KR102035022B1

KR102035022B1 - 효소를 사용하지 않고 생체조직에서 기질세포를 분리하는 방법 및 장치

Info

Publication number: KR102035022B1
Application number: KR1020170099447A
Authority: KR
Inventors: 이희영; 양현진
Original assignee: 이희영
Priority date: 2017-08-07
Filing date: 2017-08-07
Publication date: 2019-11-08
Also published as: US20200370002A1; CN111032858B; KR20190015803A; CN111032858A; WO2019031641A1

Abstract

본 발명의 일 실시례는, 효소를 사용하지 않고 생체조직에서 기질세포를 분리하는 방법으로서, 생체조직의 기질세포의 자발적 마이그레이션(spontaneous migration)을 유도하여 기질세포를 생체조직의 외부로 이동시키는 것을 이용하고, 기질세포의 자발적 마이그레이션의 유도는 생체조직을 부착시킬 수 있는 소재의 부착부재 상에 생체조직이 부착된 상태에서 이루어지며, 기질세포의 자발적 마이그레이션의 유도는 기질세포가 생존할 수 있는 배양액 내에서 이루어지고, 생체조직의 외부로 이동된 기질세포를 배양액과 함께 난류 운동시켜 기질세포에 물리적 힘을 가함으로써 기질세포를 생체조직에서 분리하고, 부착부재는, 배양액보다 더 작은 평균비중을 갖는 제1 부착부재와, 배양액보다 더 큰 평균비중을 갖는 제2 부착부재와, 배양액과 동일한 평균비중을 갖는 제3 부착부재를 포함하며, 배양액 내에서, 제1 부착부재는 배양액보다 더 작은 평균비중을 갖는 생체조직과 분포하는 영역이 중첩되고, 제2 부착부재는 배양액보다 더 큰 평균비중을 갖는 생체조직과 분포하는 영역이 중첩되며, 제3 부착부재는 배양액과 동일한 평균비중을 갖는 생체조직과 분포하는 영역이 중첩되는 것을 특징으로 하는 방법 및 장치를 제공한다.

Description

효소를 사용하지 않고 생체조직에서 기질세포를 분리하는 방법 및 장치{METHOD AND APPARATUS OF ISOLATING STROMAL CELLS FROM BIOLOGICAL TISSUE WITHOUT USING PHOSPHATASE}

본 발명은 생체조직에서 기질세포를 분리하는 방법 및 장치로서, 상세하게는 효소를 사용하지 않고 생체조직에서 기질세포를 분리하는 방법 및 장치에 관한 것이다.

동물의 생체조직 속에 존재하는 기질세포를 생체조직에서 분리하는 방법에는 효소를 사용하는 방법과 효소를 사용하지 않는 방법이 있다.

효소를 사용하여 동물의 생체조직에서 기질세포를 분리하는 방법은 초기 분리 단계에서 효소를 사용하는 방법 또는 수확이나 계대(subculture) 단계에서 효소를 사용하는 방법이 있다.

생체조직에서 기질세포를 분리하는 초기 단계에서는, 생체조직에서 기질세포를 감싸며 강하게 붙어있는 콜라겐(collagen) 조직들을 콜라게나아제(collagenase)와 같은 효소를 사용함으로써 생체조직에서 기질세포를 녹여내고, 이와 같이 녹여낸 기질세포에서 효소를 세척한 후 기질세포를 얻게 된다. 그러나 이 경우에는 효소의 독성과 비용, 처리 시간, 이종 바이러스에 대한 우려 등의 문제점이 발생하게 된다.

생체조직에서 기질세포를 분리하는 위 초기 단계에서 분리된 기질세포를 배양기에서 증식하는 경우, 세포 밀도(confluency)가 높아져 계대를 해야 할 때에는, 트립신(trypsin)과 같은 효소를 사용함으로써 계대를 하게 된다. 그러나 이때 사용되는 효소는 이종 동물의 위액에서 추출된 성분이어서 안정성이 떨어지는 문제점이 발생하게 된다.

효소를 사용하지 않고 동물의 생체조직에서 기질세포를 분리하는 방법은, 초기 분리 단계에서는, 초음파나 레이저 또는 강한 음압 등을 이용하여 생체조직을 미세하게 절단함으로써 콜라겐을 파괴하고 원심분리를 통해 기질세포를 분리하게 된다. 그러나 이 경우에는 기질세포가 콜라겐으로부터 떨어져 온전하게 분리될 확률이 극히 낮고 기질세포의 손상이 커져서 효소를 사용하는 방법에 비해 수율이 5% 미만이며 공정이 복잡하게 되는 문제점이 있다.

효소를 사용하지 않고 동물의 생체조직에서 기질세포를 분리하는 방법은, 수확 또는 계대 단계에서는, 분리된 기질세포를 배양 증식하기 위하여 비중이 다른 마이크로 비드 표면에 세포를 증식하고, 이와 같이 세포가 증식된 마이크로 비드들을 액체와 함께 혼합하는 것을 반복하여 마이크로 비드들을 서로 충돌시킴으로써 이탈되어 나오는 세포를 수거하거나 또는 평면에 기질세포를 배양 증식한 후 스크레이퍼(scraper)로 기질세포를 긁어내게 된다. 그러나 이 경우에는 마이크로 비드가 구형이므로 상호 충돌과정에서 마이크로 비드 표면에 증식된 세포가 이탈되는 효과를 극대화 할 수 없고 스크레이퍼로 긁어내어 이탈되는 세포의 수가 많지 않음은 물론 긁어내는 과정에서 세포가 손상될 염려가 있는 문제점이 있다.

한편, 지방조직과 같은 생체조직을 배양시킨 것은 배양액에 뜨는 특성이 있는 점을 이용하여 배양액이 가득 채워진 용기에 지방조직을 넣음으로써 배양액에 떠서 배양용기의 상부 내측면에 배양된 지방조직이 부착되도록 유도한다. 그러나 이 경우 배양된 지방조직이 부착되는 면은 평면으로 되어 있어서 배양된 지방조직이 부착되는 면을 극대화 할 수 없고 배양 효율을 극대화 할 수 없는 문제점이 있게 된다.

대한민국 공개번호 제10-2015-0114947호 공개특허공보

본 발명이 해결하고자 하는 주요 과제는, 효소를 사용하지 않고 미세하게 절단한 생체조직을 배양액에 넣고 생체조직에서 콜라겐으로 둘러싸인 기질세포가 자발적 마이그레이션(spontaneous migration)에 의해 생체조직의 외부로 이동하도록 유도함으로써, 효소의 독성과 비용, 처리 시간, 이종 바이러스에 대한 우려 등의 문제점과 이종 동물의 위액에서 추출된 성분을 갖는 효소를 사용하는 것으로 인한 불안정성의 문제점을 해소함과 동시에 생체조직으로부터 기질세포를 효소를 사용하지 않고 손상 없이 상대적으로 온전한 자연 상태의 기질세포로 분리하여 분리효율을 향상시킬 수 있는 방법 및 장치를 제공하는 것이다.

본 발명이 해결하고자 하는 다른 주요 과제는, 배양액 내에서 자발적 마이그레이션에 의해 생체조직의 외부로 이동한 기질세포를 생체조직에서 효과적으로 스크레이핑(scraping)함으로써, 효소의 독성과 비용, 처리 시간, 이종 바이러스에 대한 우려 등의 문제점과 이종 동물의 위액에서 추출된 성분을 갖는 효소를 사용하는 것으로 인한 불안정성의 문제점을 해소함과 동시에 생체조직으로부터 기질세포의 분리효율을 향상시킬 수 있는 방법 및 장치를 제공하는 것이다.

위 과제를 해결하기 위한 본 발명의 일 실시례는, 효소를 사용하지 않고 생체조직에서 기질세포를 분리하는 방법으로서, 생체조직의 기질세포의 자발적 마이그레이션(spontaneous migration)을 유도하여 기질세포를 생체조직의 외부로 이동시키는 것을 이용하고, 기질세포의 자발적 마이그레이션의 유도는 생체조직을 부착시킬 수 있는 소재의 부착부재 상에 생체조직이 부착된 상태에서 이루어지며, 기질세포의 자발적 마이그레이션의 유도는 기질세포가 생존할 수 있는 배양액 내에서 이루어지고, 생체조직의 외부로 이동된 기질세포를 배양액과 함께 난류 운동시켜 기질세포에 물리적 힘을 가함으로써 기질세포를 생체조직에서 분리하고, 부착부재는, 배양액보다 더 작은 평균비중을 갖는 제1 부착부재와, 배양액보다 더 큰 평균비중을 갖는 제2 부착부재와, 배양액과 동일한 평균비중을 갖는 제3 부착부재를 포함하며, 배양액 내에서, 제1 부착부재는 배양액보다 더 작은 평균비중을 갖는 생체조직과 분포하는 영역이 중첩되고, 제2 부착부재는 배양액보다 더 큰 평균비중을 갖는 생체조직과 분포하는 영역이 중첩되며, 제3 부착부재는 배양액과 동일한 평균비중을 갖는 생체조직과 분포하는 영역이 중첩되는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.

본 실시례에 있어서, 생체조직에서 기질세포를 둘러싸는 콜라겐 사이로 기질세포의 적어도 일부가 외부로 노출되도록 생체조직을 미세하게 절단하는 것을 더 포함할 수 있다.

삭제

본 실시례에 있어서, 생체조직에서 분리된 기질세포를 수집하는 것을 더 포함할 수 있다.

위 과제를 해결하기 위한 본 발명의 다른 실시례는, 효소를 사용하지 않고 생체조직에서 기질세포를 분리하는 방법으로서, (1) 생체조직을 미세하게 절단하는 것; (2) 미세하게 절단된 생체조직을 배양액 내에서 그 생체조직이 부착될 수 있는 소재의 부착부재 상에 부착시키는 것; (3) 부착부재 상에서 기질세포의 자발적 마이그레이션을 유도하여 기질세포를 생체조직의 외부로 이동시키는 것; 및 (4) 생체조직의 외부로 이동된 기질세포를 생체조직에서 분리하는 것을 포함하고, (4)의 기질세포의 분리는 생체조직의 외부로 이동된 기질세포가 배열된 복수의 부착부재들을 배양액의 난류 운동에 의해 서로 충돌시켜 기질세포에 물리적 힘을 가함으로써 이루어지고, 부착부재는, 배양액보다 더 작은 평균비중을 갖는 제1 부착부재와, 배양액보다 더 큰 평균비중을 갖는 제2 부착부재와, 배양액과 동일한 평균비중을 갖는 제3 부착부재를 포함하며, 배양액 내에서, 제1 부착부재는 배양액보다 더 작은 평균비중을 갖는 생체조직과 분포하는 영역이 중첩되고, 제2 부착부재는 배양액보다 더 큰 평균비중을 갖는 생체조직과 분포하는 영역이 중첩되며, 제3 부착부재는 배양액과 동일한 평균비중을 갖는 생체조직과 분포하는 영역이 중첩되는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.

본 실시례에 있어서, (1)의 생체조직은 그 생체조직에서 기질세포를 둘러싸는 콜라겐 사이로 기질세포의 적어도 일부가 외부로 노출되도록 미세하게 절단될 수 있다.

삭제

본 실시례에 있어서, (5) 생체조직에서 분리된 기질세포를 수집하는 것을 더 포함할 수 있다.

본 실시례에 있어서, (2) 내지 (4)를 순서대로 반복할 수 있다.

본 실시례에 있어서, 생체조직, 배양액 및 부착부재로 이루어진 군 중에서 선택된 적어도 하나를 교체한 후에 (2) 내지 (4)를 순서대로 반복할 수 있다.

위 실시례들에 있어서, 생체조직은 피부, 지방, 연골, 점막, 혈관, 인대, 심장, 뇌, 태반, 제대, 양막, 근육 및 말초신경으로 이루어진 군 중에서 선택된 적어도 어느 하나를 포함할 수 있다.

위 실시례들에 있어서, 배양액은 DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) 및 소태아혈청(fetal bovine serum)으로 이루어진 군 중에서 선택된 적어도 어느 하나를 포함할 수 있다.

위 과제를 해결하기 위한 본 발명의 또다른 실시례는, 효소를 사용하지 않고 생체조직에서 기질세포를 분리하는 장치로서, 배양액 내에서 생체조직을 부착시켜 생체조직의 기질세포의 자발적 마이그레이션을 유도하여 기질세포를 생체조직의 외부로 이동시키는 부착부재; 및 배양액과 생체조직 및 부착부재를 내부에 수용하는 용기를 구비하고, 부착부재는 배양액보다 더 작은 평균비중을 가지거나 또는 배양액보다 더 큰 평균비중을 가지며, 용기는 배양액의 난류를 유도할 수 있고, 부착부재는, 배양액보다 더 작은 평균비중을 갖는 제1 부착부재와, 배양액보다 더 큰 평균비중을 갖는 제2 부착부재와, 배양액과 동일한 평균비중을 갖는 제3 부착부재를 포함하며, 배양액 내에서, 제1 부착부재는 배양액보다 더 작은 평균비중을 갖는 생체조직과 분포하는 영역이 중첩되고, 제2 부착부재는 배양액보다 더 큰 평균비중을 갖는 생체조직과 분포하는 영역이 중첩되며, 제3 부착부재는 배양액과 동일한 평균비중을 갖는 생체조직과 분포하는 영역이 중첩되는 것을 특징으로 하는 장치를 제공한다.

본 실시례에 있어서, 제1 부착부재는, 폴리프로필렌(polypropylene), 폴리에틸렌(polyethylene), 폴리우레탄(polyurethane), ECM(Extracellular Matrix), 콜라겐(collagen), 폴리디옥사논(polydioxanone), 폴리카프롤락톤(polycaprolactone), PLLA(poly(L-lactide)), PLGA(poly(lactic-co-glycolic acid)), PLA(poly(lactic acid)), PGA(pterolyglutamic acid), 히알루론산(hyaluronic acid) 및 실리콘으로 이루어진 군 중에서 선택된 적어도 어느 하나를 포함하는 것일 수 있다.

본 실시례에 있어서, 제2 부착부재는, 테프론(teflon), 폴리카보네이트(polycarbonate), 폴리에틸렌(polyethylene), 프탈레이트(phthalate), 폴리스티렌(polystyrene), 폴리우레탄(polyurethane), ECM(Extracellular Matrix), 콜라겐(collagen), 폴리디옥사논(polydioxanone), 폴리카프롤락톤(polycaprolactone), PLLA(poly(L-lactide)), PLGA(poly(lactic-co-glycolic acid)), PLA(poly(lactic acid)), PGA(pterolyglutamic acid), 히알루론산(hyaluronic acid) 및 실리콘으로 이루어진 군 중에서 선택된 적어도 어느 하나를 포함하는 것일 수 있다.

본 실시례에 있어서, 부착부재는 생체조직에서 기질세포를 둘러싸는 콜라겐 사이로 기질세포의 적어도 일부가 외부로 노출되도록 미세하게 절단된 생체조직을 부착시키는 것일 수 있다.

본 실시례에 있어서, 부착부재는, 배양액 내에서 생체조직을 부착시켜 생체조직의 기질세포의 자발적 마이그레이션을 유도하여 기질세포를 생체조직의 외부로 이동시킬 뿐만 아니라, 이와 같이 이동된 기질세포를 생체조직에서 분리시키는 것일 수 있다.

본 실시례에 있어서, 부착부재는, 자발적 마이그레이션에 의해 생체조직의 외부로 이동된 기질세포가 배열되는 영역을 이루는 본체와, 본체에서 외측으로 연장되어 본체의 두께보다 더 얇은 두께로서 타 부착부재에 배열된 기질세포를 스크레이핑(scraping)할 수 있는 형상을 갖는 스크레이핑부를 구비하는 것일 수 있다.

본 실시례에 있어서, 스크레이핑부는 그 횡단면의 코너부가 형성하는 각도가 예각을 이루는 것일 수 있다.

삭제

본 실시례에 있어서, 용기는 배양액과 생체조직 및 부착부재가 수용되는 공간을 형성하며 회전에 의한 원심분리가 가능하도록 형성된 경사부를 갖는 것일 수 있다.

본 실시례에 있어서, 용기는 정회전과 역회전에 의한 배양액의 난류를 유도할 수 있는 것일 수 있다.

본 실시례에 있어서, 용기는, 생체조직은 투과되지 않고 배양액은 투과되며 용기가 정지된 상태에서 배양액에 잠기는 위치에 배열되어 배양액에 뜨는 생체조직이 배양액에 뜨는 것을 차단하는, 차단막을 더 구비하는 것일 수 있다.

본 실시례에 있어서, 용기는 원심력이 최대인 위치에 형성되어 생체조직에서 분리된 기질세포를 원심력에 의해 수렴시키는 수렴부를 갖는 것일 수 있다.

본 실시례에 있어서, 용기는 수용 공간에서 수렴부까지의 경로 상에 위치하여 원심력에 의한 기질세포의 이동을 허용하고 생체조직 및 부착부재의 이동을 차단하는 필터를 더 구비하는 것일 수 있다.

본 실시례에 있어서, 용기는 수렴부에 형성되어 수렴부에 수렴된 기질세포를 외부로 배출시키는 기질세포 배출부를 더 구비하는 것일 수 있다.

본 실시례에 있어서, 용기는 외부에서 수용 공간으로 연장되어 배양액을 주입하거나 배출시키는 배양액 관통관을 더 구비하는 것일 수 있다.

본 실시례에 있어서, 용기는 내부 소독을 위한 가스를 주입시키는 가스 주입부를 더 구비하는 것일 수 있다.

본 발명의 주요 효과는, 효소를 사용하지 않고 미세하게 절단한 생체조직을 배양액에 넣고 생체조직에서 콜라겐으로 둘러싸인 기질세포가 자발적 마이그레이션에 의해 생체조직의 외측면으로 이동하도록 유도함으로써, 효소의 독성과 비용, 처리 시간, 이종 바이러스에 대한 우려 등의 문제점과 이종 동물의 위액에서 추출된 성분을 갖는 효소를 사용하는 것으로 인한 불안정성의 문제점을 해소함과 동시에 생체조직으로부터 기질세포를 효소를 사용하지 않고 손상 없이 상대적으로 온전한 자연 상태의 기질세포로 분리하여 분리효율을 향상시킬 수 있는 방법 및 장치를 제공할 수 있는 것이다.

본 발명의 다른 주요 효과는, 배양액 내에서 자발적 마이그레이션에 의해 생체조직의 외측면으로 이동한 기질세포를 생체조직에서 효과적으로 스크레이핑(scraping)함으로써, 효소의 독성과 비용, 처리 시간, 이종 바이러스에 대한 우려 등의 문제점과 이종 동물의 위액에서 추출된 성분을 갖는 효소를 사용하는 것으로 인한 불안정성의 문제점을 해소함과 동시에 생체조직으로부터 기질세포의 분리효율을 향상시킬 수 있는 방법 및 장치를 제공할 수 있는 것이다.

도 1은 생체조직에서 기질세포가 뻗어 나온 이미지를 나타내는 사진이다.
도 2는 크로믹 봉합사에 붙은 지방세포의 이미지를 나타내는 사진이다.
도 3은 부착부재 상에서 생체조직의 기질세포가 자발적 마이그레이션에 의해 생체조직의 외부로 이동한 것을 개략적으로 나타내는 도면이다.
도 4는 다른 형태의 부착부재 상에서 생체조직의 기질세포가 자발적 마이그레이션에 의해 생체조직의 외부로 이동한 것을 개략적으로 나타내는 도면이다.
도 5는 부착부재 상에서 자발적 마이그레이션에 의해 생체조직의 외부로 이동한 기질세포가 다른 부착부재에 의해 스크레이핑되는 것을 개략적으로 나타내는 도면이다.
도 6은 배양액과 생체조직 및 부착부재가 수용된 용기 내에서 각 층으로 배열된 상태를 나타내는 도면이다.
도 7은 용기 내의 배양액과 생체조직 및 부착부재가 원심분리된 상태를 나타내는 도면이다.
도 8은 용기 내의 생체조직으로부터 분리된 기질세포가 배양액과 함께 수렴부에 수렴된 상태를 나타내는 도면이다.

발명을 실시하기 위한 구체적인 내용을 설명한다. 이러한 설명은 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용을 이해할 수 있도록 하기 위하여 예시적으로 제공되는 것으로서 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으므로, 본 발명의 범위가 이하의 설명에 의해 한정되는 것은 아니다.

1. 효소를 사용하지 않고 생체조직에서 기질세포를 분리하는 방법

본 방법은 효소를 사용하지 않고 생체조직에서 기질세포를 분리하는 방법으로서, 생체조직의 기질세포의 자발적 마이그레이션(spontaneous migration)을 유도하여 기질세포를 생체조직의 외부로 이동시키는 것을 이용하는 것을 특징으로 한다.

생체조직은 피부, 지방, 연골, 점막, 혈관, 인대, 심장, 뇌, 태반, 제대, 양막, 근육 및 말초신경으로 이루어진 군 중에서 선택된 적어도 어느 하나를 포함할 수 있다.

생체조직의 기질세포의 자발적 마이그레이션은 생체조직 내에서 기질세포를 둘러싸는 콜라겐(collagen)을 뚫고 기질세포가 자발적으로 외부로 이동하는 것을 의미한다. 이러한 기질세포의 자발적 마이그레이션에 의해 생체조직에서 계속 기질세포가 뻗어 나온 이미지는 예시적으로 도 1에 나타나 있는 바와 같다.

이러한 기질세포의 자발적인 마이그레이션에 의해 기질세포가 생체조직의 외부로 이동하는 것은 효소를 사용하지 않고 생체조직에서 기질세포를 분리하기 위한 매우 중요한 특성이 될 수 있다. 본 발명은 생체조직의 기질세포의 자발적 마이그레이션을 유도하여 기질세포를 생체조직의 외부로 이동시키는 것을 이용함으로써 효소를 사용하지 않고도 생체조직에서 기질세포를 분리할 수 있는 방법을 제공한다.

기질세포의 자발적 마이그레이션은 생체조직을 부착시킬 수 있는 소재의 부재에 생체조직을 부착시킨 상태에서 더욱 효과적으로 이루어질 수 있다. 예컨대, 예시적으로 도 2에 나타나 있는 바와 같이, 크로믹 봉합사(chromic catgut)에 지방조직이 부착된 때에 지방세포의 자발적 마이그레이션에 의해 지방조직 외부로 지방세포가 이동하여 붙어 있을 수 있다. 이와 같이 기질세포의 자발적 마이그레이션은 생체조직을 부착시킬 수 있는 소재의 부재에 생체조직을 부착시킨 상태에서 유도됨으로써 기질세포의 자발적 마이그레이션을 더욱 효과적으로 유도할 수 있고 이에 의해 생체조직에서 기질세포를 더욱 효과적으로 분리할 수 있게 된다. 여기서 생체조직을 부착시킬 수 있는 소재의 부재는 다양한 부재가 될 수 있다. 예컨대, 크로믹 봉합사와 동일한 소재의 부재가 될 수 있다.

기질세포의 자발적 마이그레이션의 유도는 기질세포가 생존할 수 있는 배양액 내에서 이루어지는 것이 바람직하다. 이에 의해 생체조직 외부로 이동한 기질세포를 배양액과 함께 분리함으로써 기질세포를 손상되지 않게 수집하여 배양할 수 있게 된다.

배양액은 DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) 및 소태아혈청(fetal bovine serum)으로 이루어진 군 중에서 선택된 적어도 어느 하나를 포함할 수 있다.

배양액은 생체조직과 평균비중이 같은 것을 사용함으로써 배양액에 전체적으로 생체조직이 분포되도록 하여 자발적 마이그레이션에 의해 생체조직의 외부로 이동한 기질세포를 배양액과 함께 효율적으로 분리할 수 있게 된다.

만일 기질세포의 자발적 마이그레이션이 배양액 내에서 생체조직을 부착시킬 수 있는 소재의 부재에 생체조직을 부착시킨 상태에서 이루어진다면, 배양액은 부착부재 및 생체조직과 평균비중이 같은 것을 사용하거나 또는 부착부재 및 생체조직보다 평균비중이 더 큰 것을 사용하는 것이 바람직하다. 왜냐하면, 이 경우에는 배양액 내에서 부착부재 및 생체조직은 전체적으로 분포되거나 또는 배양액의 수면 근처에 부착부재 및 생체조직이 분포됨으로써 부착부재에 생체조직이 접촉할 가능성이 더욱 커져서 부착부재에 생체조직이 더욱 효과적으로 부착되고 기질세포의 자발적 마이그레이션이 더욱 효과적으로 유도될 수 있기 때문이다.

생체조직은 기질세포를 둘러싸는 콜라겐 사이로 기질세포의 적어도 일부가 외부로 노출되도록 미세하게 절단된 상태로 부착부재에 부착되는 것이 더욱 바람직하다. 이에 의해 생체조직에서 기질세포의 자발적 마이그레이션을 더욱 잘 유도하여 생체조직에서 기질세포를 더욱 효율적으로 분리할 수 있기 때문이다. 이때 이러한 생체조직의 절단은 레이져 등을 이용하여 이루어질 수 있다.

기질세포의 자발적 마이그레이션에 의해 기질세포가 생체조직의 외부로 이동된 후에는 기질세포에 물리적 힘을 가함으로써 기질세포를 생체조직으로부터 분리할 수 있다. 예컨대, 배양액 내에서 기질세포가 자발적 마이그레이션에 의해 생체조직의 외부로 이동된 후에는 기질세포를 배양액과 함께 난류 운동시킴으로써 기질세포에 물리적 힘을 가하여 기질세포를 생체조직으로부터 분리할 수 있다. 만일 배양액 내에서 부착부재 상에서 기질세포가 자발적 마이그레이션에 의해 생체조직의 외부로 이동된 경우에는, 부착부재를 배양액과 함께 난류 운동시킴으로써 부착부재 상의 기질세포에 물리적 힘을 가하거나 또는 복수의 부착부재를 배양액과 함께 난류 운동시켜 서로 충돌시킴으로써 부착부재 상의 기질세포에 더 강한 물리적 힘을 가하여 기질세포를 생체조직에서 효율적으로 분리할 수 있게 된다.

기질세포는 생체조직에서 분리된 후에는 외부로 수집된다. 이와 같이 수집된 기질세포는 배양액 내에서 배양 또는 계대 배양을 통해 증식될 수 있다. 만일 기질세포가 배양액 내에서 생체조직으로부터 분리된다면, 기질세포는 배양액과 함께 수집될 수 있어서 더욱 효율적으로 분리 및 배양 또는 계대 배양할 수 있게 된다.

2. 효소를 사용하지 않고 생체조직에서 기질세포를 분리하는 장치

본 장치는 효소를 사용하지 않고 생체조직에서 기질세포를 분리하는 장치로서, 배양액 내에서 생체조직을 부착시켜 생체조직의 기질세포의 자발적 마이그레이션을 유도하여 기질세포를 생체조직의 외부로 이동시키는 부착부재를 구비하는 것을 특징으로 한다.

부착부재의 소재는 배양액 내에서 생체조직을 부착시켜 생체조직의 기질세포의 자발적 마이그레이션을 유도하여 기질세포를 생체조직의 외부로 이동시키도록 다양하게 이루어질 수 있다. 예컨대, 부착부재는 생체조직을 안정적으로 또는 효율적으로 부착시키기 위하여 생체조직과 동일하거나 유사한 소재로 이루어질 수 있다. 만일 부착부재의 표면의 적어도 일부에 생체조직을 부착시킨 상태에서 부착부재를 배양액 내에 배열시키게 되면, 배양액 내에 분포된 생체조직은 동일한 조직이 부착된 부착부재의 표면에 더욱 용이하게 부착될 수 있게 된다.

부착부재의 형상은 배양액 내에서 생체조직을 부착시켜 생체조직의 기질세포의 자발적 마이그레이션을 유도하여 기질세포를 생체조직의 외부로 이동시키도록 다양하게 이루어질 수 있다. 예시적으로 도 3에 나타나 있는 바와 같이 부착부재(110)는 미세하게 절단된 다수의 생체조직(120)이 부착되고 부착된 다수의 생체조직(120)의 기질세포(130)가 자발적 마이그레이션에 의해 생체조직(120)의 외부로 이동되어 배열되는 영역을 이루는 표면을 갖는 본체(111)로 이루어질 수 있다. 이를 위하여 부착부재(110)는 전체적으로 납작한 입방체의 형상으로 이루어질 수 있다. 예시적으로 도 3에 나타나 있는 부착부재(110)는 사각 입방체의 형상으로 이루어져 있으나, 이에 한정되지 않고 부착부재는 원 입방체, 삼각 입방체, 오각 입방체 등 다양한 형상으로 이루어질 수 있다.

부착부재(110)의 두께(t)는 미세하게 절단된 다수의 생체조직(120)이 부착되고 배양액의 난류 운동에 견딜 수 있는 강성을 갖도록 두껍고 동시에 배양액의 난류 운동에 의해 원활하게 움직일 수 있도록 얇게 이루어지는 것이 바람직하다.

만일 부착부재의 표면의 적어도 일부에 요철 형상이 형성되면, 생체조직이 부착부재의 표면과 접촉하는 면적이 커져서 더욱 용이하게 부착될 수 있게 된다.

부착부재의 비중은 배양액 내에서 생체조직을 부착시켜 생체조직의 기질세포의 자발적 마이그레이션을 유도하여 기질세포를 생체조직의 외부로 이동시키도록 다양하게 이루어질 수 있다.

만일 생체조직이 배양액보다 평균비중이 더 작아서 배양액의 수면 근처에 대부분 분포하게 된다면, 부착부재는 배양액보다 평균비중이 더 작게 되도록 하는 것이 바람직하다. 왜냐하면, 이 경우에는 부착부재도 생체조직과 마찬가지로 배양액의 수면 근처에 대부분 분포하게 되므로, 부착부재가 생체조직과 접촉할 가능성이 더 커지게 되어서 부착부재 상에 생체조직이 부착될 가능성이 더 커지게 되기 때문이다. 따라서 이 경우에는 생체조직의 기질세포가 부착부재 상에서 자발적 마이그레이션에 의해 생체조직의 외부로 이동할 가능성이 더 커지게 된다.

부착부재가 배양액보다 평균비중이 더 작게 되는 경우, 부착부재는, 폴리프로필렌(polypropylene), 폴리에틸렌(polyethylene), 폴리우레탄(polyurethane), ECM(Extracellular Matrix), 콜라겐(collagen), 폴리디옥사논(polydioxanone), 폴리카프롤락톤(polycaprolactone), PLLA(poly(L-lactide)), PLGA(poly(lactic-co-glycolic acid)), PLA(poly(lactic acid)), PGA(pterolyglutamic acid), 히알루론산(hyaluronic acid) 및 실리콘으로 이루어진 군 중에서 선택된 적어도 어느 하나를 포함하는 것일 수 있다.

만일 생체조직이 배양액보다 평균비중이 더 커서 배양액의 저면 근처에 대부분 분포하게 된다면, 부착부재는 배양액보다 평균비중이 더 크게 되도록 하는 것이 바람직하다. 왜냐하면, 이 경우에는 부착부재도 생체조직과 마찬가지로 배양액의 저면 근처에 대부분 분포하게 되므로, 부착부재가 생체조직과 접촉할 가능성이 더 커지게 되어서 부착부재 상에 생체조직이 부착될 가능성이 더 커지게 되기 때문이다. 따라서 이 경우에는 생체조직의 기질세포가 부착부재 상에서 자발적 마이그레이션에 의해 생체조직의 외부로 이동할 가능성이 더 커지게 된다.

부착부재가 배양액보다 평균비중이 더 크게 되는 경우, 부착부재는, 테프론(teflon), 폴리카보네이트(polycarbonate), 폴리에틸렌(polyethylene), 프탈레이트(phthalate), 폴리스티렌(polystyrene), 폴리우레탄(polyurethane), ECM(Extracellular Matrix), 콜라겐(collagen), 폴리디옥사논(polydioxanone), 폴리카프롤락톤(polycaprolactone), PLLA(poly(L-lactide)), PLGA(poly(lactic-co-glycolic acid)), PLA(poly(lactic acid)), PGA(pterolyglutamic acid), 히알루론산(hyaluronic acid) 및 실리콘으로 이루어진 군 중에서 선택된 적어도 어느 하나를 포함하는 것일 수 있다.

만일 생체조직이 배양액과 평균비중이 동일하여서 배양액의 전체에 분산되어 분포하게 된다면, 부착부재는 배양액과 평균비중이 동일하도록 하는 것이 바람직하다. 왜냐하면, 이 경우에는 부착부재도 생체조직과 마찬가지로 배양액의 전체에 분산되어 분포하게 되므로, 부착부재가 생체조직과 접촉할 가능성이 더 커지게 되어서 부착부재 상에 생체조직이 부착될 가능성이 더 커지기 때문이다. 따라서 이 경우에는 생체조직의 기질세포가 부착부재 상에서 자발적 마이그레이션에 의해 생체조직의 외부로 이동할 가능성이 더 커지게 된다.

부착부재에 부착되는 생체조직은 생체조직에서 기질세포를 둘러싸는 콜라겐 사이로 기질세포의 적어도 일부가 외부로 노출되도록 미세하게 절단된 생체조직인 것이 바람직하다. 이에 의하여 기질세포의 자발적 마이그레이션이 더 잘 유도되어 기질세포가 생체조직에서 더 잘 분리될 수 있기 때문이다.

부착부재는, 배양액 내에서 생체조직을 부착시켜 생체조직의 기질세포의 자발적 마이그레이션을 유도하여 기질세포를 생체조직의 외부로 이동시키는 것뿐만 아니라, 자발적 마이그레이션에 의해 생체조직의 외부로 이동된 기질세포를 생체조직에서 분리시키는 것일 수 있다. 이에 의하여 부착부재는 기질세포가 자발적 마이그레이션에 의해 생체조직의 외부로 이동하는 것뿐만 아니라, 생체조직의 외부로 이동된 기질세포가 생체조직에서 분리되는 것도 촉진할 수 있게 된다.

부착부재가 자발적 마이그레이션에 의해 생체조직의 외부로 이동된 기질세포를 생체조직에서 분리시키는 것은 다양하게 이루어질 수 있다.

예컨대, 부착부재는 부착부재 상에서 생체조직의 외부로 이동된 기질세포를 스크레이핑(scraping)하는 역할을 할 수 있다. 이에 의하여 기질세포는 물리적 힘을 받아 생체조직에서 분리되어 배양액 내로 이동하게 된다. 이를 위하여 예시적으로 도 4에 나타나 있는 바와 같이 부착부재(210)는 생체조직(220)이 부착되고 자발적 마이그레이션에 의해 생체조직(220)의 외부로 이동된 기질세포(230)가 배열되는 영역을 이루는 본체(211) 이외에, 본체(211)에서 외측으로 연장되어 본체(211)의 두께(t)보다 더 얇은 두께로서 타 부착부재에 배열된 기질세포를 스크레이핑(scraping)할 수 있는 형상을 갖는 스크레이핑부(212)를 더 구비할 수 있다. 이러한 스크레이핑부(212)는 그 횡단면의 코너부가 형성하는 각도가 90도보다 작은 예각으로 이루어질 수 있다. 이러한 스크레이핑부(212)에 의해 자발적 마이그레이션에 의해 생체조직(220)에서 분리되어 생체조직(220)의 외측면에 또는 부착부재(210) 상에 배열되어 있는 기질세포(230)를 생체조직(220) 또는 부착부재(210)에서 쉽게 분리하여 배양액 내부로 이동시킬 수 있게 된다. 예시적으로 도 5에 나타나 있는 바와 같이 제1 부착부재(210) 상에서 생체조직(220)에서 분리되어 생체조직(220)의 외측면에 또는 부착부재(210) 상에 배열되어 있는 기질세포(230)는, 배양액의 난류 운동과 함께 난류 운동을 하는 인접하는 제2 부착부재(210')와 충돌하는 과정에서 제2 본체(211')의 두께(t')보다 더 얇은 두께를 갖고 외측으로 연장된 제2 스크레이핑부(212')에 의해 쉽게 스크레이핑됨으로써 생체조직(220) 또는 부착부재(210)에서 쉽게 분리되어 배양액 내부로 이동할 수 있게 된다. 제1 스크레이핑부(212)도 다른 부착부재 상에 배열되어 있는 기질세포를 스크레이핑하는 역할을 한다. 제1 스크레이핑부(212)와 제2 스크레이핑부(212')는 각각 제1 본체(211)의 두께(t)와 제2 본체(211')의 두께(t')보다 더 작은 두께를 갖도록 그 횡단면의 코너부의 각도(A)(A')가 90도보다 작은 예각을 이루고 있다. 다만, 스크레이핑부의 형상은 예시적으로 도 4 및 도 5에 나타나 있는 형상으로 한정되지 않으며 부착부재 상에 배열된 기질세포를 분리할 수 있는 다른 다양한 형상을 가질 수도 있다.

본 장치는 배양액과 생체조직 및 부착부재를 내부에 수용하는 용기를 더 구비할 수 있다.

용기는 배양액과 생체조직 및 부착부재가 수용되는 공간을 구비한다. 예시적으로 도 6에 나타나 있는 바와 같이 용기(350)는 배양액(340)과 생체조직(320) 및 부착부재(310)(311)가 수용될 수 있는 수용공간(351)을 구비할 수 있다. 다만, 수용공간(351)은 이에 한정되지 않고 배양액(340)과 생체조직(320) 및 부착부재(310)(311)가 수용될 수 있는 다양한 형상을 가질 수 있다.

수용공간(351)은 회전에 의한 원심분리가 가능하도록 형성된 경사부(352)를 갖고 있으며, 위쪽으로 갈수록 반경이 커지는 원형 횡단면을 갖는다. 수용공간(351)의 상부는 덮개(353)로 덮여 있다. 덮개(353)는 수용공간(351)에 수용된 배양액(340)과 생체조직(320) 및 부착부재(310)(311)가 외부로 누출되지 않도록 하는 기능을 한다. 나아가, 덮개(353)는 용기(350)의 정회전과 역회전에 의한 배양액(340)의 난류 운동으로 인해 배양액(340)이 외부로 누출되는 것을 차단하는 기능을 한다. 덮개(353)는 수용공간(351)의 경사부(352)와 반대되는 경사를 갖는 경사부를 가지며 위쪽으로 갈수록 반경이 작아지는 원형 횡단면을 갖는 것이 회전에 의한 원심분리에 유리할 수 있다.

용기는 어느 한 방향으로의 정회전과 반대 방향으로의 역회전을 반복하여 수용공간 내부의 배양액의 난류를 유도할 수 있다. 이러한 배양액의 난류에 의하여 생체조직 및 부착부재도 난류 운동을 하게 된다. 이에 따라 부착부재 상에 부착된 생체조직에서 자발적 마이그레이션에 의하여 생체조직의 외부로 이동함으로써 부착부재 상에 배열되어 있는 기질세포가 생체조직 또는 부착부재로부터 분리되어 배양액 내부로 분리된다. 또한, 용기는 어느 한 방향으로 회전하여 배양액 내부에 분포된 기질세포에 원심력을 가함으로써 기질세포를 생체조직 및 부착부재와 분리시켜 배양액과 함께 수집할 수 있게 한다.

용기는 그것이 정지된 상태에서 수용공간 내부의 배양액에 잠기는 위치에 배열되어 있는 차단막을 더 구비할 수 있다. 차단막은 배양액보다 평균비중이 더 작아서 배양액에 뜨는 생체조직이 배양액의 수면 위로 뜨는 것을 차단함으로써 생체조직이 부착부재와 접촉하여 부착부재에 부착할 수 있게 한다. 이를 위하여 차단막은 생체조직은 투과되지 않고 배양액은 투과되는 관통공을 구비한다. 이러한 차단막의 관통공을 통해서는 부착부재가 투과되지 않게 된다.

예시적으로 도 6에 나타나 있는 바와 같이 차단막(360)은 용기(350)가 정지된 상태에서 수용공간(351) 내부의 배양액(340)의 수면보다 아래의 수면 근방과 같이 배양액(340)에 잠기는 위치에 배열된다. 차단막(360)에는 복수의 관통공이 형성되어 있는데, 이러한 관통공은 배양액(340)은 투과되지만 생체조직(320) 및 부착부재(310)(311)는 투과되지 않도록 조절된 크기를 갖는다. 차단막(360) 하부의 배양액(340) 내부로 주입된 생체조직(320)은 배양액(340)보다 평균비중이 작은 경우 차단막(360)에 의해 차단되어 배양액(340)의 수면 위로 뜨지 않고 차단막(360) 하측 근방에 모이게 된다. 차단막(360) 하부의 배양액(340) 내부로 주입된 부착부재(310)(311) 중에서 배양액(340)보다 평균비중이 작은 부착부재(311)는 차단막(360)에 의해 차단되어 배양액(340)의 수면 위로 뜨지 않고 차단막(360)의 하측 근방에 모이게 된다. 만일 생체조직(320)이 부착부재(311)보다 평균비중이 작을 경우에는 부착부재(311)는 생체조직(320)이 모인 층의 하측에 모이게 된다. 따라서 생체조직(320)은 부착부재(311)와 인접되거나 중첩되어 층을 형성하게 되어서 부착부재(311)와 접촉 가능성이 대폭 증가하게 되고 부착부재(311)에 부착될 가능성이 대폭 증가하게 된다. 결과적으로, 부착부재(311)에 부착된 생체조직(320)에서 기질세포가 자발적 마이그레이션에 의해 생체조직(320)의 외부로 이동할 가능성이 대폭 증가하게 된다.

또한, 차단막은 배양액의 난류에 의해 부착부재가 난류 운동을 할 때에 부착부재가 배양액 상부로 이탈하는 것을 차단함으로써 부착부재 상에서 생체조직의 외부로 이동된 기질세포가 배양액 외부로 이탈하는 것을 차단하는 역할도 한다.

용기는 원심력이 최대인 위치에 형성되어 생체조직에서 분리된 기질세포를 원심력에 의해 수렴시키는 수렴부를 가질 수 있다. 이에 의하여 생체조직에서 분리된 기질세포를 수렴하여 외부로 쉽게 배출할 수 있게 된다.

예시적으로 도 6에 나타나 있는 바와 같이 수렴부(354a)(354b)는 수용공간(351)의 상부 가장자리 중에서 원심력이 최대인 위치에 배열된 제1 수렴부(354a)와, 수용공간(351)의 상부 가장자리 중에서 제1 수렴부(354a)와 대칭이 되면서 원심력이 최대인 위치에 배열된 제2 수렴부(354b)를 구비한다. 제1 수렴부(354a) 및 제2 수렴부(354b)는 각각 배양액(340)과 함께 수렴된 기질세포를 수용할 수 있는 공간을 갖는다. 이러한 제1 및 제2 수렴부(354a)(354b)는 원심력이 최대인 위치에 배열되어 있기 때문에 용기(350)의 회전에 의한 원심 분리가 이루어질 때에 생체조직(320)에서 분리되어 배양액(340)에 분포되어 있는 기질세포가 배양액(340)과 함께 수렴되도록 유도하게 된다. 수렴부는 예시적으로 도 6에 나타나 있는 것에 한정되지 않고 한 개 또는 세 개 이상의 수렴부로 이루어질 수 있다.

용기는 수용공간에서 수렴부까지의 경로 상에 위치하여 원심력에 의한 기질세포의 이동을 허용하고 생체조직 및 부착부재의 이동을 차단하는 필터를 더 구비할 수 있다. 이에 의하여 수렴부에는 기질세포가 분포된 배양액은 수렴되고 생체조직과 부착부재는 수렴되지 않도록 조절할 수 있게 된다.

예시적으로 도 6에 나타나 있는 바와 같이 필터(370a)(370b)는 수용공간(351)에서 제1 수렴부(354a)까지의 경로 상에 위치하는 제1 필터(370a)와, 수용공간(351)에서 제2 수렴부(354b)까지의 경로 상에 위치하는 제1 필터(370b)를 구비한다. 제1 필터(370a)는 제1 수렴부(354a)의 입구에 위치하고, 제2 필터(370b)는 제2 수렴부(354b)의 입구에 위치한다. 제1 및 제2 필터(370a)(370b)에는 복수의 관통공이 형성되어 있는데, 이러한 관통공은 기질세포가 분포된 배양액(340)은 관통되도록 하고 생체조직(320)과 부착부재(310)(311)는 관통되지 않게 조절되어 있는 크기를 갖는다. 이에 의하여 제1 및 제2 필터(370a)(370b)는 기질세포가 분포된 배양액(340)의 이동을 허용하고 생체조직(320)과 부착부재(310)(320)의 이동을 차단함으로써 제1 및 제2 수렴부(354a)(354b)에 생체조직(320)과 부착부재(310)(311)를 제외하고 기질세포가 분포된 배양액(340)이 수렴되도록 한다. 필터는 예시적으로 도 6에 나타나 있는 것에 한정되지 않고 수용공간에서 수렴부까지의 경로 상의 다양한 위치에 배열될 수 있다.

용기는 수렴부에 형성되어 수렴부에 수렴된 기질세포를 외부로 배출시키는 기질세포 배출부를 더 구비할 수 있다. 이에 의하여 수렴부에 수렴된 기질세포를 외부로 쉽게 배출시킬 수 있게 된다.

예시적으로 도 6에 나타나 있는 바와 같이 기질세포 배출부(355a)(355b)는 제1 수렴부(354a)에 형성되어 제1 수렴부(354a)에 수렴된 기질세포를 외부로 배출시키는 제1 기질세포 배출부(355a)와, 제2 수렴부(354b)에 형성되어 제2 수렴부(354b)에 수렴된 기질세포를 외부로 배출시키는 제2 기질세포 배출부(355b)를 구비한다. 제1 기질세포 배출부(355a)는 제1 수렴부(354a)에 수렴된 기질세포가 분포된 배양액(340)을 외부로 배출시키고, 제2 기질세포 배출부(355b)는 제2 수렴부(354b)에 수렴된 기질세포가 분포된 배양액(340)을 외부로 배출시킨다. 제1 및 제2 기질세포 배출부(355a)(355b)는 제1 및 제2 수렴부(354a)(354b)에 형성된 배출구에 연결된 튜브로 이루어질 수 있다. 기질세포 배출부는 예시적으로 도 6에 나타나 있는 것에 한정되지 않고 수렴부에 형성되어 수렴부에 수렴된 기질세포를 외부로 배출시킬 수 있는 다양한 구성으로 이루어질 수 있다.

용기는 외부에서 수용공간으로 연장되어 배양액을 주입하거나 배출시키는 배양액 관통관을 더 구비할 수 있다. 이에 의하여 수용공간으로 배양액을 주입하거나 배출시키는 것을 용이하게 실행할 수 있게 된다.

예시적으로 도 6에 나타나 있는 바와 같이 배양액 관통관(380)은 외부에서 덮개(353)를 관통하여 수용공간(351) 내부로 연장된 튜브를 구비한다. 배양액 관통관(380)은 덮개(353) 및 차단막(360)의 중앙 부분을 차례로 관통하여 수용공간(351)의 중앙 저면 근처까지 연장될 수 있다. 배양액 관통관(380)이 관통하는 덮개(353)의 중앙 부분에는 고무 재질의 실링부재(390)가 배열됨으로써 배양액 관통관(380)이 관통하는 수용공간(351)의 중앙 부분을 견고하게 밀폐시킬 수 있다. 배양액 관통관(380)에 의하여 덮개(353)를 개봉하지 않고도 외부에서 수용공간(351)으로 배양액을 용이하게 주입하거나 배출함으로써 필요할 때마다 쉽게 배양액을 주입 또는 교체할 수 있게 된다. 배양액 관통관은 예시적으로 도 6에 나타나 있는 것에 한정되지 않고 외부에서 수용공간으로 연장되어 배양액을 주입하거나 배출시킬 수 있는 다양한 구성으로 이루어질 수 있다.

용기는 내부 소독을 위한 가스를 주입시키는 가스 주입부를 더 구비할 수 있다. 이에 의하여 용기 내부 소독을 용이하게 실행할 수 있다.

3. 실시례

본 발명의 일 실시례는, 효소를 사용하지 않고 생체조직에서 기질세포를 분리하는 방법으로서, (1) 생체조직을 미세하게 절단하는 단계; (2) 미세하게 절단된 생체조직을 배양액 내에서 그 생체조직이 부착될 수 있는 소재의 부착부재 상에 부착시키는 단계; (3) 부착부재 상에서 기질세포의 자발적 마이그레이션을 유도하여 기질세포를 생체조직의 외부로 이동시키는 단계; (4) 생체조직의 외부로 이동된 기질세포를 생체조직에서 분리하는 단계; 및 (5) 생체조직에서 분리된 기질세포를 수집하는 단계를 포함한다.

(1) 생체조직을 미세하게 절단하는 단계는 생체조직에서 기질세포를 둘러싸는 콜라겐 사이로 기질세포의 적어도 일부가 외부로 노출되도록 미세하게 절단하는 것을 말한다. 이러한 생체조직의 절단은 레이져 등을 이용하여 이루어질 수 있다. 이와 같이 기질세포를 둘러싸는 콜라겐 사이로 기질세포의 적어도 일부가 외부로 노출되도록 생체조직을 미세하게 절단함으로써 생체조직에서 기질세포의 자발적 마이그레이션을 효과적으로 유도할 수 있게 된다.

(2) 미세하게 절단된 생체조직을 배양액 내에서 그 생체조직이 부착될 수 있는 소재의 부착부재 상에 부착시키는 단계는 예시적으로 도 6에 나타나 있는 바와 같이 생체조직과 배양액 및 부착부재를 넣은 용기 내에서 이루어진다.

먼저, 생체조직(320)과 배양액(340) 및 부착부재(310)(311)를 수용하는 수용공간(351)을 갖는 용기(350)를 준비한다. 용기(350)의 덮개(353) 및 차단막(360)을 용기(350)로부터 분리한 다음 미리 준비한 미세하게 절단된 생체조직(320) 및 생체조직(320)이 부착될 수 있는 소재의 부착부재(310)(311)를 수용공간(351)에 위치시킨다. 이후 덮개(353) 및 차단막(360)을 용기(350)와 결합한 다음, 덮개(353) 및 차단막(360)의 중앙부를 차례로 관통하여 수용공간(351)까지 연장된 배양액 관통관(380)을 통해 기질세포가 생존할 수 있는 배양액(340)을 주입한다. 이때 배양액(340)의 수면이 차단막(360)보다 높은 위치에 있도록 배양액(340)을 주입한다.

위와 같이 생체조직(320)과 부착부재(310)(311)를 용기(350)의 수용공간(351)에 위치시킨 상태에서 배양액(340)을 주입하게 되면, 배양액(340)보다 평균비중이 작은 생체조직(320)과 부착부재(311)는 배양액(340)의 수면 쪽으로 상승하여 차단막(360) 하측면 및 그 근방에 층을 이루어 배열된다. 이때 부착부재(311)보다 평균비중이 작은 생체조직(320)이 부착부재(311)의 상층에 위치하게 되고 부착부재(311)는 생체조직(320)의 하층에 위치하게 된다. 이 경우 생체조직(320)이 배열된 층은 부착부재(311)이 배열된 층과 일부 중첩되거나 인접하게 되어 생체조직(320)은 부착부재(311)와 접촉하는 영역이 대폭 확대된다. 배양액(340)보다 평균비중이 큰 부착부재(310)는 배양액(340)의 아래쪽에 있는 수용공간(351)의 저면 및 그 근방에 배열된다. 배양액(340)보다 평균비중이 큰 부착부재(310)의 일부는 차단막(360)의 상측면에 배열될 수 있다. 이와 같이 배양액(340)과 생체조직(320) 및 부착부재(311)이 배열된 상태에서 시간이 지나면, 생체조직(320)은 부착부재(311)에 부착하게 된다.

(3) 부착부재 상에서 기질세포의 자발적 마이그레이션을 유도하여 기질세포를 생체조직의 외부로 이동시키는 단계는 예시적으로 도 6에 나타나 있는 바와 같이 생체조직(320)이 부착된 부착부재(311) 상에서 생체조직(320) 내의 기질세포가 자발적 마이그레이션에 의하여 생체조직(320)의 외부로 이동되도록 하는 것을 의미한다.

생체조직(320) 내의 기질세포는 자발적 마이그레이션에 의하여 생체조직(320)의 외측면이나 부착부재(311)의 표면 또는 배양액(340) 내부로 이동하게 된다. 이러한 기질세포의 이동은 부착부재(311) 상에 부착된 생체조직(320)의 콜라겐 사이를 통해 외부로 노출된 기질세포에 의해 활발히 일어나게 된다.

(4) 생체조직의 외부로 이동된 기질세포를 생체조직에서 분리하는 단계는 예시적으로 도 6에 나타나 있는 바와 같이 생체조직(320)이 부착된 부착부재(311) 상에서 생체조직(320) 내의 기질세포의 자발적 마이그레이션에 의하여 생체조직(320)의 외부로 이동된 기질세포를 생체조직(320)에서 분리하여 배양액(340) 내로 이동시키는 것을 의미한다.

생체조직(320)의 외부로 이동된 기질세포를 생체조직(320)에서 분리하여 배양액(340) 내로 이동시키는 것은 예시적으로 도 6에 나타나 있는 바와 같이 용기(350)의 정회전과 역회전을 번갈아 반복하여 생체조직(320)의 외부로 이동된 기질세포에 생체조직(320)에서 분리시키는 물리적 힘을 가함으로써 이루어진다. 용기(350)의 정회전과 역회전을 번갈아 반복하게 되면, 배양액(340)에 난류가 발생하게 되어 배양액(340)에 잠긴 부착부재(311)가 난류 운동을 하게 되므로, 부착부재(311) 상에서 생체조직(320)의 외부로 이동된 기질세포가 생체조직(320)에서 분리되도록 하는 물리적 힘을 받게 된다.

또한, 다수의 부착부재(311)들의 난류 운동에 의해 부착부재(311)들이 서로 충돌하게 되면서 부착부재(311)에 형성된 스크레이핑부(도 5 참조)에 의해 다른 부착부재(311) 상에서 생체조직(320)의 외부로 이동된 기질세포를 스크레이핑(scraping)하게 됨으로써 기질세포가 생체조직(320)에서 배양액(340) 내부로 분리되는 것을 더욱 촉진하게 된다.

나아가, 다수의 부착부재(311)들의 난류 운동에 의해 부착부재(311)들이 용기(350)의 경사부(352)의 내측면, 평균비중이 배양액(340)보다 더 크면서 난류 운동을 하는 부착부재(310), 배양액 관통관(380)의 외측면 또는 차단막(360)의 하측면에 접촉 내지 충돌하게 되면서 부착부재(311) 상에서 생체조직(320)의 외부로 이동된 기질세포가 생체조직(320)에서 배양액(340) 내부로 분리되는 것을 촉진하게 된다.

(5) 생체조직에서 분리된 기질세포를 수집하는 단계는 생체조직에서 배양액 내부로 분리된 기질세포를 생체조직 및 부착부재와 분리하여 수집하는 것으로서, 예시적으로 도 7 및 도 8에 나타나 있는 바와 같이, (a) 생체조직(320)에서 배양액(340) 내부로 분리된 기질세포(330)를 원심분리에 의해 수렴부(354a)(354b)에 수렴하는 단계와, (b) 수렴부(354a)(354b)에 수렴된 기질세포(330)를 외부로 배출하는 단계로 이루어진다.

(a) 생체조직(320)에서 배양액(340) 내부로 분리된 기질세포(330)를 원심분리에 의해 수렴부(354a)(354b)에 수렴하는 단계는, 예시적으로 도 7에 나타나 있는 바와 같이, 생체조직(320)에서 배양액(340) 분리된 기질세포(330)를 포함하는 용기(350)를 정회전 또는 역회전의 일 방향으로 회전시켜 기질세포(330)에 원심력을 가함으로써, 기질세포(330)를 서로 대칭이 되는 위치에 배열되어 원심력이 최대로 작용하는 제1 수렴부(354a) 및 제2 수렴부(354b)에 각각 수렴시키는 것이다.

용기(350)가 일 방향으로 회전함에 따라, 배양액(340)은 물론 생체조직(320) 및 부착부재(310)(311)도 원심력에 의해 제1 수렴부(354a) 및 제2 수렴부(354b)로 이동하게 된다. 이때 배양액(340)은 기질세포(320)와 함께 제1 수렴부(354a)의 입구에 배열된 제1 필터(370a) 및 제2 수렴부(354b)의 입구에 배열된 제2 필터(370b)를 각각 투과하여 제1 수렴부(354a) 및 제2 수렴부(354b)에 각각 수렴된다. 그러나 생체조직(320)과 부착부재(310)(311)는 모두 제1 수렴부(354a)의 입구에 배열된 제1 필터(370a) 및 제2 수렴부(354b)의 입구에 배열된 제2 필터(370b)를 모두 투과하지 못하여 제1 수렴부(354a) 및 제2 수렴부(354b) 중 어느 곳에도 수렴되지 못한다. 왜냐하면, 제1 및 제2 필터(370a)(370b)는 모두 배양액(340)과 기질세포(320)는 투과하지만 생체조직(320)과 부착부재(310)(311)는 투과하지 못하도록 관통공의 크기가 조절되어 있기 때문이다.

위와 같이 제1 및 제2 수렴부(354a)(354b)에는 각각 배양액(340)과 함께 기질세포(320)만이 수렴된다.

(b) 수렴부(354a)(354b)에 수렴된 기질세포(330)를 외부로 배출하는 단계는 예시적으로 도 8에 나타나 있는 바와 같이 제1 및 제2 수렴부(354a)(354b)에 각각 수렴된 배양액(340)과 기질세포(320)를 외부로 배출하는 것을 의미한다.

용기(350)의 일 방향 회전에 의하여 제1 및 제2 수렴부(354a)(354b)에 각각 배양액(340)과 기질세포(320)만이 수렴되면, 용기(350)의 회전을 정지시킨다. 그 다음, 제1 수렴부(354a)에 형성된 제1 기질세포 배출부(355a)를 통해 제1 수렴부(354a)에 수렴된 배양액(340)과 기질세포(330)를 외부로 배출하고, 제2 수렴부(354b)에 형성된 제2 기질세포 배출부(355b)를 통해 제2 수렴부(354b)에 수렴된 배양액(340)과 기질세포(330)를 외부로 배출하게 된다.

위와 같은 과정을 통해 생체조직(320)에서 분리된 기질세포(330)를 최종적으로 수집하게 된다.

위 (1) 내지 (5)의 단계를 연속해서 실행함으로써 생체조직에서 기질세포를 연속적으로 분리할 수 있어서 분리효율을 향상시킬 수 있게 된다.

위 (2) 내지 (5)의 단계는 순서대로 반복해서 실행될 수 있다. 이에 의해 용기(350)의 수용공간(351) 내에 존재하는 동일한 부착부재(310)(311)나 생체조직(320) 또는 배양액(340)에 잔존하는 기질세포(330)을 반복해서 수집할 수 있어서 기질세포의 수율을 향상시킬 수 있다.

위 (2) 내지 (4)의 단계에서 생체조직(320), 배양액(340) 및 부착부재(310)(311) 중 적어도 어느 하나를 교체한 후에 위 (2) 내지 (5)의 단계를 순서대로 반복해서 실행할 수도 있다. 이에 의해 용기(350)의 수용공간(351) 내에 존재하는 생체조직(320), 배양액(340) 및 부착부재(310)(311) 중 적어도 어느 하나를 교체하면서 기질세포(330)을 반복해서 수집할 수 있어서 수율을 대폭 향상시킬 수 있다.

본 발명은 효소를 사용하지 않고 생체조직에서 기질세포를 분리하는 방법 및 장치에 이용할 수 있다.

110, 210, 210', 310, 311: 부착부재
120, 220, 320: 생체조직
130, 230, 330: 기질세포
340: 배양액
350: 용기
353: 덮개
354a: 제1 수렴부
354b: 제2 수렴부
360: 차단막
370a: 제1 필터
370b: 제2 필터
380: 배양액 관통관
390: 실링부재

Claims

효소를 사용하지 않고 생체조직에서 기질세포를 분리하는 방법으로서,
생체조직의 기질세포의 자발적 마이그레이션(spontaneous migration)을 유도하여 기질세포를 생체조직의 외부로 이동시키는 것을 이용하고,
기질세포의 자발적 마이그레이션의 유도는 생체조직을 부착시킬 수 있는 소재의 부착부재 상에 생체조직이 부착된 상태에서 이루어지며,
기질세포의 자발적 마이그레이션의 유도는 기질세포가 생존할 수 있는 배양액 내에서 이루어지고,
생체조직의 외부로 이동된 기질세포를 배양액과 함께 난류 운동시켜 기질세포에 물리적 힘을 가함으로써 기질세포를 생체조직에서 분리하고,
부착부재는, 배양액보다 더 작은 평균비중을 갖는 제1 부착부재와, 배양액보다 더 큰 평균비중을 갖는 제2 부착부재와, 배양액과 동일한 평균비중을 갖는 제3 부착부재를 포함하며,
배양액 내에서, 제1 부착부재는 배양액보다 더 작은 평균비중을 갖는 생체조직과 분포하는 영역이 중첩되고, 제2 부착부재는 배양액보다 더 큰 평균비중을 갖는 생체조직과 분포하는 영역이 중첩되며, 제3 부착부재는 배양액과 동일한 평균비중을 갖는 생체조직과 분포하는 영역이 중첩되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1에 있어서,
생체조직에서 기질세포를 둘러싸는 콜라겐 사이로 기질세포의 적어도 일부가 외부로 노출되도록 생체조직을 미세하게 절단하는 것을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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삭제
청구항 1에 있어서,
생체조직에서 분리된 기질세포를 수집하는 것을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
효소를 사용하지 않고 생체조직에서 기질세포를 분리하는 방법으로서,
(1) 생체조직을 미세하게 절단하는 것;
(2) 미세하게 절단된 생체조직을 배양액 내에서 그 생체조직이 부착될 수 있는 소재의 부착부재 상에 부착시키는 것;
(3) 부착부재 상에서 기질세포의 자발적 마이그레이션을 유도하여 기질세포를 생체조직의 외부로 이동시키는 것; 및
(4) 생체조직의 외부로 이동된 기질세포를 생체조직에서 분리하는 것을
포함하고,
(4)의 기질세포의 분리는 생체조직의 외부로 이동된 기질세포가 배열된 복수의 부착부재들을 배양액의 난류 운동에 의해 서로 충돌시켜 기질세포에 물리적 힘을 가함으로써 이루어지고,
부착부재는, 배양액보다 더 작은 평균비중을 갖는 제1 부착부재와, 배양액보다 더 큰 평균비중을 갖는 제2 부착부재와, 배양액과 동일한 평균비중을 갖는 제3 부착부재를 포함하며,
배양액 내에서, 제1 부착부재는 배양액보다 더 작은 평균비중을 갖는 생체조직과 분포하는 영역이 중첩되고, 제2 부착부재는 배양액보다 더 큰 평균비중을 갖는 생체조직과 분포하는 영역이 중첩되며, 제3 부착부재는 배양액과 동일한 평균비중을 갖는 생체조직과 분포하는 영역이 중첩되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 6에 있어서,
(1)의 생체조직은 그 생체조직에서 기질세포를 둘러싸는 콜라겐 사이로 기질세포의 적어도 일부가 외부로 노출되도록 미세하게 절단되는 것을 특징으로 하는 방법.
삭제
청구항 6에 있어서,
(5) 생체조직에서 분리된 기질세포를 수집하는 것을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 6에 있어서,
(2) 내지 (4)를 순서대로 반복하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 6에 있어서,
생체조직, 배양액 및 부착부재로 이루어진 군 중에서 선택된 적어도 하나를 교체한 후에 (2) 내지 (4)를 순서대로 반복하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1, 2, 5 내지 7, 9 내지 11 중 어느 한 항에 있어서,
생체조직은 피부, 지방, 연골, 점막, 혈관, 인대, 심장, 뇌, 태반, 제대, 양막, 근육 및 말초신경으로 이루어진 군 중에서 선택된 적어도 어느 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 6, 7, 9 내지 11 중 어느 한 항에 있어서,
배양액은 DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) 및 소태아혈청(fetal bovine serum)으로 이루어진 군 중에서 선택된 적어도 어느 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
효소를 사용하지 않고 생체조직에서 기질세포를 분리하는 장치로서,
배양액 내에서 생체조직을 부착시켜 생체조직의 기질세포의 자발적 마이그레이션을 유도하여 기질세포를 생체조직의 외부로 이동시키는 부착부재; 및
배양액과 생체조직 및 부착부재를 내부에 수용하는 용기를 구비하고,
용기는 배양액의 난류를 유도할 수 있고,
부착부재는, 배양액보다 더 작은 평균비중을 갖는 제1 부착부재와, 배양액보다 더 큰 평균비중을 갖는 제2 부착부재와, 배양액과 동일한 평균비중을 갖는 제3 부착부재를 포함하며,
배양액 내에서, 제1 부착부재는 배양액보다 더 작은 평균비중을 갖는 생체조직과 분포하는 영역이 중첩되고, 제2 부착부재는 배양액보다 더 큰 평균비중을 갖는 생체조직과 분포하는 영역이 중첩되며, 제3 부착부재는 배양액과 동일한 평균비중을 갖는 생체조직과 분포하는 영역이 중첩되는 것을 특징으로 하는 장치.
청구항 14에 있어서,
제1 부착부재는, 폴리프로필렌(polypropylene), 폴리에틸렌(polyethylene), 폴리우레탄(polyurethane), ECM(Extracellular Matrix), 콜라겐(collagen), 폴리디옥사논(polydioxanone), 폴리카프롤락톤(polycaprolactone), PLLA(poly(L-lactide)), PLGA(poly(lactic-co-glycolic acid)), PLA(poly(lactic acid)), PGA(pterolyglutamic acid), 히알루론산(hyaluronic acid) 및 실리콘으로 이루어진 군 중에서 선택된 적어도 어느 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
청구항 14에 있어서,
제2 부착부재는, 테프론(teflon), 폴리카보네이트(polycarbonate), 폴리에틸렌(polyethylene), 프탈레이트(phthalate), 폴리스티렌(polystyrene), 폴리우레탄(polyurethane), ECM(Extracellular Matrix), 콜라겐(collagen), 폴리디옥사논(polydioxanone), 폴리카프롤락톤(polycaprolactone), PLLA(poly(L-lactide)), PLGA(poly(lactic-co-glycolic acid)), PLA(poly(lactic acid)), PGA(pterolyglutamic acid), 히알루론산(hyaluronic acid) 및 실리콘으로 이루어진 군 중에서 선택된 적어도 어느 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
청구항 14에 있어서,
부착부재는 생체조직에서 기질세포를 둘러싸는 콜라겐 사이로 기질세포의 적어도 일부가 외부로 노출되도록 미세하게 절단된 생체조직을 부착시키는 것을 특징으로 하는 장치.
청구항 14에 있어서,
부착부재는, 배양액 내에서 생체조직을 부착시켜 생체조직의 기질세포의 자발적 마이그레이션을 유도하여 기질세포를 생체조직의 외부로 이동시킬 뿐만 아니라, 이와 같이 이동된 기질세포를 생체조직에서 분리시키는 것을 특징으로 하는 장치.
청구항 18에 있어서,
부착부재는, 자발적 마이그레이션에 의해 생체조직의 외부로 이동된 기질세포가 배열되는 영역을 이루는 본체와, 본체에서 외측으로 연장되어 본체의 두께보다 더 얇은 두께로서 타 부착부재에 배열된 기질세포를 스크레이핑(scraping)할 수 있는 형상을 갖는 스크레이핑부를 구비하는 것을 특징으로 하는 장치.
청구항 19에 있어서,
스크레이핑부는 그 횡단면의 코너부가 형성하는 각도가 예각을 이루는 것을 특징으로 하는 장치.
삭제
청구항 14에 있어서,
용기는 배양액과 생체조직 및 부착부재가 수용되는 공간을 형성하며 회전에 의한 원심분리가 가능하도록 형성된 경사부를 갖는 것을 특징으로 하는 장치.
청구항 14에 있어서,
용기는 정회전과 역회전에 의한 배양액의 난류를 유도할 수 있는 것을 특징으로 하는 장치.
청구항 14에 있어서,
용기는, 생체조직은 투과되지 않고 배양액은 투과되며 용기가 정지된 상태에서 배양액에 잠기는 위치에 배열되어 배양액에 뜨는 생체조직이 배양액에 뜨는 것을 차단하는, 차단막을 더 구비하는 것을 특징으로 하는 장치.
청구항 14에 있어서,
용기는 원심력이 최대인 위치에 형성되어 생체조직에서 분리된 기질세포를 원심력에 의해 수렴시키는 수렴부를 갖는 것을 특징으로 하는 장치.
청구항 25에 있어서,
용기는 수용 공간에서 수렴부까지의 경로 상에 위치하여 원심력에 의한 기질세포의 이동을 허용하고 생체조직 및 부착부재의 이동을 차단하는 필터를 더 구비하는 것을 특징으로 하는 장치.
청구항 25에 있어서,
용기는 수렴부에 형성되어 수렴부에 수렴된 기질세포를 외부로 배출시키는 기질세포 배출부를 더 구비하는 것을 특징으로 하는 장치.
청구항 14에 있어서,
용기는 외부에서 수용 공간으로 연장되어 배양액을 주입하거나 배출시키는 배양액 관통관을 더 구비하는 것을 특징으로 하는 장치.
청구항 14에 있어서,
용기는 내부 소독을 위한 가스를 주입시키는 가스 주입부를 더 구비하는 것을 특징으로 하는 장치.