KR20230173249A - Dusp6가 결핍된 줄기세포 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 DUSP6가 결핍된 줄기세포 및 이의 용도에 관한 것으로, 상기 DUSP6 결핍은 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하며, 본 발명에서 제조된 줄기세포는 생존율 향상 및 우수한 분화능을 보유하고 있으므로, 다양한 치료 분야에 적용될 수 있다.

Description

DUSP6가 결핍된 줄기세포 및 이의 용도{DUSP6 deficient stem cells and their use}
본 발명은 DUSP6가 결핍된 줄기세포 및 이의 용도에 관한 것이다.
자극에 대한 반응은 변화하는 환경에서 사는 생명체에게 가장 중요한 특징 중 하나이다. 인간 전분화능줄기세포(human pluripotent stem cell, hPSC)는 우리 몸의 모든 형태의 세포로 분화할 수 있는 능력을 가지고 있고 이것이 세포치료제나 질병 모델링과 같은 재생의료의 유망한 원천이 되도록 해준다. 임상에 적용하기 위해 좋은 품질의 전분화능줄기세포를 얻기 위해서 다양한 배양조건들이 개발되어 왔다. 전분화능줄기세포는 배양액에 분명하게 반응하는데, 분화능과 경향성에서 변화가 발생하게 된다. 배양액 외에도 계대방법도 전분화능줄기세포에게 또다른 중요한 자극일 수 있는데 이는 전분화능줄기세포가 콜로니 형태로 자라기 때문에 계대를 위해서는 작은 덩어리로 분리가 필요하기 때문이다. 일반적으로 기계적인, 화학적인 또는 효소를 이용한 계대방법들이 이용되어 오고 있다. 화학적인 방법과 효소를 이용한 계대는 콜로니를 단일세포로 분리시키는 경향이 높고, 단일세포로 분리된 세포는 대부분 세포사멸에 이르기 때문에 세포-세포와 세포-기질 간의 접합에 의존해서 자라는 인간 전분화능줄기세포에게 이러한 계대방법은 치명적이다. ROCK (Rho-associated kinase) 저해는 이러한 단일세포 분리로 야기되는 세포사멸을 최소화하는 것으로 알려져 왔고, 그 작용 기작도 잘 분석되어 있다. 비록 세포-세포, 세포-기질 간의 강한 접합이 전분화능줄기세포의 self-renewal과 전분화능을 유지하는데 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있지만, 전분화능줄기세포가 이러한 치명적인 세포분리 자극에 반응하고 특징들을 회복하는지에 대해서는 거의 알려진 바가 없다.
ERK (Extracellular signal-regulated kinase)는 인간 전분화능줄기세포의 필수 성장인자인 FGF2 (fibroblast growth factor 2)의 중요한 신호전달물질로서 self-renewal에 필수불가결하다. ERK는 인간 배아줄기세포의 전분화능, 신진대사, cell cycle 및 translation에 관여하는 유전자들을 활성화시킨다. 쥐의 배아줄기세포에서 ERK 유전자 결손은 telomere shortening과 같은 genomic instability뿐만 아니라 전분화능 유전자의 잘못 조절된 발현과 G1 cell cycle arrest와 apoptosis의 증가를 야기한다. 반대로 쥐에서 FGF를 처리해서 ERK 신호전달을 자극하면 쥐의 배아줄기세포는 self-renewal 상태를 벗어나 lineage commitment로 전환된다. ERK는 핵에서의 효과뿐만 아니라, 공격적인 이동성, 다층성, 상처치료 및 epithelial-mesenchymal transition (EMT)와 같은 세포질에서의 효과도 다른 세포들에서 밝혀지고 있다. 이러한 증거들은 ERK 신호전달이 전분화능줄기세포의 세포 특성을 유지하기 위해 긴밀히 조절되어야 함을 제시하지만, ERK 신호전달과 전분화능줄기세포의 특성 간의 관계성은 완전히 규명되지 않은 상태이다.
본 발명은 세포분리 자극에 대한 인간 전분화능줄기세포의 반응 기작을 알아내기 위해 인간 배아줄기세포와 역분화줄기세포를 ROCK 저해제를 처리하지 않고 기계적으로 또는 화학적으로 계대한 후 유전자 발현을 비교하였다. 이를 통해 EDTA로 인간 전분화능줄기세포를 분리하면 ERK가 즉각적으로 활성화되고, 그 아래 단계인 RSK 또한 활성화되고, ERK 특이적인 탈인산화 효소인 DUSP6의 발현 증가를 확인하였다. ERK 활성화를 저해하면 세포 분리 후에 생존율이 낮아졌다. FAK 와 ROCK 저해제들이 세포분리에 의한 ERK 활성화를 저해할 수 있음을 확인하였다. ERK 활성화와 되먹임 loop의 역할을 알아보기 위해, 본 발명에서는 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 DUSP6 유전자 결손을 유발하였다. DUSP6 KO 세포는 정상세포에 비해 높은 ERK 활성을 가지고 있고 중배엽과 내배엽으로 치우친 분화경향성을 가지는 것을 확인하였다. 이러한 결과들은 인간 전분화능줄기세포가 세포분리 자극에 어떻게 반응하는 지와 ERK-DUSP6 신호전달 되먹임 loop을 통해 원래의 능력을 어떻게 회복하는지에 대한 통찰을 보여준다.
(특허문허 1) 한국 공개특허 제2018-0066263호
Biochem Biophys Res Commun. 2020;521(2):375-382. Biochem Biophys Res Commun. 2009;378(2):319-323.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 DUSP6가 결핍된 줄기세포를 제조하고, 이의 생존율 향상 및 우수한 분화능을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 DUSP6(dual specificity phosphatase 6)가 결핍된 줄기세포를 제공한다.
본 발명에서 사용된 용어 "DUSP6(dual specificity phosphatase 6)"는 이중 특이성 단백질 포스파타제 서브패밀리의 구성원으로서, 포스포세린/트레오닌 및 포스포티로신 잔기를 모두 탈인산화하여 표적 키나제를 비활성화한다. 세포 증식 및 분화와 관련된 미토겐 활성화 단백질(MAP) 키나제 슈퍼패밀리(MAPK/ERK, SAPK/JNK, p38)의 구성원을 부정적으로 조절한다. 이중 특이성 포스파타아제 계열의 다른 구성원은 다양한 MAP 키나아제, 다양한 조직 분포 및 세포내 국소화, 세포외 자극에 의한 발현 유도성의 다양한 모드에 대한 뚜렷한 기질 특이성을 보여준다. 이 유전자 산물은 ERK2를 비활성화하고 심장과 췌장에서 가장 높은 수준으로 다양한 조직에서 발현되며 이 계열의 다른 대부분의 구성원과 달리 세포질에 국한된다.
본 발명에서 사용된 용어 “줄기세포”는 전분화능을 가지는 세포로서, 내배엽, 중배엽, 외배엽 세포 혹은 조직으로 분화가 가능한 세포이다. 구체적으로, 인간배아줄기세포, 체세포복제줄기세포 및 역분화줄기세포를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 줄기세포는 사람의 신체 구조 또는 기능의 재생, 회복 또는 치료를 위해 실시하는 세포치료, 유전자치료, 조직공학치료 등에 원료로 사용될 수 있다.
상기 결핍은 본 발명이 속하는 기술분야의 모든 유전자 또는 단백질 억제기술로 이용될 수 있고, 바람직하게는 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용된 용어, "CRISPR/Cas9 시스템"이란 미생물의 면역체계로 알려진 CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) 시스템을 이용해 원하는 유전자 염기서열을 절단하도록 고안된 것으로서, 고정적 구성요소로서 Cas9 단백질을 포함하고, 가변적 구성요소로서 타겟 유전자에 특이적인 가이드 RNA를 포함한다. 이때 타겟 유전자의 조건은 23 bp 길이이고 두 개의 구아닌 염기(GG)로 끝나기만 하면 된다. 가이드 RNA가 타겟 유전자를 인식하면 가이드 RNA에 Cas9 단백질이 결합하여 뉴클레아제로 작용하여 타겟 유전자의 하류 약 3 bp에 위치한 두 개의 구아닌 염기(GG)를 인식하여 절단함으로써 DNA 이중가닥 손상(DNA double strand break, DSB)을 유발한다.
본 발명에서 사용된 용어, "가이드 RNA(guide RNA)"란 표적 DNA에 특이적인 RNA로, Cas 단백질과 복합체를 형성할 수 있고, Cas 단백질을 표적 DNA에 가져오는 RNA를 말한다.
본 발명에서 사용된 용어, "Cas 단백질"은 CRISPR/Cas 시스템에서 필수적인 단백질 요소를 의미하고, 가이드 RNA와 복합체를 형성할 때, 활성 엔도뉴클레아제 또는 니카아제 (nickase)를 형성한다. 바람직하게, Cas 단백질은 Cas9 단백질일 수 있다.
상기 CRISPR/Cas9 시스템은 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 단일 가이드 RNA(single guide RNA)를 포함하는 것일 수 있다.
상기 줄기세포는 인간 역분화줄기세포 또는 인간 배아줄기세포로부터 유래한 것일 수 있다.
본 발명의 일 예로서, 본 발명은 DUSP6(dual specificity phosphatase 6)가 결핍된 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 세포치료제를 제공한다.
본 발명의 다른 예로서, 본 발명은 DUSP6(dual specificity phosphatase 6)가 결핍된 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 조직재생용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어, "예방" 또는 "방지"라 함은 질환의 원인으로부터 발생을 억제하거나 지연시키는 것을 의미한다.
본 명세서에서, "치료"라 함은 완전히 치유하지 않아도 증상의 진전 및/또는 악화를 억제하여 손상의 진행을 멈추거나, 또는 증상의 일부 혹은 전부를 개선하여 치유의 방향으로 유도하는 것을 의미한다.
또한, 본 발명은 DUSP6(dual specificity phosphatase 6)가 결핍된 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 심장질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
상기 심장질환은 심근경색, 심부전 및 허혈성 심장질환으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 예로서, 본 발명은 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 가이드 RNA(guide RNA); 및 Cas9 단백질을 도입하는 단계를 포함하는 DUSP6(dual specificity phosphatase 6)가 결핍된 줄기세포 제조방법을 제공한다.
상기 도입은 본 발명이 속하는 기술분야의 모든 유전자 또는 단백질 도입 방법을 이용할 수 있고, 바람직하게는 전기천공으로 수행하는 것이나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 예로서, 본 발명은 DUSP6(dual specificity phosphatase 6)가 결핍된 줄기세포를 마트리겔(matrigel) 코팅 세포배양 접시에서 배양하는 단계; ROCK 억제제(rho kinase inhibitor)를 첨가하여 배양하는 단계; 심근세포 분화 배지에서 배양하는 단계; GSK-3 억제제(glycogen synthase kinase-3 inhibitor) 및 Wnt 억제제를 첨가하여 배양하는 단계; L-락트산을 포함하는 심근세포 분화 배지를 사용하여 분화된 심근세포를 대사적으로 선택하고 정제하는 단계;를 포함하는 DUSP6가 결핍된 줄기세포를 심근세포로 분화시키는 방법을 제공한다.
상기 심근세포 분화 배지는 소혈청 알부민 및 아스코르브산이 보충된 RPMI1640인 것일 수 있다.
상기 ROCK 억제제는 Y-27632; 상기 GSK-3 억제제는 CHIR99021; 및 상기 Wnt 억제제는 C59인 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 예로서, 본 발명은 서열번호 4로 표시되는 단일 가이드 RNA를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 단일 가이드 RNA 및 Cas9를 조합하여 포함하는 CRISPR/Cas9 시스템을 제공한다.
본 발명은 DUSP6가 결핍된 줄기세포 및 이의 용도에 관한 것으로, 상기 DUSP6 결핍은 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하며, 본 발명에서 제조된 줄기세포는 생존율 향상 및 우수한 분화능을 보유하고 있으므로, 조직재생 및 심장질환을 포함하는 다양한 질병 치료에 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 EDTA 계대가 DUSP6 발현을 증가시키는 결과를 나타낸 것이다. (A) 기계적 계대(Mech)용 EZPassage 도구와 화학적 계대(EDTA)용 또는 DPBS 내 0.5 mM EDTA를 사용하여 hPSC의 각 계대에 의한 3회 계대 후 RNA-seq 분석 도식. 각 방법에 의해 해리된 세포 덩어리가 표시된다(Scale bar: 1 mm). 샘플이 복제되었다. (B) Mech 또는 EDTA 계대 후 인간 역분화 줄기 세포주 hFSiPS1 및 인간 배아 줄기 세포주 SNUhES31에서 차등적으로 발현된 유전자(DEG). DEG는 p-값이 0.05 미만인 1.8배 변화를 기반으로 선택되었다. (C) 두 세포주에서 공통 DEG의 히트맵. (D) Mech 또는 EDTA 계대 세포 사이의 DEG에 대한 생물학적 과정의 유전자 온톨로지 농축 분석은 MAPK 신호 전달 경로를 나타내는 유전자가 상당히 풍부하다는 것을 보여준다. (E) Mech 또는 EDTA 계대 세포(n=6)에서 DUSP6 mRNA 발현의 확인은 실시간 PCR에 의해 수행되었다. 0.0001보다 작은 p-값은 <0.0001로 표시된다. (F) DUSP6 단백질의 수준은 웨스턴 블롯에 의해 Mech 또는 EDTA 계대 세포에서 분석되었다.
도 2는 hiPSC에서 EDTA 처리에 의한 ERK의 인산화를 나타낸 것이다. (A) 스크레이퍼(Scrp), EDTA 또는 Dispase를 사용하여 hFSiPS1 세포를 수확한 후 인산화된 ERK를 분석했다. EDTA는 4분 동안 처리되었다. Dispase는 15분 동안 처리되었다. (B) 스크레이퍼(Scrp)를 사용한 수확과 직접 용해(Direct) 간의 인산화된 ERK의 비교. Scrp의 경우 35 mm 접시의 세포를 DPBS로 두 번 세척하고 스크래퍼를 사용하여 수확했다. 직접 용해를 위해 35 mm 접시의 세포를 DPBS로 두 번 세척하고 용해 완충액을 추가하여 직접 용해했다. (C) ReLeSR 또는 TrypLE를 사용하여 수확된 세포의 인산화된 ERK 분석. (D) Mech, EDTA, ReLeSR 또는 TrypLE를 사용하여 세포를 3회 계대한 후 실시간 PCR을 사용하여 DUSP6 mRNA의 발현을 분석하였다. (E) 4분 동안 EDTA 처리 후 인산화된 ERK, 인산화된 RSK1 또는 DUSP6의 지속 시간 추정. 처리 후, EDTA 용액을 제거하고 표시된 시점에서 세포가 수확될 때까지 DPBS를 첨가하였다. (F) 세포가 Dispase에 의해 해리되었을 때 인산화된 ERK의 지속 시간 또는 DUSP6의 발현 추정. (G) EDTA 처리 후 인산화된 ERK 또는 인산화된 RSK1의 핵 전위 분석. 4분 동안 EDTA를 처리한 후 세포를 수확하고 DPBS로 세척했다. 핵 및 세포질 분획을 분리하였다. 히스톤 H4는 핵 지시약으로 사용되었다. α-tubulin은 cytosol indicator로 사용되었습니다. (H) Mech 또는 EDTA에 의해 계대된 후 표시된 날에 세포를 수확하였다. DUSP6 발현의 분석은 실시간 PCR을 사용하여 수행되었다. (I) 대조군으로서 MAPK1 발현의 평가.
도 3은 해리에 의한 ERK 활성화를 위한 업스트림 신호 변환기의 식별을 나타낸 것이다. (A) 세포를 EDTA 처리 전 1시간 동안 표시된 억제제로 처리하고, 수확하고 웨스턴 블롯을 실시했다. 억제제 농도: FGFR의 경우 0.1μM PD173074, ROCK의 경우 10μM Y27643, FAK의 경우 10μM PF573228. (B) 세포를 표시된 억제제로 1시간 동안 처리하고 EDTA 처리 없이 수확했다. (C) EDTA 처리에 의한 ERK 활성화 억제를 위한 PF573228의 최적 농도 추정. 표시된 농도의 PF573228은 EDTA 처리 전 1시간 동안 처리되었다. (D) 세포-세포 및 세포-기질 해리에 의한 ERK-DUSP6 신호전달 루프에 대한 그럴듯한 신호전달 경로.
도 4는 DUSP6 녹아웃에 대한 sgRNA의 검증을 나타낸 것이다. (A) DUSP6 유전자의 엑손 1의 서열. (B) sgRNA의 서열(RG1, RG2, RG3, RG4). (C) T7E1 분석을 사용한 sgRNA의 검증. DUSP6 유전자의 779 bp 단편은 PCR 프라이머 DUSP6_F 및 DUSP6_R로 증폭되었다. 산물을 각각의 sgRNA와 Cas9 단백질로 처리한 후 T7E1 assay를 수행하였다.
도 5는 DUSP6 녹아웃 세포의 생성 및 특성화를 나타낸 것이다. (A) DUSP6 유전자 좌의 첫 번째 엑손에서 DUSP6 녹아웃, RG1 및 RG4에 대한 sgRNA의 표적 부위. (B) 항-DUSP6 항체에 의한 웨스턴 블롯은 RG1에 의해 생성된 DUSP6KO 세포가 여전히 DUSP6 단백질을 갖지만 야생형보다 작은 반면 RG4에 의해 생성된 DUSP6KO 세포에는 DUSP6 단백질이 고갈됨을 나타낸다. (C) p-ERK, ERK 및 DUSP6의 수준은 RG4에 의해 유도된 WT 및 DUSP6KO 세포에서 분석되었다. (D) Mech-계대된 WT 및 DUSP6KO 세포의 ERK 신호. 화살표는 신선한 배지를 추가하는 시기를 나타낸다. (E) WT 및 DUSP6KO 세포에서 EDTA-계대된 WT 및 DUSP6KO 세포에서 ERK 신호. 화살표는 신선한 배지를 추가하는 시기를 나타낸다. (F) 세포 해리 또는 신선한 배지에 의한 ERK 신호전달의 개략도. DUSP6 피드백 조절은 메모리가 있는 되먹임 조절자로 표시된다. (G) EDTA 해리 및 새로운 접시에 부착 24시간 후 CCK-8 분석을 사용하여 WT와 DUSP6KO 세포 사이의 생존율 비교. PD0325901은 해리 전에 DUSP6KO 세포에서 처리되었다(WT 및 DUSP6KO 세포의 경우 n=11, PD0325901 처리된 DUSP6KO 세포의 경우 n=4). (H) WT 및 DUSP6KO 세포의 성장 곡선을 표시된 날짜(n=4)에 CCK-8 분석에 의해 조사했다. (I) WT 및 DUSP6KO 세포는 단일 세포 RNA-seq에 의해 클러스터링되었다. 각 클러스터는 다른 색상으로 표시되고 숫자는 표에 표시된다. 주요 세포 집단은 클러스터에 표시된다. 대표적인 DEG(UTF1, LEFTY1, NODAL)가 표시된다. (J) 6개 클러스터에서 발현된 유전자의 특성에 대한 버블 플롯. 기포 크기는 유전자 비율의 백분율에 비례하고 색상 강도는 조정된 p-값에 비례한다.
도 6은 DUSP6KO 돌연변이의 시퀀싱 분석을 나타낸 것이다. (A) RG1 및 RG4 sgRNA 처리 세포에서 분리된 DUSP6KO 돌연변이의 Sanger 시퀀싱의 히스토그램. (B) 분리된 DUSP6KO 돌연변이에 대한 서열. (C) 단리된 DUSP6KO 돌연변이체의 추론된 아미노산 서열.
도 7은 DUSP6KO 돌연변이에서 전분화능 마커 및 p-ERK의 발현을 나타낸 것이다. (A) WT 및 DUSP6KO 세포에서 전분화능 마커, OCT4, SSEA4 및 TRA-1-60의 발현(스케일 바: 200 μm). (B) WT 및 DUSP6KO 세포에서 EDTA 처리 후 ERK 활성화 지속 시간의 비교. (C) WT와 DUSP6KO 세포 사이의 RNA-seq의 DEG에 대한 생물학적 과정의 유전자 온톨로지 농축 분석.
도 8은 WT 및 DUSP6KO 콜로니에서 인산화된 ERK를 나타낸 것이다. (A) WT 및 DUSP6KO 세포는 Mech 및 EDTA 방법에 의해 3회 이상 계대되었다. 새로운 배지를 공급한 후 표시된 시간에 세포를 고정했다. 콜로니는 항-p-ERK-특이적 항체(녹색) 및 항-OCT4 항체(빨간색)로 염색되었다. 아래쪽 화살표는 매체가 변경된 시기를 나타낸다. 스케일 바: 200 μm. (B) 콜로니를 각각 FGFR(PD173074), ROCK(Y27632), FAK(PF573228)의 억제제로 1시간 동안 처리하고 항-p-ERK 특이적 항체(녹색) 및 DyLight 594 팔로이딘(빨간색)으로 염색했다. WT 및 DUSP6KO 세포집락. 스케일 바: 200 μm. 흰색 화살표는 ERK 활동이 하향 조절된 영역을 나타낸다. 흰색 점선은 FAK 억제제 처리된 세포에서 콜로니의 경계를 나타낸다.
도 9는 분화 성향에 대한 DUSP6 고갈의 효과를 나타낸 것이다. (A) 5% FBS 분화 배지를 사용한 자발적 분화에 의한 WT 및 DUSP6KO 세포의 분화 성향 추정. 내배엽에 대한 분화 성향에 대한 양성 대조군으로서, WT 세포를 5% FBS 분화 전에 2일 동안 Activin A로 처리하였다. (B) DUSP6KO 및 DUSP6KO-A 세포를 5% FBS 분화를 시작하기 전에 1시간 동안 MEK 억제제(1mM PD0325901)로 처리하였다. (C) 심근세포 분화 체계. 간단히 말해서, WT 및 DUSP6KO 세포는 TeSR-E8에서 유지되었다. CHIR99021로 중배엽을 유도하고 Wnt-C59로 심근세포 분화를 유도하였다. 심근 세포 사양은 박동을 확인하여 모니터링하였다. (D) 심근세포는 cTNT, sarcomeric-α-actinin 및 DAPI로 염색되었다. (스케일 바: 50 μm) (E) 성숙한 심근세포 마커인 MYH7의 발현을 실시간 PCR을 사용하여 측정하였다(n=3). 대조군으로서 CDI 및 1차 심장으로부터의 심근세포의 mRNA를 사용하였다. (F) FACS를 사용하여 cTnT 및 MF20 양성 세포로 심근세포 분화를 추정하였다. (G) WT, DUSP6KO 및 DUSP6KO-A 세포에서 유래한 심근세포의 유형.
도 10은 히트맵의 z-점수를 그래프로 변환한 결과를 나타낸 것이다. (A) 5% FBS를 사용한 분화 2주 후 분화된 WT 및 DUSP6KO 세포의 중배엽 및 내배엽의 z-점수. (B) 5% FBS를 사용한 분화 2주 후 DUSP6KO 및 DUSP6KO-A 세포의 중배엽 및 내배엽 분화에 대한 MEK 억제 효과. MEK 억제제, 1 μM PD0325901은 5% FBS 분화 배지를 추가하기 전에 1시간 동안 처리되었다.
도 11은 WT 및 DUSP6KO 세포의 스코어카드 분석을 나타낸 것이다. (A) 2주 동안 5% FBS로 분화 전후에 WT 및 DUSP6KO 세포의 계산된 점수 그래프. (B) WT 및 DUSP6KO 세포의 각 생식층의 점수. (C) WT 및 DUSP6KO에서 자가 재생 및 3개의 배엽 제작자를 위한 구성 요소 유전자의 변화.
도 12는 WT 및 DUSP6KO의 테라토마 분석을 나타낸 것이다. (A-B) WT 및 DUSP6KO 세포의 테라토마 조직. (C) 대표적인 각 lineage 조직의 부분을 나타낸다. (D) 병리학자가 분석한 lineage의 부분에 기반한 테라토마 조직의 정량. (E) 3개의 lineage에 대한 WT 테라토마 부분. (F) 3개의 lineage에 대한 각 DUSP6KO 테라토마 부분.
도 13은 WT, DUSP6KO 및 DUSP6KO-A 세포에서 유래한 심근세포의 유형을 나타낸 것이다. (A) WT, DUSP6KO 및 DUSP6KO-A 세포 및 심근세포의 형태. (B) 박동 패턴에 따른 심근세포의 유형. (C) 심근세포에 대한 분류 지수.
도 14는 DUSP6KO-A 세포의 특성화 및 세포 탄력성의 모델링을 나타낸 것이다. (A) WT, KO 및 KO-A 콜로니의 이미지는 통과 후 4일째에 입체현미경으로 관찰한 것이다. (B) 생존율은 CCK-8 분석을 사용하여 48시간에 추정되었다. (C) 항-p-ERK 항체(녹색), DyLight 594 팔로이딘(빨간색) 및 DAPI(파란색)로 염색된 WT, KO 및 KO-A 콜로니의 공초점 이미지. (D) z축 이미지에서 집락의 높이를 측정했다. (E) WT, KO, KO-A 세포의 p-ERK의 웨스턴 블롯. (F) p-ERK 밴드의 강도는 3개의 독립적인 실험에서 계산되었다. (G) hPSC에서 세포 해리에 대한 응답으로 ERK-DUSP6 신호 전달 루프를 기반으로 하는 세포 탄력성의 모델링. 잘 형성된 세포-세포 및 세포-기질 연결은 균형 잡힌 분화 경향으로 상피 특성을 보장한다. 서로 또는 매트릭스로부터 세포의 해리는 즉시 ERK 및 RSK를 활성화한다. 활성화된 ERK와 RSK는 세포가 생존하는 데 유익한 중간엽 특성을 증가시킨다. 증가된 중간엽 특성을 갖는 세포는 중배엽 및 내배엽으로 기울어진 분화 경향을 갖는다. DUSP6의 지속적인 발현은 세포가 기저 ERK 활성을 낮추어 상피 특성과 균형 잡힌 분화 성향을 회복하도록 돕는다.
도 15는 단일 세포 해리 후 WT, DUSP6KO 및 DUSP6KO-A 세포의 라이브 이미지를 나타낸 것이다. 10분 및 12시간에서 단세포 해리 후 부착된 세포의 이미지.
이하, 본 발명의 바람직한 구현예에 대하여 상세히 설명한다. 또한, 하기의 설명에서는 구체적인 구성요소 등과 같은 많은 특정 사항들이 도시되어 있는데, 이는 본 발명의 보다 전반적인 이해를 돕기 위해서 제공된 것일 뿐 이러한 특정 사항들 없이도 본 발명이 실시될 수 있음은 이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 자명하다 할 것이다. 그리고, 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 기능 혹은 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
<실시예 1> 실험재료
REAGENT OR RESOURCE SOURCE IDENTIFIER
Antibodies
Anti-α-Tubulin Sigma Aldrich SIG-T6074
Anti-Histone H4 (mono methyl K20) Abcam Ab177188
Anti-β-Actin Sigma Aldrich A5316
Anti-OCT-3/4 (C-10) Santa Cruz Sc-5279
Anti-SSEA-4, clone MC-813-70 Merck Millipore MAB4304
Anti-TRA-1-60, clone TRA-1-60 Merck Millipore MAB4360
Anti-DUSP6 Abcam Ab220811
Anti-Phospho-p44/42 MAPK (ERK1/2)(Thr202/Tyr204) (197G2) Cell Signaling #4377S
Anti-p44/42 MAPK (ERK1/2) (L34F12) Cell Signaling #4696S
Anti-RSK1 p90 (phospho T573) Abcam Ab62324
Anti-RSK1 p90 Abcam Ab32114
Anti-cTnT Abcam Ab209813
Anti-Sarcomeric-α-actinin Abcam Ab68167
Anti-MF20 Thermo Fisher 14-6503-82
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher A-21206
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 Thermo Fisher A-21207
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher A-21202
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 Thermo Fisher A-21203
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, HRP Thermo Fisher A16035
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, HRP Thermo Fisher A16017
Chemicals
CCK-8 kit Dojindo CK04-20
PD0325901 Sigma Aldrich PZ0162
PD173074 Sigma Aldrich P2499
Y27632 dihydrochloride Sigma Aldrich Y0503
PF573228 Selleckchem S2013
Selleckchem CT99021
Wnt-C59 Selleckchem S7037
DMSO VWR Life Science 97063-136
DAPI Solution Thermo Fisher 62248
DyLightTM 594 Phalloidin Cell Signaling 12877S
RIPA Lysis and Extraction Buffer Thermo Fisher 8990
HaltTM Protease and Phosphatase Inhibitor Single-Use Cocktail (100X) Thermo Fisher 78442
Bolt® 4-12% Bis-Tris Plus Gels, 1.0mm, 15-well Invitrogen NW04125
Bolt® 4-12% Bis-Tris Plus Gels, 1.0mm, 10-well Invitrogen NW04120
iBindTM Flex Western Starter Kit Thermo Fisher SLF2000S
20X BoltTM MES SDS Running Buffer Thermo Fisher B0002
4% Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution Fujifilm Wako Pure Chemical 163-20145
NuncTM Lab-TekTM II CC2TM Chamber Slide System (2 wells) Nunc 154852PK
Bovine Serum Albumin solution Sigma Aldrich A8412
DPBS (without Ca2+, Mg2+) Gibco 14190-144
TWEEN 20 LPS TW2001
Plasmid Midi Kit Qiagen 12145
Recombinant Cas9 protein Toolgen TGEN_CP1
TrypLE Gibco 12563-011
Accutase Stem Cell Technologies 05872
Dispase Stem Cell Technologies 07923
REAGENT OR RESOURCE SOURCE IDENTIFIER
Critical commercial assays
Maxwell® RSC simply RNA Cells Kit Promega AS1390
RNA to cDNA EcoDry Premix (Oligo dT) Clontech 639543
TaqMan Gene Expression assays DUSP6 (Hs04329643_s1) Thermo Fisher 4331182
TaqMan Gene Expression assays NANOG (Hs0287400_g1) Thermo Fisher 4331182
TaqMan Gene Expression assays POU5F1 (Hs00999632_g1) Thermo Fisher 4331182
TaqMan Gene Expression assays SOX2 (Hs04234836_s1) Thermo Fisher 4331182
TaqMan Gene Expression assays GAPDH (Hs02786624_g1) Thermo Fisher 4331182
TaqMan Gene Expression assays ACTB (Hs03023943_g1) Thermo Fisher 4331182
TaqMan Gene Expression assays MAPK1 (Hs01046830_m1) Thermo Fisher 4331182
TaqMan Gene Expression assays MYH7 (Hs01110632_m1) Thermo Fisher 4331182
TaqMan Gene Expression master mix Thermo Fisher 4369016
TaqMan® hPSC Scrorecard?? Panel 2 X 96w FAST Thermo Fisher A15876
Experimental models: cell lines
hFSiPS1 Korea National Stem Cell Bank
SNUhES31 Seoul National University
Oligonucleotides
sgRNA for DUSP6 (RG1; 서열번호 1)
ATTTCCGACGCGAAGGGCACGGG		 Toolgen
sgRNA for DUSP6 (RG2; 서열번호 2)
GATCGCCATTTCCGACGCGAAGG		 Toolgen
sgRNA for DUSP6 (RG3; 서열번호 3)
AGCGCCGGGTGAAGCGGTCCCGG		 Toolgen
sgRNA for DUSP6 (RG4; 서열번호 4)
CGAGAATACGGGCGGCGAGTCGG		 Toolgen
PCR and sequencing primers for DUSP6KO
RG1_F1GATTTGAGGTGCAGCCTTGG Bioneer
RG1_R1GGCGCGTACCTTCCAGGTAG Bioneer
RG1_SF1CAACCGCTAGCCTCGG Bioneer
RG1_SR1TGCGACGACTCGTATAGCTC Bioneer
RG4_F1GGCATCATGCTGCGGCGCCT Bioneer
RG4_R1CTGGTGCGGAACGCGCGGTT Bioneer
RG4_SF1GAGGACCGGGACCGCTTCAC Bioneer
RG4_SR1GGAGTTCCCTGGGCGCGTAC Bioneer
Software and algorithms
GraphPad Prism 9 GraphPad
Excel Microsoft
ImageJ NIH
<실시예 2> 세포 배양
본 발명의 실험 모델은 국가줄기세포은행과 서울대학교의 인간역분화줄기세포(human induced pluripotent stem cells, hiPSCs)와 인간배아줄기세포(human embryonic stem cells, hESCs)였다. hESCs와 hiPSCs를 이용한 본 발명은 질병관리청 기관심사위원회(20200207PA)의 심사 및 승인을 받았다.
인간 역분화 줄기세포(human pluripotent stem cells, hPSCs)를 TeSR-E8 배지(Stem Cell Technologies)에서 성장시켰다. 매트릭스는 비트로넥틴(VTN-N, Thermo Fisher)을 사용하였다. 세포는 화학적 계대를 위해 EDTA를 사용하거나 기계적 계대를 위해 EZPassage (Thermo Fisher)를 사용하여 5 내지 7일에 한 번 계대되었다. EDTA는 3분 동안; TrypLE (Thermo Fisher)는 2분 동안; ReLeSR (Stem Cell Technologies)은 3분 동안 처리되었다. DPBS로 세포를 세척한 후 세포 스크레이퍼(Cell scraper, SPL)를 사용하여 세포를 수확하였다. 세포를 1.5 ml 원심분리 튜브로 옮기고 원심분리하였다. 직접 용해를 위해 세포를 DPBS로 두 번 세척하고 용해 용액을 추가하여 용해될 때까지 -80℃ 냉동고에 접시를 보관하였다.
<실시예 3> RNA-seq
제조업체의 지침에 따라 자동화된 Maxwell RSC Instrument (Promega)가 있는 Maxwell RSC RNA FFPE 키트를 사용하여 hPSC에서 총 RNA를 분리하였다. 총 RNA 농도는 Quant-IT RiboGreen (Invitrogen)에 의해 계산되었다. 전체 RNA의 무결성을 평가하기 위해 TapeStation RNA 스크린 테이프(Agilent)에서 샘플을 실행한다. RIN이 7.0보다 큰 고품질 RNA 제제만 RNA 라이브러리 구축에 사용되었다.
Illumina TruSeq Stranded mRNA Sample Prep Kit(Illumina)를 사용하여 각 샘플에 대해 1 ㎍의 총 RNA로 라이브러리를 독립적으로 준비하였다. 워크플로의 첫 번째 단계는 poly-T-attached magnetic bead를 사용하여 mRNA 분자를 포함하는 poly-A를 정제하는 것이다. 정제 후, mRNA는 승온에서 2가 양이온을 사용하여 작은 조각으로 단편화된다. 절단된 RNA 단편은 SuperScript II 역전사효소(Invitrogen, #18064014) 및 무작위 프라이머를 사용하여 첫 번째 가닥 cDNA로 복사된다. 그 다음 DNA 중합효소 I, RNase H 및 dUTP를 사용한 두 번째 가닥 cDNA 합성이 이어진다. 그런 다음 이 cDNA 단편은 최종 수리 과정, 단일 'A' 염기 추가, 어댑터 결찰을 거친다. 그런 다음 제품을 정제하고 PCR로 농축하여 최종 cDNA 라이브러리를 만든다.
라이브러리는 qPCR 정량화 프로토콜 가이드(KAPA BIOSYSTEMS)에 따라 Illumina 시퀀싱 플랫폼용 KAPA 라이브러리 정량화 키트를 사용하여 정량화하고 TapeStation D1000 ScreenTape(Agilent Technologies)를 사용하여 검증하였다. 그런 다음 인덱싱된 라이브러리를 Illumina HiSeqXten(Illumina)에 제출하고 페어드 엔드(2x151 bp) 시퀀싱을 Macrogen에서 수행하였다. 일부 샘플은 제조업체의 프로토콜에 따라 150bp 페어드 엔드가 있는 조명 NovaSeq6000 플랫폼에서 시퀀싱되었다. 이미지 분석은 NovaSeq6000 제어 소프트웨어 버전 1.3.1을 사용하여 수행되었으며 출력 base calls 데이터는 fastQ 파일을 생성하는 bcl2fastq 버전 v2.20.0422로 역다중화되었다. NovaSeq6000은 Theragen과 DNALink에서 수행하였다.
Cufflinks를 사용하여 Read Count에서 유전자의 상대적 존재비를 측정하였다. 샘플의 각 유전자에 대한 풍부도 추정치를 사용하여 차등적으로 발현된 유전자를 찾기 위해 통계적 분석을 수행하였다. 샘플에서 읽기 카운트 값이 0보다 하나 이상인 유전자는 제외되었다. log2 변환을 용이하게 하기 위해 필터링된 유전자의 각 Read Count 값에 1이 추가되었다. 필터링된 데이터를 log2로 변환하고 TMM 정규화를 수행하였다. 차등 발현 데이터의 통계적 유의성은 edgeR을 사용하는 exactTest와 그룹 간에 차이가 없다는 귀무 가설인 fold change를 사용하여 결정되었다. FDR(False Discovery Rate)은 Benjamini-Hochberg 알고리즘을 사용하여 p 값을 조정하여 제어하였다. DEG 집합의 경우, 유사도의 척도로 완전한 연결과 유클리드 거리를 사용하여 계층적 클러스터링 분석을 수행하였다. Gene Ontology(www.geneontology.org/)를 기반으로 중요한 유전자 목록에 대한 Gene-enrichment 및 기능 주석 분석 및 경로 분석을 수행하였다.
<실시예 4> 정량적 실시간 PCR
RNA-seq에 대해 동일한 방법을 사용하여 총 RNA를 분리하였다. RNA to cDNA EcoDry Premix(Takara)를 사용하여 2 μg의 total RNA로 역전사를 수행하였다. 정량적 실시간 PCR은 Taqman® Primer & Probe 세트(Thermo Fisher)로 수행되었다. ACTB는 내부 대조군으로 사용되었다. PCR은 QuantStudio 6 Flex(Life Technologies)로 수행되었다. 폴드 변화는 △△CT 방법으로 계산되었다(Livak, K.J., and Schmittgen, T.D. (2001). Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2ΔΔCT Method. Methods 25, 402-408. https://doi.org/10.1006/meth.2001.1262).
<실시예 5> 웨스턴 블롯
전체 세포 추출물은 프로테아제 억제제(Roche) 및 포스파타제 억제제(Sigma)가 보충된 RIPA 용해 완충액(Thermo Fisher)을 사용하여 분리되었다. 분리된 단백질의 농도는 BCA 단백질 분석 시약(Pierce)을 사용하여 결정되었다. 15-20 마이크로그램의 단백질을 4-12% Bis-Tris Plus 겔(Thermo Fisher)에서 분리하고 iBind™ Flex Western Starter Kit(Thermo Fisher)를 사용하여 PVDF 멤브레인(Millipore)으로 옮겼다. 그런 다음 1차 항체 및 적절한 2차 항체와 함께 막을 반응시켰다. 양의 검증은 α-tubulin 또는 β-actin(Sigma, 1:2,000)으로 확인되었다.
<실시예 6> 핵 분리
배양 세포로부터 핵의 분리는 Nabbi et al(Nabbi, A., and Riabowol, K. (2015). Rapid Isolation of Nuclei from Cells In Vitro. Cold Spring Harb Protoc 2015, 769-772. 10.1101/pdb.prot083733.)의 방법을 따랐다. 간단히 말해서, 90% 합류 세포를 포함하는 접시를 빙냉 PBS로 세척하고 1 ml PBS를 사용하여 세포를 긁어냈다. 세포를 얼음 위의 1.5 ml 미세원심분리 튜브로 옮겼다. 세포를 간단한 원심분리에 의해 펠렛화하였다. 세포를 빙냉 PBS를 함유하는 0.1% NP-40으로 재현탁시켰다. 세포를 P1000 마이크로피펫 팁으로 얼음 위에서 5회 분쇄하였다. 용해된 세포 현탁액을 10,000rpm에서 5-10초 동안 원심분리하였다. 상층액을 새로운 튜브에 옮겨 세포질 분획으로 사용하였다. 펠렛을 PBS를 함유하는 0.1% NP-40에 재현탁시키고 10,000 rpm에서 5-10초 동안 원심분리하였다. 상층액을 버린 후, 펠릿을 1X Laemmli 샘플 버퍼에 재현탁하고 핵 분획으로 사용하였다.
<실시예 7> Bisulfite amplicon sequencing analysis
Genomic DNA는 bisulfite로 변환되고 bisulfite 변환된 DNA에 특이적인 프라이머를 사용하여 bisulfite-specific PCR을 수행하였다. 앰플리콘은 라이브러리 준비를 거쳐 조명 Miseq에서 시퀀싱되었다. 잠재적으로 존재하는 시퀀싱 어댑터와 낮은 읽기의 원시 품질 기반은 Skew ver 0.2.2에 의해 트리밍되었다. BS-seeker2 ver 2.1.2 소프트웨어로 정제된 고품질 판독값을 참조 게놈에 매핑하였다. 매핑 결과에서 메틸화 수준을 호출하기 위해 BS-seeker2를 사용하였다. 메틸화 수준은 단일 염기 분해능에서 계산되었다. 샘플 그룹 중 CpG 사이트의 메틸화 프로파일을 비교하기 위해 유일한 CpG 사이트 값을 선택하였다. Mann-Whitney U 테스트는 그룹에 대해 수행되었다.
<실시예 8> Constructs
Pritchard et al.(Pritchard, C.A., Samuels, M.L., Bosch, E., and McMahon, M. (1995). Conditionally oncogenic forms of the A-Raf and B-Raf protein kinases display different biological and biochemical properties in NIH 3T3 cells. Mol Cell Biol 15, 6430-6442. 10.1128/mcb.15.11.6430.)에 기초하여 RAF 구조의 우세한 활성 형태가 합성되었다. 간단히 말해서, RAF1의 키나제 도메인을 에스트로겐 수용체 도메인에 융합시킨 다음 안전한 은닉 부위를 표적으로 하는 AAVS1 벡터에 삽입하였다. AAVS1 벡터(AICSDP-36: AAVS1-mEGFP)는 Addgene(Plasmid #114404)에서 얻었고 PGK 프로모터는 EF1α 프로모터로 변경되었다.
EGFP-DUSP6 발현 벡터는 AAVS1-EF1a-mEGFP에서 EGFP 서열 뒤에 DUSP6 코딩 서열을 삽입하여 구축하였다.
<실시예 9> Transfection for CRISPR/Cas9
DUSP6의 녹아웃(KO) 돌연변이에 대한 sgRNA의 hFSiPS1(WT)로의 형질감염은 제조업체의 권장 사항에 따라 전기천공법(Amax P3 Primary Cell 4D-Nucleofector® X Kit)으로 수행되었다. 10 μg의 Cas9 단백질(Toolgen)을 1.5 x 106 세포의 형질감염을 위해 2 μg의 sgRNA(Toolgen)와 혼합하였다. 전기천공 후, 세포를 웰당 단일 세포에 대한 한계 희석으로 0.5 ㎍/cm2 비트로넥틴 코팅된 96웰 플레이트에 플레이팅하였다. 단일 세포의 생존율을 증가시키기 위해 CloneR(Stem Cell Technolongies)을 전기천공 후 24시간 동안 처리하였다. 약 12일 만에 세포 덩어리가 형성되었을 때, 본 발명에서는 콜로니의 절반을 수확하고 게놈 DNA를 분리하고 해당 영역을 증폭하였다. 증폭된 DNA 단편은 Sanger Sequencing(Bioneer)으로 분석하였다. 두 염색체 모두에서 조기 종결 돌연변이를 갖는 KO 세포를 선택하였다.
<실시예 10> Construct for feedback-resistant RAF
△RAF(S642A):ER 단편은 pBabe HA-△RAF(S642A):ER puro의 서열을 기반으로 합성되었다. 합성된 단편은 AAVS1-mEGFP(PGK)(Addgene 114404)의 EGFP 단편을 대체하여 NcoI 및 EcoRI 사이트에 삽입하였다. PGK 프로모터는 EF1α 프로모터로 대체되었다. AAVS1-Puro-EF1α-△RAF(S642A):ER, gRNA_AAVS1-T2(플라스미드 #41818) 및 Cas9 단백질(Toolgen)을 hFSiPS1(WT)에 전기천공하여 호르몬 반응성, 피드백 내성 RAF 발현 세포주를 생성하였다. 전기천공 후, 세포를 비트로넥틴 코팅된 35 mm 플레이트에 플레이팅하였다. 녹인(KI) 클론의 선택을 위해 퓨로마이신(500ng/ml)을 추가하였다. 선택된 콜로니를 새로운 35 mm 플레이트로 옮겼다. PCR 및 웨스턴 블롯으로 적절한 KI 세포를 확인하였다.
<실시예 11> 생존율 및 성장률
WT 및 DUSP6KO 세포를 VTN-N으로 코팅된 96웰 플레이트에 웰당 1 x 104개 세포의 밀도로 시딩하였다. 해리에 의한 손상을 줄이기 위해 Y27632를 EDTA를 사용하여 해리 전에 1시간 동안 전처리하였다. Eon 마이크로플레이트 분광광도계(BioTek)를 사용하여 CCK-8 키트(Dojindo)에 의해 생존율 및 성장률을 추정하였다.
<실시예 12> 5% FBS에 의한 자발적 분화
자발적 분화를 위해 배지를 0.1 mM 2-메르캅토에탄올, 1% NEAA, 1% 항생제-항진균제, 0.1% Mycozap Plus-PR 및 5% 소태아혈청(FBS)을 포함하는 DMEM/F12로 변경하였다. 배지는 2일마다 변경되었다. 세포를 각 시점에서 수확하고 RNA-seq로 분석하였다.
<실시예 13> 테라토마 분석(Teratoma assay)
세포 현탁액(50 ㎕)을 23G 바늘이 있는 멸균 1ml 주사기를 사용하여 피하 주사하였다. 테라토마 형성을 8주 동안 육안으로 모니터링하였다. CO2 수치가 상승한 마우스를 안락사시킨 후 주변 조직에서 테라토마를 조심스럽게 절제하였다. 사진을 찍은 후 테라토마를 두 조각으로 자른다. 한 조각은 Bouin 용액에 고정한 후 파라핀 절편을 사용하고 다른 조각은 -80℃에 보관하였다. 5 μm 섹션으로 잘랐고(Leica RM2255), 염색 또는 면역조직화학염색을 수행하기 전에 4℃에 보관하였다. 모든 헤마톡실린 및 에오신은 표준 프로토콜에 따라 수행되었다. 테라토마는 강원대학교의 공인 병리학자가 평가하였다.
자연적으로 발생하는 인간 테라토마의 조직학 평가에서 일상적으로 수행되는 바와 같이, 각 테라토마의 구성은 맹검 방식으로 H&E 염색 섹션의 육안 검사에 의해 반정량적으로 추정되었다. 테라토마에서 분화된 요소는 전체 조직의 백분율로 외배엽(피부, 신경 등), 내배엽(선 구조) 및 중배엽(연골, 뼈) 성분으로 분류되었다. 동물과 관련된 모든 실험 절차는 GHbio에 의해 수행되었으며 한국생명공학연구원(KRIBB)의 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았다.
<실시예 14> 단일 세포 RNA-seq
hiPSC는 Accutase(Stem Cell Technologies)를 사용하여 단일 세포 현탁액으로 해리되었다. 제조업체의 프로토콜에 따라 Chromium Single Cell 3' v2 라이브러리를 사용하여 단일 세포 바코드 액적을 구성하기 위해 실행 가능한 단일 세포를 GemCode Instrument(10X Genomics, CA, USA)에 로드하였다. 라이브러리는 Illumina HiSeq 4000 시스템에서 구성되었다. Chromium 플랫폼(10X Genomics)을 사용하여 WT_Mech에서 3,169개, WT_EDTA에서 3,429개, DUSP6KO_Mech에서 3,904개, DUSP6KO_EDTA에서 3,263개의 세포를 시퀀싱하였다. 단일 세포 RNA 시퀀싱 데이터는 Cell Ranger 2.1.1 단일 세포 분석 파이프라인(10X Genomics)을 사용하여 전처리되었다. 원시 FASTQ 파일은 STAR 정렬기를 사용하여 인간 참조 게놈(hg38, GRCh 38)에 매핑되었다. Chromium 세포 바코드는 유전자-바코드 매트릭스를 구성하는 데 사용되었다. MEX 형식의 세포 바코드만 포함하는 필터링된 유전자-바코드 매트릭스를 다운스트림 분석에 적용하였다. scRNA-seq 발현 데이터는 Seurat v3.0.0 R 패키지로 분석되었다. 본 발명에서는 hiPSC 사이의 공통적이고 별개의 세포 유형을 식별하기 위해 Seurat 통합 절차를 사용하여 비교 분석을 수행하였다.
4개의 모든 EB의 기능 발현 매트릭스를 기반으로 Seurat 개체를 생성한 후 고유 유전자 수(nFeature_RNA)가 200개 미만 및 6,000개 이상인 세포를 필터링하고 미토콘드리아 유전자 발현 비율이 7.5% 미만인 세포를 고려하였다. 결과 데이터는 총 카운트를 기반으로 표현식 카운트를 정규화하는 "NormalizeData" 방법을 사용하여 정규화되었다. 본 발명에서는 상위 2,000개의 가장 가변적인 특성과 함께 'vst' 방법을 사용하여 '평균 변동성 플롯'에서 이상값인 특성을 식별하였다. 그런 다음 'FindIntegrationAnchors' 기능을 사용하여 통합 앵커를 찾은 후 단일 셀 데이터를 로그 변환된 단일 셀 발현 데이터와 통합하였다. 통합 분석은 hFSiPS3(대조군) 및 hFSiPS1(케이스) 샘플의 2개 그룹에서 수행되었다.
본 발명에서는 유전자 발현 데이터 세트의 크기를 조정하고 중심에 둔 다음 주성분 분석(PCA)을 위해 크기가 조정된 z-점수 잔차를 사용하였다. 통계적으로 유의한 주성분을 기반으로 하는 T-분산 확률적 이웃 임베딩(tSNE) 차원 축소가 수행되었다. SNN(Shared Nearest Neighbor) 그래프는 셀 클러스터를 식별하기 위해 모든 셀과 k-최근접 이웃 간의 이웃 중첩(Jaccard 인덱스)을 계산하여 구성되었다. 클러스터의 거리 매트릭스를 기반으로 계통 발생 트리를 구축하였다. 클러스터 간의 차등 발현 유전자(DEG)를 계산하여 세포 유형 마커 유전자를 식별하였다. 조정된 p-값≤0.05 및 로그 배수 변화≥0.1을 갖는 DEG가 각 클러스터에서 고려되었다.
대조군과 사례 샘플의 클러스터 간의 구성은 다음과 같이 계산되었다.
대조군과 사례 샘플 사이에 비율이 다른 클러스터에서 상향 조절된 유전자는 DAVID를 사용하여 유전자 온톨로지(GO)에 적용되었다. 세포 클러스터는 본 발명의 데이터 세트와 유사하게 H9, 순진한 H9 및 프라이밍된 H9에서 파생된 EB의 scRNA-seq 데이터를 분석했기 때문에 Han X. et al (Mapping the mouse cell atlas by microwell-seq)의 결과를 기반으로 주석을 달았다.
<실시예 15> hiPSC의 심근세포 분화
hiPSC의 심근세포 분화 및 분석은 T&R Biofab에 의해 수행되었다. 간단히 말해서, hiPSC 계통인 WT 및 DUSP6KO는 Matrigel(Corning)의 StemMACS iPS-BREW XF(Miltenyi Biotec)로 유지되었다. 심근세포 분화를 위해 hiPSC를 hPSC 적격 Matrigel 코팅 세포 배양 접시(Eppendorf)에 140,000 cells/cm2 접시로 시딩하였다. 계대 후 처음 24시간 동안 5 μM의 Y-27632(Tocris)를 첨가하였다. 배지는 매일 교체되었고 hiPSC는 90% 합류에 도달할 때까지 3-4일 동안 성장하였다. 0일에 세포를 심근세포 분화 배지(CDM; 소 혈청 알부민[BSA, Sigma-Aldrich] 및 아스코르브산[Sigma-Aldrich]가 보충된 RPMI1640[Thermo Fisher])에서 6 μM/ml의 CHIR99021(Tocris)로 처리하였다. 48시간 배양 후 배지를 Wnt inhibitor(Stemgent Inc.)인 2 μM/ml의 C59가 첨가된 CDM으로 교체하고 48시간 동안 더 배양하였다. 5일째에 배지를 신선한 CDM으로 교체한 후 이틀에 한 번 새 배지로 교체하였다. 자연적으로 수축하는 세포는 대략 8일에서 10일에 나타나기 시작하였다. 10일부터 15일까지 L-락트산을 함유한 CDM을 사용하여 hiPSC 유래 심근세포를 대사적으로 선택하고 정제하였다. Eclipse-Ti2 형광 현미경(Nikon)을 사용하여 이미지를 분석하였다.
<실시예 16> Flow cytochemistry
hPSCs-CM을 재현탁하고 4% PFA/투과성 용액(BD Bioscience)으로 15분 동안 고정하였다. hPSC-CM은 항-TNNT2 항체(Abcam) 및 항-미오신 4 항체(Thermo Fisher)를 사용하여 4℃에서 30분 동안 cTnT 및 MF20에 대해 염색되었다. 이어서, 세포를 30분 동안 플루오레세인 접합 이차 항체로 표지한 다음, SH800S 세포 분류기 유세포 분석기와 세포 분류기 소프트웨어 버전 2.1.5(Sony Biotechnology)를 사용하여 분석하였다.
<실시예 17> Scorecard assessment
WT 및 DUSP6KO 세포는 TeSR-E8에서 계대배양된 VTN 코팅된 35mm 접시에서 성장하였다. 세포가 약 90% confluency에 도달했을 때, 배지는 5% FBS를 사용한 자발적 분화에서와 같이 TeSR-E8에서 5% FBS 함유 분화 배지로 변경되었다. 14일 후, 미분화 세포 및 분화 세포를 수집하였다. RNA 추출 및 cDNA 합성은 RNA-seq와 동일한 방법으로 수행하였다. hPSC 스코어카드 qPCR은 QuantStudio 6 Flex(Life Technologies)에서 제조업체의 지시에 따라 실행되었으며 스코어카드 애플리케이션을 통해 분석되었다.
<실시예 18> Immunocytochemistry
세포를 4% 파라포름알데히드(Wako)로 20분 동안 고정하고 10분 동안 1x PBS에서 0.2%(v/v) Triton X-100(Sigma Aldrich)으로 투과화하였다. 세포를 30분 동안 1x PBS에서 1%(v/v) 소 혈청 알부민(Sigma Aldrich)으로 블로킹하였다. 그런 다음 4℃에서 밤새 1차 항체(표 1에 나열됨)와 함께 인큐베이션한 다음 1시간 동안 플루오레세인 결합 이차 항체로 표지하였다. 이미지는 공초점 현미경(Olympus FV3000)을 사용하여 획득하였다.
<실시예 19> 공초점 형광 현미경(Confocal fluorescence microscopy)
공초점 형광 이미지는 KNIH의 현미경 시설에서 10x 및 40X 대물렌즈가 있는 공초점 현미경 FV3000(Olympus)으로 얻었다. 488 nm, 594 nm 및 405 nm에서 순차적인 여기가 다이오드형 레이저에 의해 제공되었다. 순차적인 여기 후 녹색, 빨간색, 청광 형광 이미지를 FV31S-SW 소프트웨어로 저장하였다.
<실시예 20> 정량 및 통계 분석
데이터는 반복된 실험에서 두 그룹 비교를 위해 쌍을 이루는 t-검정으로 분석되었다. 통계적으로 유의한 p-값은 그림에 표시되며 p 값 < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. 최소 3회의 독립적인 실험의 평균 및 SD가 도면에 표시된다.
<실험예 1> 계대 방법에 의해 다르게 발현하는 유전자 분석
인간 전분화능줄기세포가 세포분리에 어떻게 반응하는지 조사하기 위해 인간 역분화줄기세포주(hFSiPS1)과 인간 배아줄기세포주(SNUHES31)를 ROCK 저해제 처리 없이 기계적으로 또는 화학적인 방법으로 계대하여 배양하였다(도 1A). 각각의 방법으로 세번의 계대 후 세포를 수확하여 RNA-seq 분석을 실시하였다. 그 결과, 두 세포주에서 공통으로 0.05 이하의 p-value를 가지고 1.8 배 이상 변화를 보인 유전자가 144개로 나타났다(도 1B-C). 이들 발현의 차이를 보이는 유전자들(DEGs)에 대한 pathway 분석은 MAPK signaling pathway에 관련된 유전자들이 이 자극에 높게 반응하는 것으로 나타났다(도 1D). MAPK signaling pathway 유전자들 중에서도 DUSP6 유전자의 발현이 대표적이고, 그 발현은 real-time PCR과 western blot으로 확인되었다(도 1E-F).
<실험예 2> 세포분리에 의한 ERK 활성화
DUSP6의 발현은 FGFR로부터 시작된 ERK signaling에 의존하는 것으로 알려져 있기 때문에 본 발명에서는 세포분리가 ERK를 활성화시키는지 조사했다. 세포를 scraper, EDTA 또는 Dispase로 각각 회수하고, ERK의 인산화 정도를 Western blot으로 확인하였다(도 2A). 4분간 EDTA 처리는 즉각적으로 ERK 인산화(p-ERK)를 증가시켰다. 세포배양접시로부터 콜로니를 떼어내지만 세포-세포 간 접착에는 영향이 거의 없는 Dispase도 ERK 인산화를 증가시키는 것으로 보아, 세포-세포 및 세포-세포외기질(ECM) 간의 접합 모두가 ERK 활성화에 영향을 미치는 것을 확인하였다. 심지어 scraper로 세포를 회수했을 때도 세포배양접시에서 바로 세포를 lysis했을 때에 비해 ERK의 인산화가 증가하였다(도 2B). 광범위하게 사용되고 있는 다른 계대 용액들도 ERK를 활성화시키는지 확인하기 위해 ReLeSR와 TrypLE로 세포를 회수하고 Western blot을 실시하였다. 이들 계대용액들 역시 ERK를 활성화시키는 것을 확인하였다(도 2C). 그리고 이들 ReLeSR와 TrypLE로 계대한 세포에서도 DUSP6 유전자의 발현이 증가하는 것을 확인하였다(도 2D). EDTA 처리에 의해 ERK 활성화 지속기간을 측정했을 때 활성화는 즉각적일 뿐만 아니라 순간적이라는 것을 확인하였다(도 2E). 활성화는 EDTA 처리 후 10 이하로 지속되었다. 본 발명에서는 또한 ERK의 downstream kinase로 알려져 있는 RSK가 세포분리에 의해 활성화되고 그 지속시간은 ERK보다 약간 질다는 것을 확인할 수 있었다. 하지만 Dispase를 처리했을 때는 그 처리기간 동안 ERK의 활성화가 어느 정도 지속되었다(도 2F). ERK와 RSK 중에 어떤 것이 핵으로 신호를 전달하는지 확인하기 위해 ERK 와 RSK의 핵/세포질 분포를 분석하였다. 그 결과 EDTA를 처리한 세포의 핵과 세포질에서는 인산화된 RSK가 확인되었지만, 대부분의 인산화된 ERK는 세포질에서 확인이 된 것으로 보아 RSK가 세포분리에 의한 ERK 활성화 신호를 핵으로 전달하는 매개체일 가능성을 제시한다(도 2G). 하지만, 핵에서 p-ERK가 존재하는 기간이 짧아서 검출하는데 한계가 있을 수 있다. 다음으로 본 발명은 어떻게 순간적인 ERK 활성화가 계대 후 6일째까지 증가된 DUSP6 유전자 발현으로 이어질 수 있는 지에 대한 질문했다. 그래서 기계적인 계대와 EDTA 계대 후 4일부터 7일까지 세포에 대해 DUSP6 유전자발현을 분석하였다. 도 2H에서처럼, DUSP6 유전자발현은 EDTA로 계대한 세포에서는 4일째에 비해 7일째에 2배 이상까지 증가한 반면, 기계적인 방법으로 계대한 세포에서는 DUSP6의 발현이 약간 감소했다. 대조군으로 MAPK1 유전자의 발현에는 변화가 없었다(도 2I).
<실험예 3> 세포분리에 의한 ERK 활성화의 상위 신호들
인간 전분화능줄기세포들을 세포분리하면 ROCK을 활성화시키는 것이 알려져 있기 때문에 본 발명에서는 세포분리에 의한 ERK 활성화가 저해제들에 의해 억제될 수 있는지 분석하였다. ROCK 저해제인 Y-27632는 ERK 활성화를 약간 억제하는 반면 FAK 저해제는 세포분리에 의한 ERK 활성화를 분명히 억제하였다(도 3A-B). 반면, FGFR 저해제인 PD173074는 그 활성화를 억제하지 못했다. ROCK 저해제와 FAK 저해제를 동시에 처리하면 ERK 활성화에 시너지 효과가 있는 것으로 보아 세포분리에 의한 ERK 활성화 신호는 최소한 두 개의 독립적인 경로에서 온 것으로 보인다. 하나는 세포-세포외기질 접합의 파괴로부터 오고, 다른 하나는 세포분리에 의해 활성화되는 ROCK을 통해서(또는 ROCK에 의한 membrane blebbing에 의해 간접적으로) 오는 것으로 보인다. 높은 농도의 PF573228은 ERK와 MEK을 포함하는 다른 kinase들도 부분적으로 저해할 수 있는 것으로 알려져 있어서 본 발명에서는 낮은 농도에서 저해 효과를 측정해 보았으나, 10 μM보다 낮은 농도에서는 억제가 일어나지 않았다(도 3C). 그러므로, FAK 저해제가 세포분리에 의한 ERK 활성화에 작용하는 기작이 FAK 특이적인지에 대해 불명확한 부분이 있다. 하지만, FAK는 세포막 integrin과 actin cytoskeleton 사이에 위치하고 있고 세포막이 actin cytoskeleton과 떨어졌을 때 blebbing이 형성되는 것으로 알려져 있기 때문에 FAK가 떨어지는 것을 인지하는 센서나 신호전달자로 관련될 가능성은 높다. 세포분리에 의한 신호전달 경로와 그 피드백 조절은 도 3D에 있다.
<실험예 4> ERK 활성 조절을 위한 DUSP6의 역할
EDTA-계대 세포에서 ERK 활성화와 DUSP6 유전자발현의 증가의 역할을 규명하기 위해 본 발명에서는 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 DUSP6 유전자발현이 결핍된 knockout (KO) 돌연변이 세포주를 수립하였다. 이를 위해 본 발명에서는 DUSP6 유전자의 첫번째 exon에서 4개 site에 대한 single guide RNAs (sgRNAs)를 디자인(도 4)하고 이에 대한 validation을 거쳐 RG1과 RG4 site를 target하여 돌연변이를 유발하였다(도 5A). Target sequence에 유발된 결손은 Sanger sequencing을 통해 확인하였다(도 6). DUSP6 단백질의 발현은 DUSP6 특이적인 항체를 이용하여 확인하였다(도 5B). RG1 KO 세포는 WT 단백질에 비해 약간 작은 DUSP6 단백질을 발현하고 있었는데, 이는 40-42에 위치한 두번째 ATG에서 발현이 시작되었을 가능성을 보여주었다(도 6B). 이는 COS-1 세포에서 DUSP6 단백질이 첫번째와 두번째 ATG를 모두 initiation codon으로 사용할 수 있음을 보여준 결과와 일치한다. 그러므로 본 발명에서는 RG4 KO 돌연변이 세포를 추가적인 분석에 사용하였다. DUSP6 유전자의 결손이 전분화능 마커의 발현에 영향을 주지는 않았다(도 7A). KO 세포들은 정상세포에 비해 높은 수준의 p-ERK를 보여주었다(도 5C). 하지만, EDTA를 이용한 세포분리에 의한 ERK 활성화 지속시간에는 영향이 없었는데, 이는 DUSP6가 ERK 활성의 basal level 조절자이며 ERK signaling은 여전히 다른 피드백 조절을 받고 있음을 보여준다(도 7B).
성장인자들이 ERK를 활성화시키는 것으로 알려져 있기 때문에 본 발명에서는 세포분리 자극이 성장인자에 의한 ERK signaling에 영향을 주는지 분석해 보았다. 흥미롭게도 ERK 활성화 정도가 기계적으로 계대한 세포에 비해 EDTA로 계대한 세포에서 낮게 유지되었다(도 5D-E). 이는 DUSP6에 의한 피드백 loop가 세포분리에 의한 자극이 더 이상 존재하지 않는 상태에서도 상당기간 동안 ERK의 basal 활성을 결정하는 것을 보여준다. ERK 활성의 down-regulation은 EDTA로 계대한 WT 세포에서만 일어나고 KO 세포에서는 일어나지 않았다. DUSP6가 이전 자극의 종료된 후에도 ERK signaling의 양을 조절하기 때문에 본 발명에서는 DUSP6의 역할을 ERK signaling의 basal level에 대한 기억유지조절자(memory retention regulator)로 명명하였다(도 5F).
다음으로 본 발명에서는 ERK의 upstream kinase인 MEK의 저해제(PD0325901)을 사용하여 ERK 활성화를 억제함으로써 세포분리에 의한 ERK 활성화의 역할을 규명해 보고자 하였다. 세포분리 24 시간 후 세포 생존율은 KO 세포가 정상세포보다 높았다(도 5G). 그리고 MEK 저해제를 이용하여 ERK 활성을 억제했을 때는 KO 세포의 생존율을 낮추는 것으로 보아 KO 세포의 높아진 생존율은 높아진 ERK 활성도 때문인 것을 확인할 수 있다. 생존율 이외에 성장률에서도 KO 세포가 정상세포에 비해 빨리 자라는 것을 확인하였다(도 5H). 이러한 결과들로 보아 세포분리에 의한 ERK 활성화는 pro-survival 신호임을 알 수 있다. 이러한 ERK 활성화는 세포주기 진전에서 이전에 제시된 ERK signaling의 역할과 일치한다.
정상세포와 KO 세포 간의 RNA-seq 유전자발현 차이 분석 결과는 KO 세포에서 focal adhesion, ECM-receptor interaction과 같은 세포-세포외기질 상호작용에 관련된 유전자들의 발현이 크게 변한 것을 확인할 수 있다(도 7C). 그리고 single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq)을 이용한 유전자발현 비교는 DUSP6 유전자의 결핍과 계대의 방법이 세포 clustering을 구별할 수 있음을 보여준다(도 5I). 각 cluster들에 enriched biological processes는 KO 세포에서 증가한 ERK 활성은 스트레스에 반응을 위한 신호로 작용하는 것을 보여준다(도 5J).
<실험예 5> 인간 전분화능줄기세포 콜로니에서 ERK 활성의 조절
콜로니에서 ERK의 활성 정도를 조사하기 위해, 본 발명에서는 신선한 배양액을 넣기 전화 후에 시간에 따라 기계적 또는 EDTA로 계대한 정상세포와 KO 콜로니에서 p-ERK 패턴을 조사하였다. 도 8A에서처럼, 계대방법에 상관없이 p-ERK 패턴은 신선한 배양액을 넣기 전(또는 넣은 후 24시간 후)에는 콜로니의 바깥쪽에서 높은 신호를 보였는데, 이는 인간 배아줄기세포에서의 결과와 일치한다. 흥미롭게도, 신선한 배양액을 넣으면 EDTA로 계대한 정상세포 콜로니에서는 p-ERK의 증가가 억제되는 반면에 기계적으로 계대한 세포의 코로니에서는 가운데 부분에서 p-ERK가 증가했다. 계대 방법에 따른 p-ERK 신호의 강도차이가 KO 콜로니에서는 나타나지 않은 것으로 보아 계대 방법에 따른 p-ERK 패턴의 차이는 DUSP6에 의한 것으로 설명할 수 있다. 이러한 p-ERK의 패턴은 western blot 결과(도 5D-E)와도 일치한다.
ROCK 과 FAK 저해제가 콜로니에서는 p-ERK의 패턴이나 모양을 어떻게 바꾸는지 확인하기 위하여 정상세포와 KO 세포 콜로니에서 p-ERK와 filamentous actin (FA)를 분석하였다(도 8B). 흥미롭게도 Y27632를 이용하여 ROCK을 저해했을 때 신선한 배양액을 교체한 1시간과 24시간에서 바깥쪽 ERK 활성을 억제하였다. 반면, FGFR 저해제인 PD173074는 콜로니 전체 지역에서 ERK 활성을 억제하였다(도 8B의 화살표). 전분화능줄기세포의 콜로니 경계부분에서 ERK 활성이 ROCK에 의해 조절되는 것은 새로운 발견이다. 콜로니를 싸고 있는 FA-fence 형성이 ROCK 활성에 의존하는 것으로 알려져 있어서, ROCK에 의한 ERK 활성의 저하가 직접적인 것인지 간접적인 것인지는 명확하지 않다. 이 발견은 도 3A-B에서 EDTA에 의한 ERK 활성화를 Y27632가 부분적으로 억제할 수 있다는 결과와 일치한다.
<실험예 6> ERK 활성도와 분화 간의 연관성
ERK의 활성은 쥐의 배아줄기세포에서 self-renewal과 분화에 영향을 미치는 것으로 알려져 있지만, 인간 전분화능줄기세포에서 역할은 분명치 않다. 쥐에서 ERK 신호전달 활성은 초기 발생단계에서 lineage 결정에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 본 발명에서는 DUSP6 유전자 결손에 의한 ERK 활성의 증가가 분화경향성에 영향을 미치는지 확인하기 위해 5% FBS를 이용하여 인간 역분화줄기세포를 자연분화시켰다. DUSP6 결손 후 초기 계대에서 기계적으로 계대한 KO 세포는 정상세포와 유사한 분화경향성을 보인 반면, EDTA로 계대한 KO 세포는 중배엽과 내배엽으로 치우쳐 분화하는 경향을 보였다(도 9A). Heatmap data를 중배엽 및 내배엽에 대한 p-value에 간한 z-Scores에 기반한 그래프로 변환하였다(도 10). 내배엽 분화를 위한 positive 대조군으로 전분화능 줄기세포에 내배엽 유도 인자로 알려진 Activin A를 처리하였다. 내배엽과 중배엽 모두에서 KO 세포는 Activin A를 전처리한 세포에 비해 분화경향성이 높게 나타났다. Scorecard 분석을 이용해서 분화경향성을 한 번 더 확인하였다(도 11). 테라토마 분석에서는 KO 세포도 세 종류의 lineage로 분화할 수 있는 능력을 가지고 있음을 확인했지만 조직별 차이가 커서 분화 경향성을 결정하기는 어려웠다(도 12).
KO 세포의 계대 과정에서 대부분의 세포들은 정상 분화경향성으로 회복하였는데, 하나의 subline은 분화경향성이 중배엽과 내배엽으로 완전히 변화된 특징을 보여주었다(도 9B). 본 발명에서는 이 subline 세포주를 DUSP6KO-A, 짧게 KO-A로 명명하였다. 이 변화된 분화경향성은 ERK 활성을 낮추기 위해 MEK 저해제를 처리하였을 때도 비록 약간의 분화정도가 낮아지긴 했지만 돌이킬 수 없었다.
본 발명에서는 이들 세포를 심근세포로 분화시켜서 중배엽으로의 분화를 측정해 보았다(도 9C). 심근세포로의 분화는 면역염색과 beating 세포를 관찰하여 확인하였다(도 9D, 도 13). Mature 심근세포 마커인 MYH7은 정상세포에 비해 KO와 KO-A 세포에서 높게 발현하였다(도 9E). 정상세포에서는 cTnT-positive 심근세포가 50%인데, KO 세포에서 90%까지 증가한 반면 KO-A에서는 49%로 정상세포와 비슷했다(도 9F). Beating 패턴을 분석하여 심근세포를 분류했을 때, KO 세포는 nodal 특징이 감소하는데 반해 KO-A에서는 50%까지 증가하는 결과를 보였다(도 9G, 도 13B).
<실험예 7> KO-A subline의 특성
KO-A 세포는 현미경 상에서 암세포처럼 과성장을 보여준다(도 14A). 단일세포 분리 후 KO-A 세포의 생존율은 정상세포에 비해 2배 이상 높았다(도 14B). 반면, 20 계대 이상된 KO 세포는 약간의 높은 생존율을 보였다. Live image 관찰을 통해 KO-A 세포의 높은 생존율을 확인하였다(도 15, Live image 결과 생략). 이러한 형질은 지속적으로 활성을 가진 MEK이나 MEK-ERK2를 발현하는 세포의 과성장이나 transformation과 일치한다. 형광 confocal 현미경으로 관찰한 결과, 콜로니 중심 부위에서 높이가 증가했을 뿐만 아니라 중심부와 외곽의 경계선 부위에 FA ring 구조가 관찰되었다(도 14C-D). 이 링 구조 밖에 있는 세포들은 콜로니 가운데 쪽으로의 방향성을 보였다. Western blot data는 KO세포는 WT에 비해 2배 정도 높은데 반해, KO-A 세포의 ERK 활성은 WT에 비해서는 5배가 높음을 보여주었다. 분화경향성, 생존율, ERK 활성 측정 결과는 KO 세포에서는 ERK 활성에 대해 어느 정도 피드백 조절이 회복된 것처럼 보이는 반면 KO-A에서는 그렇지 못한 것을 보여준다.
<실험예 8> 고찰
세포외부로부터의 자극에 반응하는 것은 살아있는 생물체에게 필수적이다. 세포 수준에서 이러한 반응을 측정하는 것은 대부분 생존성, 형태성, 이동성에 제한된다. 비록 정량화가 어렵긴 하지만 전분화능줄기세포는 분화경향성이라는 또다른 특징을 측정해 볼 수 있다. 이전에 본 발명자들은 5% FBS와 RNA-seq 방법을 이용하여 분화경향성을 정량화 할 수 있는 방법을 개발하였다. 여기서 본 발명은 그 방법이 이러한 반응을 측정하는데 마커로 사용될 수 있도록 정량화 할 수 있는 예를 제시한다.
세포분리는 인간 전분화능줄기세포에게는 치명적인 자극이다. 이는 대부분의 분리된 단일 세포는 ROCK의 의한 세포막의 blebbing에 의한 세포사멸에 이르기 때문이다. 따라서, ROCK 저해제는 그 효과의 발견 이래로 인간 전분화능줄기세포를 계대하는데 폭넓게 이용되어 오고 있다. ROCK의 활성은 상위 effector인 small GTPase인 Rho에 의존한다. Rho는 또한 YAP/TAZ 신호전달경로를 통해 인간 전분화능줄기세포의 장기간의 증식과 생존에 영향을 미친다. 하지만 다른 신호경로가 이 치명적인 자극에 어떻게 반응하는지는 불분명했다.
ERK는 extracellular signal-regulated kinase로 밝혀진 것처럼 외부 자극들에 대한 긴급한 반응에 최첨단에 있는 분자이다. 배아줄기세포에서 ERK 신호는 self-renewal과 분화에 필수불가결하다. 하지만 전분화능줄기세포에서 ERK의 역할은 다소 불분명한 부분들이 있다. MEK 저해제로 ERK 신호를 억제하면 쥐의 배아줄기세포는 naive 상태에 머물게 되는데 반해, 인간 전분화능줄기세포는 분화한다.
본 발명에서는 인간 전분화능줄기세포가 세포분리에 대해 어떻게 반응하는지 보기 위해 유전자발현을 비교했다. 이 비교로부터 본 발명은 인간 전분화능줄기세포에서 세포분리는 즉각적으로 ERK 신호전달 경로를 활성화시키는 것을 밝혔다. FAK와 ROCK에 의한 독립적인 ERK 활성화 저해는 이 활성화에 최소한 두가지 경로가 있음을 시사한다: 하나는 세포분리에 의해 focal adhesion으로 분리된 FAK를 거치고; 다른 하나는 ROCK을 통해서이다. 두 신호는 MEK과 ERK에서 합쳐지는 것으로 보인다. ERK가 epithelial-to-mesenchymal transition (EMT)의 핵심 중개자 중 하나이고, mesenchymal 세포는 배아 발생단계나 종양의 진행 동안에 세포 분리와 같은 악조건에서 살아남을 수 있다는 것을 고려하면 세포분리에 의한 빠른 ERK 활성화는 세포의 mesenchymal 성질을 즉시 증가시킴으로써 생존율을 증가시킬 가능성이 있다. 특히 RSK의 활성화는 RSK가 epithelial 세포의 invasive phenotype을 위한 ERK 신호전달경로에서 principal effector라는 점을 고려하면 더욱 그렇다. 하지만 DUSP6 결손에 의해 증가한 ERK 활성은 domainant RAF가 다른 종류의 epithelial 세포에서 한 것처럼 콜로니를 부수고 세포가 흩어질 정도로 충분한 mesenchymal 형질을 만들진 못했다. 이는 인간 전분화능줄기세포의 세포-세포 간 접합이 다른 epithelial 세포들에 비해 강하거나 DUSP6의 결손만으로는 다른 피드백 조절 때문에 충분히 ERK를 활성화시키지 못했을 수 있다. 쥐의 초기 배아에서 primitive streak의 FGF signaling은 gastrulation 단계에서 중배엽을 형성하는 데 통합적인 역할을 한다. 더욱이, 암세포의 epithelial-mesenchymal 조절에서 ERK-DUSP6 signaling의 역할도 잘 알려져 왔다. 특히 DUSP6는 endometrial adenocarcinoma에서 EMT를 저해하는 것으로 알려져 있다. Micropatterned 배양에서 인간 배아줄기세포는 콜로니 경계지역에서 높은 ERK 활성도를 보였는데 이 부분은 SNAIL과 같은 중내배엽 마커가 분화 시 증가하였다. 그러므로, DUSP6는 ERK의 basal 활성을 조절함으로써 mesenchymal 상태로부터 epithelial 특성을 회복시키는 역할을 할 가능성이 있다.
FAK 또한 intestine epithelial 세포나 간세포와 같은 다른 종류의 세포에서 EMT에 관여하는 것으로 알려져 있다. Lineage specification 측면에서 인간 전분화능줄기세포의 mesenchymal property와 중배엽으로의 분화경향성 간에는 밀접하게 연관되어 있을 가능성이 높은데, 이는 SNAIL과 TWIST와 같은 mesenchymal 특성을 가진 전사인자들이 중배엽 형성에도 역할을 하기 때문이다. 본 발명에서는 또한 콜로니 경계에서 ERK 활성이 FA fence 형성과 관련된다는 것을 발견하였다. 경계지역에서 ERK 활성은 ROCK-myosin에 의한 기계적인 스트레스로 인해 발생하는 것으로 보이는데 이는 콜로니 가장자리의 FA fence 형성이 ROCK 활성에 의존하기 때문이다. 이와 같은 콜로니에서 ERK 패턴은 Rosowski가 보여준 콜로니의 가장자리와 중심에서의 분화능이 다른 현상에 대한 설명이 될 수 있을 것이다.
DUSP6KO 세포를 20계대 이상 계대하면 대부분의 세포는 ERK 신호에 대한 피드백 조절을 회복하는 것처럼 보이지만, 한 subline은 높은 기본 ERK 활성을 유지하고 있었고 중배엽과 내배엽으로 고정된 분화경향성을 가지고 transformed 과성장 능력을 획득하였다.
이러한 새로운 발견들에 기초해서 본 발명은 생존과 회복력에 대한 모델을 제시하고자 한다: 세포분리에 의해 활성화되는 ERK 신호는 전분화능줄기세포의 mesenchymal 특성을 높이고, 이는 모든 lineage로 동일하게 분화할 수 있는 분화능을 대가로 생존율을 높인다. 생존한 세포는 지속적인 DUSP6 발현을 통해 ERK 기초 활성을 낮춤으로써 원래의 분화경향성을 회복한다(도 14G).
Anoikis는 세포-세포 또는 세포-세포외기질의 접합이 파괴될 때 야기되는 세포자살(apoptosis)의 한 형태이다. 인간 전분화능줄기세포가 단일세포로 분리된 후에 죽는 것은 분명히 anoikis의 한 형태이다. RAS/MAPK 신호전달 경로는 pro-survival 신호로서 anoikis 저항성에 관련된 것으로 알려져 왔다. 인간 전분화능줄기세포의 세포분리 시 ERK와 ROCK의 동시 활성화는 세포-세포 세포-기질 접합의 파괴는 pro-survival과 pro-apoptotic 신호를 동시에 활성화시킴을 보여준다. Pro-survival 신호는 이후에 DUSP6를 포함한 피드백 조절에 의해 빨리 down-regulation된다. 이 피드백은 ERK 활성화가 종료된 이후에도 지속함으로써 신호의 기초 레벨을 낮춰 평등한 분화능을 포함한 원래 상태를 회복할 수 있도록 한다. 이러한 생존과 원래상태로의 회복을 위한 세포의 능력은 분명히 일종의 세포회복력(cellular resilience)이다. 이러한 회복력이 적절히 작동하지 않으면 인간 전분화능줄기세포는 KO-A와 같이 치우친 분화경향성을 가진 암세포처럼 영원히 transformed될 수 있다. 따라서, DUSP6는 단순히 ERK의 기초 활성을 위한 피드백 조절자일 뿐만 아니라 원래 상태를 회복할 수 있도록 시간을 주기 이전의 경험에 대한 기억으로써도 역할을 한다.
임상적용을 위한 좋은 품질의 측면에서 축적되고 있는 증거들은 계대 방법이 유전체의 안정성에 영향을 준다는 것을 밝히고 있다. 하지만, GMP 환경에서 기계적인 계대방법은 적용하기 어려운데 그 이유는 공기 노출을 최소화하기 위해서 배양접시 보다는 플라스크를 사용할 것을 요구하고 있기 때문이다. 따라서 본 발명에서는 장기간 동안 EDTA나 효소를 이용한 계대 방법이 유전체 안정성에 어떤 영향을 주는지 조심스럽고 철저하게 관찰할 필요가 있다. ERK 1/2 유전자의 결손은 쥐 배아줄기세포에서 유전체 이상을 유발하는 것으로 알려져 있기 때문에 ERK 활성을 적절히 조절하는 것이 유전체 안정성을 위해 필요할 것으로 보인다. 그리고 ROCK은 mitotic spindle의 조직에 관여하고 있기 때문에 세포 분리에 의한 세포사멸을 억제하기 위해 그 저해제를 장기간 처리하는 효과에 대해서도 모니터링이 필요하다.
요약하면 본 발명은 ERK-DUSP6 signaling loop을 전분화능줄기세포의 세포 회복력과 연결함으로써 외부 자극에 대한 세포의 반응에 대한 하나의 통찰을 제공한다.
<110> KDCA <120> DUSP6 deficient stem cells and their use <130> M22-0000 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DUSP6_RG1 <400> 1 atttccgacg cgaagggcac ggg 23 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DUSP6_RG2 <400> 2 gatcgccatt tccgacgcga agg 23 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DUSP6_RG3 <400> 3 agcgccgggt gaagcggtcc cgg 23 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DUSP6_RG4 <400> 4 cgagaatacg ggcggcgagt cgg 23

Claims (15)

  1. DUSP6(dual specificity phosphatase 6)가 결핍된 줄기세포.
  2. 제1항에 있어서, 상기 결핍은 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하는 것을 특징으로 하는 줄기세포.
  3. 제2항에 있어서, 상기 CRISPR/Cas9 시스템은 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 단일 가이드 RNA(single guide RNA)를 포함하는 것을 특징으로 하는 줄기세포.
  4. 제1항에 있어서, 상기 줄기세포는 인간 역분화줄기세포 또는 인간 배아줄기세포로부터 유래한 것을 특징으로 하는 줄기세포.
  5. DUSP6(dual specificity phosphatase 6)가 결핍된 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 세포치료제
  6. DUSP6(dual specificity phosphatase 6)가 결핍된 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 조직재생용 조성물
  7. DUSP6(dual specificity phosphatase 6)가 결핍된 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 심장질환 예방 또는 치료용 조성물
  8. 제7항에 있어서, 상기 심장질환은 심근경색, 심부전 및 허혈성 심장질환으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 심장질환 예방 또는 치료용 조성물
  9. 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 가이드 RNA(guide RNA); 및 Cas9 단백질을 도입하는 단계를 포함하는 DUSP6(dual specificity phosphatase 6)가 결핍된 줄기세포 제조방법
  10. 제9항에 있어서, 상기 도입은 전기천공으로 수행하는 것을 특징으로 하는 줄기세포 제조방법
  11. DUSP6(dual specificity phosphatase 6)가 결핍된 줄기세포를 마트리겔(matrigel) 코팅 세포배양 접시에서 배양하는 단계;
    ROCK 억제제(rho kinase inhibitor)를 첨가하여 배양하는 단계;
    심근세포 분화 배지에서 배양하는 단계;
    GSK-3 억제제(glycogen synthase kinase-3 inhibitor) 및 Wnt 억제제를 첨가하여 배양하는 단계;
    L-락트산을 포함하는 심근세포 분화 배지를 사용하여 분화된 심근세포를 대사적으로 선택하고 정제하는 단계;를 포함하는 DUSP6가 결핍된 줄기세포를 심근세포로 분화시키는 방법
  12. 제11항에 있어서, 상기 심근세포 분화 배지는 소혈청 알부민 및 아스코르브산이 보충된 RPMI1640인 것을 특징으로 하는 DUSP6가 결핍된 줄기세포를 심근세포로 분화시키는 방법
  13. 제11항에 있어서, 상기 ROCK 억제제는 Y-27632; 상기 GSK-3 억제제는 CHIR99021; 및 상기 Wnt 억제제는 C59인 것을 특징으로 하는 DUSP6가 결핍된 줄기세포를 심근세포로 분화시키는 방법
  14. 서열번호 4로 표시되는 단일 가이드 RNA.
  15. 제14항의 따른 단일 가이드 RNA 및 Cas9를 조합하여 포함하는 CRISPR/Cas9 시스템.
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Biochem Biophys Res Commun. 2009;378(2):319-323.
Biochem Biophys Res Commun. 2020;521(2):375-382.

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