JP2022542543A - 抗ｄｌｌ３キメラ抗原受容体及びその使用 - Google Patents
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Abstract
抗ＤＬＬ３キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、ＤＬＬ３結合タンパク質、及びＤＬＬ３関連障害（例えば小細胞肺がん）の治療におけるそのようなＣＡＲ又はＤＬＬ３結合タンパク質の使用が本明細書で提供される。
Description
本発明は、ＤＬＬ３を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及びＤＬＬ３に特異的な結合タンパク質に関する。本発明は、ＣＡＲ又は結合タンパク質をコードする核酸配列、ＣＡＲを発現する修飾された免疫細胞、及びＤＬＬ３関連障害を治療するためのそれらの使用にも関する。
細胞免疫療法における進歩は、様々な腫瘍の治療における有望な手法を提示している。１つのそのような治療は、免疫細胞、特にＴ細胞の、細胞表面上でキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するための遺伝子操作を含む。キメラ抗原受容体は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の特異性をＴ細胞のエフェクター機能に通常の形式で移植するタンパク質である。ＣＡＲがＴ細胞において発現すると、ＣＡＲ修飾Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ又はＣＡＲ－Ｔ細胞）は、いくつかの特性、例えば抗原特異的認識、抗腫瘍反応性及び増殖を獲得し、したがって、標的とする腫瘍細胞を根絶するための「生きた薬」として作用し得る。原則として、あらゆる抗原（例えば、細胞表面分子）がこれらのＣＡＲ－Ｔ細胞によって標的とされ得る。ＣＡＲ－Ｔ細胞療法は、自己抗原に対する耐容性を無効化し、患者のＭＨＣ状態に依存しない治療を提供し得る。最近の試験では、ＣＤ１９を標的とするキメラ抗原受容体を発現するように改変されたＴ細胞を使用することで、白血病及びリンパ腫患者における顕著な臨床応答が実証されている。
ＣＡＲは、抗原特異的結合部位、膜貫通領域及びシグナル伝達細胞質ドメイン（例えば、ＣＤ３ζ鎖）を含む膜貫通タンパク質として発現する。抗原特異的結合部位は、通常、フレキシブルリンカーによって連結された重鎖及び軽鎖からなるモノクローナル抗体由来の一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。近年では、ＣＡＲ構築物は、インビボでＴ細胞生存を増強するため、ＣＤ２８又は４－１ＢＢなどの共刺激分子から追加の細胞質ドメインを組み込んでいる。ＣＡＲには、他の遺伝子修飾、例えばサイトカイン遺伝子又は腫瘍部位で免疫抑制機構を回避するための遺伝子の付加もなされている。
ＤＬＬ３（デルタ様リガンド３）タンパク質は、神経内分泌特徴を示す腫瘍、例えば小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）を含む様々な増殖性障害に臨床的に関連することが見出されている。神経内分泌前駆細胞に起因するＳＣＬＣは、すべての肺がんの約１５％を含み、最低の５年生存率の１つを６％において有する（Ａｌｖａｒａｄｏ－Ｌｕｎａ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｔｒａｎｓｌ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５：２６－３８；Ｓｉｅｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，２０１７，ＣＡ Ｃａｎｃｅｒ Ｊ Ｃｌｉｎ ６７：７－３０（非特許文献1））。これは、それが高度に侵襲性であり、患者の約３分の２が診断時に転移性疾患を有し、通常の処置（例えば、白金に基づく化学療法）に対して高度に難治性であるためである。
ＳＣＬＣ及び他のＤＬＬ３発現がんを治療するための改善された治療アプローチが求められている。
Ａｌｖａｒａｄｏ－Ｌｕｎａ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｔｒａｎｓｌ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５：２６－３８；Ｓｉｅｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，２０１７，ＣＡ Ｃａｎｃｅｒ Ｊ Ｃｌｉｎ ６７：７－３０
一態様では、本開示は、ＤＬＬ３を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）（抗ＤＬＬ３ ＣＡＲ）を提供する。抗ＤＬＬ３ ＣＡＲは、ＤＬＬ３結合ドメインを含み、ＤＬＬ３結合ドメインは、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）又は一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含むか又はそれに由来する。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、配列番号１～８１のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１又はＣＤＲ１において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体、配列番号８２～１６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２又はＣＤＲ２において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体、及び配列番号１６３～２４３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３又はＣＤＲ３において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体を含む、ポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、配列番号１～８１のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号８２～１６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１６３～２４３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含むポリペプチド、又はＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３において最大で約３つのアミノ酸置換を含むポリペプチドの変異体を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、以下：
（１）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１６８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（２）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１０２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１８３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（３）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１８６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（４）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（５）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１９６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（６）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号２０１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（７）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号８８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１６９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（８）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１７０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；又は
（９）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号９０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１７１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体
のいずれか１つを含むポリペプチドを含む。
（１）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１６８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（２）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１０２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１８３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（３）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１８６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（４）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（５）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１９６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（６）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号２０１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（７）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号８８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１６９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（８）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１７０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；又は
（９）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号９０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１７１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体
のいずれか１つを含むポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、以下：
（１）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１６８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（２）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１０２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１８３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（３）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１８６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（４）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（５）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１９６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（６）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号２０１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（７）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号８８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１６９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（８）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１７０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；又は
（９）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号９０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１７１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３
のいずれか１つを含むポリペプチドを含む。
（１）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１６８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（２）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１０２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１８３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（３）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１８６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（４）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（５）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１９６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（６）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号２０１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（７）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号８８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１６９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（８）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１７０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；又は
（９）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号９０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１７１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３
のいずれか１つを含むポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ヒト又はアカゲザルＤＬＬ３に対して産生されたラクダｓｄＡｂである。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、配列番号２７４～３５４のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ＣＤＲ移植を通じてヒト化されている。
いくつかの実施形態では、ヒト化ｓｄＡｂは、配列番号３５５～３６７のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ｓｃＦｖのＶＨドメインは、配列番号４９８若しくは５０４で示されるＣＤＲ１又はＣＤＲ１において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体、配列番号４９９若しくは５０５で示されるＣＤＲ２又はＣＤＲ２において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体、及び配列番号５００若しくは５０６で示されるＣＤＲ３又はＣＤＲ３において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体を含み、かつｓｃＦｖのＶＬドメインは、配列番号４９５若しくは５０１で示されるＣＤＲ１又はＣＤＲ１において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体、配列番号４９６若しくは５０２で示されるＣＤＲ２又はＣＤＲ２において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体、及び配列番号４９７若しくは５０３で示されるＣＤＲ３又はＣＤＲ３において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖのＶＨドメインは、配列番号４９８で示されるＣＤＲ１、配列番号４９９で示されるＣＤＲ２、及び配列番号５００で示されるＣＤＲ３を含み、及びｓｃＦｖのＶＬドメインは、配列番号４９５で示されるＣＤＲ１、配列番号４９６で示されるＣＤＲ２、及び配列番号４９７で示されるＣＤＲ３を含むか；又はｓｃＦｖのＶＨドメインは、配列番号５０４で示されるＣＤＲ１、配列番号５０５で示されるＣＤＲ２、及び配列番号５０６で示されるＣＤＲ３を含み、及びｓｃＦｖのＶＬドメインは、配列番号５０１で示されるＣＤＲ１、配列番号５０２で示されるＣＤＲ２、及び配列番号５０３で示されるＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖのＶＨドメインは、配列番号５０８で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、及びｓｃＦｖのＶＬドメインは、配列番号５０７で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか；又はｓｃＦｖのＶＨドメインは、配列番号５１０で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、及びｓｃＦｖのＶＬドメインは、配列番号５０９で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、合成ヒトＦａｂファージライブラリーから得られる。
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３は、ヒト又はアカゲザルＤＬＬ３である。
いくつかの実施形態では、抗ＤＬＬ３ ＣＡＲは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、シグナルペプチド、ＤＬＬ３結合ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、又はＣＤ６６ｄに由来する。
いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、細胞内共刺激配列をさらに含む。
いくつかの実施形態では、細胞内共刺激配列は、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＬＦＡ－１、ＩＣＯＳ、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＴＮＦＲＳＦ９、ＴＮＦＲＳＦ４、ＴＮＦＲＳＦ８、ＣＤ４０ＬＧ、ＩＴＧＢ２、ＫＬＲＣ２、ＴＮＦＲＳＦ１８、ＴＮＦＲＳＦ１４、ＨＡＶＣＲ１、ＬＧＡＬＳ９、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ８３、ＣＤ８３のリガンド、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される共刺激分子に由来する。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号４７６～４８４、配列番号４８５～４９４又は配列番号５１５～５１６からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３結合ドメインは、互いに連結された２つのｓｄＡｂを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂの各々は独立して、配列番号３５６又は配列番号３６６に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号５１８～５２０からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号５２０のアミノ酸配列を含む。
別の態様では、本開示は、ＤＬＬ３に特異的に結合する単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）部分を含むＤＬＬ３結合タンパク質であって、ｓｄＡｂ部分は、配列番号１～８１のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１又はＣＤＲ１において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体、配列番号８２～１６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２又はＣＤＲ２において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体、及び配列番号１６３～２４３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３又はＣＤＲ３において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体を含むポリペプチドを含む、ＤＬＬ３結合タンパク質を提供する。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂ部分は、配列番号１～８１のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号８２～１６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１６３～２４３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含むポリペプチド、又はＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３において最大で約３つのアミノ酸置換を含むポリペプチドの変異体を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂ部分は、以下：
（１）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１６８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（２）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１０２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１８３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（３）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１８６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（４）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（５）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１９６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（６）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号２０１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（７）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号８８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１６９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（８）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１７０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；又は
（９）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号９０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１７１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体
のいずれか１つを含むポリペプチドを含む。
（１）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１６８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（２）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１０２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１８３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（３）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１８６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（４）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（５）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１９６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（６）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号２０１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（７）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号８８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１６９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（８）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１７０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；又は
（９）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号９０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１７１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体
のいずれか１つを含むポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂ部分は、以下：
（１）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１６８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（２）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１０２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１８３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（３）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１８６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（４）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（５）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１９６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（６）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号２０１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（７）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号８８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１６９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（８）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１７０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；又は
（９）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号９０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１７１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３
のいずれか１つを含むポリペプチドを含む。
（１）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１６８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（２）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１０２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１８３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（３）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１８６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（４）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（５）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１９６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（６）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号２０１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（７）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号８８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１６９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（８）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１７０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；又は
（９）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号９０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１７１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３
のいずれか１つを含むポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂ部分は、ヒト又はアカゲザルＤＬＬ３に対して産生されたラクダｓｄＡｂである。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂ部分は、配列番号２７４～３５４のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂ部分は、ＣＤＲ移植を通じてヒト化されている。
いくつかの実施形態では、ヒト化ｓｄＡｂは、配列番号３５５～３６７のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３は、ヒト又はアカゲザルＤＬＬ３である。
別の態様では、本開示は、ＤＬＬ３に特異的に結合する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）部分を含むＤＬＬ３結合タンパク質であって、ｓｃＦｖ部分は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ｓｃＦｖ部分のＶＨドメインは、配列番号４９８若しくは５０４で示されるＣＤＲ１又はＣＤＲ１において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体、配列番号４９９若しくは５０５で示されるＣＤＲ２又はＣＤＲ２において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体、及び配列番号５００若しくは５０６で示されるＣＤＲ３又はＣＤＲ３において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体を含み、かつｓｃＦｖ部分のＶＬドメインは、配列番号４９５若しくは５０１で示されるＣＤＲ１又はＣＤＲ１において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体、配列番号４９６若しくは５０２で示されるＣＤＲ２又はＣＤＲ２において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体、及び配列番号４９７若しくは５０３で示されるＣＤＲ３又はＣＤＲ３において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体を含む、ＤＬＬ３結合タンパク質を提供する。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖ部分は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ｓｃＦｖ部分のＶＨドメインは、配列番号４９８で示されるＣＤＲ１、配列番号４９９で示されるＣＤＲ２、及び配列番号５００で示されるＣＤＲ３を含み、及びｓｃＦｖ部分のＶＬドメインは、配列番号４９５で示されるＣＤＲ１、配列番号４９６で示されるＣＤＲ２、及び配列番号４９７で示されるＣＤＲ３を含むか；又はｓｃＦｖ部分のＶＨドメインは、配列番号５０４で示されるＣＤＲ１、配列番号５０５で示されるＣＤＲ２、及び配列番号５０６で示されるＣＤＲ３を含み、及びｓｃＦｖ部分のＶＬドメインは、配列番号５０１で示されるＣＤＲ１、配列番号５０２で示されるＣＤＲ２、及び配列番号５０３で示されるＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖ部分のＶＨドメインは、配列番号５０８で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、及びｓｃＦｖ部分のＶＬドメインは、配列番号５０７で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか；又はｓｃＦｖ部分のＶＨドメインは、配列番号５１０で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、及びｓｃＦｖ部分のＶＬドメインは、配列番号５０９で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖ部分は、合成ヒトＦａｂファージライブラリーから得られる。
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３は、ヒト又はアカゲザルＤＬＬ３である。
別の態様では、本開示は、上記のような抗ＤＬＬ３ ＣＡＲ又はＤＬＬ３結合タンパク質をコードする単離核酸分子を提供する。
いくつかの実施形態では、単離核酸分子は、ラクダ単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）をコードする、配列番号３６８～４４８からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、単離核酸分子は、ヒト化ラクダｓｄＡｂをコードする、配列番号４４９～４６１からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、単離核酸分子は、ヒトｓｃＦｖのＶＬ又はＶＨドメインをコードする、配列番号５１１～５１４からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、核酸分子は、キメラスイッチ受容体（ＣＳＲ）又はドミナントネガティブ受容体（ＤＮＲ）をコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む。
いくつかの実施形態では、核酸分子は、ＰＤ－１ドミナントネガティブ受容体（ＰＤ－１ ＤＮＲ）、ＰＤ－１キメラスイッチ受容体（ＰＤ－１ ＣＳＲ）又はＴＧＦ－βドミナントネガティブ受容体（ＴＧＦ－β ＤＮＲ）をコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む。
いくつかの実施形態では、ＰＤ－１ ＤＮＲは、配列番号５２３に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＰＤ－１ ＣＳＲは、配列番号５２４に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＴＧＦ－β ＤＮＲは、配列番号５２９に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＰＤ－１ ＤＮＲ、ＰＤ－１ ＣＳＲ又はＴＧＦ－β ＤＮＲをコードするポリヌクレオチド配列は、２Ａ自己切断ペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を介して、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド配列に連結される。
いくつかの実施形態では、２Ａ自己切断ペプチドは、Ｔ２Ａペプチド又はＰ２Ａペプチドである。
いくつかの実施形態では、核酸分子は、５’から３’の方向に、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド配列、２Ａ自己切断ペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、及びＰＤ－１ ＤＮＲ、ＰＤ－１ ＣＳＲ又はＴＧＦ－β ＤＮＲをコードするポリヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、配列番号５２１若しくは５２２に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有するペプチドをコードする核酸分子又は配列番号５２５～５２８からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有するペプチドをコードする核酸分子である。
別の態様では、本開示は、上記のような単離核酸分子を含む発現ベクターを提供する。
別の態様では、本開示は、上記のような単離核酸分子を含む改変された免疫細胞を提供する。
いくつかの実施形態では、改変された免疫細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、γδＴ細胞、ＮＫＴ細胞、及びネイチャーキラー細胞（Ｎａｔｕｒｅ Ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ）からなる群から選択される。
別の態様では、本開示は、上記のような抗ＤＬＬ３ ＣＡＲを発現する改変された免疫細胞を提供する。
いくつかの実施形態では、改変された免疫細胞は、ＣＳＲ又はＤＮＲも発現する。
いくつかの実施形態では、ＣＳＲは、ＰＤ－１ ＣＳＲであり、ＤＮＲは、ＰＤ－１ ＤＮＲ又はＴＧＦ－β ＤＮＲである。
いくつかの実施形態では、ＰＤ－１ ＤＮＲは、配列番号５２３に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＰＤ－１ ＣＳＲは、配列番号５２４に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＴＧＦ－β ＤＮＲは、配列番号５２９に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲ及びＣＳＲ、又はＣＡＲ及びＤＮＲは、２Ａ自己切断ペプチドを介して同時に発現する。
いくつかの実施形態では、２Ａ自己切断ペプチドは、Ｔ２Ａペプチド又はＰ２Ａペプチドである。
いくつかの実施形態では、改変された免疫細胞は、ＣＡＲ及びＰＤ－１ ＤＮＲを発現し、且つＤＬＬ３及びＰＤ－Ｌ１を発現する細胞によって刺激される。
いくつかの実施形態では、改変された免疫細胞は、ＣＡＲ及びＰＤ－１ ＣＳＲを発現し、且つＤＬＬ３及びＰＤ－Ｌ１を発現する細胞によって刺激される。
いくつかの実施形態では、改変された免疫細胞は、ＣＡＲ及びＴＧＦ－β ＤＮＲを発現し、且つＴＧＦ－βの存在下において、ＤＬＬ３を発現する細胞によって刺激される。
いくつかの実施形態では、改変された免疫細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、γδＴ細胞、ＮＫＴ細胞、及びネイチャーキラー細胞からなる群から選択される。
別の態様では、本開示は、上記のような抗ＤＬＬ３ ＣＡＲ、単離されたＤＬＬ３結合タンパク質、発現ベクター又は改変された免疫細胞と、生理学的に許容できる賦形剤とを含む、医薬組成物を提供する。
別の態様では、本開示は、対象におけるＤＬＬ３関連障害を治療するための方法であって、治療有効量の上記のような改変された免疫細胞、又は治療有効量の上記のような医薬組成物を対象に投与することを含む、方法を提供する。
別の態様では、本開示は、ＤＬＬ３関連障害を治療するための薬剤の調製のための、上記のような抗ＤＬＬ３ ＣＡＲ、単離されたＤＬＬ３結合タンパク質、発現ベクター又は改変された免疫細胞の使用を提供する。
別の態様では、本開示は、ＤＬＬ３関連障害の治療における使用のための薬剤であって、上記のような抗ＤＬＬ３ ＣＡＲ、ＤＬＬ３結合タンパク質、発現ベクター又は改変された免疫細胞を含む、薬剤を提供する。
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３関連障害は、肺がん、メラノーマ、乳がん、前立腺がん、結腸がん、腎細胞がん、卵巣がん、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、白血病及びリンパ腫からなる群から選択されるがんである。
いくつかの実施形態では、がんは、ＤＬＬ３及びＰＤ－Ｌ１を発現する。
いくつかの実施形態では、がんは、対応する正常組織と比較してより高いＴＧＦ－β発現レベルを有する。
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３関連障害は、小細胞肺がんである。
詳細な説明
特に定義されない限り、本明細書で用いられる科学技術用語は、当業者により一般に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものに類似の又は均等な任意の方法、デバイス及び材料が本発明の実施において使用可能である。以下の定義は、本明細書中で頻繁に使用される特定の用語の理解を容易にするために提供され、本開示の範囲を限定することを意図されない。
特に定義されない限り、本明細書で用いられる科学技術用語は、当業者により一般に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものに類似の又は均等な任意の方法、デバイス及び材料が本発明の実施において使用可能である。以下の定義は、本明細書中で頻繁に使用される特定の用語の理解を容易にするために提供され、本開示の範囲を限定することを意図されない。
冠詞「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」は、冠詞の文法的対象の１つ又は２つ以上（即ち少なくとも１つ）を指すように本明細書で用いられる。例として、「要素」は、１つの要素又は２つ以上の要素を意味する。
用語「結合タンパク質」は、本明細書で用いられるとき、標的分子（例えば、ＤＬＬ３）に結合する分子又は分子の一部を指す。いくつかの実施形態では、結合タンパク質は、抗体を含む。いくつかの実施形態では、結合タンパク質は、抗体の抗原結合断片を含む。いくつかの実施形態では、結合タンパク質は、低分子量成分、例えば小分子薬剤又は毒素をさらに含み得る。結合タンパク質は、抗体又はその抗原結合断片でもあり得る。いくつかの実施形態では、結合タンパク質は、受容体のリガンド結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、結合タンパク質は、膜貫通受容体の細胞外ドメインを含む。結合タンパク質は、受容体のリガンド結合ドメイン又は膜貫通受容体の細胞外ドメインでもあり得る。いくつかの実施形態では、結合タンパク質は、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）又は一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む。いくつかの実施形態では、結合タンパク質は、ｓｄＡｂ又はｓｃＦｖであり得る。ＤＬＬ３結合タンパク質は、ＤＬＬ３結合ドメインであり得る。いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３結合タンパク質は、ＤＬＬ３に結合する抗体又は抗体の抗原結合断片を含む。いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３結合タンパク質は、抗体又は抗体の抗原結合断片であり得る。いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３結合タンパク質は、ＤＬＬ３に結合する単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）又は一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む。いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３結合タンパク質は、ｓｄＡｂ又はｓｃＦｖであり得る。
用語「抗体」は、一般に、Ｉｇ分子の本質的なエピトープ結合特徴を保持する、４つのポリペプチド鎖、２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖又はそれらの任意の機能断片からなる任意の免疫グロブリン（Ｉｇ）分子を指す。完全長抗体では、各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書中でＨＣＶＲ又はＶＨと略される）及び重鎖定常領域からなる。重鎖定常領域は、３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書中でＬＣＶＲ又はＶＬと略される）及び軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬからなる。ＶＨ及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称されるより保存された領域に散在された、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域にさらに細分化され得る。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端まで、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序で配列された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲからなる。免疫グロブリン分子は、任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又はサブクラスであり得る。広義には、用語「抗体」は、４つのポリペプチド鎖を有する免疫グロブリン分子に由来しないｓｃＦｖ又はｓｄＡｂをさらに指す。
抗体断片は、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂなどのような抗体の一部である。全長抗体の機能断片は、全長抗体の標的特異性を保持する。したがって、組換え機能的抗体断片、例えばｓｃＦｖ（一本鎖可変鎖断片）は、ｍＡｂに基づく治療薬の代わりとしての治療薬を開発するために使用されている。ｓｃＦｖ断片（約２５ｋＤａ）は、２つの可変ドメインＶＨ及びＶＬからなる。天然には、ＶＨ及びＶＬドメインは、疎水性相互作用を介して非共有結合的に会合し、且つ解離する傾向がある。しかし、安定な断片を、ドメインを親水性フレキシブルリンカーと連結することにより改変することでｓｃＦｖが作出され得る。
本明細書で用いられるとき、用語「単一ドメイン抗体」（ｓｄＡｂ）は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、ラクダ科哺乳類中に見出すことができ、且つ天然に軽鎖を欠いているタイプの抗体の単一重鎖可変ドメインを指す。そのような単一ドメイン抗体は、ＶＨＨ又は「ナノボディ」とも称される。単一ドメイン抗体のアミノ酸配列及び構造は、４つのフレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）並びに３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）からなると考えることができる。したがって、単一ドメイン抗体は、可変ドメインＶＨ又はＶＬに類似する、一般構造：ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４を有するアミノ酸配列と定義され得る。単一の抗原結合タンパク質として又はより大きいタンパク質若しくはポリペプチド中の抗原結合ドメインとしてのｓｄＡｂの使用は、通常の抗体又は抗体断片（例えば、ｓｃＦｖ）の使用を上回るいくつかの有意な利点を提供する。ｓｄＡｂの利点は、単一ドメインのみが高い親和性及び高い選択性で抗原に結合することが求められること；ｓｄＡｂが、熱、ｐＨ及びプロテアーゼを含む変性因子又は条件に対して高度に安定であること；及びｓｄＡｂが、通常の抗体に接近できない標的及びエピトープに接近可能であることを含む。典型的には、ｓｄＡｂは、ラマなどのラクダ類において産生されるが、当技術分野で周知である技術を用いて合成的にも作製され得る。
本明細書で用いられるとき、用語「ヒト化ｓｄＡｂ」は、天然に存在するＶＨＨ配列のアミノ酸配列内の１つ以上のアミノ酸残基が、ヒト由来の通常の４鎖抗体からのＶＨドメイン中の対応する位置に存在するアミノ酸残基の１つ以上によって置換されているｓｄＡｂを意味する。これは、当技術分野で周知である方法により実施可能である。例えば、ｓｄＡｂのＦＲは、ヒト可変ＦＲによって置換され得る。そのため、ヒト化ｓｄＡｂは、ヒト身体に投与されるとき、低減された抗原性を有する。
本明細書で用いられるとき、用語「重鎖単独抗体」又は「ＨＣＡｂ」は、重鎖を含むが、通常、４鎖抗体中に見出される軽鎖が欠如している機能的抗体を指す。ラクダ科動物（ラクダ、ラマ又はアルパカなど）は、ＨＣＡｂを産生することが知られている。
「ＤＬＬ３」は、「デルタ様リガンド３」としても公知であり、ノッチシグナル伝達経路に関与する膜貫通タンパク質である。最初に、線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）及びショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）中で同定され、その後、無脊椎動物から脊椎動物にかけて進化的に保存されることが示されたノッチシグナル伝達経路は、正常な胚発生、成体組織ホメオスタシス及び幹細胞維持を含む一連の基本的な生物学的過程に関与する。ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）では、ノッチシグナル伝達は、主として、セレート及びデルタとして公知である１つのノッチ受容体遺伝子及び２つのリガンド遺伝子によって媒介される（Ｗｈａｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８５；Ｒｅｂａｙ ｅｔ ａｌ．，１９９１）。ヒトでは、４つの公知のノッチ受容体並びに５つのＤＳＬ（デルタ－セレートＬＡＧ２）リガンド － ジャギド１及びジャギド２として公知のセレートの２つの相同体及びデルタ様リガンド又はＤＬＬ１、ＤＬＬ３及びＤＬＬ４と称されるデルタの３つの相同体が認められる。ヒトでは、ＤＬＬ３遺伝子は、染色体１９ｑ１３上に位置し、９．５ｋｂに及ぶ８つのエクソンからなる。最終エクソン内部での選択的スプライシングは、２つのタンパク質アイソフォームをもたらす。両方とも、それらの細胞外ドメイン及びそれらの膜貫通ドメインを通して全体で１００％の同一性を共有し、より長いアイソフォームが伸長された細胞質側末端を有することに限って異なる。
本明細書で用いられるとき、用語「特異的に結合する」若しくは「特異的に結合している」又はそのあらゆる同義語は、ポリペプチド、例えば単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）が、標準のインビトロアッセイによるアッセイとして、ＤＬＬ３分子に対して特異的に認識し、検出可能に結合する能力を指す。例えば、結合することは、本明細書で用いられるとき、十分に記載された抗原抗体結合アッセイ、フローサイトメトリー及び当業者に公知の他のアッセイを用いて、本発明の抗ＤＬＬ３ポリペプチドが細胞表面上のＤＬＬ３分子を認識する能力により測定される。
本明細書で用いられるとき、用語「発現ベクター」は、宿主細胞内での別の核酸の転写及び／又は発現を可能にする特定の核酸因子を用いて組換え的又は合成的に作製された核酸構築物又は配列である。発現ベクターは、プラスミド、ウイルス又は核酸断片の一部であり得る。一例において、発現ベクターは、少なくとも１つのプロモーター配列及び少なくとも１つのターミネーター配列（例えば、ポリアデニル化配列）、また任意選択的に複製起点（ｏｒｉ）配列、また任意選択的に選択又は選択可能マーカー配列を含む、ＤＮＡベクター、例えばプラスミドである。任意選択的に、発現ベクターは、少なくとも１つのポリペプチドをコードする目的の少なくとも１つのヌクレオチドコード配列をさらに含み得、少なくとも１つのプロモーター配列は、少なくとも１つのコード配列と作動可能に連結される。用語「発現」は、限定はされないが、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾及び／又は分泌を含む、ポリペプチドの産生に関与する任意のステップを含む。
用語「単離された」は、通常、天然状態で含有される成分から実質的又は本質的に遊離した材料を指す。材料は、細胞又はタンパク質若しくは核酸などの高分子であり得る。例えば、「単離核酸」は、本明細書で用いられるとき、天然に存在する状態でそれに隣接する配列から精製されているポリヌクレオチド、例えば、通常、断片に隣接した配列から除去されているＤＮＡ断片を指す。代わりに、「単離抗体」又は「単離ポリペプチド」などは、本明細書で用いられるとき、抗体又はポリペプチド分子のその天然細胞環境及び細胞の他の成分との会合からのインビトロ単離及び／又は精製を指す。
非ヒト（例えば、ラクダ類）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を有するキメラ抗体である。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域（ＨＶＲ）からの残基が、所望の特異性、親和性及び／又は能力を有する、マウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）のＨＶＲからの残基で置換されたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。場合により、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク（「ＦＲ」）残基は、対応する非ヒト残基で置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体中又はドナー抗体中に見出されない残基を含み得る。抗体性能、例えば結合親和性をさらに精密にするためにこれらの修飾がなされ得る。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含むことになり、超可変ループのすべて又は実質的にすべては、非ヒト免疫グロブリン配列のものに対応し、且つＦＲ領域のすべて又は実質的にすべては、ヒト免疫グロブリン配列の場合に等しいが、ＦＲ領域は、抗体性能、例えば結合親和性、異性化、免疫原性などを改善する１つ以上の各ＦＲ残基置換を含み得る。ＦＲにおけるこれらのアミノ酸置換の数は、典型的には、Ｈ鎖内で６つ以下且つＬ鎖内で３つ以下である。ヒト化抗体は、任意選択的に、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのものも含むことになる。さらなる詳細として、例えば、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２－５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２９（１９８８）；及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３－５９６（１９９２）を参照されたい。さらに、例えば、Ｖａｓｗａｎｉ ａｎｄ Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ａｎｎ．Ａｌｌｅｒｇｙ，Ａｓｔｈｍａ＆Ｉｍｍｕｎｏｌ．１：１０５－１１５（１９９８）；Ｈａｒｒｉｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ ２３：１０３５－１０３８（１９９５）；Ｈｕｒｌｅ ａｎｄ Ｇｒｏｓｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．５：４２８－４３３（１９９４）；並びに米国特許第６，９８２，３２１号明細書及び米国特許第７，０８７，４０９号明細書を参照されたい。
ペプチド、ポリペプチド又は抗体配列に関して、「配列同一性」及び「相同性」は、配列を整列し、必要に応じてギャップを導入し、配列同一性の一部として保存的置換を全く考慮せずに、最大パーセント配列同一性を達成した後の、特定のペプチド又はポリペプチド配列内のアミノ酸残基と同一である候補配列内のアミノ酸残基の百分率と定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定することを意図したアライメントは、当技術分野の範囲内での様々な方法において、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ又はＭＥＧＡＬＩＧＮ（商標）（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成可能である。当業者は、比較されている配列の完全長にわたる最大アライメントを達成するために必要とされる任意のアルゴリズムを含む、アライメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。
解離定数（ＫＤ又はＫｄ）は、抗体の抗原に対する親和性を示す指標として使用される。例えば、種々のマーカー剤で標識された抗体を使用するスキャッチャード法により、且つＯＴＣ測定キットであるＢｉａｃｏｒｅＸ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）又は同様のキットを、キットに添付されたユーザーマニュアル及び実験操作方法に従って使用することにより容易な分析が可能である。これらの方法を用いて導出可能なＫＤ値は、Ｍ（モル）単位で表される。
「キメラスイッチ受容体（ＣＳＲ）」は、本明細書で用いられるとき、免疫細胞（例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞）に所望の活性、例えば免疫抑制性腫瘍微小環境を克服し、且つそれが一層のインビボ持続性を有し得るような能力を与えるため、その元のシグナル伝達経路の結果を反転させるように作出された受容体を指す。いくつかの実施形態では、ＣＳＲは、がん細胞によって発現された阻害性分子を利用して、ＣＡＲ Ｔ細胞をさらに刺激することができる。非限定例では、ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＣＤ２８の膜貫通及び細胞質共刺激シグナル伝達ドメインに融合されたヒト阻害性受容体のプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）の細胞外リガンド結合ドメインからなるＣＳＲを発現するように改変され得る。ＣＡＲ Ｔ細胞が、ＤＬＬ３及びプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）を発現するがんを有する対象に投与されるとき、発現したＣＡＲは、ＤＬＬ３に結合し得、発現したスイッチ受容体は、ＰＤ－Ｌ１に結合し得る。ＰＤ－１／ＣＤ２８キメラスイッチ受容体融合タンパク質の性質は、正常なＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１媒介性Ｔ細胞抑制を阻止し、代わりにＣＤ２８ドメインを通したシグナル伝達を促進し、ＣＡＲ Ｔ細胞の刺激をもたらす。したがって、ＰＤ－１の膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインをＣＤ２８の場合と交換することで、ＰＤ－Ｌ１がＣＡＲ Ｔ細胞の共刺激リガンドに変換される。これは、ＰＤ－Ｌ１を発現するがん細胞に対して増強された毒性を誘導することになる。他の実施形態では、ＣＳＲは、意図されない標的細胞に対するＣＡＲ Ｔ細胞の効果を阻害するためにも使用可能である。
「ドミナントネガティブ受容体（ＤＮＲ）」は、本明細書で用いられるとき、そのリガンドに結合可能であるが、細胞内部でシグナル伝達カスケードを誘導しない受容体を指す。ＤＮＲは、通常、インタクトなリガンド結合領域を有するが、細胞内酵素領域を欠いている。それは、完全長受容体の突然変異形態又は受容体の切断形態であり得る。ＣＡＲ Ｔ細胞免疫療法後、一部のがん、特に固形がんは、ＣＡＲ Ｔ細胞上の阻害性受容体に結合する阻害性リガンドを上方制御することがある。この適応的抵抗性は、キメラＣＡＲ Ｔ細胞療法の有効性を損なう。一部のがん、特に固形がんは、免疫抑制環境を創出するトランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ－β）を分泌することが知られている。ＴＧＦ－βは、転移を誘導又は促進し、免疫系を強力に抑制することが知られている。したがって、いくつかの実施形態では、本発明者らは、ＴＧＦ－β ＤＮＲとしてのＴＧＦ－β受容体ＴＧＦΒＲＩＩの切断されたバージョンを使用することで、本明細書で開示されるＣＡＲ Ｔ細胞の抗腫瘍性能を改善する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ及びＴＧＦ－β ＤＮＲは、２Ａ自己切断ペプチドの使用により、Ｔ細胞の表面上で同時に発現する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ及びＴＧＦ－β ＤＮＲは、２つの発現ベクターの使用により、Ｔ細胞の表面上で別々に発現する。本発明者らは、ＴＧＦ－β ＤＮＲが、本明細書で開示される抗ＤＬＬ３ ＣＡＲ Ｔ細胞に導入されるとき、いくつかのＤＬＬ３陽性がん細胞、例えばＳＣＬＣ細胞に対するＣＡＲ Ｔ細胞の細胞傷害性を増強し得ることを見出している。同様に、いくつかの実施形態では、本発明者らは、ＰＤ－１ ＤＮＲとしてのＰＤ－１受容体の切断されたバージョンを使用することで、本明細書で開示されるＣＡＲ Ｔ細胞の抗腫瘍性能を改善する。
本明細書で用いられるとき、「治療」又は「治療する」は、疾患又は病態の症状又は病理に対するあらゆる有利な又は望ましい効果を含み、治療されている疾患又は病態、例えばがん、自己免疫疾患、免疫異常などの１つ以上の測定可能なマーカーにおける最小限の減少をさらに含み得る。治療は、任意選択的に、疾患又は病態の進行の遅延を含み得る。「治療」は、疾患若しくは病態又はその関連症状の完全な根絶又は治癒を必ずしも示さない。
本発明のいくつかの態様は、ヒト又はアカゲザルＤＬＬ３タンパク質に対する結合特異性を有するＤＬＬ３結合タンパク質に関する。
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３結合タンパク質は、ＤＬＬ３に特異的に結合する単一ドメイン抗体（「ｓｄＡｂ」）部分を含み、ｓｄＡｂ部分は、配列番号１～８１のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１又はＣＤＲ１において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体、配列番号８２～１６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２又はＣＤＲ２において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体、及び配列番号１６３～２４３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３又はＣＤＲ３において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体を含むポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、配列番号１～８１のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号８２～１６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１６３～２４３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含むポリペプチド又はＣＤＲ領域において最大で約３つのアミノ酸置換を含むポリペプチドの変異体を含む。いくつかの実施形態では、抗ＤＬＬ３抗体は、ヒト又はアカゲザルＤＬＬ３タンパク質で免疫された後にラクダから産生された単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）であるか又はそれを含む。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、表１の各列中に列記される通り、ＣＤＲセット（即ちＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３の組み合わせ）を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、以下：
（１）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１６８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（２）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１０２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１８３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（３）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１８６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（４）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（５）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１９６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（６）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号２０１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（７）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号８８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１６９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（８）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１７０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；又は
（９）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号９０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１７１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体
のいずれか１つを含むポリペプチドを含む。
（１）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１６８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（２）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１０２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１８３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（３）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１８６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（４）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（５）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１９６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（６）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号２０１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（７）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号８８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１６９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（８）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１７０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；又は
（９）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号９０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１７１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体
のいずれか１つを含むポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、以下：
（１）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１６８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（２）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１０２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１８３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（３）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１８６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（４）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（５）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１９６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（６）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号２０１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（７）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号８８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１６９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（８）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１７０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；又は
（９）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号９０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１７１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３
のいずれか１つを含むポリペプチドを含む。
（１）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１６８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（２）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１０２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１８３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（３）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１８６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（４）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（５）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１９６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（６）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号２０１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（７）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号８８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１６９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（８）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１７０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；又は
（９）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号９０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１７１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３
のいずれか１つを含むポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、配列番号２７４～３５４のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％（例えば、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又は約１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、配列番号２７４～３５４のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、ｓｄＡｂは、ヒト化され、配列番号３５５～３６７のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％（例えば、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又は約１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、配列番号３５５～３６７のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。ヒト化抗体は、限定はされないが、ＣＤＲ移植（例えば、米国特許第５，２２５，５３９号明細書、米国特許第５，５３０，１０１号明細書及び米国特許第５，５８５，０８９号明細書を参照されたい）、ベニヤリング又はリサーフェイシング（例えば、欧州特許第５９２，１０６号明細書及び欧州特許第５１９，５９６号明細書を参照されたい）及びチェーンシャッフリング（例えば、米国特許第５，５６５，３３２号明細書を参照されたい）を含む、当技術分野で公知の種々の技術を用いて産生され得る。一般に、ヒト化中、受容体抗体（例えば、ヒト抗体）のＣＤＲ残基は、ドナー抗体（例えば、齧歯類抗体）のＣＤＲ残基と置換され、抗原結合特異性が保持される一方、インビボ免疫原性が最小化される。多くの場合、フレームワーク領域内のフレームワーク残基がドナー抗体からの対応する残基と置換されることで、抗原結合性が改変、例えば改善されることにもなる。これらのフレームワーク置換、例えば保存的置換は、当技術分野で周知の方法、例えば抗原結合にとって重要なフレームワーク残基を同定するためのＣＤＲ及びフレームワーク残基の相互作用のモデリング並びに特定の位置での異常なフレームワーク残基を同定するための配列比較により同定される（例えば、Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，５８５，０８９号明細書；及びＲｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３を参照されたい）。
いくつかの場合、ｓｄＡｂは、ヒトＩｇＧヒンジ断片及びＦｃ断片と融合され、重鎖抗体（ＨＣＡｂ）を形成し得る。いくつかの場合、ｓｄＡｂは、ＤＬＬ３以外の抗原に特異的である別のｓｄＡｂ又はｓｃＦｖと融合され、二重特異性抗体を形成し得る。いくつかの場合、ｓｄＡｂは、ＤＬＬ３以外の抗原に特異的である２つ以上のｓｄＡｂ又はｓｃＦｖと融合され、多特異性抗体を形成し得る。他の場合、ｓｄＡｂは、薬剤分子を担持するように化学修飾され得る。そのため、抗ＤＬＬ３ ｓｄＡｂは、薬剤分子をＤＬＬ３発現細胞に導くようにインビボで使用され得る。
いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３結合タンパク質は、ＤＬＬ３に特異的に結合する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であるか又はそれを含む。いくつかの場合、ｓｃＦｖは、何回ものファージパニングを通して合成ヒトＦａｂ又はｓｃＦｖファージライブラリーから単離され、パニングの各回は、結合するプロセス、非特異的ファージの除去並びに結合ファージの溶出及び増幅を含み、次のラウンドに備える。いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３結合タンパク質は、ＤＬＬ３に特異的に結合するｓｃＦｖ部分を含み、ｓｃＦｖは、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ｓｃＦｖのＶＨドメインは、配列番号４９８又は５０４で示されるＣＤＲ１、配列番号４９９又は５０５で示されるＣＤＲ２、及び配列番号５００又は５０６で示されるＣＤＲ３を含み、及びｓｃＦｖのＶＬドメインは、配列番号４９５又は５０１で示されるＣＤＲ１、配列番号４９６又は５０２で示されるＣＤＲ２、及び配列番号４９７又は５０３で示されるＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３結合タンパク質は、ＤＬＬ３に特異的に結合するｓｃＦｖ部分を含み、ｓｃＦｖは、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ｓｃＦｖのＶＨドメインは、配列番号４９８で示されるＣＤＲ１、配列番号４９９で示されるＣＤＲ２、及び配列番号５００で示されるＣＤＲ３を含み、及びｓｃＦｖのＶＬドメインは、配列番号４９５で示されるＣＤＲ１、配列番号４９６で示されるＣＤＲ２、及び配列番号４９７で示されるＣＤＲ３を含むか；又はｓｃＦｖのＶＨドメインは、配列番号５０４で示されるＣＤＲ１、配列番号５０５で示されるＣＤＲ２、及び配列番号５０６で示されるＣＤＲ３を含み、及びｓｃＦｖのＶＬドメインは、配列番号５０１で示されるＣＤＲ１、配列番号５０２で示されるＣＤＲ２、及び配列番号５０３で示されるＣＤＲ３を含む。
いくつかの場合、ｓｃＦｖは、二重特異性抗体を形成するため、ＤＬＬ３以外の抗原に特異的である別のｓｄＡｂ又はｓｃＦｖと融合され得る。いくつかの場合、ｓｃＦｖは、多特異性抗体を形成するため、ＤＬＬ３以外の抗原に特異的である２つ以上のｓｄＡｂ又はｓｃＦｖと融合され得る。他の場合、ｓｃＦｖは、薬剤分子を担持するように化学修飾され得る。そのため、抗ＤＬＬ３ ｓｃＦｖは、薬剤分子をＤＬＬ３発現細胞に導くためにインビボで使用され得る。
本発明のいくつかの態様は、ＤＬＬ３結合ドメインを含むＣＡＲ又はＣＡＲ－Ｔ細胞（抗ＤＬＬ３ ＣＡＲ又は抗ＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞）に関する。
本発明のＣＡＲは、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、Ｎ末端のシグナルペプチド、及び細胞外ドメインと膜貫通ドメインとの間のヒンジ領域をさらに含む。細胞外ドメインは、標的特異的結合因子（抗原認識ドメイン又は抗原結合ドメインとも称される）を含む。細胞内ドメイン又はさもなければ細胞質ドメインは、１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメイン及びＣＤ３ζ鎖部分を含むことが多い。共刺激シグナル伝達ドメインは、共刺激分子の細胞内ドメインを含むＣＡＲの一部分を指す。
ＣＡＲ分子による抗原認識又は抗原標的化は、最も一般的には、抗体又は抗体断片の使用を含む。本発明によると、抗原結合ドメインは、ＤＬＬ３に特異的に結合する抗体又は抗体断片である。好ましくは、本発明のＣＡＲの抗原結合ドメインは、上記のような抗ＤＬＬ３ ｓｃＦｖ又はｓｄＡｂである。
膜貫通ドメインは、天然又は合成供給源のいずれにも由来し得る。供給源が天然である場合、当該ドメインは、任意の膜結合又は膜貫通タンパク質に由来し得る。本発明における特定の使用の膜貫通領域は、例えば、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータ又はゼータ鎖、ＣＤ８α鎖に由来し得る（即ち少なくともその膜貫通領域を含み得る）。
本発明のＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫細胞の正常なエフェクター機能の少なくとも１つの活性化に関与する。用語「エフェクター機能」は、細胞の特殊化された機能を指す。例えば、Ｔ細胞のエフェクター機能は、サイトカインの分泌を含む細胞溶解活性又はヘルパー活性であり得る。そのため、用語「細胞内ドメイン」は、エフェクター機能シグナルを伝達し、細胞が特殊化された機能を遂行するように導くタンパク質の部分を指す。通常、全細胞質ドメインが利用され得るが、多くの場合、全鎖を使用することは必要でない。細胞質ドメインの切断部分が使用される程度であるが、そのような切断部分は、エフェクター機能シグナルを伝達する限り、インタクトな鎖の代わりに使用され得る。そのため、細胞内ドメインという用語は、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な細胞質ドメインの任意の切断部分を含むことを意味する。本発明のＣＡＲにおける使用が意図される細胞質ドメインの好ましい例として、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及び抗原受容体会合後のシグナル伝達の開始に連携して作用する共受容体の細胞質配列並びにこれらの配列の任意の誘導体又は変異体及び同じ機能的能力を有する任意の合成配列が挙げられる。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、又はＣＤ６６ｄに由来する。
多くの場合、ＴＣＲ単独により生成されるシグナルは、Ｔ細胞の完全活性化にとって不十分である。したがって、二次又は共刺激シグナルが使用される。そのため、Ｔ細胞活性化は、２つの異なるクラスの細胞質シグナル伝達配列：ＴＣＲを通して抗原依存性一次活性化を開始させるもの（一次細胞質シグナル伝達配列）及び二次又は共刺激シグナルを提供するように抗原非依存的様式で作用するもの（二次細胞質シグナル伝達配列）によって媒介されると述べることが可能である。共刺激シグナル伝達配列は、共刺激分子の細胞内ドメインを含むＣＡＲの一部を指す。共刺激分子は、抗原に対するリンパ球の効率的応答に必要とされる、抗原受容体又はそのリガンド以外の細胞表面分子である。そのような分子の例として、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＬＦＡ－１、ＩＣＯＳ、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＴＮＦＲＳＦ９、ＴＮＦＲＳＦ４、ＴＮＦＲＳＦ８、ＣＤ４０ＬＧ、ＩＴＧＢ２、ＫＬＲＣ２、ＴＮＦＲＳＦ１８、ＴＮＦＲＳＦ１４、ＨＡＶＣＲ１、ＬＧＡＬＳ９、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ８３、ＣＤ８３のリガンド、及びそれらの組み合わせが挙げられる。
ＣＡＲの細胞外ドメインと膜貫通ドメインとの間のヒンジ領域は、一般に、膜貫通ドメインをポリペプチド鎖内の細胞外ドメインに連結するように機能する任意のオリゴ又はポリペプチドを意味する。ヒンジ領域は、最大で３００アミノ酸、好ましくは２～１００アミノ酸、最も好ましくは２～１０アミノ酸であり得る。
抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞質ドメイン及びヒンジ領域に加えて、本発明のＣＡＲは、ＣＡＲのＮ末端に連結されたシグナルペプチド配列も含み得る。シグナルペプチド配列は、多数の分泌タンパク質及び膜タンパク質のＮ末端に存在し、典型的には１５～３０アミノ酸長を有する。上記のタンパク質分子の多くがシグナルペプチド配列を有することから、これらのシグナルペプチドは、本発明のＣＡＲのためのシグナルペプチドとして使用可能である。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＤＬＬ３結合ドメインを含み、ＤＬＬ３結合ドメインは、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）又は一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含むか又はそれに由来する。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＤＬＬ３結合ドメインを含み、ＤＬＬ３結合ドメインは、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を含むか又はそれに由来し、ｓｄＡｂは、配列番号１～８１のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１又はＣＤＲ１において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号８２～１６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２又はＣＤＲ２において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１６３～２４３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３又はＣＤＲ３において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＤＬＬ３結合ドメインを含み、ＤＬＬ３結合ドメインは、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を含むか又はそれに由来し、ｓｄＡｂは、配列番号１～８１のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号８２～１６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１６３～２４３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＤＬＬ３結合ドメインを含み、ＤＬＬ３結合ドメインは、以下：
（１）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１６８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（２）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１０２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１８３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（３）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１８６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（４）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（５）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１９６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（６）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号２０１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（７）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号８８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１６９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（８）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１又はその最大で約３つのアミノ酸置換を含む変異体；配列番号８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１７０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；又は
（９）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号９０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１７１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体
のいずれか１つを含むｓｄＡｂを含む。
（１）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１６８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（２）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１０２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１８３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（３）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１８６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（４）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（５）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１９６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（６）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号２０１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（７）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号８８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１６９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（８）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１又はその最大で約３つのアミノ酸置換を含む変異体；配列番号８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１７０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；又は
（９）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号９０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１７１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体
のいずれか１つを含むｓｄＡｂを含む。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＤＬＬ３結合ドメインを含み、ＤＬＬ３結合ドメインは、以下：
（１）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１６８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（２）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１０２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１８３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（３）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１８６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（４）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（５）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１９６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（６）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号２０１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（７）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号８８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１６９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（８）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１７０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；又は
（９）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号９０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１７１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３
のいずれか１つを含むｓｄＡｂを含む。
（１）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１６８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（２）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１０２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１８３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（３）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１８６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（４）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（５）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１９６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（６）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号２０１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（７）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号８８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１６９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（８）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１７０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；又は
（９）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号９０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１７１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３
のいずれか１つを含むｓｄＡｂを含む。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＤＬＬ３結合ドメインを含み、ＤＬＬ３結合ドメインは、ラクダｓｄＡｂを含み、ｓｄＡｂは、配列番号２７４～３５４のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％（例えば、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＤＬＬ３結合ドメインを含み、ＤＬＬ３結合ドメインは、配列番号２７４～３５４のいずれか１つのアミノ酸を含むラクダｓｄＡｂを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＤＬＬ３結合ドメインを含み、ＤＬＬ３結合ドメインは、ヒト化ｓｄＡｂを含み、ｓｄＡｂは、配列番号３５５～３６７のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％（例えば、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＤＬＬ３結合ドメインを含み、ＤＬＬ３結合ドメインは、配列番号３５５～３６７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むヒト化ｓｄＡｂを含む。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＤＬＬ３結合ドメインを含み、ＤＬＬ３結合ドメインは、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含むか又はそれに由来し、ｓｃＦｖのＶＨドメインは、配列番号４９８で示されるＣＤＲ１、配列番号４９９で示されるＣＤＲ２、及び配列番号５００で示されるＣＤＲ３を含み、及びｓｃＦｖのＶＬドメインは、配列番号４９５で示されるＣＤＲ１、配列番号４９６で示されるＣＤＲ２、及び配列番号４９７で示されるＣＤＲ３を含むか；又はｓｃＦｖのＶＨドメインは、配列番号５０４で示されるＣＤＲ１、配列番号５０５で示されるＣＤＲ２、及び配列番号５０６で示されるＣＤＲ３を含み、及びｓｃＦｖのＶＬドメインは、配列番号５０１で示されるＣＤＲ１、配列番号５０２で示されるＣＤＲ２、及び配列番号５０３で示されるＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖのＶＨドメインは、配列番号５０８で示されるアミノ酸配列を含み、及びｓｃＦｖのＶＬドメインは、配列番号５０７で示されるアミノ酸配列を含むか；又はｓｃＦｖのＶＨドメインは、配列番号５１０で示されるアミノ酸配列を含み、及びｓｃＦｖのＶＬドメインは、配列番号５０９で示されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、本発明のＣＡＲは、ＤＬＬ３結合ドメインとして本明細書に提供されるラクダｓｄＡｂを含み、及び配列番号４７６～４８４のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％（例えば、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明のＣＡＲは、ＤＬＬ３結合ドメインとして本明細書に提供されるラクダｓｄＡｂを含み、及び配列番号４７６～４８４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、本発明のＣＡＲは、ＤＬＬ３結合ドメインとして本明細書に提供されるヒト化ｓｄＡｂを含み、及び配列番号４８５～４９４のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％（例えば、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、本発明のＣＡＲは、ＤＬＬ３結合ドメインとして本明細書に提供されるヒト化ｓｄＡｂを含み、及び配列番号４８５～４９４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、本発明のＣＡＲは、ＤＬＬ３結合ドメインとして本明細書に提供されるヒトｓｃＦｖを含み、及び配列番号５１５～５１６のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％（例えば、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明のＣＡＲは、ＤＬＬ３結合ドメインとして本明細書に提供されるヒトｓｃＦｖを含み、及び配列番号５１５～５１６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、本発明のＣＡＲは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、シグナルペプチド、ＤＬＬ３結合ドメイン、ヒンジ領域、膜貫通ドメイン及び細胞質シグナル伝達ドメインを含む。特定の実施形態では、本発明のＣＡＲは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、配列番号４６５で示されるようなＣＤ８αシグナルペプチド、ＤＬＬ３結合ドメイン、配列番号４６６で示されるようなＣＤ８αヒンジドメイン、配列番号４６７で示されるようなＣＤ８α膜貫通ドメイン、配列番号４６８で示されるようなＣＤ１３７細胞質ドメイン、配列番号４６９で示されるようなＣＤ２８細胞質ドメイン及び配列番号４７０で示されるようなＣＤ３ζ細胞質ドメインを含む。
本発明のいくつかの態様は、本発明のｓｄＡｂ、ｓｃＦｖ又はＣＡＲをコードする単離核酸分子に関する。いくつかの実施形態では、核酸分子は、ラクダｓｄＡｂをコードし、配列番号３６８～４４８からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は、ヒト化ｓｄＡｂをコードし、配列番号４４９～４６１からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は、ｓｃＦｖのＶＨ及びＶＬドメインをコードし、ＶＨドメインをコードする配列は、配列番号５１２又は５１４のポリヌクレオチド配列を含み、ＶＬドメインをコードする配列は、配列番号５１１又は５１３のポリヌクレオチド配列を含む。
本願のいくつかの態様は、上に提供されたＣＡＲのいずれか１つ、又は上記の単離核酸のいずれか１つ、又は上記のベクターのいずれか１つを含む改変された免疫細胞に関する。いくつかの実施形態では、改変された免疫細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、γδＴ細胞、ＮＫＴ細胞、及びネイチャーキラー細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、本発明の単離核酸分子を担持する発現ベクターを含む。核酸分子の一部によってコードされるポリペプチドを発現するための発現ベクターで細胞を遺伝子改変することは、当技術分野で周知の遺伝子技術である。
本発明のいくつかの態様は、本発明のＤＬＬ３結合タンパク質、抗ＤＬＬ３ ＣＡＲ、核酸分子又はＣＡＲ－Ｔ細胞の使用に関する。いくつかの実施形態では、本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞は、生理学的に許容できる賦形剤を有する医薬組成物として製剤化される。本明細書で用いられるとき、「生理学的に許容できる賦形剤」は、限定はされないが、ヒト又は家畜における使用にとって許容できるものとして、任意のアジュバント、担体、希釈剤、保存剤、分散剤、懸濁化剤、安定剤、等張剤、溶剤、界面活性剤又は乳化剤を含む。いくつかの実施形態では、本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞又はそれを含む医薬組成物は、対象におけるＤＬＬ３関連障害を治療するために使用される。したがって、ＤＬＬ３関連障害を治療するための方法であって、ＤＬＬ３関連障害を患う対象に治療有効量の本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞又は医薬組成物を投与することを含む、方法が提供される。抗体、ＣＡＲ－Ｔ細胞又は医薬組成物の「治療有効量」は、対象（例えば、患者）の病態、年齢、性別及び体重などの要素に応じて変化し得る。用語「治療有効量」は、対象を「治療する」のに有効である量を含み得る。治療量が指定されるとき、特定の実施形態において企図される投与される正確な量は、医師により対象の病態を考慮して決定され得る。いくつかの実施形態では、ＤＬＬ３関連障害は、細胞表面タンパク質としてＤＬＬ３を発現するがん、例えばメラノーマ、乳がん、前立腺がん、結腸がん、腎細胞がん、卵巣がん、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、白血病及びリンパ腫である。好ましくは、ＤＬＬ３関連障害は、肺がん、特に小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）である。
本明細書に記載の実施例は、下の実験が実施されたすべて又は唯一の実験であることを表すことを意図されない。使用する数値（例えば、量、温度など）についての正確さを保証するための努力を行っているが、いくらかの実験誤差及び偏差を考慮する必要がある。特に指示のない限り、部は、重量部であり、分子量は、重量平均分子量であり、温度は、摂氏度であり、及び圧力は、大気圧又はその近傍である。
実施例１．動物免疫及び抗体ライブラリー構築
本実施例では、免疫ラクダがヒト又はアカゲザルＤＬＬ３タンパク質に対して良好な免疫応答を示し、後天性免疫ライブラリーが優れた質を示すことを実証した。
本実施例では、免疫ラクダがヒト又はアカゲザルＤＬＬ３タンパク質に対して良好な免疫応答を示し、後天性免疫ライブラリーが優れた質を示すことを実証した。
動物免疫
Ｎ末端ＦＬＡＧタグを有するヒトＤＬＬ３タンパク質（ａａ２７～４６６）（ＡｄｉｐｏＧｅｎ，ＡＧ－４０Ｂ－０１５１）又は／及びＤＬＬ３発現プラスミド若しくはＤＬＬ３発現細胞（ＣＨＯ－Ｋ１／ＤＬＬ３又は／及びＣＨＯ－Ｋ１／ＥＧＦ４）の細胞外ドメインを含む免疫原をアジュバント又はＰＢＳと混合し、ラクダに注射した。典型的には、ラクダを１週～２週間隔で２～４回免疫した。複数回の免疫後、標的抗原ＤＬＬ３に対する免疫反応を、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）とフローサイトメトリーアッセイとの両方を通した血清滴定により評価した。
Ｎ末端ＦＬＡＧタグを有するヒトＤＬＬ３タンパク質（ａａ２７～４６６）（ＡｄｉｐｏＧｅｎ，ＡＧ－４０Ｂ－０１５１）又は／及びＤＬＬ３発現プラスミド若しくはＤＬＬ３発現細胞（ＣＨＯ－Ｋ１／ＤＬＬ３又は／及びＣＨＯ－Ｋ１／ＥＧＦ４）の細胞外ドメインを含む免疫原をアジュバント又はＰＢＳと混合し、ラクダに注射した。典型的には、ラクダを１週～２週間隔で２～４回免疫した。複数回の免疫後、標的抗原ＤＬＬ３に対する免疫反応を、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）とフローサイトメトリーアッセイとの両方を通した血清滴定により評価した。
ファージディスプレイライブラリー構築
ＴＲＩＺＯＬ（登録商標）試薬を使用し、製造業者のプロトコルに従い、免疫ラクダのリンパ球から全ＲＮＡを抽出した。ＰＲＩＭＥＳＣＲＩＰＴ（商標）ファーストストランドｃＤＮＡ合成キットを使用し、製造業者のプロトコルに従い、オリゴ（ｄＴ）２０プライマーにより、ＲＮＡ鋳型に基づいてｃＤＮＡを合成した。ＶＨＨファージライブラリーの作成のため、ラクダｃＤＮＡからＶＨＨを増幅した。
ＴＲＩＺＯＬ（登録商標）試薬を使用し、製造業者のプロトコルに従い、免疫ラクダのリンパ球から全ＲＮＡを抽出した。ＰＲＩＭＥＳＣＲＩＰＴ（商標）ファーストストランドｃＤＮＡ合成キットを使用し、製造業者のプロトコルに従い、オリゴ（ｄＴ）２０プライマーにより、ＲＮＡ鋳型に基づいてｃＤＮＡを合成した。ＶＨＨファージライブラリーの作成のため、ラクダｃＤＮＡからＶＨＨを増幅した。
実施例２．抗ＤＬＬ３抗体の作製
本明細書に提供される抗ＤＬＬ３抗体は、免疫ラクダから作製された単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）又は合成ヒトＦａｂライブラリーから単離されたヒトＦａｂを含む。
本明細書に提供される抗ＤＬＬ３抗体は、免疫ラクダから作製された単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）又は合成ヒトＦａｂライブラリーから単離されたヒトＦａｂを含む。
ファージディスプレイ
免疫（Ｎ末端ＦＬＡＧタグを有するヒトＤＬＬ３タンパク質（ａａ２７～４６６）（ＡｄｉｐｏＧｅｎ，ＡＧ－４０Ｂ－０１５１）又は／及びＤＬＬ３発現プラスミド若しくはＤＬＬ３発現細胞（ＣＨＯ－Ｋ１／ＤＬＬ３又は／及びＣＨＯ－Ｋ１／ＥＧＦ４）の細胞外ドメインを含む免疫原）によって得られたｓｄＡｂを用いて、ファージディスプレイライブラリーを構築した。別のヒトＦａｂファージディスプレイライブラリーを合成した。さらなる使用のため、両方のファージライブラリーを４℃でのフィルター滅菌後に救出及び貯蔵した。上記の２つのファージライブラリーにより、タンパク質に基づくパニング及び細胞に基づくパニングを使用し、結合ファージを単離した。両方のライブラリーを使用し、タンパク質に基づくパニング手法及び細胞に基づくパニング手法の両方について、ＤＬＬ３に特異的なファージクローンの百分率が３０％に達するまで少なくとも１回のパニングを実施した。全アウトプットクローンの数、ＥＬＩＳＡによるＤＬＬ３陽性クローンの百分率及びＤＬＬ３に特異的なクローンの配列多様性について、各回のアウトプットファージを評価した。これらの結果に基づき、ハイスループットスクリーニングのために最高のパニングアウトプットを選択した。
免疫（Ｎ末端ＦＬＡＧタグを有するヒトＤＬＬ３タンパク質（ａａ２７～４６６）（ＡｄｉｐｏＧｅｎ，ＡＧ－４０Ｂ－０１５１）又は／及びＤＬＬ３発現プラスミド若しくはＤＬＬ３発現細胞（ＣＨＯ－Ｋ１／ＤＬＬ３又は／及びＣＨＯ－Ｋ１／ＥＧＦ４）の細胞外ドメインを含む免疫原）によって得られたｓｄＡｂを用いて、ファージディスプレイライブラリーを構築した。別のヒトＦａｂファージディスプレイライブラリーを合成した。さらなる使用のため、両方のファージライブラリーを４℃でのフィルター滅菌後に救出及び貯蔵した。上記の２つのファージライブラリーにより、タンパク質に基づくパニング及び細胞に基づくパニングを使用し、結合ファージを単離した。両方のライブラリーを使用し、タンパク質に基づくパニング手法及び細胞に基づくパニング手法の両方について、ＤＬＬ３に特異的なファージクローンの百分率が３０％に達するまで少なくとも１回のパニングを実施した。全アウトプットクローンの数、ＥＬＩＳＡによるＤＬＬ３陽性クローンの百分率及びＤＬＬ３に特異的なクローンの配列多様性について、各回のアウトプットファージを評価した。これらの結果に基づき、ハイスループットスクリーニングのために最高のパニングアウトプットを選択した。
ハイスループットスクリーニング
選択したアウトプットファージを使用して、指数関数的に成長する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞に感染させた。アウトプットファージの二本鎖ＤＮＡを抽出した。ハイスループットスクリーニングのため、ｓｄＡｂ／Ｆａｂインサートをファージミドベクターから切断し、抗体断片の発現ベクターに挿入した。得られたプラスミドを使用して、指数関数的に成長する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を形質転換させ、次いでそれらを蒔き、３７℃で一晩成長させた。数千のコロニーを個別に選定し、１ｍＬの２×ＹＴ培地を含有する９６ディープウェルプレート内で成長させた。１ｍＭのＩＰＴＧを添加することにより、抗体断片の発現を誘導した。
選択したアウトプットファージを使用して、指数関数的に成長する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞に感染させた。アウトプットファージの二本鎖ＤＮＡを抽出した。ハイスループットスクリーニングのため、ｓｄＡｂ／Ｆａｂインサートをファージミドベクターから切断し、抗体断片の発現ベクターに挿入した。得られたプラスミドを使用して、指数関数的に成長する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を形質転換させ、次いでそれらを蒔き、３７℃で一晩成長させた。数千のコロニーを個別に選定し、１ｍＬの２×ＹＴ培地を含有する９６ディープウェルプレート内で成長させた。１ｍＭのＩＰＴＧを添加することにより、抗体断片の発現を誘導した。
上清中のｓｄＡｂ／Ｆａｂタンパク質を、ＥＬＩＳＡにより、ＤＬＬ３ ＥＣＤタンパク質に結合するそれらの能力について分析し、且つＦＡＣＳにより、ＤＬＬ３を発現するＳＨＰ－７７細胞株（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（登録商標）ＣＲＬ－２１９５（商標））及びＣＨＯ－Ｋ１／ヒトＤＬＬ３（自家製）に結合するそれらの能力について分析した。すべての結合剤を配列決定した。冗長配列を除去した。ヒト及びアカゲザルＤＬＬ３タンパク質と細胞株の両方に結合する合計で８１のラクダｓｄＡｂ及び２つのヒトＦａｂ結合剤が得られた。すべてのこれらの結合剤は、固有のアミノ酸配列を有する。
これらの固有の結合剤の一部に対して、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によるさらなる特徴付けを行った。実験は、以下のように実施した：粗ｓｄＡｂ／Ｆａｂタンパク質をアフィニティータグによりセンサーチップ上に捕捉した。高濃度（１００ｎＭ）のヒトＤＬＬ３がセンサーチップ表面上を流れ、３００秒間、抗体断片と結合させておき、続いてランニングバッファーを注射し、形成された複合体を解離させておいた。オンレート（ｋａ）及びオフレート（ｋｄ）を１つの会合及び解離曲線に基づいて概算し、それらを使用して平衡解離定数（ＫＤ）を推定した。これらの固有の結合剤の一部の結合親和性を表７に示した。
抗ＤＬＬ３ラクダｓｄＡｂのＣＤＲ配列を表１に列記し、抗ＤＬＬ３ヒトｓｃＦｖのＣＤＲ配列を表２に列記した。
（表１）抗ＤＬＬ３ラクダｓｄＡｂのＣＤＲ配列
（表２）抗ＤＬＬ３ヒトｓｃＦｖのＣＤＲ配列
抗ＤＬＬ３ ｓｄＡｂのアミノ酸配列を表３に列記した。ｓｄＡｂのＣＤＲに下線を引いた。抗ＤＬＬ３ ｓｄＡｂをコードする核酸配列を配列番号３６８～４４８に示した。
（表３）抗ＤＬＬ３ラクダｓｄＡｂのアミノ酸配列
抗ＤＬＬ３ヒトｓｃＦｖのＶＨ及びＶＬドメインのアミノ酸配列を表４に列記した。抗ＤＬＬ３ヒトｓｃＦｖのＶＨ又はＶＬドメインをコードする核酸配列を配列番号５１１～５１４に示した。
（表４）抗ＤＬＬ３ヒトｓｃＦｖのアミノ酸配列
実施例３．単一特異性ラクダＣＡＲの作製
抗ＤＬＬ３ラクダｓｄＡｂ断片のアミノ酸配列を上の表３に提示し、抗ＤＬＬ３ラクダｓｄＡｂ断片の核酸配列を配列番号３６８～４４８に提示した。表３のｓｄＡｂ断片及び追加の配列を使用して、ＣＡＲ構築物（配列番号４７６～４８４）を作製した。ヒト抗ＤＬＬ３ ｓｃＦｖであるＣＡＲ３ ｓｃＦｖ（配列番号４７３）も使用して、参照としてのＣＡＲ構築物（ＣＡＲ３）を作製した。完全長ＣＡＲは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号４６５）、表３に提示したＤＬＬ３結合ドメインｓｄＡｂ、ＣＤ８αヒンジドメイン（配列番号４６６）、ＣＤ８α膜貫通ドメイン（配列番号４６７）、ＣＤ１３７細胞内ドメイン（配列番号４６８）又はＣＤ２８細胞内ドメイン（配列番号４６９）及びＣＤ３ζ細胞内ドメイン（配列番号４７０）を有する。ＣＡＲ構築物の概略図を図１に示す。次に、ＣＡＲ断片をコードする核酸をレンチウイルスベクターにクローン化し、発現のためのヒトＥＦ１αプロモーターを用いて、単一コーディングフレームで完全長ＣＡＲ構築物を作出した。得られたＣＡＲ骨格ベクターを「ＰＬＬＶ－ｈＥＦ１α－ＤＬＬ３」と名付けた。
抗ＤＬＬ３ラクダｓｄＡｂ断片のアミノ酸配列を上の表３に提示し、抗ＤＬＬ３ラクダｓｄＡｂ断片の核酸配列を配列番号３６８～４４８に提示した。表３のｓｄＡｂ断片及び追加の配列を使用して、ＣＡＲ構築物（配列番号４７６～４８４）を作製した。ヒト抗ＤＬＬ３ ｓｃＦｖであるＣＡＲ３ ｓｃＦｖ（配列番号４７３）も使用して、参照としてのＣＡＲ構築物（ＣＡＲ３）を作製した。完全長ＣＡＲは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号４６５）、表３に提示したＤＬＬ３結合ドメインｓｄＡｂ、ＣＤ８αヒンジドメイン（配列番号４６６）、ＣＤ８α膜貫通ドメイン（配列番号４６７）、ＣＤ１３７細胞内ドメイン（配列番号４６８）又はＣＤ２８細胞内ドメイン（配列番号４６９）及びＣＤ３ζ細胞内ドメイン（配列番号４７０）を有する。ＣＡＲ構築物の概略図を図１に示す。次に、ＣＡＲ断片をコードする核酸をレンチウイルスベクターにクローン化し、発現のためのヒトＥＦ１αプロモーターを用いて、単一コーディングフレームで完全長ＣＡＲ構築物を作出した。得られたＣＡＲ骨格ベクターを「ＰＬＬＶ－ｈＥＦ１α－ＤＬＬ３」と名付けた。
実施例４．ラクダ抗ＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞の作製
レンチウイルスの調製
ｐＣＭＶ－△Ｒ－８．４７及びｐＭＤ２．Ｇ（Ａｄｄｇｅｎｅ，カタログ番号１２２５９）を含むレンチウイルスパッケージングプラスミド混合物を、ＨＥＫ２９３細胞への添加前に、ポリエチレンイミンの存在下において、ＰＬＬＶ－ｈＥＦ１α－ＤＬＬ３ベクターと予め最適化された比（１：１：１：２）で予備混合した。一晩インキュベーション後、上清を収集した。ウイルス含有上清を０．４５μｍのＰＥＳフィルターを通して濾過し、超遠心し、レンチウイルスを濃縮した。ウイルスペレットを予備冷却したＤＰＢＳでリンスした。ウイルスを適切にアリコートし、直ちに－８０℃で貯蔵した。フローサイトメトリーアッセイを介したｓｕｐＴ１細胞株に対する形質導入効率の測定により、ウイルス力価を決定した。
レンチウイルスの調製
ｐＣＭＶ－△Ｒ－８．４７及びｐＭＤ２．Ｇ（Ａｄｄｇｅｎｅ，カタログ番号１２２５９）を含むレンチウイルスパッケージングプラスミド混合物を、ＨＥＫ２９３細胞への添加前に、ポリエチレンイミンの存在下において、ＰＬＬＶ－ｈＥＦ１α－ＤＬＬ３ベクターと予め最適化された比（１：１：１：２）で予備混合した。一晩インキュベーション後、上清を収集した。ウイルス含有上清を０．４５μｍのＰＥＳフィルターを通して濾過し、超遠心し、レンチウイルスを濃縮した。ウイルスペレットを予備冷却したＤＰＢＳでリンスした。ウイルスを適切にアリコートし、直ちに－８０℃で貯蔵した。フローサイトメトリーアッセイを介したｓｕｐＴ１細胞株に対する形質導入効率の測定により、ウイルス力価を決定した。
Ｔリンパ球の収集及び形質導入
アフェレーシスにより、健常ドナーから白血球を収集した。Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ（商標）ＰＬＵＳ培地を使用し、製造業者のプロトコルに従い、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を単離した。汎Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ，カタログ番号１３０－０９６－５３５）を使用し、製造業者のプロトコルに従い、ヒトＴ細胞をＰＭＢＣから精製した。その後、ヒトＴ細胞活性化／拡大増殖キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ，カタログ番号１３０－０９１－４４１）により、製造業者のプロトコルに従い、精製したＴ細胞を４８時間予備活性化し、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ ＭＡＣＳｉＢｅａｄ粒子を１：２のビーズ対細胞比で添加した。予備活性化Ｔ細胞に７μｇ／ｍＬのポリブレンの存在下でレンチウイルスストックを形質導入した。次に、形質導入細胞を細胞培養インキュベーターに移し、好適な条件下で導入遺伝子を発現させた。
アフェレーシスにより、健常ドナーから白血球を収集した。Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ（商標）ＰＬＵＳ培地を使用し、製造業者のプロトコルに従い、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を単離した。汎Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ，カタログ番号１３０－０９６－５３５）を使用し、製造業者のプロトコルに従い、ヒトＴ細胞をＰＭＢＣから精製した。その後、ヒトＴ細胞活性化／拡大増殖キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ，カタログ番号１３０－０９１－４４１）により、製造業者のプロトコルに従い、精製したＴ細胞を４８時間予備活性化し、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ ＭＡＣＳｉＢｅａｄ粒子を１：２のビーズ対細胞比で添加した。予備活性化Ｔ細胞に７μｇ／ｍＬのポリブレンの存在下でレンチウイルスストックを形質導入した。次に、形質導入細胞を細胞培養インキュベーターに移し、好適な条件下で導入遺伝子を発現させた。
実施例５．ラクダ抗ＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞のインビトロ活性の評価
インビトロ細胞傷害性アッセイ
形質導入後６日目、形質導入Ｔ細胞を収集し、ＤＬＬ３発現腫瘍細胞株ＳＨＰ－７７と、２：１及び５：１のエフェクター（ＣＡＲ－Ｔ）対標的細胞比で２０時間コインキュベートした。すべてのアッセイにおいて、ＣＡＲ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞を参照として使用して、アッセイ変動を比較し、且つ／又は対照として作用させた。非形質導入Ｔ細胞（ＵｎＴ）を陰性対照として使用した。
インビトロ細胞傷害性アッセイ
形質導入後６日目、形質導入Ｔ細胞を収集し、ＤＬＬ３発現腫瘍細胞株ＳＨＰ－７７と、２：１及び５：１のエフェクター（ＣＡＲ－Ｔ）対標的細胞比で２０時間コインキュベートした。すべてのアッセイにおいて、ＣＡＲ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞を参照として使用して、アッセイ変動を比較し、且つ／又は対照として作用させた。非形質導入Ｔ細胞（ＵｎＴ）を陰性対照として使用した。
形質導入Ｔ細胞の細胞傷害性を乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）アッセイにより判定した。結果は、ＣＡＲ３ ＣＡＲ－Ｔ及び一部の抗ＤＬＬ３ ＣＡＲ－ＴがインビトロでＳＨＰ－７７細胞に対して強力な抗腫瘍活性を示す一方、ＵｎＴが目標の細胞殺傷効果を有しないことを示す（図２）。
ＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－α放出検出
加えて、インビトロ細胞傷害性アッセイからの上清を収集し、ＣＡＲ誘導性のサイトカイン放出、例えばインターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）及びＴＮＦ－α放出を評価した。図３Ａ及び図３Ｂに示す通り、ＣＡＲ３ ＣＡＲ－Ｔ及び一部の抗ＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔは、ＳＨＰ－７７により刺激され、ＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－αを産生した一方、ＵｎＴは、ＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－αをほとんど産生しなかった。ＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－α放出検出のプロトコルについては、ＣＩＳＢＩＯのヒトＴＮＦ－αキット及びＩＦＮ－γキットを参照可能である。
加えて、インビトロ細胞傷害性アッセイからの上清を収集し、ＣＡＲ誘導性のサイトカイン放出、例えばインターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）及びＴＮＦ－α放出を評価した。図３Ａ及び図３Ｂに示す通り、ＣＡＲ３ ＣＡＲ－Ｔ及び一部の抗ＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔは、ＳＨＰ－７７により刺激され、ＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－αを産生した一方、ＵｎＴは、ＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－αをほとんど産生しなかった。ＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－α放出検出のプロトコルについては、ＣＩＳＢＩＯのヒトＴＮＦ－αキット及びＩＦＮ－γキットを参照可能である。
長期刺激アッセイによるＣＡＲ－Ｔ拡大増殖
０日目、１×１０５個のＳＨＰ－７７細胞を２４ウェルプレートに蒔き、単層を確立した。１日目、形質導入Ｔ細胞を計数し、２×１０５個の生存ＣＡＲ＋Ｔ細胞をサイトカインの不在下で新しい培地中においてＳＨＰ－７７細胞の最上部に蒔いた。３日目、新しい１×１０５個のＳＨＰ－７７細胞単層をＣＡＲ－Ｔ細胞の最上部に蒔いた。４日目、各ウェルについて、生存ＣＡＲ－Ｔ細胞を計数した。同日、２×１０５個の、（少なくともこの量の細胞を有した）拡大増殖したウェルからのＣＡＲ＋Ｔ細胞を再播種し、１日目のように新しい単層を確立した。プロセスを反復し、３～４回刺激した。各刺激後の拡大増殖倍率を［４日目の生存ＣＡＲ＋Ｔ細胞］／２×１０５個（各刺激の１日目に蒔かれたＣＡＲ Ｔ細胞の量）として算出した。新しい各刺激で廃棄された細胞について正規化するため、［（拡大増殖倍率）×（拡大増殖倍率＋１）．．．］により累積拡大増殖倍率を決定した。
０日目、１×１０５個のＳＨＰ－７７細胞を２４ウェルプレートに蒔き、単層を確立した。１日目、形質導入Ｔ細胞を計数し、２×１０５個の生存ＣＡＲ＋Ｔ細胞をサイトカインの不在下で新しい培地中においてＳＨＰ－７７細胞の最上部に蒔いた。３日目、新しい１×１０５個のＳＨＰ－７７細胞単層をＣＡＲ－Ｔ細胞の最上部に蒔いた。４日目、各ウェルについて、生存ＣＡＲ－Ｔ細胞を計数した。同日、２×１０５個の、（少なくともこの量の細胞を有した）拡大増殖したウェルからのＣＡＲ＋Ｔ細胞を再播種し、１日目のように新しい単層を確立した。プロセスを反復し、３～４回刺激した。各刺激後の拡大増殖倍率を［４日目の生存ＣＡＲ＋Ｔ細胞］／２×１０５個（各刺激の１日目に蒔かれたＣＡＲ Ｔ細胞の量）として算出した。新しい各刺激で廃棄された細胞について正規化するため、［（拡大増殖倍率）×（拡大増殖倍率＋１）．．．］により累積拡大増殖倍率を決定した。
３回刺激後、異なるＣＡＲ－Ｔ構築物の拡大増殖倍率を算出した。図４でそれを示した通り、大部分のＣＡＲ－Ｔ構築物は、ＳＨＰ－７７腫瘍細胞による３回の刺激で、ＣＡＲ３ ＣＡＲ－Ｔよりも一層拡大増殖した。
実施例６．ＣＡＲ－Ｔ細胞媒介腫瘍増殖阻害によるラクダＣＡＲのインビボ有効性評価
ラクダＣＡＲの抗腫瘍活性をＳＨＰ－７７腫瘍モデルにおいて評価した。ＳＨＰ－７７細胞をＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに皮下移植し、７群に無作為化した（１群あたりマウス４匹、０日目）。群１：媒体（ＰＢＳのみ）；群２：ＵｎＴ（陰性対照）；群３：ＣＡＲ３；群４：ＣＡＳ６４３８０；群５：ＣＡＳ６４５１１；群６：ＣＡＳ６３９３１；群７：ＣＡＳ６３９９７。腫瘍が触知可能であったとき（１００ｍｍ３）、ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＵｎＴ細胞又は媒体（ＰＢＳのみ）による処置を開始し、それらの腫瘍体積が約３０００ｍｍ３に達したとき、マウスを安楽死させた。腫瘍体積を週２回測定した。ＣＡＲ－Ｔ細胞に１×１０６個のＣＡＲ陽性Ｔ細胞／マウスを静脈内投与した。腫瘍細胞移植後、マウス及び腫瘍を約２１日間監視した。
ラクダＣＡＲの抗腫瘍活性をＳＨＰ－７７腫瘍モデルにおいて評価した。ＳＨＰ－７７細胞をＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに皮下移植し、７群に無作為化した（１群あたりマウス４匹、０日目）。群１：媒体（ＰＢＳのみ）；群２：ＵｎＴ（陰性対照）；群３：ＣＡＲ３；群４：ＣＡＳ６４３８０；群５：ＣＡＳ６４５１１；群６：ＣＡＳ６３９３１；群７：ＣＡＳ６３９９７。腫瘍が触知可能であったとき（１００ｍｍ３）、ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＵｎＴ細胞又は媒体（ＰＢＳのみ）による処置を開始し、それらの腫瘍体積が約３０００ｍｍ３に達したとき、マウスを安楽死させた。腫瘍体積を週２回測定した。ＣＡＲ－Ｔ細胞に１×１０６個のＣＡＲ陽性Ｔ細胞／マウスを静脈内投与した。腫瘍細胞移植後、マウス及び腫瘍を約２１日間監視した。
図５に示す通り、すべての選択されたラクダＣＡＲがこの動物腫瘍モデルにおいて抗腫瘍活性を示した。
実施例７．ラクダｓｄＡｂのヒト化
ＣＤＲ移植技術（例えば、米国特許第５，２２５，５３９号明細書を参照されたい）を使用し、選択したラクダｓｄＡｂ（配列番号２７９、２９４、２９７、３１２）をヒト化した。即ち、ラクダｓｄＡｂ配列を、構造バイオインフォマティクス研究共同体（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）（ＲＣＳＢ）タンパク質データバンクにおいて利用可能なものと比較した。各ラクダｓｄＡｂの相同性モデルを最も近いＶＨ構造に基づいて作製した。モデル構造から、ＣＤＲの近傍に存在するか又は分子の内側に埋没した残基（即ち側鎖溶媒のアクセス可能な１５％未満の表面積を有する）を同定した。
ＣＤＲ移植技術（例えば、米国特許第５，２２５，５３９号明細書を参照されたい）を使用し、選択したラクダｓｄＡｂ（配列番号２７９、２９４、２９７、３１２）をヒト化した。即ち、ラクダｓｄＡｂ配列を、構造バイオインフォマティクス研究共同体（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）（ＲＣＳＢ）タンパク質データバンクにおいて利用可能なものと比較した。各ラクダｓｄＡｂの相同性モデルを最も近いＶＨ構造に基づいて作製した。モデル構造から、ＣＤＲの近傍に存在するか又は分子の内側に埋没した残基（即ち側鎖溶媒のアクセス可能な１５％未満の表面積を有する）を同定した。
その後、各ラクダｓｄＡｂ配列をＮＣＢＩヒト生殖系列Ｖ遺伝子データベースに対してＢＬＡＳＴ検索し、ｓｄＡｂに対して最高の同一性を有するヒトＶＨ生殖系列配列（即ちヒトアクセプター）を同定した（例えば、Ｆｏｏｔｅ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：４８７－４９９（１９９２）；Ｍｏｒｅａ Ｖ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０：２６７－２７９（２０００）；Ｃｈｏｔｈｉａ Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８６：６５１－６６３（１９８５）を参照されたい）。ＣＤＲ移植手法では、ヒトアクセプターのＣＤＲをラクダｓｄＡｂのＣＤＲで置換し、ストレートグラフト（ｓｔｒａｉｇｈｔ－ｇｒａｆｔ）配列が産生された。ストレートグラフト抗体は、通常、結合活性を失い、それは、抗体の活性にとって決定的であるフレームワーク残基を非ヒト残基で置換することにより回復される必要があった。ＣＤＲの近傍に存在するか又は分子の内側に埋没したアミノ酸残基は、通常、抗体の活性及び構造にとって重要であり、そのため、潜在的な逆突然変異部位である必要があった。一連のヒト化変異体は、この方法を用いて設計した。ヒト化変異体のＣＤＲアミノ酸配列を表５に示した。ヒト化変異体の完全長アミノ酸配列を表６に示した。ＣＤＲに下線を引いた。
（表５）抗ＤＬＬ３ヒト化ｓｄＡｂのＣＤＲ配列
（表６）抗ＤＬＬ３ヒト化ｓｄＡｂのアミノ酸配列
ラクダ及びヒト化ｓｄＡｂ配列をヒトＩｇＧ１ヒンジ及びＦｃと融合し、キメラ及びヒト化ＨＣＡｂ配列が得られた。これらのＨＣＡｂをコードするＤＮＡを合成し、ｐＴＴ５ベクターに挿入した。ＨＣＡｂ発現プラスミドを使用して、ＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトした。培地に分泌された粗ＨＣＡｂタンパク質に対して、以下のようなＳＰＲ親和性測定を施した：即ち、捕捉する抗体の抗ヒトＦｃ ｐＡｂ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、ＥＤＣ活性化アミンカップリング化学を用いてＢｉａｃｏｒｅ（商標）ＣＭ５チップ上に固定化し、約６，０００ＲＵにした。目的のＨＣＡｂをセンサーチップ表面上に３００秒間捕捉した。ヒトＤＬＬ３（ＡｄｉｐｏＧｅｎ，ＡＧ－４０Ｂ－０１５１）を一連の増加濃度でセンサーチップ表面上に流した。会合及び解離相を監視した。１０ｍＭグリシン－ＨＣｌ、ｐＨ２．０の緩衝液を使用して、捕捉された抗体及び抗原をサイクル間で除去し、抗原に対する新しい結合表面を確認した。１：１の結合モデルを用いて、得られたセンサーグラムを全体的にフィットさせ、オン及びオフレート（それぞれｋａ及びｋｄ）並びに親和性（ＫＤ）を計算した。
一部のヒト化ｓｄＡｂの結合親和性を測定し、元のラクダｓｄＡｂの場合と比較した（表７）。ヒト化抗体の大部分がラクダｓｄＡｂの結合親和性を保持した。本実施例は、本発明者らの標準プロトコルを用いたｓｄＡｂのヒト化が成功であることを示した。ｓｄＡｂの大部分がヒト化後にそれらの結合親和性を保持した。
ｓｃＦｖは、上記と同じ手順でアッセイすると、同等のＫＤ値を有する（表７中のＡＳ５６７８８及びＡＳ５６７０４）。
（表７）ラクダ及びヒト化抗体並びにｓｃＦｖの一価結合親和性
実施例８．単一特異性ヒト化ＣＡＲの作製
抗ＤＬＬ３ヒト化ｓｄＡｂのアミノ酸配列を上の表６中に提示し、抗ＤＬＬ３ヒト化ｓｄＡｂの核酸配列を配列番号４４９～４６１に列記した。表６中のヒト化ｓｄＡｂ及び追加の配列を使用して、完全ＣＡＲ構築物（配列番号４８５～４９４）を作製した。完全長ＣＡＲは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号４６５）、表６中に提示したＤＬＬ３結合ドメイン（ヒト化ｓｄＡｂ）、ＣＤ８αヒンジドメイン（配列番号４６６）、ＣＤ８α膜貫通ドメイン（配列番号４６７）、ＣＤ１３７細胞内ドメイン（配列番号４６８）又はＣＤ２８細胞内ドメイン（配列番号４６９）及びＣＤ３ζ細胞質ドメイン（配列番号４７０）を有する。ＣＡＲ構築物の概略図を図１に示す。次に、ＣＡＲ断片をコードする核酸をレンチウイルスベクターにクローン化し、発現のためのヒトＥＦ１αプロモーターを使用して、単一コーディングフレームで完全長ＣＡＲ構築物を作出した。得られたＣＡＲ骨格ベクターを「ＰＬＬＶ－ｈＥＦ１α－ＤＬＬ３」と名付けた。
抗ＤＬＬ３ヒト化ｓｄＡｂのアミノ酸配列を上の表６中に提示し、抗ＤＬＬ３ヒト化ｓｄＡｂの核酸配列を配列番号４４９～４６１に列記した。表６中のヒト化ｓｄＡｂ及び追加の配列を使用して、完全ＣＡＲ構築物（配列番号４８５～４９４）を作製した。完全長ＣＡＲは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号４６５）、表６中に提示したＤＬＬ３結合ドメイン（ヒト化ｓｄＡｂ）、ＣＤ８αヒンジドメイン（配列番号４６６）、ＣＤ８α膜貫通ドメイン（配列番号４６７）、ＣＤ１３７細胞内ドメイン（配列番号４６８）又はＣＤ２８細胞内ドメイン（配列番号４６９）及びＣＤ３ζ細胞質ドメイン（配列番号４７０）を有する。ＣＡＲ構築物の概略図を図１に示す。次に、ＣＡＲ断片をコードする核酸をレンチウイルスベクターにクローン化し、発現のためのヒトＥＦ１αプロモーターを使用して、単一コーディングフレームで完全長ＣＡＲ構築物を作出した。得られたＣＡＲ骨格ベクターを「ＰＬＬＶ－ｈＥＦ１α－ＤＬＬ３」と名付けた。
実施例９．ヒト化抗ＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞のインビトロ活性の評価
実施例４に記載の手順と同様に、腫瘍細胞のＣＡＲ－Ｔ細胞媒介性殺傷、サイトカイン放出及び長期刺激アッセイを介してヒト化ＣＡＲの効力を評価した。
実施例４に記載の手順と同様に、腫瘍細胞のＣＡＲ－Ｔ細胞媒介性殺傷、サイトカイン放出及び長期刺激アッセイを介してヒト化ＣＡＲの効力を評価した。
インビトロ細胞傷害性アッセイ
結果を図６Ａ～６Ｄに示した。本発明者らのヒト化ＣＡＲ－Ｔは、インビトロで優位な抗腫瘍有効性を示した。
結果を図６Ａ～６Ｄに示した。本発明者らのヒト化ＣＡＲ－Ｔは、インビトロで優位な抗腫瘍有効性を示した。
ＩＦＮ－γ放出アッセイ
加えて、インビトロ細胞傷害性アッセイからの上清を収集し、ＣＡＲ誘導サイトカイン放出、例えばインターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）及び腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ－α）放出を評価した。図７Ａ及び図７Ｂに示す通り、ＣＡＲ３ ＣＡＲ－Ｔ及び一部の抗ＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔは、ＳＨＰ－７７により刺激され、ＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－αを産生した一方、ＵｎＴは、ＩＦＮ－γ又はＴＮＦ－αをほとんど産生しなかった。
加えて、インビトロ細胞傷害性アッセイからの上清を収集し、ＣＡＲ誘導サイトカイン放出、例えばインターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）及び腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ－α）放出を評価した。図７Ａ及び図７Ｂに示す通り、ＣＡＲ３ ＣＡＲ－Ｔ及び一部の抗ＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔは、ＳＨＰ－７７により刺激され、ＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－αを産生した一方、ＵｎＴは、ＩＦＮ－γ又はＴＮＦ－αをほとんど産生しなかった。
長期刺激アッセイによるＣＡＲＴ拡大増殖
０日目、１×１０５個のＳＨＰ－７７細胞を２４ウェルプレートに蒔き、単層を確立した。１日目、ＣＡＲ－Ｔ細胞を計数し、２×１０５個の生存ＣＡＲ＋Ｔ細胞をサイトカインの不在下で新しい培地中においてＳＨＰ－７７細胞の最上部に蒔いた。３日目、新しい１×１０５個のＮＣＩ－Ｈ８２細胞単層をＣＡＲ－Ｔ細胞の最上部に蒔いた。４日目、各ウェルについて、生存ＣＡＲ－Ｔ細胞を計数した。同日、２×１０５個の、（少なくともこの量の細胞を有する）拡大増殖したウェルからのＣＡＲ＋Ｔ細胞を再播種し、１日目のように新しい単層を確立した。プロセスを反復し、３～４回刺激した。各刺激後の拡大増殖倍率を［４日目の生存ＣＡＲ＋Ｔ細胞］／２×１０５個（各刺激の１日目に蒔かれたＣＡＲ－Ｔ細胞の量）として算出した。新しい各刺激で廃棄された細胞について正規化するため、［（拡大増殖倍率）×（拡大増殖倍率＋１）．．．］により累積拡大増殖倍率を決定した。
０日目、１×１０５個のＳＨＰ－７７細胞を２４ウェルプレートに蒔き、単層を確立した。１日目、ＣＡＲ－Ｔ細胞を計数し、２×１０５個の生存ＣＡＲ＋Ｔ細胞をサイトカインの不在下で新しい培地中においてＳＨＰ－７７細胞の最上部に蒔いた。３日目、新しい１×１０５個のＮＣＩ－Ｈ８２細胞単層をＣＡＲ－Ｔ細胞の最上部に蒔いた。４日目、各ウェルについて、生存ＣＡＲ－Ｔ細胞を計数した。同日、２×１０５個の、（少なくともこの量の細胞を有する）拡大増殖したウェルからのＣＡＲ＋Ｔ細胞を再播種し、１日目のように新しい単層を確立した。プロセスを反復し、３～４回刺激した。各刺激後の拡大増殖倍率を［４日目の生存ＣＡＲ＋Ｔ細胞］／２×１０５個（各刺激の１日目に蒔かれたＣＡＲ－Ｔ細胞の量）として算出した。新しい各刺激で廃棄された細胞について正規化するため、［（拡大増殖倍率）×（拡大増殖倍率＋１）．．．］により累積拡大増殖倍率を決定した。
３回刺激後、異なるＣＡＲ－Ｔ構築物の拡大増殖倍率を算出した。図８でそれを示した通り、大部分のＣＡＲ－Ｔ構築物は、ＳＨＰ－７７腫瘍細胞による３回の刺激で、ＣＡＲ３ ＣＡＲ－Ｔよりも一層拡大増殖した。
実施例１０．ＣＡＲ－Ｔ細胞媒介腫瘍増殖阻害によるヒト化ＣＡＲのインビボ有効性評価
ヒト化ＣＡＲの抗腫瘍活性をＳＨＰ－７７腫瘍モデルにおいて評価した。ＳＨＰ－７７細胞をＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに皮下移植し、９群：媒体（ＰＢＳのみ）、ＵｎＴ（陰性対照）、ＣＡＲ３、ＣＡＳ６４３８０、ＣＡＳ６４３８０ＶＨ５、ＣＡＳ６４５１１、ＣＡＳ６４５１１ＶＨ５、ＣＡＳ６３９９７及びＣＡＳ６３９９７ＶＨ５に無作為化した（１群あたりマウス４匹、０日目）。腫瘍が触知可能であったとき（１００ｍｍ３）、ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＵｎＴ細胞又は媒体（ＰＢＳのみ）による処置を開始し、それらの腫瘍体積が約３０００ｍｍ３に達したとき、マウスを安楽死させた。腫瘍体積を週２回測定した。ＣＡＲ－Ｔ細胞に０．２×１０６個のＣＡＲ陽性Ｔ細胞／マウスを静脈内投与した。腫瘍細胞移植後、マウス及び腫瘍を約２１日間監視した。
ヒト化ＣＡＲの抗腫瘍活性をＳＨＰ－７７腫瘍モデルにおいて評価した。ＳＨＰ－７７細胞をＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに皮下移植し、９群：媒体（ＰＢＳのみ）、ＵｎＴ（陰性対照）、ＣＡＲ３、ＣＡＳ６４３８０、ＣＡＳ６４３８０ＶＨ５、ＣＡＳ６４５１１、ＣＡＳ６４５１１ＶＨ５、ＣＡＳ６３９９７及びＣＡＳ６３９９７ＶＨ５に無作為化した（１群あたりマウス４匹、０日目）。腫瘍が触知可能であったとき（１００ｍｍ３）、ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＵｎＴ細胞又は媒体（ＰＢＳのみ）による処置を開始し、それらの腫瘍体積が約３０００ｍｍ３に達したとき、マウスを安楽死させた。腫瘍体積を週２回測定した。ＣＡＲ－Ｔ細胞に０．２×１０６個のＣＡＲ陽性Ｔ細胞／マウスを静脈内投与した。腫瘍細胞移植後、マウス及び腫瘍を約２１日間監視した。
図９Ａ～９Ｊに示す通り、ベンチマークＣＡＲ３と比較して、ＣＡＳ６４３８０ＶＨ５及びＣＡＳ６３９９７ＶＨ５がこの動物モデルにおいて優位な抗腫瘍活性を示した。
これらのヒト化ＣＡＲの抗腫瘍活性は、それらのインビトロ細胞殺傷効力と相関することが認められなかった。
本明細書中に記載のいくつかのアミノ酸配列及び核酸配列を以下に列記する。
ラクダｓｄＡｂ核酸配列
配列番号３６８（ラクダｓｄＡｂ ＡＳ６３９３０核酸配列）
配列番号３６９（ラクダｓｄＡｂ ＡＳ６３９３２核酸配列）
配列番号３７０（ラクダｓｄＡｂ ＡＳ６３９５１核酸配列）
配列番号３７１（ラクダｓｄＡｂ ＡＳ６３９８４核酸配列）
配列番号３７２（ラクダｓｄＡｂ ＡＳ６３９８７核酸配列）
配列番号３７３（ラクダｓｄＡｂ ＡＳ６３９９７核酸配列）
配列番号３７４（ラクダｓｄＡｂ ＡＳ６４０４７核酸配列）
配列番号３７５（ラクダｓｄＡｂ ＡＳ６４０５２核酸配列）
配列番号３７６（ラクダｓｄＡｂ ＡＳ６４０６２核酸配列）
配列番号３７７（ラクダｓｄＡｂ ＡＳ６４０７２核酸配列）
配列番号３７８（ラクダｓｄＡｂ ＡＳ６４０９７核酸配列）
配列番号３７９（ラクダｓｄＡｂ ＡＳ６４１１４核酸配列）
配列番号３８０（ラクダｓｄＡｂ ＡＳ６４１２３核酸配列）
配列番号３８１（ラクダｓｄＡｂ ＡＳ６４１３０核酸配列）
配列番号３８２（ラクダｓｄＡｂ ＡＳ６４１３７核酸配列）
配列番号３８３（ラクダｓｄＡｂ ＡＳ６４１４２核酸配列）
配列番号３８４（ラクダｓｄＡｂ ＡＳ６４１５４核酸配列）
配列番号３８５（ラクダｓｄＡｂ ＡＳ６４１６０核酸配列）
配列番号３８６（ラクダｓｄＡｂ ＡＳ６４２２８核酸配列）
配列番号３８７（ラクダｓｄＡｂ ＡＳ６４３００核酸配列）
配列番号３８８（ラクダｓｄＡｂ ＡＳ６４３８０核酸配列）
配列番号３８９（ラクダｓｄＡｂ ＡＳ６４３９５核酸配列）
配列番号３９０（ラクダｓｄＡｂ ＡＳ６４４４３核酸配列）
配列番号３９１（ラクダｓｄＡｂ ＡＳ６４５１１核酸配列）
配列番号３９２（ラクダｓｄＡｂ ＡＳ６４５３６核酸配列）
配列番号３９３（ラクダｓｄＡｂ ＡＳ６４５９７核酸配列）
配列番号３９４（ラクダｓｄＡｂ ＡＳ６４６１７核酸配列）
配列番号３９５（ラクダｓｄＡｂ ＡＳ６４６３４核酸配列）
配列番号３９６（ラクダｓｄＡｂ ＡＳ６９４９８核酸配列）
配列番号３９７（ラクダｓｄＡｂ ＡＳ６９５００核酸配列）
配列番号３９８（ラクダｓｄＡｂ ＡＳ６９５２７核酸配列）
配列番号３９９（ラクダｓｄＡｂ ＡＳ６８２８０核酸配列）
配列番号４００（ラクダｓｄＡｂ ＡＳ６８３５５核酸配列）
配列番号４０１（ラクダｓｄＡｂ ＡＳ６９４４３核酸配列）
配列番号４０２（ラクダｓｄＡｂ ＡＳ７５３７６核酸配列）
配列番号４０３（ラクダｓｄＡｂ ＡＳ７５３８７核酸配列）
配列番号４０４（ラクダｓｄＡｂ ＡＳ７５６９５核酸配列）
配列番号４０５（ラクダｓｄＡｂ ＡＳ７６１６９核酸配列）
配列番号４０６（ラクダｓｄＡｂ ＡＳ６３９３１核酸配列）
配列番号４０７（ラクダｓｄＡｂ ＡＳ６３９３７核酸配列）
配列番号４０８（ラクダｓｄＡｂ ＡＳ６３９４８核酸配列）
配列番号４０９（ラクダｓｄＡｂ ＡＳ６３９５６核酸配列）
配列番号４１０（ラクダｓｄＡｂ ＡＳ６３９６５核酸配列）
配列番号４１１（ラクダｓｄＡｂ ＡＳ６３９９３核酸配列）
配列番号４１２（ラクダｓｄＡｂ ＡＳ６３９９９核酸配列）
配列番号４１３（ラクダｓｄＡｂ ＡＳ６４００６核酸配列）
配列番号４１４（ラクダｓｄＡｂ ＡＳ６４０５７核酸配列）
配列番号４１５（ラクダｓｄＡｂ ＡＳ６４０６０核酸配列）
配列番号４１６（ラクダｓｄＡｂ ＡＳ６４０７１核酸配列）
配列番号４１７（ラクダｓｄＡｂ ＡＳ６４０９３核酸配列）
配列番号４１８（ラクダｓｄＡｂ ＡＳ６４１１８核酸配列）
配列番号４１９（ラクダｓｄＡｂ ＡＳ６４１２０核酸配列）
配列番号４２０（ラクダｓｄＡｂ ＡＳ６４１２４核酸配列）
配列番号４２１（ラクダｓｄＡｂ ＡＳ６４１３５核酸配列）
配列番号４２２（ラクダｓｄＡｂ ＡＳ６４１６３核酸配列）
配列番号４２３（ラクダｓｄＡｂ ＡＳ６４１８２核酸配列）
配列番号４２４（ラクダｓｄＡｂ ＡＳ６４１８３核酸配列）
配列番号４２５（ラクダｓｄＡｂ ＡＳ６４２０７核酸配列）
配列番号４２６（ラクダｓｄＡｂ ＡＳ６４２７６核酸配列）
配列番号４２７（ラクダｓｄＡｂ ＡＳ６４３３６核酸配列）
配列番号４２８（ラクダｓｄＡｂ ＡＳ６４３４６核酸配列）
配列番号４２９（ラクダｓｄＡｂ ＡＳ６４４２０核酸配列）
配列番号４３０（ラクダｓｄＡｂ ＡＳ６４４７３核酸配列）
配列番号４３１（ラクダｓｄＡｂ ＡＳ６４４７５核酸配列）
配列番号４３２（ラクダｓｄＡｂ ＡＳ６４５１３核酸配列）
配列番号４３３（ラクダｓｄＡｂ ＡＳ６４５６２核酸配列）
配列番号４３４（ラクダｓｄＡｂ ＡＳ６４５８３核酸配列）
配列番号４３５（ラクダｓｄＡｂ ＡＳ６４５９４核酸配列）
配列番号４３６（ラクダｓｄＡｂ ＡＳ６４６０５核酸配列）
配列番号４３７（ラクダｓｄＡｂ ＡＳ６４６０６核酸配列）
配列番号４３８（ラクダｓｄＡｂ ＡＳ６８１２１核酸配列）
配列番号４３９（ラクダｓｄＡｂ ＡＳ６８１７０核酸配列）
配列番号４４０（ラクダｓｄＡｂ ＡＳ６３９６４核酸配列）
配列番号４４１（ラクダｓｄＡｂ ＡＳ６４１１６核酸配列）
配列番号４４２（ラクダｓｄＡｂ ＡＳ６８２７０核酸配列）
配列番号４４３（ラクダｓｄＡｂ ＡＳ６８３２０核酸配列）
配列番号４４４（ラクダｓｄＡｂ ＡＳ６８３５１核酸配列）
配列番号４４５（ラクダｓｄＡｂ ＡＳ７５３７８核酸配列）
配列番号４４６（ラクダｓｄＡｂ ＡＳ７５３８３核酸配列）
配列番号４４７（ラクダｓｄＡｂ ＡＳ７５７５１核酸配列）
配列番号４４８（ラクダｓｄＡｂ ＡＳ７６４２２核酸配列）
ラクダｓｄＡｂ核酸配列
配列番号３６８（ラクダｓｄＡｂ ＡＳ６３９３０核酸配列）
ヒト化ラクダｓｄＡｂ 核酸配列
配列番号４４９（ヒト化ｓｄＡｂ ＡＳ６４３８０ＶＨ４核酸配列）
配列番号４５０（ヒト化ｓｄＡｂ ＡＳ６４３８０ＶＨ５核酸配列）
配列番号４５１（ヒト化ｓｄＡｂ ＡＳ６４３８０ＶＨ６核酸配列）
配列番号４５２（ヒト化ｓｄＡｂ ＡＳ６４３８０ＶＨ７核酸配列）
配列番号４５３（ヒト化ｓｄＡｂ ＡＳ６４５１１ＶＨ４核酸配列）
配列番号４５４（ヒト化ｓｄＡｂ ＡＳ６４５１１ＶＨ５核酸配列）
配列番号４５５（ヒト化ｓｄＡｂ ＡＳ６４５１１ＶＨ６核酸配列）
配列番号４５６（ヒト化ｓｄＡｂ ＡＳ６３９３１ＶＨ４核酸配列）
配列番号４５７（ヒト化ｓｄＡｂ ＡＳ６３９３１ＶＨ５核酸配列）
配列番号４５８（ヒト化ｓｄＡｂ ＡＳ６３９３１ＶＨ６核酸配列）
配列番号４５９（ヒト化ｓｄＡｂ ＡＳ６３９９７ＶＨ４核酸配列）
配列番号４６０（ヒト化ｓｄＡｂ ＡＳ６３９９７ＶＨ５核酸配列）
配列番号４６１（ヒト化ｓｄＡｂ ＡＳ６３９９７ＶＨ６核酸配列）
配列番号４６２（リンカーアミノ酸配列）
配列番号４６３（リンカーアミノ酸配列）
配列番号４６４（リンカーアミノ酸配列）
配列番号４６５（ＣＤ８αシグナルペプチドアミノ酸配列）
配列番号４６６（ＣＤ８αヒンジアミノ酸配列）
配列番号４６７（ＣＤ８α膜貫通ドメインアミノ酸配列）
配列番号４６８（４－１ＢＢ細胞内ドメインアミノ酸配列）
配列番号４６９（ＣＤ２８細胞内ドメインアミノ酸配列）
配列番号４７０（ＣＤ３ζ細胞内ドメインアミノ酸配列）
配列番号４７１（Ｆ２Ａエレメントアミノ酸配列）
配列番号４７２（Ｐ２Ａエレメントアミノ酸配列）
配列番号４７３（ＣＡＲ３抗ＤＬＬ３ ｓｃＦｖアミノ酸配列）
配列番号４７４（ＣＤ２８膜貫通ドメインアミノ酸配列）
配列番号４７５（ＣＤ２８ヒンジ）
配列番号４４９（ヒト化ｓｄＡｂ ＡＳ６４３８０ＶＨ４核酸配列）
ラクダ抗ＤＬＬ３ ＣＡＲ配列
配列番号４７６（ＣＡＳ６３９９７）
配列番号４７７（ＣＡＳ６４３８０）
配列番号４７８（ＣＡＳ６４５１１）
配列番号４７９（ＣＡＳ６４６１７）
配列番号４８０（ＣＡＳ６９４４３）
配列番号４８１（ＣＡＳ６３９３１）
配列番号４８２（ＣＡＳ６４０４７）
配列番号４８３（ＣＡＳ６４０５２）
配列番号４８４（ＣＡＳ６４０６２）
配列番号４７６（ＣＡＳ６３９９７）
ヒト化抗ＤＬＬ３ ＣＡＲ配列
配列番号４８５（ＣＡＳ６４３８０ＶＨ４）
配列番号４８６（ＣＡＳ６４３８０ＶＨ５）
配列番号４８７（ＣＡＳ６４３８０ＶＨ６）
配列番号４８８（ＣＡＳ６４３８０ＶＨ７）
配列番号４８９（ＣＡＳ６４５１１ＶＨ４）
配列番号４９０（ＣＡＳ６４５１１ＶＨ５）
配列番号４９１（ＣＡＳ６４５１１ＶＨ６）
配列番号４９２（ＣＡＳ６３９９７ＶＨ４）
配列番号４９３（ＣＡＳ６３９９７ＶＨ５）
配列番号４９４（ＣＡＳ６３９９７ＶＨ６）
配列番号４８５（ＣＡＳ６４３８０ＶＨ４）
抗ＤＬＬ３ヒトｓｃＦｖ ＶＬ及びＶＨドメイン核酸配列
配列番号５１１（抗ＤＬＬ３ヒトｓｃＦｖ ＡＳ５６７０４のＶＬドメインにおける核酸配列）
配列番号５１２（抗ＤＬＬ３ヒトｓｃＦｖ ＡＳ５６７０４のＶＨドメインにおける核酸配列）
配列番号５１３（抗ＤＬＬ３ヒトｓｃＦｖ ＡＳ５６７８８のＶＬドメインにおける核酸配列）
配列番号５１４（抗ＤＬＬ３ヒトｓｃＦｖ ＡＳ５６７８８のＶＨドメインにおける核酸配列）
配列番号５１１（抗ＤＬＬ３ヒトｓｃＦｖ ＡＳ５６７０４のＶＬドメインにおける核酸配列）
ヒト抗ＤＬＬ３ ｓｃＦｖ ＣＡＲ配列
配列番号５１５（ＣＡＳ５６７０４）
配列番号５１６（ＣＡＳ５６７８８）
配列番号５１５（ＣＡＳ５６７０４）
抗ＤＬＬ３ベンチマークＣＡＲ
配列番号５１７（１Ｈ２．１アミノ酸配列）
配列番号５１７（１Ｈ２．１アミノ酸配列）
実施例１１．ヒト化抗ＤＬＬ３タンデムＣＡＲ－Ｔ細胞のインビトロ活性の評価
ＣＡＲ－Ｔの抗腫瘍有効性を改善するため、本発明者らは、３つのタンデムＣＡＲ（Ｔ１、Ｔ２及びＴ３）を構築した。タンデムＣＡＲのアミノ酸配列を配列番号５１８～５２０に提示した。抗ＤＬＬ３ヒト化ｓｄＡｂ断片のアミノ酸配列を配列番号３５６（ＡＳ６４３８０ＶＨ５）及び配列番号３６６（ＡＳ６３９９７ＶＨ５）に提示した。抗ＤＬＬ３ ＣＡＲである１Ｈ２．１（配列番号５１７、例えば国際公開第２０１９２００００７号パンフレットを参照されたい）を使用して、参照としてのＣＡＲ構築物も作製した。完全長ＣＡＲは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号４６５）、配列番号３５６（ＡＳ６４３８０ＶＨ５）及び配列番号３６６（ＡＳ６３９９７ＶＨ５）で提示するＤＬＬ３結合ドメインｓｄＡｂ、ＣＤ８αヒンジドメイン（配列番号４６６）、ＣＤ８α膜貫通ドメイン（配列番号４６７）、ＣＤ１３７細胞内ドメイン（配列番号４６８）又はＣＤ２８細胞内ドメイン（配列番号４６９）及びＣＤ３ζ細胞内ドメイン（配列番号４７０）を有する。ＣＡＲ構築物の概略図を図１０Ａに示す。Ｔ１の場合、ｓｄＡｂ１及びｓｄＡｂ２の両方は、ＡＳ６４３８０ＶＨ５であった。Ｔ２の場合、ｓｄＡｂ１及びｓｄＡｂ２の両方は、ＡＳ６３９９７ＶＨ５であった。Ｔ３の場合、ｓｄＡｂ１及びｓｄＡｂ２は、それぞれＡＳ６３９９７ＶＨ５及びＡＳ６４３８０ＶＨ５であった。次に、ＣＡＲ断片をコードする核酸をレンチウイルスベクターにクローン化し、発現のためのヒトＥＦ１αプロモーターを用いて、単一コーディングフレームで完全長ＣＡＲ構築物を作出した。
ＣＡＲ－Ｔの抗腫瘍有効性を改善するため、本発明者らは、３つのタンデムＣＡＲ（Ｔ１、Ｔ２及びＴ３）を構築した。タンデムＣＡＲのアミノ酸配列を配列番号５１８～５２０に提示した。抗ＤＬＬ３ヒト化ｓｄＡｂ断片のアミノ酸配列を配列番号３５６（ＡＳ６４３８０ＶＨ５）及び配列番号３６６（ＡＳ６３９９７ＶＨ５）に提示した。抗ＤＬＬ３ ＣＡＲである１Ｈ２．１（配列番号５１７、例えば国際公開第２０１９２００００７号パンフレットを参照されたい）を使用して、参照としてのＣＡＲ構築物も作製した。完全長ＣＡＲは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号４６５）、配列番号３５６（ＡＳ６４３８０ＶＨ５）及び配列番号３６６（ＡＳ６３９９７ＶＨ５）で提示するＤＬＬ３結合ドメインｓｄＡｂ、ＣＤ８αヒンジドメイン（配列番号４６６）、ＣＤ８α膜貫通ドメイン（配列番号４６７）、ＣＤ１３７細胞内ドメイン（配列番号４６８）又はＣＤ２８細胞内ドメイン（配列番号４６９）及びＣＤ３ζ細胞内ドメイン（配列番号４７０）を有する。ＣＡＲ構築物の概略図を図１０Ａに示す。Ｔ１の場合、ｓｄＡｂ１及びｓｄＡｂ２の両方は、ＡＳ６４３８０ＶＨ５であった。Ｔ２の場合、ｓｄＡｂ１及びｓｄＡｂ２の両方は、ＡＳ６３９９７ＶＨ５であった。Ｔ３の場合、ｓｄＡｂ１及びｓｄＡｂ２は、それぞれＡＳ６３９９７ＶＨ５及びＡＳ６４３８０ＶＨ５であった。次に、ＣＡＲ断片をコードする核酸をレンチウイルスベクターにクローン化し、発現のためのヒトＥＦ１αプロモーターを用いて、単一コーディングフレームで完全長ＣＡＲ構築物を作出した。
配列番号５１８（Ｔ１アミノ酸配列）
配列番号５１９（Ｔ２アミノ酸配列）
配列番号５２０（Ｔ３アミノ酸配列）
インビトロ細胞傷害性アッセイ
形質導入後９日目、形質導入Ｔ細胞を収集し、ＤＬＬ３発現腫瘍細胞株（ＤＬＬ３が高発現であるＳＨＰ－７７、ＤＬＬ３が中発現であるＮＣＩ－Ｈ８２及びＤＬＬ３が低発現であるＮＣＩ－Ｈ２１７１）及びＤＬＬ３陰性発現細胞株（ＮＣＩ－Ｈ４６０及びＨＥＫ２９３）と０．５：１及び２：１のエフェクター（ＣＡＲ－Ｔ）対標的細胞比で２２時間コインキュベートした。すべてのアッセイにおいて、ＣＡＲ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞を参照として使用して、アッセイ変動を比較し、且つ／又は対照として作用させた。非形質導入Ｔ細胞（ＵｎＴ）を陰性対照として使用した。
形質導入後９日目、形質導入Ｔ細胞を収集し、ＤＬＬ３発現腫瘍細胞株（ＤＬＬ３が高発現であるＳＨＰ－７７、ＤＬＬ３が中発現であるＮＣＩ－Ｈ８２及びＤＬＬ３が低発現であるＮＣＩ－Ｈ２１７１）及びＤＬＬ３陰性発現細胞株（ＮＣＩ－Ｈ４６０及びＨＥＫ２９３）と０．５：１及び２：１のエフェクター（ＣＡＲ－Ｔ）対標的細胞比で２２時間コインキュベートした。すべてのアッセイにおいて、ＣＡＲ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞を参照として使用して、アッセイ変動を比較し、且つ／又は対照として作用させた。非形質導入Ｔ細胞（ＵｎＴ）を陰性対照として使用した。
形質導入Ｔ細胞の細胞傷害性を乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）アッセイにより判定した。結果は、ＣＡＲ３ ＣＡＲ－Ｔ及び一部の抗ＤＬＬ３タンデムＣＡＲ－ＴがインビトロでＳＨＰ－７７細胞に対して強力な抗腫瘍活性を示す一方、ＵｎＴが目標の細胞殺傷効果を有せず（図１１Ａ～Ｃ）、ＤＬＬ３陰性発現細胞（ＮＣＩ－Ｈ４６０及びＨＥＫ２９３）が細胞傷害性を誘導しなかった（図１１Ｄ～Ｅ）ことを示す。ＣＡＲ３に加えて、本発明者らは、Ｔ３及び１Ｈ２．１のＳＨＰ－７７細胞に対するインビトロ細胞傷害性も比較した。結果は、Ｔ３が短期刺激において同等の又はそれほど強力でない細胞殺傷活性を有したことを示す（図１１Ｖ）。
ＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－α放出検出
加えて、インビトロ細胞傷害性アッセイからの上清を収集し、ＣＡＲ誘導性のサイトカイン放出、例えばインターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）及びＴＮＦ－α放出を評価した。図１１Ｆ～Ｋに示す通り、ＣＡＲ３ ＣＡＲ－Ｔ及び一部の抗ＤＬＬ３タンデムＣＡＲ－Ｔは、ＤＬＬ３発現細胞株により刺激され、ＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－αを産生した一方、ＵｎＴは、ＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－αをほとんど産生しなかった。ＤＬＬ３陰性発現細胞株は、ＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－αの特異的放出を低減しなかった（データは示さず）。ＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－α放出検出のプロトコルについては、ＣＩＳＢＩＯのヒトＴＮＦ－αキット及びＩＦＮ－γキットを参照可能である。
加えて、インビトロ細胞傷害性アッセイからの上清を収集し、ＣＡＲ誘導性のサイトカイン放出、例えばインターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）及びＴＮＦ－α放出を評価した。図１１Ｆ～Ｋに示す通り、ＣＡＲ３ ＣＡＲ－Ｔ及び一部の抗ＤＬＬ３タンデムＣＡＲ－Ｔは、ＤＬＬ３発現細胞株により刺激され、ＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－αを産生した一方、ＵｎＴは、ＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－αをほとんど産生しなかった。ＤＬＬ３陰性発現細胞株は、ＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－αの特異的放出を低減しなかった（データは示さず）。ＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－α放出検出のプロトコルについては、ＣＩＳＢＩＯのヒトＴＮＦ－αキット及びＩＦＮ－γキットを参照可能である。
１Ｈ２．１と比べて、Ｔ３は、（２２時間のコインキュベーション後に）より多くのＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－αを放出した（図１１Ｗ～Ｘ）。
長期刺激アッセイによるタンデムＣＡＲ－Ｔ細胞傷害性及び拡大増殖
反復的な抗原刺激アッセイにより、ＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞を評価した。ＳＣＬＣ細胞株及び対照細胞株による反復刺激時、タンデムＣＡＲ－Ｔ細胞Ｔ３は、ＳＣＬＣ細胞、特にＳＨＰ－７７及びＮＣＩ－Ｈ８２細胞に対してより強力な細胞傷害性を示した（図１１Ｌ～Ｐ）。細胞傷害活性に加えて、タンデムＣＡＲ－Ｔ細胞Ｔ３は、特にＳＨＰ－７７及びＮＣＩ－Ｈ８２細胞による刺激時、他のＣＡＲＴよりも高い増殖能も示した（図１１Ｑ～Ｕ）。
反復的な抗原刺激アッセイにより、ＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞を評価した。ＳＣＬＣ細胞株及び対照細胞株による反復刺激時、タンデムＣＡＲ－Ｔ細胞Ｔ３は、ＳＣＬＣ細胞、特にＳＨＰ－７７及びＮＣＩ－Ｈ８２細胞に対してより強力な細胞傷害性を示した（図１１Ｌ～Ｐ）。細胞傷害活性に加えて、タンデムＣＡＲ－Ｔ細胞Ｔ３は、特にＳＨＰ－７７及びＮＣＩ－Ｈ８２細胞による刺激時、他のＣＡＲＴよりも高い増殖能も示した（図１１Ｑ～Ｕ）。
ＣＡＲ３に加えて、本発明者らは、Ｔ３及び１Ｈ２．１のＳＨＰ－７７細胞に対するインビトロ細胞傷害性も比較した。結果は、Ｔ３が長期刺激において優位な細胞傷害性及び拡大増殖を有したことを示す（図１１Ｙ～Ｚ）。
反復刺激は、以下のように実施した。
ラウンド１：ＣＡＲ－Ｔ細胞及び３×１０５個の標的細胞（例えば、ＳＨＰ－７７）を２４ウェルプレートに１：５のエフェクター対標的細胞比で添加し、３７℃、５％ＣＯ２の二酸化炭素インキュベーター内で３日間コインキュベートした。サイトカイン検出のため、２００μＬの細胞培養上清をピペッティングし、コインキュベートした細胞を収集し、％ＣＤ３及びＣＡＲ陽性率をフローサイトメトリーにより評価した；
ラウンド２：ラウンド１において収集した細胞のＣＡＲ－Ｔ陽性率に基づき、収集した細胞を同じ体積の新しい標的細胞（ＳＨＰ－７７）と１：２のエフェクター対標的細胞比でさらに３日間コインキュベートし続けた。サイトカイン検出のため、２００μＬの細胞培養上清をピペッティングし、コインキュベートした細胞を収集し、％ＣＤ３及びＣＡＲ陽性率をフローサイトメトリーにより評価した；
ラウンド３及び後続するラウンドは、先行する各ラウンドのＣＡＲ－Ｔ陽性率に基づき、ラウンド２の場合と同様の様式で実施した。
ラウンド１：ＣＡＲ－Ｔ細胞及び３×１０５個の標的細胞（例えば、ＳＨＰ－７７）を２４ウェルプレートに１：５のエフェクター対標的細胞比で添加し、３７℃、５％ＣＯ２の二酸化炭素インキュベーター内で３日間コインキュベートした。サイトカイン検出のため、２００μＬの細胞培養上清をピペッティングし、コインキュベートした細胞を収集し、％ＣＤ３及びＣＡＲ陽性率をフローサイトメトリーにより評価した；
ラウンド２：ラウンド１において収集した細胞のＣＡＲ－Ｔ陽性率に基づき、収集した細胞を同じ体積の新しい標的細胞（ＳＨＰ－７７）と１：２のエフェクター対標的細胞比でさらに３日間コインキュベートし続けた。サイトカイン検出のため、２００μＬの細胞培養上清をピペッティングし、コインキュベートした細胞を収集し、％ＣＤ３及びＣＡＲ陽性率をフローサイトメトリーにより評価した；
ラウンド３及び後続するラウンドは、先行する各ラウンドのＣＡＲ－Ｔ陽性率に基づき、ラウンド２の場合と同様の様式で実施した。
実施例１２．ＰＤ－１ ＤＮＲ又はＣＳＲで武装したヒト化抗ＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞のインビトロ活性の評価
ＣＡＲ－Ｔの持続性を改善するため、本発明者らは、ＰＤ－１ドミナントネガティブ受容体（ＰＤ－１ＤＮＲ）又はＰＤ－１キメラスイッチ受容体（ＰＤ－１ＣＳＲ）で武装したＤＬＬ３ ＣＡＲを構築した。２つのＣＡＲのアミノ酸配列を配列番号５２１～５２２に提示した。ＰＤ－１ＤＮＲ及びＰＤ－１ＣＳＲ配列を、Ｐ２Ａを介してＴ３のＣ末端に連結した。ＰＤ－１ＤＮＲ及びＰＤ－１ＣＳＲのアミノ酸配列を配列番号５２３～５２４に提示した。ＣＡＲ構築物の概略図を図１０Ｂに示す。
ＣＡＲ－Ｔの持続性を改善するため、本発明者らは、ＰＤ－１ドミナントネガティブ受容体（ＰＤ－１ＤＮＲ）又はＰＤ－１キメラスイッチ受容体（ＰＤ－１ＣＳＲ）で武装したＤＬＬ３ ＣＡＲを構築した。２つのＣＡＲのアミノ酸配列を配列番号５２１～５２２に提示した。ＰＤ－１ＤＮＲ及びＰＤ－１ＣＳＲ配列を、Ｐ２Ａを介してＴ３のＣ末端に連結した。ＰＤ－１ＤＮＲ及びＰＤ－１ＣＳＲのアミノ酸配列を配列番号５２３～５２４に提示した。ＣＡＲ構築物の概略図を図１０Ｂに示す。
配列番号５２１（Ｔ３－ＰＤ－１ＤＮＲアミノ酸配列）
配列番号５２２（Ｔ３－ＰＤ－１ＣＳＲアミノ酸配列）
配列番号５２３（ＰＤ－１ＤＮＲアミノ酸配列）
配列番号５２４（ＰＤ－１ＣＳＲアミノ酸配列）
反復的な抗原刺激アッセイにより、ＰＤ－１ＤＮＲ又はＰＤ－１ＣＳＲで武装したＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞を評価した。ＳＨＰ－７７細胞により反復刺激した場合、武装したＣＡＲ－Ｔ細胞は、通常のＣＡＲＴと比べて、細胞傷害性効力を増強せず、拡大増殖能を改善しなかった（図１２Ａ～Ｂ）。（ＳＨＰ－７７細胞においてヒトＰＤ－Ｌ１を過剰発現する）ＳＨＰ－７７／ＰＤ－Ｌ１細胞により反復刺激した場合、ＰＤ－１ ＣＳＲで武装したＣＡＲ－Ｔ細胞は、優位な細胞傷害性効力及び拡大増殖能を示した（図１２Ｃ～Ｄ）。
実施例１３．ＴＧＦ－β－ＤＮＲはＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍有効性を増強する
ＴＧＦ－β－ＤＮＲで武装したＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞の構築
腫瘍微小環境内でのＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍性能を改善するため、図１３Ａに示す通り、ＴＧＦ－β－ＤＮＲ配列をＤＬＬ３ ＣＡＲに組み込んだ。ＴＧＦ－β－ＤＮＲは、ＴＧＦＢＲＩＩの細胞外及び膜貫通ドメインからなる、ＴＧＦＢＲＩＩの切断されたバージョンである。構築物Ｔ３－Ｐ２Ａ－ＴＧＦ－β－ＤＮＲ、Ｔ３－Ｔ２Ａ－ＴＧＦ－β－ＤＮＲは、Ｎ末端におけるＴ３－ＢＢＺ配列、図示のようなＰ２Ａ又はＴ２Ａペプチド、Ｃ末端におけるＴＧＦ－β－ＤＮＲを含み；構築物ＴＧＦ－β－ＤＮＲ－Ｐ２Ａ－Ｔ３及びＴＧＦ－β－ＤＮＲ－Ｔ２Ａ－Ｔ３は、Ｎ末端におけるＴＧＦ－β－ＤＮＲ配列、図示のようなＰ２Ａ又はＴ２Ａペプチド及びＣ末端におけるＴ３－ＢＢＺ配列を含む。ＴＧＦ－β－ＤＮＲ及び武装したＤＬＬ３ ＣＡＲの詳細な配列を配列番号５２５～５２９に提示した。
ＴＧＦ－β－ＤＮＲで武装したＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞の構築
腫瘍微小環境内でのＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍性能を改善するため、図１３Ａに示す通り、ＴＧＦ－β－ＤＮＲ配列をＤＬＬ３ ＣＡＲに組み込んだ。ＴＧＦ－β－ＤＮＲは、ＴＧＦＢＲＩＩの細胞外及び膜貫通ドメインからなる、ＴＧＦＢＲＩＩの切断されたバージョンである。構築物Ｔ３－Ｐ２Ａ－ＴＧＦ－β－ＤＮＲ、Ｔ３－Ｔ２Ａ－ＴＧＦ－β－ＤＮＲは、Ｎ末端におけるＴ３－ＢＢＺ配列、図示のようなＰ２Ａ又はＴ２Ａペプチド、Ｃ末端におけるＴＧＦ－β－ＤＮＲを含み；構築物ＴＧＦ－β－ＤＮＲ－Ｐ２Ａ－Ｔ３及びＴＧＦ－β－ＤＮＲ－Ｔ２Ａ－Ｔ３は、Ｎ末端におけるＴＧＦ－β－ＤＮＲ配列、図示のようなＰ２Ａ又はＴ２Ａペプチド及びＣ末端におけるＴ３－ＢＢＺ配列を含む。ＴＧＦ－β－ＤＮＲ及び武装したＤＬＬ３ ＣＡＲの詳細な配列を配列番号５２５～５２９に提示した。
配列番号５２５（Ｔ３－Ｐ２Ａ－ＴＧＦ－β－ＤＮＲアミノ酸配列）
配列番号５２６（ＴＧＦ－β－ＤＮＲ－Ｐ２Ａ－Ｔ３アミノ酸配列）
配列番号５２７（Ｔ３－Ｔ２Ａ－ＴＧＦ－β－ＤＮＲアミノ酸配列）
配列番号５２８（ＴＧＦ－β－ＤＮＲ－Ｔ２Ａ－Ｔ３アミノ酸配列）
配列番号５２９（ＴＧＦ－β－ＤＮＲアミノ酸配列）
すべての構築物を、第二世代レンチウイルス系に基づくレンチウイルスにパッケージングした。次に、健常ドナーのＰＢＭＣから単離した初代Ｔ細胞にレンチウイルスを形質導入した。形質導入から４日後、ｓｄＡｂ及びＴＧＦ－β－ＤＮＲの陽性率をＦＡＣＳにより検出した（図１３Ｂ）。結果は、Ｔ３－Ｐ２Ａ－ＴＧＦ－β－ＤＮＲ、Ｔ３－Ｔ２Ａ－ＴＧＦ－β－ＤＮＲ、ＴＧＦ－β－ＤＮＲ－Ｐ２Ａ－Ｔ３及びＴＧＦ－β－ＤＮＲ－Ｔ２Ａ－Ｔ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞のｓｄＡｂ陽性率が同等であることを示した。しかし、ＴＧＦ－β－ＤＮＲの陽性率は、構築物Ｔ３－Ｐ２Ａ－ＴＧＦ－β－ＤＮＲ及びＴ３－Ｔ２Ａ－ＴＧＦ－β－ＤＮＲにおいて、ＴＧＦ－β－ＤＮＲ－Ｐ２Ａ－Ｔ３及びＴＧＦ－β－ＤＮＲ－Ｔ２Ａ－Ｔ３の場合よりも高かった。これらの結果は、ＴＧＦ－β－ＤＮＲの発現がＣＡＲのＣ末端にコンジュゲートするときにより高いことを示した。
インビトロ細胞傷害性アッセイ
次に、これらのＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞傷害性をＬＤＨ又はＩＦＮ－γ放出アッセイにより評価した。形質導入から５日後、ＣＡＲ－Ｔ細胞を非形質導入Ｔ細胞（ＵｎＴ）により同じｓｄＡｂ陽性率に調節した。次に、ＣＡＲ－Ｔ細胞又はＵｎＴ細胞を５ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ－βの存在下でＳＨＰ７７と４８時間コインキュベートし、ＬＤＨ及びＩＦＮ－γ放出を測定した（図１３Ｃ～Ｄ）。結果は、ＴＧＦ－β－ＤＮＲで武装したＣＡＲ－Ｔ細胞が、標的細胞の、武装していないＣＡＲ－Ｔ細胞よりも特異的な溶解を誘導することを示した。したがって、ＴＧＦ－β－ＤＮＲで武装したＣＡＲ－Ｔ細胞は、抗原活性化時、より高いＩＦＮ－γ放出能力を示した。異なるＣＡＲ－Ｔ細胞のＴＧＦ－β－ＤＮＲ発現レベルと一致して、Ｔ３－Ｐ２Ａ－ＴＧＦ－β－ＤＮＲ、Ｔ３－Ｔ２Ａ－ＴＧＦ－β－ＤＮＲは、ＴＧＦ－β－ＤＮＲ－Ｐ２Ａ－Ｔ３及びＴＧＦ－β－ＤＮＲ－Ｔ２Ａ－Ｔ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも高いレベルのＩＦＮ－γ分泌を示した。まとめると、これらの結果は、ＴＧＦ－β－ＤＮＲが、ＤＬＬ３陽性ＳＣＬＣ細胞に対してＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞傷害性を増強できることを示した。
次に、これらのＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞傷害性をＬＤＨ又はＩＦＮ－γ放出アッセイにより評価した。形質導入から５日後、ＣＡＲ－Ｔ細胞を非形質導入Ｔ細胞（ＵｎＴ）により同じｓｄＡｂ陽性率に調節した。次に、ＣＡＲ－Ｔ細胞又はＵｎＴ細胞を５ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ－βの存在下でＳＨＰ７７と４８時間コインキュベートし、ＬＤＨ及びＩＦＮ－γ放出を測定した（図１３Ｃ～Ｄ）。結果は、ＴＧＦ－β－ＤＮＲで武装したＣＡＲ－Ｔ細胞が、標的細胞の、武装していないＣＡＲ－Ｔ細胞よりも特異的な溶解を誘導することを示した。したがって、ＴＧＦ－β－ＤＮＲで武装したＣＡＲ－Ｔ細胞は、抗原活性化時、より高いＩＦＮ－γ放出能力を示した。異なるＣＡＲ－Ｔ細胞のＴＧＦ－β－ＤＮＲ発現レベルと一致して、Ｔ３－Ｐ２Ａ－ＴＧＦ－β－ＤＮＲ、Ｔ３－Ｔ２Ａ－ＴＧＦ－β－ＤＮＲは、ＴＧＦ－β－ＤＮＲ－Ｐ２Ａ－Ｔ３及びＴＧＦ－β－ＤＮＲ－Ｔ２Ａ－Ｔ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも高いレベルのＩＦＮ－γ分泌を示した。まとめると、これらの結果は、ＴＧＦ－β－ＤＮＲが、ＤＬＬ３陽性ＳＣＬＣ細胞に対してＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞傷害性を増強できることを示した。
長期刺激アッセイ
ＴＧＦ－β－ＤＮＲがＣＡＲ－Ｔ細胞に対するＴＧＦ－βの阻害効果に抗することができたか否かを判定するため、長期刺激アッセイを実施した。即ち、Ｔ３－Ｐ２Ａ－ＴＧＦ－β－ＤＮＲ及びＴ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞に５ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ－βの存在下又は不在下で３日ごとにＳＨＰ７７細胞を反復的に負荷した。各回刺激の終了時、全生細胞中のＴ細胞の百分率をＦＡＣＳにより分析し、ＣＡＲ－Ｔ細胞の拡大増殖を計算した。図１３Ｅ及び図１３Ｆに示す通り、Ｔ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞の持続性及び拡大増殖がＴＧＦ－βにより阻害された。それに対して、Ｔ３－Ｐ２Ａ－ＴＧＦ－β－ＤＮＲの持続性及び拡大増殖は、ＴＧＦ－βの存在下でも十分に維持された。ＳＨＰ７７細胞による２回の刺激後、Ｔ細胞消耗マーカーをＦＡＣＳにより分析した。図１３Ｇに示す通り、ＴＧＦ－βによる処理により、消耗マーカーの発現がＴ３細胞においては上方制御されたが、Ｔ３－Ｐ２Ａ－ＴＧＦ－β－ＤＮＲ ＣＡＲ－Ｔ細胞においては上方制御されなかった。まとめると、これらの結果は、ＴＧＦ－β－ＤＮＲがＴＧＦ－βによる阻害からＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞を保護することを示した。ＴＧＦ－βの発現レベルが固形腫瘍の微小環境内で通常上昇することから、本発明者らの結果は、ＴＧＦ－β－ＤＮＲの添加により、固形腫瘍におけるＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍有効性が改善されることを示す。
ＴＧＦ－β－ＤＮＲがＣＡＲ－Ｔ細胞に対するＴＧＦ－βの阻害効果に抗することができたか否かを判定するため、長期刺激アッセイを実施した。即ち、Ｔ３－Ｐ２Ａ－ＴＧＦ－β－ＤＮＲ及びＴ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞に５ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ－βの存在下又は不在下で３日ごとにＳＨＰ７７細胞を反復的に負荷した。各回刺激の終了時、全生細胞中のＴ細胞の百分率をＦＡＣＳにより分析し、ＣＡＲ－Ｔ細胞の拡大増殖を計算した。図１３Ｅ及び図１３Ｆに示す通り、Ｔ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞の持続性及び拡大増殖がＴＧＦ－βにより阻害された。それに対して、Ｔ３－Ｐ２Ａ－ＴＧＦ－β－ＤＮＲの持続性及び拡大増殖は、ＴＧＦ－βの存在下でも十分に維持された。ＳＨＰ７７細胞による２回の刺激後、Ｔ細胞消耗マーカーをＦＡＣＳにより分析した。図１３Ｇに示す通り、ＴＧＦ－βによる処理により、消耗マーカーの発現がＴ３細胞においては上方制御されたが、Ｔ３－Ｐ２Ａ－ＴＧＦ－β－ＤＮＲ ＣＡＲ－Ｔ細胞においては上方制御されなかった。まとめると、これらの結果は、ＴＧＦ－β－ＤＮＲがＴＧＦ－βによる阻害からＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞を保護することを示した。ＴＧＦ－βの発現レベルが固形腫瘍の微小環境内で通常上昇することから、本発明者らの結果は、ＴＧＦ－β－ＤＮＲの添加により、固形腫瘍におけるＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍有効性が改善されることを示す。
インビボ抗腫瘍有効性試験
ＴＧＦ－β－ＤＮＲがインビボでＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍有効性を増強し得たか否かをさらに検討するため、Ｔ３－Ｔ２Ａ－ＴＧＦ－β－ＤＮＲ ＣＡＲ－Ｔ細胞又は親ＣＡＲ－Ｔ細胞を異種移植片モデルにおいて評価した。即ち、１×１０７個のＳＨＰ７７細胞をＮＣＧマウスに皮下移植した。７～１０日後、腫瘍体積が１００～２００ｍｍ３に達したとき、２．５×１０５個のＣＡＲ－Ｔ細胞をマウスに静脈内注射した。次に、腫瘍体積を週２回測定し、末梢血中のＣＡＲ－Ｔの百分率を週１回測定した。図１３Ｈに示す通り、準最適用量において、Ｔ３－Ｔ２Ａ－ＴＧＦ－β－ＤＮＲ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、腫瘍増殖を強力に抑制できた一方、親Ｔ３ ＣＡＲ－Ｔは、抑制できなかった。図１３Ｉに示す通り、末梢血白血球中のＴ３－Ｔ２Ａ－ＴＧＦ－β－ＤＮＲ ＣＡＲ－Ｔの百分率は、Ｔ３よりも高かった。まとめると、これらの結果は、ＴＧＦ－β－ＤＮＲがインビボでＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍有効性を増強できたことを示す。
ＴＧＦ－β－ＤＮＲがインビボでＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍有効性を増強し得たか否かをさらに検討するため、Ｔ３－Ｔ２Ａ－ＴＧＦ－β－ＤＮＲ ＣＡＲ－Ｔ細胞又は親ＣＡＲ－Ｔ細胞を異種移植片モデルにおいて評価した。即ち、１×１０７個のＳＨＰ７７細胞をＮＣＧマウスに皮下移植した。７～１０日後、腫瘍体積が１００～２００ｍｍ３に達したとき、２．５×１０５個のＣＡＲ－Ｔ細胞をマウスに静脈内注射した。次に、腫瘍体積を週２回測定し、末梢血中のＣＡＲ－Ｔの百分率を週１回測定した。図１３Ｈに示す通り、準最適用量において、Ｔ３－Ｔ２Ａ－ＴＧＦ－β－ＤＮＲ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、腫瘍増殖を強力に抑制できた一方、親Ｔ３ ＣＡＲ－Ｔは、抑制できなかった。図１３Ｉに示す通り、末梢血白血球中のＴ３－Ｔ２Ａ－ＴＧＦ－β－ＤＮＲ ＣＡＲ－Ｔの百分率は、Ｔ３よりも高かった。まとめると、これらの結果は、ＴＧＦ－β－ＤＮＲがインビボでＤＬＬ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍有効性を増強できたことを示す。
Claims (70)
- ＤＬＬ３結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、前記ＤＬＬ３結合ドメインが、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）又は一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含むか又はそれに由来する、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
- 前記ｓｄＡｂが、配列番号１～８１のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１又は前記ＣＤＲ１において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体、配列番号８２～１６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２又は前記ＣＤＲ２において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体、及び配列番号１６３～２４３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３又は前記ＣＤＲ３において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体を含むポリペプチドを含む、請求項１に記載のＣＡＲ。
- 前記ｓｄＡｂが、配列番号１～８１のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号８２～１６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１６３～２４３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含むポリペプチド、又は前記ＣＤＲ１、前記ＣＤＲ２、及び前記ＣＤＲ３において最大で約３つのアミノ酸置換を含む前記ポリペプチドの変異体を含む、請求項１又は２に記載のＣＡＲ。
- 前記ｓｄＡｂが、
（１）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１６８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（２）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１０２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１８３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（３）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１８６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（４）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（５）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１９６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（６）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号２０１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（７）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号８８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１６９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（８）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１７０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；又は
（９）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号９０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１７１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体
のいずれか１つを含むポリペプチドを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のＣＡＲ。 - 前記ｓｄＡｂが、
（１）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１６８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（２）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１０２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１８３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（３）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１８６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（４）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（５）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１９６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（６）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号２０１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（７）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号８８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１６９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（８）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１７０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；又は
（９）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号９０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１７１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３
のいずれか１つを含むポリペプチドを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のＣＡＲ。 - 前記ｓｄＡｂが、ヒト又はアカゲザルＤＬＬ３に対して産生されたラクダｓｄＡｂである、請求項１～５のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
- 前記ｓｄＡｂが、配列番号２７４～３５４のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
- 前記ｓｄＡｂが、ＣＤＲ移植を通じてヒト化されている、請求項１～７のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
- ヒト化された前記ｓｄＡｂが、配列番号３５５～３６７のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
- 前記ｓｃＦｖが、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、前記ｓｃＦｖの前記ＶＨが、配列番号４９８若しくは５０４で示されるＣＤＲ１又は前記ＣＤＲ１において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体、配列番号４９９若しくは５０５で示されるＣＤＲ２又は前記ＣＤＲ２において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体、及び配列番号５００若しくは５０６で示されるＣＤＲ３又は前記ＣＤＲ３において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体を含み、かつ前記ｓｃＦｖの前記ＶＬが、配列番号４９５若しくは５０１で示されるＣＤＲ１又は前記ＣＤＲ１において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体、配列番号４９６若しくは５０２で示されるＣＤＲ２又は前記ＣＤＲ２において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体、及び配列番号４９７若しくは５０３で示されるＣＤＲ３又は前記ＣＤＲ３において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
- 前記ｓｃＦｖの前記ＶＨが、配列番号４９８で示されるＣＤＲ１、配列番号４９９で示されるＣＤＲ２、及び配列番号５００で示されるＣＤＲ３を含み、かつ前記ｓｃＦｖの前記ＶＬが、配列番号４９５で示されるＣＤＲ１、配列番号４９６で示されるＣＤＲ２、及び配列番号４９７で示されるＣＤＲ３を含むか；又は前記ｓｃＦｖの前記ＶＨが、配列番号５０４で示されるＣＤＲ１、配列番号５０５で示されるＣＤＲ２、及び配列番号５０６で示されるＣＤＲ３を含み、かつ前記ｓｃＦｖの前記ＶＬが、配列番号５０１で示されるＣＤＲ１、配列番号５０２で示されるＣＤＲ２、及び配列番号５０３で示されるＣＤＲ３を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
- 前記ｓｃＦｖの前記ＶＨが、配列番号５０８で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ前記ｓｃＦｖの前記ＶＬが、配列番号５０７で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか；又は前記ｓｃＦｖの前記ＶＨが、配列番号５１０で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ前記ｓｃＦｖの前記ＶＬが、配列番号５０９で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
- 前記ｓｃＦｖが、合成ヒトＦａｂファージライブラリーから得られる、請求項１～１２のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
- 前記ＤＬＬ３が、ヒト又はアカゲザルＤＬＬ３である、請求項１～１３のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
- Ｎ末端からＣ末端に向かって、シグナルペプチド、前記ＤＬＬ３結合ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
- 前記細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、又はＣＤ６６ｄに由来する、請求項１～１５のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
- 前記細胞内シグナル伝達ドメインが、細胞内共刺激配列をさらに含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
- 前記細胞内共刺激配列が、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＬＦＡ－１、ＩＣＯＳ、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＴＮＦＲＳＦ９、ＴＮＦＲＳＦ４、ＴＮＦＲＳＦ８、ＣＤ４０ＬＧ、ＩＴＧＢ２、ＫＬＲＣ２、ＴＮＦＲＳＦ１８、ＴＮＦＲＳＦ１４、ＨＡＶＣＲ１、ＬＧＡＬＳ９、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ８３、ＣＤ８３のリガンド、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される共刺激分子に由来する、請求項１～１７のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
- 配列番号４７６～４８４、配列番号４８５～４９４又は配列番号５１５～５１６からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
- 前記ＤＬＬ３結合ドメインが、互いに連結された２つのｓｄＡｂを含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
- 前記ｓｄＡｂの各々が独立して、配列番号３５６又は配列番号３６６に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
- 配列番号５１８～５２０からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
- 配列番号５２０のアミノ酸配列を含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
- ＤＬＬ３に特異的に結合する単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）部分を含むＤＬＬ３結合タンパク質であって、前記ｓｄＡｂ部分が、配列番号１～８１のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１又は前記ＣＤＲ１において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体、配列番号８２～１６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２又は前記ＣＤＲ２において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体、及び配列番号１６３～２４３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３又は前記ＣＤＲ３において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体を含むポリペプチドを含む、ＤＬＬ３結合タンパク質。
- 前記ｓｄＡｂ部分が、配列番号１～８１のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号８２～１６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１６３～２４３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含むポリペプチド、又は前記ＣＤＲ１、前記ＣＤＲ２、及び前記ＣＤＲ３において最大で約３つのアミノ酸置換を含む前記ポリペプチドの変異体を含む、請求項２４に記載のＤＬＬ３結合タンパク質。
- 前記ｓｄＡｂ部分が、
（１）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１６８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（２）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１０２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１８３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（３）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１８６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（４）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（５）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１９６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（６）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号２０１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（７）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号８８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１６９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（８）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１７０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；又は
（９）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号９０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１７１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３若しくは最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体
のいずれか１つを含むポリペプチドを含む、請求項２４又は２５に記載のＤＬＬ３結合タンパク質。 - 前記ｓｄＡｂ部分が、
（１）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１６８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（２）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１０２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１８３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（３）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１８６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（４）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（５）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１９６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（６）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号２０１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（７）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号８８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１６９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（８）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１７０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；又は
（９）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号９０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１７１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３
のいずれか１つを含むポリペプチドを含む、請求項２４～２６のいずれか一項に記載のＤＬＬ３結合タンパク質。 - 前記ｓｄＡｂ部分が、ヒト又はアカゲザルＤＬＬ３に対して産生されたラクダｓｄＡｂである、請求項２４～２７のいずれか一項に記載のＤＬＬ３結合タンパク質。
- 前記ｓｄＡｂ部分が、配列番号２７４～３５４のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２４～２８のいずれか一項に記載のＤＬＬ３結合タンパク質。
- 前記ｓｄＡｂ部分が、ＣＤＲ移植を通じてヒト化されている、請求項２４～２９のいずれか一項に記載のＤＬＬ３結合タンパク質。
- ヒト化された前記ｓｄＡｂが、配列番号３５５～３６７のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２４～３０のいずれか一項に記載のＤＬＬ３結合タンパク質。
- 前記ＤＬＬ３が、ヒト又はアカゲザルＤＬＬ３である、請求項２４～３１のいずれか一項に記載のＤＬＬ３結合タンパク質。
- ＤＬＬ３に特異的に結合する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）部分を含むＤＬＬ３結合タンパク質であって、前記ｓｃＦｖ部分が、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、前記ｓｃＦｖ部分の前記ＶＨが、配列番号４９８若しくは５０４で示されるＣＤＲ１又は前記ＣＤＲ１において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体、配列番号４９９若しくは５０５で示されるＣＤＲ２又は前記ＣＤＲ２において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体、及び配列番号５００若しくは５０６で示されるＣＤＲ３又は前記ＣＤＲ３において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体を含み、かつ前記ｓｃＦｖ部分の前記ＶＬが、配列番号４９５若しくは５０１で示されるＣＤＲ１又は前記ＣＤＲ１において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体、配列番号４９６若しくは５０２で示されるＣＤＲ２又は前記ＣＤＲ２において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体、及び配列番号４９７若しくは５０３で示されるＣＤＲ３又は前記ＣＤＲ３において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体を含む、ＤＬＬ３結合タンパク質。
- 前記ｓｃＦｖ部分の前記ＶＨが、配列番号４９８で示されるＣＤＲ１、配列番号４９９で示されるＣＤＲ２、及び配列番号５００で示されるＣＤＲ３を含み、かつ前記ｓｃＦｖ部分の前記ＶＬが、配列番号４９５で示されるＣＤＲ１、配列番号４９６で示されるＣＤＲ２、及び配列番号４９７で示されるＣＤＲ３を含むか；又は前記ｓｃＦｖ部分の前記ＶＨが、配列番号５０４で示されるＣＤＲ１、配列番号５０５で示されるＣＤＲ２、及び配列番号５０６で示されるＣＤＲ３を含み、かつ前記ｓｃＦｖ部分の前記ＶＬが、配列番号５０１で示されるＣＤＲ１、配列番号５０２で示されるＣＤＲ２、及び配列番号５０３で示されるＣＤＲ３を含む、請求項３３に記載のＤＬＬ３結合タンパク質。
- 前記ｓｃＦｖ部分の前記ＶＨが、配列番号５０８で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ前記ｓｃＦｖ部分の前記ＶＬが、配列番号５０７で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか；又は前記ｓｃＦｖ部分の前記ＶＨが、配列番号５１０で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ前記ｓｃＦｖ部分の前記ＶＬが、配列番号５０９で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３３又は３４に記載のＤＬＬ３結合タンパク質。
- 前記ｓｃＦｖ部分が、合成ヒトＦａｂファージライブラリーから得られる、請求項３３～３５のいずれか一項に記載のＤＬＬ３結合タンパク質。
- 前記ＤＬＬ３が、ヒト又はアカゲザルＤＬＬ３である、請求項３３～３６のいずれか一項に記載のＤＬＬ３結合タンパク質。
- 請求項１～２３のいずれか一項に記載のＣＡＲ又は請求項２４～３２若しくは請求項３３～３７のいずれか一項に記載のＤＬＬ３結合タンパク質をコードする、単離核酸分子。
- ラクダ単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）をコードする、配列番号３６８～４４８からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む、請求項３８に記載の単離核酸分子。
- ヒト化ラクダｓｄＡｂをコードする、配列番号４４９～４６１からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む、請求項３８又は３９に記載の単離核酸分子。
- ヒトｓｃＦｖのＶＬ又はＶＨドメインをコードする、配列番号５１１～５１４からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む、請求項３８～４０のいずれか一項に記載の単離核酸分子。
- キメラスイッチ受容体（ＣＳＲ）又はドミナントネガティブ受容体（ＤＮＲ）をコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む、請求項３８～４１のいずれか一項に記載の単離核酸分子。
- ＰＤ－１ドミナントネガティブ受容体（ＰＤ－１ ＤＮＲ）、ＰＤ－１キメラスイッチ受容体（ＰＤ－１ ＣＳＲ）又はＴＧＦ－βドミナントネガティブ受容体（ＴＧＦ－β ＤＮＲ）をコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む、請求項３８～４２のいずれか一項に記載の単離核酸分子。
- 前記ＰＤ－１ ＤＮＲが、配列番号５２３に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；前記ＰＤ－１ ＣＳＲが、配列番号５２４に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３８～４３のいずれか一項に記載の単離核酸分子。
- 前記ＴＧＦ－β ＤＮＲが、配列番号５２９に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３８～４４のいずれか一項に記載の単離核酸分子。
- 前記ＰＤ－１ ＤＮＲ、前記ＰＤ－１ ＣＳＲ、又は前記ＴＧＦ－β ＤＮＲをコードする前記ポリヌクレオチド配列が、２Ａ自己切断ペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を介して、前記ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド配列に連結されている、請求項３８～４５のいずれか一項に記載の単離核酸分子。
- 前記２Ａ自己切断ペプチドが、Ｔ２Ａペプチド又はＰ２Ａペプチドである、請求項３８～４６のいずれか一項に記載の単離核酸分子。
- ５’から３’の方向に、前記ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド配列、前記２Ａ自己切断ペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、及び前記ＰＤ－１ ＤＮＲ、前記ＰＤ－１ ＣＳＲ又は前記ＴＧＦ－β ＤＮＲをコードするポリヌクレオチド配列を含む、請求項３８～４７のいずれか一項に記載の単離核酸分子。
- 配列番号５２１若しくは５２２に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有するペプチドをコードするか、又は配列番号５２５～５２８からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有するペプチドをコードする、請求項３８～４８のいずれか一項に記載の単離核酸分子。
- 請求項３８～４９のいずれか一項に記載の単離核酸分子を含む、発現ベクター。
- 請求項３８～４９のいずれか一項に記載の単離核酸分子又は請求項５０に記載の発現ベクターを含む、改変された免疫細胞。
- 細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、γδＴ細胞、ＮＫＴ細胞、及びネイチャーキラー細胞からなる群から選択される、請求項５１に記載の改変された免疫細胞。
- 請求項１～２３のいずれか一項に記載のＣＡＲを発現する、改変された免疫細胞。
- ＣＳＲ又はＤＮＲも発現する、請求項５３に記載の改変された免疫細胞。
- 前記ＣＳＲがＰＤ－１ ＣＳＲであり、前記ＤＮＲがＰＤ－１ ＤＮＲ又はＴＧＦ－β ＤＮＲである、請求項５３又は５４に記載の改変された免疫細胞。
- 前記ＰＤ－１ ＤＮＲが、配列番号５２３に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；前記ＰＤ－１ ＣＳＲが、配列番号５２４に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項５３～５５のいずれか一項に記載の改変された免疫細胞。
- 前記ＴＧＦ－β ＤＮＲが、配列番号５２９に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項５３～５６のいずれか一項に記載の改変された免疫細胞。
- 前記ＣＡＲ及び前記ＣＳＲ、又は前記ＣＡＲ及び前記ＤＮＲが、２Ａ自己切断ペプチドを介して同時に発現する、請求項５３～５７のいずれか一項に記載の改変された免疫細胞。
- 前記２Ａ自己切断ペプチドが、Ｔ２Ａペプチド又はＰ２Ａペプチドである、請求項５３～５８のいずれか一項に記載の改変された免疫細胞。
- 前記ＣＡＲ及び前記ＰＤ－１ ＣＳＲを発現する、請求項５３～５９のいずれか一項に記載の改変された免疫細胞。
- 前記ＣＡＲ及び前記ＴＧＦ－β ＤＮＲを発現し、且つＴＧＦ－βの存在下において、ＤＬＬ３を発現する細胞によって刺激される、請求項５３～６０のいずれか一項に記載の改変された免疫細胞。
- 細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、γδＴ細胞、ＮＫＴ細胞、及びネイチャーキラー細胞からなる群から選択される、請求項５３～６１のいずれか一項に記載の改変された免疫細胞。
- 請求項１～２３のいずれか一項に記載のＣＡＲ、請求項２４～３２若しくは請求項３３～３７のいずれか一項に記載のＤＬＬ３結合タンパク質、請求項５０に記載の発現ベクター又は請求項５１～６２のいずれか一項に記載の改変された免疫細胞と、生理学的に許容できる賦形剤とを含む、医薬組成物。
- 対象におけるＤＬＬ３関連障害を治療するための方法であって、治療有効量の請求項５１～６２のいずれか一項に記載の改変された免疫細胞、又は治療有効量の請求項６３に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
- 前記ＤＬＬ３関連障害が、肺がん、メラノーマ、乳がん、前立腺がん、結腸がん、腎細胞がん、卵巣がん、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、白血病及びリンパ腫からなる群から選択されるがんである、請求項６４に記載の方法。
- 前記ＤＬＬ３関連障害が、小細胞肺がんである、請求項６５に記載の方法。
- 前記がんが、ＤＬＬ３及びＰＤ－Ｌ１を発現する、請求項６４～６６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記がんが、対応する正常組織と比較してより高いＴＧＦ－β発現レベルを有する、請求項６４～６７のいずれか一項に記載の方法。
- ＤＬＬ３関連障害を治療するための薬剤の調製のための、請求項１～２３のいずれか一項に記載のＣＡＲ、請求項２４～３２若しくは請求項３３～３７のいずれか一項に記載のＤＬＬ３結合タンパク質、請求項５０に記載の発現ベクター又は請求項５１～６２のいずれか一項に記載の改変された免疫細胞の使用。
- ＤＬＬ３関連障害の治療における使用のための薬剤であって、請求項１～２３のいずれか一項に記載のＣＡＲ、請求項２４～３２若しくは請求項３３～３７のいずれか一項に記載のＤＬＬ３結合タンパク質、請求項５０に記載の発現ベクター又は請求項５１～６２のいずれか一項に記載の改変された免疫細胞を含む、薬剤。
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