KR20210077634A - 인간 만능 줄기세포로부터 3d 오가노이드를 이용하여 미세교세포를 다량 확보하는 미세교세포의 분화방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인간 만능 줄기세포로부터 제작된 난황낭(yolk sac) 모사 3D 오가노이드를 패턴화하고 증식, 배양하고 분화를 유도하여 미세교세포를 다량 확보하는 분화 방법에 관한 것으로, 다량 확보된 미세교세포는 기존 분화방법에 의해 분화된 세포에 비해 수율, 순도, 보관안정성 면에서 현저히 우수한 효과를 나타냄으로써 뇌질환 병변 및 치료기전 연구 및 약물 스크리닝 플랫폼에 활용될 수 있다.

Description

인간 만능 줄기세포로부터 3D 오가노이드를 이용하여 미세교세포를 다량 확보하는 미세교세포의 분화방법 {Differentiation method of securing large amount of microglia cells by using 3D organoids prepared from human pluripotent stem cells}
본 발명은 인간 만능 줄기세포로부터 제작된 난황낭(yolk sac)을 모사하는 오가노이드를 이용하여 미세교세포를 다량 확보하는 미세교세포의 분화방법에 관한 것이다.
근대의 인간 뇌 질환 연구는 대부분이 설치류의 신경세포를 이용해 진행되어 왔다. 그 이유는 인간 뇌신경세포의 확보가 어렵고 설치류 유전자와 인간 유전자의 유사성이 어느 정도 존재하기 때문이었으나, 최근 줄기세포 분야 연구가 진전됨에 따라 인간 뇌 신경계 세포들을 배아줄기세포로부터 분화시키는 방법들이 개발되면서 점점 뇌 질환 연구가 설치류 동물 세포에서 직접 인간의 세포들을 이용한 연구로 전환되었다. 또한, 최근 유전체 분야의 연구가 발달하면서 특히나 미세교세포에 있어서 인간과 실험동물 유전자 사이의 유사성이 기대됐던 것보다 상당히 많이 떨어진다는 것이 밝혀지게 됐다. 이는 인간 뇌 신경계 세포와 실험동물 간의 상호작용이 종간의 유전적 차이 때문에 실제 인간 뇌에서 벌어지는 병변 및 치료 효과를 유의미하게 나타내기 어렵다는 문제점을 제시하였다.
특히 미세교세포의 경우 무엇보다 뇌 조직 내에서 염증의 중추 역할을 수행하므로, 이의 이해가 인간 질병의 병인 규명 및 질환 약물 개발에 매우 중요하다. 그럼에도 여타의 다른 뇌 신경계 세포에 비하여, 미세교세포의 경우 분화법이 뇌 신경계의 다른 세포들과 다르고, 안정적으로 확립된 분화법이 현재까지 연구된 바 없어, 이러한 분화법 개발이 절실한 실정이다.
뇌 신경계는 크게 신경세포(neuron), 성상교세포(astrocyte), 희소돌기세포 (oligodendrocyte)와 미세교세포(microglia)로 이루어져 있다. 신경세포, 성상세포와 희소돌기세포까지는 모두 외배엽 발생 유래된 신경줄기세포에서 발생되지만, 미세교세포는 발생과정에서 난황낭(yolk-sac)에서 근본적 조혈(primitive hematopoiesis) 과정으로 파생된다. 이는 혈액세포를 생성하는 조혈모세포가 생성되는 결정적 조혈(definitive hematopoiesis)과 구분되는 과정이다. 그럼에도 현재까지 개발된 프로토콜은 조혈모세포와 같은 발생 과정인 결정적 조혈 과정을 거쳐 분화시키는 프로토콜이 대부분이다.
인간 만능 줄기세포로부터 미세교세포로 분화법에 대해 연구 개발되어 보고[비특허문헌 1, 2]된 바 있으나 다음과 같은 문제점이 제시된다.
(1) 미세교세포를 얻기까지 상당한 시간이 소요된다.
비특허문헌 1의 프로토콜의 경우 성숙한 미세교세포를 얻기까지 75일, 비특허문헌 2의 프로토콜의 경우 38일이 소요된다. 세포를 얻기까지 38~75일 이상이 소요된다면 매 실험마다 적어도 약 40일 동안의 준비기간이 필요하기 때문에 원활한 세포 확보를 위해 분화시기를 앞당기는 것이 중요하다.
(2) 산소 농도 조절기기와 많은 종류의 단백질 처리가 필요하다.
비특허문헌 2의 프로토콜의 경우 수율을 올리기 위해서 초반 4일 동안 저산소(hypoxia condition)을 적용한다. 비효율적으로 분화 기간 동안 처리하는 단백질의 개수만 14개이다.
(3) 수율이 떨어지거나, 별도의 세포 선별(cell sorting) 과정이 필요하다.
비특허문헌 1의 프로토콜의 경우 1x106개의 iPS 세포로 시작하여 74일차에 0.5~4x106개의 미세교세포 밖에 얻지 못하며, 비특허문헌 2의 경우에는 1x106개의 iPS 세포로 시작하여 얻을 수 있는 미세교세포 양이 30~40x106개로 높은 편이지만 프로토콜 중간에 FACS를 이용한 세포 선별 과정을 거치고 있다. 이러한 세포 선별 과정을 거치면 세포 손상(cell damage) 및 세포 손실(cell loss)이 수반될 수밖에 없다.
Julien Muffat, Rudolf Jaenisch. et al. 2016, Efficient derivation of microglia-like cells from human pluripotent stem cells. Nature Medicine. 22, pages1358-1367 Edsel M.Abud, MathewBlurton-Jones. et al. 2017, iPSC-Derived Human Microglia-like Cells to Study Neurological Diseases. Neuron. Volume 94, Issue 2, 19 April 2017, Pages 278-293.e9
이에, 본 발명자들은 인간 만능 줄기세포로부터 제작된 난황낭(yolk sac)을 모사하는 오가노이드를 배양 시 배지에 XAV939를 추가하여 Wnt pathway를 차단(block)하여 원시선(primitive streak) HSC로의 분화를 유도하기 때문에 실제의 생체 내의 발생과정을 가장 닮아있는 프로토콜을 개발하고, 특히 배양 중에 뇌세포 배양 조건으로 배지를 교체하여 발생된 미세교세포가 배양액 상으로 사출되게 하도록 별다른 세포 선별 과정 없이 순수한 미세교세포를 다량 획득할 수 있는 분화방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 다음 화학식 1로 표시되는 화합물 추가로 포함하는 미세교세포 분화 유도용 배지 조성물을 제공하는 것이다.
[화학식 1]
Figure pat00001
또한, 본 발명의 다른 목적은
인간 만능 줄기세포로부터 난황낭(yolk sac) 모사 오가노이드를 제작하는 단계; 및
상기 오가노이드를 NGD(Neuroglia Differentiation) 배지로 배양 중 N2 보충물(supplement) 배지로 교체하는 단계;
를 포함하며,
상기 NGD 배지로 배양 시 배지 내 다음 화학식 1로 표시되는 화합물 추가로 포함하는 다량의 미세교세포 확보를 위한 분화 방법을 제공하는 것이다.
[화학식 1]
Figure pat00002
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 방법으로 얻은 분화된 미세교세포 유래 항염증성 사이토카인을 포함하는 신경 퇴행성 질환 또는 염증성 퇴행성 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법으로 얻은 분화된 미세교세포를 이용한 약물 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명은 인간 만능 줄기세포로부터 제작된 난황낭(yolk sac)을 모사하는 오가노이드를 이용하여 미세교세포를 다량 확보하는 미세교세포의 분화방법에 관한 것이다.
본 발명에서, 용어 "만능 줄기세포(pluripotent stem cell, PSC)"는 몸을 구성하는 어떠한 형태의 세포로도 유도 분화가 가능한 줄기세포를 의미하며, 만능 줄기세포에는 배아줄기세포(embryonic stem cell, ESC)와 유도 만능 줄기세포 (induced pluripotent stem cell, Ipsc, 역분화 줄기세포)가 포함된다.
본 발명에서, 용어 "난황낭(yolk sac)"은 단황난, 다황난성 동물의 배자에서 난황(egg yolk)을 함유하고 있는 (배체)외배층으로 구성된 주머니모양의 구조물, 즉 배아를 감싸는 얇은 주머니로, 수정된 난자에서 관찰할 수 있다. 난황 속 배아에게 혈액을 공급하는 역할을 하며, 인간의 경우 배아가 성장하면서 난황낭 대부분이 초기 내장에 융합된다.
본 발명에서, 용어 "오가노이드 (organoid)"는 줄기세포를 이용해 최소 기능을 할 수 있도록 만든 '미니 유사 장기’로서, 3차원 구조로 만들어져 실험실에서도 실제 신체 기관과 비슷한 환경을 만들 수 있는 것이 특징이다. 즉, "오가노이드 (organoid)"는 3D 입체구조를 가지는 세포를 의미하며, 동물 등에서 수집, 취득하지 않은 인공적인 배양 과정을 통하여 제조한 신경, 장 등의 장기와 유사한 모델을 의미한다. 이를 구성하는 세포의 유래는 제한되지 않는다. 상기 오가노이드 (organoid)는 세포의 성장 과정에서 주변 환경과 상호 작용하도록 허용되는 환경을 가질 수 있다.
오가노이드는(organoid)는 일반적으로 인간 만능줄기세포를 배양하여 제조할 수 있다. 구체적으로, 파킨슨병 유래의 유도만능 줄기세포로부터 신경외배엽 구체 (neuroectodermal sphere) 형태의 신경외배엽 구체로 분화하거나 파킨슨병 유래의 유도만능 줄기세포로부터 진정 내배엽 (definitive endoderm), 후장(hindgut)으로의 단계별 분화를 통한 장관 오가노이드로 분화를 유도할 수 있다.
본 발명에서, 용어 "미세교세포(microglia)"는 미세아교세포 또는 미세신경교세포로 불리기도 하며, 뇌에서 면역기능을 담당하는 신경교세포이다. 일반적으로 중배엽성이며 단구(單球)유래로 보고 있다. 태생후기에 뇌실, 수막주위에 출현하여 점점 뇌실질 내로 이동하여 생후 2주를 정점으로 수가 감소하여 가지가 나누어진 휴지형 세포가 된다. 성숙뇌에서는 전(全)신경교세포의 수 %가량이 된다. 염증이나 신경변성 시에는 아메바모양 및 막대모양 미소신경교가 증가한다. 형태학적으로는 대식세포와 유사하여 그의 표지는 대부분이 미소신경교의 동정에 사용한다. 유주능, 탐식능이 있고, 발생기에는 노폐물처리를 담당하는 기능 외에 활성산소, 일산화질소, 산성인산가수분해효소, 프로스타글란딘을 생산하여 염증세포로의 기능도 갖고 있다. 뇌내에 유일 클래스Ⅱ 주요 조직적합성항원이나 CD4항원이 있어 활발하게 사이토카인을 생산하는 점에서 면역조절세포로서 신경-면역 상호작용에 중요한 역할을 담당한다. 교세포 중에서 가장 크기가 작으며, 특별한 형태의 대식세포로 손상된 신경에 미세아교세포가 이동하여 포식작용을 통해 신경세포를 보호한다. 미세아교세포의 기원은 내배엽 유래 조혈줄기세포 (Hematopoietic Stem Cell)이기 때문에 신경계의 다른 세포와 연관성이 적다.
본 발명에서, 용어 "패터닝"는 오르가노이드 제작 시, 뇌 세부 조직들 중 최종적으로 뽑아내고자 하는 세포의 오리진 조직의 특성을 지니는 운명체의 세포군을 다수의 세포군으로 함유되도록 (target cell enriched) 오르가노이드를 제작함을 의미한다. 또한, 패턴화 마커는 CD34, CD41, CD235a, PU.1 등이 있다.
본 발명에서, 용어 "분화(differentiation)"는 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 서로 구조나 기능이 특수화하는 현상, 즉 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어진 일을 수행하기 위하여 형태나 기능이 변해가는 것을 말한다. 일반적으로 비교적 단순한 계(系)가 둘 이상의 질적으로 다른 부분계(部分系)로 분리되는 현상이다. 예를 들면, 개체발생에서 처음에 동질적이었던 알 부분 사이에 머리나 몸통 등의 구별이 생기거나 세포에도 근세포라든가 신경세포 등의 구별이 생기는 것과 같이 처음에 거의 동질이었던 어떤 생물계의 부분 사이에 질적인 차이가 생기는 것, 또는 그 결과로서 질적으로 구별할 수 있는 부역 또는 부분계로 나누어져 있는 상태를 분화라고 한다.
인간 만능 줄기세포로부터 난황낭 모사 오가노이드를 제작하고, 즉 각 타겟으로 하는 세포를 최대한 함유하고 있는 오가노이드 확보, 이 오가노이드 조직을 패터닝하고 증식, 배양 중간에 뇌세포 배양 조건으로 액체 배지를 교체함으로써 마치 실제 발생단계에서 미세교세포가 뇌로 침투하는 것과 같이 일정 배양 기간 이후에 CSF(cerebrospinal fluid) 환경에서, 뇌 내 배양 조건으로 변화 시켜주는 전략을 취하여 미세교세포들만 오가노이드로부터 배양액으로 효율적으로 빠져나오는 것을 확인하였고 다량의 순도 높은 미세교세포를 얻을 수 있다. 이렇게 빠져 나온 세포군에는 증식을 하고 있는 세포군이 존재함으로써 약 30일 내지 40일 정도면 계속 미세교세포를 분리하는 것이 가능하다.
따라서, 본 발명에서는 제작된 난황낭 오가노이드를 배양 도중 뇌세포 배양 조건으로 배지를 교체함으로써 다량의 순도 높은 미세교세포 확보가 가능한 배지 조성 및 분화법을 확립하였다.
본 발명의 일 구현예에 따르면,
미세교세포 분화 유도용 배지 조성물에 있어서,
다음 화학식 1로 표시되는 화합물 추가로 포함하는 미세교세포 분화 유도용 배지 조성물을 포함한다.
[화학식 1]
Figure pat00003
상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 XAV939　(CAS　284028-89-3)으로, 3,5,7,8-Tetrahydro-2-[4-(trifluoromethyl)phenyl]-4H-thiopyrano[4,3-d]pyrimidin-4-one라 명명된다. XAV939는 베타-카테닌, TNKS1 및 TNKS2의 강력한 억제제이다.
XAV939는 Wnt pathway를 차단(block)하여 원시선(primitive streak) HSC로의 분화를 유도한다.
상기 미세교세포 분화 유도용 배지는 NGD(Neuroglia Differentiation) 배지인 것이 바람직하다.
상기 NGD(Neuroglia Differentiation) 배지는 Gem21, Neuroplex N2, Albumax I, sodium chloride, sodium pyruvate, biotin, lactic syrup, GlutaMAX, ascorbic acid, Penicilin/Streptomycin 를 포함하는 배지 조성을 의미하며, 비특허문헌 1 을 참고할 수 있다.
상기 미세교세포 분화 유도용 배지에 BMP4(Bone morphogenetic protein 4) 및 액티빈 에이(Activin A)가 추가로 포함될 수 있다.
또한, 상기 미세교세포 분화 유도용 배지에 bFGF(Basic fibroblast growth factor) 및 VEGF(vascular endothelial growth factor)이 추가로 포함될 수 있다.
이러한 배지 조성으로 저산소 장비 및 많은 단백질 성분이 필요하지 않고도 다량의 고순도의 미세교세포를 확보할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면,
인간 만능 줄기세포로부터 난황낭(yolk sac) 모사 오가노이드를 제작하는 단계; 및
상기 오가노이드를 NGD 배지로 배양 중 N2 보충물(supplement) 배지로 교체하는 단계;를 포함하며,
상기 NGD 배지로 배양 시 배지 내 다음 화학식 1로 표시되는 화합물 추가로 포함하는 다량의 미세교세포 확보를 위한 미세교세포의 분화방법을 포함한다.
[화학식 1]
Figure pat00004
상기 NGD 배지를 N2 보충물(supplement) 배지로 교체하는 시기는 배양 9~11일째가 바람직하다.
상기 NGD 배지에 BMP4(Bone morphogenetic protein 4) 및 액티빈 에이(Activin A)가 추가로 포함될 수 있다.
또한, 상기 NGD 배지에 bFGF (Basic fibroblast growth factor) 및 VEGF(vascular endothelial growth factor)이 추가로 포함될 수 있다.
상기 N2 보충물(supplement) 배지에 M-CSF(macrophage colony stimulating factor) 및 IL-34(Interleukin 34) 이 추가로 포함될 수 있다.
상기 N2 보충물(supplement) 배지에 콜레스테롤 및 TGF-β1(Transforming growth factor beta 1)이 추가로 포함될 수 있다.
산소 농도 조절기기 없이 7종류의 단백질, XAV-939와 콜레스테롤을 포함하는 배지 조성으로 산소 농도 조절기기 및 많은 단백질 성분을 필요로 하지 않고 다량의 고순도의 미세교세포를 확보할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 동결 보존을 실시하는 단계를 추가 가능하다.
상기 동결 보존은 -250 ℃ 내지 -150 ℃에서 3개월 내지 6개월간 보관하는 것을 의미한다.
본 발명으로 구현된 미세교세포를 동결 보존하고 다시 해동시킬 경우 70% 이상의 세포가 살아 있음을 확인하였다. 따라서, 본 발명에 따른 미세교세포 분화법으로 확보된 미세교세포는 동결 보존도 가능하였다.
본 발명에 따른 분화방법에서 1~10%의 CO2 인큐베이터에서 배양하는 것이 바람직하다. 기존 분화법과 같이 저산소 배양이 필요하지 않고, 일반적인 세포 배양 조건과 동일하게 실시하여도 무방하다. 또한, 기존 분화법과 같이 세포 선별 작업을 거치지 않고도 높은 수율 및 순도의 미세교세포 확보가 가능하다.
구체적으로, 성숙한 미세교세포를 약 30일 내지 40일이면 얻을 수 있다. 특히, 비특허문헌 1 보다 45~55일 더 빨리 생산 가능하고 비특허문헌 2 보다는 약 8~18일 더 빨리 세포를 생산해낼 수 있다.
또한, 산소 농도 조절기기 없이 7종류의 단백질과 1종류의 chemical (XAV-939), 1종류의 유기화합물(cholesterol)만으로 미세교세포 배양에 성공함으로써 기존 방법 대비 보다 경제적이고 효율적인 분화법이다.
현재 가장 수율이 높다는 비특허문헌 2의 프로토콜에 비하여, 시작할 때 들어간 세포의 개수대비 38일차에 30~40배의 미세교세포 밖에 얻지 못하는 반면, 본 발명에 따른 분화법의 프로토콜은 2x106개의 iPS cell로 시작하여 30일차에는 초기세포개수 대비 5.5~6.5배에 달하는 성숙한 미세교세포를, 40일차까지 누적한다면 약 50배에 달하는 양을 얻을 수 있다. 더욱이 비특허문헌 2의 프로토콜과는 달리 FACS 세포 선별(sorting) 없이 90%에 달하는 순도를 보여주고 있으므로, 세포의 손상 없이 안정적인 양의 미세교세포의 확보가 가능하다.
미세교세포는 미세아교세포의 활성화는 M1과 M2 두 가지 타입으로 구분할 수 있으며, M1 반응은 염증성 사이토카인 등의 인자들을 방출한다. 즉, 신경독성물질을 생성함으로써 뇌 손상을 악화시킨다. 이러한 신경독성물질로는 IL-1β, TNF-α, IL-6, 글루타메이트, NO 등의 염증성 사이토카인이 있으며, M2 반응에서는 세포 잔해를 제거하고 뇌 복구를 위한 영양인자를 방출함으로써 인접한 세포들을 보호한다.
이처럼 M2 반응은 염증 반응으로 인해 손상받은 조직들을 회복시키고 영양 공급을 위한 혈관을 형성하거나 고친다. 이때 역할을 하는 물질들은 IL-4, IL-10, TNF-β, IGF-1, IL-33 등과 같은 항염증성 사이토카인들이다.
따라서, 미세교세포 유래 항염증성 사이토카인을 활용하여 신경 퇴행성 질환 또는 염증성 퇴행성 질환 예방 또는 치료가 가능하다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 분화방법으로 확보된 미세교세포 유래 항염증성 사이토카인 또는 성장인자를 포함하는 신경 퇴행성 질환 또는 염증성 퇴행성 질환 예방 또는 치료용 조성물을 포함한다.
상기 항염증성 사이토카인은 IL-4, IL-10, IL-33, TNF-β 및 IGF-1로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
상기 본 발명의 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
상기 본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여 시 피부 외용 또는 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식을 선택하는 것이 바람직하며, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 본 발명의 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 혼합생약재에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 상기 조성물은 1일 0.0001 내지 1 g/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 200 mg/kg으로 투여하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명에서 용어 "치료"는 질환과 관련된 임상적 상황을 억제하거나 완화하거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다. 또한 치료는 치료를 받지 않은 경우 예상되는 생존율과 비교하여 증가된 생존을 의미할 수 있다. 치료는 치료적 수단 이외에 예방적 수단을 동시에 포함한다.
상기 신경계 퇴행성 질환은 예를 들어 파킨슨병, 치매, 알츠하이머 질환, 헌팅턴 질환, 근위축성 측색 경화증, 기억력 저하, 중증근무력증, 진행성 핵상마비, 다계통 위축증, 본태성 진전증, 피질-기저핵 퇴행증, 미만성 루이소체 질환 및 픽병으로 이루어진 군에서 선택된 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 염증성 퇴행성 질환은 치매, 루이소체치매, 전두측두치매, 백질변성, 부신백질이영양증, 다발성 경화증 및 루게릭병으로 이루어진 군에서 선택된 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 치료상의 유효량의 미세교세포 유래 항염증성 사이토카인을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 신경 퇴행성 질환 또는 염증성 퇴행성 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 용어 "대상체"는 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 척추동물, 바람직하게는 포유동물, 예를 들어, 소, 돼지, 말, 염소, 개, 고양이, 쥐, 생쥐, 토끼, 기니아 피그, 인간 등일 수 있다.
본 발명에서 용어 "치료상 유효량"은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상의에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 유효 성분에 대한 치료상 유효량 및 투여횟수는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로 투여될 최적의 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 등에 따라 그 범위가 다양하다.
본 발명은 또한, 상기 방법으로 확보된 미세교세포를 이용한 약물 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명으로 확보된 미세교세포의 중요한 특징으로 다량의 세포 생산 확보 가능성과 냉동보존 시에도 그 특성의 유지로 장기간 같은 성격의 세포군 유지 가능성, 생체 유래 세포와 보다 흡사하게 분화됨에 있다. 이러한 특성은 특히나, 동일한 상태의 다량의 세포를 요구하고 이의 반복 분석을 위해서는 장기간의 동일한 세포의 확보가 관건인, 다종의 약물의 동시 스크리닝 시에 적합하다. 주요 마커가 유지되는 동일한 성격의 세포군이 스크리닝 작업 시작 시점에서부터 끝나는 시점까지 계속 사용 가능함으로 스크리닝 세포에 매우 적합하다.
상기 약물은 신경 퇴행성 질환, 신경 퇴행성 질환 및 염증성 퇴행성 질환 으로 이루어진 군에서 선택된 질환을 치료하는 약물로서, 상기 신경 퇴행성 질환 또는 염증성 퇴행성 질환에 대한 치료 효과를 나타낸다.
상기 신경계 퇴행성 질환은 예를 들어 파킨슨병, 치매, 알츠하이머 질환, 헌팅턴 질환, 근위축성 측색 경화증, 기억력 저하, 중증근무력증, 진행성 핵상마비, 다계통 위축증, 본태성 진전증, 피질-기저핵 퇴행증, 미만성 루이소체 질환 및 픽병을 포함하는 다양한 신경계 질환이 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 염증성 퇴행성 질환은 치매, 루이소체치매, 전두측두치매, 백질변성, 부신백질이영양증, 다발성 경화증 및 루게릭병으로 이루어진 군에서 선택된 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.
본 발명에 따른 미세교세포 분화법은 분화된 미세교세포가 XAV939를 통해 Wnt pathway를 차단하여 primitive streak HSC로의 분화를 유도하기 때문에 실제의 생체 내의 발생과정을 가장 닮아있는 프로토콜이라고 할 수 있다. 또한 기존의 미세교세포 분화방법에서는 세포 수율을 올리기 위해 5%의 저 산소(hypoxia)를 초반에 주사하기도 하지만 본 발명에서는 저산소법을 적용하지 않아도 다른 대조군들에 비해 얻는 미세교세포의 수율이 더 많다.
발생단계의 난황낭(yolk sac)을 모사하는 오가노이드를 발생시켜 배양(분화) 9~11일째에 뇌세포 배양 조건으로 배지를 바꿈으로써 효율적으로 발생된 미세교세포가 배양액 상으로 사출되게 하는 시스템으로서 별다른 세포 선별 과정 없이 순수한 미세교세포를 획득할 수 있다. 즉, 미세교세포의 순도 또한 FACS 나 MACS와 같은 세포 선별 없이 90% 이상의 순수도를 얻을 수 있었다. 게다가 이러한 미세교세포는 동결 보존도 가능하다. 본 발명에 따른 미세교세포 분화법은 단독 세포 시스템을 통해서, 혹은 다른 뇌신경세포, 성상세포, 희소돌기세포와 공배양을 통해 성인 인간의 뇌와 비슷한 미세한 3차원 뇌 구조 시스템 개발을 통해, 뇌질환 병변 및 치료기전 연구와 약물 스크리닝의 플랫폼으로 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 본 발명에 따른 난황낭 오가노이드를 이용하여 미세교세포를 분화시키는 세부 프로토콜을 나타낸 것이다[x축은 배양(분화) 일(day)를 나타냄].
도 2는 난황낭으로 발달중인 iPSC 유래 분화(배양) 1일후부터 9일후까지의 오가노이드 사진이다.
도 3은 실제로 난황낭 오가노이드 내부에서 primitive hematopoietic stem cell (primitive HSC) 이 생성되고 있는지를 확인하기 위해서 오가노이드를 동결 후 편으로 절단해서 그 단면을 면역세포화학분석법으로 확인한 사진이다.
도 4는 오가노이드 단면 및 오가노이드를 단일 세포 수준으로 분해해서 부착배양 후 면역세포화학분석법으로 확인한 사진이다.
도 5는 분화(배양) 14일째에 난황낭 오가노이드의 RNA를 걷어서 미세교세포 분화 초기에 발현하는 유전자 마커의 양을 rt-PCR로 확인한 것이다.
도 6은 난황낭 오가노이드로부터 사출된 미세교세포 모양의 변화를 나타낸 것이다. 분화(배양) 시작 후 10일째에 M-CSF 와 IL-34가 포함된 N2 배지로 바꿔주는데 이는 난황낭에서 미세교세포가 빠져나와 뇌로 침투되는 환경을 모사한 것이다.
도 7은 24일 분화(배양)한 난황낭 오가노이드로부터 사출되어 나온 미세교세포를 걷어 세포배양 접시에 부착 후 찍은 사진이다.
도 8은 분화(배양) 32일째 난황낭 오가노이드로부터 사출되어 나온 미세교세포와 (supernatant, sup) yolk sac organoid 각각에서 성숙한 미세교세포 마커 유전자 발현을 (Iba1; microglia, CD11b; macrophage and microglia, CX3CR1; microglia-enriched protein) qPCR 로 확인한 결과이다.
도 9는 분화(배양) 38일된 난황낭 오가노이드의 단면을 면역세포화학분석법으로 분석한 결과이다.
도 10은 미세교세포 전구체 생성을 현미경 사진으로 확인한 것이다 [①: 오가노이드로부터 사출된 세포를 분화(배양) 24일째 세포배양접시에 플레이팅한 사진; ②: ①번 사진과 같은 웰에서 +11일 추가로 배양했을 때 사진; ③: ①번 사진과 같은 웰에서 +29일 추가로 배양했을 때 사진(접시에 붙어있는 세포와 떠있는 세포); ④: ③번 사진에서 떠있는 세포를 다시 걷어서 세포배양접시에 플레이팅한 사진].
도 11은 미세교세포 전구체의 미세교세포 마커 발현을 나타낸 것이다. 증식력이 뛰어난 미세교세포 후보 세포군은 오가노이드로부터 빠져나온 직후부터 증식하지 않고 일정 시간이 지난 뒤에 증식함. IBA1 염색으로 증식하는 세포가 미세교세포 전구체일 가능성을 확인함(하얀 화살표가 증식중의 세포).
도 12는 미세교세포 전구체의 미세교세포 마커 발현을 나타낸 것이다. 증식력이 뛰어난 미세교세포 전구체 후보와 미세교세포가 모두 미세교세포의 중요한 마커인 CX3CR1을 발현함을 면역세포화학분석법으로 확인한 것이다.
도 13은 성상교세포를 단독 배양 또는 성상교세포와 미세교세포 공동 배양 시, 독성 자극에 대한 반응을 염증반응 마커들로 확인한 결과이다.
도 14는 본 발명에 따른 분화법으로 분화된 미세교세포의 탐식능(phagocytic activity)을 형광비드와 면역세포화학분석법으로 확인한 것이다.
도 15는 본 발명에 따른 분화법으로 분화된 미세교세포의 탐식능(phagocytic activity)을 pHrodo를 이용한 탐식능 분석실험과 면역세포화학분석법으로 확인한 것이다. 도 15a는 pHrodo를 처리한 결과를, 도 15b는 세포 내에 쌓인 pHrodo 양을 intensity 분석을 통해 정량한 결과이다.
도 16은 본 발명에 따른 분화법으로 분화된 미세교세포의 동결보존 가능성을 나타낸 것이다.
도 17은 본 발명에 따른 분화법에 따라 분화(배양)일 21~39일의 사출 확보된 미세교세포의 수확 수를 나타낸 그래프이다. 난황낭 모사 오가노이드에서 방출된 세포를(미세교세포+미세교세포 전구세포) 2일마다 한번씩 모아 21~39일까지 6well plate의 하나의 well (9.6cm2)에 부착시킨 후, 2일마다 한번씩 각 well에 떠있는 미세교세포를 다시 수확해서 측정한 결과이다.
도 18은 비특허문헌 1을 통한 인간 태아 미세교세포의 유전자 발현 데이터 (public data) 및 본 발명의 분화법으로 확보된 미세교세포 (빨간색 박스)와 H9 배아줄기세포의 유전자발현 데이터를 비교 분석한 결과이다.
이하, 본 출원은 실시예를 통해 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 출원을 예시하는 것일 뿐 본 출원의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 인간 유도만능 줄기세포로부터 난황낭 오가노이드를 이용하여 미세교세포로의 분화
[실험방법]
인간 배아줄기세포 또는 인간 유도만능 줄기세포의 배양
한양대학교(서울, 대한민국)의 IRB(institutional review board)에 의해 승인된 hESC 리서치 가이드라인을 기초로 hESCs 및 hiPSCs를 배양하였다. 본 실험에서 사용된 hESCs 및 hiPSCs는 하기 표 1에 나타내었다.
hESC line
Name used in this paper Original name Karyotype Establishing institute
H9 WA09 Female (46, XX) Wi cell
hiPSC line
Name used in this paper Original name Source
(Human) 		Reprogramming factors Methods Establishing institute
Epi-ips episomal-ips1 Skin OCT4, SOX2, KLF4, shp53 Episomal vector Hanyang Univ. (Our own)
3D 오가노이드를 이용하여 미세교세포 분화
미분화 상태로 정상 배양하고 있던, hESC 및 hiPSC를 계대배양 시 AccutaseTM를 이용하여 떼어내고 바닥에 붙지 않는 바닥 둥근 형태의 96 well plate 에다가 미분화 상태의 인간배아/역분화 줄기세포를 20,000 세포/well 로 분주하여 일단 오가노이드를 형성하게 하였다.
첫날의 배지 조성은 아래 표 3의 NGD(Neuroglia Differentiation) 배지에 표 2의 배양(분화) Day0에 해당하는 첨가물 조건 (BMP4(Peprotech, #120-05ET 40ng/ml) + Activin A(Peprotech, #120-14P, 10μg/ml) + Ascorbic Acid(Sigma, #A4544, 200μM) + Y27632(Sigma, #Y0503, 20μM))으로 오가노이드 발생을 시작하였다. 다음날은 배지를 같은 NGD 배지에 첫날 첨가 성분 중에 Y27632(20uM)을 제외한 성분에다가 추가적으로 XAV939(Sigma, #X3004, 2μM)을 첨가하면서 발생 유도하였다 (표 3 참조). 배양배지는 9일까지 NGD로 하고 첨가성분은 표 3 참조하여 첨가물을 농도에 맞춰 가감하며 발생 유도하였다. 배지는 성분이 바뀌는 날마다 교환하였고 성분이 바뀌지 않을 시 격일로 교환하였다. 오가노이드의 바른 형성은 4~8일째에 세포괴의 형성으로 확인하고, 12일 이후에 세포 외부로의 사출로 체크하였다. 오가노이드 분화(배양) 6일째에 96웰 플레이트에 하나씩 형성되어있는 오가노이드를 8개씩 그룹화하여 6 well low binding plate한 웰에 분주 배양하였다. Orbitary shaker (80~100 rpm)로 돌리면서 표 2의 성분이 들어간 N2 base media (표 3) 하에서 발생 유도하였다. 20일째에 오가노이드가 들어있는 미디어를 걷어 1000g에 3분간 원심분리하여 사출된 세포를 회수하여 PLO(poly-L ornithine; 15ug/cm2)/Laminin(Laminin;200ng/cm2) 코팅된 6 웰 플레이트에 6웰 1 well당 8개 정도의 오르가노이드를 plating 하였다. 6 웰 플레이트에 부착된 미세교세포는 이후 표 2의 배지 조성에 따라 배양되었으며 2~3일마다 배지를 교체해주었다.
Day 0 Neuroglial Differentiation Media(recipe below) + BMP4(Peprotech, #120-05ET 40ng/ml) + Activin A(Peprotech, #120-14P, 10μg/ml) + Ascorbic Acid(Sigma, #A4544, 200μM) + Y27632(Sigma, #Y0503, 20μM)
Day 1~5 Neuroglial Differentiation Media(recipe below) + BMP4(Peprotech, #120-05ET 40ng/ml) + Activin A(Peprotech, #120-14P, 10μg/ml) + Ascorbic Acid(Sigma, #A4544, 200μM) + XAV939(Sigma, #X3004, 2μM)
Day 6~9 Neuroglial Differentiation Media(recipe below) + rhVEGF(Peprotech, #100-20 33ng/ml) + bFGF(R&D systems, #233-FB, 20ng/ml) + Ascorbic Acid(Sigma, #A4544, 200μM)
Day 10~11 N2 supplement base media(recipe below) + IL-34(Peprotech, #200-34, 100ng/ml) + M-CSF(Peprotech, #300-25, 25ng/ml) + Ascorbic Acid(Sigma, #A4544, 200μM)
Day 12~
End of culture		 N2 supplement base media(recipe below) + IL-34(Peprotech, #200-34, 100ng/ml) + M-CSF(Peprotech, #300-25, 25ng/ml) + TGF-B1(Peprotech, #100-21, 50ng/ml) + cholesterol(Sigma, #C8667, 1.5μg/ml) + Ascorbic Acid(Sigma, #A4544, 200μM)
Neuroglial Differentiation Media (NGD) N2 supplement Base Media
Neurobasal(100%)
(Neurobasal, Gibco, #21103049)

GlutaMAX
(Gibco, #35050061, 1:100)
Gem21
(Gemini Bio-products, #400-160, 1:100)
Neuroplex N2
(Gemini Bio-products, #400-163, 1:100)
AlbumaxI
(Thermo Scientific, #11020-021, 0.2%)
Sodium Chloride 50mM
Sodium pyruvate 1mM
biotin
(Sigma, #B4639, 3.5ng/ml)
lactic syrup
(Sigma, #L7900, 0.017%)

 N2(100%)
(N2 recipe as follows(1L))
D.W. 1L
DMEM-F12 12g
Sodium Bicarbonate 1.69g
D-glucose 1.55g
L-Glutamine 0.073g
Apo-transferrin 100mg
Putrescine 0.1mM
Selenite 0.000030057803mM
Progesterone 0.000020033708mM
B27
(Gibco, #17504044, 1:50)
Insulin
(Gibco, #12585014, 0.31㎕/ml)
MEM-NEAA
(Sigma, #M7145, 1:100)
GlutaMAX
(Gibco, #35050061, 1:100)
오가노이드 해체(chopping) 방법
오가노이드를 해체하여 단일세포로 배양하는 방법은 다음과 같다.
오가노이드를 얇은 주사기 바늘(30gauge needle)로 잘게(약 직경 200μm) 쪼개어 acutase에 10분 배양한 뒤 PLO/Laminin 코팅된 디시에 부착하여 배양하였다.
난황낭 3D 오가노이드 유래 미세교세포의 대량 증식 및 수율 확인
난황낭 3D 오가노이드로부터 사출되어 나오는 미세교세포를 2일 주기로 6웰에 플레이팅하였다. 난황낭 3D 오가노이드가 담긴 배양액을 걷어 15ml 코니컬 튜브에 담고 300g에서 2분 원심분리시킨 뒤, 튜브 밑면에 생긴 세포 덩어리를 단일세포 단위로 풀어준 뒤 PLO/Laminin 코팅된 6웰 플레이트에 부착하였다. 이후 계속해서 오가노이드로부터 사출되어 나오는 세포 외에도 6웰에서 부착 배양 중인 세포로부터 증식한 새로운 미세교세포 또한 2일 간격으로 배양액을 걷어서 원심분리하여 미세교세포를 분리한 뒤 다시 PLO/Laminin 코팅된 6웰에 플레이팅하였다. 30일을 기점으로 플레이팅되는 미세교세포의 수가 급격히 증가하기 시작하였다. 30일 기준 최초 배양에 들어간 세포 수의 6배 가량 미세교세포 확보가 가능하다. 매 플레이팅 마다 세포 수를 헤모사이토미터로 측정하여 수율을 계산하였다. 수율은 최초 2x106 개 세포를 기반으로 계산하였다.
면역세포화학 분석
면역세포화학분석법은 표적단백질에 대한 1차 항체를 부착한 뒤 해당 항체에 대한 형광이 부착된 2차 항체를 부착하여 표적단백질을 가시화하는 분석 방법이다. 2차 항체의 형광 종류에 따라 가시화할 수 있는 단백질의 수가 정해진다. 본 연구에서는 2가지 혹은 3가지의 형광을 사용하였다.
샘플을 고정액(4% Paraformaldehyde/PBS)으로 20분 간 고정시킨 뒤, PBS로 5분씩 3번 헹군다. Blocking buffer(1% BSA/PBS, 0.1% Triton X100)를 이용해 40분 blocking을 진행한 뒤 1차 항체를 동일한 버퍼에 녹여 샘플에 24시간 부착하였다. 0.1% BSA/PBS로 샘플을 3번 헹군 뒤 2차 항체를 동일한 버퍼에 녹여 1시간 부착한다. 이후 0.1% BSA/PBS로 샘플을 3번 헹군 뒤 D.W.로 1번 헹구고 Mounting solution(Vectashield, Vector Lab)으로 커버 슬라이드에 마운팅하였다.
오가노이드 절편 면역세포화학분석법의 경우 다음과 같이 진행하였다. 오가노이드를 고정액에 30분 이상 고정시킨 뒤, PBS로 10분씩 3번 헹군 후 30% sucrose 용액에 24시간 배양하여 탈수시켰다. 탈수가 끝난 샘플을 OCT(Optimal Cutting Temperature Compound) 컴파운드에 얼린 뒤 microtome으로 10~12μm 두께로 절단하여 위의 blocking 과정부터 진행하였다.
RT-PCR
분석하고자 하는 샘플의 RNA를 트리졸(Trizol)을 이용해 추출한 뒤, RNA extraction 완료 후 cDNA를 합성하여 RT-PCR을 진행하였다. 샘플 간 존재하는 RNA의 상대적인 양을 비교할 수 있는 실험법으로, 본 연구에서는 여러 샘플 간 비교를 통해 특정 샘플의 마커단백질 발현을 확인하는데 사용하였다.
RNA 추출 방법은 다음과 같다. Trizol 1ml에 5분 동안 세포를 녹이고, 200ul 의 클로로포름을 추가하여 흔들어서 섞어준 후 2~3분 동안 방치하였다. 4℃에서 12000 Xg, 15분동안 원심분리하였다. 원심분리 후 상층의 투명한 부분을 따서 (400~500ul) 새로운 튜브에 옮겨주고 거기에 500ul의 이소프로판올을 넣어준 후 섞어주었다. 10분 동안 인큐베이션 후 4℃에서 12000 Xg, 10분 동안 원심분리하였다.　
튜브 바닥에 작게 남아있는 RNA 덩어리를 제외하고 상층액을 제거한 후 1ml 의 75% 에탄올 용액을 넣어 덩어리와 섞어주었다. 4℃에서 7500 Xg, 5분 동안 원심분리하였다. 상층액을 제거한 후 RNA 덩어리만 남긴 후 뚜껑을 열어 자연건조시켰다. RNase-free water 로 건조된 RNA 을 녹인 후 농도를 측정하였다.　
cDNA 합성 방법은 다음과 같다.
2ug의 RNA 를 cDNA 합성에 사용하였다. Random primer (Invitrogen)를 이용하여 fisrt-strand cDNA 합성을 진행하고, 75℃에서 15분간 PCR 기계로 반응시켰다. 이후 얼음에서 2분간 인큐베이션 후 First-strand buffer (Invitrogen), DTT (Invitrogen), RNasin (Promega)를 추가하여 25℃에서 15분, 42℃에서 50분, 70℃에서 15분 반응시켰다.
만들어진 cDNA 는 총 20ul이며 이를 10배 희석하여 RT-PCR에 사용하였다. 반응에는 SYBR green master mix (Bio-rad)를 사용하였고, cDNA는 2ul씩 반응시켰다.
전구체 생성 확인
끊임없이 미세교세포를 생산하는 미세교세포 덩어리를 IBA1으로 염색했을 때, 양성으로 나오는 것을 확인하여 미세교세포 전구체를 확인하였다. 증식하는 세포는 또한 실시간으로 현미경 모니터링을 통해 확인하였다. 또한 미세교세포를 사출하는 오가노이드의 분화 14일차 PU.1 마커발현을 통해서도 확인하였다.
순도 및 수율 확인
순도는 면역세포화학분석법으로 미세교세포의 마커단백질(Iba1, CX3CR1 등) 염색을 통해 확인하였다. 마커 단백질이 발현되는 세포의 생성 및 사출을 날짜 별로 카운팅하여 최초에 플레이팅된 세포 대비하여 그 수율을 계산하였다. (도 17)
난황낭 모사 오가노이드에서 방출된 세포를(미세교세포+미세교세포 전구세포) 2일마다 한번씩 모아 21~39일까지 6well plate의 하나의 well (9.6cm2)에 부착시킨 후, 2일 마다 한번씩 각 well에 떠있는 미세교세포를 다시 수확해서 측정하였다.
세포 기능(탐식능) 확인　
첫 번째 세포탐식능은 형광이 달린 microsphere 를 세포에 처리하여 세포 안에 들어간 microsphere 를 확인함으로써 확인하였다. 24well plate 에 well 하나당 1x10^4 개의 세포를 붙이고 하루 뒤에 3x10^5 개의 bead 를 처리해주었다. 다음날 PBS 로 3번 씻어내어 세포 내부로 들어가지 않고 표면에 붙은 microsphere 를 제거한 후 세포를 고정시켜 면역항체염색법을 진행하였다.
두 번째 세포탐식능은 pHrodo에 PFF (Pre-formed Fibril)을 부착하여 미세교세포에 처리함으로써 확인하였다. pHrodo 는 산성환경에서 붉은 형광을 내는 물질로, 세포에게 포식되었을 경우 붉은 형광을 띠게 된다. PFF는 미세교세포와 같은 식세포의 포식대상이 되는 물질로, PFF에 pHrodo(Invitrogen, #P36600)를 부착하여 미세교세포에 처리 후 시간 별로 형광량을 측정하여 미세교세포의 탐식능을 확인하였다. 실험 방법으로는 5mg/ml PFF 2.86 ul 를 pHrodo 1ul 와 1.5ml tube 에서 섞은 후 빛을 차단한 상태에서 1시간 동안 실온 보관하였다. PBS 1ml 를 추가하여 14000rpm, 1분 원심분리 후 튜브 바닥의 짙은 보라색 덩어리만 남기고 상층액을 제거하였다. PBS 1ml를 추가하고 덩어리를 풀어내어 다시　14000rpm, 1분 원심분리하였다.　이를 한번 더 반복하였다. 보라색 덩어리를　배양액 1ml 로 풀어낸 후　24well plate 에 키우고 있는 세포　한 well 당 250ul씩 분주하여 넣어주었다. 처리 후 1.5 시간 뒤부터 관찰 시작하였다.
3D 오가노이드 유래 미세교세포의 동결 보존
오가노이드 유래 미세교세포를 배양 30일 시점에 5x105 개만큼을 90% 배양액과 10% DMSO의 동결액으로 -196 ℃에서 동결시킨 뒤 100일이 지난 시점에 녹여서 생존율을 확인하였다.
[실험결과]
인간배아줄기세포로부터 난황낭 오가노이드 제작
도 2에서는 광학현미경으로 난황낭 오가노이드가 제작되었음을 확인하였다. 난황낭으로 발달중인 iPSC 유래 분화(배양) 1일후부터 9일후까지의 오가노이드 사진으로, 속이 반투명한 낭포(cyst) 구조가 실제 난황낭 구조와 닮아 있음을 확인하였다.
primitive streak HSC marker 발현 확인
도 3은 실제로 난황낭 오가노이드 내부에서 primitive hematopoietic stem cell (primitive HSC) 이 생성되고 있는지를 확인하기 위해서 오가노이드를 동결 후 편으로 절단해서 그 단면을 분석하였다. 분화 14일째에 난황낭 오가노이드를 고정액으로 고정하고 면역세포화학분석법으로 확인하였다. primitive streak HSC marker인 CD41과 CD235a가 내부에서 발현되고 있는지 확인하였다. Microglia는 HSC 중에서도 primitive streak 과 definitive streak 중 primitive streak에서 기원하기에, primitive streak HSC에서는 발현이 되면서 definitive streak HSC에서는 발현이 되지 않는 CD235a 단백질의 존재를 면역세포화학분석법으로 확인하였다.
또한, 도 4는 오가노이드 단면뿐만 아니라 오가노이드를 단일 세포 수준으로 해체해서 부착배양 후 분석해보니 90% 이상의 세포가 CD235a를 발현하는 것을 면역세포화학분석법으로 확인하였다. 분화 14일째에 난황낭 오가노이드를 accutase 를 이용하여 단일세포로 해체 후, 2 차원 플레이팅하여, 오르가노이드 안 쪽에 세포까지 그 특성을 분석하였다.
미세교세포 마커 발현
분화(배양) 14일째에 난황낭 오가노이드의 RNA를 걷어서 미세교세포 분화 초기에 발현하는 유전자 마커의 양을 RT-PCR로 확인하였다 (CD235a; primitive HSC, CD34; HSC, PU.1; Myeloid-associated transcription factor, TREM2; microglia-enriched protein).
도 5에 나타낸 바와 같이, 대조군인 배아줄기세포(H9 hESC), 다른 종류의 cell type (neural progenitor cell, NPC)에 비해 난황낭 오가노이드에서 확연히 많이 발현하는 것이 보였다. 이는 미세교세포 분화초기 세포가 오가노이드 안에 상당히 포진되어 있음을 의미한다.
오가노이드로부터 사출된 세포 모양 변화 확인
분화(배양) 10일째에 M-CSF와 IL-34가 포함된 N2 배지로 바꿔주는데 이는 난황낭에서 미세교세포가 빠져 나와 뇌로 침투되는 환경을 모사한 것이다. 해당 배지로 바꾸어 주면 오가노이드에서 세포가 사출되기 시작하였다. 배지를 바꾸고 2일 뒤에는(분화 12일) 사출된 세포의 모양이 대부분 원형이었는데 배지를 바꾸고 11일 뒤에는(분화 21일) 사출된 세포 모양이 미세교세포와 비슷한 가지가 뻗은 모양을 확인할 수 있었다[도 6]. 따라서 사출된 세포를 걷어서 PLO/laminin 코팅된 세포배양접시에 깔면 도 7과 같은 모양이 된다.
도 7은 분화(배양) 24일된 오가노이드로부터 사출되어 나온 미세교세포를 걷어 세포배양 접시에 부착 후 찍은 사진이다. 왼편의 bright field 사진은 세포 부착 후 다음날 찍은 사진이며, 모양이 미세교세포와 매우 흡사하였다. 6일 뒤 미세교세포 마커인 Iba1의 발현을 형광염색으로 확인했더니 전체 세포에서 IbaI을 발현하는 세포의 비율이 약 90% 정도 되었다. sorting 없이 순도 높은 미세교세포 분화 가능하였다.
분화(배양) 32일째 사출되어 나온 미세교세포(supernatant, sup)와 난황낭 오가노이드 각각에서 성숙한 미세교세포 마커 유전자 발현을 (Iba1; microglia, CD11b; macrophage and microglia, CX3CR1; microglia-enriched protein) qPCR 로 확인하였다. 그 결과. 난황낭 sphere 보다 supernatant에 사출되어 나온 세포에서 성숙한 미세교세포 마커 유전자가 적게는 43배, 많게는 444배 많이 나오는 것을 확인하였다[도 8].
따라서 성숙한 미세교세포는 바깥으로 빠져나올 수 있고, 모양이 미세교세포와 매우 흡사하며, 사출된 미세교세포는 성숙한 미세교세포 유전자 마커가 상당히 많이 발현되는 것으로 보아 난황낭 오가노이드를 만들고, 사출된 세포를 얻는 방법을 통해 성공적으로 미세교세포를 얻을 수 있음을 보였다.
분화(배양) 38일째된 난황낭 오가노이드의 단면을 면역세포화학분석법으로 분석한 결과는 도 9에 나타내었다, 오가노이드 내부에 세포(DAPI)가 없는 낭포(cyst) 구조가 존재하며 (실제로 난황낭과 비슷한 구조), 그 주변으로 미세교세포(Iba1)가 분포하고 있음을 확인하였다. 특히 Iba1은 대부분 낭포 내부보다는 오가노이드 표면 쪽에 분포하고 있었다. 이는 난황낭에서 미세교세포가 빠져 나오는 실제 조직의 상황을 비슷하게 모사하고 있음을 다시 한 번 보여주었다.
미세교세포 전구체 생성
오가노이드로부터 사출되어 나오는 세포 외에도 6웰에서 부착 배양 중인 세포로부터 증식한 새로운 미세교세포 또한 2일 간격으로 배양액을 걷어서 원심분리하여 미세교세포를 분리한 뒤 다시 PLO/Laminin 코팅된 6웰에 플레이팅하였다. 분화(배양) 30일을 기점으로 플레이팅 되는 미세교세포의 수가 급격히 증가하기 시작하였다. 도 10의 ① 오가노이드로부터 사출된 세포를 분화(배양) 24일째 세포배양접시에 plating 한 사진; ② ①번 사진과 같은 well에서 +11일 추가로 배양했을 때 사진; ③ ①번 사진과 같은 well에서 +29일 추가로 배양했을 때 사진 (접시에 붙어있는 세포와 떠있는 세포); ④ ③번 사진에서 떠있는 세포를 다시 걷어서 세포배양접시에 plating 한 사진이다.
분화(배양) 24일된 난황낭 오가노이드로부터 세포를 걷었을 때 90% 이상의 미세교세포 순수도를 보이는데, 나머지에서 전형적인 미세교세포 모양을 띤 세포 외에 미세교세포 전구체로 추측되는 세포군이 관찰됨 (도 10의 ①번 사진). 이 세포는 미세아교세포보다 증식력이 뛰어나며 (도 10의 ②번 사진) 약 30일 정도가 지나면 그 위에 세포의 군집이 생기며 군집을 이루는 세포의 모양이 미세아교세포와 매우 닮아있다. 또한 배양액에 미세아교세포로 추정되는 세포가 떠있는데 이 세포를 다시 걷어 plating 했을 때 미세아교세포임을 확인하였다 (도 10의 ④번 사진).
증식력이 뛰어난 미세교세포 후보 세포군은 오가노이드로부터 빠져나온 직후부터 증식하지 않고 일정 시간(분화 30일 정도) 뒤에 증식하였다. 분화 31일차에 IBA1 염색으로 증식하는 세포가 미세교세포 전구체일 가능성을 확인하였다(도 11의 하얀 화살표가 증식 중의 세포를 나타냄). 현미경 하에서 세포의 증식 상황을 실시간으로 모니터링하여 증식중인 세포를 확인하였다.
증식력이 뛰어난 세포와 미세교세포가 모두 미세교세포의 중요한 마커인 CX3CR1을 발현함을 면역세포화학분석법으로 확인하였다(도 12 좌측; 미세교세포, 우측; 증식하는 세포). CX3CR1은 homeostatic microglia의 대표적인 마커이다. 이러한 결과를 토대로 이 증식하는 세포군을 미세교세포 전구체로 추정하였다.
제작한 세포의 미세교세포로서의 기능 확인
성상교세포를 단독 배양 또는 미세교세포와 공동 배양했을 때, 독성 자극(LPS)에 대한 반응을 염증반응 마커들로 확인한 결과는 도 13과 같다. 성상교세포는 LPS 자극을 인지하는 TLR2,4의 발현이 미세교세포에 비해 약한 것으로 알려져 있어 공동배양 시 미세교세포의 독성 자극 감수성에 의한 차이가 나타날 것으로 기대되어 실험을 위와 같이 설계하였다. 미세교세포와 공동 배양 시 염증반응의 중요한 마커인 TNFa의 발현이 줄어들고 항염증 반응의 주요 마커인 IL-10과 Arg1의 발현이 증가하는 것이 관찰되었다. 성상세포의 단독 배양은 대조군으로, 미세교세포와 공동 배양 시에는 LPS 자극 상황에서 미세교세포의 상태 변화 자극에 의한 성상세포의 독성감수성 유도가 일어남을 보아, 미세교세포가 정상적으로 기능 발현이 됨을 확인하였다.
미세교세포의 탐식능(phagocytic activity)을 형광 bead를 이용하여 확인하였다. 형광 bead를 많이 포식하는 것으로 보아 미세교세포의 주요한 기능인 phagocytosis를 잘 일으키는 것을 확인하였다[도 14].
미세교세포의 phagocytic activity pHrodo™ Green and Red Amine-Reactive Labels를 이용하여 확인하였다. 세포에 pHrodo (PFF 단백질에 tagging 되어 있다, phagocytosis 작용으로 인해 세포 내로 들어가면 붉은색을 띠는 물질)를 처리한 결과, 성상교세포와 비교했을 때 미세교세포에서 더 빠른 시간에 더 많은 붉은색 발현을 하는 것을 관찰하였다 (도 15a). 세포 내에 쌓인 pHrodo 양을 intensity 분석을 통해 정량한 결과, 미세교세포에서 3배 이상의 많은 양이 확인되었다 (도 15b).
미세교세포 동결 보존 가능성 확인
미세교세포을 -196℃ 100일 동안 동결보존시킨 후 다시 녹여 키워본 결과, 71.5%의 세포가 살아있음을 확인하였다[도 16].
확보된 미세교세포 수율 확인
오가노이드에서 방출된 세포를(미세교세포+미세교세포 전구세포) 2일마다 한번씩 모아 21~39일까지 6well plate의 하나의 well (9.6cm2)에 부착시킨 후, 2일마다 한번씩 각 well에 떠있는 미세교세포를 다시 수확해서 측정한 결과를 도 17에 나타내었다. (미세교세포 전구세포는 well에 부착되어있기 때문에 떠있는 세포만 개수를 측정하였다. 미세교세포 전구세포로 인해 지속적으로 미세교세포가 생성되며, 하나의 well에서 여러 번 수확할 수 있다.) 한번에 얻을 수 있는 미세교세포의 개수는 30일 근처 부착시킨 well에서 최대였으며, 초반에 부착시킨 well일수록 세포를 다회에 걸쳐 얻을 수 있었다.
2x106개의 iPS cell로 시작하여 30일차에는 초기세포개수 대비 5.5~6.5배에 달하는 성숙한 미세교세포를, 40일차까지 누적한다면 수확된 미세교세포의 총 양은 약 50배에 달하는 양을 얻을 수 있으며, 이는 종래기술에 비해 4배 (비특허문헌 1) 와 30~40배 (비특허문헌 2) 보다 많은 수준이다.
실제 인간 태아 미세교세포와의 유전자 발현 비교 분석
비특허문헌 1를 통한 인간 태아 미세교세포의 유전자발현 데이터 (public data)와 본 발명에 따라 확보된 미세교세포 (빨간색 박스), 그리고 H9 배아줄기세포(hESC)의 유전자발현 데이터를 비교 분석한 결과는 도 18과 같다. heatmap에 나타낸 유전자들은 모두 미세교세포의 마커로 활용되는 유전자들이며 발명된 미세교세포가 태아 미세교세포와 매우 흡사한 유전자 발현 패턴을 보이는 것이 확인되었다.

Claims (21)

  1. 미세교세포 분화 유도용 배지 조성물에 있어서,
    다음 화학식 1로 표시되는 화합물 추가로 포함하는 미세교세포 분화 유도용 배지 조성물.
    [화학식 1]
    Figure pat00005

  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 미세교세포 분화 유도용 배지는 NGD(Neuroglia Differentiation) 배지인, 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 미세교세포 분화 유도용 배지는 BMP4(Bone morphogenetic protein 4) 및 액티빈 에이(Activin A)가 포함된, 조성물.
  4. 제 3 항에 있어서,
    bFGF(Basic fibroblast growth factor) 및 VEGF(vascular endothelial growth factor)이 추가로 포함된, 조성물
  5. 인간 만능 줄기세포로부터 난황낭(yolk sac) 모사 오가노이드를 제작하는 단계; 및
    상기 오가노이드를 NGD(Neuroglia Differentiation) 배지로 배양 중 N2 보충물(supplement) 배지로 교체하는 단계;
    를 포함하며,
    상기 NGD 배지로 배양 시 배지 내 다음 화학식 1로 표시되는 화합물 추가로 포함하는 다량의 미세교세포 확보를 위한 미세교세포의 분화방법.
    [화학식 1]
    Figure pat00006

  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 NGD 배지를 배양 9~11일째 N2 보충물(supplement) 배지로 교체하는, 분화방법.
  7. 제 5 항에 있어서,
    상기 NGD 배지에 BMP4(Bone morphogenetic protein 4) 및 액티빈 에이(Activin A)가 포함된, 분화방법.
  8. 제 5 항에 있어서,
    상기 NGD 배지에 bFGF (Basic fibroblast growth factor) 및 VEGF(vascular endothelial growth factor)이 추가로 포함된, 분화방법.
  9. 제 5 항에 있어서,
    상기 N2 보충물(supplement) 배지에 M-CSF(macrophage colony stimulating factor) 및 IL-34(Interleukin 34)이 추가로 포함된, 분화방법.
  10. 제 5 항에 있어서,
    상기 N2 배지에 콜레스테롤 및 TGF-β1(Transforming growth factor beta 1)이 추가로 포함된, 분화방법.
  11. 제 5 항에 있어서,
    동결 보존을 실시하는 단계를 추가로 포함하는, 분화방법.
  12. 제 5 항에 있어서,
    상기 배양은 1~10%의 CO2 인큐베이터에서 실시하는, 분화방법.
  13. 제 5 항에 있어서,
    별도의 세포 선별(sorting) 작업을 거치지 않는, 분화방법.
  14. 제 5 항의 방법으로 분화된 미세교세포 유래 항염증성 사이토카인을 포함하는 신경 퇴행성 질환 또는 염증성 퇴행성 질환 예방 또는 치료용 조성물.
  15. 제 14 항에 있어서,
    상기 항염증성 사이토카인은 IL-4, IL-10, IL-33, TNF-β 및 IGF-1로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 조성물.
  16. 제 14 항에 있어서,
    상기 신경 퇴행성 질환은 파킨슨병, 치매, 알츠하이머 질환, 헌팅턴 질환, 근위축성 측색 경화증, 기억력 저하, 중증근무력증, 진행성 핵상마비, 다계통 위축증, 본태성 진전증, 피질-기저핵 퇴행증, 미만성 루이소체 질환 및 픽병으로 이루어진 군에서 선택된 하나인, 조성물.
  17. 제 14 항에 있어서,
    상기 염증성 퇴행성 질환은 치매, 루이소체치매, 전두측두치매, 백질변성, 부신백질이영양증, 다발성 경화증 및 루게릭병으로 이루어진 군에서 선택된 하나인, 조성물.
  18. 제 5 항의 방법으로 분화된 미세교세포를 이용한 약물 스크리닝 방법.
  19. 제 18 항에 있어서,
    상기 약물은 신경 퇴행성 질환 또는 염증성 퇴행성 질환을 치료하는, 약물 스크리닝 방법.
  20. 제 19 항에 있어서,
    상기 신경 퇴행성 질환은 파킨슨병, 치매, 알츠하이머 질환, 헌팅턴 질환, 근위축성 측색 경화증, 기억력 저하, 중증근무력증, 진행성 핵상마비, 다계통 위축증, 본태성 진전증, 피질-기저핵 퇴행증, 미만성 루이소체 질환 및 픽병으로 이루어진 군에서 선택된 하나인, 약물 스크리닝 방법.
  21. 제 19 항에 있어서,
    상기 염증성 퇴행성 질환은 치매, 루이소체치매, 전두측두치매, 백질변성, 부신백질이영양증, 다발성 경화증 및 루게릭병으로 이루어진 군에서 선택된 하나인, 약물 스크리닝 방법.
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