KR20220103709A - 항-tigit 항체와의 병용물 형태로 항-ox40 항체를 사용하는 암 치료의 방법 - Google Patents

항-tigit 항체와의 병용물 형태로 항-ox40 항체를 사용하는 암 치료의 방법 Download PDF

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Abstract

인간 OX40(ACT35, CD134, 또는 TNFRSF4)에 결합하는 비경쟁적인 효능제(agonist) 항-OX40 항체 및 이의 항원-결합 단편을 항-TIGIT 항체 또는 이의 단편과의 병용물 형태로 사용하여 암을 치료하거나 면역 반응을 증가, 향상, 또는 자극하는 방법이 제공된다.

Description

항-TIGIT 항체와의 병용물 형태로 항-OX40 항체를 사용하는 암 치료의 방법
본 명세서에서는 인간 OX40, 및 인간 TIGIT에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 병용물을 사용하여 암을 치료하는 방법이 개시된다.
OX40(ACT35, CD134, 또는 TNFRSF4로도 알려짐)은 대략 50 KD의 I형 막관통 당단백질이고, 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리(tumor necrosis factor receptor super family, TNFRSF)의 구성원이다(문헌[Croft, 2010; Gough and Weinberg, 2009]). 성숙 인간 OX40은 249개의 아미노산(AA) 잔기로 구성되며, 이때 37개 AA 세포질 꼬리(cytoplasmic tail) 및 185개 AA 세포외 영역을 갖는다. OX40의 세포외 도메인은 3개의 완전한 시스테인-풍부 도메인(cysteine-rich domain, CRD) 및 1개의 불완전한 시스테인-풍부 도메인을 함유한다. OX40의 세포내 도메인은 하나의 보존된 신호전달-관련 QEE 모티프를 함유하며, 이는 몇몇 TNFR-연관 인자(TRAF)(TRAF2, TRAF3, 및 TRAF5를 포함함)에 대한 결합을 매개하여, OX40이 세포내 키나제에 연결될 수 있게 한다(문헌[Arch and Thompson, 1998; Willoughby et al., 2017]).
OX40은 활성화된 래트 CD4+ T 세포 상에서 최초로 발견되었으며, 후속으로 뮤린 및 인간 상동체를 T 세포로부터 클리닝하였다(문헌[al-Shamkhani et al., 1996; Calderhead et al., 1993]). T 헬퍼(Th) 1 세포, Th2 세포, Th17 세포뿐만 아니라 조절성 T(Treg) 세포를 포함한, 활성화된 CD4+ T 세포 상에서의 발현에 더하여, OX40 발현은 또한 활성화된 CD8+ T 세포, 자연 살해(NK) T 세포, 호중구, 및 NK 세포의 표면 상에서 발견되었다(문헌[Croft, 2010]). 대조적으로, 미감작(
Figure pct00001
) CD4+ 및 CD8+ T 세포 상에서, 이뿐만 아니라 대부분의 휴지기 기억 T 세포 상에서는 낮은 OX40 발현이 발견된다(문헌[Croft, 2010; Soroosh et al., 2007]). 미감작 T 세포 상에서의 OX40의 표면 발현은 일시적이다. TCR 활성화 후에, T 세포 상에서의 OX40 발현이 24시간 이내에 크게 증가되고, 2 내지 3일만에 피크에 도달하고, 5 내지 6일 동안 지속된다(문헌[Gramaglia et al., 1998]).
OX40에 대한 리간드(OX40L, 이는 gp34, CD252 또는 TNFSF4로도 알려짐)는 OX40에 대한 유일한 리간드이다. 기타 다른 TNFSF(종양 괴사 인자 수퍼패밀리) 구성원과 유사하게, OX40L은 II형 당단백질이며, 이는 183개의 AA를 함유하는데, 이때 23개 AA 세포내 도메인 및 133개 AA 세포외 도메인을 갖는다(문헌[Croft, 2010; Gough and Weinberg, 2009]). OX40L은 세포 표면 상에 동종삼량체성 복합체를 천연적으로 형성한다. 리간드 삼량체는 대개 수용체의 CRD1, CRD2, 및 부분 CRD3 영역을 통해, 그러나 CRD4의 관여는 없이, 리간드 단량체-단량체 계면에서 OX40의 3개의 복제물과 상호작용한다(문헌[Compaan and Hymowitz, 2006]). OX40L은 활성화된 B 세포(문헌[Stuber et al., 1995]), 성숙된 통상적인 수지상 세포(DC)(문헌[Ohshima et al., 1997]), 형질세포양 DC(pDC)(문헌[Ito et al., 2004]), 대식세포(문헌[Weinberg et al., 1999]), 및 랑게르한스 세포(문헌[Sato et al., 2002])를 포함한, 활성화된 항원 제시 세포(APC) 상에서 주로 발현된다. 또한, OX40L은 NK 세포, 비만 세포, 활성화된 T 세포들의 하위세트뿐만 아니라, 혈관 내피 세포 및 평활근 세포와 같은 기타 다른 세포 유형 상에서도 발현되는 것으로 확인되어 있다(문헌[Croft, 2010; Croft et al., 2009]).
삼량체성 OX40L에 의한 결찰을 통한 OX40 삼량체화 또는 효능적(agonistic) 항체에 의한 이량체화는 어댑터 분자 TRAF2, TRAF3, 및/또는 TRAF5를 그의 세포내 QEE 모티프로 동원하고 도킹(docking)하는 데 기여한다(문헌[Arch and Thompson, 1998; Willoughby et al., 2017]). TRAF2 및 TRAF3의 동원 및 도킹은 추가로 표준 NF-κB1 경로 및 비표준 NF-κB2 경로 둘 모두의 활성화로 이어질 수 있는데, 이는 T 세포의 생존, 분화, 증폭, 사이토카인 생성 및 이펙터 기능의 조절에서 중요한 역할을 한다(문헌[Croft, 2010; Gramaglia et al., 1998; Huddleston et al., 2006; Rogers et al., 2001; Ruby and Weinberg, 2009; Song et al., 2005a; Song et al., 2005b; Song et al., 2008]).
정상 조직에서는, OX40 발현이 낮으며, 림프계 기관 내의 림프구 상에 주로 존재한다(문헌[Durkop et al., 1995]). 그러나, 면역 세포 상에서의 OX40 발현의 상향조절이 병리학적 상태(문헌[Redmond and Weinberg, 2007]), 예컨대 자가면역 질병(문헌[Carboni et al., 2003; Jacquemin et al., 2015; Szypowska et al., 2014]) 및 암(문헌[Kjaergaard et al., 2000; Vetto et al., 1997; Weinberg et al., 2000])을 갖는 동물 모델 및 인간 환자 둘 모두에서 빈번하게 관찰되어 왔다. 특히, OX40의 증가된 발현은, 결직장암 및 피부 흑색종을 갖는 환자에서는 더 긴 생존과 연관되어 있으며, 원격 전이의 발생 및 더 진행성인 종양 특징과는 역상관관계에 있다(문헌[Ladanyi et al., 2004; Petty et al., 2002; Sarff et al., 2008]). 항-OX40 항체 치료는 다양한 마우스 모델에서 항-종양 효능을 유도할 수 있는 것으로 또한 밝혀져 있는데(문헌[Aspeslagh et al., 2016]), 이는 면역요법 표적으로서의 OX40의 잠재성을 나타낸다. Curti외 다수에 의해 수행된 암 환자에서의 최초의 임상 시험에서, 항-종양 효능 및 종양-특이적 T 세포의 활성화의 증거가 효능적 항-OX40 단일클론 항체에 대해 관찰되었는데, 이는 OX40 항체가 항-종양 T-세포 반응을 증진시키는 데 있어서 유용성을 갖는다는 것을 나타낸다(문헌[Curti et al., 2013]).
항-종양 효능을 매개하는 데 있어서의 효능적 항-OX40 항체의 작용 기전은 마우스 종양 모델에서 주로 연구되어 왔다(문헌[Weinberg et al., 2000]). 최근까지, 종양에서의 효능적 항-OX40 항체의 작용 기전은 이펙터 T 세포에서 공동자극성 신호전달 경로를 촉발하는 능력에 기인될 뿐만 아니라, Treg 세포의 분화 및 기능에 대한 억제 효과에 기인되었다(문헌[Aspeslagh et al., 2016; Ito et al., 2006; St Rose et al., 2013; Voo et al., 2013]). 최근의 연구에서는 동물 종양 모델 및 암 환자 둘 모두에서, 종양 침윤 Treg가 이펙터 T 세포(CD4+ 및 CD8+ 둘 모두) 및 말초 Treg보다 더 높은 수준의 OX40을 발현하는 것으로 밝혀져 있다(문헌[Lai et al., 2016; Marabelle et al., 2013b; Montler et al., 2016; Soroosh et al., 2007; Timperi et al., 2016]). 따라서, 항-OX40 항체가 항-종양 반응을 촉발하는 2차 효과는 항체-의존성 세포독성(ADCC) 및/또는 항체-의존성 세포성 식세포작용(ADCP)을 통해 종양내 OX40+ Treg 세포를 고갈시키는 데 있어서 그들의 Fc-매개 이펙터 기능에 의존한다(문헌[Aspeslagh et al., 2016; Bulliard et al., 2014; Marabelle et al., 2013a; Marabelle et al., 2013b; Smyth et al., 2014]). 이 연구는 Fc-매개 이펙터 기능을 갖는 효능적 항-OX40 항체가 종양내 Treg를 우선적으로 고갈시키고, 종양 미세환경(tumor microenvironment, TME)에서 CD8+ 이펙터 T 세포 대 Treg의 비를 개선하여, 그 결과 개선된 항-종양 면역 반응, 증가된 종양 퇴행 및 개선된 생존을 가져올 수 있었음을 입증한다(문헌[Bulliard et al., 2014; Carboni et al., 2003; Jacquemin et al., 2015; Marabelle et al., 2013b]). 이들 발견에 기초하여, 효능적 활성 및 Fc-매개 이펙터 기능 둘 모두를 갖는 효능적 항-OX40 항체의 개발에 대한 충족되지 않은 의학적 요구가 있다.
지금까지, 임상에서의 효능적 항-OX40 항체는 대부분 OX40-OX40L 상호작용을 차단하는 리간드-경쟁적 항체이다(예를 들어, WO2016196228A1). OX40-OX40L 상호작용은 효과적인 항-종양 면역을 향상시키는 데 필수적이기 때문에, OX40-OX40L의 차단은 이들 리간드-경쟁적 항체의 효능을 제한한다. 따라서, OX40이 OX40L과 상호작용하는 것을 방해하지 않으면서 OX40에 특이적으로 결합하는 OX40 효능제 항체는 단제요법 및 병용 요법 둘 모두를 통해 암 및 자가면역 장애의 치료에서 유용성을 갖는다.
종양-침윤 림프구(TIL) 및 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서의 TIGIT 발현의 상향조절은 많은 유형의 암, 예컨대 폐암(문헌[Tassi, et al., Cancer Res. 2017 77: 851-861]), 식도암(문헌[Xie J, et al., Oncotarget 2016 7: 63669-63678]), 유방암(문헌[Gil Del Alcazar CR, et al. 2017 Cancer Discov.]), 급성 골수성 백혈병(AML)(문헌[Kong Y et al., Clin Cancer Res. 2016 22: 3057-66]) 및 흑색종(문헌[Chauvin JM, et al., J Clin Invest. 2015 125: 2046-2058])에 보고되어 있다. AML에서의 TIGIT의 증가된 발현은 환자에 대한 불량한 예후와 연관되어 있다(문헌[Kong Y et al., Clin Cancer Res. 2016 22: 3057-66]). TIGIT 신호전달의 상향조절은 암에 대한 면역 관용에서 중요한 역할을 할 뿐만 아니라, 만성 바이러스성 감염에도 그러하다. HIV 감염 동안, T 세포 상에서의 TIGIT의 발현은 유의하게 더 높았으며, 바이러스 부하 및 질병 진행과 양의 상관관계가 있었다(문헌[Chew GM, et al., 2016 PLoS Pathog. 12: e1005349]). 또한, 단독으로의 또는 기타 다른 차단과 조합된 형태로의 TIGIT 수용체의 차단은 시험관내(in vitro) 및 생체내(in vivo) 둘 모두에서 기능적으로 "탈진된(exhausted)" T 세포를 구제할 수 있었다(문헌[Chauvin JM, et al., J Clin Invest. 2015 125: 2046-2058]; 문헌[Chew GM, et al., 2016 PLoS Pathog. 12: e1005349]; 문헌[Johnston RJ, et al. Cancer Cell 2014 26: 923-937]). 암 및 바이러스성 감염의 경우에, TIGIT 신호전달의 활성화는 면역 세포 기능이상을 촉진시키며, 이는 암 증생(outgrowth) 또는 연장된 바이러스성 감염으로 이어진다. 치료제에 의한 TIGIT-매개 억제성 신호전달의 억제는 T 세포, NK 세포 및 수지상 세포(DC)를 포함한 면역 세포의 기능적 활성을 회복시킬 수 있으며, 이에 따라 암 또는 만성 바이러스성 감염에 대한 면역을 향상시킬 수 있다.
본 개시내용은 효능적 항-OX40 항체 및 항-TIGIT 항체의 병용물, 및 암의 치료에서 이들 항체의 병용물을 사용하는 방법에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 개시내용은 항-TIGIT 항체와의 병용물 형태로 항-OX40 항체를 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용의 효능적 OX40 항체 및 항원-결합 단편은 OX40L과 경쟁하지 않거나, OX40이 그의 리간드 OX40L에 결합하는 것을 방해하지 않는다. 일 양태에서, TIGIT 항체는 TIGIT 신호전달을 감소시킨다.
본 개시내용은 하기 구현예를 포함한다.
암 치료의 방법으로서, 비경쟁적 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 유효량을 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원-결합 단편과의 병용물 형태로 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
상기 방법에 있어서, OX40 항체는 인간 OX40에 특이적으로 결합하고,
(i) (a) 서열 번호 3의 HCDR(중쇄 상보성 결정 영역) 1, (b) 서열 번호 24의 HCDR2, 및 (c) 서열 번호 5의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (d) 서열 번호 25의 LCDR(경쇄 상보성 결정 영역) 1, (e) 서열 번호 19의 LCDR2, 및 (f) 서열 번호 8의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(ii) (a) 서열 번호 3의 HCDR1, (b) 서열 번호 18의 HCDR2, 및 (c) 서열 번호 5의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (d) 서열 번호 6의 LCDR1, (e) 서열 번호 19의 LCDR2, 및 (f) 서열 번호 8의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(iii) (a) 서열 번호 3의 HCDR1, (b) 서열 번호 13의 HCDR2, 및 (c) 서열 번호 5의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (d) 서열 번호 6의 LCDR1, (e) 서열 번호 7의 LCDR2, 및 (f) 서열 번호 8의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
(iv) (a) 서열 번호 3의 HCDR1, (b) 서열 번호 4의 HCDR2, 및 (c) 서열 번호 5의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (d) 서열 번호 6의 LCDR1, (e) 서열 번호 7의 LCDR2, 및 (f) 서열 번호 8의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역
을 포함하며, 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원-결합 단편과의 병용물 형태인, 방법.
상기 방법에 있어서, OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편은
(i) 서열 번호 26을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 서열 번호 28을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL);
(ii) 서열 번호 20을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 서열 번호 22를 포함하는 경쇄 가변 영역(VL);
(iii) 서열 번호 14를 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 서열 번호 16을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 또는
(iv) 서열 번호 9를 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 서열 번호 11을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)
을 포함하는, 방법.
상기 방법에 있어서, 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편은는, 인간 TIGIT에 특이적으로 결합하고, 서열 번호 32의 HCDR1, 서열 번호 33의 HCDR2, 및 서열 번호 34의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열 번호 35의 LCDR1, 서열 번호 36의 LCDR2, 및 서열 번호 37의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 항원 결합 도메인을 포함하는, 방법.
상기 방법에 있어서, 항-TIGIT 항체는 인간 TIGIT에 특이적으로 결합하고, 서열 번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 서열 번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 항체 항원 결합 도메인을 포함하는, 방법.
상기 방법에 있어서, 항-OX40 항체 또는 항원 결합 단편은 Fab, Fab'-SH, Fv, scFv, 및 (Fab')2 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체 단편인, 방법.
상기 방법에 있어서, 항-TIGIT 항체 또는 항원 결합 단편은 Fab, Fab'-SH, Fv, scFv, 및 (Fab')2 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체 단편인, 방법.
상기 방법에 있어서, 암은 유방암, 결장암, 두경부암, 위암, 신장암, 간암, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 난소암, 피부암, 중피종, 림프종, 백혈병, 골수종 또는 육종인, 방법.
상기 방법에 있어서, 유방암은 전이성 유방암인, 방법.
상기 방법에 있어서, 치료는 치료 중단 후의 대상체에서 지속된 항암 반응을 가져오는, 방법.
면역 반응 또는 기능을 증가, 향상, 또는 자극하는 방법으로서, 비경쟁적 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 유효량을 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원-결합 단편과의 병용물 형태로 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
상기 방법에 있어서, OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원-결합 단편과의 병용물 형태로 인간 OX40에 특이적으로 결합하고,
(i) (a) 서열 번호 3의 HCDR(중쇄 상보성 결정 영역) 1, (b) 서열 번호 24의 HCDR2, 및 (c) 서열 번호 5의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 (d) 서열 번호 25의 LCDR(경쇄 상보성 결정 영역) 1, (e) 서열 번호 19의 LCDR2, 및 (f) 서열 번호 8의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(ii) (a) 서열 번호 3의 HCDR1, (b) 서열 번호 18의 HCDR2, 및 (c) 서열 번호 5의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (d) 서열 번호 6의 LCDR1, (e) 서열 번호 19의 LCDR2, 및 (f) 서열 번호 8의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(iii) (a) 서열 번호 3의 HCDR1, (b) 서열 번호 13의 HCDR2, 및 (c) 서열 번호 5의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (d) 서열 번호 6의 LCDR1, (e) 서열 번호 7의 LCDR2, 및 (f) 서열 번호 8의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
(iv) (a) 서열 번호 3의 HCDR1, (b) 서열 번호 4의 HCDR2, 및 (c) 서열 번호 5의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (d) 서열 번호 6의 LCDR1, (e) 서열 번호 7의 LCDR2, 및 (f) 서열 번호 8의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역
을 포함하는, 방법.
상기 방법에 있어서, OX40 항체 또는 이의 항원-결합은
(i) 서열 번호 26을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 서열 번호 28을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL);
(ii) 서열 번호 20을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 서열 번호 22를 포함하는 경쇄 가변 영역(VL);
(iii) 서열 번호 14를 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 서열 번호 16을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 또는
(iv) 서열 번호 9를 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 서열 번호 11을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)
을 포함하는, 방법.
상기 방법에 있어서, 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 인간 TIGIT에 특이적으로 결합하고,
서열 번호 32의 HCDR1, 서열 번호 33의 HCDR2, 및 서열 번호 34의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열 번호 35의 LCDR1, 서열 번호 36의 LCDR2, 및 서열 번호 37의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 항원-결합 도메인을 포함하는, 방법.
상기 방법에 있어서, 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 인간 TIGIT에 특이적으로 결합하고, 서열 번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 서열 번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 항체 항원-결합 도메인을 포함하는, 방법.
상기 방법에 있어서, 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 Fab, Fab'-SH, Fv, scFv, 및 (Fab')2 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체 단편인, 방법.
상기 방법에 있어서, 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 Fab, Fab'-SH, Fv, scFv, 및 (Fab')2 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체 단편인, 방법.
상기 방법에 있어서, 면역 반응을 자극하는 것은 T 세포 또는 NK 세포와 연관된 것인, 방법.
상기 방법에 있어서, 면역 반응을 자극하는 것은 항원 자극에 대한 증가된 반응성을 특징으로 하는 것인, 방법.
상기 방법에 있어서, T 세포 또는 NK 세포는 증가된 사이토카인 분비, 증식, 또는 세포용해 활성을 갖는, 방법.
상기 방법에 있어서, T 세포는 CD4+ 및 CD8+ T 세포인, 방법.
상기 방법에 있어서, 투여는 치료 중단 후의 대상체에서 지속된 면역 반응을 가져오는, 방법.
일 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 8, 서열 번호 13, 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 24 및 서열 번호 25로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 (a) 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 13, 서열 번호 18, 서열 번호 24 및 서열 번호 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 상보성 결정 영역(HCDR)을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및/또는 (b) 서열 번호 6, 서열 번호 25, 서열 번호 7, 서열 번호 19 및 서열 번호 8로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 상보성 결정 영역(LCDR)을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 (a) 3개의 상보성 결정 영역(HCDR)을 포함하며, 이들은 서열 번호 3의 아미노산 서열을 갖는 HCDR1; 서열 번호 4, 서열 번호 13, 서열 번호 18, 또는 서열 번호 24의 아미노산 서열을 갖는 HCDR2; 및 서열 번호 5의 아미노산 서열을 갖는 HCDR3인, 중쇄 가변 영역; 및/또는 (b) 3개의 상보성 결정 영역(LCDR)을 포함하며, 이들은 서열 번호 6 또는 서열 번호 25의 아미노산 서열을 갖는 LCDR1; 서열 번호 7 또는 서열 번호 19의 아미노산 서열을 갖는 LCDR2; 및 서열 번호 8의 아미노산 서열을 갖는 LCDR3인, 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 (a) 3개의 상보성 결정 영역(HCDR)을 포함하며, 이들은 서열 번호 3의 아미노산 서열을 갖는 HCDR1, 서열 번호 4의 아미노산 서열을 갖는 HCDR2, 및 서열 번호 5의 아미노산 서열을 갖는 HCDR3; 또는 서열 번호 3의 아미노산 서열을 갖는 HCDR1, 서열 번호 13의 아미노산 서열을 갖는 HCDR2, 및 서열 번호 5의 아미노산 서열을 갖는 HCDR3; 또는 서열 번호 3의 아미노산 서열을 갖는 HCDR1, 서열 번호 18의 아미노산 서열을 갖는 HCDR2, 및 서열 번호 5의 아미노산 서열을 갖는 HCDR3; 또는 서열 번호 3의 아미노산 서열을 갖는 HCDR1, 서열 번호 24의 아미노산 서열을 갖는 HCDR2, 및 서열 번호 5의 아미노산 서열을 갖는 HCDR3인, 중쇄 가변 영역; 및/또는 (b) 3개의 상보성 결정 영역(LCDR)을 포함하며, 이들은 서열 번호 6의 아미노산 서열을 갖는 LCDR1, 서열 번호 7의 아미노산 서열을 갖는 LCDR2, 및 서열 번호 8의 아미노산 서열을 갖는 LCDR3; 또는 서열 번호 6의 아미노산 서열을 갖는 LCDR1, 서열 번호 19의 아미노산 서열을 갖는 LCDR2, 및 서열 번호 8의 아미노산 서열을 갖는 LCDR3; 또는 서열 번호 25의 아미노산 서열을 갖는 LCDR1, 서열 번호 19의 아미노산 서열을 갖는 LCDR2, 및 서열 번호 8의 아미노산 서열을 갖는 LCDR3인, 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 개시내용의 항체 또는 항원-결합 단편은 서열 번호 3의 아미노산 서열을 갖는 HCDR1, 서열 번호 4의 아미노산 서열을 갖는 HCDR2, 및 서열 번호 5의 아미노산 서열을 갖는 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열 번호 6의 아미노산 서열을 갖는 LCDR1, 서열 번호 7의 아미노산 서열을 갖는 LCDR2, 및 서열 번호 8의 아미노산 서열을 갖는 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일 구현예에서, 본 개시내용의 항체 또는 항원-결합 단편은 서열 번호 3의 아미노산 서열을 갖는 HCDR1, 서열 번호 13의 아미노산 서열을 갖는 HCDR2, 및 서열 번호 5의 아미노산 서열을 갖는 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열 번호 6의 아미노산 서열을 갖는 LCDR1, 서열 번호 7의 아미노산 서열을 갖는 LCDR2, 및 서열 번호 8의 아미노산 서열을 갖는 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 개시내용의 항체 또는 항원-결합 단편은 서열 번호 3의 아미노산 서열을 갖는 HCDR1, 서열 번호 18의 아미노산 서열을 갖는 HCDR2, 및 서열 번호 5의 아미노산 서열을 갖는 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열 번호 6의 아미노산 서열을 갖는 LCDR1, 서열 번호 19의 아미노산 서열을 갖는 LCDR2, 및 서열 번호 8의 아미노산 서열을 갖는 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 개시내용의 항체 또는 항원-결합 단편은 서열 번호 3의 아미노산 서열을 갖는 HCDR1, 서열 번호 24의 아미노산 서열을 갖는 HCDR2, 및 서열 번호 5의 아미노산 서열을 갖는 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열 번호 25의 아미노산 서열을 갖는 LCDR1, 서열 번호 19의 아미노산 서열을 갖는 LCDR2, 및 서열 번호 8의 아미노산 서열을 갖는 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일 구현예에서, 본 개시내용의 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 (a) 서열 번호 9, 서열 번호 14, 서열 번호 20 또는 서열 번호 26의 아미노산 서열을 갖거나, 서열 번호 9, 서열 번호 14, 서열 번호 20 또는 서열 번호 26 중 어느 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역; 및/또는 (b) 서열 번호 11, 서열 번호 16, 서열 번호 22 또는 서열 번호 28의 아미노산 서열을 갖거나, 서열 번호 11, 서열 번호 16, 서열 번호 22 또는 서열 번호 28 중 어느 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 개시내용의 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 (a) 서열 번호 9, 서열 번호 14, 서열 번호 20 또는 서열 번호 26의 아미노산 서열을 갖거나, 서열 번호 9, 서열 번호 14, 서열 번호 20 또는 서열 번호 26의 아미노산 서열 내에 1개, 2개, 또는 3개의 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역; 및/또는 (b) 서열 번호 11, 서열 번호 16, 서열 번호 22 또는 서열 번호 28의 아미노산 서열을 갖거나, 서열 번호 11, 서열 번호 16, 서열 번호 22 또는 서열 번호 28의 아미노산 내에 1개, 2개, 3개, 4개, 또는 5개의 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환이다.
일 구현예에서, 본 개시내용의 항체 또는 이의 항원-결합 단편은
(a) 서열 번호 9의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 11의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역; 또는
(b) 서열 번호 14의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 16의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역; 또는
(c) 서열 번호 20의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 22의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역; 또는
(d) 서열 번호 26의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 28의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역
을 포함한다.
일 구현예에서, 본 개시내용의 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 동종형(isotype)을 갖는다. 더 구체적인 구현예에서, 본 개시내용의 항체는 야생형 인간 IgG1(인간 IgG1wt 또는 huIgG1로도 지칭됨) 또는 IgG2의 Fc 도메인을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 개시내용의 항체는 S228P 및/또는 R409K 치환(EU 넘버링 체계에 따름)을 갖는 인간 IgG4의 Fc 도메인을 포함한다.
일 구현예에서, 본 개시내용의 항체는 1 × 10-6 M 내지 1 × 10-10 M의 결합 친화도(KD)로 OX40에 결합한다. 또 다른 구현예에서, 본 개시내용의 항체는 약 1 × 10-6 M, 약 1 × 10-7 M, 약 1 × 10-8 M, 약 1 × 10-9 M 또는 약 1 × 10-10 M의 결합 친화도(KD)로 OX40에 결합한다.
또 다른 구현예에서, 본 개시내용의 항-인간 OX40 항체는 사이노몰거스 OX40에 대해 교차종 결합 활성을 나타낸다.
일 구현예에서, 본 개시내용의 항-OX40 항체는 OX40-OX40L 상호작용 계면의 외측에 있는 인간 OX40의 에피토프에 결합한다. 또 다른 구현예에서, 본 개시내용의 항-OX40 항체는 OX40에 대한 OX40 리간드 결합과 경쟁하지 않는다. 또 다른 구현예에서, 본 개시내용의 항-OX40 항체는 OX40과 이의 리간드 OX40L 사이의 상호작용을 차단하지 않는다.
본 개시내용의 항체는 효능적이고, 면역 반응을 유의하게 향상시킨다. 일 구현예에서, 본 개시내용의 항체는 혼합 림프구 반응(MLR) 검정에서 1차 T 세포를 유의하게 자극하여 IL-2를 생성할 수 있다.
일 구현예에서, 본 개시내용의 항체는 강한 Fc-매개 이펙터 기능을 갖는다. 항체는 NK 세포에 의한 OX40Hi 표적 세포, 예컨대 조절성 T 세포(Treg 세포)에 대한 항체-의존성 세포성 세포독성(ADCC)을 매개한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 상이한 OX40 발현 수준에 기초하여 특정 T-세포 하위세트들의 항-OX40 항체-매개 시험관내(in vitro) 고갈을 평가하는 방법을 제공한다.
본 개시내용의 항체 또는 항원-결합 단편은 OX40-OX40L 상호작용을 차단하지 않는다. 또한, OX40 항체는 동물 모델에서 밝혀진 바와 같이, 생체내(in vivo)에서 용량-의존적 항-종양 활성을 나타낸다. 용량-의존적 활성은 OX40-OX40L 상호작용을 차단하는 항-OX40 항체의 활성 프로파일과는 구별된다.
본 개시내용은 항체 또는 항원-결합 단편의 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산에 관한 것이다. 일 구현예에서, 단리된 핵산은 서열 번호 10, 서열 번호 15, 서열 번호 21, 또는 서열 번호 27의 VH 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 서열 번호 10, 서열 번호 15, 서열 번호 21, 또는 서열 번호 27과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 본 개시내용의 항체 또는 항원-결합 단편의 VH 영역을 인코딩한다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단리된 핵산은 서열 번호 12, 서열 번호 17, 서열 번호 23, 또는 서열 번호 29의 VL 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 서열 번호 12, 서열 번호 17, 서열 번호 23, 또는 서열 번호 29와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 본 개시내용의 항체 또는 항원-결합 단편의 VL 영역을 인코딩한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 대상체에서 질병을 치료하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 치료적 유효량의 OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 OX40 항체 약제학적 조성물을 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원-결합 단편과의 병용물 형태로 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항-TIGIT 항체와의 병용물 형태의 항-OX40 항체에 의해 치료하려는 질병은 암 또는 자가면역 질병이다.
도 1은 OX40-mIgG2a, OX40-huIgG1 및 OX40-His 작제물의 개략도이다. OX40 ECD: OX40 세포외 도메인. N: N-말단. C: C-말단.
도 2는 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의한 정제된 키메라(ch445) 및 인간화(445-1, 445-2, 445-3 및 445-3 IgG4) 항-OX40 항체의 친화도 결정을 나타낸다.
도 3은 유세포측정법에 의한 OX40 결합의 결정을 입증한다. OX40-양성 HuT78/OX40 세포를 다양한 항-OX40 항체(항체 ch445, 445-1, 445-2, 445-3 및 445-3 IgG4)와 함께 인큐베이션하고, FACS 분석을 거쳤다. 결과는 평균 형광 세기(MFI, Y-축)에 의해 나타나 있다.
도 4는 유세포측정법에 의한 OX40 항체의 결합을 나타낸다. HuT78/OX40 및 HuT78/cynoOX40 세포를 항체 445-3에 의해 염색하고, 평균 형광 세기(MFI, Y-축에 나타나 있음)를 유세포측정법에 의해 결정하였다.
도 5는 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의한 OX40 야생형 및 점 돌연변이체에 대한 445-3 Fab의 친화도 결정을 나타낸다.
도 6은 항체 445-3과 OX40 상의 그의 에피토프 사이의 상세한 상호작용을 나타낸다. 항체 445-3 및 OX40은 각각 담회색 및 흑색으로 나타나 있다. 수소 결합 또는 염 가교, 파이-파이 적층(pi-pi stacking) 및 반데르발스(VDW) 상호작용은 각각 파선, 이중 파선 및 실선으로 표시되어 있다.
도 7은 항체 445-3이 OX40L 결합을 방해하지 않음을 입증한다. HEK293/OX40L 세포를 염색하기 전에, OX40-마우스 IgG2a(OX40-mIgG2a) 융합 단백질을 인간 IgG(+HuIgG), 항체 445-3(+445-3) 또는 항체 1A7.gr1(+1A7.gr1, US 2015/0307617 참조)과 함께 1:1의 몰비로 사전-인큐베이션하였다. OX40-mIgG2a/항-OX40 항체 복합체에 대한 OX40L의 결합을, HEK293/OX40L 세포와 OX40-mIgG2a/항-OX40 항체 복합체의 공동-인큐베이션을 수행한 후, 항-마우스 IgG 2차 Ab와 반응시키고, 유세포측정법을 수행함으로써 결정하였다. 결과를 2회 반복시험의 평균 ± SD로 나타내었다. 통계학적 유의성: *: P<0.05; **: P<0.01.
도 8은 OX40/445-3 Fab와 보고된 OX40/OX40L 복합체(PDB 코드: 2HEV)의 구조 정렬을 나타낸다. OX40L은 백색으로, 445-3 Fab는 회색으로, 그리고 OX40은 흑색으로 나타나 있다.
도 9a 및 도 9b는 항-OX40 항체 445-3이 TCR 자극과 함께 IL-2 생성을 유도함을 나타낸다. OX40-양성 HuT78/OX40 세포(도 9a)를 항-OX40 항체의 존재 하에서 인공 항원-제시 세포(APC)주(HEK293/OS8Low-FcγRI)와 밤새 공동배양하고, IL-2 생성을 T-세포 자극에 대한 판독치로서 사용하였다(도 9b). 배양 상청액 중의 IL-2를 ELISA에 의해 검출하였다. 결과는 3회 반복시험의 평균 ± SD로 나타나 있다.
도 10은 항-OX40 항체가 MLR 반응을 향상시킴을 나타낸다. 시험관내 분화된 수지상 세포(DC)를 항-OX40 항체(0.1 내지 10 μg/ml)의 존재 하에서 2일 동안 동종이계 CD4+ T 세포와 공동배양하였다. 상청액 중의 IL-2를 ELISA에 의해 검출하였다. 모든 시험을 4회 반복하여 수행하였으며, 결과를 평균 ± SD로서 나타내었다. 통계학적 유의성: *: P<0.05; **: P<0.01.
도 11은 항-OX40 항체 445-3이 ADCC를 유도함을 나타낸다. 항-OX40 항체(0.004 내지 3 μg/ml) 또는 대조군의 존재 하에서 이펙터 세포로서 NK92MI/CD16V 세포를 그리고 표적 세포로서 HuT78/OX40 세포를 사용하여 ADCC 검정을 수행하였다. 동일한 수의 이펙터 세포와 표적 세포를 5시간 동안 공동배양한 후, 락테이트 데하이드로게나제(LDH) 방출을 검출하였다. 세포독성의 백분율(Y-축)을 실시예 12에 기재된 바와 같이 제조자의 프로토콜에 기초하여 계산하였다. 결과는 3회 반복시험의 평균 ± SD로 나타나 있다.
도 12a 내지 도 12c는 NK 세포와의 병용물 형태의 항-OX40 항체 445-3이 시험관내에서 활성화된 PBMC 중에서 CD8+ 이펙터 T 세포 대 Treg 비를 증가시킴을 나타낸다. 인간 PBMC를 PHA-L(1 μg/ml)에 의해 사전-활성화하고, 이어서 항-OX40 항체 또는 대조군의 존재 하에서 NK92MI/CD16V 세포와 공동배양하였다. 상이한 T-세포 하위세트들의 백분율을 유세포측정법에 의해 결정하였다. CD8+ 이펙터 T 세포 대 Treg의 비를 추가로 계산하였다. 도 12a는 CD8+/총 T 세포 비를 나타낸다. 도 12b는 Treg/총 T 세포 비이다. 도 12c는 CD8+/Treg 비를 나타낸다. 데이터는 2회 반복시험의 평균 ± SD로서 나타나 있다. 지시된 농도에서의 445-3과 1A7.gr1 사이의 통계학적 유의성이 나타나 있다. *: P<0.05; **: P<0.01.
도 13a 및 도 13b는, 항-OX40 항체 445-3은 OX40-인간화 마우스에서의 MC38 결직장암 동계(syngeneic) 모델에서 용량-의존적 항-종양 활성을 보여주지만 1A7.gr1은 그렇지 않음을 나타낸다. MC38 뮤린 결장 암종 세포(2×107개)를 암컷 인간 OX40 유전자도입 마우스에 피하 이식하였다. 종양 부피에 따라 무작위 배정 후에, 지시된 바와 같이 주 1회씩 3회 동안 동물에 항-OX40 항체 또는 동종형 대조군 중 어느 하나를 복막내 주사하였다. 도 13a는 증가하는 용량의 445-3 항체와 증가하는 용량의 1A7.gr1 항체를 비교하고, 종양 성장의 감소를 비교한다. 도 13b는 그러한 특정 용량으로 처리된 모든 마우스에 대한 데이터를 제시한다. 데이터는 군당 6 마리의 마우스에 대해 평균 종양 부피 ± 평균 표준 오차(SEM)로서 제시된다. 통계학적 유의성: *: 동종형 대조군 대비 P<0.05.
도 14a 및 도 14b는 OX40 항체에서 만들어진 아미노산 변경의 표이다.
도 15는 전이성 유방암의 마우스 모델에서의 항-TIGIT 항체와의 병용물 형태의 OX40 항체의 효능을 나타낸다.
정의
본 명세서의 다른 곳에서 구체적으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 다른 기술 및 과학 용어는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다.
첨부된 청구범위를 포함하여 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 단어의 단수형, 예컨대 "부정관사(a 및 an)", 및 "정관사(the)"는 문맥이 달리 명확하게 나타내지 않는 한, 그들의 상응하는 복수의 지시 대상을 포함한다.
용어 "또는"은, 문맥이 달리 명확히 나타내지 않는 한, 용어 "및/또는"을 의미하는 것으로 사용되고, "및/또는"과 상호교환 가능하게 사용된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "항암제"는 세포 증식성 장애, 예컨대 암을 치료하는 데 사용될 수 있는 임의의 작용제를 지칭하며, 이에는 세포독성제, 화학요법제, 방사선 요법 및 방사선 요법제, 표적화된 항암제, 및 면역요법제가 포함되지만 이로 한정되지 않는다.
용어 "OX40"은 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리의 구성원인 대략 50 KD의 I형 막관통 당단백질을 지칭한다. OX40은 또한 ACT35, CD134, 또는 TNFRSF4로도 알려져 있다. 인간 OX40의 아미노산 서열(서열 번호 1)은 또한 수탁 번호 NP_003318에서 찾을 수 있으며, OX40 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 수탁 번호 X75962.1이다. 용어 "OX40 리간드" 또는 "OX40L"은 OX40의 유일한 리간드를 지칭하며, gp34, CD252 또는 TNFSF4와 상호교환 가능하다.
본 명세서에서, 용어 "투여", "투여하는", "치료하는" 및 "치료"는 동물, 인간, 실험 대상체, 세포, 조직, 기관, 또는 생물학적 유체에 적용될 때, 동물, 인간, 대상체, 세포, 조직, 기관, 또는 생물학적 유체에 대한 외인성 약제학적, 치료적, 진단적 작용제, 또는 조성물의 접촉을 의미한다. 세포의 처리는 세포에 대한 시약의 접촉뿐만 아니라, 세포와 접촉 상태에 있는 유체에 대한 시약의 접촉을 포함한다. 용어 "투여" 및 "치료"는 또한 시약, 진단용, 결합 화합물에 의한 또는 또 다른 세포에 의한, 예를 들어 세포의, 시험관내 및 생체외(ex vivo) 치료를 의미한다. 본 명세서에서, 용어 "대상체"는 임의의 유기체, 바람직하게는 동물, 더 바람직하게는 포유동물(예를 들어, 래트, 마우스, 개, 고양이, 토끼), 가장 바람직하게는 인간을 포함한다. 일 양태에서, 임의의 질병 또는 장애를 치료한다는 것은 질병 또는 장애를 개선하는(즉, 질병의 발생 또는 이의 임상 증상들 중 적어도 하나를 둔화, 정지, 또는 감소시키는) 것을 지칭한다. 또 다른 양태에서, "치료하다", "치료하는", 또는 "치료"는 환자에 의해 식별 가능하지 않을 수 있는 것들을 포함한 적어도 하나의 신체적 파라미터를 경감 또는 개선하는 것을 지칭한다. 또 다른 양태에서, "치료하다", "치료하는", 또는 "치료"는 질병 또는 장애를 신체적으로 조절하거나(예를 들어, 식별 가능한 증상의 안정화), 생리학적으로 조절하거나(예를 들어, 신체적 파라미터의 안정화), 또는 둘 모두를 지칭한다. 또 다른 양태에서, "치료하다", "치료하는", 또는 "치료"는 질병 또는 장애의 발병 또는 발생 또는 진행을 예방 또는 지연시키는 것을 지칭한다.
본 개시내용과 관련하여 용어 "대상체"는 포유동물, 예를 들어 영장류, 바람직하게는 고등 영장류, 예를 들어 인간(예를 들어, 본 명세서에 기재된 장애를 갖거나 가질 위험이 있는 환자)이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "친화도"는 항체와 항원 사이의 상호작용의 강도를 지칭한다. 항원에서, 항체 "아암(arm)"의 가변 영역은 다수의 부위에서 항원과 비공유적인 힘을 통해 상호작용하며; 상호작용이 더 많을수록 친화도는 더 강해진다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "항체"는 상응하는 항원에 비공유적으로, 가역적으로, 그리고 특이적 방식으로 결합할 수 있는 면역글로불린 패밀리의 폴리펩티드를 지칭한다. 예를 들어, 천연 발생 IgG 항체는 이황화물 결합에 의해 상호연결된 적어도 2개의 중쇄(H)와 2개의 경쇄(L)를 포함하는 사량체이다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본 명세서에서 VH로 약기됨) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, 즉 CH1, CH2 및 CH3으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본 명세서에서 VL로 약기됨) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인, 즉 CL로 구성된다. VH 및 VL 영역은 상보성 결정 영역(CDR)으로 불리는 초가변성의 영역들로 추가로 세분될 수 있으며, 이들 사이에는 프레임워크 영역(FR)으로 불리는 더 보존된 영역들이 산재되어 있다. 각각의 VH 및 VL은 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성되며, 아미노-말단부터 카르복시-말단까지 하기의 순서대로 배열된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 및 FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은, 면역 시스템의 다양한 세포(예를 들어, 이펙터 세포) 및 고전적 보체 시스템의 제1 성분(C1q)을 포함한, 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
용어 "항체"는 단일클론 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 및 항-이디오타입(항-Id) 항체를 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 항체는 임의의 동종형/부류(class)(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 또는 하위부류(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2)를 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 항-OX40 항체는 적어도 하나의 항원-결합 부위 또는 적어도 가변 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-OX40 항체는 본 명세서에 기재된 OX40 항체로부터 유래되는 항원-결합 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-OX40 항체는 단리되거나 재조합된 것이다.
본 명세서에서, 용어 "단일클론 항체" 또는 "mAb" 또는 "Mab"는 실질적으로 균질한 항체들의 집단을 의미하며, 즉, 그러한 집단 내에 포함된 항체 분자들은 소량으로 존재할 수 있는 천연 발생 돌연변이의 가능성을 제외하고는 아미노산 서열이 동일하다. 대조적으로, 통상적인(다중클론) 항체 제제는 통상적으로, 종종 상이한 에피토프에 특이적인 가변 도메인, 특히 상보성 결정 영역(CDR) 내에 상이한 아미노산 서열을 갖는 다수의 상이한 항체를 포함한다. 수식어 "단일클론"은 항체들의 실질적으로 균질한 집단으로부터 수득되는 것으로서 항체의 특징을 나타내며, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생성을 요구하는 것으로서 해석되어서는 안 된다. 단일클론 항체(mAb)는 당업자에게 알려진 방법에 의해 수득될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Kohler et al., Nature 1975 256:495-497]; 미국 특허 4,376,110; 문헌[Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY 1992]; 문헌[Harlow et al., ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold spring Harbor Laboratory 1988]; 및 문헌[Colligan et al., CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY 1993]을 참조한다. 본 명세서에 개시된 항체는 IgG, IgM, IgD, IgE, IgA를 포함한 임의의 면역글로불린 부류 및 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4와 같은 이들의 임의의 하위부류를 가질 수 있다. 단일클론 항체를 생성하는 하이브리도마는 시험관내 또는 생체내에서 배양될 수 있다. 고역가의 단일클론 항체는 생체내 생성에서 수득될 수 있는데, 여기서는 개별 하이브리도마들로부터 유래되는 세포를 마우스, 예컨대 고유하게 프라이밍된(pristine-primed) Balb/c 마우스 내로 복막내 주사하여 고농도의 원하는 항체를 함유하는 복수(ascites fluid)를 생성한다. 동종형 IgM 또는 IgG의 단일클론 항체가 당업자에게 잘 알려진 컬럼 크로마토그래피 방법을 사용하여 그러한 복수로부터 또는 배양 상청액으로부터 정제될 수 있다.
일반적으로, 기본 항체 구조 단위는 사량체를 포함한다. 각각의 사량체는 2개의 동일한 쌍의 폴리펩티드 사슬을 포함하며, 각각의 쌍은 하나의 "경쇄"(약 25 kDa) 및 하나의 "중쇄"(약 50 내지 70 kDa)를 갖는다. 각각의 사슬의 아미노-말단 부분은, 주로 항원 인식을 담당하는 약 100 내지 110개 또는 그 이상의 아미노산의 가변 영역을 포함한다. 중쇄의 카르복시-말단 부분은 이펙터 기능을 주로 담당하는 불변 영역을 규정할 수 있다. 통상적으로, 인간 경쇄는 카파 경쇄 및 람다 경쇄로 분류된다. 더욱이, 인간 중쇄는 통상적으로 α, δ, ε, γ, 또는 μ로 분류되며, 각각 IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM으로서 항체의 동종형을 규정한다. 경쇄 및 중쇄에서, 가변 영역과 불변 영역은 약 12개 이상의 아미노산의 "J" 영역에 의해 결합되며, 중쇄는 또한 약 10개 이상의 아미노산의 "D" 영역을 포함한다.
각각의 경쇄/중쇄(VL/VH) 쌍의 가변 영역은 항체-결합 부위를 형성한다. 따라서, 일반적으로, 온전한 항체는 2개의 결합 부위를 갖는다. 이작용성 또는 이중특이성 항체의 경우를 제외하고는, 2개의 결합 부위는 일반적으로 동일하다.
통상적으로, 중쇄 및 경쇄 둘 모두의 가변 도메인은 "상보성 결정 영역(CDR)"으로도 불리는 3개의 초가변 영역을 포함하며, 이들은 상대적으로 보존된 프레임워크 영역들(FR) 사이에 위치된다. CDR들은 통상 프레임워크 영역들에 의해 정렬되어, 특정 에피토프에 대한 결합을 가능하게 한다. 일반적으로, N-말단에서 C-말단으로, 경쇄 가변 도메인 및 중쇄 가변 도메인 둘 모두는 FR-1(또는 FR1), CDR-1(또는 CDR1), FR-2(FR2), CDR-2(CDR2), FR-3(또는 FR3), CDR-3(CDR3), 및 FR-4(또는 FR4)를 포함한다. CDR 및 프레임워크 영역의 위치는 당업계에 잘 알려진 다양한 정의, 예를 들어 카바트(Kabat), 초티아(Chothia), 및 AbM을 사용하여 결정될 수 있다(예를 들어, 문헌[Johnson et al., Nucleic Acids Res., 29:205-206 (2001)]; 문헌[Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987)]; 문헌[Chothia et al., Nature, 342:877-883 (1989)]; 문헌[Chothia et al., J. Mol. Biol., 227:799-817 (1992)]; 문헌[Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol., 273:927-748 (1997] 참조). 항원-결합 부위의 정의는 또한 하기에 기재되어 있다: 문헌[Ruiz et al., Nucleic Acids Res., 28:219-221 (2000)]; 문헌[Lefranc, M. P., Nucleic Acids Res., 29:207-209 (2001)]; 문헌[MacCallum et al., J. Mol. Biol., 262:732-745 (1996)]; 문헌[Martin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:9268-9272 (1989)]; 문헌[Martin et al., Methods Enzymol., 203:121-153 (1991)]; 및 문헌[Rees et al., In Sternberg M. J. E. (ed.), Protein Structure Prediction, Oxford University Press, Oxford, 141-172 (1996)]. 일부 구현예에서, 조합된 카바트 및 초티아 넘버링 체계에서, CDR은 카바트 CDR의 일부, 초티아 CDR의 일부, 또는 둘 모두인 아미노산 잔기에 상응한다. 예를 들어, CDR은 VH, 예를 들어 포유류 VH, 예를 들어 인간 VH에서는 아미노산 잔기 26 내지 35(HC CDR1), 50 내지 65(HC CDR2), 및 95 내지 102(HC CDR3), 그리고 VL, 예를 들어 포유류 VL, 예를 들어 인간 VL에서는 아미노산 잔기 24 내지 34(LC CDR1), 50 내지 56(LC CDR2), 및 89 내지 97(LC CDR3)에 상응한다.
용어 "초가변 영역"은 항원-결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 의미한다. 초가변 영역은 "CDR"로부터 유래되는 아미노산 잔기(즉, 경쇄 가변 영역에서의 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3 및 중쇄 가변 도메인에서의 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3)를 포함한다. 문헌[Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.](서열에 의해 항체의 CDR 영역을 정의함)을 참조하며; 또한, 문헌[Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917](구조에 의해 항체의 CDR 영역을 정의함)을 참조한다. 용어 "프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 본 명세서에서 CDR 잔기로 정의된 초가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 의미한다.
달리 나타내지 않는 한, "항원-결합 단편"은 항체의 항원-결합 단편, 즉, 전장 항체에 의해 결합되는 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체 단편, 예를 들어 하나 이상의 CDR 영역을 보유하는 단편을 의미한다. 항원-결합 단편의 예에는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 다이아바디(diabody); 선형 항체; 단일쇄 항체 분자, 예를 들어 단일쇄 Fv(ScFv); 나노바디; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이성 항체가 포함되지만 이로 한정되지 않는다.
항체는 표적 단백질에 "특이적으로 결합"하는데, 이는, 항체가 기타 다른 단백질과 대비하여 그러한 표적에 대한 우선적인 결합을 나타내지만, 이러한 특이성은 절대적인 결합 특이성을 필요로 하지 않음을 나타낸다. 항체는, 그의 결합이, 예를 들어 위양성(false positive)과 같은 원치 않는 결과를 생성하지 않고서, 샘플 내의 표적 단백질의 존재를 결정짓는 경우에, 그의 의도된 표적에 "특이적인" 것으로 여겨진다. 본 개시내용에 유용한 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 비표적 단백질에 대한 친화도보다 적어도 2배 더 큰, 바람직하게는 적어도 10배 더 큰, 더 바람직하게는 적어도 20배 더 큰, 그리고 가장 바람직하게는 적어도 100배 더 큰 친화도로 표적 단백질에 결합할 것이다. 본 명세서에서, 항체가 주어진 아미노산 서열, 예를 들어 인간 OX40 분자의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 특이적으로 결합한다고 되어 있다면, 이는, 항체가 그러한 서열을 포함하는 폴리펩티드에는 결합하지만 그러한 서열이 결여되어 있는 단백질에는 결합하지 않는 경우이다.
본 명세서에서, 용어 "인간 항체"는 인간 면역글로불린 단백질 서열만을 포함하는 항체를 의미한다. 인간 항체는 마우스에서, 마우스 세포에서, 또는 마우스 세포로부터 유래되는 하이브리도마에서 생성된다면, 뮤린 탄수화물 사슬을 함유할 수 있다. 유사하게, "마우스 항체" 또는 "래트 항체"는 각각 마우스 또는 래트 면역글로불린 단백질 서열만을 포함하는 항체를 의미한다.
용어 "인간화 항체"는 비인간(예를 들어, 뮤린) 항체뿐만 아니라 인간 항체로부터의 서열을 함유하는 항체의 형태를 의미한다. 그러한 항체는 비인간 면역글로불린으로부터 유래되는 최소한의 서열을 함유한다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 하나, 그리고 통상적으로는 2개의, 실질적으로 모든 가변 도메인을 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비인간 면역글로불린의 것들에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 면역글로불린 서열의 것들이다. 인간화 항체는 선택적으로 또한 면역글로불린 불변 영역(Fc), 통상적으로는 인간 면역글로불린의 것의 적어도 일부분을 포함할 것이다. 접두사 "hum", "hu", "Hu", 또는 "h"는 인간화 항체를 모 설치류 항체와 구별하는 데 필요할 때 항체 클론 표기에 추가된다. 설치류 항체의 인간화 형태는 일반적으로 모 설치류 항체와 동일한 CDR 서열을 포함하겠지만, 친화도를 증가시키기 위하여, 인간화 항체의 안정성을 증가시키기 위하여, 번역후 변형을 제거하기 위하여, 또는 기타 다른 이유로 특정 아미노산 치환이 포함될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "비경쟁적"은 항체 결합이 일어나고 수용체에 대한 리간드 결합을 방해하지 않음을 의미한다.
용어 "상응하는 인간 생식세포계열 서열"은 인간 생식세포계열 면역글로불린 가변 영역 서열에 의해 인코딩된 모든 다른 알려진 가변 영역 아미노산 서열과 대비하여, 참조 가변 영역 아미노산 서열 또는 하위서열과 최고로 결정된 아미노산 서열 동일성을 공유하는 인간 가변 영역 아미노산 서열 또는 하위서열을 인코딩하는 핵산 서열을 지칭한다. 상응하는 인간 생식세포계열 서열은 또한 모든 다른 평가된 가변 영역 아미노산 서열과 대비하여, 참조 가변 영역 아미노산 서열 또는 하위서열과 최고의 아미노산 서열 동일성을 갖는 인간 가변 영역 아미노산 서열 또는 하위서열을 지칭할 수 있다. 상응하는 인간 생식세포계열 서열은 프레임워크 영역만일 수 있거나, 상보성 결정 영역만일 수 있거나, 프레임워크 및 상보성 결정 영역일 수 있거나, 가변 세그먼트(상기에 정의된 바와 같음)일 수 있거나, 가변 영역을 포함하는 서열 또는 하위서열의 기타 다른 조합일 수 있다. 서열 동일성은 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여, 예를 들어 BLAST, ALIGN, 또는 당업계에 알려진 또 다른 정렬 알고리즘을 사용하여 2개의 서열을 정렬함으로써 결정될 수 있다. 상응하는 인간 생식세포계열 핵산 또는 아미노산 서열은 참조 가변 영역 핵산 또는 아미노산 서열과 적어도 약 90%, 91, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 가질 수 있다.
용어 "평형 해리 상수(KD, M)"는 해리 속도 상수(kd, 시간-1)를 회합 속도 상수(ka, 시간-1, M- 1)로 나눈 값을 지칭한다. 평형 해리 상수는 당업계에 알려진 임의의 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 본 개시내용의 항체는 일반적으로 평형 해리 상수가 약 10-7 또는 10-8 M 미만, 예를 들어 약 10-9 M 또는 10-10 M 미만, 일부 양태에서는, 약 10-11 M, 10-12 M 또는 10-13 M 미만일 것이다.
본 명세서에서, 용어 "암" 또는 "종양"은 당업계에 이해되는 바와 같은 가장 넓은 의미를 가지며, 통상적으로 비조절된 세포 성장을 특징으로 하는 포유동물에서의 생리학적 상태를 지칭한다. 본 개시내용과 관련하여, 암은 특정 유형 또는 위치로 한정되지 않는다.
용어 "병용 요법"은 본 개시내용에 기재된 치료 질환 또는 장애를 치료하기 위하여 2개 이상의 치료제를 투여하는 것을 지칭한다. 그러한 투여는 실질적으로 동시적인 방식으로의 이들 치료제의 공동투여를 포함한다. 그러한 투여는 또한 각각의 활성 성분을 위한 다수의 또는 개별 용기(예를 들어, 캡슐, 분말, 및 액체)로의 공동투여를 포함한다. 분말 및/또는 액체는 투여 전에 원하는 용량으로 재구성되거나 희석될 수 있다. 추가적으로, 그러한 투여는 또한 대략적으로 동일한 시간에 또는 상이한 시간에 순차적 방식으로의 각각의 유형의 치료제의 사용을 포함한다. 어느 경우이든, 치료 계획(treatment regimen)은 본 명세서에 기재된 질환 또는 장애를 치료하는 데 있어서 약물 병용의 유익한 효과를 제공할 것이다.
본 개시내용과 관련하여, 아미노산 서열을 언급할 때, 용어 "보존적 치환"은 원래의 아미노산을 항체 또는 단편의 화학적, 물리적 및/또는 기능적 특성, 예를 들어 OX40에 대한 그의 결합 친화도를 실질적으로 변경시키지 않는 새로운 아미노산으로 치환하는 것을 의미한다. 구체적으로, 아미노산의 일반적인 보존적 치환은 하기 표에 제시되어 있으며, 당업계에 잘 알려져 있다.
예시적인 보존적 아미노산 치환
Figure pct00002
% 서열 동일성 및 서열 유사성을 결정하는 데 적합한 알고리즘의 예는 BLAST 알고리즘이며, 이들은 문헌[Altschul et al, Nuc. Acid Res. 25:3389-3402, 1977]; 및 문헌[Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990]에 각각 기재되어 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 NCBI(National Center for Biotechnology Information, 미국 국립생물공학정보센터)를 통해 공개적으로 입수 가능하다. 이 알고리즘은 먼저, 데이터베이스 서열 중의 동일한 길이의 단어와 정렬될 때, 양의 역치 점수(positive-valued threshold score) T에 어느 정도 매칭되거나 충족되는, 질의(query) 서열 중의 길이 W의 짧은 단어를 확인함으로써 고득점 서열 쌍(high scoring sequence pair, HSP)을 확인하는 것을 수반한다. T는 이웃 단어 점수 역치(neighborhood word score threshold)라고 한다. 이들 초기 이웃 단어 히트(hit)는 이들을 함유하는 더 긴 HSP를 찾기 위한 검색을 개시하기 위한 값으로서 역할을 한다. 단어 히트는 누적 정렬 점수가 증가될 수 있는 한 멀리 각각의 서열을 따라 양방향으로 연장된다. 누적 점수는, 뉴클레오티드 서열의 경우, 파라미터 M(매칭 잔기 쌍에 대한 보상 점수; 항상 > 0) 및 N(미스매칭 잔기에 대한 페널티 점수; 항상 < 0)을 사용하여 계산한다. 아미노산 서열의 경우, 득점 매트릭스를 사용하여 누적 점수를 계산한다. 각 방향에서의 단어 히트의 연장은 다음의 경우에 정지된다: 누적 정렬 점수가 그의 최대 도달 값으로부터 X의 양만큼 하락한 경우; 하나 이상의 실점(negative-scoring) 잔기 정렬의 축적으로 인해, 누적 점수가 0 이하가 된 경우; 또는 어느 서열이든 말단에 도달한 경우. BLAST 알고리즘 파라미터 W, T 및 X는 정렬의 감도 및 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램(뉴클레오티드 서열용)은 디폴트로서 단어 길이(W) = 11, 기대치(E) = 10, M = 5, N = -4 및 양쪽 가닥 비교를 사용한다. 아미노산 서열의 경우, BLAST 프로그램은 디폴트로서 단어 길이 = 3, 및 기대치(E) = 10, 및 BLOSUM62 득점 매트릭스(문헌[Henikoff and Henikoff, (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915] 참조), 정렬(B) = 50, 기대치(E) = 10, M = 5, N = -4, 및 양쪽 가닥 비교를 사용한다.
BLAST 알고리즘은 또한 2개의 서열 사이의 유사성 통계 분석을 수행한다(예를 들어, 문헌[Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787, 1993] 참조). BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 유사성의 한 가지 척도는 최소 합계 확률(P(N))이며, 이는 2개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 매치가 우연히 일어날 확률의 지표를 제공한다. 예를 들어, 참조 핵산 대비 검사 핵산의 비교에서 최소 합계 확률이 약 0.2 미만, 더 바람직하게는 약 0.01 미만, 가장 바람직하게는 약 0.001 미만인 경우, 핵산은 참조 서열과 유사한 것으로 간주된다.
2개의 아미노산 서열 사이의 % 동일성은 또한, PAM120 가중치 잔기(weight residue) 표, 갭 길이 페널티 = 12 및 갭 페널티 = 4를 사용하여, ALIGN 프로그램(버전 2.0) 내로 통합된 문헌[E. Meyers and W. Miller, Comput. Appl. Biosci. 4: 11-17, (1988)]의 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다. 또한, 2개의 아미노산 서열 사이의 % 동일성은, BLOSUM62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스 중 어느 하나, 및 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4의 갭 가중치(gap weight) 및 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6의 길이 가중치(length weight)를 사용하여, GCG 소프트웨어 패키지 내의 GAP 프로그램 내로 통합된 문헌[Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:444-453, (1970)]의 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "핵산"은 용어 "폴리뉴클레오티드"와 상호교환 가능하게 사용되며, 단일가닥 형태 또는 이중가닥 형태 중 어느 하나의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 및 이들의 중합체를 지칭한다. 이 용어는 알려진 뉴클레오티드 유사체 또는 변형된 백본(backbone) 잔기 또는 결합(linkage)을 함유하는 핵산을 포함하며, 이러한 핵산은 합성, 천연 발생, 및 비천연 발생 핵산이고, 참조 핵산과 유사한 결합 특성을 갖고, 참조 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사된다. 그러한 유사체의 예에는, 제한 없이, 포스포로티오에이트, 포스포르아미데이트, 메틸 포스포네이트, 키랄-메틸 포스포네이트, 2-O-메틸 리보뉴클레오티드, 및 펩티드-핵산(PNA)이 포함된다.
핵산과 관련하여 용어 "작동 가능하게 연결된"은 2개 이상의 폴리뉴클레오티드(예를 들어, DNA) 세그먼트 사이의 기능적 관계를 지칭한다. 통상적으로, 그것은 전사 조절 서열과 전사된 서열의 기능적 관계를 지칭한다. 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서 서열이 적절한 숙주 세포 또는 기타 다른 발현 시스템에서 코딩 서열의 전사를 자극하거나 조절하는 경우, 그것은 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된다. 일반적으로, 전사된 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터 전사 조절 서열은 전사된 서열에 물리적으로 인접해 있으며, 즉, 이들은 시스-작용성(cis-acting)이다. 그러나, 일부 전사 조절 서열, 예컨대 인핸서는 전사를 향상시키려는 코딩 서열에 물리적으로 인접해 있거나 근접하게 위치될 것을 필요로 하지 않는다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 부형제와 함께 제형화되는, 본 명세서에 기재된 항-OX40 항체를 포함하는 조성물, 예를 들어 약제학적으로 허용되는 조성물을 제공한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "약제학적으로 허용되는 부형제"는 생리학적으로 적합한 임의의 그리고 모든 용매, 분산 매질, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 부형제는 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 직장, 척수 또는 표피 투여(예를 들어, 주사 또는 주입에 의함)에 적합할 수 있다.
본 명세서에 개시된 조성물은 다양?h 형태일 수 있다. 이들은, 예를 들어 액체, 반고체 및 고체 투여 형태, 예컨대 액체 용액(예를 들어, 주사가능 및 주입 용액), 분산물 또는 현탁액, 리소좀, 및 좌제를 포함한다. 적합한 형태는 의도된 투여 방식 및 치료적 응용에 좌우된다. 통상적인 적합한 조성물은 주사가능 용액 또는 주입 용액의 형태이다. 하나의 적합한 투여 방식은 비경구(예를 들어, 정맥내, 피하, 복막내, 근육내)이다. 일부 구현예에서, 항체는 정맥내 주입 또는 주사에 의해 투여된다. 특정 구현예에서, 항체는 근육내 또는 피하 주사에 의해 투여된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "치료적 유효량"은 질병을 치료하거나 질병 또는 장애의 임상 증상들 중 적어도 하나를 치료하기 위하여 대상체에게 투여될 때, 질병, 장애, 또는 증상을 위한 그러한 치료를 달성하기에 충분한 항체의 양을 지칭한다. "치료적 유효량"은 항체, 질병, 장애, 및/또는 질병 또는 장애의 증상; 질병, 장애, 및/또는 질병 또는 장애의 증상의 중증도; 치료하려는 대상체의 연령; 및/또는 치료하려는 대상체의 체중에 따라 변동될 수 있다. 임의의 주어진 경우의 적절한 양이 당업자에게 명백할 수 있거나 일상 실험에 의해 결정될 수 있다. 병용 요법의 경우에, "치료적 유효량"은 질병, 장애 또는 질환의 유효적 치료를 위한 병용 물질들의 총량을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 어구 "~와 병용하여"는 항-OX40 항체 또는 결합 단편이 항-TIGIT 항체 또는 결합 단편의 투여와 동시에, 그 전에, 또는 그 후에 대상체에게 투여되는 것을 의미한다. 특정 구현예에서, 항-OX40 항체 또는 결합 단편은 항-TIGIT 항체 또는 결합 단편과의 공동제형(co-formulation)으로서 투여된다.
항- TIGIT 항체
본 개시내용은 VSIG9 및 VSTM3(GenBank 수탁 번호 NM_173799 참조)으로도 알려진 인간 TIGIT에 특이적으로 결합하는 항체, 항원-결합 단편을 제공한다. 더욱이, 본 개시내용은 바람직한 약동학적 특성 및 기타 다른 바람직한 속성을 갖는 항체를 제공하며, 이에 따라 암의 가능성을 감소시키거나 암을 치료하는 데 사용될 수 있다. 본 개시내용은 항체를 포함하는 약제학적 조성물 및 암 및 연관 장애의 예방 및 치료를 위하여 그러한 약제학적 조성물을 제조하는 방법 및 사용하는 방법을 추가로 제공한다.
본 개시내용의 항-TIGIT 항체는 WO2019/129261에서 확인될 수 있다. 항-TIGIT 항체가 또한 본 명세서에 제공되며, 상기 항-TIGIT 항체는 인간 TIGIT에 특이적으로 결합하는 항체 항원-결합 도메인을 포함하고, 상보성 결정 영역(CDR)으로서, 서열 번호 32에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열 번호 33에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열 번호 34에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및 서열 번호 35에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열 번호 36에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열 번호 37에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항-TIGIT 항체는, 인간 TIGIT에 특이적으로 결합하고, 서열 번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 서열 번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 항체 항원-결합 도메인을 포함한다.
항-OX40 항체
본 개시내용은 인간 OX40에 특이적으로 결합하는 항체, 항원-결합 단편을 제공한다. 더욱이, 본 개시내용은 바람직한 약동학적 특성 및 기타 다른 바람직한 속성을 갖는 항체를 제공하며, 이에 따라 암의 가능성을 감소시키거나 암을 치료하는 데 사용될 수 있다. 본 개시내용은 항체를 포함하는 약제학적 조성물 및 암 및 연관 장애의 예방 및 치료를 위하여 그러한 약제학적 조성물을 제조하는 방법 및 사용하는 방법을 추가로 제공한다.
본 개시내용은 OX40에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 본 개시내용의 항체 또는 항원-결합 단편은 하기에 기재된 바와 같이 생성된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하지만 이로 한정되지 않는다.
본 개시내용은 OX40에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편을 제공하며, 상기 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원-결합 단편)은 서열 번호 14, 20 또는 26의 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인을 포함한다(표 3). 본 개시내용은 또한 OX40에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편을 제공하며, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 표 3에 열거된 VH CDR 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR을 포함한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 OX40에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편을 제공하며, 상기 항체는 표 3에 열거된 VH CDR 중 임의의 것의 아미노산 서열을 갖는 1개, 2개, 3개, 또는 그 이상의 VH CDR을 포함한다(또는 대안적으로 이로 이루어진다).
본 개시내용은 OX40에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편을 제공하며, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 서열 번호 16, 22 또는 28의 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함한다(표 3). 본 개시내용은 또한 OX40에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편을 제공하며, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 표 3에 열거된 VL CDR 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR을 포함한다. 구체적으로는, 본 개시내용은 OX40에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편을 제공하며, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 표 3에 열거된 VL CDR 중 임의의 것의 아미노산 서열을 갖는 1개, 2개, 3개, 또는 그 이상의 VL CDR을 포함한다(또는 대안적으로 이로 이루어진다).
본 개시내용의 기타 다른 항체 또는 이의 항원-결합 단편은, 돌연변이되었지만, 여전히 CDR 영역 내에서 표 3에 기재된 서열로 나타낸 CDR 영역과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%의 % 동일성을 갖는 아미노산을 포함한다. 일부 양태에서, 그것은 돌연변이 아미노산 서열을 포함하는데, 여기서는 표 3에 기재된 서열에 나타낸 CDR 영역과 비교할 때 CDR 영역 내에서 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개 이하의 아미노산이 돌연변이되었다.
기타 다른 본 개시내용의 항체는, 아미노산 또는 아미노산을 인코딩하는 핵산이 돌연변이되었지만; 여전히, 표 3에 기재된 서열과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%의 % 동일성을 갖는 것들을 포함한다. 일부 양태에서, 그것은 돌연변이 아미노산 서열을 포함하는데, 여기서는 표 3에 기재된 서열에 나타낸 가변 영역과 비교할 때, 실질적으로 동일한 치료적 활성을 보유하면서, 가변 영역 내에서 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개 이하의 아미노산이 돌연변이되었다.
본 개시내용은 또한 OX40에 특이적으로 결합하는 항체의 VH, VL, 전장 중쇄, 및 전장 경쇄를 인코딩하는 핵산 서열을 제공한다. 그러한 핵산 서열은 포유류 세포에서의 발현을 위하여 최적화될 수 있다.
에피토프의 확인 및 동일한 에피토프에 결합하는 항체
본 개시내용은 인간 OX40의 에피토프에 결합하는 항체 및 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 특정 양태에서, 항체 및 항원-결합 단편은 OX40의 동일한 에피토프에 결합할 수 있다.
본 개시내용은 또한 표 3에 기재된 항-OX40 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체 및 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 따라서, 추가적인 항체 및 이의 항원-결합 단편이 결합 검정에서 기타 다른 항체와 교차-경쟁하는(예를 들어, 통계학적으로 유의한 방식으로 그의 결합을 경쟁적으로 억제하는) 그들의 능력에 기초하여 확인될 수 있다. OX40에 대한 본 개시내용의 항체 및 이의 항원-결합 단편의 결합을 억제하는 검사 항체의 능력은 검사 항체가 OX40에 대한 결합을 위하여 그러한 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 경쟁할 수 있음을 입증한다. 그러한 항체는, 어느 하나의 이론에 구애되지 않고서, 그것이 경쟁하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 OX40 상의 동일하거나 관련된(예를 들어, 구조적으로 유사하거나 공간적으로 근접한) 에피토프에 결합할 수 있다. 특정 양태에서, 본 개시내용의 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 OX40 상의 동일한 에피토프에 결합하는 항체는 인간 또는 인간화 단일클론 항체이다. 그러한 인간 또는 인간화 단일클론 항체는 본 명세서에 기재된 바와 같이 제조되고 단리될 수 있다.
Fc 영역의 프레임워크의 추가의 변경
또 다른 양태에서, Fc 영역은 적어도 하나의 아미노산 잔기를 상이한 아미노산 잔기로 대체하여 항체의 이펙터 기능을 변경시킴으로써 변경된다. 예를 들어, 하나 이상의 아미노산은, 항체가 이펙터 리간드에 대한 변경된 친화도를 갖지만 모 항체의 항원-결합 능력은 보유하도록 상이한 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 친화도가 변경되는 이펙터 리간드는, 예를 들어 Fc 수용체 또는 C1 보체 성분일 수 있다. 이러한 접근법은, 예를 들어 미국 특허 5,624,821 및 5,648,260(둘 모두 Winter et al.)에 기재되어 있다.
또 다른 양태에서, 하나 이상의 아미노산 잔기는, 항체가 변경된 C1q 결합을 갖고/갖거나 감소되거나 소실된 보체 의존성 세포독성(CDC)을 갖도록 하나 이상의 상이한 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 이러한 접근법은, 예를 들어 미국 특허 6,194,551(Idusogie et al.)에 기재되어 있다.
또 다른 양태에서, 하나 이상의 아미노산 잔기를 변경시킴으로써, 보체를 고정하는 항체의 능력을 변경시킨다. 이러한 접근법은, 예를 들어 PCT 공개 WO 94/29351(Bodmer et al.)에 기재되어 있다. 구체적인 양태에서, 본 개시내용의 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 하나 이상의 아미노산은 IgG1 하위부류 및 카파 동종형에 대하여 하나 이상의 알로타입(allotypic) 아미노산 잔기로 대체된다. 알로타입 아미노산 잔기는 또한 문헌[Jefferis et al., MAbs. 1:332-338 (2009)]에 기재된 바와 같이, IgG1, IgG2, 및 IgG3 하위부류의 중쇄의 불변 영역뿐만 아니라, 카파 동종형의 경쇄의 불변 영역을 포함하지만 이로 한정되지 않는다.
또 다른 양태에서, Fc 영역은 항체 의존성 세포성 세포독성(ADCC)을 매개하는 항체의 능력을 증가시키고/시키거나, 하나 이상의 아미노산을 변형시킴으로써 Fcγ 수용체에 대한 항체의 친화도를 증가시키도록 변형된다. 이러한 접근법은, 예를 들어 PCT 공개 WO 00/42072(Presta)에 기재되어 있다. 더욱이, FcγRI, FcγRII, FcγRIII 및 FcRn에 대한 인간 IgG1 상의 결합 부위는 맵핑되어 있으며, 개선된 결합을 갖는 변이체가 기재되어 있다(문헌[Shields et al., J. Biol. Chem. 276:6591-6604, 2001] 참조).
또 다른 양태에서, 항체의 글리코실화가 변형된다. 예를 들어, 비글리코실화(aglycosylated) 항체가 제조될 수 있다(즉, 항체는 글리코실화가 결여되어 있거나 감소됨). 글리코실화는, 예를 들어 "항원"에 대한 항체의 친화도를 증가시키도록 변경될 수 있다. 그러한 탄수화물 변형은, 예를 들어 항체 서열 내의 하나 이상의 글리코실화 부위를 변경시킴으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 가변 영역 프레임워크 글리코실화 부위의 제거를 가져옴으로써 그 부위에서의 글리코실화를 제거하는 하나 이상의 아미노산 치환이 이루어질 수 있다. 그러한 비글리코실화는 항원에 대한 항체의 친화도를 증가시킬 수 있다. 그러한 접근법은, 예를 들어 미국 특허 5,714,350 및 6,350,861(Co et al.)에 기재되어 있다.
추가적으로 또는 대안적으로, 변경된 유형의 글리코실화를 갖는 항체, 예컨대 감소된 양의 푸코실 잔기를 갖는 하이포푸코실화(hypofucosylated) 항체 또는 증가된 이등분(bisecting) GlcNac 구조를 갖는 항체가 제조될 수 있다. 그러한 변경된 글리코실화 패턴은 항체의 ADCC 능력을 증가시키는 것으로 입증되어 있다. 그러한 탄수화물 변형은, 예를 들어 변경된 글리코실화 기구를 갖는 숙주 세포에서 항체를 발현시킴으로써 달성될 수 있다. 변경된 글리코실화 기구를 갖는 세포는 당업계에 기재되어 있으며, 재조합 항체를 발현시킴으로써 변경된 글리코실화를 갖는 항체를 생성하기 위한 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 예를 들어, EP 1,176,195(Hang et al.)는 기능적으로 파괴된 FUT8 유전자를 갖는 세포주를 기재하는데, 이는 푸코실 트랜스퍼라제를 인코딩하여, 그러한 세포주에서 발현되는 항체가 하이포푸코실화를 나타내도록 한다. PCT 공개 WO 03/035835(Presta)는 변이 CHO 세포주, Lecl3 세포를 기재하는데, 이것은 Asn(297)-결합된 탄수화물에 푸코스를 부착시키는 능력이 감소되며, 이는 또한 그러한 숙주 세포에서 발현된 항체의 하이포푸코실화를 가져온다(또한, 문헌[Shields et al., (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740] 참조). PCT 공개 WO 99/54342(Umana et al.)는 당단백질-변형 글리코실 트랜스퍼라제(예를 들어, 베타(1,4)-N 아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III(GnTIII))를 발현하도록 조작된 세포주를 기재하는데, 이에 따라, 조작된 세포주에서 발현된 항체는 증가된 이등분 GlcNac 구조를 나타내며, 이는 항체의 증가된 ADCC 활성을 가져온다(또한, 문헌[Umana et al., Nat. Biotech. 17:176-180, 1999] 참조).
또 다른 양태에서, ADCC의 감소가 요구된다면, 인간 항체 하위부류 IgG4가 많은 이전 보고서에서 단지 약한 ADCC만을 가지며 CDC 이펙터 기능을 거의 갖지 않는 것으로 밝혀져 있다(문헌[Moore G L, et al. 2010 MAbs, 2:181-189]). 다른 한편으로, 천연 IgG4는 스트레스 조건에서, 예컨대 산성 완충액 중에서 또는 증가하는 온도 하에서 덜 안정한 것으로 확인되었다(문헌[Angal, S. 1993 Mol Immunol, 30:105-108]; 문헌[Dall'Acqua, W. et al, 1998 Biochemistry, 37:9266-9273]; 문헌[Aalberse et al. 2002 Immunol, 105:9-19]). 감소된 ADCC는, 항체를 감소된 또는 널(null) FcγR 결합 또는 C1q 결합 활성을 갖는 변경들의 조합으로 조작된 IgG4에 작동 가능하게 연결시킴으로써 ADCC 및 CDC 이펙터 기능을 감소시키거나 제거함으로써 달성될 수 있다. 생물학적 약물로서 항체의 물리화학적 특성을 고려해 볼 때, IgG4의 덜 바람직한 고유 특성 중 하나는 용액 중에서 그의 2개의 중쇄를 동적 분리하여 하프 항체(half antibody)를 형성하는 것인데, 이는 "Fab 아암 교환"으로 불리는 공정을 통해 생체내에서 생성되는 이중특이성 항체로 이어진다(문헌[Van der Neut Kolfschoten M, et al. 2007 Science, 317:1554-157]). 위치 228((EU 넘버링 체계))에서 세린에서 프롤린으로의 돌연변이는 IgG4 중쇄 분리에 대해 억제적인 것으로 나타났다(문헌[Angal, S. 1993 Mol Immunol, 30:105-108]; 문헌[Aalberse et al. 2002 Immunol, 105:9-19]). 힌지 및 γFc 영역 내의 아미노산 잔기들 중 일부는 Fcγ 수용체와의 항체 상호작용에 대해 영향을 미치는 것으로 보고되었다(문헌[Chappel S M, et al. 1991 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:9036-9040]; 문헌[Mukherjee, J. et al., 1995 FASEB J, 9:115-119]; 문헌[Armour, K. L. et al. 1999 Eur J Immunol, 29:2613-2624]; 문헌[Clynes, R. A. et al, 2000 Nature Medicine, 6:443-446]; 문헌[Arnold J. N., 2007 Annu Rev immunol, 25:21-50]). 더욱이, 인간 집단에서 드물게 발생하는 일부 IgG4 아이소형(isoform)은 또한 상이한 물리화학적 특성을 유도할 수 있다(문헌[Brusco, A. et al. 1998 Eur J Immunogenet, 25:349-55]; 문헌[Aalberse et al. 2002 Immunol, 105:9-19]). 낮은 ADCC, CDC 및 불안정성을 갖는 OX40 항체를 생성하기 위하여, 인간 IgG4의 힌지 및 Fc 영역을 변형시키고 다수의 변경을 도입하는 것이 가능하다. 이들 변형된 IgG4 Fc 분자는 미국 특허 8,735,553(Li et al.)의 서열 번호 83 내지 88에서 확인될 수 있다.
OX40 항체 생성
항-OX40 항체 및 이의 항원-결합 단편은 항체 사량체의 재조합 발현, 화학적 합성, 및 효소적 분해를 포함하지만 이로 한정되지 않는 당업계에 알려진 임의의 수단에 의해 생성될 수 있는 반면, 전장 단일클론 항체는, 예를 들어 하이브리도마 또는 재조합 생성에 의해 수득될 수 있다. 재조합 발현은 당업계에 알려진 임의의 적절한 숙주 세포, 예를 들어 포유류 숙주 세포, 세균 숙주 세포, 효모 숙주 세포, 곤충 숙주 세포 등으로부터 일어날 수 있다.
본 개시내용은 본 명세서에 기재된 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 또는 세그먼트를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 제공한다. 일부 양태에서, 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 15, 21 또는 27로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드와 적어도 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 핵산 서열 동일성을 갖는다. 일부 양태에서, 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 17, 23 또는 29로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드와 적어도 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 핵산 서열 동일성을 갖는다.
본 개시내용의 폴리뉴클레오티드는 항-OX40 항체의 가변 영역 서열을 인코딩할 수 있다. 이들은 또한 항체의 가변 영역 및 불변 영역 둘 모두를 인코딩할 수 있다. 폴리뉴클레오티드 서열들 중 일부는 예시된 항-OX40 항체들 중 하나의 중쇄 및 경쇄 둘 모두의 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 기타 다른 폴리뉴클레오티드는, 뮤린 항체들 중 하나의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역과 각각 실질적으로 동일한 2개의 폴리펩티드 세그먼트를 인코딩한다.
항-OX40 항체를 생성하기 위한 발현 벡터 및 숙주 세포가 본 개시내용에 또한 제공된다. 발현 벡터의 선택은 벡터가 발현되도록 의도된 숙주 세포에 따라 다르다. 통상적으로, 발현 벡터는 프로모터, 및 항-OX40 항체 사슬 또는 항원-결합 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결된 기타 다른 조절 서열(예를 들어, 인핸서)을 함유한다. 일부 양태에서, 유도성 조건의 제어 하에서를 제외하고, 삽입된 서열의 발현을 방지하도록 유도성 프로모터가 사용된다. 유도성 프로모터는, 예를 들어 아라비노스, lacZ, 메탈로티오네인 프로모터 또는 열충격 프로모터를 포함한다. 형질전환된 유기체의 배양물은, 발현 생성물에 대해 숙주 세포가 더 우수한 내성을 나타내는 코딩 서열을 위하여, 집단을 편향시키지 않고서 비유도성 조건 하에서 증폭될 수 있다. 프로모터에 더하여, 항-OX40 항체 또는 항원-결합 단편의 효율적인 발현을 위하여 기타 다른 조절성 요소가 또한 필요하거나 요구될 수 있다. 이들 요소는 통상적으로 ATG 개시 코돈 및 인접한 리보솜 결합 부위 또는 기타 다른 서열을 포함한다. 또한, 발현 효율은 사용 중인 세포 시스템에 대해 적절한 인핸서의 포함에 의해 향상될 수 있다(예를 들어, 문헌[Scharf et al., Results Probl. Cell Differ. 20:125, 1994]; 및 문헌[Bittner et al., Meth. Enzymol., 153:516, 1987] 참조). 예를 들어, SV40 인핸서 또는 CMV 인핸서는 포유류 숙주 세포에서의 발현을 증가시키는 데 사용될 수 있다.
항-OX40 항체 사슬을 보유하고 발현시키기 위한 숙주 세포는 원핵세포 또는 진핵세포 중 어느 하나일 수 있다. E. 콜라이(E. coli)는 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드를 클로닝하고 발현시키기에 유용한 하나의 원핵생물성 숙주이다. 사용하기에 적합한 기타 다른 미생물성 숙주는 간균강, 예컨대 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 및 기타 다른 장내세균과(Enterobacteriaceae), 예컨대 살모넬라(Salmonella), 세라티아(Serratia), 및 다양한 슈도모나스(Pseudomonas) 종을 포함한다. 이들 원핵생물성 숙주에서, 발현 벡터를 또한 제조할 있으며, 이는 통상적으로 숙주 세포와 양립 가능한 발현 제어 서열(예를 들어, 복제 기점)을 함유한다. 또한, 임의의 수의 다양한 잘 알려진 프로모터가 존재할 것이며, 이에는 락토스 프로모터 시스템, 트립토판(trp) 프로모터 시스템, 베타-락타마제 프로모터 시스템, 또는 파지 람다로부터의 프로모터 시스템과 같은 것이 있다. 이들 프로모터는 통상적으로, 선택적으로 작동자 서열과 함께 발현을 제어하며, 전사 및 번역을 개시하고 완료하기 위한 리보솜-결합 부위 서열 등을 갖는다. 기타 다른 미생물, 예컨대 효모가 또한 항-OX40 폴리펩티드를 발현시키는 데 사용될 수 있다. 배큘로바이러스 벡터와 조합된 곤충 세포가 또한 사용될 수 있다.
기타 다른 양태에서, 본 개시내용의 항-OX40 폴리펩티드를 발현시키고 생성하는 데 포유류 숙주 세포가 사용될 수 있다. 예를 들어, 이들은 내인성 면역글로불린 유전자를 발현하는 하이브리도마 세포주 또는 외인성 발현 벡터를 포함하는 포유류 세포주 중 어느 하나일 수 있다. 이들은 임의의 정상적인 필멸(mortal) 또는 정상적 또는 비정상적인 불멸(immortal) 동물 또는 인간 세포를 포함한다. 예를 들어, 온전한 면역글로불린을 분비할 수 있는 다수의 적합한 숙주 세포주가 개발되어 왔으며, 이에는 CHO 세포주, 다양한 COS 세포주, HEK 293 세포, 골수종 세포주, 형질전환된 B-세포 및 하이브리도마가 포함된다. 폴리펩티드를 발현시키기 위하여 포유류 조직 세포 배양을 사용하는 것은, 예를 들어 문헌[Winnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, NY, N.Y., 1987]에 전반적으로 논의되어 있다. 포유류 숙주 세포를 위한 발현 벡터는 발현 제어 서열, 예컨대 복제 기원, 프로모터, 및 인핸서(예를 들어, 문헌[Queen et al., Immunol. Rev. 89:49-68, 1986] 참조), 및 필요한 처리 정보 부위, 예컨대 리보솜 결합 부위, RNA 스플라이스 부위, 폴리아데닐화 부위, 및 전사 종결자 서열을 포함할 수 있다. 이들 발현 벡터는 포유류 유전자 또는 포유류 바이러스로부터 유래되는 프로모터를 통상 함유한다. 적합한 프로모터는 구성적, 세포 유형-특이적, 발생단계-특이적, 및/또는 조정 가능한 또는 조절 가능할 수 있다. 유용한 프로모터는 메탈로티오네인 프로모터, 구성적 아데노바이러스 주요 후기 프로모터, 덱사메타손-유도성 MMTV 프로모터, SV40 프로모터, MRP polIII 프로모터, 구성적 MPSV 프로모터, 테트라사이클린-유도성 CMV 프로모터(예컨대, 인간 전초기 CMV 프로모터), 구성적 CMV 프로모터, 및 당업계에 알려진 프로모터-인핸서 조합을 포함하지만 이로 한정되지 않는다.
검출 및 진단의 방법
본 개시내용의 항체 또는 항원-결합 단편은 OX40의 검출을 위한 방법을 포함하지만 이로 한정되지 않는 다양한 응용에 유용하다. 일 양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 생물학적 샘플 내의 OX40의 존재를 검출하는 데 유용하다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "검출"은 정량적 또는 정성적 검출을 포함한다. 특정 양태에서, 생물학적 샘플은 세포 또는 조직을 포함한다. 기타 다른 양태에서, 그러한 조직은 기타 다른 조직에 비하여 더 높은 수준으로 OX40을 발현하는 정상 및/또는 암성 조직을 포함한다.
일 양태에서, 본 개시내용은 생물학적 샘플 내의 OX40의 존재를 검출하는 방법을 제공한다. 특정 양태에서, 상기 방법은 생물학적 샘플을 항원에 대한 항체의 결합을 허용하는 조건 하에서 항-OX40 항체와 접촉시키는 단계 및 항체와 항원 사이에 복합체가 형성되는지의 여부를 검출하는 단계를 포함한다. 생물학적 샘플은 제한 없이, 소변 또는 혈액 샘플을 포함할 수 있다.
OX40의 발현과 연관된 장애를 진단하는 방법이 또한 포함된다. 특정 양태에서, 상기 방법은 검사 세포를 항-OX40 항체와 접촉시키는 단계; OX40 폴리펩티드에 대한 항-OX40 항체의 결합을 검출함으로써 검사 세포에서의 OX40의 발현의 수준을 (정량적으로 또는 정성적으로) 결정하는 단계; 및 검사 세포에서의 발현 수준을 대조 세포(예를 들어, 검사 세포와 동일한 조직 기원의 정상 세포 또는 비-OX40 발현 세포)에서의 OX40 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하며, 대조 세포와 대비하여 검사 세포에서의 더 높은 수준의 OX40 발현은 OX40의 발현과 연관된 장애의 존재를 나타낸다.
치료 방법
본 개시내용의 항체 또는 항원-결합 단편은 OX40-연관 장애 또는 질병의 치료를 위한 방법을 포함하지만 이로 한정되지 않는 다양한 응용에 유용하다. 일 양태에서, OX40-연관 장애 또는 질병은 암이다.
일 양태에서, 본 발명은 암을 치료하는 방법을 제공한다. 특정 양태에서, 상기 방법은 항-OX40 항체 또는 항원-결합 단편의 유효량을 필요한 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 암은, 제한 없이, 유방암, 두경부암, 위암, 신장암, 간암, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 난소암, 피부암, 중피종, 림프종, 백혈병, 골수종 및 육종을 포함할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편은 비경구, 폐내, 및 비강내를 포함한 임의의 적합한 수단에 의해, 그리고 필요하다면 국부 치료, 병변내 투여를 위하여 투여될 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복막내, 또는 피하 투여를 포함한다. 투여는, 부분적으로 투여가 짧은지 만성인지의 여부에 따라, 임의의 적합한 경로에 의해, 예를 들어 주사, 예컨대 정맥내 또는 피하 주사에 의해 행해질 수 있다. 다양한 시점에 걸친 단회 또는 다회 투여, 볼루스 투여, 및 펄스 주입을 포함하지만 이로 한정되지 않는 다양한 투여 일정이 본 명세서에서 고려된다.
본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편은 모범 의료행위 지침(good medical practice)에 따른 방식으로 제형화되고, 투약되고, 투여될 것이다. 이와 관련하여 고려 대상이 되는 인자는 치료되는 특정 장애, 치료되는 특정 포유동물, 개별 환자의 임상 질환, 장애의 원인, 작용제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 일정, 및 의료 종사자에게 알려진 기타 다른 인자를 포함한다. 항체는 대상이 되는 장애를 예방하거나 치료하기 위해 현재 사용되는 하나 이상의 작용제와 함께 제형화될 필요는 없지만, 선택적으로 제형화된다. 그러한 기타 다른 작용제의 유효량은 제형에 존재하는 항체의 양, 장애 또는 치료의 유형, 및 상기에 논의된 기타 다른 인자에 좌우된다. 이들은 일반적으로 본 명세서에 기재된 것과 동일한 투여량으로 그리고 투여 경로로 사용되거나, 본 명세서에 기재된 투여량의 약 1 내지 99%로 사용되거나, 임의의 투여량으로 그리고 경험적으로/임상적으로 적절한 것으로 결정된 임의의 경로에 의해 사용된다.
질병의 예방 또는 치료를 위하여, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편의 적절한 투여량은 치료하려는 질병의 유형, 항체의 유형, 질병의 중증도 및 경과, 항체가 예방적 또는 치료적 목적을 위하여 투여되는지의 여부, 이전 요법, 환자의 임상 병력 및 항체에 대한 반응, 및 담당 의사의 재량에 좌우될 것이다. 항체는 일시에 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 적합하게 투여된다. 질병의 유형 및 중증도에 따라, 약 1 μg/kg 내지 100 mg/kg의 항체가, 예를 들어 1회 이상의 별개의 투여, 또는 연속 주입 중 어느 것이든, 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량일 수 있다. 하나의 통상적인 일일 투여량은 상기 언급된 인자에 따라 약 1 μg/kg 내지 100 mg/kg 또는 그 이상의 범위일 수 있다. 수일 또는 그 이상에 걸친 반복된 투여의 경우, 질환에 따라, 치료는 질병 증상의 원하는 억제가 일어날 때까지 일반적으로 지속될 것이다. 그러한 용량은 간헐적으로, 예를 들어 매주 또는 매 3주마다(예를 들어, 환자가 약 2 내지 약 20회, 또는 예를 들어 약 6회 용량의 항체를 제공받도록) 투여될 수 있다. 초기의 더 높은 로딩 용량 후에 1회 이상의 더 낮은 용량이 투여될 수 있다. 그러나, 기타 다른 투여량 계획이 유용할 수 있다. 이 요법의 진행은 통상적인 기법 및 검정에 의해 용이하게 모니터링된다.
병용 요법
일 양태에서, 본 발명의 OX40 항체는 기타 다른 치료제, 예를 들어 항-TIGIT 항체와 병용하여 사용될 수 있다. 본 개시내용의 OX40 항체와 함께 사용될 수 있는 기타 다른 치료제는 화학요법제(예를 들어, 파클리탁셀 또는 파클리탁셀제(예를 들어, Abraxane®), 도세탁셀; 카보플라틴; 토포테칸; 시스플라틴; 이리노테칸, 독소루비신, 레날리도미드, 5-아자시티딘, 이포스파미드, 옥살리플라틴, 페메트렉시드 이나트륨, 사이클로포스파미드, 에토포시드, 데시타빈, 플루다라빈, 빈크리스틴, 벤다무스틴, 클로람부실, 부설판, 젬시타빈, 멜팔란, 펜토스타틴, 미톡산트론, 페메트렉시드 이나트륨), 티로신 키나제 억제제(예를 들어, EGFR 억제제(예를 들어, 에를로티닙), 멀티키나제 억제제(예를 들어, MGCD265, RGB-286638), CD-20 표적화제(예를 들어, 리툭시맙, 오파투무맙, RO5072759, LFB-R603), CD52 표적화제(예를 들어, 알렘투주맙), 프레드니솔론, 다르베포에틴 알파, 레날리도미드, Bcl-2 억제제(예를 들어, 오블리메르센 나트륨), 오로라 키나제 억제제(예를 들어, MLN8237, TAK-901), 프로테아좀 억제제(예를 들어, 보르테조밉), CD-19 표적화제(예를 들어, MEDI-551, MOR208), MEK 억제제(예를 들어, ABT-348), JAK-2 억제제(예를 들어, INCB018424), mTOR 억제제(예를 들어, 템시롤리무스, 에베롤리무스), BCR/ABL 억제제(예를 들어, 이마티닙), ET-A 수용체 길항제(예를 들어, ZD4054), TRAIL 수용체 2(TR-2) 효능제(예를 들어, CS-1008), HGF/SF 억제제(예를 들어, AMG 102), EGEN-001, Polo-유사 키나제 1 억제제(예를 들어, BI 672)를 포함하지만 이로 한정되지 않는다.
본 명세서에 개시된 바와 같은 항-TIGIT 항체와의 병용물 형태의 항-OX40 항체는 다양한 알려진 방식으로, 예컨대 경구적으로, 국소적으로, 직장으로, 비경구적으로, 흡입 분무에 의해, 또는 이식된 저장소를 통해 투여될 수 있지만, 임의의 주어진 경우에서 가장 적합한 경로는 특정 숙주에, 그리고 활성 성분이 투여되고 있는 질환의 성질 및 중증도에 따라 다를 것이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "비경구"는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 동맥내, 골액낭내, 흉골내, 수강내, 병변내 및 두개내 주사 또는 주입 기법을 포함한다.
항-OX40 항체 및 항-TIGIT 항체의 병용물은 상이한 경로들을 통해 투여될 수 있다. 각각의 항체는 다른 항체와 독립적으로 비경구 투여될 수 있으며, 예컨대 피하, 피내, 정맥내 또는 복막내 투여될 수 있다.
일 구현예에서, 항-OX40 항체 또는 항-TIGIT 항체는 환자의 요구에 기초하여 일일 1회(매일 1회, QD), 하루당 2회(매일 2회, BID), 하루당 3회, 하루당 4회, 또는 하루당 5회 투여된다.
약제학적 조성물 및 제형
항-OX40 항체 또는 항원-결합 단편, 또는 항-OX40 항체 또는 항원-결합 단편을 인코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 약제학적 제형을 포함한 조성물이 또한 제공된다. 특정 구현예에서, 조성물은 OX40에 결합하는 하나 이상의 항체 또는 항원-결합 단편, 또는 OX40에 결합하는 하나 이상의 항체 또는 항원-결합 단편을 인코딩하는 서열을 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 이들 조성물은 적합한 담체, 예컨대 당업계에 잘 알려진 약제학적으로 허용되는 부형제(완충액을 포함함)를 추가로 포함할 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 OX40 항체 또는 항원-결합 단편의 약제학적 제형은 원하는 순도를 갖는 그러한 항체 또는 항원-결합 단편을 하나 이상의 선택적인 약제학적으로 허용되는 담체(문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980])와 혼합함으로써 동결건조된 제형 또는 수용액 형태로 제조된다. 약제학적으로 허용되는 담체는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에 대해 일반적으로 비독성이며, 완충액, 예컨대 인산염, 시트르산염, 및 기타 다른 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함한 산화방지제; 방부제(예컨대, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤잘코늄 클로라이드; 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 라이신; 단당, 이당, 및 기타 다른 탄수화물(글루코스, 만노스, 또는 덱스트린을 포함함); 킬레이트제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대-이온, 예컨대 나트륨; 금속 복합체(예를 들어, Zn-단백질 복합체); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 본 명세서에서 예시적인 약제학적으로 허용되는 담체는 틈새 약물 분산제(interstitial drug dispersion agent), 예컨대 가용성 중성-활성 하이알루로니다제 당단백질(sHASEGP), 예를 들어 인간 가용성 PH-20 하이알루로니다제 당단백질, 예컨대 rHuPH20(HYLENEX®, Baxter International, Inc.)을 추가로 포함한다. rHuPH20을 포함한 특정 예시적인 sHASEGP 및 사용 방법이 미국 특허 7,871,607 및 US 2006/0104968에 기재되어 있다. 일 양태에서, sHASEGP는 하나 이상의 추가의 글리코사미노글리카나제, 예컨대 콘드로이티나제와 병용된다.
예시적인 동결건조된 항체 제형이 미국 특허 6,267,958에 기재되어 있다. 수성 항체 제형은 미국 특허 6,171,586 및 WO2006/044908에 기재된 것들을 포함하며, 후자의 제형은 히스티딘-아세테이트 완충액을 포함한다.
지속-방출 제제가 제조될 수 있다. 지속-방출 제제의 적합한 예에는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되며, 이러한 매트릭스는 성형된 물품, 예를 들어 필름, 또는 마이크로캡슐의 형태이다.
생체내 투여에 사용되는 제형은 일반적으로 멸균성이어야 한다. 멸균성은, 예를 들어 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성될 수 있다.
실시예
실시예 1: 항-OX40 단일클론 항체의 생성
약간 수정된 통상적인 하이브리도마 융합 기술(문헌[de StGroth and Sheidegger, 1980 J Immunol Methods 35:1]; 문헌[Mechetner, 2007 Methods Mol Biol 378:1])에 기초하여 항-OX40 단일클론 항체를 생성하였다. 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA) 및 형광-활성화된 세포 분류(FACS) 검정에서 높은 결합 활성을 갖는 항체를 추가의 특성화를 위하여 선택하였다.
면역화 및 결합 검정을 위한 OX40 재조합 단백질
전장 인간 OX40(서열 번호 1)을 코딩하는 cDNA를 GenBank 서열(수탁 번호 X75962.1)에 기초하여 Sino Biological(중국 베이징 소재)에 의해 합성하였다. OX-40의 아미노산(AA) 1 내지 216으로 이루어진 세포외 도메인(ECD) 및 신호 펩티드의 코딩 영역(서열 번호 2)을 PCR-증폭시키고, C-말단이 마우스 IgG2a의 Fc 도메인, 인간 IgG1 야생형 중쇄의 Fc 도메인, 또는 His-태그에 융합된 사내 개발된 발현 벡터 내로 클로닝하였으며, 그 결과 3개의 재조합 융합 단백질 발현 플라스미드, 즉 OX40-mIgG2a, OX40-huIgG1 및 OX40-His가 각각 생성되었다. OX40 융합 단백질의 개략도가 도 1에 나타나 있다. 재조합 융합 단백질 생성을 위하여, OX40-mIgG2a, OX40-huIgG1 및 OX40-His 발현 플라스미드를 293G 세포 내로 일시적으로 형질감염시키고, 회전 진탕기가 구비된 CO2 인큐베이터 내에서 7일 동안 배양하였다. 재조합 단백질을 함유하는 상청액을 수집하고, 원심분리에 의해 청징화하였다. OX40-mIgG2a 및 OX40-huIgG1을 단백질 A 컬럼(Cat: 17-5438-02, GE Life Sciences)을 사용하여 정제하였다. OX40-His를 Ni 세파로스 컬럼(Cat: 17-5318-02, GE Life Science)을 사용하여 정제하였다. OX40-mIgG2a, OX40-huIgG 및 OX40-His 단백질을 인산염 완충 식염수(PBS)에 대해 투석하고, 소량의 분취물로 -80℃ 냉동기 내에 저장하였다.
안정한 발현 세포주
전장 인간 OX40(OX40) 또는 사이노몰거스 OX40(cynoOX40)을 발현하는 안정한 세포주를 생성하기 위하여, 이들 유전자를 레트로바이러스 벡터 pFB-Neo(Cat: 217561, Agilent, USA) 내로 클로닝하였다. 앞서 기재된 프로토콜에 기초하여 레트로바이러스 형질도입을 수행하였다(문헌[Zhang et al., 2005]). HuT78 및 HEK293 세포를 각각 인간 OX40 또는 cynoOX40을 함유하는 바이러스에 의해 레트로바이러스 형질도입시켜 HuT78/OX40, HEK293/OX40 및 HuT78/cynoOX40 세포주를 생성하였다.
면역화, 하이브리도마 융합 및 클로닝
8주령 내지 12주령된 Balb/c 마우스(중국 베이징 소재의 HFK BIOSCIENCE CO., LTD로부터 입수됨)를 10 μg의 OX40-mIgG2a 및 Quick-Antibody Immuno-Adjuvant(Cat: KX0210041, KangBiQuan, 중국 베이징 소재)를 함유하는 200 μL의 혼합 항원을 사용하여 복막내로 면역화하였다. 이 절차를 3주 반복하였다. 두 번째 면역화 후 2주째에, ELISA 및 FACS에 의해 OX40 결합에 대해 마우스 혈청을 평가하였다. 혈청 스크리닝 후 10일째에, 최고의 항-OX40 항체 혈청 적가를 갖는 마우스를 10 μg의 OX40-mIgG2a로 i.p. 주사를 통해 부스팅하였다. 부스팅 후 3일째에, 비장세포를 단리하고, 표준 기법(문헌[Somat Cell Genet, 1977 3:231])을 사용하여 뮤린 골수종 세포주, SP2/0 세포(ATCC, 미국 버지니아주 머내서스 소재)에 융합하였다.
ELISA 및 FACS에 의한 항체의 OX40 결합 활성의 평가
하이브리도마 클론의 상청액을 문헌[Methods in Molecular Biology (2007) 378:33-52]을 약간 수정하여 그것에 기재된 바와 같이 ELISA에 의해 초기에 스크리닝하였다. 간략하게 말하면, OX40-His 단백질을 4℃에서 밤새 96웰 플레이트에 코팅하였다. PBS/0.05% Tween-20에 의한 세척 후에, 플레이트를 실온에서 2시간 동안 PBS/3% BSA에 의해 블로킹하였다. 후속으로, 플레이트를 PBS/0.05% Tween-20으로 세척하고, 실온에서 1시간 동안 세포 상청액과 함께 인큐베이션하였다. HRP-연결된 항-마우스 IgG 항체(Cat: 115035-008, Jackson ImmunoResearch Inc, Peroxidase AffiniPure 염소 항-마우스 IgG, Fcγ 단편 특이적) 및 기질(Cat: 00-4201-56, eBioscience, USA)을 사용하여, 450 nm 파장의 색 흡수 신호를 발생시켰으며, 이것을 플레이트 판독기(SpectraMax Paradigm, Molecular Devices/ PHERAstar, BMG LABTECH)를 사용하여 측정하였다. 양성 모 클론을 간접 ELISA에 의한 융합 스크리닝으로부터 선별하였다. ELISA-양성 클론을 상기 기재된 HuT78/OX40 및 HuT78/cynoOX40 세포를 사용하여 FACS에 의해 추가로 검증하였다. OX40-발현 세포(105개의 세포/웰)를 ELISA-양성 하이브리도마 상청액과 함께 인큐베이션한 후, 항-마우스 IgG eFluor® 660 항체(Cat: 50-4010-82, eBioscience, USA)와의 결합을 수행하였다. 유세포측정기(Guava easyCyte 8HT, Merck-Millipore, USA)를 사용하여 세포 형광을 정량화하였다.
ELISA 및 FACS 스크리닝 둘 모두에서 양성 신호를 나타낸 하이브리도마로부터 컨디셔닝된 배지를 기능 검정을 거쳐서, 인간 면역 세포-기반 검정(하기 섹션 참조)에서 우수한 기능적 활성을 갖는 항체를 확인하였다. 원하는 기능적 활성을 갖는 항체를 추가로 하위클로닝하고 특성화하였다.
무혈청 또는 저혈청 배지에 대한 하이브리도마의 하위클로닝 및 적응화
상기 기재된 바와 같은 ELISA, FACS 및 기능 검정에 의한 1차 스크리닝 후에, 양성 하이브리도마 클론을 제한 희석에 의해 하위클로닝하여 클론성(clonality)을 보장하였다. 상위 항체 하위클론들을 기능 검정에 의해 검증하고, 3% FBS를 함유하는 CDM4MAb 배지(Cat: SH30801.02, Hyclone, USA) 중에서의 성장을 위해 적응화하였다.
단일클론 항체의 발현 및 정제
상위 항체 클론들을 발현하는 하이브리도마 세포를 CDM4MAb 배지(Cat: SH30801.02, Hyclone) 중에서 배양하고, 37℃에서 5 내지 7일 동안 CO2 인큐베이터 내에서 인큐베이션하였다. 컨디셔닝된 배지를 원심분리를 통해 수집하고, 정제 전에 0.22 μm 막을 통과시킴으로써 여과하였다. 상청액 중의 뮤린 항체를 제조자의 안내서에 따라 단백질 A 컬럼(Cat: 17-5438-02, GE Life Sciences)에 적용하고 그것에 결합시켰다. 이 절차는 통상 90%를 초과하는 순도로 항체를 생성하였다. 단백질 A-친화성 정제된 항체를 PBS에 대해 투석시키거나, 필요하다면, HiLoad 16/60 Superdex 200 컬럼(Cat: 28-9893-35, GE Life Sciences)을 사용하여 추가로 정제하여 응집체를 제거하였다. 280 nm에서의 흡광도를 측정함으로써 단백질 농도를 결정하였다. 최종 항체 제제를 -80℃ 냉동기 내에 분취물로 저장하였다.
실시예 2: 항-OX40 항체의 클로닝 및 서열 분석
뮤린 하이브리도마 클론을 수합하여, 제조자의 프로토콜에 기초하여 Ultrapure RNA 키트(Cat: 74104, QIAGEN, 독일)를 사용하여 총 세포 RNA를 제조하였다. 제1 가닥 cDNA를 Invitrogen으로부터의 cDNA 합성 키트(Cat: 18080-051)를 사용하여 합성하고, PCR 키트(Cat: CW0686, CWBio, 중국 베이징 소재)를 사용하여 하이브리도마 항체의 VH 및 VL의 PCR 증폭을 수행하였다. 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)의 항체 cDNA 클로닝에 대해 사용된 올리고 프라이머를 이전에 보고된 서열에 기초하여 Invitrogen(중국 베이징 소재)에 의해 합성하였다(문헌[Brocks et al. 2001 Mol Med 7:461]). PCR 산물을 서열분석에 직접 사용하거나, pEASY-Blunt 클로닝 벡터(Cat: CB101 TransGen, 중국) 내로 하위클로닝하고, Genewiz(중국 베이징 소재)에 의해 서열분석하였다. VH 및 VL 영역의 아미노산 서열을 DNA 서열분석 결과로부터 추론하였다.
뮤린 항체의 상보성 결정 영역(CDR)을 서열 주석에 의해 그리고 컴퓨터 프로그램 서열 분석에 의해 카바트(문헌[Wu and Kabat 1970 J. Exp. Med. 132:211-250]) 체계에 기초하여 정의하였다. 대표적인 상위 클론 Mu445의 아미노산 서열(VH 및 VL)이 표 1에 열거되어 있다(서열 번호 9 및 11). Mu445의 CDR 서열이 표 2에 열거되어 있다(서열 번호 3 내지 8).
Mu445 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열
Mu445 VH 서열 번호 9 EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYKFTSYIIHWVKQKPGQGLEWIGYINPYNDGTRYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMEYSSLTSEDSAVYYCARGYYGSSYAMDYWGQGTSVTVSS
Mu445 VL 서열 번호 11 DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCSASQGISNYLNWYQQKPDGTIKLLIYDTSTLYSGVPSRFSGSGSGTDYFLTISNLEPEDIATYYCQQYSKLPYTFGGGTKLEKK
마우스 단일클론 항체 Mu445 VH 및 VL 영역의 CDR 서열(아미노산)
항체 서열 번호 CDR 서열
Mu445 서열 번호 3 HCDR1(카바트) SYIIH
서열 번호 4 HCDR2(카바트) YINPYNDGTRYNEKFKG
서열 번호 5 HCDR3(카바트) GYYGSSYAMDY
서열 번호 6 LCDR1(카바트) SASQGISNYLN
서열 번호 7 LCDR2(카바트) DTSTLYS
서열 번호 8 LCDR3(카바트) QQYSKLPYT
실시예 3: 뮤린 항-인간 OX40 항체 445의 인간화
항체 인간화 및 조작
Mu445의 인간화를 위하여, IMGT에서 인간 면역글로불린 유전자 데이터베이스에 대해 서열 비교함으로써 Mu445 가변 영역의 cDNA 서열과 고도의 상동성을 공유하는 서열에 대해 인간 생식세포계열 IgG 유전자를 검색하였다. 높은 빈도로 인간 항체 레퍼토리에 존재하고(문헌[Glanville et al., 2009 PNAS 106:20216-20221]), Mu445와 고도로 상동성인 인간 IGHV 및 IGKV 유전자를 인간화를 위한 주형으로서 선택하였다.
CDR-이식에 의해 인간화를 수행하고(문헌[Methods in Molecular Biology, Antibody Engineering, Methods and Protocols, Vol 248: Humana Press]), 사내 개발된 발현 벡터를 사용함으로써 인간 IgG1 야생형 포맷으로서 인간화 항체를 조작하였다. 인간화의 초기 라운드에서는, 시뮬레이션된 3D 구조 분석에 의해 프레임워크 영역 내의 뮤린 아미노산 잔기로부터 인간 아미노산 잔기로의 돌연변이를 안내하고, CDR의 표준 구조를 유지하는 데 있어서 구조적 중요성을 갖는 뮤린 프레임워크 잔기를 인간화 항체 445의 제1 버전 내에 보유하였다(표 3의 445-1 참조). 445-1의 6개의 CDR은 HCDR1(서열 번호 3), HCDR2(서열 번호 13), HCDR3(서열 번호 5) 및 LCDR1(서열 번호 6), LCDR2(서열 번호 7), 및 LCDR3(서열 번호 8)의 아미노산 서열을 갖는다. 445-1의 중쇄 가변 영역은 서열 번호 15의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 (VH) 서열 번호 14의 아미노산 서열을 가지며, 경쇄 가변 영역은 서열 번호 17의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 (VL) 서열 번호 16의 아미노산 서열을 갖는다. 구체적으로는, Mu445의 LCDR(서열 번호 6 내지 8)을 2개의 뮤린 프레임워크 잔기(I44 및 Y71)가 보유된 상태로 인간 생식세포계열 가변 유전자 IGVK1-39의 프레임워크 내로 이식하였다(서열 번호 16). HCDR1(서열 번호 3), HCDR2(서열 번호 13) 및 HCDR3(서열 번호 5)을 2개의 뮤린 프레임워크 잔기(L70 및 S72)가 보유된 상태로 인간 생식세포계열 가변 유전자 IGHV1-69의 프레임워크 내로 이식하였다(서열 번호 14). 445 인간화 변이체(445-1)에서는, 카바트 HCDR2의 N-말단 절반만이 이식되었는데, 그 이유는, 시뮬레이션된 3D 구조에 따라 N-말단 절반만이 항원-결합에 중요할 것으로 예측되었기 때문이다.
용이한 적응화 하위클로닝 부위를 사용하여, 인간 야생형 IgG1(IgG1wt) 및 카파 사슬의 불변 영역을 각각 함유하는 사내 개발된 발현 벡터를 사용하여 인간화 전장 항체로서 445-1을 작제하였다. 445-1 항체를 293G 세포 내로의 상기 2개의 작제물의 공동-형질감염에 의해 발현시키고, 단백질 A 컬럼(Cat: 17-5438-02, GE Life Sciences)을 사용하여 정제하였다. 정제된 항체를 PBS 중에 0.5 내지 10 mg/mL로 농축시키고, -80℃ 냉동기 내에서 분취물로 저장하였다.
445-1 항체를 사용하여, 몇몇 단일 아미노산 변화를 만들어서, VH 및 VL의 프레임워크 영역 내에 보유된 뮤린 잔기를 상응하는 인간 생식세포계열 잔기로, 예컨대 VL에서는 I44P 및 Y71F로, 그리고 VH에서는 L70I 및 S72A로 전환시켰다. 또한, 잠재적인 이성질화 위험을 감소시키도록 그리고 인간화 수준을 증가시키도록 CDR에서 몇몇 단일 아미노산 변화를 만들었다. 예를 들어, LCDR2에서는 T51A 및 D50E의 변경을 만들었고, HCDR2에서는 D56E, G57A 및 N61A의 변경을 만들었다. 특정 위치에서 돌연변이를 함유하는 프라이머 및 부위 지정 돌연변이생성 키트(Cat: AP231-11, TransGen, 중국 베이징 소재)를 사용하여 모든 인간화 변경을 만들었다. 원하는 변경은 서열분석에 의해 입증되었다.
445-1 항체에서의 아미노산 변경을 OX40에 대한 그들의 결합 및 열 안정성에 대해 평가하였다. 서열 번호 3의 HCDR1, 서열 번호 18의 HCDR2, 서열 번호 5의 HCDR3, 서열 번호 6의 LCDR1, 서열 번호 19의 LCDR2 및 서열 번호 8의 LCDR3을 포함하는 항체 445-2(표 3 참조)를 상기에 기재된 특정 변경들의 조합으로부터 작제하였다. 2개의 항체의 비교에서, 결과는 항체 445-2 및 445-1 둘 모두가 비견되는 결합 친화도를 나타내었음을 보여주었다(하기 표 4 및 표 5 참조).
445-2 항체로 시작하여, 결합 친화도/속도론적 특성을 추가로 개선하기 위하여 VL의 프레임워크 영역에서의 몇몇 추가적인 아미노산 변경, 예를 들어 아미노산 G41D 및 K42G의 변경을 만들었다. 또한, 면역원성 위험을 낮추고 열 안정성을 증가시키기 위하여 VH 및 VL 둘 모두의 CDR에서 몇몇 단일-아미노산 변경을 만들었으며, 예를 들어 LCDR1에서는 S24R, 그리고 HCDR2에서는 A61N의 변경을 만들었다. 생성되는 변경은 445-2와 대비하여 개선된 결합 활성 또는 열 안정성을 나타내었다.
인간에서의 치료적 사용을 위하여 분자적 특성 및 생물물리학적 특성을 개선하도록 CDR 및 프레임워크 영역 내에 특정 아미노산 변경을 도입함으로써 인간화 445 항체를 추가로 조작하였다. 고려사항은 결합 활성을 유지하면서, 해로운 번역후 변형을 제거하는 것, 열 안정성(Tm), 표면 소수성 및 등전점(pI)을 개선하는 것을 포함하였다.
서열 번호 3의 HCDR1, 서열 번호 24의 HCDR2, 서열 번호 5의 HCDR3, 서열 번호 25의 LCDR1, 서열 번호 19의 LCDR2, 및 서열 번호 8의 LCDR3을 포함하는 인간화 단일클론 항체, 445-3(표 3 참조)을 상기 기재된 성숙 과정으로부터 작제하고, 상세하게 특성화하였다. 항체 445-3을 또한 인간 IgG2의 야생형 중쇄의 Fc 도메인을 포함하는 IgG2 버전(445-3 IgG2), 및 S228P 및 R409K 돌연변이를 갖는 인간 IgG4의 Fc 도메인을 포함하는 IgG4 버전(445-3 IgG4)으로 제조하였다. 결과는 항체 445-3 및 445-2가 비견되는 결합 친화도를 보였음을 나타내었다(표 4 및 표 5 참조).
445 항체 서열
항체 서열 번호 서열
445-1 서열 번호 3 HCDR1(카바트) SYIIH
서열 번호 13 HCDR2(카바트) YINPYNDGTRYNQKFQG
서열 번호 5 HCDR3(카바트) GYYGSSYAMDY
서열 번호 6 LCDR1(카바트) SASQGISNYLN
서열 번호 7 LCDR2(카바트) DTSTLYS
서열 번호 8 LCDR3(카바트) QQYSKLPYT
서열 번호 14 VH QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYKFTSYIIHWVRQAPGQGLEWMGYINPYNDGTRYNQKFQGRVTLTSDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGYYGSSYAMDYWGQGTTVTVSS
서열 번호 16 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQGISNYLNWYQQKPGKAIKLLIYDTSTLYSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQYSKLPYTFGGGTKVEIK
445-2 서열 번호 3 HCDR1(카바트) SYIIH
서열 번호 18 HCDR2(카바트) YINPYNEGTRYAQKFQG
서열 번호 5 HCDR3(카바트) GYYGSSYAMDY
서열 번호 6 LCDR1(카바트) SASQGISNYLN
서열 번호 19 LCDR2(카바트) DASTLYS
서열 번호 8 LCDR3(카바트) QQYSKLPYT
서열 번호 20 VH QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYKFTSYIIHWVRQAPGQGLEWMGYINPYNEGTRYAQKFQGRVTLTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGYYGSSYAMDYWGQGTTVTVSS
서열 번호 22 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQGISNYLNWYQQKPGKAIKLLIYDASTLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSKLPYTFGGGTKVEIK
445-3 서열 번호 3 HCDR1(카바트) SYIIH
서열 번호 24 HCDR2(카바트) YINPYNEGTRYNQKFQG
서열 번호 5 HCDR3(카바트) GYYGSSYAMDY
서열 번호 25 LCDR1(카바트) RASQGISNYLN
서열 번호 19 LCDR2(카바트) DASTLYS
서열 번호 8 LCDR3(카바트) QQYSKLPYT
서열 번호 26 VH QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYKFTSYIIHWVRQAPGQGLEWMGYINPYNEGTRYNQKFQGRVTLTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGYYGSSYAMDYWGQGTTVTVSS
서열 번호 28 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLNWYQQKPDGAIKLLIYDASTLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSKLPYTFGGGTKVEIK
실시예 4: SPR에 의한 항-OX40 항체의 결합 속도론적 특성 및 친화도 결정
항-OX40 항체를 BIAcore™ T-200(GE Life Sciences)을 사용하여 SPR 검정에 의해 그들의 결합 속도론적 특성 및 친화도에 대해 특성화하였다. 간략하게 말하면, 항-인간 IgG 항체를 활성화된 CM5 바이오센서 칩(Cat: BR100530, GE Life Sciences) 상에 고정화하였다. 인간 IgG Fc 영역을 갖는 항체를 칩 표면 위로 유동시키고, 항-인간 IgG 항체에 의해 포획하였다. 이어서, His 태그(Cat: 10481-H08H, Sino Biological)를 갖는 재조합 OX40 단백질의 연속 희석물을 칩 표면 위로 유동시키고, 표면 플라즈몬 공명 신호의 변화를 분석하여, 일대일 랭뮤어 결합 모델(BIA Evaluation Software, GE Life Sciences)을 사용함으로써 회합 속도(ka) 및 해리 속도(kd)를 계산하였다. 평형 해리 상수(KD)를 kd/ka 비로서 계산하였다. 항-OX40 항체의 SPR-결정된 결합 프로파일의 결과가 도 2 및 표 4에 요약되어 있다. 항체 445-3의 평균 KD(9.47 nM)의 결합 프로파일은 항체 445-2(13.5 nM) 및 445-1(17.1 nM)보다는 약간 더 우수하였고, ch445의 것과는 유사하였다. 445-3 IgG4의 결합 프로파일은 (IgG1 Fc를 갖는) 445-3과 유사하였는데, 이는, IgG4와 IgG1 사이의 Fc의 변경이 445-3 항체의 특이적 결합을 변경시키지 않았음을 나타낸다.
SPR에 의한 항-OX40 항체의 결합 친화도
시험 파라미터 ch445 * 445-1 445-2 445-3 445-3 IgG4
시험 1 ka (M -1 s -1 ) 1.74 × 105 1.56 × 105 2.76 × 105 1.82 × 105 1.61 × 105
kd (s -1 ) 1.43 × 10-3 2.77 × 10-3 3.90 × 10-3 1.67 × 10-3 1.61 × 10-3
K D (nM) 8.26 17.8 14.2 9.16 10.0
K A (M -1 ) 1.22 × 108 0.56 × 108 0.71 × 108 1.09 × 108 1.00 × 108
시험 2 ka (M -1 s -1 ) 2.65 × 105 2.37 × 105 2.06 × 105 1.63 × 105 _
kd (s -1 ) 1.67 × 10-3 3.89 × 10-3 2.64 × 10-3 1.59 × 10-3 _
K D (nM) 6.3 16.4 12.8 9.77 _
K A (M -1 ) 1.59 × 108 0.61 × 108 0.78 × 108 1.03 × 108 _
평균 K D (nM) 7.28 17.1 13.5 9.47 10.0
K A (M -1 ) 1.41 × 108 0.59 × 108 0.75 × 108 1.06 × 108 1.00 × 108
*ch445는 인간 IgG1wt/카파 불변 영역에 융합된 Mu445 가변 도메인으로 구성된다.
실시예 5: HuT78 세포 상에서 발현되는 OX40에 대한 항-OX40 항체의 결합 친화도의 결정
살아있는 세포의 표면 상에서 발현되는 OX40에 대한 결합에 대한 항-OX40 항체의 결합 활성을 평가하기 위하여, HuT78 세포를 실시예 1에 기재된 바와 같이 인간 OX40으로 형질감염시켜 OX40 발현 세포주를 생성하였다. 살아있는 HuT78/OX40 세포를 96웰 플레이트에 시딩하고, 다양한 항-OX40 항체의 연속 희석물과 함께 인큐베이션하였다. 염소 항-인간 IgG-FITC(Cat: A0556, Beyotime)를 2차 항체로서 사용하여 세포 표면에 대한 항체 결합을 검출하였다. 용량-반응 데이터를 GraphPad Prism을 사용하여 4-파라미터 로지스틱 모델에 피팅함으로써 인간 OX40에 대한 용량-의존적 결합에 대한 EC50 값을 결정하였다. 도 3 및 표 5에 나타낸 바와 같이, OX40 항체는 OX40에 대한 높은 친화도를 가졌다. 본 개시내용의 OX40 항체는 유세포측정법에 의해 측정될 때 상대적으로 더 높은 최상위 수준의 형광 세기를 가졌다는 것을 또한 알아내었는데(표 5의 마지막 열 참조), 이는, OX40으로부터의 항체의 더 느린 해리를 나타내는 것으로, 이는 더 바람직한 결합 프로파일이다.
OX40에 대한 인간화 445 변이체의 용량-의존적 결합의 EC 50
항체 EC 50 ( μg /mL) 최상위 ( MFI )
시험 1 시험 2 평균 평균
ch445 0.321 0.277 0.299 725
445-1 0.293 0.278 0.285 525
445-2 0.323 0.363 0.343 620
445-3 0.337 0.319 0.328 910
445-3 IgG4 0.263 N/A 0.263 892
실시예 6: 항-OX40 항체의 교차 반응성의 결정
인간 및 사이노몰거스(사이노) 원숭이 OX40에 대한 항체 445-3의 교차 반응성을 평가하기 위하여, 인간 OX40(HuT78/OX40) 및 사이노 OX40(HuT78/cynoOX40)을 발현하는 세포를 96웰 플레이트에 시딩하고, OX40 항체의 연속 희석물과 함께 인큐베이션하였다. 염소 항-인간 IgG-FITC(Cat: A0556, Beyotime)를 검출을 위한 2차 항체로서 사용하였다. 용량-반응 데이터를 GraphPad Prism을 사용하여 4-파라미터 로지스틱 모델에 피팅함으로써 인간 및 사이노몰거스 원숭이 천연 OX40에 대한 용량-의존적 결합에 대한 EC50 값을 결정하였다. 결과는 도 4 및 하기 표 6에 나타나 있다. 항체 445-3은 하기에 나타낸 바와 같이 유사한 EC50 값으로 인간 및 사이노몰거스 원숭이 OX40 둘 모두와 교차-반응한다.
인간 및 사이노몰거스 원숭이 OX40에 대한 항체 445-3 결합의 EC 50
세포주 445-3의 EC 50 ( ug /mL) 최상위( MFI )
HuT78/OX40 0.174 575
HuT78/cynoOX40 0.171 594
실시예 7: OX40과 445-3 Fab의 공결정화 및 구조 결정
본 개시내용의 항체에 대한 OX40의 결합 기전을 이해하기 위하여, OX40과 445-3의 Fab의 공결정 구조를 해석하였다. 잔기 T148 및 N160에서의 돌연변이를 도입하여 OX40의 글리코실화를 차단하고 단백질의 균일성을 개선하였다. 돌연변이 인간 OX40(2개의 돌연변이된 부위, T148A 및 N160A를 갖는 잔기 M1-D170)을 인코딩하는 DNA를 헥사-His 태그를 포함시켜 발현 벡터 내로 클로닝하고, 이 작제물을 37℃에서 7일 동안 단백질 발현을 위하여 293G 세포 내로 일시적으로 형질감염시켰다. 세포를 수합하고, 상청액을 수집하고, 4℃에서 1시간 동안 Hig 태그 친화성 수지와 함께 인큐베이션하였다. 수지를 20 mM Tris(pH 8.0), 300 mM NaCl 및 30 mM 이미다졸을 함유하는 완충액으로 3회 헹구었다. 이어서, OX40 단백질을 20 mM Tris(pH 8.0), 300 mM NaCl 및 250 mM 이미다졸을 함유하는 완충액으로 용리시킨 후, 20 mM Tris(pH 8.0), 100 mM NaCl을 함유하는 완충액 중 Superdex 200(GE Healthcare)을 사용하여 추가로 정제하였다.
445-3 Fab의 중쇄 및 경쇄의 코딩 서열을 중쇄의 C-말단에 헥사-His 태그를 포함시켜 발현 벡터 내로 클로닝하고, 이들을 37℃에서 7일 동안 단백질 발현을 위하여 293G 세포 내로 일시적으로 공동-형질감염시켰다. 445-3 Fab의 정제 단계는 상기에서 돌연변이 OX40 단백질에 대해 사용된 것과 동일하였다.
정제된 OX40과 445-3 Fab를 1:1의 몰비로 혼합하고, 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션한 후, 20 mM Tris(pH 8.0), 100 mM NaCl을 함유하는 완충액 중 Superdex 200(GE Healthcare)을 사용하여 추가로 정제하였다. 복합 피크(complex peak)를 수집하고 대략 30 mg/ml까지 농축시켰다.
단백질 복합체를 저장 용액과 혼합함으로써 1:1의 부피비로 공결정 스크리닝을 수행하였다. 0.1 M HEPES(pH 7.0), 1% PEG 2,000 MME 및 0.95 M 석신산나트륨을 함유하는 저장 용액과 함께 증기 확산에 의해 20℃에서 배양된 현적(hanging drop)으로부터 공결정을 수득하였다.
나일론 루프를 사용하여 공결정을 수합하고, 결정을 20% 글리세롤이 보충된 저장 용액 중에 10초 동안 침지해 두었다. 회절 데이터를 BL17U1(Shanghai Synchrotron Radiation Facility)에서 수집하고, XDS 프로그램으로 처리하였다. 분자 대체 검색 모델로서 IgG Fab의 구조(PDB의 사슬 C 및 D: 5CZX) 및 OX40의 구조(PDB의 사슬 R: 2HEV)를 사용하여 프로그램 PHASER에 의해 상(phase)을 해석하였다. Phenix.refine 그래픽 인터페이스를 사용하여 강체, TLS를 수행하고, X-선 데이터에 대한 정밀화를 구속한 후, COOT 프로그램으로 조정하고, Phenix.refine 프로그램에서 추가로 정밀화하였다. X-선 데이터 수집 및 정밀화 통계량은 표 7에 요약되어 있다.
데이터 수집 및 정밀화 통계량
데이터 수집
빔라인 BL17U1, SSRF
공간군 P 31 2 1
셀 치수(Å) a=183.96 b=183.96 c=79.09
각도(°) α=90.00 β=90.00 γ=120.00
분해능(Å) 159.3-2.55 (2.63-2.55)
총 반사의 수 988771 (81305)
고유 반사의 수 50306 (4625)
완전성(%) 99.9 (99.9)
평균 중복성 19.7 (17.6)
Rmergea 0.059 (0.962)
I/시그마(I) 29.4 (3.5)
윌슨(Wilson) B 인자(Å) 73.9
정밀화
분해능(Å) 60.22-2.55
반사의 수 50008
rmsd 결합 길이(Å) 0.010
rmsd 결합각(°) 0.856
Rwork b(%) 19.27
Rfree c(%) 21.60
단백질의 평균 B-인자 97.10
라마찬드란 도표(%)
선호됨 96.34
허용됨 3.48
이상치 0.17
* 괄호 안의 값은 최고 분해능 셸에 대해 나타낸 것이다.
a Rmerge =
Figure pct00003
, 여기서
Figure pct00004
는 등가의 평균 세기이다.
b Rwork =
Figure pct00005
, 여기서 Fo 및 Fc는 각각 관찰된 구조 인자 진폭 및 계산된 구조 인자 진폭이다.
c Rfree =
Figure pct00006
, 관찰된 반사로부터 무작위로 선택된 총 데이터의 5%인 검사 데이터 세트를 사용하여 계산됨.
실시예 8: SPR에 의한 항체 445-3의 에피토프 확인
OX40과 항체 445-3 Fab의 공결정 구조를 지침으로 하여, 본 발명자들은 인간 OX40 단백질에서의 일련의 단일 돌연변이를 선택하고 생성하여 본 개시내용의 항-OX40 항체의 핵심 에피토프를 추가로 확인하였다. 부위-지정 돌연변이생성 키트(Cat: AP231-11, TransGen)를 사용하여 인간 OX40/IgG1 융합 작제물에 대해 단일 점 돌연변이를 만들었다. 원하는 돌연변이는 서열분석에 의해 입증되었다. OX40 돌연변이체의 발현 및 제조를 293G 세포 내로의 형질감염에 의해 달성하고, 단백질 A 컬럼(Cat: 17-5438-02, GE Life Sciences)을 사용하여 정제하였다.
445-3 Fab에 대한 OX40 점 돌연변이체의 결합 친화도를 BIAcore 8K(GE Life Sciences)를 사용하여 SPR 검정에 의해 특성화하였다. 간략하게 말하면, OX40 돌연변이체 및 야생형 OX40을 EDC 및 NHS를 사용하여 CM5 바이오센서 칩(Cat: BR100530, GE Life Sciences) 상에 고정화하였다. 이어서, HBS-EP+ 완충액(Cat: BR-1008-26, GE Life Sciences) 중 445-3 Fab의 연속 희석물을 180초의 접촉 시간 및 600초의 해리 시간을 사용하여 30 μl/분으로 칩 표면 위로 유동시켰다. 표면 플라즈몬 공명 신호의 변화를 분석하여, 일대일 랭뮤어 결합 모델(BIA Evaluation Software, GE Life Sciences)을 사용함으로써 회합 속도(ka) 및 해리 속도(kd)를 계산하였다. 평형 해리 상수(KD)를 kd/ka 비로서 계산하였다. 돌연변이체의 KD 이동 배수(shift fold)를 돌연변이체 KD/WT KD 비로서 계산하였다. SPR에 의해 결정된 에피토프 확인의 프로파일이 도 5 및 표 8에 요약되어 있다. 이들 결과는 OX40에서의 잔기 H153, I165 및 E167의 알라닌으로의 돌연변이가 OX40에 대한 항체 445-3 결합을 유의하게 감소시켰으며, 잔기 T154 및 D170의 알라닌으로의 돌연변이가 OX40에 대한 항체 445-3 결합을 약간 감소시켰음을 나타내었다.
항체 445-3과 OX40의 잔기 H153, T154, I165, E167 및 D170 사이의 상세한 상호작용이 도 6에 나타나 있다. OX40 상의 H153의 측쇄가 상호작용 계면 상에서 445-3의 작은 포켓에 의해 둘러싸여져서, heavyS31 및 heavyG102와는 수소 결합을 형성하고, heavyY101과는 파이-파이 적층을 형성하였다. E167의 측쇄는 heavyY50 및 heavyN52와의 수소 결합을 형성하였으며, 한편 D170은 각각 heavyS31 및 heavyK28과 수소 결합 및 염 가교를 형성하였는데, 이것은 복합체를 추가로 안정시킬 수 있다. T154와 heavyY105, I165와 heavyR59 사이의 반데르발스(VDW) 상호작용은 OX40에 대한 항체 445-3의 높은 친화도에 기여하였다.
결론적으로, OX40의 잔기 H153, I165 및 E167은 항체 445-3과 상호작용하는 데 있어서 중요한 잔기로서 확인되었다. 추가적으로, OX40의 아미노산 T154 및 D170이 또한 항체 445-3에 대한 중요한 접촉 잔기이다. 이 데이터는 항체 445-3의 에피토프가 OX40의 잔기 H153, T154, I165, E167 및 D170임을 나타내었다. 이들 에피토프는 서열 HT LQPASNSSDA I C E DR D (서열 번호 30) 내에 존재하며, 이때 중요한 접촉 잔기는 볼드체이고 밑줄이 그어져 있다.
SPR에 의해 결정된 항체 445-3의 에피토프 확인
돌연변이체 돌연변이체 K D /WT K D
H153A 결합이 검출되지 않았음
T154A 8
Q156A 1.9
S161A 1.1
S162A 0.6
I165A 28
E167A 135
D170A 8
유의한 영향: 결합이 검출되지 않았거나, 돌연변이체 KD/WT KD의 값이 10보다 컸음. 약간의 영향: 돌연변이체 KD/WT KD의 값이 5 내지 10이었음. 유의하지 않은 영향: 돌연변이체 KD/WT KD의 값이 5보다 작았음.
실시예 9: 항-OX40 항체 445-3은 OX40- OX40L 상호작용을 차단하지 않는다.
항체 445-3이 OX40-OX40L 상호작용을 방해하는지의 여부를 결정하기 위하여, 세포-기반 유세포측정법 검정을 확립하였다. 이 검정에서는, 항체 445-3, 참조 항체 1A7.gr1, 대조 huIgG 또는 배지 단독을 뮤린 IgG2a Fc를 갖는 인간 OX40 융합 단백질(OX40-mIgG2a)과 함께 사전-인큐베이션하였다. 이어서, 항체 및 융합 단백질 복합체를 OX40L-발현 HEK293 세포에 첨가하였다. OX40 항체가 OX40-OX40L 상호작용을 방해하지 않는다면, OX40 항체-OX40 mIgG2a 복합체는 여전히 표면 OX40L에 결합할 것이며, 이러한 상호작용은 항-마우스 Fc 2차 항체를 사용하여 검출 가능하다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 항체 445-3은 높은 농도에서도, OX40L에 대한 OX40의 결합을 감소시키지 않았는데, 이는 445-3이 OX40-OX40L 상호작용을 방해하지 않음을 나타낸다. 이는 445-3이 OX40L 결합 부위에서 결합하지 않거나 OX40L 결합을 입체적으로 방해할 정도로 충분히 가깝게 결합하지 않음을 나타낸다. 대조적으로, 양성 대조 항체인 1A7.gr1은 도 7에 나타낸 바와 같이, OX40L에 대한 OX40 결합을 완전히 차단한다.
또한, 445-3 Fab와 복합체를 형성한 OX40의 공결정 구조를 해석하였으며, 도 8에 나타낸 바와 같이 OX40/OX40L 복합체(PDB 코드: 2HEV)와 정렬되었다. OX40 리간드 삼량체는 주로 OX40의 CRD1(시스테인 풍부 도메인), CRD2 및 부분 CRD3 영역을 통해 OX40과 상호작용하는 반면(문헌[Compaan and Hymowitz, 2006]), 항체 445-3은 단지 CRD4 영역을 통해서만 OX40과 상호작용한다. 요약하면, 445-3 항체 및 OX40L 삼량체는 OX40의 상이한 각각의 영역들에서 결합하고, 항체 445-3은 OX40/OX40L 상호작용을 방해하지 않는다. 이러한 결과는 상기 실시예에 기재된 에피토프 맵핑 데이터와 상관관계가 있다. OX40의 CRD4는 아미노산 127 내지 167에 위치해 있으며, 항체 445-3의 에피토프는 이 영역과 부분적으로 중첩된다. OX40 CRD4(아미노산 127 내지 167)의 서열은 하기에 나타나 있으며, 445-3 에피토프의 부분 중첩은 볼드체이고 밑줄이 그어져 있다. PCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGK HT LQPASNSSDA I C E (서열 번호 31).
실시예 10: 항-OX40 항체 445-3의 효능적 활성
항체 445-3의 효능적 기능을 조사하기 위하여, OX40-양성 T-세포주, HuT78/OX40을 445-3 또는 1A7.gr1의 존재 하에서 또는 부재 하에서 인공 항원-제시 세포(APC)주(HEK293/OS8low-FcγRI)와 밤새 공동배양하고, IL-2 생성을 T-세포 자극에 대한 판독치로서 사용하였다. HEK293/OS8Low-FcγRI 세포에서, 막-결합된 항-CD3 항체 OKT3(OS8)(미국 특허 8,735,553에 개시된 바와 같음) 및 인간 FcγRI(CD64)을 코딩하는 유전자를 HEK293 세포 내로 안정하게 공동-형질도입시켰다. 항-OX40 항체-유도 면역 활성화는 항체 가교결합에 따라 다르기 때문에(문헌[Voo et al., 2013]), HEK293/OS8Low-FcγRI 상의 FcγRI는 OX40 및 FcγRI 둘 모두에 대한 항-OX40 항체의 이중 결합 시에 OX40의 항-OX40 항체-매개 가교결합에 대한 토대를 제공한다. 도 9에 나타낸 바와 같이, 항-OX40 항체 445-3은 0.06 ng/ml의 EC50으로 용량-의존적 방식으로 TCR 신호전달을 향상시키는 데 있어서 매우 강력하였다. 참조 Ab 1A7.gr1의 약간 더 약한 활성이 또한 관찰되었다. 대조적으로, 대조 인간 IgG(10 μg/mL) 또는 블랭크는 IL-2 생성에 대해 어떠한 효과도 나타내지 않았다.
실시예 11: 항-OX40 항체 445-3은 혼합된 림프구 반응( MLR ) 검정에서 면역 반응을 촉진시켰다
항체 445-3이 T 세포 활성화를 자극할 수 있는지의 여부를 결정하기 위하여, 혼합된 림프구 반응(MLR) 검정을 앞서 기재된 바와 같이 설정하였다(문헌[Tourkova et al., 2001]). 간략하게 말하면, GM-CSF 및 IL-4와 배양한 후, LPS 자극을 수행함으로써, 인간 PBMC-유래 CD14+ 골수계 세포로부터 성숙 DC를 유도하였다. 다음으로, 미토마이신 C-처리된 DC를 항-OX40 445-3 항체(0.1 내지 10 μg/ml)의 존재 하에서 2일 동안 동종이계 CD4+ T 세포와 공동배양하였다. 공동배양 하에서의 IL-2 생성을 MLR 반응의 판독치로서 ELISA에 의해 검출하였다.
도 10에 나타낸 바와 같이, 항체 445-3은 IL-2 생성을 유의하게 촉진시켰는데, 이는, CD4+ T-세포를 활성화하는 445-3의 능력을 나타낸다. 대조적으로, 참조 항체 1A7.gr1은 MLR 검정에서 유의하게(P<0.05) 더 약한 활성을 나타내었다.
실시예 12: 항-OX40 항체 445-3은 ADCC 활성을 나타내었다
락테이트 데하이드로게나제(LDH) 방출-기반 ADCC 검정은 항체 445-3이 OX40Hi 발현 표적 세포를 사멸시킬 수 있는지의 여부를 조사하도록 설정하였다. NK92MI/CD16V 세포주를 CD16v158(V158 대립유전자) 및 FcRγ 유전자를 NK 세포주, NK92MI(ATCC, 미국 버지니아주 머내서스 소재) 내로 공동-형질도입시킴으로써 이펙터 세포로서 생성하였다. OX40-발현 T-세포주, HuT78/OX40을 표적 세포로서 사용하였다. 동일한 수(3×104개)의 표적 세포와 이펙터 세포를 항-OX40 항체(0.004 내지 3 μg/ml) 또는 대조 Ab의 존재 하에서 5시간 동안 공동배양하였다. CytoTox 96 비방사성 세포독성 검정 키트(Promega, 미국 위스콘신주 매디슨 소재)를 사용하여 LDH 방출에 의해 세포독성을 평가하였다. 하기에 나타낸 식에 의해 특이적 용해를 계산하였다.
Figure pct00007
도 11에 나타낸 바와 같이, 항체 445-3은 용량-의존적 방식(EC50: 0.027 μg/mL)으로 ADCC를 통해 OX40Hi 표적을 사멸하는 데 있어서 높은 효력을 나타내었다. 항체 445-3의 ADCC 효과는 1A7.grl 대조 항체의 ADCC 효과와 유사하였다. 대조적으로, S228P 및 R409K 돌연변이를 갖는 IgG4 Fc 포맷의 445-3(445-3-IgG4)은 대조 인간 IgG 또는 블랭크와 비교하여 어떠한 유의한 ADCC 효과도 나타내지 않았다. 이들 결과는 IgG4 Fc가 ADCC에 대해 약하거나 침묵한다는 이전의 조사결과와 일치한다(문헌[An Z, et al. mAbs 2009]).
실시예 13: 항-OX40 항체 445-3은 시험관내에서 CD4 + Treg를 우선적으로 고갈시키고, CD8 + Teff / Treg 비를 증가시킨다
몇몇 동물 종양 모델에서 항-OX40 항체는 종양-침윤 OX40Hi Treg를 고갈시키고 CD8+ T 세포 대 Treg의 비를 증가시킬 수 있는 것으로 밝혀져 있다(문헌[Bulliard et al., 2014; Carboni et al., 2003; Jacquemin et al., 2015; Marabelle et al., 2013b]). 결과적으로, 면역 반응이 향상되었으며, 이는 종양 퇴행 및 개선된 생존으로 이어졌다.
시험관내에서 활성화된 또는 종양내 CD4+Foxp3+ Treg가 기타 다른 T-세포 하위세트보다 OX40을 우선적으로 발현시킨다는 사실을 고려하여(문헌[Lai et al., 2016; Marabelle et al., 2013b; Montler et al., 2016; Soroosh et al., 2007; Timperi et al., 2016]), OX40Hi 세포, 특히 Treg를 사멸시키는 항체 445-3의 능력을 조사하기 위해 인간 PBMC-기반 검정을 설정하였다. 간략하게 말하면, OX40 발현의 유도를 위하여 PHA-L(1 μg/mL)에 의해 1일 동안 PBMC를 사전-활성화하고, 표적 세포로서 사용하였다. 이어서, 이펙터 NK92MI/CD16V 세포(실시예 12에 기재된 바와 같음, 5×104개)를 항-OX40 항체(0.001 내지 10 μg/mL) 또는 플라세보의 존재 하에서 동일한 수의 표적 세포와 밤새 공동배양하였다. 각각의 T-세포 하위세트의 백분율을 유세포측정법에 의해 결정하였다. 도 12a 및 도 12b에 나타낸 바와 같이, 항체 445-3에 의한 처리는 용량-의존적 방식으로 CD8+ T 세포의 백분율의 증가 및 CD4+Foxp3+ Treg의 백분율의 감소를 유도하였다. 결과로서, CD8+ T 세포 대 Treg 비가 크게 개선되었다(도 12c). 1A7.gr1 처리에 대해서는 더 약한 결과가 얻어졌다. 이러한 결과는 CD8+ T 세포 기능을 부스팅하지만, Treg-매개 면역 관용을 제한함으로써 항-종양 면역을 유도하는 데 있어서 445-3의 치료적 응용을 입증한다.
실시예 14: 항-OX40 항체 445-3은 마우스 종양 모델에서 용량-의존적 항-종양 활성을 발휘한다
항-OX40 항체 445-3의 효능이 마우스 종양 모델에서 밝혀졌다. 뮤린 MC38 결장 종양 세포를 인간 OX40이 유전자 도입된 C57 마우스(Biocytogen, 중국 베이징 소재) 내에 피하 이식하였다. 종양 세포의 이식 후에, 종양 부피를 주 2회 측정하고, 하기 식을 사용하여 mm3로 계산하였다: V = 0.5(a × b 2 )(여기서, a 및 b는 각각 종양의 긴 직경 및 짧은 직경이었음). 종양이 대략 190 mm3 크기의 평균 부피에 도달하였을 때, 마우스를 7개의 군에 무작위 할당하고, 3주 동안 주 1회 445-3 또는 1A7.gr1 항체 중 어느 하나를 복막내 주사하였다. 인간 IgG를 동종형 대조군으로서 투여하였다. 부분 퇴행(PR)은 3회의 연속적인 측정에서 첫 번째 투여일의 출발 종양 부피의 50%보다 작은 종양 부피로서 정의되었다. 하기 식을 사용하여 종양 성장 억제(TGI)를 계산하였다:
Figure pct00008
처리됨t = 시간 t에서의 처리된 종양 부피
처리됨t0 = 시간 0에서의 처리된 종양 부피
플라세보t = 시간 t에서의 플라세보 종양 부피
플라세보t0 = 시간 0에서의 플라세보 종양 부피
이들 결과는 445-3이 0.4 mg/kg, 2 mg/kg, 및 10 mg/kg의 용량에 의한 복막내 주사로서 용량-의존적 항-종양 효능을 가졌음을 입증하였다. 445-3의 투여는 기저선으로부터 53%(0.4 mg/kg), 69%(2 mg/kg), 및 94%(10 mg/kg)의 종양 성장 억제를 가져왔고, 0%(0.4 mg/kg), 17%(2 mg/kg), 및 33%(10 mg/kg)의 부분 퇴행을 가져왔다. 대조적으로, 항체 1A7.gr1에 의한 부분 퇴행은 관찰되지 않았다. 생체내 데이터는 리간드-비차단 항체 445-3이 항-종양 요법에 대해 OX40-OX40L 차단 항체 1A7.gr1보다 더 우수하게 적합하다는 것을 나타낸다(도 13a 및 도 13b, 표 9).
뮤린 MC38 결장 종양 마우스 모델에서의 445-3 및 1A7.gr1의 효능
처리 QW 용량(mg/kg) N 부분 퇴행률 일수 21에서의 평균 종양 부피 ( mm 3 ) 일수 21에서의 TGI ( % )
445-3 0.4 6 0% 953 53
2 6 17% 696 69
10 6 33% 280 94
1A7.gr1 0.4 6 0% 886 57
2 6 0% 1163 41
10 6 0% 1030 49
실시예 15: 항-OX40 항체의 아미노산 변경
OX40 항체의 개선을 위한 변경을 위하여 몇몇 아미노산을 선택하였다. 친화도를 개선하거나 인간화를 증가시키도록 아미노산을 변경시켰다. PCR 프라이머 세트를 적절한 아미노산 변경을 위하여 설계하고, 합성하고, 항-OX40 항체 변형시키는 데 사용하였다. 예를 들어, 중쇄에서의 K28T 및 경쇄에서의 S24R의 변경은 FACS에 의해 결정된 EC50에 대해 원래의 445-2 항체에 비해 1.7배 증가를 가져왔다. 중쇄에서의 Y27G 및 경쇄에서의 S24R의 변경은 Biacore에 의해 결정된 KD에 대해 원래의 445-2 항체에 비해 1.7배 증가를 가져왔다. 이들 변경은 도 14a 및 도 14b에 요약되어 있다.
실시예 16: MMTV - PyMT 동계 마우스 모델에서 항- TIGIT 항체와의 병용물 형태의 OX40 항체
MMTV-PyMT는 유방암 전이의 마우스 모델이며, 여기서는 MMTV-LTR이 유선(mammary gland)에서 폴리오마바이러스 중간 T-항원을 과발현시키는 데 사용된다. 마우스는 고도로 전이성인 종양을 발생시키며, 이 모델은 유방암 진행을 연구하는 데 일반적으로 사용된다.
MMTV-PyMT 유전자도입 마우스에서 자발적으로 발생된 종양으로부터 생성된 1 x 106개의 MMTV-PyMT 종양 세포를 암컷 FVB/N 마우스에 유방내 이식하였다. 8일 동안 접종 후에, 동물들을 4개의 군에 각각의 군마다 15 마리씩의 동물을 갖도록 무작위 배정하였다. 하나의 마우스군은 대조군으로서의 비히클(PBS)로 처리하였다.
OX86은 이전에 WO2016/057667에 개시된 래트 항-마우스 OX40 항체이며, 이것을 마우스 연구에서 그의 면역원성을 감소시키고 또한 그의 Fc-매개 기능을 유지하기 위하여 마우스 IgG2a 불변 영역으로 추가로 조작하였다. OX86의 VH 및 VL 영역이 하기에 제공되어 있다. 이전에 과학 문헌에 보고된 바와 같이, OX86은 OX40과 OX40 리간드 사이의 상호작용을 차단하지 않는다는 점에서 항체 445-3과 유사한 작용 기전을 갖는다(문헌[al-Shamkhani Al, et al., Euro J. Immunol (1996) 26(8);1695-9], 문헌[Zhang, P. et al. Cell Reports 27, 3117-3123]). 단제요법으로서, OX86을 복막내(i.p.) 주사에 의해 주당 1회(QW) 0.4 mg/kg으로 투여하였다.
Figure pct00009
뮤린 특이적 항-TIGIT 항체(muTIGIT)를 사내에서 생성하고, 복막내 주사에 의해 주 1회 5 mg/kg으로 투여하였다. muTIGIT와의 병용물 형태의 OX86 항체를 단제요법에 대해 앞서 기재된 바와 같이 각각의 개별 항체에 대해 동일한 용량으로 투여하였다. 캘리퍼를 사용하여 종양 부피 및 체중을 2개의 치수로 매주 2회 결정하였으며, 하기 식을 사용하여 mm3로 표현하였다: V = 0.5(a × b2)(여기서, a 및 b는 각각 종양의 긴 직경 및 짧은 직경임). 데이터는 평균 종양 부피 ± 평균 표준 오차(SEM)로서 제시된다. 하기 식을 사용하여 종양 성장 억제(TGI)를 계산한다:
Figure pct00010
처리됨t = 시간 t에서의 처리된 종양 부피
처리됨t0 = 시간 0에서의 처리된 종양 부피
플라세보t = 시간 t에서의 플라세보 종양 부피
플라세보t0 = 시간 0에서의 플라세보 종양 부피
muTIGIT 처리와 병용된 OX86 항체의 처리에 대한 MMTV-PyMT 동계 모델의 반응이 도 15 및 표 10에 나타나 있다. 일수 21에서, 주 1회 복막내 투여된 각각의 OX86 및 muTIGIT 단제요법은 각각에 대해 31% 및 13%의 TGI로 종양 성장을 억제하였다. 대조적으로, 단제로서 투여될 때의 OX86에 비해 TGI가 25% 증가된 56%의 TGI로 muTIGIT와의 병용물 형태의 OX86에서 유의하게 개선된 항종양 활성이 관찰되었다(비히클 대비 병용물, p < 0.001; OX86 단제요법 대비 병용물, p < 0.05; 및 muTIGIT 단제요법 대비 병용물, p < 0.001). 이 데이터는 항-TIGIT 항체와의 병용물 형태의 항-OX40 항체가 MMTV-PyMT 동계 마우스 모델에서 효능이 있음을 입증한다. 항-TIGIT 항체와 병용된 OX40 항체의 병용물은 또한 본 연구 전체에 걸쳐 동물 체중에 대해 어떠한 유의한 영향도 갖지 않았다.
참조문헌
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
SEQUENCE LISTING <110> BeiGene, Ltd. Jiang, Beibei Liu, Ye Song, Xiaomin <120> METHODS OF CANCER TREATMENT USING ANTI-OX40 ANTIBODIES IN COMBINATION WITH ANTI-TIGIT ANTIBODIES <130> BGB22306-00PCT <160> 44 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 277 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Cys Val Gly Ala Arg Arg Leu Gly Arg Gly Pro Cys Ala Ala Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Gly Leu Gly Leu Ser Thr Val Thr Gly Leu His Cys Val 20 25 30 Gly Asp Thr Tyr Pro Ser Asn Asp Arg Cys Cys His Glu Cys Arg Pro 35 40 45 Gly Asn Gly Met Val Ser Arg Cys Ser Arg Ser Gln Asn Thr Val Cys 50 55 60 Arg Pro Cys Gly Pro Gly Phe Tyr Asn Asp Val Val Ser Ser Lys Pro 65 70 75 80 Cys Lys Pro Cys Thr Trp Cys Asn Leu Arg Ser Gly Ser Glu Arg Lys 85 90 95 Gln Leu Cys Thr Ala Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg Cys Arg Ala Gly 100 105 110 Thr Gln Pro Leu Asp Ser Tyr Lys Pro Gly Val Asp Cys Ala Pro Cys 115 120 125 Pro Pro Gly His Phe Ser Pro Gly Asp Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp 130 135 140 Thr Asn Cys Thr Leu Ala Gly Lys His Thr Leu Gln Pro Ala Ser Asn 145 150 155 160 Ser Ser Asp Ala Ile Cys Glu Asp Arg Asp Pro Pro Ala Thr Gln Pro 165 170 175 Gln Glu Thr Gln Gly Pro Pro Ala Arg Pro Ile Thr Val Gln Pro Thr 180 185 190 Glu Ala Trp Pro Arg Thr Ser Gln Gly Pro Ser Thr Arg Pro Val Glu 195 200 205 Val Pro Gly Gly Arg Ala Val Ala Ala Ile Leu Gly Leu Gly Leu Val 210 215 220 Leu Gly Leu Leu Gly Pro Leu Ala Ile Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu 225 230 235 240 Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly 245 250 255 Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser 260 265 270 Thr Leu Ala Lys Ile 275 <210> 2 <211> 216 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Cys Val Gly Ala Arg Arg Leu Gly Arg Gly Pro Cys Ala Ala Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Gly Leu Gly Leu Ser Thr Val Thr Gly Leu His Cys Val 20 25 30 Gly Asp Thr Tyr Pro Ser Asn Asp Arg Cys Cys His Glu Cys Arg Pro 35 40 45 Gly Asn Gly Met Val Ser Arg Cys Ser Arg Ser Gln Asn Thr Val Cys 50 55 60 Arg Pro Cys Gly Pro Gly Phe Tyr Asn Asp Val Val Ser Ser Lys Pro 65 70 75 80 Cys Lys Pro Cys Thr Trp Cys Asn Leu Arg Ser Gly Ser Glu Arg Lys 85 90 95 Gln Leu Cys Thr Ala Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg Cys Arg Ala Gly 100 105 110 Thr Gln Pro Leu Asp Ser Tyr Lys Pro Gly Val Asp Cys Ala Pro Cys 115 120 125 Pro Pro Gly His Phe Ser Pro Gly Asp Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp 130 135 140 Thr Asn Cys Thr Leu Ala Gly Lys His Thr Leu Gln Pro Ala Ser Asn 145 150 155 160 Ser Ser Asp Ala Ile Cys Glu Asp Arg Asp Pro Pro Ala Thr Gln Pro 165 170 175 Gln Glu Thr Gln Gly Pro Pro Ala Arg Pro Ile Thr Val Gln Pro Thr 180 185 190 Glu Ala Trp Pro Arg Thr Ser Gln Gly Pro Ser Thr Arg Pro Val Glu 195 200 205 Val Pro Gly Gly Arg Ala Val Ala 210 215 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 3 Ser Tyr Ile Ile His 1 5 <210> 4 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Arg Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 5 Gly Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6 Ser Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 7 Asp Thr Ser Thr Leu Tyr Ser 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 8 Gln Gln Tyr Ser Lys Leu Pro Tyr Thr 1 5 <210> 9 <211> 120 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 9 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Ile Ile His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Arg Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Tyr Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 10 <211> 360 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 10 gaggtccagc tgcagcagtc tggacctgaa ctggtaaagc ctggggcttc agtgaagatg 60 tcctgcaagg cttctggata taaattcact agctatatta tacactgggt gaagcagaag 120 cctgggcagg gccttgagtg gattggatat attaatcctt acaatgatgg tactaggtac 180 aatgagaagt tcaaaggcaa ggccacactg acttcagaca aatcctccag cacagcctac 240 atggagtaca gcagcctgac ctctgaggac tctgcggtct attactgtgc aaggggttac 300 tacggtagta gctatgctat ggactactgg ggtcaaggaa cctcagtcac cgtctcctca 360 <210> 11 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 11 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Thr Ser Thr Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Phe Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Lys Leu Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Lys Lys 100 105 <210> 12 <211> 321 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 12 gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60 atcagttgca gtgcaagtca gggcattagc aattatttaa actggtatca gcagaaacca 120 gatggaacta ttaaactcct gatctatgac acatcaacct tatactcagg agtcccatca 180 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagat tattttctca ccatcagcaa cctggaacct 240 gaagatattg ccacttacta ttgtcagcag tatagtaagc ttccgtacac gttcggaggg 300 gggaccaagc tggaaaaaaa a 321 <210> 13 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 445-1 HCDR2 <400> 13 Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 14 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 445-1 VH pro <400> 14 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Ile Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 15 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 445-1 VH DNA <400> 15 caggtgcagc tggtgcagtc tggagcagag gtgaagaagc caggcagctc cgtgaaggtg 60 tcctgcaagg cctctggcta caagttcacc tcctatatca tccactgggt gcggcaggca 120 ccaggacagg gactggagtg gatgggctac atcaaccctt ataatgacgg cacacggtac 180 aaccagaagt ttcagggcag agtgaccctg acaagcgata agtctaccag cacagcctat 240 atggagctgt ctagcctgag gtccgaggac accgccgtgt actattgtgc cagaggctac 300 tatggctcct cttacgccat ggattattgg ggccagggca ccacagtgac agtgagctcc 360 <210> 16 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 445-1 VK pro <400> 16 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Ile Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Thr Ser Thr Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Lys Leu Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 17 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 445-1 VK DNA <400> 17 gacatccaga tgacccagtc tcccagctcc ctgtccgcct ctgtgggcga tagggtgacc 60 atcacatgca gcgcctccca gggcatctcc aactacctga attggtatca gcagaagcca 120 ggcaaggcca tcaagctgct gatctacgac acctctacac tgtatagcgg cgtgccctcc 180 agattctctg gcagcggctc cggaaccgac tacaccctga caatctctag cctgcagccc 240 gaggatttcg ccacatacta ttgtcagcag tacagcaagc tgccttatac ctttggcggc 300 ggcacaaagg tggagatcaa g 321 <210> 18 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 445-2 HCDR2 <400> 18 Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Glu Gly Thr Arg Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 19 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 445-2 LCDR2 <400> 19 Asp Ala Ser Thr Leu Tyr Ser 1 5 <210> 20 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 445-2 VH pro <400> 20 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Ile Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Glu Gly Thr Arg Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 21 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 445-2 VH DNA <400> 21 caggtgcagc tggtgcagtc tggagcagag gtgaagaagc caggcagctc cgtgaaggtg 60 tcctgcaagg cctctggcta caagttcacc tcctatatca tccactgggt gcggcaggca 120 ccaggacagg gactggagtg gatgggctac atcaaccctt ataatgaggg cacacggtac 180 gcccagaagt ttcagggcag agtgaccctg acagccgata agtctaccag cacagcctat 240 atggagctgt ctagcctgag gtccgaggac accgccgtgt actattgtgc cagaggctac 300 tatggctcct cttacgccat ggattattgg ggccagggca ccacagtgac agtgagctcc 360 <210> 22 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 445-2 VK pro <400> 22 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Ile Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Thr Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Lys Leu Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 23 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 445-2 VK DNA <400> 23 gacatccaga tgacccagtc tcccagctcc ctgtccgcct ctgtgggcga tagggtgacc 60 atcacatgca gcgcctccca gggcatctcc aactacctga attggtatca gcagaagcca 120 ggcaaggcca tcaagctgct gatctacgac gcctctacac tgtatagcgg cgtgccctcc 180 agattctctg gcagcggctc cggaaccgac ttcaccctga caatctctag cctgcagccc 240 gaggatttcg ccacatacta ttgtcagcag tacagcaagc tgccttatac ctttggcggc 300 ggcacaaagg tggagatcaa g 321 <210> 24 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 445-3 HCDR2 <400> 24 Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Glu Gly Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 25 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 445-3 LCDR1 <400> 25 Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 26 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 445-3 VH pro <400> 26 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Ile Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Glu Gly Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 27 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 445-3 VH DNA <400> 27 caggtgcagc tggtgcagtc tggagcagag gtgaagaagc caggcagctc cgtgaaggtg 60 tcctgcaagg cctctggcta caagttcacc tcctatatca tccactgggt gcggcaggca 120 ccaggacagg gactggagtg gatgggctac atcaaccctt ataatgaggg cacacggtac 180 aaccagaagt ttcagggcag agtgaccctg acagccgata agtctaccag cacagcctat 240 atggagctgt ctagcctgag gtccgaggac accgccgtgt actattgtgc cagaggctac 300 tatggctcct cttacgccat ggattattgg ggccagggca ccacagtgac agtgagctcc 360 <210> 28 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 445-3 VK pro <400> 28 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Ala Ile Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Thr Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Lys Leu Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 29 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 445-3 VK DNA <400> 29 gacatccaga tgacccagtc tcccagctcc ctgtccgcct ctgtgggcga tagggtgacc 60 atcacatgcc gggcctccca gggcatctcc aactacctga attggtatca gcagaagcca 120 gacggcgcca tcaagctgct gatctacgac gcctctacac tgtatagcgg cgtgccctcc 180 agattctctg gcagcggctc cggaaccgac ttcaccctga caatctctag cctgcagccc 240 gaggatttcg ccacatacta ttgtcagcag tacagcaagc tgccttatac ctttggcggc 300 ggcacaaagg tggagatcaa g 321 <210> 30 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 His Thr Leu Gln Pro Ala Ser Asn Ser Ser Asp Ala Ile Cys Glu Asp 1 5 10 15 Arg Asp <210> 31 <211> 41 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Pro Cys Pro Pro Gly His Phe Ser Pro Gly Asp Asn Gln Ala Cys Lys 1 5 10 15 Pro Trp Thr Asn Cys Thr Leu Ala Gly Lys His Thr Leu Gln Pro Ala 20 25 30 Ser Asn Ser Ser Asp Ala Ile Cys Glu 35 40 <210> 32 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 32 Asp Tyr Tyr Met Tyr 1 5 <210> 33 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hu1217-1-1 HCDR2 <400> 33 Tyr Ile Thr Lys Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 34 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 34 Gln Thr Asn Tyr Asp Phe Thr Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 35 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 35 Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ser Val Ala 1 5 10 <210> 36 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 36 Trp Ala Ser Ala Arg His Thr 1 5 <210> 37 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 37 Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Leu Thr 1 5 <210> 38 <211> 329 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG1mf <400> 38 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Pro Ala Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 115 120 125 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 130 135 140 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 145 150 155 160 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 165 170 175 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 180 185 190 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 195 200 205 Ala Leu Ala Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 210 215 220 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu 225 230 235 240 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 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110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 40 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hu1217-2-2 VH DNA <400> 40 gaggtgcagc tggtggagag cggaggagga ctggtgcagc ctggaggcag cctgagactg 60 agctgcgccg ccagcggctt caccttctcc gactactaca tgtactgggt caggcaggcc 120 cctggcaaag gcctggagtg ggtggcctac atcaccaagg gcggcggcag cacctactac 180 cccgatagcg tgaagggcag gttcaccatc agcagggaca acgccaagaa caccctgtac 240 ctgcagatga acagcctgag ggccgaggat accgccgtgt actactgcgc caggcagacc 300 aactacgact tcaccatgga ctactggggc cagggcacac tggtgaccgt gagcagc 357 <210> 41 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hu1217-2-2 VK pro <400> 41 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ser 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Ala Ser Ala Arg His Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser 65 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Claims (22)

  1. 암 치료의 방법으로서, 비경쟁적 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 유효량을 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원-결합 단편과의 병용물 형태로 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 OX40 항체는 인간 OX40에 특이적으로 결합하고,
    (i) (a) 서열 번호 3의 HCDR(중쇄 상보성 결정 영역) 1, (b) 서열 번호 24의 HCDR2, 및 (c) 서열 번호 5의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 (d) 서열 번호 25의 LCDR(경쇄 상보성 결정 영역) 1, (e) 서열 번호 19의 LCDR2, 및 (f) 서열 번호 8의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    (ii) (a) 서열 번호 3의 HCDR1, (b) 서열 번호 18의 HCDR2, 및 (c) 서열 번호 5의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (d) 서열 번호 6의 LCDR1, (e) 서열 번호 19의 LCDR2, 및 (f) 서열 번호 8의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    (iii) (a) 서열 번호 3의 HCDR1, (b) 서열 번호 13의 HCDR2, 및 (c) 서열 번호 5의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (d) 서열 번호 6의 LCDR1, (e) 서열 번호 7의 LCDR2, 및 (f) 서열 번호 8의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
    (iv) (a) 서열 번호 3의 HCDR1, (b) 서열 번호 4의 HCDR2, 및 (c) 서열 번호 5의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (d) 서열 번호 6의 LCDR1, (e) 서열 번호 7의 LCDR2, 및 (f) 서열 번호 8의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하며, 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원-결합 단편과의 병용물 형태인, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 OX40 항체 또는 항원-결합은
    (i) 서열 번호 26을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 서열 번호 28을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL);
    (ii) 서열 번호 20을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 서열 번호 22를 포함하는 경쇄 가변 영역(VL);
    (iii) 서열 번호 14를 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 서열 번호 16을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 또는
    (iv) 서열 번호 9를 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 서열 번호 11을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원-결합 단편은, 인간 TIGIT에 특이적으로 결합하고, 서열 번호 32의 HCDR1, 서열 번호 33의 HCDR2, 및 서열 번호 34의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열 번호 35의 LCDR1, 서열 번호 36의 LCDR2, 및 서열 번호 37의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 항원-결합 도메인을 포함하는, 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 항-TIGIT 항체는, 인간 TIGIT에 특이적으로 결합하고, 서열 번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 서열 번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 항체 항원-결합 도메인을 포함하는, 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 항-OX40 항체 또는 항원-결합 단편은 Fab, Fab'-SH, Fv, scFv, 및 (Fab')2 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체 단편인, 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 항-TIGIT 항체 또는 항원-결합 단편은 Fab, Fab'-SH, Fv, scFv, 및 (Fab')2 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체 단편인, 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 암은 유방암, 결장암, 두경부암, 위암, 신장암, 간암, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 난소암, 피부암, 중피종, 림프종, 백혈병, 골수종 또는 육종인, 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 유방암은 전이성 유방암인, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료는 치료 중단 후의 대상체에서 지속된 항암 반응을 가져오는, 방법.
  11. 면역 반응 또는 기능을 증가, 향상, 또는 자극하는 방법으로서, 비경쟁적 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 유효량을 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원-결합 단편과의 병용물 형태로 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 OX40에 특이적으로 결합하고,
    (i) (a) 서열 번호 3의 HCDR(중쇄 상보성 결정 영역) 1, (b) 서열 번호 24의 HCDR2, 및 (c) 서열 번호 5의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 (d) 서열 번호 25의 LCDR(경쇄 상보성 결정 영역) 1, (e) 서열 번호 19의 LCDR2, 및 (f) 서열 번호 8의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    (ii) (a) 서열 번호 3의 HCDR1, (b) 서열 번호 18의 HCDR2, 및 (c) 서열 번호 5의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (d) 서열 번호 6의 LCDR1, (e) 서열 번호 19의 LCDR2, 및 (f) 서열 번호 8의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    (iii) (a) 서열 번호 3의 HCDR1, (b) 서열 번호 13의 HCDR2, 및 (c) 서열 번호 5의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (d) 서열 번호 6의 LCDR1, (e) 서열 번호 7의 LCDR2, 및 (f) 서열 번호 8의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
    (iv) (a) 서열 번호 3의 HCDR1, (b) 서열 번호 4의 HCDR2, 및 (c) 서열 번호 5의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (d) 서열 번호 6의 LCDR1, (e) 서열 번호 7의 LCDR2, 및 (f) 서열 번호 8의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하며, 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원-결합 단편과의 병용물 형태인, 방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 OX40 항체 또는 항원-결합은
    (i) 서열 번호 26을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 서열 번호 28을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL);
    (ii) 서열 번호 20을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 서열 번호 22를 포함하는 경쇄 가변 영역(VL);
    (iii) 서열 번호 14를 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 서열 번호 16을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 또는
    (iv) 서열 번호 9를 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 서열 번호 11을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, 방법.
  14. 제11항에 있어서, 상기 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원-결합 단편은, 인간 TIGIT에 특이적으로 결합하고, 서열 번호 32의 HCDR1, 서열 번호 33의 HCDR2, 및 서열 번호 34의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열 번호 35의 LCDR1, 서열 번호 36의 LCDR2, 및 서열 번호 37의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 항원-결합 도메인을 포함하는, 방법.
  15. 제11항에 있어서, 상기 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 인간 TIGIT에 특이적으로 결합하고, 서열 번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 서열 번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 항체 항원-결합 도메인을 포함하는, 방법.
  16. 제11항에 있어서, 상기 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 Fab, Fab'-SH, Fv, scFv, 및 (Fab')2 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체 단편인, 방법.
  17. 제11항에 있어서, 상기 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 Fab, Fab'-SH, Fv, scFv, 및 (Fab')2 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체 단편인, 방법.
  18. 제11항에 있어서, 면역 반응을 자극하는 것은 T 세포 또는 NK 세포와 연관된 것인, 방법.
  19. 제18항에 있어서, 면역 반응을 자극하는 것은 항원 자극에 대한 증가된 반응성을 특징으로 하는 것인, 방법.
  20. 제18항에 있어서, 상기 T 세포 또는 NK 세포는 증가된 사이토카인 분비, 증식, 또는 세포용해 활성을 갖는, 방법.
  21. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 T 세포는 CD4+ 및 CD8+ T 세포인, 방법.
  22. 제11항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여는 치료 중단 후의 대상체에서 지속된 면역 반응을 가져오는, 방법.

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