CN112342181B - 基于数控激光辐射的非入侵式的细胞成图案方法及系统 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基于数控激光辐射的非入侵式的细胞成图案方法及系统。该方法包括：通过在无血清培养基添加低密度脂蛋白进行细胞培养，得到体外培养细胞；利用调节后的数控激光辐射所述体外培养细胞，得到辐射后细胞；利用胰蛋白酶消化洗脱所述辐射后细胞，继续培养体外培养细胞，得到体外成图案的图像；采集所述体外成图案的图像。本发明能够有效避免外界环境的污染，减轻对细胞的损伤，提高成图案精度。

Description

基于数控激光辐射的非入侵式的细胞成图案方法及系统
技术领域
本发明涉及细胞成图案领域，特别是涉及一种基于数控激光辐射的非入侵式的细胞成图案方法及系统。
背景技术
在目前细胞生物学研究中，细胞间的相互作用受到越来越多的关注，精确控制细胞在空间上的分布，在组织工程学、生物芯片、细胞生物学中有巨大的应用前景。为了解决此问题，目前主要采用的方式为3D打印技术，将细胞混合于生物墨水中进行打印，对细胞损伤较大，同时操作过程复杂，容易受到外界环境的污染。此外，有学者通过控制界面的不同位置的对细胞的黏附程度，控制细胞的空间分布，此种方法操作复杂、造价更高，且灵活度较差，一旦合成材料后无法再改变细胞分布的图案。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于数控激光辐射的非入侵式的细胞成图案方法及系统，能够有效避免外界环境的污染，减轻对细胞的损伤，提高成图案精度。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
一种基于数控激光辐射的非入侵式的细胞成图案方法，包括：
通过在无血清培养基添加低密度脂蛋白进行细胞培养，得到体外培养细胞；
利用调节后的数控激光辐射所述体外培养细胞，得到辐射后细胞；
利用胰蛋白酶消化洗脱所述辐射后细胞，继续培养体外培养细胞，得到体外成图案的图像；
采集所述体外成图案的图像。
可选的，所述通过在无血清培养基添加低密度脂蛋白进行细胞培养，得到体外培养细胞，具体包括：
采集无菌条件下的细胞株；
将所述细胞株在无血清培养基添加1mg/mL低密度脂蛋白进行培养，得到体外培养细胞。
可选的，所述利用调节后的数控激光辐射所述体外培养细胞，得到辐射后细胞，具体包括：
设置激光辐射参数，所述激光辐射参数包括空间图案、脉冲时间、能量强度和脉冲间隔时间；
根据所述激光辐射参数和数控激光辐射所述体外培养细胞，得到辐射后细胞。
可选的，所述利用胰蛋白酶消化洗脱所述辐射后细胞，继续培养体外培养细胞，得到体外成图案的图像，具体包括：
利用含0.125％胰蛋白酶的磷酸盐缓冲液消化所述辐射后细胞，继续培养体外培养细胞，得到体外成图案的图像。
一种基于数控激光辐射的非入侵式的细胞成图案系统，包括：
细胞培养模块，用于通过在无血清培养基添加低密度脂蛋白进行细胞培养，得到体外培养细胞；
激光辐射模块，用于利用调节后的数控激光辐射所述体外培养细胞，得到辐射后细胞；
蛋白酶消化模块，用于利用胰蛋白酶消化洗脱所述辐射后细胞，继续培养体外培养细胞，得到体外成图案的图像；
图像采集模块，用于采集所述体外成图案的图像。
可选的，所述细胞培养模块，具体包括：
细胞株采集单元，用于采集无菌条件下的细胞株；
细胞培养单元，用于将所述细胞株在无血清培养基添加1mg/mL低密度脂蛋白进行培养，得到体外培养细胞。
可选的，所述激光辐射模块，具体包括：
激光辐射参数设置单元，用于设置激光辐射参数，所述激光辐射参数包括空间图案、脉冲时间、能量强度和脉冲间隔时间；
激光辐射单元，用于根据所述激光辐射参数和数控激光辐射所述体外培养细胞，得到辐射后细胞。
可选的，所述蛋白酶消化模块，具体包括：
蛋白酶消化单元，用于利用含0.125％胰蛋白酶的磷酸盐缓冲液消化所述辐射后细胞，继续培养体外培养细胞，得到体外成图案的图像。
根据本发明提供的具体实施例，本发明公开了以下技术效果：
本发明提供了一种通过低能量脉冲激光，有效改变细胞黏附强度，使得不同区域的细胞抗胰蛋白酶能力发生差异，再通过特异性的酶消化细胞，保留所需位置的细胞，而去除多余细胞，实现细胞的成图案处理。本发明基于传统的体外培养细胞体系，经济便捷、操作灵活、通用性强，通过数控激光脉冲进行非入侵式的辐射，有效避免了外界环境的污染，对细胞损伤较小，同时成图案精度可达200μm。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明基于数控激光辐射的非入侵式的细胞成图案方法流程图；
图2为本发明基于数控激光辐射的非入侵式的细胞成图案系统结构图；
图3为非侵入式细胞成图案工作流程示意图；
图4为450nm激光脉冲对活细胞功能的影响示意图；
图5为低密度脂蛋白在450nm激光脉冲诱导细胞成图案中的作用示意图；
图6为自编程激光数控软件Gcodetranslator1.0示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明的目的是提供一种基于数控激光辐射的非入侵式的细胞成图案方法及系统，能够有效避免外界环境的污染，减轻对细胞的损伤，提高成图案精度。
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1为本发明基于数控激光辐射的非入侵式的细胞成图案方法流程图。如图1所示，一种基于数控激光辐射的非入侵式的细胞成图案方法包括：
步骤101：通过在无血清培养基添加1mg/mL低密度脂蛋白进行细胞培养，得到体外培养细胞，具体包括：
采集无菌条件下的细胞株。
将所述细胞株在无血清培养基添加1mg/mL低密度脂蛋白进行培养，得到体外培养细胞。
以NIH3T3细胞为例，在无菌条件下取NIH3T3细胞株，以含10％胎牛血清、青霉素(100U/ml)和链霉素(100μg/ml)的DMEM为培养液，在37℃、5％CO2孵育箱内培养，24h后更换培养基，弃掉未贴壁细胞，以后每2～3d换液1次。待细胞达80％融合时，用0.25％的胰蛋白酶消化，给予传代培养。
步骤102：利用调节后的数控激光辐射所述体外培养细胞，得到辐射后细胞，具体包括：
设置激光辐射参数，所述激光辐射参数包括空间图案、脉冲时间、能量强度和脉冲间隔时间。
根据所述激光辐射参数和数控激光辐射所述体外培养细胞，得到辐射后细胞。
步骤103：利用胰蛋白酶消化洗脱所述辐射后细胞，继续培养体外培养细胞，得到体外成图案的图像，具体包括：
利用含0.125％胰蛋白酶的磷酸盐缓冲液消化所述辐射后细胞，继续培养体外培养细胞，得到体外成图案的图像。
优选的，以含0.125％胰蛋白酶的磷酸盐缓冲液(PBS)室温下消化体外培养NIH3T3细胞5-10min，PBS洗涤2次，每次1min。加入NIH3T3细胞培养基，继续培养。
步骤104：采集所述体外成图案的图像。
成图案后，培养皿内加入0.5mg/ml溴化乙锭，室温染色5min，弃去培养基，PBS洗涤2次，每次5min，在紫外线成像系统下观察采集图像。
图2为本发明基于数控激光辐射的非入侵式的细胞成图案系统结构图。如图2所示，一种基于数控激光辐射的非入侵式的细胞成图案系统包括：
细胞培养模块201，用于通过在无血清培养基添加低密度脂蛋白进行细胞培养，得到体外培养细胞。
激光辐射模块202，用于利用调节后的数控激光辐射所述体外培养细胞，得到辐射后细胞。
蛋白酶消化模块203，用于利用胰蛋白酶消化洗脱所述辐射后细胞，继续培养体外培养细胞，得到体外成图案的图像。
图像采集模块204，用于采集所述体外成图案的图像。
所述细胞培养模块201，具体包括：
细胞株采集单元，用于采集无菌条件下的细胞株。
细胞培养单元，用于将所述细胞株在无血清培养基添加1mg/mL低密度脂蛋白进行培养，得到体外培养细胞。
所述激光辐射模块202，具体包括：
激光辐射参数设置单元，用于设置激光辐射参数，所述激光辐射参数包括空间图案、脉冲时间、能量强度和脉冲间隔时间。
激光辐射单元，用于根据所述激光辐射参数和数控激光辐射所述体外培养细胞，得到辐射后细胞。
所述蛋白酶消化模块203，具体包括：
蛋白酶消化单元，用于利用含0.125％胰蛋白酶的磷酸盐缓冲液消化所述辐射后细胞，继续培养体外培养细胞，得到体外成图案的图像。
实施例1：
本实施例提供一种具体的基于数控激光辐射的非入侵式的细胞成图案方法，其中细胞采用NIH3T3细胞，具体包括：
1.NIH3T3的体外培养：无菌条件下取NIH3T3细胞株，以含10％胎牛血清、青霉素(100U/ml)和链霉素(100μg/ml)的DMEM为培养液，在37℃、5％CO2孵育箱内培养，24h后更换培养基，弃掉未贴壁细胞，以后每2～3d换液1次。待细胞达80％融合时，用0.25％的胰蛋白酶消化，给予传代培养。
2.激光脉冲刺激：自编程激光数控软件Gcodetranslator1.0(如图6)可控制激光器辐射的位置、强度和时间，可配套常规细胞培养皿(96孔板，24孔板，6孔板，35mm培养皿，60mm培养皿，100mm培养皿)使用。应用时，选择培养皿类型，选择需要操作的区域，设置扫描数据、扫描间隔和激光强度，导入CAD文件，将设计图案转换为G-code代码驱动数控激光设备。450nm激光以0-100mW能量，脉冲1s辐射细胞。
3.蛋白酶消化：以含0.125％胰蛋白酶的磷酸盐缓冲液(PBS)室温下消化体外培养NIH3T3细胞5-10min，PBS洗涤2次，每次1min。加入NIH3T3细胞培养基，继续培养。
4.体外成图案的图像采集与分析：成图案后，培养皿内加入0.5mg/ml溴化乙锭，室温染色5min，弃去培养基，PBS洗涤2次，每次5min，在紫外线成像系统下观察采集图像。
5.450nm低量激光脉冲诱导成图案效果：100mW450nm激光脉冲辐射可以有效诱导激光扫描区域细胞黏附，控制细胞在培养皿中的空间分布(图3e)，操控精度为200μm(图3d)，且对细胞活率无任何影响(图3b)。图3为非侵入式细胞成图案工作流程示意图。其中(a)为细胞成图案操作流程示意图；(b)为脉冲激光辐射强度对细胞活率的影响示意图；(c)为450nm激光辐射强度和时间对体外培养细胞抗消化性能的影响示意图；(d)为激光脉冲诱导细胞成图案操作精度示意图，比例尺＝200μm；(e)为激光脉冲诱导细胞成图案实施效果示意图。计算机设计图案(上排)最终细胞排布图案(下排)比例尺＝5mm。
实施例2：
本实施例用于论述450nm低量激光脉冲对NIH3T3细胞转录组表达谱的影响，具体的，450nm激光以100mW能量，脉冲1s，间隔2h，持续12个循环。收集样本提取总RNA进行转录组测序(RNA-seq)。结果显示，激光脉冲辐射并不影响细胞黏附分子和细胞外基质的表达，主要通过氧化应激刺激对细胞发生作用，同时上调脂蛋白结合受体，促进细胞微环境中脂蛋白与膜受体相结合(图4)。图4为450nm激光脉冲对活细胞功能的影响示意图。
实施例3：
本实施例论述450nm低量激光脉冲诱导LDL向细胞表面黏附，同时诱导细胞抵抗胰蛋白酶消化，具体包括：
1.450nm低量激光脉冲诱导LDL向NIH3T3细胞表面黏附:450nm激光以100mW能量，脉冲1s，间隔2h，持续12个循环，培养基中添加不同浓度的荧光标记的LDL。结果显示，1-2mg/mLLDL条件下，激光脉冲辐射可以显著诱导LDL在NIH3T3细胞表面的黏附(图5)。
2.LDL促进无血清条件下450nm低量激光脉冲诱导的细胞黏附：在无血清培养条件下培养NIH3T3细胞，分别添加不同浓度的LDL(0-2mg/mL)，450nm激光以100mW能量，脉冲1s，间隔2h，持续12个循环。辐射后以含0.125％胰蛋白酶的磷酸盐缓冲液(PBS)室温下消化体外培养NIH3T3细胞5-10min，PBS洗涤2次，每次1min。培养皿内加入0.5mg/ml溴化乙锭，室温染色5min，弃去培养基，PBS洗涤2次，每次5min，在紫外线成像系统下观察采集图像，记录荧光强度。结果显示，无血清培养条件下，1-2mg/mLLDL可以有效增加激光脉冲诱导的细胞成图案效果，证实无血清培养细胞可通过添加1mg/mLLDL实现450nm低量激光脉冲诱导的细胞成图案。
图5为低密度脂蛋白在450nm激光脉冲诱导细胞成图案中的作用示意图。其中，(a)为450nm激光脉冲诱导LDL吸附于细胞表面示意图；(b)为LDL在细胞表面的3D成像示意图；(c)为450nm激光脉冲对不同浓度LDL吸附效果的影响示意图；(d)为不同浓度LDL对450nm激光脉冲诱导细胞黏附的影响示意图；(e)为450nm激光脉冲诱导细胞黏附原理示意图。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的系统而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。
本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处。综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (6)

1.一种基于数控激光辐射的非入侵式的细胞成图案方法，其特征在于，包括：
通过在无血清培养基添加1mg/mL低密度脂蛋白进行细胞培养，得到体外培养细胞；
利用调节后的数控激光辐射所述体外培养细胞，得到辐射后细胞，其中激光辐射是450nm激光以100mW能量，脉冲1s；
利用含0.125%胰蛋白酶的磷酸盐缓冲液消化所述辐射后细胞5-10min，继续培养体外培养细胞，得到体外成图案的图像；
采集所述体外成图案的图像。
2.根据权利要求1所述的基于数控激光辐射的非入侵式的细胞成图案方法，其特征在于，
采集无菌条件下的细胞株；
将所述细胞株在无血清培养基添加1mg/mL低密度脂蛋白进行培养，得到体外培养细胞。
3.根据权利要求1所述的基于数控激光辐射的非入侵式的细胞成图案方法，其特征在于，所述利用调节后的数控激光辐射所述体外培养细胞，得到辐射后细胞，包括：
设置激光辐射参数，所述激光辐射参数包括空间图案、脉冲时间、能量强度和脉冲间隔时间；
根据所述激光辐射参数和数控激光辐射所述体外培养细胞，得到辐射后细胞。
4.一种基于数控激光辐射的非入侵式的细胞成图案系统，其特征在于，包括：
细胞培养模块，用于通过在无血清培养基添加1mg/mL低密度脂蛋白进行细胞培养，得到体外培养细胞；
激光辐射模块，用于利用调节后的数控激光辐射所述体外培养细胞，得到辐射后细胞，其中激光辐射是450nm激光以100mW能量，脉冲1s；
蛋白酶消化模块，包括：蛋白酶消化单元，用于利用含0.125%胰蛋白酶的磷酸盐缓冲液消化洗脱所述辐射后细胞5-10min，继续培养体外培养细胞，得到体外成图案的图像；
图像采集模块，用于采集所述体外成图案的图像。
5.根据权利要求4所述的基于数控激光辐射的非入侵式的细胞成图案系统，其特征在于，所述细胞培养模块，包括：
细胞株采集单元，用于采集无菌条件下的细胞株；
细胞培养单元，用于将所述细胞株在无血清培养基添加1mg/mL低密度脂蛋白进行培养，得到体外培养细胞。
6.根据权利要求4所述的基于数控激光辐射的非入侵式的细胞成图案系统，其特征在于，所述激光辐射模块，包括：
激光辐射参数设置单元，用于设置激光辐射参数，所述激光辐射参数包括空间图案、脉冲时间、能量强度和脉冲间隔时间；
激光辐射单元，用于根据所述激光辐射参数和数控激光辐射所述体外培养细胞，得到辐射后细胞。
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