CN111868078A - 使用wnt激动剂和生物活性脂质用于生成和扩增心肌细胞的试剂和方法 - Google Patents

使用wnt激动剂和生物活性脂质用于生成和扩增心肌细胞的试剂和方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了用于扩增搏动的心肌细胞的方法，包括用一种或多种Wnt激动剂、一种或多种生物活性脂质或一种或多种Wnt激动剂与一种或多种生物活性脂质的组合处理搏动的心肌细胞。本发明提供了用于将包括iPS细胞的干细胞分化为搏动的心肌细胞的方法，包括用一种或多种Wnt激动剂与一种或多种生物活性脂质的组合处理iPS细胞。本发明提供了用于再生医学的组合物和试剂盒，其包含搏动的心肌细胞、一种或多种Wnt激动剂和一种或多种生物活性脂质。

Description

使用WNT激动剂和生物活性脂质用于生成和扩增心肌细胞的 试剂和方法
本发明是在美国国立卫生研究院授予的NIH基金LM012179和U01 HL099776的政府支持下完成的。美国政府享有本发明的某些权利。
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年3月16日提交的美国临时专利申请62/644,091的优先权权益，其全部公开内容通过引用并入本文。
发明领域
本发明涉及用于扩增搏动的心肌细胞的试剂、组合物和方法。本发明还涉及用于从包括iPS细胞的各种干细胞产生心肌细胞的组合物和方法。本发明还涉及其中可以使用这些心肌细胞的各种应用，包括心脏病的治疗和高通量药物筛选、心脏疾病建模、精密医学和再生疗法。
背景
心肌梗塞(MI)后，人的心脏可能会失去大约十亿个心肌细胞(CM)，从而导致急性心脏功能障碍，并使患者处于发展慢性心力衰竭的风险中。已证明，成年哺乳动物心脏表现出有限的自身再生能力，并且目前的治疗方法(包括注射hiPSC-CM或使用工程化的心脏组织创建心脏补片)受到移植后细胞死亡和细胞受体中心律不齐的困扰((Beltrami等人,2001；Chong等人,2014；Senyo等人,2013)。不同于成年CM，胎儿CM是增殖性的并经历充分的有丝分裂，这解释了胚胎发育过程中的指数性心肌生长(de Boer等人,2012；Risebro等人,2015)。虽然新生儿心脏具有在各种形式的损伤后再生的能力，但这种能力在出生后不久即丧失，导致成年期受损时心肌质量的显著和永久性丧失((Foglia and Poss,2016；Laflamme and Murry,2011；Porrello等人,2011；Uygur and Lee,2016)。
据计算，成年心脏的年CM周转率不到2％，因此，人的心脏通常被认为是有丝分裂后的器官(Bergmann等人,2009；Goldstein等人,1974；Senyo等人,2013)。胎儿CM的充分自我复制特性随着进行性成熟而逐渐降低(Bruneau，2013；Srivastava，2006)。一致地，这种生物学在体外使用hiPSC-CM概括。尽管心肌祖细胞可以轻松扩增，但一旦它们已定向于CM谱系，它们就会迅速丧失其增殖能力并增加肌节组织(Birket等人，2015；Burridge等人，2012；Mauritz等人，2008；Zhang等人，2009；Zhang等人，2016)。多能干细胞的心脏分化涉及多种胚胎途径(Kattman等人，2011；Lee等人，2017；Paige等人，2010；Protze等人，2017；Yang等人，2008)。特别地，Wnt信号传导在心肌细胞发育的多个不同阶段中起关键作用，并且对于心脏特化、生长和分化是必需的。早期，需要抑制Wnt信号传导才能使中胚层特化成为心脏祖细胞(Foley和Mercola，2005；Schneider和Mercola，2001)。在特化后，第二心区多能祖细胞在刺激Wnt信号传导途径后自我复制，并随后在Wnt信号传导终止后分化为心脏的三种心血管谱系(Cohen等人，2007；Kwon等人，2009；Lin等人，2007；Qyang等人，2007)。最终，一旦形成心脏，Wnt信号传导在紧凑型心肌层中仍然保持显著活跃，以促进心肌生长(Buikema等人，2013；Ye等人，2015)。从这些体内早期发育研究中获得的知识已转化为可重现的方法，其用于从多能干细胞来源体外有效生成CM。当前针对hiPSC的定向分化方案已将Wnt调节的简化形式与Wnt信号传导的早期、小分子介导的激活和随后的后期Wnt抑制相结合以随后诱导高纯度的CM(Burridge等人，2014；Lian等人，2012；Lian等人，2013；Paige等人，2010)。但是，该领域的主要限制仍然是无法有效扩增和传代已定向的CM，以生成组织工程化或真正的再生方法所需的数量。
成年哺乳动物的心肌细胞具有有限的细胞分裂能力(Sharma等人，2015)。放射性碳测年研究表明，在成年人心脏中，基线时的年细胞周转率不到0.5％(Bergmann等人，2009)。因此，哺乳动物成年心脏的再生不能补偿例如心肌梗塞的心脏损伤后心肌细胞的大量损失，从而导致不良的心脏重构。人心脏的这种有限的再生能力已经获得了对于开发用于从头创建心肌细胞和诱导最终分化的心肌细胞的增殖的新方法的浓厚兴趣。
人多能干细胞研究的主要目标是提供大量适用于再生医学细胞疗法的心肌细胞(Chuang等人，2011；Laflamme等人，2011；Serpooshan等人，2017；Li等人，2016)。与十年前相比，人多能干细胞心脏分化的方案得到了极大的改善。当前的方案可以在分化然后进行代谢选择的过程中获得超过90％纯的心肌细胞，这可以通过使用CRISPR/Cas9基因编辑以将选择标志物引入hiPSC来进一步增强(Lian等人2012；Sharma等人2018)。最新的策略是使用双相Wnt/β-联蛋白调节用于从人诱导的多能干细胞(hiPSC)直接进行心脏分化(Burridge等人，2014；Lian等人，2013)。为了模拟体内中胚层诱导所需的发育性Wnt信号传导，首先用非选择性糖原激酶3β(GSK3β)抑制剂CHIR99021(CHIR)处理hiPSC，然后用Wnt/β-联蛋白抑制剂处理以促进心脏细胞分化。
近年来，越来越多的证据支持溶血磷脂(一种具有多种功能的生物活性脂质的集合)是体外干细胞分化和体内心血管发育的重要调节剂(Kleger等人，2011)。在这些生物活性脂质中，鞘氨醇-1-磷酸(S1P)和溶血磷脂酸(LPA)是主要成员(Kleger等人，2011)。
体内研究已证明在小鼠正常心脏发育过程中心肌细胞中经由S1P受体的S1P信号传导的必要作用(Clay等人，2016)。体外研究表明，这些信号分子能够调节人胚胎干细胞的多能性和细胞周期活性(Avery等人，2008；Garcia-Gonzalo等人，2008)。
还据报告，生物活性脂质还通过其刺激重要的细胞信号途径(例如MAPK/ERK途径、Hippo途径、Wnt/β-联蛋白信号途径)的能力而在上皮细胞、成纤维细胞和各种癌细胞系的细胞增殖中发挥作用(Harvey等人，2013；Marinissen等人，2001；Oskouian等人，2007；Yang等人，2005)。
美国专利9,074,188和美国专利公开2013/0244262公开了在培养物中产生心肌细胞的方法。
然而，尽管有最近的进展，但分化效率仍存在明显的批次间变化，因为不同的hiPSC细胞系(即使是来自同一个体的那些)可其在重复产生心肌细胞的能力上不同。因此，仍然需要具有一致的高效率的体外hiPSC-CM产生方案。
概述
一方面，本公开内容提供了用于扩增搏动的心肌细胞的方法，该方法包括用WNT激动剂、生物活性脂质和/或WNT激动剂与生物活性脂质的组合处理搏动的心肌细胞。搏动的心肌细胞可以是人心肌细胞。该处理可以在体外进行。该方法可以进一步包括在处理搏动的心肌细胞的步骤之前，将多能干细胞分化为搏动的心肌细胞的步骤。多能干细胞包括胚胎干细胞、间充质干细胞、心肌祖细胞和/或诱导多能干(iPS)细胞。WNT激动剂包括GSK3β抑制剂。一种优选的GSK3β抑制剂是CHIR99021。优选的生物活性脂质包括鞘氨醇-1-磷酸(S1P)和/或溶血磷脂酸(LPA)。本发明的用于扩增搏动的心肌细胞的方法可以包括用CHIR99021、BIO、Wnt3A、Wnt3A+R-spondin、Wnt替代物ScFv-DKK1c、ScFv-DKK1c+R-spondin和/或其任何组合来处理搏动的心肌细胞。可以处理搏动的心肌细胞1天至120天的时间。
在一些实施方案中，扩增搏动的心肌细胞的方法包括通过将WNT激动剂和/或生物脂质添加至组织培养基中来处理搏动的心肌细胞，其中对于每种生物活性脂质以1至50μM的终浓度、对于CHIR99021或BIO以1至50μM的终浓度、以及对于重组WNT激动剂Wnt3A、Wnt3A+R-spondin、Wnt替代物ScFv-DKK1c、ScFv-DKK1c+R-spondin和/或其任何组合以1至500ng/mL的终浓度添加至组织培养基中。
本公开内容的其他方面包括用于从多能干细胞产生搏动的心肌细胞的方法。这些方法包括用至少一种生物活性脂质和至少一种WNT激动剂处理多能干细胞。多能干细胞可以是人细胞。多能干细胞可以是胚胎干细胞、间充质干细胞、心肌祖细胞和/或诱导多能干(iPS)细胞。WNT激动剂可以是GSK3β抑制剂。一些优选的生物活性脂质是鞘氨醇-1-磷酸(S1P)、溶血磷脂酸(LPA)及其组合。优选的WNT激动剂包括CHIR99021、BIO、Wnt3A、Wnt3A+R-spondin、Wnt替代物ScFv-DKK1c、ScFv-DKK1c+R-spondin和/或其任何组合。可以在1小时到10天的时间内处理多能干细胞。
在本发明的用于从多能干细胞产生搏动的心肌细胞的方法的一个优选实施方案中，通过将S1P和LPA各自以1至50μM的终浓度、对于CHIR99021或BIO以1至50μM的终浓度、以及对于重组WNT激动剂Wnt3A、Wnt3A+R-spondin、Wnt替代物ScFv-DKK1c、ScFv-DKK1c+R-spondin和/或其任何组合以1至500ng/mL的终浓度添加至组织培养基中来处理多能干细胞。
本公开内容还提供了一种获得人心肌细胞的方法，该方法包括：
通过双相Wnt信号传导方案将hiPS细胞分化为搏动的心肌细胞，其中在方案的第一阶段的任何时间期间用至少一种Wnt激动剂和至少一种生物活性脂质处理hiPS细胞，和其中在方案的第二阶段期间用至少一种Wnt拮抗剂进一步处理细胞，从而获得搏动的心肌细胞；和
通过用至少一种生物活性脂质、至少一种Wnt激动剂及其任何组合处理搏动的心肌细胞来扩增搏动的心肌细胞。
其他方面包括通过本发明的任何方法和药物筛选方法产生的人搏动心肌细胞，其中使人心肌细胞与药物接触，然后监测药物对人心肌细胞的作用。
其他方面包括治疗患有心脏病的患者的方法。该方法包括将通过本方法获得的心肌细胞直接施用至患者的心脏。心脏病包括由先天性心脏病、由心肌梗塞、由心脏毒性剂例如蒽环类药物、酪氨酸激酶抑制剂和用于癌症疗法的免疫检查点抑制剂、由环境暴露例如酒精、细菌例如引起恰氏病或莱姆病的细菌、引起心肌炎的病毒或由遗传性/世袭性心肌病引起的心力衰竭。在治疗方法中，心肌细胞可以通过施加在患者的心脏上的贴剂施用至患者。
治疗患有心脏病的患者的其他方法包括这样的方法，其包括向该患者施用至少一种Wnt激动剂、Wnt替代物、生物活性脂质和/或其组合。
其他方面提供了治疗患有心脏病或血管疾病的患者的方法，该方法包括施用包含通过本方法获得的心肌细胞的组织工程化血液泵。
附图的简要说明
图1A-1I显示，Wnt信号传导刺激搏动的hiPSC-CM的大规模扩增和长期传代。(A)hiPSC-CM扩增和传代的示意性时间表。(B)hiPSC-CM从第0代(P0)的初始10cm2汇合培养皿扩增到后续传代的多个汇合T-175cm2细胞培养瓶的代表性图像。(C)每次传代时hiPSC-CM的总表面积(cm2)覆盖率。(D)每次传代时在存在CHIR或DMSO(CTR)的情况下，汇合的hiPSC-CM的代表性明视野图像。将相同的稀释系数应用于两种处理条件。(E)从P0到P5的细胞总数的定量。(F)用DMSO(CTR)或CHIR处理的hiPSC-CM在P3时的TnT表达的免疫荧光分析。(G)在每次传代时CHIR处理的细胞相对DMSO处理的细胞中TnT+细胞的倍数增加。(H)在CHIR处理的细胞中TnT表达的代表性流式细胞术图。(I)从(H)中的流式细胞术分析定量TnT+细胞的百分比。比例尺代表100μm，数据为平均值(n＝3-5)±误差棒，误差棒指示标准偏差，*p<0.05。
图2A-2K报告了通过Wnt信号传导对hiPSC-CM增殖窗口的延长。(A)在分化的第12天(P0)开始的每次传代时的hiPSC-CM的免疫荧光显微图像。心肌肌钙蛋白T(TnT)。(B)用CHIR或DMSO(CTR)处理后，TnT+细胞中ki67的表达(一种细胞周期指数)。(C)在CHIR或CTR处理的TnT+细胞中pHH3的表达(一种增殖指数)。(D)在有丝分裂的不同阶段用CHIR处理的hiPSC-CM的代表性共聚焦显微镜图像。(E)在来自(D)的不同的有丝分裂期中对增殖性hiPSC-CM的定量。(F)在经历胞质分裂的TnT+细胞中Aurora B激酶表达的免疫荧光图像。(G)定量随后用CTR、CHIR或C59处理另外6天的CHIR处理的P3细胞的双核hiPSC-CM百分比(作为总CM百分比)和(H)ki67表达。(I)用CTR、CHIR或C59处理24小时(24h)的P0 hiPSC-CM的免疫荧光图像。(J)从(I)中所述的实验中定量ki67表达(即细胞周期指数)作为总hiPSC-CM的百分比。(K)从(I)中描述的实验中在hiPSC-CM中使用TOPFlash萤光素酶报告了基因评估经由TCF/LEF的经典Wnt信号传导。注意在存在CHIR的情况下TCF/LEF活性急剧增加。比例尺代表100μm，数据为平均值(n＝3-5)±误差棒，误差棒指示标准偏差，*p<0.05。
图3A-3M报告了在Wnt刺激后hiPSC-CM的表型评估。(A)用DMSO(CTR)、CHIR(2.0μm)或CHIR和随后C59(CHIR>C59)处理并针对肌钙蛋白T(TnT)和α-肌节肌动蛋白(α-SA)免疫染色的微模式化表面上的P3 hiPSC-CM的共聚焦显微镜图像。(B)肌节纤维排列的自动定量。垂直轴定义为零度。(C)定量以指定的角度取向的肌节面积的百分比。(D)在(A)中处理的细胞中的收缩性测量。(E)hiPSC-CM的代表性动作电位追踪。数据代表第28天(D28)的hiPSC-CM的膜电位[Em]变化。(F)代表第28天各组的90％复极(ADP90)和最大舒张电位(MDP)中的动作电位持续时间(APD)的图。(G)第28天在hiPSC-CM中相对于基线[F/[F0]表达的Ca2+瞬时(Fluo-4AM)荧光。(H)显示每个组的衰减tau的图。在D28、D35、D42和D49扩增CM的肌节基因(I)、电生理基因(J)和代谢基因(K)表达的倍数增加。在D28之后，细胞继续用CHIR处理、停用或用C59处理。(L)用CHIR、CTR和CHIR>C59处理的P3 CM中MLC2V和TnT的免疫组织化学。(M)MLC2V和TnT阳性细胞的百分比。比例尺代表100μm，数据为平均值(n＝3-5)±误差棒，误差棒指示D、E、G和H中的SEM以及J和L中的标准偏差，*p<0.05。
图4A-4K报告了在Wnt信号传导的获得和丧失之后hiPSC-CM的单细胞RNA测序分析。(A)已用DMSO CTR(灰色)、CHIR(黄色)或C59(黑色)处理24小时的第12天hiPSC-CM的t-SNE图。(B)来自(A)中三个组的显著差异表达基因的热图。(C)Wnt靶基因的表达。(D和E)增殖基因的表达。注意在CHIR处理的细胞中它们的表达增加。(F)t-SNE图显示了来自(A)的单个hiPSC-CM的无监督聚类。(G)在无监督聚类中差异表达基因的热图。(H)用于途径富集分析的每个聚类的基因。(I)单个hiPSC-CM的心室标志物的表达。(J)心房标志物细胞的表达。(K)心室成熟标志物的表达。对于所有显示的图，基因代表p<0.01。
图5A-5K报告了GSK3β抑制作用调节有丝分裂所需的AKT激酶的磷酸化。(A)TnT阳性细胞的细胞计数表示为随着CHIR处理的倍数增加。(B)用所示抑制剂处理24小时后的TOPFlash萤光素酶TCF/LEF分析。(C)针对指定抑制剂的基因表达。(D)用CHIR(CHIR99021)抑制GSK3和用PNU74654抑制下游经典Wnt信号传导的示意图。(E)显示用CHIR处理43个经筛选的磷酸化靶标后具有显著改变的磷酸化水平的激酶的图。(F)在存在或不存在CHIR的情况下培养100分钟的细胞中pAKT T308的蛋白质印迹分析。(G)代表pAKT蛋白表达的图。(H)在用所示处理培养6天的第12天hiPSC-CM中pAKT T308的免疫荧光分析。每种处理的TnT(I)和pAKT T 308(J)细胞数量的定量表示为相对于对照的倍数。(K)用指定的处理进行处理24小时后的TOPFlash萤光素酶TCF/LEF分析。比例尺代表100μm，数据为平均值(n＝3-5)±误差棒，误差棒指示标准偏差，*p<0.05。
图6A-6E报告了Wnt受体-配体诱导CM细胞周期再激活。(A)用于研究细胞周期的hiPSC-CM的时间点的示意图(B)用Wnt3A、scFv-DKK1c+RSPO或H2O对照(CTR)处理的第12天CM的代表性图像。(C)TnT阳性细胞数量的定量显示为相对于CTR的倍数增加。(D)针对所列处理的D66 CM的免疫荧光分析。(E)在第66天有丝分裂的CM中的倍数增加。比例尺代表100μm，数据为平均值(n＝3-5)±误差棒，误差棒指示标准偏差，*p<0.05。
图7A-7G报告了Wnt替代物促进心肌生长。(A)Wnt替代物处理或CTR的12周龄小鼠的代表性图像。(B)显示心脏重量体重比的图。(C)在3个心室水平上的苏木精和伊红(H&E)染色。(D)显示以μm为单位的LV尺寸和(E)壁厚的图。(F)小麦胚芽凝集素(WGA)和dapi(DNA)的免疫荧光分析。(G)显示相对细胞数和以μm为单位的细胞大小的图。比例尺在A和C中代表1000μm、在F中代表100μm，数据为平均值(A中n＝3，C和D中n＝6，E-H中n＝4)±误差棒，误差棒指示标准偏差，*p<0.05。
图8A-8C报告了hiPSC心脏分化的基因表达分析。(A)在hiPSC-CM分化过程中多能、心脏中胚层、心脏祖细胞和心肌转录因子表达。虚线表示从第12天到第14天用2.0μM CHIR处理的样品中的基因表达。显示了在用CHIR或DMSO(CTR)处理的第14天hiPSC-CM中ISL1(B)和胱天蛋白酶3(C)表达的免疫荧光图像。
图9A-9B报告了在Wnt刺激下hiPSC-CM增殖的表型分析。(A)在用CHIR或DMSO(CTR)处理后的不同传代中，hiPSC-CM中TnT和pHH3表达的免疫荧光图像。(B)在微模式底物上在第3代(P3)时CTR和CHIR处理的hiPSC-CM中的TnT pHH3表达的免疫荧光图像，表明在CHIR处理但非在CTR处理的细胞中在有丝分裂的不同阶段存在杂乱无章的肌节结构和多个hiPSC-CM。
图10报告了心脏基因表达的实时定量PCR分析。收获在头两个月用或不用CHIR处理的三个月年龄的hiPSC-CM，用于心脏基因表达的qPCR分析。
图11A-11C报告了使用CHIR处理的hiPSC-CM产生3D心脏组织。(A)封装在胶原基水凝胶中并体外培养7天的CHIR处理的hiPSC-CM的明视野图像。(B)显示(A)中的工程化心脏组织中的组织化的肌节和Cx43间隙连接蛋白的表达的免疫荧光图像。(C)用所示起始数量的CHIR处理的hiPSC-CM产生的3D心脏构建体中的搏动区域的数量和收缩速度的定量。
图12A-12E报告了先前扩增的CM被用于创建功能性3维心脏组织。
图13报告了用CHIR传代3次的hiPSC-CM中pAKT T308和TnT的免疫组织化学。
图14A-14B报告了(A)用Wnt替代物、scFv-DKK1c或媒介物对照(CTR)处理的8周龄小鼠心脏的图像。(B)8周龄小鼠心脏中平滑肌肌动蛋白、DNA和WGA膜染色的共聚焦图像。
图15A-15C报告了96孔分化，其举例说明了当与Wnt激活剂CHIR99021同时添加时hiPSC-心肌细胞分化的S1P/LPA介导的增强。A)本研究中使用的“常规”化学上确定的心脏分化方案的图示。在hiPSC-CM分化过程中的不同时间点添加S1P/LPA。B)两个不良分化性hiPSC细胞系的基于2D单层的化学上确定的分化为心肌细胞的绿色的心肌钙蛋白T(TnT)和蓝色的核DNA的代表性96孔免疫荧光图像。在96孔板的形式中对分化后第8天的hiPSC-CM进行染色。在hiPSC-CM分化过程中，将S1P、LPA或两者添加0-2、4-6或6-8天。C)总计的TnT阳性细胞数量的定量表示为当添加S1P、LPA或两者时每个时间点的TnT阳性细胞的百分比。误差棒指示标准偏差。*表示相对于对照，p＜0.05。实验是在2个不同的hiPSC细胞系中以3-6次重复进行的。
图16A-16E报告了在从hiPSC的早期心脏分化过程中，生物活性脂质S1P和LPA增强β-联蛋白的核累积并激活Wnt信号传导。A)用DMSO、小分子GSK3β抑制剂/Wnt活化剂CHIR99021(CHIR)、生物活性脂质S1P+LPA或CHIR+生物活性脂质对hiPSC处理2小时后，β-联蛋白(绿色)、多能性标志物Nanog(红色)和DAPI(DNA)(蓝色)的免疫荧光。箭头指示细胞表现出特征性的β-联蛋白核累积。B)β-联蛋白染色的定量表示为针对DMSO对照标准化的处理组的核强度相对细胞质强度。C)用TOPFlash Wnt途径活性报告物转染hiPSC和用CHIR、S1P/LPA或两者进行2小时处理后的萤光素酶发光强度表示相对于DMSO对照的倍数增加。D)举例说明在hiPSC的情况下连接生物活性脂质和Wnt/β-联蛋白信号传导途径的信号传导级联的模型。在hiPSC上用S1P/LPA处理可将β-联蛋白从粘附连接和E-钙黏着蛋白上解离，从而增加了可用于下游信号传导和基因转录的整体β-联蛋白库。使用GSK3β抑制剂CHIR进行治疗可释放β-联蛋白并增加整个细胞内β-联蛋白池，用于下游信号传导和基因转录。E)微阵列分析，显示在用小分子GSK3β抑制剂/Wnt激活剂CHIR处理或不使用生物活性脂质S1P/LPA的hiPSC处理48小时后，基因表达的关键变化。显示了用生物活性脂质处理后上调(红色)和下调(蓝色)的基因的列表。实验进行了3-4次生物学重复。
图17A-17E报告了生物活性脂质S1P/LPA在早期心脏分化过程中迅速改变hiPSC形态并增强波形蛋白的表达。A)用S1P和LPA处理24小时的hiPSC的免疫荧光和相衬图像。钙黄绿素AM染料染色整个细胞体的膜。B)用DMSO或S1P与LPA的组合处理的hiPSC的以μm显示的细胞直径定量。C)在用DMSO或S1P/LPA处理24小时后，对3个独立的hiPSC细胞系进行标准化细胞计数。N＝3个生物学重复实验。误差棒指示SEM。D)用DMSO、GSK3β抑制剂CHIR99021(CHIR)、生物活性脂质S1P+LPA或组合处理hiPSC 48小时后的免疫荧光染色。中间的丝状蛋白波形蛋白(绿色)标记上皮到间充质的过渡，而短尾蛋白(brachyury)(红色)标记早期中胚层。E)对于对照、CHIR、S1P/LPA和组合处理，波形蛋白(VIM)和短尾蛋白T(BRY)阳性细胞的定量表示为总细胞百分比。误差棒指示标准偏差。误差棒代表标准偏差。实验进行了3次生物学重复。*表示P<0.05。每个条件以N＝9个图像定量细胞。
图18A-18G报告了LPA和S1P表现出对hiPSC-CM的细胞周期诱导作用。A)在分化的不同时间点将hiPSC-CM重铺成96孔形式用于下游测定的示意图。B)代表性的图像显示第30天的hiPSC-CM与DMSO、仅S1P/LPA、仅CHIR或CHIR和S1P/LPA一起培养48小时后，以绿色显示的心肌肌钙蛋白T(TnT)、以红色显示的细胞周期活动标志物ki67和以蓝色显示的核染料(DNA)。C)每次处理48小时后ki67阳性心肌细胞的百分比。D)每组处理48小时后的CM总数的标准化细胞计数。E)第30天的hiPSC-CM与DMSO、仅S1P/LPA、仅CHIR或CHIR+S1P/LPA一起培养48小时后，以绿色显示的心肌肌钙蛋白T(TnT)、以红色显示的有丝分裂标志物磷酸组蛋白H3(pHH3)和以蓝色显示的核染料(DNA)的免疫荧光染色。F)不同处理组之间的有丝分裂(pHH3)CM的百分比。G)所示处理组中双核和多核CM的百分比。*表示与对照相比P＜0.05。N＝3个生物学重复。误差棒指示标准偏差。
图19A-19H报告了在具有S1P和LPA的hiPSC-CM中细胞周期的重新激活取决于ERK信号传导。A)用TOPFlash Wnt信号传导途径活性报告因子转染第30天的hiPSC-CM并用CHIR、S1P/LPA或两者进行2小时处理后的萤光素酶发光强度。所示数据代表相对于DMSO对照的倍数增加。B)激酶测定的定量示出响应于0、5、10和30分钟的S1P/LPA处理，hiPSC-CM激酶组磷酸化的改变。数据表示为平均值±SEM。*表示P<0.05。C)在使用和不使用小分子MEK抑制剂曲美替尼、使用和不使用S1P/LPA(各10μM)处理的第30天的hiPSC-CM中进行的代表性激酶测定。标记了对应于ERK磷酸化和抗体对照的斑点。D)在存在或不存在MEK抑制剂曲美替尼的情况下，用S1P和LPA处理的第30天的hiPSC-CM中心肌肌钙蛋白T(TnT)(绿色)、ki67(红色)和核DNA(蓝色)的免疫荧光。E)定量(D)中ki67阳性心肌细胞(CM)的百分比。*表示P<0.001。F)在存在或不存在5μM S1P受体拮抗剂VPC23019的情况下，用生物活性脂质S1P处理的第30天的hiPSC-CM中心肌肌钙蛋白T(TnT)(绿色)、ki67(红色)和核DNA(蓝色)的免疫荧光。G)在有或没有5μM VPC23019的S1P处理后对ki67阳性CM的百分比进行定量。H)模型示出了在分化的hiPSC-CM中生物活性脂质和典型的MAPK/MEK/ERK信号传导途径之间的联系。N＝4。
图20A-20B报告了生物活性脂质S1P和LPA增加核β-联蛋白，但不诱导早期中胚层分化。A)在0、0.5、1、2、4、8、16和24小时(hr)后进行核β-联蛋白累积的时程研究。箭头指示表达浓厚核β-联蛋白的细胞。B)用GSK3抑制剂CHIR99021、生物活性脂质S1P和LPA或DMSO对照培养24小时的hiPSC中多能性标志物Nanog(绿色)、中胚层早期标志物短尾蛋白(红色)和DAPI(蓝色)的免疫荧光。该图表示所列处理的短尾蛋白(Bry)阳性细胞百分比的定量。误差棒指示SEM。*表示P<0.05。N.S.＝不显著。N＝3。
图21A-21B报告了hiPSC-CM在终末分化时表达相关的S1P和LPA受体，并对S1P/PA处理产生反应。A)来自5个不同的hiPSC-CM细胞系的第30天的hiPSC-CM的转录组分析。高TNNT2和低PECAM1分别指示高心肌细胞纯度和低内皮细胞污染。使用IonTorrent Ampliseq转录组图谱进行表达谱分析。误差棒指示SEM。B)生物活性脂质LPA和S1P在终末分化的不同时间点诱导ki67表达。在约第20天的和约第50天的hiPSC-CM中，用S1P和LPA、IGF或DMSO处理48小时后，α-肌动蛋白(绿色)、ki67(红色)和dapi(蓝色)的免疫荧光。
图22A-22D报告了在第30天的hiPSC-CM中运动衍生的收缩参数。A)从高分辨率和频率影像生成的用DMSO、CHIR99021或S1P/LPA处理的第30天的hiPSC-CM的代表性热图，红色＝高速运动，蓝色＝低速运动。图显示收缩频率(跳动数/分钟)B)、收缩变形距离C)和收缩速度D)。数据表示为均值。误差棒指示SEM。
图23A-23B报告了LPA不能增强hiPSC-CM中的YAP核累积。A)在未经处理的hiPSC、hiPSC-CM和非CM中胚层衍生物(以黄色框表示)中对DAPI(蓝色)、总YAP(绿色)和细胞类型特异性标志物(红色)：对于hiPSC为Tra-1-81，对于hiPSC-CM为α-肌动蛋白)的免疫荧光染色。如黄色箭头标记的代表性细胞所示，YAP在基线处位于所有三种细胞类型的细胞核中。B)用和不用LPA处理的纯化的第10天或第30天的hiPSC-CM的YAP免疫荧光，针对下游Hippo途径转录效应子YAP(绿色)进行染色。在对第10天或第30天的hiPSC-CM进行LPA处理后，YAP核累积或β-联蛋白易位没有显著增加(N.S.)。每个条件以N＝9个图像对细胞进行定量。数据表示为平均值±STD。
图24报告了在未分化的hiPSC中生物活性脂质不改变ERK的磷酸化。在使用和不使用5分钟的S1P和LPA(S+L)处理的情况下在未分化的hiPSC中进行ERK1/2磷酸化。标记对应于ERK1/2磷酸化和抗体对照的斑点。
图25报告了在hiPSC-CM中S1P和LPA激活MAPK/MEK/ERK信号传导。图19的完整版本。在使用和不使用小分子MEK抑制剂曲美替尼、使用和不使用S1P/LPA(各自10μM)处理的第30天的hiPSC-CM中进行激酶测定。标记对应于ERK磷酸化和抗体对照的斑点。
图26报告了S1P和LPA不改变hiPSC-CM中的成熟度或亚型特化。在使用和不使用S1P/LPA(各自10μM)处理的第30天的hiPSC-CM中进行QPCR基因表达分析。标记对应于心房、心室和结亚型的基因以及成熟标志物。*表示p<0.05。
图27是表S1，其显示了在用生物活性脂质S1P和LPA处理的hiPSC和hiPSC-CM中筛选的不同磷酸化激酶的组。在表中，带有星号(*)的蛋白质表示在S1P/LPA处理后磷酸化的显著变化(P<0.05)(另参见图19A-19H)。
详述
一方面，本公开内容提供了一种用于扩增搏动的心肌细胞包括人搏动的心肌细胞的方法。该方法包括用一种或多种WNT激动剂、一种或多种生物活性脂质或一种或多种WNT激动剂与一种或多种生物活性脂质的组合处理搏动的心肌细胞。
在本公开内容中，术语“搏动的心肌细胞”与其他术语例如心肌细胞、心脏肌细胞、心脏肌肉细胞、心脏的肌细胞和/或心肌肉细胞可互换使用。心肌细胞(CM)是构成心脏肌肉的细胞。在本公开内容中，“心肌细胞”是指已经从心脏组织中分离的原代心肌细胞，并且还指已经通过重组技术例如通过分化干细胞获得的心肌细胞。
在本公开内容中，心肌细胞包括通过分化多能干细胞例如胚胎干细胞、间充质干细胞、心肌祖细胞和/或诱导多能干(iPS)细胞或任何其他心肌祖细胞而衍生的心肌细胞。在本公开内容中，iPS细胞包括人iPS(hiPS)细胞对于获得心肌细胞是特别优选的。源自iPS细胞的心肌细胞在本公开内容中可以可互换地称为iPS衍生的心肌细胞或心肌细胞。
任何搏动的心肌细胞(原发性或来源于多能干细胞)均可通过本方法进行扩增，其中用一种或多种WNT激动剂、一种或多种生物活性脂质或一种或多种WNT激动剂与一种或多种生物活性脂质的组合处理搏动的心肌细胞。本发明的扩增方法通过刺激它们的增殖来有效地增加搏动的心肌细胞的数量。该结果是非常出乎意料的，因为搏动的心肌细胞通常是非分裂细胞，甚至在组织培养中也不能有效增殖。
搏动的心肌细胞保留了它们在体外经历收缩/松弛循环的能力。搏动的心肌细胞的收缩性可以通过高分辨率的影像进行检测和记录。可以进行其他免疫组织化学测试以定量肌节排列。其他测试可能包括电生理研究，其中以锐电流钳模式记录搏动的心肌细胞的电位。
术语“Wnt激动剂”是指单独地或与其他试剂组合地激活细胞中的经典Wnt信号传导途径的任何试剂。经典Wnt信号传导途径的激活是指β-联蛋白信号传导的激活，通过该信号传导使β-联蛋白易位到细胞核中。为了本公开内容的目的，将产生具有核β-联蛋白的搏动的心肌细胞的单独的或与其他试剂组合的任何试剂称为Wnt激动剂。
Wnt激动剂包括小化合物、肽、蛋白质、抗体及其片段、siRNA和替代物多肽。WNT激动剂包括GSK3β抑制剂。化合物CHIR99021(氨基嘧啶衍生物，可获自Selleckchem)是一种优选的GSK3β抑制剂。在本公开内容中，CHIR99021可以互换地称为CHIR。另一种优选的GSK3β抑制剂是BIO(6-溴代靛红-3'-肟，可获自Sigma-Eldridge)。
如WO2016040895中所公开的，合适的Wnt激动剂还包括替代物多肽，其用Lrp5/6二聚化卷曲蛋白(Fzd)受体。这些替代物多肽包含对一种或多种Fzd蛋白具有至少1×10-7M的KD的特异性亲和力的结合结构域和对Lrp5和Lrp6蛋白之一或两者具有至少1×10-7M的KD的特异性亲和力的结合结构域。
Fzd结合结构域可以是norrin蛋白或其结合片段。Fzd结合结构域可以是包含抗Fzd抗体的六个CDR区的scFv。特别优选的Fzd结合结构域包括泛特异性卷曲抗体OMP-18R5的六个CDR区。Fzd结合结构域可以是从头设计的Fzd结合结构域。
Lrp5/6结合结构域可以包含DKK蛋白的结合部分。特别地，Lrp5/6结合结构域可以包含人DKK1的C末端结构域。
特别优选的替代Wnt激动剂是ScFv-DKK1c，其在WO2016040895中公开，并且包含OMP-18R5抗体的scFv片段(可从Oncomed获得)，其经由接头与人DKK-1的C-末端结构域连接。
合适的Wnt激动剂还包括RSPO家族的蛋白质配体，包括RSPO1、RSPO2、RSPO3和RSPO4，也称为R-spondin 1、2、3或4。合适的Wnt激动剂还包括Wnt3(Wnt家族成员3)蛋白质及其可以用作Wnt激动剂的任何衍生物。合适的激动剂还包括Wnt3A及其可以用作Wnt激动剂的任何衍生物。
任何一种WNT激动剂可以与任何其他Wnt激动剂组合使用。一些优选的组合可以包括Wnt3A和至少一种R-spondin蛋白。其他组合可以包括与至少一种R-spondin蛋白组合的ScFv-DKK1c。
生物活性脂质是单独的或作为与Wnt激动剂的共同刺激剂来调节细胞信号传导途径的脂质。生物活性脂质包括多不饱和和单不饱和脂肪酸、磷脂衍生物和溶血磷脂，其是糖磷脂家族的亚组，其中三碳甘油主链上的羟基之一未酯化。溶血磷脂仅包含一种脂肪酸。合适的生物活性脂质包括鞘氨醇-1-磷酸(S1P)、溶血磷脂酸(LPA)以及两种化合物的组合。任何其他合适的生物活性脂质包括刺激或与一种或多种Wnt激动剂共刺激心肌细胞的分化和/或扩增的任何生物脂质。
广义地理解搏动的心肌细胞的术语“治疗(treating)”和/或“治疗/处理(treatment)”，并且其可以包括使搏动的心肌细胞暴露于至少一些Wnt激动剂和/或生物活性脂质的任何体外和/或体内程序。处理可以包括用包含Wnt激动剂和/或生物活性脂质中的至少一种的制剂孵育搏动的心肌细胞。在一些实施方案中，如果搏动的心肌细胞在体外孵育，则Wnt激动剂和/或生物活性脂质中的至少一种可以溶解在溶剂中并添加至组织培养基中。合适的溶剂可以包括水、缓冲液、组织培养基、有机溶剂及其任何组合。
在一些实施方案中，治疗可包括向患者的器官和/或组织施用至少一些Wnt激动剂和/或生物活性脂质。施用可以包括注射(包括静脉内注射或直接注射到心脏组织中)、贴剂和/或口服施用。
在本发明的扩增心肌细胞的方法中，可用一种或多种Wnt激动剂、一种或多种生物活性脂质或一种或多种Wnt激动剂与一种或多种生物活性脂质的组合在体外治疗搏动的心肌细胞。可以在一天至120天的一段时间内施用治疗。
在一个优选的实施方案中，通过向组织培养基中添加至少一种Wnt激动剂与至少一种生物活性脂质的组合来处理搏动的心肌细胞1至120天。可以添加生物活性脂质至终浓度为1至50μM。可以添加GSK3β抑制剂至终浓度为1至50μM。可以添加重组Wnt激动剂(例如包含Fzd配体和Lrp5/6配体的替代物多肽)至终浓度为1至500ng/mL。
在一个优选的实施方案中，通过向组织培养基中加入终浓度各自为1至50μM的S1P和LPA来处理搏动的心肌细胞。在另一个优选的实施方案中，用S1P和LPA以1至50μM的终浓度以及用CHIR99021和BIO中的至少一种也以1至50μM的终浓度处理搏动的心肌细胞。在进一步的实施方案中，用S1P和LPA以1至50μM的终浓度以及用重组WNT激动剂Wnt3A、Wnt3A+R-spondin、Wnt替代物ScFv-DKK1c或ScFv-DKK1c+R-spondin中的至少一种以1至500ng/mL的终浓度处理搏动的心肌细胞。在进一步的实施方案中，用S1P和LPA以1至50μM的终浓度、用CHIR99021和BIO中的至少一种也以1至50μM的终浓度以及用重组WNT激动剂Wnt3A、Wnt3A+R-spondin、Wnt替代物ScFv-DKK1c或ScFv-DKK1c+R-spondin中的至少一种以1至500ng/mL的终浓度处理搏动的心肌细胞。还可以通过以1至50μM和CHIR99021和BIO的心肌细胞中的至少一种处理心肌细胞和/或用重组WNT激动剂Wnt3A、Wnt3A+R-spondin、Wnt替代物ScFv-DKK1c或ScFv-DKK1c+R-spondin中的一种或多种以1至500ng/mL的终浓度处理心肌细胞来产生搏动的心肌细胞。
其他方面提供了通过用一种或多种Wnt激动剂、一种或多种生物活性脂质或一种或多种Wnt激动剂与一种或多种生物活性脂质的组合处理搏动的心肌细胞而获得的心肌细胞。
另一方面，本发明提供了从多能干细胞产生心肌细胞的方法。
多能干细胞包括胚胎干细胞、间充质干细胞、心肌祖细胞和诱导性多能干(iPS)细胞。也可以使用其他类型的多能细胞。在本公开内容中，iPS细胞包括人iPS(hiPS)细胞对于获得心肌细胞是特别优选的。iPS细胞(包括人iPS细胞)是通过重编程从成年细胞生成的多能干细胞。通过对细胞进行重编程以表达OCT4、KLF4、SOX2和MYC，可以从角质形成细胞或血细胞或某些其他合适的细胞获得iPS。
本公开内容提供了通过用一种或多种生物活性脂质和一种或多种WNT激动剂的组合处理多能干细胞并将干细胞分化为搏动的心肌细胞来产生搏动的心肌细胞的方法。出乎意料的是，在本发明的用于从多能干细胞产生搏动的心肌细胞的方法中，生物活性脂质和WNT激动剂之间存在协同作用。在这些方法中，iPS细胞包括hiPS细胞是特别优选的。该方法中特别优选的生物活性脂质是鞘氨醇-1-磷酸(S1P)和溶血磷脂酸(LPA)，它们可以单独或组合使用。优选的方法包括S1P和LPA的组合。也可以添加其他生物活性脂质。
在用于将多能干细胞分化为搏动的心肌细胞的本方法中，任何WNT激动剂都可以与一种或多种生物活性脂质组合使用。这样的WNT激动剂包括GSK3β抑制剂。CHIR99021和/或BIO可与一种或多种生物活性脂质组合用于本方法中。方法还可以用一种或多种生物活性脂质和一种或多种来自CHIR99021、BIO、Wnt3A、Wnt3A+R-spondin、Wnt替代物ScFv-DKK1c、ScFv-DKK1c+R-spondin的WNT激动剂来进行，Wnt替代物包括Frd配体和Lpr5/6配体。
在本发明的一些将多能干细胞分化为搏动的心肌细胞的方法中，将多能干细胞在组织培养中用一种或多种生物活性脂质和一种或多种WNT激动剂处理1小时至10天。将生物活性脂质各自以1至50μM的终浓度添加至组织培养基中。将CHIR99021和/或BIO各自以1至50μM的终浓度添加至组织培养基中。将WNT激动剂Wnt3A、Wnt3A+R-spondin、Wnt替代物ScFv-DKK1c、ScFv-DKK1c+R-spondin和/或其任何组合各自以1至500ng/mL的终浓度添加至组织培养基中。
本领域技术人员将理解，一种或多种生物活性脂质与一种或多种Wnt激动剂的组合可用于将任何多能干细胞分化为搏动的心肌细胞的任何方案。这些分化方案包括双相Wnt信号传导方案，其中在分化的第一阶段添加Wnt激动剂，然后在分化的第二阶段添加Wnt拮抗剂。在双相Wnt信号传导方案中，在方案的第一阶段期间用一种或多种生物活性脂质和一种或多种Wnt激动剂的组合处理多能干细胞，即iPS细胞。
本公开内容的其他方面包括用于获得人心肌细胞的方法，所述方法包括：
1)通过双相Wnt信号传导方案将hiPS细胞分化为搏动的心肌细胞，其中在方案的第一阶段中的任何时间期间，用一种或多种Wnt激动剂和一种或多种生物活性脂质处理hiPS细胞，然后在方案的第二阶段期间用一种或多种Wnt拮抗剂处理；
和
2)通过用一种或多种生物活性脂质、一种或多种Wnt激动剂或一种或多种生物活性脂质与一种或多种Wnt激动剂的组合处理搏动的心肌细胞来扩增搏动的心肌细胞。
其他方面包括通过双相Wnt方案通过分化多能干细胞优选hiPS细胞而获得的人搏动的心肌细胞，其中在方案的第一阶段使用一种或多种生物活性脂质与一种或多种Wnt激动剂的组合。然后可通过用一种或多种生物活性脂质、一种或多种Wnt激动剂或一种或多种生物活性脂质与一种或多种Wnt激动剂的组合处理hiPS细胞分化的搏动的心肌细胞(hiPSC-CM)来进一步扩增hiPS细胞分化的搏动的心肌细胞。
本发明方法提供的技术优势之一是大量产生搏动的心肌细胞，这在以前难以实现，因为搏动的心肌细胞通常是非增殖性细胞。通过本发明的方法产生的搏动的心肌细胞可用于多种应用，包括高通量药物筛选，其中搏动的心肌细胞与药物接触，然后监测药物对心肌细胞的作用。许多药物对心肌有细胞毒性。由于搏动的心肌细胞的高通量药物筛选方法可以在组织培养中进行，因此可以快速鉴定潜在的细胞毒性药物。
特别优选的实施方案包括其中生物活性脂质S1P和LPA被用来促进从hiPS细胞分化心肌细胞的方法。与CHIR99021一起，未分化的hiPS细胞中的S1P和LPA处理协同增加核β-联蛋白的累积和中胚层表型。在hiPSC-CM分化的后期，S1P和LPA处理通过ERK/MAPK信号传导刺激hiPSC-CM中的细胞周期活性，并增强细胞增殖。
其他方面包括治疗需要治疗心脏病的人患者的方法。可以通过将通过本发明的分化和/或扩增方法获得的搏动的心肌细胞施用至患者的心脏来治疗患者。该治疗方法可能有益于与心肌细胞退化有关的任何心脏病，包括但不限于先天性心脏病，由心肌梗塞引起的退化，由心脏毒性药物例如蒽环类药物、酪氨酸激酶抑制剂和/或用于癌症治疗的免疫检查点抑制剂引起的退化，由环境暴露例如酒精、细菌例如引起恰氏病或莱姆病的细菌、引起心肌炎的病毒或由遗传性/世袭性心肌病引起的退化。
治疗方法可包括通过施加在患者心脏上的贴剂将搏动的心肌细胞施用至患者。搏动的心肌细胞可以与也可以包含在贴剂中的一种或多种生物活性脂质和一种或多种Wnt激动剂组合施用，或者可以将它们分开施用至患者，例如通过静脉内注射或口服。
其他方面提供了一种用于治疗患有心脏病的患者的方法，该方法包括向患者施用一种或多种Wnt激动剂、Wnt替代物、生物活性脂质和/或其任何组合。
在另一方面，本公开内容提供了一种用于治疗心脏病的试剂盒。该试剂盒包含通过本发明的分化和/或扩增方法之一获得的搏动的心肌细胞。试剂盒可以进一步包含一种或多种生物活性脂质和/或一种或多种Wnt激动剂，并且可以进一步包含用于递送细胞的介质，例如设计为贴剂的基质凝胶。
在另一方面，本公开内容提供了由通过本发明的分化和/或扩增方法获得的搏动的心肌细胞产生的组织工程化血液泵。本公开内容还提供了用于治疗患有心脏病或血管疾病的患者的方法。该方法包括向患者施用组织工程化的血液泵。
本公开内容提供了其中经典的Wnt信号传导刺激允许搏动的心肌细胞(CM)的大规模扩增和多次传代的方法。Wnt激动剂的停用导致快速的细胞周期退出并恢复CM的正常收缩、电生理和细胞特征。
一方面，该系统可用于在体外从扩增的CM产生功能性心脏组织，并刺激成年心脏组织内的体内心肌生长，其可用于患者特异性心肌的再生。
心脏再生医学的“圣杯(holy-grail)”仍然是心肌梗塞后心脏组织功能的恢复。但是，实现该目标的主要障碍仍然是不能够生成大量的CM从而允许生成患者特异性的工程化心脏组织或可替代地增强已有CM的细胞分裂。迄今为止，来自hiPS细胞的CM的扩增和多次传代一直是极富挑战性且基本上没有成功的任务。本公开内容旨在满足该需求并提供一种方法，当连续进行阶段特异性小分子GSK3抑制剂处理时，通过该方法使得未成熟的hiPSC-CM大量扩增持续多次传代。这样导致增加的CM纯化率(图1)。
停用GSK3抑制剂后，CM停止增殖并保留自发正常体外成熟的能力(图2)。作为临床前应用的证明，先前扩增的CM被用于创建功能性3维心脏组织(图12)。此外，在静息的hiPSC-CM和成年小鼠心脏中用Wnt替代受体激动剂刺激经典Wnt信号传导途径，诱导CM复制并促进心肌生长(图6和图7)。
以前的一些研究显示使用多种GSK3抑制剂瞬时扩增搏动的心肌细胞，但没有持续多次传代的能力(Buikema等人，2013；Titmarsh等人，2016；Uosaki等人，2013)。最有可能的是，因为这些研究使用的是来自其他物种的多能干细胞来源的CM，在分化的后期开始处理，培养基含有胎牛血清和/或在解离和传代时会丢失过多的细胞。相反，本公开内容提供了当将第12天的hiPSC-CM保存在化学上确定的培养基和Matrigel包被的单层培养物中时，它们可以传代3-5次，传代后估计的存活率>90％，从而获得CM数量的大量增加(图1)。
最近的两项研究着眼于使用纯化的蛋白、小分子和/或癌基因的过度表达的组合的心血管祖细胞的扩增，并显示107倍和1010倍的扩增(Birket等人，2015；Zhang等人，2016)。尽管与hiPSC-CM扩增相比，心血管祖细胞的增殖能力更高，但多能心血管祖细胞的分化仍然是不受控制的过程，导致最终分化后混合的细胞群。本方法扩增搏动的hiPSC-CM而不是祖细胞(图9A-B)，并且在扩增过程中稳健地产生了>95％的TnT纯度，这对于可再现的下游应用将是有益的(图1H-I和图13)。在停用CHIR后，这些心肌细胞通常会成熟并显示出与对照组相同的肌节组织、电生理和力量再生(图2)。
终末分化CM的一个显著特征是其有限的增殖潜能，以及含有高度组织化的肌节结构的细胞骨架以在一生中进行数以亿次计的收缩。最近的一份报告显示CM细胞分裂主要发生在单核二倍体细胞部分中，而不是四倍体或多核CM中，并且肌节调节剂TNNI3k与心脏的那些CM群体之间的这种差异相关(Patterson等人，2017)。
在图2中，本公开内容显示了增殖细胞是单核的。在图3中，本公开内容显示，在停用CHIR后，多核细胞增加，而增殖细胞减少。在本公开内容中提供的单细胞RNA测序数据表明，典型Wnt信号传导途径的激活主要维持CM的相对未成熟状态，从而延长了它们的增殖窗口(图3)。该数据与未成熟的CM群体增殖和再生心肌的先前体内发现一致(Kikuchi等人，2010；Patterson等人，2017)。
各种研究已将Wnt信号传导与心脏生长和CM分裂联系起来，但是，本公开内容提供了一个发现，即Wnt/β-联蛋白信号传导反而保持CM不成熟性，从而延长了该增殖性CM子集的增殖窗口(图3-4)(Buikema等人，2013；Heallen等人，2011；Kerkela等人，2008；Titmarsh等人，2016；Tseng等人，2006；Uosaki等人，2013)。从概念上讲，这是新颖的，并形成了幼龄小鼠而非成年小鼠中对Wnt信号传导的罕见CM增殖反应的机制解释(图6)。
哺乳动物心脏的生物学似乎与具有再生能力的相对不成熟的斑马鱼心脏截然不同，在斑马鱼心脏中Wnt信号传导响应心脏损伤时是活跃的(Kikuchi等人，2010；Stoick-Cooper等人，2007)。最近的一项哺乳动物研究表明，驱动再生的先存CM的稀有群体是单核二倍体细胞(Patterson等人，2017)。
目前尚不清楚通过本发明的方法获得的扩增性CM是否已针对心房或心室谱系做出命运决定，但测序数据为以SLN和HEY1表达为特征的心房样群体以及富含MYL2和未成熟的心室标志物MYL3和MYL4的心室样群体提供了证据(Josowitz等人，2014；Kurabayashi等人，1988；Protze等人，2017)。有趣的是，心房和心室样群体均对Wnt刺激作出反应，并且所有经CHIR处理的细胞一起形成了一个独特的聚类，再次出现了心房样和心室样亚聚类(图3)。独立于β-联蛋白信号传导，本公开内容提供了CHIR/GSK3调节细胞质内AKT的周转(图5)。重要的是，本公开内容提供了该组分引起一些成熟变化和通过图1中所示的CHIR暴露观察到的大约50％的增殖反应。
本公开内容提供功能上不成熟的CM的稳健的、长期的体外扩增，其最终保留了其进一步成熟的能力以及因此在翻译应用中的效用。它提出了一种概念上新颖的原理，即Wnt信号传导在维持CM不成熟性并因此增强hiPSC-CM的阶段特异性增殖中起着关键作用。此外，它还提供了体内方法来调节成年心肌生长。这些方法对于扩大用于各种个体化疗法的患者特异性CM的产量以及用于心脏修复的新型体内再生方法具有重要意义。
出乎意料的是，本公开内容还提供了S1P和LPA与GSK3β抑制剂CHIR协同作用以通过核β-联蛋白累积调节早期hiPSC中胚层分化。在后期阶段，S1P和LPA的组合处理导致分化的hiPSC-CM中的细胞周期活化，这是通过ERK/MAPK信号传导介导的作用，并与β-联蛋白信号传导协同作用以增加心肌细胞增殖。生物活性脂质表现出对从hiPS细胞的心脏分化的阶段特异性作用。
本公开内容报告了hiPSC-CM分化期间S1P/LPA的高度阶段特异性作用。当单独或与CHIR组合施用给未分化的hiPS细胞时，S1P/LPA增加核β-联蛋白水平并增强中胚层诱导。心肌细胞分化完成后，S1P/LPA的添加启动了通过激活MAPK/MEK/ERK信号传导介导的hiPSC-CM中的细胞周期再进入和增强的CHIR诱导的心肌细胞增殖。这些发现举例说明了hiPS细胞分化平台用于研究信号传导途径对人心肌细胞发育的影响的多功能性。另外，通过生物活性脂质处理大量产生分化的人心肌细胞的能力可用于开发用于心脏病建模的高通量测定和发现用于未来再生应用的新分子。
S1P和LPA在未分化的hiPS细胞中快速诱导形态和基因表达变化的能力是一个出乎意料的发现。在开始S1P/LPA处理后的12-24小时内，观察到hiPS细胞形态的快速变化。这些变化还伴随着hiPS细胞中中间丝状蛋白波形蛋白表达的增加，这一发现提示上皮向间质转化(EMT)的诱导。
但是，S1P/LPA处理在处理后24小时未导致Nanog表达降低，这提示S1P/LPA对hiPSC心脏分化的更加中胚层特异性而不是整体的作用(图22B)。EMT的标志是通常由粘附连接复合物介导的细胞间接触的丧失(Lamouille等人，2014)。
溶血磷脂对于其解离这些粘附连接、显著松开细胞间接触以及将结合粘附连接的β-联蛋白释放到细胞质中的能力是得到确定的(Kam等人，2009；Burkhalter等人，40)。重要的是，β-联蛋白还用作下游核转录效应子用于激活Wnt信号传导(Lian等人，2012)。
用S1P/LPA处理在hiPSC中快速诱导β-联蛋白胞质和核累积。因此，S1P/LPA处理与CHIR介导的GSK3β抑制协同作用以增强细胞质β-联蛋白的总体库并促进其核进入(图16D)。除了促进β-联蛋白的胞质库的增加外，S1P/LPA处理似乎还通过不同的机制诱导波形蛋白表达的增加，因为Wnt抑制剂的存在无法消除S1P/LPA模拟波形蛋白表达的能力。
β-联蛋白核定位的增加可能是由于质膜上β-联蛋白的稳定化(即防止GSK3β介导的降解)或β-联蛋白从E-钙黏着蛋白的更多的释放。但是，S1P/LPA无法直接诱导早期中胚层标志物例如Bry T(图17D-E)的能力支持其除了促进β-联蛋白核易位外的对hiPS细胞分化的独立作用。S1P/LPA对LEF/TCF报告基因表达没有强烈影响(图16C，19A)进一步证明了这一点，表明涉及Wnt/β-联蛋白对hiPSC心肌细胞分化的独立机制。参与通过S1P/LPA的中胚层诱导的其他信号传导途径的鉴定可能有助于进一步改善hiPSC心脏分化。
在高度分化的hiPSC-CM中S1P/LPA处理诱导MAPK/MEK/ERK信号传导的强烈和快速上调的发现是出乎意料的。S1P/LPA诱导ERK信号传导(一种已知的细胞增殖调节剂)的能力已在其他细胞类型中进行了描述(Hannun等人，2008)。S1P/LPA诱导的ERK磷酸化和细胞周期再进入需要MAPK/MEK/ERK途径，这通过显示用MEK抑制剂曲美替尼进行处理有效地消除这些作用来证明(图19D-E)。通过S1P/LPA诱导的HSP27磷酸化(其是先前报告的对抗ERK磷酸化的MEK靶标)下调进一步支持了MEK信号传导的参与(McMullen等人，2005)。
有趣的是，PI3-Akt途径(一种参与心肌细胞增殖的已知途径(Lin等人，2015年))在基线或通过S1P/LPA处理时未被激活。这可能是因为这些hiPSC-CM在表型上不成熟或缺乏刺激PI3K-Akt信号传导的最佳培养条件。这些发现也与最近的表明ERK和YAP信号传导参与成年心肌细胞分裂的研究(Bassat等人2017)相一致，并提示S1P/LPA的体内递送也可能增强心肌细胞分裂。
本发明的使用生物活性脂质和/或Wnt激动剂的方法还可以在体内应用于胎儿或新生儿心肌细胞。
生物活性脂质对hiPSC分化和hiPSC-CM增殖的阶段特异性作用证明了生物活性脂质在增强人iPSC分化为心肌细胞中的作用。尽管近年来将hiPS细胞分化为CM的效率显著提高，但人iPSC细胞系之间以及同一细胞系的不同分化批次之间仍存在显著差异。本公开内容提供了对生物活性脂质在心血管生物学中的作用的更深入的理解，以及提供了增强可用于心血管疾病建模、药物筛选和再生医学的下游应用的hiPSC-CM的产量的新颖手段。
实施例1–7的材料和方法
细胞培养。在包被Matrigel(Corning)(1：400持续24h)的聚苯乙烯2D培养系统中在补充必需的八种(E8)(Thermo Fisher)生长因子的DMEM/F12(Thermo Fisher)中维持四个hiPS细胞系(LMNA、273、202和HSP8)。80-90％汇合后，将细胞在含0.5％EDTA的PBS中于37度解离5-10分钟。以温和吹吸进行解离以获得hiPS细胞的小细胞团。以1:15-20的分瓶比例进行传代，以在4-5天内达到完全汇合。在最初的24小时内，10μM的ROCK抑制剂Y-27632(Selleckchem)包含在hiPSC维持培养基中。
CM的产生通过使用先前描述的在具有除去胰岛素的B27(Invitrogen)的RPMI1640(Thermo Fisher)分化培养基中的经典Wnt刺激和抑制来完成。在第0-2天之间，使用CHIR99021(Seleckchem)浓度的梯度(3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0μM)。在第3-5天之间，将Wnt-C59(Selleckchem)加入分化培养基中。在第7天，将具有胰岛素的B27加入分化培养基中。在第11天，将目测包含超过80％的搏动细胞的孔与TrypLE Select Enzyme 10X(Invitrogen)在37度下孵育20-40分钟。每10分钟轻轻摇动一次。以非常温和的吹吸使细胞解离，然后转移至装有洗涤缓冲液(含20％FBS的PBS)的15mL锥形管中。将细胞以1000RPM离心3分钟，然后在含10％敲除血清替代物(Gibco)和Thiazovivin 1.0μM(Selleckchem)的RPMI 1640+B27中以1:10-15的比例重新铺板。在第12天，在补充有2.0至4.0μM CHIR99021(Selleckchem)的分化培养基中进一步培养hiPSC-CM用于下游测定。在传代后的第一个24小时内，将10％的敲除替代血清和Thiozovivin 1.0μM加入分化培养基中。
小分子/生长因子。PNU74654、MK2206、CHIR99021和Wnt-C59获自Selleckchem。ScFV-DKK1c和RSPO是在Garcia实验室(斯坦福大学)的重组细胞系中产生的。纯化的Wnt3A蛋白购自(R&D systems)。
蛋白质表达分析。免疫组织化学使用一抗孵育过夜然后使用各种Alexa荧光缀合的二抗孵育2小时来进行。用共聚焦(Zeiss LSM 710)或常规免疫荧光显微镜(Leica DM ILLED)制作图像。本研究中使用的主要物质是心肌钙蛋白T(MS-295，Fisher)，Ki67(ab15580，Abcam)，pHH3(#9701，Cell Signaling)，aurora B(ab2254，Abcam)，α肌节肌动蛋白(A7811，Sigma-Aldrich)，MLC2V(ab48003，Abcam)，phospo AKT T318(#9275，Cell Signaling)。
用Proteome Profiler人磷酸激酶阵列试剂盒(R&D Systems)筛选激酶的磷酸化水平，该试剂盒包含43种人激酶和2种蛋白质的总量。用常规蛋白质印迹进行验证。总蛋白表达用凝胶成像仪(Biorad)测量并用像素强度软件(Biorad)处理。
萤光素酶测定。用TCF报告质粒(TOPflash M50，Addgene)或突变报告质粒(TOPflash M51，Addgene)和使用Lipofectamine3000(Invitrogen)转染第12天的hiPSC-CM48小时。转染后72小时，将细胞用各种小分子处理24小时。裂解细胞并与萤光素酶底物(Promega)混合，并用96孔微量酶标仪(Fisher)测量萤火虫萤光素酶的表达。
实时PCR表达分析。为了定量分析基因表达，用裂解缓冲液(Qiagen)从hiPSC-CM中提取RNA，并储存在-80℃下。使用RNA纯化试剂盒(Qiagen)从细胞裂解物中纯化出每个样品的总RNA。使用iScript cDNA合成试剂盒(BioRad)制备cDNA。使用具有SYBR Green底物(Affymetrix)的96孔热循环仪系统(Biorad)进行40个循环的定量PCR。所有引物序列均从PrimerBank(Massachusetts General Hospital/Harvard Medical School)在线数据库获得。寡核苷酸是在斯坦福大学合成的。
单细胞基因表达分析。对于单细胞基因表达，在第12天，用DMSO、CHIR99021或C59处理重新铺板的hiPSC-CM 24小时。在第13天，用TrypLE Select酶消化细胞约5分钟，并以温和吹吸将其解离。洗涤样品并将其悬浮在含B27补充剂的冰冷RPMI 1640中，并提交至10xGenomics单细胞捕获平台。制备cDNA文库，并将其用于Illumina HiSeq测序，得到平均每个细胞93.522次读出。使用Loupe Cell Browser软件进行单细胞分析。
流式细胞术。将新鲜分离的hiPSC-CM在PFA 4％中固定5分钟，然后在室温下用TnT(MS-295，Fisher)染色1小时。多次洗涤后，施加Alexa488-小鼠二抗30分钟。使用
Figure BDA0002685201660000291
(BD Biosciences)通过流式细胞术分析样品。流式细胞术和细胞周期数据是在
Figure BDA0002685201660000292
(BD Biosciences)流式细胞仪上获取的，并通过FlowJo软件(Treestar)处理。
扩增性hiPSC-CM的电生理研究。在电生理学研究之前，将在RPMI 1640+B27补充剂+CHIR99021中传代3次的扩增性HiPSC-CM和在RPMI 1640+B27补充剂中保持等同天数的对照稀疏地接种在包被Matrigel的8mm盖玻片上。将盖玻片上的细胞浸入pH 7.4的含有140mMNaCl、2.8mM KCl、2mM CaCl2、2mM MgCl2、10mM HEPES和10mM葡萄糖的细胞外溶液中。用pH7.3的含有140mM葡萄糖酸钾、10mM NaCl、2mM MgCl2、10mM HEPES、1mM EGTA、4mM Mg-ATP和0.3mM Na-GTP的细胞内溶液填充片形电极，因此产生约2-5M′Ω的电阻。在室温下以锐电流钳模式记录自发的CM动作电位。
单细胞模式化和收缩性。将细胞铺板在顶部具有微模式化的蛋白质的柔软的基底上。培养3-6天后，针对每组至少10个个体细胞记录高分辨率影像(Sony Microscopy)，并以数字方式处理运动速度分析。记录后，将细胞固定并用于免疫组织化学和共聚焦成像。肌节排列用Image J软件定量。
在小鼠中的体内研究。出生后第4周和第8周，每周两次向C57/BL6小鼠(JacksonLaboratory，Barharbor，ME)注射可溶性scFv-DKK1c Wnt蛋白。安乐死是先通过异氟烷对小鼠进行镇静(吸入剂，在100％氧气中的2％，新出生的小鼠放在温暖的垫上)然后进行继发性颈椎脱位来进行的。在安乐死后和处置前确认死亡。所有动物实验均已获得斯坦福大学动物护理和使用委员会(APLAC)的批准。所有实验均根据斯坦福大学的相关指南和规定进行。体重和心脏重量由不知情的观察者测量。从小鼠胸腔切出新鲜分离的成年心脏，并用PBS洗涤以去除多余的血液。将取出的心脏在磷酸盐缓冲溶液(PBS)中的30％蔗糖中孵育过夜，然后与PBS中梯度浓度的OCT逐步孵育以用于冷冻切片。冷冻保存后，将心脏切成10μm切片，并在免疫染色之前在PBS中的4％多聚甲醛中轻轻固定。根据制造商建议的方案对组织切片进行苏木精和伊红染色。对组织学切片的所有定量分析均以观察者不知情的方式对数字编码的动物进行，以防止数据分析中的主观偏见。
数据分析。数值数据表示为平均值±标准偏差或SEM。使用具有相等方差的两尾配对t检验进行统计学显著性。p<0.05的值被认为具有统计学意义。
实施例1.Wnt刺激导致连续传代时搏动的hiPSC-CM的大量扩增
在hiPS细胞的心脏分化过程中，搏动的hiPSC-CM的分裂能力迅速下降，并伴随着肌节组织和收缩力产生的增加，从而模仿了新生儿心肌细胞在体内的成熟过程。虽然晚期胚胎发育过程中的Wnt激活似乎会增强小鼠中的CM增殖(Buikema等人，2013；Titmarsh等人，2016；Uosaki等人，2013)，但尚不清楚搏动的hiPSC-CM是否可以在体外类似地反应以及不清楚连续传代后可以实现的扩增程度。
为了解决这个问题，使用已建立的双相Wnt信号传导方案分化了四个先前验证的野生型hiPS细胞系，以在分化的第11天产生约85％的CM纯度(Burridge等人，2014；Lian等，2013)。这些细胞在定向至心肌发生谱系之前表达多能干细胞(NANOG)、中胚层(MESP1)和心脏祖细胞(Isl1)的阶段特异性基因表达(图8A-B)。
这些hiPSC-CM在分化的第7天开始搏动，并在第12天用或不用2.0μM CHIR99021(CHIR)(一种激活经典Wnt信号传导的GSK3β抑制剂)处理，并进行连续传代。值得注意的是，在存在CHIR的情况下，hiPSC-CM继续分裂而没有明显的细胞死亡(图8C)，并可以传代多至5次，而对照二甲亚砜(DMSO)处理的细胞在第一次传代后停止增殖(图1A-C)。有趣的是，经CHIR处理的早期传代hiPSC-CM在活跃分裂的同时继续搏动(补充影像1)，在传代后5-7天内达到汇合(图1D)，导致总细胞数量(图1E)和CM数量(图1F-G)增加超过100倍。
通常，制备二百万个第12天的hiPSC-CM将产生三千万-九千万个hiPSC-CM。此外，与对照DMSO处理的hiPSC-CM相比(其随着每次传代降低CM纯度，这很可能是由于非肌细胞的过度生长)，CHIR处理似乎可以保持CM纯度(如果没有稍微的富集)(图1H-I)。总的来说，这些数据支持Wnt信号传导活化(通过GSK3β抑制)和连续传代在体外实现搏动的hiPSC-CM的大规模扩增的能力。
实施例2.通过Wnt信号传导扩大hiPSC-CM增殖窗口
搏动的hiPSC-CM的通过CHIR处理的大量扩增引起了有关引起增加的iPSC-CM分裂的机制的有趣问题。为了检查这一点，测定在用CHIR或DMSO(CTR)处理后在每次传代时表达细胞周期标志物ki67或有丝分裂标志物磷酸化组蛋白H3(pHH3)的肌钙蛋白T(TnT)阳性hiPSC-CM的百分比(图2A-C)。
有趣的是，尽管CTR hiPSC-CM在每次传代时显示ki67和pHH3的表达的迅速下降，其中第2代(P2)后只能观察到少量的有丝分裂细胞，但CHIR处理导致增殖窗口的显著延长(多至5次传代)(图2C和图9A)。为了进一步阐明增殖性CM的特征，在单细胞微模型(micropattern)上进行了有丝分裂的CM的共聚焦成像(Ribeiro等人，2015)。在存在CHIR的情况下，有丝分裂的CM是丰富的，尤其是在后期和末期，其中它们伴随着拆解的肌节结构(图2D-E和图9B)。CHIR处理的hiPSC-CM的Aurora B激酶染色表明，hiPSC-CM可以经历胞质分裂以完成细胞分裂(图2F)。此外，与CTR或C59处理的细胞相比，CHIR处理的hiPSC-CM显示出较少的双核化(图2G-H)。
与对照DMSO处理相比，CHIR增加hiPSC-CM增殖的能力可以通过直接增加CM增殖/分裂的速率、防止CM成熟和细胞周期停滞或两者来实现。在用CHIR-、CTR-或C59(一种Wnt信号传导的特异性抑制剂)处理后评估第12天的hiPSC-CM(P0)的增殖速率的短期(24小时)变化(图2I-J)。
发现在CHIR和CTR/C59处理之间hiPSC-CM中ki67表达的显著差异。但是，应注意的是，来自起始hiPSC-CM群体(0小时的CTR)的经CHIR处理的hiPSC-CM之间增殖hiPSC-CM的频率没有变化(图2I-J)。CHIR对直接刺激hiPSC-CM增殖的这种相对适度的作用增加了CHIR处理也可能阻止hiPSC-CM成熟和细胞周期停滞以实现细胞数量随时间的大量扩增的可能性(图1)。此外，在这些hiPSC-CM中Wnt信号传导活性的可忽略不计的基线水平(图2K)解释了为什么与CTR处理相比用C59处理并不会导致hiPSC-CM增殖速率降低(图2I-J)。
这些结果证明了CHIR通过维持细胞周期活性和防止双核化显著延长hiPSC-CM的增殖窗口的能力。此外，本发明的免疫染色数据表明，hiPSC-CM在活跃的有丝分裂过程中拆解了其排列的肌节，这一发现提示Wnt信号传导途径抑制hiPSC-CM的成熟。
实施例3.Wnt刺激后hiPSC-CM的表型评估
CM成熟伴随着高度结构化的肌节的形成、双核或多核化以及细胞周期退出(Bassat等人，2017；Bersell等人，2009；Senyo等人，2014；Uygur和Lee，2016)。在Wnt刺激后观察到的搏动的hiPSC-CM大量扩增增加了成熟停滞可能伴随其保留的增殖能力的可能性。为了解决这个问题，使用CM功能的各种表型测定，将暴露于含DMSO(CTR)的培养基的年龄匹配的hiPSC-CM与在包含2.0μM CHIR的培养基中经历了3次传代的那些进行比较。为了评估肌节排列，将长宽比为7:1的微模型上的CHIR和CTR hiPSC-CM(Ribeiro等人，2015)进行培养并用TnT和肌节肌动蛋白抗体进行免疫染色。
CTR处理的hiPSC-CM表现出高度组织化和排列的肌节，而CHIR处理的hiPSC-CM在微模型上活跃地分裂，并显著减少了肌节的排列和组织(图3A)。通过肌纤维与垂直方向(定义为0度)的偏离角的自动成像评估来定量肌纤维排列的这个差异(图3B-C)，从而确认在CHIR处理的hiPSC-CM中观察到的肌节组织紊乱。
有趣的是，当将C59添加至先前已用CHIR处理过的细胞中(CHIR>C59)时，这些细胞首先分裂，然后将其肌节重新组织成类似于未经历CHIR处理的年龄匹配的对照hiPSC-CM的状态(图3A-C)。
对CTR和CHIR处理的细胞的收缩特性的评估证明在CHIR处理的细胞中降低的力产生(图3D和补充影像2-4)。CHIR和CTR处理的年龄匹配的hiPSC-CM的单细胞电生理研究显示相似的自发动作电位(图3E-F)和钙成像(图3G-H)。总体而言，这些数据强烈支持Wnt信号传导激活对CM成熟的抑制，这种现象在Wnt刺激后在第二心区衍生的心脏祖细胞和其他细胞类型中也观察到(Qyang等人，2009；Sato等人，2004；Yin等人，2014)
为在转录水平上确认成熟停滞表型，将从分化第12天至28天用含CHIR的培养基处理的iPSC-CM在存在CHIR(2.0μM)、DMSO(CTR)或C59的情况下培养额外3周并收获用于RNA纯化和实时定量PCR分析。与用CHIR处理的hiPSC-CM相比，用DMSO或C59处理的hiPSC-CM显示出与心肌细胞成熟(MYL2、TNNI3、MYOM2)、刺激(GJA1)、收缩(RYR2)和代谢(COX6A2、CKMT)相关的标志物的上调(图3I-K)。这些发现通过与CHIR处理的细胞相比DMSO和C59处理的hiPSC-CM中MYL2的免疫荧光染色的增加而在蛋白质水平上得到了支持(图3L-M)。
鉴于Wnt信号传导调节细胞谱系定向和分化的不同的作用，长时间暴露于CHIR可能导致hiPSC-CM表型转化或致癌转化，这阻止其适当成熟，这一发现将严重阻碍其在细胞疗法或药物发现应用中的应用。将第12天的hiPSC-CM在CHIR中在连续传代的情况下培养2个月，然后在停用CHIR的情况下培养一个月。
在3个月末，测量CM基因表达并将其与在12天及之后未暴露于CHIR的年龄匹配的对照hiPSC-CM进行比较(图10)。发现在用CHIR处理两个月的细胞中，成熟标志物(例如MYL2、TNNI3)的表达即使没有略微增加，也是相似的，这支持了在长时间Wnt刺激后hiPSC-CM中不存在异常表型转化。从功能的角度也证实了这一发现，其中CHIR处理的hiPSC-CM能够产生搏动的3D心脏组织(图11)。总而言之，这些数据表明，通过GSK3β抑制，Wnt刺激阻止了hiPSC-CM的成熟，但是在Wnt刺激撤出后，这些细胞仍然能够经历成熟。
实施例4.在Wnt信号传导的获得和丧失之后hiPSC-CM的单细胞RNA测序分析
为研究响应于Wnt信号传导的获得和丧失hiPSC-CM的全局转录变化，在用DMSO(CTR)、CHIR或C59处理24小时的第12天的hiPSC-CM中进行了单细胞RNA测序。总共捕获了8,381个细胞，每个细胞进行了93,552次平均读出，得到每个细胞1,297个基因读出的中值(图4)。
首先使用T分布随机邻居嵌入(tSNE)算法分析单细胞基因表达数据，以在我们的3个处理样品中进行降维(图4A)。发现在用CHIR处理的hiPSC-CM中相对用CTR或C59处理的hiPSC-CM，成熟心脏基因被显著下调，而Wnt信号传导靶基因和心源性转录因子被高度上调(图4B)。具体而言，Wnt靶基因AXIN2、LEF1、BMP4、DOK4在几乎所有用CHIR处理的细胞中均升高(图4C和D)，而与细胞周期激活相关的基因(如CCND2、MKI67和KIAA0101)仅在CHIR处理后的一部分hiPSC-CM中被上调(图4D-E)。重要的是，刺激Wnt信号传导不会导致心脏祖细胞标志物Isl1和MESP1/2的表达增加，这表明用CHIR扩增hiPSC-CM不会导致残余心脏中胚层或第二心区祖细胞的稀有群体的扩增(图12C)(Wu等人，2008)。
为了进一步在存在或不存在Wnt信号传导的情况下研究hiPSC-CM的不同亚群，对所有细胞进行了无监督的聚类，导致总共5个聚类(图4F)。基于它们的心房相对心室CM的基因表达特征(图4G-H)，将这些聚类重新分配为V1-3(对于心室CM 1-3)和A1-2(对于心房CM1-2)。这些分配通过心室基因例如MYL2和早期胎儿心室标志物MYL3和MYL4的V1-3聚类特异性表达(图4I)和心房标志物例如HEY1和SLN的A1-2聚类特异性表达来确认(图4J)。
比较了在心室聚类V3(即CHIR处理的心室iPSC-CM)和V1-2(CTR和C59处理的心室iPSC-CM)之间成熟心室基因例如MYH7、TNNI3、TNNC1、ACTN2和MYOM1的表达，并与V1-2聚类细胞相比，检测V3聚类细胞中成熟标志物的表达的显著降低(图4K)。这些数据进一步证明了Wnt信号传导抑制iPSC-CM成熟，从而导致了延长的增殖窗口和大量的hiPSC-CM扩增。
实施例5.Wnt/β-联蛋白信号传导非依赖性hiPSC-CM增殖中AKT激酶磷酸化的要求
虽然CHIR介导的Wnt/β-联蛋白信号传导通过GSK3β抑制而发生，但已知GSK3β除了其对典型Wnt信号传导的抑制作用以外，还参与了多种细胞过程。为了检查非β-联蛋白介导的事件是否参与hiPSC-CM增殖，我们在存在PNU74654(一种特异性的TCF/LEFβ-联蛋白信号传导阻滞剂)(Trosset等人，2006)的情况下，用CHIR处理细胞，并评估在与单独用CHIR处理的细胞相比时hiPSC-CM增殖的变化。
有趣的是，发现虽然CHIR介导的hiPSC-CM增殖减少了约50％(图5A)，但TCF/LEF萤光素酶报告基因的CHIR诱导的激活消失了(图5B)。这表明，非β-联蛋白介导的信号传导负责使用CHIR处理观察到的增殖活性的一半。
通过实时定量PCR确认了在hiPSC-CM中进行CHIR处理后Wnt信号传导靶基因表达(例如Axin2、LEF和CCND2)的诱导(图5C)以及PNU74654处理使此增加的消除的能力。通过CHIR处理下调了hiPSC-CM成熟标志物(MYL2、MYH7、MYOM1)的表达，并在用PNU746554共处理后该表达完全恢复(图5C)。这些结果证明，β-联蛋白依赖性信号传导有效调节hiPSC-CM的成熟，而GSK3β介导的但为β-联蛋白非依赖性的信号传导驱动通过hiPSC-CM的细胞周期。
为鉴定参与CHIR介导的hiPSC-CM增殖的下游激酶，筛选了具有已知功能的43种激酶的文库(图5E和图12)，并且发现了在T308残基上AKT1/2/3磷酸化的显著上调(图5E)，该残基是AKT激活和细胞分裂所需的残基(Liu等人，2014)。
此外，还发现了AKT结合蛋白HSP27(一种下游AKT靶标p70S6K)的磷酸化增强，以及生长抑制因子P27的磷酸化的微弱增加(图5E)(Conejo等人，2002；Song等人，2005)。通过使用针对磷酸化AKT(pAKT)的T308残基的抗体，已证实，与DMSO处理的对照相比，在向细胞培养物中加入CHIR后AKT的活性形式迅速增加(图5F-G)。
为研究pAKT在CM中的定位，将第12天的hiPSC-CM在DMSO(CTR)或CHIR中培养6天，发现T308 pAKT在有丝分裂的CM的细胞质中大量表达(图5H，左侧两个图和图12A)。一致地，在胎鼠心脏内的活跃增殖的CM类似地显示增加的细胞质pAKT(图13)。
通过使用先前描述的高度选择性的AKT磷酸化抑制剂MK2206来确定T308 pAKT在有丝分裂的CM中的作用(Lindsley等人，2007)。当用CHIR和MK2206处理细胞时，与单独使用CHIR处理相比，CM复制减少，并且观察到表达pAKT的有丝分裂细胞少得多(图5H-J)。研究所有处理条件下的TCF/LEF萤光素酶活性表明，用MK2206观察到的hiPSC-CM增殖的减少不是由于下游β-联蛋白信号传导的下调，而是由于导致减少的增殖的pAkt的抑制(图5K)。这些数据支持了CHIR在AKT途径的激活中的作用，并证实了Wnt信号传导在调节成熟和增殖变化中的作用。
实施例6.Wnt受体-配体诱导CM细胞周期再激活
再激活Wnt信号传导可能促进衰老的非增殖性CM中的增殖，而不是简单地维持预先存在的增殖(图6A)。首先，在第12天的增殖性hiPSC-CM中测试了已建立的Wnt受体配体的功效，并确实发现Wnt3A和Wnt替代物ScFv-DKK1c促进了CM扩增(图6B-C)。接下来，将hiPSC-CM分化60天，并用Wnt替代物ScFv-DKK1c处理。观察到少量但显著增加的部分的CM变成有丝分裂的(图6D-E)。这些结果表明，Wnt激活足以再激活一小部分CM中的细胞周期，从而导致细胞增殖。
实施例7.Wnt替代物促进成年心肌生长
Wnt信号传导可能足以在体内促进成年心肌中的CM增殖。已知胎鼠心脏中存在多种Wnt(Mazzotta等人，2016)，包括Wnt3A，但是由于其溶解性，其不太适合于体内应用。最近开发的Wnt替代物ScFv-DKK1c是完全水溶性的，因此被用于这些体内研究(Janda等人，2017)。八周龄的成年小鼠用Wnt替代物或载体对照(H2O)处理连续4周。处理4周后，我们观察到Wnt替代物处理的小鼠的心脏看上去比用载体对照处理的小鼠大(图7A和图13A)。通过心脏身体重量比(图7B)和LV直径(图7D)的增加支持了这一观察结果。H&E染色显示具有增加的尺寸的整体上正常的心脏(图7C-E)。细胞分析显示，在用或不用Wnt替代物处理的小鼠中相对CM大小是相当的(图7F-G)，表明Wnt替代物处理促进了成年心肌的生长。
实施例8-12的实验程序
hiPSC-CM的化学上确定的分化。为了从多能干细胞产生人心肌细胞，使用化学上确定的心肌细胞分化方案将hiPSC分化为hiPSC-CM。这些hiPSC-CM维持在补充有重组人白蛋白和抗坏血酸(CDM3)10的RPMI 1640培养基中。简言之，首先用GSK3β信号传导小分子抑制剂CHIR99021处理hiPSC，以激活Wnt信号传导途径。两天后，将细胞用Wnt信号传导抑制剂Wnt-C59处理直至第4天。此后，每两天更换不含任何小分子的CDM3培养基。为了纯化心肌细胞，对细胞群进行葡萄糖饥饿处理并补充5mM DL-乳酸钠持续2至4天，以代谢地选择hiPSC-CM44。在重新铺板hiPSC-CM时，将细胞用TrypLE Express(Life Technologies)分离并重新接种在包被Matrigel的板上。
96孔分化、成像和定量活力测定。对于96孔、hiPSC-CM分化测定，将hiPSC以每孔1000个细胞的量铺板在包被Matrigel的96孔板中，并允许贴壁4天。随后用生物活性脂质以指定浓度和持续时间处理hiPSC，并在化学上确定的hiPSC-CM分化方案的第8天后进行评估。使用先前公开的方案进行免疫染色以定性评估细胞活力和心肌细胞分化效率(Sharma等人，2014)。使用ImageJ软件定量荧光强度和细胞数。为了进行定量活力测量，按照制造商推荐的程序用CellTiter-Glo 2.0活力测定(Promega)或PrestoBlue试剂(LifeTechnologies)处理细胞。使用Cytation 5酶标仪/成像仪(BioTek Instruments)进行96孔成像和活力测定。Prism(GraphPad)用于图形生成和统计分析。使用Zeiss LSM 510Meta显微镜(Carl Zeiss)利用Zen软件进行共聚焦成像。
小分子。S1P和LPA从Sigma Aldrich获得，并以1mM和10mM的储备溶液溶解在水中。除非另有说明，否则S1P和LPA的终浓度为10μM。C59和CHIR99021获自Tocris Bioscience，并以10mM的储备液浓度溶于DMSO。S1P拮抗剂VPC 23019获自Tocris Bioscience，并溶解在酸化的DMSO中。
激酶磷酸化分析。使用人磷酸-受体酪氨酸激酶(RTK)阵列或人磷酸-激酶抗体阵列(R&D Systems)测定人激酶和其他磷蛋白的磷酸化(表S1)。用生物活性脂质以指定浓度和持续时间处理细胞。将RTK或磷酸-激酶组与10mg细胞蛋白裂解物一起孵育过夜，然后与抗磷酸-酪氨酸-辣根过氧化物酶抗体一起孵育过夜，以评估磷酸化。使用Gel Doc XR(BioRad)显影印迹。使用ImageJ软件确定磷酸化强度。
萤光素酶发光测量。将HiPSC和第30天的hiPSC-CM重新铺板在96孔板中，并培养2-3天，然后用100ng/孔的Lipofectamine(Invitrogen)和TOPFlash(TCF/LEF)萤光素酶Wnt信号传导报告质粒(M50，Addgene)进行转染。48小时后，更换培养基，使细胞经受2小时的不同处理，然后裂解，并使用标准发光酶标仪测量萤光素酶(Promega)的发光。
基因表达。使用实时定量PCR评估生物活性脂质处理后特定的感兴趣的基因的基因表达水平。使用RNeasy Plus试剂盒(QIAGEN)分离RNA，并使用High-Capacity RNA-to-cDNA试剂盒(Applied Biosystems)产生cDNA。使用
Figure BDA0002685201660000391
Green qPCR Master Mix(2X)(Affymetrix)通过CFXTM Connect Real-Time System(BIO-RAD)进行实时PCR。qPCR反应一式两份地进行，将其针对参考基因GAPDH进行标准化，并使用比较Ct方法(Schmittgen等人，2008)进行评估。为了对生物活性脂质处理后的hiPSC进行更全面的转录组分析，使用
Figure BDA0002685201660000392
Human Gene 1.0ST DNA Microarray(Affymetrix)。
统计方法。除非另有说明，否则数据以平均值±标准偏差表示。除非另有说明，否则比较是通过学生t检验进行的，其中显著性差异(*)由P<0.05定义。对于微阵列，使用Affymetrix Transcriptome Analysis Console 2.0软件利用单向受试者间ANOVA(P<0.05)进行多重P值比较。
影像S1：通过葡萄糖剥夺纯化后的hiPSC-CM。分化后，hiPSC-CM在心脏分化开始后大约第8-10天开始自发收缩。葡萄糖剥夺后，细胞片层含有较纯的hiPSC-CM群体。影像是放大10倍的。
人诱导多能干细胞(hiPSC)的衍生。这项研究的所有方案均已获得斯坦福大学机构审查委员会的批准。根据先前公开的方案(Churko等人，2013)进行重编程。总之，外周血单核细胞(PBMC)是通过从同意的个体中进行标准抽血获得的，并使用Ficoll梯度分离法进行分离。按照制造商提供的方案，使用表达OCT4、KLF4、SOX2和MYC(OKSM)的仙台病毒载体(Life Technologies)对PBMC进行重编程。重编程后约一个月，分离出hiPSC克隆，并在E8多能干细胞培养基(Life Technologies)中于生长因子减量的包被Matrigel(Corning)的6孔组织培养皿(Greiner)上进行培养。
基因表达。使用Ion AmpliSeq(Life Technologies)测定hiPSC-CM中生物活性脂质受体的表达。用RNeasy Micro试剂盒(Qiagen)提取RNA。使用Ion AmpliSeqTranscriptome Human Gene Expression试剂盒合成cDNA文库。将文库添加至Ion PI芯片中，并添加至Ion Chef仪器中用于模板制备。转录组测序在Ion Proton测序系统(LifeTechnologies)上进行。为了对脂质处理后的hiPSC-CM进行表达分析，使用
Figure BDA0002685201660000401
Human Gene 1.0ST DNA Microarray(Affymetrix)，或者进行qPCR表达分析(BioRad)。
实施例8.生物活性脂质以阶段特异性方式增强从hiPSC的心脏分化
通过引入表达Yamanaka因子(OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC)的病毒载体来重编程来自五个个体的体细胞组织来产生五个hiPSC细胞系。随后，使用化学上确定的方案分化所有hiPS细胞系以生成心肌细胞(Burridge等人，2014；Churko等人，2013)。由于hiPSC细胞系3、4和5在不添加生物活性脂质的情况下很好地分化为搏动的心肌细胞，因此我们研究了S1P/LPA对hiPS细胞系1和2的作用，后者表现出分化为心肌细胞的受损的能力。
研究了S1P和LPA处理是否可以改善这两种难以分化的hiPS细胞系中的心肌细胞分化。建立了一个96孔分化平台，以评估用生物活性脂质处理后CM分化的效率(图15A)。使用该平台，已确定在化学上确定的分化方案中在第0-2天之间S1P和/或LPA与CHIR的同时添加与对照相比使hiPSC-CM生成增强2-3倍，如通过在第8天心肌肌钙蛋白T(TnT)的表达评估的(Burridge等人2014；Churko等人2013)(图15B-C)。当在分化的第4-6天或6-8天之间添加S1P/LPA时，未检测到hiPSC-CM分化的显著增强(图15C)。这些结果表明，在这些原本较差分化的hiPS细胞系中，生物活性脂质在增强心脏分化和心肌细胞生成方面起着早期作用。
实施例9.在hiPS细胞中生物活性脂质与Wnt/β-联蛋白协同作用以诱导中胚层分化
这些研究的其余部分是对表现出正常心脏分化能力的三个独立的hiPS细胞系进行的。以前已证明，使用Wnt/β-联蛋白信号传导诱导剂处理未分化的hiPSC有效增强中胚层分化(Burridge等人，2014)。由于发现在较早施用生物活性脂质时增强hiPSC-CM的分化，因此假设观察到的hiPSC-CM形成的增加可能归因于S1P/LPA引起的核β-联蛋白的水平的增加。在其他细胞系中的先前工作显示，生物活性脂质增强粘附连接处β-联蛋白与E-钙黏着蛋白的解离，从而增加可用于细胞核中的下游信号传导的细胞质β-联蛋白(Kam等人，2009)。研究了未分化的hiPS细胞的单独的或与CHIR组合的S1P/LPA处理是否可以增加核β-联蛋白的水平。首先，注意到单独的S1P/LPA处理在hiPS细胞中诱导了β-联蛋白的显著核累积(图16A-B)。另外，在不同时间点对β-联蛋白进行的连续免疫染色显示，这种作用最早可在处理后2小时内观察到(图20A)。与CHIR组合使用时，S1P和LPA进一步促进了β-联蛋白的核累积，表明这些化合物之间具有协同作用(图16A-B)。为了检查核β-联蛋白水平的增加是否在转录水平上导致Wnt信号传导的激活，将hiPSC用先前描述的TOPFlash萤光素酶报告质粒23(Veeman等人2003)转染。该系统使用生物发光技术提供了Wnt转录活性的成比例可视化。随后，将细胞用二甲基亚砜(DMSO)、CHIR、S1P/LPA或S1P/LPA与CHIR的组合处理。有趣的是，当与DMSO对照组相比较时，仅使用S1P/LPA的处理使TCF/LEF萤光素酶活性最低程度地增加(约1.25倍)(图16C)，而仅使用CHIR的处理导致TCF/LEF萤光素酶活性的高度显著的约40倍增加。当S1P/LPA与CHIR组合使用时，与DMSO对照相比，TCF/LEF萤光素酶活性进一步提高到超过60倍(图16C)。因此，尽管单独的S1P/LPA处理最低程度地激活LEF/TCF报告基因，但该生物活性脂质与CHIR协同作用以进一步增加β-联蛋白信号传导(图16D)。
为了揭示S1P/LPA处理后基因表达的关键变化，在分化的第2天对hiPS细胞进行了全基因组微阵列表达分析。有趣的是，发现DKK4和DKK1显著下调(图16E)，这是众所周知的调节干细胞发育和分化的Wnt抑制剂(Paige等人，2010)。此外，我们的微阵列数据还揭示了细胞骨架和细胞外基质基因(例如COL12A1和波形蛋白(VIM))的表达增加，后者与发育过程中上皮向间质的转化有关。
综上所述，这些结果表明，生物活性脂质S1P和LPA与GSK3β抑制剂CHIR协同作用以在hiPSC分化过程中增加Wnt信号传导/β-联蛋白核累积，这可能是通过增强β-联蛋白从膜相关E-钙黏着蛋白的释放实现的(图16D)。S1P和LPA处理还抑制Wnt抑制剂(如DKK1/4)的表达，并增加细胞骨架/细胞外基质基因的表达。
实施例10.生物活性脂质诱导hiPSC分化期间细胞形态和基因表达的变化
此微阵列数据显示了通过S1P/LPA处理诱导的细胞骨架和细胞外基质基因(例如COL12A1和VIM)的上调，提示其生物学表型发生了变化(图16E)。此外，在S1P/LPA处理的24小时内，细胞形态发生了显著变化，并且细胞大小增加了两倍(图17A-B)。有趣的是，这伴随着细胞数量的很少和甚至没有的增加(图17C)。
基因表达的变化在用生物活性脂质或CHIR处理后在使用免疫染色和定量PCR分析的微阵列研究中得到验证(图17D-E)。有趣的是，发现只有CHIR处理可以增加VIM和短尾蛋白T(Bry T)的表达(Menez等人，2010)，而S1P/LPA处理仅增加VIM的表达而不影响Bry T的表达(图17D-E)。总之，这些结果证明了生物活性脂质对hiPSC的Wnt信号传导介导的中胚层分化具有增强心脏分化的协同但在机理上独立的作用。
实施例11.生物活性脂质和Wnt/β-联蛋白激活诱导终末分化的hiPSC-CM中的细胞周期活性的协同作用
先前的研究表明，β-联蛋白激活是小鼠胎儿心脏和人胚胎干细胞衍生的心肌细胞中心室心肌细胞增殖所必需的，并且hiPSC-CM细胞周期停滞的代谢调节可通过β-联蛋白信号传导的激活来逆转(Buikema等人2013；Mills等人2017)。鉴于生物活性脂质和Wnt/β-联蛋白信号传导之间增强中胚层分化的协同作用(图16、17)，检查了生物活性脂质是否也可以与Wnt/β-联蛋白信号传导协同作用以诱导hiPSC-CM的增殖。
为解决这个问题，使用化学上确定的方案(Burridge等人，2014年；Churko等人，2013年；Sharma等人，2015年)生成了良好分化的hiPSC-CM(例如，第30天或更晚的)(影像S1)并用S1P/LPA或CHIR或两者处理它们(图18A)。首先验证了这些细胞中S1P/LPA受体的存在(图21)。然后在心肌肌钙蛋白T(TnT)阳性细胞中针对细胞周期活性标志物ki67和有丝分裂标志物磷酸组蛋白H3(pHH3)进行免疫荧光染色。发现单独使用S1P/LPA的处理可诱导未成熟(约第20-30天)以及良好分化(约第50天)的hiPSC-CM中的ki67表达达到与单独使用CHIR(一种众所周知的促分裂原(Titmarsh等人2016))的处理相似的水平(图18B-C、21)。然而，尽管ki67表达增加，但S1P/LPA处理并未导致hiPSC-CM的数量增加，表明细胞(图18D)和核(图18E-F)分裂是不完全的。尽管如此，单独使用CHIR的处理导致细胞数量增加，并且向CHIR添加S1P/LPA进一步增强了由CHIR介导的hiPSC-CM的增殖，如细胞数量和pHH3表达的增加所证明的(图18D-F)。使用S1P/LPA或CHIR或两者的两天处理没有增加双核或多核心肌细胞的数量(图18G)。
用S1P/LPA或CHIR处理的第30天的hiPSC-CM的其他功能分析显示与良好分化的hiPSC-CM对照相比其搏动频率或收缩力产生无显著差异(图22)。这些研究举例说明了S1P/LPA在良好分化的hiPSC-CM中调节细胞周期活性和与β-联蛋白信号传导协同作用以增加hiPSC-CM增殖的额外作用。
实施例12.生物活性脂质激活hiPSC-CM中的ERK信号传导
为了确定S1P/LPA在hiPSC-CM中调节细胞周期活性的机制，使用TOPFlash(TCF/LEF–萤光素酶)报告基因评估了S1P和LPA处理是否可以直接刺激第30天的心肌细胞中的Wnt/β-联蛋白信号传导。本公开内容报告了虽然在单独的CHIR的存在下激活了经典Wnt信号传导(通过TOPFlash报告基因测量的)，但用S1P/LPA处理不能增加TCF/LEF-萤光素酶活性(图19A)，提示生物活性脂质的作用在hiPSC-CM中不是由Wnt信号传导直接介导的。
考虑到Hippo/Yap信号传导在调节心肌细胞和非肌细胞增殖和再生中的众所周知的作用(Yusuf等人，2012；Heallen等人，2011；Morikawa等人，2017；Leach等人，2017；vonGise等人，2012)，评估了生物活性脂质促进Yap的核累积的能力(图23)。令人惊讶地，发现在hiPSC-CM和许多其他细胞类型(包括未分化的hiPSC和hiPSC衍生的非肌细胞)中在基线处的强细胞核YAP定位(计数的所有细胞核的>85-90％)(图23A)。因此，在生物活性脂质处理后，未观察到细胞核YAP累积的增加(图23B)。
为进一步阐明S1P/LPA调节hiPSC-CM中细胞周期活性的机制，在用S1P/LPA处理后在第30天的hiPSC-CM中进行了充分的激酶磷酸化小组筛选(表S1)。
值得注意的是，在S1P/LPA处理后，观察到ERK1/2(一种已知的细胞周期活性调节剂)的磷酸化的迅速上调(图19B)(Zang等人，2002)。在用S1P/LPA处理的5分钟内还观察到HSP27的磷酸化的下调以及GSK3β和JNK磷酸化的细微变化(图19B)。与S1P/LPA对经典Wnt/β-联蛋白信号传导的直接作用的缺乏相一致，用S1P/LPA处理后，β-联蛋白的水平保持不变。在经历心脏分化的hiPSC中S1P/LPA处理的分析显示，尽管S1P/LPA对CHIR诱导的中胚层诱导有影响(图16)，但ERK1/2磷酸化在第0天的未分化的hiPSC中不是活跃的(图24)。
为解决S1P/LPA是否通过刺激MAPK/MEK/ERK信号传导级联反应促进hiPSC-CM中的ERK1/2磷酸化，在存在或不存在曲美替尼(ERK上游的MEK信号传导的一种小分子抑制剂(Kim等人，2013))的情况下，用S1P/LPA处理hiPSC-CM。此公开内容报告了S1P/LPA激活hiPSC-CM中ERK磷酸化的能力在曲美替尼的存在下被消除，证实了S1P/LPA诱导的ERK磷酸化是由MAPK/MEK/ERK信号传导介导的(图19C、图25)。
通过在存在和不存在曲美替尼的情况下用S1P/LPA处理hiPSC-CM来检查MAPK/MEK/ERK信号传导对S1P/LPA诱导的细胞周期活性的要求，并评估ki67在hiPSC-CM中的表达(图19D-E)。此公开内容报告了曲美替尼处理消除了S1P/LPA诱导的ki67上调。这证实了MAP/MEK/ERK信号传导在hiPSC-CM中的S1P/LPA介导的细胞周期激活中的作用。
为了评估S1P受体信号传导是否参与S1P介导的hiPSC-CM细胞周期激活，将hiPSC-CM与单独的或与其受体拮抗剂VPC23019(Davis等人，2005)一起的S1P一起培养。发现在VPC23019存在的情况下，S1P处理的hiPSC-CM中ki67的表达减少(图19F-G)。这支持了S1P受体介导生物活性脂质诱导的hiPSC-CM细胞周期活化的作用(图19H)。最后，尽管在响应于S1P/LPA处理在hiPSC-CM中观察到细胞周期活性的增加，但是未观察到在S1P/LPA处理后hiPSC-CM的成熟状态或亚型特性的改变(图26)。
参考文献
Bassat,E.,Mutlak,Y.E.,Genzelinakh,A.,Shadrin,I.Y.,Baruch Umansky,K.,Yifa,O.,Kain,D.,Rajchman,D.,Leach,J.,Riabov Bassat,D.,等人(2017).Theextracellular matrix protein agrin promotes heart regeneration in mice.Nature547,179-184.
Beltrami,A.P.,Urbanek,K.,Kajstura,J.,Yan,S.M.,Finato,N.,Bussani,R.,Nadal-Ginard,B.,Silvestri,F.,Leri,A.,Beltrami,C.A.,等人(2001).Evidence thathuman cardiac myocytes divide after myocardial infarction.N Engl J Med 344,1750-1757.
Bergmann,O.,Bhardwaj,R.D.,Bernard,S.,Zdunek,S.,Barnabe-Heider,F.,Walsh,S.,Zupicich,J.,Alkass,K.,Buchholz,B.A.,Druid,H.,等人(2009).Evidence forcardiomyocyte renewal in humans.Science 324,98-102.
Bersell,K.,Arab,S.,Haring,B.,and Kuhn,B.(2009).Neuregulin1/ErbB4signaling induces cardiomyocyte proliferation and repair of heart injury.Cell138,257-270.
Birket,M.J.,Ribeiro,M.C.,Verkerk,A.O.,Ward,D.,Leitoguinho,A.R.,denHartogh,S.C.,Orlova,V.V.,Devalla,H.D.,Schwach,V.,Bellin,M.,等人(2015).Expansion and patterning of cardiovascular progenitors derived from humanpluripotent stem cells.Nat Biotechnol 33,970-979.
Bruneau,B.G.(2013).Signaling and transcriptional networks in heartdevelopment and regeneration.Cold Spring Harb Perspect Biol 5,a008292.
Buikema,J.W.,Mady,A.S.,Mittal,N.V.,Atmanli,A.,Caron,L.,Doevendans,P.A.,Sluijter,J.P.,and Domian,I.J.(2013).Wnt/beta-catenin signaling directsthe regional expansion of first and second heart field-derived ventricularcardiomyocytes.Development 140,4165-4176.
Burridge,P.W.,Keller,G.,Gold,J.D.,and Wu,J.C.(2012).Production of denovo cardiomyocytes:human pluripotent stem cell differentiation and directreprogramming.Cell stem cell 10,16-28.
Burridge,P.W.,Matsa,E.,Shukla,P.,Lin,Z.C.,Churko,J.M.,Ebert,A.D.,Lan,F.,Diecke,S.,Huber,B.,Mordwinkin,N.M.,等人(2014).Chemically definedgeneration of human cardiomyocytes.Nat Methods 11,855-860.
Chong,J.J.,Yang,X.,Don,C.W.,Minami,E.,Liu,Y.W.,Weyers,J.J.,Mahoney,W.M.,Van Biber,B.,Cook,S.M.,Palpant,N.J.,等人(2014).Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts.Nature 510,273-277.
Cohen,E.D.,Wang,Z.,Lepore,J.J.,Lu,M.M.,Taketo,M.M.,Epstein,D.J.,andMorrisey,E.E.(2007).Wnt/beta-catenin signaling promotes expansion of Isl-1-positive cardiac progenitor cells through regulation of FGF signaling.J ClinInvest 117,1794-1804.
Conejo,R.,de Alvaro,C.,Benito,M.,Cuadrado,A.,and Lorenzo,M.(2002).Insulin restores differentiation of Ras-transformed C2C12 myoblasts byinducing NF-kappaB through an AKT/P70S6K/p38-MAPK pathway.Oncogene 21,3739-3753.
de Boer,B.A.,van den Berg,G.,de Boer,P.A.,Moorman,A.F.,and Ruijter,J.M.(2012).Growth of the developing mouse heart:an interactive qualitativeand quantitative 3D atlas.Dev Biol 368,203-213.
Foglia,M.J.,and Poss,K.D.(2016).Building and re-building the heart bycardiomyocyte proliferation.Development 143,729-740.
Foley,A.C.,and Mercola,M.(2005).Heart induction by Wnt antagonistsdepends on the homeodomain transcription factor Hex.Genes&development 19,387-396.
Goldstein,M.A.,Claycomb,W.C.,and Schwartz,A.(1974).DNA synthesis andmitosis in well-differentiated mammalian cardiocytes.Science 183,212-213.
Heallen,T.,Zhang,M.,Wang,J.,Bonilla-Claudio,M.,Klysik,E.,Johnson,R.L.,and Martin,J.F.(2011).Hippo pathway inhibits Wnt signaling to restraincardiomyocyte proliferation and heart size.Science 332,458-461.
Janda,C.Y.,Dang,L.T.,You,C.,Chang,J.,de Lau,W.,Zhong,Z.A.,Yan,K.S.,Marecic,O.,Siepe,D.,Li,X.,等人(2017).Surrogate Wnt agonists that phenocopycanonical Wnt and beta-catenin signalling.Nature 545,234-237.
Josowitz,R.,Lu,J.,Falce,C.,D'Souza,S.L.,Wu,M.,Cohen,N.,Dubois,N.C.,Zhao,Y.,Sobie,E.A.,Fishman,G.I.,等人(2014).Identification and purification ofhuman induced pluripotent stem cell-derived atrial-like cardiomyocytes basedon sarcolipin expression.PloS one9,e101316.
Kattman,S.J.,Witty,A.D.,Gagliardi,M.,Dubois,N.C.,Niapour,M.,Hotta,A.,Ellis,J.,and Keller,G.(2011).Stage-specific optimization of activin/nodal andBMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotentstem cell lines.Cell stem cell 8,228-240.
Kerkela,R.,Kockeritz,L.,Macaulay,K.,Zhou,J.,Doble,B.W.,Beahm,C.,Greytak,S.,Woulfe,K.,Trivedi,C.M.,Woodgett,J.R.,等人(2008).Deletion of GSK-3beta in mice leads to hypertrophic cardiomyopathy secondary tocardiomyoblast hyperproliferation.J Clin Invest 118,3609-3618.
Kikuchi,K.,Holdway,J.E.,Werdich,A.A.,Anderson,R.M.,Fang,Y.,Egnaczyk,G.F.,Evans,T.,Macrae,C.A.,Stainier,D.Y.,and Poss,K.D.(2010).Primarycontribution to zebrafish heart regeneration by gata4(+)cardiomyocytes.Nature464,601-605.
Kurabayashi,M.,Komuro,I.,Tsuchimochi,H.,Takaku,F.,and Yazaki,Y.(1988).Molecular cloning and characterization of human atrial and ventricularmyosin alkali light chain cDNA clones.The Journal of biological chemistry263,13930-13936.
Kwon,C.,Qian,L.,Cheng,P.,Nigam,V.,Arnold,J.,and Srivastava,D.(2009).Aregulatory pathway involving Notch1/beta-catenin/Isl1 determines cardiacprogenitor cell fate.Nat Cell Biol 11,951-957.
Laflamme,M.A.,and Murry,C.E.(2011).Heart regeneration.Nature 473,326-335.
Lee,J.H.,Protze,S.I.,Laksman,Z.,Backx,P.H.,and Keller,G.M.(2017).Human Pluripotent Stem Cell-Derived Atrial and Ventricular CardiomyocytesDevelop from Distinct Mesoderm Populations.Cell stem cell 21,179-194e174.
Lian,X.,Hsiao,C.,Wilson,G.,Zhu,K.,Hazeltine,L.B.,Azarin,S.M.,Raval,K.K.,Zhang,J.,Kamp,T.J.,and Palecek,S.P.(2012).Robust cardiomyocytedifferentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation ofcanonical Wnt signaling.Proceedings of the National Academy of Sciences ofthe United States of America 109,E1848-1857.
Lian,X.,Zhang,J.,Azarin,S.M.,Zhu,K.,Hazeltine,L.B.,Bao,X.,Hsiao,C.,Kamp,T.J.,and Palecek,S.P.(2013).Directed cardiomyocyte differentiation fromhuman pluripotent stem cells by modulating Wnt/beta-catenin signaling underfully defined conditions.Nat Protoc 8,162-175.
Lin,L.,Cui,L.,Zhou,W.,Dufort,D.,Zhang,X.,Cai,C.L.,Bu,L.,Yang,L.,Martin,J.,Kemler,R.,等人(2007).Beta-catenin directly regulates Islet1expression in cardiovascular progenitors and is required for multiple aspectsof cardiogenesis.Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of America 104,9313-9318.
Lindsley,C.W.,Barnett,S.F.,Yaroschak,M.,Bilodeau,M.T.,and Layton,M.E.(2007).Recent progress in the development of ATP-competitive and allostericAkt kinase inhibitors.Curr Top Med Chem 7,1349-1363.
Liu,P.,Begley,M.,Michowski,W.,Inuzuka,H.,Ginzberg,M.,Gao,D.,Tsou,P.,Gan,W.,Papa,A.,Kim,B.M.,等人(2014).Cell-cycle-regulated activation of Aktkinase by phosphorylation at its carboxyl terminus.Nature 508,541-545.
Mauritz,C.,Schwanke,K.,Reppel,M.,Neef,S.,Katsirntaki,K.,Maier,L.S.,Nguemo,F.,Menke,S.,Haustein,M.,Hescheler,J.,等人(2008).Generation offunctional murine cardiac myocytes from induced pluripotent stemcells.Circulation 118,507-517.
Mazzotta,S.,Neves,C.,Bonner,R.J.,Bernardo,A.S.,Docherty,K.,andHoppler,S.(2016).Distinctive Roles of Canonical and Noncanonical WntSignaling in Human Embryonic Cardiomyocyte Development.Stem Cell Reports 7,764-776.
Paige,S.L.,Osugi,T.,Afanasiev,O.K.,Pabon,L.,Reinecke,H.,and Murry,C.E.(2010).Endogenous Wnt/beta-catenin signaling is required for cardiacdifferentiation in human embryonic stem cells.PloS one 5,e11134.
Patterson,M.,Barske,L.,Van Handel,B.,Rau,C.D.,Gan,P.,Sharma,A.,Parikh,S.,Denholtz,M.,Huang,Y.,Yamaguchi,Y.,等人(2017).Frequency ofmononuclear diploid cardiomyocytes underlies natural variation in heartregeneration.Nat Genet 49,1346-1353.
Porrello,E.R.,Mahmoud,A.I.,Simpson,E.,Hill,J.A.,Richardson,J.A.,Olson,E.N.,and Sadek,H.A.(2011).Transient regenerative potential of theneonatal mouse heart.Science 331,1078-1080.
Protze,S.I.,Liu,J.,Nussinovitch,U.,Ohana,L.,Backx,P.H.,Gepstein,L.,and Keller,G.M.(2017).Sinoatrial node cardiomyocytes derived from humanpluripotent cells function as a biological pacemaker.Nat Biotechnol 35,56-68.
Qyang,Y.,Martin-Puig,S.,Chiravuri,M.,Chen,S.,Xu,H.,Bu,L.,Jiang,X.,Lin,L.,Granger,A.,Moretti,A.,等人(2007).The renewal and differentiation ofIsl1+cardiovascular progenitors are controlled by a Wnt/beta-cateninpathway.Cell stem cell 1,165-179.
Ribeiro,A.J.,Ang,Y.S.,Fu,J.D.,Rivas,R.N.,Mohamed,T.M.,Higgs,G.C.,Srivastava,D.,and Pruitt,B.L.(2015).Contractility of single cardiomyocytesdifferentiated from pluripotent stem cells depends on physiological shape andsubstrate stiffness.Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of America 112,12705-12710.
Risebro,C.A.,Vieira,J.M.,Klotz,L.,and Riley,P.R.(2015).Characterisation of the human embryonic and foetal epicardium during heartdevelopment.Development 142,3630-3636.
Sato,N.,Meijer,L.,Skaltsounis,L.,Greengard,P.,and Brivanlou,A.H.(2004).Maintenance of pluripotency in human and mouse embryonic stem cellsthrough activation of Wnt signaling by a pharmacological GSK-3-specificinhibitor.Nat Med 10,55-63.
Schneider,V.A.,and Mercola,M.(2001).Wnt antagonism initiatescardiogenesis in Xenopus laevis.Genes&development 15,304-315.
Senyo,S.E.,Lee,R.T.,and Kuhn,B.(2014).Cardiac regeneration based onmechanisms of cardiomyocyte proliferation and differentiation.Stem Cell Res13,532-541.
Senyo,S.E.,Steinhauser,M.L.,Pizzimenti,C.L.,Yang,V.K.,Cai,L.,Wang,M.,Wu,T.D.,Guerquin-Kern,J.L.,Lechene,C.P.,and Lee,R.T.(2013).Mammalian heartrenewal by pre-existing cardiomyocytes.Nature 493,433-436.
Song,G.,Ouyang,G.,and Bao,S.(2005).The activation of Akt/PKBsignaling pathway and cell survival.J Cell Mol Med 9,59-71.
Srivastava,D.(2006).Making or breaking the heart:from lineagedetermination to morphogenesis.Cell 126,1037-1048.
Stoick-Cooper,C.L.,Weidinger,G.,Riehle,K.J.,Hubbert,C.,Major,M.B.,Fausto,N.,and Moon,R.T.(2007).Distinct Wnt signaling pathways have opposingroles in appendage regeneration.Development 134,479-489.
Titmarsh,D.M.,Glass,N.R.,Mills,R.J.,Hidalgo,A.,Wolvetang,E.J.,Porrello,E.R.,Hudson,J.E.,and Cooper-White,J.J.(2016).Induction of HumaniPSC-Derived Cardiomyocyte Proliferation Revealed by Combinatorial Screeningin High Density Microbioreactor Arrays.Sci Rep 6,24637.
Trosset,J.Y.,Dalvit,C.,Knapp,S.,Fasolini,M.,Veronesi,M.,Mantegani,S.,Gianellini,L.M.,Catana,C.,Sundstrom,M.,Stouten,P.F.,等人(2006).Inhibition ofprotein-protein interactions:the discovery of druglike beta-catenininhibitors by combining virtual and biophysical screening.Proteins 64,60-67.
Tseng,A.S.,Engel,F.B.,and Keating,M.T.(2006).The GSK-3inhibitor BIOpromotes proliferation in mammalian cardiomyocytes.Chemistry&biology 13,957-963.
Uosaki,H.,Magadum,A.,Seo,K.,Fukushima,H.,Takeuchi,A.,Nakagawa,Y.,Moyes,K.W.,Narazaki,G.,Kuwahara,K.,Laflamme,M.,等人(2013).Identification ofchemicals inducing cardiomyocyte proliferation in developmental stage-specific manner with pluripotent stem cells.Circ Cardiovasc Genet 6,624-633.
Uygur,A.,and Lee,R.T.(2016).Mechanisms of Cardiac Regeneration.DevCell 36,362-374.
Wu,S.M.,Chien,K.R.,and Mummery,C.(2008).Origins and fates ofcardiovascular progenitor cells.Cell 132,537-543.
Yang,L.,Soonpaa,M.H.,Adler,E.D.,Roepke,T.K.,Kattman,S.J.,Kennedy,M.,Henckaerts,E.,Bonham,K.,Abbott,G.W.,Linden,R.M.,等人(2008).Humancardiovascular progenitor cells develop from a KDR+embryonic-stem-cell-derived population.Nature 453,524-528.
Ye,B.,Hou,N.,Xiao,L.,Xu,Y.,Boyer,J.,Xu,H.,and Li,F.(2015).APCcontrols asymmetric Wnt/beta-catenin signaling and cardiomyocyteproliferation gradient in the heart.Journal of molecular and cellularcardiology 89,287-296.
Yin,X.,Farin,H.F.,van Es,J.H.,Clevers,H.,Langer,R.,and Karp,J.M.(2014).Niche-independent high-purity cultures of Lgr5+intestinal stem cellsand their progeny.Nat Methods 11,106-112.
Zhang,J.,Wilson,G.F.,Soerens,A.G.,Koonce,C.H.,Yu,J.,Palecek,S.P.,Thomson,J.A.,and Kamp,T.J.(2009).Functional cardiomyocytes derived from humaninduced pluripotent stem cells.Circulation research 104,e30-41.
Zhang,Y.,Cao,N.,Huang,Y.,Spencer,C.I.,Fu,J.D.,Yu,C.,Liu,K.,Nie,B.,Xu,T.,Li,K.,等人(2016).Expandable Cardiovascular Progenitor Cells Reprogrammedfrom Fibroblasts.Cell stem cell 18,368-381.
Sharma,A.,Zhang,Y.&Wu,S.M.Harnessing the Induction of CardiomyocyteProliferation for Cardiac Regenerative Medicine.Current treatment options incardiovascular medicine 17,404,doi:10.1007/s11936-015-0404-z(2015).
Bergmann,O.等人Evidence for cardiomyocyte renewal in humans.Science324,98-102,doi:10.1126/science.1164680(2009).
Chuang,W.等人Partial Reprogramming of Pluripotent Stem Cell-DerivedCardiomyocytes into Neurons.Scientific reports 7,44840,doi:10.1038/srep44840(2017).
Laflamme,M.A.&Murry,C.E.Heart regeneration.Nature 473,326-335,doi:10.1038/nature10147(2011).
Serpooshan,V.等人Nkx2.5+Cardiomyoblasts Contribute toCardiomyogenesis in the Neonatal Heart.Sci Rep 7,12590,doi:10.1038/s41598-017-12869-4(2017).
Li,G.等人Transcriptomic Profiling Maps Anatomically PatternedSubpopulations among Single Embryonic Cardiac Cells.Dev Cell 39,491-507,doi:10.1016/j.devcel.2016.10.014(2016).
Lian,X.等人Robust cardiomyocyte differentiation from humanpluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wntsignaling.Proc Natl Acad Sci U S A 109,E1848-1857,doi:10.1073/pnas.1200250109(2012).
Sharma,A.等人CRISPR/Cas9-Mediated Fluorescent Tagging of EndogenousProteins in Human Pluripotent Stem Cells.Current protocols in human genetics96,21 11 21-21 11 20,doi:10.1002/cphg.52(2018).
Sharma,A.,Toepfer,C.N.,Schmid,M.,Garfinkel,A.C.&Seidman,C.E.Differentiation and Contractile Analysis of GFP-Sarcomere Reporter hiPSC-Cardiomyocytes.Current protocols in human genetics 96,21 12 21-21 12 12,doi:10.1002/cphg.53(2018).
Burridge,P.W.等人Chemically defined generation of humancardiomyocytes.Nature methods 11,855-860,doi:10.1038/nmeth.2999(2014).
Lian,X.等人Directed cardiomyocyte differentiation from humanpluripotent stem cells by modulating Wnt/beta-catenin signaling under fullydefined conditions.Nat Protoc 8,162-175,doi:10.1038/nprot.2012.150(2013).
Kleger,A.,Liebau,S.,Lin,Q.,von Wichert,G.&Seufferlein,T.The impact ofbioactive lipids on cardiovascular development.Stem cells international 2011,916180,doi:10.4061/2011/916180(2011).
Clay,H.等人Sphingosine 1-phosphate receptor-1in cardiomyocytes isrequired for normal cardiac development.Dev Biol 418,157-165,doi:10.1016/j.ydbio.2016.06.024(2016).
Avery,K.,Avery,S.,Shepherd,J.,Heath,P.R.&Moore,H.Sphingosine-1-phosphate mediates transcriptional regulation of key targets associated withsurvival,proliferation,and pluripotency in human embryonic stem cells.Stemcells and development 17,1195-1205,doi:10.1089/scd.2008.0063(2008).
Garcia-Gonzalo,F.R.&Izpisua Belmonte,J.C.Albumin-associated lipidsregulate human embryonic stem cell self-renewal.PloS one 3,e1384,doi:10.1371/journal.pone.0001384(2008).
Pebay,A.,Bonder,C.S.&Pitson,S.M.Stem cell regulation by lysophospholipids.Prostaglandins Other Lipid Mediat 84,83-97,doi:10.1016/j.prostaglandins.2007.08.004(2007).
Harvey,K.F.,Zhang,X.&Thomas,D.M.The Hippo pathway and humancancer.Nat Rev Cancer 13,246-257,doi:10.1038/nrc3458(2013).
Marinissen,M.J.&Gutkind,J.S.G-protein-coupled receptors and signalingnetworks:emerging paradigms.Trends Pharmacol Sci 22,368-376(2001).
Oskouian,B.&Saba,J.Sphingosine-1-phosphate metabolism and intestinaltumorigenesis:lipid signaling strikes again.Cell Cycle 6,522-527,doi:10.4161/cc.6.5.3903(2007).
Yang,M.等人G protein-coupled lysophosphatidic acid receptorsstimulate proliferation of colon cancer cells through the{beta}-cateninpathway.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United Statesof America 102,6027-6032,doi:10.1073/pnas.0501535102(2005).
Churko,J.M.,Burridge,P.W.&Wu,J.C.Generation of human iPSCs from humanperipheral blood mononuclear cells using non-integrative Sendai virus inchemically defined conditions.Methods in molecular biology 1036,81-88,doi:10.1007/978-1-62703-511-8_7(2013).
Kam,Y.&Quaranta,V.Cadherin-bound beta-catenin feeds into the Wntpathway upon adherens junctions dissociation:evidence for an intersectionbetween beta-catenin pools.PloS one 4,e4580,doi:10.1371/journal.pone.0004580(2009).
Veeman,M.T.,Slusarski,D.C.,Kaykas,A.,Louie,S.H.&Moon,R.T.Zebrafishprickle,a modulator of noncanonical Wnt/Fz signaling,regulates gastrulationmovements.Curr Biol 13,680-685(2003).
Paige,S.L.等人Endogenous Wnt/beta-catenin signaling is required forcardiac differentiation in human embryonic stem cells.PloS one 5,e11134,doi:10.1371/journal.pone.0011134(2010).
Mendez,M.G.,Kojima,S.&Goldman,R.D.Vimentin induces changes in cellshape,motility,and adhesion during the epithelial to mesenchymaltransition.FASEB journal:official publication of the Federation of AmericanSocieties for Experimental Biology 24,1838-1851,doi:10.1096/fj.09-151639(2010).
Buikema,J.W.等人Wnt/beta-catenin signaling directs the regionalexpansion of first and second heart field-derived ventricularcardiomyocytes.Development 140,4165-4176,doi:10.1242/dev.099325(2013).
Mills,R.J.等人Functional screening in human cardiac organoids revealsa metabolic mechanism for cardiomyocyte cell cycle arrest.Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America,doi:10.1073/pnas.1707316114(2017).
Sharma,A.等人Derivation of highly purified cardiomyocytes from humaninduced pluripotent stem cells using small molecule-modulated differentiationand subsequent glucose starvation.Journal of visualized experiments:JoVE,doi:10.3791/52628(2015).
Titmarsh,D.M.等人Induction of Human iPSC-Derived CardiomyocyteProliferation Revealed by Combinatorial Screening in High DensityMicrobioreactor Arrays.Scientific reports6,24637,doi:10.1038/srep24637(2016).
Yusuf,S.W.,Sharma,J.,Durand,J.B.&Banchs,J.Endocarditis andmyocarditis:a brief review.Expert review of cardiovascular therapy 10,1153-1164,doi:10.1586/erc.12.107(2012).
Heallen,T.等人Hippo pathway inhibits Wnt signaling to restraincardiomyocyte proliferation and heart size.Science 332,458-461,doi:10.1126/science.1199010(2011).
Morikawa,Y.,Heallen,T.,Leach,J.,Xiao,Y.&Martin,J.F.Dystrophin-glycoprotein complex sequesters Yap to inhibit cardiomyocyteproliferation.Nature 547,227-231,doi:10.1038/nature22979(2017).
Leach,J.P.等人Hippo pathway deficiency reverses systolic heartfailure after infarction.Nature 550,260-264,doi:10.1038/nature24045(2017).
von Gise,A.等人YAP1,the nuclear target of Hippo signaling,stimulatesheart growth through cardiomyocyte proliferation but nothypertrophy.Proceedings of the National Academy of Sciences of the UnitedStates of America 109,2394-2399,doi:10.1073/pnas.1116136109(2012).
Zhang,W.&Liu,H.T.MAPK signal pathways in the regulation of cellproliferation in mammalian cells.Cell research 12,9-18,doi:10.1038/sj.cr.7290105(2002).
Kim,K.B.等人Phase II study of the MEK1/MEK2 inhibitor Trametinib inpatients with metastatic BRAF-mutant cutaneous melanoma previously treatedwith or without a BRAF inhibitor.Journal of clinical oncology:officialjournal of the American Society of Clinical Oncology 31,482-489,doi:10.1200/JCO.2012.43.5966(2013).
Davis,M.D.,Clemens,J.J.,Macdonald,T.L.&Lynch,K.R.Sphingosine 1-phosphate analogs as receptor antagonists.The Journal of biological chemistry280,9833-9841,doi:10.1074/jbc.M412356200(2005).
Hannun,Y.A.&Obeid,L.M.Principles of bioactive lipid signalling:lessons from sphingolipids.Nature reviews.Molecular cell biology 9,139-150,doi:10.1038/nrm2329(2008).
Lamouille,S.,Xu,J.&Derynck,R.Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition.Nature reviews.Molecular cell biology 15,178-196,doi:10.1038/nrm3758(2014).
Burkhalter,R.J.,Westfall,S.D.,Liu,Y.&Stack,M.S.Lysophosphatidic AcidInitiates Epithelial to Mesenchymal Transition and Induces beta-Catenin-mediated Transcription in Epithelial Ovarian Carcinoma.The Journal ofbiological chemistry 290,22143-22154,doi:10.1074/jbc.M115.641092(2015).
McMullen,M.E.,Bryant,P.W.,Glembotski,C.C.,Vincent,P.A.&Pumiglia,K.M.Activation of p38 has opposing effects on the proliferation and migrationof endothelial cells.The Journal of biological chemistry 280,20995-21003,doi:10.1074/jbc.M407060200(2005).
Lin,Z.等人Pi3kcb links Hippo-YAP and PI3K-AKT signaling pathways topromote cardiomyocyte proliferation and survival.Circulation research 116,35-45,doi:10.1161/CIRCRESAHA.115.304457(2015).
Bassat,E.等人The extracellular matrix protein agrin promotes heartregeneration in mice.Nature 547,179-184,doi:10.1038/nature22978(2017).
Tohyama,S.等人Distinct metabolic flow enables large-scalepurification of mouse and human pluripotent stem cell-derivedcardiomyocytes.Cell stem cell 12,127-137,doi:10.1016/j.stem.2012.09.013(2013).
Sharma,A.等人Human induced pluripotent stem cell-derivedcardiomyocytes as an in vitro model for coxsackievirus B3-induced myocarditisand antiviral drug screening platform.Circulation research 115,556-566,doi:10.1161/CIRCRESAHA.115.303810(2014).
Schmittgen,T.D.&Livak,K.J.Analyzing real-time PCR data by thecomparative C(T)method.Nat Protoc 3,1101-1108(2008).

Claims (28)

1.一种用于扩增搏动的心肌细胞的方法，所述方法包括用WNT激动剂、生物活性脂质和/或WNT激动剂与生物活性脂质的组合处理搏动的心肌细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述搏动的心肌细胞是人心肌细胞。
3.根据权利要求1或2中任一项所述的方法，其中所述处理在体外进行。
4.根据权利要求1或2中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在处理搏动的心肌细胞的步骤之前，将多能干细胞分化为搏动的心肌细胞的步骤。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述多能干细胞是胚胎干细胞、间充质干细胞、心肌祖细胞和/或诱导多能干(iPS)细胞。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述WNT激动剂是GSK3β抑制剂。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述生物活性脂质是鞘氨醇-1-磷酸(S1P)和/或溶血磷脂酸(LPA)。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述WNT激动剂是CHIR99021。
9.根据权利要求1-5或7中任一项所述的方法，其中所述WNT激动剂是CHIR99021、BIO、Wnt3A、Wnt3A+R-spondin、Wnt替代物ScFv-DKK1c、ScFv-DKK1c+R-spondin和/或其任何组合。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中在1天至120天的时间内处理所述搏动的心肌细胞。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中通过将所述WNT激动剂和/或生物脂质添加至组织培养基中来处理所述搏动的心肌细胞，其中对于每种生物活性脂质以1至50μM的终浓度、对于CHIR99021或BIO以1至50μM的终浓度、以及对于重组WNT激动剂Wnt3A、Wnt3A+R-spondin、Wnt替代物ScFv-DKK1c、ScFv-DKK1c+R-spondin和/或其任何组合以1至500ng/mL的终浓度添加至组织培养基中。
12.一种从多能干细胞产生搏动的心肌细胞的方法，所述方法包括：
用至少一种生物活性脂质和至少一种WNT激动剂处理多能干细胞。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述多能干细胞是人细胞。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述多能干细胞是胚胎干细胞、间充质干细胞、心肌祖细胞和/或诱导性多能干(iPS)细胞。
15.根据权利要求12-14中任一项所述的方法，其中所述WNT激动剂是GSK3β抑制剂。
16.根据权利要求12-15中任一项所述的方法，其中所述生物活性脂质是鞘氨醇-1-磷酸(S1P)和/或溶血磷脂酸(LPA)。
17.根据权利要求12-16中任一项所述的方法，其中所述WNT激动剂是CHIR99021。
18.根据权利要求12-16中任一项所述的方法，其中所述WNT激动剂是CHIR99021、BIO、Wnt3A、Wnt3A+R-spondin、Wnt替代物ScFv-DKK1c、ScFv-DKK1c+R-spondin和/或其任何组合。
19.根据权利要求12-18中任一项所述的方法，其中在1小时至10天的时间内处理所述多能干细胞。
20.根据权利要求12-19中任一项所述的方法，其中通过将S1P和LPA各自以1至50μM的终浓度、对于CHIR99021或BIO以1至50μM的终浓度、以及对于重组WNT激动剂Wnt3A、Wnt3A+R-spondin、Wnt替代物ScFv-DKK1c、ScFv-DKK1c+R-spondin和/或其任何组合以1至500ng/mL的终浓度添加至组织培养基中来处理所述多能干细胞。
21.一种用于获得人心肌细胞的方法，所述方法包括：
通过双相Wnt信号传导方案将hiPS细胞分化为搏动的心肌细胞，其中在方案的第一阶段的任何时间期间用至少一种Wnt激动剂和至少一种生物活性脂质处理hiPS细胞，和其中在方案的第二阶段期间用至少一种Wnt拮抗剂进一步处理细胞，从而获得搏动的心肌细胞；和
通过用至少一种生物活性脂质、至少一种Wnt激动剂及其任何组合处理搏动的心肌细胞来扩增搏动的心肌细胞。
22.通过权利要求21的方法产生的人搏动的心肌细胞。
23.一种药物筛选的方法，所述方法包括将权利要求22的人心肌细胞与药物接触，并监测所述药物对心肌细胞的作用。
24.一种治疗患有心脏病的患者的方法，所述方法包括将通过权利要求1-21中任一项的方法获得的心肌细胞直接施用至患者的心脏。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述心脏病是由先天性心脏病、由心肌梗塞、由心脏毒性剂例如蒽环类药物、酪氨酸激酶抑制剂和用于癌症疗法的免疫检查点抑制剂、由环境暴露例如酒精、细菌例如引起恰氏病或莱姆病的细菌、引起心肌炎的病毒或由遗传性/世袭性心肌病引起的心力衰竭。
26.根据权利要求24或25中任一项所述的方法，其中所述心肌细胞通过施加在患者的心脏上的贴剂施用至所述患者。
27.一种治疗患有心脏病的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用至少一种Wnt激动剂、Wnt替代物、生物活性脂质和/或其组合。
28.一种治疗患有心脏病或血管疾病的患者的方法，所述方法包括施用包含通过权利要求1-21中任一项的方法获得的心肌细胞的组织工程化血液泵。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112472701A (zh) * 2020-12-04 2021-03-12 复旦大学附属中山医院 Wnt抑制剂Wnt-C59在制备治疗SCN5A突变致扩张型心肌病的药物中的应用
CN113061573A (zh) * 2021-05-21 2021-07-02 苏州大学 间歇性饥饿促进心肌细胞成熟的方法
CN113249310A (zh) * 2021-05-17 2021-08-13 湖北大学 一种拓展性多能干细胞诱导分化为心肌细胞的方法及应用

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021251393A1 (ja) * 2020-06-09 2021-12-16 株式会社マイオリッジ 心筋細胞集団の製造方法、心筋細胞の増殖方法、心筋細胞集団、移植材料、多核心筋細胞、および心筋細胞増殖用キット
GB202117642D0 (en) * 2021-12-07 2022-01-19 Inst De Medicina Molecular Joao Lobo Antunes Methods of cardiomyocyte production
WO2023183371A2 (en) * 2022-03-22 2023-09-28 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Engineered heart tissue model of restrictive cardiomyopathy for drug discovery

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130244262A1 (en) * 2010-11-17 2013-09-19 Kyoto University Cardiomyocyte- and/or cardiac progenitor cell-proliferating agent and method for proliferating cardiomyocytes and/or cardiac progenitor cells
US20140134733A1 (en) * 2012-11-13 2014-05-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Chemically defined production of cardiomyocytes from pluripotent stem cells
CN104894058A (zh) * 2015-07-01 2015-09-09 山东大学 神经鞘氨醇磷酸胆碱在制备促内源心脏干细胞分化为心脏谱系细胞药物中的应用
WO2018035574A1 (en) * 2016-08-26 2018-03-01 The University Of Queensland Cardiomyocyte maturation

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6949528B1 (en) * 1998-03-18 2005-09-27 Goddard John G Compositions containing lysophosphatidic acids which inhibit apoptosis and uses thereof
WO2005118782A2 (en) * 2004-04-16 2005-12-15 Hydra Biosciences, Inc. Methods of promoting cardiac cell proliferation
EP2035552A2 (en) * 2006-06-09 2009-03-18 Anthrogenesis Corporation Placental niche and use thereof to culture stem cells
US20100129915A1 (en) * 2006-11-09 2010-05-27 Deepak Srivastava Methods for inducing cardiomyogenesis

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130244262A1 (en) * 2010-11-17 2013-09-19 Kyoto University Cardiomyocyte- and/or cardiac progenitor cell-proliferating agent and method for proliferating cardiomyocytes and/or cardiac progenitor cells
US20140134733A1 (en) * 2012-11-13 2014-05-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Chemically defined production of cardiomyocytes from pluripotent stem cells
CN104894058A (zh) * 2015-07-01 2015-09-09 山东大学 神经鞘氨醇磷酸胆碱在制备促内源心脏干细胞分化为心脏谱系细胞药物中的应用
WO2018035574A1 (en) * 2016-08-26 2018-03-01 The University Of Queensland Cardiomyocyte maturation

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ALEXANDERKLEGER ET AL.: "The Impact of Bioactive Lipids on Cardiovascular Development", vol. 2011, pages 916180 *
ARUN SHARMA ET AL.: "Stage-specific Effects of Bioactive Lipids on Human iPSC Cardiac Differentiation and Cardiomyocyte Proliferation", vol. 8, pages 6618, XP055850588, DOI: 10.1038/s41598-018-24954-3 *
PRAMOD HEMA: "Regulation of Stem Cell Differentiation Into Cardiomyocytes by Lysophosphatidic Acid", pages 1 - 243 *
ZHENQIANG ZHAO ET AL.: "Sphingosine-1-phosphate promotes the differentiation of human umbilical cord mesenchymal stem cells into cardiomyocytes under the designated culturing conditions", vol. 18, no. 37, pages 1 - 9 *
杨康鹃等: "《医学细胞生物学》", 31 March 2013, 人民军医出版社, pages: 279 - 280 *
章静波等主编: "《干细胞》", 28 February 2003, 中国协和医科大学出版社, pages: 265 - 266 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112472701A (zh) * 2020-12-04 2021-03-12 复旦大学附属中山医院 Wnt抑制剂Wnt-C59在制备治疗SCN5A突变致扩张型心肌病的药物中的应用
CN112472701B (zh) * 2020-12-04 2021-08-31 复旦大学附属中山医院 Wnt抑制剂Wnt-C59在制备治疗SCN5A突变致扩张型心肌病的药物中的应用
CN113249310A (zh) * 2021-05-17 2021-08-13 湖北大学 一种拓展性多能干细胞诱导分化为心肌细胞的方法及应用
CN113249310B (zh) * 2021-05-17 2022-10-11 湖北大学 一种拓展性多能干细胞诱导分化为心肌细胞的方法及应用
CN113061573A (zh) * 2021-05-21 2021-07-02 苏州大学 间歇性饥饿促进心肌细胞成熟的方法

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