JP2010094062A - 間葉系幹細胞の多分化能維持用培地、培養方法、及び分化方法 - Google Patents
間葉系幹細胞の多分化能維持用培地、培養方法、及び分化方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2010094062A JP2010094062A JP2008266721A JP2008266721A JP2010094062A JP 2010094062 A JP2010094062 A JP 2010094062A JP 2008266721 A JP2008266721 A JP 2008266721A JP 2008266721 A JP2008266721 A JP 2008266721A JP 2010094062 A JP2010094062 A JP 2010094062A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- mesenchymal stem
- stem cells
- medium
- differentiation
- tgf
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
【課題】間葉系幹細胞の多分化能、及び増殖能を維持し、簡単に、効率よく間葉系幹細胞を培養することができる間葉系幹細胞の多分化能維持用培地、間葉系幹細胞の培養方法、及び該培養方法により得られた間葉系幹細胞、間葉系幹細胞の分化方法、及び該分化方法により得られた骨芽細胞、並びに脂肪細胞の提供。
【解決手段】本発明の間葉系幹細胞の多分化能維持用培地は、間葉系幹細胞の多分化能の維持、及び増殖が可能な培地であって、前記培地が、ＴＧＦ−βを含有することを特徴とする。前記ＴＧＦ−βの含有量が、２．５ｎｇ／ｍＬ〜５．０ｎｇ／ｍＬである態様などが好ましい。
【選択図】なし
【解決手段】本発明の間葉系幹細胞の多分化能維持用培地は、間葉系幹細胞の多分化能の維持、及び増殖が可能な培地であって、前記培地が、ＴＧＦ−βを含有することを特徴とする。前記ＴＧＦ−βの含有量が、２．５ｎｇ／ｍＬ〜５．０ｎｇ／ｍＬである態様などが好ましい。
【選択図】なし
Description
本発明は、間葉系幹細胞の多分化能の維持、及び増殖が可能な間葉系幹細胞の多分化能維持用培地、間葉系幹細胞の培養方法、及び該培養方法により得られた間葉系幹細胞、間葉系幹細胞の分化方法、及び該分化方法により得られた骨芽細胞、並びに脂肪細胞に関する。
再生医療で利用が期待される幹細胞として、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、間葉系幹細胞が挙げられる。ＥＳ細胞は、様々な細胞への分化が可能であるが、倫理的に樹立が困難であったり、腫瘍化するおそれがあったりするなど問題がある。また、ｉＰＳ細胞は、様々な細胞への分化が可能であり、ＥＳ細胞のような倫理的な問題がほとんどないが、腫瘍化するおそれがあるという問題がある。
一方、間葉系幹細胞は、骨髄や臍帯血から採取することができ、再生医療で必要とされる様々な細胞（骨、軟骨、骨格筋、心筋など）に分化可能であり、また、臓器移植の際、移植片体宿主病を抑える働きがあるなど、応用範囲が広いという利点がある。
しかし、再生医療などに間葉系幹細胞から分化した細胞を用いるためには、間葉系幹細胞を大量に確保する必要があるが、間葉系幹細胞は、特定の細胞に分化してしまいやすく、培養をしている間に多分化能、及び細胞増殖能が低下してしまうため、大量の間葉系幹細胞を確保することが困難である（例えば、非特許文献１〜２参照）。その結果、再生医療などへの応用が進んでいないのが現状である。
しかし、再生医療などに間葉系幹細胞から分化した細胞を用いるためには、間葉系幹細胞を大量に確保する必要があるが、間葉系幹細胞は、特定の細胞に分化してしまいやすく、培養をしている間に多分化能、及び細胞増殖能が低下してしまうため、大量の間葉系幹細胞を確保することが困難である（例えば、非特許文献１〜２参照）。その結果、再生医療などへの応用が進んでいないのが現状である。
間葉系幹細胞の培養方法としては、例えば、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）を培地に添加する方法が提案されている（例えば、特許文献１参照）が、間葉系幹細胞の多分化能、及び増殖能を維持し、簡単に、効率よく間葉系幹細胞を培養することができる間葉系幹細胞の培養方法の更なる改良が求められているのが現状である。
また、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−βは、例えば、特許文献１にも記載されているように、デキサメタゾン、アスコルビン酸−２−リン酸などとともに培地に添加され、該培地を用いて間葉系幹細胞を軟骨へ分化誘導することができることが知られている。しかしながら、ＴＧＦ−βを用いて、間葉系幹細胞の多分化能を維持した状態で培養することができることは知られていない。
本発明は、前記従来における諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、間葉系幹細胞の多分化能、及び増殖能を維持し、簡単に、効率よく間葉系幹細胞を培養することができる間葉系幹細胞の多分化能維持用培地、間葉系幹細胞の培養方法、及び該培養方法により得られた間葉系幹細胞、間葉系幹細胞の分化方法、及び該分化方法により得られた骨芽細胞、並びに脂肪細胞を提供することを目的とする。
前記課題を解決するため、本発明者らは鋭意検討した結果、以下のような知見を得た。即ち、培地にＴＧＦ−βを添加することにより、間葉系幹細胞の多分化能、及び増殖能を維持した状態で間葉系幹細胞を培養することができ、前記培養を行った間葉系幹細胞を分化誘導培地で培養すると、前記培養を行っていない間葉系幹細胞に比べて、効率よく分化することができるという知見である。従来、ＴＧＦ−βは、デキサメタゾンなどとともに培地に添加することにより、間葉系幹細胞を軟骨などへ誘導することは知られているが、間葉系幹細胞の多分化能を維持した状態で培養できることは全く知られておらず、前記知見は、本発明者らによって得られた予期せぬ新たな知見である。
本発明は、本発明者らの前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞ 間葉系幹細胞の多分化能の維持、及び増殖が可能な培地であって、
前記培地が、ＴＧＦ−βを含有することを特徴とする間葉系幹細胞の多分化能維持用培地である。
＜２＞ ＴＧＦ−βの含有量が、２．５ｎｇ／ｍＬ〜５．０ｎｇ／ｍＬである前記＜１＞に記載の間葉系幹細胞の多分化能維持用培地である。
＜３＞ 前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の間葉系幹細胞の多分化能維持用培地を用いることを特徴とする間葉系幹細胞の培養方法である。
＜４＞ 前記＜３＞に記載の間葉系幹細胞の培養方法により得られたことを特徴とする間葉系幹細胞である。
＜５＞ 前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の間葉系幹細胞の多分化能維持用培地を用いて間葉系幹細胞を培養する工程と、
前記培養した間葉系幹細胞を分化誘導培地で培養する工程と、
を含むことを特徴とする間葉系幹細胞の分化方法である。
＜６＞ 分化誘導培地が、骨芽細胞分化誘導培地、及び脂肪細胞分化誘導培地のいずれかである前記＜５＞に記載の間葉系幹細胞の分化方法である。
＜７＞ 前記＜５＞から＜６＞のいずれかに記載の間葉系幹細胞の分化方法により得られたことを特徴とする骨芽細胞である。
＜８＞ 前記＜５＞から＜６＞のいずれかに記載の間葉系幹細胞の分化方法により得られたことを特徴とする脂肪細胞である。
＜１＞ 間葉系幹細胞の多分化能の維持、及び増殖が可能な培地であって、
前記培地が、ＴＧＦ−βを含有することを特徴とする間葉系幹細胞の多分化能維持用培地である。
＜２＞ ＴＧＦ−βの含有量が、２．５ｎｇ／ｍＬ〜５．０ｎｇ／ｍＬである前記＜１＞に記載の間葉系幹細胞の多分化能維持用培地である。
＜３＞ 前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の間葉系幹細胞の多分化能維持用培地を用いることを特徴とする間葉系幹細胞の培養方法である。
＜４＞ 前記＜３＞に記載の間葉系幹細胞の培養方法により得られたことを特徴とする間葉系幹細胞である。
＜５＞ 前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の間葉系幹細胞の多分化能維持用培地を用いて間葉系幹細胞を培養する工程と、
前記培養した間葉系幹細胞を分化誘導培地で培養する工程と、
を含むことを特徴とする間葉系幹細胞の分化方法である。
＜６＞ 分化誘導培地が、骨芽細胞分化誘導培地、及び脂肪細胞分化誘導培地のいずれかである前記＜５＞に記載の間葉系幹細胞の分化方法である。
＜７＞ 前記＜５＞から＜６＞のいずれかに記載の間葉系幹細胞の分化方法により得られたことを特徴とする骨芽細胞である。
＜８＞ 前記＜５＞から＜６＞のいずれかに記載の間葉系幹細胞の分化方法により得られたことを特徴とする脂肪細胞である。
本発明によれば、前記従来における諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、間葉系幹細胞の多分化能、及び増殖能を維持し、簡単に、効率よく間葉系幹細胞を培養することができる間葉系幹細胞の多分化能維持用培地、間葉系幹細胞の培養方法、及び該培養方法により得られた間葉系幹細胞、間葉系幹細胞の分化方法、及び該分化方法により得られた骨芽細胞、並びに脂肪細胞を提供することができる。
（間葉系幹細胞の多分化能維持用培地）
本発明の間葉系幹細胞の多分化能維持用培地は、間葉系幹細胞の多分化能の維持、及び増殖が可能な培地であって、ＴＧＦ（トランスフォーミング増殖因子）−βを少なくとも含有し、必要に応じて、更にその他の成分を含有してなる。
本発明の間葉系幹細胞の多分化能維持用培地は、間葉系幹細胞の多分化能の維持、及び増殖が可能な培地であって、ＴＧＦ（トランスフォーミング増殖因子）−βを少なくとも含有し、必要に応じて、更にその他の成分を含有してなる。
−間葉系幹細胞−
前記間葉系幹細胞とは、少なくとも骨芽細胞または脂肪細胞への分化能を有する未分化間葉系幹細胞のことをいう。
前記間葉系幹細胞の多分化能とは、分化刺激に応答して骨芽細胞または脂肪細胞など種々の細胞へ分化する能力のことをいう。
前記間葉系幹細胞が多分化能を維持しているか否かを確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、間葉系幹細胞に骨芽細胞などへの分化誘導を行い、骨芽細胞などに分化することができれば間葉系幹細胞は多分化能を維持していることが確認できる。
前記間葉系幹細胞が増殖可能か否かを確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＭＴＳアッセイにより間葉系幹細胞の増殖活性を評価することで確認することができる。
前記間葉系幹細胞とは、少なくとも骨芽細胞または脂肪細胞への分化能を有する未分化間葉系幹細胞のことをいう。
前記間葉系幹細胞の多分化能とは、分化刺激に応答して骨芽細胞または脂肪細胞など種々の細胞へ分化する能力のことをいう。
前記間葉系幹細胞が多分化能を維持しているか否かを確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、間葉系幹細胞に骨芽細胞などへの分化誘導を行い、骨芽細胞などに分化することができれば間葉系幹細胞は多分化能を維持していることが確認できる。
前記間葉系幹細胞が増殖可能か否かを確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＭＴＳアッセイにより間葉系幹細胞の増殖活性を評価することで確認することができる。
−ＴＧＦ−β−
前記ＴＧＦ−βとは、サイトカインの１種であり、アイソフォームが存在することが知られている。前記ＴＧＦ−βのアイソフォームとしては、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３が挙げられる。
本発明のＴＧＦ−βとは、ＴＧＦ−βに分類されるものをいい、前記アイソフォームを含む。
前記ＴＧＦ−βの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１．２５ｎｇ／ｍＬ〜５．０ｎｇ／ｍＬが好ましく、２．５ｎｇ／ｍＬ〜５．０ｎｇ／ｍＬがより好ましい。
前記ＴＧＦ−βとは、サイトカインの１種であり、アイソフォームが存在することが知られている。前記ＴＧＦ−βのアイソフォームとしては、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３が挙げられる。
本発明のＴＧＦ−βとは、ＴＧＦ−βに分類されるものをいい、前記アイソフォームを含む。
前記ＴＧＦ−βの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１．２５ｎｇ／ｍＬ〜５．０ｎｇ／ｍＬが好ましく、２．５ｎｇ／ｍＬ〜５．０ｎｇ／ｍＬがより好ましい。
−培地−
前記培地としては、特に制限はなく、公知の哺乳類細胞培地を目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＲＰＭＩ−１６４０培地やＤＭＥＭ培地などが挙げられる。
前記培地としては、特に制限はなく、公知の哺乳類細胞培地を目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＲＰＭＩ−１６４０培地やＤＭＥＭ培地などが挙げられる。
−その他の成分−
前記その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＦＢＳ、ペニシリン、ストレプトマイシンなどが挙げられる。
前記その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＦＢＳ、ペニシリン、ストレプトマイシンなどが挙げられる。
（間葉系幹細胞の培養方法、及び間葉系幹細胞）
本発明の間葉系幹細胞の培養方法は、本発明の間葉系幹細胞の多分化能維持用培地を用いて間葉系幹細胞を培養する工程（第１培養工程）を少なくとも含み、必要に応じて、更にその他の工程を含んでいる。
本発明の間葉系幹細胞は、前記間葉系幹細胞の培養方法により得ることができる。
本発明の間葉系幹細胞の培養方法は、本発明の間葉系幹細胞の多分化能維持用培地を用いて間葉系幹細胞を培養する工程（第１培養工程）を少なくとも含み、必要に応じて、更にその他の工程を含んでいる。
本発明の間葉系幹細胞は、前記間葉系幹細胞の培養方法により得ることができる。
−第１培養工程−
前記第１培養工程は、前記間葉系幹細胞の多分化能維持用培地を用いて間葉系幹細胞を培養する工程である。前記第１培養工程により、多分化能を有する間葉系幹細胞を増殖させることができる。
前記第１培養工程は、前記間葉系幹細胞の多分化能維持用培地を用いて間葉系幹細胞を培養する工程である。前記第１培養工程により、多分化能を有する間葉系幹細胞を増殖させることができる。
−−間葉系幹細胞−−
前記間葉系幹細胞の入手方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、マウスなどの個体の骨髄などから単離することにより入手する方法、既にクローン化された間葉系幹細胞を各種機関から入手する方法などが挙げられる。
前記既にクローン化された間葉系幹細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、マウスＳＴ２細胞、マウスＮＲＧ細胞、マウスＤＦＡＴ−Ｄ１細胞などが挙げられる。なお、前記マウスＳＴ２細胞、及びマウスＮＲＧ細胞は、独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター（ＢＲＣ）から入手することができる。
前記間葉系幹細胞の入手方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、マウスなどの個体の骨髄などから単離することにより入手する方法、既にクローン化された間葉系幹細胞を各種機関から入手する方法などが挙げられる。
前記既にクローン化された間葉系幹細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、マウスＳＴ２細胞、マウスＮＲＧ細胞、マウスＤＦＡＴ−Ｄ１細胞などが挙げられる。なお、前記マウスＳＴ２細胞、及びマウスＮＲＧ細胞は、独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター（ＢＲＣ）から入手することができる。
−−培養方法、温度、ＣＯ２濃度、時間−−
前記第１培養工程の培養方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、静置培養などが挙げられる。前記培養では、コンフルエント状態にならないように継代培養することが好ましい。
前記第１培養工程の温度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、３７℃などが挙げられる。
前記第１培養工程のＣＯ２濃度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、５％などが挙げられる。
前記第１培養工程の時間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記第１培養工程の培養方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、静置培養などが挙げられる。前記培養では、コンフルエント状態にならないように継代培養することが好ましい。
前記第１培養工程の温度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、３７℃などが挙げられる。
前記第１培養工程のＣＯ２濃度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、５％などが挙げられる。
前記第１培養工程の時間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
−その他の工程−
前記その他の工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、間葉系幹細胞採取工程、間葉系幹細胞回収工程などが挙げられる。
前記その他の工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、間葉系幹細胞採取工程、間葉系幹細胞回収工程などが挙げられる。
−−間葉系幹細胞採取工程−−
前記間葉系幹細胞採取工程は、例えば、ヒト、マウスなどの個体の骨髄などから間葉系幹細胞を採取する工程である。
前記採取の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、公知の方法を用いることができる。
前記間葉系幹細胞採取工程は、例えば、ヒト、マウスなどの個体の骨髄などから間葉系幹細胞を採取する工程である。
前記採取の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、公知の方法を用いることができる。
−−間葉系幹細胞回収工程−−
前記間葉系幹細胞回収工程は、前記第１培養工程により得られた間葉系幹細胞を回収する工程である。
前記回収の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、培養液を遠心分離し、間葉系幹細胞を回収する方法などが挙げられる。
前記間葉系幹細胞回収工程は、前記第１培養工程により得られた間葉系幹細胞を回収する工程である。
前記回収の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、培養液を遠心分離し、間葉系幹細胞を回収する方法などが挙げられる。
（間葉系幹細胞の分化方法、並びに骨芽細胞、及び脂肪細胞）
本発明の間葉系幹細胞の分化方法は、本発明の間葉系幹細胞用培地を用いて間葉系幹細胞を培養する工程（第１培養工程）と、前記培養した間葉系幹細胞を分化誘導培地で培養する工程（第２培養工程）とを少なくとも含み、必要に応じて、更にその他の工程を含んでなる。
本発明の骨芽細胞、及び脂肪細胞は、前記間葉系幹細胞の分化方法により得ることができる。
本発明の間葉系幹細胞の分化方法は、本発明の間葉系幹細胞用培地を用いて間葉系幹細胞を培養する工程（第１培養工程）と、前記培養した間葉系幹細胞を分化誘導培地で培養する工程（第２培養工程）とを少なくとも含み、必要に応じて、更にその他の工程を含んでなる。
本発明の骨芽細胞、及び脂肪細胞は、前記間葉系幹細胞の分化方法により得ることができる。
−第１培養工程−
前記第１培養工程は、前記間葉系幹細胞の多分化能維持用培地を用いて間葉系幹細胞を培養する工程であり、前記第１培養工程により、後述する第２培養工程で、間葉系幹細胞を効率的に分化させることができる。
前記第１培養工程は、前記間葉系幹細胞の培養方法における第１培養工程と同様に行うことができる。
前記第１培養工程の培養時間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、後述する第２工程において間葉系幹細胞を効率的に分化させることができる点で、コンフルエント状態になる前に継代することが好ましい。
前記第１培養工程の間葉系幹細胞の継代数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、後述する第２工程において間葉系幹細胞を効率的に分化させることができる点で、継代の回数は少ないことが好ましい。
前記第１培養工程は、前記間葉系幹細胞の多分化能維持用培地を用いて間葉系幹細胞を培養する工程であり、前記第１培養工程により、後述する第２培養工程で、間葉系幹細胞を効率的に分化させることができる。
前記第１培養工程は、前記間葉系幹細胞の培養方法における第１培養工程と同様に行うことができる。
前記第１培養工程の培養時間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、後述する第２工程において間葉系幹細胞を効率的に分化させることができる点で、コンフルエント状態になる前に継代することが好ましい。
前記第１培養工程の間葉系幹細胞の継代数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、後述する第２工程において間葉系幹細胞を効率的に分化させることができる点で、継代の回数は少ないことが好ましい。
−第２培養工程−
前記第２培養工程は、前記培養した間葉系幹細胞を分化誘導培地で培養する工程である。前記第２培養工程により、間葉系幹細胞を目的とする細胞に分化させることができる。
前記第２培養工程では、必要に応じて、分化誘導因子を含まない培地で培養する工程を含んでもよい。
前記目的とする細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、骨芽細胞、脂肪細胞、心筋細胞、軟骨細胞などが挙げられる。
前記第２培養工程は、前記培養した間葉系幹細胞を分化誘導培地で培養する工程である。前記第２培養工程により、間葉系幹細胞を目的とする細胞に分化させることができる。
前記第２培養工程では、必要に応じて、分化誘導因子を含まない培地で培養する工程を含んでもよい。
前記目的とする細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、骨芽細胞、脂肪細胞、心筋細胞、軟骨細胞などが挙げられる。
−−分化誘導培地−−
前記分化誘導培地としては、特に制限はなく、分化させる細胞に応じて適宜選択することができ、例えば、間葉系幹細胞を骨芽細胞へ分化させる場合には、骨芽細胞への分化誘導因子を含む骨芽細胞分化誘導培地を用いることができ、間葉系幹細胞を脂肪細胞へ分化させる場合には、脂肪細胞への分化誘導因子を含む脂肪細胞分化誘導培地を用いることができる。
前記分化誘導培地としては、特に制限はなく、分化させる細胞に応じて適宜選択することができ、例えば、間葉系幹細胞を骨芽細胞へ分化させる場合には、骨芽細胞への分化誘導因子を含む骨芽細胞分化誘導培地を用いることができ、間葉系幹細胞を脂肪細胞へ分化させる場合には、脂肪細胞への分化誘導因子を含む脂肪細胞分化誘導培地を用いることができる。
前記骨芽細胞分化誘導培地としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、分化誘導因子を含まない培地に骨芽細胞分化誘導因子を含有させた培地を用いることができる。
前記分化誘導因子を含まない培地としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン含有のＲＰＭＩ−１６４０培地などが挙げられる。
前記骨芽細胞分化誘導因子としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＢＭＰ（ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）４、ＢＭＰ２などが挙げられる。
前記骨芽細胞分化誘導培地中の骨芽細胞分化誘導因子の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、ＢＭＰ４の場合、５０ｎｇ／ｍＬ〜３００ｎｇ／ｍＬが好ましく、５０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬが特に好ましい。前記ＢＭＰ４の含有量が、２５ｎｇ／ｍＬ未満であると骨芽細胞分化しないことがある。一方、前記ＢＭＰ４の含有量が前記特に好ましい範囲内であると、骨芽細胞分化の点で有利である。
前記分化誘導因子を含まない培地としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン含有のＲＰＭＩ−１６４０培地などが挙げられる。
前記骨芽細胞分化誘導因子としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＢＭＰ（ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）４、ＢＭＰ２などが挙げられる。
前記骨芽細胞分化誘導培地中の骨芽細胞分化誘導因子の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、ＢＭＰ４の場合、５０ｎｇ／ｍＬ〜３００ｎｇ／ｍＬが好ましく、５０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬが特に好ましい。前記ＢＭＰ４の含有量が、２５ｎｇ／ｍＬ未満であると骨芽細胞分化しないことがある。一方、前記ＢＭＰ４の含有量が前記特に好ましい範囲内であると、骨芽細胞分化の点で有利である。
前記脂肪細胞分化誘導培地としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、分化誘導因子を含まない培地に脂肪細胞分化誘導因子を含有させた培地を用いることができる。
前記分化誘導因子を含まない培地としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン含有のＲＰＭＩ−１６４０培地などが挙げられる。
前記脂肪細胞分化誘導因子としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、（１）デキサメタゾン、３−イソブチル−１−メチルキサンチン、インスリン及びロシグリタゾン、（２）デキサメタゾン、３−イソブチル−１−メチルキサンチン、及びインスリン、（３）ロシグリタゾンなどが挙げられる。
前記脂肪細胞分化誘導培地中の脂肪細胞分化誘導因子の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、デキサメタゾン、３−イソブチル−１−メチルキサンチン、インスリン及びロシグリタゾンの場合、デキサメタゾンは、２５０ｎＭ〜１，０００ｎＭが好ましく、２５０ｎＭが特に好ましく、３−イソブチル−１−メチルキサンチンは、０．５ｍＭが特に好ましく、インスリンは、５μｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬが好ましく、５μｇ／ｍＬが特に好ましく、ロシグリタゾンは、０．３μＭ〜１μＭが好ましく、１μＭが特に好ましい。
前記デキサメタゾン、３−イソブチル−１−メチルキサンチン、インスリン、及びロシグリタゾンの含有量が、前記好ましい範囲から外れると脂肪細胞分化が十分に誘導されないことがある。一方、前記デキサメタゾン、３−イソブチル−１−メチルキサンチン、インスリン、及びロシグリタゾンの含有量が前記特に好ましい範囲内であると、脂肪細胞の分化誘導の点で有利である。
前記分化誘導因子を含まない培地としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン含有のＲＰＭＩ−１６４０培地などが挙げられる。
前記脂肪細胞分化誘導因子としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、（１）デキサメタゾン、３−イソブチル−１−メチルキサンチン、インスリン及びロシグリタゾン、（２）デキサメタゾン、３−イソブチル−１−メチルキサンチン、及びインスリン、（３）ロシグリタゾンなどが挙げられる。
前記脂肪細胞分化誘導培地中の脂肪細胞分化誘導因子の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、デキサメタゾン、３−イソブチル−１−メチルキサンチン、インスリン及びロシグリタゾンの場合、デキサメタゾンは、２５０ｎＭ〜１，０００ｎＭが好ましく、２５０ｎＭが特に好ましく、３−イソブチル−１−メチルキサンチンは、０．５ｍＭが特に好ましく、インスリンは、５μｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬが好ましく、５μｇ／ｍＬが特に好ましく、ロシグリタゾンは、０．３μＭ〜１μＭが好ましく、１μＭが特に好ましい。
前記デキサメタゾン、３−イソブチル−１−メチルキサンチン、インスリン、及びロシグリタゾンの含有量が、前記好ましい範囲から外れると脂肪細胞分化が十分に誘導されないことがある。一方、前記デキサメタゾン、３−イソブチル−１−メチルキサンチン、インスリン、及びロシグリタゾンの含有量が前記特に好ましい範囲内であると、脂肪細胞の分化誘導の点で有利である。
なお、前記第２培養工程では、第２培養工程において調製した培地を使用してもよく、前記第１培養工程の培地に前記分化誘導因子を添加した培地を使用してもよい。
−−培養方法、温度、ＣＯ２濃度、時間−−
前記第２培養工程の培養方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、静置培養などが挙げられる。前記培養では、コンフルエント状態にならないように継代培養することが好ましい。
前記第２培養工程の温度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、３７℃などが挙げられる。
前記第２培養工程のＣＯ２濃度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、５％などが挙げられる。
前記第２培養工程の時間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、間葉系幹細胞を骨芽細胞へ分化させる場合には、分化誘導培地で５日間〜１０日間培養する、などが挙げられる。また、間葉系幹細胞を脂肪細胞へ分化させる場合には、分化誘導培地で４８時間〜６０時間培養した後、さらに分化誘導因子を含まない培地で４日間〜６日間培養する、などが挙げられる。
前記第２培養工程の培養方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、静置培養などが挙げられる。前記培養では、コンフルエント状態にならないように継代培養することが好ましい。
前記第２培養工程の温度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、３７℃などが挙げられる。
前記第２培養工程のＣＯ２濃度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、５％などが挙げられる。
前記第２培養工程の時間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、間葉系幹細胞を骨芽細胞へ分化させる場合には、分化誘導培地で５日間〜１０日間培養する、などが挙げられる。また、間葉系幹細胞を脂肪細胞へ分化させる場合には、分化誘導培地で４８時間〜６０時間培養した後、さらに分化誘導因子を含まない培地で４日間〜６日間培養する、などが挙げられる。
−−骨芽細胞への分化の確認−−
前記第２工程により、前記間葉系幹細胞が骨芽細胞に分化したか否かを確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、細胞をアルカリフォスファターゼ染色する方法、細胞のアルカリフォスファターゼ活性を測定する方法、細胞内のＯｓｔｅｒｉｘ遺伝子の発現量を測定する方法、及び細胞内のＯｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ遺伝子の発現量を測定する方法などが挙げられる。
前記第２工程により、前記間葉系幹細胞が骨芽細胞に分化したか否かを確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、細胞をアルカリフォスファターゼ染色する方法、細胞のアルカリフォスファターゼ活性を測定する方法、細胞内のＯｓｔｅｒｉｘ遺伝子の発現量を測定する方法、及び細胞内のＯｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ遺伝子の発現量を測定する方法などが挙げられる。
−−脂肪細胞への分化の確認−−
前記第２工程により、前記間葉系幹細胞が脂肪細胞に分化したか否かを確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、細胞をＯｉｌ Ｒｅｄ Ｏで染色する方法、細胞内のトリグリセリド量を測定する方法（例えば、トリグリセリドＥ−テスト和光；和光純薬製）、細胞内のＰＰＡＲγ（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇａｍｍａ）遺伝子の発現量を測定する方法、及び細胞内のＦａｂｐ４（ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ４）遺伝子の発現量を測定する方法などが挙げられる。
前記第２工程により、前記間葉系幹細胞が脂肪細胞に分化したか否かを確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、細胞をＯｉｌ Ｒｅｄ Ｏで染色する方法、細胞内のトリグリセリド量を測定する方法（例えば、トリグリセリドＥ−テスト和光；和光純薬製）、細胞内のＰＰＡＲγ（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇａｍｍａ）遺伝子の発現量を測定する方法、及び細胞内のＦａｂｐ４（ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ４）遺伝子の発現量を測定する方法などが挙げられる。
以下に本発明の実施例について説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。
本発明の実施例で用いた間葉系幹細胞、培地、及び間葉系幹細胞の培養条件は以下の通りである。
−間葉系幹細胞−
間葉系幹細胞として、マウス間葉系幹細胞ＳＴ２細胞（独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター）を用いた。
−基本培地−
基本培地として、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン含有のＲＰＭＩ−１６４０培地（ナカライテスク製）を用いた。
−脂肪細胞分化誘導培地−
脂肪細胞分化誘導培地として、前記基本培地に、２５０ｎＭ デキサメタゾン（和光純薬製）、０．５ｍＭ ３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ナカライテスク製）、５μｇ／ｍＬ インスリン（ＩＴＳ；ＧＩＢＣＯ製）、及び１μＭ ロシグリタゾン（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ製）を含有させた培地を用いた。
−骨芽細胞分化誘導培地−
骨芽細胞分化誘導培地として、前記基本培地に、５０ｎｇ／ｍＬ ｒｈＢＭＰ−４（ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ−４）； Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ製）を含有させた培地を用いた。
−培養条件−
間葉系幹細胞は、３７℃、５％ＣＯ２存在下で培養した。
−間葉系幹細胞−
間葉系幹細胞として、マウス間葉系幹細胞ＳＴ２細胞（独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター）を用いた。
−基本培地−
基本培地として、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン含有のＲＰＭＩ−１６４０培地（ナカライテスク製）を用いた。
−脂肪細胞分化誘導培地−
脂肪細胞分化誘導培地として、前記基本培地に、２５０ｎＭ デキサメタゾン（和光純薬製）、０．５ｍＭ ３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ナカライテスク製）、５μｇ／ｍＬ インスリン（ＩＴＳ；ＧＩＢＣＯ製）、及び１μＭ ロシグリタゾン（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ製）を含有させた培地を用いた。
−骨芽細胞分化誘導培地−
骨芽細胞分化誘導培地として、前記基本培地に、５０ｎｇ／ｍＬ ｒｈＢＭＰ−４（ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ−４）； Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ製）を含有させた培地を用いた。
−培養条件−
間葉系幹細胞は、３７℃、５％ＣＯ２存在下で培養した。
（実施例１）
＜ＴＧＦ−β１を含有する培地を用いた間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化抑制＞
前記間葉系幹細胞を直径６ｃｍの培養皿１個あたり６×１０５個播種し、前記基本培地５ｍＬで２日間の前培養を行った。
前記前培養を行った間葉系幹細胞を以下の４群に分け、それぞれの培地５ｍＬで本培養を開始した。本培養を開始し、６０時間培養（脂肪細胞への分化誘導）した後、全ての群の培地を吸引廃棄して基本培地に交換した。その後、基本培地５ｍＬで培地交換を２日おきに行った。
（１）未処理群（対照群）
本培養は、基本培地で６０時間培養した後、引き続き基本培地で培養。
（２）ＴＧＦ−β１添加群
本培養は、基本培地に、５ｎｇ／ｍＬ ｒｈＴＧＦ−β１（Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ製）を含有させた培地で６０時間培養した後、基本培地で培養。
（３）脂肪細胞分化誘導培地群
本培養は、脂肪細胞分化誘導培地で６０時間培養した後、基本培地で培養。
（４）［脂肪細胞分化誘導培地＋ＴＧＦ−β１添加］群
本培養は、脂肪細胞分化誘導培地に５ｎｇ／ｍＬ ＴＧＦ−β１を含有させた培地で６０時間培養した後、基本培地で培養。
＜ＴＧＦ−β１を含有する培地を用いた間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化抑制＞
前記間葉系幹細胞を直径６ｃｍの培養皿１個あたり６×１０５個播種し、前記基本培地５ｍＬで２日間の前培養を行った。
前記前培養を行った間葉系幹細胞を以下の４群に分け、それぞれの培地５ｍＬで本培養を開始した。本培養を開始し、６０時間培養（脂肪細胞への分化誘導）した後、全ての群の培地を吸引廃棄して基本培地に交換した。その後、基本培地５ｍＬで培地交換を２日おきに行った。
（１）未処理群（対照群）
本培養は、基本培地で６０時間培養した後、引き続き基本培地で培養。
（２）ＴＧＦ−β１添加群
本培養は、基本培地に、５ｎｇ／ｍＬ ｒｈＴＧＦ−β１（Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ製）を含有させた培地で６０時間培養した後、基本培地で培養。
（３）脂肪細胞分化誘導培地群
本培養は、脂肪細胞分化誘導培地で６０時間培養した後、基本培地で培養。
（４）［脂肪細胞分化誘導培地＋ＴＧＦ−β１添加］群
本培養は、脂肪細胞分化誘導培地に５ｎｇ／ｍＬ ＴＧＦ−β１を含有させた培地で６０時間培養した後、基本培地で培養。
−オイルレッド（Ｏｉｌ Ｒｅｄ）Ｏ染色法による間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化の度合の評価−
本培養開始７日後に、Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ染色法（Ｙａｇｉ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ３２１, ９６７−９７４ （２００４年））により、間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化の度合を評価した。結果を図１〜図４に示す。
対照群（図１）、及びＴＧＦ−β１添加群（図２）では、Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ陽性細胞が観察されなかった。
一方、脂肪細胞分化誘導培地群（図３）では、ほとんどの細胞がＯｉｌ Ｒｅｄ Ｏ陽性であった。しかし、［脂肪細胞分化誘導培地＋ＴＧＦ−β１添加］群（図４）では、Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ陽性細胞が、脂肪細胞分化誘導培地群と比べて著しく減少した。
本培養開始７日後に、Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ染色法（Ｙａｇｉ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ３２１, ９６７−９７４ （２００４年））により、間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化の度合を評価した。結果を図１〜図４に示す。
対照群（図１）、及びＴＧＦ−β１添加群（図２）では、Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ陽性細胞が観察されなかった。
一方、脂肪細胞分化誘導培地群（図３）では、ほとんどの細胞がＯｉｌ Ｒｅｄ Ｏ陽性であった。しかし、［脂肪細胞分化誘導培地＋ＴＧＦ−β１添加］群（図４）では、Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ陽性細胞が、脂肪細胞分化誘導培地群と比べて著しく減少した。
−トリグリセリド量による間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化の度合の評価−
本培養開始７日後に、細胞内のトリグリセリド量を測定し、間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化の度合を評価した（トリグリセライドＥ−テストワコー：和光純薬製）。結果を図５に示す。図５中の各棒グラフは、左から順に、対照群［１］、ＴＧＦ−β１添加群［２］、脂肪細胞分化誘導培地群［３］、［脂肪細胞分化誘導培地＋ＴＧＦ−β１添加］群［４］の順に記載されている。
図５の結果から、上記Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ染色法の場合と同様に、対照群（図５の［１］）、及びＴＧＦ−β１添加群（図５の［２］）では、トリグリセリド量がほぼ０であり、非常に少なかった。
一方、脂肪細胞分化誘導培地群（図５の［３］）では、トリグリセリド量が、１０（ｍｇ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）を超え、非常に多かった。しかし、［脂肪細胞分化誘導培地＋ＴＧＦ−β１添加］群（図５の［４］）では、トリグリセリド量がほぼ０であり、脂肪細胞分化誘導培地群と比べて著しく減少した。
本培養開始７日後に、細胞内のトリグリセリド量を測定し、間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化の度合を評価した（トリグリセライドＥ−テストワコー：和光純薬製）。結果を図５に示す。図５中の各棒グラフは、左から順に、対照群［１］、ＴＧＦ−β１添加群［２］、脂肪細胞分化誘導培地群［３］、［脂肪細胞分化誘導培地＋ＴＧＦ−β１添加］群［４］の順に記載されている。
図５の結果から、上記Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ染色法の場合と同様に、対照群（図５の［１］）、及びＴＧＦ−β１添加群（図５の［２］）では、トリグリセリド量がほぼ０であり、非常に少なかった。
一方、脂肪細胞分化誘導培地群（図５の［３］）では、トリグリセリド量が、１０（ｍｇ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）を超え、非常に多かった。しかし、［脂肪細胞分化誘導培地＋ＴＧＦ−β１添加］群（図５の［４］）では、トリグリセリド量がほぼ０であり、脂肪細胞分化誘導培地群と比べて著しく減少した。
−脂肪細胞分化マーカー遺伝子による間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化の検証−
本培養開始７日後に、細胞を回収し、前記細胞からＴｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）プライマーを用いて、ｃＤＮＡを合成した。前記ｃＤＮＡを鋳型として、定量リアルタイムＰＣＲ法により、脂肪細胞分化マーカー遺伝子（ＰＰＡＲγ（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇａｍｍａ）、Ｆａｂｐ４（ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ４））の発現を調べた。結果を図６〜図７に示す。なお、定量リアルタイムＰＣＲ法に使用した機器、試薬、プライマーは下記の通りである。
使用機器：Ｍｘ３０００Ｐ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製）
試薬：Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）
プライマー：
（１）ＰＰＡＲγ２ （Ｆｏｒｗａｒｄ）：
５’−ＡＴＧＧＧＴＧＡＡＡＣＴＣＴＧＧＧＡＧＡ−３’（配列番号１）
（２）ＰＰＡＲγ２ （Ｒｅｖｅｒｓｅ）：
５’−ＧＡＧＣＴＧＡＴＴＣＣＧＡＡＧＴＴＧＧＴ−３’（配列番号２）
（３）Ｆａｂｐ４ （Ｆｏｒｗａｒｄ）：
５’−ＴＧＧＡＡＧＣＴＴＧＴＣＴＣＣＡＧＴＧＡ−３’（配列番号３）
（４）Ｆａｂｐ４ （Ｒｅｖｅｒｓｅ）：
５’−ＴＣＣＣＣＡＴＴＴＡＣＧＣＴＧＡＴＧＡＴ−３’（配列番号４）
（５）ＧＡＰＤＨ （Ｆｏｒｗａｒｄ）：
５’−ＴＧＧＡＧＡＡＡＣＣＴＧＣＣＡＡＧＴＡＴＧ−３’（配列番号５）
（６）ＧＡＰＤＨ （Ｒｅｖｅｒｓｅ）：
５’−ＧＧＡＧＡＣＡＡＣＣＴＧＧＴＣＣＴＣＡＧ−３’（配列番号６）
本培養開始７日後に、細胞を回収し、前記細胞からＴｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）プライマーを用いて、ｃＤＮＡを合成した。前記ｃＤＮＡを鋳型として、定量リアルタイムＰＣＲ法により、脂肪細胞分化マーカー遺伝子（ＰＰＡＲγ（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇａｍｍａ）、Ｆａｂｐ４（ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ４））の発現を調べた。結果を図６〜図７に示す。なお、定量リアルタイムＰＣＲ法に使用した機器、試薬、プライマーは下記の通りである。
使用機器：Ｍｘ３０００Ｐ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製）
試薬：Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）
プライマー：
（１）ＰＰＡＲγ２ （Ｆｏｒｗａｒｄ）：
５’−ＡＴＧＧＧＴＧＡＡＡＣＴＣＴＧＧＧＡＧＡ−３’（配列番号１）
（２）ＰＰＡＲγ２ （Ｒｅｖｅｒｓｅ）：
５’−ＧＡＧＣＴＧＡＴＴＣＣＧＡＡＧＴＴＧＧＴ−３’（配列番号２）
（３）Ｆａｂｐ４ （Ｆｏｒｗａｒｄ）：
５’−ＴＧＧＡＡＧＣＴＴＧＴＣＴＣＣＡＧＴＧＡ−３’（配列番号３）
（４）Ｆａｂｐ４ （Ｒｅｖｅｒｓｅ）：
５’−ＴＣＣＣＣＡＴＴＴＡＣＧＣＴＧＡＴＧＡＴ−３’（配列番号４）
（５）ＧＡＰＤＨ （Ｆｏｒｗａｒｄ）：
５’−ＴＧＧＡＧＡＡＡＣＣＴＧＣＣＡＡＧＴＡＴＧ−３’（配列番号５）
（６）ＧＡＰＤＨ （Ｒｅｖｅｒｓｅ）：
５’−ＧＧＡＧＡＣＡＡＣＣＴＧＧＴＣＣＴＣＡＧ−３’（配列番号６）
図６〜図７中の各棒グラフは、左から順に、対照群［１］、ＴＧＦ−β１添加群［２］、脂肪細胞分化誘導培地群［３］、［脂肪細胞分化誘導培地＋ＴＧＦ−β１添加］群［４］の順に記載されている。
図６〜図７の結果から、対照群（図６の［１］、及び図７の［１］）、及びＴＧＦ−β１添加群（図６の［２］、及び図７の［２］）では、ＰＰＡＲγ、及びＦａｂｐ４遺伝子の発現レベルは低かった。
一方、脂肪細胞分化誘導培地群（図６の［３］、及び図７の［３］）では、前記両遺伝子の発現が著しく誘導された。しかし、［脂肪細胞分化誘導培地＋ＴＧＦ−β１添加］群（図６の［４］、及び図７の［４］）では、脂肪細胞分化誘導培地群と比べて、前記両遺伝子の発現は強く抑制されていた。
図６〜図７の結果から、対照群（図６の［１］、及び図７の［１］）、及びＴＧＦ−β１添加群（図６の［２］、及び図７の［２］）では、ＰＰＡＲγ、及びＦａｂｐ４遺伝子の発現レベルは低かった。
一方、脂肪細胞分化誘導培地群（図６の［３］、及び図７の［３］）では、前記両遺伝子の発現が著しく誘導された。しかし、［脂肪細胞分化誘導培地＋ＴＧＦ−β１添加］群（図６の［４］、及び図７の［４］）では、脂肪細胞分化誘導培地群と比べて、前記両遺伝子の発現は強く抑制されていた。
上記各評価、及び検証の結果、ＴＧＦ−β１を含有する培地で間葉系幹細胞を培養すると、脂肪細胞への分化誘導を行った場合であっても、脂肪細胞への分化を抑制することができ、間葉系幹細胞の多分化能を維持した状態で培養することができることがわかった。
（実施例２）
＜ＴＧＦ−β１を含有する培地を用いた間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化抑制＞
前記間葉系幹細胞を直径６ｃｍの培養皿１個あたり６×１０５個播種し、前記基本培地５ｍＬで２日間の前培養を行った。
前記前培養を行った間葉系幹細胞を以下の４群に分け、それぞれの培地で本培養（骨芽細胞への分化誘導）を開始した。なお、本培養の培地の交換は吸引除去後、各実験群の培地５ｍＬで３日おきに行った。
（１）未処理群（対照群）
本培養は、基本培地５ｍＬで培養。
（２）ＴＧＦ−β１添加群
本培養は、基本培地５ｍＬに、終濃度２．５ｎｇ／ｍＬになるようにＴＧＦ−β１を含有させた培地で培養。
（３）骨芽細胞分化誘導培地群
本培養は、骨芽細胞分化誘導培地５ｍＬで培養。
（４）［骨芽細胞分化誘導培地＋ＴＧＦ−β１添加］群
本培養は、骨芽細胞分化誘導培地５ｍＬに終濃度２．５ｎｇ／ｍＬになるようにＴＧＦ−β１を含有させた培地で培養。
＜ＴＧＦ−β１を含有する培地を用いた間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化抑制＞
前記間葉系幹細胞を直径６ｃｍの培養皿１個あたり６×１０５個播種し、前記基本培地５ｍＬで２日間の前培養を行った。
前記前培養を行った間葉系幹細胞を以下の４群に分け、それぞれの培地で本培養（骨芽細胞への分化誘導）を開始した。なお、本培養の培地の交換は吸引除去後、各実験群の培地５ｍＬで３日おきに行った。
（１）未処理群（対照群）
本培養は、基本培地５ｍＬで培養。
（２）ＴＧＦ−β１添加群
本培養は、基本培地５ｍＬに、終濃度２．５ｎｇ／ｍＬになるようにＴＧＦ−β１を含有させた培地で培養。
（３）骨芽細胞分化誘導培地群
本培養は、骨芽細胞分化誘導培地５ｍＬで培養。
（４）［骨芽細胞分化誘導培地＋ＴＧＦ−β１添加］群
本培養は、骨芽細胞分化誘導培地５ｍＬに終濃度２．５ｎｇ／ｍＬになるようにＴＧＦ−β１を含有させた培地で培養。
−アルカリフォスファターゼ染色による間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化の度合の評価−
本培養開始５日後に、骨芽細胞分化マーカーの１つであるアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）の染色により、間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化の度合を評価した（Ｍｉｚｕｎｏ Ｙ． ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ３６８, ２６７−２７２ （２００８年））。結果を図８〜図１１に示す。
対照群（図８）、及びＴＧＦ−β１添加群（図９）では、ＡＬＰ陽性細胞が観察されなかった。
一方、骨芽細胞分化誘導培地群（図１０）では、ＡＬＰ陽性細胞が顕著に増加した。しかし、［骨芽細胞分化誘導培地＋ＴＧＦ−β１添加］群（図１１）では、ＡＬＰ陽性細胞が、骨芽細胞分化誘導培地群と比べて著しく減少した。
本培養開始５日後に、骨芽細胞分化マーカーの１つであるアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）の染色により、間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化の度合を評価した（Ｍｉｚｕｎｏ Ｙ． ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ３６８, ２６７−２７２ （２００８年））。結果を図８〜図１１に示す。
対照群（図８）、及びＴＧＦ−β１添加群（図９）では、ＡＬＰ陽性細胞が観察されなかった。
一方、骨芽細胞分化誘導培地群（図１０）では、ＡＬＰ陽性細胞が顕著に増加した。しかし、［骨芽細胞分化誘導培地＋ＴＧＦ−β１添加］群（図１１）では、ＡＬＰ陽性細胞が、骨芽細胞分化誘導培地群と比べて著しく減少した。
−アルカリフォスファターゼ活性の測定による間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化の度合の評価−
本培養開始５日後に、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）活性の測定により（ｐ−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍ： Ｓｉｇｍａ製）、間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化の度合を評価した。結果を図１２に示す。図１２中の各棒グラフは、左から順に、対照群［１］、ＴＧＦ−β１添加群［２］、骨芽細胞分化誘導培地群［３］、［骨芽細胞分化誘導培地＋ＴＧＦ−β１添加］群［４］の順に記載されている。
対照群（図１２の［１］）、及びＴＧＦ−β１添加群（図１２の［２］）では、ＡＬＰ活性がほぼ０であり、非常に低かった。
一方、骨芽細胞分化誘導培地群（図１２の［３］）では、ＡＬＰ活性が約１００％と非常に高かった。しかし、［骨芽細胞分化誘導培地＋ＴＧＦ−β１添加］群（図１２の［４］）では、ＡＬＰ活性２０％未満であり、骨芽細胞分化誘導培地群と比べて著しく低下した。
本培養開始５日後に、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）活性の測定により（ｐ−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍ： Ｓｉｇｍａ製）、間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化の度合を評価した。結果を図１２に示す。図１２中の各棒グラフは、左から順に、対照群［１］、ＴＧＦ−β１添加群［２］、骨芽細胞分化誘導培地群［３］、［骨芽細胞分化誘導培地＋ＴＧＦ−β１添加］群［４］の順に記載されている。
対照群（図１２の［１］）、及びＴＧＦ−β１添加群（図１２の［２］）では、ＡＬＰ活性がほぼ０であり、非常に低かった。
一方、骨芽細胞分化誘導培地群（図１２の［３］）では、ＡＬＰ活性が約１００％と非常に高かった。しかし、［骨芽細胞分化誘導培地＋ＴＧＦ−β１添加］群（図１２の［４］）では、ＡＬＰ活性２０％未満であり、骨芽細胞分化誘導培地群と比べて著しく低下した。
−骨芽細胞分化マーカー遺伝子による間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化の検証−
本培養開始５日後に、細胞を回収し、前記細胞からＴｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）プライマーを用いて、ｃＤＮＡを合成した。前記ｃＤＮＡを鋳型として、定量リアルタイムＰＣＲ法により、骨芽細胞分化マーカー遺伝子（オステリックス（Ｏｓｔｅｒｉｘ）、オステオカルシン（Ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ））の発現を調べた。結果を図１３〜図１４に示す。なお、定量リアルタイムＰＣＲ法に使用した機器、試薬、プライマーは下記の通りである。
使用機器：Ｍｘ３０００Ｐ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製）
試薬：Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）
プライマー：
（１）Ｏｓｔｅｒｉｘ （Ｆｏｒｗａｒｄ）：
５’−ＣＧＴＣＣＴＣＴＣＴＧＣＴＴＧＡＧＧＡＡ−３’（配列番号７）
（２）Ｏｓｔｅｒｉｘ （Ｒｅｖｅｒｓｅ）：
５’−ＴＴＣＣＣＣＡＧＧＧＴＴＧＴＴＧＡＧＴ−３’（配列番号８）
（３）Ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ （Ｆｏｒｗａｒｄ）：
５’−ＧＧＡＧＣＴＧＣＴＧＴＧＡＣＡＴＣＣＡＴＡＣ−３’（配列番号９）
（４）Ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ （Ｒｅｖｅｒｓｅ）：
５’−ＣＴＣＴＧＴＣＴＣＴＣＴＧＡＣＣＴＣＡＣＡＧ−３’（配列番号１０）
（５）ＧＡＰＤＨ （Ｆｏｒｗａｒｄ）：
５’−ＴＧＧＡＧＡＡＡＣＣＴＧＣＣＡＡＧＴＡＴＧ−３’（配列番号１１）
（６）ＧＡＰＤＨ （Ｒｅｖｅｒｓｅ）：
５’−ＧＧＡＧＡＣＡＡＣＣＴＧＧＴＣＣＴＣＡＧ−３’（配列番号１２）
本培養開始５日後に、細胞を回収し、前記細胞からＴｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）プライマーを用いて、ｃＤＮＡを合成した。前記ｃＤＮＡを鋳型として、定量リアルタイムＰＣＲ法により、骨芽細胞分化マーカー遺伝子（オステリックス（Ｏｓｔｅｒｉｘ）、オステオカルシン（Ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ））の発現を調べた。結果を図１３〜図１４に示す。なお、定量リアルタイムＰＣＲ法に使用した機器、試薬、プライマーは下記の通りである。
使用機器：Ｍｘ３０００Ｐ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製）
試薬：Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）
プライマー：
（１）Ｏｓｔｅｒｉｘ （Ｆｏｒｗａｒｄ）：
５’−ＣＧＴＣＣＴＣＴＣＴＧＣＴＴＧＡＧＧＡＡ−３’（配列番号７）
（２）Ｏｓｔｅｒｉｘ （Ｒｅｖｅｒｓｅ）：
５’−ＴＴＣＣＣＣＡＧＧＧＴＴＧＴＴＧＡＧＴ−３’（配列番号８）
（３）Ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ （Ｆｏｒｗａｒｄ）：
５’−ＧＧＡＧＣＴＧＣＴＧＴＧＡＣＡＴＣＣＡＴＡＣ−３’（配列番号９）
（４）Ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ （Ｒｅｖｅｒｓｅ）：
５’−ＣＴＣＴＧＴＣＴＣＴＣＴＧＡＣＣＴＣＡＣＡＧ−３’（配列番号１０）
（５）ＧＡＰＤＨ （Ｆｏｒｗａｒｄ）：
５’−ＴＧＧＡＧＡＡＡＣＣＴＧＣＣＡＡＧＴＡＴＧ−３’（配列番号１１）
（６）ＧＡＰＤＨ （Ｒｅｖｅｒｓｅ）：
５’−ＧＧＡＧＡＣＡＡＣＣＴＧＧＴＣＣＴＣＡＧ−３’（配列番号１２）
図１３〜図１４中の各棒グラフは、左から順に、対照群［１］、ＴＧＦ−β１添加群［２］、骨芽細胞分化誘導培地群［３］、［骨芽細胞分化誘導培地＋ＴＧＦ−β１添加］群［４］の順に記載されている。
図１３〜図１４の結果から、対照群（図１３の［１］、及び図１４の［１］）、及びＴＧＦ−β１添加群（図１３の［２］、及び図１４の［２］）では、オステリックス、及びオステオカルシン遺伝子の発現レベルは低かった。
一方、骨芽細胞分化誘導培地群（図１３の［３］、及び図１４の［３］）では、前記両遺伝子の発現が著しく誘導された。しかし、［骨芽細胞分化誘導培地＋ＴＧＦ−β１添加］群（図１３の［４］、及び図１４の［４］）では、骨芽細胞分化誘導培地群と比べて、前記両遺伝子の発現は強く抑制されていた。
図１３〜図１４の結果から、対照群（図１３の［１］、及び図１４の［１］）、及びＴＧＦ−β１添加群（図１３の［２］、及び図１４の［２］）では、オステリックス、及びオステオカルシン遺伝子の発現レベルは低かった。
一方、骨芽細胞分化誘導培地群（図１３の［３］、及び図１４の［３］）では、前記両遺伝子の発現が著しく誘導された。しかし、［骨芽細胞分化誘導培地＋ＴＧＦ−β１添加］群（図１３の［４］、及び図１４の［４］）では、骨芽細胞分化誘導培地群と比べて、前記両遺伝子の発現は強く抑制されていた。
上記各評価、及び検証の結果、ＴＧＦ−β１を含有する培地で間葉系幹細胞を培養すると、骨芽細胞への分化誘導を行った場合であっても、骨芽細胞への分化を抑制することができ、間葉系幹細胞の多分化能を維持した状態で培養できることが示唆された。
（実施例３）
＜脂肪細胞への分化を抑制された間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化（１）＞
前記間葉系幹細胞を直径６ｃｍの培養皿１個あたり６×１０５個播種し、前記基本培地５ｍＬで２日間の前培養を行った。
前記前培養を行った間葉系幹細胞を以下の３群に分け、それぞれの培地で６０時間培養（脂肪細胞への分化誘導）した。その後、全ての群の培地を骨芽細胞誘導培地に交換し、６日間培養（骨芽細胞への分化誘導）した。なお、骨芽細胞誘導培地の交換は吸引除去後、新しい骨芽細胞誘導培地５ｍＬで３日おきに行った。
（１）対照群
基本培地５ｍＬで６０時間培養した後、骨芽細胞誘導培地５ｍＬで６日間培養。
（２）脂肪細胞分化誘導培地群
脂肪細胞分化誘導培地５ｍＬで６０時間培養した後、骨芽細胞誘導培地５ｍＬで６日間培養。
（３）［脂肪細胞分化誘導培地＋ＴＧＦ−β１添加］群
脂肪細胞分化誘導培地５ｍＬにＴＧＦ−β１を終濃度５ｎｇ／ｍＬになるように含有させた培地で６０時間培養した後、骨芽細胞誘導培地５ｍＬで６日間培養。
＜脂肪細胞への分化を抑制された間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化（１）＞
前記間葉系幹細胞を直径６ｃｍの培養皿１個あたり６×１０５個播種し、前記基本培地５ｍＬで２日間の前培養を行った。
前記前培養を行った間葉系幹細胞を以下の３群に分け、それぞれの培地で６０時間培養（脂肪細胞への分化誘導）した。その後、全ての群の培地を骨芽細胞誘導培地に交換し、６日間培養（骨芽細胞への分化誘導）した。なお、骨芽細胞誘導培地の交換は吸引除去後、新しい骨芽細胞誘導培地５ｍＬで３日おきに行った。
（１）対照群
基本培地５ｍＬで６０時間培養した後、骨芽細胞誘導培地５ｍＬで６日間培養。
（２）脂肪細胞分化誘導培地群
脂肪細胞分化誘導培地５ｍＬで６０時間培養した後、骨芽細胞誘導培地５ｍＬで６日間培養。
（３）［脂肪細胞分化誘導培地＋ＴＧＦ−β１添加］群
脂肪細胞分化誘導培地５ｍＬにＴＧＦ−β１を終濃度５ｎｇ／ｍＬになるように含有させた培地で６０時間培養した後、骨芽細胞誘導培地５ｍＬで６日間培養。
−オイルレッド（Ｏｉｌ Ｒｅｄ）Ｏ染色法による間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化の度合の評価−
６日間培養後に、Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ染色法により、間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化の度合を評価した（Ｙａｇｉ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ３２１, ９６７−９７４ （２００４年））。結果を図１５〜図１７に示す。
６日間培養後に、Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ染色法により、間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化の度合を評価した（Ｙａｇｉ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ３２１, ９６７−９７４ （２００４年））。結果を図１５〜図１７に示す。
−アルカリフォスファターゼ染色による間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化の度合の評価−
６日間培養後に、骨芽細胞分化マーカーの１つであるアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）の染色により、間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化の度合を評価した（Ｍｉｚｕｎｏ Ｙ． ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ３６８, ２６７−２７２ （２００８年））。結果を図１８〜図２０に示す。
６日間培養後に、骨芽細胞分化マーカーの１つであるアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）の染色により、間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化の度合を評価した（Ｍｉｚｕｎｏ Ｙ． ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ３６８, ２６７−２７２ （２００８年））。結果を図１８〜図２０に示す。
上記各評価の結果、対照群では、骨芽細胞分化誘導培地中のＢＭＰ４の作用でＡＬＰ陽性細胞が多数誘導されたが（図１８）、予測されたようにＯｉｌ Ｒｅｄ Ｏ陽性細胞は存在しなかった（図１５）。
一方、脂肪細胞分化誘導培地群は、ＢＭＰ４添加にも関らずＡＬＰ陽性細胞は観察されなかったが（図１９）、Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ陽性細胞は多数観察された（図１６）。
注目すべきことに、［脂肪細胞分化誘導培地＋ＴＧＦ−β１添加］群は、対照群と同様にＡＬＰ陽性細胞が多数誘導されたが（図２０）、Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ陽性細胞はほとんど観察されなかった（図１７）。
以上から、ＴＧＦ−β１により脂肪細胞への分化を抑制された間葉系幹細胞は、その後のＢＭＰ４刺激に応答して骨芽細胞へ分化することができ、間葉系幹細胞の多分化能が維持されていることが示された。
一方、脂肪細胞分化誘導培地群は、ＢＭＰ４添加にも関らずＡＬＰ陽性細胞は観察されなかったが（図１９）、Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ陽性細胞は多数観察された（図１６）。
注目すべきことに、［脂肪細胞分化誘導培地＋ＴＧＦ−β１添加］群は、対照群と同様にＡＬＰ陽性細胞が多数誘導されたが（図２０）、Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ陽性細胞はほとんど観察されなかった（図１７）。
以上から、ＴＧＦ−β１により脂肪細胞への分化を抑制された間葉系幹細胞は、その後のＢＭＰ４刺激に応答して骨芽細胞へ分化することができ、間葉系幹細胞の多分化能が維持されていることが示された。
（実施例４）
＜脂肪細胞への分化を抑制された間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化（２）＞
脂肪細胞への分化を抑制された間葉系幹細胞が骨芽細胞へ分化することができることを遺伝子発現プロファイルで評価するために、以下の実験を行った。
前記間葉系幹細胞を直径６ｃｍの培養皿１個あたり６×１０５個播種し、前記基本培地５ｍＬで２日間の前培養を行った。
前記前培養を行った間葉系幹細胞を以下の８群に分け、各培地で６０時間培養（脂肪細胞への分化誘導）した後、６日間培養（骨芽細胞への分化誘導）した。なお、６日間培養における培地の交換は、吸引除去後、新しい培地（基本培地または骨芽細胞分化誘導培地）５ｍＬで３日おきに行った。３日おきに行った。培養後、細胞を回収し、前記細胞からＴｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）プライマーを用いて、ｃＤＮＡを合成した。前記ｃＤＮＡを鋳型として、定量リアルタイムＰＣＲ法により、脂肪細胞分化マーカー遺伝子（ＰＰＡＲγ、Ｆａｂｐ４）、及び骨芽細胞分化マーカー遺伝子（オステリックス、オステオカルシン）の発現を調べた。前記リアルタイムＰＣＲ法は、実施例１、実施例２のリアルタイムＰＣＲ法と同様に行った。結果を図２１〜図２４に示す。
（１）実験群１
基本培地５ｍＬで６０時間培養した後、引き続き基本培地５ｍＬで６日間培養。
（２）実験群２
基本培地に、ＴＧＦ−β１（終濃度５ｎｇ／ｍＬ）を含有させた培地５ｍＬで６０時間培養した後、基本培地５ｍＬで６日間培養。
（３）実験群３
脂肪細胞分化誘導培地５ｍＬで６０時間培養した後、基本培地５ｍＬで６日間培養。
（４）実験群４
脂肪細胞分化誘導培地に、ＴＧＦ−β１（終濃度５ｎｇ／ｍＬ）を含有させた培地５ｍＬで６０時間培養した後、基本培地５ｍＬで６日間培養。
（５）実験群５
基本培地５ｍＬで６０時間培養した後、骨芽細胞分化誘導培地５ｍＬで６日間培養。
（６）実験群６
基本培地に、ＴＧＦ−β１（終濃度５ｎｇ／ｍＬ）を含有させた培地５ｍＬで６０時間培養した後、骨芽細胞分化誘導培地５ｍＬで６日間培養。
（７）実験群７
脂肪細胞分化誘導培地５ｍＬで６０時間培養した後、骨芽細胞分化誘導培地５ｍＬで６日間培養。
（８）実験群８
脂肪細胞分化誘導培地に、ＴＧＦ−β１（終濃度５ｎｇ／ｍＬ）を含有させた培地５ｍＬで６０時間培養した後、骨芽細胞分化誘導培地５ｍＬで６日間培養。
＜脂肪細胞への分化を抑制された間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化（２）＞
脂肪細胞への分化を抑制された間葉系幹細胞が骨芽細胞へ分化することができることを遺伝子発現プロファイルで評価するために、以下の実験を行った。
前記間葉系幹細胞を直径６ｃｍの培養皿１個あたり６×１０５個播種し、前記基本培地５ｍＬで２日間の前培養を行った。
前記前培養を行った間葉系幹細胞を以下の８群に分け、各培地で６０時間培養（脂肪細胞への分化誘導）した後、６日間培養（骨芽細胞への分化誘導）した。なお、６日間培養における培地の交換は、吸引除去後、新しい培地（基本培地または骨芽細胞分化誘導培地）５ｍＬで３日おきに行った。３日おきに行った。培養後、細胞を回収し、前記細胞からＴｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）プライマーを用いて、ｃＤＮＡを合成した。前記ｃＤＮＡを鋳型として、定量リアルタイムＰＣＲ法により、脂肪細胞分化マーカー遺伝子（ＰＰＡＲγ、Ｆａｂｐ４）、及び骨芽細胞分化マーカー遺伝子（オステリックス、オステオカルシン）の発現を調べた。前記リアルタイムＰＣＲ法は、実施例１、実施例２のリアルタイムＰＣＲ法と同様に行った。結果を図２１〜図２４に示す。
（１）実験群１
基本培地５ｍＬで６０時間培養した後、引き続き基本培地５ｍＬで６日間培養。
（２）実験群２
基本培地に、ＴＧＦ−β１（終濃度５ｎｇ／ｍＬ）を含有させた培地５ｍＬで６０時間培養した後、基本培地５ｍＬで６日間培養。
（３）実験群３
脂肪細胞分化誘導培地５ｍＬで６０時間培養した後、基本培地５ｍＬで６日間培養。
（４）実験群４
脂肪細胞分化誘導培地に、ＴＧＦ−β１（終濃度５ｎｇ／ｍＬ）を含有させた培地５ｍＬで６０時間培養した後、基本培地５ｍＬで６日間培養。
（５）実験群５
基本培地５ｍＬで６０時間培養した後、骨芽細胞分化誘導培地５ｍＬで６日間培養。
（６）実験群６
基本培地に、ＴＧＦ−β１（終濃度５ｎｇ／ｍＬ）を含有させた培地５ｍＬで６０時間培養した後、骨芽細胞分化誘導培地５ｍＬで６日間培養。
（７）実験群７
脂肪細胞分化誘導培地５ｍＬで６０時間培養した後、骨芽細胞分化誘導培地５ｍＬで６日間培養。
（８）実験群８
脂肪細胞分化誘導培地に、ＴＧＦ−β１（終濃度５ｎｇ／ｍＬ）を含有させた培地５ｍＬで６０時間培養した後、骨芽細胞分化誘導培地５ｍＬで６日間培養。
図２１〜図２４中の各棒グラフは、左から順に、実験群１から実験群８の順に記載されている。
図２１〜図２４の結果で特に興味深い点は、実験群７と実験群８の各遺伝子の発現パターンである。実験群７では、ＰＰＡＲγ、及びＦａｂｐ４遺伝子の発現レベルは実験群３と同レベルに誘導されたが、オステリックス、及びオステオカルシン遺伝子の発現は顕著に低下した。一方、実験群８では、ＰＰＡＲγ、及びＦａｂｐ４遺伝子の発現はほとんど誘導されなかったが、注目すべきことにオステリックス、及びオステオカルシン遺伝子の発現は実験群７と比べて顕著に誘導された。これらの結果は、ＴＧＦ−β１は間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化を抑制するだけでなく、骨芽細胞への分化能を維持させる作用があることを示唆している。
また、実験群６では、オステリックス、及びオステオカルシン遺伝子の発現は、実験群５に比べて高くなる傾向を示した。この結果は、間葉系幹細胞をＴＧＦ−βで前処理すると、ＢＭＰ４刺激に対する間葉系幹細胞の応答性が高くなっていることを示唆している。
図２１〜図２４の結果で特に興味深い点は、実験群７と実験群８の各遺伝子の発現パターンである。実験群７では、ＰＰＡＲγ、及びＦａｂｐ４遺伝子の発現レベルは実験群３と同レベルに誘導されたが、オステリックス、及びオステオカルシン遺伝子の発現は顕著に低下した。一方、実験群８では、ＰＰＡＲγ、及びＦａｂｐ４遺伝子の発現はほとんど誘導されなかったが、注目すべきことにオステリックス、及びオステオカルシン遺伝子の発現は実験群７と比べて顕著に誘導された。これらの結果は、ＴＧＦ−β１は間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化を抑制するだけでなく、骨芽細胞への分化能を維持させる作用があることを示唆している。
また、実験群６では、オステリックス、及びオステオカルシン遺伝子の発現は、実験群５に比べて高くなる傾向を示した。この結果は、間葉系幹細胞をＴＧＦ−βで前処理すると、ＢＭＰ４刺激に対する間葉系幹細胞の応答性が高くなっていることを示唆している。
（実施例５）
＜間葉系幹細胞の増殖促進＞
前記間葉系幹細胞を９６穴培養皿１個あたり５×１０３個播種し、前記基本培地１００μＬで２日間の前培養を行った。
前記前培養を行った間葉系幹細胞を以下の２群に分け、下記培地１００μＬで培地交換して２４時間培養後、ＭＴＳアッセイにより細胞の増殖活性を評価した（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ： Ｐｒｏｍｅｇａ製）。結果を図２５に示す。
（１）対照群
基本培地１００μＬで２４時間培養。
（２）ＴＧＦ−β１添加群
終濃度２．５ｎｇ／ｍＬ ＴＧＦ−β１を含有させた培地１００μＬで２４時間培養。
＜間葉系幹細胞の増殖促進＞
前記間葉系幹細胞を９６穴培養皿１個あたり５×１０３個播種し、前記基本培地１００μＬで２日間の前培養を行った。
前記前培養を行った間葉系幹細胞を以下の２群に分け、下記培地１００μＬで培地交換して２４時間培養後、ＭＴＳアッセイにより細胞の増殖活性を評価した（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ： Ｐｒｏｍｅｇａ製）。結果を図２５に示す。
（１）対照群
基本培地１００μＬで２４時間培養。
（２）ＴＧＦ−β１添加群
終濃度２．５ｎｇ／ｍＬ ＴＧＦ−β１を含有させた培地１００μＬで２４時間培養。
図２５の結果から、ＴＧＦ−β１添加群では、対照群の１．５倍の増殖活性を有することが示された。この結果から、ＴＧＦ−β１は、間葉系幹細胞の多分化能の維持に作用するだけでなく、増殖を促進する働きを持つことも示唆された。
本発明の間葉系幹細胞の多分化能維持用培地は、間葉系幹細胞の多分化能、及び増殖能を維持し、簡単に、効率よく間葉系幹細胞を培養することができるので、多分化能を維持した間葉系幹細胞を大量に得るために好適に用いることができる。これにより、従来困難とされてきた多分化能を維持する間葉系幹細胞を大量に調製することができ、間葉系幹細胞の産業ベースでの利用が可能となる。
本発明の間葉系幹細胞は、多分化能を維持しているので、骨芽細胞、脂肪細胞、心筋細胞、軟骨細胞などへ分化させるための細胞として、好適に用いることができる。
本発明の間葉系幹細胞の分化方法は、間葉系幹細胞を効率よく分化させることができるので、再生医療などに用いる骨芽細胞、脂肪細胞、心筋細胞、軟骨細胞などを大量に得るために好適に用いることができる。
本発明の間葉系幹細胞の分化方法により得られる細胞は、例えば、再生医療の原料として用いることができ、骨芽細胞は骨粗鬆症患者や大腿骨頭壊死患者などへの移植、心筋細胞は心筋梗塞患者などへの移植、軟骨細胞はリウマチ性関節炎患者への移植に好適に用いることができる。また、脂肪細胞は、遺伝子治療用の細胞として用いることができる。
本発明の間葉系幹細胞は、多分化能を維持しているので、骨芽細胞、脂肪細胞、心筋細胞、軟骨細胞などへ分化させるための細胞として、好適に用いることができる。
本発明の間葉系幹細胞の分化方法は、間葉系幹細胞を効率よく分化させることができるので、再生医療などに用いる骨芽細胞、脂肪細胞、心筋細胞、軟骨細胞などを大量に得るために好適に用いることができる。
本発明の間葉系幹細胞の分化方法により得られる細胞は、例えば、再生医療の原料として用いることができ、骨芽細胞は骨粗鬆症患者や大腿骨頭壊死患者などへの移植、心筋細胞は心筋梗塞患者などへの移植、軟骨細胞はリウマチ性関節炎患者への移植に好適に用いることができる。また、脂肪細胞は、遺伝子治療用の細胞として用いることができる。
Claims (8)
- 間葉系幹細胞の多分化能の維持、及び増殖が可能な培地であって、
前記培地が、ＴＧＦ−βを含有することを特徴とする間葉系幹細胞の多分化能維持用培地。 - ＴＧＦ−βの含有量が、２．５ｎｇ／ｍＬ〜５．０ｎｇ／ｍＬである請求項１に記載の間葉系幹細胞の多分化能維持用培地。
- 請求項１から２のいずれかに記載の間葉系幹細胞の多分化能維持用培地を用いることを特徴とする間葉系幹細胞の培養方法。
- 請求項３に記載の間葉系幹細胞の培養方法により得られたことを特徴とする間葉系幹細胞。
- 請求項１から２のいずれかに記載の間葉系幹細胞の多分化能維持用培地を用いて間葉系幹細胞を培養する工程と、
前記培養した間葉系幹細胞を分化誘導培地で培養する工程と、
を含むことを特徴とする間葉系幹細胞の分化方法。 - 分化誘導培地が、骨芽細胞分化誘導培地、及び脂肪細胞分化誘導培地のいずれかである請求項５に記載の間葉系幹細胞の分化方法。
- 請求項５から６のいずれかに記載の間葉系幹細胞の分化方法により得られたことを特徴とする骨芽細胞。
- 請求項５から６のいずれかに記載の間葉系幹細胞の分化方法により得られたことを特徴とする脂肪細胞。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2008266721A JP2010094062A (ja) | 2008-10-15 | 2008-10-15 | 間葉系幹細胞の多分化能維持用培地、培養方法、及び分化方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2008266721A JP2010094062A (ja) | 2008-10-15 | 2008-10-15 | 間葉系幹細胞の多分化能維持用培地、培養方法、及び分化方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2010094062A true JP2010094062A (ja) | 2010-04-30 |
Family
ID=42256201
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2008266721A Withdrawn JP2010094062A (ja) | 2008-10-15 | 2008-10-15 | 間葉系幹細胞の多分化能維持用培地、培養方法、及び分化方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2010094062A (ja) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2012120529A (ja) * | 2010-11-18 | 2012-06-28 | Tokyo Institute Of Technology | 骨芽細胞分化誘導用培養基材、骨芽細胞分化誘導方法、及び骨芽細胞製造方法 |
| WO2012104936A1 (ja) | 2011-01-31 | 2012-08-09 | 独立行政法人医薬基盤研究所 | ヒト多能性幹細胞の培養方法 |
| JP2013036797A (ja) * | 2011-08-05 | 2013-02-21 | Kao Corp | 脂肪細胞の分化成熟抑制剤及び／又は脂肪蓄積抑制剤の探索方法 |
| JP2013532989A (ja) * | 2010-07-27 | 2013-08-22 | ウニヴェルシタ・デッリ・ストゥーディ・ディ・ペルージャ | 羊水由来多能性幹細胞の単離及び自己免疫疾患の処置又は予防におけるその使用 |
| JP2015523083A (ja) * | 2012-07-11 | 2015-08-13 | イムステム バイオテクノロジー，インコーポレイテッド | ヒト胚性幹細胞由来の間葉系様幹細胞、方法およびその使用 |
| CN107929726A (zh) * | 2017-11-23 | 2018-04-20 | 吉林省拓华生物科技有限公司 | 一种干细胞复方注射液及其在制备防治股骨头坏死药物中的应用 |
| WO2018181342A1 (ja) | 2017-03-28 | 2018-10-04 | 味の素株式会社 | 未分化維持培地添加剤 |
-
2008
- 2008-10-15 JP JP2008266721A patent/JP2010094062A/ja not_active Withdrawn
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2013532989A (ja) * | 2010-07-27 | 2013-08-22 | ウニヴェルシタ・デッリ・ストゥーディ・ディ・ペルージャ | 羊水由来多能性幹細胞の単離及び自己免疫疾患の処置又は予防におけるその使用 |
| JP2012120529A (ja) * | 2010-11-18 | 2012-06-28 | Tokyo Institute Of Technology | 骨芽細胞分化誘導用培養基材、骨芽細胞分化誘導方法、及び骨芽細胞製造方法 |
| WO2012104936A1 (ja) | 2011-01-31 | 2012-08-09 | 独立行政法人医薬基盤研究所 | ヒト多能性幹細胞の培養方法 |
| JP2013036797A (ja) * | 2011-08-05 | 2013-02-21 | Kao Corp | 脂肪細胞の分化成熟抑制剤及び／又は脂肪蓄積抑制剤の探索方法 |
| JP2015523083A (ja) * | 2012-07-11 | 2015-08-13 | イムステム バイオテクノロジー，インコーポレイテッド | ヒト胚性幹細胞由来の間葉系様幹細胞、方法およびその使用 |
| US9725698B2 (en) | 2012-07-11 | 2017-08-08 | Imstem Biotechnology, Inc. | Trophoblast-derived mesenchymal stem cells (T-MSCs) produced from human embryonic stem cells, methods and uses thereof |
| US10226488B2 (en) | 2012-07-11 | 2019-03-12 | Imstem Biotechnology, Inc. | Mesenchymal-like stem cells derived from human embryonic stem cells, methods and uses thereof |
| US10842826B2 (en) | 2012-07-11 | 2020-11-24 | Imstem Biotechnology, Inc. | Mesenchymal-like stem cells derived from human embryonic stem cells, methods and uses thereof |
| WO2018181342A1 (ja) | 2017-03-28 | 2018-10-04 | 味の素株式会社 | 未分化維持培地添加剤 |
| CN107929726A (zh) * | 2017-11-23 | 2018-04-20 | 吉林省拓华生物科技有限公司 | 一种干细胞复方注射液及其在制备防治股骨头坏死药物中的应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Hanada et al. | Stimulatory effects of basic fibroblast growth factor and bone morphogenetic protein‐2 on osteogenic differentiation of rat bone marrow‐derived mesenchymal stem cells | |
| Tsutsumi et al. | Retention of multilineage differentiation potential of mesenchymal cells during proliferation in response to FGF | |
| Siddappa et al. | Donor variation and loss of multipotency during in vitro expansion of human mesenchymal stem cells for bone tissue engineering | |
| Date et al. | Bone morphogenetic protein-2 induces differentiation of multipotent C3H10T1/2 cells into osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes in vivo and in vitro | |
| JP2010094062A (ja) | 間葉系幹細胞の多分化能維持用培地、培養方法、及び分化方法 | |
| EP1857544B1 (en) | Pluripotent stem cell derived from cardiac tissue | |
| JPWO2006006692A1 (ja) | 低血清培養で選択的に増殖する動物組織遍在性の分化多能性細胞 | |
| Baboolal et al. | Multipotential stromal cell abundance in cellular bone allograft: comparison with fresh age-matched iliac crest bone and bone marrow aspirate | |
| Zhao et al. | Comparison of multipotent differentiation potentials of murine primary bone marrow stromal cells and mesenchymal stem cell line C3H10T1/2 | |
| Kokai et al. | Adipose stem cell function maintained with age: an intra-subject study of long-term cryopreserved cells | |
| CN109072183A (zh) | 细胞的制备方法 | |
| JP2007525979A (ja) | 間葉系前駆細胞無血清懸濁培養システム | |
| Krattinger et al. | Regulation of proliferation and differentiation of human fetal bone cells | |
| Arpornmaeklong et al. | Allogenic human serum, a clinical grade serum supplement for promoting human periodontal ligament stem cell expansion | |
| Colenci et al. | Bone marrow mesenchymal stem cells stimulated by bFGF up-regulated protein expression in comparison with periodontal fibroblasts in vitro | |
| Kermani et al. | Differentiation capacity of mouse dental pulp stem cells into osteoblasts and osteoclasts | |
| Wittenburg et al. | Scaffold preferences of mesenchymal stromal cells and adipose-derived stem cells from green fluorescent protein transgenic mice influence the tissue engineering of bone | |
| KR20130124076A (ko) | 신경능선줄기세포의 배양방법 및 그 용도 | |
| KR101280911B1 (ko) | 타우로우루소데옥시콜릭산을 이용한 성체줄기세포의 연골세포 또는 골세포로의 분화방법 | |
| CN100475956C (zh) | 制备用于移植的细胞的方法 | |
| JP2019521708A (ja) | 組織再生のための細胞組成物 | |
| AU2018204403B2 (en) | Method for isolation of stem cells from bone marrow using subfractionation culturing method and proliferation thereof | |
| Semyari et al. | Isolation and culture of mesenchymal stem cells from rabbit scapular subcutaneous adipose tissue and their ability to differentiate into osteoblasts | |
| KR101287861B1 (ko) | 지방-유래 중간엽 줄기세포의 연골세포로의 분화방법 및 중간엽 줄기세포의 연골세포로의 분화능의 분석방법 | |
| JP2020525107A (ja) | 移植可能な軟骨組織の製造方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A300 | Application deemed to be withdrawn because no request for examination was validly filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 20120110 |