CN111712565A - 同种异体组合物 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及间充质干细胞/基质细胞的同种异体群体和相关组合物，所述群体和组合物包含从多个供体汇集的细胞，及所述群体和组合物在疾病，例如1型糖尿病的疗法和/或预防中的用途。本公开还涉及用于获得所述组合物的方法。

Description

同种异体组合物
技术领域
本公开涉及间充质干/基质细胞的同种异体群体和相关组合物，所述群体和组合物包含从多个供体汇集的细胞，及所述群体和组合物在疾病，例如1型糖尿病的疗法和/或预防中的用途。本公开还涉及用于获得所述组合物的方法。
背景技术
间充质干细胞(MSC)是表达表面标记CD73、CD90和CD105，但缺少CD14、CD34和CD45的表达的非造血细胞。当扩增为多克隆培养物时，它们是异质细胞群，具有自我更新和分化成各种形式的间充质的能力(Dominici等人(2006年)，The International Society forCellular Therapy position statement[国际细胞疗法学会立场声明].Cytotherapy[细胞疗法]8：315-317)。在体外，MSC必须在标准组织培养条件下粘附于塑料，并具有分化为成骨细胞、脂肪细胞和成软骨细胞的能力。MSC不仅可以在最初发现它们的骨髓中找到，而且可以在几乎所有其他形式的组织中找到，例如华通氏胶和胎盘。
MSC具有促进存活、血管生成和组织修复，并调节先天性和适应性免疫细胞应答的能力(Berman等人，(2010)Diabetes[糖尿病]59：2558-2568)。因此，MSC的移植提供了有吸引力的治疗选择，例如在自身免疫性疾病、炎性疾病和移植排斥领域。
1型糖尿病(T1D)是其中胰岛素产生不足的一种糖尿病。潜在机制涉及胰腺中产生胰岛素的β细胞的自身免疫性破坏。与正常水平相比，T1D发作时，β细胞的数量通常减少到20％-40％。维持残余胰岛素分泌对于降低HbA1c，减少血糖波动以及降低酮症酸中毒的风险很重要(Madsbad等人，(1979)Br Med J[英国医学杂志]，2(6200)：1257-9；Steffes等人，(2003)Diabetes[糖尿病]Care；26(3)：832-6)。它还大大降低了严重降血糖事件和晚期并发症的风险。明确的成功干预措施不仅可以用于预防疾病，而且可以适用于在明显的高血糖之前患有进行中的疾病的患者，从而提供预防疾病发展的手段。
已经测试了不同的干预策略来保存残留的β细胞，但充其量只能暂时保留内源性胰岛素的产生。
1995年发表了第一个使用在培养中扩增的MSC移植的临床试验(Lazarus等人((1995)Bone Marrow Transplant[骨髓移植]16：557-564)。从那时起，已经发表了许多用于治疗多种疾病的MSC的临床试验，并且许多试验正在进行中。
但是，在移植中使用MSC的一个限制因素是难以获得大批具有所需特性的细胞。此外，来自一个供体的细胞的扩增通常用于单批的生产，下一批通常将使用另一供体的细胞。因此，批次与批次之间的差异性是安全性和功效的主要问题。
这些挑战使细胞疗法行业经历了具有广泛测试的繁琐的制造过程，并且由于过度扩增，细胞可能会失去效力和/或表现出更高的遗传不稳定性风险。此外，当根据情况进行细胞扩增时，很难确保接受患者的MSC最佳剂量，并且“向患者提供我们设法扩增的细胞数量”是一种常见的方法。这使得治疗结果以及潜在的不良副作用非常难以预测。此外，寻找合适的供体的过程可能是耗时且费力的，并且带来关于是否会找到合适的供体的不确定性。另外，存在患者产生针对移植的MSC的抗体的风险。具体地，所施用的MSC与针对所述MSC产生抗体的患者之间的剂量反应关系是预期的。通过多个施用，这种影响可能会是深远的。
因此，在该领域中非常需要提供适合于治疗和/或预防自身免疫性疾病、炎性疾病和移植排斥的MSC群，该MSC群能够向需要的患者施用合适剂量的细胞。生产应确保稳健的生产过程，各批次之间几乎没有差异，并且每批次应产生多个剂量。细胞需要具有经过验证的效力，并经过配制以最大程度降低同种致敏和/或供体特异性抗体的风险。进一步期望所述群体可即时用于患者而无需供体-受体匹配。
发明内容
本公开的目的是提供克服现有技术的缺点的用于炎性疾病或病症、自身免疫性疾病和移植排斥的方法、药剂和治疗。可以预见，使用本文所述的分离的汇集的同种异体MSC群体的治疗是有吸引力的治疗选择。
因此，本公开旨在向有需要的患者提供适合移植的MSC群体，所述MSC群体包含有效细胞，表现出低的或甚至没有显著的批次间的统计学差异性，并且导致接受治疗的患者的同种异体免疫或同种致敏较低。通过公开的方法获得的分离的汇集的同种异体MSC群体来实现本目的，所述方法采用本文所述的选择算法。
如本文所使用的，术语“选择算法”是指以下定义的方法的步骤2至5，换言之，是指除了培养步骤或提供步骤和汇集步骤之外公开的所有方法步骤。可以理解的是，可以将进一步的步骤添加到选择算法，而不脱离本公开的范围。
因此，在本公开的第一方面，提供了获得分离的汇集的同种异体间充质干细胞(MSC)群体的方法，所述群体包括来自至少3个单独供体的MSC，其中来自任一供体的细胞数不超过总细胞数的50％，并且其中所述MSC至多经历8次传代；
所述方法包括以下步骤：
-从多于所述至少3个单独供体中培养或提供MSC，以获得多于至少3个单独供体来源的MSC群体；
-使用至少3个测定来测定每个单独供体来源的MSC群体，以获得所述每个单独供体来源的MSC群体的至少3个测定结果，其中所述至少3个测定包括至少一个测量每个单独供体来源的MSC群体的免疫抑制能力的测定；
-对于每个测定，基于所述测定结果将单独排名得分值分配给所述每个单独供体来源的MSC群体，并因此获得每个单独供体来源的MSC群体的至少3个单独排名得分值，其中较高的排名得分值表示更理想的测定结果；或其中较低的排名得分值表示更理想的测定结果；
-基于所述至少3个单独排名得分值，将总得分值分配给每个单独供体来源的MSC群体，其中在较高的排名得分值表示更理想的测定结果的情况下，较高的总得分值表示更理想的群体特性；或其中在较低的排名得分值表示更理想的测定结果的情况下，较低的总得分值表示更理想的群体特性；
-基于它们的总得分值，选择具有理想群体特性的单独供体来源的MSC群体的子集；以及汇集所述选择的单独供体来源的MSC群体以获得分离的，汇集的同种异体MSC群体，
其中所述汇集的同种异体MSC群体在汇集步骤之后不再进一步培养，并且其中所述至少3个测定包括一个测量吲哚胺-2，3-双加氧酶(IDO)活性的测定；一个测量所述MSC分泌的前列腺素E2的测定；一个测量所述MSC对外周血单个核细胞(PBMC)增殖的作用的测定。
本公开提供了获得分离的汇集的同种异体MSC群体的方法，所述群体包括来自至少3个单独供体的MSC，其中来自任一供体的细胞数不超过总细胞数的50％，因此，确保所述群体包含大量来自每个供体的细胞，并且来自任何供体的细胞在群体中都不占主导地位。认为群体包含相似数目或相同范围的数目的来自不同单独供体的细胞是有益的。发明人期望根据本发明方法获得的分离的汇集的同种异体MSC群体将表现出低免疫原性。选择算法在本文中用于选择具有期望功能的细胞。此外，汇集满足选择算法标准的来自多个供体的细胞将减少批次间的差异。所述方法还确保了分离的汇集的同种异体MSC群体包含有效细胞，因为选择算法的作用是选择具有所需特性的细胞。另外，由于汇集步骤，本文所述的方法允许获得大批量细胞。具体地，可以获得大批量经历了少量传代的细胞。另外，大批量还可以降低制造成本。相反，如果不汇集细胞，则很难获得大批量细胞，特别是如果细胞经历了少量传代。此外，低传代次数与MSC的高效力有关，因此希望细胞不暴露于过量的传代。为了清楚起见，传代培养是通过将部分或全部细胞从先前培养物转移到新鲜生长培养基而制成的新的细胞或微生物培养物。此动作称为传代培养或传代细胞。为了记录细胞在培养中已经分裂的大致数目，可以记录传代的次数。如本文所用，术语“传代”是指将细胞从先前培养物转移至新鲜生长培养基。
因此，在一个实施方案中，提供了本文所公开的方法，其中所述分离的汇集的同种异体MSC群体中的所述MSC最多经历了7次传代，例如最多6次传代，例如最多5次传代，例如最多4次传代，例如最多3次传代，例如1次、2次或3次传代，例如2次或3次传代。应当理解，传代次数与培养物中存在的细胞数有关。因此，为了获得足够数量的具有所需特性的细胞，保持细胞数量和维持的效力之间的平衡可能是有益的。因此，在一些实施方案中，所述MSC经历了2至6次，例如2至5次，例如2至4次，例如2至3次传代。
间充质干细胞(MSC)是表达表面标记CD73、CD90和CD105，但缺少CD14、CD34和CD45的表达的非造血细胞。在体外，MSC必须在标准组织培养条件下粘附于塑料，并具有分化为成骨细胞、脂肪细胞和成软骨细胞的能力。如本文所用，术语“MSC”，“间充质干细胞”，“间充质基质细胞”和“骨髓基质细胞”是指具有上述特性的细胞。本公开遵循国际细胞治疗学会(ISCT)的标准对MSC的定义。MSC可以来源于骨髓、外周血、脂肪组织、牙齿组织、胎盘、脐带、羊水、脐带血、华通氏胶，蜕膜、软骨膜和羊膜。
因此，在一个实施方案中，提供了本文所公开的方法，其中所述MSC选自由以下组成的组：骨髓来源的MSC、外周血来源的MSC，脂肪组织来源的MSC、牙科组织来源的MSC、胎盘来源的MSC、脐带来源的MSC、羊水来源的MSC、脐带血来源的MSC、华通氏胶来源的MSC、蜕膜来源的MSC、软骨膜来源的MSC和羊膜来源的MSC。在特定实施方案中，所述MSC选自由以下组成的组：胎盘来源的MSC、脐带来源的MSC、羊水来源的MSC、脐带血来源的MSC、华通氏胶来源的MSC、蜕膜来源的MSC、软骨膜来源的MSC、牙髓和羊膜来源的MSC；例如胎盘来源的MSC、脐带来源的MSC、羊水来源的MSC、脐带血来源的MSC、华通氏胶来源的MSC，蜕膜来源的MSC、牙髓来源的MSC和羊膜来源的MSC；例如胎盘来源的MSC、脐带来源的MSC、羊水来源的MSC、脐带血来源的MSC、华通氏胶来源的MSC、牙髓来源的MSC；例如胎盘来源的MSC、脐带来源的MSC、脐带血的MSC和华通氏胶来源的MSC；例如脐带来源的MSC、脐带血来源的MSC和华通氏胶来源的MSC。在一实施方案中，所述MSC是脐带来源的MSC或华通氏胶来源的MSC，例如华通氏胶来源的MSC。
在本发明方法的一些实施方案中，分离的汇集的同种异体MSC群体包含来自3个以上供体的MSC可能是有益的，以确保任何同种异体人类白细胞抗原(HLA)的浓度将低于使用来自单个供体或少量供体的细胞时的浓度。可以预料，这将降低施用该分离的、汇集同种异体MSC群体的患者产生抗HLA抗体(即供体特异性抗体，DSA)的风险。发明人期望在分离的汇集的同种异体MSC群体中低浓度的任何特异性HLA等位基因将降低与所述细胞的单次和多次施用有关的不良反应的风险。另外，通过使用来自多个供体的细胞，可以获得较低的批次差异性。将所有供体的结果与选择汇集的供体的结果进行比较时，针对制造合格的供体和在扩增至大规模临床级药物产品中通过了所有GMP质量标准的供体之间的差异性最多可降低40％或甚至更多。实施例12中给出了针对特定测定的差异的减少，其基于选择算法产生了所选供体与为特定批次评估的所有供体之间的总体评估差异降低多达40％或甚至更多。
MSC的GMP产生将显著降低供体差异性，选择算法将进一步降低差异性多达40％或甚至更多，从而导致批次间差异而无统计学意义。
因此，在一个实施方案中，所述群体包括来自至少四个单独供体的MSC，例如至少五个单独供体，例如至少六个单独供体，例如至少七个单独供体，例如至少八个单独供体，例如至少九个单独供体，例如至少十个单独供体。在另一个实施方案中，分离的汇集的同种异体MSC群体包含来自3-20个单独供体的MSC，例如3-15个单独供体，例如3-10个单独供体，例如4-8个单独供体，例如5-7个单独供体，例如5、6或7个单独供体。在一个特定的实施方案中，所述测定每个单独供体来源的MSC群体的步骤包括测定比在汇集步骤中汇集的单独供体来源的MSC群体的数量多至少一个，例如至少两个，例如至少三个，例如至少四个，例如至少五个，例如至少六个，例如至少七个，例如至少八个，例如至少九个，例如至少十个单独供体来源的MSC群体。在一个特定的实施方案中，所述测定每个单独供体来源的MSC群体的步骤包括，测定在汇集步骤中汇集的单独供体来源的MSC群体的数量的至少1-4至倍，例如至少2-4倍，例如2-3倍或3-4倍的单独供体来源的MSC群体。因此，例如，如果分离的汇集的同种异体MSC群包含来自3个单独供体来源的MSC群体的MSC，则测定每个单独供体来源的MSC群体的步骤包括测定3-12，例如6-12，例如6-9或9-12个单独供体来源的MSC群体。在该实施例中，仅选择3个单独供体来源的MSC群体进行汇集，而其余单独供体来源的MSC群体将被丢弃。
在本公开的一个实施方案中，所述培养或提供MSC的步骤包括培养或提供来自至少4个单独供体的MSC，以获得所述至少4个单独供体来源的MSC群体，例如至少5个，例如至少6个，例如至少7个，例如至少8个，例如至少9个，例如至少10个，例如至少11个，例如至少12个，例如至少13个，例如至少14个，例如至少15个，例如至少16个，例如至少17个，例如至少18个，例如至少19个，例如至少20个单独供体来源的MSC群体。例如，提供或培养约3至约50个单独供体来源的MSC群体，例如约4至约50个，例如约5至约50个，例如约6至约50个，例如约6至约30个，例如约6至约20个，例如约6至约15个，例如约8至约12个单独供体来源的MSC群体。
在本文所公开的方法的一些实施方案中，测定所述每个单独供体来源的MSC群体的步骤包括测定至少3个，例如至少4个，例如至少5个，例如至少6个，例如至少7个，例如至少8个，例如至少9个，例如至少10个，例如至少11个，例如至少12个，例如至少13个，例如至少14个，例如至少15个，例如至少16个，例如至少17个，例如至少18个，例如至少19个，例如至少20个单独供体来源的MSC群体。在另一个实施方案中，测定所述每个单独供体来源的MSC群体的步骤包括测定约3至约50个单独供体来源的MSC群体，例如约4至约50个，例如约5至约50个，例如约6至约50个，例如约6至约30个，例如约6至约20个，例如约6至约15个，例如约8至约12个单独供体来源的MSC群体。在一个实施方案中，测定约3至约20个单独供体来源的MSC群体，例如，可以测定8、9、10、11、12、13、14个单独供体来源的MSC群体。应当理解，在本文所公开的方法的本步骤中测定的单独供体来源的MSC群体是在根据本方法的培养或提供步骤中获得的。
在一些实施方案中，有益的是，用至少一个或多个功能测定来测定所述每个单独供体来源的MSC群体，以获得关于每个MSC群体的特性的更多信息。因此，在本文所公开的方法的一个实施方案中，使用至少3个测定来测定每个单独供体来源的MSC群体的步骤包括使用至少一个功能测定，例如至少两个功能测定，例如至少三个功能测定，例如至少四个功能测定，例如至少五个功能测定。技术人员将理解，可以对所述测定进行调整以反映MSC群体中所需的性质。例如，在期望MSC群体是免疫抑制的情况下，可以选择测定以反映所关注的该特性。
在一个实施方案中，所述至少3个测定包括至少一个测量所述MSC的免疫抑制能力的测定。如本文所用，术语“免疫抑制能力”是指引起免疫系统的激活或功效降低的能力。技术人员将理解，可以在测定中直接或间接地测量免疫抑制能力。
在一个实施方案中，其中所述至少一个测量所述MSC的免疫抑制能力的测定测量吲哚胺-2，3-双加氧酶(IDO)活性。免疫抑制潜力可以作为IDO活性的一种度量，通过测量培养上清液中的色氨酸和犬尿氨酸来确定。IDO是一种在人体内由IDO1基因编码的含血红素的酶。IDO酶将L-色氨酸转化为N-甲酰基犬尿氨酸(或犬尿氨酸)，一种可作为免疫细胞(包括T细胞)增殖的抑制剂的免疫抑制分子。IDO活性可以表示为犬尿氨酸/色氨酸的比率，并且可以通过例如使用ELISA试剂盒计算细胞培养上清液中存在的色氨酸和犬尿氨酸的量来确定。当用干扰素γ(IFNY)刺激时，与不刺激时相比，间充质干/基质细胞(MSC)分泌更多的IDO。
诱导的IDO活性表明细胞具有与免疫调节和/或免疫抑制有关的功能效能，发明人认为该功能效能是该方法中所用MSC的关键质量属性。
可以定量测量MSC对外周血单核细胞(PBMC)增殖的免疫抑制作用。MSC已显示抑制T淋巴细胞增殖。与MSC的混合淋巴细胞反应经常用于证明MSC的免疫抑制活性。在一个实施方案中，测量所述MSC的免疫抑制能力的所述至少一个测定测量所述MSC对外周血单核细胞(PBMC)，例如T淋巴细胞的增殖的作用。例如，T淋巴细胞的增殖，例如植物血凝素(PHA)刺激的T淋巴细胞的增殖。PHA用作激活T淋巴细胞增殖的促细胞分裂剂。因此，在一个实施方案中，所述PBMC的增殖是T淋巴细胞的增殖，例如PHA刺激的T淋巴细胞的增殖。MSC的免疫抑制活性可以量化为PHA刺激的T淋巴细胞增殖的减少。
此外，可以测定MSC以测量由所述MSC分泌的前列腺素E2。前列腺素E2(PGE2)是由前列腺素H2在各种细胞中形成的，而前列腺素H2是由花生四烯酸通过前列腺素合成酶合成的。PGE2具有许多生物学作用，包括血管舒张作用、抗炎作用和促炎作用、调节睡眠/唤醒周期以及促进人类免疫缺陷病毒复制。PGE2在炎症、免疫调节、发烧、疼痛感、保护胃粘膜、生育力和分娩以及钠和水的保留方面具有活性。PGE2在体内迅速代谢，PGE2在循环系统中的半衰期约为30秒，正常血浆水平为3-12pg/mL。PGE2参与免疫应答的不同阶段和免疫的不同效应机理的调节。MSC组成性地产生PGE2，并且通过cAMP依赖性蛋白激酶同工型的差异激活由前列腺素调节它们的增殖。PGE2的这种产生对炎症信号刺激其诱导的局部环境敏感。在与免疫细胞共培养期间，MSC的PGE2产量显著增加，并参与MSC的免疫调节作用。此外，如Rasmusson等人(Rasmusson等人，(2005)Exp.Cell.Res[实验细胞研究]，305(1)(2005)，第33-41页)报道，PGE2在MSC诱导的免疫抑制作用中的作用取决于T细胞刺激。PGE2对由PHA而非同种抗原激活的T细胞的MSC抑制有效。MSC通过调节COX1/COX2表达并最终调节PGE2的产生来防止淋巴细胞激活并诱导T细胞增殖的抑制。因此，可能使用外周血单核细胞(PBMC)和MSC共培养的细胞培养上清液中发现的PGE2分泌量作为免疫抑制能力的量度。在一个实施方案中，其中所述至少一个测量所述MSC的免疫抑制能力的测定测量所述MSC分泌的前列腺素E2。在一个实施方案中，所述至少一个测量由所述MSC分泌的前列腺素E2的测定包括当与PBMC(如PHA刺激的PBMC，如PHA刺激的T淋巴细胞)共培养时，测量所述MSC分泌的前列腺素E2。
在另一个测定中，可以测量MSC中的HLA-G表达。HLA-G已被鉴定为天然诱导耐受的分子。它在生理条件下表达受到限制，但可以例如响应于IFNγ、IL-10和PHA而被上调。MSC具有低水平的细胞内HLA-G，并且表达低水平的可溶性HLA-G(sHLA-G)，但是预计用IFNγ或IL-10刺激可导致水平升高。预计用PHA或GABA刺激会增加可溶性HLA-G的水平。JEG-3是胎盘来源的细胞系，在细胞内和可溶性细胞中均具有高水平的HLA-G表达，可在测定中用作阳性对照。范围可以是比较例如通过流式细胞术(FACS)分析的细胞内HLA-G表达和通过例如ELISA测定的单独供体来源的MSC群体之间的sHLA-G的释放。
因此，在本文所公开的方法的一个实施方案中，所述至少3个测定进一步包括至少一个测量所述MSC中的HLA-G表达的测定，例如，所述至少一个测定测量所述MSC中响应IFNγ、IL-10、PHA和/或GABA的HLA-G表达，例如，所述至少一个测定测量所述MSC中响应IFNγ、IL-10和/或PHA的HLA-G表达。在一个实施方案中，所述至少一个测定测量所述MSC中响应选自由IFNγ、IL-10、PHA和GABA组成的组中的一种或几种的HLA-G表达。所述HLA-G表达可以是可溶性HLA-G的表达。
另外，可以根据蛋白质表达和/或细胞因子表达来评估单独供体来源的MSC群体，以选择具有所需特征的群体。例如，评估所述群体中白介素、生长因子、干扰素、肿瘤坏死因子、集落刺激因子和脂蛋白的表达可能是令人感兴趣的。因此，在本文所公开的方法的一个实施方案中，所述至少3个测定进一步包括至少一个测量所述MSC的蛋白质表达和/或细胞因子表达的测定，例如选自由白介素、生长因子、干扰素、肿瘤坏死因子、集落刺激因子和脂蛋白组成的组中的一种或几种蛋白质或细胞因子的表达。在另一个实施方案中，所述至少一个测量蛋白质表达和/或细胞因子表达的测定测量一种或几种选自以下组成的组中的蛋白质或细胞因子的表达：IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-12/13、IL-17A、IL-21、IL-22、IL-29、IL-31、TGFβ、VEGF、FGF、GM-CFS、IFNα、IFNγ、apo E和TNFα，例如选自：IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-12、IL-12/13、IL-17A、IL-21、IL-22、IL-29、IL-31、TGFβ、VEGF、FGF、GM-CFS、IFNα、IFNγ、apo E和TNFα，例如选自由IL-6、IL-8、GM-CSF和TGFβ组成的组，例如选自由至少IL-6组成的组。在一特定实施方案中，测量至少2种，例如至少3种，例如至少4种，例如至少5种，例如至少6种，例如至少7种，例如至少8种，例如至少9种，例如至少10种，例如至少11种，例如至少12种，例如至少13种，例如至少14种，例如至少15种，例如至少16种，例如至少17种，例如至少18种，例如全部19种所述蛋白质和/或细胞因子的表达。此外，技术人员将理解，可以在不存在任何刺激的情况下和/或在存在至少一种刺激的情况下测量所述蛋白质和/或细胞因子的表达。在一个实施方案中，在至少一种刺激或几种刺激，例如两种、三种、四种或更多种刺激的存在下测量所述蛋白质和/或细胞因子的表达。在一个实施方案中，所述一种或多种刺激是免疫应答修饰刺激。所述免疫应答修饰刺激的非限制性实例包括PBMC、刺激的PBMC(例如用PHA刺激的PBMC)、IL10、γ-氨基丁酸(GABA)、干扰素γ(IFNγ)等。因此，在一个实施方案中，所述一种或多种免疫应答修饰刺激选自由以下组成的组：PBMC、刺激的PBMC、用PHA、IL10、GABA和IFNγ刺激的PBMC。在一个实施方案中，所述一种或多种刺激是GABA和/或IFNγ。在一个实施方案中，提供了本文所公开的方法，其中所述一种或多种刺激选自由聚肌苷酸：聚胞苷酸(聚I：C)、瑞喹莫德(r848)、GABA和IFNγ组成的组，例如选自由聚I：C和IFNγ组成的组。在一个实施方案中，所述刺激是PBMC，例如刺激或未刺激的PBMC，例如PHA刺激的PBMC，例如PHA刺激的T淋巴细胞。在一个实施方案中，提供了本文所公开的方法，其中所述一种或多种刺激是PHA刺激的T淋巴细胞和/或GABA。
在一个特定的实施方案中，本文所公开的所述方法包括测量响应于PHA刺激T淋巴细胞和/或GABA的刺激的所述MSC中的IL-10表达。
本领域技术人员理解，取决于所测定的MSC群体的期望特性，可以将所述测定组合以获得感兴趣的特定测定组合。所述测定可以彼此独立地选择。
此外重要的是，将要汇集以获得通过本文所公开的方法可获得的分离的、同种异体汇集的MSC群体的任何MSC都是具有正常细胞的细胞形态的细胞。已知MSC培养物包含快速自我更新的小型圆形细胞亚群，通常通过流式细胞仪鉴定为低前向散射和低侧向散射。已知从具有较大菌落形成能力的供体分离的MSC具有明显更高比例的较小细胞。总体而言，数据表明，被归类为具有高生长能力的供体MSC具有更高的自我更新能力，更高的CFU-F效率和更大比例的小型细胞。可以在扩增(培养)期间以及在紧接收获之前或与收获关联地目视检查细胞，并根据例如以下进行评估：细胞的大小；细胞核大小；细胞形状；细胞大小与细胞核大小之比。因此，在本文所公开的方法的一个实施方案中，所述至少3个测定包括至少一个形态学测定。在一个实施方案中，所述形态学测定测定细胞和/或细胞核的形态学特征。在一个实施方案中，所述细胞和/或细胞核的形态特征是选自由以下组成的组中的一种或多种特征：细胞大小、细胞核大小、细胞形状以及细胞与细胞核大小之比。
重要的是，分离的汇集的同种异体MSC群体应包含尽可能多的表现出健康和所需形态(即正常形态)的细胞。因此，在本文所公开的方法的一个实施方案中，单独供体来源的MSC群体仅在其表现出至少90％，例如至少91％，例如至少92％，例如至少93％，例如至少94％，例如至少95％，例如至少96％，例如至少97％，例如至少98％，例如至少99％的正常细胞和/或细胞核时，才有资格进行汇集。因此，如果所述单独供体来源的MSC群体包含少于90％的正常细胞，则所述群体不适合汇集。
将理解的是，使用至少3个测定来测定每个单独供体来源的MSC群体的所述步骤可以在第0代(p0)至第8代中的任何一个进行。例如，当所述单独供体来源的MSC群体与它们被汇集时处于相同的传代时，可以执行所述测定，以确保所述单独供体来源的MSC群体然后在相关时间点展现出期望的特性。也可能在它们被汇集时所处的传代更早的传代中进行测定。还应当理解，可以在不同的传代中进行不同的测定，只要在相同的传代中对每个单独供体来源的MSC群体进行特定测定以确保可以比较每个单独供体来源的MSC群体获得的测定结果。
因此，在本方法的一个实施方案中，当MSC群体处于第0代(p0)至第8代(p8)，例如在p1-p5中时，例如在p1-p4中，例如在p2-p4中，或在p1-p4中，例如在p1、p2和/或p3中，例如在p2和/或p3中，执行使用至少3个测定来测定每个单独供体来源的MSC群体的步骤。在一个实施方案中，当细胞与细胞被汇集时在相同的传代中时执行至少一个测定，例如至少两个测定，例如至少三个测定，例如所有测定。在另一个实施方案中，在不同的传代中进行至少两个测定。
在本方法的一个实施方案中，通过至少一个形态测定来测定所述每个单独供体来源的MSC群体。在本方法的一个实施方案中，通过至少一个测量吲哚胺-2，3-双加氧酶(IDO)活性的测定来测定所述每个单独供体来源的MSC群体。在一个实施方案中，通过至少一个测量所述MSC对PBSC增殖的作用的测定来测定所述每个单独供体来源的MSC群体。在一个实施方案中，通过至少一个测量所述MSC分泌的前列腺素E2的测定来测定所述每个单独供体来源的MSC群体。
在所述方法的一个实施方案中，通过以下来测定所述每个单独供体来源的MSC群体：至少一个形态测定；测量IDO活性的测定；以及测量所述MSC对PBSC增殖的作用的测定。在本方法的一个实施方案中，通过以下来测定所述每个单独供体来源的MSC群体：至少一个形态测定；测量IDO活性的测定；测量所述MSC对PBSC增殖的作用的测定；以及测量由所述MSC分泌的前列腺素E2的测定。在一个实施方案中，提供了本文所公开的方法，其中通过测量所述MSC中的HLA-G表达的测定进一步测定所述每个单独供体来源的MSC群体。在一个实施方案中，提供了一种方法，其中通过至少一个测定，例如至少两个测定，例如至少三个测定，例如至少四个测定，进一步测定所述每个单独供体来源的MSC群体，以测量选自以下中的至少一种，例如两种，例如三种，例如所有四种因子的表达：IL-6、IL-8。GM-CFS和TGFβ。将理解的是，每个测定可以测量以下之一的表达：IL-6、IL-8。GM-CFS和TGFβ。在一个实施方案中，提供了一种方法，其中通过测量所述MSC中HLA-G表达的测定和通过至少一个测定，例如至少两个测定，例如至少三个测定，例如至少四个测定，进一步测定所述每个单独供体来源的MSC群体，以测量选自以下中的至少一种，例如两种，例如三种，例如所有四种因子的表达：IL-6、IL-8。GM-CFS和TGFβ。将理解的是，每个测定可以测量以下之一的表达：IL-6、IL-8。GM-CFS和TGFβ。
本方法包括将总得分分配给每个单独供体来源的MSC群体的步骤。在该步骤中，基于所述至少三个单独排名得分值，将总得分分配给每个单独供体来源的MSC群体。在较高的得分值表示更理想的测定结果的情况下，较高的总得分值表示更理想的群体特性。或者在较低的排名得分值表示更理想的测定结果的情况下，较低的总得分值表示更理想的群体特性。本领域技术人员将理解，在不脱离本公开内容的范围的情况下，可以修改排名得分值系统和/或总得分值系统，只要所述系统允许在单独供体来源的MSC群体之间在理想的特性方面进行比较。在本文所公开的方法的一个实施方案中，其中基于所述每个单独供体来源的MSC群体的测定结果与剩余的单独供体来源的MSC群体的结果的比较，将至少一个测定的单独排名得分值分配给所述每个单独供体来源的MSC群体。因此，可以基于分析的单独供体来源的MSC群体之间的比较来分配单独排名得分值。在一个实施方案中，其中基于针对所述单独供体来源的MSC群体获得的绝对测定结果，将至少一个测定的单独排名得分值分配给所述每个单独供体来源的MSC群体。因此，可以选择用于测定的期望阈值。在一个实施例中，当所述绝对结果对应于至少预定值或至多预定值时，认为测定结果是期望的，并且分配反映所获得的期望测定结果的单独排名得分值。
将理解的是，将单独排名得分值分配给来自所述至少3个测定中的一个、两个、三个或更多个的结果的步骤包括分配单独排名得分值，该单独排名得分值是非二进制的。非二进制得分值是从至少三个级别中选择的得分值，换句话说，是至少三个不同的得分。非二进制得分值的非限制性实例是1、2和3；0、1和2；1、3和5。将理解的是，非二进制排名得分值可以由任意三个数字X，Y，Z表示，其中，所述X，Y和Z是不同的数字。与二进制得分值相比，非二进制得分值的分配允许对测定结果进行排名的更高分辨率。因此，在本文所公开的方法的一个实施方案中，基于测定结果向每个单独供体来源的MSC群体分配单独排名得分值包括分配选自至少三个排名得分值，例如至少四个排名的得分值，例如至少五个排名得分值的得分值。例如，所述单独排名得分值可以选自5、6、7、8、9、10或甚至更多可能的得分值。技术人员将理解，排名得分值可以是数字的或不是数字的。
总得分值可以是通过将每个单独供体来源的MSC群体的排名得分值相加而获得的累加得分值。
或者总得分值可以是加权的总得分值，其通过以下方式获得：1)为每个测定的排名得分值分配权重，以及2)将单独供体来源的MSC群体的加权的排名得分值相加。通过这种方式，与其余的测定结果相比，可能为选择的一个或几个测定结果分配相对较高的权重(或重要性)。技术人员将理解，可以加权一个或几个测定结果，并且可以独立选择分配给每个测定结果的权重。因此，在一个实施方案中，提供了本文所公开的方法，其中分配给所述每个单独供体来源的MSC群体的所述总得分值是通过将每个单独供体来源的MSC群体的排名得分值相加而获得的累加总得分值。在另一个实施方案中，分配给所述每个单独供体来源的MSC群体的所述总得分值是通过以下方式获得的加权总得分值：1)为每个测定的排名得分值分配权重，以及2)将单独供体来源的MSC群体的加权的排名得分值相加。
基于总得分值，选择具有期望的群体特性的单独供体来源的MSC群体的子集。在该步骤中，设想选择至少3个，例如至少4个，例如至少5个，例如至少6个，例如至少7个，例如至少8个，例如至少9个，例如至少10个单独供体来源的MSC群体。如本文所用，术语“子集”是指所有或少于所有测定的单独供体来源的MSC群体。
在本文所公开的方法的一个实施方案中，选择具有期望的群体特性的单独供体来源的MSC群体的子集的步骤包括在较高总得分值表示更期望的群体特性的情况下，选择总得分值至少对应于预定总得分值的单独供体来源的MSC群体；或在较低总得分值表示更期望的群体特性的情况下，选择总得分值最高对应于预定总得分值的单独供体来源的MSC群体。在另一个实施方案中，选择具有期望的群体特性的单独供体来源的MSC群体的子集的步骤包括选择预定数量的单独供体来源的MSC群体，在较高的总得分值表示更理想的群体特性的情况下，相对于其余的单独供体来源的MSC群体，该群体显示出更高的总得分值；或在较低的总得分值表示更理想的群体特性的情况下，相对于其余的单独供体来源的MSC群体，该群体显示出更低的总得分值。
在本发明方法的下一步骤中，汇集选择的单独供体来源的MSC群体，以获得分离的汇集的同种异体MSC群体。如上所述，认为分离的汇集的同种异体MSC群体包含相似的数量或相似范围数目的来自每个单独供体的细胞被认为是有益的，使得来自一个供体的细胞在所述汇集的群体中没有明显优势。因此，在本文所公开的方法的一个实施方案中，在所述分离的汇集的MSC群体中任何一个供体来源的细胞数量不超过所述分离的汇集的MSC群体中总体细胞数量的约45％，例如不超过40％，例如不超过约35％，并且其中所述群体包括来自至少3个供体的MCS；例如在所述分离的汇集的MSC群体中任何一个供体来源的细胞数量不超过所述分离的汇集的MSC群体中总体细胞数量的约40％，例如不超过35％，例如不超过约30％，并且其中所述群体包括来自至少4个供体的MCS；例如在所述分离的汇集的MSC群体中任何一个供体来源的细胞数量不超过所述分离的汇集的MSC群体中总体细胞数量的约35％，例如不超过30％，例如不超过约25％，并且其中所述群体包括来自至少5个供体的MCS；例如在所述分离的汇集的MSC群体中任何一个供体来源的细胞数量不超过所述分离的汇集的MSC群体中总体细胞数量的约30％，例如不超过25％，例如不超过约20％，并且其中所述群体包括来自至少6个供体的MCS；例如在所述分离的汇集的MSC群体中任何一个供体来源的细胞数量不超过所述分离的汇集的MSC群体中总体细胞数量的约25％，例如不超过22％，例如不超过约20％，并且其中所述群体包括来自至少7个供体的MCS；例如在所述分离的汇集的MSC群体中任何一个供体来源的细胞数量不超过所述分离的汇集的MSC群体中总体细胞数量的约20％，例如不超过18％，例如不超过约16％，并且其中所述群体包括来自至少8个供体的MCS；例如在所述分离的汇集的MSC群体中任何一个供体来源的细胞数量不超过所述分离的汇集的MSC群体中总体细胞数量的约18％，例如不超过15％，例如不超过约13％，并且其中所述群体包括来自至少9个供体的MCS；例如在所述分离的汇集的MSC群体中细胞455667761223344556677612的数量不超过所述分离的汇集的MSC群体中总体细胞数量的约16％，例如不超过14％，例如不超过约12％，并且其中所述群体包括来自至少10个供体的MCS。在所述方法的一个特定实施方案中，来自任何一个单独供体的MSC的数量不超过来自任何其他供体的细胞数量的约四倍，例如约三倍，例如约两倍。
应当理解，为了维持来自单独供体的MSC的所需分布，在汇集单独供体来源的MSC群体的选定子集之后，不再进行MCS的进一步培养。不受理论的束缚，可以预见，在汇集的群体中来自单独供体的MSC的分布对于获得预期的HLA错配具有重要意义，以确保在施用分离的汇集的同种异体MSC群体的患者中没有或仅有低水平的HLA免疫。因此，根据本发明的方法，在汇集后不再进一步培养本文所公开的分离的汇集的同种异体MSC群体。在本方面的一个实施方案中，提供了本文所公开的方法，其中在汇集步骤之后不再进一步培养所述群体。
如上所述，只有满足由所述至少所述3个测定而测定的期望要求的单独供体来源的MSC群体才有资格在汇集步骤中汇集。不合格的细胞因此被丢弃。可以将针对单独供体来源的MSC群体获得的测定结果，从而所述细胞的特性，与较早获得的分离的汇集的同种异体MSC群体获得的测定结果进行比较，该较早群体是通过本文所公开的方法获得的。因此，较早的群体在本方法中用作内部质量控制。因此，在本方法的一个实施方案中，该方法进一步包括以下步骤：如果单独供体来源的MSC群体的测定结果不如先前通过相同方法获得的同种异体MSC群体的相应测定结果理想，则从汇集步骤中丢弃所述单独供体来源的MSC群体。
重要的是，本公开的方法导致分离的汇集的同种异体MCS群体的总体评估的差异减少。为了澄清，与包括从所有供体汇集的MSC的批次相比，批次内的差异减少。
为了说明这一点，可以通过以下公式计算评估差异：
Figure BDA0002629213840000141
其中最大值和最小值是获得的最大和最小测定结果。
可以将总体评估计算为所选供体的δ选择算法得分(在此实例中为6-3＝3)除以所有评估的供体的δ选择算法得分(在本实例中为6-1＝5)。
Figure BDA0002629213840000142
因此，在如本文所公开的获得分离的汇集的同种异体MSC群体的方法的一个实施方案中，比较所有测定的单独供体来源的MSC群体的测定结果和所选单独供体来源的MSC群体的子集的测定结果时，批次内总体评估的差异，减少了至少30％，例如至少35％，例如至少40％，例如至少45％，例如至少50％，例如至少60％。
如针对本公开的第二方面详细解释的，本文所公开的方法允许获得多批次本文所公开的分离的汇集的同种异体间充质干细胞(MSC)群体，这些批次没有显示统计学上显著的批次间差异性。
在本公开的第二方面，提供了可通过本文所公开的方法获得的分离的汇集同种异体MSC群体，其中所述群体在汇集后不再进一步培养。此外，在一个实施方案中，所述分离的汇集的同种异体MSC群体不表现出统计学上显著的批次间差异性。本方法允许获得显示出有利特性的分离的汇集的同种异体MSC群体。认为有利的是，由于汇集细胞的步骤，可以获得大批的MSC，并且另外这可以降低制造成本。由于单独供体来源的MSC群体的汇集，因此可以将细胞维持在如上所述的低传代数，由此获得的分离的汇集的同种异体MSC群体显示出高效力以及低的遗传不稳定风险。因此，可以获得具有高效力的大批遗传稳定细胞。此外，由于所采用的方法步骤，通过本文所公开的方法获得的分离的汇集的同种异体MSC群体没有统计学上显著的批次间差异性。
如本文所用，术语“批次”是指通过本文所公开的方法获得的分离的汇集的同种异体MSC群体。
如本文所用，术语“批次间差异性”是指通过本文所公开的方法获得的分离的汇集的同种异体MSC群体与通过本文所公开的方法获得的另一分离的汇集的同种异体MSC群体之间的性质差异。
可以通过比较来自所述至少三个测定中的一个或几个的结果来定量所述批次间的差异性，所述测定用于测定单独供体来源的MSC群体。或者可以采用一个或几个不同的测定。
如本文所用，术语“无统计学上的批次间差异性”应理解为来自一个批次的测定结果与来自不同批次的测定结果之间的差异在统计学上不显著(例如，使用概率值P＞0.05)。所述统计显著性可以被证明为批次之间的变异系数等于或小于测定间和/或测定内变异系数。技术人员熟悉合适的统计计算。
因此，在一个实施方案中，提供了如本文所公开的分离的汇集的同种异体MSC群体，该群体不表现出统计学上显著的批次间差异性。在一个实施方案中，所述两个连续生产的批次之间没有统计学上显著的批次间差异性。在一个实施方案中，所述无统计学显著的批次间差异性是在任何两个批次之间。在一个实施方案中，所述在生产批次和参考批次之间没有统计学上显著的批次间差异性，其中所述参考批次是先前通过本文所公开的方法生产的分离的汇集的同种异体MSC群体。
在一个实施方案中，所述无统计学显著的批次间差异性与＞0.05的概率值(P)相关联，例如＞0.04的P，例如＞0.03的P，例如＞0.02的P，例如＞0.01的P，例如＞0.005的P，例如＞0.001的P。
在一个实施方案中，基于选自由以下组成的组中的至少一个测定的测定结果对所述批次间差异性进行定量：本文所述的IDO测定，本文所述的PGE2测定和本文所述的增殖测定；例如选自由以下组成的组中的至少两个测定：本文所述的IDO测定，本文所述的PGE2测定和本文所述的增殖测定；例如本文所述的IDO测定，本文所述的PGE2测定和本文所述的增殖测定中的所有三个。任选地，可以基于一个或多个另外的测定来定量批次间的差异性。
本文所公开的分离的汇集的同种异体MSC群体表现出期望的功能和形态学特性，高效力，无统计学上显著的批次间差异性，并且还可以大批量获得。当所述群体用作药物时，这允许可预测性和低差异性。因此，本分离的汇集的同种异体MSC群体可以用于标准化的医学治疗程序中。可以预料，当将所述群体用作药物时，特别是就制剂和剂量方案而言，通过本文所公开的方法可获得的分离的汇集的同种异体MSC群体既具有物流优势又具有剂量优势。物流链是为了将分离的汇集的同种异体MSC群体保持在低温储存状态，因此确保分离的汇集的同种异体MSC群体的特性得以维持并允许患者接受预定义的细胞数量(与根据现有技术“为患者提供我们设法扩增的细胞数量”相反)作为药物被认为是重要的。因此，本文所公开的分离的汇集的同种异体MSC群体适合作为“现成的”标准化医疗产品，其在治疗效果和安全性方面提供了可预测性。
可以预见，本文所公开的所述分离的汇集的同种异体MSC群体可用于治疗和/或预防选自由炎性疾病或病症、自身免疫性疾病和移植排斥组成的组中的疾病或病症。
因此，在本公开的第三方面，提供了本文所公开的分离的汇集的同种异体MSC群体，其用作药物。
不受理论的束缚，设想分离的汇集的同种异体MSC群体能够调节先天性和适应性免疫细胞的应答，使树突状细胞保持未成熟状态，抑制树突状细胞分化并抑制其促炎性细胞因子的产生。因此，可以预见本发明的分离的汇集的同种异体MSC群体可用于治疗和/或预防炎性和自身免疫性疾病或病症以及移植排斥。
因此，在本公开的相关第四方面，提供了本文所公开的分离的汇集的同种异体MSC群体，其用于治疗和/或预防选自由炎性疾病或病症、自身免疫性疾病和移植排斥组成的组中的疾病或病症。
在一个实施方案中，所述用途包括将所述分离的汇集的同种异体MSC群体作为输注施用到有此需要的患者。在一个实施方案中，所述输注是静脉内、腹膜内或淋巴内、静脉内、鞘内、脑内和/或通过ommaya储液器、动脉内或皮下施用。在一个实施方案中，所述输注是静脉内、腹膜内或淋巴内，例如静脉内施用。
MSC的调节性质和HLA-DR的低表达是两个假设可以接受MSC的同种异体移植而供体和受体之间没有HLA匹配的两个原因。可以预见，取决于患者的治疗需要，所述输注可以重复进行或仅进行一次。不受理论的束缚，可以预见，通过一次输注或重复输注的所述施用将不会在治疗的患者中导致临床上相关水平的抗HLA抗体。因此，所述患者将有资格进行本文所述的几个输注治疗或在需要时接受移植。因此，在一个实施方案中，所述输注仅执行一次。在另一个实施方案中，所述输注重复进行。例如，所述输注可以进行两次、三次、四次或更多次。
因此，在一个实施方案中，所述施用在所述患者中不诱导抗HLA抗体滴度或诱导低抗HLA抗体滴度。如本文所用，术语“低或无抗-HLA抗体滴度”指的是在临床上不相关的滴度。通过固相复合技术进行的抗体分析可以更精确地定义HLA抗体的广度和强度。通过将这些结果与实际的基于细胞的交叉匹配获得的结果以及最终的移植结局相关联，可以以中心特异性的方式定义临床相关抗体(Zachary等人，Using real data for a virtualcrossmatch[使用真实数据进行虚拟交叉匹配].HumImmunol[人类免疫学]2009；70：574-579)。技术人员将理解，可以通过LABScreen单抗原珠试验来定义临床上不相关的抗HLA抗体滴度，其中供体特异性抗体的平均荧光强度(MFI)高于1000，DSAMFI＞1000。
如上所述，可以预见，本文所公开的分离的汇集的同种异体MSC群体可用于治疗和/或预防选自由炎性疾病或病症、自身免疫性疾病和移植排斥组成的组中的疾病或病症。
炎性疾病或病症的非限制性实例包括：寻常痤疮、哮喘、自身免疫性疾病、自身炎症性疾病、乳糜泻、慢性前列腺炎、结肠炎、憩室炎、肾小球肾炎、化脓性汗腺炎、肠炎、间质性膀胱炎、盆腔炎、再灌注损伤、风湿热、类风湿关节炎、结节病、移植排斥、II型糖尿病和血管炎。自身免疫性疾病或病症的非限制性实例包括：阿尔茨海默氏病、阿米科侧索硬化症、自闭症、全身性自身免疫性疾病，例如SLE、干燥综合征、结节病、硬皮病、类风湿性关节炎、冷冻性肺纤维化血管炎和皮肌炎；影响特定器官或组织的局部自身免疫性疾病/综合征或病症，例如内分泌自身免疫性疾病或病症，例如1型糖尿病、成人潜伏性自身免疫性糖尿病(LADA)、桥本甲状腺炎和艾迪生氏病；胃肠道自身免疫性疾病或病症，例如乳糜泻、克罗恩氏病和恶性贫血；皮肤病性自身免疫性疾病或病症，例如寻常型天疱疮和白癜风；血液自身免疫性疾病或病症，例如自身免疫性溶血性贫血和特发性血小板减少性紫癜；以及神经系统自身免疫性疾病或病症，例如多发性硬化症、重症肌无力和脑炎。其中可以施用本发明的分离的汇集的同种异体MSC群体的移植排斥性疾病或病症的非限制性实例包括：移植物抗宿主病、器官移植、造血干细胞移植、细胞移植和胰岛移植。本领域技术人员将理解，本分离的汇集的同种异体MSC群体的施用可用作与任何上述疾病和病症相关的治疗和/或预防方法。
在特定实施方案中，提供了本文公开使用的分离的汇集的同种异体MSC群体，其中所述炎性疾病或病症选自由自身免疫性疾病组成的组。
在特定实施方案中，提供了用于本文所公开的用途的分离的汇集的同种异体MSC群体，其中所述疾病或病症是移植排斥，例如排斥任何种类的移植，包括细胞、组织、器官或植入物。在一实施方案中，所述移植排斥可以是器官移植排斥或胰岛移植排斥。在一个实施方案中，所述器官选自由以下组成的组：肾、肝、肺和心脏。在一实施方案中，所述移植是肾脏移植。在一实施方案中，所述移植排斥是胰岛移植排斥。
在特定实施方案中，提供了用于本文所公开的用途的分离的汇集的同种异体MSC群体，其中自身免疫性疾病选自由以下组成的组：肌萎缩侧索硬化(ALS)、多发性硬化、糖尿病、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、炎性肠病和关节炎。在一实施方案中，所述自身免疫性疾病是ALS或炎性肠病。在一个特定的实施方案中，所述自身免疫性疾病是1型糖尿病或LADA。可以预见，本分离的汇集的同种异体MSC群体对于预防和治疗LADA患者，最近诊断为1型糖尿病的患者以及存在至少一些内源性胰岛素产生的长期1型糖尿病患者可能特别有用。不受理论的束缚，预见分离的汇集的同种异体MSC群体的免疫抑制特性可以减慢或阻碍胰腺中产生胰岛素的β细胞的自身免疫性破坏。向具有至少一些内源性胰岛素产生的患者施用所述分离的汇集的同种异体MSC群体可能是有益的。
因此，在一个实施方案中，提供了用于本文所述的用途的分离的汇集的同种异体MSC群体，其中所述1型糖尿病或LADA是最近被诊断为1型糖尿病或LADA，例如在施用所述输注前不超过3年，例如不超过2年，例如不超过1年，例如不超过6个月，例如不超过5、4、3、2或1个月被诊断为1型糖尿病或LADA。预期最近被诊断患有1型糖尿病的患者会表现出至少一些内源性胰岛素产生，因此会表达C肽，C肽是一种将胰岛素的A链连接至胰岛素原分子中的B链的短的31个氨基酸的多肽。
在一个实施方案中，提供了用于本文所述的用途的分离的汇集的同种异体MSC群体，其中所述患者最近开始表现出1型糖尿病或LADA的临床症状，例如在施用所述输注前不超过3年，例如不超过2年，例如不超过1年，例如不超过6个月，例如不超过5、4、3、2或1个月开始表现出1型糖尿病或LADA的临床症状。
在一个实施方案中，提供了一种用于本文所公开的用途的分离的汇集的同种异体MSC群体，其中所述患者表达C肽。在一个实施方案中，所述患者的空腹血浆C肽浓度≥0.01nmol/L，例如≥0.04nmol/L，例如≥0.08nmol/L，例如≥0.12nmol/L。
在一个实施方案中，与未治疗的患者相比，所述治疗和/或预防导致接受治疗的患者的血浆C肽浓度降低速率更低，例如，与未治疗的患者相比，接受治疗的患者通过混合膳食耐受性测试(MMTT)测得的刺激血浆C肽浓度降低速率更低。在一个实施方案中，接受输注的患者中血浆C肽浓度的所述降低速率比未经治疗的患者低至少10％，例如至少20％，例如至少30％，例如至少40％，例如至少50％。在另一个实施方案中，与施用前的空腹血浆C肽浓度相比，所述治疗和/或预防导致患者中空腹血浆C肽浓度增加。所述空腹或刺激血浆C肽浓度的增加可以例如在治疗后3个月、6个月或1年测量。在一个实施方案中，在将HbA1c水平维持在低于7的同时，与施用之前每千克体重的胰岛素需求相比，所述治疗和/或预防导致所述患者每千克体重的胰岛素需求减少。在一个实施方案中，与施用前每千克体重的胰岛素需求相比，所述治疗和/或预防导致所述患者每千克体重的胰岛素需求减少。例如，可以在治疗后3个月、6个月或1年测量所述每千克体重的胰岛素需求量的减少。在一个实施方案中，所述治疗和/或预防导致所述患者中的胰岛素独立性(根据ADA标准)，其可以例如在治疗后3个月、6个月或1年进行测量。在一个实施方案中，与施用之前的每天胰岛素需求相比，所述治疗和/或预防导致所述患者的每日胰岛素需求减少。例如，所述减少可能导致在治疗的患者中胰岛素每天需求＜0.50U/kg体重，例如每天＜0.40U/kg体重，例如每天＜0.30U/kg体重，每天＜0.25U/kg体重，例如在治疗后3个月、6个月或1年测量。如本文所述的分离的汇集的同种异体MSC群体将以治疗有效剂量施用。在一个实施方案中，提供了用于本文所公开的用途的分离的汇集的同种异体MSC群体，其中所述用途包括向所述患者施用以下剂量：至少约3×106个细胞，例如至少约5×106个细胞，例如至少约10×106个细胞，例如至少约15×106个细胞，例如至少约20×106个细胞，例如至少约25×106个细胞，例如大约至少约50×106个细胞，例如大约至少约75×106个细胞，例如大约至少约100×106个细胞，例如大约至少约125×106个细胞，例如大约至少约150×106个细胞，例如大约至少约175×106个细胞，例如大约至少约200×106个细胞。在一个实施方案中，所述用途包括向所述患者施用以下剂量：至少约0.1×106细胞/kg体重，例如至少约0.5×106细胞/kg体重，例如至少约1×106细胞/kg体重，例如至少约5×106细胞/kg体重，例如至少约10×106细胞/kg体重。在一个实施方案中，所述用途包括向所述患者施用大约以下剂量：约0.1×106细胞/kg体重至约10×106细胞/kg体重，例如约0.25×106细胞/kg体重至约5×106细胞/kg体重，约0.25×106细胞/kg体重至约4×106细胞/kg体重，约0.5×106细胞/kg体重至约4×106细胞/kg体重，约1×106细胞/kg体重至约4×106细胞/kg体重，约1×106细胞/kg体重至约3×106细胞/kg体重，约2×106细胞/kg体重至约3×106细胞/kg体重，约1×106细胞/kg体重至约2×106细胞/kg体重。
可以预见，所述分离的汇集的同种异体MSC群体将可用作药物组合物。
因此，在本公开的相关的第五方面，提供了一种药物组合物，其包含本文所公开的分离的汇集的同种异体MSC群体和至少一种药学上可接受的赋形剂或载体。所述药物组合物可以用作药物，例如用于治疗选自由炎性疾病或病症、自身免疫性疾病和移植排斥组成的组中的疾病或病症。将理解的是，药物组合物可用于治疗和/或预防与本公开的第四方面有关的任何一种疾病或病症，为了简洁起见，这些疾病或病症将不在这里重复。在一个实施方案中，所述药物组合物包含大约至少约3×106个细胞，例如至少约5×106个细胞，例如至少约10×106个细胞，例如至少约15×106个细胞，例如至少约20×106个细胞，例如至少约25×106个细胞，例如大约至少约50×106个细胞，例如大约至少约75×106个细胞，例如大约至少约100×106个细胞，例如至少约大约125×106个细胞，例如大约至少约150×106个细胞，例如大约至少约175×106个细胞，例如大约至少约200×106个细胞。因此，一个剂量的所述组合物包含上述数量的细胞。
在一个实施方案中，所述药物组合物被配制成用于输注，例如用于静脉内输注、腹膜内输注、淋巴内输注、静脉内输注、鞘内输注、脑内输注、动脉内输注、皮下输注或通过ommaya储液器的输注。在一个实施方案中，所述药物组合物被配制为静脉内、腹膜内或淋巴内输注。
在相关的第六方面，提供了一种治疗和/或预防选自由炎性疾病或病症、自身免疫性疾病和移植排斥组成的组中的疾病或病症的方法，所述非包括向有需要的患者施用治疗有效剂量的本文所公开的分离的汇集的同种异体MSC群体或本文所公开的药物组合物。本领域技术人员将理解，结合本公开的第四方面提及的任何实施方案同样适用于本发明的治疗和/或预防方法。为了简洁起见，在此将不重复或仅简单地提及所述实施方案。在所述方法的一个实施方案中，通过输注来施用所述MSC群体，例如静脉内输注、腹膜内输注、淋巴内输注、静脉内输注、鞘内输注、脑内输注、动脉内输注、皮下输注或通过ommaya储液器的输注。在所述方法的一个实施方案中，施用是通过静脉内、腹膜内或淋巴内输注。
在一个实施方案中，所述输注重复进行。在另一个实施方案中，所述输注只进行1次。在本文所公开的用于治疗和/或预防的方法的一个实施方案中，所述施用在患者中不诱导抗HLA抗体滴度或诱导低抗HLA抗体滴度。在一个实施方案中，所述疾病或病症是移植排斥，例如排斥任何种类的移植，包括细胞、组织、器官或植入物。在一个实施方案中，所述移植排斥可以是器官移植排斥或胰岛移植排斥。在一个实施方案中，所述器官选自由以下组成的组：肾、肝、肺和心脏。在一实施方案中，所述移植是肾脏移植。在一实施方案中，所述移植排斥是胰岛移植排斥。在一个实施方案中，所述炎性疾病或病症选自由自身免疫性疾病组成的组。在另一个实施方案中，所述自身免疫性疾病选自由以下组成的组：肌萎缩侧索硬化、多发性硬化、糖尿病、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、炎性肠病和关节炎，例如1型糖尿病或LADA。在一实施方案中，所述自身免疫性疾病是ALS或炎性肠病。在一个实施方案中，所述1型糖尿病是最近被诊断为1型糖尿病或LADA，例如在施用所述输注前不超过3年，例如不超过2年，例如不超过1年，例如不超过6个月，例如不超过5、4、3、2或1个月被诊断为1型糖尿病或LADA。在一实施方案中，所述患者表达C肽。在一个特定的实施方案中，所述患者的空腹血浆C肽浓度约≥0.01nmol/L，例如约≥0.04nmol/L，例如约≥0.08nmol/L，例如约≥0.12nmol/L。
在本文所公开的方法的一个实施方案中，所述患者最近开始表现出1型糖尿病或LADA的临床症状，例如在施用所述输注前不超过3年，例如不超过2年，例如不超过1年，例如不超过6个月，例如不超过5、4、3、2或1个月开始表现出1型糖尿病或LADA的临床症状。
在一个实施方案中，与未治疗的患者相比，所述治疗和/或预防导致在接受输注的患者中血浆C肽浓度的降低速率更低。在一个实施方案中，接受输注的患者中血浆C肽浓度的所述降低速率比未经治疗的患者低至少约10％，例如至少约20％，例如至少约30％，例如至少约40％，例如至少约50％。在另一个实施方案中，与所述施用前的空腹血浆C肽浓度相比，所述治疗和/或预防导致患者中空腹血浆C肽浓度增加。例如，可以在治疗后约3个月、约6个月或约1年测量所述空腹血浆C肽浓度的增加。在一个实施方案中，与施用前每千克体重的胰岛素需求相比，所述治疗和/或预防导致所述患者每千克体重的胰岛素需求减少。例如，可以在治疗后约3个月、约6个月或约1年测量所述每千克体重的胰岛素需求量的减少。在一个实施方案中，所述治疗和/或预防导致所述患者中的胰岛素独立性(根据ADA标准)，其可以例如在治疗后3个月、6个月或1年进行测量。在一个实施方案中，与施用之前的每天胰岛素需求相比，所述治疗和/或预防导致所述患者的每日胰岛素需求减少。例如，所述减少可能导致在治疗的患者中每天胰岛素需求约＜0.50U/kg体重，例如每天约＜0.40U/kg体重，例如每天约＜0.30U/kg体重，每天约＜0.25U/kg体重，例如在治疗后约3个月、约6个月或约1年测量。
在一个实施方案中，所述方法包括向所述患者施用以下剂量：至少约3×106个细胞，例如至少约5×106个细胞，例如至少约10×106个细胞，例如至少约15×106个细胞，例如至少约20×106个细胞，例如至少约25×106个细胞，例如大约至少约50×106个细胞，例如大约至少约75×106个细胞，例如大约至少约100×106个细胞，例如大约至少约125×106个细胞，例如大约至少约150×106个细胞，例如大约至少约175×106个细胞，例如大约至少约200×106个细胞。在一个实施方案中，所述方法包括向所述患者施用以下剂量：至少约0.1×106细胞/kg体重，例如至少约0.5×106细胞/kg体重，例如至少约1×106细胞/kg体重，例如至少约5×106细胞/kg体重，例如至少约10×106细胞/kg体重。在一个实施方案中，所述方法包括向所述患者施用大约以下剂量：约0.1×106细胞/kg体重至约10×106细胞/kg体重，例如约0.25×106细胞/kg体重至约5×106细胞/kg体重，约0.25×106细胞/kg体重至约4×106细胞/kg体重，约0.5×106细胞/kg体重至约4×106细胞/kg体重，约1×106细胞/kg体重至约4×106细胞/kg体重，约1×106细胞/kg体重至约3×106细胞/kg体重，约2×106细胞/kg体重至约3×106细胞/kg体重，约1×106细胞/kg体重至约2×106细胞/kg体重。
在本公开的另一方面，提供了如本文所公开的分离的汇集的同种异体MSC群体在制备用于治疗选自由炎性疾病或病症、自身免疫性疾病和移植排斥组成的组中的疾病或病症的药物中的用途。
在本公开的另一方面，提供了一种用于评估MSC群体的效力的方法，其包括以下步骤：
培养或提供MSC群体；
使用至少3个测定来测定所述MSC群体以获得所述至少3个测定结果；
对于每个测定，基于测定结果将得分值分配给所述MSC群体，其中较高的得分值表示更理想的测定结果；或其中较低的得分值表示更理想的测定结果；
基于分配给每个测定的得分值，将总得分值分配给所述MSC群体，其中在较高的排名得分值表示更理想的测定结果的情况下，较高的总得分值表示更理想的群体特性；或其中在较低的得分值表示更理想的测定结果的情况下，较低的总得分值表示更理想的群体特性；
在较高的得分值表示更理想的测定结果的情况下，如果所述总得分值高于预定阈值，则将MSC群体资格确定为有效；或在较低的得分值表示更理想的测定结果的情况下，如果所述总得分值低于预定阈值，则将MSC群体的资格确定为有效。在所述方法的一个实施方案中，该方法采用本文定义的至少3个测定。
分离的汇集的同种异体MSC群体还可用于培养用于离体治疗的细胞，例如，MSC群体可用作饲养细胞或提供感兴趣的因子或信号。因此，在本公开的另一方面，提供了本文所公开的分离的汇集的同种异体MSC群体用于免疫细胞的共培养的用途。例如，所述MSC群体可以用作培养中的饲养细胞，用于离体扩增和/或刺激免疫细胞，例如但不限于树突状细胞、天然杀伤细胞、淋巴细胞(例如B细胞或T细胞)、单核细胞和肥大细胞。所述MSC群体可以用作产生外来体的细胞和/或产生旁分泌因子的细胞和/或用于培养中MSC和免疫细胞之间的细胞间刺激。在一个实施方案中，提供了本文所公开的分离的汇集的同种异体MSC群体作为用于免疫细胞共培养的饲养细胞的用途。在一个实施方案中，提供了本文所公开的分离的汇集的同种异体MSC群体用于刺激与所述群体共培养的免疫细胞的用途。可以预见，已经与本文公开的分离的汇集的同种异体MSC群体共培养的所述免疫细胞可用于治疗。
虽然已经参考各种示例性方面和实施方案描述了本发明，但是本领域技术人员应理解，在不脱离本发明的范围的情况下，可以进行各种改变并且可以用等同物来替换其元件。另外，在不脱离本发明的实质范围的情况下，可以进行许多修改以使特定情况、MSC群体或组合物适应本发明的传授内容。因此，意图是本发明不限于所设想的任何特定实施方案，而是本发明将包括落入所附权利要求的范围内的所有实施例。通过以下非限制性实施例进一步说明本发明。
附图说明
图1是示出本公开的分离的汇集的同种异体MSC群体的生产过程的流程图。
图2显示了实施例2中描述的增殖测定的结果。
温育72小时后，外周血单核细胞的CFSE荧光强度的直方图。每个峰代表一个世代(G0位于10^3处)。分图A：
用PHA刺激的PBMC。分图B：用PHA刺激的PBMC，与MSC共培养。分图C：分图A和B的叠加。
图3A和3B显示了实施例4的荧光斑点测定的结果。已经将来自单独供体的细胞接种在96孔荧光斑点测定板上。细胞不受刺激或用r484、聚I：C、GABA、IFNγ刺激。图3A：第1和第2象限包含来自3号供体的细胞，分别分析IL-6和IL-8的表达。第3和第4象限包含来自5号供体的细胞，分别分析IL-6和IL-8的表达。
图3B：第1和第2象限包含来自3号供体的细胞，分别分析IL-13和TGFβ的表达。第3和第4象限包含来自5号供体的细胞，分别分析IL-13和TGFβ的表达。
图4是所选择的单独供体来源的MSC群体的IDO倍数诱导、增殖指数和PGE2测定结果的差异分析，以及根据本文所公开的选择算法对所有分析细胞的评分和所选择的细胞的评分的总体评估的差异的图示。显示标准分布，灰色框表示选择的供体。如分图所示，通过仅选择具有最理想特性的供体，可以减少特定测定的分析结果差异。差异减少的范围从53％(对于IDO倍数诱导)到14％(对于增殖指数)。供体差异的减少反映在总体评估中，即在本实施例中，选择算法的结果是差异减少了40％。
实施例
本非限制性实施例描述了体外扩增的间充质基质细胞的创新性的汇集的同种异体MSC组合物的产生，包括细胞的表征，合适的供体来源的细胞群体的选择以及汇集所述供体来源的细胞群体以获得所述组合物。实施例1-6描述了获得创新性的同种异体MSC组合物的方法。实施例7-10描述了使用所述汇集的同种异体MSC组合物治疗和/或预防1型糖尿病，特别是用于在诊断为1型糖尿病的患者中保持内源胰岛素产生的临床研究。
在实施例部分使用的以下术语具有以下含义：
母细胞库-用于定义在某传代的原料药中间体的术语。在本文提供的实施例中，母细胞库是在第1代的原料药中间体。
原料药中间体-用于定义来自单个供体的生产中，因此被扩增的MSC的术语。符合过程质量标准，但尚未使用选择算法进行评估。原料药中间体对应于本文所公开的单独供体来源的MSC群体，尚未选择对哪个单独供体来源的MSC群体进行汇集。
原料药-用于定义来自单个供体，符合制造质量标准并且已被选择算法鉴定为具有所需特性的MSC的术语。因此，无需进一步培养或扩增。因此，原料药对应于本文所公开的单独供体来源的MSC群体，已经选择了对哪个单独供体来源的MSC群体进行汇集。
药物产品-该术语药物产品是指来自多个供体的离体扩增的华通氏胶来源的间充质干细胞(WJMSC)的细胞悬浮液，该细胞悬浮液已通过选择算法鉴定为具有所需特性。药物产品对应于本文所公开的分离的汇集的同种异体MSC群体。
最终产品-术语最终产品是指包含药物产品和至少一种药学上可接受的赋形剂或载体的药物组合物。
实施例1
本实施例描述了从华通氏胶中收获、运输、离体扩增和冷冻保存MSC的过程。另外，对母体血液进行传染原测试。此外，描述了培养条件。
材料与方法
华通氏胶来源的MSC的母细胞库的生产是从供体资格鉴定到随后在无异种培养系统中的离体扩增的连续过程。
在自然分娩以及剖腹产后在排除胎盘和收集脐带血(用于传染原筛查)后收集脐带(UC)样品。还收集孕妇外周血样品。
为了使污染的风险最小化，使用一次性的无菌剪刀和镊子，并将脐带的片段放入装有补充了1％的抗生素/抗真菌溶液(Gibco目录号：15240-062)的运输液(99％氯化钠(0.9％sol.))(Fresenius目录号：PK03XE050PL)的无菌运输容器中。样品将在保护盒内运输到制造商的实验室。监测运输情况，并在分娩后72小时内处理UC组织。在GMP实验室中，使用无异种无血清的培养基和化合物进行华通氏胶组织的分离和用于细胞分离的外植体培养。
UC组织作为源材料的资格要求提供对医学调查表的完整答复，并提交在UC收集后7天内收集的母体外周血样品以进行传染原测试。供体的采样、测试和筛查(医疗健康调查表)符合指令2006/17/EC的附件II。所有供体测试试剂盒均经过验证可用于预期用途。表1列出了在脐带线合格之前进行的传染原测试。大约有10％-25％的收集的样品符合进一步生产的条件。
传染原/疾病 测试规格 所需结果
HIVI，HIV II 抗HIV I/II (-)没反应
HIVI HIV I核酸测试(NAT) (-)阴性
HBV 抗HB核心 (-)没反应
HBV HBs-Ag (-)没反应
HBV HBV核酸测试(NAT) (-)阴性
HCV 抗HCV (-)没反应
HCV HCV核酸测试(NAT) (-)阴性
CMV 抗-CMV M (-)没反应
CMV 抗CMV G (-)没反应<sup>*</sup>
弓形虫病 抗Toxo M (-)没反应
弓形虫病 抗Toxo G (-)没反应
梅毒 特异的螺旋体抗体测定 (-)没反应
表1.从母体血液(MB)样品中进行传染原测试。*如果对母体血液筛选的CMV IgG的反应结果为阳性，则应从原代培养中进行实时PCR的附加测试。RT PCR CMV的阴性结果对于产品释放是必需的。
到达制造商实验室后，将UC碎片从运输容器中去除并在无菌运输注中洗涤。将UC解剖并去除血管。用无菌刺血针将华通氏胶组织切成1-2mm3的碎片，然后将其置于无异种无血清的培养基中，放入涂有附着溶液(1％MSC附着溶液库99％D-PBS)的培养瓶中，进行初级外植体培养。将培养瓶在37℃下于5％的CO2中温育。培养1至2周后检查粘附的成纤维细胞样细胞的存在。洗去培养物中存在的所有非粘附细胞。细胞培养基包含94％的
Figure BDA0002629213840000252
(生物科学公司(Biological Science)，目录号：05-200-1 A)，5％的
Figure BDA0002629213840000253
补充剂混合物(生物科学公司，目录号：05-201-1 U)和1％的抗生素/抗真菌溶液(Gibco目录号：15240-062)。达到90％融合后，传代原代细胞的粘附细胞(控制培养物的酶消化)，并在1至1.5×105/cm2的条件下重新接种，以便在p.1培养中进一步扩增。扩增2至3周后，收获母细胞库(是第1代粘附细胞)，并且
(i)在冷冻保护剂液(70％-80％人血清白蛋白(5％sol.)(CSL Behring产品目录号：Alburex 5)和20％-30％的二甲基亚砜(WAK Chemie，产品目录号：WAK-DMSO-50)(用于液氮存储的气相)中冷冻保存或
(ii)立即重新接种以进一步扩增。
当将第1代之后的细胞重新接种以进行进一步扩增时，母细胞库仅存在几个小时。不管MCS的寿命如何短，都执行图1中提到的所有测试。
表2.根据图1在制造过程步骤中使用的溶液。
Figure BDA0002629213840000251
*当要冷冻保存母细胞库存时
从脐带组织收集到药物产品释放的生产过程中，没有使用动物来源的原材料。
在外植体的原代培养中以及在每细胞传代的母细胞库制备结束时，取样以确定细菌和真菌污染，支原体和内毒素的存在。在母细胞库和药物产品中评估细胞的数量和活力。从最终产品中评估微生物培养，支原体和内毒素。另外，可将药物产品的一种参考样品解冻并建立细胞培养测试。这种测试培养物可作为产品安全纯度(通过微生物培养，支原体和内毒素测试，核型等)、效力(细胞数，粘附效率和生存力)和同一性(细胞计数免疫表型)的额外最终确认的材料来源。满足表3所列批准标准的培养物符合后续处理或冷冻保存的步骤，实施例2说明了用于评估培养物的分析程序。
结果
制造商证明了自然分娩后获得的脐带来源的WJMSC的微生物学安全性。在运输液中以及后续制造步骤中添加抗生素/抗真菌溶液导致母细胞库以及药物产品中没有微生物(细菌和真菌)。
回顾性分析了从不同供体获得的细胞的特征，从而使所有MCS都能满足制造如表4所示的可比较药物产品的标准。
表6中列出的五种来自不同供体的母细胞库的分析结果显示出细胞特性的高度相似性。因此，本程序提供了高度均一的MSC群体，这些群体满足所需的安全标准。
表3.测试和验收规格
测试或规格 目标 批准标准
生产中培养基的无菌性 安全，纯度 未检测到细菌/真菌
母细胞库的无菌性 安全，纯度 未检测到细菌/真菌
支原体 安全，纯度 未检测到
内毒素 安全，纯度 未检测到(＜0.25IU/ml)
细胞计数 效力 ≥200×10<sup>6</sup>
细胞活力 效力 ≥80％
表面粘附 效力，同一性 ≥90％的贴壁细胞
核型 安全性 46和性染色体
CD45抗原表达 同一性 ＜5％
CD34抗原表达 同一性 ＜5％
CD14抗原表达 同一性 ＜5％
CD19抗原表达 同一性 ＜5％
CD3抗原表达 同一性 ＜5％
CD73抗原表达 同一性 ≥70％
CD90抗原表达 同一性 ≥70％
CD105抗原表达 同一性 ≥70％
表4.不同批次母细胞库的分析
Figure BDA0002629213840000271
*母体血液中CMV IgG阳性结果。原代培养的实时PCR检测证实培养细胞中缺乏病毒DNA
**在一个抗体组中进行的测试
实施例2
本实施例根据ISCT的标准描述了基于MSC的形态、增殖能力和标记的表达的来自供体的MSC表征。此外，筛选细胞中是否存在支原体，内毒素，细菌污染物，真菌污染物，病毒污染物和/或内毒素，并进行核型测试。所描述的表征结果可鉴定源自原料药中间体的MSC群体，其中MSC符合汇集的质量标准。
材料和方法：
首先，在标准培养条件下保持MSC时，MSC必须是塑料粘附性的。仅对塑料粘附性细胞进行下述分析程序。根据以下分析程序筛选培养物。
分析程序
传染原。
采样。在排出胎盘后的几分钟内获得用于WJ-MSC制造的原材料(脐带的胎盘部分)。这就是为什么传染原传播的唯一途径是通过胎盘从母体血液中传播。分娩当天和来源组织收获时，收集了供体-母亲的两个外周血样品。
分析。根据制造商的说明，使用用于化学发光免疫分析的ABBOTT ARCHITECT 2000和用于NAT分析的Procleix PANTHER系统。使用进行化学发光免疫分析的Abbott ACHITECT进行以下测试：HIV Ag/Ab Combo；HBsAg定性II；抗-HBc II；抗-HCV；CMV IgM；CMV IgG；Toxo IgM；Toxo IgG；和Syphilis TP。此外，Proclex Utrio Plus测定用于定性筛选人类供体血浆和血清样本中HIV-1 RNA，丙型肝炎病毒(HCV)RNA和乙型肝炎病毒(HBV)DNA的体外核酸扩增。
验收标准。传染原的测试结果必须为“阴性”，“非反应性”或“未检测到”(CMV IgG除外：该测试结果呈阳性制造商通过RealTime PCR测试确认产品中不含CMV DNA)。
无菌性。
采样。酶促收获后，来自培养物的细胞和上清液的样品(10mL)。
分析。将样品接种到两个BACTEC瓶中，用于培养厌氧和好氧细菌以及检测真菌污染。将这些瓶放在BACTEC FX400微生物分析仪中放置14天。
验收标准。温育14天后，好氧厌氧细菌和真菌微生物的测试结果必须为“阴性”或“未检测到”。
支原体。
采样。酶促收获后，来自培养物的细胞和上清液的样品(0.1mL)
分析。
Figure BDA0002629213840000281
GeM经典测定(Merck KGaA，目录号MP0025)基于PCR扩增，根据制造商的说明使用。
验收标准。凝胶槽中的扩增产物的测试结果必须为“未检测到”。
内毒素。
采样。酶促收获后，来自培养物的细胞和上清液的样品(0.5mL)
分析。根据制造商的建议，使用
Figure BDA0002629213840000282
(查尔斯河实验室(CharlesRiver Laboratories)，目录号PTS2005F)实时内毒素测试系统。
验收标准。测试结果必须为“未检测到”
细胞计数。
采样。酶促收获分析后，来自培养物的细胞的样品(0.5mL)。使用Malassez室对细胞数量进行光学显微镜分析。
验收标准。不少于所需细胞数量的98％
细胞活力。
采样。酶促收获后，来自培养物的细胞的样品(0.5mL)
分析。使用FACS Calibur流式细胞仪对7-AAD(碧迪公司(Becton，Dickinson andCompany)，目录号559925)染色的细胞悬浮液进行流式细胞分析。
验收标准。超过80％的活细胞。
免疫分型。
采样。酶促收获后，来自培养物的细胞的样品(0.5mL)
分析。使用FACS Calibur流式细胞仪对先前用单克隆抗体标记的细胞进行流式细胞分析，测试的抗原列于表4。
验收标准-CD73，CD90和CD105在70％以上的细胞中表达。谱系抗原(CD45，CD34，CD14或CD11b，CD79α或CD19和HLA-DR表面分子)缺乏表达。
细胞核学。
采样。特别针对此测定进行的细胞培养。
分析。用Colcemid封闭培养物并用Giemsa染色。评估染色体数量和结构畸变。
验收标准。46条染色体，XY；无可见畸变。
分化测定
将细胞进行分化
分析。根据制造商的说明进行分化测定。人间充质干细胞功能鉴定试剂盒，目录号SC006，R&D系统公司(R&D Systems，Inc.)，其设计用于根据人MSC分化为多种间充质谱系的能力进行鉴定。试剂盒包含专门制定的成脂、成软骨和成骨培养基补充剂，可用于有效地将MSC分化为成脂、成软骨或成骨谱系。包括一组由抗mFABP4、抗hAggrecan和抗hOsteocalcin组成的抗体，以分别定义脂肪细胞、软骨细胞和骨细胞的成熟表型。
Figure BDA0002629213840000291
软骨分化试剂盒，目录号：A1007101，赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific Inc.)，它是为组织培养容器中的间充质干细胞(MSC)的软骨分化而开发的。该试剂盒包含诱导MSC参与软骨生成途径并生成软骨细胞所需的所有试剂。
验收标准。能够体外分化为成骨细胞、脂肪细胞和成软骨细胞。
结果
当保持在标准培养条件下时，获得的MSC群体是塑料粘附性的。如实施例3中所述，MSC表达CD105、CD73和CD90，并且缺乏CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79α或CD19和HLA-DR表面分子的表达，并且能够在体外分化为成骨细胞、脂肪细胞和成软骨细胞。因此，鉴定了适合汇集的MSC群体。
尽管当前使用这些标准，但是随着新知识的发展，它们可能需要进行修改，从而导致例如根据ISCT的标准的MSC的定义的改变，但发明人认为上述最小标准集将有助于对MSC进行更统一的表征。如本文所用，根据ISCT的标准定义MSC。
实施例3
本实施例描述了用于表征来自原料药中间体的所述MSC群体的形态，增殖和功能特性的筛选测定，以便选择要汇集的MSC群体。
材料和方法：
以下是用于表征MSC群体的6个测定的描述。
测定1-IDO：IDO测定用于分析原料药中间体或原料药，即间充质干/基质细胞(MSC)的免疫抑制能力。
据报道，UC-MSC的免疫调节潜力是通过测量培养上清液中的色氨酸和犬尿氨酸来测定的吲哚胺2，3-双加氧酶(IDO)活性的量度。吲哚胺-吡咯2，3-双加氧酶(IDO或INDO EC1.13.11.52)是一种含血红素的酶，在人体内由ID01基因编码。IDO酶将L-色氨酸转化为N-甲酰基犬尿氨酸(或犬尿氨酸)，一种可作为免疫细胞(包括T细胞)增殖的抑制剂的免疫抑制分子。IDO活性为犬尿氨酸/色氨酸的比率，并且可以通过使用ELISA试剂盒计算细胞培养上清液中存在的色氨酸和犬尿氨酸的量来确定。当用干扰素γ(IFNγ)刺激时，与不刺激时相比，间充质干/基质细胞(MSC)分泌更多的IDO。
可诱导的IDO活性表明释放的细胞具有与免疫调节相关的功能效能。
MSC培养：在100μl测定培养基(DMEM，低葡萄糖，GlutaMAXTM补充剂，丙酮酸(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific)，目录号21885025)+合格的热失活的10％胎牛血清(赛默飞世尔科技公司，目录号16140071))中，在48孔细胞培养板中接种10000MSC/孔。稀释来自库的IFNγ，1mg/ml(赛默飞世尔科技公司，目录号PHC4033)。每孔IFNγ的最终浓度为100ng/ml。向孔中添加100μl的200ng/ml的IFNγ。向非刺激细胞(无IFNγ)中添加100μl的测定培养基。将细胞培养板在37℃，5％CO2下温育72小时。从每个孔中取出上清液，并保存在-20℃的微管中，直至进一步处理以进行ELISA分析。
色氨酸和犬尿氨酸的测量是根据ELISA试剂盒制造商提供的手册(免疫诊断公司AG(Immundiagnostik AG)，目录号K 3730和K 3728)进行的。色氨酸和犬尿氨酸的ELISA均在同一天，但分开进行。两种ELISA均按照制造商的说明进行；请参见相应ELISA的手册。
在Spectramax酶标仪(分子仪器公司(Molecular Devices)，Spectramax 190)中测量扣除620nm处背景的450nm处的吸收。
分析结果：测得的吸光度与样品中氨基酸的含量成反比；即OD450越低，犬尿氨酸或色氨酸越多。按照试剂盒制造商的推荐，使用4PL算法(四参数对数回归)来计算结果(软件SoftMax Pro 7.0.2，分子仪器公司)。浓度直接从标准曲线确定。应评估试剂盒随附的对照样品的可接受性：如果超出试剂盒制造商的可接受范围，则需要重新测定样品。
结果
根据选择算法(实施例4)，将来自原料药中间体的IFNγ处理细胞的相对IDO生物活性用于样品排名。生物活性增加最高的供体获得最高排名得分。排名得分(表5)随后用于供体的最终选择(请参见实施例4)。
表5.基于IDO倍数增加的排名得分的示例。
供体 IDO倍数增加 排名得分 供体 IDO倍数增加 排名得分
D5 150 3 D3 112 2
D7 130 3 D2 100 1
D4 125 3 D8 90 1
D6 124 2 D10 85 0
D1 112 2 D9 80 0
测定2：增值测定
该方法用于定量测量原料药中间体和/或原料药即脐带来源的MSC对外周血单核细胞(PBMC)增殖的免疫抑制作用。MSC已显示抑制T淋巴细胞的增殖。与MSC的混合淋巴细胞反应经常用于证明MSC的免疫抑制活性。
植血凝集素(PHA)被用作激活T淋巴细胞增殖的促有丝分裂剂。原料药中间体和/或原料药的免疫抑制活性被量化为PHA刺激的T淋巴细胞增殖的减少。
培养和CFSE引发：500μl工作培养基(RPMI1640(赛默飞世尔科技公司，目录号12633012)+2mM Glutamax(赛默飞世尔科技公司，目录号35050061)+100U/ml Pest(赛默飞世尔科技公司，目录号15140122)+10％FBS(赛默飞世尔科技公司，目录号16140071)MSC(2×105细胞/孔))接种在12孔细胞培养板中。将板在37℃+5％CO2下温育2小时，以使细胞发生塑料粘附。LymphoprepTM试剂盒用于根据制造商的说明(干细胞技术公司(Stem CellTechnologies)，目录号07801)从捐献的外周血(其从血液中心提取)中分离单核细胞。PBMC悬浮在RPMI 1640中，浓度为22×106细胞/ml。CellTraceTM CFSE细胞增殖试剂盒(赛默飞世尔科技公司，目录号C34554)用于根据制造商的说明测定增殖。
分析：CFSE阳性细胞通过流式细胞仪(默克公司(Merck)，Guava easyCyte 5HT)进行分析。CFSE直方图包含3个或4个峰，右边的第一个顶部代表未分裂的细胞(G0)。随后顶部显示了不同的世代(G1-G4)。增殖指数(PI)计算为所有世代细胞总数除以进入细胞分裂的亲代细胞数。
表6.基于增殖指数的排名得分的示例。
供体 增殖指数 排名得分 供体 增殖指数 排名得分
D7 0.90 3 D1 1.02 2
D5 0.92 3 D8 1.03 1
D6 0.98 3 D2 1.03 1
D4 1.00 2 D9 1.05 0
D3 1.00 2 D10 1.11 0
结果
每种原料药中间体的平均增殖指数用于供体的相对比较。PI最低的供体获得最高的排名得分。排名得分(表6)随后用于供体的最终选择(请参见实施例4)。
测定3：前列腺素E2
与通过植物血凝素(PHA)活化的外周血单核细胞(PBMC)共培养时，前列腺素E2(PGE2)测定可评估PGE2的原料药中间体和/或原料药分泌。
细胞培养：在存在和不存在PHA(默克公司，目录号11082132001)的情况下，以共培养细胞比例为MSC-PBMC 1/5将细胞在测定培养基(DMEM，低葡萄糖，GlutaMAXTM补充剂，丙酮酸(赛默飞世尔科技公司，目录号21885025)+10％的合格的、热失活的胎牛血清(赛默飞世尔科技公司，目录号16140071))中温育3天。将MSC以每孔40000个MSC接种到12孔细胞培养板中。将细胞培养板在37℃，5％CO2下温育2小时，以使细胞粘附。
LymphoprepTM试剂盒用于根据制造商的说明(干细胞技术公司(Stem CellTechnologies)，目录号07801)从捐献的外周血(其从血液中心提取)中分离单核细胞。将PBMC悬浮在测定培养基中，0.5×106细胞/ml，并将400μl接种到用于PBMC的孔中。将500μl测定培养基添加到没有PBMC的孔中。将100μg/ml的PHA以100μl/孔添加到含有PBMC的孔中，并将细胞培养板在37℃，5％CO2下温育72小时。从每个孔中除去上清液，并以500g离心5分钟以除去颗粒。将上清液冷冻并保存在-20℃下，直到进一步处理以进行ELISA分析为止。
ParameterTM前列腺素E2免疫测定试剂盒根据制造商的说明(生物技术公司(Bio-Techne)，目录号KGE004B)用于PGE2表达检测，并通过Spectramax酶标仪(分子仪器公司，Spectramax 190)进行分析。使用4PL算法(四参数对数回归)来计算结果(软件SoftMax Pro7.0.2，分子仪器公司)。
结果
每种原料药中间体的PGE2平均表达(pg/ml)用于供体的相对比较。表达水平最高的供体获得最高排名得分。排名得分(表7)随后用于供体的最终选择(请参见实施例4)。
表7.基于PGE2表达的排名得分的示例。
供体 PGE2表达 排名得分 供体 PGE2表达 排名得分
D5 14900 3 D3 12400 2
D7 13000 3 D2 12000 1
D4 12900 3 D8 11100 1
D6 12600 2 D10 10000 0
D1 12500 2 D9 9000 0
测定4：HLA-G
HLA-G测定评估了响应于IFNγ、IL-10和/或PHA的可溶性和/或细胞内HLA-G的原料药中间体和/或原料药表达。
细胞培养：将每孔50000MSC和25000个JEG-3细胞(阳性对照细胞，ATCC，目录号
Figure BDA0002629213840000331
-36TM)接种到12孔细胞培养板的1ml测定培养基(DMEM，低葡萄糖，GlutaMAXTM补充剂，丙酮酸(赛默飞世尔科技公司，目录号21885025)+10％的合格的、热失活的胎牛血清(赛默飞世尔科技公司，目录号16140071))中，具有最终浓度为10-50ng/ml的IL-10(美天旎生物技术公司(Miltenyi Biotec)，目录号130-108-985)或25-100ng/ml IFNγ(赛默飞世尔科技公司，目录号PHC4033)或无刺激。接下来，将细胞在37℃，5％CO2下温育48h至72h。从每个孔中除去上清液，并保存在-20℃下用于可溶性HLA-G的ELISA分析。细胞内HLA-G：将贴壁细胞用DPBS洗涤两次，然后用TrypLE Express(赛默飞科技公司(ThermoScientific)，目录号12604021)分离。根据制造商的说明，使用BD Cytofix/CytopermTM(碧迪公司，目录号554714)进行细胞的固定和透化。根据制造商的说明，将细胞用HLA-G(PE)抗体(EXBIO Praha，目录号1P-431-C100)染色，并通过流式细胞仪(默克公司，GuavaeasyCyte 5HT)进行分析。
可溶性HLA-G：根据制造商的说明，使用sHLA-G ELISA试剂盒(恩佐生命科学公司(Enzo Life Sciences)，目录号ALX-850-309-KI01)分析上清液中HLA-G的浓度。
结果
分析原料药中间体和/或原料药的细胞内和可溶性HLA-G表达，并根据与其他分析样品相比的相对表达获得得分。总结了来自细胞内和可溶性HLA-G表达的总得分，并且原料药中间体获得了用于最终供体选择的排名得分(表8)(参见实施例4)。
表8.基于sHLA-G和iHLA-G得分的排名得分的示例。
供体 可溶性HLA-G sHLA-G得分 细胞内HLA-G iHLA-G得分 HLA-G得分 排名得分
D5 1110 8 0％ 9 17 3
D7 1100 7 1％ 6 13 3
D4 990 4 0％ 9 13 3
D6 1200 9 6％ 1 10 2
D1 1002 6 1％ 6 12 2
D3 980 3 0％ 9 12 2
D2 1000 5 8％ 0 5 1
D8 937 2 5％ 3 5 1
D10 825 1 5％ 3 4 0
D9 600 0 2％ 4 4 0
测定5：形态
连续监测原料药中间体和/或原料药培养物的细胞形态。在扩增过程中以及收获前对细胞进行目视检查，并根据以下进行评估：
·细胞大小 正常/大
·细胞核大小 正常/大
·细胞形态 正常/异常
·细胞大小与细胞核大小之比 正常/异常
结果
根据上述标准目测评估原料药中间体细胞。仅接受正常细胞含量超过90％的样品。使用异常细胞的频率对原料药中间体进行排名(表9)(参见实施例4)。
表9.基于形态的排名得分的示例。
供体 异常细胞百分比 排名得分 供体 异常细胞百分比 排名得分
D5 0％ 3 D4 2％ 2
D6 0％ 3 D3 5％ 1
D7 0％ 3 D8 5％ 1
D1 1％ 2 D9 6％ 0
D2 1％ 2 D10 8％ 0
测定6：荧光斑点(Fluorospot)
在预先涂有抗体的荧光斑点特异性96孔板(MabTech提供)中培养原料药中间体和/或原料药。将细胞以每孔1000-3000个接种在100μl测定培养基(DMEM，低葡萄糖，GlutaMAXTM补充剂，丙酮酸(赛默飞世尔科技公司，目录号21885025)+10％的合格的、热失活的胎牛血清(赛默飞世尔科技公司，目录号16140071))中并且在不存在刺激或存在刺激的情况下温育48小时。所使用的刺激是聚I：C(英杰公司(Invivogen)，目录号tlrl-pic)，r848(英杰公司，目录号tlrl-r848)，GABA(戴米德医疗公司(Diamyd Medical))和IFNγ(赛默飞世尔科技公司，目录号PHC4033)。IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-12、IL-12/13、IL-17A、IL-21、IL-22、IL-29、IL-31、TGFβ1、GM-CFS、IFNα、IFNγ、apoE和TNFα的表达用荧光斑点(MabTech)分析。
较早批次的汇集的同种异体MSC组合物(即药物产品)用作参考。该测定同时包含被认为需要的和不需要的蛋白质和细胞因子。例如，如果细胞表达IL-6则为阳性，但如果表达IFNγ则为阴性。
表10：在所述荧光斑点测定中使用的抗体。
Figure BDA0002629213840000351
结果
使用荧光斑点阅读器随附的软件分析结果。该程序会生成可视化的和数字的输出(请参见图3)。
对原料药中间体样品相对于参考样品(数值)进行评分。为每个标记物预定义了阳性与阴性的阈值，并且根据表12对原料药中间体进行了评分。
表11：将标记物转换为数字得分。
Figure BDA0002629213840000352
原料药中间体的最终排名是基于所有分析的有或没有刺激的标记物的总分(表12)。
表12.所有分析的标记物的排名得分的示例。
Figure BDA0002629213840000361
D1＝供体1，D2＝供体2等。M1＝标记物1，M2＝标记物2等。S1＝刺激1，S2＝刺激2等。M1和M4为阳性标记物。M2和M3为阴性标记物。
原料药中间体的排名基于针对荧光斑点测定的排名得分。该排名得分随后用于实施例4中所述的供体的总体选择。得分最高的原料药中间体样品也将获得最高排名得分(请参见表13)：
表13.基于荧光斑点测定得出的总分的排名得分的示例。
供体 得分 排名得分 供体 得分 排名得分
D6 8 3 D4 5 2
D5 7 3 D3 4 1
D7 7 3 D8 3 1
D1 5 2 D9 3 0
D2 5 2 D10 1 0
此外，也有可能将部分或全部荧光斑点结果用作选择算法的输入，即，来自每种分析蛋白质的数据作为选择算法中的单独成分。
实施例4
本实施例描述了基于实施例3中描述的特征选择来自供体的MSC群体的过程，该过程导致用于汇集的细胞群体的子集以获得本发明的汇集的同种异体组合物。
材料与方法：
分析和排名：使用上述测定对原料药中间体样品进行分析(IDO、增殖、PGE2、HLA-G、形态和荧光斑点)。样品排名如下所述进行：
1.使用一式两份的细胞培养样品进行上述IDO测定两次，每个样品通过ELISA一式三份进行分析。将较早批次的汇集的同种异体MSC作为参考样品。IDO测定包含对照样品，每次运行都要进行分析，并使用适当的统计方法评估对照样品分析产生的结果的可接受性。两个对照的可接受范围根据制造商的说明。可接受范围的实例为：犬尿氨酸(μmol/L)对照1：0.53-1.33和对照2：1.78-4.15；色氨酸(μmol/L)对照1：15.0-35.0和对照2：31.2-72.8。测定所用的质量标准为：IDO对照在指定范围内且IDO活性(参考样品)＞60倍，即干扰素γ(IFNγ)参考样品与未刺激参考样品相比的IDO活性的诱导倍数。
原料药中间体根据其相对IDO表达进行排名。
2.使用一式两份的细胞培养样品进行上述增殖测定两次，每个样品通过FACS一式三份进行分析。样品对PBMC增殖的影响表示为增殖指数PI。较早批次的汇集的同种异体MSC用作参考样品，在无MSC的情况下用PHA刺激的PBMC用作阳性对照。测定所用的质量标准为：增殖指数(阳性对照)＞1.5和增殖指数(参考)0.9-1.3。
原料药中间体根据其相对增殖指数进行排名
3.使用一式两份的细胞培养样物进行PGE2测定两次，每个样品通过ELISA一式三份进行分析。该试剂盒包括用于为每个实验建立标准曲线的标准物。较早批次的汇集的同种异体MSC用作参考样品，并根据在PHA激活的PBMC存在下PGE2表达的水平对样品进行比较。测定所用的质量标准为：PGE2表达(参考)5-15ng/ml和标准曲线R2＞0.95。
原料药中间体根据其相对PGE2表达进行排名。
4.使用一式两份的细胞培养样物进行HLA-G测定两次，每个样品通过ELISA或FACS一式三份进行分析。较早批次的汇集的同种异体MSC用作参考样品，并根据在PHA激活的PBMC存在下HLA-G表达的水平对样品进行比较。该ELISA试剂盒包括用于为每个实验建立标准曲线的标准物。测定所用的质量标准为：可溶性HLA-G表达(参考)＞3U/ml，标准曲线R2＞0.95和细胞内HLA-G表达(参考)＞5％，原料药中间体根据其相对的HLA-G细胞内和/或可溶性表达进行排名。
5.形态评估是由在MSC培养方面具有丰富经验的实验室人员进行的。较早批次的汇集的同种异体MSC用作参考样品，并根据以下来评估样品：细胞大小(正常或大)；细胞核大小(正常或大)；细胞形状(正常或异常)；细胞大小和细胞核大小之比(正常或异常)。测定所用的质量标准为：根据所有四个标准，＞90％的正常细胞。参考样品具有＞90％的正常细胞。异常细胞超过10％的原料药中间体被取消资格。根据异常细胞的频率对原料药中间体进行排名。
样品的离群值和不合格：从每个细胞培养孔中一式三份分析ELISA和FACS。三个重复中只有一个可以视为离群值。离群值分析基于ELISA的6光密度(AOD)和增殖指数以及FACS的HLA-G阳性百分比。如果变异系数(CV)＞10％，则分析来自细胞培养孔的测量值的离群值。当从分析中去除时，如果排除副本将使CV降低＞3％，则偏离平均值最大的副本被认为是离群值。这种离群值没有进一步的理由就被排除在分析之外。
如果离群值分析后CV＞20％，则单个细胞培养孔的分析不合格。同一实验中三个或更多不合格细胞培养孔将取消进行该实验的资格。
总体评估：原料药中间体的选择是根据下表14所示的得分系统对测定的总体评估。每个测定都会产生排名得分，在此最终选择中，所有测定的排名得分通过加法汇总。从实施例3中描述的10个供体中选择5个供体，如表14所示，每个测定对总得分和最终决定的贡献等同。每个测定的排名值相加以获得累加的总得分。
Figure BDA0002629213840000381
表14.基于相加总得分的选择的实例。
可替代地，通过分配测定的权重(从而允许分析影响更多或更少供体的选择)来完成从10个供体中选择5个。一个实例是对形态给予因子二，并将HLA-G测定的重要性降低一半。将加权的排名得分相加以获得加权的总得分。表15显示了基于加权总得分的实施例3的结果：
Figure BDA0002629213840000382
Figure BDA0002629213840000391
表15.基于加权总得分的选择的实例。
结果
选择具有最高总得分(相加/简单或加权的)的5种原料药中间体(DX)以制造本公开所述的分离的汇集的同种异体MSC群体，即药物产品。因此，分离的汇集的同种异体群体包含来自5个不同供体的MSC，这些MCS满足本文公开的功能、形态和安全性标准。
实施例5
本实施例描述了最终产品的制造方法，该最终产品是如下所述的包含赋形剂的单细胞悬浮液。将所述最终产品填充到适于冷冻保存的转移袋中，并根据如下所述的预定温度曲线进行冷冻。
Figure BDA0002629213840000392
表16.最终产品*Alburex 5(CSL Behring)的组成包装，50G/L；人血清白蛋白50g/L；蛋白质纯度＞96％，N-乙酰基色氨酸钠，辛酸钠，氯化钠
**WAK Chemie，目录号WAK-DMSO-50。
材料与方法
供体汇集
只有通过所有验收标准的供体样品才被考虑汇集。根据实施例3和4选择所用的药物。在第3代中汇集药物后，直接进行冷冻保存。由此获得药物产品。重要的是，药物产品不进行任何进一步的培养或扩增。
药物产品的配制和包装
最终产品是5mL细胞悬浮液，并放入冻存袋中。
表16显示了包括药物产品在内的冷冻保存的最终产品的组成：
结果
因此，获得了如本文所公开的最终产品。
实施例6
本实施例描述了冷冻保存后最终产品的稳定性的评价。它表明最终产品在解冻后至少2小时是稳定的。
材料与方法
本发明的组合物在装有5ml细胞悬浮液的冻存袋中在液氮或干冰上运输，每袋1亿个细胞，为最终产品。将冻存袋在水浴(37℃)中解冻，然后直接转移到通常装有100ml氯化钠溶液的输注袋中。然后准备好105ml的输注溶液进行输注。通过在不同时间点从输注袋中取样来分析细胞的活力。通过采集约1×106个细胞的样品并在95％的
Figure BDA0002629213840000401
XF(生物科学，目录号：05-200-1A)，5％的
Figure BDA0002629213840000402
XF补充混合物(生物科学公司(Biological Science)，目录号：05-201-1U)中解冻后的5分钟，1小时和2小时进行培养来进一步分析细胞的功能。其中，NutriStem仅使用一次，然后将其更换为测定培养基(DMEM，低葡萄糖，GlutaMAXTM补充剂，丙酮酸(赛默飞世尔科技公司，目录号21885025)+10％的合格的、热失活的胎牛血清(赛默飞世尔科技公司，目录号16140071))。肉眼观察细胞的塑料粘附，并在适当的时间间隔拍摄显微照片。解冻后细胞的活力分析是根据制造商的说明，通过流式细胞仪(默克公司，GuavaeasyCyte 5HT)分析7-氨基放线菌素D(7-AAD，碧迪公司，目录号559925)进行。根据制造商的说明，分析通过CD90(碧迪公司，目录号561557)和HLA-DR(Exbio，目录号IF-690-T100)的表型特征。
结果
活力：当活力＞80％时，细胞被认为是稳定的，因此如表17所示解冻后24小时CB1在室温下保存时是稳定的。
解冻时间 活力％ SD％ cv％
22min 94.9 1.9 2
40min 99.2 0.15 0.15
1h 98.4 0.27 0.27
2h 98.0 0.11 0.11
3h 97.5 0.13 0.13
24h 92.7 0.11 0.11
表17.解冻后22分钟至24小时CB1的活力结果。
表型表征：无论开始培养之前在RT中的时间如何，MSC Nutristem基础培养基和DMEM中生长的CB1细胞显示高百分比的CD90表面标记物，＞99％。发现HLA-DR是阴性的(参见表18)。
Figure BDA0002629213840000411
表18.在MSC Nutristem基础培养基(NS)或DMEM+10％FBS(DMEM)中培养的CB1细胞中CD90和HLA-DR表面标记物的单染色。
表面粘附：在MSC Nutristem基础培养基中培养1小时后，细胞已经附着在T-75烧瓶的表面。培养24小时后，在DMEM+10％FBS中生长的细胞附着。
结论：所分析批次的本发明组合物满足质量标准，在室温下3小时后细胞活力＞97％，在室温下24小时后＞92％。另外，在解冻后5分钟、1小时和2小时培养的细胞中，CD90表面标记物为阳性，而HLA-DR染色为阴性。与在常规细胞生长培养基中培养相比，在MSC特异性培养基(MSC Nutristem基础培养基)中培养的细胞的表面粘附更快。24小时后，所有“解冻后时间”的细胞均已附着。由于内部测试的所有标准均在可接受的结果范围内，因此可以验证该批次的高质量。
实施例7
本实施例提供了将本发明的汇集的同种异体MSC组合物输注到诊断为1型糖尿病的患者中的临床研究设计的总结。考查了安全性和耐受性以及β细胞功能、代谢控制和糖尿病治疗满意度的变化。将报告任何不良事件，并将研究与最终产品的潜在因果关系。
研究设计：进行了I期和II期联合研究。第一部分是由9名18-40岁的男性患者组成的开放式剂量递增研究。第二部分是随机、双盲、安慰剂-对照的I/II期平行设计，比较了在诊断为1型糖尿病的成年患者中使用本文所述的汇集的同种异体MSC组合物与安慰剂进行的治疗。评估内源性胰岛素生产的安全性，保存(以C肽浓度衡量)以及代谢控制、糖尿病治疗满意度和免疫学谱。
共有24名患者入选本研究(第一部分为9名患者，第二部分为15名患者)，并在最终产品/安慰剂治疗后随访一年。实施例8中描述了纳入和排除标准。
在研究的第一部分中，患者1-3接受单剂量的2500万个细胞，患者4-6接受1亿个细胞，而患者7-9接受2亿个细胞。研究第二部分中的15名患者将以比例为1∶1∶1分配至三组之一：A.用WJMSC的同种异体输注(批次1)，即最终产品批次1；B.用WJMSC的同种异体输注(批次2)，即最终产品批次2；和C.安慰剂输注。在统计分析中，将组A和组B汇集，并将其与组C进行比较。
在研究的第二部分中，所有患者均将接受固定剂量的最终产品。初步建议剂量为1亿个MSC，但在评估第1部分的数据以确认初步建议剂量之前，第2部分中不会进行任何给药。
该研究从筛选期开始，以获得知情同意、筛选和纳入研究。纳入研究必须在1型糖尿病诊断的两年内。在整个研究过程中，所有患者将继续进行其胰岛素治疗，并根据临床实践调整胰岛素剂量以维持最佳血糖控制。所有患者(1-24)将遵循设定的就诊时间表，在每次就诊期间，将根据表19进行一系列测试和程序。
Figure BDA0002629213840000421
表19.研究概述。从上面指出的日期开始，就诊3和4可以进行+/-3天，就诊5可以进行+/-7天，而6-8可以进行+/-14天。
研究结束被定义为最后一个参与者的最后随访。
在整个研究过程中，患者的安全至关重要。研究人员将至少可能与最终产品相关的每种严重不良反应(SAE)归类为预期的或未预期的，并根据方案进行随访。
结果
对包括的24名患者的医疗状况的清晰见解。这包括安全性和不良事件参数，并且将有助于深入了解设定的功效终点。
对于多种疾病，例如移植物抗宿主病、心肌梗塞或肝硬化后的组织再生、或成骨不全症，在临床研究中以前未观察到MSC治疗的副作用，或仅有轻微副作用。尚无已知患者发生肿瘤的风险增加，也未观察到异位组织形成(von Bahr等人，(2012)Biol Blood MarrowTransplant[生物学和骨髓移植]；18：557-564，von Bahr L等人，(2012)(Stem Cells[干细胞]；30：1575-1578)。类似地，在新诊断为1型糖尿病的成年患者的第一项研究中，未观察到副作用(Hu J等人，(2013)Endocr J[内分泌杂志]；60：347-357，Carlsson PO等人，(2015)Diabetes[糖尿病]2015；64(2)：587-92)。
用于本研究的制造商生产的WJMSC先前已在各种条件下用于医院豁免程序，并且细胞的安全性谱是一致的，并且耐受性良好的，仅具有与产品相关的轻度和短暂不良反应。然而，已经报道，对于接受治疗的终末期ALS患者和4级GVHD患者，由于潜在疾病引起严重不良事件和死亡。在本研究中，任何预期的不良事件均为轻度和短暂的流感样症状。
用包含药物产品的最终产品的本发明治疗是来自多个供体的细胞的同种异体移植，并且保证了HLA错配。如果生命晚期的T1DM患者需要进行肾脏移植，则会给患者带来HLA免疫的巨大理论风险。
没有临床相关性的针对外源性HLA的抗体有望在多达20％的患者中使用。
成功的干预将对受试患者是非常有益的，可能为患者提供更低的HbA1c、更低的血糖波动以及降低的酮症酸中毒风险。这也将大大降低严重的降血糖事件和晚期并发症的风险。与接受安慰剂(对照)的患者相比，接受本发明最终产品的患者的治疗前和治疗后12个月C肽浓度的降低预计较小。
实施例8
本实施例描述了研究群体的选择标准。参加研究的每个患者必须满足所有纳入标准，并且不满足排除标准。
纳入和排除标准：降从新诊断的1型糖尿病患者群体中招募受试者。
有资格参与本研究的患者必须满足以下条件：1.签署书面知情同意书以参与研究；2.与入组前2年内诊断出的1型糖尿病相适应的临床病史；3.在研究的第一部分，患者1-9仅包括18-40岁之间的男性患者。在研究的第二部分中，将包括年龄在10至24岁之间，年龄在18至40岁之间(包括两端点)的男性和女性患者；4.空腹血浆C肽浓度＞0.12nmol/L；和5。非孕妇，并使用批准的避孕/禁欲方法。
满足以下任何一项筛选标准的患者不符合纳入本研究：1.无法提供知情同意；2.体重指数(BMI)＞30或体重＞100kg的患者；3.体重＜50kg的患者；4.心血管状况不稳定的患者，包括NYHA III/IV级或心绞痛症状、无法控制的高血压(≥160/105mmHg)、活动性持续感染、
结核病，或有患结核病或真菌病的风险、HIV、梅毒螺旋体、乙型肝炎抗原或丙型肝炎、脱髓鞘疾病、增生性视网膜病和先前或已知的恶性肿瘤；5.接受任何免疫抑制治疗的患者；6.孕妇或哺乳期妇女；7.采取口服抗糖尿病疗法或胰岛素以外的可能会干扰葡萄糖调节任何其他药物；8.GFR＜80ml/min/1.73m2体表的患者；9.已知对任何赋形剂(即二甲基亚砜(DMSO))过敏的患者。
结果
根据上述标准选择24个人的研究群体。
实施例9
本实施例描述了如何进行临床研究。在此，本发明的汇集的同种异体MSC组合物被称为药物产品，而药物组合物被称为最终产品。
材料和方法
如实施例1-5所述，最终产品是具有从脐带组织的捐献的华通氏胶产生的并在粘附培养中扩增约4-5周(最多3次传代)的MSC的细胞悬浮液。该治疗是同种异体的，并且由5-10个不同供体的汇集的扩增的MSC组成。输注前至少72小时，研究人员向生产商发送一份要求交付最终产品的请求。在输注当天，制造商将适用的最终产品运输到了研究人员所在地。将最终产品存储在液氮运输罐中的冻存袋中。将最终产品在床边在水浴中用无菌盐水溶液解冻，并在100ml盐水中稀释，得到105ml的输注量。制备后30分钟内将最终产品施用于患者。
受试者和研究人员都对受试者的治疗是盲的。安慰剂与最终产品装在相同的组织袋中。涉及数据审查和分析的受试者、研究人员、研究现场人员和申办人员在整个研究过程中一直对治疗是盲的，直到数据库干净并锁定为止。
所有患者均接受标准皮下胰岛素治疗。根据临床常规，患者应从药房开具处方并收集胰岛素治疗。从研究中撤出接受胰岛素治疗或其他免疫抑制治疗以外的可能会干扰葡萄糖调节的伴随药物(例如口服抗糖尿病疗法，GLP-1 RA)的研究患者。允许受试者服用其他不干扰葡萄糖调节的药物。报告患者开始用研究药物治疗后所用的所有药物和重要的非药物疗法(包括物理疗法和输血)。
对于研究的第I部分，男性患者1-3接受25×106个细胞，患者4-6接受100×106个细胞以及患者7-10接受200×106个细胞。在每个剂量组之间进行安全性评估，并建议继续、修改或停止试验。
对于研究的第II部分：男性和女性患者以1∶1∶1的比例分配给以下三个治疗组之一；最终产品批次1，批次2的输注或安慰剂输注。以1∶2的比率评估主要终点，将接受最终产品(批次1和2)治疗的患者与接受安慰剂治疗的患者进行比较。如实施例5所定义，患者接受最终产品，所述最终产品作为在具有5％的HSA和10％的DMSO的等渗氯化钠(NaCl)溶液中以浓度为20×106个细胞/ml的一次输注。安慰剂输注由等渗的NaCl溶液(具有5％的HSA)和10％的DMSO组成，但没有细胞，体积相应(5ml)。所有的输注都需要大约20分钟的时间。输注3小时后观察患者的任何急性反应。在研究的第二部分中，200×106个细胞的固定剂量相当于处于既定剂量范围内的2-4×106个细胞/kg。因此将不进行剂量调整。
该研究在输注最终产品或安慰剂后的一年随访时完成。此后患者将继续标准胰岛素治疗。
将比较接受最终产品批次1的患者和接受最终产品批次2的患者的亚组分析。将比较批次之间的安全性和功效。
结果
上述方法确保了产品的正确使用，并允许研究产品的安全性和功效。
在Protrans研究的第1部分(9位接受治疗的患者)中，未观察到与研究药物相关的主要不良事件(表14)。
表14a.试验的第一部分中输注WJMSC后的不良事件
Figure BDA0002629213840000451
Figure BDA0002629213840000461
表14b.输注WJMSC后的同一天发生不良事件
患者数量 不良事件说明
1 证实无不良事件
1 头痛
1 令人讨厌的玉米味
1 左眼单侧结膜感染
表14c.输注WJMSC后一天或更长时间发生不良事件。
Figure BDA0002629213840000462
实施例10
本实施例描述了在临床研究中研究的参数。
材料和方法
以下测试用于评估本临床研究。
混合餐耐受性测试：以响应混合餐耐受性测试的C肽浓度测量内源性胰岛素的产生。禁食过夜后，患者进行标准MMTT。患者饮用源蛋白溶液(诺华雀巢(Novartis Nestlé)(6ml/kg，最大剂量360ml)。在0、15、30、60、90和120分钟的时间点采集血样进行分析。测量在每个时间点收集的外周静脉血浆中的C肽值，并计算AUC C-肽浓度以进行测试。
优化糖尿病护理：使用患者盲系统连续进行葡萄糖监测(CGM)72小时。研究对象在研究中的就诊前连续三天通过葡萄糖试剂条自己测量的血浆葡萄糖记录血糖浓度，以7点曲线模式记录。
受试者自己每天在受试者的日记中写下胰岛素剂量和测得的血浆葡萄糖值。包括胰岛素量，记录的血浆葡萄糖值，时间和日期。这用于计算：
·第187天和372天的非胰岛素依赖患者的数量(ADA标准)。
·第187天和第372天，每日胰岛素需求＜0.25U/kg的患者数量。
·第187天和372天的胰岛素需求量/千克体重。
治疗满意度和生活质量：研究中对糖尿病治疗满意度的变化将使用糖尿病治疗满意度问卷进行测量。输注后第372天，通过标准糖尿病治疗满意度问卷分析生活质量和治疗满意度。当与开始治疗前相比，治疗功效以该参数的δ变化来衡量。
临床安全性评估：在研究过程中和治疗之前进行几次体格检查。体格检查包括对一般外观、心脏和肺部听诊的检查。生命体征包括血压和脉搏测量。研究期间所有就诊时均进行心电图检查。由专业眼科医生在第1、4和8次就诊时进行眼底检查和视网膜检查。
血液学：测量血红蛋白、血细胞比容、红细胞计数、白细胞计数、中性粒细胞计数、淋巴细胞计数、单核细胞计数和血小板计数。
临床化学，血清学：在研究之前测量C反应蛋白(CRP)、肌酐、胱抑素C、GFR，总胆红素、AST、ALT、碱性磷酸酶(ALP)、钠、钾、钙、磷、白蛋白和尿酸。通过对HIV、梅毒螺旋体(梅毒)、乙型和丙型肝炎的测试来筛查慢性感染。对CRP、AST、ALT、ALP、总胆红素、脂质(总胆固醇、LDL、HDL、甘油三酸酯)、钠、钾、钙、磷、白蛋白、肌酐、胱抑素C、GFR和尿酸在治疗之前进行分析，然后在就诊时反复进行分析。在研究之前测量并且在研究过程中反复测量P-葡萄糖、HbA1c、C肽、HLA I类抗体、GAD ab和IA2抗体。
收集单独的血液样品以测量血浆样品中分析的不同细胞因子(IL-2、IL-6、IL-10、IL-17、IL-21、IL-33、IL-35、IFN-γ和TGF-β)的循环水平，这是使用可商购的ELISA技术(RnD系统公司(RnD Systems)，英国阿宾登(Abingdon))或Mesoscale技术。通过使用流式细胞术进一步研究了PBMC，以确定不同免疫细胞(如抗原呈递细胞、T细胞、调节性T细胞、调节性B细胞和其他先天免疫细胞)的比例。同样，PBMC用于确定免疫调节基因的表达和体外测定。
患者外周血用于测量未甲基化INS DNA的循环水平，以衡量正在进行的β细胞死亡。
结果
预期本实施例将显示，使用本文所述的选择算法配制的最终产品和本文所述的来自多个单独供体的汇集的MSC进行治疗将显示以下结果中的一项或多项：与安慰剂相比，C肽的降幅经12个月更低；在最终产品治疗的群体中C肽持续存在；经12个月C肽增加；与对照组相比，胰岛素依赖性更低，胰岛素需求更低。预期与对照组相比，根据本公开治疗的患者将表现出更高的治疗满意度和患者生活质量。
另外，已经显示本治疗不产生任何从头同种异体免疫。在第4次就诊时(即治疗后一个月)从分析的9位受试者的血液样品，无论给予何种剂量，都不会导致任何同种异体免疫。两名受试者在治疗前具有HLA低滴度的HLA抗体。治疗后的滴度持续存在，更重要的是，不是由汇集的MSC触发的。因此，该治疗在患者中不诱导或仅诱导低的抗HLA抗体滴度。因此，没有发生抗HLA抗体的临床相关诱导。已知HLA抗体的发展是剂量依赖性的。通过具有多个供体，任何同种异体HLA的浓度都将低于使用来自单个供体的细胞的浓度，从而导致同种异体免疫水平低，例如关于HLA免疫的临床上不相关的抗体滴度。关于HLA免疫的临床相关抗体滴度没有通用的阈值。然而，通过固相复合技术进行抗体分析，可以更精确地定义HLA抗体的广度和强度。通过将这些结果与实际的基于细胞的交叉匹配获得的结果以及最终的移植结局相关联，可以以中心特异性的方式定义临床相关抗体(Zachary等人，Using realdata for a virtual crossmatch[使用真实数据进行虚拟交叉匹配].Hum Immunol[人类免疫学]2009；70：574-579)。此外，预期本公开的分离的汇集的同种异体MSC群体在高耐受性水平上不显示统计学上显著的批次间差异性。由于选择了具有所需功能和特性的细胞，因此预计不会出现严重的不良事件。
实施例11
本实施例描述了如何进行第二临床研究。在此，本发明的汇集的同种异体MSC组合物被称为药物产品，而药物组合物被称为最终产品。在实施例9中描述的临床试验完成后，要求先前接受过药物产品治疗的受试者参加。该试验的目的是研究用该药物产品重复治疗的安全性和功效。
材料和方法
如实施例1-5所述，最终产品是具有从脐带组织的捐献的华通氏胶产生的并在粘附培养中扩增约4-5周(最多3次传代)的MSC的细胞悬浮液。该治疗是同种异体的，并且由5-10个不同供体的汇集的扩增的MSC组成。输注前至少72小时，研究人员向生产商发送一份要求交付最终产品的请求。在输注当天，制造商将适用的最终产品运输到了研究人员所在地。将最终产品存储在液氮运输罐中的冻存袋中。将最终产品在床边在水浴中用无菌盐水溶液解冻，并在100ml盐水中稀释，得到105ml的输注量。制备后30分钟内将最终产品施用于患者。
受试者和研究人员都对受试者的治疗是盲的。安慰剂与最终产品装在相同的组织袋中。涉及数据审查和分析的受试者、研究人员、研究现场人员和申办人员在整个研究过程中一直对治疗是盲的，直到数据库干净并锁定为止。只有在紧急情况下(例如SAE)，才可以在完成研究之前发生揭盲。
所有患者均接受标准皮下胰岛素治疗。根据临床常规，患者应从药房开具处方并收集胰岛素治疗。从研究中撤出接受胰岛素治疗或其他免疫抑制治疗以外的可能会干扰葡萄糖调节的伴随药物(例如口服抗糖尿病疗法，GLP-1RA)的研究患者。允许受试者服用其他不干扰葡萄糖调节的药物。报告患者开始用研究药物治疗后所用的所有药物和重要的非药物疗法(包括物理疗法和输血)。
只有完成了第一临床试验的第一部分(剂量递增)的患者才可以招募以接受第二剂药物产品的治疗，其剂量与之前接受的剂量相同，患者1-3接受25×106个细胞，患者4-6接受100×106个细胞，而患者7-10接受200×106个细胞。另外，追踪9名具有匹配基线数据的患者作为对照组，而无需进行任何干预。
实施例12
本实施例描述了批次内差异性的分析。在通过本文公开的选择算法选择用于汇集的单独供体来源的MSC群体的测定结果与所有单独供体来源的MSC群体(包括未选择的群体)的测定结果之间进行比较。
方法和结果
通过如实施例3中所述的IDO测定、增殖测定和PGE2测定来分析单独供体来源的MSC群体。通过以下公式计算评估差异：
Figure BDA0002629213840000491
其中最大值和最小值是获得的最大和最小测定结果。
来自单独供体的细胞的IDO倍数诱导的总范围为50-200倍，最终通过选择算法选择的供体的范围为130-200倍。来自单独供体的细胞的增殖指数的总范围为1.14-1.07，最终通过选择算法选择的供体的范围为1.13-1.07。来自单独供体的细胞诱导的PGE2表达的总范围为0.29-1.76，最终通过选择算法选择的供体的范围为0.61-1.42。
根据以上公式量化供体来源的MSC群体之间的差异。结果表明，IDO测定差异降低了53％，增殖测定差异降低了14％，PGE2测定差异降低了45％(见图4)。
当比较所有所分析的细胞的得分和所选择的细胞的得分时，使用选择算法计算的总体评估中的差异将差异降低了40％(见图4)。
实施例13
本实施例描述了本文所公开的分离的汇集的同种异体MSC群体之间的批次间差异性的分析。
方法和结果
通过如实施例3中所述的IDO测定、增殖测定和PGE2测定分析本文公开的分离的汇集的同种异体MSC群体(药物产品)。比较了来自不同批次的药物产品的测定结果。根据本文公开的方法，已经用通过选择算法选择的来自汇集的供体的细胞制造了三个批次的药物产品。药物产品批次的名称为TB1(技术批次编号1，非临床用途)，CB1和CB2(分别在实施例9和11中所述的临床试验中使用的临床批次1和2)。对来自三个批次TB1、CB1和CB2的药物产品进行了分析。
每个实验进行两次，每个批次在每个实验中进行两次重复分析。
测定内的标准偏差和变异系数是基于同一测定中的两次重复进行计算，即两次重复之间的标准偏差，变异系数计算为标准偏差除以平均值。
测定间的标准偏差和变异系数计算为两次实验的平均值之间的标准偏差和变异系数。
分别基于两次实验中IDO、PGE2和PI的所有重复实验的平均值，计算了批次间的标准偏差和变异系数。
结果列于表15a-c。
表15a.IDO测定结果比较的结果。
Figure BDA0002629213840000511
批次间标准偏差＝13，CV＝4％
表15b.PGE2测定结果比较的结果。
Figure BDA0002629213840000512
批次间标准偏差＝655，CV＝12％
表15c.增殖测定结果比较的结果。
Figure BDA0002629213840000513
批次间标准偏差＝0，02，CV＝2％
表15d.差异性分析总结
测定内CV％ 测定间CV％ 批次间CV％
IDO 10％ 10％ 4％
PGE2 11％ 12％ 12％
PI 2％ 1％ 2％
总之，本实施例表明，重复之间的测定内标准偏差和测定间的标准偏差(来自独立分析的平均值之间)高于不同批次之间的标准偏差。因此，显示出在批次之间没有差异，因此，本文所公开的分离的汇集的同种异体MSC群体的不同批次之间没有统计上显著的批次间差异性。
实施方案清单
1.一种用于获得分离的汇集的同种异体间充质干细胞(MSC)群体的方法，所述群体包括源自至少3个单独供体的MSC，其中源自任一供体的细胞数不超过总细胞数的50％，并且其中所述MSC至多经历8次传代；
所述方法包括以下步骤：
-从多于所述至少3个单独供体中培养或提供MSC，以获得多于至少3个单独供体来源的MSC群体；
-使用至少3个测定来测定每个单独供体来源的MSC群体，以获得所述每个单独供体来源的MSC群体的至少3个测定结果，其中所述至少3个测定包括至少一个测量每个单独供体来源的MSC群体的免疫抑制能力的测定；
-对于每个测定，基于所述测定结果将单独排名得分值分配给所述每个单独供体来源的MSC群体，并因此获得每个单独供体来源的MSC群体的至少3个单独排名得分值，其中较高的排名得分值表示更理想的测定结果；或其中较低的排名得分值表示更理想的测定结果；
-基于所述至少3个单独排名得分值，将总得分值分配给每个单独供体来源的MSC群体，其中在较高的排名得分值表示更理想的测定结果的情况下，较高的总得分值表示更理想的群体特性；或其中在较低的排名得分值表示更理想的测定结果的情况下，较低的总得分值表示更理想的群体特性；
-基于它们的总得分值，选择具有理想群体特性的单独供体来源的MSC群体的子集；以及
-汇集所述选择的单独供体来源的MSC群体以获得分离的汇集的同种异体间充质干细胞(MSC)群体。
-以及
其中所述汇集的同种异体MSC群体在汇集步骤之后不再进一步培养，并且
其中所述至少3个测定包括一个测量吲哚胺-2，3-双加氧酶(IDO)活性的测定；一个测量所述MSC分泌的前列腺素E2的测定；以及一个测量所述MSC对外周血单个核细胞(PBMC)增殖的作用的测定。
2.根据项1所述的用于获得分离的汇集的同种异体MSC群体的方法，其中基于所述每个单独供体来源的MSC群体的测定结果与剩余的单独供体来源的MSC群体的结果的比较，将至少一个测定的单独排名得分值分配给所述每个单独供体来源的MSC群体。
3.根据项1或项2所述的用于获得分离的汇集的同种异体MSC群体的方法，其中基于针对所述单独供体来源的MSC群体获得的绝对测定结果，将至少一个测定的单独排名得分值分配给所述每个单独供体来源的MSC群体。
4.根据项3所述的用于获得分离的汇集的同种异体MSC群体的方法，其中当所述绝对结果对应于至少预定值或至多预定值时，认为测定结果是期望的，并且分配反映所获得的期望测定结果的单独排名得分值。
5.根据项1-4中任一项所述的用于获得分离的汇集的同种异体MSC群体的方法，其中选择具有期望的群体特性的单独供体来源的MSC群体的子集的步骤包括在较高总得分值表示更期望的群体特性的情况下，选择总得分值至少对应于预定值的单独供体来源的MSC群体；或在较低总得分值表示更期望的群体特性的情况下，选择总得分值最高对应于预定值的单独供体来源的MSC群体。
6.根据项1-4中任一项所述的用于获得分离的汇集的同种异体MSC群体的方法，其中选择具有期望的群体特性的单独供体来源的MSC群体的子集的步骤包括选择预定数量的单独供体来源的MSC群体，在较高的总得分值表示更理想的群体特性的情况下，相对于其余的单独供体来源的MSC群体，该群体显示出更高的总得分值；或在较低的总得分值表示更理想的群体特性的情况下，相对于其余的单独供体来源的MSC群体，该群体显示出更低的总得分值。
7.根据项1-6中任一项所述的用于获得分离的汇集的同种异体MSC群体的方法，其中所述MSC最多经历了7次传代，例如最多6次传代，例如最多5次传代，例如最多4次传代，例如最多3次传代，例如1次、2次或3次传代，例如2次或3次传代。
8.根据项1-7中任一项所述的用于获得分离的汇集的同种异体MSC群体的方法，其中所述MSC选自由以下组成的组：骨髓来源的MSC、外周血来源的MSC，脂肪组织来源的MSC、牙科组织来源的MSC、胎盘来源的MSC、脐带来源的MSC、羊水来源的MSC、脐带血来源的MSC、华通氏胶来源的MSC、蜕膜来源的MSC、软骨膜来源的MSC和羊膜来源的MSC；例如选自由以下组成的组：胎盘来源的MSC、脐带来源的MSC、羊水来源的MSC、脐带血来源的MSC、华通氏胶来源的MSC、蜕膜来源的MSC、软骨膜来源的MSC、牙髓来源的MSC和羊膜来源的MSC。
9.根据项8所述的用于获得分离的汇集的同种异体MSC群体的方法，其中所述MSC选自由以下组成的组：脐带来源的MSC和华通氏胶来源的MSC，例如其中所述MSC是华通氏胶来源的MSC。
10.根据项1-9中任一项所述的用于获得分离的汇集的同种异体MSC群体的方法，其中所述群体包括源自至少四个单独供体，例如至少五个单独供体，例如至少六个单独供体，例如至少七个单独供体，例如至少八个单独供体，例如至少九个单独供体，例如至少十个单独供体的MSC。
11.根据项1-9中任一项所述的用于获得分离的汇集的同种异体MSC群体的方法，其中所述群体包含源自3-20个单独供体的MSC，例如3-15个单独供体，例如3-10个单独供体，例如4-8个单独供体，例如5-7个单独供体，例如5、6或7个单独供体。
12.根据项1-11中任一项所述的用于获得分离的汇集的同种异体MSC群体的方法，其中所述测定每个单独供体来源的MSC群体的步骤包括，测定在汇集步骤中汇集的单独供体来源的MSC群体的数量的至少1-4至倍，例如至少2-4倍，例如2-3倍或3-4倍的单独供体来源的MSC群体。
13.根据项1-12中任一项所述的用于获得分离的汇集的同种异体MSC群体的方法，其中所述测定每个单独供体来源的MSC群体的步骤包括测定至少3个，例如至少4个，例如至少5个，例如至少6个，例如至少7个，例如至少8个，例如至少9个，例如至少10个，例如至少11个，例如至少12个，例如至少13个，例如至少14个，例如至少15个，例如至少16个，例如至少17个，例如至少18个，例如至少19个，例如至少20个单独供体来源的MSC群体。
14.根据项1-12中任一项所述的用于获得分离的汇集的同种异体MSC群体的方法，其中所述测定每个单独供体来源的MSC群体的步骤包括测定3-50个单独供体来源的MSC群体，例如4-50个，例如5-50个，例如6-50个，例如6-30个，例如6-20个，例如6-15个，例如8-12个单独供体来源的MSC群体。
15.根据项1-14中任一项所述的用于获得分离的汇集的同种异体MSC群体的方法，使用至少3个测定来测定每个单独供体来源的MSC群体的步骤包括使用至少一个功能测定，例如至少两个功能测定，例如至少三个功能测定，例如至少四个功能测定，例如至少五个功能测定。
16.根据项1-15中任一项所述的用于获得分离的汇集的同种异体MSC群体的方法，其中所述PBMC的增殖是T淋巴细胞的增殖，例如植物血凝素(PHA)刺激的T淋巴细胞的增殖。
17.根据项1-16中任一项所述的用于获得分离的汇集的同种异体MSC群体的方法，其中所述至少一个测量由所述MSC分泌的前列腺素E2的测定包括当与PBMC(如PHA刺激的PBMC，如PHA刺激的T淋巴细胞)共培养时，测量所述MSC分泌的前列腺素E2。
18.根据项1-17中任一项所述的用于获得分离的汇集的同种异体MSC群体的方法，其中所述至少3个测定进一步包括至少一个测量所述MSC中响应IFNγ、IL-10、PHA和/或GABA，例如响应IFNγ、IL-10和/或PHA的HLA-G表达的测定。
19.根据项1-18中任一项所述的用于获得分离的汇集的同种异体MSC群体的方法，其中所述至少3个测定进一步包括至少一个测量蛋白表达和/或细胞因子表达的测定。
20.根据项19所述的用于获得分离的汇集的同种异体MSC群体的方法，其中所述至少一个测量蛋白质表达和/或细胞因子表达的测定测量一种或几种选自由以下组成的组中的蛋白质或细胞因子的表达：IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-12、IL-12/13、IL17A、IL-21、IL-22、IL-29、IL-31、TGFβ、VEGF、FGF、GM-CFS、IFNα、IFNγ、apo E和TNFα，例如选自由IL-6、IL-8、GM-CSF和TGFβ组成的组，例如选自由至少IL-6组成的组。
21.根据项20所述的用于获得分离的汇集的同种异体MSC群体的方法，其中测量至少2种，例如至少3种，例如至少4种，例如至少5种，例如至少6种，例如至少7种，例如至少8种，例如至少9种，例如至少10种，例如至少11种，例如至少12种，例如至少13种，例如至少14种，例如至少15种，例如至少16种，例如至少17种，例如至少18种，例如全部19种所述蛋白质和/或细胞因子的表达。
22.根据项19-21中任一项所述的用于获得分离的汇集的同种异体MSC群体的方法，其中所述表达是在不存在和/或存在至少一种刺激的情况下测量的。
23.根据项22所述的用于获得分离的汇集的同种异体MSC群体的方法，其中所述刺激是免疫应答修饰刺激。
24.根据项23所述的用于获得分离的汇集的同种异体MSC群体的方法，其中所述免疫应答修饰刺激选自由以下组成的组：PBMC；刺激的PBMC，例如用PHA刺激的PBMC；IL10；γ-氨基丁酸(GABA)；和干扰素γ(IFNγ)。
25.根据项24所述的用于获得分离的汇集的同种异体MSC群体的方法，其中所述免疫应答修饰刺激是γ-氨基丁酸(GABA)。
26.根据项24所述的用于获得分离的汇集的同种异体MSC群体的方法，其中所述刺激是细胞因子，例如干扰素γ(IFNγ)。
27.根据项22-26中任一项所述的用于获得分离的汇集的同种异体MSC群体的方法，其中刺激选自由以下组成的组：聚肌苷酸：聚胞苷酸(聚I：C)、瑞喹莫德(r848)、γ-氨基丁酸(GABA)和IFNγ，例如选自由聚I：C和IFNγ组成的组。
28.根据项22-23中任一项所述的用于获得分离的汇集的同种异体MSC群体的方法，其中刺激是PBMC，例如刺激或未刺激的PBMC，例如PHA刺激的PBMC，例如PHA刺激的T淋巴细胞。
29.根据项1-28中任一项所述的用于获得分离的汇集的同种异体MSC群体的方法，其中所述至少3个测定包括至少一个形态学测定。
30.根据项29所述的用于获得分离的汇集的同种异体MSC群体的方法，其中所述形态学测定测定细胞和/或细胞核的形态学特征。
31.根据项30所述的用于获得分离的汇集的同种异体MSC群体的方法，其中所述细胞和/或细胞核的形态特征是选自由以下组成的组中的一种或多种特征：细胞大小、细胞核大小、细胞形状以及细胞与细胞核大小之比。
32.根据项29-31中任一项所述的用于获得分离的汇集的同种异体MSC群体的方法，其中单独供体来源的MSC群体仅在其表现出大于或等于90％，例如至少91％，例如至少92％，例如至少93％，例如至少94％，例如至少95％，例如至少96％，例如至少97％，例如至少98％，例如至少99％的正常细胞和/或细胞核时，才有资格进行汇集。
33.根据项1-32中任一项所述的用于获得分离的汇集的同种异体MSC群体的方法，其中当MSC群体处于第0代(p0)至第8代(p8)，例如在p1-p5中时，例如在p1-p4中，例如在p2-p4中，或在p1-p4中，例如在p1、p2和/或p3中，例如在p2和/或p3中，执行使用至少3个测定来测定每个单独供体来源的MSC群体的步骤。
34.根据项1-33中任一项所述的用于获得分离的汇集的同种异体MSC群体的方法，当细胞与其被汇集时在相同的传代中时执行至少一个测定，例如至少两个测定，例如至少三个测定，例如所有测定。
35.根据项1-33中任一项所述的用于获得分离的汇集的同种异体MSC群体的方法，其中在不同的传代进行至少两个测定。
36.根据项1-35中任一项所述的用于获得分离的汇集的同种异体MSC群体的方法，其中分配给所述每个单独供体来源的MSC群体的所述总得分值是通过将每个单独供体来源的MSC群体的排名得分值相加而获得的累加总得分值。
37.根据项1-35中任一项所述的用于获得分离的汇集的同种异体MSC群体的方法，其中分配给所述每个单独供体来源的MSC群体的所述总得分值是通过以下方式获得的加权总得分值：1)为每个测定的排名得分值分配权重，以及2)将单独供体来源的MSC群体的加权的排名得分值相加。
38.根据项1-37中任一项所述的用于获得分离的汇集的同种异体MSC群体的方法，其中选择具有期望的群体特性的单独供体来源的MSC群体的子集的步骤包括选择至少3个，例如至少4个，例如至少4个，例如至少5个，例如至少6个，例如至少7个，例如至少8个，例如至少9个，例如至少10个单独供体来源的MSC群体。
39.根据项1-38中任一项所述的用于获得分离的汇集的同种异体MSC群体的方法，在该群体中任何一个供体来源的细胞数量不超过45％，例如不超过40％，例如不超过35％的总细胞数量，并且其中所述群体包括源自至少3个供体的MCS；例如，在该群体中任何一个供体来源的细胞数量不超过40％，例如不超过35％，例如不超过30％的总细胞数量，并且其中所述群体包括源自至少4个供体的MCS；例如，在该群体中任何一个供体来源的细胞数量不超过35％，例如不超过30％，例如不超过25％的总细胞数量，并且其中所述群体包括源自至少5个供体的MCS；例如，在该群体中任何一个供体来源的细胞数量不超过30％，例如不超过25％，例如不超过20％的总细胞数量，并且其中所述群体包括源自至少6个供体的MCS；例如，在该群体中任何一个供体来源的细胞数量不超过25％，例如不超过22％，例如不超过20％的总细胞数量，并且其中所述群体包括源自至少7个供体的MCS。
40.根据项1-39中任一项所述的用于获得分离的汇集的同种异体MSC群体的方法，该群体中任何一个供体来源的MSC的数量不超过任何其他供体来源的细胞数量的四倍，例如不超过三倍，例如不超过两倍。
41.根据项1-40中任一项所述的用于获得分离的汇集的同种异体MSC群体的方法，该方法进一步包括以下步骤：如果单独供体来源的MSC群体的测定结果不如先前通过项1-40中任一项所述的方法获得的汇集的同种异体MSC群体的相应测定结果理想，则从汇集步骤中丢弃所述单独供体来源的MSC群体。
42.一种分离的汇集的同种异体MSC群体，所述分离的汇集的同种异体MSC群体根据项1-41中任一项所述的方法可获得，其中所述群体在汇集后不再进一步培养。
43.根据项42所述的分离的汇集的同种异体MSC群体，并且其中所述群体没有显示统计学上显著的批次间差异性。
44.根据项43所述的分离的汇集的同种异体MSC群体，用作药物。
45.根据项44所述的分离的汇集的同种异体MSC群体，用于治疗和/或预防选自由以下组成的组中的疾病或病症：炎性疾病或病症、自身免疫性疾病和移植排斥。
46.用于根据项44-45中任一项所述使用的分离的汇集的同种异体MSC群体，其中所述使用包括将所述MSC群体作为输注施用到有此需要的患者。
47.用于根据项46所述使用的分离的汇集的同种异体MSC群体，其中所述输注是静脉内、腹膜内、淋巴内、静脉内、鞘内、脑内、动脉内、皮下或通过ommaya储液器；例如静脉内、腹膜内或淋巴内。
48.用于根据项44-47中任一项所述使用的分离的汇集的同种异体MSC群体，其中所述输注重复进行。
49.用于根据项44-47中任一项所述使用的分离的汇集的同种异体MSC群体，其中所述输注仅执行一次。
50.用于根据项44-49中任一项所述使用的分离的汇集的同种异体MSC群体，其中所述施用在患者中不诱导抗HLA抗体滴度或诱导低抗HLA抗体滴度。
51.用于根据项44-50中任一项所述使用的分离的汇集的同种异体MSC群体，其中所述炎性疾病或病症选自由自身免疫性疾病组成的组。
52.用于根据项51所述使用的分离的汇集的同种异体MSC群体，其中所述自身免疫性疾病选自由以下组成的组：肌萎缩侧索硬化、多发性硬化、糖尿病、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎和关节炎。
53.用于根据项52所述使用的分离的汇集的同种异体MSC群体，其中所述自身免疫性疾病是1型糖尿病或成人隐匿性自身免疫性糖尿病(LADA)。
54.用于根据项53所述使用的分离的汇集的同种异体MSC群体，其中所述1型糖尿病或LADA是最近被诊断的1型糖尿病或LADA，例如在施用所述输注前不超过3年，例如不超过2年，例如不超过1年被诊断为1型糖尿病或LADA。
55.用于根据项52-54中任一项所述使用的分离的汇集的同种异体MSC群体，其中所述患者表达C肽。
56.用于根据项55所述使用的分离的汇集的同种异体MSC群体，其中所述患者的空腹血浆C肽浓度≥0.01nmol/L，例如≥0.04nmol/L，例如≥0.08nmol/L，例如≥0.12nmol/L。
57.用于根据项52-56中任一项所述使用的分离的汇集的同种异体MSC群体，其中与未治疗的患者相比，所述治疗和/或预防导致在接受输注的患者中血浆C肽浓度的降低速率更低。
58.用于根据项52-57中任一项所述使用的分离的汇集的同种异体MSC群体，其中接受输注的患者中血浆C肽浓度的所述降低速率比未经治疗的患者低至少10％，例如至少20％，例如至少30％，例如至少40％，例如至少50％。
59.用于根据项52-58中任一项所述使用的分离的汇集的同种异体MSC群体，其中与所述治疗前的空腹血浆C肽浓度相比，治疗和/或预防导致患者中空腹血浆C肽浓度增加。
60.用于根据项44-50所述使用的分离的汇集的同种异体MSC群体，其中所述疾病或病症是移植排斥。
61.用于根据项44-60中任一项所述使用的分离的汇集的同种异体MSC群体，其中所述使用包括向所述患者施用以下剂量：至少3×106个细胞，例如至少5×106个细胞，例如至少10×106个细胞，例如至少15×106个细胞，例如至少20×106个细胞，例如至少25×106个细胞，例如大约至少50×106个细胞，例如大约至少75×106个细胞，例如大约至少100×106个细胞，例如大约至少125×106个细胞，例如大约至少150×106个细胞，例如大约至少175×106个细胞，例如大约至少200×106个细胞。
62.用于根据项44-60中任一项所述使用的分离的汇集的同种异体MSC群体，其中所述使用包括向所述患者施用以下剂量：至少0.1×106个细胞/kg体重，例如至少0.5×106个细胞/kg体重，例如至少1×106个细胞/kg体重，例如至少5×106个细胞/kg体重，例如至少10×106个细胞/kg体重。
63.用于根据项44-62中任一项所述使用的分离的汇集的同种异体MSC群体，其中所述使用包括向所述患者施用大约以下剂量：0.1×106个细胞/kg体重至10×106个细胞/kg体重，例如0.25×106个细胞/kg体重至5×106个细胞/kg体重，0.25×106个细胞/kg体重至4×106个细胞/kg体重，0.5×106个细胞/kg体重至4×106个细胞/kg体重，1×106个细胞/kg体重至4×106个细胞/kg体重，1×106个细胞/kg体重至3×106个细胞/kg体重，2×106个细胞/kg体重至3×106个细胞/kg体重，1×106个细胞/kg体重至2×106个细胞/kg体重。
64.一种药物组合物，其包含根据项44-63中任一项所述的分离的汇集的同种异体MSC群体，和至少一种药学上可接受的赋形剂或载体。
65.包含根据项64所述的分离的汇集的同种异体MSC群体的药物组合物，其包含约至少3×106个细胞，例如至少5×106个细胞，例如至少10×106个细胞，例如至少15×106个细胞，例如至少20×106个细胞，例如至少25×106个细胞，例如约至少50×106个细胞，例如约至少75×106个细胞，例如约至少100×106个细胞，例如约至少125×106个细胞，例如约至少150×106个细胞，例如约至少175×106个细胞，例如约至少200×106个细胞。
66.包含根据项64-65任一项所述的分离的汇集的同种异体MSC群体的药物组合物，其被配制成用于输注；例如用于静脉内输注、腹膜内输注、淋巴内输注、静脉内输注、鞘内输注、脑内输注、动脉内输注、皮下输注或通过ommaya储液器的输注；例如用于静脉内、腹膜内或淋巴内输注。
67.一种用于治疗和/或预防选自由炎性疾病或病症、自身免疫性疾病和移植排斥组成的组中的疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的患者施用治疗有效剂量的根据项44-63中任一项所述的分离的汇集的同种异体MSC群体或根据项64-66中任一项所述的药物组合物。
68.根据项67所述的用于治疗和/或预防方法，其中所述MSC群体的所述施用是通过输注；例如通过静脉内输注、腹膜内输注、淋巴内输注、静脉内输注、鞘内输注、脑内输注、动脉内输注、皮下输注或通过ommaya储液器的输注；例如通过静脉内、腹膜内或淋巴内输注。
69.根据项67-68中任一项所述的用于治疗和/或预防的方法，其中所述输注重复进行。
70.根据项67-68中任一项所述的用于治疗和/或预防的方法，其中所述输注仅执行一次。
71.根据项67-70中任一项所述的用于治疗和/或预防的方法，其中所述施用在患者中不诱导抗HLA抗体滴度或诱导低抗HLA抗体滴度。
72.根据项67-71中任一项所述的用于治疗和/或预防的方法，其中所述炎性疾病或病症选自由自身免疫性疾病组成的组。
73.根据项67-72中任一项所述的用于治疗和/或预防的方法，其中所述自身免疫性疾病选自由以下组成的组：肌萎缩侧索硬化、多发性硬化、糖尿病、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎和关节炎。
74.根据项73所述的用于治疗和/或预防的方法，其中所述自身免疫性疾病是1型糖尿病或LADA。
75.根据项74所述的用于治疗和/或预防的方法，其中所述1型糖尿病或LADA是最近被诊断的1型糖尿病或LADA，例如在施用前(例如在施用所述输注前)不超过3年，例如不超过2年，例如不超过1年被诊断为1型糖尿病或LADA。
76.根据项74-76中任一项所述的用于治疗和/或预防的方法，其中所述患者表达C肽。
77.根据项76所述的用于治疗和/或预防的方法，其中所述患者的空腹血浆C肽浓度≥0.01nmol/L，例如≥0.04nmol/L，例如≥0.08nmol/L，例如≥0.12nmol/L。
78.根据项73-77中任一项所述的用于治疗和/或预防的方法，其中与未治疗的患者相比，所述治疗和/或预防导致在接受输注的患者中血浆C肽浓度的降低速率更低。
79.根据项73-78中任一项所述的用于治疗和/或预防的方法，其中接受输注的患者中血浆C肽浓度的所述降低速率比未经治疗的患者低至少10％，例如至少20％，例如至少30％，例如至少40％，例如至少50％。
80.根据项73-79中任一项所述的用于治疗和/或预防的方法，其中与所述输注前的空腹血浆C肽浓度相比，治疗和/或预防导致患者中空腹血浆C肽浓度增加。
81.根据项71-76中所述的用于治疗的方法，其中所述疾病或病症是移植排斥。
82.根据项67-81中任一项所述的用于治疗和/或预防的方法，其中所述方法包括向所述患者施用以下剂量：至少3×106个细胞，例如至少5×106个细胞，例如至少10×106个细胞，例如至少15×106个细胞，例如至少20×106个细胞，例如至少25×106个细胞，例如至少50×106个细胞，例如至少75×106个细胞，例如至少100×106个细胞，例如至少125×106个细胞，例如至少150×106个细胞，例如至少175×106个细胞，例如至少200×106个细胞。
83.根据项67-82中任一项所述的用于治疗和/或预防的方法，其中所述方法包括向所述患者施用以下剂量：至少0，1×106个细胞/kg体重，例如至少0，5×106个细胞/kg体重，例如至少1×106个细胞/kg体重，例如至少5×106个细胞/kg体重，例如至少10×106个细胞/kg体重。
84.根据项67-83中任一项所述的用于治疗和/或预防的方法，其中所述方法包括向所述患者施用以下剂量：0.1×106个细胞/kg体重至10×106个细胞/kg体重，例如0.25×106个细胞/kg体重至5×106个细胞/kg体重，0.25×106个细胞/kg体重至4×106个细胞/kg体重，0.5×106个细胞/kg体重至4×106个细胞/kg体重，1×106个细胞/kg体重至4×106个细胞/kg体重，1×106个细胞/kg体重至3×106个细胞/kg体重，2×106个细胞/kg体重至3×106个细胞/kg体重，1×106个细胞/kg体重至2×106个细胞/kg体重。
85.根据项44-63中任一项所述的分离的汇集的同种异体MSC群体在制备用于治疗选自由炎性疾病或病症、自身免疫性疾病和移植排斥组成的组中的疾病或病症的药物中的用途。
86.一种用于评估MSC群体的效力的方法，所述方法包括以下步骤：培养或提供MSC群体；
使用至少3个测定测量所述MSC群体，以获得所述至少3个测定结果，其中所述至少3个测定包括至少一个测量每个单独供体来源的MSC群体的免疫抑制能力的测定；；
对于每个测定，基于测定结果将得分值分配给所述MSC群体，其中较高的得分值表示更理想的测定结果；或其中较低的得分值表示更理想的测定结果；
基于分配给每个测定的得分值，将总得分值分配给所述MSC群体，其中在较高的排名得分值表示更理想的测定结果的情况下，较高的总得分值表示更理想的群体特性；或其中在较低的得分值表示更理想的测定结果的情况下，较低的总得分值表示更理想的群体特性；
在较高的得分值表示更理想的测定结果的情况下，如果所述总得分值高于预定阈值，则将MSC群体资格确定为有效；或在较低的得分值表示更理想的测定结果的情况下，如果所述总得分值低于预定阈值，则将MSC群体的资格确定为有效。
87.根据项86所述的方法，其中所述至少3个测定包括其中所述至少3个测定包括一个测量吲哚胺-2，3-双加氧酶(IDO)活性的测定；一个测量所述MSC分泌的前列腺素E2的测定；以及一个测量所述MSC对外周血单个核细胞(PBMC)增殖的作用的测定。
88.根据项86或87所述的方法，其中所述至少3个测定是根据项15-32中任一项定义的。
89.根据项42或43所述的分离的汇集的同种异体MSC群体用于免疫细胞的共培养的用途。
90.根据项89所述的用途，其中所述分离的汇集的同种异体MSC群体用作用于免疫细胞共培养的饲养细胞。
91.根据项89所述的用途，其中所述分离的汇集的同种异体MSC群体用于刺激与所述群体共培养的免疫细胞。

Claims (17)

1.一种用于获得分离的汇集的同种异体间充质干细胞(MSC)群体的方法，所述群体包括源自至少3个单独供体的MSC，其中源自任一供体的细胞数不超过总细胞数的50％，并且其中所述MSC至多经历8次传代；
所述方法包括以下步骤：
-从多于所述至少3个单独供体中培养MSC，以获得多于至少3个单独供体来源的MSC群体；
-使用至少3个测定来测定每个单独供体来源的MSC群体，以获得所述每个单独供体来源的MSC群体的至少3个测定结果，其中所述至少3个测定包括至少一个测量每个单独供体来源的MSC群体的免疫抑制能力的测定；对于每个测定，基于所述测定结果将单独排名得分值分配给所述每个单独供体来源的MSC群体，并因此获得每个单独供体来源的MSC群体的至少3个单独排名得分值，其中较高的排名得分值表示更理想的测定结果；
或其中较低的排名得分值表示更理想的测定结果；
-基于所述至少3个单独排名得分值，将总得分值分配给每个单独供体来源的MSC群体，其中在较高的排名得分值表示更理想的测定结果的情况下，较高的总得分值表示更理想的群体特性；或其中在较低的排名得分值表示更理想的测定结果的情况下，较低的总得分值表示更理想的群体特性；
-基于它们的总得分值，选择具有理想群体特性的单独供体来源的MSC群体的子集；以及
-汇集所述选择的单独供体来源的MSC群体以获得分离的汇集的同种异体间充质干细胞(MSC)群体，并且
其中所述汇集的同种异体MSC群体在汇集步骤之后不再进一步培养，并且
其中所述至少3个测定包括一个测量吲哚胺-2，3-双加氧酶(IDO)活性的测定；一个测量所述MSC分泌的前列腺素E2的测定；以及一个测量所述MSC对外周血单个核细胞(PBMC)增殖的作用的测定。
2.根据权利要求1所述的用于获得分离的汇集的同种异体MSC群体的方法，其中所述至少3个测定进一步包括至少一个测量所述MSC中响应IFNγ、IL-10、PHA和/或GABA，例如响应IFNγ、IL-10和/或PHA的HLA-G表达的测定。
3.根据权利要求1或2所述的用于获得分离的汇集的同种异体MSC群体的方法，其中测定每个单独供体来源的MSC群体的步骤包括，测定比在汇集步骤中汇集的单独供体来源的MSC群体的数量至少多一个的单独供体来源的MSC群体。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的用于获得分离的汇集的同种异体MSC群体的方法，其中测定每个单独供体来源的MSC群体的步骤包括，测定在汇集步骤中汇集的单独供体来源的MSC群体的数量的至少2-4倍，例如2-3倍或3-4倍的单独供体来源的MSC群体。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的用于获得分离的汇集的同种异体MSC群体的方法，在所述群体中任何一个供体来源的MSC的数量不超过任何其他供体来源的细胞数量的四倍，例如不超过三倍，例如不超过两倍。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的用于获得分离的汇集的同种异体MSC群体的方法，其中所述分离的汇集的同种异体MSC群体中的MSC至多经历2至6次传代。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的用于获得分离的汇集的同种异体MSC群体的方法，其中所述MSC选自由以下组成的组：脐带来源的MSC和华通氏胶来源的MSC，例如其中所述MSC是华通氏胶来源的MSC。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的用于获得分离的汇集的同种异体MSC群体的方法，其中所述群体包括源自至少四个单独供体，例如至少五个单独供体，例如至少六个单独供体，例如至少七个单独供体，例如至少八个单独供体，例如至少九个单独供体，例如至少十个单独供体的MSC。
9.一种分离的汇集的同种异体MSC群体，所述分离的汇集的同种异体MSC群体根据权利要求1-8中任一项所述的方法可获得，其中所述群体在汇集后不再进一步培养。
10.根据权利要求9所述的分离的汇集的同种异体MSC群体，其中所述群体没有显示统计学上显著的批次间差异性。
11.根据权利要求9或10所述的分离的汇集的同种异体MSC群体，用作药物。
12.用于根据权利要求11所述使用的分离的汇集的同种异体MSC群体，其中所述分离的汇集的同种异体MSC群体的施用在患者中不诱导抗HLA抗体滴度或诱导低抗HLA抗体滴度，例如不诱导抗HLA抗体滴度或诱导与临床无关的抗HLA抗体滴度。
13.根据权利要求11-12中任一项所述的分离的汇集的同种异体MSC群体，用于治疗和/或预防选自由以下组成的组中的疾病或病症：炎性疾病或病症、自身免疫性疾病和移植排斥。
14.用于根据权利要求13所述使用的分离的汇集的同种异体MSC群体，其中所述自身免疫性疾病是1型糖尿病或成人隐匿性自身免疫性糖尿病(LADA)。
15.用于根据权利要求14所述使用的分离的汇集的同种异体MSC群体，其中有待施用所述群体的患者在之前不超过3年被诊断患有1型糖尿病或LADA。
16.用于根据权利要求14或15所述使用的分离的汇集的同种异体MSC群体，其中被诊断患有1型糖尿病或LADA的患者的空腹血浆C肽浓度≥0.01nmol/L，例如≥0.04nmol/L，例如≥0.08nmol/L，例如≥0.12nmol/L。
17.一种药物组合物，其包含根据权利要求9-16中任一项所述的分离的汇集的同种异体MSC群体，和至少一种药学上可接受的赋形剂或载体。
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