JP2024514207A - 乳房オルガノイドを成長させるための培地及び方法 - Google Patents

Abstract

乳房オルガノイドを指向的に形成するための培地、キット及び方法を開示する。オルガノイド培地の実施形態は、単離された乳房上皮細胞からの管腔オルガノイドの形成を偏向させる／濃縮するために使用され得る。改変オルガノイド培地の実施形態は、単離された乳房上皮細胞からの混合系統オルガノイドの形成を偏向させる／濃縮するために、または管腔オルガノイドを混合系統オルガノイドに変換するために使用され得る。【選択図】図４

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年４月１６日に出願された米国仮出願第６３／１７５，６８６号に対する優先権の利益を主張し、そのすべての内容は参照により本明細書に組み込まれる。

本開示は、細胞培養用途に関するものであり、より具体的には乳腺の細胞を用いた細胞培養用途に関するものであり、さらに具体的には、特定の乳腺細胞型から構成される多細胞構造体の成長に関する細胞培養用途に関する。

米国の約８人に１人の女性が、生涯において浸潤性乳癌と診断される。乳房腫瘍は、乳腺の上皮に発生する。乳房上皮は、授乳中に乳汁分泌性腺房を排出させる一連の分岐管から構成されている。これらの管及び腺房の細胞は、内側管腔層及び外側基層を有する二層化上皮として組織化される。管腔層は、エストロゲン受容体（ＥＲ）を発現する系統と乳系統の２系統の上皮細胞から構成される。休止乳腺における乳系統細胞は、妊娠中に増殖して、腺房と呼ばれる嚢状構造を生成する細胞である。腺房の内側を覆っている細胞、すなわち腺房細胞は、授乳中に乳汁を合成して分泌する。乳房上皮の基底細胞層は、基底細胞から構成されており、これらの細胞は、収縮特性を有するため（乳腺から乳を搾り出す）、筋上皮細胞とも呼ばれる。

出産後の腺における３系統の細胞（基底、ＥＲ^＋、乳）は、主にそれぞれ自身の幹細胞集団によって維持される。ＥＲ^＋系統は、高レベルの管腔ケラチン（Ｋ）８及び１８を発現するが、基底Ｋ５及びＫ１４は発現しない。これらの細胞は、その名前が示唆するように、プロゲステロン受容体（ＰＲ）と同様に、高レベルのＥＲを発現する。基底細胞は、Ｋ８またはＫ１８を発現しないが、ケラチンＫ５及びＫ１４を発現する。乳系統は、中間表現型を有し；ヒトでは、この乳系統の細胞が、管腔及び基底のケラチンの両方を発現する。マウスにおける乳系統は、管腔ケラチン発現は低レベルではあるが、主に管腔表現型を有し、基底ケラチンの転写レベルは、低いが検出可能である。乳系統では、ＥＲは発現しない。

ヒト乳房腫瘍は、表現型に基づいて３つのサブタイプ：ＥＲ^＋、ＨＥＲ２増幅（ＨＥＲ２^＋）、及びトリプルネガティブ（ＥＲ^－、ＰＲ^－、ＨＥＲ２^－）に広く分類できる。トリプルネガティブ分類は、さらに基底様とクローディン^ｌｏｗとに細分することができる。ヒト乳房腫瘍の細胞起源は、依然として完全には理解されていないが、ＥＲ^＋腫瘍は、ＥＲ^＋細胞に由来し、ＨＥＲ２^＋腫瘍は、ＥＲ^＋及び乳系統細胞に由来し、基底様腫瘍は、乳系統細胞に由来し、クローディン^ｌｏｗ腫瘍は、基底細胞に由来するという仮説が存在する。

Ｉｎ ｖｉｔｒｏモデル系は、基礎乳腺生物学の疑問を研究し、また乳房腫瘍細胞と比較して、正常な乳房細胞の違いを理解するためにも有益であろう。さらに、系は、化合物スクリーニングアッセイ及び毒性試験に有益であり得る。

乳腺の正常状態及び疾患状態を調べるための効果的なｉｎ ｖｉｔｒｏモデル系が依然として必要とされている。特に、正常な状況でも疾患の状況でも、単離している乳腺の個々の細胞型を調べるためのｉｎ ｖｉｔｒｏモデル系が依然として必要とされている。さらに、正常な状態であろうと疾患のある状態であろうと、調査される特定の構造または細胞の型を再現するｉｎ ｖｉｔｒｏモデル系を得るために、細胞培養培地を含めた確認された培養条件が依然として必要である。

本開示は、乳房オルガノイドを成長させるための培地、キット及び方法に関する。より具体的には、本開示は、所望の乳腺細胞型から構成される乳房オルガノイドを予測可能かつ再現可能に得るために、乳房上皮細胞を培養することに関する。

本開示の広い一態様では、単離された乳房上皮細胞から乳房オルガノイドを形成する方法が提供される。そのような方法は、外因的に付加されたＷＮＴシグナル伝達アゴニスト及び／またはＢＭＰシグナル伝達の阻害剤の一方または両方を含まないオルガノイド培地と乳房上皮細胞とを接触させることと、外因的に付加されたＷＮＴシグナル伝達アゴニスト及び／またはＢＭＰシグナル伝達阻害剤の一方または両方がオルガノイド培地に含まれる場合、非管腔細胞（基底細胞、間質細胞など）よりも多い管腔細胞から構成されるオルガノイドが濃縮されたオルガノイドの第１の集団を形成するのに十分な時間、オルガノイド培地中で乳房上皮細胞を培養することと、を含み得る。一実施形態では、乳房上皮細胞は、乳房上皮幹細胞または前駆細胞を含む。一実施形態では、乳房上皮細胞は、霊長類またはげっ歯類から単離される。一実施形態では、非管腔細胞は、基底細胞、間質細胞、造血細胞及び内皮細胞のうちの１つ以上である。

一実施形態では、管腔細胞は、Ｋ８を発現する。一実施形態では、管腔細胞は、Ｋ８及びＫ１８を共発現する。一実施形態では、基底細胞は、Ｋ５を発現する。一実施形態では、基底細胞は、Ｋ５及びＫ１４を共発現する。

一実施形態では、オルガノイド培地は、基礎培地と、ＥＲＢＢ１のリガンド及び／またはＥＲＢＢ４のリガンドの一方または両方と、を含む。一実施形態では、ＥＲＢＢ１のリガンドは、ＥＧＦまたはＴＧＦαではない。一実施形態では、ＥＲＢＢ１のリガンドは、アンフィレグリンである。一実施形態では、ＥＲＢＢ４のリガンドはまた、異なるＥＲＢＢ受容体ファミリーメンバーのリガンドである。一実施形態では、ＥＲＢＢ４のリガンドは、ヘレグリン及び／またはニューレグリン３である。

一実施形態では、オルガノイド培地は、ＢＭＰシグナル伝達の阻害剤を含むが、ＷＮＴシグナル伝達アゴニストを含まない。一実施形態では、オルガノイド培地は、ＷＮＴシグナル伝達アゴニストを含むが、ＢＭＰシグナル伝達の阻害剤を含まない。

一実施形態では、ＷＮＴシグナル伝達アゴニスト（オルガノイド培地には含まれない）は、Ｒ－スポンジン、ＷＮＴタンパク質、または上記のいずれかの操作された模倣物である。

一実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達の阻害剤は、タンパク質または低分子である。一実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達の阻害剤は、ノギン、コーディン、フォリスタチン、ＬＤＮ１９３１８９またはドルソモルフィンのうちの１つ以上である。

一実施形態では、オルガノイド培地は、外因的に付加された性ホルモンを含まない。一実施形態では、性ホルモンは、プロゲステロンである。

一実施形態では、オルガノイドは、５０％以上が管腔細胞で構成されている。

一実施形態では、本方法は、オルガノイドの第１の集団を改変オルガノイド培地中で培養して、オルガノイドの第１の集団をオルガノイドの第２の集団に変換することをさらに含み得る。

一実施形態では、改変オルガノイド培地には、ＥＧＦが補充される。一実施形態では、改変オルガノイド培地は、ＷＮＴシグナル伝達アゴニスト及び／またはＢＭＰシグナル伝達の阻害剤を補充する。

一実施形態では、ＷＮＴシグナル伝達アゴニスト及び／またはＢＭＰシグナル伝達の阻害剤の一方または両方がオルガノイド培地に添加されていない場合には、オルガノイドの第２の集団は、より多くの基底細胞及びより少ない管腔細胞から構成される。

一実施形態では、オルガノイドの第１の集団は、オルガノイド培地中で５回以上継代され得る。一実施形態では、オルガノイドの第２の集団は、改変オルガノイド培地中で５回以上継代され得る。

一実施形態では、本方法は、オルガノイドの第１の集団または第２の集団をＴＧＦ－ベータの阻害剤と接触させることをさらに含み得る。一実施形態では、本方法は、ＴＧＦ－ベータの阻害剤での処理により、ＥＲの核局在を得ることをさらに含み得る。

一実施形態では、オルガノイドの第１の集団は、平均して５０％超の管腔細胞及び３０％未満の基底細胞で構成されている。

本開示の別の広い態様では、乳房オルガノイド培地配合物が提供される。そのような乳房オルガノイド培地は、基礎培地と、ＥＲＢＢ１のリガンド及びＥＲＢＢ４のリガンドの一方または両方とを含み、外因的に付加されたＷＮＴシグナル伝達アゴニスト及びＢＭＰシグナル伝達の阻害剤の一方または両方を欠く。

一実施形態では、オルガノイド培地は、ＢＭＰシグナル伝達の阻害剤を含むが、ＷＮＴシグナル伝達アゴニストを含まない。一実施形態では、オルガノイド培地は、ＷＮＴシグナル伝達アゴニストを含むが、ＢＭＰシグナル伝達の阻害剤を含まない。

一実施形態では、ＷＮＴシグナル伝達アゴニスト（オルガノイド培地には含まれない）は、Ｒ－スポンジン、ＷＮＴタンパク質、または上記のいずれかの操作された模倣物のうちの１つ以上である。

一実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達の阻害剤（オルガノイド培地に含まれない）は、タンパク質または低分子である。一実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達の阻害剤（オルガノイド培地に含まれない）は、ノギン、コーディン、フォリスタチン、ＬＤＮ１９３１８９またはドルソモルフィンのうちの１つ以上である。

一実施形態では、ＥＲＢＢ１のリガンドは、ＥＧＦまたはＴＧＦαではない。一実施形態では、ＥＲＢＢ１のリガンドは、アンフィレグリンである。一実施形態では、ＥＲＢＢ４のリガンドはまた、異なるＥＲＢＢ受容体ファミリーメンバーのリガンドである。一実施形態では、ＥＲＢＢ４のリガンドは、ニューレグリン１及び／またはニューレグリン３である。

一実施形態では、オルガノイド培地は、外因的に付加された性ホルモンを含まない。一実施形態では、性ホルモンは、プロゲステロンである。

一実施形態では、オルガノイド培地中で、単離された乳房上皮細胞を培養することにより、非管腔細胞よりも多い管腔細胞から構成されるオルガノイドが濃縮される。

一実施形態では、単離された乳房上皮細胞が、外因的に付加されたＷＮＴシグナル伝達アゴニスト及び／またはＢＭＰシグナル伝達阻害剤の一方または両方を含むオルガノイド培地中で培養される場合、オルガノイド培地中で、単離された乳房上皮細胞を培養することにより、より多くの管腔細胞及びより少ない基底細胞から構成されるオルガノイドが濃縮される。一実施形態では、乳房上皮細胞は、乳房上皮幹細胞または前駆細胞を含む。一実施形態では、乳房上皮細胞は、霊長類またはげっ歯類から単離される。

本開示の別の広い態様では、（本開示のオルガノイド培地、改変オルガノイド培地、及びＥＲ核局在性培地などの培地配合物を配合するための）キットが提供される。一実施形態では、このようなキットは、基礎培地と、この基礎培地に添加される第１の管腔細胞促進補充物とを含んでよい。一実施形態では、第１の補充物は、ＥＲＢＢ１のリガンド及び／またはＥＲＢＢ４のリガンドの一方または両方を含み得る。一実施形態では、第１の補充物は、外因的に付加されたＷＮＴシグナル伝達アゴニスト及び／またはＢＭＰシグナル伝達の阻害剤の一方または両方を欠いている場合もある。

一実施形態では、本開示のキットは、基礎培地に添加される、または第１の補充物を補充した基礎培地に添加される、第２の混合系統促進補充物をさらに含み得る。一実施形態では、第２の補充物は、第１の補充物中のＥＲＢＢ１のリガンドとは異なるＥＲＢＢ１の第２のリガンドを含み得る。一実施形態では、第２の補充物は、外因的に付加されたＷＮＴシグナル伝達アゴニスト及び／またはＢＭＰシグナル伝達の阻害剤の一方または両方をさらに含んでいてもよい。

一実施形態では、本開示のキットはさらに、基礎培地に、または第１の補充物及び／または第２の補充物を補充した基礎培地に添加される第３のＥＲ核局在補充物を含んでもよい。一実施形態では、第３の補充物は、ＴＧＦβシグナル伝達の阻害剤を含み得る。一実施形態では、ＴＧＦβシグナル伝達の阻害剤は、ＳＢ４３１５４２、ＲｅｐＳｏｘ、Ａ７７－０１またはＡ８３－０１である。

本発明の他の特徴、及び利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、この詳細な説明及び特定の例は、本発明の好ましい実施形態を示してはいるが、例示としてのみ行われるものであって、この詳細な説明によって当業者に明らかになる各種の変更や修正は、本発明の趣旨及び範囲内にあることを理解するべきである。

本明細書に記載の種々の実施形態のより良い理解のため、またこれらの種々の実施形態を効果的に実行し得る方法をより明確に示すために、少なくとも１つの例示的実施形態を示す添付図面を参照として提示し、これより、添付図面について説明する。各図面は、本明細書に記載の教示の範囲を限定することを意図したものではない。

選別されていないマウス乳房上皮細胞から形成されたオルガノイドの代表的な画像を示す。パネルＡ）、Ｂ）及びＣ）の画像は、外因的に付加されたＷＮＴアゴニスト及びＢＭＰシグナル伝達の阻害剤を含むオルガノイド培地中のオルガノイドの連続継代に相当する。パネルＤの画像には、パネルＡ）～Ｃ）に示されたオルガノイドを形成するために使用されるオルガノイド培地において生成されたオルガノイドの継代２の共焦点顕微鏡によって撮影された画像を示す。オルガノイドを、Ｋ８、Ｋ１４及び核染色ＤＡＰＩについて染色した。スケールバーは、パネルＡ）～Ｃ）では５００μｍであり、パネルＤ）では１００μｍである。 選別されたマウス乳房上皮細胞の集団から形成されたオルガノイドの代表的な画像を示す。ＥＲ^＋管腔細胞（パネルＡ及びＤ）、乳細胞（パネルＢ及びＥ）、ならびに基底細胞（パネルＣ及びＦ）を、ＢＭＰシグナル伝達の阻害剤を含まないオルガノイド培地中で、及びＲＳＰＯ－１の存在下または非存在下のいずれかで培養した。スケールバーは、５００μｍである。 選別されていないマウス乳房上皮細胞から形成されたオルガノイドの代表的な画像を示す。パネルＡ）における画像は、ＷＮＴアゴニストＲＳＰＯ－１もしくはＲＳＰＯ－３を含むか、または外因的に付加されたＷＮＴシグナル伝達アゴニストを含まない培地中に形成されたオルガノイドを示す。スケールバーは、５００μｍである。パネルＢ）のフローサイトメトリープロットは、パネルＡ）のオルガノイド培地中のオルガノイドに形成された細胞間の表現型を示す。 連続継代において選別されていないマウス乳房上皮細胞から形成されたオルガノイドの代表的な画像を示す。管腔オルガノイドは、外因的に付加されたＷＮＴシグナル伝達アゴニストを含むかまたは含まない、本開示のオルガノイド培地中で増殖した。スケールバーは、５００μｍである。継代２のオルガノイドを、Ｋ８、Ｋ１４、及び核染色ＤＡＰＩについて染色し、共焦点顕微鏡法によって撮像した。スケールバーは、１００μｍである。 連続継代において選別されていないマウス乳房上皮細胞から形成されたオルガノイドの代表的な画像を示す。管腔オルガノイドは、外因的に付加されたＢＭＰシグナル伝達の阻害剤を含むかまたは含まない本開示のオルガノイド培地中では、形成または増殖しない。スケールバーは、５００μｍである。継代２のオルガノイドを、Ｋ８、Ｋ１４、及び核染色ＤＡＰＩについて染色し、共焦点顕微鏡によって撮像した。スケールバーは、１００μｍである。 選別されていないマウス乳房上皮細胞から形成されたオルガノイドの代表的なフローサイトメトリープロットを示す。パネルＡ）及びＢ）は、Ｒ－スポンジンを含む（パネルＡ）またはＲ－スポンジンを含まない（パネルＢ）培地中で１４日間（Ｐ０）細胞を培養後のオルガノイドの代表的な画像を示す。パネルＡ）及びＢ）に示されるオルガノイドの細胞を、それぞれ、ＥｐＣＡＭ及びＣＤ４９ｆ（パネルＣ）及びＤ））の発現についてフローサイトメトリーにより分析した。フローサイトメトリーデータの概要をパネルＥに示す。結果は、ｎ＝８のマウスで確認した。スケールバーは、５００μｍである。 選別されていないヒト乳房上皮細胞から形成されたオルガノイドの代表的な画像を示す。ＲＳＰＯ－１、ＥＧＦ及びノギンが外因的に添加されたオルガノイド培地に、オルガノイドが形成された。パネルＡ）の画像は、形成された複数のオルガノイドを捕捉するより広い焦点領域を示す。スケールバーは、５００μｍである。パネルＢ）及びパネルＣ）のそれぞれの画像は、Ｋ８、Ｋ１４及び核染色ＤＡＰＩについて染色した後に、明視野または共焦点顕微鏡法のいずれかによって撮像された１つのオルガノイドを示す。スケールバーは、１００μｍである。 選別されていないヒト乳房上皮細胞から形成されたヒトのオルガノイドに対する、ＢＭＰ受容体を介したシグナル伝達の調節の効果を示す。パネルＡ）のフローサイトメトリープロットは、ＢＭＰシグナル伝達アゴニスト（ＢＭＰ２またはＢＭＰ４）またはアンタゴニスト（ノギンまたはＬＤＮ１９３１８９）のいずれかを含むオルガノイド培地での形成後のオルガノイド組成を比較する。パネルＢ）のフローサイトメトリープロットは、２つの異なるドナーについて、ＢＭＰ受容体を介したシグナル伝達の阻害がオルガノイド細胞系統のバランスに及ぼす効果を示す。 選別されていないヒト乳房上皮細胞から形成されたヒトのオルガノイドに対する、ＢＭＰ受容体を介したシグナル伝達の調節の効果を示す。パネルＡ）のプロットは、ＢＭＰシグナル伝達アゴニスト（ＢＭＰ２またはＢＭＰ４）またはアンタゴニスト（ノギンまたはＬＤＮ１９３１８９）のいずれかを含むオルガノイド培地に形成されたオルガノイドの中に含まれる細胞の総数を示す。パネルＢ）の棒グラフには、ＢＭＰシグナル伝達の異なる調節因子を含むオルガノイド培地に形成されたオルガノイドの組成をまとめる。棒グラフは、ＢＭＰシグナル伝達の外因的に付加された調節因子を含まない対照に対して正規化させた、２つの実験＋／－標準偏差の平均を表す。パネルＣ）では、ＢＭＰシグナル伝達の阻害剤を含むまたは含まない培地に形成されたオルガノイドを、Ｋ８、Ｋ１４及び核染色ＤＡＰＩについて染色した後に共焦点顕微鏡によって撮像した。白い矢印は、Ｋ８について明るく染色している選択された領域を示す。スケールバーは、５０μｍである。 連続継代において撮影された管腔偏向型ヒトオルガノイドの画像を示す。ＢＭＰシグナル伝達の２つの異なる阻害剤の組み合わせを含むオルガノイド培地中で、または各ＢＭＰシグナル伝達阻害剤を個別に含む培地中で、オルガノイドを形成させた。スケールバーは、５００μｍである。 選別されていないヒト乳房上皮細胞から形成されたオルガノイドに対するＷｎｔアゴニスト作用の効果を示す。パネルＡ）のオルガノイドは、ＷＮＴシグナル伝達のアゴニストを含むか、または省略するオルガノイド培地中で形成され、そのようなオルガノイドの組成の代表的なフローサイトメトリープロットは、パネルＢ）に示す。スケールバーは、５００μｍである。パネルＣ）の棒グラフは、種々のＷＮＴシグナル伝達アゴニストまたはアンタゴニストを含む培地中で形成された後のオルガノイド組成をまとめたものである。棒グラフは、外因的に付加されたＷＮＴシグナル伝達調節因子を含まない対照に対して正規化させた、２つの実験＋／－標準偏差の平均を表す。 選別されていないヒト乳房上皮細胞から形成されたオルガノイドに対する、様々なＥＲＢＢ受容体ファミリーメンバーを介したシグナル伝達の調節の効果を示す。パネルＡ）のフローサイトメトリープロットは、ＥＲＢＢ受容体ファミリーメンバーの調節を含まないオルガノイド培地または示されたＥＲＢＢ受容体ファミリーリガンドを含むオルガノイド培地のいずれかで形成された後のオルガノイド組成の比較を示す。パネルＢ）のフローサイトメトリープロットは、２つの異なるドナーについて、ＥＲＢＢファミリーメンバーの外因性調節因子を含まないかまたはＥＧＦシグナル伝達阻害剤を含むオルガノイド培地のオルガノイド形成に対する効果を示す。 選別されていないヒト乳房上皮細胞から形成されたオルガノイドに対する、ＥＲＢＢファミリーメンバーを介したシグナル伝達の調節の効果を示す。パネルＡ）のプロットは、ＥＲＢＢアゴニスト（ＡＲＥＧ、ＥＧＦまたはＮＲＧ１）またはアンタゴニスト（エルロチニブ＋ゲフィチニブ）のいずれかを含むオルガノイド培地中で形成されたオルガノイドに含まれる細胞の総数を示す。パネルＢ）の棒グラフには、異なるＥＲＢＢ受容体調節因子を含むオルガノイド培地中で形成された後に、得られたオルガノイドの組成をまとめる。棒グラフは、外因的に付加されたＥＲＢＢファミリーシグナル伝達調節因子を含まない対照に対して正規化させた、２つの実験＋／－標準偏差の平均を表す。 選別されていないヒト乳房上皮細胞から形成されたオルガノイドに対する、ＴＧＦβを介したシグナル伝達の調節の効果を示す。パネルＡ）のフローサイトメトリープロットは、ＴＧＦβシグナル伝達の調節を含まないか、または外因的に付加されたＴＧＦβ１を含むオルガノイド培地中で形成された後のオルガノイド細胞組成の比較を示す。パネルＢ）のフローサイトメトリーのプロットは、ＴＧＦβシグナル伝達の外因的に付加された阻害剤がオルガノイド形成に及ぼす効果を示す。 ＴＧＦβを介したシグナル伝達の阻害がＥＲの局在化に及ぼす効果を示す。パネルＡ）（ヒト）及びパネルＢ）（マウス）では、本開示のそれぞれのオルガノイド培地にオルガノイドが形成され、次いで、ＴＧＦβシグナル伝達の異なる阻害剤に一過性に曝露させた。Ｋ８、Ｋ１４、ＥＲ及び核染色ＤＡＰＩについて染色した後に、共焦点顕微鏡によりオルガノイドを撮像した。矢印は、ＥＲ染色及びＤＡＰＩ染色の共局在を示す。 選別されていないヒト乳房上皮細胞から形成された継代１、１０日目のオルガノイドの代表的な画像を示す。オルガノイドは、外因的に付加されたＲＳＰＯ－１、ノギン、プロゲステロンまたはＥＧＦを含まないオルガノイド培地中で形成された。パネルＡ）の画像は、形成された複数のオルガノイドを捕捉するより広い焦点領域を示す。スケールバーは、１００μｍである。パネルＢ）～Ｄ）の画像は、Ｋ８、Ｋ１４及び核染色ＤＡＰＩについて染色した後に、共焦点顕微鏡によって撮像された１つの形成されたオルガノイドを、単独でまたはマージさせて示す。スケールバーは、５０μｍである。 選別されていないヒト乳房上皮細胞から形成されたオルガノイドの代表的な共焦点顕微鏡画像を示す。管腔制限オルガノイドは、５０ｎｇ／ｍｌのニューレグリン３（ＮＲＧ３）（Ａ）または１００ｎｇ／ｍｌの抗ミュラー管ホルモン（ＡＭＨ）（Ｂ）のいずれかを含むオルガノイド培地中で形成された。基底制限オルガノイドは、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）５０ｎｇ／ｍｌを含むオルガノイド培地中で形成された（Ｃ）。オルガノイドを、Ｋ８、Ｋ１４及び核染色ＤＡＰＩについて染色した。スケールバーは、１００μｍである。

本開示は、乳房オルガノイドを成長させるための培地及び方法に関する。より具体的には、本開示は、乳房上皮細胞の培養物を操作して、所望の乳腺細胞型から構成される乳房オルガノイドを予測可能かつ再現可能に生成することに関する。いくつかの実施形態では、本開示の培地中でまたは本開示の方法を実施することによって形成される乳房オルガノイドは、培地中において増殖されるかまたは継代されてよい。

本開示で使用される場合、「乳房オルガノイド（複数可）」という用語は、乳房上皮またはその特定の成分、例えば乳管のセグメントまたは終末乳管小葉単位の一般的な組織を繰り返す多細胞構造を指す。一実施形態では、乳房オルガノイドは、他のあらゆる細胞型（例えば、基底、内皮、間質、造血など）よりも多い特定の細胞型（例えば、管腔細胞）から構成されている。関連する実施形態では、そのような乳房オルガノイドは、主に、または完全に、１つの型の乳房上皮細胞で構成され得る。一実施形態では、乳房オルガノイドは、様々な型の乳房上皮細胞のよりバランスの取れた混合物から構成される。

前者の例として、「管腔オルガノイド」、「管腔制限オルガノイド」または「管腔偏向オルガノイド」は、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％またはそれ以上の管腔細胞から構成される乳房オルガノイド（本開示のオルガノイド培地を用いて形成される）である。したがって、管腔オルガノイドは、非管腔細胞よりも多い管腔細胞から構成され得る。本開示のオルガノイド培地を使用して形成される場合には、このような管腔オルガノイドは、オルガノイドの第１の集団と呼ばれ得る。一実施形態では、管腔オルガノイド（またはオルガノイドの第１の集団）は、本明細書に開示のとおりのオルガノイド培地とは異なって配合された培地を使用する場合に存在し得るよりも多い管腔細胞で構成される。

後者の例として、「混合系統オルガノイド」または「分岐型オルガノイド」は、種々の細胞の種類（例えば、基底細胞、管腔細胞、間質細胞など）から構成される乳房オルガノイドである。混合系統オルガノイドは、実質的に正常乳房組織で観察されるようにして組織化され得る。本開示のオルガノイド培地とは異なるように配合された培地を使用して形成される場合に、そのような混合系統オルガノイドは、オルガノイドの第２の集団と呼ばれ得る。したがって、オルガノイドの第２の集団のオルガノイドは、本開示のオルガノイド培地に曝露された後に、少なくともより多くの基底細胞及びより少ない管腔細胞から構成される。混合系統オルガノイドは、単離された乳房上皮細胞から出発するかまたはオルガノイドの第１の集団から出発するかにかかわらず、本開示の改変オルガノイド培地を使用して形成することができる。

本開示で使用される場合、「乳房上皮細胞」という用語は、哺乳動物の乳腺に存在し、この乳腺から単離可能な細胞を指す。一実施形態では、乳房上皮細胞は、乳房上皮幹細胞または前駆細胞を含み得る。本開示の目的のために、乳房上皮細胞は、単細胞懸濁液、乳房上皮細胞の断片の懸濁液、乳房上皮細胞の塊、または前述のものの任意の組み合わせの混合物として提供され得る。一実施形態では、乳房上皮細胞は、多能性幹細胞、例えば誘導多能性幹細胞、胚性幹細胞などから誘導される場合には、「乳房上皮様細胞」であり得る。一実施形態では、乳房上皮細胞または乳房上皮様細胞は、ヒトなどの霊長類またはマウスなどのげっ歯類に由来する。

乳房上皮細胞は、典型的には、基底細胞（例えば、Ｋ１４^＋、Ｋ５^＋、ＳＭＡ^＋、ＣＤ４９ｆ^＋、及びＫ８^－のうちの１つ以上を特徴とする細胞）及び管腔細胞を含み、ここで、管腔細胞は、ＥＲ^＋系統（例えば、Ｋ８^＋、ＥＲ^＋、Ｋ５^－、Ｋ１４^－、及びＣＤ４９ｆ^－のうちの１つ以上を特徴とする細胞）及び乳産生系統（例えば、Ｋ８^＋、ＣＤ４９ｂ^＋、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ^＋のうちの１つ以上を特徴とする細胞）にさらに細分される。一実施形態では、管腔細胞は、Ｋ８の発現（「Ｋ８^＋」）に基づいて分類され得る。一実施形態では、管腔細胞は、Ｋ８及びＫ１８の共発現に基づいて分類され得る。一実施形態では、基底細胞は、Ｋ１４の発現（「Ｋ１４^＋」）に基づいて分類され得る。一実施形態では、管腔細胞は、Ｋ１４及びＫ５の共発現に基づいて分類され得る。当業者であれば、基底細胞または管腔細胞のシグネチャは、網羅的でも排他的でもないことを理解するであろう。いくつかの場合において、異なるマーカーが、それぞれの細胞型の区別に有用であり得る。あるいは場合によっては、異なる細胞型が、おおむね同等のレベルまたは異なるレベルで、共通のマーカーを発現してもよい。

基底細胞及び管腔細胞は、例えば選別された管腔細胞集団が、適切な培養環境が使用される限り、基底細胞の最終的な出現を促進する条件下で培養され、その逆の場合も同様であるため、双能である可能性が高い。一実施形態では、適切な培養環境は、（本明細書でさらに説明されるように）任意の適切な補充培養培地を含む。

公知の方法論または公知の方法論の変形例を用いて、哺乳動物上皮細胞の調製物を得ることができる。典型的には、乳腺は、対象から切除され、メスまたは他の同様の手段を用いて物理的／機械的に破壊される。通常、酵素消化により、乳腺の結合組織などの乳腺のさらなる解離が容易になる。

一実施形態では、メスを用いて細かく刻んだ乳房組織を、コラゲナーゼ及びヒアルロニダーゼを含む溶液中で穏やかに撹拌することにより、細胞外マトリックス及び結合組織を分解することができる。生じた液体画分は、その後、１回または複数回の遠心分離に供され得る。

複数回の遠心分離を実施する場合には、各回を、段階的により高い遠心力及び／またはより長い継続時間で行ってもよく、これにより、各ステップにおけるペレットを節約することができる。一実施形態では、目的の細胞を単離するには、２～３回の遠心分離で十分である。例えば、約１００ｘｇで約０．５～１分間にわたる最初の遠心分離後に、乳房上皮細胞の断片を含むより大きなデブリがペレット中に回収され得る。約２００ｘｇで約３～５分間にわたる２回目の遠心分離の後に、ペレット中に乳房上皮細胞の塊及び個々の乳房上皮細胞を回収することができる。また、約４００ｘｇで約５分間にわたる３回目の遠心分離後、間質細胞を含む個々の細胞をペレット中に回収することができる。

いくつかの実施形態では、ペレット細胞の外観に応じて、混入した赤血球を溶解するために塩化アンモニウムで短時間処理する必要があり得る。

乳房上皮細胞の単細胞懸濁液を生成するために、第１のペレットの細胞、及び該当する場合には第２のペレットの細胞は、トリプシン含有溶液、次にＤＮａｓｅ溶液で順次処理し、任意にその後３７μｍフィルターを通した濾過によってさらに処理され得る。

いくつかの実施形態では、培養された乳房上皮細胞は、上記のように消化及び濾過後の残渣として得られるような、比較的大きい組織断片に含まれ得る。

いくつかの実施形態では、培養された乳房上皮細胞は、上記のプロセスを使用して得られる単一細胞であってよい。

いくつかの実施形態では、培養された乳房上皮細胞は、より小さいもの（例えば３７μｍのフィルターを通過するもの）及び／またはより大きいもの（例えば３７μｍのフィルターを通過しないもの）であるか否かにかかわらず、単一細胞及び組織断片の混合物であってよい。

しかしながら、処理された乳房上皮細胞は、本明細書に開示の培地（例えば、オルガノイド培地）中に及び／または本明細書に開示の方法に従って播種及び培養され得る。

培地
本開示の一態様では、乳房オルガノイドを形成または成長させるための細胞培養培地（すなわち、オルガノイド培地）が提供される。一実施形態では、本開示のオルガノイド培地は、複数の継代にわたって乳房オルガノイドを維持及び／または増殖させる。一実施形態では、オルガノイド培地は、乳房上皮細胞から乳房オルガノイドを成長させる／形成するため、及び複数の継代にわたって乳房オルガノイドを維持／増殖させるために使用され得る。

本開示で使用される場合に、用語「オルガノイド培地」とは、乳房上皮細胞の単離された調製物から乳房オルガノイドを形成及び／または成長及び／または増殖させるために使用され得る溶液を指す。さらに、そのようなオルガノイド培地は、乳房上皮細胞の単離された調製物から形成された乳房オルガノイドを継代させるために使用されてもよい。一実施形態では、オルガノイド培地は、基礎培地を含み、かつ哺乳動物細胞、特に初代上皮細胞の培養用の添加剤、例えば、塩（複数可）；緩衝液（複数可）；アミノ酸；エネルギー源（複数可）（例えば、グルコース、ピルビン酸など）；アルブミン（複数可）またはアルブミンサロゲート；微量元素；及び脂質のうちの１つ以上が適切に補充される。さらに、オルガノイド培地は、所望の系統の細胞から構成される乳房オルガノイド（乳房上皮細胞由来）の形成を偏向させるための、１つ以上の適切な低分子及び／またはサイトカインもしくは成長因子またはそれらの模倣物を含み得る。一実施形態では、そのようなオルガノイド培地はまた、乳房オルガノイドの成長／増殖を促進し得る。特定の実施形態では、オルガノイド培地は、オルガノイドの第１の集団に含まれ得る管腔オルガノイドを形成及び／または成長及び／または増殖させることを意図している。一実施形態では、同じオルガノイド培地を使用して、ヒト及びマウスの管腔オルガノイドを形成／継代させ得る。一実施形態では、異なるオルガノイド培地を使用して、ヒト及びマウスの管腔オルガノイドを形成／継代させ得る。

オルガノイド培地は、乳房上皮細胞などの上皮細胞の培養をサポートすることができる任意の公知の及び／または市販の基礎培地を使用して配合され得る。例えば、乳房上皮細胞などの上皮細胞の培養において日常的に使用される基礎培地には、ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ａｄｖ－ＤＭＥＭ、及びＡｄｖ－ＤＭＥＭ／Ｆ１２などが含まれる。一実施形態では、基礎培地は、ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ａｄｖ－ＤＭＥＭ、またはＡｄｖ－ＤＭＥＭ／Ｆ１２のいずれかである。

一方で、乳房上皮細胞の培養を偏向させて、そうでない場合に生じるよりも多くの管腔細胞で構成される管腔オルガノイドを形成することが望ましい場合には、この特定の目的のためにオルガノイド培地の配合物を最適化する必要があり得る。

一実施形態では、オルガノイド培地は、少なくとも１種の分裂促進因子を含む。少なくとも１種の分裂促進因子は、ヒト遺伝子に対応するアミノ酸配列に基づくことができる。一実施形態では、分裂促進因子は、げっ歯類種などの非ヒト遺伝子に対応するアミノ酸配列に基づくことができる。一実施形態では、分裂促進因子の起源（配列または供給源に関して）を、培養する単離された乳房上皮細胞の種起源と一致させることが適切である。いくつかの実施形態では、分裂促進因子の起源（配列または供給源に関して）を、培養する単離された乳房上皮細胞の種起源と一致させる必要はない。

一実施形態では、（管腔オルガノイドを形成及び維持するための）オルガノイド培地は、ＥＲＢＢ１のリガンドを含む。一実施形態では、ＥＲＢＢ１のリガンドは、上皮成長因子（ＥＧＦ）ではない。同一または異なる実施形態では、ＥＲＢＢ１のリガンドは、形質転換成長因子アルファ（ＴＧＦα）ではない。したがって、一実施形態では、ＥＲＢＢ１のリガンドは、ＥＧＦまたはＴＧＦα、前述のものの機能的断片または模倣体でない。

一実施形態では、ＥＲＢＢ１のリガンドは、アンフィレグリンである。そのような実施形態において、アンフィレグリンの濃度は、約１μｇ／ｍＬ～０.１ｎｇ／ｍＬ、または約５００ｎｇ／ｍＬ～０.５ｎｇ／ｍＬ、または約２５０ｎｇ／ｍＬ～１ｎｇ／ｍＬ、または約１２５ｎｇ／ｍＬ～２ｎｇ／ｍＬ、または約５０ｎｇ／ｍＬ～３ｎｇ／ｍＬであり得る。

一実施形態では、（管腔オルガノイドを形成及び維持するための）オルガノイド培地は、ＥＲＢＢ４のリガンドを含む。一実施形態では、ＥＲＢＢ４のリガンドはまた、異なるＥＲＢＢ受容体ファミリーメンバーのリガンドである。そのような実施形態では、ＥＲＢＢ４のリガンドはまた、ＥＲＢＢ３のリガンドであり得る。

一実施形態では、ＥＲＢＢ４のリガンドは、ヘレグリン（別名ニューレグリン１、二量体化ＥＲＢＢ３及びＥＲＢＢ４のリガンド）である。そのような実施形態において、ヘレグリンの濃度は、約１μｇ／ｍＬ～０.１ｎｇ／ｍＬ、または約５００ｎｇ／ｍＬ～０.５ｎｇ／ｍＬ、または約２５０ｎｇ／ｍＬ～１ｎｇ／ｍＬ、または約１２５ｎｇ／ｍＬ～２ｎｇ／ｍＬ、または約５０ｎｇ／ｍＬ～３ｎｇ／ｍＬである。一実施形態では、ＥＲＢＢ４のリガンドは、ニューレグリン３であり、これは前述の濃度範囲内でオルガノイド培地中に含まれ得る。

一実施形態では、オルガノイド培地は、ＥＲＢＢ１またはＥＲＢＢ４のリガンドの一方を含む。一実施形態では、オルガノイド培地は、ＥＲＢＢ１及びＥＲＢＢ４のリガンドの双方を含む。

一実施形態では、ＥＲＢＢ４のリガンドは、ベタセルリン、エピゲン、エピレグリン、ニューレグリン１、ニューレグリン２、ニューレグリン３、ニューレグリン４またはトモレグリンであり得る。いくつかの実施形態では、（基底または混合オルガノイドを促進及び維持するための）オルガノイド培地は、２つ以上のＥＲＢＢ４リガンドを含む。

一実施形態では、ＥＲＢＢ４のリガンドは、ニューレグリン３である。そのような実施形態において、ニューレグリン３の濃度は、約１μｇ／ｍＬ～０.１ｎｇ／ｍＬ、または約５００ｎｇ／ｍＬ～０.５ｎｇ／ｍＬ、または約２５０ｎｇ／ｍＬ～１ｎｇ／ｍＬ、または約１２５ｎｇ／ｍＬ～２ｎｇ／ｍＬ、または約５０ｎｇ／ｍＬ～３ｎｇ／ｍＬである。一実施形態では、ニューレグリン３の濃度は、約５０ｎｇ／ｍＬである。

タンパク質、ペプチドまたは低分子リガンドを用いて特定のシグナル伝達カスケードを活性化及び／または阻害することが重要であり得るのと同様に、他のシグナル伝達カスケードを活性化及び／または阻害しないようにすることも重要であり得る。

したがって、一実施形態では、（管腔オルガノイドを形成及び維持するための）オルガノイド培地は、外因的に付加されたＷＮＴシグナル伝達アゴニスト及びＢＭＰシグナル伝達の調節因子（例えば、活性化剤または阻害剤）のうちの一方または両方を含まない。

一実施形態では、オルガノイド培地には含まれないＷＮＴシグナル伝達アゴニストは、Ｒ－スポンジン、ＷＮＴタンパク質、または上記のいずれかの操作された模倣物である。ＷＮＴシグナル伝達アゴニストは、特定の上皮性オルガノイドの培養において使用されるが、本発明者らは、本開示のオルガノイド培地中にＷＮＴシグナル伝達アゴニストを含めることは、管腔オルガノイドの形成、成長の促進、及び維持にとって不要であり、または有害であり得ることを示した。また、ＷＮＴシグナル伝達アゴニストをオルガノイド培地に含むことによって、混合系統オルガノイドの形成／成長を促進／維持することもできる。

一実施形態では、オルガノイド培地から除外されるＲ－スポンジンは、Ｒ－スポンジン１、Ｒ－スポンジン２、Ｒ－スポンジン３、またはＲ－スポンジン４のうちの１つ以上である。一実施形態では、オルガノイド培地から除外されるＲ－スポンジンは、Ｒ－スポンジン１、Ｒ－スポンジン２、Ｒ－スポンジン３、またはＲ－スポンジン４のそれぞれである。したがって、管腔オルガノイドを促進及び維持するために、オルガノイド培地に添加されるＲ－スポンジンの濃度は、０ｎｇ／ｍＬ、または実質的に０ｎｇ／ｍＬである。

一実施形態では、オルガノイド培地から除外されるＷＮＴタンパク質は、ＷＮＴ１、ＷＮＴ２、ＷＮＴ２Ｂ、ＷＮＴ３、ＷＮＴ３Ａ、ＷＮＴ４、ＷＮＴ５Ａ、ＷＮＴ５Ｂ、ＷＮＴ６、ＷＮＴ７Ａ、ＷＮＴ７Ｂ、ＷＮＴ８Ａ、ＷＮＴ８Ｂ、ＷＮＴ９Ａ、ＷＮＴ９Ｂ、ＷＮＴ１０Ａ、ＷＮＴ１０Ｂ、ＷＮＴ１１、またはＷＮＴ１６のうちの１つ以上である。別の実施形態では、オルガノイド培地から除外されるＷＮＴタンパク質は、ＷＮＴ１、ＷＮＴ２、ＷＮＴ２Ｂ、ＷＮＴ３、ＷＮＴ３Ａ、ＷＮＴ４、ＷＮＴ５Ａ、ＷＮＴ５Ｂ、ＷＮＴ６、ＷＮＴ７Ａ、ＷＮＴ７Ｂ、ＷＮＴ８Ａ、ＷＮＴ８Ｂ、ＷＮＴ９Ａ、ＷＮＴ９Ｂ、ＷＮＴ１０Ａ、ＷＮＴ１０Ｂ、ＷＮＴ１１、またはＷＮＴ１６のうちのそれぞれである。したがって、管腔オルガノイドを促進及び維持するために、オルガノイド培地に添加されるＷＮＴタンパク質の濃度は、０ｎｇ／ｍＬ、または実質的に０ｎｇ／ｍＬである。

合成生物学における進歩により、タンパク質ベース、ペプチドベースまたは低分子ベースのリガンド模倣物のｉｎ ｓｉｌｉｃｏデザインが可能となった。このような模倣物の利点としては、限定されるものではないが、活性の増加、安定性の増加、構造の単純化、サイズの減少などが挙げられる。したがって、いくつかの実施形態では、ＷＮＴまたはＲ－スポンジンの機能（例えばその模倣物によるもの）は、本開示のオルガノイド培地には存在しない。

例えば、典型的な組換えＷＮＴタンパク質は、培養培地に添加された場合、恐らく疎水性が高いことで急速に分解するため、効果はほとんどまたは全くない。この課題を解決するために、標準的なＦＺＤ媒介ＷＮＴ経路アゴニストを、培養培地に添加した場合に許容される生物学的活性を保持しながら、野生型Ｗｎｔ３ａよりも強力になるように操作した（Ｕ－Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ）。

一実施形態では、オルガノイド培地に含まれないＢＭＰシグナル伝達の調節因子は、ＢＭＰ受容体を介したシグナル伝達を阻害するタンパク質、ペプチドまたは低分子である。一実施形態では、オルガノイド培地に含まれないＢＭＰシグナル伝達の調節因子は、ＢＭＰ受容体を介したシグナル伝達を活性化するタンパク質、ペプチドまたは低分子である。ＢＭＰシグナル伝達の調節因子は、特定の上皮性オルガノイドを培養するために一般的に使用されるが、本発明者らは、本開示のオルガノイド培地中にＢＭＰシグナル伝達の特定の調節因子（複数可）を含めることは、管腔オルガノイドの促進及び維持にとって不要または有害であり得ることを示している。

一実施形態では、（管腔オルガノイドを促進／維持するための）オルガノイド培地から除外されるＢＭＰシグナル伝達の阻害剤は、タンパク質またはペプチドである。そのような除外されるタンパク質（または機能的に同等のペプチド）は、ノギン、コーディン、フォリスタチン、スクレロスチン、ＣＴＧＦ／ＣＣＮ２、グレムリン（ｇｒｅｍｌｉｎ）、ケルベロス（Ｃｅｒｂｅｒｕｓ）、ＤＡＮ、ＰＲＤＣ、デコリン、アルファ－２マクログロブリンタンパク質などのうちの１つ以上であってもよい。一実施形態では、オルガノイド培地から除外されるＢＭＰシグナル伝達阻害剤は、ノギン、コーディン、フォリスタチン、スクレロスチン、ＣＴＧＦ／ＣＣＮ２、グレムリン、ケルベロス、ＤＡＮ、ＰＲＤＣ、デコリン、及びアルファ－２マクログロブリンタンパク質のそれぞれである。したがって、管腔オルガノイドを促進及び維持するためのオルガノイド培地中のＢＭＰシグナル伝達の阻害剤の有効濃度は、０ｎｇ／ｍＬ、または実質的に０ｎｇ／ｍＬである。

一実施形態では、（管腔オルガノイドを促進／維持するための）オルガノイド培地から除外されるＢＭＰシグナル伝達の阻害剤は、低分子である。このような除外される低分子は、ＬＤＮ１９３１８９またはドルソモルフィンであり得る。一実施形態では、オルガノイド培地から除外されるＢＭＰシグナル伝達の阻害剤は、ＬＤＮ１９３１８９及びドルソモルフィンの各々である。したがって、管腔オルガノイドを促進及び維持するためのオルガノイド培地中のＢＭＰシグナル伝達阻害剤の有効濃度は、０ｎｇ／ｍＬ、または実質的に０ｎｇ／ｍＬである。

一実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達の活性化剤は、ＢＭＰ２もしくはＢＭＰ４などのタンパク質またはそれらのペプチドであり得る。

ＢＭＰシグナル伝達の多くの調節因子が知られており、それらが調節する経路に基づいて、器官培地に包含するまたは包含しない特定の調節因子を選択することが重要であり得る。オルガノイド培地のいくつかの実施形態では、ＢＭＰを介したシグナル伝達の２つ以上の異なる調節因子を含むことにより、管腔オルガノイドの最適な形成及び維持を達成することができる。一実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達の複数の阻害剤またはＢＭＰシグナル伝達の複数の活性化剤がオルガノイド培地に含まれ得る。一実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達の活性化剤及び阻害剤の両方が、オルガノイド培地に含まれ得る。ＢＭＰシグナル伝達阻害剤またはＢＭＰシグナル伝達活性化剤またはこれら２つの組み合わせを含む任意の実施形態では、調節された特定のＢＭＰ経路は、管腔オルガノイドの形成にとって重要な考慮事項であり得る。

一実施形態では、管腔オルガノイドを形成／維持するためのオルガノイド培地は、ＥＲＢＢ１及びＥＲＢＢ４リガンドの両方を含み、かつ外因的に付加されたＷＮＴシグナル伝達アゴニスト及びＢＭＰシグナル伝達の阻害剤（または前述のいずれかの模倣物）の一方または両方を含まない。

一実施形態では、オルガノイド培地は、ＢＭＰシグナル伝達の阻害剤を含むが、外因的に付加されたＷＮＴシグナル伝達アゴニストは含まない。一実施形態では、オルガノイド培地は、ＷＮＴシグナル伝達アゴニストを含むが、外因的に付加されたＢＭＰシグナル伝達の阻害剤は含まない。

管腔オルガノイドの形成を偏向させるまたは促進することは、オルガノイド培地中で乳房上皮細胞を培養することにより、（例えば、オルガノイド培地とは異なる培地中で単離された乳房上皮細胞からオルガノイドを形成することと比較して）非管腔細胞よりも多い管腔細胞から構成されるオルガノイドが濃縮されることを意味し得る。一実施形態では、オルガノイド培地中に形成された管腔オルガノイドは、７０％超の管腔細胞と、約２０％以下の基底細胞とを含む。一実施形態では、オルガノイド培地中に形成された管腔オルガノイドは、８０％超の管腔細胞と、約１５％以下の基底細胞とを含む。一実施形態では、オルガノイド培地中に形成された管腔オルガノイドは、約９０％以上の管腔細胞と、約５％以下の基底細胞とを含む。

他方で、管腔オルガノイド（すなわち、オルガノイドの第１の集団）の形成をむしろ、例えば混合系統オルガノイド（すなわち、オルガノイドの第２の集団）に変換することが所望される場合、この目的のために改変オルガノイド培地が使用され得る。一実施形態では、改変オルガノイド培地は、分裂促進因子、ＷＮＴシグナル伝達のアゴニスト、またはＢＭＰシグナル伝達の調節因子のうちの１つ以上、または２つ以上を含み得る。

一実施形態では、（混合系統オルガノイドを形成及び維持するための）改変オルガノイド培地は、ＥＲＢＢ１、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、またはＥＲＢＢ４のうちの１つ以上の、１つ以上のリガンドを含む。

一実施形態では、ＥＲＢＢ１のリガンドは、上皮成長因子（ＥＧＦ）、形質転換成長因子アルファ（ＴＧＦα）、アンフィレグリン、ヘパリン結合ＥＧＦ（ＨＢ－ＥＧＦ）、ベタセルリン、エピゲン、またはエピレグリンであってもよい。いくつかの実施形態では、改変オルガノイド培地は、２つ以上のＥＲＢＢ１リガンドを含み得る。

一実施形態では、ＥＲＢＢ１のリガンドは、ＥＧＦ及び／またはＴＧＦα及び／またはアンフィレグリンである。そのような実施形態において、そのようなＥＲＢＢ１のリガンド（複数可）の濃度は、約１μｇ／ｍＬ～０．１ｎｇ／ｍＬ、または約５００ｎｇ／ｍＬ～０．５ｎｇ／ｍＬ、または約２５０ｎｇ／ｍＬ～１ｎｇ／ｍＬ、または約１２５ｎｇ／ｍＬ～２ｎｇ／ｍＬ、または約５０ｎｇ／ｍＬ～３ｎｇ／ｍＬであり得る。

一実施形態では、改変オルガノイド培地に含まれるＥＲＢＢ３のリガンドは、ニューレグリン１、ニューレグリン２、またはニューログリカンＣのうちの１つ以上であり得る。いくつかの実施形態では、（混合系統オルガノイドを形成及び維持するための）改変オルガノイド培地は、２つ以上のＥＲＢＢ３リガンドを含み得る。

一実施形態では、ＥＲＢＢ３のリガンドは、ニューレグリン１である。そのような実施形態において、ニューレグリン１の濃度は、約１μｇ／ｍＬ～０．１ｎｇ／ｍＬ、または約５００ｎｇ／ｍＬ～０．５ｎｇ／ｍＬ、または約２５０ｎｇ／ｍＬ～１ｎｇ／ｍＬ、または約１２５ｎｇ／ｍＬ～２ｎｇ／ｍＬ、または約５０ｎｇ／ｍＬ～３ｎｇ／ｍＬである。

一実施形態では、改変オルガノイド培地に含まれるＷＮＴシグナル伝達アゴニストは、Ｒ－スポンジン、ＷＮＴタンパク質、または上記のいずれかの操作された模倣物である。ＷＮＴシグナル伝達アゴニストを改変オルガノイド培地に、単独で、または他の因子と組み合わせて含めることで、管腔オルガノイドの形成／維持を抑制し得、乳房上皮細胞の培養が混合系統オルガノイド（例えば、オルガノイドの第２の集団）に偏向する可能性がある。

一実施形態では、改変オルガノイド培地に含まれるＲ－スポンジンは、Ｒ－スポンジン１、Ｒ－スポンジン２、Ｒ－スポンジン３、またはＲ－スポンジン４のうち１つ以上である。一実施形態では、改変オルガノイド培地に含まれるＲ－スポンジンは、Ｒ－スポンジン１、Ｒ－スポンジン２、Ｒ－スポンジン３、またはＲ－スポンジン４である。したがって、混合系統オルガノイドを形成及び維持するための改変オルガノイド培地中のＲ－スポンジンの有効濃度は、１μｇ／ｍＬ～０．１ｎｇ／ｍＬ、または約５００ｎｇ／ｍＬ～０．５ｎｇ／ｍＬ、または約２５０ｎｇ／ｍＬ～１ｎｇ／ｍＬ、または約１２５ｎｇ／ｍＬ～２ｎｇ／ｍＬ、または約５０ｎｇ／ｍＬ～３ｎｇ／ｍＬである。

一実施形態では、改変オルガノイド培地に含まれるＷＮＴタンパク質は、ＷＮＴ１、ＷＮＴ２、ＷＮＴ２Ｂ、ＷＮＴ３、ＷＮＴ３Ａ、ＷＮＴ４、ＷＮＴ５Ａ、ＷＮＴ５Ｂ、ＷＮＴ６、ＷＮＴ７Ａ、ＷＮＴ７Ｂ、ＷＮＴ８Ａ、ＷＮＴ８Ｂ、ＷＮＴ９Ａ、ＷＮＴ９Ｂ、ＷＮＴ１０Ａ、ＷＮＴ１０Ｂ、ＷＮＴ１１、またはＷＮＴ１６のうちの１つ以上である。したがって、混合系統オルガノイドを形成及び維持するための改変オルガノイド培地中のＷＮＴタンパク質の有効濃度は、１μｇ／ｍＬ～０．１ｎｇ／ｍＬ、または約５００ｎｇ／ｍＬ～０．５ｎｇ／ｍＬ、または約２５０ｎｇ／ｍＬ～１ｎｇ／ｍＬ、または約１２５ｎｇ／ｍＬ～２ｎｇ／ｍＬ、または約５０ｎｇ／ｍＬ～３ｎｇ／ｍＬである。

Ｗｎｔ３ａは、細胞培養培地中で不安定であり得るか、または細胞培養条件下で使用される場合があるため、いくつかの実施形態では、Ｗｎｔ３ａ馴化培地は、本開示の改変オルガノイド培地中のＷｎｔ３ａの適切な代替物であり得る。ＷＮＴ馴化培地は、ＷＮＴ産生細胞の培養などによるなど、公知のアプローチを用いて生成することができる。ＷＮＴ馴化培地中のＷＮＴの濃度は、典型的には上記で概説した濃度と同等である。

合成生物学の進歩により、リガンド模倣物のｉｎ ｓｉｌｉｃｏデザインが可能になった。このような模倣物の利点としては、限定されるものではないが、活性の増加、安定性の増加、構造の単純化、サイズの減少などが挙げられる。したがって、いくつかの実施形態では、模倣物を介したＷＮＴまたはＲ－スポンジン機能が、本開示のオルガノイド培地中に存在する。

例えば、典型的な組換えＷＮＴタンパク質は、培養培地に添加された場合、恐らく疎水性が高いことで急速に分解するため、効果はほとんどまたは全くない。この課題を解決するために、標準的なＦＺＤ媒介ＷＮＴ経路アゴニストを、培養培地に添加した場合に許容される生物学的活性を保持しながら、野生型Ｗｎｔ３ａよりも強力になるように操作した（Ｕ－Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ）。

一実施形態では、ＷＮＴ模倣物が、管腔オルガノイドの形成／維持を抑制しながら混合系統オルガノイドの形成／維持を促進するための改変オルガノイド培地に含まれる。一実施形態では、ＷＮＴ模倣物は、そのような培地中に単独でまたはＷＮＴシグナル伝達の１種以上の他のアゴニストと共に含まれてよい。実施形態において、ＷＮＴ模倣物がそのような培地中に含まれる場合、ＷＮＴ模倣物は、ＷＮＴサロゲート－ＦＣ融合タンパク質であり得る。ＷＮＴ模倣物が、管腔オルガノイドの形成／維持を抑制しながら基底または混合オルガノイドの形成／維持を促進するための改変オルガノイド培地に含まれる場合、ＷＮＴ模倣物の濃度は、約１００ｎＭ～０ｎＭ、約５０ｎＭ～０．０１ｎＭ、約２０ｎＭ～０．０５ｎＭ、または約１０ｎＭ～０．１ｎＭであり得る。

一実施形態では、管腔オルガノイドの形成／維持を抑制しつつ、混合系統オルガノイドの形成／維持を促進するための改変オルガノイド培地に含まれるＢＭＰシグナル伝達の調節因子は、タンパク質、ペプチドまたは低分子である。一実施形態では、このような調節因子は、ＢＭＰシグナル伝達の活性化剤または阻害剤であり得る。

改変オルガノイド培地がＢＭＰシグナル伝達の活性化剤を含む実施形態では、そのような活性化剤の例としては、ＢＭＰ２またはＢＭＰ４などが挙げられる。したがって、改変オルガノイド培地中でのＢＭＰシグナル伝達の活性化剤の有効濃度は、約１０μｇ／ｍＬ～０．１ｎｇ／ｍＬ、または約１μｇ／ｍＬ～１ｎｇ／ｍＬ、または約３００ｎｇ／ｍＬ～３ｎｇ／ｍＬ、または約１５０ｎｇ／ｍＬ～５ｎｇ／ｍＬ、または約１００ｎｇ／ｍＬ～１０ｎｇ／ｍＬ、または約５０ｎｇ／ｍＬ～１０ｎｇ／ｍＬであり得る。

改変オルガノイド培地がＢＭＰシグナル伝達の阻害剤を含む実施形態では、そのようなタンパク質（またはペプチドベースの）阻害剤の例としては、ノギン、コーディン、フォリスタチン、スクレロスチン、ＣＴＧＦ／ＣＣＮ２、グレムリン、ケルベロス、ＤＡＮ、ＰＲＤＣ、デコリン、アルファ－２マクログロブリンタンパク質などが挙げられる。したがって、改変オルガノイド培地中でのＢＭＰシグナル伝達の阻害剤の有効濃度は、約１０μｇ／ｍＬ～０．１ｎｇ／ｍＬ、または約１μｇ／ｍＬ～１ｎｇ／ｍＬ、または約３００ｎｇ／ｍＬ～３ｎｇ／ｍＬ、または約１５０ｎｇ／ｍＬ～５ｎｇ／ｍＬ、または約１００ｎｇ／ｍＬ～１０ｎｇ／ｍＬ、または約５０ｎｇ／ｍＬ～１０ｎｇ／ｍＬであり得る。

改変オルガノイド培地がＢＭＰシグナル伝達の阻害剤を含む実施形態では、そのような低分子阻害剤の例としては、ＬＤＮ１９３１８９またはドルソモルフィンが挙げられる。改変オルガノイド培地に含まれるＢＭＰシグナル伝達のそのような阻害剤は、約１ｍＭ～０.００１ｎＭ、約１μＭ～０.１ｎＭ、約１００ｎＭ～１ｎＭであり得る。

一実施形態では、オルガノイド培地は、タンパク質／ペプチドベースまたは低分子（またはこれら２つの組み合わせ）である、ＢＭＰシグナル伝達の阻害剤を含み得、したがって、改変オルガノイド培地は、ＢＭＰシグナル伝達の活性化剤またはアゴニストを含み得るか、またはその逆も可能である。

したがって、一実施形態では、管腔オルガノイドの形成／維持を抑制し、かつ混合系統オルガノイドの形成／維持を促進するための改変オルガノイド培地は、少なくとも１つのＥＲＢＢリガンド、少なくとも１つのＷＮＴシグナル伝達のアゴニスト、及び少なくとも１つのＢＭＰシグナル伝達の調節因子のうちの２つ以上を含む。

本開示の別の態様では、乳房オルガノイドを形成するための構成要素を含むキットが提供される。一実施形態では、マウス乳房オルガノイドを形成するために、ヒト乳房オルガノイドを形成するために使用されるものとは異なるキットが使用される。培地組成物に関する上記の記載は、以下のキットの記載に組み込まれる。

本開示のキットは、基礎培地と、基礎培地に添加される少なくとも１種の補充物を含む。一実施形態では、本開示のキットは、基礎培地と、基礎培地に添加される少なくとも２種の補充物とを含む。一実施形態では、本開示のキットは、基礎培地と、基礎培地に添加される３種以上の補充物とを含む。

特定のタイプの乳房オルガノイドを形成することが望ましい場合には、任意の特定の補充物を基礎培地と組み合わせてもよい。例えば、オルガノイドの第１の集団（例えば、管腔制限オルガノイドまたは管腔偏向オルガノイド）を形成することが望ましい場合には、基礎培地に添加される第１の補充物は、ＥＲＢＢ１のリガンド及びＥＲＢＢ４のリガンドの一方または両方を含み得る。いくつかの実施形態では、第１の補充物はまた、外因的に付加されたＷＮＴシグナル伝達アゴニスト及びＢＭＰシグナル伝達の調節因子の一方または両方を含まない。このような実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達の調節因子は、ＢＭＰシグナル伝達の活性化剤または阻害剤であり得る。関連する実施形態では、第１の補充物は、ＥＲＢＢ１のリガンド及びＥＲＢＢ４のリガンドの一方または両方、ならびにＢＭＰシグナル伝達の調節因子のうち一方または両方を含み、ＷＮＴシグナル伝達アゴニストを含まない。関連する実施形態では、第１の補充物は、ＥＲＢＢ１のリガンド及びＥＲＢＢ４のリガンドの一方または両方、ならびにＷＮＴシグナル伝達アゴニストを含み、ＢＭＰシグナル伝達の調節因子を含まない。関連する実施形態では、第１の補充物は、ＥＲＢＢ１のリガンド及びＥＲＢＢ４のリガンドの一方または両方を含み、ＷＮＴシグナル伝達アゴニスト及びＢＭＰシグナル伝達の調節因子を両方とも含まない。一実施形態では、ＥＲＢＢ１のリガンドは、ＥＧＦではない。一実施形態では、基礎培地または第１の補充物はいずれも、プロゲステロンを含まない。

キットは、形成されたオルガノイドの第１の集団（例えば、管腔制限または管腔偏向オルガノイド集団）をオルガノイドの第２の集団（例えば、混合オルガノイド）に変換させるために、基礎培地に添加される第２の補充物をさらに含み得る。第２の補充物を補充した（かつ任意により第１の補充物も補充した）基礎培地は、本明細書では改変オルガノイド培地と呼ばれる。第２の補充物の実施形態では、これはＷＮＴシグナル伝達アゴニスト及びＢＭＰシグナル伝達調節因子の一方または両方を含み得る。このような実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達の調節因子は、ＢＭＰシグナル伝達の活性化剤または阻害剤であり得る。関連する実施形態では、第２の補充物に含まれるＢＭＰシグナル伝達調節因子は、ＢＭＰ２またはＢＭＰ４などのＢＭＰシグナル伝達の活性化剤である。関連する実施形態では、第２の補充物は、第１の補充物に含まれるＥＲＢＢ１のリガンドとは異なるＥＲＢＢ１のリガンドをさらに含み得る。一実施形態では、第２の補充物に含まれるＥＲＢＢ１のリガンドは、ＥＧＦである。

キットは、基礎培地に添加される第３の補充物をさらに含んでもよい（第１の補充物及び第２の補充物の一方または両方が存在しているかまたは存在していない）。第３の補充物は、ＴＧＦβシグナル伝達の阻害剤を含み得る。一実施形態では、第３の補充物は、目的の乳房オルガノイドが形成された後に基礎培地（またはオルガノイド培地または改変オルガノイド培地）に添加されて、エストロゲン受容体の核局在化を促進する。一実施形態では、ＴＧＦβシグナル伝達の阻害剤は、ＳＢ４３１５４２である。一実施形態では、ＴＧＦβシグナル伝達の阻害剤は、ＲｅｐＳｏｘである。

上記の培地（キットに含まれる実施形態など）はいずれも、乳房オルガノイドを形成及び／または維持する方法において使用することができ、それにより形成及び／または維持され得る乳房オルガノイドの種類は、培地の配合（例えば、オルガノイド培地対改変オルガノイド培地）に依存する。乳房上皮細胞及びそれから生じるオルガノイドは、性ホルモン応答性であるため、いくつかの実施形態では、本開示の培地（例えば、基礎培地、オルガノイド培地、及び改変オルガノイド培地）及びそれに添加される補充物は、方法において使用されるか、またはキットに組み込まれる場合でも、外因的に添加された性ホルモンを含まないことが望ましい場合がある。一実施形態では、性ホルモンは、エストロゲンである。一実施形態では、性ホルモンは、プロゲステロンである。

方法
本開示の別の態様では、乳房オルガノイドを形成または成長させるための方法が提供される。一実施形態では、本開示の方法は、複数の継代にわたって乳房オルガノイドを維持及び／または増殖させる。開示された方法に従って形成／増殖／継代された乳房オルガノイドは、正常な状態及び疾患の状態の両方における乳腺の生物学をより深く理解するためなどの下流のアッセイ、薬物スクリーニング及び毒性試験、または治療用途などに使用され得る。

単離された乳房上皮細胞から乳房オルガノイド、及び特にオルガノイドの第１の集団を形成する方法は、乳房上皮細胞を、外因的に付加されたＷＮＴシグナル伝達アゴニスト及び／またはＢＭＰシグナル伝達の調節因子の一方または両方を含まないオルガノイド培地と接触させることを含む。このような実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達の調節因子は、ＢＭＰシグナル伝達の阻害剤であり得るか、またはＢＭＰシグナル伝達の活性化剤であり得る。

一実施形態では、方法は、ＢＭＰシグナル伝達の調節因子（例えば、ＢＭＰシグナル伝達の阻害剤または活性化剤）を含むが、ＷＮＴシグナル伝達アゴニストを含まないオルガノイド培地を用いる。一実施形態では、本方法は、ＷＮＴシグナル伝達アゴニストを含むが、ＢＭＰシグナル伝達の調節因子（例えば、ＢＭＰシグナル伝達の阻害剤または活性化剤）を含まないオルガノイド培地を使用する。一実施形態では、本方法は、ＢＭＰシグナル伝達の調節因子（例えば、ＢＭＰシグナル伝達の阻害剤または活性化剤）もＷＮＴシグナル伝達アゴニストも含まないオルガノイド培地を使用する。

一実施形態では、乳房上皮細胞は、乳房上皮幹細胞または前駆細胞を含む。

単離された乳房上皮細胞は、任意の哺乳動物種のものであり得る。一実施形態では、乳房上皮細胞は、ヒト乳房上皮細胞またはマウス乳房上皮細胞のいずれかである。単離された乳房上皮細胞は、市販の供給者、学術的協力者から、または乳房組織を処理することによって得られ得る。乳房組織から出発する場合、このような試験片は、通常、機械的／物理的及び酵素的手段の組み合わせを使用して処理される。

本明細書に記載されるように、乳房上皮細胞の単細胞懸濁液または乳房上皮細胞の断片または塊の懸濁液は、典型的には、メスまたは組織解離器などを使用して乳房組織を切断することによって生成される。切断操作後、または切断操作中、乳房組織は、典型的には、細胞外マトリックス及び結合組織を分解するために、酵素含有溶液中でインキュベートされる。酵素溶液は、乳房組織を処理する目的で有用な任意の酵素または酵素の組み合わせを含むことができる。非限定的な例として、この目的のために使用され得る酵素としては、コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ、ジパーゼ、サーモリシン、トリプシン、ＤＮａｓｅなどが挙げられる。

一実施形態では、細かく刻んだ乳房組織の酵素処理は、連続的に適用される。例えば、細かく刻んだ乳房組織は、最初に、コラゲナーゼ及びヒアルロニダーゼの一方または両方を含む溶液中でインキュベートされてもよい。消化された乳房組織のより大きい断片は、比較的低い遠心力（例えば＜２００ｘｇ）で遠心分離により収集され、取り置かれてもよい。細胞の塊または単細胞を含む比較的小さい物質を単離するために、得られる上清は、徐々に高い遠心力（例えば、≧２００ｘｇ）でさらに遠心分離することができる。両方のペレットを組み合わせ、トリプシン含有溶液中でさらに消化させ、実質的に単細胞の懸濁液を得ることができる。

いくつかの実施形態では、実質的に単細胞もしくは断片の懸濁液、または単細胞と断片との混合物は、溶解された細胞からＤＮＡを分解して、細胞懸濁液の粘度を低下させるためにＤＮａｓｅ処理を必要とし得る。

乳腺上皮細胞の懸濁液を生成した後、特にその中に単細胞が含まれている場合、サンプル中の様々な細胞型の状態から乳房上皮細胞の特定のサブセットを分離することが望ましい場合がある。乳房上皮細胞の特定のサブセットは、ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって市販されているように、蛍光活性化細胞選別または免疫磁気細胞分離などの既知の方法を使用して、サンプルから分離され得る。

乳腺の細胞組成物は、上皮細胞及び非上皮細胞（線維芽細胞、内皮細胞、リンパ球細胞、脂肪細胞、ニューロン及び筋細胞）の両方を含む。対応する細胞型間のマーカーの発現は、ヒトとマウスとで異なり得る。ヒトでは、上皮細胞は、ＥｐＣＡＭの発現により非上皮細胞と区別され得る。ＥｐＣＡＭ^＋上皮コンパートメント内では、乳房上皮は、２つの主要な系統、すなわち管腔系統及び筋上皮（または基底）系統を含む。筋上皮細胞は、典型的にはｉ）サイトケラチン５（Ｋ５）、サイトケラチン１４（Ｋ１４）、Ｐ６３、平滑筋アクチン（ＳＭＡ）、ＣＤ４９ｆ及びＣＤ２９の高発現；ならびにｉｉ）サイトケラチン８（Ｋ８）、サイトケラチン（Ｋ１８）及びＣＤ２４が不在であることを特徴とする。一方、管腔系統は、２つの亜集団、すなわち乳前駆細胞とホルモン応答性ＥＲ^＋系統とに分けることができる。ＥＲ^＋系統は、ｉ）Ｋ８、Ｋ１８、エストロゲン受容体アルファ（ＥＲα）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）の高発現、ならびにｉｉ）Ｋ５、Ｋ１４、ＣＤ４９ｆ及びＳＭＡが不在であることによって区別され得る。乳系統は、ｉ）ＡＬＤＨ１Ａ３発現を示すＡＬＤＥＦＬＵＯＲ染色陽性、ｉｉ）Ｋ８、Ｋ１８及びＣＤ４９ｆの発現、ｉｉｉ）Ｋ５及びＫ１４の発現、ならびにｉｖ）ＥＲα及びＳＭＡが不在であることによって区別され得る。マウスでは、上皮細胞は、ＥｐＣＡＭまたはＣＤ２４の発現により非上皮細胞と区別され得る。ＥｐＣＡＭ^＋上皮コンパートメント内では、乳房上皮は、２つの主要な系統、すなわち管腔系統及び筋上皮（または基底）系統を含む。筋上皮細胞は、典型的にはｉ）サイトケラチン５（Ｋ５）、サイトケラチン１４（Ｋ１４）、Ｐ６３、平滑筋アクチン（ＳＭＡ）、ＣＤ４９ｆ及びＣＤ２９の高発現；ならびにｉｉ）サイトケラチン８（Ｋ８）、サイトケラチン（Ｋ１８）が不在であることを特徴とする。一方、管腔系統は、２つの亜集団、すなわち乳前駆細胞とホルモン応答性ＥＲ^＋系統とに分けることができる。ＥＲ^＋系統は、ｉ）Ｋ８、Ｋ１８、エストロゲン受容体アルファ（ＥＲα）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）の高発現、ならびにｉｉ）Ｋ５、Ｋ１４、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ４９ｂ及びＳＭＡが不在であることによって区別され得る。乳系統は、ｉ）ＡＬＤＨ１Ａ３の発現を示す、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ染色陽性；ｉｉ）Ｋ８、Ｋ１８、ＣＤ４９ｂ、及びＣＤ４９ｆの発現；ｉｉｉ）Ｋ５、Ｋ１４、ＥＲα、及びＳＭＡの低発現によって区別され得る。場合によっては、ＳＭＡ及びＥＲ＋の一方または両方が存在することまたは存在しないことは、基底細胞と管腔細胞とをさらに区別する助けとなり得る。

いくつかの実施形態では、単離された乳房上皮細胞は、細胞外マトリックスを用いて培養される。一実施形態では、単離された乳房上皮細胞は、細胞外マトリックスの「ドーム」内に播種される。一実施形態では、単離された乳房上皮細胞は、細胞外マトリックスの「サンドイッチ」内に播種され、細胞は、細胞外マトリックスの層上に播種され、次いで、同じまたは異なる細胞外マトリックスの被覆層によって覆われる。一実施形態では、単離された乳房上皮細胞は、細胞外マトリックスの層の上に播種される。

乳房上皮細胞を培養するための細胞外マトリックスが知られており、本開示では任意の適切な細胞外マトリックスが企図される。一実施形態では、細胞外マトリックスは、マトリゲル（商標）（Ｃｏｒｎｉｎｇ）である。一実施形態では、細胞外マトリックスは、Ｃｕｌｔｒｅｘ（登録商標）基底膜マトリックス（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ）などのマトリゲルの好適な代替物であり得る。

一実施形態では、細胞外マトリックスは、細胞外マトリックスの１つの天然成分であっても、またはそれらの任意の組み合わせであってもよい。細胞外マトリックスの天然成分の例としては、コラーゲン、ラミニン、エンタクチン、ヘパリン硫酸塩、プロテオグリカン、またはフィブロネクチンが挙げられる。

一実施形態では、細胞外マトリックスは、合成マトリックス、例えば上で概説した天然の細胞外成分のうちのいずれか１つ以上を配合したヒドロゲルであり得る。

細胞外マトリックスの層上、または特定の体積の細胞外マトリックス内に播種される乳房上皮細胞の密度は、経験的に決定される。乳房上皮細胞が２４ウェルプレートの底で細胞外マトリックスの「ドーム」内に播種される実施形態では、３０～５０μＬのドーム内に約１，０００～５０，０００個の任意の数の細胞を含めることができる。異なるプレートフォーマットを用いた場合、細胞数及び細胞外マトリックスの体積を調整する必要があり得る。それにもかかわらず、１つの細胞または細胞のクローン密度まで、細胞外マトリックス上または細胞外マトリックス中に播種できることを理解されたい。

本明細書で先に記載したように、オルガノイド培地の性質は、本明細書に開示された方法の意図されるアウトプットに依存するであろう。したがって、上記のオルガノイド培地の説明は、乳房オルガノイドを形成する方法に関する以下の開示に組み込まれる。

方法の所望のアウトプットが、オルガノイドの第１の集団（例えば、管腔オルガノイド）である場合には、オルガノイド培地は、基礎培地と、ＥＲＢＢ１のリガンド及び／またはＥＲＢＢ４のリガンドの一方または両方とを含み得る（加えて、外因的に付加されたＷＮＴシグナル伝達アゴニスト及び／またはＢＭＰシグナル伝達の調節因子（例えば、阻害剤または活性化剤）の一方または両方を含まない）。

オルガノイド培地に含まれ得るＥＲＢＢ１及びＥＲＢＢ４の潜在的リガンドは、本明細書の上記に記載している。一実施形態では、ＥＲＢＢ１のリガンドは、アンフィレグリンである。一実施形態では、ＥＲＢＢ４のリガンドは、ニューレグリン１である。管腔オルガノイドの形成及び／または維持を促進するためのオルガノイド培地の一実施形態では、培地は、ＥＲＢＢ１のリガンド及びＥＲＢＢ４のリガンドの両方を含む。一実施形態では、ＥＲＢＢ１のリガンドは、ＥＧＦまたはＴＧＦアルファではない。一実施形態では、ＥＲＢＢ１のリガンドは、ＥＧＦまたはＴＧＦアルファのいずれでもない。

また、上記のとおり、管腔オルガノイドの形成及び／または維持を促進するためのオルガノイド培地を配合する場合に重要な考慮すべき点は、特定のシグナル伝達カスケードを活性化または阻害しないようにすることである。したがって、このようなオルガノイド培地の一実施形態では、この培地は、外因的に付加されたＷＮＴシグナル伝達アゴニスト及び／またはＢＭＰシグナル伝達の調節因子（例えば、その阻害剤または活性化剤）の一方または両方を含まない。

一実施形態では、（管腔オルガノイドの形成及び／または維持を促進するための）オルガノイド培地に含まれないＷＮＴシグナル伝達のアゴニストは、Ｒ－スポンジン、ＷＮＴタンパク質またはペプチド、または上述のいずれかの操作／合成された模倣物である。

一実施形態では、（管腔オルガノイドの形成及び／または維持を促進するための）オルガノイド培地に含まれないＢＭＰシグナル伝達の阻害剤は、タンパク質阻害剤、例えば、ノギン、またはＬＤＮ１９３１８９もしくはドルソモルフィンなどの低分子阻害剤である。一実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達のタンパク質阻害剤もＢＭＰシグナル伝達の低分子阻害剤も、（管腔オルガノイドの形成及び／または維持を促進するための）オルガノイド培地に含まれない。

したがって、本方法は、非管腔細胞よりも多い管腔細胞から構成されるオルガノイドが濃縮されたオルガノイドの第１の集団を形成するのに十分な時間、オルガノイド培地中で乳房上皮細胞を培養することをさらに含む。換言すれば、乳房上皮細胞は、オルガノイドの第１の集団を形成するのに十分な時間、オルガノイド培地中で培養されてよく、ここで、オルガノイド培地とは異なる培地を使用して形成されるオルガノイドは、全くオルガノイドを生じさせないか、本開示のオルガノイド培地が使用される場合と比較してより少ない管腔細胞（及びより多くの非管腔細胞）から構成される。

一実施形態では、管腔オルガノイドは、オルガノイド培地による接触から約３日後に形成され得る。一実施形態では、管腔オルガノイドは、オルガノイド培地による接触から約５日後に形成され得る。一実施形態では、管腔オルガノイドは、オルガノイド培地による接触から約７日後に形成され得る。一実施形態では、管腔オルガノイドは、オルガノイド培地による接触から約１０日後に形成され得る。一実施形態では、管腔オルガノイドは、オルガノイド培地による接触から約１４日後に形成され得る。一実施形態では、形成された管腔オルガノイドは、継代する必要がある前に、最大３０日間以上培養され得る。

一実施形態では、乳房上皮細胞とオルガノイド培地とを接触させた際に形成される管腔オルガノイド（すなわち、オルガノイドの第１の集団）は、３回以上、または５回以上、または７回以上、または１０回以上継代させ得る。

方法のアウトプットが、混合系統オルガノイドが豊富に含まれる乳房オルガノイドの集団（例えば、オルガノイドの第２の集団）である場合、次いで、改変オルガノイド培地（上述したような）を使用して、乳房上皮細胞または第１の集団もしくはオルガノイドを接触させて培養してもよい。したがって、そのような改変オルガノイド培地は、オルガノイドの第１の集団の形成をオルガノイドの第２の集団に変換することができる。

ＥＲＢＢリガンド、ＷＮＴシグナル伝達のアゴニスト及びＢＭＰシグナル伝達の調節因子（活性化剤または阻害剤）の例は、上記で特定されたとおりである。一実施形態では、（管腔オルガノイドの形成を抑制する、及び混合系統オルガノイドの形成／継代を促進するための）改変オルガノイド培地は、少なくとも１つのＥＲＢＢリガンド；少なくとも１つのＷＮＴシグナル伝達のアゴニスト；及び少なくとも１つのＢＭＰシグナル伝達の調節因子のそれぞれを含む。

一実施形態では、本開示のオルガノイド培地を使用して、または本開示の方法を実施することによって形成されたオルガノイドの第１の集団（例えば管腔オルガノイド）を、オルガノイドの第２の集団（例えば、混合系統オルガノイド）に変換してもよい。オルガノイドの第１の集団をオルガノイドの第２の集団に変えることは、本開示の改変オルガノイド培地を使用して行われ得る。

一実施形態では、乳房上皮細胞またはオルガノイドの第１の集団を改変オルガノイド培地と接触させることで形成される混合系統オルガノイド（すなわち、オルガノイドの第２の集団）は、３回以上、または５回以上、または７回以上、または１０回以上にわたり継代させ得る。

一実施形態では、本方法は、オルガノイドの第１の集団またはオルガノイドの第２の集団をＴＧＦβシグナル伝達の阻害剤と接触させることをさらに含み得る。ＴＧＦβシグナル伝達の阻害剤は、公知であり、市販されているため、ＴＧＦβシグナル伝達の阻害剤は、そのような任意の阻害剤であり得る。一実施形態では、ＴＧＦβシグナル伝達の阻害剤は、ＳＢ４３１５４２である。一実施形態では、ＴＧＦβシグナル伝達の阻害剤は、Ａ７７－０１である。一実施形態では、ＴＧＦβシグナル伝達の阻害剤は、Ａ８３－０１である。一実施形態では、ＴＧＦβシグナル伝達の阻害剤は、ＲｅｐＳｏｘである。オルガノイドの第１の集団及び／またはオルガノイドの第２の集団をＴＧＦβシグナル伝達の阻害剤と接触させることにより、エストロゲン受容体の核局在が促進され得る。一実施形態では、オルガノイドの第１の集団及び／またはオルガノイドの第２の集団をＴＧＦβシグナル伝達の阻害剤と接触させることは、（オルガノイド培地または改変オルガノイド培地中における）培養ステップの期間である。一実施形態では、オルガノイドの第１の集団及び／またはオルガノイドの第２の集団をＴＧＦβシグナル伝達の阻害剤と接触させることは、例えば、オルガノイドの第１の集団及び／またはオルガノイドの第２の集団の形成後に、一時的に行われる。

本明細書に開示された方法を実施することによって形成される乳房オルガノイドの種類にかかわらず、これらのオルガノイドは、任意の数の下流アッセイ、方法または用途で使用され得る。例として、乳房オルガノイドは、正常または疾患の乳房上皮細胞に由来するかにかかわらず、化合物のパネルをスクリーニングしてそれらの有効性及び／または毒性を決定するために使用され得る。別の例として、そのような乳房オルガノイドは、基礎乳房生物学またはがんなどの疾患乳房上皮の生物学を調査するために使用され得る。別の例として、このような乳房オルガノイドは、ヒト患者または動物モデルのいずれかの対象にグラフト移植される治療的介入を調査するために使用されてもよい。

以下の非限定的実施例は、本開示を例示するものである。

実施例１：乳房組織サンプルの処理
本開示で使用した全ての細胞は、適用可能なＩＲＢ及び倫理的要件に従って、ヒトまたはマウスの対象由来の組織から得たものである。

ヒト乳房上皮細胞の断片を、以下のように、学術協力者から得られた組織サンプルから単離した。切除した組織サンプルを、メスを使用してペトリ皿で細かく刻んで、クロスハッチパターンで切断した。細かく刻んだ組織サンプルを、ＢＳＡ、インスリン、コラゲナーゼ及びヒアルロニダーゼを補充した標準培養培地中の解離フラスコに入れた。フラスコを３７℃の組織培養器に入れたオービタルシェーカーで一晩中穏やかに振とうした。翌朝、浮動層の脂肪をピペットにより取り除き、残りの液体をチューブに移し、低ｒｐｍで短時間遠心分離した（約８０ｇで３０秒間）。ペレット（ペレットＡ）を取り置き、上清をさらに、徐々により長い時間にわたって、かつ徐々により高いｒｐｍで遠心分離した（４分間で約２００ｇ）。ペレット（ペレットＢ）を取り置き、上清をさらに、徐々により長い時間にわたって、かつ徐々により高いｒｐｍで遠心分離した（５分間で約４５０ｇ）。

凍結保存したペレットＡ及びペレットＢを、０．２５％のトリプシン－ＥＤＴＡで５分にわたり３７℃で処理することによって単細胞懸濁液に解離させ（間欠的なトリチュレーションを伴う）、次いで３００ｇで５分にわたり遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットを１００μｇ／ｍｌのＤＮａｓｅ溶液中に室温で１分間再懸濁させた。得られた細胞を３７μｍのストレーナに通過させて、単細胞懸濁液を得た。

マウス乳房上皮細胞の単細胞懸濁液を、乳腺から以下のように単離した。切除した乳腺を細かく刻み、５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン、コラゲナーゼ及びヒアルロニダーゼを含む標準培地の入ったチューブに入れた。乳腺を、組織培養器中、３７℃で２時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞解離混合物を高度ＤＭＥＭで洗浄し、３００ｇで５分間遠心分離した。ペレットの外観に応じて、いくつかの場合には、ペレットを塩化アンモニウムに再懸濁させて、混入した赤血球を溶解させることが望ましい。次に、ペレットを上記のとおり０.２５％トリプシン－ＥＤＴＡ中に３７℃で５分間再懸濁させ、次いで遠心分離する（３００ｇで５分間）。上清を廃棄し、ペレットを１００ｕｇ／ｍｌのＤＮａｓｅ溶液中に室温で１分間再懸濁させた。得られた細胞を３７μｍのストレーナに通過させて、単細胞懸濁液を得た。

実施例２：乳房上皮細胞の単細胞懸濁液の播種及び培養
実施例１に記載したとおりに得られた単細胞懸濁液を１００％のマトリゲル（商標）（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中で再構成し、ドームとしてマイクロプレートのウェルに播種し、約１～２ｘ１０^４のヒト細胞または約５ｘ１０^３のマウス細胞をそれぞれの約２５～４０μＬのドームに播種した。それぞれのウェルには、本明細書に記載の様々な培養培地のいずれか１種を０．５～１ｍＬ入れた。

乳房上皮細胞のプレーティングされた単細胞懸濁液は、およそ７日おきに継代させるオルガノイドに形成され、そのような７日間の間に２～３回、完全に培地を変えた。オルガノイドを継代させるために、予め加温しておいた０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡでピペッティングし、３７℃で約５～１５分間インキュベートし、再びピペッティングすることによってマトリゲルドームを粉砕した。トリプシン化反応を、２％ＦＢＳを補充した同容量のＨａｎｋｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎでの洗浄によって不活性化させた。オルガノイドの密度及びサイズに応じて、１：２～１：５の分割を行い、細胞を上記のようにドームとして播種した。代替的には、細胞を３７μｍのストレーナにより漉すことにより、単細胞懸濁液が得られ、上記のとおりマトリゲルドームに播種する。

実施例３：乳房オルガノイドの染色
氷上で揺動させながらＣｏｒｎｉｎｇ細胞回収溶液で１時間インキュベートすることにより、マトリゲルからオルガノイドを回収した。次いで、オルガノイドを、室温で１時間、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中で固定し、４℃でＰＢＳ中に貯蔵した。ＰＦＡ固定後、オルガノイドをクエン酸ナトリウム緩衝液中で９６℃で２０分間沸騰させることにより抗原回収を行った。オルガノイドを、室温で一晩、ＰＢＳ中０．５％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ－１００溶液中で透過処理した。５％ヤギ血清の溶液中で一晩インキュベートすることによりサンプルをブロックした。

固定及び透過処理の後に、オルガノイドを、室温で一晩、一次抗体及び二次抗体溶液（以下の表にまとめる）中で順次インキュベートした。サンプルを２ｕｇ／ｍｌのＤＡＰＩ溶液中で２０分間対比染色し、メタノール濃度を増加させた溶液（５０％、８０％、次いで１００％メタノール）中で段階的にインキュベートすることにより脱水した。オルガノイドを、２：１の安息香酸ベンジル－ベンジルアルコール（ＢＡＢＢ）の溶液に埋め込み、Ｉｂｉｄｉガラス底チャンバスライドに移し、Ｌｅｉｃａ ＳＰ８共焦点レーザー走査顕微鏡を使用して撮像した。１％ＢＳＡ、０．１％冷魚皮ゼラチン、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ－１００及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳからなる免疫蛍光（ＩＦ）緩衝液を用いて、各ステップ間にオルガノイドを洗浄した。

実施例４：マウス乳房分岐状オルガノイドの形成
マウス乳房上皮細胞の単細胞懸濁液を実施例１に従って得、本質的に実施例２に記載したように、ＷＮＴシグナル伝達アゴニスト（例えば、ＲＳＰＯ１）、ＢＭＰシグナル伝達の阻害剤（例えば、ノギン）、及びＥＧＦを含む培地中で播種し、培養した（図１）。

３つの連続継代において、上記の培地で形成されたマウス乳房オルガノイドは、基底細胞型及び他の非管腔細胞型を相当数有するオルガノイドの特徴である、高レベルの分岐を特徴とするオルガノイドを一貫して再生し、維持した（図１Ａ、１Ｂ、及び１Ｃ）。第２の継代後、形成されたオルガノイドを、実施例３に記載のとおり共焦点顕微鏡を使用して撮像し、高度に分岐したオルガノイドにおいて強いＫ１４の発現が観察された（図１Ｄ）。

実施例５：本開示のオルガノイド培地におけるマウスの管腔偏向オルガノイドの形成
マウス乳房上皮細胞の単細胞懸濁液を、実施例１に従って得た。ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ（商標）Ｆｕｓｉｏｎフローサイトメーターを使用して、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ４９ｆ及びＣＤ４９ｂの発現差に基づいて、ＥＲ^＋、乳及び基底細胞系統に対応する３つの細胞集団に単細胞懸濁液を選別した。非上皮細胞は、ＣＤ４５、Ｔｅｒ１１９及びＣＤ３１の発現をベースにした選別戦略の間にさらに除外された。選別された細胞は、基本的に実施例２に記載のとおり、外因的に付加されたＢＭＰシグナル伝達の阻害剤を含まない、外因的に付加されたＲＳＰＯ－１（約１００ｎｇ／ｍＬ）を含むかまたは外因的に付加されたＲＳＰＯ－１を含まないオルガノイド培地（例えば、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ（商標）マウスオルガノイド成長培地、ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に、播種し、培養した（図２）。

マウス乳房上皮細胞のＥＲ^＋系統は、明らかな嚢胞性組織を有する管腔オルガノイドを形成し、試験した培地配合のいずれにおいてもほぼ同じ効率であった（図２Ａ及び図２Ｄ）。対照的に、マウス乳房上皮細胞の乳系統は、ＲＳＰＯ－１含有培地で培養した場合に基底細胞、管腔細胞及び他の細胞の混合された組織がより多くなるのに比べて、ＲＳＰＯ－１欠損培養培地において嚢胞組織に偏向していた（図２Ｂ及び２Ｅ）。乳系統と同様に、基底系統細胞は、ＲＳＰＯ－１含有培地で培養した場合に主に混合組織であったのに比べて、ＲＳＰＯ－１欠損培地では嚢胞性組織に偏向しているように見えるが、顕著な数の混合オルガノイドが残っていた（図２Ｃ及び図２Ｆ）。

マウス乳房上皮細胞の３つの選別された系統のそれぞれが、培地配合に基づいて嚢胞組織（すなわち、管腔オルガノイド）に偏向している可能性があるという観察により、バルク（すなわち、選別されていない）乳房上皮細胞に対する異なる培地配合の効果を調査する実験が促がされた。

オルガノイド培地を、外因的に付加されたＲＳＰＯ－１またはＲＳＰＯ－３のいずれかを欠くように配合し、それらを、実施例１に従って得られたバルク乳房上皮細胞の単細胞懸濁液について試験し、実施例２に記載のとおり、播種し、培養した。ＲＳＰＯ－１及びＲＳＰＯ－３の両方を含む培地では、相当数の混合オルガノイドが得られたが、図２と同様に、外因的に付加されたＲＳＰＯ（または他のＷｎｔアゴニスト）がないオルガノイド培地では管腔偏向（または嚢胞性）オルガノイドが観察された（図３Ａ））。ＲＳＰＯ含有培地またはＲＳＰＯ非含有培地のいずれかで形成されたオルガノイドの細胞組成のフローサイトメトリー分析により、ＷＮＴアゴニスト作用の非存在下で形成されたオルガノイドのうち、基底細胞の数が減少することが確認された（図３Ｂ）。

フォローアップ実験では、実施例１に従って得られた単細胞懸濁液からオルガノイドを形成し、実施例２に記載のとおり播種し、培養した。オルガノイドは、ＲＳＰＯ－１の存在下または非存在下で３回連続継代で培養され、各継代で、ＲＳＰＯ－１の非存在下で形成されたオルガノイドは、管腔細胞制限オルガノイドの特徴である分岐のない嚢胞状組織を一貫して再現し、維持した（図４；Ｐ０、Ｐ１、及びＰ２）。第２の継代の最後に、形成されたオルガノイドを、実施例３に記載のとおり、Ｋ８、Ｋ１４及びＤＡＰＩについて処理を行い、染色した。共焦点顕微鏡を用いて得られた画像は、ＷＮＴアゴニスト作用の非存在下で形成されたオルガノイド間での強いＫ８発現と、Ｋ１４染色の明らかな欠如を示し、これは、ＷＮＴアゴニスト作用の存在下で形成されたオルガノイドの共焦点顕微鏡画像とは対照的であった（図４）。

ＢＭＰシグナル伝達の阻害剤を含む培地中で上記の実験を行い、マウス乳房オルガノイドの形成に対するＢＭＰシグナル伝達阻害の効果を検討した。実施例１に従って得られた単細胞懸濁液からオルガノイドを形成し、外因的に付加されたＢＭＰシグナル伝達の阻害剤を含むまたは含まない（０ｎｇ／ｍＬまたは～１００ｎｇ／ｍＬ）（しかし、ＷＮＴシグナル伝達アゴニストであるＲＳＰＯ－１を含む）培地中で、実施例２に記載のとおり播種し、培養した。上記の培地配合物において連続継代にわたって撮影した明視野画像及び共焦点顕微鏡画像から、使用される培地配合物にかかわらず、顕著な数の基底細胞を含む顕著な数の分岐状オルガノイドが明らかになった（図５）。

次に、外因的に付加したＷＮＴシグナル伝達アゴニストを含むかもしくは含まないオルガノイド培地の状況におけるＢＭＰシグナル伝達阻害の有無の効果を検討した。オルガノイドを、実施例１に従って得られた単細胞懸濁液から形成させ、実施例２に記載のとおりに播種し、培養した。約１００ｎｇ／ｍＬのノギン及び約１００ｎｇ／ｍＬのＲＳＰＯ－１を含むオルガノイド培地（図６Ａ）及び図６Ｃ））、または外因的に添加されたノギン及びＲＳＰＯ－１を含まないオルガノイド培地（図６Ｂ）及び６Ｄ））を使用した８つの独立した実験に基づいて、ＢＭＰシグナル伝達の阻害剤及びＷＮＴシグナル伝達アゴニストを含まない培地配合物では、管腔細胞の増加を伴う基底細胞の顕著な減少が観察された（図６Ｅ）。

前述のデータに基づき、オルガノイド培地中にＷＮＴシグナル伝達アゴニストが存在しないことは、乳房オルガノイド間の系統バランスに大きい影響を及ぼし（例えば、管腔細胞の増加）、ＢＭＰシグナル伝達の阻害剤の有無は、管腔に偏向したオルガノイドの形成には必ずしも必要ではないと考えられる。

実施例６：ヒトの乳房分岐状オルガノイドの形成
ヒト乳房上皮細胞の単細胞懸濁液を実施例１に従って得て、実質的に実施例２に記載のとおり、ＲＳＰＯ－１、ノギン及びＥＧＦを含む培地中で播種し、培養した（図７）。

２６日目に、前述の培地で形成されたヒト乳房オルガノイドは、多数の基底細胞を含むオルガノイドの特徴である高レベルの分岐を特徴とするオルガノイドを一貫して再生し、維持した（図７Ａ、７Ｂ、及び７Ｃ）。共焦点顕微鏡を使用して、形成されたオルガノイドを撮像し、高度に分岐したオルガノイドでは強いＫ１４の発現が観察された（図７Ｃ）。ローブの周縁部における基底細胞は、互いに積み重なることが確認できる。凝集性分岐の代わりに、１つの集まりで基底細胞がオルガノイドから離れて進み、その結果、「分解性オルガノイド分岐」が生じる。腺形成ユニットがないことは、古典的な浸潤性小葉癌を暗示する。

実施例７：本開示のオルガノイド培地におけるヒト管腔偏向オルガノイドの形成
ヒト乳房上皮細胞の単細胞懸濁液を実施例１に従って得た。細胞の単細胞懸濁液を、ＢＭＰシグナル伝達の異なる活性化剤及び阻害剤の効果を試験するオルガノイド培地（例えばＭａｍｍｏＣｕｌｔ（商標）Ｈｕｍａｎ Ｏｒｇａｎｏｉｄ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉａ，ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に、実質的に実施例２に記載したように播種し、培養した（図８）。

ＢＭＰシグナル伝達活性化剤、約５０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ２または約５０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４のいずれかを含む培地及びＢＭＰシグナル伝達阻害剤、約２５～２００ｎｇ／ｍＬのノギンまたは約１０～１００ｎＭのＬＤＮ１９３１８９のいずれかを含む培地においてオルガノイドを形成した。第１の継代の直前に、形成されたオルガノイドを解離させ、細胞系統のバランスをフローサイトメトリーによって分析した。ＢＭＰ経路を介するシグナル伝達の活性化は、ＢＭＰシグナル伝達の阻害剤を含む培地中で形成されるオルガノイドと比較して、基底細胞の顕著な増加及び管腔細胞の減少をもたらした（図８Ａ）。２つの異なるドナーサンプルでのフォローアップ実験により、ＢＭＰを介するシグナル伝達を阻害することにより、基底細胞の数が減少する一方で、ＢＭＰ調節を含まないオルガノイド培地と比較して、管腔細胞の数が増加することが確認された（図８Ｂ）。

ＢＭＰを介するシグナル伝達を調節する効果を、形成されたオルガノイド間の総細胞数（図９Ａ）、及び形成されたオルガノイド間の細胞の系統バランス（図９Ｂ）に関して、複数の実験において分析した。前述の条件で形成されたオルガノイドは、総細胞数について分析したところ、ＢＭＰを介するシグナル伝達が調節されないか、またはノギンもしくはＬＤＮ１９３１８９のいずれかを介して阻害された条件と比較して、ＢＭＰ２またはＢＭＰ４のいずれかによるＢＭＰを介するシグナル伝達の活性化により、総細胞の顕著な純損失が生じることが観察された（図９Ａ）。図８で観察された結果と同様に、ＢＭＰシグナル伝達の活性化及び阻害について、細胞系統のバランスに対する効果を確認した（図９Ｂ）。Ｋ８^＋管腔細胞の相対的増加は、ＢＭＰシグナル伝達の阻害剤を含むオルガノイド培地に形成されたオルガノイドに関する共焦点顕微鏡法により確認された（図９Ｃ）。また、共焦点顕微鏡法によって撮影された画像は、ＢＭＰシグナル伝達の阻害剤を含むオルガノイド培地に形成されたオルガノイド中のＫ１４^＋細胞の染色が、存在するとしても、わずかであることが判明した。

最後に、ＢＭＰを介するシグナル伝達の二重阻害の潜在的な付加効果について検討した（図１０）。ノギン及びＬＤＮ１９３１８９の両方を含む培地中、またはノギンもしくはＬＤＮ１９３１８９の一方を含む培地中でオルガノイドを形成させた。明視野顕微鏡により培養物を調べることにより、ＢＭＰシグナル伝達の１つの阻害剤を含むオルガノイド培地が、乳房上皮細胞からの管腔オルガノイドの形成を偏向させるのに十分であると考えられることが明らかになった（図１０）。

全体として、オルガノイド培地中にＢＭＰシグナル伝達の１つ以上の阻害剤が存在しない場合には、顕著な数の管腔細胞から構成されるオルガノイドが生成され、オルガノイド培地中にＢＭＰシグナル伝達の１つ以上の阻害剤を添加することにより、管腔細胞の数が増加し、基底細胞の数が減少すると考えられる。対照的に、ＢＭＰを介するシグナル伝達の活性化は、管腔制限型または管腔偏向型の乳房オルガノイドの形成が望まれる場合、オルガノイドの系統バランスに負の影響を及ぼすと考えられる。

次に、ＢＭＰシグナル伝達の調節がヒト乳房オルガノイドの系統バランスに及ぼす重要な役割を考慮して、ＷＮＴシグナル伝達の調節が乳房オルガノイド形成に及ぼす潜在的影響を検討した。ヒト乳房上皮細胞の単細胞懸濁液を実施例１に従って得た。細胞の単細胞懸濁液を、オルガノイド培地中に、実質的に実施例２に記載のとおりに播種し、培養し、異なる活性化剤（約０．１～１ｎＭのＷＮＴサロゲートまたは約２０～２００ｎｇ／ｍＬのＲＳＰＯ－１）及びＷＮＴシグナル伝達阻害剤（約５０ｎｇ／ｍＬのＤＫＫ１または約２００ｎＭのＮＳＣ）の効果を試験した（図１１）。

管腔促進性オルガノイド培地（例えばＭａｍｍｏＣｕｌｔ（商標）Ｈｕｍａｎ Ｏｒｇａｎｏｉｄ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ、ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を配合し、外因的に付加されたＲＳＰＯ－１を補充したかまたは外因的に付加されたＲＳＰＯ－１を含まないようにした。形成されたオルガノイドの明視野画像では、試験した２つの配合物間で管腔偏向オルガノイドの顕著な増加または減少は示されなかった（図１１Ａ）。この観察は、いずれかの状態で形成されたオルガノイドの細胞を、フローサイトメトリーにより分析した後に確認された（図１１Ｂ）。複数のオルガノイド形成実験のフローサイトメトリーデータを集計したところ、同様に、ＷＮＴシグナル伝達の調節は、分析したオルガノイドの細胞の系統バランスにほとんど影響を有さないことが示唆された（図１１Ｃ）。オルガノイド培地にＷＮＴシグナル伝達アゴニスト、ＷＮＴシグナル伝達アンタゴニストが含まれるか、またはＷＮＴシグナル伝達の調節が含まれないかに関係なく、管腔細胞と基底細胞のパーセンテージはほぼ同等であると考えられた。したがって、ＷＮＴシグナル伝達のアゴニスト作用及び／またはアンタゴニスト作用は、乳房上皮細胞からの管腔制限型または管腔偏向型のヒト乳房オルガノイドの形成に対して重要でないと考えられる。

ＷＮＴシグナル伝達の調節が管腔制限型または管腔偏向型ヒト乳房オルガノイドの形成には重要でないと考えられること、及びＢＭＰシグナル伝達の阻害が、細胞系統バランスを管腔細胞に有利に傾けると考えられることから、次にＥＲＢＢファミリーメンバーを介したシグナル伝達の調節が、ヒト乳房オルガノイドの形成に及ぼす効果を検討した。ヒト乳房上皮細胞の単細胞懸濁液を実施例１に従って得た。実質的に実施例２に記載のとおり細胞の単細胞懸濁液を、オルガノイド培地（例えば、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ（商標）Ｈｕｍａｎ Ｏｒｇａｎｏｉｄ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ、ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に播種して、培養し、異なるＥＲＢＢ受容体ファミリーメンバーのリガンドを試験した（図１２）。

ＥＲＢＢ受容体ファミリーメンバーのリガンドを含まないか、または約１０～５０ｎｇ／ｍＬのアンフィレグリン（ＡＲＥＧ）、約１０～５０ｎｇ／ｍＬの上皮成長因子（ＥＧＦ）、または約５０～１００ｎｇ／ｍＬのヘレグリン／ニューレグリン１（ＮＲＧ１）を含む培地中でオルガノイドを形成した。第１の継代の直前に、形成されたオルガノイドを解離させ、細胞系統のバランスをフローサイトメトリーによって分析した。ＡＲＥＧ及びＮＲＧ１が、細胞系統のバランスに対してわずかな効果を有するかまたは全く効果を有しないと考えられるのに対し、ＥＧＦは、形成されたオルガノイドの間の基底細胞の数を顕著に増加させながら、管腔細胞の数を顕著に減少させると考えられた（図１２Ａ）。２つのドナーサンプルのフォローアップ実験では、約１００ｎＭのゲフィチニブ及び約１００ｎＭのエルロチニブでの処理により、ＥＧＦ受容体を介したシグナル伝達の阻害の効果を試験し、この処理では、細胞系統のバランスに対しては、無視できるかまたは効果を有しないと考えられた（図１２Ｂ）。

ＥＲＢＢ受容体ファミリーメンバーを介するシグナル伝達を調節する効果を、形成されたオルガノイド間の総細胞数（図１３Ａ）、及び形成されたオルガノイド間の細胞の系統バランス（図１３Ｂ）に関して、複数の実験において分析した。前述の条件で形成されたオルガノイドを全細胞数について分析し、ＥＲＢＢファミリーメンバーを介してシグナル伝達の活性化剤を含めることにより、ＥＲＢＢシグナル伝達の調整を含まない対照条件と比較して、形成された乳房オルガノイドの細胞総数が正味増加することが観察された（図１３Ａ）。最も高い分裂促進活性は、ＥＧＦまたはＡＲＥＧのいずれかがオルガノイド培地に含まれている場合に観察された。図１２で観察された結果と同様に、試験した種々のＥＲＢＢ受容体ファミリーリガンドについて細胞系統のバランスに対する効果を確認した（図１３Ｂ）。ＥＧＦは、管腔細胞の最大減少及び基底細胞の最大増加をもたらした一方で、ＡＲＥＧは、管腔細胞の割合に最小の影響を有するが、基底細胞の割合の増加に大きな影響を有すると考えられる。それとは対照的に、ＮＲＧ１をオルガノイド培地に含めることで、より高い割合の管腔細胞及び基底細胞の割合の低下が生じたと考えられた。

最後の一連の実験において、ＴＧＦβを介したシグナル伝達の調整が、ヒト乳房オルガノイド形成に及ぼす効果について検討した。ヒト乳房上皮細胞の単細胞懸濁液を実施例１に従って得た。細胞の単細胞懸濁液を実質的に実施例２に記載したとおりオルガノイド培地（例えば、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ（商標）Ｈｕｍａｎ Ｏｒｇａｎｏｉｄ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ、ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で播種して、培養し、ＴＧＦβ受容体のリガンドまたはＴＧＦβを介したシグナル伝達の阻害剤の効果を試験した（図１４）。

ＴＧＦβ受容体のリガンドを含まないか、または約５０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβ１（またはＴＧＦβ３、データは示されていないが、ＴＧＦβ１と一致する結果）を含む培地中でオルガノイドを形成させた。第１の継代の直前に、形成されたオルガノイドを解離させ、細胞系統のバランスをフローサイトメトリーによって分析した。オルガノイド培地中でのＴＧＦβ１の存在は、管腔細胞及び基底細胞の割合に全体的に負の影響を有すると同時に、形成された乳房オルガノイドの間の間質細胞の比率を大幅に増加させると考えられた（図１４Ａ）。

オルガノイド培地にＴＧＦβ１が含まれていることが、管腔制限型または管腔偏向型のヒト乳房オルガノイドの形成に負の影響を有することを考慮して、ＴＧＦβ受容体を介したシグナル伝達の阻害による潜在的な役割を検討した。約１０μΜのＳＢ４３１５４２、約２００～５００ｎＭのＡ７７－０１、または約５～２５ＲｅｐＳｏｘ μＭのいずれかをオルガノイド培地に含めることは、管腔細胞の比率を維持するかまたは改善しながら、間質細胞の比率を減少させると考えられた（図１４Ｂ）。これらの結果に基づいて、オルガノイド培地中にＲｅｐＳｏｘなどのＴＧＦβシグナル伝達の阻害剤を含めることで、ＴＧＦβ受容体を介したシグナル伝達の調節因子を含まないオルガノイド培地と比較して、管腔細胞の比率を増加させることができる。しかしながら、潜在的により興味深い発見により、ＴＧＦβシグナル伝達の阻害剤への一過性の曝露（上記のようにオルガノイドが形成された後）は、細胞質内ではなく核内でのエストロゲン受容体の局在が促進されることが示唆された（図１５）。これらの結果は、ヒト（図１５Ａ）及びマウス（図１５Ｂ）の両方の乳房オルガノイドにおけるＳＢ４３１５４及びＲｅｐＳｏｘの両方について確認された。

フォローアップ実験では、オルガノイド培地を、外因的に付加されたＲＳＰＯ－１及びノギンの両方を欠くように配合した。この培地を、実施例１に従って得られた、実施例２に記載のとおりに播種し、培養した単細胞懸濁液で試験した。第１の継代の１０日目に、外因的に付加されたＲＳＰＯ－１及びノギンに曝露することなく形成されたオルガノイドは、嚢胞形態を呈し、管腔オルガノイドの特徴である分岐がないことを示した（図１６Ａ）。これらの培養条件下で形成された乳房オルガノイドの共焦点顕微鏡検査によって、管腔細胞マーカー発現（Ｋ８）が存在すること及び基底細胞マーカー発現（Ｋ５）が明らかにないことが確認された（図１６Ｂ、図１６Ｃ及び図１６Ｄ）。

実施例８：乳房管腔オルガノイドの形成を促進するさらなる因子
他の候補因子をオルガノイド培地中で試験し、乳房上皮細胞の特定系統に制限される乳房オルガノイドの形成の偏向に対するその効果を調べた。ヒト乳房上皮細胞の単細胞懸濁液を実施例１に従って得た。細胞の単細胞懸濁液を、５０ｎｇ／ｍｌのニューレグリン（ＮＲＧ３）、１００ｎｇ／ｍｌの抗ミュラー管ホルモン（ＡＭＨ）または５０ｎｇ／ｍｌの顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）のいずれかを補充したオルガノイド培地（例えば、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ（商標）Ｈｕｍａｎ Ｏｒｇａｎｏｉｄ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ、ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に実質的に実施例２に記載のとおり播種し、培養した。

１７日目のオルガノイドを、Ｋ１４またはＫ８のいずれかについて染色し、共焦点顕微鏡法によって撮像した（図１７）。オルガノイド培地中にＮＲＧ３またはＡＭＨのいずれかを含めることは、乳房上皮細胞の培養を偏向させて、管腔制限型オルガノイドを形成すると考えられ（図１７Ａ及び図１７Ｂ）、一方、オルガノイド培地中にＧＭ－ＣＳＦを含むことは、乳房上皮細胞の培養を偏向させて、基底制限型オルガノイドを形成すると考えられた（図１７Ｃ）。

本開示は、現在好ましい実施例であると考えられるものを参照して説明してきたが、本開示は開示する実施例に限定されないことを理解すべきである。それとは反対に、本開示は、添付の特許請求の範囲の趣旨及び範囲内に含まれる種々の変更及び同等の構成を包括することを目的としている。

全ての出版物、特許、及び特許出願は、各個別の出版物、特許、または特許出願が、その全体を参照することにより組み込まれるように明確にかつ個別に示された場合と同一の程度に、それらの全体を参照することにより本明細書に組み込まれる。

Claims (38)

1. 単離された乳房上皮細胞から乳房オルガノイドを形成する方法であって、前記方法は、
   ａ）前記乳房上皮細胞を、外因的に付加されたＷＮＴシグナル伝達アゴニスト及び／またはＢＭＰシグナル伝達の阻害剤の一方または両方を含まないオルガノイド培地と接触させることと、
   ｂ）非管腔細胞よりも多い管腔細胞から構成されるオルガノイドが濃縮されたオルガノイドの第１の集団を形成するのに十分な時間、前記オルガノイド培地中で前記乳房上皮細胞を培養することと、を含み、
   ここで、前記オルガノイド培地は、基礎培地と、ＥＲＢＢ１のリガンド及び／またはＥＲＢＢ４のリガンドの一方または両方と、を含む、前記方法。
2. 前記オルガノイド培地が、前記ＢＭＰシグナル伝達の阻害剤を含むが、前記ＷＮＴシグナル伝達アゴニストを含まない、請求項１に記載の方法。
3. 前記オルガノイド培地が、前記ＷＮＴシグナル伝達アゴニストを含むが、前記ＢＭＰシグナル伝達の阻害剤を含まない、請求項１に記載の方法。
4. 前記ＷＮＴシグナル伝達アゴニストが、Ｒ－スポンジン、ＷＮＴタンパク質、または、前述のいずれかの操作された模倣物である、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記ＢＭＰシグナル伝達の阻害剤が、タンパク質または低分子である、請求項１に記載の方法。
6. 前記ＢＭＰシグナル伝達の阻害剤は、ノギン、コーディン、フォリスタチン、ＬＤＮ１９３１８９またはドルソモルフィンのうちの１つ以上である、請求項５に記載の方法。
7. 前記ＥＲＢＢ１のリガンドが、ＥＧＦまたはＴＧＦアルファではない、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
8. 前記ＥＲＢＢ１のリガンドが、アンフィレグリンである、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
9. 前記ＥＲＢＢ４のリガンドが、異なるＥＲＢＢ受容体ファミリーメンバーのリガンドでもある、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
10. 前記ＥＲＢＢ４のリガンドが、ニューレグリン１及び／またはニューレグリン３である、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
11. 前記オルガノイド培地が、外因的に付加された性ホルモンを含まない、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
12. 前記性ホルモンが、プロゲステロンである、請求項１１に記載の方法。
13. 前記非管腔細胞が、基底細胞、間質細胞、造血細胞及び内皮細胞のうちの１つ以上である、請求項１に記載の方法。
14. 前記オルガノイドが、５０％以上の管腔細胞から構成される、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
15. 前記オルガノイドの第１の集団を改変オルガノイド培地中で培養して、前記オルガノイドの第１の集団をオルガノイドの第２の集団に変換することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
16. 前記改変オルガノイド培地にＥＧＦを補充する、請求項１５に記載の方法。
17. 前記改変オルガノイド培地に、ＷＮＴシグナル伝達アゴニスト及び／またはＢＭＰシグナル伝達の阻害剤を補充する、請求項１５または１６に記載の方法。
18. 前記ＷＮＴシグナル伝達アゴニスト及び／または前記ＢＭＰシグナル伝達の阻害剤の一方または両方が前記オルガノイド培地に添加されていない場合には、前記オルガノイドの第２の集団は、より多くの基底細胞及びより少ない管腔細胞から構成される、請求項１５～１７のいずれか１項に記載の方法。
19. 前記オルガノイドの第１の集団が、前記オルガノイド培地中で５回以上継代可能である、請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法。
20. 前記オルガノイドの第２の集団が、前記改変オルガノイド培地中で５回以上継代可能である、請求項１５～１８のいずれか１項に記載の方法。
21. 前記オルガノイドの第１の集団をＴＧＦ－ベータの阻害剤と接触させることをさらに含む、請求項１～２０のいずれか１項に記載の方法。
22. ＥＲの核局在を得ることをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
23. 乳房オルガノイド培地であって、基礎培地と、ＥＲＢＢ１のリガンド及びＥＲＢＢ４のリガンドの一方または両方とを含み、外因的に付加されたＷＮＴシグナル伝達アゴニスト及びＢＭＰシグナル伝達の阻害剤の一方または両方を欠く、前記培地。
24. 前記オルガノイド培地が、前記ＢＭＰシグナル伝達の阻害剤を含むが、前記ＷＮＴシグナル伝達アゴニストを含まない、請求項２３に記載の培地。
25. 前記オルガノイド培地が、前記ＷＮＴシグナル伝達アゴニストを含むが、前記ＢＭＰシグナル伝達の阻害剤を含まない、請求項２３に記載の培地。
26. 前記ＷＮＴシグナル伝達アゴニストが、Ｒ－スポンジン、ＷＮＴタンパク質、または、前述のいずれかの操作された模倣物である、請求項２３～２５のいずれか１項に記載の培地。
27. 前記ＢＭＰシグナル伝達の阻害剤が、タンパク質または低分子である、請求項２３～２６のいずれか１項に記載の培地。
28. 前記ＢＭＰシグナル伝達の阻害剤は、ノギン、コーディン、フォリスタチン、ＬＤＮ１９３１８９またはドルソモルフィンのうちの１つ以上である、請求項２７に記載の培地。
29. 前記ＥＲＢＢ１のリガンドが、ＥＧＦまたはＴＧＦアルファではない、請求項２３～２８のいずれか１項に記載の培地。
30. 前記ＥＲＢＢ１のリガンドが、アンフィレグリンである、請求項２３～２９のいずれか１項に記載の方法。
31. 前記ＥＲＢＢ４のリガンドが、異なるＥＲＢＢ受容体ファミリーメンバーのリガンドでもある、請求項２３～３０のいずれか１項に記載の培地。
32. 前記ＥＲＢＢ４のリガンドが、ニューレグリン１またはニューレグリン３である、請求項２３～３１のいずれか１項に記載の培地。
33. 前記オルガノイド培地が、外因的に付加された性ホルモンを含まない、請求項２３～３２のいずれか１項に記載の培地。
34. 前記性ホルモンがプロゲステロンである、請求項３３に記載の培地。
35. 前記オルガノイド培地中で、単離された乳房上皮細胞を培養することにより、非管腔細胞よりも多い管腔細胞から構成されるオルガノイドが濃縮される、請求項２３～３４のいずれか１項に記載の培地。
36. 単離された乳房上皮細胞から乳房オルガノイドを形成するためのキットであって、前記キットが、
    基礎培地と；
    前記基礎培地に添加される第１の補充物であって、ＥＲＢＢ１のリガンド及び／またはＥＲＢＢ４のリガンドの一方または両方を含み、かつ、外因的に付加されたＷＮＴシグナル伝達アゴニスト及び／またはＢＭＰシグナル伝達の阻害剤の一方または両方を含まない、前記第１の補充物と、を含む、前記キット。
37. 前記基礎培地または前記第１の補充物を補充した前記基礎培地に添加される第２の補充物をさらに含み、前記第２の補充物が、前記第１の補充物中のＥＲＢＢ１のリガンドとは異なるＥＲＢＢ１の第２のリガンドと、外因的に付加されたＷＮＴシグナル伝達アゴニスト及び／または前記ＢＭＰシグナル伝達の阻害剤の一方または両方と、を含む、請求項３６に記載のキット。
38. 前記基礎培地に、または前記第１の補充物及び／または前記第２の補充物を補充した前記基礎培地に添加される第３の補充物をさらに含み、前記第３の補充物が、ＴＧＦβシグナル伝達阻害剤を含む、請求項３６または３７に記載のキット。
    
    

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