KR20180083934A - 중간엽 줄기세포의 제조방법 - Google Patents

중간엽 줄기세포의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명에 의하면 중간엽 줄기세포를 함유하는 세포집단을 피브로넥틴 프래그먼트의 존재하에서 배양하는 공정을 포함함으로써, 이종 유래 성분 불포함 배지에서 단기간에 대량의 중간엽 줄기세포가 제조된다.

Description

중간엽 줄기세포의 제조방법
본 발명은 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell: MSC)의 제조방법에 관한 것으로서, 그 중에서도 특히 지방 유래 줄기세포(adipose-derived stem cells: ASC 또는 ADSC)의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명은 또, 상기 방법에 의해 수득되는 중간엽 줄기세포, 당해 세포를 유효성분으로 함유하는 재생의료용 조성물에 관한 것이다.
중간엽 줄기세포란 중배엽성 조직(간엽)에 유래하는 중배엽성 줄기세포이며, 중간엽에 속하는 세포로의 분화능을 가지기 때문에, 뼈나 혈관, 심근의 재구축 등의 재생의료으로의 응용이 기대되고 있다. 또 발생학, 분자생물학, 약학분야에서의 연구 툴로서도 이용 가능성을 가지고 있다. MSC는 골수, 지방조직, 혈액, 태반, 탯줄, 치수 등, 여러 조직으로부터 취득할 수 있음이 알려져 있지만, 채취하는 조직에 따라서 특성이 다르기 때문에, 채취하는 조직마다 골수유래 줄기세포나 지방 유래 줄기세포 등으로 불리고 있다.
종래, 중간엽 줄기세포는 골수로부터 채취되고 있었지만, 골수 중에는 중간엽 줄기세포는 소량밖에 존재하지 않고, 또 고령이 됨에 따라서 중간엽 줄기세포의 수가 감소하기 때문에, 임상응용을 시야에 넣으면, 충분한 세포수를 얻기 위해서 전신마취하에서 수 백㎖나 되는 골수를 채취해야 하는 경우가 상정되고, 환자에 대한 부담이 크다. 한편, 피하지방에는 중간엽 줄기세포가 풍부하게 존재하고, 국부마취의 지방흡입에 의해 간편하게 취득할 수 있기 때문에, 환자에 대한 부담은 작고, 최근에서는 지방 유래 줄기세포를 사용한 임상연구가 많아지고 있다.
일반적으로 이루어지고 있는 지방 유래 줄기세포의 취득 방법에서는, 인간으로부터 채취한 소량의 지방편을 효소처리해서 수득되는 세포집단으로부터, 원심분리에 의해 침강성의 기질혈관분획(stromal vascular fraction: SVF)을 분리하고, 소 혈청을 포함하는 배지 중에서 계대배양하는 것에 의해서 증식시킨다(비특허문헌 1). 그러나 동물유래 성분인 소 혈청의 사용은 임상응용을 시야에 넣었을 때에 큰 문제가 된다.
Tissue Engineering, 2001, Vol.7, No.2, pages 211-218
본 발명은 이러한 종래의 중간엽 줄기세포 제조방법이 가지고 있었던 문제를 해결하려고 하는 것으로서, 이종 유래 성분을 포함하지 않는 배지에서, 단기간에 대량의 중간엽 줄기세포를 제조하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 하는 것이다.
본 발명자들은 상기의 과제를 해결하기 위해서 예의 연구를 거듭한 결과, 중간엽 줄기세포를 함유하는 세포집단을 피브로넥틴 프래그먼트의 존재하에서 배양하는 공정을 포함함으로써, 이종 유래 성분 불포함 배지에서 단기간에 대량의 중간엽 줄기세포가 제조되는 것을 발견하고, 본 발명을 완성시켰다.
본 발명을 개략적으로 설명하면, 본 발명은 이하에 관한 것이다.
[1] 중간엽 줄기세포를 함유하는 세포집단을 피브로넥틴 프래그먼트의 존재하에서 배양하는 공정을 포함하는 중간엽 줄기세포의 제조방법.
[2] 상기 [1]에서, 피브로넥틴 프래그먼트가 세포접착 도메인 및 헤파린 결합 도메인으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 적어도 하나의 도메인을 가지는 프래그먼트인 것을 특징으로 하는 제조방법.
[3] 상기 [1]에서, 피브로넥틴 프래그먼트의 존재하에서 배양하는 공정이 피브로넥틴 프래그먼트가 코팅된 고상과 접촉한 상태에서 배양하는 공정인 것을 특징으로 하는 제조방법.
[4] 상기 [1]에서, 배양하는 공정이 이종 유래 성분 불포함 배지에서 배양하는 공정인 것을 특징으로 하는 제조방법.
[5] 상기 [4]에서, 이종 유래 성분 불포함 배지가 무혈청 배지 또는 동종 혈청을 함유하는 배지인 것을 특징으로 하는 제조방법.
[6] 상기 [1]에서, 세포집단이 인간 유래의 세포집단인 것을 특징으로 하는 제조방법.
[7] 상기 [6]에서, 세포집단이 생체조직에서 직접 분리한 세포집단인 것을 특징으로 하는 제조방법.
[8] 상기 [7]에서, 생체조직이 지방조직, 골수, 혈액, 태반, 탯줄, 치수로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
[9] 상기 [6]에서, 세포집단이 배아 줄기세포 또는 인공 다능성 줄기세포로부터 분화·유도된 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 하는 제조방법.
[10] 상기 [1] 내지 [9] 중 어느 하나에 기재된 방법으로 수득되는 중간엽 줄기세포.
[11] 상기 [10]에 기재된 세포를 유효성분으로서 함유하는 치료용 조성물.
[12] 상기 [1] 내지 [9] 중 어느 하나에 기재된 방법으로 수득되는 중간엽 줄기세포를 분화시키는 공정을 포함하는 중간엽에 속하는 세포의 제조방법.
[13] 상기 [1]에서, 분화시키는 공정이 중간엽 줄기세포로부터 다른 세포로의 분화를 유도하는 분화 유도제를 함유하는 배지에서 배양하는 공정인 것을 특징으로 하는 제조방법.
본 발명에 의해, 이종 유래 성분 불포함 배지에서 단기간에 대량의 중간엽 줄기세포를 제조하는 것이 가능하게 된다.
도 1은 실시예 1에서의, 배양 8일째의 현미경상을 나타낸다. (좌)조건 A, (중앙)조건 B, (우)조건 C
도 2는 실시예 2에서의, 배양 일수와 회수 시의 세포 수를 나타낸다.
도 3은 실시예 4에서의, 중간엽 줄기세포로부터 각종 세포로의 분화를 나타낸다.
정의 등:
본 명세서에 있어서 「중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell: MSC)」란, 중배엽성 조직(간엽)에 유래하는 체성(중배엽성) 줄기세포이다.
중간엽 줄기세포는 예를 들면 CD73, CD90, CD105와 같은 특이적인 세포 표면 마커를 발현하는 것이 알려져 있다. 이것들의 마커의 발현을 면역학적 방법(항체에 의한 검출) 등으로 조사하는 것에　의해, 출발 재료로 하는 시료, 혹은 최종적으로 수득된 세포집단 중의 중간엽 줄기세포를 검출·정량할 수 있다.
본 명세서에 있어서 「지방 유래 줄기세포(adipose-derived stem cells: ADSC 또는 ASC)」란, 지방조직에 포함되는 줄기세포이다. 지방 유래 줄기세포는 중간엽 줄기세포에 하나이며, 중간엽 줄기세포와 동일한 분화능을 유지한다.
본 명세서에 있어서 「동종」이란, 생물 또는 그것이 가지는 유전자 등에 대해서, 기준이 되는 종과 동일 종에 유래하는 것을 말한다. 동종에는 동계 및 자기가 포함된다.
본 명세서에 있어서 「이종」이란, 생물 또는 그것이 가지는 유전자 등에 대해서, 기준이 되는 종과 다른 종에 유래하는 것을 말한다.
본 명세서에 있어서 「이종 유래 성분 불포함(xeno-free)」이란, 기준이 되는 종과 다른 종 유래의 성분이 들어가 있지 않는 것을 말한다.
이하에 본 발명에 대해서 상세하게 설명한다.
(1) 본 발명의 중간엽 줄기세포 제조방법
<중간엽 줄기세포를 함유하는 세포집단>
본 발명의 중간엽 줄기세포 제조방법은 중간엽 줄기세포를 함유하는 세포집단을 피브로넥틴 프래그먼트의 존재하에서 배양하는 공정을 포함한다. 이하에서는, 「중간엽 줄기세포를 함유하는 세포집단」에 대해서 상세하게 설명한다.
「중간엽 줄기세포를 함유하는 세포집단」이란 중간엽 줄기세포를 가지는 세포집단이라면 특별하게 한정은 없다.
사용되는 세포의 생물유래는 특별하게 한정되지 않고, 임의의 생물, 바람직하게는 포유동물에 유래할 수 있다. 생물의 연령, 성별은 특별하게 한정되지 않는다. 하나의 실시형태에 있어서, 영장목(예를 들면, 침팬지, 일본원숭이, 인간) 유래의 세포가 사용된다. 가장 바람직하게는, 인간 유래의 세포가 사용되지만, 본 발명은 그것에 한정되지 않는다. 인간으로의 투여를 목적으로 해서 본 발명 의 방법에 의해 중간엽 줄기세포를 제조하는 경우, 바람직하게는 수용자와 조직 적합성 항원의 타입이 일치 또는 유사한 도너에서 채취된 세포집단이 재료로 된다. 더 바람직하게는 수용자 자신으로부터 채취된 세포집단이 중간엽 줄기세포의 제조에 적용된다.
「중간엽 줄기세포를 함유하는 세포집단」은 중간엽 줄기세포를 함유하는 생체조직으로부터 직접 분리한 초대 세포일 수도 있고, 또, 수립된 중간엽 줄기세포주, 배아 줄기세포나 인공 다능성 줄기세포로부터 분화·유도된 중간엽 줄기세포일 수도 있고, 이것들을 동결보존한 것일 수도 있다. 여기에서, 「직접」이란, 생체외에서의 배양/증식을 실시하는 공정을 거치지 않는 것을 말한다.
상기 중간엽 줄기세포를 함유하는 생체조직으로서는 골수, 지방조직, 혈액, 태반, 탯줄, 치수 등이 예시된다. 지방조직은 지방흡입 또는 지방조직 절제에 의해 채취할 수 있고, 개체에 제공하는 기능 장애의 우려가 작다는 점에서 상기 세포집단의 채취원으로 호적하다.
지방조직이란, 지방세포에 의해 구성되는 생체조직의 일종이다. 본 발명에서 사용되는 지방조직의 부위는 특별하게 한정되지 않지만, 피하지방, 내장지방, 근육내지방, 근육간 지방이 예시된다. 이 중에서도 피하지방은 국소마취하에서 간단하게 채취할 수 있기 때문에, 채취 시 도너에 대한 부담이 적고, 바람직한 세포원이라 할 수 있다.
지방조직의 조제 방법은 특별하게 한정되지 않고, 미용정형의 때 지방흡입수술에 의해 흡인되는 조직편이나, 외과수술 등의 때에 생체로부터 절제되는 조직에 포함되는 절제 지방조직으로부터 조제할 수 있다. 지방 유래 줄기세포는 굵은 혈관의 주위에 존재하기 위해서 지방흡입액보다도 절제 지방조직으로부터 많이 얻을 수 있다. 한편, 지방 흡입액으로부터 줄기세포를 조제하는 것이, 수술 흔적이 작게 되므로 도너의 부담이 작다.
또, 통상은 1종류의 지방조직을 사용하지만, 2종류 이상의 지방조직을 병용하는 것도 가능하다. 또, 복수 회로 나누어서 채취한 지방조직을 혼합하고, 사용할 수 있다.
지방조직의 채취량은 도너의 종류나 조직의 종류, 혹은 필요로 되는 중간엽 줄기세포의 양을 고려해서 정할 수 있다. 특히 본 발명을 한정하는 것은 아니지만, 0.3∼20g의 지방조직으로부터 중간엽 줄기세포를 얻을 수 있다. 스케일 업이나 복수 회로 나누어서 조작을 실시하는 것에　의해, 추가로 다량의 지방조직을 출발 재료로 할 수도 있다.
채취한 지방조직은 필요에 따라서 그것에 부착된 혈액성분의 제거 및 작은 조각화를 거친 후, 이하의 효소처리(프로테아제 처리)가 실시된다. 또 지방조직을 적당한 완충액이나 배양액 중에서 세정하는 것에 의해서 혈액성분을 제거할 수 있다.
효소처리는 지방조직을 콜라게나아제, 트립신, 디스파제 등의 프로테아제에 의해 소화하는 것에 의해 실시한다. 이러한 효소처리는 당업자에게 있어서 기지의 수법 및 조건에 의해 실시할 수 있다(예를 들면, R.I. Freshney, Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 4th Edition, A John Wiley & Sones Inc., Publication 참조). 바람직하게는, 후술의 실시예에 기재된 수법 및 조건에 의해서 효소처리를 실시한다.
효소 처리된 지방조직은 2개의 주요한 세포집단, 기질혈관분획과 성숙 지방세포를 포함한다. 기질혈관분획은 전지방세포, 성숙내피세포, 내피전구세포, 혈관평활근세포, 주피세포, 벽세포, 마크로파지, 섬유아세포, 및 지방 유래 줄기세포로 이루어지는 세포 혼합물이다. 지방 유래 줄기세포는 지방세포, 골아세포, 및 연골세포 등으로 용이하게 분화될 수 있는 중간엽 줄기세포이다. 세포집단을 구성하는 세포의 종류나 비율 등은 사용한 지방조직의 유래나 종류에 의존한다.
효소 처리된 지방조직은 계속해서 원심 처리해서 2개의 세포집단은 서로 분리된다. 원심 처리에 의한 침전물을 침강 세포집단(상기한 기질혈관분획을 포함한다)으로서 회수한다. 원심 처리의 조건은 세포의 종류나 양에 따라서 다르지만, 예를 들면 1∼15분 동안, 300∼2000×g이다. 또, 원심 처리에 앞서서, 효소처리 후의 세포집단을 여과 등 처리하고, 그 안에 포함되는 효소 미소화 조직 등을 제거해 둘 수 있다. 여과에는 예를 들면 포어 직경 50∼2000㎛, 바람직하게는 포어 직경 100㎛의 필터를 사용할 수 있다. 본 발명에 있어서는 기질혈관분획을 「중간엽 줄기세포를 함유하는 세포집단」으로 사용할 수 있다.
<피브로넥틴 프래그먼트>
피브로넥틴은 동물의 혈액 중, 배양세포 표면, 조직의 세포외 매트릭스에 존재하는 분자량 약 25만의 거대한 당 단백질로 다채로운 기능을 가지는 것이 알려져 있다. 그 도메인 구조는 7개로 나눌 수 있고 있어, 또 그 아미노산 서열 중에는 3종류의 유사한 서열이 포함되어 있으며, 이들 각 서열의 반복으로 전체가 구성되어 있다. 3종류의 유사한 서열은 I형, II형, III형이라고 불리고, 이 중, III형은 아미노산 잔기 71∼96개의 아미노산 잔기로 구성되고 있고, 이들 아미노산 잔기의 일치율은 17∼40%이다. 피브로넥틴 중에는 14개의 III형의 서열이 존재하지만, 그 중, 8번째, 9번째, 10번째(이하, 각각 III-8, III-9, III-10이라 칭한다)는 세포접착 도메인에, 또 12번째, 13번째, 14번째(이하, 각각 III-12, III-13, III-14라 칭한다)는 헤파린 결합 도메인에 함유되어 있다. III-10에는 인테그린 α5β1(VLA-5 라고도 한다)에 대해서 결합 활성을 가지는 영역이 포함되고 있고, 이 코어 서열은 RGD이다. 또, 피브로넥틴의 C말단측에 편파적인 부위에는 IIICS라 불리는 영역이 존재한다. 여기는 CS-1로 불리는 25아미노산으로 이루어지는 서열이 포함되어 있고, 당해 서열은 인테그린 α4β1(VLA-4 라고도 칭한다)에 대해서 결합 활성을 나타낸다.
III-8∼III-14 및 CS-1의 아미노산 서열을, 각각 서열번호 1∼7 및 8로 해서, 본 명세서의 일부인 서열목록에 나타낸다. 본 발명에는 중간엽 줄기세포의 배양에 적합한 성질을 가지는 한, 임의의 피브로넥틴 프래그먼트, 예를 들면 상기의 아미노산 서열로부터 선택되는 하나 또는 복수의 아미노산 서열을 함유하는 피브로넥틴 프래그먼트를 사용할 수 있다.
피브로넥틴 프래그먼트로서 분자 내에 세포접착 도메인이나 헤파린 결합 도메인을 가지는 프래그먼트가 다수 알려져 있다[예를 들면, Biochem., vol. 110, pp. 284-291, 1991].
본 발명에서 사용되는 피브로넥틴 프래그먼트는 특별하게 한정은 되지 않지만, 예를 들면, 세포접착 도메인(III-8, III-9, 및 III-10) 및 헤파린 결합 도메인(III-12, III-13, 및 III-14)으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 적어도 하나의 도메인을 가지는 것을 들 수 있다.
본 명세서에 있어서, 피브로넥틴 프래그먼트는 상기의 피브로넥틴이 기능적인 도메인, 즉, 세포접착 도메인 또는 헤파린 결합 도메인을 포함하는 것일 수 있고, 피브로넥틴의 연속한 아미노산 서열의 일부로 이루어지는 것일 수도 있다. 피브로넥틴 프래그먼트는 천연으로부터 수득된 피브로넥틴의 효소 소화에 의한 단편화, 또는 재조합 DNA 기술에 의해 제조할 수 있다. 불순물의 제거에 관한 노동력의 점, 및 효소 인식부위 등에 좌우되지 않고 목적으로 하는 프래그먼트를 설계·취득할 수 있는 점에서, 재조합 피브로넥틴 프래그먼트는 본 발명에 호적하다. 재조합체의 제조, 혹은, 취급의 점에서, 본 발명에서 사용되는 피브로넥틴 프래그먼트의 분자량은 100 kDa 이하가 바람직하다.
세포접착 도메인과 헤파린 결합 도메인의 양쪽을 가지는 피브로넥틴 프래그먼트의 일례로서, 레트로넥틴(등록상표) (TAKARA BIO INC.사)을 들 수 있다. 레트로넥틴은 전기 J. Biochem.에 CH-296로서 기재되어 있다. 레트로넥틴은 세포접착 도메인(III-8, III-9, 및 III-10), 헤파린 결합 도메인(III-12, III-13, 및 III-14) 및 CS-1을 포함하는 분자량 약 63000(574 아미노산 잔기)의 재조합 단백질이다. 레트로넥틴의 아미노산 서열을 서열번호 9로 해서 본 명세서의 일부인 서열목록에 나타낸다.
또, 본 명세서에서의 피브로넥틴 프래그먼트에는 아세틸화 등의 단백의 화학 변형체 등도 포함된다. 또, 본 발명에서의 중간엽 줄기세포의 제조에서는 피브로넥틴 프래그먼트가 단일의 분자종의 것 이외에, 복수의 분자종을 혼합해서 사용할 수 있다.
또 이것들의 피브로넥틴 프래그먼트와 기능적으로 동등한 물질, 예를 들면, 세포접착 도메인 및/또는 헤파린 결합 도메인을 가지는 물질도 사용할 수 있다. 또, 피브로넥틴 프래그먼트의 유도체 등도 사용할 수 있다.
본 발명에서의 피브로넥틴 프래그먼트의 존재하에서 배양은 중간엽 줄기세포를 함유하는 세포집단과 피브로넥틴 프래그먼트가 접촉하는 어느 쪽의 방법으로 실시할 수도 있다. 예를 들면, 피브로넥틴 프래그먼트를 배지 중에 용해시켜서 배양에 적용할 수도 있고, 또는 피브로넥틴 프래그먼트를 고상으로 고정화해서, 해당 고상을 배양에 사용할 수도 있다. 본 발명이 호적한 형태에서는 중간엽 줄기세포를 함유하는 세포집단을 피브로넥틴 프래그먼트가 코팅된 고상과 접촉한 상태에서 배양하는 공정을 포함한다. 이하에서는, 「피브로넥틴 프래그먼트가 코팅된 고상」에 대해서 상세한 설명한다.
본 발명이 호적한 형태에 있어서, 상기의 피브로넥틴 프래그먼트는 적절한 고상, 예를 들면 세포배양에 사용되는 용기 또는 담체(마이크로비즈 등)에 코팅된 상태로 사용된다. 배양 용기는 세포의 유지·생존·분화·성숙·자기복제를 저해하는 것이 아니면 어떠한 소재, 형상의 것을 사용할 수 있다. 배양 용기의 소재로서는 예를 들면 글래스, 부직포를 포함하는 합성 수지나 천연 수지 또는 금속 등이 있다. 또, 배양 용기의 형상으로서는 삼각주, 정육면체, 직육면체 등의 다각주나 원주, 3각뿔, 사각뿔 등의 다각뿔이나 원뿔, 표주박과 같은 임의의 형상, 구형, 반구형, 원형, 타원형, 반원형 등이 있다. 시판하고 있는 배양 플라스크, 배양접시(배양 디쉬), 배양 백, 중공사형의 배양장치 등을 사용할 수도 있다.
또, 배양 백으로서는 가스 투과성을 가지는 것이 호적하다. 대량의 세포를 필요로 하는 경우에는, 대형 배양조를 사용할 수 있다. 배양은 개방계 또는 폐쇄계의 어느 쪽으로도 실시할 수 있지만, 수득된 중간엽 줄기세포의 인간으로의 투여 등을 목적으로 하는 경우에는 폐쇄계에서 배양을 실시하는 것이 바람직하다.
고상 표면으로의 피브로넥틴 프래그먼트의 코팅은, 공지의 수법에 의해 실시할 수 있고, 예를 들면, 피브로넥틴 프래그먼트를 멸균 증류수, 완충액 혹은 생리식염수 등에 용해한 상태로 코팅에 사용할 수 있다. 적합하게는, 인산 완충 생리식염수(phosphate buffered saline: PBS)에 피브로넥틴 프래그먼트를 용해시킨다.
본 발명에서 사용되는 피브로넥틴 프래그먼트의 양은 특별하게 한정되지 않고, 당업자가 적당하게 결정할 수 있다. 예를 들면, 피브로넥틴 프래그먼트로서 레트로넥틴을 사용하는 경우, 예를 들면 최종농도 20㎍/㎖의 레트로넥틴을 포함하는 PBS를 배양 용기에 첨가하고, 실온에서 1시간 인큐베이션하는 것에　의해, 코팅을 실시할 수 있다.
피브로넥틴 프래그먼트가 코팅된 용기는 사용시까지 저온, 예를 들면 4℃에서 보존할 수 있다. 사용 직전에는 이것들의 배양 기재로부터 피브로넥틴 프래그먼트 함유 용액을 흡인 제거하고, PBS로 1회, 이어서 각 세포 배양용 배지로 1회 세정하고 나서 세포 배양한다.
<배양>
본 발명의 중간엽 줄기세포 제조방법에 있어서 「중간엽 줄기세포를 함유하는 세포집단을 피브로넥틴 프래그먼트의 존재하에서 배양하는 공정」은 중간엽 줄기세포의 분리 배양 공정, 또는 중간엽 줄기세포의 확대 배양 공정 ,또는 중간엽 줄기세포의 분리 배양 및 중간엽 줄기세포의 확대 배양의 양쪽을 포함하는 공정이다. 따라서 본 발명의 중간엽 줄기세포 제조방법은 「중간엽 줄기세포를 함유하는 세포집단을 피브로넥틴 프래그먼트의 존재하에서 배양하는 공정」을 포함하는 중간엽 줄기세포의 분리 배양방법, 또는 「중간엽 줄기세포를 함유하는 세포집단을 피브로넥틴 프래그먼트의 존재하에서 배양하는 공정」을 포함하는 중간엽 줄기세포의 확대 배양 방법일 수도 있다. 본 발명이 호적한 형태에서는 중간엽 줄기세포의 분리 배양, 및 분리 배양한 중간엽 줄기세포의 확대 배양의 2단계의 공정에 의해, 중간엽 줄기세포를 취득하는 방법이 예시된다. 이하에서는, 이들 공정에 대해서 상세한 설명한다.
(i) 중간엽 줄기세포의 분리 배양
본 공정은 중간엽 줄기세포를 함유하는 세포집단을 피브로넥틴 프래그먼트의 존재하에서 배양하는 것에　의해, 목적하는 중간엽 줄기세포를 선택적으로 증식시킨다.
본 공정에 있어서의 배지는 통상의 동물세포의 배양에 사용되는 배지를 기초배지로 해서 조제할 수 있다. 적합하게는, 소 태아 혈청(fetal bovine serum: FBS 또는 fetal calf serum: FCS)이나 양 혈청 등의 이종 유래 성분을 포함하지 않는 배지를 들 수 있다. 이러한 이종 유래 성분 불포함(xeno-free) 배지는 적당하게 조제할 수 있지만, 공지의 배지나 시판하고 있는 배지를 그대로, 혹은 개변해서 사용할 수 있다. 시판하고 있는 이종 유래 성분 불포함 배지로서는 예를 들면 DEF-CS500XF(Cellartis사), DXF(PromoCell사)을 사용할 수 있다.
생체로의 투여를 목적으로 해서 자기의 조직으로부터 중간엽 줄기세포를 제조하는 경우, 배지는 동종 혈청을 함유하는 것 일 수도 있고, 혹은 무혈청 배지일 수도 있다. 호적한 예로서는, 이종 유래 성분을 포함하지 않는 동종 혈청 함유 또는 무혈청 배지를 들 수 있다. 동종 혈청은 자기 혈청이 바람직하다. 여기에서 자기 혈청, 및 후술의 자기 혈장이란 배양되는 세포집단과 동일한 도너로부터 채취된 혈액에서 수득된 혈청 및 혈장을 각각 의미한다.
혈장은 혈청의 성분을 함유하고 있기 때문에, 자기 혈장을 함유하는 배지를 사용할 수 있다. 바람직하게는 비활성화된 자기 혈장이 배지에 첨가된다. 예를 들면, 10%(V/V) 이하, 바람직하게는 5%(V/V) 이하, 더욱 바람직하게는 2%(V/V) 이하의 비활성화된 자기 혈장을 포함하는 배양액 중에서 세포를 배양한다. 자기 혈장을 사용하는　것에　의해서, 제조공정 중에서 이종 유래 성분을 배척하고, 안전성이 높은 세포의 제조방법이 제공된다.
세포의 배양조건에는 특별하게 한정은 없고, 통상의 세포 배양조건을 채용할 수 있다. 상기배양조건으로서, 온도 37℃, 습도 95%, CO2 농도 5%에서의 배양이 예시되지만, 본 발명은 이러한 조건에 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 온도 30∼40℃, 습도 90∼98%, CO2 농도 3∼7%, 에서의 배양이 예시되지만, 소망의 세포 증식을 달성할 수 있는 온도라면 상기의 범위 이외의 온도, 습도, CO2 농도에서 실시할 수도 있다. 배양 중은 적절한 간격으로 유효성분을 함유하는 배지의 교환을 실시하는 것이 바람직하다.
본 발명이 호적한 형태에 있어서, 기질혈관분획은 피브로넥틴 프래그먼트가 코팅된 용기 중에서 5% 자기 혈장이 첨가된 이종 유래 성분 불포함 배지를 사용하고, 3∼4일마다 배지교환을 실시하면서, 예를 들면 4∼14일 동안, 바람직하게는 7∼10일 동안 배양된다. 이 배양에 의해, 중간엽 줄기세포를 선택적으로 증식시킬 수 있다. 즉, 이 배양에서 수득된 세포집단에 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상이 중간엽 줄기세포이다.
분리 배양에서의 배양 개시 시의 세포농도로서는, 특별하게 한정은 없지만, 예를 들면 0.1∼10×105 cells/㎖, 적합하게는 0.3∼5×105 cells/㎖, 더욱 적합하게는 0.5∼2×105 cells/㎖가 예시된다.
(ii) 중간엽 줄기세포의 확대 배양
본 공정은 중간엽 줄기세포를, 피브로넥틴 프래그먼트의 존재하에서 확대 배양하는 것에　의해, 중간엽 줄기세포를 대량으로 증식시킨다. 본 공정의 배양에 적용되는 중간엽 줄기세포로서는 어느 하나의 방법에 의해 분리된 중간엽 줄기세포 또는 중간엽 줄기세포를 포함하는 세포집단, 예를 들면, 상기 공정(i)에서 분리 배양된 중간엽 줄기세포, 또는 수립된 중간엽 줄기세포주, 배아 줄기세포나 인공 다능성 줄기세포로부터 분화·유도된 중간엽 줄기세포를 들 수 있다.
상기 공정(i)에서 분리 배양된 중간엽 줄기세포를 배양 용기로부터 분리하는 방법으로서는 당해 분야에서 통상 수행되는 방법을 사용할 수 있고, 예를 들면, 물리적 방법, 킬레이트제를 사용하는 방법, 프로테아제 활성 및/또는 콜라게나아제 활성을 가지는 분리액 예를 들면 Accutase(등록상표) 및 Accumax(등록상표)등)을 사용하는 효소적 방법이나 그것들의 조합을 들 수 있다. 바람직하게는 효소적 방법으로 중간엽 줄기세포의 시트를 분해한 후, 물리적으로 잘게 세포를 분산시키는 방법이다. 여기에서, 사용하는 세포는 사용한 배양 용기에 대해서 70∼95% 컨플루언트가 될 때까지 배양된 세포인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 80∼90% 컨플루언트가 될 때까지 배양된 세포다.
분리한 세포집단은 그대로 혹은 동결 보존한 것의 어느 것이나 사용할 수 있다. 또, 상기의 세포집단에서 특정한 세포 표면 마커에 의거해서 분리된 세포의 서브세트, 예를 들면 분리된 중간엽 줄기세포를 본 공정에 사용할 수도 있다.
본 공정에서의 배지 및 배양조건은, 상기 공정(i)에 대해서 기재된 것과 동일하다. 본 공정은 상기 공정(i)과 동일한 배지·용기·배양조건으로 실시할 수도 있고, 또는 상 기공정(i)과는 다른 배지·용기·배양조건으로 실시할 수도 있다. 상기 공정(i)에 기재된 배양과 동일하게, 적합하게는 이종 유래 성분을 포함하지 않는 배지가 사용되고, 임의의 이종 성분 비함유 배지, 예를 들면 공지의 배지나 시판하고 있는 배지를 그대로, 혹은 개변해서 사용할 수 있다.
본 발명이 호적한 형태에 있어서, 분리 배양된 중간엽 줄기세포는 피브로넥틴 프래그먼트가 코팅된 용기 중에서, 혈청이 첨가되어 있지 않은 이종 유래 성분 불포함 배지를 사용하고, 3∼4일마다 배지교환을 실시하면서, 적당하게 계대하고, 예를 들면 4∼14일 동안, 바람직하게는 6∼12일 동안 확대 배양된다. 이 배양에 의해, 중간엽 줄기세포를 대량으로 증식시킬 수 있다. 즉, 이 배양에 의한 증식 배율은 100배 이상, 바람직하게는 300배 이상이다.
확대 배양에서의 배양 개시 시의 세포농도로서는 특별하게 한정은 없지만, 예를 들면 0.1∼10×105 cells/㎖, 적합하게는 0.3∼5×105 cells/㎖, 더욱 적합하게는 0.5∼2×105 cells/㎖가 예시된다.
(2) 본 발명의 방법으로 수득되는 중간엽 줄기세포
상기의, 본 발명의 중간엽 줄기세포 제조방법에 의해, 중간엽 줄기세포 또는 중간엽 줄기세포를 함유하는 세포집단을 얻을 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 수득되는 중간엽 줄기세포는 중간엽 줄기세포에 특징적인 분자, 예를 들면 효소, 리셉터, 저분자 화합물 등을 검출해서 확인할 수 있다. 중간엽 줄기세포에 특징적인 분자로서는 세포 표면 마커(포지티브 마커)인 CD73, CD90, CD105, CD166, 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 또, 중간엽 줄기세포에는 발현하고 있지 않은 네거티브 마커로서 CD19, CD34, CD45, HLA-DR, CD1lb, CD14등이 알려지고 있고, 중간엽 줄기세포임의 확인에 이용할 수 있다. 상기의 분자의 검출에는 면역학적 방법을 이용할 수 있지만, 각 분자의 mRNA량의 정량에 의해 검출을 실시할 수도 있다.
본 발명의 방법에 의해 수득되는 중간엽 줄기세포를 함유하는 세포집단은 예를 들면, 그 세포집단에 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상이 상기 포지티브 마커를 발현하고 있다. 또, 본 발명의 방법에 의해 수득되는 중간엽 줄기세포를 함유하는 세포집단에서의 네거티브 마커의 발현율은 예를 들면 5% 이하, 바람직하게는 1% 이하, 더욱 바람직하게는 검출한계이하이다.
중간엽 줄기세포에 특징적인 분자를 인식하는 항체는 본 발명에 의해 수득된 중간엽 줄기세포를 분리, 정제에도 유용하다. 본 발명은 중간엽 줄기세포에 특징적인 분자에 의거해서 중간엽 줄기세포를 분리, 분리, 정제한 세포집단을 포함한다.
본 발명에서 수득되는 중간엽 줄기세포는 예를 들면 중간엽 줄기세포의 분화에 관한 연구나 여러 질환에 관한 의약 스크리닝, 의약 후보 화합물의 효능·안전성 평가 등에 사용할 수도 있다. 본 발명에 의하면, 1회의 조작으로 많은 중간엽 줄기세포를 취득할 수 있기 때문에, 지금까지와 같이 세포의 로트 차이의 영향을 받지 않고, 재현성이 있는 연구결과를 얻는 것이 가능하게 된다.
(3) 본 발명의 치료용 조성물
상기의 본 발명의 방법에 의해 수득되는 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 함유하는 치료용 조성물을 조제할 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 수득되는 중간엽 줄기세포 및 당해 세포를 함유하는 조성물은 골 질환, 연 골질환, 심장 질환, 척수손상, 이식편대숙주병 등의 질환 치료에 유용하다. 본 발명에 의해 수득된 중간엽 줄기세포를 사용해서 여러 가지의 질환의 치료 위한 의약용 조성물을 제조할 수 있다.
본 발명의 중간엽 줄기세포를 의약용 조성물로 하는 경우에는, 통상의 방법에 의해, 당해 세포를 의약적으로 허용되는 담체와 혼합하는 등 해서, 개체로의 투여에 적합한 형태의 제제로 할 수 있다. 담체로서는 예를 들면, 생리식염수, 포도당이나 기타의 보조약(예를 들면, D-솔비톨, D-만니톨, 염화나트륨 등)을 첨가해서 등장으로 한 주사용 증류수를 들 수 있다. 또, 완충제(예를 들면, 인산염 완충액, 아세트산 나트륨 완충액), 무통화제(예를 들면, 염화 벤잘코늄, 염산 프로카인 등), 안정제(예를 들면, 인간 혈청 알부민, 폴리에틸렌글리콜 등), 보존제, 산화방지제 등을 배합할 수도 있다.
(4) 본 발명의 중간엽에 속하는 세포의 제조방법
본 발명 의 방법에서 수득되는 중간엽 줄기세포를 다른 세포로의 분화를 유도하는 분화 유도제를 함유하는 배지에서 배양하는 것에　의해, 중간엽 줄기세포로부터 분화되어 발생하는 것이 알려져 있는 각종 세포, 즉 중간엽에 속하는 세포를 얻을 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 수득되는 중간엽에 속하는 세포에는 특별하게 한정은 없고, 지방세포(갈색 지방세포, 백색지방세포), 연골세포, 골세포, 골아세포, 근육세포 등이 예시된다. 중간엽에 속하는 여러 세포에 대해서, 중간엽 줄기세포로부터 분화 유도하는 방법이 알려져 있다. 예를 들면, 지방세포에 대해서는 덱사메타손, 인슐린, 3-이소부틸-1-메틸크산틴 등이, 골세포에 대해서는 덱사메타손, 아스코르브산 또는 아스코르브산-2-인산, β-글리세로인산 등이, 골아세포에 대해서는 하이드로 코르티손, 아스코르브산, β-글리세로인산 등이, 연골세포에 대해서는 인슐린, 아스코르브산-2-인산, 하이드로코르티손 등이, 각각 분화 유도제로서 알려져 있다. 중간엽 줄기세포에 이것들의 분화 유도제를 접촉시키는 것에　의해, 소망하는 세포를 얻을 수 있다.
상기와 같은 분화 유도 배지는 적당하게 조제할 수 있지만, 공지의 배지나 시판하고 있는 배지를 그대로, 혹은 개변해서 사용할 수 있다. 시판하고 있는 분화유도 배지로서 예를 들면, 지방세포로의 분화는 hMSC differentiation BulletKits-adipogenic 배지(LONZA사), 골아세포로의 분화는 hMSC differentiation BulletKits-osteogenic 배지(LONZA사), 연골세포로의 분화는 hMSC differentiation BulletKits-chondrogenic 배지(LONZA사)를 사용할 수 있다.
또, 상기의 방법에 의해 수득된 중간엽에 속하는 세포도, 의약용 조성물로 할 수 있다. 이 경우도, 목적이나 투여의 방법에 따라서 적절한 조성, 형태가 선택된다. 또 이것들의 중간엽에 속하는 세포를 의약 후보 화합물의 스크리닝이나 화합물의 안전성 평가에 사용할 수도 있다.
실시예
이하의 실시예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 범위는 이것들의 실시예에 의해 한정되지 않는다.
실시예 1: 지방 유래 줄기세포의 분리 배양
(1) 자기 혈장의 분리
사전동의가 수득된 인간 정상 도너로부터 채혈용 주사통으로 채취한 혈액을 500×g에서 20분 동안 원심하고, 혈장을 회수했다. 회수한 혈장은 56℃에서 30분 동안의 비활성화 후, 4℃에서 30분 동안 냉각하고, 800×g에서 30분 동안 원심분리하고, 그 상청액을 비활성화 자기 혈장으로 사용한했다(이하 자기 혈장이라고 약칭한다).
(2) 기질혈관분획(stromal vascular fraction: SVF)의 분리
실시예 1-(1)의 정상인 도너로부터 채취한 지방조직을 생리식염수 중에서 보관했다. 안전 캐비닛 내에서 지방조직을 10cm 배양 디쉬로 꺼내고, 멸균 가위에 의해 일변이 1∼2mm의 정육면체가 되도록 조직을 세단했다. 새로운 10cm 배양 디쉬를 칭량계에 올려 놓고, 세단한 지방조직을 15g 재취했다. 이 조직 1g에 대해서 3㎖의 2mg/㎖ Collagenase TypeI/HBSS 용액을 첨가하고, 조직을 현탁했다. 이 현탁액을 항온조 내에서 100rpm/분의 조건으로 진탕시키면서 37℃에서 1시간 보온했다. 원심 튜브를 안전 캐비닛으로 반입하고, 100㎛ 메쉬를 통해서 여과한 현탁액을 원심 튜브에 회수했다. 현탁액을 25℃, 1200×g, 10분 동안의 조건으로 원심분리를 실시하고, 전동 피펫터를 사용해서 신중하게 상청액을 제거했다. 침전물에 10∼20㎖의 ACK lysing Buffer(LONZA사)를 첨가해서 현탁하고, 실온에서 5분 동안 방치한 후, 25℃, 400×g, 5분 동안의 조건으로 원심분리를 실시했다. 전동 피펫터를 사용해서 원심 후의 시료로부터 신중하게 상청액을 제거하고, 수득된 침전에 적당량의 PBS를 첨가해서 현탁하고, 기질혈관분획을 얻었다.
(3) 레트로넥틴(RetroNectin: RN)에 의한 코팅
이하의 실험에서 사용하는 배양 기재에 RN을 코팅했다. 즉 T-25배양 플라스크(Corning사)에 레트로넥틴(등록상표)(TAKARA BIO INC.)(최종농도 20㎍/㎖)을 포함하는 인산 완충 생리식염수(PBS)를 5㎖ 첨가했다. 대조로서 레트로넥틴(이하, RN이라고 약칭한다)을 포함하지 않는 PBS를 첨가한 그룹도 설정했다.
이것들의 배양 기재를 실온에서 1시간 인큐베이션한 후, 사용시까지 4℃에서 보존했다. 사용 직전에는 이것들의 배양 기재로 PBS를 흡인 제거 후, PBS로 1회, 이어서 각 세포배양용 배지에서 1회 세정해서 배양에 적용했다. RN이 코팅된 배양 플라스크는 이하, RN 플라스크라고 기재한다.
(4) 기질혈관분획의 배양
실시예 1-(2)에서 수득된 기질혈관분획으로부터 일부 검체를 채취하고, Nucleo Counter(Chemometec사)에 의해 총 유핵세포 농도를 계측했다. 이다음, 1×105 총 유핵세포/㎖가 되도록 배양용 배지(표 1의 기초배지 및 첨가물)를 첨가하고, 세포 현탁액을 조제했다. 이 다음에, 실시예 1-(3)에서 준비한 RN 플라스크 또는 대조 플라스크에 10㎖의 세포 현탁액을 첨가하고, 37℃, CO2 농도 5%에서 배양을 개시했다(배양 0일째). 배양 개시 후 1일째에 배지를 신선 배지로 교환하고, 이후, 세포가 80∼90% 컨플루언트에 도달할 때까지 3∼4일/회의 빈도로 배지교환을 실시했다.
배양에 사용한 기초배지, 첨가물, RN 코팅의 유무, 및 80∼90% 컨플루언트에 도달할 때까지 소비한 배양 일수와 회수 시의 세포 수를 표 1에 나타낸다. 또, 배양 8일째의 현미경상을 도 1에 나타낸다.
Figure pct00001
표 1 및 도 1에서 나타내는 바와 같이, 10% FBS가 첨가된 DMEM(조건 A, 종래법)을 5% 자기 혈장이 첨가된 DEF-CS500XF(조건 B)로 변경했을 경우, 세포가 컨플루언트한 상태에 도달하는 경우는 없었다. 한편, 5% 자기 혈장이 첨가된 DEF-CS500XF를 사용해서 RN 플라스크에서 배양했을 경우(조건 C)에는 세포의 증식율은 종래법(조건 A)을 크게 상회하고, 단기간의 배양에서 보다 많은 세포를 얻을 수 있었다.
또, 배양 개시 시의 세포 수(1×106)은 기질혈관분획 중의 모든 세포가 함유되고, 대부분은 배양 개시 후 1일째의 배지교환으로 배제되기 때문에, 회수 시의 세포 수는 1×106 보다도 적어진다. 또, 80∼90% 컨플루언트에 도달했을 때의 조건 A와 조건 C의 세포 수가 크게 다른 것은 세포의 크기나 형상이 다르기 때문이다.
실시예 2: 지방 유래 줄기세포의 확대 배양
(1) 기질혈관분획의 배양
실시예 1-(4)에 기재된 방법과 동일하게, 실시예 1-(2)에서 수득된 기질혈관분획을 1×105 총 유핵세포/㎖가 되로독 배양용 배지에 현탁하고, 실시예 1-(3)에서 준비한 RN 플라스크 또는 대조 플라스크 중, 10㎖의 세포 현탁액을 첨가하고, 37℃, CO2 농도 5%에서 배양을 개시했다(배양 0일째). 배양 개시 후 1일째에 배지를 신선 배지로 교환하고, 이후, 세포가 80∼90% 컨플루언트에 도달할 때까지 3∼4일/회의 빈도로 배지교환을 실시했다. 본 배양에 사용한 기초배지, 첨가물, RN 코팅의 유무를 표 2에 나타낸다.
Figure pct00002
(2) 확대 배양
세포가 80∼90% 컨플루언트에 도달한 시점에서 세포를 회수하고, 1×105 세포/㎖가 되도록 배양용 배지(표 2의 기초배지 및 첨가물)를 첨가하고, 세포 현탁액을 조제했다. 10㎖의 세포 현탁액을, 실시예 1-(3)에서 준비한 RN 플라스크 또는 대조 플라스크에 첨가하고, 37℃, CO2 농도 5%에서 확대 배양을 개시했다(P0).
확대 배양 개시 후 1일째에 배지를 신선 배지로 교환하고, 이후, 세포가 70∼95% 컨플루언트에 도달할 때까지 3∼4일/회의 빈도로 배지교환을 실시했다. 세포가 70∼95% 컨플루언트에 도달한 시점(P1)에서 세포를 회수하고, 트리판 블루 염색에 의해 총 유핵세포 농도를 계측한 후, 재차, 1×105 세포/㎖가 되도록 배양용 배지(표 2의 기초배지 및 첨가물)를 첨가하고, 조제한 세포 현탁액을, 새로운 RN 플라스크 또는 대조 플라스크에 첨가하고, 37℃, CO2 농도 5%로 확대 배양을 계속했다. 세포가 80∼90% 컨플루언트에 도달한 시점(P2)에서 세포를 회수하고, 트리판 블루 염색에 의해 총 유핵세포 농도를 계측했다. 배양 일수와 회수 시의 세포 수를 표 3에 나타낸다. 또, 이것들의 결과를 그래프화한 것을 도 2에 나타낸다.
Figure pct00003
표 3 및 도 2에서 나타내는 바와 같이, 10% FBS가 첨가된 DMEM(조건 D, 종래법)에서의 배양에 비해서, DXF를 사용해서 RN 플라스크에서 배양했을 경우(조건E 및 조건 F)에는 단기간의 배양에 의해 보다 많은 세포를 얻을 수 있었다. 또, 자기 혈장을 포함하지 않은 경우(조건 E)에서도, 세포의 증식율은 종래법(조건 D)을 크게 상회했다.
실시예 3: 세포 표면 마커의 해석
실시예 2-(2)에서 수득된 P2의 세포집단을, 각각의 배양조건으로 세포가 80∼90% 컨플루언트에 도달한 시점에서 계대하고, 확대 배양을 계속했다. 확대 배양을 개시하고 나서 약 20일째에서 세포를 회수하고, 0.1% 소혈청알부민(bovine serum albumin: BSA, Sigma Corporation)을 포함하는 PBS (이하, 0.1% BSA/PBS로 기재)으로 세정했다. 0.1% BSA/PBS에 세포집단을 현탁하고, 항체 반응액으로서, PE-Cy7 표지 마우스 항 인간 CD73 항체(Becton, Dickinson and Company), APC 표지 마우스 항 인간 CD90 항체(Becton, Dickinson and Company), APC 표지 마우스 항 인간 CD105 항체(Becton, Dickinson and Company), PE 표지 마우스 항 인간 CD34 항체(Becton, Dickinson and Company), FITC 표지 마우스 항 인간 CD45 항체(Becton, Dickinson and Company), PE-Cy7 표지 마우스 항 인간 HLA-DR 항체(Becton, Dickinson and Company), FITC 표지 마우스 항 인간 CD1lb 항체(Becton, Dickinson and Company), 및 PE 표지 마우스 항 인간 CD14 항체(Becton, Dickinson and Compan)를 포함하는 항체액을 각각 첨가하고, 실온에서 10분 동안 방치했다. 그 후에 0.1% BSA/PBS로 세포집단을 2회 세정하고, 재차 0.1% BSA/PBS에 현탁했다. 이 세포집단을 Flow cytometry(FACSCantoII, Becton, Dickinson and Company)에 적용하고, 세포집단의 각종 세포 표면 마커의 함유율을 산출했다. 여기에서, CD73, CD90, CD105는 중간엽 줄기세포의 세포 표면 마커(포지티브 마커)이고, CD34, CD45, HLA-DR, CD1lb, CD14은 중간엽 줄기세포에 발현하지 않고 있는 네거티브 마커다. 결과를 표 4에 나타낸다.
Figure pct00004
표 중, P3은 P2의 세포집단을 계대 배양해서 80∼90% 컨플루언트에 도달한 시점의 세포집단을 나타낸다. P5는 P3의 세포집단을 2회 계대 배양해서 80∼90% 컨플루언트에 도달한 시점의 세포집단을 나타낸다.
표 4에서 나타내는 바와 같이, 모든 조건에서 중간엽 줄기세포의 포지티브 마커의 발현은 95% 이상이었다. 한편, 중간엽 줄기세포의 네거티브 마커는 종래 의 방법(조건D)에서는 조금 발현하고 있었던 것에 대해서, DXF를 사용해서 RN 플라스크에서 배양했을 경우(조건 E 및 조건 F)에서는 전부 검출한계 이하이었다. 즉, DXF를 사용해서 RN 플라스크에서 배양했을 경우, 종래의 방법보다도 효율적으로, 중간엽 줄기세포를 고함유하는 세포집단을 취득할 수 있음이 분명하게 되었다.
실시예 4: 중간엽에 속하는 세포에의 분화
실시예 3에서 수득된 중간엽 줄기세포(조건E P5)를 각종 세포로 분화시켰다.
지방세포로의 분화에서는 중간엽 줄기세포(조건E P5)를 hMSC differentiation Bullet Kits-adipogenic 배지(LONZA사)를 사용하고, 설명서의 기재에 따라서 배양했다. 배지를 제거 후, 4% 파라 포름알데히드(SIGMA사)를 첨가하고, 실온에서 10분 동안 방치함으로써 세포를 고정했다. 60% 이소프로판올(SIGMA사)로 세포를 세정한 후, Oil-RedO를 첨가해 실온에서 15분 동안 인큐베이션하고, 지질의 액적을 가시화했다.
골아세포로의 분화에서는 중간엽 줄기세포(조건E P5)을 hMSC differentiation BulletKits-osteogenic 배지(LONZA사)를 사용하고, 설명서의 기재에 따라서 배양했다. 배지를 제거 후, 4% 파라 포름알데히드(SIGMA사)를 첨가하고, 실온에서 10분 동안 방치함으로써 세포를 고정했다. 증류수에서 세포를 세정한 후, Alizarin Red 염색액을 첨가해 실온에서 45분 동안 인큐베이션하고, 칼슘 침착을 가시화했다.
연골세포로의 분화에서는 중간엽 줄기세포(조건E P5)을 hMSC differentiation BulletKits-chondrogenic 배지(LONZA사)를 사용하고, 설명서의 기재에 따라서 배양했다. 배지를 제거 후, 4% 파라 포름알데히드(SIGMA사)를 첨가하고, 실온에서 60분 동안 방치함으로써 세포를 고정했다. 증류수에서 세포를 세정한 후, Alcian Blue 염색액을 첨가해 실온에서 하룻밤 인큐베이션하고, 연골을 만드는 세포외 매트릭스의 주요성분인 프로테오글리칸을 가시화했다.
상기의 결과를 도 3에 나타낸다. 도 3에 나타내는 바와 같이, 각각의 분화 유도 배지에서 배양했을 경우에만, 세포는 염색되었다. 이것들의 결과로부터 본 발명 의 방법에 의해 수득된 중간엽 줄기세포가 분화 유도제를 함유하는 배지에서 배양하는 것에　의해, 중간엽 줄기세포로부터 분화되어 발생하는 것이 알려져 있는 각종 세포, 즉 중간엽에 속하는 세포로 분화될 수 있음이 분명하게 되었다.
(산업상의 이용가능성)
본 발명에 의해, 단기간으로 대량인 중간엽 줄기세포를 제조하는 방법이 제공된다. 본 발명의 중간엽 줄기세포 제조방법은 특히 재생 의료로의 응용에 유용하다.
SEQ ID NO:1 ; Partial region of fibronectin named III-8
SEQ ID NO:2 ; Partial region of fibronectin named III-9
SEQ ID NO:3 ; Partial region of fibronectin named III-10
SEQ ID NO:4 ; Partial region of fibronectin named III-11
SEQ ID NO:5 ; Partial region of fibronectin named III-12
SEQ ID NO:6 ; Partial region of fibronectin named III-13
SEQ ID NO:7 ; Partial region of fibronectin named III-14
SEQ ID NO:8 ; Partial region of fibronectin named CS-1
SEQ ID NO:9 ; Fibronectin fragment named Retronectin (CH-296)
SEQUENCE LISTING <110> TAKARA BIO INC. <120> Method for producing mesenchymal stem cells <130> 673183 <150>JP 2015-236442 <151>2015-12-3 <160> 9 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 87 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Partial region of fibronectin named III-8 <400> 1 Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn Ile Gly Pro Asp Thr Met Arg Val 1 5 10 15 Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser Ile Asp Leu Thr Asn Phe Leu Val Arg 20 25 30 Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu Ser Ile Ser 35 40 45 Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu Pro Gly Thr Glu 50 55 60 Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gln His Glu Ser Thr Pro 65 70 75 80 Leu Arg Gly Arg Gln Lys Thr 85 <210> 2 <211> 90 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Partial region of fibronectin named III-9 <400> 2 Gly Leu Asp Ser Pro Thr Gly Ile Asp Phe Ser Asp Ile Thr Ala Asn 1 5 10 15 Ser Phe Thr Val His Trp Ile Ala Pro Arg Ala Thr Ile Thr Gly Tyr 20 25 30 Arg Ile Arg His His Pro Glu His Phe Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp 35 40 45 Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser Ile Thr Leu Thr Asn Leu Thr Pro 50 55 60 Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Ile Val Ala Leu Asn Gly Arg Glu Glu 65 70 75 80 Ser Pro Leu Leu Ile Gly Gln Gln Ser Thr 85 90 <210> 3 <211> 94 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Partial region of fibronectin named III-10 <400> 3 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg Gly Asp 65 70 75 80 Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 <210> 4 <211> 84 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Partial region of fibronectin named III-11 <400> 4 Gln Met Gln Val Thr Asp Val Gln Asp Asn Ser Ile Ser Val Lys Trp 1 5 10 15 Leu Pro Ser Ser Ser Pro Val Thr Gly Tyr Arg Val 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Thr Ile Ser Trp Arg Thr Lys Thr Glu Thr Ile Thr Gly Phe 20 25 30 Gln Val Asp Ala Val Pro Ala Asn Gly Gln Thr Pro Ile Gln Arg Thr 35 40 45 Ile Lys Pro Asp Val Arg Ser Tyr Thr Ile Thr Gly Leu Gln Pro Gly 50 55 60 Thr Asp Tyr Lys Ile Tyr Leu Tyr Thr Leu Asn Asp Asn Ala Arg Ser 65 70 75 80 Ser Pro Val Val Ile Asp Ala Ser Thr 85 <210> 7 <211> 90 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Partial region of fibronectin named III-14 <400> 7 Ala Ile Asp Ala Pro Ser Asn Leu Arg Phe Leu Ala Thr Thr Pro Asn 1 5 10 15 Ser Leu Leu Val Ser Trp Gln Pro Pro Arg Ala Arg Ile Thr Gly Tyr 20 25 30 Ile Ile Lys Tyr Glu Lys Pro Gly Ser Pro Pro Arg Glu Val Val Pro 35 40 45 Arg Pro Arg Pro Gly Val Thr Glu Ala Thr Ile Thr Gly Leu Glu Pro 50 55 60 Gly Thr Glu Tyr Thr Ile Tyr Val Ile Ala Leu Lys Asn Asn Gln Lys 65 70 75 80 Ser Glu Pro Leu Ile Gly Arg Lys Lys Thr 85 90 <210> 8 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Partial region of fibronectin named CS-1 <400> 8 Asp Glu Leu Pro Gln Leu Val 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Leu Ile Gly Gln Gln Ser 165 170 175 Thr Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro 180 185 190 Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr 195 200 205 Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu 210 215 220 Phe Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys 225 230 235 240 Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg Gly 245 250 255 Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Glu 260 265 270 Ile Asp Lys Pro Ser Met Ala Ile Pro Ala Pro Thr Asp Leu Lys Phe 275 280 285 Thr Gln Val Thr Pro Thr Ser Leu Ser Ala Gln Trp Thr Pro Pro Asn 290 295 300 Val Gln Leu Thr Gly Tyr Arg Val Arg Val Thr Pro Lys Glu Lys Thr 305 310 315 320 Gly Pro Met Lys Glu Ile Asn Leu Ala Pro Asp Ser Ser Ser Val Val 325 330 335 Val Ser Gly Leu Met Val Ala Thr Lys Tyr Glu Val Ser Val Tyr Ala 340 345 350 Leu Lys Asp Thr Leu Thr Ser Arg Pro Ala Gln Gly Val Val Thr Thr 355 360 365 Leu Glu Asn Val Ser Pro Pro Arg Arg Ala Arg Val Thr Asp Ala Thr 370 375 380 Glu Thr Thr Ile Thr Ile Ser Trp Arg Thr Lys Thr Glu Thr Ile Thr 385 390 395 400 Gly Phe Gln Val Asp Ala Val Pro Ala Asn Gly Gln Thr Pro Ile Gln 405 410 415 Arg Thr Ile Lys Pro Asp Val Arg Ser Tyr Thr Ile Thr Gly Leu Gln 420 425 430 Pro Gly Thr Asp Tyr Lys Ile Tyr Leu Tyr Thr Leu Asn Asp Asn Ala 435 440 445 Arg Ser Ser Pro Val Val Ile Asp Ala Ser Thr Ala Ile Asp Ala Pro 450 455 460 Ser Asn Leu Arg Phe Leu Ala Thr Thr Pro Asn Ser Leu Leu Val Ser 465 470 475 480 Trp Gln Pro Pro Arg Ala Arg Ile Thr Gly Tyr Ile Ile Lys Tyr Glu 485 490 495 Lys Pro Gly Ser Pro Pro Arg Glu Val Val Pro Arg Pro Arg Pro Gly 500 505 510 Val Thr Glu Ala Thr Ile Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu Tyr Thr 515 520 525 Ile Tyr Val Ile Ala Leu Lys Asn Asn Gln Lys Ser Glu Pro Leu Ile 530 535 540 Gly Arg Lys Lys Thr Asp Glu Leu Pro Gln Leu Val Thr Leu Pro His 545 550 555 560 Pro Asn Leu His Gly Pro Glu Ile Leu Asp Val Pro Ser Thr 565 570

Claims (13)

  1. 중간엽 줄기세포를 함유하는 세포집단을 피브로넥틴 프래그먼트의 존재하에서 배양하는 공정을 포함하는 중간엽 줄기세포의 제조방법.
  2. 제1 항에 있어서,
    피브로넥틴 프래그먼트가 세포접착 도메인 및 헤파린 결합 도메인으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 적어도 하나의 도메인을 가지는 프래그먼트인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  3. 제1 항에 있어서,
    피브로넥틴 프래그먼트의 존재하에서 배양하는 공정이 피브로넥틴 프래그먼트가 코팅된 고상과 접촉한 상태에서 배양하는 공정인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  4. 제1 항에 있어서,
    배양하는 공정이 이종 유래 성분 불포함 배지에서 배양하는 공정인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  5. 제4 항에 있어서,
    이종 유래 성분 불포함 배지가 무혈청 배지 또는 동종 혈청을 함유하는 배지인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  6. 제1 항에 있어서,
    세포집단이 인간 유래의 세포집단인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  7. 제6 항에 있어서,
    세포집단이 생체조직에서 직접 분리한 세포집단인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  8. 제7 항에 있어서,
    생체조직이 지방조직, 골수, 혈액, 태반, 탯줄, 치수로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  9. 제6 항에 있어서,
    세포집단이 배아 줄기세포 또는 인공 다능성 줄기세포로부터 분화·유도된 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  10. 제1 항 내지 제9 항 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 수득되는 중간엽 줄기세포.
  11. 제10 항에 기재된 세포를 유효성분으로서 함유하는 치료용 조성물.
  12. 제1 항 내지 제9 항 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 수득되는 중간엽 줄기세포를 분화시키는 공정을 포함하는 중간엽에 속하는 세포의 제조방법.
  13. 제12 항에 있어서,
    분화시키는 공정이 중간엽 줄기세포로부터 다른 세포로의 분화를 유도하는 분화 유도제를 함유하는 배지에서 배양하는 공정인 것을 특징으로 하는 제조방법.
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