JP6266726B2 - 放射線照射または化学物質による傷害を治療するための方法 - Google Patents

放射線照射または化学物質による傷害を治療するための方法 Download PDF

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Description

関連出願の相互参照
本願は、２０１１年３月２２日に出願された米国特許出願第１３／０６９，１３０号、２０１１年６月１５日に出願された米国特許出願第１３／１６１，３３４号、２０１１年６月１５日に出願された米国仮出願第６１／４９７，４００号、および２０１２年２月６日に出願された米国仮出願第６１／５９５，４８５号の利益を主張し、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、放射線または化学物質への曝露による傷害の治療法に関する。
造血幹細胞（ＨＳＣ）は、骨髄系とリンパ系双方の全ての種類の血液細胞の元になる前駆細胞である。このため、ＨＳＣは、赤血球、血小板、およびリンパ球、ならびに他のほとんどの血液細胞の生産に必要である。ＨＳＣは、細胞間接触または短距離相互作用を介して、ＨＳＣの分化および自己再生を集団的に媒介する分子シグナルを提供する骨髄中の別々のニッチとインビボで親密に関連付けられている。これらのニッチは、骨髄細胞を含む造血誘導性微小環境の一部、または間質、すなわち、マクロファージ、線維芽細胞、脂肪細胞および内皮細胞である。骨髄細胞は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質および細胞間接触を促進する基底膜成分を提供することにより、微小環境の機能的完全性を維持する。これらは、制御された造血細胞の分化および増殖のために必要な様々な可溶性サイトカインまたは常在性サイトカインも提供する。ＨＳＣと間質間の相互作用は、ＨＳＣの生存率を維持し、それらの分化を防止するために必要とされる。
ＨＳＣは、疾患により、またはこの急速に分裂する細胞集団に対して毒性がある物質への曝露により失われることがある。例えば、有害なレベルの放射線の被曝は、ＨＳＣの死を引き起こす。癌化学療法で使用されるものを含む化学物質も、ＨＳＣを死滅させ得る。ＨＳＣ欠損患者は、酸素運搬（赤血球）から凝固（血小板）、免疫（Ｔ細胞、Ｂ細胞）にわたる機能に必要な十分な数の血液細胞を生産しない。この患者が、ＨＳＣ移植によって治療されない場合、ＨＳＣの完全損失により、数日以内に死亡する。しかし、ＨＳＣの数が減少しているが、完全には失われていない患者でも、貧血、出血、感染症、および他の生命を脅かす状態の非常に危険な状態にある。
ＨＳＣ移植を用いて、対象が十分な数のＨＳＣを有していない状態を治療することができるが、移植細胞の生存率の低さが、深刻な問題である。静脈内移植されたＨＳＣは、それらの輸血後数分以内に、血液循環から排除され、骨髄で可視化されることは十分に立証されている。ＨＳＣ移植後３〜５時間の時点では、ドナー細胞は、レシピエントの末梢血中に検出されない（Ａｓｋｅｎａｓｙ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２００２；２０：３０１−１０）。しかし、移植細胞の大半は、輸血された直後に破壊される。その結果、レシピエントの骨髄のコロニー形成は低効率であり、輸血細胞の１〜５％のみが、移植後２〜３日目に、レシピエントの骨髄中で検出される（Ｋｅｒｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１；１６７：３６９２−８；Ｊｅｔｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ２００２；９９：１５８５−９３）。
間葉系幹細胞と共移植した時に、ＨＳＣの生着効率がより高くなることをいくつかの論文が示している（Ｇｕｒｅｖｉｔｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ １９９９；６８：１３６２−８；Ｆａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２００１；１９：１４４−５０）。ヒト−羊移植モデルにおけるヒト間葉系幹細胞の共移植が、これらの動物におけるヒトＨＳＣキメラ骨髄の長期生着の向上を引き起こすことも実証された（Ａｌｍｅｉｄａ−Ｐｏｒａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ２０００；９５：３６２０−７）。ＨＳＣおよび間葉系幹細胞の同時注入は、造血を加速することができる（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２００４；２２：１２５６−６２；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｚｈｏｎｇｈｕａ Ｘｕｅ Ｙｅ Ｘｕｅ Ｚａ Ｚｈｉ．２００５；２６：３８５−８）。間葉系幹細胞は、ヒト対象におけるＨＳＣの生着を促進するために使用されてきた（Ｋｏｃ ＯＮ，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２０００；１８：３０７−３１６；Ｌａｚａｒｕｓ ＨＭ，Ｂｉｏｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２００５；１１：３８９−９８）。おそらく、間葉系幹細胞は、移植されたＨＳＣのホーミング、自己再生およびコミットメントの潜在能力（ｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）を媒介し、バランスを保つのに役立つ支援サイトカインを生産することによって、ＨＳＣのホーミングおよび増殖に必要な損傷を受けた造血微小環境を再構築することによって、かつ移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を引き起こす可能性があるドナー由来のＴ細胞を阻害することによって造血の生着に寄与する（Ｃｈａｒｂｏｒｄ＆Ｍｏｏｒｅ，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ２００５；１０４４：１５９−６７；米国特許第６，０１０，６９６号；同第６，５５５，３７４号）。
間葉系幹細胞はＨＳＣ生着を促進することができるが、日常的な臨床応用に十分な量を入手できない。同様に、ＨＳＣ、特に、レシピエントとマッチし、破壊される可能性の低いＨＳＣの十分な供給を提供することは困難であり得る。したがって、放射線または化学物質への曝露などによって造血系が損傷された対象を治療するために使用できる代替療法に対する満たされていない臨床的必要性が残っている。
本発明の一態様によると、放射線被曝後に対象を治療するための方法であって、放射線被曝の１７以上の影響を軽減するために、治療有効量の接着間質細胞をこの対象に投与する工程を含む方法を提供する。特定の実施形態において、この放射線は電離放射線である。特定の実施形態において、この電離放射線は放射線治療である。特定の実施形態において、この曝露は、電離放射線への偶発的な曝露である。
実施形態のいくつかにおいて、放射線被曝の影響は、悪心、嘔吐、下痢、頭痛、発熱、体重減少、神経症状、白血球減少症、貧血、血小板減少症、疲労、脱力、紫斑、出血、脱毛、またはショックのうちの１つ以上であり得る。同様に、本発明のこの態様の実施形態のいくつかにおいて、放射線被曝の影響は、呼吸器系への損傷、神経系への損傷、胃腸系への損傷、心血管系への損傷、皮膚への損傷、または腎臓系への損傷のうちの１つ以上であり得る。特定の実施形態において、神経症状は、認知機能障害、発作、振戦、運動失調、または嗜眠である。
実施形態のいくつかにおいて、この放射線被曝は、進行中であってよい。
実施形態のいくつかにおいて、この対象は、化学療法も受けている。
実施形態のいくつかにおいて、この投与は、血管内注射、筋肉注射、腹腔内注射、くも膜下腔内注射、皮下注射、または吸入によるものであってよい。特定の実施形態において、投与は、筋肉注射または静脈注射によるものである。
実施形態のいくつかにおいて、外因性造血幹細胞は、この対象に投与されない。
実施形態のいくつかにおいて、本発明は、さらに、第１の投与後約２日〜約２１日目に、少なくとも１つの追加的な治療有効量の接着間質細胞を投与する工程を含んでよい。
実施形態のいくつかにおいて、この第１の治療有効量の投与およびこの少なくとも１つの追加的な治療有効量の投与は、筋肉注射によるものであってよい。
実施形態のいくつかにおいて、この第１の治療有効量は、曝露後約０日目〜約１日目、２日目、または３日目に投与され、この少なくとも１つの追加的な治療有効量は、約２日後、約３日後、約４日後、または約５日後に投与される。
実施形態のいくつかにおいて、この第１の治療有効量は、放射線被曝前に投与される。本発明のこのさらなる態様の実施形態のいくつかにおいて、この第１の治療有効量は、曝露の約１日前、約２日前、約３日前、約４日前、または約５日前に投与される。いくつかの実施形態において、この少なくとも１つの追加的な治療有効量の少なくとも一部も、曝露前に投与される。
本発明の別の態様によると、化学療法を受けている対象を治療するための方法であって、化学療法の１以上の影響を軽減するために、治療有効量の接着間質細胞をこの対象に投与する工程を含む方法を提供する。
実施形態のいくつかにおいて、化学療法の影響は、悪心、嘔吐、下痢、頭痛、発熱、体重減少、神経症状、白血球減少症、貧血、血小板減少症、疲労、脱力、紫斑、出血、脱毛、またはショックのうちの１つ以上であり得る。同様に、実施形態のいくつかにおいて、化学療法の影響は、呼吸器系への損傷、神経系への損傷、胃腸系への損傷、心血管系への損傷、皮膚への損傷、または腎臓系への損傷のうちの１つ以上であり得る。特定の実施形態において、神経症状は、認知機能障害、発作、振戦、運動失調、または嗜眠である。
実施形態のいくつかにおいて、この化学療法は、進行中であってよい。
実施形態のいくつかにおいて、この対象は、放射線にも曝露されている。
実施形態のいくつかにおいて、この投与は、血管内注射、筋肉注射、腹腔内注射、くも膜下腔内注射、皮下注射、または吸入によるものであってよい。特定の実施形態において、投与は、筋肉注射または静脈注射によるものである。
実施形態のいくつかにおいて、外因性造血幹細胞は、この対象に投与されない。
実施形態のいくつかにおいて、本発明は、さらに、第１の投与後約２日〜約２１日目に、少なくとも１つの追加的な治療有効量の接着間質細胞を投与する工程を含んでよい。
実施形態のいくつかにおいて、この第１の治療有効量の投与およびこの少なくとも１つの追加的な治療有効量の投与は、筋肉注射によるものであってよい。
実施形態のいくつかにおいて、この第１の治療有効量は、曝露後約０日目〜約１日目、２日目、または３日目に投与され、この少なくとも１つの追加的な治療有効量は、約２日後、約３日後、約４日後、または約５日後に投与される。
実施形態のいくつかにおいて、この第１の治療有効量は、化学療法前に投与される。本発明のこのさらなる態様の実施形態のいくつかにおいて、この第１の治療有効量は、化学療法の約１日前、約２日前、約３日前、約４日前、または約５日前に投与される。いくつかの実施形態において、この少なくとも１つの追加的な治療有効量の少なくとも一部も、化学療法前に投与される。
別の態様によると、内因性造血系に損傷を受けた対象を治療するための方法であって、内因性造血細胞の再増殖を誘導し、および／または内因性造血細胞数の減少を軽減するために治療有効量の接着間質細胞をこの対象に投与する工程を含む方法を提供する。
実施形態のいくつかにおいて、内因性造血細胞の再増殖は、内因性造血細胞数の増加を含んでもよい。一実施形態において、内因性造血細胞の再増殖は、ＣＤ４５を発現する造血細胞数の増加を含んでもよい。
実施形態のいくつかにおいて、この内因性造血系は、放射線被曝または化学療法により損なわれる。
実施形態のいくつかにおいて、この放射線被曝または化学療法は進行中である。
実施形態のいくつかにおいて、放射線被曝または化学療法の影響は、悪心、嘔吐、下痢、頭痛、発熱、体重減少、神経症状、白血球減少症、貧血、血小板減少症、疲労、脱力、紫斑、出血、脱毛、またはショックのうちの１つ以上であり得る。同様に、本発明のこの態様の実施形態のいくつかにおいて、放射線または化学療法の影響は、呼吸器系への損傷、神経系への損傷、胃腸系への損傷、心血管系への損傷、皮膚への損傷、または腎臓系への損傷のうちの１つ以上であり得る。特定の実施形態において、神経症状は、認知機能障害、発作、振戦、運動失調、または嗜眠である。
実施形態のいくつかにおいて、この投与は、血管内注射、筋肉注射、腹腔内注射、くも膜下腔内注射、皮下注射、または吸入によるものであってよい。特定の実施形態において、投与は、筋肉注射または静脈注射によるものである。
実施形態のいくつかにおいて、外因性造血幹細胞は、この対象に投与されない。
実施形態のいくつかにおいて、本発明は、さらに、第１の投与後約２日〜約２１日目に、少なくとも１つの追加的な治療有効量の接着間質細胞を投与する工程を含んでよい。
実施形態のいくつかにおいて、この第１の治療有効量の投与およびこの少なくとも１つの追加的な治療有効量の投与は、筋肉注射によるものであってよい。
実施形態のいくつかにおいて、この第１の治療有効量は、曝露後約０日目〜約１日目、２日目、または３日目に投与され、この少なくとも１つの追加的な治療有効量は、約２日後、約３日後、約４日後、または約５日後に投与される。
実施形態のいくつかにおいて、この第１の治療有効量は、放射線被曝前に投与される。いくつかの実施形態において、この第１の治療有効量は、曝露の約１日前、約２日前、約３日前、約４日前、または約５日前に投与される。
別の態様によると、放射線被曝または化学療法によって内因性造血系に損傷を受けた対象の治療法であって、内因性造血細胞の再増殖を誘導し、および／または内因性造血細胞数の減少を軽減するために、放射線被曝または化学療法後の指定期間内に第１の治療有効量の接着間質細胞をこの対象に投与する工程と、内因性造血細胞の再増殖をさらに誘導し、および／または内因性造血細胞数の減少を軽減するために、少なくとも１つの追加的な治療有効量の接着間質細胞をこの対象に投与する工程と、を含む方法を提供する。
実施形態のいくつかにおいて、内因性造血細胞の再増殖は、内因性造血細胞数の増加を含んでもよい。一実施形態において、内因性造血細胞の再増殖は、ＣＤ４５を発現する造血細胞数の増加を含んでもよい。
実施形態のいくつかにおいて、この放射線被曝または化学療法は進行中である。
実施形態のいくつかにおいて、放射線被曝または化学療法の影響は、悪心、嘔吐、下痢、頭痛、発熱、体重減少、神経症状、白血球減少症、貧血、血小板減少症、疲労、脱力、紫斑、出血、脱毛、またはショックのうちの１つ以上であり得る。同様に、本発明のこの態様の実施形態のいくつかにおいて、放射線または化学療法の影響は、呼吸器系への損傷、神経系への損傷、胃腸系への損傷、心血管系への損傷、皮膚への損傷、または腎臓系への損傷のうちの１つ以上であり得る。特定の実施形態において、神経症状は、認知機能障害、発作、振戦、運動失調、または嗜眠である。
実施形態のいくつかにおいて、この指定期間は０〜１０日以内である。特定の実施形態において、この指定期間は７〜１０日以内である。さらに他の実施形態において、この指定期間は５〜６日以内である。さらに他の実施形態において、この指定期間は２〜４日以内である。さらなる実施形態において、この指定期間は１〜２日以内である。いくつかの実施形態において、この指定期間は約１日以内である。
実施形態のいくつかにおいて、この第１の治療有効量は、放射線被曝または化学療法前に投与される。実施形態のいくつかにおいて、この第１の治療有効量は、曝露の約１日前、約２日前、約３日前、約４日前、または約５日前に投与される。
実施形態のいくつかにおいて、少なくとも１つの第２の治療有効量の投与は、第１の治療有効量の投与後約２日〜約２１日目であってよい。特定の実施形態において、この少なくとも１つの第２の治療有効量の投与は、第１の治療有効量の投与後約２日〜約１０日目である。他の実施形態において、この少なくとも１つの第２の治療有効量の投与は、第１の治療有効量の投与後約２日〜約５日目である。
実施形態のいくつかにおいて、この第１の治療有効量の投与は、血管内注射、筋肉注射、腹腔内注射、皮下注射、または吸入によるものであってよい。
実施形態のいくつかにおいて、この少なくとも１つの追加的な治療有効量の投与は、血管内注射、筋肉注射、腹腔内注射、皮下注射、または吸入によるものであってよい。
いくつかの実施形態において、この第１の治療有効量の投与およびこの少なくとも１つの第２の治療有効量の投与は、筋肉注射によるものである。
さらに別の態様によると、放射線被曝または化学療法によって内因性造血系に損傷を受けた対象を治療するための方法であって、内因性造血細胞の再増殖を誘導し、および／または内因性造血細胞数の減少を軽減するために、放射線被曝または化学療法後の指定期間内に第１の治療有効量の接着間質細胞をこの対象に投与する工程と、内因性造血細胞の再増殖をさらに高めるために、曝露の次のマッチング期間後に外因性造血幹細胞と共に少なくとも１つの第２の治療有効量の接着間質細胞をこの対象に投与する工程と、を含む方法を提供する。対象とマッチする外因性造血幹細胞を見つけるのに必要な期間は、「マッチング期間」と呼ばれる。
実施形態のいくつかにおいて、内因性造血細胞の再増殖は、内因性造血細胞数の増加を含んでもよい。一実施形態において、内因性造血細胞の再増殖は、ＣＤ４５を発現する造血細胞数の増加を含んでもよい。
本発明のこの態様の実施形態のいくつかにおいて、放射線被曝または化学療法は進行中である。
実施形態のいくつかにおいて、放射線被曝または化学療法の影響は、悪心、嘔吐、下痢、頭痛、発熱、体重減少、神経症状、白血球減少症、貧血、血小板減少症、疲労、脱力、紫斑、出血、脱毛、またはショックのうちの１つ以上であり得る。同様に、実施形態のいくつかにおいて、放射線または化学療法の影響は、呼吸器系への損傷、神経系への損傷、胃腸系への損傷、心血管系への損傷、皮膚への損傷、または腎臓系への損傷のうちの１つ以上であり得る。特定の実施形態において、神経症状は、認知機能障害、発作、振戦、運動失調、または嗜眠である。
実施形態のいくつかにおいて、この指定期間は０〜１０日以内である。特定の実施形態において、この指定期間は７〜１０日以内である。さらに他の実施形態において、この指定期間は５〜６日以内である。さらに他の実施形態において、この指定期間は２〜４日以内である。さらなる実施形態において、この指定期間は１〜２日以内である。いくつかの実施形態において、この指定期間は約１日以内である。
実施形態のいくつかにおいて、この第１の治療有効量は、放射線被曝または化学療法前に投与される。実施形態のいくつかにおいて、この第１の治療有効量は、曝露の約１日前、約２日前、約３日前、約４日前、または約５日前に投与される。
実施形態のいくつかにおいて、この少なくとも１つの第２の治療有効量の投与は、第１の治療有効量の投与後約２日〜約２１日目であってよい。特定の実施形態において、この少なくとも１つの第２の治療有効量の投与は、第１の治療有効量の投与後約２日〜約１０日目である。他の実施形態において、この少なくとも１つの第２の治療有効量の投与は、第１の治療有効量の投与後約２日〜約５日目である。
実施形態のいくつかにおいて、第１の治療有効量の投与は、血管内注射、筋肉注射、腹腔内注射、皮下注射、または吸入によるものであってよい。
実施形態のいくつかにおいて、この少なくとも１つの追加的な治療有効量の投与は、血管内注射、筋肉注射、腹腔内注射、皮下注射、または吸入によるものであってよい。
いくつかの実施形態において、この第１の治療有効量の投与およびこの少なくとも１つの第２の治療有効量の投与は、筋肉注射によるものである。
実施形態のいくつかにおいて、本発明は、さらに、外因性造血幹細胞を対象とマッチさせる工程を含んでもよい。対象とマッチする外因性造血幹細胞を見つけるのに必要な期間は、「マッチング期間」と呼ばれる。
実施形態のいくつかにおいて、この外因性造血幹細胞は、マッチさせた同種の臍帯血細胞または骨髄細胞である。
実施形態のいくつかにおいて、この外因性造血幹細胞は対象とマッチするが、この接着間質細胞はこの造血幹細胞とマッチしないか、および／またはこの接着間質細胞はレシピエント対象とマッチしない。
別の態様によると、放射線被曝または化学療法によって内因性造血系に損傷を受けた対象を治療するためのキットであって、内因性造血細胞の再増殖を誘導し、および／または内因性造血細胞数の減少を軽減するために、無菌パッケージ内に治療有効量の接着間質細胞と、治療有効量の投与のための取扱説明書と、を含むキットを提供する。
実施形態のいくつかにおいて、この無菌パッケージは、血管内注射用、筋肉注射用、腹腔内注射用、皮下注射用、または吸入用に構成される。
実施形態のいくつかにおいて、本発明は、さらに、内因性造血細胞の再増殖をさらに高めるために、第２の無菌パッケージに第２の治療有効量の接着間質細胞を含んでもよい。
実施形態のいくつかにおいて、この第２の治療有効量の接着間質細胞は、この第２の無菌パッケージ内に外因性造血幹細胞と共に包装される。
実施形態のいくつかにおいて、この外因性造血幹細胞は、同種の臍帯血細胞または骨髄細胞である。
実施形態のいくつかにおいて、この第１および第２の無菌パッケージは、血管内注射用、筋肉注射用、腹腔内注射用、皮下注射用、または吸入用に構成される。
さらに別の態様によると、放射線被曝後、放射線被曝の影響を軽減するために、対象を治療するための接着間質細胞を提供する。
別の態様によると、化学療法の影響を軽減するために、化学療法を受けている対象を治療するための接着間質細胞を提供する。
さらに別の態様によると、放射線被曝および化学療法後に、放射線被曝および化学療法の影響を軽減するために、対象を治療するための接着間質細胞を提供する。
さらなる態様によると、内因性造血細胞の再増殖を誘導し、および／または内因性造血細胞数の減少を軽減するために、内因性造血系に損傷を受けた対象を治療するための接着間質細胞を提供する。
別の態様によると、放射線被曝または化学療法によって内因性造血系に損傷を受けた対象を治療するための接着間質細胞であって、内因性造血細胞の再増殖を誘導し、および／または内因性造血細胞数の減少を軽減するために、放射線被曝または化学療法後の指定期間内に第１の治療有効量の接着間質細胞をこの対象に投与する工程と、内因性造血細胞の再増殖をさらに誘導し、および／または内因性造血細胞数の減少を軽減するために少なくとも１つの追加的な治療有効量の接着間質細胞をこの対象に投与する工程と、を含む接着間質細胞を提供する。
さらなる態様によると、放射線被曝または化学療法によって内因性造血系に損傷を受けた対象を治療するための接着間質細胞であって、内因性造血細胞の再増殖を誘導し、および／または内因性造血細胞数の減少を軽減するために、放射線被曝または化学療法後の指定期間内に第１の治療有効量の接着間質細胞をこの対象に投与する工程と、内因性造血細胞の再増殖をさらに高めるために、曝露の次のマッチング期間後に外因性造血幹細胞と共に第２の治療有効量の接着間質細胞をこの対象に投与する工程と、を含む接着間質細胞を提供する。対象とマッチする外因性造血幹細胞を見つけるのに必要な期間は、「マッチング期間」と呼ばれる。
別の態様において、治療有効量の開示された接着間質細胞のいずれかを含む医薬組成物を提供する。
さらなる態様において、無菌パッケージ中の開示された医薬組成物のいずれかと、この医薬組成物を投与するための取扱説明書と、を含むキットを提供する。
別の態様は、開示された方法のいずれかを実施するための薬剤調製における接着間質細胞の使用を提供する。
一態様によると、放射線被曝後に対象を治療するための薬剤調製における接着間質細胞の使用であって、治療が、放射線被曝の影響を軽減するために、治療有効量の接着間質細胞をこの対象に投与する工程を含む接着間質細胞の使用を提供する。
一態様によると、化学療法を受けている対象を治療するための薬剤調製における接着間質細胞の使用であって、治療が、化学療法の影響を軽減するために治療有効量の接着間質細胞をこの対象に投与する工程を含む接着間質細胞の使用を提供する。
一態様によると、内因性造血系に損傷を受けた対象を治療するための薬剤調製における接着間質細胞の使用であって、治療が、内因性造血細胞の再増殖を誘導し、および／または内因性造血細胞数の減少を軽減するために、治療有効量の接着間質細胞をこの対象に投与する工程を含む接着間質細胞の使用を提供する。
一態様によると、放射線被曝または化学療法によって内因性造血系に損傷を受けた対象を治療するための薬剤調製における接着間質細胞の使用であって、治療が、内因性造血細胞の再増殖を誘導し、および／または内因性造血細胞数の減少を軽減するために、放射線被曝または化学療法後の指定期間内に第１の治療有効量の接着間質細胞をこの対象に投与する工程と、内因性造血細胞の再増殖をさらに誘導するために、少なくとも１つの追加的な治療有効量の接着間質細胞をこの対象に投与する工程と、を含む接着間質細胞の使用を提供する。
一態様によると、放射線被曝または化学療法によって内因性造血系に損傷を受けた対象を治療するための薬剤調製における接着間質細胞の使用であって、治療が、内因性造血細胞の再増殖を誘導し、および／または内因性造血細胞数の減少を軽減するために、放射線被曝または化学療法後の指定期間内に第１の治療有効量の接着間質細胞をこの対象に投与する工程と、内因性造血細胞の再増殖をさらに高めるために、曝露の次のマッチング期間後に外因性造血幹細胞と共に第２の治療有効量の接着間質細胞をこの対象に投与する工程と、を含む接着間質細胞の使用を提供する。対象とマッチする外因性造血幹細胞を見つけるのに必要な期間は、「マッチング期間」と呼ばれる。
いくつかの前述の態様のいずれかの特定の実施形態において、これらの接着間質細胞の入手源は、胎盤、脂肪組織、または骨髄である。
いくつかの前述の態様のいずれかの特定の実施形態において、これらの接着間質細胞は、細胞増殖を支援する三次元培養条件下で培養される。
いくつかの前述の態様のいずれかの特定の実施形態において、これらの接着間質細胞の入手源は、胎盤、脂肪組織、または骨髄であり、これらの接着間質細胞は、分化することなく、細胞増殖を支援する三次元培養条件下で培養される。
いくつかの前述の態様のいずれかの特定の実施形態において、これらの接着間質細胞は、分化することなく、細胞増殖を支援する三次元培養条件下で、バイオリアクター中で培養された胎盤接着間質細胞である。
いくつかの前述の態様のいずれかの特定の実施形態において、これらの胎盤接着間質細胞の約６０％未満は、アイソタイプ対照と比較して、フローサイトメトリーによって検出される、マーカーＣＤ２００が陽性である。
いくつかの前述の態様のいずれかの特定の実施形態において、これらの胎盤接着間質細胞の約６０％未満は、アイソタイプ対照と比較して、免疫蛍光法によって検出される、マーカーＯＣＴ−４が陽性である。
いくつかの前述の態様のいずれかの特定の実施形態において、これらの接着間質細胞は、Ｆｌｔ−３リガンド、ＩＬ−６、およびＳＣＦを分泌する。
いくつかの前述の態様のいずれかの特定の実施形態において、外因性造血幹細胞は、この対象に投与されない。
さらなる態様によると、内因性造血系に損傷を受けた対象を治療するための方法であって、内因性造血系において内因性造血細胞の再増殖を誘導し、および／または内因性造血細胞数の減少を軽減するために、少なくとも１つの治療有効量の接着細胞をこの対象に投与する工程を含む方法を提供する。
さらなる態様によると、放射線被曝または化学療法後１０日以内に投与するための治療有効量の接着細胞を含むことを特徴とする指定された投与計画において、放射線被曝または化学療法による内因性造血系の損傷の治療に使用するための薬剤製造用の接着細胞の使用を提供する。
さらなる態様によると、放射線被曝または化学療法によって内因性造血系に損傷を受けた対象を治療するためのキットであって、放射線被曝または化学療法後の指定期間内に投与するための、無菌パッケージ内に治療有効量の接着細胞を含むキットを提供する。
記載した実施形態のさらなる特徴によると、これらの接着細胞は、内因性造血系において内因性造血細胞の再増殖を誘導し、および／または内因性造血細胞数の減少を軽減する。
記載した実施形態のさらなる特徴によると、これらの内因性造血細胞は、対象の造血系によって生産された。
記載した実施形態のさらなる特徴によると、内因性造血細胞の再増殖は、対象の内因性造血系の造血細胞数の増加を含む。
記載した実施形態のさらなる特徴によると、内因性造血細胞の再増殖は、ＣＤ４５マーカーを発現する造血細胞数の増加を含む。
記載した実施形態のさらなる特徴によると、この対象は放射線に曝露された。
記載した実施形態のさらなる特徴によると、この放射線曝露は進行中である。
記載した実施形態のさらなる特徴によると、この対象は、造血系に損傷を与える化学物質に曝露された。
記載した実施形態のさらなる特徴によると、この対象は、化学療法で治療された。
記載した実施形態のさらなる特徴によると、この化学療法は進行中である。
記載した実施形態のさらなる特徴によると、接着細胞の入手源は、胎盤、脂肪組織、または骨髄である。
記載した実施形態のさらなる特徴によると、これらの接着細胞は、細胞増殖を支援する三次元培養条件下で培養された。
記載した実施形態のさらなる特徴によると、これらの胎盤接着間質細胞の約６０％未満は、アイソタイプ対照と比較して、フローサイトメトリーによって検出される、マーカーＣＤ２００が陽性である。
記載した実施形態のさらなる特徴によると、これらの胎盤接着間質細胞の約６０％未満は、アイソタイプ対照と比較して、免疫蛍光法によって検出される、マーカーＯＣＴ−４が陽性である。
記載した実施形態のさらなる特徴によると、これらの接着間質細胞は、Ｆｌｔ−３リガンド、ＩＬ−６、およびＳＣＦを分泌する。
記載した実施形態のさらなる特徴によると、これらの接着細胞の入手源は、胎盤、脂肪組織、または骨髄であり、これらの接着細胞は、分化することなく細胞増殖を支援する三次元培養条件下で培養された。
記載した実施形態のさらなる特徴によると、これらの接着細胞の入手源は胎盤であり、これらの接着細胞は、分化することなく細胞増殖を支援する三次元培養条件下で培養された。
記載した実施形態のさらなる特徴によると、これらの接着細胞は、筋肉注射によって投与される。
記載した実施形態のさらなる特徴によると、これらの接着細胞は、少なくとも２回、３回、４回、５回、または最大１０回投与される。
記載した実施形態のさらなる特徴によると、これらの接着細胞は、少なくとも２回投与され、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０日間隔で投与される。
記載した実施形態のさらなる特徴によると、これらの接着細胞は、少なくとも２回筋肉内投与され、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０日間隔で投与される。
別の態様によると、損なわれた造血系に罹患している対象の内因性造血系において内因性造血細胞の再増殖を誘導し、および／または内因性造血細胞数の減少を軽減するための治療有効量の接着細胞を含む医薬組成物を提供する。
さらなる態様によると、放射線または化学物質への曝露によって内因性造血系に損傷を受けた対象を治療するための方法であって、放射線または化学物質への曝露後の指定期間内に第１の治療有効量の接着細胞をこの対象に投与する工程と、曝露の次のマッチング期間後に、外因性造血幹細胞と共に第２の治療有効量の接着細胞をこの対象に投与する工程と、を含む方法を提供する。対象とマッチする外因性造血幹細胞を見つけるのに必要な期間は、「マッチング期間」と呼ばれる。いくつかの実施形態において、この造血幹細胞は、マッチさせた同種の臍帯血細胞または骨髄細胞である。いくつかの実施形態において、この治療法は、この対象において内因性造血細胞の再増殖を誘導する。いくつかの実施形態において、この治療法は、対象において内因性造血細胞数の減少を軽減する。いくつかの実施形態において、この化学物質への曝露は化学療法である。いくつかの実施形態において、放射線は電離放射線である。
さらに別の態様によると、放射線または化学物質への曝露によって内因性造血系に損傷を受けた対象を治療するための方法であって、放射線または化学物質への曝露後の指定期間内に第１の治療有効量の接着細胞をこの対象に投与する工程と、少なくとも１つの追加的な治療有効量の接着細胞をこの対象に投与する工程と、を含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、治療有効量の接着細胞のそれぞれの入手源は、胎盤、脂肪組織、または骨髄であり、これらの接着細胞は、細胞増殖を支援する三次元培養条件下で培養された。いくつかの実施形態において、この治療法は、対象において内因性造血細胞の再増殖を誘導する。いくつかの実施形態において、この治療法は、対象において内因性造血細胞数の減少を軽減する。いくつかの実施形態において、この化学物質への曝露は化学療法である。いくつかの実施形態において、放射線は電離放射線である。
さらなる態様によると、放射線または化学物質への曝露によって内因性造血系に損傷を受けた対象を治療するためのキットであって、放射線または化学物質への曝露後の指定期間内に投与するための、第１の無菌パッケージ内の第１の治療有効量の接着細胞と、曝露の次のマッチング期間後に投与するための、第２の無菌パッケージ内の造血幹細胞と共に必要に応じて提供される第２の治療有効量の接着細胞と、第１および第２の治療有効量の投与のための取扱説明書と、を含むキットを提供する。造血幹細胞がキットの一部として提供されるそれらの実施形態において、特定の実施形態において、これらの造血細胞は、マッチさせた同種の臍帯血細胞または骨髄細胞として提供される。いくつかの実施形態において、この治療法は、対象において内因性造血細胞の再増殖を誘導する。いくつかの実施形態において、この治療法は、対象において内因性造血細胞数の減少を軽減する。いくつかの実施形態において、この化学物質への曝露は化学療法である。いくつかの実施形態において、放射線は電離放射線である。
さらなる態様によると、放射線被曝または化学療法後１０日以内に第１の治療有効量の接着細胞を、かつ第２の指定期間後に少なくとも１つの第２の治療有効量の接着細胞を投与する工程を含むことを特徴とする指定された投与計画において、放射線被曝または化学療法による内因性造血系の損傷の治療に使用するための薬剤製造用の接着細胞の使用を提供する。いくつかの実施形態において、この治療法は、対象における内因性造血細胞の再増殖を誘導する。いくつかの実施形態において、この治療法は、対象における内因性造血細胞数の減少を軽減する。いくつかの実施形態において、化学物質への曝露は化学療法である。いくつかの実施形態において、放射線は電離放射線である。
記載した実施形態のさらなる特徴によると、この少なくとも１つの第２の治療有効量が、マッチした同種の臍帯血細胞または骨髄細胞をさらに含み、その際、第２の指定期間は、対象とマッチさせる細胞をマッチングするマッチング期間である。
さらに別の態様によると、放射線または化学物質に曝露された対象を治療する方法であって、治療有効量の接着間質細胞を曝露された対象に投与する工程を含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、この化学物質への曝露は化学療法である。いくつかの実施形態において、放射線は電離放射線である。いくつかの実施形態において、この曝露は、治療されないままであると、一般に、約１〜２日以内（例えば、３０Ｇｙを上回る電離放射線（ＩＲ）の曝露）、２日〜２週間以内（例えば、約８〜３０ＧｙのＩＲの曝露）、または約２〜４週間以内（例えば、約２〜８ＧｙのＩＲの曝露）に、この対象にとって致死的であるような曝露である。
さらに別の態様によると、放射線障害または有毒化学物質への曝露に関連する症状を軽減する方法であって、治療有効量の接着間質細胞を曝露された対象に投与する工程を含む方法も提供する。いくつかの実施形態において、放射線障害は急性である。いくつかの実施形態において、この有毒化学物質は、化学療法の一部として投与される。これらの実施形態のいずれにおいても、症状には、吐き気、嘔吐、下痢、頭痛、発熱、体重減少、神経症状（例えば、認知機能障害、発作、振戦、運動失調、嗜眠）、白血球減少症、貧血、血小板減少症、疲労感、脱力、紫斑、出血、脱毛、およびショックが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、放射線または化学療法は、呼吸器系への損傷、神経系への損傷、胃腸系への損傷、心血管系への損傷、皮膚への損傷、または腎臓系への損傷を引き起こす。
これらの態様の様々な実施形態のいくつかにおいて、投与期間、投与回数および投与経路は上記のとおりである。
これらの様々な態様の特定の実施形態において、外因性造血幹細胞は、対象に投与されない。
特に定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載したものと同様または同等の方法および材料を、本発明の実施または試験に用いることができるが、適切な方法および材料を以下に記載する。矛盾する場合、定義を含む本特許明細書が支配する。さらに、材料、方法、および実施例は例示にすぎず、限定することを意図しない。
本発明は、本明細書に添付の図面を参照しながら、単なる例として記載されている。以降詳細に図面を具体的に参照するが、示される個々の項目は例示であり、本発明の好ましい実施形態の単なる例示的な説明の目的のためであり、本発明の原理および概念的側面の最も有用かつ容易に理解される説明であると考えられるものを提供するために提示されることを強調する。この点で、本発明の基本的な理解に必要であるものよりも詳細に本発明の構造細部を示す試みはなされておらず、図面と共に説明することで、本発明のいくつかの形態を実際に具体化できる方法が当業者には明らかとなる。
３−Ｄ担体を含むバイオリアクターシステムで作り出された骨様微小環境を示す写真である。図１ａ〜図１ｂは、天然の骨（図１ａ）と、骨の微小環境を模倣した、接着間質細胞播種後７日目のＰｌｕｒｉＸ（ＴＭ）３Ｄ担体（３Ｄ−ＡＳＣ）の構造（図１ｂ）を比較した電子顕微鏡写真である。図１ｃ〜図１ｆは、骨髄から生産した３Ｄ−ＡＳＣを播種し、播種後２０日目（図１ｃ〜図１ｄ、それぞれ１５０倍および２５０倍に拡大）および４０日目（図１ｅ〜図１ｆ、それぞれ３５０倍および５００倍に拡大）のＰｌｕｒｉＸ（商標）３Ｄマトリックスを示す電子顕微鏡写真である。図１ｇは、ＰｌｕｒｉＸ３Ｄ押し出し流れバイオリアクター（ｐｌｕｇ ｆｌｏｗ ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ）の図であり、個々の部分を番号で定義する：培養培地貯蔵所（１）、ガス混合物供給源（２）、フィルター（３）、注入点（４）、３Ｄ担体を置くカラム（５）、流量計（６）、流量弁（６ａ）、分離容器（７）、細胞増殖分析器（８）、蠕動ポンプ（９）、サンプリング点（１０）、溶解したＯ２測定用電極（１１）、ｐＨ測定用電極（１２）、制御システム（１３）、新たな増殖培地（１４）、使用済み増殖培地（１５）。
バイオリアクターシステム内で、３Ｄ成長条件で成長させた、異なる生産ロットの胎盤由来接着間質細胞（３Ｄ−ＡＳＣ；ロット５〜８）の結果を示すグラフである。ＡＳＣ（２×１０６）を、１００００〜１５０００細胞／担体の密度でバイオリアクターに播種した。１２日間の培養後、３Ｄ−ＡＳＣは、担体あたり１５０，０００から２５０，０００細胞の間の密度または１５０個の担体を含むバイオリアクター中で２２．５〜３７．５×１０６個に達した。
従来の２Ｄ培養条件で培養した胎盤細胞中の膜マーカー（薄紫）と比較した、胎盤由来の３Ｄ−ＡＳＣ中で発現した膜マーカー（濃い紫色）の発現レベルの差を示す棒グラフである。接着細胞を、ポリスチレン担体（３Ｄ）上で、フラスコ（２Ｄ）中で４〜６週間、またはバイオリアクターシステムで２〜３週間成長させた。フラスコまたは担体のいずれかから収集した後、細胞をインキュベートし、間葉細胞（図３ａ）、または造血細胞（図３ｂ）に特徴的な膜マーカーを認識するモノクローナル抗体（ＭＡｂ）のパネルに結合させた。ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ７３およびＣＤ２９の膜マーカーについて示すとおり、３Ｄ培養接着細胞で発現させた膜マーカーと比較して、２Ｄ培養細胞において膜マーカーの発現は著しく高く、特に、ＣＤ１０５は、３Ｄ培養細胞において５６％の発現を示し、２Ｄ培養細胞においては８７％の発現を示した（図３ａ）ことに留意されたい。２Ｄ培養および３Ｄ培養の両方のＡＳＣは、造血膜マーカーを全く発現しなかった（図３ｂ）。
２Ｄ条件下および３Ｄ条件下で培養し、胎盤から生産したＡＳＣ中または２Ｄ条件下および３Ｄ条件下での培養の馴化培地中のタンパク質レベルの比較を示す棒グラフである。図４ａは、２Ｄおよび３Ｄで培養したＡＳＣの馴化培地中１×１０６細胞／ｍｌに対して規準化し、ＥＬＩＳＡによって分析した時のＦｌｔ−３リガンドのレベル（ｐｇ／ｍｌ）を示す。結果は、３つの独立した実験のうちの１つを表す。タンパク質試料は、２Ｄ（白色棒）および３Ｄ（灰色の棒）条件下で成長させたＡＳＣから収集した。この図は、２つのレプリカ実験のうちの１つを示す。２Ｄおよび３Ｄ培養条件の細胞中ならびに馴化培地中のタンパク質のいくつかの発現レベルの違いに留意されたい。 ２Ｄ条件下および３Ｄ条件下で培養し、胎盤から生産したＡＳＣ中または２Ｄ条件下および３Ｄ条件下での培養の馴化培地中のタンパク質レベルの比較を示す棒グラフである。図４ｂは、２Ｄおよび３Ｄで培養したＡＳＣの馴化培地中１×１０６細胞／ｍｌに対して規準化し、ＥＬＩＳＡによって分析した時のＩＬ−６のレベル（ｐｇ／ｍｌ）を示す。結果は、３つの独立した実験のうちの１つを表す。タンパク質試料は、２Ｄ（白色棒）および３Ｄ（灰色の棒）条件下で成長させたＡＳＣから収集した。この図は、２つのレプリカ実験のうちの１つを示す。２Ｄおよび３Ｄ培養条件の細胞中ならびに馴化培地中のタンパク質のいくつかの発現レベルの違いに留意されたい。 ２Ｄ条件下および３Ｄ条件下で培養し、胎盤から生産したＡＳＣ中または２Ｄ条件下および３Ｄ条件下での培養の馴化培地中のタンパク質レベルの比較を示す棒グラフである。図４ｃは、２Ｄおよび３Ｄで培養したＡＳＣの馴化培地中１×１０６細胞／ｍｌに対して規準化し、ＥＬＩＳＡによって分析した時のＳＣＦのレベル（ｐｇ／ｍｌ）を示す。結果は、３つの独立した実験のうちの１つを表す。タンパク質試料は、２Ｄ（白色棒）および３Ｄ（灰色の棒）条件下で成長させたＡＳＣから収集した。この図は、２つのレプリカ実験のうちの１つを示す。２Ｄおよび３Ｄ培養条件の細胞中ならびに馴化培地中のタンパク質のいくつかの発現レベルの違いに留意されたい。 ２Ｄ条件下および３Ｄ条件下で培養し、胎盤から生産したＡＳＣ中または２Ｄ条件下および３Ｄ条件下での培養の馴化培地中のタンパク質レベルの比較を示す棒グラフである。図４ｄは、ｉＴＲＡＱ試薬で標識したタンパク質試料を用いて質量分析によって分析し、互いに比較した時の異なる細胞タンパク質の発現レベルを示す。タンパク質試料は、２Ｄ（白色棒）および３Ｄ（灰色の棒）条件下で成長させたＡＳＣから収集した。この図は、２つのレプリカ実験のうちの１つを示す。２Ｄおよび３Ｄ培養条件の細胞中ならびに馴化培地中のタンパク質のいくつかの発現レベルの違いに留意されたい。
移植後３．５週間の化学療法（連続した２週間は２５ｍｇ／ｋｇのブスルファンを腹腔内注射）で治療したＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの骨髄（ＢＭ）中で検出されたヒトＣＤ４５＋細胞の割合を示すグラフである。単核臍帯血由来の細胞から精製したＣＤ３４＋細胞（１００，０００）を単独で移植（５匹のマウス、ａ）するか、または２Ｄの条件で培養した０．５×１０６個の胎盤由来の接着細胞と共移植（２Ｄ−ＡＳＣ；２匹のマウス、ｂ）するか、またはｐｌｕｒｉＸ（商標）バイオリアクター中３Ｄ条件で培養した胎盤由来の接着細胞（３Ｄ−ＡＳＣ）と共移植（５匹のマウス、ｃ）した。次いで、骨髄（ＢＭ）を、マウスの大腿骨および脛骨から収集した。ＢＭ中のヒト細胞をフローサイトメトリーによって検出した。抗ヒトＣＤ４５−ＦＩＴＣと細胞をインキュベートすることによって、ＣＤ４５を発現するヒト細胞の割合を決定した。ＨＳＣ単独で治療したマウス中のヒト細胞の割合（ａ）と比較して、２Ｄ−ＡＳＣ（ｂ）および３Ｄ−ＡＳＣ（ｃ）と共移植したマウスの骨髄中のヒト細胞（ｈＣＤ４５＋）の割合が高いことに留意されたい。２Ｄ−ＡＳＣ培養細胞で治療したマウスと比較して、３Ｄ−ＡＳＣ培養細胞で治療したマウスに見られるより高い生着は、３Ｄ培養ＡＳＣに固有のより高い治療上の利点を示す。
脂肪組織由来のＡＳＣと共に移植したＣＤ３４＋細胞（図６ｂ）と比較した、ＣＤ３４＋細胞単独（図６ａ）を移植したマウス中のヒト移植組織ＣＤ４５＋細胞のＦＡＣＳ分析である。ヒトＣＤ３４＋細胞単独で治療したマウス（６ｂ、１２％）と比較して、脂肪組織由来のＡＳＣで共移植したマウス中のヒト造血集団（ｈＣＤ４５＋）（６ａ、２９％）の割合が著しく高いことに留意されたい。
ヒト臍帯血単核細胞（ＣＢ）と同量の放射線照射（３０００ラッド）臍帯血細胞（ｉＣＢ）との間、ヒト臍帯血単核細胞（ＣＢ）とヒト末梢血由来の単核球（ＰＢＭＣ）との間、ヒト臍帯血単核細胞（ＣＢ）と２Ｄ培養（２Ｄ）胎盤ＡＳＣとの間、もしくはヒト臍帯血単核細胞（ＣＢ）と３Ｄ培養（３Ｄ）胎盤ＡＳＣとの間、またはヒト臍帯血単核細胞（ＣＢ）とＰＢＭＣと２Ｄ培養胎盤ＡＳＣの組み合わせおよびヒト臍帯血単核細胞（ＣＢ）とＰＢＭＣと３Ｄ培養胎盤ＡＳＣの組み合わせ（ＰＢＭＣ＋２ＤおよびＰＢＭＣ＋３Ｄ）との間で行った混合リンパ球反応の結果を示す棒グラフである。ＣＢ細胞集団のサイズを、培養の最後の１８時間中に測定した（ＣＰＭで測定した）３Ｈ−チミジン取り込みによって表す。刺激したＣＢ細胞増殖の上昇は、より高いレベルの免疫反応を示す。接着細胞と共にインキュベートした細胞によって示される免疫反応のレベルの低さ、および、特に、接着細胞と共培養した時のＰＢＭＣに対するＣＢ免疫反応の低減に留意されたい。各反応について３回反復を行った。
ヒト脂肪組織由来の接着間質細胞（図８Ｂ）と共にヒトＣＤ３４＋細胞を移植したマウスと比較して、ヒトＣＤ３４＋細胞単独（図９Ａ）を移植したマウス中のマウスＣＤ４５＋細胞のＦＡＣＳ分析である。ヒトＣＤ３４＋細胞単独で治療したマウス中のマウス造血集団（ｍＣＤ４５＋）（８Ａ、５．５７％）と比較して、脂肪組織由来の接着細胞と共移植したマウス中のマウス造血集団（ｍＣＤ４５＋）（８Ｂ、９．４２％）の割合が著しく高いことに留意されたい。
ＢＡＬＢ／ｃマウスおよびＣ３Ｈマウスにおける２種類の放射線量の電離放射線照射後（３Ｄ−ＡＳＣ治療なし）のマウスの生存率の追跡調査を示すグラフである。
非放射線照射Ｃ３ＨマウスおよびＢＡＬＢ／ｃマウスの体重変化に対する異なる用量の３Ｄ−ＡＳＣ（ＰＬＸ）細胞の効果を示すグラフであり、０．５×１０６細胞用量および１×１０６細胞用量の静脈注射の安全性を示す。
放射線被曝後のＣ３Ｈマウスの生存率（パネルＡ）および規準化した体重変化（パネルＢ）を示すグラフである。「ＰＬＸ」は、３Ｄ−ＡＳＣ細胞を用いた治療を意味する。「ビヒクル」は、ＰＬＸ細胞を与えなかった対照マウスを意味する。
治療しない（左）か、またはＰＬＸ細胞で治療した（右）放射線照射マウスの脾臓重量を示すグラフであり、さらに、マウスの対応するグループ由来の代表的な調製脾臓を視覚的に示す。Ｃ３Ｈマウスへの亜致死線量の放射線照射、続く３Ｄ−ＡＳＣ（ＰＬＸ）の注射後９日目にこの調製を行い、ＢＭ細胞の再生を、脾臓コロニー形成アッセイにより試験した。前駆細胞由来のコロニーをＢＭ中に再懸濁した。
骨髄前駆細胞の再増殖を示すグラフである。有核ＢＭ細胞を、ＰＢＳでの洗浄、その後、溶解溶液を用いるＲＢＳ溶解によりマウスの両後肢四肢の大腿骨および脛骨から収集し、次いで、直接数を数えた。非放射線照射マウスの正常骨髄細胞数は、約３０×ｌ０６個に及ぶ。３Ｄ−ＡＳＣ（ＰＬＸ）で治療したマウスは、放射線被曝後９日および２３日目に、非常に高レベルの全有核骨髄細胞を有していた。
３Ｄ−ＡＳＣおよび同種骨髄の移植（ＰＬＸ−ＢＭＴ）による治療の相乗効果、すなわちヒト臍帯血（ｈＵＣＢ）の生着の向上を示す結果のグラフである。これらの結果は、３５０ラドの放射線照射ＮＯＤマウスを用いて得られ、生着は注射後５週目に起きた。放射線照射の代わりにブスルファンを用いた時に、同様の生着の結果が得られ、これらの結果は、放射線照射または化学療法によって損なわれた内因性造血系を治療するための併用治療の有効性および相乗効果も示す。
放射線被曝または化学療法によって内因性造血系に損傷を受けた対象を治療する方法２００を示す高レベルフローチャートである。
本発明のいくつかの実施形態に係るいくつかの投与計画を示す図である。接着間質細胞（ＡＳＣ）の投与およびマッチさせた同種の臍帯血細胞または骨髄細胞（ＣＢ／ＢＭ）とＡＳＣの投与を、放射線被曝または化学療法後の時間に対して示す。
放射線照射後２４時間にＰＬＸを静脈内投与したマウス（●）およびＰＬＸ治療を受けていないマウス（○）の生存データを示すグラフである。
１８日間の体重変化を、規準化した体重変化（図１８Ａ）または平均体重変化（図１８Ｂ）として経時的に示すグラフである。
８日目（図１９Ａ；全グループ ｎ＝３）および１８日目（図１９Ｂ；対照 ｎ＝２、ＰＬＸ ｎ＝９、およびビヒクル ｎ＝１）における対照マウス、ビヒクル治療マウス、およびＰＬＸ治療マウスの全骨髄細胞数を示すグラフである。
８日目（図２０Ａ）および１８日目（図２０Ｂ）における赤血球（ＲＢＣ）数を示すグラフである。
８日目（Ａ）および１８日目（Ｂ）における白血球（ＷＢＣ）数を示すグラフである。
８日目（Ａ、Ｃ）および１８日目（Ｂ、Ｄ）における有核ＲＢＣのデータを示すグラフである。上のグラフ（Ａ、Ｂ）は有核ＲＢＣの割合（％）を示す。下のグラフ（Ｃ、Ｄ）は、１μｌあたりの有核ＲＢＣの絶対数×１０３を示す。
８日目（Ａ）および１８日目（Ｂ）におけるヘモグロビン値を示すグラフである。
８日目（Ａ）および１８日目（Ｂ）における血小板数を示すグラフである。
８日目（Ａ）および１８日目（Ｂ）におけるヘマトクリット値を示すグラフである。
ＰＬＸ細胞またはビヒクルの注射後１日目（Ａ）および４日目（Ｂ）のサイトカインプロファイルを示すグラフである。
マウスを放射線に曝露した後の生存率（パネルＡ）および規準化した体重変化（パネルＢ）を示すグラフである。１用量の接着間質細胞（ＡＳＣ）（■）または２用量の接着間質細胞（ＡＳＣ）（●）を筋肉内投与（ＩＭ）して治療した放射線照射マウスを、ＡＳＣで治療していない対照マウスと比較して示す。
７７０ｃＧｙの放射線量で放射線照射し、放射線照射後１日目または１日目と５日目に、示した細胞用量を筋肉内投与（ＩＭ）して治療した後の生存率（Ａ）および平均体重変化（Ｂ）を示すグラフである。
２３日目における骨髄細胞の平均細胞数を示すグラフである。
２３日目における白血球（ＷＢＣ）および赤血球（ＲＢＣ）の数を示すグラフである。各マウスのそれぞれの数を、パネルＡ（ＷＢＣ）およびパネルＢ（ＲＢＣ）に示す。パネルＣ（ＷＢＣ）およびパネルＤ（ＲＢＣ）は、各グループについてプールしたデータを示す。
２３日目の個々のマウス（Ａ）および平均グループ（Ｂ）の血小板数を示すグラフである。
２３日目の個々のマウス（Ａ、Ｂ）のヘモグロビン（Ａ、Ｃ）およびヘマトクリット値（Ｂ、Ｄ）の結果ならびにグループごとに平均化した値（Ｃ、Ｄ）を示すグラフである。
７７０ｃＧｙの放射線量での放射線照射後の生存率（Ａ）および平均体重変化（Ｂ）を示すグラフである。マウスに、放射線照射後２４時間および５日目に、注射あたり２×１０６細胞の用量で母方由来の細胞または母方／胎児混合細胞のいずれか一方を筋肉注射した。
２３日目の血液結果を示すグラフである。図３４Ａは全骨髄細胞数を示す。図３４Ｂは白血球数を示す。図３４Ｃは赤血球数を示す。図３４Ｄは血小板数を示す。
２３日目のヘモグロビン（Ａ）およびヘマトクリット値（Ｂ）を示すグラフである。
ＰＬＸ細胞またはビヒクルでの注射後８日目におけるサイトカインプロファイルを示すグラフである。
８日目における全骨髄細胞数（Ａ）、白血球数（Ｂ）、赤血球数（Ｃ）、および血小板数（Ｄ）に関するマウスのグループ間の差異を示すグラフである。
ヘマトクリット値（Ａ）およびヘモグロビン（Ｂ）を示すグラフである。
脱灰した大腿骨組織像を示す写真である。
７７０ｃＧｙの放射線量での放射線照射後の生存率（Ａ）および平均体重変化（Ｂ）を示すグラフである。マウスに、放射線照射後４８時間および５日目に、注射あたり２×１０６細胞の用量で母方由来の細胞または母方／胎児混合細胞のいずれか一方を筋肉注射した。
４８時間および５日目に母方ＰＬＸ細胞または混合ＰＬＸ細胞で治療したマウスにおける２３日目の血液結果を示すグラフである。図４１Ａは全骨髄細胞数を示す。図４１Ｂは白血球数を示す。図４１Ｃは赤血球数を示す。図４１Ｄは血小板数を示す。
２３日目のヘモグロビン（図４２Ａ）およびヘマトクリット値（図４２Ｂ）を示すグラフである。
本発明には、細胞増殖の方法ならびに細胞および細胞によって生成される馴化培地の使用が含まれる。有害なレベルの放射線の被曝後に対象を治療する方法であって、放射線被曝の影響を軽減するために、治療有効量の接着間質細胞をこの対象に投与する工程を含む方法が本発明に包含される。化学療法を受けている対象を治療するための方法であって、化学療法の影響を軽減するために、治療有効量の接着間質細胞をこの対象に投与する工程を含む方法も本発明に包含される。これらの方法は、放射線照射または化学療法後に対象に投与される接着間質細胞がこの対象の生存を促進し、損なわれた造血系を有する対象において、これらの接着間質細胞が、対象の内因性造血系の回復を促進し、および／または内因性造血細胞数の減少を軽減するという本発明者の認識に由来する。
本発明の原理および操作は、図面および付随する説明を参照することでよりよく理解することができる。本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、以下の説明に記載されるかまたは実施例によって例示される細部への適用において限定されないことを理解されたい。本発明は、他の実施形態が可能であり、あるいは、様々な方法で実施するかまたは行うことが可能である。本明細書で用いられる表現および専門用語は、説明の目的のためであり、限定するものとみなされるべきではないことも理解されたい。
本発明を実施に向けてまとめる一方で、本発明者らは、胎盤、脂肪組織、または骨髄由来の接着細胞を効率的に三次元培養条件で増殖させることができることを発見した。従って、胎盤、脂肪組織、または骨髄由来の接着細胞、およびそれから生成される馴化培地を、移植、組織再生およびインビボでのＨＳＣ支援などの治療法のために使用することができる。
以下の本明細書および下記の実施例のセクションに示すとおり、本発明者らは、３Ｄ設定で脂肪、骨髄、および胎盤由来の接着細胞を増殖させることができた。それに応じて、増殖させた細胞は、接着アッセイおよび再増殖アッセイ（実施例１参照）から明らかなように、低温保存後に生存能力があることが見出された。胎盤由来の接着細胞のフローサイトメトリー分析により、異なるマーカーの発現パターンが明らかになった（図３ａ〜３ｂ参照）。最も重要なことに、２Ｄまたは３Ｄの設定で増殖させた脂肪および胎盤由来の接着細胞は、ＨＳＣ生着を支援することができ（実施例２参照）、このことが、クリニックにおける本発明の細胞の使用を示した。
したがって、本発明の一態様によると、細胞増殖の方法であって、細胞増殖を支援する三次元（３Ｄ）培養条件下で胎盤、脂肪組織、または骨髄由来の接着細胞を培養する工程を含む方法を提供する。
本明細書で使用する「増殖（ｅｘｐａｎｄｉｎｇ）」および「増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）」という用語は、実質的には細胞の分化の無い維持（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｌｅｓｓ ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ）、および最終的には細胞成長、すなわち、このような増加に伴って分化することのない細胞集団の増加（例えば、少なくとも２倍）を表す。
本明細書で使用する「維持（ｍａｉｎｔａｉｎｉｎｇ）」および「維持（ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ）」という用語は、実質的に分化の無い細胞の再生、すなわち、このような定常性に伴って分化することのない実質的に定常な細胞集団を表す。
本明細書で使用する「接着細胞」という語句は、足場依存的な、すなわち、インビトロで成長するために表面への付着を必要とする細胞の同種集団または異種集団を表す。
本明細書で使用する「脂肪組織」という語句は、脂肪細胞（ｆａｔ ｃｅｌｌ）（脂肪細胞（ａｄｉｐｏｃｙｔｅ））を含む結合組織を表す。
本明細書で使用する「胎盤組織」という用語は、子宮壁の内側を覆い、妊娠中、胎児を包む哺乳類の雌の臓器の部分を表し、その部分に胎児は臍帯によって付着している。出産後、胎盤は取り除かれる（産後の胎盤ともいわれる）。
本明細書で使用する「三次元培養条件」という語句は、細胞成長に適合する一方で、細胞が複数の層で成長するのを可能にする条件に細胞を置くことを表す。三次元構造として生体（または組織）中の細胞の原位置の環境はよく理解されている。細胞は、他の細胞によって囲まれている。細胞は、様々な局所微小環境の確立を可能にする細胞外マトリックスのナノスケール繊維の複雑なネットワーク中で保持される。それらの細胞外リガンドは、基底膜への付着を仲介するだけでなく、様々な血管およびリンパ管へアクセスする。酸素、ホルモンおよび栄養素は細胞へ運ばれ、老廃物は運び出される。本発明の三次元培養条件は、例えば、以下でさらに例示するような環境を模倣するように設計される。
胎盤由来の接着間質細胞は、胎盤の胎児部分（すなわち、羊膜または胎盤の内部の部分）および母方部分（すなわち、基底脱落膜、および壁側脱落膜）の両方から得ることができる。したがって、胎盤由来の「母方」接着間質細胞は、胎盤の母方部分由来の細胞を少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９８％、９９％または１００％含む。同様に、「胎児」接着間質細胞は、胎盤の胎児部分由来の接着細胞を少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９８％、９９％または１００％含む。
母方由来および胎児由来の接着間質細胞を調製し、特徴付ける方法については、ＷＯ２０１１／０６４６６９に記載されており、これは参照により組み込まれる。いくつかの実施形態において、母方および胎児の胎盤接着間質細胞は、遺伝子型および／または核型（例えば、ＦＩＳＨ）分析に基づいて同定される。例えば、雄胚の胎盤由来の接着間質細胞は、核型分析に基づいて胎児および母方の細胞に分離することができる（すなわち、ＸＸ細胞は母方であるが、ＸＹ細胞は胎児である）。いくつかの実施形態において、（例えば、絨毛膜絨毛から成るまたは絨毛膜絨毛を含む）胎盤の胎児部分由来の接着間質細胞は、ＣＤ２００を発現する。すなわち、負の発現を明確にするためのアイソタイプ対照を用いてフローサイトメトリーにより測定した場合に、これらの細胞の少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％は、ＣＤ２００を発現する。いくつかの実施形態において、負の発現を明確にするためのアイソタイプ対照を用いてフローサイトメトリーにより測定した場合に、母方部分由来の接着間質細胞の３．５％以下、３％以下、２％以下、または１％以下がＣＤ２００を発現する。
母方由来の胎盤接着細胞、胎児由来の胎盤接着細胞、または混合された母方と胎児由来の胎盤接着細胞が調製されるか否かにかかわらず、組織標本を生理的緩衝液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）またはハンクス緩衝液）で洗浄する。単一細胞懸濁液を、消化酵素で組織を処理するか（下記参照）、および／またはナイロンフィルター（ファルコン、ベクトン・ディッキンソン、サンノゼ、カリフォルニア州）に通すか、穏やかにピペッティングすることによって組織部分を刻み、洗浄培地で洗い流すことによって作製する。
脂肪組織由来の接着間質細胞は、当業者に周知の様々な方法により単離することができる。例えば、このような方法は、米国特許第６，１５３，４３２号に記載されている。脂肪組織は、大網／内臓、乳房、生殖腺、または他の脂肪組織の部位に由来してもよい。脂肪組織の好ましい供給源は、大網脂肪である。ヒトにおいて、脂肪は、典型的には、脂肪吸引により単離される。
脂肪組織から単離した接着間質細胞は、コラゲナーゼ、トリプシンおよび／もしくはディスパーゼなどの消化酵素、ならびに／または有効濃度のヒアルロニダーゼもしくはＤＮＡｓｅ、ならびにエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）で、１０分〜３時間の間の期間、２５〜５０℃の間の温度でこの組織を処理することによって取得することができる。次いで、これらの細胞を、２０ミクロン〜８００ミクロンの間のナイロンまたはチーズクロスのメッシュフィルターに通過させてもよい。次いで、これらの細胞を、培地中で直接、あるいはフィコール上もしくはパーコール上、または他の粒子の勾配で分画遠心法に供する。細胞を、１００×ｇ〜３０００×ｇの間の速度で、１分〜１時間の間、４〜５０℃の間の温度で遠心分離する（米国特許第７，０７８，２３０号参照）。
胎盤または脂肪組織由来の接着間質細胞に加えて、本発明は、他の細胞源由来の接着間質細胞の使用も想定している。例えば、特定の実施形態において、これらの接着間質細胞は、骨髄から得られる。接着間質細胞を取得することができる他の組織源には、臍帯血、毛包（例えば、米国特許出願第２００６０１７２３０４号に記載されている）、睾丸（例えば、Ｇｕａｎ Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２００６ Ａｐｒ ２７；４４０（７０８８）：１１９９−２０３に記載されている）、ヒトの嗅粘膜（例えば、Ｍａｒｓｈａｌｌ，ＣＴ．，ｅｔ ａｌ．，Ｈｉｓｔｏｌ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ．２００６ Ｊｕｎ；２１（６）：６３３−４３に記載されている）、胚卵黄嚢（例えば、Ｇｅｉｊｓｅｎ Ｎ，Ｎａｔｕｒｅ．２００４ Ｊａｎ ８；４２７（６９７０）：１４８−５４に記載されている）、ならびに羊水（Ｐｉｅｔｅｒｎｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２２：１３３８−１３４５）が含まれるが、これらに限定されない。これらの組織源由来の接着間質細胞は、接着面上でこれらの細胞を培養することによって単離することができるので、最初の集団内の他の細胞から接着間質細胞を単離することができる。
入手源（例えば、胎盤、脂肪組織、または骨髄）に関係なく、細胞の取得は、一般に、無菌条件下で行われる。一度単離細胞を取得すると、単離細胞は、（例えば、面として構成されている）接着材料に接着でき、それによって接着間質細胞を単離することができる。これは、３Ｄ培養条件での培養の前（実施例１参照）または３Ｄ培養条件での培養に付随して行われてもよい。
本明細書で使用する「接着材料」は、表面上で細胞を保持することができる化学構造（例えば、荷電表面に曝露される基）を有する合成材料、天然材料または非細胞毒性の（すなわち、生物学的に適合した）合成もしくは天然の材料の組み合わせを表す。
本発明のこの態様にしたがって使用することができる接着材料の例としては、ポリエステル、ポリアルキレン、ポリフルオロクロロエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリスルホン、セルロースアセテート、ガラス繊維、セラミック粒子、マトリゲル、細胞外マトリックス成分（例えば、フィブロネクチン、コンドロネクチン、ラミニン）、コラーゲン、ポリＬ乳酸および不活性金属繊維が挙げられるが、これらに限定されない。
特定のマーカーを発現する細胞の精製または濃縮のさらなるステップは、当技術分野で公知の方法を用いて（本明細書の以下でさらに記載するような、接着間質細胞のマーカー発現を用いるＦＡＣＳなどによって）行ってもよい。
本発明に係る培養に有用な基礎培地の非限定的な例としては、最小必須培地イーグル、ＡＤＣ−Ｉ、ＬＰＭ（ウシ血清アルブミンを含まない）、Ｆ１Ｏ（ＨＡＭ）、Ｆ１２（ＨＡＭ）、ＤＣＣＭ１、ＤＣＣＭ２、ＲＰＭＩ １６４０、ＢＧＪ培地（フィットン・ジャクソン改変の有無にかかわらず）、基礎培地イーグル（アール塩の塩基（Ｅａｒｌｅ’ｓ ｓａｌｔ ｂａｓｅ）を添加したＢＭＥ）、ダルベッコ改変イーグル培地（血清を含まないＤＭＥＭ）、Ｙａｍａｎｅ、ＩＭＥＭ−２０、グラスゴー変更イーグル培地（ＧＭＥＭ）、リーボビッツＬ−１５培地（Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ Ｌ−１５ Ｍｅｄｉｕｍ）、マッコイ５Ａ培地、培地Ｍ１９９（アール塩の塩基を含むＭ１９９Ｅ）、培地Ｍ１９９（ハンクス塩の塩基を含むＭ１９９Ｈ）、最小必須培地イーグル（アール塩の塩基を含むＭＥＭ−Ｅ）、最小必須培地イーグル（ハンクス塩の塩基を含むＭＥＭ−Ｈ）および最小必須培地イーグル（非必須アミノ酸を含むＭＥＭ−ＮＡＡ）、数ある中でもとりわけ、培地１９９、ＣＭＲＬ１４１５、ＣＭＲＬ１９６９、ＣＭＲＬ１０６６、ＮＣＴＣ１３５、ＭＢ７５２６１、ＭＡＢ８７１３、ＤＭ１４５、ウィリアムズ’Ｇ、ニューマン＆タイテル（Ｎｅｕｍａｎ＆Ｔｙｔｅｌｌ）、Ｈｉｇｕｃｈｉ、ＭＣＤＢ３０１、ＭＣＤＢ２０２、ＭＣＤＢ５０１、ＭＣＤＢ４０１、ＭＣＤＢ４１１、ＭＤＢＣ１５３が挙げられる。本発明の使用に好ましい培地は、ＤＭＥＭである。これらおよび他の有用な培地は、とりわけ、ギブコ社（（ＧＩＢＣＯ）、グランドアイランド、ニューヨーク州、米国）およびＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社（Ｂｅｔ ＨａＥｍｅｋ、イスラエル）から入手可能である。多数のこれらの培地は、Ｗｉｌｌｉａｍ Ｂ．ＪａｋｏｂｙおよびＩｒａ Ｈ．Ｐａｓｔａｎによって編集され、アカデミックプレス社から出版された酵素学の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、第５８版「細胞培養（Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ）」のページ６２〜７２にまとめられている。
この培地に、ウシまたは他の種の胎児血清などの血清、および必要に応じてまたはあるいは、成長因子、サイトカイン、およびホルモン（例えば、成長ホルモン、エリスロポエチン、トロンボポエチン、インターロイキン３、インターロイキン６、インターロイキン７、マクロファージコロニー刺激因子、ｃ−ｋｉｔリガンド／幹細胞因子、オステオプロテゲリンリガンド、インスリン、インスリン様成長因子、上皮成長因子、線維芽細胞成長因子、神経成長因子、毛様体神経栄養因子、血小板由来成長因子、および骨形成タンパク質などを、ｐｇ／ｍｌからｍｇ／ｍｌの間のレベルの濃度で補充してもよい。
さらに、追加の成分を培地に添加してもよいことが認識される。このような成分は、抗生物質、抗真菌剤、アルブミン、アミノ酸、当技術分野で公知の細胞培養用の他の成分であってよい。さらに、必要なときに分化過程を高めるための成分を添加してもよい（さらに以下を参照）。
接着間質細胞は、従来の二次元（２Ｄ）培養条件によってまたは三次元（３Ｄ）培養条件下で、インビトロで増殖させることができる。「二次元培養」または「２Ｄ」という語句は、細胞が主に組織培養皿のような１つのプレート中で成長する培養を表す。
一度接着間質細胞を入手すると、それらの細胞は三次元設定で継代してもよい（以下の実施例のセクションの実施例１参照）。しかし、これらの細胞は、（前述のとおり）単離直後に、３Ｄ構成マトリックスに移してもよいことが理解されよう。
「三次元培養」または「３Ｄ」という語句は、細胞成長に適合し、細胞が三次元で細胞接触することを可能にする足場を含む条件下で細胞が培養される培養を表す。
したがって、本発明の３Ｄ態様の接着材料は３Ｄ培養用に構成され、それによって、組織（例えば、胎盤）の基盤を模倣するために、接着間質細胞の接着に利用可能な接着表面を実質的に増加させる成長マトリックスを提供する。
例えば、高さ０．５ｍｍの成長マトリックスについては、成長マトリックスの基部上の推定によって計算すると、この増加は少なくとも５〜３０倍である。このような約５〜３０倍の増加は、単位層あたりであり、積み重ねられるか、またはスペーサなどによって分離されるこのような多数の層が用いられる場合、それぞれのこのような構造あたり５〜３０倍が適用される。このマトリックスがシート形態で用いられる場合には、このマトリックスは不織繊維シート、または開孔発泡ポリマーのシートであってよい。シートの厚さは、約５０〜１０００μｍまたはそれ以上であり、細胞の進入、栄養素の進入およびシートからの老廃物の除去に適する空隙率を提供することができる。一実施形態によると、細孔は、１０μｍ〜１００μｍの有効径を有する。このようなシートは、様々な厚さの繊維から調製することができる。いくつかの実施形態において、繊維厚または繊維径は、約０．５μｍ〜２０μｍの範囲である。例えば、これらの繊維は、直径１０μｍ〜１５μｍの範囲であり得る。
本発明の構造は、寸法安定性および物理的強度を提供する多孔性支援シートまたはスクリーンによって支援されるか、またはそれに結合していてもよい。このようなマトリックスシートを切断するか、穴を開けるか、または細断して、推定面積が約０．２ｍｍ２〜約１０ｍｍ２の大きさで、同程度の厚さ（約５０〜１０００μｍ）を有する粒子を提供してもよい。
接着面は、四角形、リング、ディスク、および十字形からなる群から選択される形状を有してよい。いくつかの実施形態において、培養は、３Ｄバイオリアクター中で行われる。
このようなバイオリアクターの例としては、栓流バイオリアクター（ｐｌｕｇ ｆｌｏｗ ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ）、連続撹拌槽型バイオリアクターおよび静止層バイオリアクターが挙げられるが、これらに限定されない。実施例のセクションの実施例１に示すように、三次元（３Ｄ）栓流バイオリアクター（米国特許第６，９１１，２０１号に記載されている）は、接着間質細胞の成長および長期維持を支援することができる。このバイオリアクターでは、接着間質細胞を、ポリエステルの不織布マトリックスから作られた多孔性担体（ｐｏｒｒｏｓｉｖｅ ｃａｒｒｉｅｒ）上に播種し、ガラスカラムに充填することによって、比較的少量からの大型細胞数の増加を可能にする。
他の３Ｄバイオリアクターを、本発明と共に使用することができる。別の非限定的な例としては連続攪拌槽型バイオリアクターが挙げられ、これは、培地を連続的にバイオリアクターに供給し、生成物を連続的にくみ出し、リアクター内で時定数定常状態を維持する。繊維状床バスケットを有する撹拌槽型バイオリアクターは、例えば、Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社（エジソン、ニュージャージー州）から入手できる。他の例としては、固定床バイオリアクター、エアーリフトバイオリアクター（このバイオリアクターでは、典型的には、空気が中央通気管の底に供給され、気泡を形成しながら上に流れ、カラムの上部から排気ガスを解放する）、ポリアクティブ発泡体を有する細胞播種灌流バイオリアクター（Ｗｅｎｄｔ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ８４：２０５−２１４，（２００３）に記載されている）、およびラジアルフロー灌流バイオリアクター内の管状ポリ−Ｌ−乳酸（ＰＬＬＡ）多孔質足場（Ｋｉｔａｇａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ９３（５）：９４７−９５４（２００６）に記載されている）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明に従って使用することができる他のバイオリアクターは、米国特許第６，２７７，１５１号、同第６，１９７，５７５号、同第６，１３９，５７８号、同第６，１３２，４６３号、同第５，９０２，７４１号および同第５，６２９，１８６号に記載されている。
バイオリアクター中で使用されるマトリックスは、例えば、シートの形態で有り得る。このシートは、不織繊維シート、または開孔発泡ポリマーのシートであってよい。いくつかの実施形態において、シートの厚さは、約５０〜１０００μｍまたはそれ以上であり、細胞の進入、栄養素の進入およびシートからの老廃物の除去に適する空隙率が提供される。
いくつかの実施形態において、細胞播種は、播種時に１００，０００〜１，５００，０００細胞／ｍｍで行われる。
いくつかの実施形態において、制御されない分化および老化を避けながら、少なくとも約４０％、６０％または８０％のコンフルエンスに達すると、細胞は収集される。
いくつかの実施形態において、培養は、少なくとも約２日間、３日間、５日間、１０日間、２０日間、１ヶ月間またはそれ以上行われる。バイオリアクターでの培養はこの期間を長くしてもよいことが理解されるであろう。継代培養を行って、細胞数を増加させてもよい。
本発明の細胞は、接着間質細胞（ＡＳＣ）である。したがって、例えば、これらの細胞は、紡錘状であってもよい。あるいはまたはさらに、これらの細胞は、接着間質細胞に典型的なマーカーまたはマーカーの一群（例えば、表面マーカー）を発現してもよい。接着間質細胞表面マーカー（陽性および陰性）の例としては、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ７３＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ４５−、ＣＤ８０−、ＣＤ１９−、ＣＤ５−、ＣＤ２０−、ＣＤ１１Ｂ−、ＣＤ１４−、ＣＤ１９−、ＣＤ７９−、ＨＬＡ−ＤＲ−、およびＦＭＣ７−が挙げられるが、これらに限定されない。他の接着間質細胞マーカーには、チロシンヒドロキシラーゼ、ネスチンおよびＨ−ＮＦが含まれるが、これらに限定されない。
接着間質細胞に典型的な機能的表現型の例としては、Ｔ細胞の抑制活性（Ｔ細胞を刺激せず、逆にＴ細胞を抑制する）および造血幹細胞支援活性が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、これらの接着間質細胞は分化しない。別の実施形態において、これらの細胞は、脂肪生成能、肝形成能、骨形成能および神経分化能のうちの１つ以上を有するが、これらの細胞は、これらの能力の全ては持っていない。一実施形態において、これらの接着間質細胞は、骨形成分化能を有していない。一実施形態において、これらの接着間質細胞は神経分化能を有していない。一実施形態において、これらの接着間質細胞は、全３つの胚葉の細胞に分化しない。これらの構造的または機能的特徴のいずれかを用いて、本発明の細胞を適任とすることができる（以下の実施例のセクションの実施例１〜２参照）。
本発明の接着間質細胞とは対照的に、間葉系幹細胞（間質）細胞は、造骨細胞分化、脂肪細胞分化、および軟骨細胞分化の全てが可能である接着細胞である（Ｄｏｍｉｎｉｃｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ ８（４）：３１５−１７（２００６））。したがって、本発明の様々な態様および実施形態のいくつかにおいて、「接着間質細胞」または「ＡＳＣ」という用語は、間葉系幹（間質）細胞を除外する。
他の場所で述べたように、ＡＳＣは、胎盤、脂肪組織、および骨髄を含むが、これらの限定されない様々な組織の供給源から調製されてもよい。これらの細胞が三次元培養で成長する場合には、これらの細胞は「３Ｄ−ＡＳＣ」と呼ばれる。これらの細胞が３Ｄ培養で生産された胎盤ＡＳＣである場合には、これらの細胞は「ＰＬＸ」細胞とも呼ぶことができる。
いくつかの実施形態において、本教示に係る細胞の集団は、実施例のセクションの実施例１に示すとおりの固有のタンパク質発現プロファイルによって特徴付けられる。したがって、例えば、本教示に従って生産された胎盤、脂肪組織、または骨髄の接着間質細胞は、高レベルの選択された因子を発現および／または分泌することができる。例えば、このような細胞は、２Ｄ培養で成長した胎盤、脂肪組織、または骨髄の接着間質細胞が発現または分泌する量よりも、ＳＣＦ、Ｆｌｔ−３、Ｈ２ＡＦまたはＡＬＤＨ Ｘを少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、またはさらに１２倍多く発現または分泌する。さらにまたはあるいは、本発明の細胞集団は、２Ｄ培養で成長した胎盤、脂肪組織、または骨髄の接着間質細胞が発現または分泌する量よりも、ＩＬ−６、ＥＥＥＦ２、ＲＣＮ２またはＣＮＮ１を少なくとも２、３、または５倍多く分泌または発現する。さらにまたはあるいは、本発明の細胞集団は、２Ｄ培養細胞と比較して、様々な他のタンパク質の発現レベルが低いことによって特徴付けられる。したがって、本発明の細胞集団は、例えば、２Ｄ培養で成長した胎盤、脂肪組織、または骨髄の接着間質細胞が発現または分泌するＨｎｒｐｈｌ、ＣＤ４４抗原アイソフォーム２前駆体、Ｐａｐｓｓ２またはｒｐＬ７ａの発現レベルの０．６、０．５、０．２５または０．１２５倍未満を分泌または発現する。
いくつかの実施形態において、３Ｄ条件下での培養によって生産される胎盤接着間質細胞の単離集団は、フローサイトメトリーによって検出される場合に、アイソタイプ対照と比較して、マーカーＣＤ２００については、約１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、または６０％未満が陽性である。いくつかの実施形態において、３Ｄ条件下での培養によって生産される接着間質細胞の単離集団は、フローサイトメトリーによって検出される場合に、アイソタイプ対照と比較して、マーカーＨＬＡ−Ｇについては、約１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、または６０％未満が陽性である。いくつかの実施形態において、３Ｄ条件下での培養によって生産される胎盤接着間質細胞の単離集団は、免疫蛍光によって検出される場合に、アイソタイプ対照と比較して、マーカーＯＣＴ−４については、約１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、または６０％未満が陽性である。
本発明を実施に向けてさらにまとめる一方で、本発明者らは、接着間質細胞、特に、３Ｄ培養接着間質細胞（３Ｄ−ＡＳＣ）が、免疫抑制活性を示したことを認識している。以下の実施例のセクションの実施例２に示すとおり、接着間質細胞、特に、３Ｄ−ＡＳＣは、ＭＬＲアッセイにおいてヒト臍帯血単核細胞の免疫反応を抑制することが見出された。したがって、本発明の細胞は、クリニックで優先的に使用され得る生物活性（例えば、Ｔ細胞の抑制活性、造血幹細胞の支援活性）を含んでもよい。
これらの細胞の馴化培地も、クリニックで優先的に使用され得る生物活性（例えば、Ｔ細胞の抑制活性、造血幹細胞の支援活性）を含んでもよい。
したがって、本発明は、馴化培地の収集およびそのままでのその使用、または当技術分野で周知の方法を用いる凝縮、濃縮または分画の以下のさらなるステップをさらに想定する。いくつかの実施形態において、本発明の馴化培地は、細胞の高い生存率の中間対数培養物から得られる。
上述したとおり、本発明の細胞および馴化培地は、少なくとも１つの接着間質細胞の表現型によって特徴付けられ、そのようなものとして、このような細胞の使用から利益を得ることができる任意の研究および臨床応用に用いることができる。そのような典型的な１つの応用は、造血幹細胞（ＨＳＣ）支援を提供している。
本明細書で使用する「幹細胞」という語句は、自己再生ができ、２種類以上の細胞型に分化することができる（すなわち、多能性である）細胞を表す。「造血幹細胞」（ＨＳＣ）は、例えば、臍帯血（ＣＢ）または骨髄（ＢＭ）由来であり得る幹細胞である。ＨＳＣは、複数の血球種に分化することができる。将来、ＨＳＣは、胚性幹細胞などに由来する他の供給源からＨＳＣを得ることができる可能性がある。
移植されたＨＳＣによる生着および造血の開始は、移植された細胞、ＥＣＭおよびニッチの間葉細胞間の物理的な接触を確立しながら、ホーミング、ケモカインの勾配に従って内皮細胞障壁を通って骨髄に進むこと、ならびに適切なニッチにとどまることを含む複雑なプロセスに依存する。全てのこれらのプロセスは、サイトカイン、ホルモン、ステロイド、細胞外マトリックスタンパク質、成長因子、細胞間相互作用および接着タンパク質、ならびにマトリックスタンパク質などの複雑な数々の分子を含む。
輸血されたＨＳＣのわずか１〜５％が、移植後２〜３日目のレシピエントのＢＭ中で検出されることが知られている（Ｋｅｒｒｅ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：３６９２−８（２００１）；Ｊｅｔｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．９９：１５８５−９３（２００２））。造血移植への間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の寄与は、部分的には、移植片対宿主病を引き起こすドナー由来のＴ細胞生産の阻害により（ＧｖＨＤ，Ｃｈａｒｂｏｒｄ Ｐ．，ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ，Ｋ．，Ａｎｎ．ＫＹ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ １０４４：１５９−１６７（２００５）；Ｍａｉｔｒａ Ｂ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．３３（６）：５９７−６０４（２００４）；米国特許第６，０１０，６９６号；同第６，５５５，３７４号）、かつ部分的には、造血幹細胞（ＨＳＣ）支援を提供すること（すなわち、造血幹細胞の増殖、成熟および／またはホーミングを維持し、支援すること）による。理論に縛られることなく、本発明の接着間質細胞は、少なくとも部分的には、ＭＳＣの機構と同様の機構によって内因性造血系に損傷を受けた患者においてそれらの有益な効果を媒介することが可能である。
以下の実施例のセクションに示すとおり、胎盤および脂肪組織由来の接着間質細胞は、驚くべきことに、化学療法または放射線照射後でさえＨＳＣ生着を支援することが判明した。したがって、骨髄などの他の供給源由来の接着間質細胞も、ＨＳＣ生着を潜在的に支援する。
これらの結果を考慮すると、本発明の細胞または培地は、幹細胞移植が使用される全ての臨床応用に使用できると考えられる。
したがって、本発明の別の態様によると、接着間質細胞移植から利益を得ることができる医学的状態（例えば、症状、疾患、症候群）を治療する方法であって、それを必要としている対象において治療する方法を提供する。
本明細書で使用する「治療する」という用語は、症状の進行を阻止もしくは停止すること、および／または症状の減少、寛解、または退行を引き起こすことを表す。当業者は、様々な方法およびアッセイを用いて、症状の進行を評価することができ、同様に、様々な方法およびアッセイを用いて、症状の減少、寛解、または退行を評価してもよいことを理解するであろう。「治療する」という用語は、癌疾患と関連する症候を軽減するか、または減少させることを表す。一実施形態において、治療は、状態と関連する症候を治癒する、例えば、実質的に排除する。しかし、治癒が意図された最終結果であることを指定しない限り、「治療」は、対象の「治癒」を必要としない。
本明細書で使用する「接着間質細胞移植から利益を得ることができる医学的状態」とは、本発明の細胞／培地の投与によって軽減され得る全ての医学的状態を表す。
「移植」という用語または語句は、対象への細胞の導入を表す。
本明細書で使用する「対象」という用語は、任意の対象（例えば、哺乳類）、例えば、ヒト対象を表す。
本発明のこの態様の方法は、（上記に記載の）本発明の治療有効量の細胞または培地を対象に投与し、それによって、対象における接着間質細胞移植から利益を得ることができる状態を治療する工程を含む。
本発明のこの態様に従って投与され得る細胞は、二次元または三次元の設定のいずれかで培養され得る上記の接着間質細胞が含まれる。
別の実施形態において、間葉系および非間葉系の部分的に分化したまたは高分化した幹細胞誘導体は、接着間質細胞と組み合わせて使用してもよい。幹細胞由来の系列特異的な細胞を得る方法は、当技術分野において周知である。例えば、米国特許第５，４８６，３５９号、同第５，９４２，２２５号、同第５，７３６，３９６号、同第５，９０８，７８４号、および同第５，９０２，７４１号を参照されたい。これらの細胞は未処理のままであってもよく、または興味のある系統を得るために遺伝的に改変されてもよい（米国特許出願第２００３０２１９４２３号参照）。
本発明の細胞および培地は、新鮮なまたは凍結（例えば、凍結保存）した調製物の自己または非自己の供給源（すなわち、同種または異種）で作ったものであってよい。
医学的状態に応じて、対象に、追加の薬物（例えば、免疫調節用、化学療法用など）または追加の細胞を投与してもよい。
したがって、例えば、幹細胞の生着を改善する（例えば、レシピエントのＢＭ中の生存ＨＳＣの数を増加させ、正常な白血球数を最適に改善する）ために、本発明の細胞／培地を、ＨＳＣ移植前、ＨＳＣ移植と同時に、またはＨＳＣ移植後に投与してもよい。
いくつかの実施形態において、これらのＨＳＣおよび接着間質細胞は、共通のＨＬＡ抗原を共有しない。他の実施形態において、これらのＨＳＣおよび接着間質細胞は、共通のＨＬＡ抗原を共有する。
いくつかの実施形態において、これらのＨＳＣおよび接着間質細胞は、単一個体に由来する。あるいは、これらのＨＳＣおよび接着間質細胞は、異なる個体に由来する。
いくつかの実施形態において、接着間質細胞／培地が内因性ＨＳＣの死を軽減するために、レシピエントのＢＭ中の生存ＨＳＣの数は少なくとも部分的に増加する。あるいは、またはさらに、本発明の細胞／培地の投与後に、このレシピエントの内因性細胞が増殖するために、レシピエントのＢＭ中の生存ＨＳＣの数は、少なくとも部分的に増加する。
驚くべきことに、本明細書に記載の接着間質細胞、例えば、３Ｄ接着間質細胞は、特定の場合において、それを必要としているレシピエントの内因性造血系の再増殖を高め、支援する重要な刺激的役割を果たし得ることが見出された。免疫欠損または免疫が損なわれた対象に接着間質細胞を投与すると、内因性造血が高まった。したがって、以下の結果および所見は、内因性造血系の再構築を含む接着間質細胞の今発見された免疫特性により、接着間質細胞を用いることのさらなる臨床的利益を提供する。
開示される３Ｄ接着間質細胞（３Ｄ−ＡＳＣ）の２つの特質によって、これらの接着間質細胞は、原子力発電所における事故またはテロ攻撃などの大災害によって引き起こされ得る人口の放射線曝露の大量治療に特に適するものとなる。第１に、開示される方法および３Ｄバイオリアクターで生産される３Ｄ−ＡＳＣ細胞は免疫原性が低いため、曝露直後の期間、個別に患者に投与される細胞を特にマッチさせる必要がなく、全ての患者に同じ種類の細胞を使用することができる。第２に、この３Ｄバイオリアクターは、３Ｄ−ＡＳＣ細胞の大量生産を可能にし、それによって大規模な治療を可能にする膨大な量の細胞を提供することができる。
実施例に示すとおり、内因性造血は、３Ｄ−ＡＳＣおよびＰＬＸ細胞を含むＡＳＣの投与によって誘導される。これらの実施例において、内因性ＣＤ４５の発現が、内因性造血細胞の増殖および／または再増殖の上方制御を示す急激な増加を実証する。
レシピエントに対するこの造血促進効果は、３Ｄ−ＡＳＣおよびＰＬＸを含むこれらのＡＳＣの認められていない機能であり、臍帯血またはＨＳＣと共移植しなくても生じる。
したがって、他の箇所でより詳細に説明するとおり、３Ｄ−ＡＳＣおよびＰＬＸを含む接着間質細胞を用いて、例えば、急性放射線障害を軽減するために、免疫欠損対象またはレシピエントを治療することができる。具体的には、これらの対象（またはレシピエント）は、致死線量または亜致死線量の放射線を照射された人々で有り得る。さらに、これらの対象（またはレシピエント）は、化学療法で事前に治療された人々であり得る。
３Ｄ−ＡＳＣおよびＰＬＸを含む接着間質細胞の投与は、放射線および化学療法後の造血回復を向上させるための補助的治療として役立ち得る。造血幹細胞および／または前駆細胞の回復を高める３Ｄ接着間質細胞の能力は、造血細胞の自己再生能および増殖能を向上させることができるＨＳＣ支援サイトカインを分泌する３Ｄ接着間質細胞の能力、またはＨＳＣの増殖に必要な、損傷を受けた造血微小環境を再構築するこれらの細胞の能力に起因し得る。
内因性造血系を再増殖させる治療としての接着間質細胞の使用は、移植用骨髄（ＢＭ）細胞およびヒト臍帯血（ＨＵＣＢ）細胞を上回る有望な利点を示す。一般に、接着間質細胞は、レシピエントに対する組織の分類およびマッチングを必要としない。これとは対照的に、ＢＭおよびＨＵＣＢは、実質的にそれらの可用性を制限する組織のマッチングを必要とする。さらに、本明細書で示すとおり、接着間質細胞は、継続維持できる細胞の供給源を大量生産し、提供することができる。
以下により詳細に説明するとおり、本発明の細胞／培地は、ＨＳＣ移植なしで投与することもでき、その上さらに、レシピエントＢＭ中の生存可能なＨＳＣ数の増加を引き起こすこともできる。同様に、放射線被曝の影響を軽減するために、たとえ外因性造血幹細胞を対象に投与しなくても、本発明の細胞／培地を有害なレベルの放射線の被曝後に対象に投与してもよい。同様に、化学療法の影響を軽減するために、外因性造血幹細胞を対象に投与しなくても、本発明の細胞／培地を、化学療法を受けている対象に投与してもよい。
したがって、一態様において、本発明は、有害なレベルの放射線の被曝後に対象を治療するための方法であって、放射線被曝の影響を軽減するために、治療有効量の接着間質細胞をこの対象に投与する工程を含む方法を提供する。この態様のいくつかの実施形態において、外因性造血幹細胞は、この対象に投与されない。
さらに別の態様において、本発明は、化学療法を受けている対象を治療するための方法であって、化学療法の影響を軽減するために、治療有効量の接着間質細胞をこの対象に投与する工程を含む方法を提供する。この態様のいくつかの実施形態において、外因性造血幹細胞は、この対象に投与されない。
さらに別の態様において、本発明は、内因性造血系に損傷を受けた対象を治療するための方法であって、内因性造血系において内因性造血細胞の再増殖を誘導し、および／または内因性造血細胞数の減少を軽減するために、治療有効量の接着間質細胞をこの対象に投与する工程を含む方法を提供する。この態様のいくつかの実施形態において、外因性造血幹細胞は、この対象に投与されない。
本明細書で使用する「内因性」、「内因性造血細胞」または「内因性造血系」という用語は、レシピエント哺乳類、ヒト（（すなわち、治療される対象）接着間質細胞で治療されているレシピエント）内で生来見られるか、またはレシピエント哺乳類内で生じる造血細胞を表す。これらの造血細胞は、レシピエント哺乳類体内で生来見られるか、またはその体内で生じ、レシピエント体内によって生産される。すなわち、それらは、外因性造血細胞ではない。
いくつかの実施形態において、これらの接着間質細胞は、本明細書に開示される接着間質細胞のいずれかで有り得る。例えば、これらの接着間質細胞は、胎盤、脂肪組織、または骨髄由来であり得る。
本明細書で使用する「外因性」、「外因性供給源」または「外因性ドナー」という用語は、レシピエントあるいは他の方法で治療される対象に対して外部の供給源に由来する細胞を表す。つまり、外因性細胞は、レシピエント対象以外のドナー由来の細胞である。
いくつかの実施形態において、外因性接着間質細胞は、同種または異種のドナーから得られる。いくつかの実施形態において、これらの接着間質細胞は、同種または異種のＨＳＣ移植なしで投与される。いくつかの実施形態において、これらの接着間質細胞は、内因性造血系の再構築または再増殖のための主要な治療として投与される。
一般に、細胞／組織の最初の供給源が、レシピエント（内因性）または別の供給源（外因性）であったか否かは知られているので、細胞／組織は、レシピエントに対して内因性または外因性であるか否かは容易に明らかになるであろう。それにもかかわらず、細胞または組織は、レシピエントに対して内因性または外因性であるか否かは、遺伝子型判定によって決定することもできる。「遺伝子型」という用語は、個体または細胞における相同染色体の対上の遺伝子座の中の１以上の多型部位のセットの位置で見られるヌクレオチド対の５’から３’（方向）の配列を表す。本明細書で使用する遺伝子型には、完全な遺伝子型が含まれる。非限定的な例として、完全な遺伝子型という用語には、レシピエント個体における相同染色体の対上の複数の多型部位で見られるヌクレオチド対の配列が含まれる。
「放射線照射」という用語は、レシピエント哺乳類、ヒト、もしくは治療される対象の放射線被曝の状況または状態を表す。いくつかの実施形態において、この放射線は電離放射線である。他の実施形態において、この放射線は非電離放射線である。放射線には、Ｘ線および／またはガンマ線を含む電磁放射線が含まれる。この放射線という用語は、放射性放射線も包含する。この用語は、放射性元素の崩壊から生じる放射線も包含する。
いくつかの実施形態において、この放射線は電離放射線である。一実施形態において、この電離放射線は、臨床電離放射線であり、すなわち、癌または腫瘍の治療などの少なくとも１つの治療目的のために病院またはクリニックで生成される電離放射線である。別の実施形態において、この電離放射線は、放射性同位体に由来する。別の実施形態において、この放射線は、核分裂または融合に由来する。
一実施形態において、この放射線は太陽放射線ではない。
レシピエント哺乳類、ヒト、または対象に対して「放射線照射された」という用語は、レシピエント哺乳類、ヒト、または対象が放射線に曝露されたことを意味する。放射線照射の効果は、以下に記載されるものなどのいくつかの方法のいずれかで明らかにされ得る。いくつかの実施形態において、放射線照射は、内因性造血系を損なう放射線被曝を意味する。いくつかの実施形態において、この損なわれた造血系は、造血細胞の数（ｃｏｕｎｔ）または数（ｎｕｍｂｅｒ）の減少によって明らかにされる。いくつかの実施形態において、この損なわれた造血系は、内因性造血ＣＤ４５＋発現細胞の数の減少によって明らかにされる。いくつかの実施形態において、この損なわれた造血系は、血小板数の減少によって明らかにされる。これらの実施形態において、この対象は、出血を示し得る。いくつかの実施形態において、この損なわれた造血系は、赤血球数の減少によって明らかにされる。これらの実施形態において、この対象は貧血を示し得る。
いくつかの実施形態において、放射線照射は、消化管症状を引き起こす放射線被曝を意味する。これらの実施形態において、この消化管症状には、悪心、嘔吐、食欲不振、または腹痛のうちの１つ以上が含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、放射線照射は、神経症状を引き起こす放射線被曝を意味する。これらの実施形態において、神経症状には、めまい、頭痛、または意識のレベルの低下のうちの１つ以上が含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、放射線照射は、皮膚症状を引き起こす放射線被曝を意味する。これらの実施形態において、皮膚症状には、発赤、水疱、潰瘍、脱毛、皮脂腺および／もしくは汗腺の損傷、萎縮、線維症、皮膚の色素沈着の低下もしくは増加、または壊死が含まれるが、これらに限定されない。
放射線は、放射線が意図される効果またはさらなる有益な効果も引き起こすか否かにかかわらず、損なわれた造血系、消化管症状、または神経症状のうちの１つ以上などの、対象における望ましくない１以上の効果を引き起こす時に「有害」である。したがって、有害な放射線照射は、癌治療に使用される治療的放射線照射を包含する。
「化学物質への曝露」という用語は、レシピエント哺乳類、ヒト、または対象の内因性造血系を損なう全ての細胞毒性物質への曝露を包含する。化学物質への曝露の一例として、「化学療法」が挙げられる。いくつかの実施形態において、化学療法は、レシピエント哺乳類、ヒトまたは治療される対象の細胞毒性治療計画を包含する。したがって、一実施形態において、化学療法は、癌を治療するために用いられる抗腫瘍薬もしくは抗腫瘍化合物またはこれらの薬物の組み合わせを表す。いくつかの実施形態において、レシピエント哺乳類、ヒト、または対象は、放射線療法に加えて、化学療法を受ける。他の実施形態において、レシピエント哺乳類、ヒト、もしくは対象は、テロ攻撃、化学プラントもしくは研究室での事故、化学物質の輸送における事故、または他の偶発的曝露で生じ得る、臨床設定を除く有毒な化学物質へ曝露される。いくつかの実施形態において、レシピエント哺乳類、ヒト、または治療される対象の内因性造血系への損傷または損害は、それらの有毒な特性のために化学兵器として使用される化学物質である細胞毒性物質への曝露によって引き起こされる。
化学物質への曝露または化学療法の効果は、いくつかの方法のいずれかで明らかにされ得る。いくつかの実施形態において、造血系への損傷は、造血細胞の数（ｃｏｕｎｔ）または数（ｎｕｍｂｅｒ）の減少によって明らかにされる。いくつかの実施形態において、この損なわれた造血系は、内因性造血ＣＤ４５＋発現細胞の数の減少によって明らかにされる。いくつかの実施形態において、この損なわれた造血系は、血小板数の減少によって明らかにされる。これらの実施形態において、この対象は、出血を示し得る。いくつかの実施形態において、この損なわれた造血系は、赤血球数の減少によって明らかにされる。これらの実施形態において、この対象は貧血を示し得る。
いくつかの実施形態において、この化学療法は、消化器症状を引き起こす。これらの実施形態において、この消化器症状には、悪心、嘔吐、食欲不振、または腹痛のうちの１つ以上が含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、化学療法は神経症状を引き起こす。これらの実施形態において、神経症状には、めまい、頭痛、または意識のレベルの低下のうちの１つ以上が含まれるが、これらに限定されない。
「損なわれた内因性造血系」という用語は、接着間質細胞の投与（または治療）から恩恵を受けることができる状態を意味する。非限定的な例として、この状態は、内因性造血系の再増殖および／または促進を必要とする。別の非限定的な例としては、治療される対象のＢＭにおける（ＣＤ４５発現細胞などの）造血細胞の数が少ない状態が挙げられる。熟練した医師は、正常レベルの造血細胞に対する造血細胞数の減少を決定することを知っている。
「移植」という用語または語句は、対象への細胞の導入を表す。これらの細胞は、レシピエントに由来するか、または同種もしくは異種のドナーに由来し得る。
いくつかの実施形態において、この対象は、非自己細胞の拒絶反応を避けるためにさらに治療されるであろう。これらの治療には、レシピエントの免疫系を抑制する工程または移植前に免疫単離用半透膜中にこれらの非自己細胞をカプセル化する工程のいずれかが含まれ得る。
カプセル化技術は、一般に、小さな球状のビヒクルを含むマイクロカプセル化、ならびにより大きなフラットシートおよび中空糸膜を含むマクロカプセル化として分類されている（Ｕｌｕｄａｇ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ．Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．２０００；４２：２９−６４）。
マイクロカプセルの調製法は当技術分野において公知であり、例えば、Ｌｕ ＭＺ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａｌｇｉｎａｔｅ ａｎｄ ａｌｐｈａ−ｐｈｅｎｏｘｙｃｉｎｎａｍｙｌｉｄｅｎｅ−ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ ｐｏｌｙ（ａｌｌｙｌａｍｉｎｅ）．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．２０００，７０：４７９−８３，Ｃｈａｎｇ ＴＭ ａｎｄ Ｐｒａｋａｓｈ Ｓ．Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｆｏｒ ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅｓ，ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ． Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００１，１７：２４９−６０、ならびにＬｕ ＭＺ，ｅｔ ａｌ．，Ａ ｎｏｖｅｌ ｃｅｌｌ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｕｓｉｎｇ ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｐｏｌｙ（ａｌｌｙｌａｍｉｎｅ ａｌｐｈａ−ｃｙａｎｏｃｉｎｎａｍｙｌｉｄｅｎｅａｃｅｔａｔｅ）．Ｊ Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌ．２０００，１７：２４５−５１に開示されるものなどを含む。
例えば、マイクロカプセルは、変性コラーゲンを、２−ヒドロキシエチルメチルアクリレート（ＨＥＭＡ）、メタクリル酸（ＭＡＡ）およびメチルメタクリレート（ＭＭＡ）のターポリマーのシェルと複合体化することによって調製され、カプセルの厚さは２〜５μｍになる。このようなマイクロカプセルは、負に帯電した滑面を付与し、血漿タンパク質吸収を最小限にするために、追加の２〜５μｍのターポリマーシェルでさらにカプセル化することができる（Ｃｈｉａ，Ｓ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｍｕｌｔｉ−ｌａｙｅｒｅｄ ｍｉｃｒｏｃａｐｓｕｌｅｓ ｆｏｒ ｃｅｌｌ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２００２ ２３：８４９−５６）。
他のマイクロカプセルは、アルギン酸塩、海産多糖類（Ｓａｍｂａｎｉｓ，Ａ．Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ ｉｓｌｅｔｓ ｉｎ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｔｈｅｒ．２００３，５：６６５−８）またはその誘導体をベースとする。例えば、マイクロカプセルは、塩化カルシウムの存在下で、ポリカチオンのポリ（メチレン−コ−グアニジン）塩酸塩と、ポリアニオンのアルギン酸ナトリウムおよびセルロース硫酸ナトリウムとの間の高分子電解質複合体形成によって調製することができる。
より小さなカプセルが使用される場合に、細胞カプセル化が改善されることが理解されるであろう。したがって、カプセルサイズが１ｍｍから４００μｍに低下した場合に、品質管理、機械的安定性、拡散特性、およびカプセル化細胞のインビトロ活性は改善される（Ｃａｎａｐｌｅ Ｌ．ｅｔ ａｌ，Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｃｅｌｌ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｉｚｅ ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｊ Ｂｉｏｍａｔｅｒ Ｓｃｉ Ｐｏｌｙｍ Ｅｄ．２００２；１３：７８３−９６）。さらに、７ｎｍほど小さなよく制御された細孔径、適合した界面化学および正確な微小構造を有するナノ多孔性バイオカプセルは、細胞の微小環境をうまく免疫単離できることが見出された（Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ｄ．Ｓｍａｌｌ ｉｓ ｂｅａｕｔｉｆｕｌ：ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ ａｎｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｉｎ ｍｅｄｉｃａｌ ｄｅｖｉｃｅｓ．Ｍｅｄ Ｄｅｖｉｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌ．１９９９，１０：６−９；Ｄｅｓａｉ，Ｔ．Ａ． Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃｅｌｌ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ．２００２，２：６３３−４６）。
免疫抑制剤の例としては、メトトレキサート、シクロホスファミド、シクロスポリン、シクロスポリンＡ、クロロキン、ヒドロキシクロロキン、スルファサラジン（スルファサラゾピリン）、金塩、Ｄ−ペニシラミン、レフルノミド、アザチオプリン、アナキンラ、インフリキシマブ（レミケード）、エタネルセプト、ＴＮＦα遮断薬、炎症性サイトカインを標的にする生物製剤、および非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）が挙げられるが、これらに限定されない。ＮＳＡＩＤの例としては、アセチルサリチル酸、サリチル酸コリンマグネシウム、ジフルニサル、サリチル酸マグネシウム、サルサレート、サリチル酸ナトリウム、ジクロフェナク、エトドラク、フェノプロフェン、フルルビプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、ケトロラク、メクロフェナム酸、ナプロキセン、ナブメトン、フェニルブタゾン、ピロキシカム、スリンダク、トルメチン、アセトアミノフェン、イブプロフェン、Ｃｏｘ−２阻害剤およびトラマドールが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書に記載の方法のいくつかにおいて、細胞または培地は、それ自体で、または薬学的に許容される担体をさらに含む医薬組成物の一部として投与することができる。
本明細書で使用する「医薬組成物」は、薬学的に適切な担体および賦形剤などの他の化学成分を有する、本明細書に記載の化学コンジュゲートのうちの１以上の製剤を表す。医薬組成物の目的は、対象への化合物の投与を促進することである。
以下の、「薬学的に許容される担体」という用語は、対象に著しい刺激を引き起こさず、投与された化合物の生物活性および特性を抑制しない担体または希釈剤を表す。担体の制限の無い例としては、プロピレングリコール、生理食塩水、エマルジョンおよび有機溶媒と水の混合物が挙げられる。
本明細書の「賦形剤」という用語は、化合物の投与をさらに促進するために医薬組成物に添加される不活性物質を表す。賦形剤の限定されない例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖および様々な種類のデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油およびポリエチレングリコールが挙げられる。
本発明の好ましい実施形態によると、この医薬担体は、生理食塩水の水溶液である。
製剤化および薬物投与の技術は、「レミントンの薬学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ社、イーストン、ペンシルベニア州、最新版で見つけることができ、これは参照により本明細書に組み込まれる。
（以下に詳述するとおり）全身的に医薬組成物を投与してもよい。あるいは、例えば、患者の組織領域に医薬組成物を直接注射することにより、局所的に医薬組成物を投与してもよい。
本発明の医薬組成物は、当技術分野において周知のプロセスによって、例えば、従来の混合、溶解、顆粒化、糖衣錠、粉末化、乳化、カプセル化、捕捉または凍結乾燥のプロセスによって製造することができる。
したがって、本発明に従って使用するための医薬組成物は、薬学的に使用することができる製剤への有効成分の加工を促進する賦形剤および助剤を含む、１以上の生理学的に許容される担体を用いて、従来の方法で製剤化してもよい。適切な製剤は、選択される投与経路に依存する。
注射のために、医薬組成物の有効成分は、水溶液、例えば、ハンクス液、リンゲル液、または生理食塩緩衝液などの生理学的に適合する緩衝液中に製剤化してもよい。経粘膜投与については、透過すべき障壁に適する浸透剤が製剤化で使用される。このような浸透剤は、一般に当技術分野で公知である。
本発明の方法で使用される全ての製剤では、治療有効量または治療有効用量は、最初に、インビトロアッセイおよび細胞培養アッセイから推定することができる。用量は、一般に、動物モデルにおいて所望の濃度または力価を達成するように製剤化される。このような情報を用いて、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定することができる。
本明細書に記載の有効成分の毒性および治療効力は、細胞培養または実験動物において、インビトロで標準的な薬学的手順によって決定することができる。
これらのインビトロアッセイおよび細胞培養アッセイならびに動物研究から得られたデータを、ヒトにおける使用のための用量範囲で製剤化する際に用いることができる。投与量は、用いられる剤形および利用される投与経路に依存して変化し得る。正確な製剤化、投与経路および投与量は、患者の状態を考慮して個々の医師が選択することができる（例えば、Ｆｉｎｇｌら、１９７５，「Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」，Ｃｈ．１ ｐ．１参照）。例えば、化学療法患者は、治療に積極的な反応を示す消化管症状の改善について症候的に監視することができる。
注射については、医薬組成物の有効成分は、水溶液、例えば、ハンクス液、リンゲル液、または生理食塩緩衝液などの生理学的に適合する緩衝液中に製剤化してもよい。
投与量および投与間隔は、移植細胞によって神経伝達物質の合成を効果的に調節するのに十分な有効成分のレベルに個別に調整してもよい。所望の効果を達成するのに必要な投与量は、個々の特徴および投与経路に依存する。検出アッセイを用いて、血漿濃度を決定することができる。
治療すべき症状の重症度および反応性に依存して、投薬は、数日から数週間続き、疾患状態の減少が達成される治療過程で単回投与または複数回投与であり得る。
いくつかの実施形態において、本発明の細胞または培地は、血管内注射、筋肉注射、腹腔内注射、皮下注射、気管内注射、または吸入によって投与される。一実施形態において、接着間質細胞は、静脈注射によって投与される。一実施形態において、接着間質細胞は、筋肉注射によって投与される。
本発明の細胞または培地は、一度だけ投与されてもよく、またはそれらは、少なくとも２回、３回、４回、５回、もしくは最大１０回またはそれ以上投与されてもよい。複数回投与の場合には、個々の投与は、治療過程において全て同じ経路を介してもよく、または異なる投与経路を異なる投与のために利用してもよい。
本発明の細胞または培地は、放射線または化学物質への曝露に関して回数の組み合わせ前に、回数の組み合わせ中に、回数の組み合わせ後に投与してもよい。投与が少なくとも２回の投与を含む場合に、各投与は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０日間隔でもよい。あるいは、各投与は、約１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、または６ヶ月間隔でもよい。
投薬は、放射線または化学物質への曝露の日に開始してもよい。投薬は、曝露後約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０日目に開始してもよい。投薬は、放射線または化学物質への曝露が進行している間、継続してもよい。いくつかの実施形態において、投薬は、曝露前、例えば、放射線療法または化学療法の日程の約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０日前に開始する。投薬が曝露前に開始する場合に、上述したとおり、曝露の日または曝露後に再び投薬を開始してもよい。
１つの例示的な投薬計画において、接着間質細胞は、少なくとも２回筋肉内に投与され、１、２、３、４、または５日間隔で投与される。他の例示的な投薬計画を、実施例に提供する。
投与される組成物の量は、もちろん、治療される個体、苦痛の重症度、投与様式、処方する医師の判断などに依存する。投与量および投与のタイミングは、個々の変化する状態の注意深い連続監視に応答する。例えば、治療される化学療法患者は、監視の指示に基づいて、化学療法の症候を緩和するのに十分な細胞量で投与される。
一実施形態において、移植後、本発明の細胞は、治療効果が観察されるように、しばらくの間、患者の中で生存する。
互換性のある薬学的担体中に製剤化される本発明の製剤を含む組成物も調製され、適当な容器に入れられ、示される状態の治療のためにラベルを付けられてもよい。
本発明の組成物は、必要であれば、ＦＤＡが承認したキットなどの、パックまたはディスペンサーデバイスで提供されてもよく、これは、有効成分を含む１以上の単位剤形を含んでもよい。このパックは、例えば、ブリスターパックなどの金属ホイルまたはプラスチックホイルを含んでもよい。このパックまたはディスペンサーデバイスは、投与のための取扱説明書が添付されてもよい。このパックまたはディスペンサーは、医薬品の製造、使用または販売を規制する政府機関によって規定された形式で、容器に付随する通知と共に収容されてもよく、この通知は、組成物の形態またはヒトもしくは動物への投与についての機関による承認を反映している。このような通知は、例えば、処方薬についての米国食品医薬品局によって承認されるラベリングまたは承認された製品の添付文書であってもよい。
本発明のいくつかの態様はキットを含む。一実施形態において、このキットは、放射線被曝の影響を軽減するために、有害なレベルの放射線の被曝後に対象を治療するためのものである。一実施形態において、このキットは、化学療法の影響を軽減するために、化学療法を受けている対象を治療するためのものである。一実施形態において、このキットは、内因性造血系に損傷を受けた対象を治療するためのものである。
これらの実施形態のいくつかにおいて、このキットは、無菌パッケージ内に少なくとも１つの治療有効量の接着間質細胞、および治療有効量の細胞の投与のための取扱説明書を含んでもよい。このキットは、さらに、放射線または化学物質への曝露後の指定期間内の投与のための取扱説明書を含んでもよい。
一実施形態において、このキットは、内因性造血系において内因性造血細胞の再増殖を誘導し、および／または内因性造血細胞数の減少を軽減するために、放射線被曝または化学療法後の指定期間内に投与するための第１の治療有効量の接着間質細胞を第１の無菌パッケージ内に含み、必要に応じて、内因性造血系において内因性造血細胞の再増殖をさらに高めるために、曝露後のマッチング期間後に投与するための、造血幹細胞と共に提供される第２の治療有効量の接着間質細胞を第２無菌パッケージ内に含み、さらに第１および第２の治療有効量の投与のための取扱説明書を含む。
いくつかの実施形態において、この治療有効量は、対象における内因性造血細胞の再増殖を誘導するか、またはさらに誘導する。いくつかの実施形態において、化学物質への曝露は化学療法である。いくつかの実施形態において、放射線は電離放射線である。一実施形態において、これらの接着間質細胞は、３Ｄ条件下で培養された胎盤、脂肪組織、または骨髄由来の接着間質細胞である。
この無菌パッケージは、互いに独立して、できる限り対象に適合できる血管内注射、筋肉注射、腹腔内注射、くも膜下腔内注射、皮下注射、または吸入による投与を可能にするように構成されてもよい。異なるパッケージを有する異なるキットを、投与方法に従って使用してもよい。
本発明のいくつかの実施形態は、放射線または化学物質への曝露によって損なわれた内因性造血系の、指定された投与計画での治療において使用するための医薬製造用の接着間質細胞の使用を含む。例えば、この指定された投与計画は、放射線または化学物質への曝露後１０日以内に投与される治療有効量の接着間質細胞を含んでもよい。別の例において、この指定された投与計画は、放射線または化学物質への曝露後１０日以内に投与される第１の治療有効量の接着間質細胞、および第２の指定期間後に投与される少なくとも１つの第２の治療有効量の接着間質細胞を含んでもよい。いくつかの実施形態において、この治療有効量は、対象における内因性造血細胞の再増殖を誘導するか、またはさらに誘導する。いくつかの実施形態において、化学物質への曝露は化学療法である。いくつかの実施形態において、放射線は電離放射線である。一実施形態において、この接着間質細胞は、３Ｄ条件下で培養された胎盤、脂肪組織、または骨髄由来の接着間質細胞である。
少なくとも１つの第２の治療有効量を含むそれらの実施形態において、この第２の治療量は、必要に応じて、マッチさせた同種の臍帯血細胞または骨髄細胞を含んでもよい。これらの実施形態は、必要に応じて、これらの細胞を対象とマッチさせるマッチング期間であり得る（第２の）指定期間を含んでもよい。例えば、この第１の治療有効量は、曝露後２日以内に投与されてもよく、このマッチング期間は、少なくとも４日間であってもよい。
少なくとも１つの第２の治療有効量は、例えば、曝露後毎週、毎月、１〜４ヶ月ごとに、または４〜６ヶ月ごとに投与されてもよい。
第１および任意の少なくとも１つの第２の治療有効量は、血管内注射、筋肉注射、腹腔内注射、皮下注射、または吸入によって投与されてもよい。
別の態様において、本発明は、損なわれた内因性造血系を引き起こす造血の疾患、障害、欠乏または症候群に罹患している対象を治療するための方法であって、治療有効量の接着間質細胞を投与する工程を含む方法を対象にする。
本発明は、内因性造血系に損傷を受けた対象を治療するための方法であって、内因性造血系において内因性造血細胞の再増殖を誘導し、および／または内因性造血細胞数の減少を軽減するために、治療有効量の接着間質細胞を対象に投与する工程を含む方法にも関する。
さらに別の態様において、本目的は、治療有効量の接着間質細胞を含む医薬組成物に関する。一実施形態において、この医薬組成物は、有害なレベルの放射線の被曝後に、放射線被曝の影響を軽減するために対象を治療するための治療有効量の接着間質細胞を含む。別の実施形態において、この医薬組成物は、化学療法の影響を軽減するために、化学療法を受けている対象を治療するための治療有効量の接着間質細胞を含む。一実施形態において、この医薬組成物は、損なわれた造血系に罹患している対象の内因性造血系において内因性造血細胞の再増殖を誘導し、および／または内因性造血細胞数の減少を軽減するための治療有効量の接着間質細胞を含む。
一実施形態において、この医薬組成物は、さらに、外因性造血幹細胞を含まない。
別の態様において、本発明は、医薬組成物の調製における治療有効量の接着間質細胞の使用に関する。一実施形態において、この医薬組成物は、有害なレベルの放射線の被曝後に、放射線被曝の影響を軽減するために、対象の治療に使用するための治療有効量の接着間質細胞を含む。別の実施形態において、この医薬組成物は、化学療法の影響を軽減するために、化学療法を受けている対象の治療に使用するための治療有効量の接着間質細胞を含む。一実施形態において、この医薬組成物は、内因性造血系に損傷を受けた対象の内因性造血系において内因性造血細胞の再増殖を誘導し、および／または内因性造血細胞数の減少を軽減するのに使用するための治療有効量の接着間質細胞を含む。
一実施形態において、この医薬組成物は、さらに、外因性造血幹細胞を含まない。
いくつかの実施形態において、この内因性造血細胞は、対象の造血系によって生産される。したがって、いくつかの実施形態において、この内因性造血細胞は、レシピエント哺乳類、例えば、ヒト（すなわち、治療される対象）である。この内因性造血細胞は、レシピエント哺乳類、例えば、ヒト（すなわち、治療される対象）の完全な遺伝子型を有することができる。いくつかの実施形態において、移植された接着間質細胞の遺伝子型は、レシピエントの内因性造血細胞の遺伝子型と異なる、すなわち同一でない。
いくつかの実施形態において、内因性造血系における内因性造血細胞の再増殖は、対象の造血系における内因性造血細胞数の増加を含む。
いくつかの実施形態において、内因性造血系における内因性造血細胞の再増殖は、ＣＤ４５マーカーを発現する内因性造血細胞数の増加を含む。
いくつかの実施形態において、この対象は放射線に曝露されている。
いくつかの実施形態において、この対象は、化学療法に起因する免疫欠損症である。いくつかの実施形態において、この対象は、内因性造血系を損なう細胞毒性物質に曝露された。
いくつかの実施形態において、これらの接着間質細胞の入手源は、胎盤、脂肪組織、または骨髄である。
いくつかの実施形態において、これらの接着間質細胞は、細胞増殖を支援する三次元培養条件下で培養された。いくつかの実施形態において、この培養された接着間質細胞は、Ｆｌｔ−３リガンド、ＩＬ−６、およびＳＣＦを培地中に分泌する。
いくつかの実施形態において、これらの接着間質細胞の入手源は、胎盤、脂肪組織、または骨髄であり、これらの接着間質細胞は、細胞増殖を支援する三次元培養条件下で培養された。
いくつかの実施形態において、これらの接着間質細胞の入手源は、胎盤、脂肪組織、または骨髄であり、これらの接着間質細胞は、分化することなく、細胞増殖を支援する三次元培養条件下で培養された。
これらの接着間質細胞は、治療される対象に由来するか、または同種もしくは異種のドナーに由来し得る。
非限定的な例として、外因性ＨＳＣを移植しなくても、本発明の方法のいずれかを使用することができる。したがって、様々な態様のいくつかの実施形態において、本方法は、患者または対象に外因性ＨＳＣを投与する工程を含まないという条件を提供する。
いくつかの実施形態において、この損なわれた内因性造血系は、造血細胞の数（ｃｏｕｎｔ）または数（ｎｕｍｂｅｒ）の減少によって明らかにされる。いくつかの実施形態において、この損なわれた造血系は、内因性造血ＣＤ４５発現細胞の数の減少によって明らかにされる。
理論に縛られることなく、これらの接着間質細胞は、一般に、治療される対象の造血系の再増殖を支援し、および／または内因性造血細胞数の減少を軽減することによって作用すると考えられている。したがって、説明したとおり、いくつかの実施形態において、これらの接着間質細胞は、それを必要とする対象における内因性造血細胞の発現、増殖および／または分化を増加させることによって作用する。他の実施形態において、これらの接着間質細胞は、対象における外因性造血幹細胞の生着を支援することによって作用する。他の実施形態において、投与される接着間質細胞の治療効果は、放射線または化学物質に曝露される対象を治療すること、または曝露された対象における放射線または化学物質への曝露の１以上の症候を改善することである。
したがって、別の態様において、本発明は、放射線または化学物質に曝露された対象を治療する方法であって、治療有効量の接着間質細胞をこの曝露された対象に投与する工程を含む方法も提供する。いくつかの実施形態において、この治療は、対象、例えば、致死線量の放射線に曝露された対象の生存を延長する。致死線量とは、約２〜８Ｇｙの電離放射線（ＩＲ）の曝露（一般に、約２〜４週間以内に死亡）、約８〜３０ＧｙのＩＲ（一般に、約２日〜２週間以内に死亡）の曝露、または約３０Ｇｙを超えるＩＲの曝露（一般に、約１〜２日以内に死亡）を意味する。本発明は、さらなる態様において、放射線、例えば、電離放射線被曝に関連する症候、または化学療法後などの有毒化学物質への曝露に関連する症候を軽減する方法であって、治療有効量の接着間質細胞をこの曝露された対象に投与する工程を含む方法も提供する。これらの実施形態において、症候には、悪心、嘔吐
、下痢、頭痛、発熱、体重減少、神経症状（例えば、認知機能障害、痙攣、振戦、運動失調、嗜眠）、白血球減少症、貧血、血小板減少症、疲労、脱力、紫斑、出血、脱毛、およびショックが含まれるが、これらに限定されない。これらの症候も、前述したとおり、呼吸器系、神経系、胃腸系、心血管系、皮膚、または腎臓系のうちの１つ以上への損傷として明らかにされ得る。
本発明のこれらの態様の様々な実施形態のいくつかにおいて、投与のタイミング、投与回数、および投与経路には、造血系の再増殖および／または内因性造血細胞数の減少の軽減を伴う様々な態様について記載されたものが含まれる。
図１５は、放射線または化学療法などの有毒化学物質への曝露によって内因性造血系に損傷を受けた対象を治療する方法２００を示す高レベルフローチャートである。
方法２００は、内因性造血系において内因性造血細胞の再増殖を誘導し、および／または内因性造血細胞数の減少を軽減するために、放射線被曝または化学療法（ステージ２１０）後の指定期間内（例えば、１０日以内、例えば、７〜１０日以内、５〜６日以内、３〜４日以内、１〜２日以内、または約１日以内）に、第１の治療有効量の接着間質細胞を対象に投与する工程（ステージ２１２）、ならびに内因性造血系において内因性造血細胞の再増殖をさらに高める（ステージ２２２）ために、曝露の次のマッチング期間（例えば、４〜２１日）後に、マッチさせた同種の臍帯血細胞または骨髄細胞と共に第２の治療有効量の接着間質細胞を対象に投与する工程（ステージ２２０）を含む。
方法２００は、さらに、接着間質細胞単独の投与を繰り返す工程（ステージ２１４）またはマッチさせた同種の臍帯血細胞または骨髄細胞と共に接着間質細胞の投与を繰り返す工程（ステージ２２４）を含んでもよい。
実施形態において、方法２００は、接着間質細胞単独の（例えば、毎週、毎月、１〜４ヶ月ごと、もしくは４〜６ヶ月ごとの）投与を繰り返す工程（ステージ２１４）のみを含むか、またはマッチさせた同種の臍帯血細胞または骨髄細胞と共に接着間質細胞の（例えば、毎週、毎月、１〜４ヶ月ごと、もしくは４〜６ヶ月ごとの）投与を繰り返す工程（ステージ２２４）のみを含んでもよい。
方法２００は、さらに、同種の臍帯血細胞または骨髄細胞を対象とマッチさせる工程（ステージ２１５）を含んでもよい。
投与２１０、投与２２０は、血管内注射、筋肉注射、腹腔内注射、皮下注射、または吸入投与によって行ってもよい。投与方法は、対象に適合させてもよく、投与２１０と投与２２０間で異なってもよい。
図１６は、本発明のいくつかの実施形態に係るいくつかの投与計画を示す。接着間質細胞（ＡＳＣ）の投与、および造血幹細胞、例えば、マッチさせた同種の臍帯血細胞または骨髄細胞（ＣＢ／ＢＭ）を有するＡＳＣの投与を、放射線被曝または化学療法後の時間に対して示す。ドナーを見つける期間（すなわち、「マッチング期間」）は、造血を支援するために、同種の臍帯血細胞または骨髄細胞を投与する可能性を決定するために、典型的には２〜５日であるが、それより長くても短くてもよい。一般的に言えば、（必要に応じてＣＢ／ＢＭを含む）ＡＳＣの第１の即時投与は、急性毒性から保護するが、ＡＳＣまたはＣＢ／ＢＭを有するＡＳＣのいずれかの次の投与は、造血を支援し、対象の回復に応じて行われてもよい。
次のリストは、開示される使用および方法に適用できる様々な投薬計画を示す。
１−例えば、曝露後約１０日以内、例えば、７〜１０日以内、５〜６日以内、３〜４日以内、１〜２日以内、または約１日以内の接着間質細胞（ＡＳＣ）単独の投与。
２−１の後−例えば、毎週、毎月、１〜４ヶ月ごと、または４〜６ヶ月ごとの接着間質細胞単独の追加投与。
３−臍帯血または骨髄のドナーが見つかった場合−曝露後約１０日以内、例えば、７〜１０日以内、５〜６日以内、３〜４日以内、１〜２日以内、または約１日以内の、接着間質細胞およびマッチさせた同種の臍帯血細胞または骨髄細胞（ＣＢ／ＢＭ）の投与。
４−３の次−マッチさせた同種の臍帯血細胞または骨髄細胞の有無にかかわらず、例えば、毎週、毎月、１〜４ヶ月ごと、または４〜６ヶ月ごとの接着間質細胞の追加投与。
５−筋肉内経路を介して、曝露後約０〜５日以内に少なくとも２回、例えば、曝露後１日目と５日目における接着間質細胞単独の投与。
６−臍帯血または骨髄ドナーが見つかった場合−曝露後２日以内の、接着間質細胞およびマッチさせた同種の臍帯血細胞または骨髄細胞の投与。
７−５または６の次−曝露後４〜２１日目（臍帯血または骨髄ドナーを見つけるために必要な期間）の、マッチさせた同種の臍帯血細胞または骨髄細胞の投与。
８−７の後−必要な時に、マッチさせた同種の臍帯血細胞または骨髄細胞の有無にかかわらず、接着間質細胞の追加投与。
上記の説明と共に、非限定的な方法で本発明を例証する以下の実施例について以降言及する。
一般に、本明細書で使用する命名法および本発明で利用する実験方法には、分子、生化学、微生物学および組換えＤＮＡの技術が含まれる。このような技術は文献に十分に説明されている。例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｉ−ＩＩＩ巻 Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．，編（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ社、ボルティモア、メリーランド州（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ，「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ社、ニューヨーク州（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎら「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ」，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ社、ニューヨーク州；Ｂｉｒｒｅｎら（編）「Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ」、１−４巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ社、ニューヨーク州（１９９８）；米国特許第４，６６６，８２８号、同第４，６８３，２０２号、同第４，８０１，５３１号、同第５，１９２，６５９号、および同第５，２７２，０５７号に記載の方法；「Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」，Ｉ−ＩＩＩ巻、Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｇｙ」Ｉ−ＩＩＩ巻、Ｃｏｌｉｇａｎ Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓら（編），「Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版），Ａｐｐｌｅｔｏｎ＆Ｌａｎｇｅ、ノーウォーク、コネティカット州（１９９４）；ＭｉｓｈｅｌｌおよびＳｈｉｉｇｉ（編）、「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎら、ニューヨーク州（１９８０）を参照されたい；利用可能な免疫アッセイは、特許および科学文献で広範に説明されており、例えば、米国特許第３，７９１，９３２号、同第３，８３９，１５３号、同第３，８５０，７５２号、同第３，８５０，５７８、同第３，８５３，９８７号、同第３，８６７，５１７号、同第３，８７９，２６２号、同第３，９０１，６５４号、同第３，９３５，０７４号、同第３，９８４，５３３号、同第３，９９６，３４５号、同第４，０３４，０７４号、同第４，０９８，８７６号、同第４，８７９，２１９号、同第５，０１１，７７１号および同第５，２８１，５２１号；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」 Ｇａｉｔ， Ｍ．Ｊ．編（１９８４）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，およびＨｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．編（１９８５）；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，およびＨｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．編（１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｌ，編（１９８６）；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ」ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ社，（１９８６）；「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．，（１９８４）および「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」１−３１７巻，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ社；「ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ社、サンディエゴ、カリフォルニア州（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋら「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ」ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ社（１９９６）を参照されたい。これらの全ては、本明細書で十分に記載されるように、参照により組み込まれる。他の一般的な参考文献は、この文書全体の中に提供される。その中の手順は、当技術分野において公知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。その中に含まれる情報は、参照により本明細書に組み込まれる。
実施例１
骨髄、胎盤および脂肪組織由来の接着間質細胞（ＡＳＣ）の生産および培養
特定の細胞マーカー発現プロファイルによって特徴付けられる３Ｄ−ＡＳＣ細胞を生産するために、３Ｄ担体を含むバイオリアクターシステムで接着間質細胞を培養した。成長効率を、細胞数を介して試験した。これらの細胞の分化能を、分化培地で培養することにより試験した。
材料および実験手順
骨髄接着間質細胞
骨髄（ＢＭ）の接着間質細胞を、開胸手術またはＢＭ生検を受ける血液学的に健常なドナーの吸引された胸骨の骨髄から得た。骨髄吸引物を、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ；ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、ゲーサーズバーグ、メリーランド州）で３倍希釈し、フィコール−ハイパック（Ｒｏｂｂｉｎｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、サニーベール、カリフォルニア州）密度勾配遠心分離を行った。その後、骨髄単核細胞（＜１．０７７ｇｍ／ｃｍ３）を収集し、ＨＢＳＳで３回洗浄し、１０％ＦＣＳ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社）、１０−４Ｍのメルカプトエタノール（Ｍｅｒｃｋ社、ホワイトハウスステーション、ニュージャージー州）、Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ−ナイスタチン混合物（１００Ｕ／ｍｌ：１００μｇ／ｍｌ：１．２５ｕｎ／ｍｌ、Ｂｅｉｔ Ｈａ’Ｅｍｅｋ社）、２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｂｅｉｔ Ｈａ’Ｅｍｅｋ）を補充した成長培地（ＤＭＥＭ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社、Ｂｅｉｔ Ｈａ’Ｅｍｅｋ、イスラエル））に再懸濁した。個々のドナーからの細胞を、３７℃（５％ＣＯ２）で組織培養フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、アクトン、マサチューセッツ州）に別々にインキュベートし、培地を１週間ごとに交換した。細胞を、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｂｅｉｔ Ｈａ’Ｅｍｅｋ）を用いて、３〜４日ごとに分けた。２〜４０回継代した後、６０〜８０％コンフルエンスに達した時に、細胞を分析のためにまたはバイオリアクターで培養するために収集した。
胎盤由来の接着間質細胞
満期分娩の胎盤の内部の部分（Ｂｎｅｉ Ｚｉｏｎ医療センター、ハイファ、イスラエル）を、無菌条件下で切り、ハンクス緩衝液で３回洗浄し、０．１％コラゲナーゼ（１ｍｇ／ｍｌの組織、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、セントルイス、ミズーリ州）と３７℃で３時間インキュベートした。その後、穏やかにピペッティングし、懸濁細胞を、１０％ＦＣＳ、Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ−ナイスタチン混合物（１００Ｕ／ｍｌ：１００μｇ／ｍｌ：１．２５ｕｎ／ｍｌ）および２ｍＭのＬ−グルタミンを補充したＤＭＥＭで洗浄し、７５ｃｍ２フラスコに播種し、３７℃で、５％ＣＯ２を含む加湿条件下の組織培養インキュベーター内でインキュベートした。その後、細胞を、７２時間プラスチック表面に接着させ、その後、培地を３〜４日ごとに交換した。６０〜８０％コンフルエンスに達した時（通常、１０〜１２日）、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡを用いて、細胞を成長フラスコから剥離し、新しいフラスコに播種した。その後、培養細胞は、分析のためにまたはバイオリアクターで培養するために収集した。
脂肪由来の接着間質細胞
接着間質細胞を、脂肪吸引手順（Ｒａｍｂａｍ ハイファ、イスラエル）のヒト脂肪組織から得た。脂肪組織を、等量のＰＢＳで十分に洗浄し、３７℃で３０分間、コラゲナーゼ（２０ｍｇ／ｍｌ）で消化した。その後、細胞を、１０％ＦＣＳ、Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ−ナイスタチン混合物（１００Ｕ／ｍｌ：１００μｇ／ｍｌ：１．２５ｕｎ／ｍｌ）およびＬ−グルタミンを含むＤＭＥＭで洗浄し、室温で１０分間、１２００ｒｐｍで遠心分離し、溶解液（１：１０；Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社、Ｂｅｉｔ Ｈａ’ｅｍｅｋ、イスラエル、赤血球を廃棄するため）に再懸濁し、遠心分離して、１０％ＦＣＳ、Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ−ナイスタチン混合物（１００Ｕ／ｍｌ：１００μｇ／ｍｌ：１．２５ｕｎ／ｍｌ）およびＬ−グルタミンを含むＤＭＥＭに再懸濁した。その後、洗浄細胞を、３〜１０×１０７細胞／フラスコで、無菌の組織培養培地のフラスコに播種した。翌日、細胞をＰＢＳで洗浄し、残留ＲＢＣおよび死細胞を除去した。これらの細胞を、５％ＣＯ２を含む加湿条件下で組織培養インキュベーター中３７℃に保持した。培地を３〜４日ごとに交換した。６０〜８０％コンフルエンスの時点で、これらの細胞を０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡを用いて成長フラスコから剥離し、新しいフラスコに播種した。２〜４０回の継代後に、細胞が６０〜８０％コンフルエンスに達した時、細胞を分析のためにまたはバイオリアクターで培養するために収集した。
ＰｌｕｒｉＸ（商標）栓流バイオリアクター
ＰｌｕｒｉＸ（商標）栓流バイオリアクター（Ｐｌｕｒｉｓｔｅｍ社、ハイファ、イスラエル；図１ｇに示す、米国特許第６，９１１，２０１号も参照されたい）に、ポリエステルの不織布マトリックスから作られた１〜１００ｍｌ充填用の３Ｄ多孔性担体（ｐｏｒｒｏｓｉｖｅ ｃａｒｒｉｅｒ）（直径４ｍｍ）を充填した。これらの担体は、比較的少量で大細胞数の増殖を可能にする。ガラス製品は、Ｐｌｕｒｉｓｔｅｍ社が設計し、製造した。このバイオリアクターは、３７℃のインキュベーター内で維持され、流速は、バルブ（図１ｇの６ａ）、および蠕動ポンプ（図１ｇの９）によって調節され、監視された。このバイオリアクターは、サンプリングポイントおよび注入ポイント（図１ｇの４）を含み、細胞の連続播種を可能にする。培地を、貯蔵所（図１ｇの１）から、ｐＨ６．７〜７．４で供給した。この貯蔵所には、バイオリアクター中の細胞密度に応じて、異なる比率で空気／ＣＯ２／Ｏ２を含む濾過したガス混合物（図１ｇの２、３）が供給された。Ｏ２の割合は、モニター（図１ｇの６）によって測定される、バイオリアクターの出口における溶存Ｏ２のレベルに適していた。このガス混合物は、シリコンチューブまたは拡散器（Ｄｅｇａｎｉａ Ｂｅｔ社、Ｅｍｅｋ Ｈａｙａｒｄｅｎ、イスラエル）を経て貯蔵所に供給された。培地を、循環している非接着細胞の収集を可能にする分離容器（図１ｇの７）に通過させた。培地の循環は、蠕動ポンプ（図１ｇの９）が行った。このバイオリアクターは、さらに、追加のサンプリングポイント（図１ｇの１０）および連続培地交換用の容器を備えていた。
３Ｄ−接着間質細胞（３Ｄ−ＡＳＣ）の生産
上記のように成長させたコンフルエントでない初代ヒト接着間質細胞の２Ｄ培養物を、トリプシン処理し、洗浄し、１０％ＦＢＳ、Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ−ナイスタチン混合物（１００Ｕ／ｍｌ：１００μｇ／ｍｌ：１．２５ｕｎ／ｍｌ）および２ｍＭのＬ−グルタミンを補充したＤＭＥＭに再懸濁し、注入ポイントを介して、無菌の栓流バイオリアクター（図１ｇ参照）内の３Ｄ担体上に播種した（１０３〜１０５細胞／ｍｌ）。接種前に、バイオリアクターに、ＰＢＳ−Ｃａ−Ｍｇ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社、Ｂｅｉｔ Ｈａ’ｅｍｅｋ、イスラエル）を充填し、これをオートクレーブ処理（１２０℃、３０分間）し、１０％熱不活性化ウシ胎児血清およびＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐ−ナイスタチン混合物（１００Ｕ／ｍｌ：１００μｇ／ｍｌ：１．２５ｕｎ／ｍｌ）を含むダルベッコ成長培地で洗浄した。流れを、０．１〜５ｍｌ／分の速度で維持した。播種プロセスには、２〜４８時間の循環の中断が含まれ、それによって、細胞がこれらの担体上で定着するのを可能にした。バイオリアクターを、必要に応じて、無菌の空気およびＣＯ２が供給されるインキュベーターを用いて、制御された温度（３７℃）およびｐＨ条件（ｐＨ＝６．７〜７．４）下で維持した。成長培地を週に２〜３回交換した。循環培地を、４時間〜７日ごとに新鮮なＤＭＥＭ培地と交換した。１×１０６〜１×１０７細胞／ｍｌの密度（成長の１２〜４０日後）で、培地の全量をこのバイオリアクターから除去し、担体をＰＢＳで３〜５回洗浄した。その後、３Ｄ−ＡＳＣ細胞を、トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社、Ｂｅｉｔ Ｈａ’ｅｍｅｋ、イスラエル；３〜１５分穏やかに攪拌しながら、１〜５回）を用いてこれらの担体から脱離させ、その後、ＤＭＥＭに再懸濁して、凍結保存した。
３Ｄ−ＡＳＣの品質の生物学的アッセイ
凍結保存した３Ｄ−ＡＳＣ細胞を解凍し、数を数えた。細胞生存率の評価のために、２×１０５細胞を１５０ｃｍ２組織培養フラスコに播種し、それらの接着力および再増殖を、播種後の７日以内に評価した。その後、３Ｄ−ＡＳＣの膜マーカーの表現型を、蛍光モノクローナル抗体のフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社、フラートン、カリフォルニア州）を用いて分析した。
フローサイトメトリーアッセイを用いた、３Ｄ培養接着間質細胞と２Ｄ培養接着間質細胞との間での細胞膜マーカープロファイルの比較
２Ｄ培養物および３Ｄフロー方式培養物の１００，０００〜２００，０００個の接着間質細胞を、５ｍｌチューブ中の培地０．１ｍｌに懸濁し、飽和濃度の以下のＭＡｂのそれぞれとインキュベートした（４℃、３０分、暗い条件）：ＦＩＴＣ結合抗ヒトＣＤ９０（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社、テメキュラ、カリフォルニア州）、ＰＥ結合抗ヒトＣＤ７３（Ｂａｃｔｌａｂ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ社、Ｃｅａｓａｒｅａ、イスラエル）、ＰＥ結合抗ヒトＣＤ１０５（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、サンディエゴ、カリフォルニア州）、ＦＩＴＣ結合抗ヒトＣＤ２９（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、サンディエゴ、カリフォルニア州）、Ｃｙ７−ＰＥ結合抗ヒトＣＤ４５（ｅＢｉｏｓｉｅｎｃｅ社）、ＰＥ結合抗ヒトＣＤ１９（ＩＱＰｒｏｄｕｃｔｓ社、グローニンゲン、オランダ）、ＰＥ結合抗ヒトＣＤ１４ＭＡｂ（ＩＱＰｒｏｄｕｃｔｓ社）、ＦＩＴＣ結合抗ヒトＣＤ１１ｂ（ＩＱＰｒｏｄｕｃｔｓ社）およびＰＥ結合抗ヒトＣＤ３４（ＩＱＰｒｏｄｕｃｔｓ社）またはＦＩＴＣ結合抗ヒトＨＬＡ−ＤＲのＭＡｂ（ＩＱＰｒｏｄｕｃｔｓ社）。インキュベーション後、これらの細胞を、１％熱不活性化ＦＣＳを含む氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、０．５％ホルムアルデヒド５００μｌに再懸濁し、ＦＣ−５００フローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社、フラートン、カリフォルニア州）を用いて分析した。
質量分析法を用いた３Ｄ培養接着間質細胞と２Ｄ培養接着間質細胞との間でのタンパク質プロファイルの比較
２Ｄおよび３Ｄの培養手順によるＡＳＣを、上述したとおり胎盤から生産した。簡単に説明すると、これらの２Ｄ培養物は、６０〜８０％コンフルエンスに達するまで３７℃の加湿５％ＣＯ２雰囲気下で４日間、１７５ｃｍ２フラスコ内で０．３〜０．７５×１０６細胞を培養することによって生産した。これらの３Ｄ培養物は、２０００担体を含むバイオリアクター中で２〜１０×１０６細胞／ｇを播種し、１８日間培養することによって生産した。収集後、細胞を洗浄し（×３）、全ての血清を除去し、ペレット化して、凍結させた。タンパク質を、（Ｔｒｉ試薬キット（Ｓｉｇｍａ社、セントルイス、米国）を用いて）ペレットから単離し、トリプシンで消化し、メーカーのプロトコールに従ってｉＴＲＡＱ試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、フォスターシティ、カリフォルニア州）で標識した。簡単に説明すると、ｉＴＲＡＱ試薬は、非ポリマー性の等圧タグ付き試薬である。各試料中のペプチドを、それらのＮ−末端および／またはリジン側鎖を介して４つの等圧の同位体コード化タグのうちの１つで標識した。これらの４つ標識試料を混合し、ペプチドを、質量分析で分析した。ペプチド断片化の際、各タグは異なる質量のレポーターイオンを放出するので、４つのレポーターの比率は、試料中の特定のペプチドの相対存在量を与える（情報元：ｈｔｔｐ：／／ｄｏｃｓ．ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ／ｐｅｂｉｏｄｏｃｓ／００１１３３７９．ｐｄｆ）。
胎盤由来のＡＳＣの２Ｄ培養対３Ｄ培養のプロテオミクス解析を、ＱＴＯＦ−Ｐｒｅｍｉｅｒ上のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（Ｗａｔｅｒｓ社、サンフランシスコ、カリフォルニア州）を用いて、Ｓｍｏｌｅｒプロテオミクスセンター（Ｔｅｃｈｎｉｏｎ社の生物事業部、ハイファ、イスラエル）で行い、同定および解析を、ｎｒデータベースのヒトの部分に対してＰｅｐ−Ｍｉｎｅｒソフトウエア（Ｂｅｅｒ，Ｉ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，４，９５０−６０（２００４）によって行った。以下のタンパク質の解析を行った：ヘテロ核リボヌクレオタンパク質Ｈ１（Ｈｎｒｐｈｌ ＧｅｎｅＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００５５１１）、Ｈ２Ａヒストンファミリー（Ｈ２ＡＦ、ＧｅｎｅＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０３４５６６．１）、真核生物の翻訳伸長因子２（ＥＥＥＦ２、ＧｅｎｅＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０３１９３３．１）、レティキュロカルビン（ｒｅｔｉｃｕｌｏｃａｌｂｉｎ）３、ＥＦハンドカルシウム結合ドメイン（ＲＣＮ２、ＧｅｎｅＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ ０６５７０１）、ＣＤ４４抗原アイソフォーム２前駆体（ＧｅｎｅＢａｎｋアクセッション番号ΝΡ＾ΟΟ １００１３８９、カルポニン１、塩基性、平滑筋（ＣＮＮ１、ＧｅｎｅＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１２９０）、３−ホスホアデノシン−５−ホスホ硫酸シンターゼ２アイソフォームａ（Ｐａｐｓｓ２、ＧｅｎｅＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ ００４６６１）、リボソームタンパク質Ｌ７ａ（ｒｐＬ７ａ、ＧｅｎｅＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０００９６３）およびアルデヒド脱水素酵素Ｘ（ＡＬＤＨ Ｘ、ＧｅｎｅＢａｎｋアクセッション番号Ｐ４７７３８）。全ての実験を二回行った。解析の性質により、全てのタンパク質は、試料中に出現するペプチドの数に従って分析した（各分析においてタンパク質が２〜２０回出現）。
ＥＬＩＳＡを用いた３Ｄ培養接着間質細胞と２Ｄ培養接着間質細胞との間での分泌タンパク質の比較
２Ｄおよび３Ｄの培養手順によって胎盤から生産させるＡＳＣを、上述したとおり、２４日間、３Ｄ培養で生産した。その後、馴化培地を収集し、３つの独立した実験で、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、ミネアポリス、ミネソタ州）を用いて、Ｆｌｔ−３リガンド、ＩＬ−６、トロンボポエチン（ＴＰＯ）および幹細胞因子（ＳＣＦ）について分析した。結果を、１×１０６細胞／ｍｌに対して規準化した。
結果
ＰｌｕｒｉＸ（商標）バイオリアクターシステムは、生理的環境のような微小環境を作り出す
接着間質細胞にとって効率的な培養条件にさせるために、生理的環境のような環境（図１ａに示す）を、ＰｌｕｒｉＸバイオリアクター（Ｐｌｕｒｉｓｔｅｍ社、ハイファ、イスラエル；担体を図１ｇに示し、図１ｂに播種前の状態を示す）を用いて人工的に作り出した。図１ｃ〜図１ｆに示すとおり、骨髄生産３Ｄ−ＡＳＣ細胞を十分に培養し、播種後２０日間（図１ｂ〜図１ｃ、それぞれ１５０倍および２５０倍に拡大）ならびに４０日間（図１ｃ〜図１ｄ、それぞれ３５０倍および５００倍に拡大）、３Ｄマトリックス上で増殖させた。
ＰｌｕｒｉＸバイオリアクターシステム内で成長した細胞は著しく増殖した
異なる生産ロットの胎盤由来の３Ｄ−ＡＳＣ細胞を、ＰｌｕｒｉＸバイオリアクターシステム内で成長させた。播種密度は、１３，３００細胞／担体（全部で２×１０６細胞）であった。播種後１４日目に、細胞密度は１５倍増し、約２００，０００細胞／担体（図２）、または１５０担体のバイオリアクター中３０×１０６個に達した。別の実験では、細胞を、１．５×１０４細胞／ｍｌの密度でバイオリアクターに播種し、播種後３０日目に、これらの担体は、５０倍を超える高い細胞数、すなわち、約０．５×１０６細胞／担体、または０．５×１０７細胞／ｍｌを含んでいた。様々なレベルの成長カラムの担体上の細胞密度は一貫しており、細胞への酸素および栄養素の移送が均質であることが示された。したがって、この３Ｄ培養系は、生着および移植の成功を支援する目的のために十分な量まで効率よく成長させることができる、高密度の間葉系細胞培養物の成長および長期維持のための支援条件を提供することが証明された。
３Ｄ−ＡＳＣは特有の膜マーカー特性を示す
３Ｄ培養法を模倣する骨環境によって与えられる可溶性分子の分泌プロファイルおよびタンパク質生産の違いを定義するために、ＦＡＣＳ分析を行った。図３ａに示すとおり、細胞マーカーのＦＡＣＳ分析は、３Ｄ−ＡＳＣが２Ｄ条件で成長させた接着間質細胞とは異なるマーカー発現パターンを示すことを表す。２Ｄ培養細胞は、３Ｄ培養細胞と比較して、著しく高いレベルの陽性膜マーカーＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ７３およびＣＤ２９を発現した。例えば、ＣＤ１０５は、３Ｄ培養細胞中では５６％の発現を示し、それに対して、２Ｄ培養細胞中では８７％の発現を示した。２Ｄ胎盤培養物と３Ｄ胎盤培養物の両方のＡＳＣは、造血膜マーカーを発現しなかった（図３ｂ）。
３Ｄ−ＡＳＣは可溶性因子の特有のプロファイルを示す
造血のニッチには、豊富なサイトカイン、ケモカインおよび成長因子を生産する支援細胞が含まれる。２Ｄ培養ＡＳＣと３Ｄ培養ＡＳＣの違いをさらに定義するために、２Ｄ ＡＳＣ培養物および３Ｄ ＡＳＣ培養物の馴化培地中の４つの主要な造血分泌タンパク質のプロファイルをＥＬＩＳＡにより調べた。図４ａ〜図４ｃは、３Ｄ条件で成長させた細胞が、高レベルのＦｌｔ−３リガンド（図４ａ）、ＩＬ−６（図４ｂ）、およびＳＣＦ（図４ｃ）を有する馴化培地を生成するが、２Ｄ培養物の馴化培地では、低レベルのＩＬ−６、ならびに０に近いレベルのＦｌｔ−３リガンドおよびＳＣＦが検出されたことを示す。トロンボポエチン（ＴＰＯ）の生産は、非常に低く、両方の培養物で等しかった。
３Ｄ−ＡＳＣは、質量スペクトル分析で特有のタンパク質プロファイルを示す
２Ｄ培養ＡＳＣと３Ｄ培養ＡＳＣの違いをさらに定義するために、これらの細胞のタンパク質プロファイルを、質量分析によって分析した。図４ｄは、２Ｄ培養ＡＳＣおよび３Ｄ培養ＡＳＣが、非常に異なるタンパク質発現プロファイルを示すことを示す。以下の表１に示すとおり、３Ｄ培養細胞は、非常に高い発現レベル（それぞれ、９倍および１２倍を上回る高さ）のＨ２ＡＦおよびＡＬＤＨ Ｘ、ならびに高レベルのタンパク質ＥＥＥＦ２、ＲＣＮ２およびＣＮＮ１を示す（それぞれ、約３倍、約２．５倍および約２倍）。さらに、３Ｄ培養細胞は、タンパク質ＨｎｒｐｈｌおよびＣＤ４４抗原アイソフォーム２前駆体が約半分の発現レベルであり、Ｐａｐｓｓ２およびｒｐＬ７ａが約３分の１の発現レベルであることを示す。
実施例２
２Ｄ培養ＡＳＣおよび３Ｄ培養ＡＳＣによるリンパ球反応の抑制
接着間質細胞、特に、３Ｄ−ＡＳＣは、ＭＬＲアッセイにおいてヒト臍帯血単核細胞の免疫反応を抑制することが見出された。
材料および実験手順
混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイ
胎盤から生産される２Ｄおよび３Ｄ培養手順によるＡＳＣの免疫抑制ならびに免疫特権の特性は、反応（増殖）細胞および刺激（非増殖）細胞の混合培養における不適合リンパ球の増殖率によって影響されるように、ＨＬＡ遺伝子座で組織適合性を測定するＭＬＲアッセイによって影響を受けた。ヒト臍帯血（ＣＢ）単核細胞（２×１０５）を反応細胞として使用し、放射線照射（３０００Ｒａｄ）した等量（１０５）のヒト末梢血由来の単球（ＰＢＭＣ）と共培養するか、胎盤から生産された２Ｄもしくは３Ｄ培養の接着間質細胞と共培養するか、または接着間質細胞とＰＢＭＣの組み合わせで共培養することによって刺激した。各アッセイを３回繰り返した。細胞を、９６ウェルプレート中の（３７℃の加湿５％ＣＯ２雰囲気下で、２０％ＦＢＳを含む）ＲＰＭＩ １６４０培地で４日間共培養した。プレートを、培養の最後の１８時間中に、１μＣの３Ｈ−チミジンでパルスした。その後、細胞を、グラスファイバーフィルター上で収集し、チミジン取り込みを、シンチレーションカウンターを用いて定量した。
結果
図７は、ＰＢＭＣで刺激した時に、ＣＢ細胞の増殖が上昇することによって示されるＣＢ細胞の免疫反応を示し、これは、理論によって縛られることなく、おそらく、ＨＬＡ不適合性に反応するＴ細胞増殖に関連付けられる。しかし、本発明の接着間質細胞とインキュベートした時に、かなり低いレベルの免疫反応がこれらの細胞によって示された。さらに、ＰＢＭＣに対するＣＢ免疫反応は、これらの接着細胞と共培養したときに、実質的に低下した。したがって、ＡＳＣは、ＧｖＨＤに特有の、ドナー細胞のＴ細胞増殖を低下させる潜在能力を有することが見出された。２Ｄおよび３Ｄの両方の培養物は、リンパ球の免疫反応を低下させるが、上記の３Ｄ−ＡＳＣの他の利点と一致して、これらの３Ｄ−ＡＳＣはより強い免疫抑制を示した。
実施例３
胎盤由来の３Ｄ−ＡＳＣのＨＳＣ生着を改善する能力の評価
ＨＳＣ生着の３Ｄ−ＡＳＣ支援を、亜致死線量の放射線照射または化学療法で前処理した免疫欠損ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスで検出されるヒト造血細胞（ｈＣＤ４５＋）のレベルにより評価した。
材料および実験手順
ＣＤ３４＋細胞の単離
臍帯血試料を、分娩中無菌条件下で取得し（Ｂｎｅｉ Ｚｉｏｎ医療センター、ハイファ、イスラエル）、単核細胞を、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ ＰｏＣ Ａｓ、オスロ、ノルウェー）密度勾配遠心分離を用いて分画し、凍結保存した。解凍した単核細胞を洗浄し、抗ＣＤ３４抗体とインキュベートし、ｍｉｄｉ ＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ社、Ｂｅｒｇｉｓｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、ドイツ）を用いて単離した。２種類以上の試料からの細胞を、所望の量（５０，０００〜１００，０００細胞）に達するまでプールした。
放射線照射マウスにおける移植細胞の検出
７週齢の雄および雌のＮＯＤ−ＳＣＩＤマウス（ＮＯＤ−ＣＢ １７−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／Ｊ；Ｈａｒｌａｎ／Ｗｅｉｚｍａｎｎ Ｉｎｓｔ．，Ｒｅｈｏｖｏｔ、イスラエル）を、無菌のオープンシステムケージ内で維持し、無菌の食事およびオートクレーブした酸性水を与えた。これらのマウスに亜致死線量（３５０ｃＧｙ）の放射線を照射し、その後（放射線照射後４８時間）、胎盤または脂肪組織由来の追加のＡＳＣ（０．５×１０６〜１×１０６）を含む場合と含まない場合とで（各群３〜７匹のマウス）、外側尾静脈への静脈注射によって５０，０００〜１００，０００個のｈＣＤ３４＋細胞を移植した。移植後４〜６週間目に、これらのマウスを脱臼により屠殺し、ＢＭを、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ５０ｍｌ、ＦＢＳ５ｍｌ、５％アジ化ナトリウム０．５ｍｌ）で大腿骨と脛骨の両方を洗い流すことによって収集した。マウスＢＭにおけるヒト細胞をフローサイトメトリーによって検出し、治療したＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスにおけるヒトおよびマウスのＣＤ４５造血細胞マーカー発現細胞の割合を、抗ヒトＣＤ４５−ＦＩＴＣ（ＩＱ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ、オランダ）と細胞をインキュベートすることによって測定した。明確なヒト生着についての最低の閾値は０．５％であった。
化学療法で治療したマウスにおける移植細胞の検出
６．５週齢の雄のＮＯＤ−ＳＣＩＤマウス（ＮＯＤ．ＣＢ１７／ＪｈｋｉＨｓｄ−ｓｃｉｄ；Ｈａｒｌａｎ、Ｒｅｈｏｖｏｔ、イスラエル）を、放射線照射マウスについて上記に記載したとおりに維持し、ブスルファンを腹腔内に注射した（２日連続−２５ｍｇ／ｋｇ）。第２のブスルファン注射後２日目に、マウスに、ＣＤ３４＋細胞を単独で、または胎盤から生産された０．５×１０６個のＡＳＣと共に注射した。移植後３．５週目に、マウスを屠殺し、放射線照射マウスについて記載したとおりに、ヒト造血細胞の存在を決定した。
結果
放射線照射マウスにおける３Ｄ−ＡＳＣによって改善されたＨＳＣの生着
ヒトＣＤ３４＋造血細胞および胎盤または脂肪に由来する３Ｄ−ＡＳＣを、放射線照射ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに共移植した。生着率を共移植後４週目に評価し、ＨＳＣを単独で移植したマウスと比較した。表２および図５に示すとおり、３Ｄ−ＡＳＣおよびＵＣＢ ＣＤ３４＋細胞の共移植は、ＵＣＢ ＣＤ３４＋細胞単独で治療したマウスと比較して、レシピエントマウスのＢＭにおいてかなり高い生着率およびより高レベルのヒト細胞を与えた。
図１４は、異なるバッチのｈＣＤ４５＋細胞の割合および３Ｄ−ＡＳＣの用量を示す生着の結果を示す。放射線照射の代わりにブスルファンを使用した場合にも同様の生着の結果が得られ、放射線照射または化学療法によって損なわれた内因性造血系を治療するための、併用治療の有効性および相乗効果が示された。
化学療法で治療したマウスにおける３Ｄ−ＡＳＣによって改善されたＨＳＣの生着
ヒトＣＤ３４＋造血細胞を、化学療法で前処理したＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに、胎盤由来の５００，０００個の２Ｄ−ＡＳＣまたは３Ｄ−ＡＳＣと共移植した。共移植後３．５週目に、生着効率を評価し、ＨＳＣを単独で移植したマウスと比較した。表３に示すとおり、ＡＳＣおよびＵＣＢ ＣＤ３４＋細胞の共移植は、ＵＣＢ ＣＤ３４＋細胞単独と比較して、レシピエントマウスのＢＭにおいてより高レベルの生着が得られた。さらに、表３に示すとおり、生着の平均レベルは、従来の静的な２Ｄ培養条件（フラスコ）で成長させた同じドナー由来の細胞を共移植したマウスよりも、ＰｌｕｒｉＸバイオリアクターシステムで成長させた胎盤由来の接着間質細胞（３Ｄ−ＡＳＣ）と共移植したマウスにおいてより高かった。
図６ａ〜図６ｂに示すＦＡＣＳ解析結果は、ＡＳＣとｈＨＳＣの共移植の利点（図６ｂ）、およびＨＳＣ移植後の造血系の回復を改善するＡＳＣの能力を示す。
まとめると、これらの結果は、ＡＳＣが、ＨＳＣ移植（自己または同種異系）後の造血回復を改善するために支援細胞として役立ち得ることを示す。ＨＳＣ移植後の造血幹細胞および／または前駆細胞の生着を高める３Ｄ−ＡＳＣの能力は、移植細胞のホーミング、自己再生および増殖の能力を向上させることができるＨＳＣ支援サイトカインを分泌する３Ｄ−ＡＳＣの能力に起因するか、または移植可能なＨＳＣのホーミングおよび増殖に必要な損傷を受けた造血微小環境を再構築するそれらの細胞の能力に起因し得る。
実施例４
放射線照射および化学損傷後にＨＳＣ回復を改善する胎盤由来の３Ｄ−接着間質細胞の
能力の評価
レシピエントの内因性ＨＳＣ回復の３Ｄ−接着間質細胞による支援を、亜致死線量の放射線照射または化学療法で前処理した免疫欠損ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスにおいて検出されるマウスの造血細胞（ｍＣＤ４５＋）のレベルによって評価した。
材料および実験手順
放射線照射マウスにおける回復した細胞の検出
７週齢の雄および雌のＮＯＤ−ＳＣＩＤマウス（ＮＯＤ−ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／Ｊ；Ｈａｒｌａｎ／Ｗｅｉｚｍａｎｎ Ｉｎｓｔ．，Ｒｅｈｏｖｏｔ、イスラエル）を、無菌のオープンシステムケージ内で維持し、無菌の食事およびオートクレーブした酸性水を与えた。これらのマウスに亜致死線量（３５０ｃＧｙ）の放射線を照射し、その後（放射線照射後４８時間）、２Ｄまたは３Ｄ条件下で成長させた胎盤由来の接着間質細胞（０．５×１０６〜１×１０６）を含む場合と含まない場合とで（各群３〜７匹のマウス）、５０，０００〜１００，０００個のｈＣＤ３４＋細胞を移植した。細胞を、外側尾静脈への静脈注射によって投与した。移植後４〜６週間目に、これらのマウスを脱臼により屠殺し、ＢＭを、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ５０ｍｌ、ＦＢＳ５ｍｌ、５％アジ化ナトリウム０．５ｍｌ）で大腿骨と脛骨の両方を洗い流すことによって収集した。マウス造血系の回復を表す、治療したＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスにおけるマウスＣＤ４５造血細胞マーカー発現細胞の測定を、抗マウスＣＤ４５−ＦＩＴＣ（ＩＱ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ、オランダ）と細胞をインキュベートすることによって行った。
化学療法で治療したマウスにおける回復した細胞の検出
６．５週齢の雄のＮＯＤ−ＳＣＩＤマウス（ＮＯＤ．ＣＢ１７／ＪｈｋｉＨｓｄ−ｓｃｉｄ；Ｈａｒｌａｎ、Ｒｅｈｏｖｏｔ、イスラエル）を、放射線照射マウスについて上記に記載したとおりに維持し、ブスルファンを腹腔内に注射した（２日連続−２５ｍｇ／ｋｇ）。第２のブスルファン注射後２日目に、マウスに、ヒトＣＤ３４＋細胞を単独で注射するか、または胎盤から生産された０．５×１０６個の接着間質細胞と共に注射した。移植後３．５週目に、マウスを屠殺し、放射線照射マウスについて上記に記載したとおりに、ヒト造血細胞の回復を測定した。
結果
放射線照射マウスにおける３Ｄ−接着間質細胞によって改善されたＨＳＣの生着
ヒトＣＤ３４＋造血細胞および胎盤または脂肪組織に由来する３Ｄ−接着間質細胞を、放射線照射ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに共移植した。マウス造血系の回復効率を共移植後４週目に評価し、胎盤接着間質細胞を含めないで、ｈＨＳＣを移植したマウスの自己回復と比較した。表４に示すとおり、２Ｄ−接着間質細胞とＵＣＢ ＣＤ３４＋細胞および３Ｄ−接着間質細胞とＵＣＢ ＣＤ３４＋細胞の両方の共移植は、ＵＣＢ ＣＤ３４＋細胞単独で治療したマウスと比較して、ｍＣＤ４５の発現レベルによって示されるように、かなり高い回復率を与えた。改善は、３Ｄ増殖細胞においてより高かったことに留意されたい。
化学療法で治療したマウスにおける３Ｄ−接着間質細胞によって改善されたＨＳＣの生着
ヒトＣＤ３４＋造血細胞を、化学療法で前処理したＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに、胎盤由来の接着間質細胞と共移植した。レシピエントマウスの造血系の回復効率を、共移植後３．５週目に評価し、ＨＳＣを単独で移植したマウスと比較した。表５に示すとおり、接着間質細胞およびＵＣＢ ＣＤ３４＋細胞の共移植が、ＵＣＢ ＣＤ３４＋細胞単独と比較して、レシピエントマウスの造血系のより高い回復率を与えた。さらに、表５に示すとおり、回復の平均レベルは、投与した接着間質細胞の数に対して用量依存的であった。
図８Ａ〜図８Ｂに示すＦＡＣＳ分析結果は、ｈＨＳＣ単独（図８Ａ）と比較した、ｈＨＳＣを脂肪由来の接着間質細胞と共移植する（図８Ｂ）利点、ならびにレシピエントの造血系の回復を改善する接着間質細胞の能力を示す。
図８Ａ〜図８Ｂは、さらに、本発明の接着間質細胞の移植または投与後に、レシピエントの内因性造血系が実質的に回復されたことを示す。これは、内因性造血細胞の数の増加を与えた。本発明の接着間質細胞は、とりわけ、レシピエント内因性造血系の回復および／または構成物を改善または誘導する。おそらく回復は、制御された造血細胞の分化および増殖に必要な可溶性サイトカインまたは常在性サイトカインを提供することによって促進される。
実施例５
放射線照射マウスの生存に対する３Ｄ−ＡＳＣ（ＰＬＸ）細胞の効果を、放射線照射（８５０ｃＧｙ）後２４時間に、Ｃ３Ｈマウスに３Ｄ増殖ＡＳＣを静脈内投与した後に検討した。
材料および実験手順
調製
マウス（Ｃ３Ｈ雄、２０ｇ、約８週齢）を、Ｈａｒｌａｎ社から購入した。動物を、実験前の馴化のためにＳＰＦ施設で１週間飼育した。３０匹のＣ３Ｈ雄マウスに全身放射線照射（８５０ｃＧｙ）した。放射線照射後２４時間に、１５匹のマウスに、外側尾静脈の１つへのゆっくりとした静脈注射（約１分）によって、マウス１匹あたりｐｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａ２５０μｌ中の３Ｄ−ＡＳＣ細胞（１×１０６個）を注射した。凝集を防ぐために、注射ステップの初めから細胞を穏やかに混合した。１５匹のマウスの残りの対照群に、等量（２５０μ１）のｐｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａ（ビヒクル）を注射した。
９日目に、（放射線照射も、３Ｄ−ＡＳＣ細胞の注射もしなかった）追加の３匹の対照マウスと共に、各群３匹の動物を屠殺した。脾臓および骨髄を収集した。ＢＭ中の全有核細胞数を数え、脾臓をコロニー形成アッセイのために取得した。
残りのマウスの生存についての追跡調査を２３日間行った。実験中、マウスをＳＰＦ条件下で監視した。動物を、週に２〜３回検査し、重さを測定した。最終時点まで生存したマウスを、ＣＯ２吸入により屠殺し、それらのＢＭを、有核ＢＭ細胞の数を数えるために収集した。
結果
図９は、ＢＡＬＢ／ｃおよびＣ３Ｈマウスにおける２種類の放射線量の電離放射線照射後のマウス（３Ｄ−ＡＳＣ治療なし）の生存率の追跡調査を示す。
図１０は、放射線を照射していないＣ３ＨマウスおよびＢＡＬＢ／ｃマウスの体重変化における異なる用量の３Ｄ−ＡＳＣ（ＰＬＸ）細胞の効果を示し、０．５×１０６および１×１０６個の細胞用量の静脈注射の安全性を示す。
図１１は、放射線被曝後のＣ３Ｈマウスの生存（パネルＡ）および規準化した体重変化（パネルＢ）を示す。「ＰＬＸ」は、３Ｄ−ＡＳＣ細胞を用いた治療を表す。「ビヒクル」は、ＰＬＸ細胞を含めないで、ｐｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａを受け取る対照マウスを表す。
図１２は、ＰＬＸ細胞で治療していない放射線照射マウス（左）または治療した放射線照射マウス（右）の固定した脾臓重量および対応するマウス群から調製した代表的な脾臓をさらに視覚的に示す。Ｃ３Ｈマウスに亜致死線量の放射線照射を行い、続いて、３Ｄ−ＡＳＣ（ＰＬＸ）を注射した後９日目に調製を行い、ＢＭ細胞の再生を、脾臓コロニー形成アッセイにより試験した。これらのコロニーは、ＢＭに再懸濁した前駆細胞に由来した。
図１３は、骨髄前駆細胞の再増殖を示す。有核ＢＭ細胞を、ＰＢＳで洗浄し、続いて、溶解溶液を用いるＲＢＣ溶解により、マウスの両方の後四肢の大腿骨および脛骨から収集し、次いで、直接数を数えた。非放射線照射マウスの正常なＢＭ細胞数は、約３０×１０６個に及ぶ。３Ｄ−ＡＳＣ（ＰＬＸ）で治療したマウスは、放射線被曝後９日目および２３日目には、非常に高レベルの全有核骨髄細胞数を有していた。
まとめるために、亜致死線量の放射線照射マウスに対する３Ｄ−ＡＳＣ治療の効果の以下の態様を示した：組織の組織学（肺、脾臓、腸、肝臓、皮膚）、ＢＭ細胞の総数の関数としてのＢＭの再構成、脾臓コロニーおよび生存。
実施例６
放射線照射マウスの生存に対する胎盤由来の３Ｄ−増殖接着間質細胞（ＰＬＸ）の効果を、放射線照射（７７０ｃＧｙ）後２４時間に、Ｃ３Ｈマウスに静脈内投与した後に検討した。
材料および実験手順
調製
マウス（Ｃ３Ｈ雄、２０ｇ、約６週齢）を、Ｈａｒｌａｎ社から購入した。動物を、実験開始前の馴化のためにＳＰＦ施設で２週間飼育した。３０匹のＣ３Ｈ雄マウスに全身放射線照射（７７０ｃＧｙ）した。放射線照射後２４時間に、１５匹のマウスに、外側尾静脈の１つへのゆっくりとした静脈注射（約１分）によって、マウス１匹あたりｐｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａ２５０μｌ中の３Ｄ−ＡＳＣ細胞（１×１０６個）を注射した。凝集を防ぐために、注射ステップの初めから細胞を穏やかに混合した。１５匹のマウスの残りの対照群に、同量（２５０μ１）のｐｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａ（ビヒクル）を注射した。
８日目に、（放射線照射も、３Ｄ−ＡＳＣ細胞の注射もしなかった）追加の３匹の対照マウスと共に、各群３匹の動物を屠殺した。完全な血液化学（ＣＢＣ）の血液を屠殺前に取得した。骨髄（ＢＭ）を収集し、ＢＭ内の全有核細胞数を計数することによって決定した。肝臓、肺、および腸を、組織学的検査のために固定した。
残りのマウスの生存についての追跡調査を１８日間行った。実験中、マウスをＳＰＦ条件下で監視した。動物を、週に２〜３回検査し、重さを測定した。最終時点まで生存したマウスを、ＣＯ２吸入により屠殺した。屠殺前に、ＣＢＣのために、後眼窩洞（ｒｅｔｒｏ−ｏｒｂｉｔａｌ ｓｉｎｕｓ）から血液を収集した。その後、骨髄を収集した。１脚（脛骨および大腿骨）からの有核ＢＭ細胞の全細胞数を直接数え、スメアを他の脚（脛骨および大腿骨）から調製した。肝臓、肺、および腸を、組織学的検査のために取得した。
結果
ＰＬＸ細胞で治療したマウス（●）およびＰＬＸ治療を受けていないマウス（○）についての、７７０ｃＧｙの放射線量での放射線照射後の生存率を図１７に示す。図１８は、規準化した体重変化（図１８Ａ）または平均体重変化（図１８Ｂ）のいずれかの１８日間の体重変化を経時的に示す。
図１９は、８日目（図１９Ａ；全群 ｎ＝３）および１８日目（図１９Ｂ；対照 ｎ＝２、ＰＬＸ ｎ＝９、およびビヒクル ｎ＝１）の対照マウス、ビヒクル治療マウス、ならびにＰＬＸ治療マウスの全骨髄細胞数（片側からの脛骨および大腿骨）を示す。８日目に、ＰＬＸ群のＢＭ細胞数は、対照の数と同様であったが、ビヒクル群におけるＢＭ細胞数は非常に低かった。１８日目の骨髄細胞数は低かったが、これらの群は、ビヒクル治療群と比較して、ＰＬＸ群におけるより高い細胞数と同じ傾向を示した。
図２０は、８日目（図２０Ａ）および１８日目（図２０Ｂ）における異なる群の赤血球（ＲＢＣ）数を示す。１８日目の放射線照射群のＲＢＣ数は、対照マウスと比較して非常に低かった。しかし、ほとんどのＰＬＸ治療マウスにおいて、ＲＢＣ数は、ビヒクル治療マウスよりも高かった。
図２１Ａ〜図２１Ｂでは、８日目（図２１Ａ）および１８日目（図２１Ｂ）の白血球（ＷＢＣ）数を比較している。ＷＢＣは、８日目に、放射線照射マウスの両群において大幅に低下している。１８日目の数は低いままである。
図２２Ａ〜図２２Ｄは、８日目（図２２Ａ、図２２Ｃ）および１８日目（図２２Ｂ、図２２Ｄ）における有核ＲＢＣのデータを示す。上のグラフ（図２２Ａ、図２２Ｂ）は、有核ＲＢＣの未熟な細胞型の割合を示す。下のグラフ（図２２Ｃ、図２２Ｄ）は、１μｌあたりの有核ＲＢＣの絶対数×１０３を示す。有核ＲＢＣの割合と総数の両方は、対照マウスと比較して増加した。１８日目において、唯一生き残ったビヒクル対照マウスは、細胞があまりにも少なかったため、数が不正確となるため報告しなかった。
測定した他の血液パラメータには、ヘモグロビン数（図２３）、血小板数（図２４）、およびヘマトクリット値（図２５）が含まれた。それぞれの図において、パネルＡは、８日目の結果を示し、パネルＢは１８日目の結果を示す。ＲＢＣ数に関しては、ＰＬＸ細胞で治療したマウスと比較したビヒクル対照のヘモグロビンは、両方の時点で減少した。血小板数も、ビヒクル対照と比較して、ＰＬＸ治療マウスで上昇した。ヘマトクリット値も、ビヒクル対照と比較して、ＰＬＸマウスにおいておそらく上昇した。非放射線照射対照マウスも、それぞれの日およびアッセイについて、比較として示す。
結論
これらの結果は、使用する放射線照射線量が使用するマウス系統に致死的であったことを示す。７７０ｃＧｙにおいて、ビヒクル治療群の１２匹のマウスのうち１匹だけが１８日目まで生存した（生存率８％）。ＰＬＸ細胞の静脈注射は、同じ線量の放射線照射後に、生存マウスの割合を７５％（９／１２）まで増加させる。追跡調査期間中、ＰＬＸ治療マウスは、ビヒクル治療マウスよりもよく食べた。１８日目に、ＰＬＸマウスは平均体重まで増えたが、たった１匹生き残ったビヒクル治療マウスは、さらに体重を失っていた。ＩＶ ＰＬＸ注射によって治療した群も、８日目および１８日目の両方において、より高い骨髄細胞数を有していた。１８日目の血液パラメータ、特に、ＲＢＣおよび血小板も、一般に、ＰＬＸ治療マウスで良好であった。これらの効果は、生存率が低下する時期の開始前である８日目においては明らかでなかった。
実施例７
放射線照射マウスの血清サイトカインプロファイルに対する胎盤由来の３Ｄ−増殖接着間質細胞（ＰＬＸ）の効果を、放射線照射（７７０ｃＧｙ）後２４時間に、Ｃ３ＨマウスにＰＬＸを静脈内投与した後１日目および４日目に検討した。
材料および実験手順
調製
マウス（Ｃ３Ｈ雄、２０ｇ、約６週齢）を、Ｈａｒｌａｎ社から購入した。動物を、実験前の馴化のためにＳＰＦ施設で２週間飼育した。４匹のマウスを未治療対照マウスとする一方で、２６匹に７７０ｃＧｙの放射線を照射した。放射線照射後２４時間に、８匹のマウスにＰＬＸをＩＶ注射し、８匹のマウスにＰｌａｓｍａｌｙｔｅを注射した。ＩＶ注射後の予期せぬ死亡の場合のために、６匹を予備として飼育した。ＰＬＸ注射後１日目および４日目に、２匹の非放射線照射対照マウス、２匹の放射線照射した対照マウス、４匹のビヒクル注射マウス、および４匹のＰＬＸ注射マウスから動脈血を収集した。血清をこの血液から分離し、次いで、６５０μｌの十分な量を得るために、各２匹のマウスからの血清を一緒にプールした。以下のサイトカイン／成長因子ＩＬ１Ａ、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ１０、ＩＬ１２、ＩＬ１７Ａ、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、Ｇ−ＣＳＦ、およびＧＭ−ＣＳＦについて「マウスの炎症性サイトカイン多検体ＥＬＩＳＡアレイキット（Ｍｏｕｓｅ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ Ｍｕｌｔｉ−Ａｎａｌｙｔｅ ＥＬＩＳＡｒｒａｙ Ｋｉｔ」（ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社；カタログ番号ＭＥＭ−００４Ａ）を用いた解析まで、収集した血清を−２０℃で保管した。
結果
図２６Ａ〜図２６Ｂは、ＰＬＸ細胞またはビヒクルでの注射後１日目（図２６Ａ）および４日目（図２６Ｂ）におけるサイトカインプロファイルを示す。最も顕著な変化は、放射線処理した全マウスにおいてＧ−ＣＳＦレベルが増加したことであった。
実施例８
放射線照射マウスの生存に対する３Ｄ−ＡＳＣ（ＰＬＸ）細胞の効果を、放射線照射（７７０ｃＧｙ）後２４時間に、Ｃ３Ｈマウスに３Ｄ増殖ＡＳＣを筋肉内投与した後に検討した。
材料および実験手順
調製
マウス（Ｃ３Ｈ雄、約２４ｇ、７週齢）を、Ｈａｒｌａｎ社から購入した。動物を、実験前の馴化のためにＳＰＦ施設で２週間飼育した。Ｃ３Ｈ雄マウスに全身放射線照射（７７０ｃＧｙ）した。放射線照射後約２４時間に、１２匹のマウス（「放射線照射＋ＰＬＸ」群）に、インスリン注射器および２５ｇ針を使用して、それぞれの尾筋肉に、２×１０６細胞／マウスの総量に対して３Ｄ−ＡＳＣ細胞５０μｌ（バッチＰＤ０６１２１０ １５３Ｂ０４、ｐｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａ中２０×１０６細胞／ｍＬ）を注射した。第２群（「放射線照射＋ＰＬＸ−２Ｘ」）には、最初に同じ量の注射をしたが、さらに、４日の間隔で、第２の２×１０６個の３Ｄ−ＡＳＣをそれぞれの尾筋肉に筋肉注射した。全ての注射について、凝集を防ぐために、注射ステップの初めから細胞を穏やかに混合した。放射線照射マウスの対照群は、ｐｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａ（ビヒクル）を同量（全部で１００μｌ、尾筋肉あたり５０μ１）、同じ方法で筋肉注射した。
これらのマウスを２１日間追跡調査した。実験中、マウスをＳＰＦ条件下で監視した。動物を週に３回検査し、生存マウスの体重を計った。最終時点まで生存したマウスを屠殺し、それぞれのＢＭを、有核ＢＭ細胞の数を数えるために収集した。
結果
図２７は、７７０ｃＧｙ電離放射線を与えたＣ３Ｈマウスの生存率（図２７Ａ）および体重変化（図２７Ｂ）を示す。放射線照射後１日目および５日目（丸）に、２×１０６細胞／用量の２回の筋肉注射を与えたマウスは、放射線照射後１日目に１回の筋肉注射を与えたマウスまたはＰＬＸ細胞を一切与えなかった対照の放射線照射マウスと比較して、生存率が改善した。
実施例９
放射線照射マウスの生存率に対する胎盤由来の３Ｄ−増殖接着間質細胞（ＰＬＸ）の効果を、放射線照射（７７０ｃＧｙ）後２４時間および／または５日目に、Ｃ３Ｈマウスに２種類の異なる用量（１万細胞または２万細胞／注射）の３Ｄ増殖ＡＳＣを筋肉内投与した後に検討した。
材料および実験手順
４４匹のＣ３Ｈマウスに、ハダサヘブライ大学医療センターの腫瘍学のシャレット研究所（Ｓｈａｒｅｔｔ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ａｔ Ｈａｄａｓｓａｈ Ｈｅｂｒｅｗ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ）で全身放射線照射（７７０ｃＧｙ）した。放射線照射マウスを４群に分け（１１匹／群）、以下のように治療した：
１．１×１０６ＰＬＸ細胞を２回注射した：放射線照射後２４時間および放射線照射後５日目（注射した全細胞数２×１０６個）。
２．２×１０６ＰＬＸ細胞を２回注射した：放射線照射後２４時間および放射線照射後５日目（注射した全細胞数４×１０６個）。
３．放射線照射後５日目に２×１０６ＰＬＸ細胞を１回注射した。
４．対照群として、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａ（ビヒクル）のみを注射した。
全注射を、マウス１匹あたりＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａ１００μｌを筋肉内（ＩＭ）に行った（各脚の２つの筋肉部位に２５μｌ×２回として、各脚の筋肉に５０μｌ注入した）。
マウスの生存についての追跡調査を２３日間行った。動物を毎日検査し、週に３回体重を計った。重要な時には、これらの動物を毎日２回検査した。実験中、これらのマウスをＳＰＦ条件で監視した。
２３日目において、２匹の追加の非放射線照射マウスと共に生存マウスを、後眼窩洞から血液を用いて、完全な血液化学（ＣＢＣ）について検査した。その後、マウスを屠殺し、骨髄を収集した。それぞれの生存動物における大腿骨と脛骨の両方における骨髄細胞の総数も数えた。
結果
図２８Ａ〜図２８Ｂは、７７０ｃＧｙの放射線量での放射線照射後の生存率（図２８Ａ）および平均体重変化（図２８Ｂ）を示す。ビヒクルで治療した１１匹のマウスのうちの３匹（△）が、監視期間生存した。５日目に２×１０６ＰＬＸ細胞単独で治療した１１匹のマウスのうちの５匹（○）が生存した。１日目および５日目に１×１０６ＰＬＸ細胞で治療した１１匹のマウスのうちの９匹（●）が生存した。１日目および５日目に２×１０６ＰＬＸ細胞を投与した場合（上部の黒丸のセット）、１１匹のうち１０匹が生存した。
２３日目における各群の骨髄細胞の平均細胞数を図２９に示す。生存データと一致して、１日目および５日目に２×１０６ＰＬＸ細胞で治療したマウスは、最も高い全骨髄細胞数を有していた。
実験終了（２３日目）時の白血球（ＷＢＣ）および赤血球（ＲＢＣ）の数を図３０Ａ〜図３０Ｄに示す。各マウスについてのそれぞれの数を、パネルＡ（ＷＢＣ）およびパネルＢ（ＲＢＣ）に示す。パネルＣ（ＷＢＣ）およびパネルＤ（ＲＢＣ）は、各群のプールしたデータを示す。本例においても、１日目および５日目に２×１０６ＰＬＸ細胞で治療したマウスは、ＷＢＣとＲＢＣの両方について最も高い平均数を有していたが、マウスごとに変動があった。ビヒクル治療マウスの平均細胞数と比較して、１日目および５日目に２×１０６ＰＬＸ細胞で治療した群のＷＢＣ数およびＲＢＣ数は、有意に増加した（ｐ＜０．０００１）。１日目および５日目に１×１０６ＰＬＸ細胞で治療した群（ｐ＜０００１）ならびに５日目だけ２×１０６ＰＬＸ細胞で治療した群（ｐ＜００５）のＲＢＣの平均数も、ビヒクル治療マウスと比較して有意に増加した。
図３１Ａ〜図３１Ｂは、個々のマウス（図３１Ａ）および平均群（図３１Ｂ）の２３日目の血小板数を示す。血小板数の増加は、１日目および５日目に２×１０６ＰＬＸ細胞で治療した群において最大であった。この増加は、ビヒクル治療マウスと比較して統計的に有意であった（ｐ＜０．００５）。
図３２Ａ〜図３２Ｄは、個々のマウス（図３２Ａ、図３２Ｂ）および群ごとに平均を求めた値（図３２Ｃ、図３２Ｄ）のヘモグロビン（図３２Ａ、図３２Ｃ）ならびにヘマトクリット値（図３２Ｂ、図３２Ｄ）の２３日目の結果を示す。これらのパラメータについて、全ての群が、ビヒクル治療マウスと比べて有意な増加を示したが、本例においても、この増加は、１日目および５日目に２×１０６ＰＬＸ細胞で治療した群において最大であった。
実施例１０
３Ｄ−増殖させ、混合した母方／胎児ＰＬＸ細胞と比較した、放射線照射マウスの生存率に対する３Ｄ−増殖させた胎盤由来の母方接着間質細胞（ＰＬＸ）の効果を、放射線照射（７７０ｃＧｙ）後２４時間および５日目に、Ｃ３Ｈマウスに２百万細胞／注射の３Ｄ増殖ＡＳＣを筋肉内投与した後に検討した。
少なくとも約９０％が母方由来の細胞である（遺伝子型または核型に基づく）胎盤由来の接着間質細胞を、「母方」ＰＬＸ細胞として用いた。「混合」ＰＬＸ細胞は、母方由来の細胞を約７０％および胎児由来の細胞を約３０％含んでいた。
２７匹の９週齢のＣ３Ｈマウスに、ハダサヘブライ大学医療センターの腫瘍学のシャレット研究所で全身放射線照射（７７０ｃＧｙ）した。放射線照射マウスを３群に分け（９匹／群）、以下のように治療した：
１．２×１０６細胞／マウスでＰＬＸ−１（混合）を２回注射した：放射線照射後２４時間および５日目（注射した全細胞数４×１０６個）。
２．２×１０６細胞／マウスでＰＬＸ−２（母方）を２回注射した：放射線照射後２４時間および５日目（注射した全細胞数４×１０６個）。
３．ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａを２回注射した：放射線照射後２４時間および５日目。
全注射を、マウス１匹あたりＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａを１００μｌ筋肉内（ＩＭ）に行った（２つの筋肉部位に２５μｌとして、各脚の筋肉に５０μｌ注入した）。
生存を２３日間監視した。動物を毎日検査し、週に３回体重を計った。実験中、これらのマウスをＳＰＦ条件で監視した。
２３日目において、２匹の追加の非放射線照射マウスと共に生存マウスを、後眼窩洞から血液を用いて、完全な血液化学（ＣＢＣ）について検査した。マウスを屠殺し、骨髄を収集した。それぞれの生存動物の大腿骨と脛骨の両方における骨髄細胞の総数も数えた。
結果
図３３Ａ〜図３３Ｂは、７７０ｃＧｙの放射線量での放射線照射後の生存率（図３３Ａ）および平均体重変化（図３３Ｂ）を示す。混合ＰＬＸ細胞（□；９／９生存）は、母方ＰＬＸ（△；７／９生存）よりも２３日の生存率は良好であったが、両群とも、ビヒクル治療マウスと比較して生存率が改善した（◇；３／９生存）。図３３Ｂに示すとおり、混合ＰＬＸ細胞で治療したマウスは、高い割合の初期体重も保持していた。
２３日目の血液検査の結果を図３４Ａ〜図３４Ｄに示す。図３４Ａは全骨髄細胞数を、図３４Ｂは白血球数を、図３４Ｃは赤血球数を、図３４Ｄは血小板数を示す。図３５は、２３日目のヘモグロビン（図３５Ａ）およびヘマトクリット値（図３５Ｂ）を示す。それぞれのパラメータについて、これらの混合ＰＬＸ細胞は、ビヒクル治療マウスまたは母方ＰＬＸ治療マウスと比較して、良好な回復値を与えた。
結論
ＩＭ投与した母方ＰＬＸ細胞とＰＬＸ細胞の混合バッチの両方は、生存率を改善した。この混合ＰＬＸバッチは、生存率をより効果的に改善した。混合ＰＬＸも、ＢＭ有核細胞および末梢血白血球百分率（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｃｏｕｎｔ）のパラメータによって示されるとおり、ＢＭ再増殖を引き起こすのにより効果的であった。
実施例１１
３Ｄ−増殖させ、混合した胎盤由来の母方／胎児接着間質細胞と比較した、放射線照射マウスの血清サイトカインに対する３Ｄ−増殖させた胎盤由来の母方接着間質細胞（ＰＬＸ）の効果を、放射線照射（７７０ｃＧｙ）後２４時間および５日目に、Ｃ３Ｈマウスに２百万細胞／注射の３Ｄ増殖ＡＳＣを筋肉内投与した後に検討した。
１５匹のＣ３Ｈ雄マウス（体重約２７ｇ、９週齢）に、典型的には、約８ＭｅＶ Ｘ線（光子）放射線照射によって、７７０ｃＧｙの放射線量を全身曝露した。設定された正確な線量校正は、シャレット研究所の物理学者が計算した。実験中、これらのマウスをＳＰＦ条件下で維持し、監視した。
８日目に、１匹の追加の（細胞も与えず、放射線照射もしない）対照マウスと共にこれらのマウスを、後眼窩洞から収集した血液を用いて、ＣＢＣについて分析した。血清を分離し、以下のサイトカイン／成長因子ＩＬ１Ａ、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ１０、ＩＬ１２、ＩＬ１７Ａ、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、Ｇ−ＣＳＦ、およびＧＭ−ＣＳＦについて「マウスの炎症性サイトカイン多検体ＥＬＩＳＡアレイキット（ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社；カタログ番号ＭＥＭ−００４Ａ）を用いて試験した。
骨髄細胞数の評価のために、１脚（脛骨および大腿骨）から骨髄を収集した。さらに、第２の後肢の大腿骨を、脱灰および組織病理診断のために送った。
結果
図３６は、ＰＬＸ細胞またはビヒクルの注射後８日目のサイトカインプロファイルを示す。Ｇ−ＣＳＦレベルは、放射線処理した全マウスにおいて増加した。この増加は、母方ＰＬＸ細胞で治療したマウスで最大であった。
図３７Ａ〜図３７Ｄに示すとおり、全骨髄細胞数（図３７Ａ）、白血球数（図３７Ｂ）、赤血球数（図３７Ｃ）、および血小板数（図３７Ｄ）に関しての放射線照射群間の違いは、８日目において２３日目ほど明らかではなかった。しかし、混合ＰＬＸ細胞で治療したマウスは、最高の全骨髄細胞数を有していた（図３７Ａ）。
図３８Ａ〜図３８Ｂは、同様に、ヘマトクリット値（図３８Ａ）またはヘモグロビン（図３８Ｂ）に関しても、８日目において放射線照射群間でほとんど違いは無かったことを示す。脱灰した大腿骨の組織診断結果を図３９に示す。低倍率の複合画像の左側にある四角の挿入図を、各試料について右側に拡大する。
結論
全身的な炎症の急性発症は、放射線照射後８日目のマウスでは検出されなかった。顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）レベルにのみ顕著な変化があった。Ｇ−ＣＳＦは骨髄を刺激し、顆粒球および幹細胞を生産し、その後、骨髄を刺激して、それらを血液中に放出する。Ｇ−ＣＳＦは、放射線照射マウスの血清、特に、母方ＰＬＸ注射群において上昇した。
実施例１２
３Ｄ−混合（ＰＬＸ）細胞と比較した、放射線照射マウスの生存率、血液学的パラメータ、および血清サイトカインに対する３Ｄ−母方（ＰＬＸ）細胞の効果を、放射線照射（７７０ｃＧｙ）後４８時間および５日目に、Ｃ３Ｈマウスに２百万細胞／注射の３Ｄ増殖ＡＳＣを筋肉内投与した後に検討した。
３６匹のＣ３Ｈマウスに、ハダサヘブライ大学医療センターの腫瘍学のシャレット研究所で全身放射線照射（７７０ｃＧｙ）した。放射線照射マウスを、以下のとおりに３群（１２匹／群）に分けた：
１．２×１０６個の混合ＰＬＸ細胞を２回注射した：放射線照射後４８時間および５日目（注射した全細胞数４×１０６個）。
２．２×１０６個の母方ＰＬＸ細胞を２回注射した：放射線照射後４８時間および５日目（注射した全細胞数４×１０６個）。
３．ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａを２回注射した：放射線照射後４８時間および５日目。
全注射を、マウス１匹あたりＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａ１００μｌを筋肉内に行った（各脚の２つの筋肉部位に２５μｌ×２として、各脚の筋肉に５０μｌ注入した）。
生存を２３日間監視した。動物を毎日検査し、週に３回体重を計った。実験中、これらのマウスをＳＰＦ条件で監視した。
２３日目において、２匹の追加の非放射線照射マウスと共に生存マウスを、後眼窩洞からの血液を用いて、完全な血液化学（ＣＢＣ）について検査した。マウスを屠殺し、骨髄を収集した。それぞれの生存動物の大腿骨と脛骨の両方における骨髄細胞の総数も数えた。
結果
図４０Ａ〜図４０Ｂは、７７０ｃＧｙの放射線量で放射線照射し、放射線照射後４８時間および５日目に治療した後の生存率（図４０Ａ）および平均体重変化（図４０Ｂ）を示す。第１の注射を、放射線照射後２４時間に行った場合のように、混合ＰＬＸ細胞（□）は、母方ＰＬＸ（△）よりも良好な日数の生存を与えたが、本例においても、両群とも、ビヒクル治療マウス（◇）と比較して生存率が改善した。図４０Ｂに示すとおり、混合ＰＬＸ細胞で治療したマウスは、対照の生存マウスと比較して、より高い割合の初期体重も保持していた。母方の細胞の性質または混合細胞の性質に関わらず、２４時間および５日目における治療と比較して、第１の治療を４８時間まで遅らせると、全体的な生存率がわずかに減少した。
２３日目の血液検査の結果を図４１Ａ〜図４１Ｄに示す。図４１Ａは全骨髄細胞数を、図４１Ｂは白血球数を、図４１Ｃは赤血球数を、図４１Ｄは血小板数を示す。図４２は、２３日目のヘモグロビン（図４２Ａ）およびヘマトクリット値（図４２Ｂ）を示す。それぞれのパラメータについて、混合ＰＬＸ細胞は、ビヒクル治療マウスまたは母方ＰＬＸ治療マウスと比較して、良好な回復値を与えた。
結論
第１の治療が２４時間〜４８時間遅れたとしても、Ｉ．Ｍ．投与した母方ＰＬＸ細胞とＰＬＸ細胞の混合バッチの両方は生存率を改善した。しかし、本例においても、混合ＰＬＸ細胞が、良好な生存率を与えた。混合ＰＬＸは、本例においても、ＢＭ有核細胞および末梢血白血球百分率のパラメータによって示されるとおり、ＢＭ再増殖を引き起こすのにより効果的でもあった。
明確にするために、別々の実施形態の文脈に記載されている本発明の特定の特徴も、単一の実施形態において組み合わせて提供され得ることが理解される。逆に、簡潔にするために、単一の実施形態の文脈に記載されている本発明の様々な特徴も、別々にまたは任意の適切な部分的組み合わせで提供され得る。
本発明を、その特定の実施形態と併せて説明してきたが、多くの代替、修正および変形が当業者には明らかであろうことは明白である。したがって、添付の特許請求の範囲の趣旨および広い範囲内に入るそのような全ての代替、修正および変形を包含することが意図される。本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願は、個々の刊行物、特許または特許出願が、具体的に、かつ個別に参照により本明細書に組み込まれると示される場合と同じ程度に、本明細書に参照によりその全体が組み込まれる。参照により組み込まれる構成要素が、本明細書における開示と競合する場合には、本明細書が優先される。さらに、本願中の全ての参考文献の引用または同定は、そのような参考文献が、本発明の先行技術として利用可能であることを認めるものとして解釈されるべきではない。

Claims (13)

  1. 接着間質細胞を含む、放射線または化学療法に曝露された対象における腸損傷を軽減するための組成物であって、前記接着間質細胞が、筋肉注射により対象へ投与され、且つ、前記接着間質細胞が、三次元培養条件下で培養されたものである、組成物。
  2. 前記放射線または化学療法への曝露が進行中である、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記接着間質細胞の入手源が、胎盤、脂肪組織、または骨髄である、請求項１または２に記載の組成物。
  4. 前記三次元培養条件が、細胞増殖を支援する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
  5. 前記接着間質細胞が、分化なしでの、細胞増殖を支援する三次元培養条件下で、バイオリアクター中で培養された胎盤接着間質細胞である、請求項４に記載の組成物。
  6. 前記接着間質細胞の約６０％未満が、アイソタイプ対照と比較して、フローサイトメトリーによって検出される、マーカーＣＤ２００が陽性である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
  7. 前記接着間質細胞の約６０％未満が、アイソタイプ対照と比較して、免疫蛍光法によって検出される、マーカーＯＣＴ−４が陽性である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
  8. 前記接着間質細胞の少なくとも７０％が、胎児細胞である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
  9. 前記接着間質細胞が胎児細胞及び母方細胞の混合物である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
  10. 外因性造血幹細胞が前記対象に投与されない、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
  11. 第１の投与後約２日〜約２１日目に少なくとも１つの追加的な治療有効量の接着間質細胞を投与する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
  12. 少なくとも１つの追加的な治療有効量の投与が、筋肉注射によるものである、請求項１１に記載の組成物。
  13. 外因性造血幹細胞が、前記第１の治療有効量の投与のときに前記対象に投与されず、少なくとも１つの追加的な治療有効量が、マッチした外来性造血幹細胞の同定後に投与される、請求項１１または１２に記載の組成物。
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