TWI806051B - 生產類紅血球及/或紅血球之方法 - Google Patents

生產類紅血球及/或紅血球之方法 Download PDF

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Abstract

本發明提供一種生產類紅血球及/或紅血球之方法，其包含將造血幹細胞(HSC)或類紅血球與永生化間葉幹細胞(MSC)之群體或獲自該等永生化MSC之條件培養基一起培養，其中該等永生化MSC經存活基因遺傳工程化。亦提供一種製造用於輸血之血液製品之方法及用於增加血紅蛋白合成之方法。

Description

生產類紅血球及/或紅血球之方法
本發明係關於紅血球生產之領域。特定言之，包含至少一個存活基因之工程化幹細胞用於產生類紅血球及/或紅血球。
儘管輸血廣泛用於各種臨床療法，但臨床血源有限，且輸血用血的供應依賴於志願者獻血。生育率之逐步下降導致符合供體條件之人口逐漸減少，且預計全球將缺少血源供應(Transfusion 2010; 50:584-588)。此外，輸血傳染性疾病仍為重要問題。幸運的是，由於用於擴增細胞之培養基可自動更換，因此有可能獲得超出實驗室水準之大量目標細胞。
發現活體外大規模生產紅血球(RBC)之技術對於生產RBC之替代來源而言重要。生物反應器系統中之無飼養層培育使製造商能夠為大規模活體外細胞生成開發無異種、有成本效益的培養方案，其將為臨床應用提供巨大優勢(Tissue Engineering. Part C Methods 2011; 17:1131-1137, Biomaterials 2005; 26:7481-7503)。然而，未闡明去白血球過程後成熟紅細胞之總數或最終RBC去核率。在實際應用之前，應證明此等結果之再現性及可行性。
因此，治療應用非常需要大規模生產紅血球之方法。
本發明係關於提供適當微環境及基質，諸如間葉幹細胞(MSC)，以誘導紅血球生成及RBC去核。
在一個態樣中，本發明提供一種生產類紅血球及/或紅血球之方法，其包含將造血幹細胞或類紅血球與永生化間葉幹細胞(MSC)之群體或獲自永生化MSC之條件培養基一起培養，其中永生化MSC經存活基因遺傳工程化。
在一些實施例中，HSC或類紅血球之細胞計數比永生化MSC之細胞計數在以下範圍內：約100:1至約1:100、約80:1至約1:80、約70:1至約1:70、約60:1至約1:60、約50:1至約1:50、約40:1至約1:40、約30:1至約1:30、約20:1至約1:20、約18:1至約1:18、約16:1至約1:16、約14:1至約1:14、約12:1至約1:12、約10:1至約1:10、約10:1至約1:8、約10:1至約1:6、約10:1至約1:4、約10:1至約1:2、約10:1至約1:1。
在一些實施例中，HSC為CD34+ HSC。在另一態樣中，HSC較佳源自人類臍帶血。
在一些實施例中，存活基因為Akt基因或肝細胞生長因子(HGF)基因。較佳地，存活基因為Akt基因。
在一些實施例中，永生化MSC經人類端粒酶反轉錄酶(hTERT)永生化。
在一個實施例中，本文所述之間葉幹細胞為臍帶間葉幹細胞(UMSC)、脂肪源性間葉幹細胞(ADSC)或骨髓間葉幹細胞(BMSC)。
在一些實施例中，永生化MSC為CD146+ IGF1R+ 。
在一些實施例中，永生化MSC經低氧處理。
在一個實施例中，本文所述之方法包含藉由將HSC與永生化MSC或獲自永生化MSC之條件培養基一起培養來增強HSC增殖。在一些實施例中，將HSC與永生化MSC或獲自永生化MSC之條件培養基一起培養以增強HSC增殖係進行0.5至8天，諸如0.5天、1天、1.5天、2天、2.5天、3天、3.5天、4天、4.5天、5天、5.5天、6天、6.5天、7天、7.5天或8天；較佳2天至6天，諸如2天、2.5天、3天、3.5天、4天、4.5天、5天、5.5天或6天；更佳3天至5天，諸如3天、3.5天、4天、4.5天或5天。
在一些實施例中，該方法進一步包含將HSC與以下中之至少一者一起培養：幹細胞因子(SCF)、fms樣酪胺酸激酶3 (Flt-3)、介白素3 (IL-3)、維生素C及地塞米松。
在一個實施例中，本文所述之方法包含藉由將HSC與永生化MSC或獲自永生化MSC之條件培養基一起培養來誘導HSC分化為類紅血球。在一些實施例中，將HSC與永生化MSC或獲自永生化MSC之條件培養基一起培養以誘導HSC分化為類紅血球係進行5天至20天，諸如5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天或20天；較佳8天至16天，諸如8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天或16天；更佳10天至15天，諸如10天、11天、12天、13天、14天或15天。
在一些實施例中，該方法進一步包含將HSC與以下中之至少一者一起培養：SCF、紅血球生成素(EPO)、顆粒球-巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)、Flt-3、地塞米松、IL-3、維生素C及富血小板血漿(PRP)。
在一個實施例中，本文所述之方法包含藉由將類紅血球與永生化MSC或獲自永生化MSC之條件培養基一起培養來促進類紅血球之分化及成熟。在一些實施例中，將類紅血球與永生化MSC或獲自永生化MSC之條件培養基一起培養以促進類紅血球之分化及成熟係進行0.5至8天，諸如0.5天、1天、1.5天、2天、2.5天、3天、3.5天、4天、4.5天、5天、5.5天、6天、6.5天、7天、7.5天或8天；較佳2天至6天，諸如2天、2.5天、3天、3.5天、4天、4.5天、5天、5.5天或6天；更佳2天至5天，諸如2天、3天、4天或5天。
在一些實施例中，該方法進一步包含將類紅血球與以下中之至少一者一起培養：肝素、運鐵蛋白、SCF、EPO及維生素C。
在一些實施例中，用於培養HSC或類紅血球之培養基中SCF之濃度在以下範圍內：約10 ng/mL至約1,000 ng/mL；約20 ng/mL至約800 ng/mL；約30 ng/mL至約600 ng/mL；約40 ng/mL至約400 ng/mL；約50 ng/mL至約300 ng/mL；約60 ng/mL至約250 ng/mL；約80 ng/mL至約200 ng/mL；約80 ng/mL至約150 ng/mL。在一些實施例中，用於培養HSC或類紅血球之培養基中Flt3之濃度在以下範圍內：約10 ng/mL至約1,000 ng/mL；約20 ng/mL至約800 ng/mL；約30 ng/mL至約600 ng/mL；約40 ng/mL至約400 ng/mL；約50 ng/mL至約300 ng/mL；約60 ng/mL至約250 ng/mL；約80 ng/mL至約200 ng/mL；約80 ng/mL至約150 ng/mL。在一些實施例中，用於培養HSC或類紅血球之培養基中IL-3之濃度在以下範圍內：約1 ng/mL至約100 ng/mL；約2 ng/mL至約80 ng/mL；約4 ng/mL至約60 ng/mL；約6 ng/mL至約40 ng/mL；約8 ng/mL至約35 ng/mL；約10 ng/mL至約30 ng/mL；約12 ng/mL至約25 ng/mL；約15 ng/mL至約25 ng/mL。在一些實施例中，用於培養HSC或類紅血球之培養基中維生素C之濃度在以下範圍內：約5 μM至約200 μM；約8 μM至約150 μM；約10 μM至約120 μM；約15 μM至約100 μM；約20 μM至約80 μM；約25 μM至約60 μM；約25 μM至約40 μM；約25 μM至約35 μM。在一些實施例中，用於培養HSC或類紅血球之培養基中地塞米松之濃度在以下範圍內：約0.1 μM至約10 μM；約0.2 μM至約8 μM；約0.3 μM至約6 μM；約0.4 μM至約4 μM；約0.5 μM至約3 μM；約0.6 μM至約2 μM；約0.8 μM至約1.5 μM；約0.8 μM至約1.2 μM。在一些實施例中，用於培養HSC或類紅血球之培養基中EPO之濃度在以下範圍內：約0.1 IU/mL至約20 IU/mL；約0.2 IU/mL至約18 IU/mL；約0.5 IU/mL至約16 IU/mL；約0.8 IU/mL至約14 IU/mL；約1 IU/mL至約12 IU/mL；約2 IU/mL至約10 IU/mL；約3 IU/mL至約9 IU/mL；約4 IU/mL至約8 IU/mL。在一些實施例中，用於培養HSC或類紅血球之培養基中GM-CSF之濃度在以下範圍內：約1 ng/mL至約50 ng/mL；約2 ng/mL至約45 ng/mL；約4 ng/mL至約40 ng/mL；約6 ng/mL至約35 ng/mL；約8 ng/mL至約30 ng/mL；約10 ng/mL至約25 ng/mL；約12 ng/mL至約25 ng/mL；約13 ng/mL至約20 ng/mL。在一些實施例中，用於培養HSC或類紅血球之培養基中PRP之濃度在以下範圍內：約1 %至約100 %；約2 %至約80 %；約3 %至約60 %；約4 %至約40 %；約5 %至約35 %；約6 %至約30 %；約7 %至約20 %；約8 %至約15 %。在一些實施例中，用於培養HSC或類紅血球之培養基中肝素之濃度在以下範圍內：約0.1 U/mL至約20 U/mL；約0.2 U/mL至約18 U/mL；約0.5 U/mL至約16 U/mL；約0.8 U/mL至約14 U/mL；約1 U/mL至約12 U/mL；約2 U/mL至約10 U/mL；約3 U/mL至約9 U/mL；約4 U/mL至約8 U/mL。在一些實施例中，用於培養HSC或類紅血球之培養基中運鐵蛋白之濃度在以下範圍內：約10 μg/mL至約2,000 μg/mL；約50 μg/mL至約1,800 μg/mL；約100 μg/mL至約1,600 μg/mL；約200 μg/mL至約1,400 μg/mL；約300 μg/mL至約1,300 μg/mL；約40 μg/mL至約1,200 μg/mL；約500 μg/mL至約1,000 μg/mL；約600 μg/mL至約900 μg/mL。
在一個實施例中，本文所述之方法包含藉由將HSC與永生化MSC或獲自永生化MSC之條件培養基一起培養來增強HSC增殖；誘導HSC分化為類紅血球，其包含將HSC與永生化MSC或獲自永生化MSC之條件培養基一起培養；及藉由將類紅血球與永生化MSC或獲自永生化MSC之條件培養基一起培養來促進類紅血球之分化及成熟。
在一個態樣中，本發明提供一種製造用於輸血之血液製品的方法，其包含藉由使用如本文所述之方法生產類紅血球及/或紅血球。
在一個態樣中，本發明提供一種用於增加血紅蛋白合成之方法，其包含藉由使用如本文所述之方法生產類紅血球及/或紅血球。
在一些實施例中，血紅蛋白為成人血紅蛋白。
除非另外定義，否則本文中所使用之所有科學或技術術語具有與一般熟習本發明所屬技術者所理解相同的含義。一般熟習此項技術者可理解及使用類似或等效於本文中所描述之彼等的任何方法及材料來實踐本發明。
除非另外指示，否則本說明書及申請專利範圍中所用之表示成分數量、反應條件等之所有數字理解為在所有情況下皆經術語「約」修飾。因此，除非有相反指示，否則本發明之說明書及申請專利範圍中所闡述的數值參數為近似值且可視藉由本發明尋求之所需特性而變化。
術語「一(a/an)」應意謂本發明中所述之目標中之一者或多於一者。術語「及/或」意謂替代方案中之一者或兩者。術語「細胞(a cell)」或「細胞(the cell)」可包括複數個細胞。
如本文所用，「類紅血球」含有細胞核，直至細胞排出其細胞核且以無核紅血球(red blood cell/erythrocyte)形式進入循環。
術語「活體外」一般意謂活有機體外部，諸如在形成於有機體外部之人工環境中進行的實驗。術語「活體外」一般描述在活有機體外部進行之程序、測試及實驗。
如本文所用之術語「永生化」係指誘導、促進或實現細胞活力、細胞存活及/或細胞增殖。
如本文所用，術語「幹細胞」係指呈未分化或部分分化狀態之細胞，其具有自體更新特性且具有自然分化為更分化細胞類型之發育潛能，關於發育潛能無特定隱含含義(亦即，分化全能、多能、多潛能等)。自體更新意謂幹細胞能夠增殖且產生更多此類幹細胞，同時維持其發育潛能。因此，術語「幹細胞」係指在特定情況下具有分化為更特定或分化表型之發育潛能，且在某些情況下保留增殖而不實質上分化之能力的任何細胞亞群。
如本文所用，術語「源自」應理解為指示特定樣品或樣品組來源於指定物種，但未必直接獲自指定來源。
在細胞個體發生之情形下，形容詞「分化(differentiated)」或「分化(differentiating)」為相對術語。「分化細胞」為相比於比所比較之細胞，在發育途徑中進一步發展的細胞。因此，幹細胞可分化為譜系受限前驅體細胞(諸如HSC)，該等細胞轉而可進一步分化為途徑中之其他類型之前驅體細胞(諸如類紅血球)，且接著分化為末期分化細胞，在某些組織類型中起特徵性作用，且可或可不保留進一步增殖之能力。
術語細胞之「遺傳工程化(genetically engineered)」或「遺傳工程化(genetic engineering)」意指使用遺傳物質操縱基因以改變細胞中之基因複本及/或基因表現量。遺傳物質可呈DNA或RNA形式。遺傳物質可藉由包括病毒轉導及非病毒轉染之各種方式轉移至細胞中。在遺傳工程化之後，細胞中某些基因之表現量可永久或暫時改變。
術語「轉導(transduction)」或「轉導(transduce)」意謂使用病毒將遺傳物質遞送至細胞中，其中病毒可為整合或非整合病毒。本發明中所用之整合病毒可為慢病毒或反轉錄病毒。整合病毒允許將其編碼基因整合至經病毒粒子感染之經轉導細胞中。非整合病毒可為腺病毒或仙台病毒(Sendai virus)。本發明中亦可使用非病毒方法，諸如藉由將DNA或RNA物質轉染至細胞中。DNA物質可呈PiggyBac、微型環載體或附加型質體之形式。RNA物質可呈mRNA或miRNA之形式。
術語「表現載體」意謂將外源基因攜帶至細胞中以進行表現而不降解之試劑。本發明中之表現載體可為質體、病毒載體及人工染色體。
為誘導紅血球生成及RBC去核，重要的是準備適當微環境。近來，藉由在異種(鼠類)基質細胞上共培養之CB源性CD34+ 細胞來大規模擴增RBC (Nat Biotechnol . 2005 ; 23 : 69 - 74 )。然而，對於人類應用，應建立經人類基質細胞替換之動物源性細胞。相比於無飼養細胞之液體培養物，在hTERT基質共培養系統中觀測到CD34+ 細胞擴增產率及紅血球母細胞去核率顯著增加(Nat Biotechnol . 2006 ; 24 : 1255 - 6 )。
本發明使用經存活基因修飾之永生化MSC來最佳化培養策略，以產生用於自CB CD34+ 細胞離體大規模產生人類紅血球之連續三相共培養系統。因此，本發明提供一種生產類紅血球及/或紅血球之方法，其包含將造血幹細胞或類紅血球與永生化間葉幹細胞(MSC)之群體或獲自永生化MSC之條件培養基一起培養，其中永生化MSC經存活基因遺傳工程化。
本發明中所用之間葉幹細胞可獲自不同來源，較佳獲自臍帶、脂肪組織或骨髓。根據不同來源，間葉幹細胞為臍帶間葉幹細胞(UMSC)、脂肪源性間葉幹細胞(ADSC)或骨髓間葉幹細胞(BMSC)。在本發明之一些實施例中，MSC自臍帶分離及純化，且稱為「臍帶MSC」或「UMSC」。在一些實施例中，已確定本發明中之UMSC表現與自其他本體分離之MSC相同的表面標記選擇，且展現可比活性。
根據本發明之永生化MSC經修飾以表現Akt或HGF。如本文所用，本發明中之術語「經修飾以表現」係指將外源基因或基因片段轉移至間葉幹細胞中以使得其可表現外源基因或基因片段。較佳地，此修飾不改變永生化MSC之分化潛能。在另一態樣中，此修飾較佳為穩定修飾，且表現可為持續性或誘導性的。根據本發明之永生化MSC經修飾以表現Akt或HGF且仍具有與無Akt或HGF轉導之常用永生化MSC或正常MSC相似的多能分化潛能，諸如但不限於脂肪生成、軟骨生成、成骨及血管形成。
蛋白激酶B (PKB)，亦稱為Akt，為絲胺酸/蘇胺酸特異性蛋白激酶，其在多種細胞過程中起關鍵作用，諸如葡萄糖代謝、細胞凋亡、細胞增殖、轉錄及細胞遷移。Akt藉由結合及調節許多下游效應子，例如核因子-κB、Bcl-2家族蛋白、主溶酶體調節劑TFEB及鼠類雙微體2 (MDM2)來調節細胞存活及代謝。Akt可直接及間接地促進生長因子介導之細胞存活。已發現移植細胞之低氧預處理(移植前短暫培育細胞)經由活化Akt 依賴性路徑來保護人類腦內皮免於缺血性凋亡(Am J Transl Res. 2017; 9: 664-673)。
肝細胞生長因子(HGF)或分散因子(SF)為旁分泌細胞生長、活動性及形態發生因子。其由間葉細胞分泌且主要靶向及作用於上皮細胞及內皮細胞，且亦作用於造血前驅細胞及T細胞。肝細胞生長因子藉由在結合於原致癌c-Met受體之後活化酪胺酸激酶信號傳導級聯來調節細胞生長、細胞活動性及形態發生。肝細胞生長因子由間葉細胞分泌且在主要來源於上皮之細胞上充當多官能細胞介素。
用Akt或HGF修飾永生化MSC之方式不受限制。較佳地，Akt或HGF經轉座子或慢病毒轉導；更佳地，轉座子為piggyBac轉座子。結果展示piggyBac轉座子可有效且穩定地轉染MSC，且piggyBac之基因修飾不改變MSC之DNA複本數或配置。
在一些實施例中，本文所述之任何方法中所用之永生化幹細胞包含誘導細胞永生性之試劑。
在一些實施例中，永生化細胞係藉由用永生化試劑處理細胞來產生。在一些實施例中，永生化試劑包含表現或過度表現誘導細胞永生性之多肽的轉殖基因。在一些實施例中，永生化試劑包含誘導細胞永生性之多肽。在一些實施例中，誘導細胞永生性之多肽為致癌肽。致癌肽為誘導細胞永生性之任何適合之類別。舉例而言，在某些實施例中，誘導細胞永生性之適合之致癌肽為：生長因子及/或有絲分裂原(例如PDGF源性生長因子，諸如c-Sis)；受體酪胺酸激酶，特定言之組成型活性受體酪胺酸激酶(例如表皮生長因子受體(EGFR)、凝血細胞源性生長因子受體(PDGFR)、血管內皮生長因子受體(VEGFR)及HER2/neu)；細胞質酪胺酸激酶(例如酪胺酸激酶之Src家族、Syk-ZAP-70家族及BTK家族)；細胞質絲胺酸/蘇胺酸激酶及其調節次單位(例如Raf激酶、細胞週期蛋白依賴性激酶、Akt家族成員)；調節性GTP酶(例如Ras蛋白)；轉錄因子(例如Myc及HIF-1a)；端粒酶反轉錄酶(例如TERT或hTERT)；及/或活化其他致癌肽之因子(例如細胞週期蛋白，包括細胞週期蛋白A、B、D及/或E，諸如細胞週期蛋白D1及D3)。在某些實施例中，腫瘤肽為Myc、HIF-1a、Notch-1、Akt、hTERT或細胞週期蛋白。在一些實施例中，腫瘤肽為誘導細胞活力、細胞存活及/或細胞增殖之任何致癌肽的功能片段、同源物或類似物，例如Myc、HIF-1a、Notch-1、Akt, hTERT或細胞週期蛋白，較佳hTERT之功能片段、同源物或類似物。
本發明之永生化MSC含有包含Akt或HGF基因之表現載體。除了Akt或HGF之序列以外，本發明之載體亦包含一或多個用於調節本發明之多核苷酸之表現的控制序列。經分離多核苷酸在其插入至載體中之前的操縱可視所用表現載體而為所需或必需的。利用重組DNA方法修飾多核苷酸及核酸序列之技術為此項技術中熟知的。在一些實施例中，控制序列尤其包括啟動子、前導序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、信號肽序列及轉錄終止子。在一些實施例中，適合之啟動子係基於宿主細胞選擇來選擇。
本發明之重組表現載體連同一或多個表現調節區，諸如啟動子及終止子、複製起點等一起揭示，此視其欲引入至之宿主的類型而定。組成型啟動子之非限制性實例包括SFFV、CMV、PKG、MDNU3、SV40、Ef1a、UBC及CAGG。
本文所述之各種核酸及控制序列接合在一起以產生重組表現載體，其包括一或多個方便的限制位點，允許在此類位點插入或取代本發明之多核苷酸。或者，在一些實施例中，本發明之多核苷酸藉由將多核苷酸或包含該序列之核酸構築體插入至用於表現之適當載體中來表現。在涉及表現載體之產生的一些實施例中，編碼序列位於載體中以使得編碼序列與用於表現之適當控制序列可操作地連接。重組表現載體可為任何適合之載體(例如質體或病毒)，其可適宜地經受重組DNA程序且引起本發明之多核苷酸之表現。載體之選擇將通常視載體與其中引入載體之宿主細胞的相容性而定。載體可為線性或閉合環狀質體。在一個實施例中，載體為病毒載體。病毒載體之實例包括反轉錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體、α病毒載體及其類似物。在某一實施例中，病毒載體為慢病毒載體。慢病毒載體係基於或源自致癌反轉錄病毒(含有MLV之反轉錄病毒亞群)及慢病毒(含有HIV之反轉錄病毒亞群)。此類病毒之實例包括但不限於人類免疫缺乏病毒(HIV)、馬感染性貧血病毒(EIAV)、猿猴免疫缺乏病毒(SIV)及貓免疫缺乏病毒(FIV)。或者，經考慮可使用其他反轉錄病毒作為載體主鏈之基礎，諸如鼠類白血病病毒(MLV)。
在一些實施例中，已在各種分化分析中測試本發明之永生化MSC以確定其與自哺乳動物身體之其他位置分離之習知MSC的相容性。分化分析包括生脂分化、成骨分化及軟骨形成分化。在一些實施例中，分化分析進一步包括神經元細胞分化。
在本發明之一些實施例中，應用經Akt修飾之hTERT-MSC來最佳化培養策略，以產生具有hTERT-MSC-Akt之連續三相共培養系統，用於自CB CD34+ 細胞離體大規模產生人類紅血球。為誘導紅血球生成及RBC去核，重要的是準備具有足夠細胞介素補充劑及基質(諸如間葉幹細胞(MSC))的適當微環境。
較佳地，如本發明中所述之永生化MSC經低氧處理。在本發明之一個實施例中，相比於無Akt之永生化MSC，經Akt修飾之永生化MSC之低氧預處理在條件培養基中誘導更多VEGF分泌。
在本發明之一個實施例中，經由與MSC共培養系統或以臍帶血源性CD34+ HSC為起始物之衍生條件培養基的組合液體培養來離體擴增類紅血球，在類紅血球增殖及分化條件下培育超過25天，其在最佳條件下在25天內產生大於106 -107 倍擴增。均質類紅血球係藉由細胞形態及流動式細胞測量術表徵。此外，藉由添加條件培養基或與攜有Akt (hTERT-ADSC-Akt)之CD146+ IGF1R+ 永生化MSC共培養來改良終末類紅血球成熟。培養之類紅血球經歷多個成熟事件，包括大小減小、血型糖蛋白A (CD235a)表現增加及核濃縮，其導致多達80%或更多細胞中之固縮核被擠出。重要的是，其具有在進一步成熟後表現成人確定性β -血球蛋白鏈(HbA)之能力。臍帶血分化紅血球(RBC)之氧平衡曲線與正常RBC相當。自臍帶血產生之類紅血球及RBC之高數目及純度使得此方法適用於為未來生產可用於輸血之RBC提供基礎。
在一個實施例中，類紅血球來自活體外或離體擴增及分化之HSC。在一些實施例中，類紅血球包含造血前驅體細胞，例如CD34+ 細胞。
在一個實施例中，類紅血球獲自血液。獲自血液或活體外或離體擴增及分化之HSC的類紅血球均可應用於進一步生產紅血球。
在某些實施例中，永生化HSC作為永生化ESC株成功地連續維持。
在一個實施例中，本文所述之方法包含藉由將HSC與永生化MSC或獲自永生化MSC之條件培養基一起培養來增強HSC增殖的第一階段。在一些實施例中，方法之第一階段進一步包含將HSC與以下中之至少一者一起培養：幹細胞因子(SCF)、fms樣酪胺酸激酶3 (Flt-3)、介白素3 (IL-3)、維生素C及地塞米松。
在一個實施例中，本文所述之方法包含藉由將HSC與永生化MSC或獲自永生化MSC之條件培養基一起培養來誘導HSC分化為類紅血球之第二階段。在一些實施例中，方法之第二階段進一步包含將HSC與以下中之至少一者一起培養：SCF、紅血球生成素(EPO)、顆粒球-巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)、Flt-3、地塞米松、IL-3、維生素C及富血小板血漿(PRP)。
在一個實施例中，本文所述之方法包含藉由將類紅血球與永生化MSC或獲自永生化MSC之條件培養基一起培養來促進類紅血球之分化及成熟之第三階段。在一些實施例中，方法之第三階段進一步包含將類紅血球與以下中之至少一者一起培養：肝素、運鐵蛋白、SCF、EPO及維生素C。
在本發明之一個實施例中，經由與MSC共培養系統或以臍帶血源性CD34+ HSC為起始物之衍生條件培養基的組合液體培養來離體擴增類紅血球，在類紅血球增殖及分化條件下培育超過25天，其在最佳條件下在25天內產生大於106 -107 倍擴增。均質類紅血球係藉由細胞形態及流動式細胞測量術表徵。此外，藉由添加條件培養基或與攜有Akt (hTERT-ADSC-Akt)之CD146+ IGF1R+ 永生化MSC共培養來改良終末類紅血球成熟。培養之類紅血球經歷多個成熟事件，包括大小減小、血型糖蛋白A (CD235a)表現增加及核濃縮，其導致多達超過80%之細胞中之固縮核被擠出。重要的是，其具有在進一步成熟後表現成人確定性β-血球蛋白鏈(HbA)之能力。臍帶血分化紅血球(RBC)之氧平衡曲線與正常RBC相當。自臍帶血產生之類紅血球及RBC之高數目及純度使得此方法適用於為未來生產可用於輸血之RBC提供基礎。
在一個實施例中，類紅血球來自活體外或離體擴增及分化之HSC。在一些實施例中，類紅血球包含造血前驅體細胞，例如CD34+ 細胞。
在一個實施例中，類紅血球獲自血液。獲自血液或活體外或離體擴增及分化之HSC的類紅血球均可應用於進一步生產紅血球。
在某些實施例中，永生化HSC成功地連續維持，以成為建立永生化ESC株。
如本文所用之條件培養基係指以培養永生化MSC為條件之培養基。此類條件培養基包含由永生化MSC分泌之分子，包括獨特基因產物。此類條件培養基及其中所包含之任何分子(尤其包括蛋白質或多肽)之組合可用於治療疾病。其可用於補充永生化MSC之活性，或替代永生化MSC，例如出於生產類紅血球及/或紅血球之目的。
在一個態樣中，本發明提供一種製造用於輸血之血液製品的方法，其包含如本文所述之生產類紅血球及/或紅血球之方法。
在一個態樣中，本發明提供一種用於增加血紅蛋白合成之方法，其包含如本文所述之生產類紅血球及/或紅血球之方法。
應理解，若在本文中引用任何先前技術公開案，則該引用不構成對該公開案形成此項技術中之公共常識之部分的承認。
儘管已出於清楚理解之目的藉助於說明及實例相當詳細地提供了揭示內容，但對於熟習此項技術者將顯而易見，可在不脫離本發明之精神或範疇的情況下實踐各種改變及修改。因此，前述描述及實例不應視為限制性的。 實例
方法及材料：
CD34 + 細胞之分離及收集
在獲得經中國醫科大學機構審查委員會(臺灣臺中(Taichung, Taiwan))批准之書面知情同意書之後，健康成年志願者提供來自正常足月分娩的臍帶血(CB)樣品(O型)。為獲得CB CD34+ 細胞，吾人藉由聚蔗糖-泛影鈉(SIGMA®)離心自CB分離低密度單核細胞，且接著使用Mini-MACS管柱(MILTENYI®)經由超磁微珠選擇自單核細胞純化CB CD34+細胞。分離之CD34+ 細胞之純度在90%至99%範圍內，如藉由流動式細胞測量術使用與藻紅素(PE)結合之抗人類CD34 mAb (BD®)所測定。
原代 UMSC 之製備、分離及表徵
經台中的中國醫科大學醫院機構審查委員會(IRB)批准之所收集人類臍帶組織用不含Ca2 + 及Mg2 + 之PBS (DPBS，LIFE TECHNOLOGY®)洗滌三次。用剪刀沿中線方向對其進行機械切割，且臍動脈、靜脈及輪廓膜(outlining membrane)之血管與花頓氏膠(Wharton's jelly，WJ) 分離。接著將膠凍內容物廣泛切成小於0.5 cm3 的小塊，用1型膠原酶(SIGMA®, St Louis, USA)處理，且在37℃下在95%空氣/5% CO2 加濕氛圍中培育3小時。接著在37℃下在95%空氣/5% CO2 加濕氛圍中於含有10%胎牛血清(FCS)及抗生素之DMEM中培養外植體。使其保持5-7天不受干擾以允許細胞自外植體遷移。臍帶源性間葉幹細胞(UMSC)之細胞形態在4-8個繼代後在培養物中變為均勻的紡錘形，且來自WJ之細胞之特定表面分子由流式細胞分析表徵。細胞用含2 mM EDTA之PBS分離，用含有2% BSA及0.1%疊氮化鈉之PBS(SIGMA®)洗滌，且與結合於以下者之各別抗體一起培育：異硫氰酸螢光素(FITC)或藻紅素(PE)，包括CD13、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD166、CD49b、CD1q、CD3、CD10、CD14、CD31、CD34、CD45、CD49d、CD56、CD117、HLA-ABC及HLA-DR (BD®，PHARMINGEN®)。此後，使用Becton Dickinson流式細胞儀(BD®)分析細胞。
質體構築
藉由特異性限制酶連接子(EcoR1、Nhe1、BamH1及Not1)將來自Akt質體之Akt cDNA (0.1 µg) (pCMV6-myc-DDK-Akt，ORIGENE®)轉移至pIRES (CLONTECH®)或pSF-CMV-CMV-SbfI (OXFORD GENETICS®)中，以構建為pSF-Akt-GFP之構築體。
用於穩定細胞株之 piggyBac 轉座子系統的構築
將含有多個選殖位點(MCS)、piggyBac末端重複序列(PB-TR)、核心絕緣子(CI)及嘌呤黴素選擇標記(BSD) (與人類EF1α驅動之RFP融合)之piggyBac載體pPB-CMV-MCS-EF1α-RedPuro用作基載體(SYSTEM BIOSCIENCES®)。含有Akt (來自pSF-Akt)之DNA片段經PCR擴增且次選殖至pPB-CMV-MCS-EF1α-RedPuro載體中，在EF1α之編碼區前面。關於載體構築體(pPB-Akt)之詳細資訊展示於圖 1B 中。為產生hTERT-ADSC-Akt穩定細胞，藉由電穿孔(AMAXA NUCLEOFECTOR II®，Lonza)用piggyBac轉座酶表現載體(SYSTEM BIOSCIENCES®)將上述pPB-Akt質體共轉染至hTERT-ADSC (SCRC-4000™，ATCC)中。在嘌呤黴素存在下選擇經穩定轉染之細胞。
總蛋白提取、西方墨點法及 ELISA
將細胞溶解於含有320 mM蔗糖、5 mM HEPES、1 μg/mL抗纖維蛋白溶酶肽及1 μg/mL抑肽酶之緩衝液中。溶解物以13,000g 離心15分鐘。將所得集結粒再懸浮於樣品緩衝液(62.5 mM Tris-HCl、10%甘油、2% SDS、0.1%溴酚藍及50 mM DTT)中且進行SDS-聚丙烯醯胺凝膠(4-12%)電泳。接著將凝膠轉移至Hybond-P耐綸膜。接著與經適當稀釋之抗體:Akt (1:200，NOVUS BIOLOGICALS®)一起培育。根據製造商之方案，分別對各抗體進行膜封閉、一級及二級抗體培育以及化學發光反應。使用Kodak® Digital Science 1D影像分析系統(EASTMAN KODAK®)來量測各帶之強度。另外，根據製造商說明書量測培養基中VEGF、HGF (Quantikine ELISA套組，R&D®)之總量。使用分光光度計(MOLECULAR DEVICES®)量測光學密度，且用程式SOFTmax (MOLECULAR DEVICES®)產生標準曲線。
活體外分化分析
對於脂肪細胞分化，將細胞在含有低葡萄糖DMEM、1× ITS (SIGMA®)、1 mg/ml LA-BSA(SIGMA®)、1 mM氫化可體松(SIGMA)、60 mM吲哚美辛(SIGMA®)、0.5 mM異丁基甲基黃嘌呤(SIGMA®)及10%馬血清(INVITROGEN®)之培養基中培養。為評估生脂分化，將細胞在室溫下用0.3%油紅O (SIGMA®)作為細胞內脂質累積之指示劑染色10分鐘且用蘇木精複染。對於軟骨細胞分化，將細胞在含有90%高葡萄糖DMEM、10% FBS、1× ITS、1 mg/ml LABSA、50 nM地塞米松及60 pM轉型生長因子-β1 (TGF-b1) (R&D SYSTEMS®)之培養基中培養。藉由施加0.5%艾爾遜藍(Alcian Blue) 8GX用於富蛋白聚糖軟骨基質及1%天狼星紅(Sirius red) F3B用於膠原基質來進行艾爾遜藍/天狼星紅染色(SIGMA®)。在含有10% FCS、100 U/ml青黴素、100 mg/ml鏈黴素、50 mg/ml L-抗壞血酸2-磷酸、10 mM b-甘油磷酸及100 nM地塞米松之高葡萄糖DMEM中生長之APSC匯合單層培養物中進行成骨分化。使用茜素紅S染色(1%)測定成骨以偵測鈣礦化。
製備 MSC 源性條件培養基
在培養燒瓶中使CD146+ IGF1R+ hTERT-ADSC-Akt (1×106 )生長至80-90%匯合度。接著用10 mL無血清CellGenix SCGM (CELLGENIX®)調節細胞。在24小時之後收集條件培養基，且用0.2 mm針筒過濾器(THERMO FISHER®)滅菌。將製備之條件培養基保持在-80℃下直至使用。
低氧程序
將在37℃下在5% CO2 加濕培育箱中培養之細胞在常氧(21% O2 )或各種低氧條件(1%、3%及5% O2 )在不同時間點(24小時、48小時或72小時)進行處理。在配備有O2 探針以調節N2 氣體含量之雙氣體培育箱(JOUAN INC, Winchester, Virginia)中培養低氧培養物。使用錐蟲藍拒染(trypan blue exclusion)分析來評估細胞數目及活力。
細胞介素陣列
使用補充有蛋白酶及磷酸酶抑制劑混合液(INVITAGEN)之溶解緩衝液來提取全蛋白。使用人類細胞介素陣列組(R&D SYSTEMS®)，根據製造商說明書測試100 mg外泌體蛋白之細胞介素含量。簡言之，將外泌體溶解物與偵測抗體混合液混合且與含有40種不同抗細胞介素捕捉抗體之膜一起在4℃下培育隔夜。在與抗生蛋白鏈菌素-HRP一起培育之後，將膜與化學發光受質一起培育且暴露於X射線膜。使用ImageJ 1.47軟體定量蛋白質之像素密度。
自臍帶血 ( CB ) 收集及分離 CD34 + 細胞
在中國醫科大學醫院中收集臍帶CB (CB)樣品(O型)。該研究經醫院之倫理委員會審查委員會(IRB)批准。使用Mini-MACS管柱(MILTENYI®)經由超磁微珠結合抗CD34 mAb選擇來進行自CB分離CD34+細胞。藉由流動式細胞測量術(BD®)測定分離之CD34+ 細胞的純度。
CB CD34 + 細胞在無細胞系統或在 hTERT - ADSC - Akt 上之培育 ( 第一階段 )
為了在第一階段培養(第1-4天)中自CB CD34+ 細胞擴增HSC，在37℃下在5% CO2 中將CB CD34+ 細胞(1×105 個/毫升)接種於具有條件培養基之無細胞系統中，該條件培養基已塗鋪於具有10 mL無血清SCGM (CELLGENIX®)之75 cm2 燒瓶(CORNING®)中，該SCGM含有白蛋白及胰島素，補充有100 ng/mL重組人類幹細胞因子(SCF，GIBCO®)、1 µM地塞米松(Dex，SIGMA®)、30 µM維生素C (Vit-C，SIGMA®)及1 ng/mL重組人類介白素-3 (IL-3，GIBCO®)。每2天部分補充培養基。
培育 HSC 以在 hTERT - ADSC - Akt 上擴增及分化類紅血球 ( 第二及第三階段 )
在第8天，為進行紅血球母細胞擴增，將細胞(1至2×106 個細胞/毫升)在75 cm2 燒瓶(CORNING®)或Hyperflask (CORNING®)中維持於CellGenix SCGM (CELLGENIX®)中12-14天，CellGenix SCGM具有/不具有hTERT-ADSC-Akt源性條件培養基且補充有100 ng/mL重組人類幹細胞因子(SCF，GIBCO®)、6 U/mL重組人類紅血球生成素(EPO，SIGMA®)、1 ng/mL IL-3 (GIBCO®)、30 µM維生素C (Vit-C，SIGMA®)、5%富血小板血漿(PRP，AVENTACELL®)、15 ng/mL GM-CSF (GIBCO®)、100 ng/mL Flt3 (GIBCO®)及1 µM地塞米松(SIGMA®) (第二階段)。隨後，將分化及去核(第三階段)之紅血球母細胞接種於單層CD146+ IGF1R+ hTERT-ADSC-Akt (1×106 )上以在再新(一半)分化培養基中進行誘導，該分化培養基含有補充有EPO (10 U/mL)、SCF (100 ng/mL)、運鐵蛋白(700 μg/ml，SIGMA®)、30 µM維生素C (Vit-C，SIGMA®)及肝素(5 U/mL，SIGMA®)之CellGenix SCGM (CELLGENIX®)，以進行3天分化。為進行白血球過濾，接著使用60 ml去白血球過濾器(Immuguard III-RC，TERUMO®)純化經培養細胞。過濾後，將過濾器洗滌2次且用25 mL CellGenix SCGM (CELLGENIX®)再懸浮。將細胞在1600 rpm下離心5分鐘以便獲得壓積的RBC。如先前所述，收集培養之細胞且在4℃下儲存於基於檸檬酸磷酸右旋糖腺嘌呤(CPDA-1)防腐劑的溶液中4週。
流動式細胞測量術
為分析細胞表面標記表現，細胞用含2 mM EDTA之PBS分離，用含有BSA (2%)及疊氮化鈉(0.1%)之PBS洗滌，且接著與結合於異硫氰酸螢光素(FITC)或藻紅素(PE)之各別抗體一起培育直至分析。作為對照，細胞用小鼠IgG1同型對照抗體染色。用於流動式細胞測量術之針對CD34、CD36、CD45、CD71、CD146、IGF1R及CD235a之抗體係購自BD Biosciences。使用FACScan (BD®)與CellQuest Analysis (BD BIOSCIENCES®)及FlowJo軟體v.8.8 (TREESTAR Inc.)分析細胞。結果表示為陽性染色細胞相對於總細胞數目之百分比。為定量比較表面蛋白質表現，各樣品之螢光強度呈現為中值螢光強度(MFI)。核用NucRed Live 647 (NucRed，INVITROGEN®)染色。在第18-21天自CD235a+ /NucRed- 部分計算去核率。使用FACScan (BD®)與CellQuest Analysis (BD BIOSCIENCES®)及FlowJo v.8.8 (TREESTAR®)分析資料。
經培養細胞之細胞計數及形態分析
分別藉由自動細胞計數器Z1 (BECKMAN COULTER®)及Wright-Giemsa染色(SIGMA®)來評估細胞數目及形態。
血紅蛋白含量偵測及氧解離曲線
來自健康志願者之經培養細胞及RBC的血紅蛋白(Hb)含量係使用德氏試劑(Drabkin's reagent) (SIGMA®)在540 nm處光度定量。為藉由流動式細胞測量術量測血紅蛋白狀態，將細胞固定、透化且用胎兒血紅蛋白-FITC (Hb-F，BD®)、血紅蛋白β-PE (Hb-β，Santa Cruz)標記。使用Hemox-Analyzer (TCS SCIENTIFIC CORP)來量測Hb於RBC中之氧解離曲線。
反轉錄定量聚合酶鏈反應 ( RT - qPCR )
收集經培養RBC且評估以確定ε-血球蛋白、γ-血球蛋白、β-血球蛋白、ζ-血球蛋白及α-血球蛋白之RNA表現量。使用RNeasy微型套組(QIAGEN®)分離總RNA，且Superscript 3 First-strand for RT-PCR Synthesis (LIFE TECHNOLOGIES®)用於獲得互補DNA (cDNA)。使用基因特異性引子及探針在Mx3000P (AGILENT TECHNOLOGIES®)中進行定量PCR分析。
藉由 HPLC 之 血紅蛋白 ( Hb ) 分析
為確定Hb A及F之比例，藉由陽離子交換TSK凝膠G7 HSi管柱(SIGMA®)上之高效液相層析(HPLC)在610 nm處光度量測紅血球母細胞溶解物、CD34源性RBC及CB。使用Bio-Rad Variant II雙程式(BIO-RAD LABORATORIES®)根據製造商說明書對洗滌之細胞集結粒進行分析。
活體內小鼠研究
使用購自臺灣國家實驗動物中心(National Laboratory Animal Center, Taiwan)之八週齡NOD/SCID或NSG小鼠。所有動物實驗均根據經中國醫科大學動物委員會批准之機構指南進行。在培養RBC (cRBC)注射之前，對小鼠靜脈內注射CL2MDP-脂質體(FORMUMAX®)兩次(第-3天及第1天)以耗盡巨噬細胞。將經CFSE (LIFE TECHNOLOGIES®)標記之cRBC (1.5×108 個)或成人周邊RBC (pRBC) (1.5×108 個)注射至小鼠之股靜脈中。在接種後10、20、40、60、120、240、480及720分鐘，自眶後靜脈穿刺抽吸NOD/SCID小鼠之肝素化周邊血液，且此後每天一次，持續3-5天。細胞經計數且用抗人類CD71、抗人類CD235a及NucRed Live 647核酸染料(NUCRED®)進行雙重染色，且藉由流動式細胞測量術進行分析。亦對非CL2MDP-脂質體治療之小鼠(對照)輸血且分析以評估鼠類巨噬細胞對接種細胞之影響。
實例 1 ： 用於自造血幹細胞擴增人類紅血球之培養方案之最佳化
使用常規培養基配方開發了三階段方案，用於自臍帶血(CB) CD34+ 細胞離體擴增及分化人類紅血球。
為了分離造血幹細胞，收集用於CD34+ 選擇之CB樣品體積為95±7.8 mL (n=8)。分離之CD34+ 細胞之純度及細胞計數為95.5±2.1%及3.1±0.3×106 。藉由7-胺基放線菌素D (7-AAD)評估之CD34+ 細胞活力為97.6±0.4%。
CD34+ 細胞之細胞計數與永生化MSC (hTERT-ADSC-Akt或hTERT-ADSC)之細胞計數之比為約10:1。
為了展示hTERT-ADSC-Akt之優勢及幹細胞自體更新潛力，脂肪細胞、軟骨細胞及骨細胞之間充質分化在hTERT-ADSC與hTERT-ADSC-Akt之間相同(圖 1A )。相比於hTERT-ADSC，在hTERT-ADSC-Akt中注意到Akt及p-Akt之表現顯著增加(圖 1B )。重要的是，hTERT-ADSC-Akt組中存在的CD146+ IGF1R+ 上之幹性表面標記的水準增強(圖 1B )。一致地，根據ELISA，相比於hTERT-ADSC，hTERT-ADSC-Akt之低氧預處理在條件培養基中誘導更多VEGF分泌(圖 1C )。
為了證明條件培養基在步驟1 (第1天至第4天)中增強了細胞增殖，將分離之CD34+ 細胞擴增4天以增加CD34+ 造血幹細胞(HSC)之量。製備具有hTERT-ADSC-Akt條件培養基之CellGenix SCGM (CELLGENIX®)以補充100 ng/ml之SCF、100 ng/mL之Flt3、20 ng/ml之IL-3、30 µM之Vit-C及1 µM之Dex，與無條件培養基之情況相比，其誘導了高約30±1.6倍之擴增(圖 1D )。
為了在步驟2 (第5天至第18天)中誘導擴增的HSC分化為類紅血球譜系，吾人優化了生長因子之組合及濃度，具有或不具有hTERT-ADSC-Akt條件培養基，用於離體產生人類類紅血球先驅細胞，其包括補充有100 ng/ml之SCF、6 IU/ml之EPO、10 ng/mL之GM-CSF、100 ng/mL之Flt3及1 µM之地塞米松以及20 ng/ml之IL-3的CellGenix SCGM (CELLGENIX®)，用於類紅血球分化(圖 1D )。重要的是，添加5%人類富血小板血漿(PRP)顯著提高細胞產量。
為了在步驟3 (第19天至第21天)中促進經培養類紅血球進一步分化及成熟，將與hTERT-ADSC-Akt共培養之經培養類紅血球在補充有肝素(5 IU/ml)及運鐵蛋白(700 µg/ml)、SCF (100 ng/ml)及EPO (10 IU/ml)之CellGenix SCGM (CELLGENIX®)中培育，以獲得更高水準之總紅血球數目(圖 1D )。SCF、EPO、GM-CSF、Flt3及IL-3與5% PRP展現經培養類紅血球之顯著擴增。
實例 2 ：自 CD34 + 細胞放大擴增人類紅血球
藉由上文所提及之最佳化策略在Hyperflask培養系統(CORNING®)中進行自CB CD34+ 細胞以工業規模離體產生紅血球生成。藉由使用約100-120公升培養基，1×105 個細胞/毫升CBCD34+ 能夠以55.0%去核率產生2.9×1011 個總紅血球(RBC)。CD34+ 細胞之細胞計數與永生化MSC之細胞計數之比為約10:1。在初始培養期(步驟1，第1天至第4天)內緩慢擴增之總細胞之離體放大倍數展示於成長曲線中(圖 2A )。接著，在步驟2 (第5天至第18天)中，細胞維持高增殖率至指數生長期(圖 2A )。截至第12天及第15天，細胞分別可擴增至約2.9×106 倍及8.9×107 倍增加。最後，在步驟3中，總細胞產生得到緩慢擴增率且截至第21-22天達到約2×108 倍(1.4-2.53 108 倍)之平穩段。相比於無條件培養基之情況，在有hTERT-ADSC-Akt條件培養基之情況下投與之培養方案中展現細胞產量的更多擴增(圖 2A )。若維持培養，則細胞生長將關於自第22-23天觀測到的細胞分化及死亡而減少(資料未示出)。
藉由Wright-Giemsa細胞染色及流動式細胞分析對細胞自幹細胞增殖及分化為類紅血球譜系進行形態檢查。最初，如所預期，CD71及CD235a之類紅血球標記的表現較低，而高水準之HSC標記(CD34及CD45)由分離之CD34+ 細胞表現(第0天) (圖 2B - 圖 2C )。逐漸地，CD34+ 之百分比在21天分化之後顯著降低至約1%-2% (圖 2B - 圖 2C )。相反，CD235a之表現逐漸增加且在細胞分化之後維持高水準(圖 2B - 圖 2C )。在分化細胞中，CD71之表現在第8天快速增加至峰值，且隨後在分化過程之後連續下調(圖 2B - 圖 2C )。最後，完全分化細胞在第21天強烈表現CD235a (90.1%±6.2%)且微弱表現CD71 (54.0%±7.2%) (圖 2B - 圖 2C )。藉由Wright-Giemsa染色進行之細胞染色依次顯示細胞形態自最初的前紅血球母細胞變為去核RBC；在此群體中注意到類紅血球表型(圖 2D )。
實例 3 ：類紅血球增殖及成熟之增強
分化細胞之血紅蛋白含量自第18至21天逐漸增加(自17.6±2.2 pg/細胞至30.3±1.8 pg/細胞)，以達到大致正常人類RBC之含量(27-33 pg/細胞) (圖 3A )。此外，細胞分化之後增加之血紅蛋白合成使得細胞集結粒之顏色在離心之後自白色-淡粉色變為紅色(圖 3B )。
在未成熟階段至第11天期間注意到良好細胞形態，但自第18天開始觀測到死細胞。最終培養日之細胞活力展示完整細胞膜(圖 3C )。相比於無共培養，紅血球與hTERT-ADSC-Akt共培養顯著增加了根據流動式細胞測量術之去核RBC率(CD235a+ /NucRed- )，直至第21天之平均值為54-65% (圖 3D )。
實例 4 ： 較高含量的攜氧能力增強之成人血紅蛋白
為了藉由流動式細胞測量術檢查血紅蛋白亞型，儘管CB CD34+細胞主要表現胎兒血紅蛋白(Hb-F)及成人血紅蛋白(Hb-β)兩者，但相比於hTERT-ADSC，經培養RBC在hTERT-ADSC-Akt組中主要表現更多Hb-β，在第21天高達84.3±5.2%，分別與正常成人周邊血液(PB)相比(圖 4A )。發現極少Hb-F陽性細胞且Hb-β+ Hb-F- 之平均比例自第21天開始增加(圖 4A )。
為了長期儲存經培養RBC，將其在第28天收集且在4℃下在防腐劑溶液(CPDA-1)中保存4週。在儲存期間，類紅血球標記及血紅蛋白含量保持不變(圖 4B )。
實例 5 ： NOD / SCID 模型中之經培養紅血球 ( cRBC ) 之成熟
為調查經培養紅血球(cRBC)是否將在活體內成熟，吾人將在第21-23天收集之經CFSE標記之成人周邊血液RBC (pRBC)或cRBC注射至經CL2MDP-脂質體治療之NOD/SCID或裸小鼠中。在注射後3天內，在兩個RBC組中之小鼠之周邊血液中均偵測到CFSE+ 細胞(圖 5 )。在注射之後3天，根據共聚焦顯微鏡，CFSE+ cRBC之百分比逐漸降低且在小鼠循環中維持與CFSE+ pRBC相同的程度。
雖然已結合上文所闡述之特定實施例來描述本發明，但對其之許多替代方案及其修改及變化對於一般熟習此項技術者而言將顯而易見。所有此等替代方案、修改及變化被視為屬於本發明之範疇內。
圖1A展示hTERT-ADSC-Akt及hTERT-ADSC之脂肪細胞、軟骨細胞及骨細胞分化的結果。
圖1B展示用於轉導AKT之質體構築以及hTERT-ADSC-Akt及hTERT-ADSC之西方墨點法、ELISA及流動式細胞測量術分析的結果。
圖1C展示根據ELISA，在24、48及72小時處，hTERT-ADSC-Akt、hTERT-ADSC、經低氧(H)預處理之hTERT-ADSC-Akt、經低氧(H)預處理之hTERT-ADSC的VEGF分泌結果。
圖1D展示在第5天至第21天，在具有或不具有條件培養基之情況下培養之CD34+ 細胞的細胞增殖結果。
圖2A展示自CB CD34+ 細胞以工業規模離體產生紅血球生成的結果。
圖2B展示根據流動式細胞測量術分析，細胞自幹細胞增殖及分化為類紅血球譜系的結果。
圖2C展示根據Wright-Giemsa細胞染色，細胞自幹細胞增殖及分化為類紅血球譜系的結果。
圖2D展示在第1天至第21天藉由Wright-Giemsa染色進行之細胞染色的結果。
圖3A展示自第18至21天，分化細胞之血紅蛋白含量的結果。
圖3B展示自第18至21天之分化細胞的照片。
圖3C展示細胞活力之結果。
圖3D展示根據流動式細胞測量術之去核RBC率(CD235a+ /NucRed- )的結果。
圖4A展示藉由流動式細胞測量術檢查血紅蛋白亞型及經培養類紅血球及PB之血紅蛋白表現的結果。
圖4B展示經培養RBC之類紅血球標記及血紅蛋白含量的結果。
圖5展示當將經CFSE標記之成人周邊血液RBC (pRBC)或cRBC注射至經CL2MDP-脂質體治療之NOD/SCID或裸小鼠中時，在共聚焦顯微鏡下觀察之CFSE+ cRBC百分比的結果。

Claims (19)

  1. 一種生產類紅血球及/或紅血球之方法，其包含將造血幹細胞(HSC)或類紅血球與永生化間葉幹細胞(MSC)之群體或獲自該等永生化MSC之條件培養基一起培養，其中該等永生化MSC經存活基因遺傳工程化，其中該存活基因為Akt基因或肝細胞生長因子(HGF)基因。
  2. 如請求項1之方法，其中該等HSC為CD34+ HSC。
  3. 如請求項1之方法，其中該等HSC係源自人類臍帶血。
  4. 如請求項1之方法，其中該存活基因為Akt基因。
  5. 如請求項1之方法，其中該等永生化MSC經人類端粒酶反轉錄酶(hTERT)永生化。
  6. 如請求項1之方法，其中該等MSC為臍帶間葉幹細胞(UMSC)、脂肪源性間葉幹細胞(ADSC)或骨髓間葉幹細胞(BMSC)。
  7. 如請求項1之方法，其中該等永生化MSC為CD146+IGF1R+。
  8. 如請求項1之方法，其中該等永生化MSC經低氧處理。
  9. 如請求項1之方法，其中該等HSC或類紅血球之細胞計數比該等永生化MSC之細胞計數在約100：1至約1：100範圍內。
  10. 如請求項1之方法，其包含藉由將該等HSC與該等永生化MSC或獲自該等永生化MSC之條件培養基一起培養來增強HSC增殖。
  11. 如請求項10之方法，其進一步包含將該等HSC與以下中之至少一者一起培養：幹細胞因子(SCF)、fms樣酪胺酸激酶3(Flt-3)、介白素3(IL-3)、維生素C及地塞米松(dexamethasone)。
  12. 如請求項1之方法，其包含藉由將該等HSC與該等永生化MSC或獲自該等永生化MSC之條件培養基一起培養來誘導該等HSC分化為該等類紅血球。
  13. 如請求項12之方法，其進一步包含將該等HSC與以下中之至少一者一起培養：SCF、紅血球生成素(EPO)、顆粒球-巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)、Flt-3、地塞米松、IL-3、維生素C及富血小板血漿(PRP)。
  14. 如請求項1之方法，其包含藉由將該等類紅血球與該等永生化MSC或獲自該等永生化MSC之條件培養基一起培養來促進該等類紅血球之分化及成熟。
  15. 如請求項12之方法，其進一步包含將該等類紅血球與以下中之至少 一者一起培養：肝素、運鐵蛋白、SCF、EPO及維生素C。
  16. 如請求項1之方法，其包含藉由將該等HSC與該等永生化MSC或獲自該等永生化MSC之條件培養基一起培養來增強HSC增殖；誘導該等HSC分化為該等類紅血球，其包含將該等HSC與該等永生化MSC或獲自該等永生化MSC之條件培養基一起培養；及藉由將該等類紅血球與該等永生化MSC或獲自該等永生化MSC之條件培養基一起培養來促進該等類紅血球之分化及成熟。
  17. 一種製造用於輸血之血液製品之方法，其包含如請求項1之方法。
  18. 一種用於增加血紅蛋白合成之方法，其包含如請求項1之方法。
  19. 如請求項18之方法，其中該血紅蛋白為成人血紅蛋白。
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