种。因此，添加到类器官培养基中用于促进和维持腔类器官的R-脊椎蛋白的浓度为0ng/mL，或有效地为0ng/mL。
在一个实施方式中，从类器官培养基中排除的WNT蛋白质是WNT1、WNT2、WNT2B、WNT3、WNT3A、WNT4、WNT5A、WNT5B、WNT6、WNT7A、WNT7B、WNT8A、WNT8B、WNT9A、WNT9B、WNT10A、WNT10B、WNT11或WNT16中的一种或多种。在另一个实施方式中，从类器官培养基中排除的WNT蛋白质是WNT1、WNT2、WNT2B、WNT3、WNT3A、WNT4、WNT5A、WNT5B、WNT6、WNT7A、WNT7B、WNT8A、WNT8B、WNT9A、WNT9B、WNT10A、WNT10B、WNT11或WNT16中的每一个。因此，添加到类器官培养基中用于促进和维持腔类器官的WNT蛋白质的浓度为0ng/mL，或有效地为0ng/mL。
合成生物学的进步已经使得能够计算机设计配体模拟物，无论是基于蛋白质、基于肽还是基于小分子。此类模拟物的优点可包括但不限于提高的活性、提高的稳定性、简化的结构、减小的尺寸等。因此，在一些实施方式中，WNT或R-脊椎蛋白功能(诸如经由其模拟物)不存在于本公开的类器官培养基。
举例来说，典型的重组WNT蛋白质当添加到培养基中时具有微不足道的没有作用或没有作用，因为它们可能由于高疏水性而快速降解。为了克服该挑战，典型的、FZD介导的WNT通路激动剂被设计为比野生型Wnt3a更有效，同时当添加到培养基(U-ProteinExpress)中时保留可接受的生物活性。
在一个实施方式中，不包含在类器官培养基中的BMP信号传导调节剂是通过BMP受体抑制信号传导的蛋白质、肽或小分子。在一个实施方式中，不包含在类器官培养基中的BMP信号传导调节剂是通过BMP受体激活信号传导的蛋白质、肽或小分子。尽管BMP信号传导调节剂通常用于培养某些上皮类器官，但发明人已经表明，在本公开的类器官培养基中包含某些BMP信号传导调节剂对于促进和维持腔类器官可能是可有可无的或有害的。
在一个实施方式中，从类器官培养基(用于促进/维持腔类器官)中排除的BMP信号传导抑制剂是蛋白质或肽。此类排除的蛋白质(或功能等同的肽)可以是头蛋白、腱蛋白、卵泡抑素、硬骨素、CTGF/CCN2、gremlin、Cerberus、DAN、PRDC、核心蛋白聚糖、α-2巨球蛋白等中的一种或多种。在一个实施方式中，从类器官培养基中排除的BMP信号传导抑制剂是头蛋白、腱蛋白、卵泡抑素、硬骨素、CTGF/CCN2、gremlin、Cerberus、DAN、PRDC、核心蛋白聚糖和α-2巨球蛋白中的每一种。因此，类器官培养基中用于促进和维持腔类器官的BMP信号传导抑制剂的有效浓度为0ng/mL，或有效地为0ng/mL。
在一个实施方式中，从类器官培养基(用于促进/维持腔类器官)中排除的BMP信号传导抑制剂是小分子。此类被排除的小分子可以是LDN 193189或多索吗啡。在一个实施方式中，从类器官培养基中排除的BMP信号传导抑制剂是LDN 193189和多索吗啡中的每一种。因此，类器官培养基中用于促进和维持腔类器官的BMP信号传导抑制剂的有效浓度为0ng/mL，或有效地为0ng/mL。
在一个实施方式中，BMP信号传导激活剂可以是蛋白质诸如BMP2或BMP4或其肽。
BMP信号传导的许多调节剂是已知的，并且基于它们调节的途径选择特定调节剂以包含或从器官培养基中省略可能是重要的。在类器官培养基的一些实施方式中，腔类器官的最佳形成和维持可通过包含两种或多种不同的通过BMP的信号传导调节剂来实现。在一个实施方式中，多于一种BMP信号传导抑制剂或多于一种BMP信号传导激活剂可包含在类器官培养基中。在一个实施方式中，BMP信号传导激活剂和BMP信号传导抑制剂都可包含在类器官培养基中。在包括BMP信号传导抑制剂或BMP信号传导激活剂或两者的组合物的任何实施方式中，所调节的特定BMP途径可以是形成腔类器官的重要考虑。
在一个实施方式中，用于形成/维持腔类器官的类器官培养基包含ERBB1和ERBB4配体两者并且不含外源添加的WNT信号传导激动剂和BMP信号传导抑制剂(或任何前述的模拟物)的一者或两者。
在一个实施方式中，类器官培养基包含BMP信号传导抑制剂但不包含外源添加的WNT信号传导激动剂。在一个实施方式中，类器官培养基包含WNT信号传导激动剂但不包含外源添加的BMP信号传导抑制剂。
偏好或促进腔类器官的形成可意味着在类器官培养基中培养乳腺上皮细胞富含包括的腔细胞多于非腔细胞的类器官(例如，相比于从不同于类器官培养基的培养基中的分离的乳腺上皮细胞形成类器官)。在一个实施方式中，在类器官培养基中形成的腔类器官包括大于70％腔细胞和约20％基底细胞或更少。在一个实施方式中，在类器官培养基中形成的腔类器官包括大于80％腔细胞和约15％基底细胞或更少。在一个实施方式中，在类器官培养基中形成的腔类器官包括约90％腔细胞或更多和约5％基底细胞或更少。
另一方面，如果需要将腔类器官(即第一类器官群)的形成转化为相当形式，例如混合谱系类器官(即第二类器官群)，则改良的类器官培养基可用于此目的。在一个实施方式中，改良的类器官培养基可包含以下的一种或多种，或者两种或多种：分裂素、WNT信号传导激动剂或BMP信号传导调节剂。
在一个实施方式中，改良的类器官培养基(用于形成和维持混合谱系类器官)包含ERBB1、ERBB2、ERBB3或ERBB4中的一种或多种的配体。
在一个实施方式中，ERBB1配体可以是表皮生长因子(EGF)、转化生长因子α(TGFα)、双调蛋白、肝素结合EGF(HB-EGF)、β-细胞素、epigen或上皮调节蛋白。在一些实施方式中，改良的类器官培养基可包含多于一种ERBB1配体。
在一个实施方式中，ERBB1配体是EGF和/或TGFα和/或双调蛋白。在此类实施方式中，ERBB1的此类配体的浓度可介于约1μg/mL至0.1ng/mL之间，或介于约500ng/mL至0.5ng/mL之间，或介于约250ng/mL至1ng/mL之间，或介于约125ng/mL至2ng/mL之间，或介于约50ng/mL至3ng/mL之间。
在一个实施方式中，改良的类器官培养基中包含的ERBB3配体可以是神经调节蛋白1、神经调节蛋白2或神经多糖C中的一种或多种。在一些实施方式中，改良的类器官培养基(用于形成和维持混合谱系类器官)可包含多于一种ERBB3配体。
在一个实施方式中，ERBB3配体是神经调节蛋白1。在此类实施方式中，神经调节蛋白1的浓度介于约1μg/mL至0.1ng/mL之间，或介于约500ng/mL至0.5ng/mL之间、或介于约250ng/mL至1ng/mL之间、或介于约125ng/mL至2ng/mL之间、或介于约50ng/mL至3ng/mL之间。
在一个实施方式中，改良的类器官培养基中包含的WNT信号传导激动剂是R-脊椎蛋白、WNT蛋白质或前述任一种的工程化模拟物。在改良的类器官培养基中单独或与其他因子组合包含WNT信号传导激动剂，可转化腔类器官的形成/维持，并将乳腺上皮细胞培养物偏好为混合谱系类器官(例如第二类器官群)。
在一个实施方式中，改良的类器官培养基中包含的R-脊椎蛋白是R-脊椎蛋白1、R-脊椎蛋白2、R-脊椎蛋白3或R-脊椎蛋白4中的一种或多种。在一个实施方式中，改良的类器官培养基中包含的R-脊椎蛋白是R-脊椎蛋白1、R-脊椎蛋白2、R-脊椎蛋白3或R-脊椎蛋白4中的每一种。因此，改良的类器官培养基中用于形成和维持混合谱系类器官的R-脊椎蛋白的有效浓度介于1μg/mL至0.1ng/mL之间，或介于约500ng/mL至0.5ng/mL之间，或介于约250ng/mL至1ng/mL之间，或介于约125ng/mL至2ng/mL之间，或介于约50ng/mL至3ng/mL之间。
在一个实施方式中，改良的类器官培养基中包含的WNT蛋白质是WNT1、WNT2、WNT2B、WNT3、WNT3A、WNT4、WNT5A、WNT5B、WNT6、WNT7A、WNT7B、WNT8A、WNT8B、WNT9A、WNT9B、WNT10A、WNT10B、WNT11或WNT16中的一种或多种。因此，用于形成和维持混合谱系类器官的改良的类器官培养基中的WNT蛋白质的有效浓度介于1μg/mL至0.1ng/mL之间，或介于约500ng/mL至0.5ng/mL之间，或介于约250ng/mL至1ng/mL之间，或介于约125ng/mL至2ng/mL之间，或介于约50ng/mL至3ng/mL之间。
由于Wnt3a在细胞培养基中或当在细胞培养条件下使用时可能不稳定的，因此在一些实施方式中，Wnt3a条件培养基可以是本公开的改良的类器官培养基中Wnt3a的适当替代物。WNT条件培养基可以使用已知的方法产生，诸如通过培养产WNT细胞。WNT条件培养基中WNT的浓度通常与上述浓度相当。
合成生物学的进步使得能够计算机设计配体模拟物。此类模拟物的优点可包括但不限于提高的活性、提高的稳定性、简化的结构、减小的尺寸等。因此，在一些实施方式中，WNT或R-脊椎蛋白功能(经由其模拟物)存在于本公开的类器官培养基中。
举例来说，典型的重组WNT蛋白质当添加到培养基中时具有微不足道的作用或没有作用，因为它们可能由于高疏水性而快速降解。为了克服该挑战，典型的、FZD介导的WNT通路激动剂被设计为比野生型Wnt3a更有效，同时当添加到培养基(U-Protein Express)中时保留可接受的生物活性。
在一个实施方式中，WNT模拟物包含在改良的类器官培养基中，用于转化腔类器官的形成/维持，同时促进混合谱系类器官的形成/维持。在一个实施方式中，WNT模拟物可以单独或与WNT信号传导的一种或多种其他激动剂一起包含在此类培养基中。在此类培养基中包含WNT模拟物的实施方式中，WNT模拟物可以是WNT替代物-FC融合蛋白。如果包含在改良的类器官培养基中用于转化腔类器官的形成/维持，同时促进基础或混合类器官的形成/维持，则WNT模拟物的浓度可以介于约100nM和0nM之间，介于约50nM和0.01nM之间，介于约20nM和0.05nM之间，或介于约10nM和0.1nM之间。
在一个实施方式中，包含在改良的类器官培养基中用于转化腔类器官的形成/维持，同时促进混合谱系类器官的形成/维持的BMP信号传导调节剂是蛋白质、肽或小分子。在一个实施方式中，此类调节剂可以是BMP信号传导激活剂或BMP信号传导抑制剂。
在改良的类器官培养基包含BMP信号传导激活剂的实施方式中，此类激活剂的实例包括BMP2或BMP4等。因此，改良的类器官培养基中BMP信号传导激活剂的有效浓度可以介于约10μg/mL至0.1ng/mL、或约1μg/mL至1ng/mL、或约300ng/mL至3ng/mL、或约150ng/mL至5ng/mL、或约100ng/mL至10ng/mL、或约50ng/mL至10ng/mL之间。
在改良的类器官培养基包含BMP信号传导抑制剂的实施方式中，此类蛋白质(或基于肽的)抑制剂的实例包括头蛋白、腱蛋白、卵泡抑素、硬骨素、CTGF/CCN2、gremlin、Cerberus、DAN、PRDC、核心蛋白聚糖、α-2巨球蛋白等。因此，改良的类器官培养基中BMP信号传导抑制剂的有效浓度可以介于约10μg/mL至0.1ng/mL、或约1μg/mL至1ng/mL、或约300ng/mL至3ng/mL、或约150ng/mL至5ng/mL、或约100ng/mL至10ng/mL、或约50ng/mL至10ng/mL之间。
在改良的类器官培养基包含BMP信号传导抑制剂的实施方式中，此类小分子抑制剂的实例包括LDN 193189或多索吗啡。包含在改良的类器官培养基中的此类BMP信号传导抑制剂可以介于约1mM至0.001nM、约1μM至0.1nM、约100nM至1nM之间。
在一个实施方式中，类器官培养基可包括BMP信号传导抑制剂，无论是基于蛋白质/肽的还是小分子(或两者的组合)，因此改良的类器官培养基可包括BMP信号传导激活剂或BMP信号传导激动剂，反之亦然。
因此，在一个实施方式中，用于转化腔类器官的形成/维持同时促进混合谱系类器官的形成/维持的改良的类器官培养基包含以下的两种或多种：至少一种ERBB配体；至少一种WNT信号传导激动剂；以及至少一种BMP信号传导调节剂。
在本公开的另一方面，提供了包括用于形成乳腺类器官的组分的试剂盒。在一个实施方式中，使用与用于形成人乳腺类器官相比不同的试剂盒来形成小鼠乳腺类器官。以上关于培养基组合物的描述被并入以下试剂盒的描述中。
本公开的试剂盒将包括基础培养基和待添加到基础培养基中的至少一种补充物。在一个实施方式中，本公开的试剂盒包括基础培养基和待添加到基础培养基中的至少两种补充物。在一个实施方式中，本公开的试剂盒包括基础培养基和待添加到基础培养基中的三种或多种补充物。
如果需要形成特定类型的乳腺类器官，任何特定的补充物可与基础培养基组合。例如，如果需要形成第一类器官群(例如，腔限制或腔偏好类器官)，则待添加到基础培养基中的第一补充物可包含ERBB1配体和ERBB4配体之一或两者。在一些实施方式中，第一补充物还不含外源添加的WNT信号传导激动剂和BMP信号传导调节剂之一或两者。在此类实施方式中，BMP信号传导调节剂可以是BMP信号传导激活剂或BMP信号传导抑制剂。在相关实施方式中，第一补充物包含ERBB1配体和ERBB4配体之一或两者、以及BMP信号传导调节剂，并且不含WNT信号传导激动剂。在相关实施方式中，第一补充物包含ERBB1配体和ERBB4配体之一或两者、以及WNT信号传导激动剂，并且不含BMP信号传导调节剂。在相关实施方式中，第一补充物包含ERBB1配体和ERBB4配体之一或两者，并且不含WNT信号传导激动剂和BMP信号传导调节剂两者。在一个实施方式中，ERBB1配体不是EGF。在一个实施方式中，基础培养基和第一补充物都不包含黄体酮。
试剂盒还可包括待添加到基础培养基中的第二补充物，用于将形成的第一类器官群(例如，腔限制或腔偏好类器官)转化为第二类器官群(例如，混合的类器官)。补充有第二补充物(以及任选地还补充了第一补充物)的基础培养基在本文中被称为改良的类器官培养基。在第二补充物的实施方式中，其可包含WNT信号传导激动剂和BMP信号传导调节剂之一或两者。在此类实施方式中，BMP信号传导调节剂可以是BMP信号传导激活剂或BMP信号传导抑制剂。在相关实施方式中，包含在第二补充物中的BMP信号传导调节剂是BMP信号传导激活剂，例如BMP2或BMP4。在相关实施方式中，第二补充物可进一步包含与第一补充物中包含的ERBB1配体不同的ERBB1配体。在一个实施方式中，第二补充物中包含的ERBB1配体是EGF。
试剂盒可进一步包含待添加到基础培养基中的第三补充物(无论是否存在第一补充物和第二补充物之一或两者)。第三补充物可包含TGFβ信号传导抑制剂。在一个实施方式中，在感兴趣的乳腺类器官形成后将第三补充物添加至基础培养基(或类器官培养基或改良的类器官培养基)中以促进雌激素受体的核定位。在一个实施方式中，TGFβ信号传导抑制剂是SB431542。在一个实施方式中，TGFβ信号传导抑制剂是RepSox。
上述任何培养基(包括试剂盒包含的实施方式)可用于形成和/或维持乳腺类器官的方法中，由此可形成和/或维持的乳腺类器官的类型取决于培养基(例如类器官培养基与改良的类器官培养基)的配方。由于乳腺上皮细胞和由其产生的类器官具有性激素响应性，因此在一些实施方式中，可能需要向其中添加的本公开的培养基(例如基础培养基、类器官培养基和改良的类器官培养基)和补充物，无论在方法中使用或捆绑成试剂盒，都不含外源添加的性激素。在一个实施方式中，性激素是雌激素。在一个实施方式中，性激素是黄体酮。
方法
在本公开的另一方面，提供了用于形成或生长乳腺类器官的方法。在一个实施方式中，本公开的方法维持和/或扩展乳腺类器官跨多次传代。根据所公开的方法形成/扩展/传代的乳腺类器官可用于下游测定，诸如更好地理解正常和患病状态下的乳腺生物学、药物筛选和毒性研究或治疗应用。
从分离的乳腺上皮细胞形成乳腺类器官，以及特别是第一类器官群的方法包括将乳腺上皮细胞与不含外源添加的WNT信号传导激动剂和/或BMP信号传导调节剂之一或两者的类器官培养基接触。在此类实施方式中，BMP信号传导调节剂可以是BMP信号传导抑制剂，或其可以是BMP信号传导激活剂。
在一个实施方式中，方法使用包含BMP信号传导调节剂(例如BMP信号传导抑制剂或BMP信号传导激活剂)但不包含WNT信号传导激动剂的类器官培养基。在一个实施方式中，方法使用包含WNT信号传导激动剂但不包含BMP信号传导调节剂(例如BMP信号传导抑制剂或BMP信号传导激活剂)的类器官培养基。在一个实施方式中，方法使用既不包含BMP信号传导调节剂(例如BMP信号传导抑制剂或BMP信号传导激活剂)也不包含WNT信号传导激动剂的类器官培养基。
在一个实施方式中，乳腺上皮细胞包括乳腺上皮干细胞或祖细胞。
分离的乳腺上皮细胞可以是任何哺乳动物物种的。在一个实施方式中，乳腺上皮细胞是人乳腺上皮细胞或小鼠乳腺上皮细胞。分离的乳腺上皮细胞可以从商业供应商、学术合作者或通过处理乳腺组织获得。如果从乳腺组织开始，通常使用机械/物理和酶促手段的组合来处理此类样本。
如本文所述，乳腺上皮细胞的单细胞悬液或乳腺上皮细胞的片段或团块的悬液通常通过使用手术刀、组织分离器等切割乳腺组织来产生。在切割操作之后或期间，乳腺组织通常在含酶溶液中孵育以分解细胞外基质和结缔组织。酶溶液可包括用于处理乳腺组织的任何酶或酶的组合。作为非限制性实例，可用于该目的的酶包括胶原酶、透明质酸酶、分散酶、嗜热菌蛋白酶、胰蛋白酶、DNA酶等。
在一个实施方式中，顺序地应用切碎的乳腺组织的酶处理。例如，可首先将切碎的乳腺组织在包含胶原酶和透明质酸酶之一或两者的溶液中孵育。消化的乳腺组织的较大片段可通过以相对低的离心力(例如<200x g)离心来收集并放置在一边。为了分离相对较小的材料，包括细胞团块或单细胞，可以以逐渐更高的离心力(例如≥200x g)进一步离心所得上清液。可以将两种沉淀物合并且进一步在含胰蛋白酶的溶液中消化以获得基本上单细胞的悬液。
在一些实施方式中，基本上单细胞、或片段、或单细胞和片段的混合物的悬液可需要DNA酶处理以降解来自裂解细胞的DNA并降低细胞悬液的粘度。
在产生乳腺上皮细胞悬液(特别是其中包含单细胞)后，可能需要从样品中的各种细胞类型的背景中分离乳腺上皮细胞的特定子集。乳腺上皮细胞的特定子集可使用已知方法(诸如通过荧光激活细胞分选或免疫磁性细胞分离)从样品中分离，如由STEMCELLTechnologies商业化的。
乳腺的细胞组成包括上皮细胞和非上皮细胞(成纤维细胞、内皮细胞、淋巴细胞、脂肪细胞、神经元和肌细胞)。人和小鼠之间相应细胞类型之间的标记物的表达可能不同。在人中，上皮细胞与非上皮细胞可通过EpCAM的表达来区分。在EpCAM+上皮区室中，乳腺上皮包括两个主要谱系：腔谱系和肌上皮(或基底)谱系。一方面，肌上皮细胞典型地由以下标记：i)细胞角蛋白5(K5)、细胞角蛋白14(K14)、P63、平滑肌肌动蛋白(SMA)、CD49f和CD29的高表达；和ii)不存在细胞角蛋白8(K8)、细胞角蛋白(K18)和CD24。另一方面，腔谱系可分为2个亚群：乳祖细胞和激素反应性ER+谱系。ER+谱系可通过以下来区分：i)K8、K18、雌激素受体-α(ERα)、黄体酮受体(PR)的高表达；和ii)不存在K5、K14、CD49f和SMA。乳谱系可通过以下区分：i)ALDEFLUOR染色阳性，表明ALDH1A3表达；ii)K8、K18和CD49f的表达；iii)K5和K14的表达；和(iv)不存在ERα和SMA。在小鼠中，上皮细胞与非上皮细胞可通过EpCAM或CD24的表达来区分。在EpCAM+上皮区室中，乳腺上皮包括两个主要谱系：腔谱系和肌上皮(或基底)谱系。一方面，肌上皮细胞典型地由以下标记：i)细胞角蛋白5(K5)、细胞角蛋白14(K14)、P63、平滑肌肌动蛋白(SMA)、CD49f和CD29的高表达；和ii)不存在细胞角蛋白8(K8)、细胞角蛋白(K18)。另一方面，腔谱系可分为2个亚群：乳祖细胞和激素反应性ER+谱系。ER+谱系可通过以下区分：i)K8、K18、雌激素受体-α(ERα)、黄体酮受体(PR)的高表达；和ii)不存在K5、K14、CD49f、CD49b和SMA。乳谱系可通过以下区分：i)ALDEFLUOR染色阳性，指示ALDH1A3表达；ii)K8、K18、CD49b和CD49f的表达；iii)K5、K14、ERα和SMA的低表达。在一些情况下，SMA和ER+之一或两者的存在或不存在可有助于进一步区分基底细胞和腔细胞。
在一些实施方式中，分离的乳腺上皮细胞与细胞外基质联合培养。在一个实施方式中，将分离的乳腺上皮细胞接种在细胞外基质的“穹顶”内。在一个实施方式中，将分离的乳腺上皮细胞接种在细胞外基质的“三明治”内，其中将细胞接种到细胞外基质的层上，并且然后用相同或不同的细胞外基质的覆盖物覆盖。在一个实施方式中，将分离的乳腺上皮细胞接种在细胞外基质的层的顶部。
用于培养乳腺上皮细胞的细胞外基质是已知的，并且本公开考虑任何合适的细胞外基质。在一个实施方式中，细胞外基质是MatrigelTM(Corning)。在一个实施方式中，细胞外基质可以是Matrigel的合适替代物，诸如CultrexTM基底膜基质(Trevigen)。
在一个实施方式中，细胞外基质可以是细胞外基质的单一天然组分或其任意组合。细胞外基质的天然组分的实例包括胶原、层粘连蛋白、巢蛋白、硫酸肝素、蛋白聚糖或纤连蛋白。
在一个实施方式中，细胞外基质可以是合成基质，诸如用上述任意一种或多种天然细胞外组分配制的水凝胶。
接种在细胞外基质层上或特定体积的细胞外基质内的乳腺上皮细胞的密度应当凭经验确定。在将乳腺上皮细胞接种在24孔板底部的细胞外基质的“穹顶”内的实施方式中，30-50μL穹顶内可包括约1,000至50,000个细胞中的任意数值。当使用不同的板形式时，细胞数量和细胞外基质的体积可能需要调整。然而，应当理解，可以将低至单细胞或细胞的克隆密度接种到细胞外基质上或细胞外基质中。
如上所述，类器官培养基的性质将取决于本文公开的方法的所需输出。因此，以上对类器官培养基的描述被并入以下涉及形成乳腺类器官的方法的公开内容中。
如果方法的所需输出是第一类器官群(例如腔类器官)，则类器官培养基可包含基础培养基以及ERBB1配体和/或ERBB4配体之一或两者(连同不含外源添加的WNT信号传导激动剂和/或BMP信号传导调节剂(例如BMP信号传导抑制剂或BMP信号传导激活剂)之一或两者)。
上文描述了可包含在类器官培养基中的ERBB1和ERBB4的潜在配体。在一个实施方式中，ERBB1配体是双调蛋白。在一个实施方式中，ERBB4配体是神经调节蛋白1。在用于促进腔类器官形成和/或维持的类器官培养基的一个实施方式中，培养基包含ERBB1配体和ERBB4配体两者。在一个实施方式中，ERBB1配体不是EGF或TGFα。在一个实施方式中，ERBB1配体既不是EGF也不是TGFα。
同样如上所述，当配制用于促进腔类器官形成和/或维持的类器官培养基时，重要的考虑是不激活或不抑制某些信号传导级联。因此，在此种类器官培养基的一个实施方式中，培养基不含外源添加的WNT信号传导激动剂和/或BMP信号传导调节剂(例如其抑制剂或激活剂)之一或两者。
在一个实施方式中，不包含在类器官培养基(用于促进腔类器官的形成和/或维持)中的WNT信号传导激动剂是R-脊椎蛋白、WNT蛋白质或肽、或前述任一种的工程化/合成模拟物。
在一个实施方式中，不包含在类器官培养基(用于促进腔类器官的形成和/或维持)中的BMP信号传导抑制剂是蛋白质抑制剂诸如头蛋白、或小分子抑制剂诸如LDN193189或多索吗啡。在一个实施方式中，类器官培养基(用于促进腔类器官的形成和/或维持)中既不包含BMP信号传导蛋白质抑制剂也不包含BMP信号传导小分子抑制剂。
因此，方法进一步包括在类器官培养基中培养乳腺上皮细胞足以形成富含包括的腔细胞多于非腔细胞的类器官的第一类器官群的时间。换句话说，乳腺上皮细胞可在类器官培养基中培养足以形成第一类器官群的时间，其中使用与类器官培养基不同的培养基形成的类器官可能根本不产生类器官，或者相对于本公开使用的类器官培养基可能产生包括更少腔细胞(以及更多非腔细胞)的类器官。
在一个实施方式中，腔类器官可在与类器官培养基接触约3天后形成。在一个实施方式中，腔类器官可在与类器官培养基接触约5天后形成。在一个实施方式中，腔类器官可在与类器官培养基接触约7天后形成。在一个实施方式中，腔类器官可在与类器官培养基接触约10天后形成。在一个实施方式中，腔类器官可在与类器官培养基接触约14天后形成。在一个实施方式中，形成的腔类器官在需要传代之前可培养达至30天或更长时间。
在一个实施方式中，乳腺上皮细胞与类器官培养基接触时形成的腔类器官(即，第一类器官群)可传代3次或更多次，或者5次或更多次，或者7次或更多次，或者10次或更多次。
如果方法的输出是富含混合谱系类器官的乳腺类器官群(例如第二类器官群)，则可使用改良的类器官培养基(如上所述)来接触和培养乳腺上皮细胞或第一类器官群。因此，此类改良的类器官培养基可将第一类器官群的形成转化为第二类器官群。
ERBB配体、WNT信号传导激动剂和BMP信号传导调节剂(无论激活剂还是抑制剂)的实例如上文所明确的。在一个实施方式中，改良的类器官培养基(用于转化腔类器官的形成并促进混合谱系类器官的形成/传代)包括以下的每一种：至少一种ERBB配体；至少一种WNT信号传导激动剂；以及至少一种BMP信号传导调节剂。
在一个实施方式中，使用本公开的类器官培养基或通过实践本公开的方法形成的第一类器官群(例如，腔类器官)可转化为第二类器官群(例如，混合谱系类器官)。可以使用本公开的改良的类器官培养基将第一类器官群转化为第二类器官群。
在一个实施方式中，乳腺上皮细胞或第一类器官群与改良的类器官培养基接触时形成的混合谱系类器官(即第二类器官群)可传代3次或更多次，或者5次或更多次，或者7次或更多次，或者10次或更多次。
在一个实施方式中，方法可进一步包括将第一类器官群或第二类器官群与TGFβ信号传导抑制剂接触。TGFβ信号传导抑制剂是已知的并且是商业可得的，因此TGFβ信号传导抑制剂可以是任何此类抑制剂。在一个实施方式中，TGFβ信号传导抑制剂是SB431542。在一个实施方式中，TGFβ信号传导抑制剂是A77-01。在一个实施方式中，TGFβ信号传导抑制剂是A83-01。在一个实施方式中，TGFβ信号传导抑制剂是RepSox。将第一类器官群和/或第二类器官群与TGFβ信号传导抑制剂接触可促进雌激素受体的核定位。在一个实施方式中，(在类器官培养基或改良的类器官培养基中)第一类器官群和/或第二类器官群与TGFβ信号传导抑制剂的接触进行培养步骤的持续时间。在一个实施方式中，第一类器官群和/或第二类器官群与TGFβ信号传导抑制剂的接触是瞬时的，诸如在第一类器官群和/或第二类器官群形成之后。
无论通过实践本文公开的方法形成的乳腺类器官的类型如何，类器官都可以用于任何数量的下游测定、方法或应用中。举例来说，乳腺类器官，无论源自正常的还是患病的乳腺上皮细胞，都可用于筛选一组化合物以确定它们的功效和/或毒性。作为另一个实例，此类乳腺类器官可用于研究基础乳腺生物学或患病乳腺上皮(例如癌症)的生物学。作为另一个实例，此类乳腺类器官可用于研究治疗干预，其中它们被移植到受试者体内，无论是人患者还是动物模型。
以下非限制性实施例用于阐释本公开。
实施例
实施例1：处理乳腺组织样品
按照适用的IRB和伦理要求，本公开中使用的所有细胞均获自源自人或小鼠受试者的组织。
如下从学术合作者获得的组织样品中分离人乳腺上皮细胞的片段。使用手术刀以交叉影线的方式(cross-hatched pattern)切割，将切除的组织样品在培养皿中切碎。将切碎的组织样品放入解离烧瓶内补充有BSA、胰岛素、胶原酶和透明质酸酶的标准培养基中。将烧瓶在置于37℃组织孵育箱中的轨道摇床上轻轻摇动过夜。第二天早上，用移液管去除漂浮的脂肪层，并且将剩余的液体转移到试管中并以低rpm短暂离心(～80g，30秒)。将沉淀物(A沉淀物)放在一边，并将上清液进一步以逐渐更长的时间段和逐渐更高的rpm离心(～200g，4分钟)。将沉淀物(B沉淀物)放在一边，并将上清液进一步以逐渐更长的时间段和逐渐更高的rpm离心(～450g，5分钟)。
通过用0.25％胰蛋白酶-EDTA在37℃处理5分钟(间歇研磨)将冷冻保存的沉淀物A和沉淀物B解离成单细胞悬液，并且然后在(300g，5分钟)离心。弃掉上清液，并在室温下将沉淀物在100μg/ml DNA酶溶液中重悬1分钟。将所得细胞通过37μm过滤器以获得单细胞悬液。
如下从乳腺分离小鼠乳腺上皮细胞的单细胞悬液。将切除的乳腺切碎并放入含有标准培养基(其包含50μg/ml庆大霉素、胶原酶和透明质酸酶)的管中。将乳腺在组织孵育箱中于37℃下孵育2小时。孵育后，将细胞解离混合物在advanced DMEM中洗涤并在300g下离心5分钟。根据沉淀物的外观，在一些情况下，需要将沉淀物重悬在氯化铵中以裂解污染的红细胞。随后，如上，在37℃下，将沉淀物在0.25％胰蛋白酶-EDTA中重悬5分钟，并且然后在300g离心5分钟。弃掉上清液，并在室温下将沉淀物在100ug/ml DNA酶溶液中重悬1分钟。将所得细胞通过37μm过滤器以获得单细胞悬液。
实施例2：乳腺上皮细胞单细胞悬液的接种和培养
将如实施例1所述获得的单细胞悬液在100％ MatrigelTM(Corning)中重构，并接种在微板的孔中的穹顶，使得每～25-40μL穹顶中接种约1-2x 104之间的个人细胞或约5x103个小鼠细胞。每个孔接受介于0.5–1mL之间的本文所述的各种培养基中的任一种。
铺板的乳腺上皮细胞的单细胞悬液形成类器官，其大约每7天传代一次，在此7天期间更换2-3次完全培养基。为了传代类器官，通过移液至预热的0.25％胰蛋白酶-EDTA中，在37℃下孵育～5-15分钟，并且再次移液，将Matrigel穹顶打碎。通过在补充有2％ FBS的等体积Hanks平衡盐溶液中洗涤来灭活胰蛋白酶化反应。根据类器官的密度和大小，进行1:2–1:5的分割，其中将细胞接种在穹顶，如上所述。可替选地，通过37μm过滤器过滤细胞以获得单细胞悬液，并如上所述接种到Matrigel穹顶中。
实施例3：乳腺类器官染色
通过在康宁细胞回收溶液(Corning Cell Recovery Solution)中孵育1小时并在冰上摇动，从Matrigel中回收类器官。然后将类器官在4％多聚甲醛(PFA)中在室温下固定1小时，并在4℃下储存在PBS中。PFA固定后，通过将类器官在柠檬酸钠缓冲液中在96℃下煮沸20分钟来进行抗原恢复。类器官在PBS中的0.5％ Triton-X-100溶液中在室温下透化过夜。通过在5％山羊血清溶液中孵育过夜来封闭样品。
固定和透化后，将类器官在一抗和二抗溶液(如下表中总结的)中在室温下顺序孵育过夜。将样品在2ug/ml DAPI溶液中复染20分钟，并通过在甲醇浓度逐渐增加(50％、80％、然后100％甲醇)的溶液中逐步孵育来脱水。将类器官包埋在2:1苯甲酸苄酯-苯甲醇(BABB)溶液中，转移到Ibidi玻璃底室载玻片上，并使用Leica SP8共聚焦激光扫描显微镜成像。免疫荧光(IF)缓冲液由PBS中的1％ BSA、0.1％冷鱼皮胶、0.2％ Triton-X-100和0.05％ Tween 20组成，用于在每个步骤之间洗涤类器官。
实施例4：形成小鼠乳腺分支类器官
根据实施例1获得小鼠乳腺上皮细胞的单细胞悬液，并在包含WNT信号传导激动剂(例如RSPO1)、BMP信号传导抑制剂(例如头蛋白)和EGF的培养基中基本上如实施例2所述接种和培养(图1)。
在三个连续的传代中，在前述培养基中形成的小鼠乳腺类器官一致地繁殖并维持了特征在于高水平分支(具有大量基底细胞和其他非腔细胞类型的类器官特征)的类器官(图1A、1B和1C)。第二次传代后，如实施例3中所述使用共聚焦显微镜对形成的类器官进行成像，并且在高度分支的类器官中观察到强K14表达(图1D)。
实施例5：在本公开的类器官培养基中形成小鼠腔偏好类器官
根据实施例1获得小鼠乳腺上皮细胞的单细胞悬液。使用BD FACSAriaTM Fusion流式细胞仪，基于EpCAM、CD49f和CD49b的差异表达，将单细胞悬液分选成对应于ER+细胞谱系、乳细胞谱系和基底细胞谱系的三个细胞群。在基于CD45、Ter119和CD31表达的分选策略期间，进一步消除了非上皮细胞。基本上如实施例2中所述将分选的细胞接种并培养在不含外源添加的BMP信号传导抑制剂、以及包含外源添加的RSPO-1(～100ng/mL)或不含外源添加的RSPO-1(例如，MammoCultTM小鼠类器官生长培养基，STEMCELL Technologies)的类器官培养基中(图2)。
小鼠乳腺上皮细胞的ER+谱系形成腔类器官，具有明显的囊性组织，在任一种测试的培养基配方中通常具有相同的效率(图2A和2D)。相比之下，相比于在含有RSPO-1的培养基中培养时更加混合的基底细胞、腔细胞和其他细胞的组织，在缺乏RSPO-1的培养基中小鼠乳腺上皮细胞的乳谱系偏向于囊性组织(图2B和2E)。与乳谱系一样，基底谱系细胞在缺乏RSPO-1的培养基中似乎偏向于囊性组织，尽管仍然存在大量混合类器官(相比于在含有RSPO-1的培养基中培养时以混合组织为主)(图2C和2F)。
小鼠乳腺上皮细胞的三种分选谱系中的每一种都可能基于培养基配方偏向于囊性组织(即腔类器官)的观察，促使实验研究不同培养基配方对本体(bulk)(即未分选)乳腺上皮细胞的影响。
类器官培养基被配制为不含外源添加的RSPO-1或RSPO-3，并且在根据实施例1获得并如实施例2中所述接种和培养的本体乳腺上皮细胞的单细胞悬液上测试它们。包含RSPO-1和RSPO-3的培养基均产生了大量混合类器官，但与图2相似，在不含外源添加的RSPO(或其他Wnt激动剂)的类器官培养基中观察到了腔偏好(或囊性)类器官(图3A)。对在包含RSPO的培养基或缺乏RSPO的培养基中形成的类器官的细胞组成进行流式细胞术分析证实，在不存在WNT激动的情况下形成的类器官中基底细胞的数量减少(图3B)。
在后续实验中，从根据实施例1获得的单细胞悬液形成类器官，并如实施例2中所述接种和培养。将类器官在存在或不存在RSPO-1的情况下培养连续三个传代，并且在每次传代中，在没有RSPO-1的情况下形成的类器官一致地繁殖并维持无分支的囊性组织，这是腔细胞限制类器官的特征(图4；P0、P1和P2)。在第二次传代结束时，对形成的类器官进行处理并用K8、K14和DAPI染色，如实施例3中所述。使用共聚焦显微镜获得的图像显示了在不存在WNT激动的情况下形成的类器官中强的K8表达和明显缺乏K14染色，这与在存在WNT激动的情况下形成的类器官的共聚焦显微镜图像形成对比(图4)。
前述实验在包含BMP信号传导抑制剂的培养基中进行，因此探索了BMP信号传导抑制对小鼠乳腺类器官形成的影响。类器官由根据实施例1获得的单细胞悬液形成，并在包含或缺乏外源添加的BMP信号传导抑制剂(0ng/mL或～100ng/mL)(但包括WNT信号传导激动剂RSPO-1)的培养基中如实施例2中所述接种和培养。跨前述培养基配方中的连续传代拍摄的明场图像和共聚焦显微镜图像显示出大量的分支类器官，其包括大量的基底细胞，无论使用何种培养基配方(图5)。
接下来，探索了在包含或缺乏外源添加的WNT信号传导激动剂的类器官培养基的背景下BMP信号传导抑制的存在或不存在的影响。类器官由根据实施例1获得的单细胞悬液形成，并如实施例2中所述接种和培养。基于使用包含～100ng/mL头蛋白和～100ng/mLRSPO-1的类器官培养基(图6A)和6C))或不含外源添加的头蛋白-和RSPO-1的类器官培养基(图6B)和6D))的8次独立实验，在不含BMP信号传导抑制剂和不含WNT信号传导激动剂的培养基配方中观察到显著的基底细胞减少伴随腔细胞增加(图6E)。
基于前述数据，类器官培养基中不存在WNT信号传导激动剂极大地影响乳腺类器官中的谱系平衡(例如增加腔细胞)，并且BMP信号传导抑制剂的存在或不存在对于形成腔偏好类器官似乎是可有可无的。
实施例6：形成人乳腺分支类器官
根据实施例1获得人乳腺上皮细胞的单细胞悬液，并在包含RSPO-1、头蛋白和EGF的培养基中基本上如实施例2中所述接种和培养(图7)。
在第26天，在前述培养基中形成的人乳腺类器官一致地繁殖并维持了特征在于高水平分支(包括大量基底细胞的类器官的特征)的类器官(图7A、7B和7C)。使用共聚焦显微镜对形成的类器官进行成像，并在高度分支的类器官中观察到强的K14表达(图7C)。可以看到叶(lobe)周围的基底细胞一个接一个地堆叠。基底细胞不是内聚分支(cohesivebranching)，而是以单列远离类器官，并且结果是“非内聚类器官分支”。腺体形成单位的缺失使人想起经典浸润性小叶癌。
实施例7：在本公开的类器官培养基中形成人腔偏好类器官
根据实施例1获得人乳腺上皮细胞的单细胞悬液。基本上如实施例2中所述将细胞的单细胞悬液接种并培养在类器官培养基(例如MammoCultTM人类器官生长培养基，STEMCELL Technologies)中，测试不同BMP信号传导激活剂和抑制剂的效果(图8)。
类器官在包含BMP信号传导激活剂、～50ng/mL BMP2或～50ng/mL BMP4的培养基中，以及在包含BMP信号传导抑制剂、～25-200ng/mL头蛋白或～10-100nM LDN193189的培养基中形成。在第一次传代之前不久，将形成的类器官解离，并通过流式细胞术分析细胞谱系平衡。与在包含BMP信号传导抑制剂的培养基中形成的类器官相比，通过BMP途径激活信号传导导致基底细胞显著增加和腔细胞减少(图8A)。在两个不同的供体样品中的后续实验证实，与不包含BMP调节的类器官培养基相比，通过BMP抑制信号传导减少基底细胞的数量，同时增加腔细胞的数量(图8B)。
就形成的类器官中的总细胞计数(图9A)和形成的类器官中的细胞谱系平衡(图9B)而言，跨多个实验分析通过BMP调节信号传导的影响。对在前述条件下形成的类器官进行总细胞计数分析，并且观察到，与信号传导通过BMP未调节或抑制(经由头蛋白或LDN193189)的情况相比，通过BMP(经由BMP2或BMP4)激活信号传导导致总细胞明显净损失(图9A)。与图8中观察到的结果类似，证实了BMP信号传导的激活和抑制对细胞谱系平衡的影响(图9B)。通过共聚焦显微镜证实了在包含BMP信号传导抑制剂的类器官培养基中形成的类器官的K8+腔细胞的相对增加(图9C)。通过共聚焦显微镜拍摄的图像还显示，在包含BMP信号传导抑制剂的类器官培养基中形成的类器官中，K14+细胞的染色微弱(如果有的话)。
最后，探索了通过BMP信号传导的双重抑制的潜在叠加效应(图10)。类器官在包含头蛋白和LDN193189两者的培养基中，或者在包含头蛋白或LDN193189的培养基中形成。通过明场显微镜检查培养物显示，包含单一BMP信号传导抑制剂的类器官培养基似乎足以从乳腺上皮细胞偏好腔类器官的形成(图10)。
总体而言，类器官培养基中不存在一种或多种BMP信号传导抑制剂似乎产生包括大量腔细胞的类器官，并且在类器官培养基中添加一种或多种BMP信号传导抑制剂似乎增加了腔细胞数量，同时减少基底细胞数量。相比之下，如果需要形成腔限制或腔偏好乳腺类器官，则通过BMP激活信号传导似乎负面影响类器官的谱系平衡。
鉴于调节BMP信号传导对人乳腺类器官谱系平衡的重要作用，接下来探索调节WNT信号传导对乳腺类器官形成的潜在影响。根据实施例1获得人乳腺上皮细胞的单细胞悬液。在类器官培养基中基本上如实施例2中所述接种和培养细胞的单细胞悬液，测试不同WNT信号传导激活剂(～0.1–1nM WNT替代物或～20-200ng/mL RSPO-1)和WNT信号传导抑制剂(～50ng/mL DKK1或～200nM NSC)的影响(图11)。
配制腔促进类器官培养基(例如，MammoCultTM人类器官生长培养基，STEMCELLTechnologies)，并且补充有外源添加的RSPO-1或缺乏外源添加的RSPO-1。所形成的类器官的明场图像并未显示两种测试的配方之间的腔偏好类器官的显著增加或减少(图11A)。通过流式细胞术分析在任一条件下形成的类器官的细胞后，证实了该观察结果(图11B)。汇集多个类器官形成实验的流式细胞术数据同样表明，调节WNT信号传导对分析的类器官细胞的谱系平衡几乎没有影响(图11C)。无论类器官培养基是否包含WNT信号传导激动剂、WNT信号传导拮抗剂，或没有WNT信号传导调节，腔细胞和基底细胞的百分比似乎大致相等。因此，WNT信号传导激动和/或拮抗似乎对于从乳腺上皮细胞形成腔限制或腔偏好的人乳腺类器官是可有可无的。
鉴于WNT信号传导调节对于形成腔限制或腔偏好的人乳腺类器官似乎是可有可无的，并且BMP信号传导的抑制似乎将细胞谱系平衡倾斜有利于腔细胞，接下来探索了通过ERBB家族成员调节信号传导对人乳腺类器官形成的影响。根据实施例1获得人乳腺上皮细胞的单细胞悬液。基本上如实施例2中所述将细胞的单细胞悬液接种并培养在类器官培养基(例如MammoCultTM人类器官生长培养基，STEMCELL Technologies)中，测试不同的ERBB受体家族成员的配体(图12)。
类器官在不包含ERBB受体家族成员的配体，或包含～10-50ng/mL双调蛋白(AREG)、～10-50ng/mL表皮生长因子(EGF)或～50-100ng/mL调蛋白/神经调节蛋白1(NRG1)的培养基中形成。在第一次传代之前不久，将形成的类器官解离，并通过流式细胞术分析细胞谱系平衡。而AREG和NRG1似乎对细胞谱系平衡影响很小或没有影响，EGF似乎显著减少了腔细胞的数量，同时显著增加了形成的类器官中基底细胞的数量(图12A)。两个供体样品的后续实验测试了经由以～100nM吉非替尼和～100nM厄洛替尼处理通过EGF受体抑制信号传导的影响，并且此处理似乎对细胞谱系平衡的影响可以忽略不计或没有影响(图12B)。
就形成的类器官中的总细胞计数(图13A)和形成的类器官中的细胞谱系平衡(图13B)而言，跨多个实验，分析通过ERBB受体家族成员调节信号传导的影响。对在前述条件下形成的类器官的总细胞计数进行了分析，并且观察到，与不包含ERBB信号传导调节的对照条件相比，包含通过ERBB家族成员的信号传导激活剂导致形成的乳腺类器官中细胞总数的净增加(图13A)。当类器官培养基中包含EGF或AREG时，观察到最高的分裂活性。与图12中观察到的结果类似，证实了所测试的各种ERBB受体家族配体对细胞谱系平衡的影响(图13B)。而EGF导致腔细胞的最大减少和基底细胞的最大增加，AREG似乎对腔细胞百分比的影响最小，但对增加基底细胞百分比有极大影响。相比之下，在类器官培养基中包含NRG1似乎产生更高百分比的腔细胞，并且百分比减少的基底细胞。
在最后一组实验中，探索了通过TGFβ调节信号传导对人乳腺类器官形成的影响。根据实施例1获得人乳腺上皮细胞的单细胞悬液。基本上如实施例2中所述将细胞的单细胞悬液接种并培养在类器官培养基(例如MammoCultTM人类器官生长培养基，STEMCELLTechnologies)中，测试TGFβ受体的配体或通过TGFβ的信号传导抑制剂的影响(图14)。
类器官在不包含TGFβ受体配体，或包含～50ng/mL TGFβ1(或TGFβ，数据未显示但结果与TGFβ1一致)的培养基中形成。在第一次传代之前不久，将形成的类器官解离，并通过流式细胞术分析细胞谱系平衡。类器官培养基中TGFβ1的存在似乎对腔细胞和基底细胞的百分比具有总体负面影响，同时大大增加了形成的乳腺类器官中基质细胞的比例(图14A)。
鉴于类器官培养基中包含TGFβ1负面影响腔限制或腔偏好的人乳腺类器官的形成，探索了通过TGFβ受体抑制信号传导的潜在作用。在类器官培养基中包括～10μMSB431542、～200-500nM A77-01或～5-25RepSoxμM似乎减少基质细胞的比例，同时维持或改善腔细胞的比例(图14B)。基于这些结果，与不包含通过TGFβ受体的信号传导调节剂的类器官培养基相比，类器官培养基中包含TGFβ信号传导抑制剂(诸如RepSox)可增加腔细胞的比例。然而，一个潜在更有趣的发现表明，短暂暴露于TGFβ信号传导抑制剂(在类器官形成后，如上所述)促进了雌激素受体在核内，而不是在细胞质内的定位(图15)。这些结果对于SB43154和RepSox在人(图15A)和小鼠(图15B)乳腺类器官中被证实。
在后续实验中，类器官培养基被配制为缺乏外源添加的RSPO-1和头蛋白二者。该培养基在单细胞悬液上进行测试，该单细胞悬液是根据实施例1获得的，并且如实施例2中所述进行接种和培养。在第一次传代后第10天，在不暴露于外源添加的RSPO-1和头蛋白形成的类器官表现出囊性形态并且不存在分支，这是腔类器官的特征(图16A)。在这些培养条件下形成的乳腺类器官的共聚焦显微镜证实了腔细胞标记物表达(K8)的存在和基底细胞标记物表达(K5)的明显缺乏(图16B、16C和16D)。
实施例8：促进乳腺腔类器官形成的其他因素
在类器官培养基中测试了其他候选因素以确定它们对偏好限于特定谱系的乳腺上皮细胞的乳腺上皮细胞的形成的影响。根据实施例1获得人乳腺上皮细胞的单细胞悬液。基本上如实施例2中所述将细胞的单细胞悬液接种并培养在补充有50ng/ml神经调节蛋白(NRG3)、100ng/ml抗苗勒管激素(AMH)或50ng/ml粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的类器官培养基(例如，MammoCultTM人类器官生长培养基，STEMCELL Technologies)中。
第17天，类器官用K14或K8染色并通过共聚焦显微镜成像(图17)。类器官培养基中包含NRG3或AMH似乎使乳腺上皮细胞的培养偏好形成腔限制类器官(图17A和图17B)，而类器官培养基中包含GM-CSF似乎使乳腺上皮细胞的培养偏好形成基底限制类器官(图17C)。
虽然已经参考当前被认为是优选的实施例的内容描述了本公开，但是应当理解，本公开不限于所公开的实施例。相反，本公开旨在涵盖包含在所附权利要求的精神和范围内的各种修改和等同排列。
所有出版物、专利和专利申请均通过引用以其整体并入本文，其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请被具体且单独地表明通过引用以其整体并入一样。

Claims (38)

1.一种从分离的乳腺上皮细胞形成乳腺类器官的方法，所述方法包括：
a)将乳腺上皮细胞与不含外源添加的WNT信号传导激动剂和/或BMP信号传导抑制剂之一或两者的类器官培养基接触；和
b)将乳腺上皮细胞在类器官培养基中培养足以形成富含包括的腔细胞多于非腔细胞的类器官的第一类器官群的时间，
其中类器官培养基包含基础培养基以及ERBB1配体和/或ERBB4配体之一或两者。
2.根据权利要求1所述的方法，其中类器官培养基包含BMP信号传导抑制剂但不包含WNT信号传导激动剂。
3.根据权利要求1所述的方法，其中类器官培养基包含WNT信号传导激动剂但不包含BMP信号传导抑制剂。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中WNT信号传导激动剂是R-脊椎蛋白、WNT蛋白质或前述任一种的工程化模拟物。
5.根据权利要求1所述的方法，其中BMP信号传导抑制剂是蛋白质或小分子。
6.根据权利要求5所述的方法，其中BMP信号传导抑制剂是头蛋白、腱蛋白、卵泡抑素、LDN193189或多索吗啡中的一种或多种。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中ERBB1配体不是EGF或TGFα。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中ERBB1配体是双调蛋白。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中ERBB4配体还是不同ERBB受体家族成员的配体。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中ERBB4配体是神经调节蛋白1和/或神经调节蛋白3。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中类器官培养基不含外源添加的性激素。
12.根据权利要求11所述的方法，其中性激素是黄体酮。
13.根据权利要求1所述的方法，其中非腔细胞是基底细胞、基质细胞、造血细胞和内皮细胞中的一种或多种。
14.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中类器官包括50％或更多的腔细胞。
15.根据权利要求1所述的方法，进一步包括在改良的类器官培养基中培养第一类器官群，以将第一类器官群转化为第二类器官群。
16.根据权利要求15所述的方法，其中改良的类器官培养基补充有EGF。
17.根据权利要求15或16的方法，其中改良的类器官培养基补充有WNT信号传导激动剂和/或BMP信号传导抑制剂。
18.根据权利要求15至17中任一项所述的方法，其中如果不添加WNT信号传导激动剂和/或BMP信号传导抑制剂中的一者或两种至类器官培养基，则第二类器官群包括更多的基底细胞、更少的腔细胞。
19.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中第一类器官群在类器官培养基中可传代5次或更多次。
20.根据权利要求15至18中任一项所述的方法，其中第二类器官群在改良的类器官培养基中可传代5次或更多次。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，进一步包括将第一类器官群与TGF-β抑制剂接触。
22.根据权利要求21所述的方法，进一步包括获得ER的核定位。
23.一种乳腺类器官培养基，其包含：基础培养基以及ERBB1配体和ERBB4配体之一或两者；并且缺乏外源添加的WNT信号传导激动剂和BMP信号传导抑制剂之一或两者。
24.根据权利要求23所述的培养基，其中类器官培养基包含BMP信号传导抑制剂但不包含WNT信号传导激动剂。
25.根据权利要求23所述的培养基，其中类器官培养基包含WNT信号传导激动剂但不包含BMP信号传导抑制剂。
26.根据权利要求23至25中任一项所述的培养基，其中WNT信号传导激动剂是R-脊椎蛋白、WNT蛋白质或前述任一种的工程化模拟物。
27.根据权利要求23至26中任一项所述的培养基，其中BMP信号传导抑制剂是蛋白质或小分子。
28.根据权利要求27所述的培养基，其中BMP信号传导抑制剂是头蛋白、腱蛋白、卵泡抑素、LDN193189或多索吗啡中的一种或多种。
29.根据权利要求23至28中任一项所述的培养基，其中ERBB1配体不是EGF或TGFα。
30.根据权利要求23至29中任一项所述的培养基，其中ERBB1配体是双调蛋白。
31.根据权利要求23至30中任一项所述的培养基，其中ERBB4配体还是不同ERBB受体家族成员的配体。
32.根据权利要求23至31中任一项所述的培养基，其中ERBB4配体是神经调节蛋白1或神经调节蛋白3。
33.根据权利要求23至32中任一项所述的培养基，其中类器官培养基不含外源添加的性激素。
34.根据权利要求33所述的培养基，其中性激素是黄体酮。
35.根据权利要求23至34中任一项所述的培养基，其中在类器官培养基中培养分离的乳腺上皮细胞富集包括的腔细胞多于非腔细胞的类器官。
36.一种用于从分离的乳腺上皮细胞形成乳腺类器官的试剂盒，所述试剂盒包含：
基础培养基；和
待添加至基础培养基中的第一补充物，第一补充物包含ERBB1配体和/或
ERBB4配体之一或两者，并且缺乏外源添加的WNT信号传导激动剂和/或
BMP信号传导抑制剂之一或两者。
37.根据权利要求36所述的试剂盒，其进一步包含待添加至基础培养基或待添加至补充有第一补充物的基础培养基中的第二补充物，第二补充物包含与第一补充物中的ERBB1配体不同的第二ERBB1配体、以及外源添加的WNT信号传导激动剂和/或BMP信号传导抑制剂之一或两者。
38.根据权利要求36或37所述的试剂盒，其进一步包含待添加至基础培养基中或待添加至补充有第一补充物和/或第二补充物的基础培养基中的第三补充物，第三补充物包含TGFβ信号传导抑制剂。
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