ES2948717T3 - Nueva proteína de fusión específica para CD137 y PD-L1 - Google Patents

Abstract

La divulgación proporciona proteínas de fusión específicas tanto para CD 137 como para PD-L1, proteína de fusión que puede usarse para coestimular la activación de linfocitos de una manera dependiente del objetivo de PD-L1. Dichas proteínas de fusión se pueden usar en muchas aplicaciones farmacéuticas, por ejemplo, como agentes anticancerígenos y/o moduladores inmunológicos para el tratamiento o prevención de enfermedades humanas tales como una variedad de tumores. La presente divulgación también se refiere a métodos para preparar las proteínas de fusión descritas en el presente documento, así como a composiciones que comprenden dichas proteínas de fusión. La presente divulgación se refiere además a moléculas de ácido nucleico que codifican dichas proteínas de fusión y a métodos para la generación de dichas proteínas de fusión y moléculas de ácido nucleico. Además, la solicitud describe usos terapéuticos y/o de diagnóstico de dichas proteínas de fusión, así como composiciones que comprenden una o más de dichas proteínas de fusión. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Nueva proteína de fusión específica para CD137 y PD-L1

I. Antecedentes

El ligando de muerte programada 1, o PD-L1 (también conocido como grupo de diferenciación 274 o CD274 y homólogo 1 de B7 o B7-H1) es una proteína de membrana de tipo I unipaso que pertenece a la familia B7 de moléculas coestimuladoras/coinhibidoras de presentación de antígenos. La porción extracelular de PD-L1 contiene dos dominios, un dominio de tipo IgV N-terminal y un dominio de tipo IgC. PD-L1 tiene un dominio citoplasmático corto sin ningún motivo de transducción de señal obvio, lo que llevó a la creencia inicial de que no hay una señalización intrínseca a través de PD-L1 como receptor. Sin embargo, datos recientes muestran que el dominio citoplasmático de PD-L1 contiene motivos de transducción de señal conservados no clásicos, capaces de inhibir la transducción del interferón (IFN) y proteger las células cancerosas de la citotoxicidad del IFN (Gato-Canas et al., Cell Rep, 2017).

PD-L1 tiene un papel crucial en la supresión del sistema inmune durante el embarazo, infecciones crónicas, aloinjertos de tejido, enfermedades autoinmunes y cáncer. PD-L1 se expresa sobre una variedad de tipos de células que incluyen linfocitos B, linfocitos T, macrófagos, células dendríticas mieloides, mastocitos, células epiteliales y endoteliales vasculares. También se expresa en varios tipos de cáncer, incluidos, pero no limitados a, melanoma, cáncer de pulmón, vejiga, colon y mama. Niveles elevados de expresión de PD-L1 se asocian con una mayor agresividad tumoral al mediar en el agotamiento y la anergia de los linfocitos T que se infiltran en un tumor, la secreción de citocinas inmunosupresoras y la protección contra la lisis por parte de los linfocitos T citotóxicos.

PD-L1 es un ligando de la proteína de muerte celular programada 1 (PD-1), un receptor inhibidor de punto de control inmune clave que se expresa principalmente en los linfocitos T activados, pero también en otras células del sistema inmune, incluidas los linfocitos B y los monocitos. PD-1 es un miembro de la familia de inmunoglobulinas que contiene un dominio extracelular similar a IgV, un dominio transmembranal y una cola citoplasmática con un ITIM (motivo inhibidor de inmunorreceptor basado en tirosina) y un ITSM (motivo convertidor de inmunorreceptor basado en tirosina). El acoplamiento de PD-1 mediante PD-L1 conduce al reclutamiento de las fosfatasas de tirosina 1 y 2 (SHP 1 y 2) que contienen el dominio de homología src 2 a los motivos convertidores intracelulares de PD-1 y a la expresión de ligasas de ubicuitina E3 de la familia CBL. Esas ligasas de ubicuitina subsecuentemente ubicuitinan e inactivan los mediadores clave de la transducción de señales de TCRs, lo que conduce a la eliminación de los TCRs de la superficie celular (Karwacz et al., EMBO Mol Med, 2011). Las fosfatasas SHP 1 y SHP 2 inhiben la señalización de TCR directamente al terminar la fosforilación de ZAP70 y PI3K. Además, PD-1 acoplada a PD-L1 puede causar la inhibición de las vías de señalización de TCR al afectar a la expresión y la actividad de la cinasa CK₂ y las cinasas dependientes de ciclina (CDKs) (Arasanz et al., Oncotarget, 2017). También se ha mostrado que el acoplamiento de PD-1 conduce a una reprogramación del metabolismo de los linfocitos T desde un aumento de la glucólisis, que se requiere para producir energía para las funciones efectoras, hasta una p-oxidación de ácidos grasos, que se asocia con células de larga vida. Esto también puede explicar la supervivencia y persistencia de células que expresan PD-1 en pacientes con infecciones crónicas y cáncer (Patsoukis et al., Nat Commun, 2015).

El bloqueo de la interacción PD-1/PD-L1 mediante agentes dirigidos anti-PD-1 o anti-PD-L1 puede revertir la función de punto de control inmune y quitar el freno a las respuestas de los linfocitos T. Actualmente, tres anticuerpos de PD-L1, atezolizumab (TECEn Tr IQ, MPDL3280A, RG7466), avelumab (BAVENCIO, MSB0010718C) y durvalumab (IMFINZI, MEDI4736) se han aprobado para el tratamiento del cáncer. Varios ensayos clínicos exitosos con esos anticuerpos han mostrado elevadas tasas de respuesta objetiva, durabilidad de la respuesta o tasas de supervivencia mejoradas en cáncer de vejiga, cáncer de piel y cáncer de pulmón (Xu-Monette et al., Front Immunol, 2017).

El grupo de diferenciación 137 o CD137 (también conocido como 4-1BB o TNFRS9) es un receptor inmune coestimulador y miembro de la superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral (TNFR). Se expresa principalmente en linfocitos T CD4+ y CD8+ activados, linfocitos B activados y linfocitos citolíticos naturales (células NK), pero también se puede encontrar en monocitos en reposo y células dendríticas (Li y Liu, Clin Pharmacol, 2013), o células endoteliales (Snell et al., Immunol Rev, 2011). CD137 tiene un papel importante en la regulación de la respuesta inmune y, por lo tanto, es un objetivo para la inmunoterapia contra el cáncer. El ligando de CD137 (CD137L) es el único ligando natural conocido de CD137 y se expresa de manera constitutiva en varios tipos de células presentadoras de antígeno, como linfocitos B activados, monocitos y células dendríticas esplénicas, y puede inducirse sobre los linfocitos T.

CD137L es una proteína trimérica que existe como forma unida a la membrana y como variante soluble. Sin embargo, la capacidad de CD137L soluble para activar CD137, por ejemplo, sobre linfocitos que expresan CD137 es, sin embargo, limitada y se requieren grandes concentraciones para provocar un efecto (Wyzgol et al., J. Immunol, 2009). La forma natural de activación de CD137 es mediante el acoplamiento de una célula positiva para CD137 con una célula positiva para CD137L. Entonces se cree que la activación de CD137 es inducida mediante una agrupación a través de CD137L en la célula opuesta, lo que conduce a una señalización a través de TRAF1, 2 y 3 (Yao et al., Nat Rev Drug Discov, 2013, Snell et al., Immunol Rev, 2011) y otros efectos posteriores concomitantes en los linfocitos T positivos para CD137. En el caso de linfocitos T activados por el reconocimiento de sus respectivas dianas afines, los efectos provocados por la coestimulación de CD137 son una mayor activación, mayor supervivencia y proliferación, la producción de citocinas proinflamatorias y una mayor capacidad para destruir.

El beneficio de una coestimulación de CD137 para la eliminación de células cancerosas se ha demostrado en una serie de modelos in vivo. La expresión forzada de CD137L sobre un tumor, por ejemplo, conduce a un rechazo del tumor (Melero et al., Eur J Immunol, 1998). Asimismo, la expresión forzada de un scFv anti-CD137 sobre un tumor conduce a una eliminación del tumor dependiente de linfocitos T CD4+ y células NK (Yang et al., Cáncer Res, 2007, Zhang et al., Mol Cáncer Ther, 2006, Ye et al., Nat Med, 2002). También se ha demostrado que un anticuerpo anti-CD137 administrado sistémicamente conduce a un retraso del crecimiento tumoral (Martinet et al., Gene Ther, 2002).

Se ha mostrado que CD137 es un marcador excelente para los linfocitos T reactivos con tumores presentes en la naturaleza, en tumores humanos (Ye et al., Clin Cancer Res, 2014), y que los anticuerpos anti-CD137 pueden emplearse para mejorar la expansión y la actividad de linfocitos que se infiltran en tumores de melanoma CD8+ para la aplicación en una terapia adoptiva con linfocitos T (Chacón et al., PLoS One, 2013).

La demostración preclínica del beneficio terapéutico potencial de una coestimulación de CD137 ha estimulado el desarrollo de anticuerpos terapéuticos dirigidos a CD137, incluido BMS-663513 (descrito en el documento de patente de EE. UU. n° 7,288,638) y PF-05082566 (Fisher et al., Cancer Immunol Immunother, 2012). El documento WO 2017/123650 A2 se refiere a moléculas que interaccionan específicamente con 4-1 BB, un miembro de la superfamilia de receptores de TNF (TNFRSF). Más específicamente, esa invención se refiere a moléculas multivalentes y multiespecíficas que se unen al menos a 4-1 BB. El documento WO 2017/215590 A1 se refiere a anticuerpos anti-PD-L1 o a fragmentos de los mismos. Los anticuerpos o fragmentos de los mismos se unen específicamente al dominio C de inmunoglobulina de la proteína PD-L1. Marlon J. Hinner et al: "Abstract B023: Costimulatory T-cell engagement via a novel bispecific anti-CD137 /anti-HER2 protein based on Anticalin technology", Cancer Immunology Research, vol. 4, n° 1, 1 de enero 2016 & Marlon J Hinner et al: "Costimulatory T cell engagement via a novel bispecific antiCD137/anti-HER2 protein based on Anticalin technology" se refiere al acoplamiento coestimulador de linfocitos T a través de una proteína anti-CD137/anti-HER2 biespecífica basándose en la tecnología de muteínas de lipocalina. El documento WO 2018/087108 A1 se refiere a muteínas de lipocalina humana que se unen a CD137 y pueden usarse en aplicaciones farmacéuticas, por ejemplo, como agentes anticancerígenos y/o inmunomoduladores para el tratamiento o la prevención de enfermedades humanas tales como el cáncer, enfermedades infecciosas y enfermedades autoinmunes.

La presente descripción proporciona, entre otras cosas, enfoques novedosos para acoplar simultáneamente CD137 y PD-L1 a través de una o más proteínas de fusión que tienen las propiedades de especificidad de unión para CD137 y especificidad de unión para PD-L1.

II. Definiciones

La siguiente lista define términos, expresiones y abreviaturas usadas a lo largo de la presente memoria descriptiva. Todos los términos indicados y definidos en este documento se entiende que incluyen todas las formas gramaticales.

Tal y como se usa en este documento, a menos que se especifique lo contrario, "CD137" significa CD137 humana (huCD137). CD137 humana significa una proteína de longitud completa definida por UniProt Q07011, un fragmento de la misma o una variante de la misma. CD137 también se conoce como 4-1BB, miembro 9 de la superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral (TNFRSF9) e inducida mediante la activación de linfocitos (ILA).

Tal y como se usa en el presente documento, a menos que se especifique lo contrario, "ligando 1 de muerte celular programada" o "PD-L1" significa PD-L1 humano (huPD-L1). PD-L1 humano significa una proteína de longitud completa definida por UniProt Q9NZQ7, un fragmento de la misma o una variante de la misma. PD-L1 humano está codificado por el gen CD274. PD-L1 también se conoce como grupo de diferenciación 274 (CD274) u homólogo 1 de B7 (B7-H1).

Tal y como se usa en el presente documento, "afinidad de unión" describe la capacidad de una biomolécula (p. ej., un polipéptido o una proteína) de la descripción (p. ej., una muteína de lipocalina, un anticuerpo, una proteína de fusión o cualquier otro péptido o proteína) para unirse a una diana seleccionada y formar un complejo. La afinidad de unión se mide mediante una serie de métodos conocidos por los expertos en la técnica que incluyen, pero no se limitan a, titulación de la fluorescencia, ensayos basados en un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), que incluyen ELISA directo y competitivo, métodos colorimétricos, tales como calorimetría de titulación isotérmica (ITC) y resonancia de plasmón superficial (SPR). Estos métodos están bien establecidos en la técnica y algunos ejemplos de tales métodos se describen más adelante en este documento. Por lo tanto, la afinidad de unión se describe como un valor de la constante de disociación (K^d), la concentración efectiva máxima media (CE₅₀) o la concentración inhibidora máxima media (CI₅₀), medido usando esos métodos. Un valor más bajo de Kd, CE₅₀ o CI₅₀ refleja una mejor (mayor) capacidad de unión (afinidad). En consecuencia, las afinidades de unión de dos biomoléculas hacia una diana seleccionada pueden medirse y compararse. Al comparar las afinidades de unión de dos biomoléculas hacia la diana seleccionado, la expresión "aproximadamente igual", "sustancialmente igual" o "sustancialmente similar" significa que una biomolécula tiene una afinidad de unión descrita como un valor de Kd, CE₅₀ o CI₅₀ que es idéntico o similar al de otra molécula dentro de la variabilidad experimental de la medición de la afinidad de unión. La variabilidad experimental de la medición de la afinidad de unión depende del método específico utilizado y es conocida por los expertos en la técnica.

Tal y como se usa en el presente documento, el término "sustancialmente" también puede referirse a la condición cualitativa de exhibir una medida o grado total o casi total de una característica o propiedad de interés. Una persona con conocimientos ordinarios en las técnicas biológicas comprenderá que los fenómenos biológicos y químicos rara vez, si es que sucede alguna vez, se completan y/o proceden a completarse o logran o evitan un resultado absoluto. Por lo tanto, el término "sustancialmente" se usa en este documento para captar la posible falta de integridad inherente a muchos fenómenos biológicos y químicos.

Tal y como se usa en el presente documento, el término "detectar", "detección", "detectable" o "detectando" se entiende tanto a nivel cuantitativo como cualitativo, así como una combinación de los mismos. Por lo tanto, incluye mediciones cuantitativas, semicuantitativas y cualitativas realizadas sobre una biomolécula de la descripción.

Tal y como se usa en este documento, "afinidad detectable" generalmente significa la capacidad de unión entre una biomolécula y su diana, descrita por un valor de Kd, CE₅₀ o CI₅₀, es como máximo aproximadamente 10-5 M o inferior. Una afinidad de unión, descrita por un valor de Kd, CE₅₀ o CI₅₀, superior a 10-5 M generalmente ya no se puede medir con métodos comunes tales como ELISA y SPR y, por lo tanto, tiene una importancia secundaria.

Se observa que la formación de un complejo entre la biomolécula de la descripción y su diana está influenciada por muchos factores diferentes, como las concentraciones del diana respectiva, la presencia de competidores, el pH y la fuerza iónica del sistema de tampón utilizado, el método experimental utilizado para la determinación de la afinidad de unión (p. ej., titulación de la fluorescencia, ELISA competitivo (también llamado ELISA de competencia) y resonancia de plasmón superficial), e incluso el algoritmo matemático utilizado para la evaluación de los datos experimentales. Por lo tanto, está claro para el experto en la materia que la afinidad de unión indicada por un valor de Kd, CE₅₀ o CI₅₀ puede variar dentro de un cierto intervalo experimental, dependiendo del método y la configuración experimental. Esto significa que puede haber una ligera desviación en la medición de los valores de K^d, CE₅₀ o CI₅₀ o un intervalo de tolerancia dependiendo, por ejemplo, de si dichos valores fueron determinados por ELISA (incluyendo ELISA directo o de competencia), por SPR, o por otro método.

Tal y como se usa en el presente documento, "específico para", "unión específica", "unir específicamente" o "especificidad de unión" se refieren a la capacidad de una biomolécula para discriminar entre la diana deseada (por ejemplo, CD137 y PD-L1) y una o más dianas de referencia (por ejemplo, receptor celular para lipocalina asociada a gelatinasa de neutrófilos). Se entiende que tal especificidad no es una propiedad absoluta sino relativa y puede determinarse, por ejemplo, de acuerdo con SPR, transferencias Western, ELISA, clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS), radioinmunoensayo (RIA), electroquimioluminiscencia (ECL), ensayo inmunorradiométrico (IRMA), inmunohistoquímica (IHC) y rastreo de péptidos.

Cuando se usa en este documento en el contexto de la proteína de fusión de la presente descripción que se une a CD137 y PD-L1, la expresión "específico para", "unión específica", "unir específicamente" o "especificidad de unión" significa que la proteína de fusión se une, reacciona o se dirige a CD137 y PD-L1, tal y como se describe en este documento, pero no se une esencialmente a otra proteína. La expresión "otra proteína" incluye cualquier proteína que no sea CD137 o PD-L1 o proteínas estrechamente relacionadas o que sean homólogas a CD137 o PD-L1. Sin embargo, CD137 o PD-L1 procedentes de especies distintas a la humana y fragmentos y/o variantes de CD137 o PD-L1 no están excluidos por la expresión "otra proteína". La expresión "no se une esencialmente" significa que las proteínas de fusión de la presente descripción se unen a otra proteína con menor afinidad de unión que a CD137 y/o PD-L1, es decir, muestran una reactividad cruzada menor del 30%, preferiblemente del 20%. más preferiblemente del 10%, particularmente preferiblemente menor del 9, 8, 7, 6 o 5%. Si la proteína de fusión reacciona específicamente tal y como se ha definido anteriormente en el presente documento, puede analizarse fácilmente, entre otros, comparando la reacción de una proteína de fusión de la presente descripción con CD137 y/o PD-L1 y la reacción de dicha proteína de fusión con otra(s) proteína(s).

Tal y como se usa en el presente documento, el término "lipocalina" se refiere a una proteína monomérica de aproximadamente 18-20 kDa de peso, que tiene una región estructural supersecundaria de lámina cilíndrica plegada en p que comprende una pluralidad de cadenas p (preferiblemente ocho cadenas p denominadas de A a H) conectadas por parejas mediante una pluralidad de bucles (preferiblemente cuatro) en un extremo para comprender de ese modo un bolsillo de unión a ligando y definir la entrada al bolsillo de unión a ligando. Está bien establecido que la diversidad de dichos bucles en la estructura de la lipocalina, que de otro modo sería rígida, da lugar a una variedad de diferentes modos de unión entre los miembros de la familia de las lipocalinas, cada uno capaz de acomodar dianas de diferentes tamaños, formas y características químicas (revisado, por ejemplo, en Skerra, Biochim Biophys Acta, 2000, Flower et al., Biochim Biophys Acta, 2000, Flower, Biochem J, 1996). Se entiende que la familia de proteínas de la lipocalina ha evolucionado naturalmente para unirse a un amplio espectro de ligandos, compartiendo niveles inusualmente bajos de conservación general de la secuencia (a menudo con identidades de secuencia de menos del 20%) pero manteniendo un patrón de plegamiento general altamente conservado. La correspondencia entre las posiciones en varias lipocalinas también es bien conocida por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, el documento de patente de EE. UU. n° 7.250.297). Las proteínas que entran en la definición de "lipocalina" tal y como se usa en este documento incluyen, pero no se limitan a, lipocalinas humanas que incluyen lipocalina lagrimal (Tlc, Lcn1), lipocalina-2 (Lcn2) o lipocalina asociada a gelatinasa de neutrófilos (NGAL), apolipoproteína D (ApoD), apolipoproteína M, a ¹-glicoproteína ácida 1, a¹-glicoproteína ácida 2, a ¹-microglobulina, componente 8^y del complemento, proteína fijadora de retinol (RBP), proteína fijadora de ácido retinoico del epidídimo, glicodelina, proteína fijadora de olores Ila, proteína fijadora de olores lIb, lipocalina-15 (Lcn15) y sintasa de prostaglandina D.

Tal y como se usa en el presente documento, a menos que se especifique lo contrario, "lipocalina lagrimal" se refiere a la lipocalina lagrimal humana (hTIc) y se refiere además a la lipocalina lagrimal humana madura. El término "madura", cuando se usa para caracterizar una proteína, significa una proteína esencialmente exenta del péptido señal. Una "hTlc madura" de la presente descripción se refiere a la forma madura de la lipocalina lagrimal humana, que está exenta del péptido señal. La hTlc madura se describe por los residuos 19-176 de la secuencia depositada en el banco de datos SWISS-PROT con el número de orden P31025, y cuyo aminoácido se indica en SEQ ID NO: 1.

Tal y como se usa en el presente documento, "lipocalina-2" o "lipocalina asociada a gelatinasa de neutrófilos" se refiere a la lipocalina-2 humana (hLcn2) o lipocalina asociada a gelatinasa de neutrófilos humana (hNGAL) y se refiere además a la lipocalina-2 humana madura o a la lipocalina asociada a gelatinasa de neutrófilos. El término "madura", cuando se usa para caracterizar una proteína, significa una proteína esencialmente exenta del péptido señal. Una "hNGAL madura" de la presente descripción se refiere a la forma madura de lipocalina asociada a gelatinasa de neutrófilos humana, que está exenta del péptido señal. La hNGAL madura se describe por los residuos 21-198 de la secuencia depositada en el banco de datos SWISS-PROT con el número de orden P80188, y cuya secuencia de aminoácidos se indica en SEQ ID NO: 2.

Tal y como se usa en el presente documento, una "secuencia natural" se refiere a una proteína o un polipéptido que tiene una secuencia que está presente en la naturaleza o que tiene una secuencia de tipo silvestre, independientemente de su modo de preparación. Esa proteína o polipéptido de secuencia natural se puede aislar de la naturaleza o se puede producir por otros medios, como métodos recombinantes o sintéticos.

La "lipocalina de secuencia natural" se refiere a una lipocalina que tiene la misma secuencia de aminoácidos que el polipéptido correspondiente obtenido a partir de la naturaleza. Por lo tanto, una lipocalina de secuencia natural puede tener la secuencia de aminoácidos de la respectiva lipocalina natural (de tipo silvestre) de cualquier organismo, en particular, un mamífero. La expresión "secuencia natural", cuando se usa en el contexto de una lipocalina, incluye específicamente formas truncadas o secretadas de origen natural de la lipocalina, formas variantes de origen natural tales como formas con cortes y empalmes alternativos y variantes alélicas de origen natural de la lipocalina. Las expresiones "lipocalina de secuencia natural" y "lipocalina de tipo silvestre" se usan indistintamente en este documento.

Tal como se usa en el presente documento, una "muteína", una entidad "mutada" (ya sea proteína o ácido nucleico) o "mutante" se refiere al intercambio, deleción o inserción de uno o más aminoácidos o nucleótidos, en comparación con la proteína o el ácido nucleico (tipo silvestre) presentes en la naturaleza. Dicho término también incluye fragmentos de una muteína tal y como se describe en este documento. La presente descripción incluye explícitamente las muteínas de lipocalina, tal y como se describen en el presente documento, que tienen una región estructural supersecundaria de lámina p plegada cilíndrica que comprende ocho hebras p conectadas por parejas mediante cuatro bucles en un extremo, para comprender de ese modo un bolsillo de unión a ligando y definir la entrada al bolsillo de unión a ligando, en donde al menos un aminoácido de cada uno de al menos tres de dichos cuatro bucles está mutado en comparación con la lipocalina de secuencia natural.

Tal y como se usa en el presente documento, el término "fragmento", en relación con las muteínas de lipocalina de la descripción, se refiere a proteínas o polipéptidos obtenidos a partir de hTIc o hNGAL maduras de longitud completa o muteínas de lipocalina que están truncadas en el extremo N y/o en el extremo C, es decir, que carecen de al menos uno de los aminoácidos N-terminales y/o C-terminales. Esos fragmentos pueden incluir al menos 10 o más, tal como 20 o 30 o más aminoácidos consecutivos de la secuencia primaria de hTIc o hNGAL madura o la muteína de lipocalina a partir de la que se obtiene y normalmente son detectables en un inmunoensayo de hTIc o hNGAL madura. Un fragmento de ese tipo puede carecer de hasta 2, hasta 3, hasta 4, hasta 5, hasta 10, hasta 15, hasta 20, hasta 25 o hasta 30 (incluidos todos los números intermedios) de los aminoácidos N-terminales y/o C-terminales. Como ejemplo ilustrativo, ese fragmento puede carecer de uno, dos, tres o cuatro aminoácidos N-terminales (His-His-Leu-Leu) y/o uno o dos aminoácidos C-terminales (Ser-Asp) de hTlc madura. Se entiende que el fragmento es preferiblemente un fragmento funcional de hTIc o hNGAL madura o la muteína de lipocalina a partir de la que se obtiene, lo que significa que preferiblemente conserva la especificidad de unión, preferiblemente a CD137, de hTlc/hNGAL madura o de la muteína de lipocalina a partir de la que se obtiene. A modo de ejemplo ilustrativo, ese fragmento funcional puede comprender al menos aminoácidos en las posiciones 5-153, 5-150, 9-148, 12-140, 20-135 o 26-133 correspondientes a la secuencia polipeptídica lineal de hTlc madura. A modo de otro ejemplo ilustrativo, ese fragmento funcional puede comprender al menos aminoácidos en las posiciones 13-157, 15-150, 18-141, 20-134, 25-134 o 28-134 correspondientes a la secuencia polipeptídica lineal de hNGAL madura.

Un "fragmento" con respecto a CD137 o PD-L1 dianas correspondientes de una proteína de fusión de la descripción, se refiere a CD137 o PD-L1 truncados en el extremo N y/o en el extremo C o dominios proteicos de CD137 o PD-L1. Los fragmentos de CD137 o los fragmentos de PD-L1 tal y como se describen en el presente documento, conservan la capacidad de CD137 o PD-L1 de longitud completa para ser reconocidos y/o unirse a una proteína de fusión de la descripción. A modo de ejemplo ilustrativo, el fragmento puede ser un dominio extracelular de CD137 o PD-L1. Como ejemplo ilustrativo, ese dominio extracelular puede comprender aminoácidos de los subdominios extracelulares de CD137, como las secuencias de aminoácidos individuales o combinadas del dominio 1 (residuos 24-45 de UniProt Q07011), del dominio 2 (residuos 46-86), del dominio 3 (87-118) y del dominio 4 (residuos 119-159). A modo de otro ejemplo ilustrativo, ese dominio extracelular puede comprender los residuos de aminoácidos 19-238 de UniProt Q9NZQ7.

Tal y como se usa en el presente documento, el término "variante" se refiere a derivados de una proteína o polipéptido que incluyen mutaciones, por ejemplo, mediante sustituciones, deleciones, inserciones y/o modificaciones químicas de una secuencia de aminoácidos o una secuencia de nucleótidos. Tales sustituciones pueden ser conservadoras, es decir, un residuo de aminoácido se reemplaza con un residuo de aminoácido químicamente similar. Ejemplos de sustituciones conservadoras son los reemplazos entre los miembros de los siguientes grupos: 1) alanina, serina, treonina y valina; 2) ácido aspártico, ácido glutámico, glutamina y asparagina e histidina; 3) arginina, lisina, glutamina, asparagina e histidina; 4) isoleucina, leucina, metionina, valina, alanina, fenilalanina, treonina y prolina; y 5) isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, tirosina y triptófano. Esas variantes incluyen proteínas o polipéptidos, en los que uno o más aminoácidos han sido sustituidos por sus respectivos estereoisómeros D o por aminoácidos distintos de los 20 aminoácidos naturales, como, por ejemplo, ornitina, hidroxiprolina, citrulina, homoserina, hidroxilisina, norvalina. Esas variantes también incluyen, por ejemplo, proteínas o polipéptidos en los que se añaden o delecionan uno o más residuos de aminoácidos en el extremo N-terminal y/o C-terminal. Generalmente, una variante tiene al menos aproximadamente un 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95% o al menos aproximadamente un 98% de identidad de secuencia de aminoácidos con la proteína o el polipéptido de secuencia natural. Una variante conserva preferentemente la actividad biológica, p. ej., uniéndose a la misma diana, de la proteína o polipéptido a partir de la cual se ha obtenido.

El término "variante", tal y como se usa en el presente documento con respecto al ligando de proteína correspondiente CD137 o PD-L1 de una proteína de fusión de la descripción, se refiere a CD137 o PD-L1 o a fragmentos de los mismos, respectivamente, que tienen uno o más tal como 1, 2, 3, 4,5,6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o más sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos en comparación con la secuencia natural de CD137 o PD-L1 (CD137 o PD-L1 de tipo silvestre), tal como CD137 depositada en UniProt con Q07011 o PD-L1 depositado en UniProt con Q9NZQ7, como se ha descrito en este documento. Una variante de CD137 o una variante de PD-L1, respectivamente, tiene preferiblemente una identidad de aminoácidos de al menos un 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% o 95% con una CD137 de tipo silvestre o PD-L1. Una variante de CD137 o una variante de PD-L1 tal y como se describe en este documento, conserva la capacidad de unirse a proteínas de fusión específicas de CD137 y PD-L1, tal y como se establece en el conjunto de reivindicaciones adjuntas.

El término "variante", tal y como se usa en este documento con respecto a una muteína de lipocalina, se refiere a una muteína de lipocalina o un fragmento de la misma de la descripción, en donde la secuencia tiene mutaciones, incluidas sustituciones, deleciones e inserciones, y/o modificaciones químicas. Una variante de la muteína de lipocalina tal y como se describe en el presente documento, conserva la actividad biológica, por ejemplo, unión a CD137, de la muteína de lipocalina a partir de la cual se obtiene. En general, una variante de la muteína de lipocalina tiene al menos aproximadamente un 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 98% de identidad de secuencia de aminoácidos con la muteína de lipocalina a partir de la cual se obtiene.

Tal y como se usa en el presente documento, el término "mutagénesis" se refiere a la introducción de mutaciones en una secuencia de polinucleótidos o aminoácidos. Las mutaciones se introducen preferiblemente en condiciones experimentales de modo que el aminoácido que se encuentra de forma natural en una posición dada de la secuencia de proteína o polipéptido se puede alterar, por ejemplo, sustituir por al menos un aminoácido. El término "mutagénesis" también incluye una modificación (adicional) de la longitud de los segmentos de una secuencia mediante deleción o inserción de uno o más aminoácidos. Por lo tanto, está dentro del alcance de la descripción que, por ejemplo, un aminoácido en una posición de la secuencia elegida se reemplace por un tramo de tres aminoácidos, lo que conduce a una adición de dos residuos de aminoácidos en comparación con la longitud del segmento respectivo de la secuencia de aminoácidos de la proteína o polipéptido natural. Esa inserción o deleción puede introducirse independientemente una de otra, en cualquiera de los segmentos de la secuencia que pueden someterse a mutagénesis en la descripción.

Tal y como se usa en el presente documento, la expresión "mutagénesis aleatoria" significa que no está presente ninguna mutación predeterminada (alteración de aminoácidos) en una determinada posición de la secuencia, pero que al menos dos aminoácidos pueden incorporarse con cierta probabilidad en una posición de la secuencia predefinida durante la mutagénesis.

Tal y como se usa en el presente documento, la expresión "identidad de secuencia" o "identidad" indica una propiedad de las secuencias que mide su similitud o relación. La expresión "identidad de secuencia" o "identidad", tal y como se usa en la presente descripción, significa el porcentaje de residuos idénticos por parejas, después de una alineación (homóloga) de una secuencia de una proteína o un polipéptido de la descripción, con una secuencia en cuestión, con respecto al número de residuos en la más larga de esas dos secuencias. La identidad de secuencia se mide dividiendo el número de residuos de aminoácidos idénticos por el número total de residuos y multiplicando el producto por 100.

Tal y como se usa en el presente documento, la expresión "homología de secuencia" u "homología" tiene su significado habitual y el aminoácido homólogo incluye aminoácidos idénticos, así como aminoácidos que se consideran sustituciones conservadoras en posiciones equivalentes en la secuencia de aminoácidos lineal de una proteína o un polipéptido de la descripción (p. ej., cualquier proteína de fusión o muteína de lipocalina de la descripción).

Un experto en la materia reconocerá los programas informáticos disponibles, por ejemplo, BLAST (Altschul et al., Nucleic Acids Res, 1997), BLAST2 (Altschul et al., J MolBiol, 1990) y Smith-Waterman (Smith y Waterman, J MolBiol, 1981), para determinar la homología de secuencia o la identidad de secuencia utilizando parámetros estándar. El porcentaje de homología de secuencia o de identidad de secuencia, por ejemplo, puede determinarse en este documento utilizando el programa BLASTP, versión 2.2.5 (16 de noviembre de 2002; (Altschul et al., Nucleic Acids Res, 1997). En este ejemplo que no forma parte de la invención reivindicada, el porcentaje de homología se basa en la alineación de las secuencias completas de proteínas o polipéptidos (matriz: BLOSUM 62; coste por hueco: 11,1; valor de corte establecido en 10-3) que incluyen las secuencias de propéptidos, preferiblemente usando la estructura de la proteína de tipo silvestre como referencia en una comparación por parejas. Se calcula como el porcentaje de cantidad de "positivos" (aminoácidos homólogos) indicados como el resultado en la salida del programa BLASTP dividido por la cantidad total de aminoácidos seleccionados por el programa para la alineación.

Específicamente, para determinar si un residuo de aminoácido de la secuencia de aminoácidos de una muteína de lipocalina es diferente de una lipocalina de tipo silvestre correspondiente a una determinada posición en la secuencia de aminoácidos de una lipocalina de tipo silvestre, un experto en la materia puede usar medios y métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, alineaciones, ya sea manualmente o mediante el uso de programas informáticos como BLAST 2.0, que significa en inglés Basic Local Alignment Search Tool, o ClustalW, o cualquier otro programa adecuado que sea adecuado para generar alineaciones de secuencias. En consecuencia, una secuencia de tipo silvestre de lipocalina puede servir como "secuencia objeto" o "secuencia de referencia", mientras que la secuencia de aminoácidos de una muteína de lipocalina diferente de la lipocalina de tipo silvestre descrita en este documento sirve como "secuencia de consulta". Las expresiones "secuencia de tipo silvestre", "secuencia de referencia" y "secuencia objeto" se usan indistintamente en este documento. Una secuencia de lipocalina de tipo silvestre preferida es la secuencia de hTLc tal y como se muestra en SEQ ID NO: 1 o hNGAL tal y como se muestra en SEQ ID NO: 2.

Los "huecos" son espacios en una alineación que son el resultado de adiciones o deleciones de aminoácidos. Por lo tanto, dos copias de exactamente la misma secuencia tienen una identidad del 100%, pero las secuencias que están menos conservadas y tienen deleciones, adiciones o reemplazos, pueden tener un menor grado de identidad de secuencia.

Tal y como se usa en el presente documento, el término "posición" significa la posición de un aminoácido dentro de una secuencia de aminoácidos representada en este documento o la posición de un nucleótido dentro de una secuencia de ácido nucleico representada en este documento. Debe entenderse que cuando se emplea el término "corresponde" o "correspondiente" tal y como se usa en este documento en el contexto de las posiciones de la secuencia de aminoácidos de una o más muteínas de lipocalina, una posición correspondiente no solo está determinada por el número de nucleótidos o aminoácidos precedentes. Por consiguiente, la posición absoluta de un aminoácido dado de acuerdo con la descripción puede variar de la posición correspondiente debido a una deleción o adición de aminoácidos en otra parte en una lipocalina (mutante o de tipo silvestre). De manera similar, la posición absoluta de un nucleótido dado de acuerdo con la presente descripción puede variar de la posición correspondiente debido a deleciones o nucleótidos adicionales en otra parte en una muteína o una región no traducida (UTR) 5' de una lipocalina de tipo silvestre que incluye el promotor y/o cualquier otra secuencia reguladora o gen (incluidos exones e intrones).

Una "posición correspondiente" de acuerdo con la descripción, puede ser la posición de la secuencia que se alinea con la posición de la secuencia a la que corresponde en una alineación de secuencia por parejas o múltiple, de acuerdo con la presente descripción. Es preferible entender que para una "posición correspondiente" de acuerdo con la descripción, las posiciones absolutas de los nucleótidos o aminoácidos pueden diferir de los nucleótidos o aminoácidos adyacentes, pero dichos nucleótidos o aminoácidos adyacentes que se pueden haber intercambiado, delecionado o añadido, pueden estar comprendidos por la misma o por varias "posiciones correspondientes".

Además, para una posición correspondiente en una muteína de lipocalina basada en una secuencia de referencia de acuerdo con la descripción, se debe entender preferiblemente que las posiciones de nucleótidos o aminoácidos de una muteína de lipocalina pueden corresponder estructuralmente a las posiciones en cualquier otra parte de una lipocalina de referencia (lipocalina de tipo silvestre) u otra muteína de lipocalina, incluso si pueden diferir en los números de posición absolutos, como apreciarán los expertos de cara al patrón de plegamiento global altamente conservado entre las lipocalinas.

Tal y como se usan indistintamente en este documento, los términos "conjugar", "conjugación", "fusionar", "fusión" o "enlazado" se refieren a la unión de dos o más subunidades, a través de todas las formas de enlace covalente o no covalente, por medios que incluyen, pero no se limitan a, fusión genética, conjugación química, acoplamiento a través de un enlazador o un agente de entrecruzamiento y asociación no covalente.

La expresión "polipéptido de fusión" o "proteína de fusión", tal y como se usa en el presente documento, se refiere a un polipéptido o una proteína que comprende dos o más subunidades. Una proteína de fusión tal y como se establece en el conjunto de reivindicaciones adjuntas, comprende dos o más subunidades, siendo al menos una de esas subunidades capaz de unirse específicamente a CD137, y otra subunidad capaz de unirse específicamente a PD-L1. Dentro de la proteína de fusión, esas subunidades pueden estar unidas por un enlace covalente o no covalente. Preferiblemente, la proteína de fusión es una fusión traduccional entre las dos o más subunidades. La fusión traduccional puede generarse modificando genéticamente la secuencia codificante de una subunidad en un marco de lectura con la secuencia codificante de otra subunidad. Ambas subunidades pueden estar intercaladas por una secuencia de nucleótidos que codifica un enlazador. Sin embargo, las subunidades de una proteína de fusión de la presente descripción también pueden unirse mediante conjugación química. Las subunidades que forman la proteína de fusión suelen estar unidas entre sí por el extremo C-terminal de una subunidad con el extremo N-terminal de otra subunidad, o el extremo C-terminal de una subunidad con el extremo C-terminal de otra subunidad, o el extremo N-terminal de una subunidad con el extremo N-terminal de otra subunidad, o el extremo N-terminal de una subunidad con el extremo C-terminal de otra subunidad. Las subunidades de la proteína de fusión se pueden unir en cualquier orden y pueden incluir más de una entre cualquiera de las subunidades constituyentes. Si una o más de las subunidades es parte de una proteína (complejo) que consiste en más de una cadena polipeptídica, la expresión "proteína de fusión" también puede referirse a la proteína que comprende las secuencias fusionadas y todas las demás cadenas polipeptídicas de la proteína (complejo). A modo de ejemplo ilustrativo, cuando una inmunoglobulina de longitud completa se fusiona con una muteína de lipocalina a través de una cadena pesada o ligera de la inmunoglobulina, la expresión "proteína de fusión" puede referirse a la cadena polipeptídica única que comprende la muteína de lipocalina y la cadena pesada o ligera. de la inmunoglobulina. La expresión "proteína de fusión" también puede referirse a la inmunoglobulina completa (cadenas tanto ligeras como pesadas) y la muteína de lipocalina fusionada con una o ambas de sus cadenas pesadas y/o ligeras.

Tal y como se usa en el presente documento, el término "subunidad" de una proteína de fusión descrita en este documento se refiere a una sola proteína o una cadena polipeptídica distinta, que puede formar una estructura plegada estable por sí misma y definir una función única de proporcionar un motivo de unión hacia una diana.

Un "enlazador" que puede estar comprendido por una proteína de fusión de la presente descripción, une dos o más subunidades de una proteína de fusión tal y como se describe en el presente documento. El enlace puede ser covalente o no covalente. Un enlace covalente preferido es a través de un enlace peptídico, tal como un enlace peptídico entre aminoácidos. Un enlazador preferido es un enlazador peptídico. En consecuencia, en una realización preferida, dicho enlazador comprende uno o más aminoácidos, tales como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más aminoácidos. Enlazadores peptídicos preferidos se describen en este documento, incluyendo enlazadores de glicina-serina (GS), enlazadores de GS glicosilados y enlazadores de polímero de prolinaalanina-serina (PAS). En algunas realizaciones preferidas, un enlazador de GS es un (G4S)₃ tal y como se describe en SEQ ID NO: 13 se usa para unir las subunidades de una proteína de fusión. Otros enlazadores preferidos incluyen enlazadores químicos.

Tal y como se usa en el presente documento, el término "albúmina" incluye todas las albúminas de mamíferos tales como albúmina de suero humano o albúmina de suero bovino o albúmina de suero de rata.

Tal y como se usa en el presente documento, la expresión "molécula orgánica" o "molécula orgánica pequeña" indica una molécula orgánica que comprende al menos dos átomos de carbono, pero preferiblemente no más de 7 o 12 enlaces de carbono giratorios, que tiene un peso molecular en el intervalo entre 100 y 2000 Dalton, preferentemente entre 100 y 1000 Dalton, y opcionalmente que incluye uno o dos átomos metálicos.

Una "muestra" se define como una muestra biológica tomada de cualquier sujeto. Las muestras biológicas incluyen, pero no se limitan a, sangre, suero, orina, heces, semen o tejido, incluido un tejido tumoral.

Un "sujeto" es un vertebrado, preferentemente un mamífero, más preferentemente un ser humano. El término "mamífero" se usa en este documento para referirse a cualquier animal clasificado como mamífero, incluidos, pero sin limitación, seres humanos, animales domésticos y de granja, y animales de zoológico, para deporte o de compañía, tales como ovejas, perros, caballos, gatos, vacas, ratas, cerdos, simios como los monos macacos cangrejeros, por nombrar solo algunos ejemplos ilustrativos. Preferiblemente, el "mamífero" utilizado en este documento es un ser humano.

Una "cantidad eficaz" es una cantidad suficiente para producir resultados beneficiosos o deseados. Una cantidad eficaz puede administrarse en una o más administraciones o dosis individuales.

Tal y como se usa en el presente documento, "anticuerpo" incluye anticuerpos completos o cualquier fragmento que se une a antígeno (es decir, "porción que se une a antígeno") o una sola cadena del mismo. Un anticuerpo completo se refiere a una glicoproteína que comprende al menos dos cadenas pesadas (HCs) y dos cadenas ligeras (LCs) interconectadas por enlaces disulfuro. Cada cadena pesada se compone de un dominio variable de cadena pesada (V_H o HCVR) y una región constante de cadena pesada (C^h). La región constante de la cadena pesada se compone de tres dominios, C^h1, C^h2 y C^h3. Cada cadena ligera se compone de un dominio variable de cadena ligera (V^l o LCVR) y una región constante de cadena ligera (Cl). La región constante de la cadena ligera se compone de un dominio, Cl. Las regiones V_H y V^l se pueden subdividir en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDRs), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones estructurales (FRs). Cada Vh y Vl se compone de tres CDRs y cuatro FRs, dispuestas en el siguiente orden desde el extremo amino al extremo carboxi: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de unión que interacciona con un antígeno (por ejemplo, PD-L1). Las regiones constantes de los anticuerpos opcionalmente pueden mediar en la unión de la inmunoglobulina a los tejidos o factores del hospedador, incluidas diversas células del sistema inmune (p. ej., células efectoras) y el primer componente (C1q) del sistema del complemento clásico.

Tal y como se usa en el presente documento, "fragmento que se une a antígeno" de un anticuerpo se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que conservan la capacidad de unirse específicamente a un antígeno (p. ej., PD-L1). Se ha mostrado que la función de unión a antígeno de un anticuerpo puede realizarse mediante fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Los ejemplos de fragmentos de unión incluidos en la expresión "fragmento que se une a antígeno" de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab que consiste en los dominios V_H, V^l, C^l y Cm; (ii) un fragmento F(ab^')2 que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento Fab' que consiste en los dominios Vh, Vl, Cl y C_H1 y la región entre los dominios C_H1 y Ch² ; (iv) un fragmento Fd que consiste en los dominios V_H y C_H1; (v) un fragmento Fv monocatenario que consiste en los dominios V_H y V^l de un solo brazo de un anticuerpo, (vi) un fragmento dAb (Ward et al., Nature, 1989) que consiste en un domino V_H; y (vii) una región determinante de la complementariedad (CDR) aislada o una combinación de dos o más CDRs aisladas que pueden unirse opcionalmente mediante un enlazador sintético; (viii) un "diacuerpo" que comprende Vh y Vl conectados en la misma cadena polipeptídica usando un enlazador corto (véanse, por ejemplo, los documentos de patente EP 404.097; WO 93/11161; y Holliger et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 1993); (ix) un "fragmento de dominio de anticuerpo" que contiene solo Vh o Vl, en donde en algunos casos dos o más regiones Vh están unidas covalentemente.

Los anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales; xenogénicos, alogénicos o singénicos; o formas modificadas de los mismos (por ejemplo, humanizado, quimérico o multiespecífico). Los anticuerpos también pueden ser completamente humanos.

Tal y como se usa en el presente documento, región "estructural" o "FR" se refiere a los residuos del dominio variable distintos de los residuos de la región hipervariable (CDR).

"Región cristalizable de un fragmento" o "región Fc" se refiere a la región C-terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina, incluidas las regiones Fc de secuencia natural y las regiones Fc variantes. Aunque los límites de la región Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina pueden variar, la región Fc de la cadena pesada de IgG humana generalmente se define por extenderse desde un residuo de aminoácido en la posición Cys226, o desde Pro230, hasta el extremo carboxilo terminal de la misma, numerándose de acuerdo con índice EU de Kabat (Johnson y Wu, Nucleic Acids Res, 2000). La lisina C-terminal (residuo 447 según el índice EU de Kabat) de la región Fc puede eliminarse, por ejemplo, durante la producción o purificación del anticuerpo, o mediante ingeniería recombinante del ácido nucleico que codifica una cadena pesada del anticuerpo. Por consiguiente, una composición de anticuerpos intactos puede comprender poblaciones de anticuerpos con todos los residuos de K447 eliminados, poblaciones de anticuerpos sin residuos de K447 eliminados y poblaciones de anticuerpos que tienen una mezcla de anticuerpos con y sin el residuo de K447.

"Receptor Fc" o "FcR" se refiere a un receptor que se une a la región Fc de un anticuerpo.

Tal y como se usa en el presente documento, "anticuerpo aislado" se refiere a un anticuerpo que está sustancialmente libre de su entorno natural. Por ejemplo, un anticuerpo aislado está sustancialmente libre de material celular y otras proteínas de la fuente celular o tisular de la que se obtiene. Un "anticuerpo aislado" se refiere además a un anticuerpo que está sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen diferentes especificidades antigénicas. En el presente caso, un anticuerpo aislado que se une específicamente a PD-L1, está sustancialmente libre de anticuerpos que se unen específicamente a antígenos distintos de PD-L1. Sin embargo, un anticuerpo aislado que se une específicamente a PD-L1 puede tener reactividad cruzada con otros antígenos, como moléculas de PD-L1 de otras especies.

Tal y como se usa en el presente documento, "anticuerpo monoclonal" se refiere a una preparación de moléculas de anticuerpo de composición molecular única. Una composición de anticuerpo monoclonal muestra una única especificidad de unión y afinidad hacia un epítopo particular.

Tal y como se usa en el presente documento, "anticuerpo humanizado" se refiere a un anticuerpo que consiste en la CDR de anticuerpos obtenidos a partir de mamíferos que no sean humanos, y la región FR y la región constante de un anticuerpo humano u obtenido a partir de un anticuerpo humano. La expresión "agente terapéutico" o "agente terapéuticamente activo", tal y como se usa en el presente documento, se refiere a un agente que es terapéuticamente útil. Un agente terapéutico puede ser cualquier agente para la prevención, mejora o tratamiento de una enfermedad, un estado fisiológico, un síntoma o para su evaluación o diagnóstico.

Tal y como se usa en el presente documento, "anticuerpo humano" incluye anticuerpos que tienen regiones variables en las que tanto la región estructural como las regiones CDRs se obtienen a partir de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Además, si el anticuerpo contiene una región constante, la región constante también se obtiene a partir de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Sin embargo, la expresión "anticuerpo humano", tal y como se usa en el presente documento, se entiende que no incluye anticuerpos en los que las secuencias de CDRs obtenidas a partir de la línea germinal de otra especie de mamífero, como un ratón, se han injertado en secuencias de la región estructural humana.

III Descripciones de las Figuras

Figura 1: proporciona una descripción general del diseño de las proteínas de fusión representativas, descritas en esta solicitud que son biespecíficas para las dianas CD137 y PD-L1. Se prepararon proteínas de fusión representativas basándose en un anticuerpo específico para PD-L1 (por ejemplo, un anticuerpo en el que las cadenas pesadas son proporcionadas por SEQ ID NO: 86, o comprenden un dominio variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 77, o comprenden las secuencias CDRs de GfSlSNYD (HCDR1, SEQ ID NO: 60), Iw Tg GAT (HCDR2, SEQ ID NO: 61) y VRDSNYRYDEPFTY (HCDR3; SEQ ID NO: 62), y las cadenas ligeras son proporcionadas por SEQ ID NO: 87, o comprenden un dominio variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 82, o comprenden las secuencias CDRs de QSIGTN (LCDR1, SEQ ID NO: 63), YAS (LCDR2) y QQSNSWPYT (LCDR3; SEQ ID NO: 64) y una o más muteínas de lipocalina específicas para CD137 (por ejemplo, la muteína de lipocalina de SEQ ID NO: 42). Una o más muteínas de lipocalina se fusionaron genéticamente con el extremo C y/o el extremo N de la cadena pesada o de la cadena ligera de un anticuerpo específico de PD-L1, como se muestra en la Figura 1A-1I, dando como resultado las proteínas de fusión, p. ej., ^s E^q ID NOs: 90 y 87, SEQ ID NOs: 86 y 91, SEQ ID NOs: 92 y 87, SEQ ID NOs: 86 y 93, SEQ ID NOs: 94 y 87 y SEQ ID NOs: 90 y 91. Las proteínas de fusión generadas pueden ser bivalentes para CD137 (por ejemplo, como se muestra en la Figura 1A-1D), o tetravalentes para CD137 (por ejemplo, como se muestra en la Figura 1E-1H), o tienen una valencia aún mayor para CD137 (por ejemplo, como se muestra en la Figura 1I). Se generaron proteínas de fusión monoespecíficas adicionales, fusionando una o más muteínas de lipocalina específicas de CD137 (por ejemplo, como se muestra en la Figura 1J-1K) con el extremo C-terminal de la región Fc de un anticuerpo proporcionado como se describe en el presente documento, a través de un enlazador peptídico. Las proteínas de fusión monoespecíficas resultantes se proporcionan, por ejemplo, en SEQ ID NO: 88 y SEQ ID NO: 89.

Figura 2: muestra los resultados de experimentos ELISA en los que se determinó la unión a PD-L1 o CD137 de proteínas de fusión representativas como se describe en el Ejemplo 4. Se revistió PD-L1 o CD137 (con marcador His o Fc C-terminal) sobre una placa de microtitulación, y los agentes sometidos a ensayo se titularon comenzando con la concentración más alta de 100 nM. Los agentes unidos en estudio se detectaron mediante anti-Fc de IgG humana-HRP o anti-NGAL-HRP, respectivamente. Los datos se ajustaron con un modelo de unión 1:1 con un valor de CE₅₀ y la señal máxima como parámetros libres, y una pendiente que se fijó en uno. Los valores de CE₅₀ resultantes se proporcionan en la Tabla 4.

Figura 3: ilustra los resultados de un experimento ELISA en el que se determinó la capacidad de proteínas de fusión representativas para unirse simultáneamente a ambas dianas, PD-L1 y CD137, como se describe en el Ejemplo 5. Se revistió con huPD-L1-His o huCD137-His recombinante una placa de microtitulación, seguido de una titulación de las proteínas de fusión comenzando con la concentración más alta de 100 nM. Posteriormente, se añadió una concentración constante de huCD137-His biotinilado o huPD-L1-His biotinilado, respectivamente, que se detectó mediante ExtrAvidin-Peroxidase.

Figura 4: muestra los resultados de una evaluación de la unión a la diana de las proteínas de fusión mediante citometría de flujo, utilizando células Flp-In-CHO que expresan CD137 humano o de macaco cangrejero (cyno) (Figura 4A-4B) así como PD-L1 humano o de macaco cangrejero (Figura 4C-4D) como se describe en el Ejemplo 6. No se observó unión cuando se usaban células Flp-In-CHO transfectadas de forma simulada (Figura 4E). Se utilizaron las medias geométricas de la intensidad de la fluorescencia para calcular los valores de CE₅₀ usando una regresión no lineal (parte inferior compartida, PENDIENTE = 1). Los valores de CE₅₀ se proporcionan en la Tabla 6.

Figura 5 : muestra la unión de proteínas de fusión a células tumorales positivas para PD-L1 evaluadas mediante citometría de flujo, mediante la incubación de células RKO y proteínas de fusión como se describe en el Ejemplo 7.

Figura 6 : proporciona ejemplos de un experimento basado en SPR de unión múltiple, diseñado para investigar si las interacciones de la proteína de fusión con CD137 se ven obstaculizadas por la unión de CD137L a CD137, como se describe en el Ejemplo 8. Esto se evalúa generando un complejo de huCD137 (fusión de Fc C-terminal) y huCD137L (con un marcador His C-terminal) en el chip sensor SPR y verificando si las proteínas de fusión aún pueden unirse al complejo de huCD137 y CD137L. Como referencia, huCD137 en ausencia de huCD137L también se incuba con las proteínas de fusión analizadas. La traza de SPR para la unión de la proteína de fusión respectiva solo a huCD137, está marcada con una flecha con un eje negro. La traza de SPR para la unión de la proteína de fusión respectiva a huCD137 que se ha saturado con huCD137L está marcada con una flecha con un eje a trazos. Como controles, se usaron inyecciones en blanco sin proteínas de fusión. El experimento muestra que todas las proteínas de fusión sometidas a ensayo se podían unir a CD137 en presencia de CD137L.

Figura 7: muestra que las proteínas de fusión compiten con PD-L1 para unirse a PD-1, representado en estudios ELISA competitivos como se describe en el Ejemplo 9. Se recubrió una placa de microtitulación con una concentración constante de huPD-1-His, seguido de la adición de una mezcla de moléculas del ensayo con diferentes concentraciones y el trazador huPD-L1-Fc con una concentración fija. El trazador unido se detectó usando un anticuerpo anti-Fc de IgG marcado con HRP. Se observó la inhibición dependiente de la dosis de la unión de huPD-L1-Fc a PD-1 por las proteínas de fusión biespecíficas de CD137 y PD-L1 o los anticuerpos específicos de PD-L1.

Figura 8: El potencial de las proteínas de fusión representativas para coestimular la activación de los linfocitos T de una manera dependiente de la diana PD-L1 se evaluó mediante un bioensayo con CD137. Se cocultivaron células Jurkat NF ^k B-I^uc2/CD137 con la línea celular tumoral RKO que expresaba PD-L1 en presencia de diversas concentraciones de las proteínas de fusión o los controles. Después de 4 h, se añadió reactivo de ensayo de luciferasa y se midieron las señales luminiscentes. El análisis de la curva logística de cuatro parámetros se realizó con GraphPad Prism® para calcular los valores de CE₅₀ (véase la Tabla 9). Las proteínas de fusión solo coestimulan la activación de los linfocitos T en presencia de PD-L1 (Figura 8A y 8C) pero no en ausencia de PDL1 (Figura 8B y 8D). Por el contrario, el mAb anti-CD137 de referencia (SEQ ID NOs: 28 y 29) muestra una activación similar en presencia y ausencia de células RKO positivas para PD-L1.

Figura 9: muestra los resultados de un experimento representativo en el que se investigó la capacidad de las proteínas de fusión seleccionadas para inducir la activación de linfocitos T. Los anticuerpos de PD-L1, incluyendo la unidad estructural del anticuerpo de PD-L1 respectivo, las muteínas de lipocalina que se unen a CD137 como fusiones de Fc y un anticuerpo de referencia anti-CD137, se sometieron a ensayo solos y en combinación como una mezcla anti-PD-L1/anti-CD137. En el experimento, se incubaron células mononucleares de sangre periférica humana (PBMCs) con proteínas de fusión, anticuerpos, fusiones de Fc y muteína de lipocalina, mezclas o control en presencia de 1 ng/ml de enterotoxina B estafilocócica (SEB). Los niveles de interleucina 2 secretada (IL-2), que reflejaban la activación de los linfocitos T, se determinaron mediante un ensayo basado en electroquimioluminiscencia como lectura de la activación de los linfocitos T y se normalizaron con los niveles del control de IgG4 correspondiente, como se describe en el Ejemplo 11. Todas las proteínas de fusión son capaces de inducir la activación de los linfocitos T, y con mayor fuerza o al menos de forma comparable a las unidades estructurales individuales o una mezcla de anticuerpos anti-PD-L1/anti-CD137 de referencia.

Figura 10: muestra la capacidad de las proteínas de fusión representativas para coestimular la activación de linfocitos T de una manera dependiente de la diana PD-L1. Los anticuerpos de PD-L1, incluida la unidad estructural del anticuerpo de PD-L1 respectivo, las muteínas de lipocalina que se unen a CD137 como fusiones de Fc y un anticuerpo de referencia anti-CD137, se sometieron a ensayo solos y en combinación como una mezcla anti-PD-L1/anti-CD137. Varias líneas de células tumorales que expresaban diferentes niveles de PD-L1 (Alto: RKO; Moderado: HCC827; Negativo: HepG) se sembraron en placas recubiertas con anti-CD3 humano. Se añadieron linfocitos T de todos los tipos (pan linfocitos T) y diversas concentraciones de proteínas de fusión y unidades estructurales individuales y se incubaron durante 3 días. Los niveles de IL-2 secretada se determinaron mediante un ensayo basado en electroquimioluminiscencia, como se describe en el Ejemplo 12. Todas las proteínas de fusión son capaces de aumentar la secreción de IL-2 de forma dependiente de PD-L1.

Figura 11: ilustra la estabilidad durante el almacenamiento de las proteínas de fusión en PBS o histidina 25 mM, NaCl 60 mM, arginina 200 mM pH 6, después de 1, 2, 3 o 4 semanas de incubación a 37°C o 40°C con una concentración de 1 mg/ml o 20 mg/ml. La estabilidad se evalúa mediante la recuperación de monómeros a partir de una exclusión analítica por tamaño o mediante la recuperación de proteínas funcionales a partir de un ELISA cuantitativo, como se describe en Ejemplo 13.

Figura 12: muestra la capacidad de una proteína de fusión representativa (SEQ ID NOs: 90 y 87) para estimular la secreción de IL-2 en una reacción mixta de linfocitos (MLR) con linfocitos T CD4+. Las proteínas de fusión, la unidad estructural del anticuerpo de PD-L1 (SEQ ID NOs: 86 y 87), la muteína de lipocalina que se une a CD137 como una fusión de Fc (SEQ ID NO: 89) y un anticuerpo de referencia anti-CD137 o de referencia anti-PD-L1 solo o en combinación como una mezcla anti-PD-L1/anti-CD137, se analizó con concentraciones equimolares, como se describe en el Ejemplo 14. La secreción de IL-2 se midió en los materiales sobrenadantes después de 6 días de incubación con linfocitos T CD4+ humanos totales y células dendríticas obtenidas a partir de monocitos (moDCs) procedentes de diferentes donantes sanos. La Figura 12A ilustra que la proteína de fusión SEQ ID NOs: 90 y 87 mostraba un aumento significativo en la secreción de IL-2 en comparación con la unidad estructural sola (el anticuerpo de PD-L1 SEQ ID NOs: 86 y 87 o la muteína de lipocalina específica de CD137 SEQ ID NO: 89) y un anticuerpo anti-PD-L1 o anti-CD137 de referencia (SEQ ID NOs: 26 y 27 o SEQ ID NOs: 28 y 29, respectivamente), en concentraciones equimolares (equivalentes a 10 o 0,1 Mg/ml de la proteína de fusión sometida a ensayo). Se muestran los datos de 8 experimentos independientes. La Figura 12B muestra que la proteína de fusión SEQ ID NOs: 90 y 87 era capaz de inducir una secreción de IL-2 dependiente de la dosis, en concentraciones que oscilaban entre 0,001 y 20 Mg/ml. Los niveles de IL-2 inducidos por la proteína de fusión eran mayores en comparación con las concentraciones equimolares de la mezcla de un anticuerpo anti-PD-L1 de referencia (SEQ iD NOs: 26 y 27) y un anticuerpo anti-CD137 de referencia (SEQ ID NOs: 28 y 29). Se muestran los datos de un donante representativo.

Figura 13: muestra la capacidad de una proteína de fusión ejemplar (SEQ ID NOs: 90 y 87) para inducir la secreción de moléculas efectoras de linfocitos T CD8+. La proteína de fusión se cultivó con moDCs y linfocitos T CD8+ de donantes sanos no coincidentes durante 6 días, después de lo cual se cuantificó la secreción de IL-2 y moléculas efectoras de linfocitos T CD8+ en los materiales sobrenadantes usando un ensayo Luminex como se describe en el Ejemplo 15. La proteína de fusión SEQ ID NOs: 90 y 87 mostraba un aumento en la secreción de IL-2 y factores citotóxicos (perforina, granzima B y granzima A) con 10 Mg/mL, en comparación con el anticuerpo anti-PD-L1 de referencia (SEQ ID NOs: 26 y 27) y el anticuerpo anti-CD137 de referencia (SEQ ID NOs: 28 y 29) cuando se usaba sola o como una mezcla.

Figura 14: muestra que las proteínas de fusión se unen a epítopos solapantes con un anticuerpo de CD137 clínicamente activo (SEQ ID NOs: 28 y 29), representado en los estudios de ELISA competitivos como se describe en el Ejemplo 17. Se recubrió una placa de microtitulación con una concentración constante de SEQ ID NOs: 28 y 29, seguido de la adición de una mezcla de moléculas del ensayo con diferentes concentraciones y el trazador de huCD137-Fc biotinilado con una concentración fija. El trazador unido se detectó a través de ExtrAvidin-Peroxidase. Las proteínas de fusión compiten con el anticuerpo de CD137 por la unión a CD137.

Figura 15: muestra el potencial de las proteínas de fusión representativas para bloquear la señal inhibidora mediada por la interacción entre PD-1/PD-L1, evaluada usando un bioensayo de bloqueo de PD-1/PD-L1 como se describe en el Ejemplo 18. Se cocultivaron células T PD-1-NFAT-luc Jurkat (una línea celular Jurkat que expresa PD-1 y un gen de luciferasa mediado por NFAT bajo el control del promotor de NFAT) con células PD-L1 aAPC/CHO-K1 en presencia de varias concentraciones de moléculas del ensayo. Después de 6 horas, se añadió reactivo del ensayo de luciferasa y se midieron las señales luminiscentes. La señal de fondo son células T PD-1-NFAT-luc Jurkat cocultivados solo con células PD-L1 aAPC/CHO-K1. La proteína de fusión de SEQ ID NOs: 90 y 87 bloquea la vía PD-1/PD-L1, de forma comparable a los anticuerpos de PD-L1 sometidos a ensayo, incluido el anticuerpo de PD-L1 de la unidad estructural que se muestra en SEQ ID NOs: 86 y 87 y el anticuerpo de PD-L1 de referencia mostrado en SEQ ID NOs: 26 y 27.

Figura 16: muestra la capacidad de una proteína de fusión representativa para inducir la activación de linfocitos T. También se sometió a ensayo la unidad estructural del anticuerpo de PD-L1 y un anticuerpo de CD137 de referencia, cuando se usaba solo y en combinación con un anticuerpo de PD-L1. En el experimento, se incubaron PBMCs humanas con la proteína de fusión, anticuerpos, mezclas o control en presencia de 0,1 ng/ml de SEB. Los niveles de IL-2 secretada se determinaron mediante un ensayo basado en electroquimioluminiscencia como lectura para la activación de linfocitos T, como se describe en el Ejemplo 19 y representado en la Figura 16A. La Figura 16B muestra el n° de veces del aumento de los niveles de secreción de IL-2, inducido por las moléculas del ensayo en comparación con el nivel de secreción de IL-2 de fondo (PBMCs estimuladas con 0,1 ng/ml de SEB y sin ninguna molécula del ensayo). La proteína de fusión conduce a un aumento dependiente de la dosis en la secreción de IL-2, que es más fuerte que con un anticuerpo de PD-L1 o un anticuerpo de CD137 solos o en combinación.

Figura 17: demuestra la capacidad de una proteína de fusión representativa para coestimular la activación de linfocitos T en presencia de PD-L1. La unidad estructural del anticuerpo de PD-L1, un anticuerpo de CD137 de referencia y una mezcla del anticuerpo de CD137 y un anticuerpo de PD-L1 de referencia se sometieron a ensayo en paralelo. Células CHO transfectadas con PD-L1 humano (Figura 17A) o transfectadas de forma simulada (PD-L1 humano negativo, Figura 17B) se sembraron en placas recubiertas con anti-CD3 antihumano. Se añadieron linfocitos T de todos los tipos, así como diversas concentraciones de moléculas del ensayo, y se incubaron durante 2 días. Los niveles de IL-2 secretada en el material sobrenadante se determinaron mediante un ensayo basado en electroquimioluminiscencia, como se describe en el Ejemplo 20. Los niveles de secreción de IL-2 se normalizaron con los niveles de fondo (linfocitos T de todos los tipos anti-CD3 células CHO) para representar el n° de veces de aumento de la secreción de IL-2 en presencia de células CHO que expresaban PD-L1 humana (Figura 17C) o células CHO transfectadas de forma simulada (Figura 17D). La proteína de fusión induce un fuerte aumento dependiente de la dosis en la secreción de IL-2 solo en presencia de PD-L1, más fuertemente que con el anticuerpo de CD137 de referencia solo o en combinación con el anticuerpo de PD-L1 de referencia.

Figura 18: proporciona el resultado de análisis farmacocinéticos de las proteínas de fusión biespecíficas y la unidad estructural del anticuerpo de PD-L1 (SEQ ID NOs: 86 y 87) en ratones, como se describe en Ejemplo 21. Ratones CD-1 macho fueron inyectados por vía intravenosa (3 ratones por punto temporal) con proteínas de fusión con una dosis de 10 mg/kg. Los niveles de fármaco se detectaron usando un ELISA de tipo sándwich que detectaba la molécula completa a través de las dianas PD-L1 y CD137. Los niveles plasmáticos de anticuerpos anti-PD-L1 se determinaron utilizando un ELISA de tipo sándwich con las dianas PD-L1 y Fc humano.

Figura 19: proporciona los resultados de un análisis farmacocinético de una proteína de fusión representativa (SEQ ID NOs: 90 y 87) en comparación con dos proteínas de fusión que se unen a CD137 y PD-L1 descritas previamente (SEQ ID NO: 147 y SEQ ID NO: 148) en ratones, como se describe en el Ejemplo 22. Ratones CD-1 macho fueron inyectados por vía intravenosa (2 ratones por punto temporal) con moléculas del ensayo con una dosis de 2 mg/kg. Los niveles de fármaco se detectaron usando un ELISA en los puntos temporales indicados. Los datos se representaron en un gráfico de tiempo frente a concentración. SEQ ID NOs: 90 y 87 descritas en este documento, pero no SEQ ID NO: 147 o SEQ ID NO: 148, muestra un perfil farmacocinético favorable o una farmacocinética similar a la de un anticuerpo.

IV. Descripción detallada de la descripción

Tal y como se describe en el presente documento, la presente descripción incluye el reconocimiento de que un aglutinante bivalente de CD137, tal como un anticuerpo, puede no ser suficiente por sí mismo para agrupar CD137 sobre linfocitos T o células NK y conducir a una activación eficiente, similar a la falta de actividad del CD137L soluble trivalente. En publicaciones recientes que utilizan modelos de ratón preclínicos, in vivo, se han presentado evidencias de que el modo de acción de otros anticuerpos anti-TNFR requiere la interacción de los anticuerpos a través de su parte Fc con receptores Fc-gamma en células que expresan receptores Fc-gamma (Bulliard et al., Immunol Cell Biol, 2014, Bulliard et al., J Exp Med, 2013). Por lo tanto, el modo de acción de esos anticuerpos anti-TNFR puede estar dominado por una agrupación no dirigida a través de los receptores Fc-gamma, dependiendo de la presencia de células que expresan el receptor Fc-gamma, que no necesariamente se sobreexpresan en el microambiente tumoral diana, como en comparación con los tejidos normales.

Por lo tanto, existe una necesidad insatisfecha de generar tratamientos que agrupen y activen CD137 con un modo de acción específico dirigido a un tumor.

Para satisfacer esta necesidad no satisfecha, la presente descripción proporciona, entre otras cosas, enfoques novedosos para acoplar simultáneamente CD137 y PD-L1 a través de una o más proteínas de fusión que tienen especificidad de unión hacia CD137 y especificidad de unión hacia PD-L1. Las proteínas de fusión proporcionadas están diseñadas para promover la agrupación de CD137 al crear un puente entre los linfocitos T positivos para CD137 y PD-L1 expresado en el microambiente tumoral. Tales moléculas biespecíficas pueden combinar la activación y expansión de linfocitos T inducidos por CD137 con el bloqueo del punto de control inmune mediado por anti-PD-L1 y, por lo tanto, pueden superar ciertas limitaciones de la terapia con un solo agente y ofrecer beneficios, por ejemplo, a pacientes resistentes o que no responden. Las proteínas de fusión también están diseñadas para proporcionar potenciales de una terapia combinatoria en una molécula y, al mismo tiempo, permitir la inducción localizada de linfocitos T específicos de antígeno en el microambiente del tumor, reduciendo potencialmente la toxicidad periférica.

En algunos aspectos, la presente descripción proporciona proteínas de fusión que se unen a CD137 y PD-L1, así como métodos y aplicaciones útiles de las mismas. La descripción también proporciona métodos para producir proteínas de fusión de unión a CD137 y PD-L1 descritas en el presente documento, así como composiciones que comprenden esas proteínas. Las proteínas de fusión que se unen a CD137 y PD-L1 de la descripción, así como sus composiciones, pueden usarse en métodos para detectar CD137 y/o PD-L1 en una muestra, en métodos para unir CD137 y/o PD-L1 en un sujeto, o en métodos de modulación de respuestas inmunitarias en un sujeto. No se han descrito previamente tales proteínas de fusión que tengan esas características correspondientes a los usos proporcionados por la presente descripción. En contraposición a las proteínas de fusión proporcionadas en el presente documento, las proteínas de fusión previamente conocidas que se dirigen tanto a CD137 como a PD-L1 tienen una o más farmacocinéticas deficientes, un grado inaceptable de unión fuera de la diana, capacidad reducida o degradada de unirse a una o ambas dianas de una proteína de fusión particular (por ejemplo, PD-L1 y/o CD137) y/o un grado inaceptable de activación no específica (por ejemplo, independiente de PD-L1), por ejemplo, del sistema inmune.

A. Ejemplos de proteínas de fusión específicas para CD137 y PD-L1 de la descripción

La presente invención se refiere a una proteína de fusión que es capaz de unirse tanto a CD137 como a PD-L1, en donde la proteína de fusión comprende dos subunidades, en donde la primera subunidad comprende una inmunoglobulina de longitud completa que es específica para PD-L1, y en donde la segunda subunidad comprende una muteína de lipocalina que es específica para CD137, en donde la proteína de fusión comprende secuencias de aminoácidos que tienen al menos un 90% de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos mostradas en SEQ ID NOs: 90 y 87, en donde la cadena pesada de la inmunoglobulina comprende el siguiente conjunto de secuencias CDRs: GFSLSNYD (HCDR1, SEQ ID NO: 60), IWTGGAT (HCDR2, SEQ ID NO: 61) y VRDSNYRYDEPFTY (HCDR3, SEQ ID NO: 62) y la cadena ligera de la inmunoglobulina comprende el siguiente conjunto de secuencias CDRs: QSIGTN (LCDR1, SEQ ID NO: 63), YAS (LCDR2) y QQSNSWPYT (LCDR3, SEQ ID NO: 64), y en donde la secuencia de aminoácidos de la muteína de lipocalina comprende el siguiente conjunto de residuos de aminoácidos mutados en comparación con la secuencia polipeptídica lineal de hNGAL madura (como se muestra en SEQ ID NO: 2): Gln 28 ^ His; Leu 36 ^ Gln; Ala 40 ^ Ile; Ile 41 ^ Arg; Gln 49 ^ Ile; Tyr 52 ^ Met; Asn 65 ^ Asp; Ser 68 ^ Met; Leu 70 ^ Lys; Arg 72 ^ Asp; Lys 73 ^ Asp; Asp 77 ^ Met; Trp 79 ^ Asp; Arg 81 ^ Trp; Cys 87 ^ Ser; Asn 96 ^ Lys; Tyr 100 ^ Phe; Leu 103 ^ His; Tyr 106 ^ Ser; Lys 125 ^ Phe; Ser 127 ^ Phe; Tyr 132 ^ Glu; y Lys 134 ^ Tyr. Una proteína de fusión proporcionada tal y como se establece en el conjunto de reivindicaciones adjunto, contiene al menos dos subunidades: (1) una primera subunidad que comprende una inmunoglobulina de longitud completa específica para PD-L1, y (2) una segunda subunidad que comprende una muteína de lipocalina específica para CD137.

En algunas realizaciones, al menos una subunidad se puede unir a otra subunidad a través de un enlazador. En algunas realizaciones adicionales, un enlazador es un enlazador peptídico, por ejemplo, un enlazador de glicina-serina (GS) no estructurado, un enlazador de GS glicosilado o un enlazador polimérico de prolina-alanina-serina (PAS). En algunas realizaciones, un enlazador GS es un enlazador (Gly4Ser)₃ ((G4S)₃) como se muestra en SEQ ID NO: 13. Otros enlazadores ejemplares se muestran en SEQ ID NOs: 14-23. En algunas realizaciones, un enlazador peptídico puede tener de 1 a 50 aminoácidos, tal como 1,2, 3, 4, 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 1718, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 aminoácidos. Por ejemplo, cuando una primera subunidad comprende una inmunoglobulina de longitud completa, una segunda subunidad puede unirse a través de un enlazador peptídico entre el extremo N-terminal de la segunda subunidad y el extremo C-terminal de una región constante de la cadena pesada (CH) de dicha inmunoglobulina.

Generalmente, una subunidad puede estar fusionada en su extremo N-terminal y/o su extremo C-terminal con otra subunidad.

En algunas realizaciones, con respecto a una proteína de fusión de la descripción, en donde al menos una subunidad puede ser o comprender una inmunoglobulina de longitud completa, la función Fc de la región Fc de la inmunoglobulina de longitud completa para la célula positiva para el receptor Fc, puede estar conservada al mismo tiempo que cuando la proteína de fusión se acopla simultáneamente a CD137 y PD-L1.

En algunas realizaciones, en las que al menos una subunidad de una proteína de fusión proporcionada puede ser o comprender una inmunoglobulina de longitud completa, la función Fc de la región Fc de la inmunoglobulina de longitud completa para la célula positiva para el receptor Fc, puede reducirse o suprimirse por completo mediante ingeniería genética de proteínas cuando la proteína de fusión interacciona simultáneamente con CD137 y PD-L1. En algunas realizaciones, esto se puede lograr, por ejemplo, cambiando la estructura principal de IgG1 a IgG4, ya que se sabe que IgG4 muestra interacciones reducidas con el receptor Fc-gamma en comparación con IgG1. En algunas realizaciones, para reducir aún más la unión residual a receptores Fc-gamma, se pueden introducir mutaciones en la estructura principal de IgG4, tal como F234A y L235A. En algunas realizaciones, también se puede introducir una mutación S228P en la estructura principal de IgG4 para minimizar el intercambio de medio anticuerpo de IgG4 (Silva et al., J Biol Chem, 2015). En algunas realizaciones, las mutaciones F234A y L235A pueden introducirse para la disminución de A^d C^c y ADCP (Glaesner et al., Diabetes Metab Res Rev., 2010) y/o mutaciones M428L y N434S o mutaciones M252Y, S254T y T256E para prolongar la semivida sérica (Dall'Acqua et al., J Biol Chem, 2006, Zalevsky et al., Nat Biotechnol, 2010). En algunas realizaciones, puede estar presente una mutación N297A adicional en la cadena pesada de la inmunoglobulina de la proteína de fusión para eliminar el motivo de glicosilación natural.

En algunas realizaciones, la porción Fc de una inmunoglobulina incluida en una proteína de fusión de la descripción puede contribuir a mantener los niveles séricos de la proteína de fusión. Por ejemplo, cuando la porción Fc se une a los receptores de Fc en las células endoteliales y los fagocitos, la proteína de fusión puede internalizarse y reciclarse nuevamente de vuelta al torrente sanguíneo, mejorando su semivida dentro del cuerpo.

En un aspecto, las proteínas de fusión de la descripción se unen a CD137 con afinidad elevada. En otro aspecto, las proteínas de fusión proporcionadas se unen a PD-L1 con afinidad elevada. En algunas realizaciones preferidas, las proteínas de fusión proporcionadas se unen simultáneamente a CD137 y PD-L1. En algunas realizaciones, la unión simultánea a CD137 y PD-L1 permite que las proteínas de fusión proporcionadas muestren una respuesta duradera antitumoral o antiinfecciosa.

En algunas realizaciones, una proteína de fusión proporcionada comprende las secuencias de aminoácidos que se muestran en SEQ ID NOs: 90 y 87.

En algunas realizaciones, una proteína de fusión proporcionada comprende las secuencias de aminoácidos que tienen al menos un 92%, al menos un 95%, al menos un 97%, al menos un 98% o incluso una mayor identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos que se muestran en SEQ ID NOs: 90 y 87.

B. Ejemplos de inmunoglobulinas incluidas en las proteínas de fusión

Una proteína de fusión tal y como se establece en el conjunto de reivindicaciones adjuntas, comprende una primera subunidad que comprende una inmunoglobulina de longitud completa específica para PD-L1. En algunas realizaciones, una inmunoglobulina, por ejemplo, puede ser IgG1, IgG2 o IgG4. En algunas realizaciones, una inmunoglobulina es o comprende IgG4.

Los ejemplos ilustrativos de anticuerpos que se unen a PD-L1 de la descripción pueden comprender una región que se une a antígeno que bloquea de forma cruzada o se une al mismo epítopo que un anticuerpo que se une a PD-L1 que comprende regiones del dominio variable de la cadena pesada (V_H) y del dominio variable de la cadena ligera (V^l) de un anticuerpo conocido como atezolizumab (también conocido como MPDL3280A o RG7446, nombre comercial Tecentriq®), avelumab (también conocido como MSB0010718C, nombre comercial Bavencio®), durvalumab (anteriormente conocido como MEDI4736, nombre comercial Imfinzi®) y BMS-936559 (también conocido como MDX-1105), 5C10 (incluido 5C10 humanizado), 5F10 (incluido 5F10 humanizado) y 9F6 (incluido 9F6 humanizado).

En algunas realizaciones, la pareja de cadena pesada y cadena ligera de un anticuerpo de PD-L1 proporcionado o su dominio que se une a antígeno son o comprenden una HCVR y una LCVR, respectivamente, de la siguiente forma: SEQ ID NOs: 77 y 82.

En algunas realizaciones, la pareja de cadena pesada y cadena ligera de un anticuerpo de PD-L1 proporcionado son o comprenden las secuencias de aminoácidos que se muestran en SEQ ID NOs: 86 y 87.

La región variable de la cadena pesada de un anticuerpo de PD-L1 provisto tiene las siguientes tres CDRs con las secuencias: GFSLSNYD (HCDR1, SEQ ID NO: 60), IWTGGAT (HCDR2, SEQ ID NO: 61), VRDSNYRYDEPFTY (HCDR3; SEQ ID NO: 62).

La región variable de la cadena ligera de un anticuerpo de PD-L1 provisto tiene las siguientes tres CDRs con las secuencias: QSIGTN (LCDR1, SEQ ID NO: 63), YAS (LCDR2), QQSNSWPYT (LCDR3; SEQ ID NO: 64).

Un anticuerpo de PD-L1 proporcionado o un dominio de unión a antígeno del mismo comprende una región variable de la cadena pesada que tiene las siguientes tres CDRs con las secuencias: GFSLSNYD (HCDR1, SEQ ID NO: 60), IWTGGAT (HCDR2, SEQ ID NO: 61), VRDSNYRYDEPFTY (HCDR3; SEQ ID NO: 62), y una región variable de la cadena ligera que tiene las siguientes tres CDRs que tienen las secuencias: QSIGTN (LCDR1, SEQ ID NO: 63), YAS (LCDR2), QQSNSWPYT (LCDR3; SEQ ID NO: 64).

A menos que se indique lo contrario, todas las secuencias de CDRs descritas en este documento se definen de acuerdo con el método IMGT tal y como se describe en Lefranc, M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999). CDR1 consiste en las posiciones 27 a 38, CDR2 consiste en las posiciones 56 a 65, CDR3 para los genes V de la línea germinal consiste en las posiciones 105 a 116, CDR3 para los genes V-J o los genes V-D-J reorganizados consiste en las posiciones 105 a 117 (posición que precede a J-PHE o J-TRP 118) con huecos en la parte superior del bucle para CDR3-IMGT reorganizada con menos de 13 aminoácidos, o con posiciones adicionales 112.1, 111.1, 112.2, 111.2, etc. para CDR3-IMGT reorganizada con más de 13 aminoácidos. Las posiciones proporcionadas en este párrafo están de acuerdo con la numeración IMGT descrita en Lefranc, M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999).

Los anticuerpos que se unen específicamente a PD-L1 tal y como se incluyen en las proteínas de fusión de la descripción, pueden comprender una parte Fc que permite extender la semivida in vivo de la molécula de unión biespecífica de la descripción. En algunas realizaciones, esa parte Fc es preferiblemente de origen humano, más preferiblemente una parte Fc humana de un anticuerpo IgG 1 o IgG4, incluso más preferiblemente una parte Fc humana modificada por ingeniería genética de una IgG1 o IgG4 con funciones efectoras activadoras o silenciadoras. En algunas realizaciones, las funciones efectoras de silenciamiento pueden preferirse a las funciones efectoras de activación. En algunas realizaciones, esa parte Fc está diseñada para silenciar funciones efectoras con mutación(es) en las posiciones 234 y/o 235, numeradas según el índice EU de Kabat (Johnson y Wu, Nucleic Acids Res, 2000). En algunas realizaciones, pueden introducirse mutaciones en las posiciones F234 y L235 de un anticuerpo anti-PD-L1 proporcionado para silenciar las funciones efectoras. En otras realizaciones, pueden introducirse mutaciones en las posiciones D265 y P329 de un anticuerpo anti-PD-L1 proporcionado para silenciar la función efectora. La numeración de ambos conjuntos de esas mutaciones potenciales está de acuerdo con el índice EU de Kabat (Shields et al., J Biol Chem, 2001).

Varias técnicas para la producción de anticuerpos y fragmentos de los mismos son bien conocidas en la técnica y se describen, por ejemplo, en Altshuler et al. (2010). Así, por ejemplo, los anticuerpos policlonales se pueden obtener a partir de la sangre de un animal tras una inmunización con un antígeno mezclado con aditivos y adyuvantes, y los anticuerpos monoclonales se pueden producir mediante cualquier técnica que proporcione anticuerpos mediante cultivos continuos de líneas celulares. Se describen ejemplos de tales técnicas, por ejemplo, en Harlow y Lane (1999), (1988), e incluyen la técnica de hibridoma descrita originalmente por Kohler y Milstein, 1975, la técnica de trioma, la técnica de hibridoma de linfocitos B humanos (véase, p. ej., Li et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2006, Kozbor y Roder, Immunol Today, 1983) y la técnica de EBV-hibridoma para producir anticuerpos monoclonales humanos (Cole et al., Cancer Res, 1984). Además, los anticuerpos recombinantes se pueden obtener a partir de anticuerpos monoclonales o se pueden preparar de novo usando varios métodos de presentación, tal como la presentación en fagos, ribosómica, en ARNm o celular.

C. Ejemplos de muteínas de lipocalina de la descripción

Las lipocalinas son moléculas de unión proteicas que han evolucionado naturalmente para unirse a ligandos. Las lipocalinas se encuentran en muchos organismos, incluidos vertebrados, insectos, plantas y bacterias. Los miembros de la familia de proteínas lipocalina (Pervaiz y Brew, FASEB J, 1987) son típicamente pequeñas proteínas secretadas y tienen una sola cadena polipeptídica. Se caracterizan por una variedad de diferentes propiedades de reconocimiento molecular: su unión a diversas moléculas pequeñas, principalmente hidrofóbicas (como retinoides, ácidos grasos, colesteroles, prostaglandinas, biliverdinas, feromonas, agentes saborizantes y odorantes) y su unión a receptores específicos de la superficie celular y la formación de complejos macromoleculares. Aunque en el pasado se han clasificado principalmente como proteínas de transporte, ahora está claro que las lipocalinas cumplen una variedad de funciones fisiológicas. Estas incluyen funciones en el transporte de retinol, el olfato, la señalización de feromonas y la síntesis de prostaglandinas. Las lipocalinas también se han implicado en la regulación de la respuesta inmune y la mediación de la homeostasis celular (revisado, por ejemplo, en Flower et al., Biochim Biophys Acta, 2000, Flower Biochem J, 1996).

Las lipocalinas comparten niveles inusualmente bajos de conservación general de la secuencia, a menudo con identidades de secuencia de menos del 20%. En fuerte contraste, su patrón general de plegamiento está muy conservado. La parte central de la estructura de la lipocalina consiste en una única lámina p antiparalela de ocho hebras que se cierra sobre sí misma para formar un barril p unido a hidrógeno de forma continua. Este barril p forma una cavidad central. Un extremo del barril está bloqueado estéricamente por el segmento peptídico N-terminal que atraviesa su parte inferior, así como por tres bucles peptídicos que conectan las hebras p. El otro extremo del barril p está abierto al disolvente e incluye un sitio de unión a la diana, que está formado por cuatro bucles peptídicos flexibles (AB, CD, EF y GH). Es la diversidad de los bucles en la estructura de la lipocalina, que de otro modo sería rígida, lo que da lugar a una variedad de diferentes modos de unión, cada uno de los cuales es capaz de acomodar dianas de diferente tamaño, forma y carácter químico (revisado, por ejemplo, en Skerra, Biochim Biophys Acta, 2000, Flower et al., Biochim Biophys Acta, 2000, Flower Biochem J, 1996).

Una muteína de lipocalina según la presente descripción, puede ser una muteína de cualquier lipocalina. Los ejemplos de lipocalinas adecuadas (también designadas a veces como "lipocalina de referencia", "lipocalina de tipo silvestre", "estructuras de proteínas de referencia" o simplemente "estructuras") entre los que se puede usar una muteína incluyen, pero no se limitan a, lipocalina lagrimal (lipocalina-1, Tlc o proteína de la glándula de von Ebner), proteína de unión a retinol, sintasa de prostaglandina D de tipo lipocalina de neutrófilos, p-lactoglobulina, proteína de unión a bilina (BBP), apolipoproteína D (APOD), lipocalina asociada a gelatinasa de neutrófilos (NGAL), proteína relacionada con microglobulina a2 (A2m), 24p3/uterocalina (24p3), proteína de la glándula de von Ebner 1 (VEGP 1), proteína de la glándula de von Ebner 2 (VEGP 2) y alérgeno principal Can f 1 (ALL-1).

La secuencia de aminoácidos de una muteína de lipocalina según la descripción puede tener una alta identidad de secuencia en comparación con la lipocalina de referencia (o de tipo silvestre) de la que se obtiene, por ejemplo, hTlc o hNGAL, cuando se comparan las identidades de secuencia con otra lipocalina (véase también más arriba). En este contexto general, la secuencia de aminoácidos de una muteína de lipocalina según la descripción es al menos sustancialmente similar a la secuencia de aminoácidos de la correspondiente lipocalina de referencia (de tipo silvestre), con la condición de que puede haber huecos (tal y como se definen en este documento) en una alineación que es el resultado de adiciones o deleciones de aminoácidos.

Por lo general, una muteína de lipocalina contiene uno o más residuos de aminoácidos mutados, en relación con la secuencia de aminoácidos de la lipocalina de tipo silvestre o de referencia, por ejemplo, hTlc y hNGAL, en los cuatro bucles en el extremo abierto que comprenden un bolsillo de unión a ligando y definen la entrada al bolsillo de unión al ligando (véase más arriba). Como se ha explicado anteriormente, esas regiones son esenciales para determinar la especificidad de unión de una muteína de lipocalina con la diana deseada.

D. Ejemplos de muteínas de lipocalina específicas de CD137 de la descripción

Como se ha señalado anteriormente, una lipocalina es un polipéptido definido por su estructura supersecundaria, es decir, una región estructural supersecundaria de lámina plegada p cilíndrica que comprende ocho hebras p conectadas por parejas mediante cuatro bucles en un extremo, para definir así un bolsillo de unión. La presente descripción no se limita a las muteínas de lipocalina descritas específicamente en el presente documento. A este respecto, la descripción se refiere a una muteína de lipocalina que tiene una región estructural supersecundaria de lámina p plegada cilíndrica que comprende ocho hebras p conectadas por parejas mediante cuatro bucles en un extremo, para definir de ese modo un bolsillo de unión, en donde al menos un aminoácido de cada uno de al menos tres de dichos cuatro bucles se ha mutado y en donde dicha lipocalina es eficaz para unirse a CD137 con una afinidad detectable.

En un aspecto, la presente descripción incluye cualquier cantidad de muteínas de lipocalina obtenidas a partir de una lipocalina de referencia (de tipo silvestre), preferiblemente obtenidas a partir de hTIc madura o hNGAL madura, que se unen a CD137 con una afinidad detectable. En un aspecto relacionado, la descripción incluye varias muteínas de lipocalina que son capaces de activar las rutas de señalización aguas abajo de CD137 al unirse a CD137. En ese sentido, CD137 puede considerarse como una diana no natural de la lipocalina de referencia (tipo silvestre), preferiblemente hTIc o hNGAL, en donde "diana no natural" se refiere a una sustancia que no se une a la lipocalina de referencia (tipo silvestre) en condiciones fisiológicas.

En algunos aspectos, la presente descripción proporciona muteínas de hNGAL que se unen a CD137. En este sentido, la descripción proporciona una o más muteínas de hNGAL que son capaces de unirse a CD137 con una afinidad medida por una K^d de aproximadamente 800 nM, 700 nM, 200 nM, 140 nM, 100 nM o inferior, preferiblemente de aproximadamente 70 nM, 50 nM, 30 nM, 10 nM, 5 nM, 2 nM o incluso inferior.

Una muteína de hNGAL que se une a CD137 comprendida en la proteína de fusión de la invención comprende el siguiente conjunto de residuos de aminoácidos mutados en comparación con la secuencia polipeptídica lineal de hNGAL madura como se muestra en SEQ ID NO: 2: Gln 28 ^ His; Leu 36 ^ Gln; Ala 40 ^ Ile; Ile 41 ^ Arg; Gln 49 ^ Ile; Tyr 52 ^ Met; Asn 65 ^ Asp; Ser 68 ^ Met; Leu 70 ^ Lys; Arg 72 ^ Asp; Lys 73 ^ Asp; Asp 77 ^ Met; Trp 79 ^ Asp; Arg 81 ^ Trp; Cys 87 ^ Ser; Asn 96 ^ Lys; Tyr 1o0 ^ Phe; Leu 103 ^ His; Tyr 106 ^ Ser; Lys 125 ^ Phe; Ser 127 ^ Phe; Tyr 132 ^ Glu; y Lys 134 ^ Tyr. En algunas realizaciones, una muteína de hNGAL comprendida en la proteína de fusión de la invención comprende la secuencia de aminoácidos que se indica en SEQ ID NO: 42.

En algunas realizaciones, una muteína de hNGAL comprendida en la proteína de fusión de la invención tiene al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 98% o una identidad de secuencia superior a la de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 42.

En algunas realizaciones, la proteína de fusión de la invención comprende una muteína de lipocalina que se une a CD137 con una afinidad medida por una Kd de aproximadamente 5 nM o inferior, en donde la muteína de lipocalina tiene una identidad de secuencia de al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 98% o superior con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 42.

En algunas realizaciones, una proteína de fusión de la invención comprende una muteína de lipocalina que puede comprender una secuencia de aminoácidos heteróloga en su extremo N-terminal o C-terminal, preferiblemente en el extremo C-terminal, como un marcador Strep II (SEQ ID NO: 12) o una secuencia de un sitio de escisión para ciertas enzimas de restricción, sin afectar a la actividad biológica (unión a su diana, por ejemplo, CD137) de la muteína de lipocalina.

En algunas realizaciones, se pueden introducir modificaciones adicionales de una muteína de lipocalina para modular ciertas características de la muteína, como mejorar la estabilidad del plegamiento, la estabilidad en suero, la resistencia a las proteínas o la solubilidad en agua o para reducir la tendencia a la agregación, o para introducir nuevas características para la muteína. En algunas realizaciones, la(s) modificación(es) puede(n) dar lugar a una modulación de dos o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10) características de una muteína proporcionada.

Por ejemplo, es posible mutar una o más posiciones de la secuencia de aminoácidos de una muteína de lipocalina para introducir nuevos grupos reactivos, por ejemplo, para la conjugación con otros compuestos, como polietilenglicol (PEG), hidroxietilalmidón (HES), biotina, péptidos o proteínas, o para la formación de enlaces disulfuro no naturales. El compuesto conjugado, por ejemplo, PEG y HES, puede en algunos casos aumentar la semivida en suero de la muteína de lipocalina correspondiente.

En algunas realizaciones, un grupo reactivo de una muteína de lipocalina puede aparecer de forma natural en su secuencia de aminoácidos, como residuos de cisteína de origen natural en dicha secuencia de aminoácidos. En algunas otras realizaciones, ese grupo reactivo puede introducirse mediante mutagénesis. En caso de que se introduzca un grupo reactivo mediante mutagénesis, una posibilidad es la mutación de un aminoácido en la posición apropiada por un residuo de cisteína. Las posibilidades ejemplares de esa mutación para introducir un residuo de cisteína en la secuencia de aminoácidos de una muteína hTIc, incluyen las sustituciones Thr 40— Cys, Glu 73— Cys, Arg 90— Cys, Asp 95— Cys y Glu 131 → Cys de la secuencia de tipo silvestre de hTIc (SEQ ID NO: 1). Las posibilidades ejemplares de esa mutación para introducir un residuo de cisteína en la secuencia de aminoácidos de una muteína de hNGAL incluyen la introducción de un residuo de cisteína en una o más de las posiciones de la secuencia que corresponden a las posiciones de la secuencia 14, 21,60, 84, 88, 116, 141, 145, 143, 146 o 158 de la secuencia de tipo silvestre de hNGAL (SEQ ID NO: 2). El resto tiol generado puede usarse para PEGilar o HESilar la muteína, por ejemplo, para aumentar la semivida sérica de una muteína de lipocalina respectiva.

En algunas realizaciones, para proporcionar cadenas laterales de aminoácidos adecuadas como nuevos grupos reactivos para conjugar uno de los compuestos anteriores con una muteína de lipocalina, se pueden introducir aminoácidos artificiales en la secuencia de aminoácidos de una muteína de lipocalina. Generalmente, esos aminoácidos artificiales están diseñados para ser más reactivos y, por lo tanto, para facilitar la conjugación con el compuesto deseado. Esos aminoácidos artificiales pueden introducirse mediante mutagénesis, por ejemplo, utilizando un ARNt artificial para-acetil-fenilalanina.

E. Ejemplos de usos y aplicaciones de proteínas de fusión específicas para CD137 y PD-L1

Las referencias a los métodos de tratamiento mediante terapia o cirugía o métodos de diagnóstico in vivo o usos de compuestos o composiciones para métodos de tratamiento mediante métodos de diagnóstico mediante terapia o cirugía o in vivo en este capítulo de la descripción, deben interpretarse como referencias a compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para uso en esos métodos.

En algunas realizaciones, las proteínas de fusión de la descripción pueden producir un efecto sinérgico a través de un direccionamiento doble de CD137 y PD-L1. En algunas realizaciones, las proteínas de fusión de la descripción pueden producir un efecto sinérgico a través de una coestimulación de CD137 y un bloqueo de la vía PD-1/PD-L1. En algunas realizaciones, las proteínas de fusión de la descripción pueden producir un efecto antitumoral localizado a través de un direccionamiento doble de CD137 y PD-L1. Por lo tanto, existen numerosas aplicaciones posibles en la medicina para las proteínas de fusión de la descripción.

En algunas realizaciones, la presente descripción incluye el uso de una o más proteínas de fusión descritas en el presente documento o de una o más composiciones que comprenden esas proteínas de fusión para la unión simultánea de CD137 y PD-L1.

La presente descripción también implica el uso de una o más proteínas de fusión, tal y como se describe para la formación de complejos con CD137 y/o PD-L1.

Por lo tanto, en un aspecto de la descripción, las proteínas de fusión proporcionadas pueden usarse para la detección de CD137 y PD-L1. Ese uso puede incluir las etapas de poner en contacto una o más de dichas proteínas de fusión, en condiciones adecuadas, con una muestra sospechosa de contener CD137 y/o PD-L1, lo que permite la formación de un complejo entre las proteínas de fusión y CD137 y/o PD-L1, y detectar el complejo mediante una señal adecuada. La señal detectable puede estar causada por un marcador, como se ha explicado anteriormente, o por un cambio de las propiedades físicas debido a la unión, es decir, la propia formación del complejo. Un ejemplo es la resonancia de plasmón superficial, cuyo valor cambia durante la unión de los ligandos, de los cuales uno está inmovilizado sobre una superficie tal como una lámina de oro.

Las proteínas de fusión de la descripción también pueden usarse para la separación de CD137 y/o PD-L1. Ese uso puede incluir las etapas de poner en contacto una o más de dichas proteínas de fusión, en condiciones adecuadas, con una muestra que se supone que contiene CD137 y/o PD-L1, lo que permite la formación de un complejo entre las proteínas de fusión y CD137 y/o PD-L1 y separar el complejo de la muestra.

En algunos aspectos, la presente descripción proporciona kits de diagnóstico y/o analíticos que comprenden una o más proteínas de fusión según la descripción.

Además de su uso en el diagnóstico, en otro aspecto adicional, la descripción contempla composiciones farmacéuticas que comprenden una o más proteínas de fusión de la descripción y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

Además, en algunas realizaciones, la presente descripción proporciona proteínas de fusión que se unen simultáneamente a CD137 y/o PD-L1 para un uso como agentes antitumorales y/o antiinfecciosos e inmunomoduladores. En algunas realizaciones, se prevé que las proteínas de fusión de la presente invención se utilicen en un método de prevención, mejora o tratamiento de enfermedades humanas, tales como una variedad de cánceres, incluidos los cánceres positivos para PD-L1. Por consiguiente, también se proporcionan métodos para prevenir, mejorar o tratar enfermedades humanas tales como una variedad de cánceres, incluido el cáncer positivo para PD-L1, en un sujeto que lo necesite, que comprenden administrar a dicho sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de una o más proteínas de fusión de la descripción.

Ejemplos de cánceres que pueden tratarse usando las proteínas de fusión de la descripción incluyen cáncer de hígado, cáncer de huesos, cáncer de páncreas, cáncer de piel, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de mama, cáncer de pulmón, melanoma maligno cutáneo o intraocular, cáncer renal, cáncer uterino, cáncer de ovario, cáncer colorrectal, cáncer de colon, cáncer de recto, cáncer de la región anal, cáncer de estómago, cáncer testicular, cáncer de útero, carcinoma de las trompas de Falopio, carcinoma de endometrio, carcinoma de cuello uterino, carcinoma de vagina, carcinoma de vulva, linfoma no Hodgkin, cáncer de esófago, cáncer de intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de la glándula tiroides, cáncer de la glándula paratiroides, cáncer de la glándula adrenal, sarcoma de tejido blando, cáncer de uretra, cáncer de pene, tumores sólidos de la infancia, linfoma linfocítico, cáncer de vejiga, cáncer de riñón o de uréter, carcinoma de la pelvis renal, neoplasia del sistema nervioso central (SNC), linfoma primario del SNC, angiogénesis tumoral, tumor del eje espinal, glioma del tronco encefálico, adenoma pituitario, sarcoma de Kaposi, cáncer epidermoide, cáncer de células escamosas, cánceres inducidos por el medio ambiente, incluidos los inducidos por amianto, neoplasias malignas hematológicas, que incluyen, por ejemplo, mieloma múltiple, linfoma de linfocitos B, linfoma de Hodgkin/linfoma mediastínico primario de linfocitos B, linfomas no Hodgkin, linfoma mieloide agudo, leucemia mielógena crónica, leucemia linfoide crónica, linfoma folicular, linfoma difuso de linfocitos B grandes, linfoma de Burkitt, linfoma inmunoblástico de células grandes, linfoma linfoblástico B precursor, linfoma de células del manto, leucemia linfoblástica aguda, micosis fungoide, linfoma anaplásico de células grandes, linfoma de linfocitos T y linfoma linfoblástico T precursor, y cualquier combinación de dichos cánceres. En algunas realizaciones, la presente invención también es aplicable al tratamiento de cánceres metastásicos.

En algunas realizaciones, las proteínas de fusión de la invención pueden dirigirse simultáneamente a células tumorales en las que se expresa PD-L1 y activar los linfocitos del sistema inmune del hospedador adyacentes a esas células tumorales. En algunas realizaciones, las proteínas de fusión de la invención pueden aumentar la actividad de los linfocitos T antitumorales dirigidos, mejorar la inmunidad antitumoral y/o tener un efecto inhibidor directo sobre el crecimiento tumoral, produciendo así resultados antitumorales sinérgicos. En algunas realizaciones, las proteínas de fusión de la invención pueden activar respuestas inmunes en un microambiente tumoral. En algunas realizaciones, las proteínas de fusión de la invención pueden reducir los efectos secundarios de los linfocitos efectores hacia las células sanas, es decir, la toxicidad fuera de la diana, por ejemplo, inhibiendo localmente la actividad del oncogén e induciendo la activación de los linfocitos.

En algunas realizaciones, la presente descripción incluye el uso de una proteína de fusión de la invención, o una composición que comprende una proteína de fusión proporcionada, para inducir una respuesta linfocítica localizada en la vecindad de células tumorales positivas para PD-L1. Por consiguiente, en algunas realizaciones, la presente descripción proporciona métodos para inducir una respuesta linfocítica localizada en la vecindad de células tumorales positivas para PD-L1, que comprende aplicar una o más proteínas de fusión de la invención o una o más composiciones que comprenden esas proteínas de fusión. "Localizada" significa que tras la unión simultánea de los linfocitos T a través de CD137 y el acoplamiento de células tumorales positivas para PD-L1, los linfocitos T producen citocinas, particularmente IL-2 y/o IFN gamma en la vecindad de las células positivas para PD-L1. Tales citocinas reflejan la activación de los linfocitos T que luego pueden destruir las células positivas para PD-L1, ya sea directa o indirectamente al atraer otras células destructoras, como los linfocitos T o las células NK.

En algunas realizaciones, la presente descripción incluye el uso de una proteína de fusión de la invención, o una composición que comprende esa proteína de fusión, para coestimular los linfocitos T y/o activar vías de señalización aguas abajo de CD137. Preferiblemente, una proteína de fusión proporcionada coestimula los linfocitos T y/o activa las vías de señalización aguas abajo de CD137, cuando se acopla con las células tumorales en las que se expresa PD-L1. En consecuencia, la presente descripción proporciona métodos para inducir la proliferación de linfocitos T y/o activar las vías de señalización aguas abajo de CD137, preferiblemente cuando se acoplan células tumorales en las que se expresa PD-L1, que comprenden aplicar una o más proteínas de fusión de la descripción y/o una o más composiciones que comprenden esas proteínas de fusión.

En algunas realizaciones, la presente descripción incluye el uso de una proteína de fusión de la invención, o una composición que comprende esa proteína de fusión, para inducir la agrupación y activación de CD137 sobre linfocitos T y dirigir esos linfocitos T a células tumorales en donde se expresa PD-L1.

F. Producción de proteínas de fusión proporcionadas a modo de ejemplo específicas para CD137 y PD-L1

En algunas realizaciones, la presente descripción proporciona moléculas de ácido nucleico (ADN y ARN) que incluyen secuencias de nucleótidos que codifican una proteína de fusión, tal y como se establece en el conjunto de reivindicaciones adjunto. En algunas realizaciones, la descripción incluye una célula hospedadora que contiene una molécula de ácido nucleico proporcionada. Dado que la degeneración del código genético permite la sustitución de ciertos codones por otros codones que especifican el mismo aminoácido, la descripción no se limita a una molécula de ácido nucleico específica que codifica una proteína de fusión tal y como se describe en este documento, sino que incluye todas las moléculas de ácido nucleico que incluyen secuencias de nucleótidos que codifican una proteína de fusión funcional. A este respecto, la presente descripción también se refiere a secuencias de nucleótidos que codifican proteínas de fusión proporcionadas.

Una molécula de ácido nucleico, como el ADN, se dice que es "capaz de expresar una molécula de ácido nucleico" o "capaz de permitir la expresión de una secuencia de nucleótidos" si incluye elementos en la secuencia que contienen una información relacionada con la regulación transcripcional y/o traduccional y esas secuencias están “ligadas funcionalmente” a la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína. Un enlace funcional es un enlace en el que los elementos de la secuencia reguladora y la secuencia que se va a expresar están conectados de una manera que permite la expresión génica. La naturaleza precisa de las regiones reguladoras necesarias para una expresión génica puede variar entre especies, pero en general esas regiones incluyen un promotor que, en procariotas, contiene tanto el promotor per se, es decir, elementos de ADN que dirigen el inicio de la transcripción, como elementos de ADN que, cuando se transcriben en ARN, señalarán el inicio de la traducción. Esas regiones promotoras normalmente incluyen secuencias no codificantes en 5' implicadas en el inicio de la transcripción y la traducción, como las cajas -35/-10 y el elemento Shine-Dalgarno en procariotas o la caja TATA, secuencias CAAT y elementos de protección en 5' en eucariotas. Esas regiones también pueden incluir elementos potenciadores o represores, así como secuencias señal y de líder traducidas para dirigir la proteína natural a un compartimento específico de una célula hospedadora.

Además, las secuencias no codificantes en 3' pueden contener elementos reguladores implicados en la terminación de la transcripción, la poliadenilación o similares. Sin embargo, si esas secuencias de terminación no son satisfactoriamente funcionales en una célula hospedadora particular, entonces pueden sustituirse por señales funcionales en esa célula.

Por lo tanto, una molécula de ácido nucleico de la descripción puede estar “ligada funcionalmente” a una o más secuencias reguladoras, como una secuencia promotora, para permitir la expresión de esa molécula de ácido nucleico. En algunas realizaciones, una molécula de ácido nucleico de la descripción incluye una secuencia promotora y una secuencia de terminación de la transcripción. Los promotores procariotas adecuados son, por ejemplo, el promotor tet, el promotor lacUV5 o el promotor T7. Ejemplos de promotores útiles para la expresión en células eucariotas son el promotor SV40 o el promotor CMV.

En algunas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico proporcionadas también pueden formar parte de un vector o cualquier otro tipo de vehículo de clonación, como un plásmido, un fagémido, un fago, un baculovirus, un cósmido o un cromosoma artificial.

En algunas realizaciones, una molécula de ácido nucleico proporcionada puede incluirse en un fagémido. Tal y como se usa en este contexto, un vector fagémido indica un vector que codifica la región intergénica de un fago moderado, tal como M13 o f1, o una parte funcional del mismo fusionada con el ADNc de interés. Por ejemplo, en algunas realizaciones, después de una superinfección de las células hospedadoras bacterianas con un vector fagémido de ese tipo proporcionado y un fago auxiliar apropiado (p. ej., M13K07, VCS-M13 o R408) se producen partículas de fago intactas, lo que permite un acoplamiento físico del ADNc heterólogo codificado con su polipéptido correspondiente que se muestra en la superficie del fago (Lowman, Annu Rev Biophys Biomol Struct, 1997, Rodi y Makowski, Curr Opin Biotechnol, 1999).

De acuerdo con diversas realizaciones, los vehículos de clonación pueden incluir, además de las secuencias reguladoras descritas anteriormente y una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión como se describe en este documento, secuencias de replicación y control obtenidas a partir de una especie compatible con la célula hospedadora que se usa para la expresión, así como marcadores de selección que confieren un fenotipo seleccionable sobre las células transformadas o transfectadas. Se conocen en la técnica un gran número de vectores de clonación adecuados y están disponibles comercialmente.

La descripción también se refiere, en algunas realizaciones, a métodos para la producción de proteínas de fusión de la descripción a partir de un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión o cualquiera de sus subunidades utilizando métodos de ingeniería genética, tal y como se describe en el conjunto de reivindicaciones adjuntas. En algunas realizaciones, un método proporcionado puede llevarse a cabo in vivo, en donde una proteína de fusión proporcionada se puede producir, por ejemplo, en un organismo hospedador bacteriano o eucariótico, y luego aislar desde ese organismo hospedador o su cultivo. También es posible producir una proteína de fusión de la descripción in vitro, por ejemplo, usando un sistema de traducción in vitro.

Al producir una proteína de fusión in vivo, un ácido nucleico que codifica esa proteína de fusión puede introducirse en un organismo hospedador bacteriano o eucariota adecuado usando tecnología de ADN recombinante bien conocida en la técnica. En algunas realizaciones, una molécula de ADN que codifica una proteína de fusión de la invención, y en particular un vector de clonación que contiene la secuencia codificante de esa proteína de fusión puede transformarse en una célula hospedadora capaz de expresar el gen. La transformación se puede realizar usando técnicas estándar. Por lo tanto, la descripción también está dirigida a las células hospedadoras que contienen una molécula de ácido nucleico tal y como se describe en el presente documento.

En algunas realizaciones, las células hospedadoras transformadas pueden cultivarse en condiciones adecuadas para expresar la secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de fusión de la invención. En algunas realizaciones, las células hospedadoras pueden ser procariotas, como Escherichia coli (E. coli) o Bacillus subtilis, o eucariotas, como Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, células de insecto SF9 o High5, líneas celulares de mamífero inmortalizadas (p. ej., células HeLa o células CHO) o células primarias de mamífero.

En algunas realizaciones, cuando una muteína de lipocalina de la descripción que está comprendida en una proteína de fusión tal y como se establece en el conjunto de reivindicaciones adjuntas, incluye enlaces disulfuro intramoleculares, puede preferirse dirigir la proteína naciente a un compartimento celular que tiene un medio redox oxidante usando una secuencia señal apropiada. Ese ambiente oxidante puede ser proporcionado por el periplasma de bacterias Gramnegativas tales como E. coli, en el medio extracelular de bacterias Grampositivas o en la luz del retículo endoplásmico de células eucariotas y suele favorecer la formación de enlaces disulfuro estructurales.

En algunas realizaciones, también es posible producir una proteína de fusión de la invención en el citosol de una célula hospedadora, preferiblemente E. coli. En ese caso, una proteína de fusión proporcionada puede obtenerse directamente en un estado soluble y plegado o recuperarse en forma de cuerpos de inclusión, seguido de renaturalización in vitro. Otra opción es el uso de cepas hospedadoras específicas que tengan un medio intracelular oxidante, lo que puede permitir la formación de enlaces disulfuro en el citosol (Venturi et al., J Mol Biol, 2002).

El trabajador experto apreciará métodos útiles para preparar proteínas de fusión contempladas por la presente descripción, pero cuyas secuencias de proteínas o ácidos nucleicos no se describen explícitamente en este documento. A modo de descripción general, tales modificaciones de la secuencia de aminoácidos incluyen, por ejemplo, mutagénesis dirigida de posiciones de aminoácidos individuales para simplificar la subclonación de un gen proteico o de sus partes mediante la incorporación de sitios de escisión para ciertas enzimas de restricción. Además, esas mutaciones se pueden incorporar para mejorar aún más la afinidad de una proteína de fusión hacia sus dianas (p. ej., CD137 y PD-L1). Además, se pueden introducir mutaciones para modular una o más características de la proteína, como mejorar la estabilidad del plegamiento, la estabilidad en suero, la resistencia de la proteína o la solubilidad en agua o para reducir la tendencia a la agregación, si es necesario.

V. Ejemplos

Ejemplo 1: Expresión y análisis de proteínas de fusión representativas

En este ejemplo, se generaron proteínas de fusión de anticuerpo-muteína de lipocalina representativas fusionando un anticuerpo específico para PD-L1 que tiene la cadena pesada proporcionada por SEQ ID NO: 86, o comprenden un dominio variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 77, o comprenden las CDRs de GFSLSNYD (HCDR¹ , SEQ ID NO: 60), IWTGGAT (HCDR2, SEQ ID NO: 61), VRDSNYRYDEPFTY (HCDR3; SEQ ID NO: 62) y cadenas ligeras proporcionadas por SEQ ID NO: 87, o comprenden un dominio variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 82, o comprenden las CDRs de QSIGTN (LCDR1, SEQ ID NO: 63), YAS (LCDR2), QQSNSWPYT (LCDR3; SEQ ID NO: 64) y la muteína de lipocalina específica de CD137 de SEQ ID NO: 42, a través de un enlazador, tal como un enlazador no estructurado (G4S)₃ de SEQ ID NO: 13, para conectar PD-L1 y CD137 al mismo tiempo. Los diferentes formatos que se generaron se representan en la Figura 1. Por ejemplo, tales proteínas de fusión, por ejemplo, SEQ ID NOs: 90 y 87, SEQ ID NOs: 86 y 91, SEQ ID NOs: 92 y 87, SEQ ID NOs: 86 y 93, SEQ ID NOs: 94 y 87 y SEQ ID NOs: 90 y 91, se generaron mediante la fusión de una o más muteínas de lipocalina de SEQ ID NO: 42 con uno o más de los cuatro extremos de un anticuerpo que comprenden la cadena pesada proporcionada por la cadena pesada proporcionada por SEQ ID NO: 86, o comprenden un dominio variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 77, o que comprenden las CDRs de GFSLSNYD (HCDR1, SEQ ID NO: 60), IWTGGAT (HCDR2, SEQ ID NO: 61), VRDSNYRYDEPFTY (HCDR3; SEQ ID NO: 62), y cadenas ligeras proporcionadas por SEQ ID NO: 87, o comprenden un dominio variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 82, o comprenden las CDRs de QSIGTN (LCDR1, SEQ ID NO: 63), YAS (LCDR2), QQSNSWPYT (LCDR3; SEQ ID NO: 64). Las proteínas de fusión generadas pueden ser bivalentes para CD137 (por ejemplo, como se muestra en la Figura 1A-1D) o tetravalentes para CD137 (por ejemplo, como se muestra en la Figura 1E-1H), o tienen una valencia aún mayor para CD137 (por ejemplo, como se muestra en la Figura 11).

Los anticuerpos específicos de PD-L1, así como todas las proteínas de fusión con muteína de lipocalina de los anticuerpos descritos en este ejemplo, tenían una estructura principal de IgG4 diseñada genéticamente, que contenía una mutación S228P para minimizar un intercambio de medio anticuerpo de IgG4 in vitro e in vivo (Silva et al., J Biol Chem, 2015). También pueden existir mutaciones adicionales en las estructuras principales de IgG4 en todos los anticuerpos y proteínas de fusión descritos en este documento, incluidas una o más mutaciones F234A, L235A, M428L, N434^s , M252Y, S254T y T256E. Se pueden introducir mutaciones F234A y L235A para disminuir ADCC y ADCP (Glaesner et al., Diabetes Metab Res Rev., 2010). Las mutaciones M428L y N434S o las mutaciones M252Y, S254T y T256E pueden introducirse para prolongar la semivida en suero (Dall'Acqua et al., J Biol Chem, 2006, Zalevsky et al., Nat Biotechnol, 2010). Todos los anticuerpos se expresaron sin la lisina carboxi-terminal para evitar una heterogeneidad.

Además, se generaron fusiones de Fc y muteína de lipocalina monoespecífica fusionando una o más de las muteínas de lipocalina específicas de CD137 de SEQ ID NO: 42, a través de un enlazador, por ejemplo, un enlazador no estructurado (G4S)₃ de SEQ ID NO: 13, con el extremo C-terminal de la región Fc de un anticuerpo proporcionado en SEQ ID NO: 30, como se muestra en la Figura 1J-1K. La estructura artificial resultante se proporciona en SEQ ID NOs: 88-89.

Las estructuras artificiales de las proteínas de fusión se generaron mediante síntesis génica y se clonaron en un vector de expresión de mamífero. Después se expresaron transitoriamente en células Expi293FTM (Life Technologies). La concentración de proteínas de fusión en el medio del cultivo celular se midió por HPLC (Agilent Technologies) empleando una columna de afinidad de proteína A de POROS® (Applied Biosystems). Los títulos de las proteínas de fusión se resumen en la Tabla 1.

Las proteínas de fusión se purificaron mediante cromatografía con proteína A seguida de cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Después de la purificación con SEC, las fracciones que contienen proteína monomérica se agrupan y se analizan nuevamente usando SEC analítica.

Tabla 1: Títulos de la expresión transitoria

Ejemplo 2: Expresión de las proteínas de fusión

Las estructuras artificiales de proteínas de fusión ejemplares se generaron mediante síntesis génica, incluida la optimización de codones, y se clonaron en un vector de expresión de mamífero. A continuación, se expresaron de forma estable en células de ovario de hámster chino (CHO). La concentración de proteínas de fusión en el medio de cultivo celular se midió usando Octet (ForteBio, Pall Corp.) con sensores de proteína A y se cuantificó usando un patrón de IgG1 humana. Los títulos de las proteínas de fusión se resumen en la Tabla 2. Los datos sugieren que la geometría de las proteínas de fusión puede influir en el rendimiento del producto y la productividad celular.

Tabla 2: Títulos de expresión estables

Ejemplo 3: Unión de las proteínas de fusión a PD-L1 o CD137 determinada por resonancia de plasmón superficial (SPR)

La cinética de la unión y la afinidad de las proteínas de fusión ejemplares hacia huPD-L1 -His o huCD137-His (PD-L1 humano o CD137 humana con un marcador de polihistidina C-terminal, R&D Systems) se determinaron mediante resonancia de plasmón superficial (SPR) usando un Biacore 8K o un Biacore T200 (GE Healthcare).

El anticuerpo anti-Fc de IgG humana (GE Healthcare) se inmovilizó sobre un chip sensor CM5 usando química de amina estándar: los grupos carboxilo en el chip se activaron usando 1 -etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS). Posteriormente, se aplicó una solución de anticuerpos anti-Fc de IgG humana (GE Healthcare) con una concentración de 25 μg/mL en acetato de sodio 10 mM (pH 5,0) con un caudal de 5 μL/min hasta que se alcanzó un nivel de inmovilización de 6000-10000 de unidades de resonancia (RU, por sus siglas en inglés).

Los ásteres de NHS residuales que no reaccionaron se bloquearon haciendo pasar una solución de etanolamina 1 M a través de la superficie. El canal de referencia se trató de manera análoga. Posteriormente, las proteínas de fusión del ensayo (SEQ ID NOs: 90 y 87, SEQ ID NOs: 86 y 91, SEQ ID NOs: 92 y 87, SEQ ID NOs: 86 y 93, SEQ ID NOs: 94 y 87, SEQ ID NOs: 90 y 91, SEQ ID NOs: 88 y SEQ ID NO: 89) a 0,25 μg/ml o 0,5 μg/ml en tampón HBS-EP+ fueron capturadas por el anticuerpo anti-Fc de IgG humana en la superficie del chip durante 180 s con un caudal de 10 μL/min. Después de cada etapa de captura, se lavó la aguja. También se sometieron a ensayo como controles los anticuerpos anti-PD-L1, incluido un anticuerpo de referencia (SEQ ID NOs: 26 y 27) y un anticuerpo incluido en las proteínas de fusión (SEQ ID NOs: 86 y 87), y un anticuerpo anti-CD137 de referencia (SEQ ID NOs: 28 y 29).

Para la determinación de la afinidad, se prepararon diluciones de huPD-L1-His (10 nM, 5 nM y 2,5 nM) o huCD137-His (900 nM, 300 nM y 100 nM) en tampón HBS-EP+ y se aplicaron a la superficie del chip preparado. El ensayo de unión se llevó a cabo con un tiempo de contacto de 180 s, un tiempo de disociación de 900 s y un caudal de 30 μL/min. Todas las mediciones se realizaron a 25°C. La regeneración de la superficie del chip se logró con inyecciones de MgCl² 3 M durante 120 s. Antes de las mediciones de proteínas, se realizaron tres ciclos de inicio con fines de acondicionamiento. Los datos se evaluaron con el programa informático de evaluación Biacore T200 (v2.0) o con el programa informático de evaluación Biacore 8K (V1.1.1). Se usó una referencia doble y se usó el modelo de enlace 1:1 para ajustar los datos sin procesar.

Los valores determinados para kact, kdesact y la constante de disociación de equilibrio resultante (Kd) para las proteínas de fusión representativas se resumen en la Tabla 3. Todas las proteínas de fusión biespecíficas (SEQ ID NOs: 90 y 87, SEQ ID NOs: 86 y 91, SEQ ID NOs: 92 y 87, SEQ ID NOs: 86 y 93, SEQ ID NOs: 94 y 87 y SEQ ID NOs: 90 y 91) se unen a PD-L1 así como a CD137 con una afinidad de subnanomolar a nanomolar baja. Las fusiones monoespecíficas de la muteína de lipocalina específica de CD137-Fc (SEQ ID NO: 88 y SEQ ID NO: 89) solo se unen a CD137 con baja afinidad nanomolar.

Tabla 3: Constantes cinéticas y afinidades de las proteínas de fusión determinadas por SPR

Ejemplo 4. Unión de las proteínas de fusión a PD-L1 o CD137 en ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA)

Se empleó un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) para determinar la potencia de la unión de las proteínas de fusión ejemplares a PD-L1 humano y PD-L1 de macaco cangrejero.

HuPD-L1-His o cyPD-L1-His recombinante (PD-L1 humano o de macaco cangrejero (abreviado en cyno) con un marcador de polihistidina C-terminal, R&D Systems o Sino Biologics) con una concentración de 1 μg/mL en PBS, se revistió durante la noche sobre placas de microtitulación a 4°C. Después de lavar con PBS-0,05% de T (PBS complementado con 0,05% (v/v) de Tween 20), las placas se bloquearon con 2% de BSA (p/v) en PBS-0,1% de T (PBS complementado con 0,1% (v/v) de Tween 20) durante 1 h a temperatura ambiente. Después de lavar cinco veces con 100 μL de PBS-0,05% de T, las proteínas de fusión ejemplares (SEQ ID NOs: 90 y 87, SEQ ID NOs: 86 y 91, SEQ ID NOs: 92 y 87, SEQ ID NOs: 86 y 93, SEQ ID NOs: 94 y 87, s Eq ID NOs: 90 y 91), las fusiones de Fc con una muteína de lipocalina específica de CD137 (SEQ ID NO: 88 y SEQ ID NO: 89) y los anticuerpos anti-PD-L1 (SEQ ID NOs: 26 y 27, SEQ ID NOs: 86 y 87) con diferentes concentraciones, se añadieron a los pocillos y se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente, seguido de otra etapa de lavado. Las moléculas unidas en estudio se detectaron mediante incubación con anti-Fc de IgG humana-HRP diluido 1:5000 (Jackson Laboratory) en PBS-0,1% de T-2% de BSA. Después de una etapa de lavado adicional, se añadió sustrato fluorogénico de HRP (QuantaBlu, Thermo) a cada pocillo y se detectó la intensidad de la fluorescencia utilizando un lector de microplacas de fluorescencia.

También se empleó la misma configuración de ELISA para determinar la potencia de la unión de las proteínas de fusión a CD137, en donde huCD137-His (CD137 humano con marcador de polihistidina C-terminal, R&D Systems) o cyCD137-Fc (CD137 de macaco cangrejero fusionado en el extremo C-terminal con Fc) en su lugar se recubrió sobre una placa de microtitulación. Los agentes de la prueba se titularon de manera similar y los agentes unidos se detectaron a través de anti-NGAL-HRP.

Los resultados de los experimentos ejemplares se representan en la Figura 2A-2D, junto con las curvas de ajuste resultantes de un ajuste sigmoidal vinculante 1:1, en donde el valor de CE₅₀ y la señal máxima eran parámetros libres, y la pendiente se fijó en la unidad. Los valores de CE₅₀ resultante se proporcionan en la Tabla 4.

Los valores de CE₅₀ observados frente a las dos dianas humanas de las proteínas de fusión proporcionadas (SEQ ID NOs: 90 y 87, SEQ ID NOs: 86 y 91, SEQ ID NOs: 92 y 87, SEQ ID NOs: 86 y 93, SEQ ID NOs: 94 y 87, SEQ ID NOs: 90 y 91, SEQ ID NOs: 88 y SEQ ID NO: 89) eran muy similares o comparables a los anticuerpos de PD-L1 analizados (anticuerpo de PD-L1 de referencia de S^eQ ID NOs: 26 y 27 y anticuerpo de PD-L1 de SEQ ID NOs: 86 y 87 como se incluyen en las proteínas de fusión), y/o la muteína de lipocalina específica de CD137 como se incluye en las proteínas de fusión (SEQ ID NO: 42).

Todas las proteínas de fusión analizadas muestran reactividad cruzada con PD-L1 de macaco cangrejero, con valores de CE₅₀ comparables al anticuerpo de PD-L1 de referencia (SEQ ID NOs: 26 y 27) o el anticuerpo de PD-L1 incluido en las proteínas de fusión (SEQ ID NOs: 86 y 87). Solo las proteínas de fusión que son tetravalentes para CD137 (SEQ ID NOs: 94 y 87, SEQ ID NOs: 90 y 91 y SeQ ID NO: 88) muestran reactividad cruzada con CD137 de macaco cangrejero a un nivel comparable a CD137 humana, es decir, unen CD137 de macaco cangrejero con valores de CE₅₀ en el mismo rango que las CE₅₀ correspondientes para CD137 humana.

Tabla 4. Datos de ELISA para la unión de PD-L1 o CD137

Ejemplo 5. Unión simultánea de las proteínas de fusión a PD-L1 y a CD137 en ELISA

Para demostrar la unión simultánea de las proteínas de fusión ejemplares a PD-L1 y a CD137, se utilizó un formato de ELISA de unión doble.

HuPD-L1-His recombinante (R&D Systems) en PBS (1 μg/mL) se revistió durante la noche sobre placas de microtitulación a 4°C. Las placas se lavaron cinco veces después de cada etapa de incubación con 100 μL de PBS-0,05% de T. Las placas se bloquearon con 2% de BSA (p/v) en PBS-0,1% de T durante 1 hora a temperatura ambiente y luego se lavaron nuevamente. Se añadieron diferentes concentraciones de proteínas de fusión del ensayo a los pocillos y se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente, seguido de una etapa de lavado. Posteriormente, se añadió huCD137-His biotinilada (huCD137-His-Bio, Sino Biological) con una concentración constante de 1 μg/mL en PBS-0,1% de T-2% de BSA durante 1 h. Después del lavado, se añadió a los pocillos una dilución 1:5000 de ExtrAvidin-HRP (Sigma-Aldrich) en PBS-0,1% de T-2% de BSA y se incubaron durante 1 h. Después de una etapa de lavado adicional, se añadió sustrato de HRP fluorogénico (QuantaBlu, Thermo) a cada pocillo y se detectó la intensidad de la fluorescencia utilizando un lector de microplacas de fluorescencia.

La unión doble de las proteínas de fusión ejemplares también se analizó con una configuración inversa en la que 1 μg/ml de huCD137-His recombinante (R&D Systems) se revistió sobre placas de microtitulación y las proteínas de fusión unidas se detectaron mediante la adición de huPD-L1-His biotinilado (R&D Systems).

Los datos de la unión doble de las proteínas de fusión (SEQ ID NOs: 90 y 87, SEQ ID NOs: 86 y 91, SEQ ID NOs: 92 y 87, SEQ ID NOs: 86 y 93, SEQ ID NOs: 94 y 87 y SEQ ID NOs: 90 y 91) se muestran en la Figura 3A y 3B, junto con las curvas de ajuste resultantes de un ajuste de unión sigmoidal 1:1, en donde el valor de CE₅₀ y la señal máxima eran parámetros libres, y la pendiente se fijó en la unidad. Los valores de CE₅₀ se resumen en la Tabla 5. Todas las proteínas de fusión biespecíficas muestran señales de unión claras, lo que demuestra que las proteínas de fusión pueden unirse a PD-L1 y CD137 simultáneamente. Los datos sugieren además que fusionar muteínas de lipocalina específicas de CD137 con los extremos C-terminales de los anticuerpos específicos de PD-L1 puede ser más ventajoso que con los extremos N-terminales.

Tabla 5. Datos de ELISA para la unión simultánea a las dianas PD-L1 y CD37

Ejemplo 6. Análisis por citometría de flujo de las proteínas de fusión que se unen a células que expresan CD137 y PD-L1 de ser humano y de macaco cangrejero

La unión específica a la diana de las proteínas de fusión a células que expresan PD-L1 humano y de macaco cangrejero y células que expresan CD137 humana y de macaco cangrejero se evaluó mediante citometría de flujo.

Las células CHO se transfectaron de manera estable con PD-L1 humano, PD-L1 de macaco cangrejero, CD137 humana, CD137 de macaco cangrejero o un control simulado usando el sistema Flp-In (Life Technologies) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Las células CHO transfectadas se mantuvieron en medio de Ham F12 (Life technologies) complementado con suero de ternera fetal al 10% (Biochrom) y 500 |ug/ml de higromicina B (Roth). Las células se cultivaron en matraces de cultivo celular de acuerdo con las instrucciones del fabricante (37°C, atmósfera con 5% de CO²).

Para el análisis por citometría de flujo, las líneas celulares respectivas se incubaron con las proteínas de fusión (SEQ ID NOs: 90 y 87, SEQ ID NOs: 86 y 91, SEQ ID NOs: 92 y 87, SEQ ID NOs: 86 y 93, SEQ ID NOs: 94 y 87, SEQ ID NOs: 90 y 91, SEQ ID NO: 88 y SEQ ID NO: 89) y se detectaron usando un anticuerpo anti-IgG humana marcado con fluorescencia en un análisis FACS como se describe a continuación:

Se incubaron 5 x 104 células por pocillo durante 1 h en PBS enfriado con hielo que contenía suero de ternera fetal al 5% (PBS-FCS). Se añadió a las células una serie de diluciones de las proteínas de fusión y los anticuerpos de control y se incubaron durante 1 h en hielo. Las células se lavaron dos veces con PBS y luego se incubaron con un anticuerpo de cabra anti-hIgG marcado con Alexa647 durante 30 min en hielo. Posteriormente, las células se lavaron y se analizaron usando un citómetro de flujo iQue (Intellicyte Screener). Las señales fluorescentes geométricas medias se trazaron y se ajustaron con el programa informático Graphpad usando una regresión no lineal (parte inferior compartida, PENDIENTE = 1).

La capacidad de las proteínas de fusión para unirse a PD-L1 y CD137 de ser humano y de macaco cangrejero se representa en la Figura 4. Las afinidades de unión (CEsos) de las proteínas de fusión biespecíficas (SEQ ID NOs: 90 y 87, SEQ ID NOs: 86 y 91, SEQ ID NOs: 92 y 87, SEQ ID NOs: 86 y 93, SEQ ID NOs: 94 y 87 y SEQ ID NOs: 90 y 91) hacia células que expresan PD-L1 humano y de macaco cangrejero (cynoPD-L1) están en el rango nanomolar de un solo dígito, lo que demuestra una reactividad cruzada completa con macaco cangrejero (resumida en la Tabla 6). Las afinidades de unión de las proteínas de fusión hacia las células que expresan CD137 humana están en el rango nanomolar bajo. Las proteínas de fusión analizadas tienen una reactividad cruzada total con CD137 de macaco cangrejero (cynoCD137) (SEQ ID NOs: 94 y 87, SEQ ID NOs: 90 y 91 y SEQ ID NO: 88), se unen a CD137 de macaco cangrejero con afinidades entre 6 y 13 veces menores en comparación con las afinidades de unión correspondientes a CD137 humano (SEQ ID NOs: 90 y 87, SEQ ID NOs: 86 y 91 y SEQ ID NO: 89), o no se unen a CD137 de macaco cangrejero (SEQ ID NOs: 92 y 87 y 86 y 93). Ninguna de las proteínas de fusión se une a las células transfectadas de forma simulada.

Tabla 6. Afinidades de unión de las proteínas de fusión a células que expresan PD-L1 o CD137 de ser humano y de macaco cangrejero (cyno)

Ejemplo 7. Afinidades de unión de las proteínas de fusión hacia células tumorales positivas para PD-L1

La unión de las proteínas de fusión a las células tumorales que expresan PD-L1 se evaluó mediante citometría de flujo. La línea celular de cáncer colorrectal que expresa PD-L1, RKO, se mantuvo en RPMI 1640 (Life technologies) complementado con FCS al 10% a 37°C en una atmósfera humidificada con un 5% de CO².

Para el análisis por citometría de flujo, las células RKO se incubaron con proteínas de fusión y se detectaron usando un anticuerpo anti-IgG humana marcado con fluorescencia como se describe en el Ejemplo 6.

La capacidad de las proteínas de fusión (SEQ ID NOs: 90 y 87, SEQ ID NOs: 86 y 91, SEQ ID NOs: 92 y 87, SEQ ID NOs: 86 y 93, SEQ ⁱD NOs: 94 y 87 y S^eQ ID NOs: 90 y 91) para unirse a las células tumorales positivas para PD-L1 se muestra en la Figura 5 y las afinidades de unión correspondientes (CEsos) se resumen en la Tabla 7. Las afinidades de unión de las proteínas de fusión hacia las células RKO que expresaban PD-L1 estaban en el rango nanomolar o subnanomolar bajo, comparable con el anticuerpo de PD-L1 incluido en las proteínas de fusión (SEQ ID NOs: 86 y 87). Tabla 7. Afinidades de unión de las proteínas de fusión hacia las células tumorales positivas para PD-L1

Ejemplo 8. Determinación de la competencia entre CD137L y las proteínas de fusión en la unión a CD137 mediante SPR Se utilizó un ensayo SPR para investigar la competencia entre CD137L humano (huCD137L-His, R&D Systems) y las proteínas de fusión ejemplares para CD137 humana. El ensayo de competencia se realizó a 25°C en un instrumento Biacore T200 (GE Healthcare).

El reactivo BiotinCAPture (GE Healthcare) se inmovilizó sobre un chip sensor CAP con una concentración de 50 μg/ml y un caudal de 2 μL/min durante 300 s. El canal de referencia se trató de manera análoga. Se capturó huCD137-Fc biotinilado (R&D Systems) sobre la superficie del chip durante 300 s con una concentración de 1 μg/ml y un caudal de 5 μL/min en otro canal.

Para analizar si las proteínas de fusión de la prueba (SEQ ID NOs: 90 y 87, SEQ ID NOs: 86 y 91, SEQ ID NOs: 92 y 87, SEQ ID NOs: 86 y 93, SEQ ID NOs: 90 y 91, SEQ ID NOs: NO: 88 y SEQ ID NO: 89) compiten con CD137L para unirse a CD137, se aplicó un tampón de ejecución (tampón HBS-EP+) o huCD137L-His 500 nM a la superficie del chip durante 180 s con un caudal de 30 μL/min. Posteriormente, las proteínas de fusión de la prueba se aplicaron a la superficie del chip preparado en tampón HBS-EP+ con una concentración fija de 1 μM. El ensayo de unión se realizó con un tiempo de contacto de 180 s, un tiempo de disociación de 15 s y un caudal de 30 μL/min. Como control, se incluyeron inyecciones de tampón con los mismos parámetros. La regeneración de la superficie del chip se logró con inyecciones de Gua-HCl 6 M, NaOH 0,25 M durante 120 s con un caudal de 10 μL/min, seguido de una etapa de lavado adicional con H²O (120 s, 10 μL/min).

Ejemplos representativos para el segmento relevante de los sensogramas resultantes se proporcionan en la Figura 6 para las proteínas de fusión de SEQ ID NOs: 90 y 87, SEQ ID NOs: 86 y 91, SEQ ID NOs: 92 y 87, SEQ ID NOs: 86 y 93, SEQ ID NOs: 90 y 91, SEQ ID NO: 88 y SEQ ID NO: 89. La traza de SPR para la unión de la proteína de fusión respectiva a huCD137-Fc sola está marcada con una flecha con un eje negro. La traza de SPR para la unión de la proteína de fusión a huCD137-Fc que se había saturado con huCD137L-His está marcada con una flecha con un eje a trazos. Los datos muestran que todas las proteínas de fusión se unen a huCD137 en presencia de huCD137L, pero con señales ligeramente reducidas en comparación con su unión a CD137 en ausencia de CD137L. Esto sugiere que las proteínas de fusión sometidas a ensayo pueden verse obstaculizadas estéricamente por la unión de CD137L a CD137 hasta cierto punto. Este comportamiento de unión de las proteínas de fusión (SEQ ID NOs: 90 y 87, SEQ ID NOs: 86 y 91, SEQ ID NOs: 92 y 87, SEQ ID NOs: 86 y 93, SEQ ID NOs: 90 y 91, SEQ ID NO: 88 y SEQ ID NO: 89) es similar al del anticuerpo anti-CD137 de SEQ ID NOs: 28 y 29.

Ejemplo 9. Competencia de las proteínas de fusión con PD-L1 en la unión a PD-1 determinada mediante ELISA

Para demostrar la capacidad de las proteínas de fusión para inhibir la interacción entre PD-1 y PD-L1, se utilizó un formato de ELISA competitivo.

huPD-1-His recombinante (Acrobiosystems) en PBS (1 μg/mL) se revistió durante la noche sobre placas de microtitulación a 4°C. Las placas se lavaron cinco veces después de cada etapa de incubación con 100 μL de PBS-0,05% de T (PBS complementado con Tween 20 al 0,05% (v/v)). Las placas se bloquearon con BSA al 2% (p/v) en PBS-0,1% de T (PBS complementado con Tween 20 al 0,1% (v/v)) durante 1 hora a temperatura ambiente y luego se lavaron nuevamente. Las proteínas de fusión con diferentes concentraciones se mezclaron con 15 nM de huPD-L1-Fc recombinante (R&D Systems) como trazador y se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente. Las mezclas de proteínas de fusión y trazador se añadieron a las placas y se incubaron durante 20 min a temperatura ambiente, seguido de cinco etapas de lavado con 100 μL de PBS-0,05% de T. Posteriormente, se añadió a los pocillos una dilución 1:5000 de anti-Fc de IgG humana HRP de cabra (Jackson) y se incubó durante 1 h. Después de una etapa de lavado adicional, se añadió sustrato de HRP fluorogénico (QuantaBlu, Thermo) a cada pocillo y se detectó la intensidad de la fluorescencia utilizando un lector de microplacas de fluorescencia.

Se muestran datos de la competencia de las proteínas de fusión ejemplares (SEQ ID NOs: 90 y 87, SEQ ID NOs: 86 y 91, SEQ ID NOs: 92 y 87, SEQ ID NOs: 86 y 93 y SEQ ID NOs: 90 y 91) en la Figura 7, junto con las curvas de ajuste resultantes de un ajuste de la unión sigmoidal 1:1, en donde el valor de CI₅₀ y la señal máxima eran parámetros libres, y la pendiente se fijó en la unidad. Los valores de CI₅₀ se resumen en la Tabla 9. Todas las proteínas de fusión biespecíficas mostraban una clara inhibición de la interacción PD-1/PD-L1 con valores de CI₅₀ comparables a la unidad estructural del anticuerpo (SEQ ID NOs: 86 y 87) y un anticuerpo de PD-L1 de referencia (SEQ ID NOs: 26 y 27).

Tabla 8. Competencia de las proteínas de fusión con PD-L1 para unirse a PD-1

Ejemplo 10. Coestimulación de linfocitos T dependiente de PD-L1 utilizando un bioensayo CD137

El potencial de las proteínas de fusión seleccionadas para inducir una activación de la vía de señalización de CD137 en presencia de PD-L1 se evaluó utilizando una línea celular Jurkat transfectada doblemente estable, disponible en el mercado que expresaba CD137 y el gen luc2 (versión humanizada de la luciferasa de luciérnaga) en tanto que la expresión de luc2 está impulsada por un elemento sensible a NF ^k B. En este bioensayo, el acoplamiento de CD137 da como resultado una señalización intracelular de CD137, lo que conduce a una luminiscencia mediada por NF ^k B.

La línea celular de cáncer colorrectal RKO que expresaba PD-L1 se cultivó como se ha descrito en el Ejemplo 7. Un día antes del ensayo, se sembraron células RKO a 1,25 x 104 células por pocillo y se permitió la adherencia durante la noche a 37°C en una atmósfera humidificada con un 5% de CO².

Al día siguiente, se añadieron 3,75 x 104 células Jurkat NF-kB-Luc2/CD137 a cada pocillo, seguido de la adición de varias concentraciones, normalmente en un intervalo de 0,001 nM a 5 nM, de proteínas de fusión o un anticuerpo de CD137 de referencia (SEQ ID NOs: 28 y 29). Las placas se cubrieron con un sellado permeable a los gases y se incubaron a 37°C en una atmósfera humidificada con un 5% de CO². Después de 4 h, se añadieron 30 μL de reactivo Bio-Gio™ a cada pocillo y se cuantificó la señal bioluminiscente utilizando un luminómetro (PHERAstar). El análisis de la curva logística de cuatro parámetros se realizó con GraphPad Prism® para calcular los valores de CE₅₀ (fondo compartido, pendiente fija) que se resumen en la Tabla 9. Para demostrar la dependencia de PD-L1 del acoplamiento de CD137 mediante proteínas de fusión, se realizó el mismo experimento en paralelo en ausencia de células RKO. El ensayo se realizó por triplicado.

Los resultados de un experimento representativo se representan en la Figura 8A-8D. Los datos demuestran que todas las proteínas de fusión analizadas (SEQ ID NOs: 90 y 87, SEQ ID NOs: ⁸⁶ y 91, SEQ ID NOs: 92 y 87 y SEQ ID NOs: ⁸⁶ y 93) inducían una fuerte coestimulación de los linfocitos T mediada por CD137. La Figura 8B y 8D muestra que la activación de CD137 a través de las proteínas de fusión depende de PD-L1, porque no se detectaba activación de las células NF-kB-Luc2/CD137 Jurkat en ausencia de células tumorales que expresaban PD-L1. Por el contrario, el mAb anti-CD137 de referencia (SEQ ID NOs: 28 y 29) mostraba una coestimulación de los linfocitos T mediada por CD137 independientemente de la presencia o ausencia de células diana.

Tabla 9. Evaluación de la activación de linfocitos T mediante un bioensayo con CD137

Ejemplo 11. Evaluación de la activación de linfocitos T utilizando células mononucleares de sangre periférica humana (PBMCs)

Se empleó un ensayo con linfocitos T para evaluar la capacidad de las proteínas de fusión seleccionadas para coestimular respuestas de los linfocitos T, así como para prevenir una coinhibición mediada por la unión de PD-L1 a PD-1. Para este fin, se añadieron proteínas de fusión en diferentes concentraciones a células mononucleares de sangre periférica humana (PBMCs) estimuladas con enterotoxina estafilocócica B (SEB) y se incubaron durante 4 días a 37°C. Los niveles de secreción de IL-2 se midieron en los materiales sobrenadantes.

Las PBMCs de donantes voluntarios sanos se aislaron a partir de las capas leucocitarias mediante centrifugación a través de un gradiente de densidad con polisacarosa (Biocoll, 1,077 g/mL, Biochrom), siguiendo los protocolos de Biochrom. Las PBMCs purificadas se resuspendieron en un tampón que consistía en FCS al 90% y DMSO al 10%, se congelaron inmediatamente y se almacenaron en nitrógeno líquido hasta un uso posterior. Para el ensayo, las PBMCs se descongelaron y se dejaron reposar en medio de cultivo (RPMI 1640, Life Technologies) complementado con FCS al 10% y penicilina-estreptomicina al 1% (Life Technologies) durante 16 h a 37°C en una atmósfera humidificada con un 5% de CO².

El siguiente procedimiento se realizó por triplicado para cada condición experimental: 2,5 x 104 PBMCs se incubaron en cada pocillo de placas de cultivo de tejido de fondo plano de 384 pocillos, en medio de cultivo. Una serie de diluciones de proteínas de fusión (SEQ ID No s : 90 y 87, SEQ ID NOs: ^{8 6} y 91, SEQ ID NOs: 92 y 87, SEQ ID NOs: ^{8 6} y 93, SEQ ID NO: 94 y 87, y ^s E^q ID NOs: 90 y 91), el anticuerpo de PD-L1 de la unidad estructural (SEQ ID NOs: ^{8 6} y 87), el anticuerpo de PD-L¹ de referencia (SEQ iD NOs : 26 y 27), el anticuerpo de CD137 de referencia (SEQ ID NOs: ²⁸ y 29), una mezcla del anticuerpo de CD137 de referencia (SEQ ID NOs: 28 y 29) y un anticuerpo de PD-L1 (SEQ ID Nos: ⁸⁶ y 87 o SEQ ID NOs: 26 y 27) o un control de isotipo (SEQ ID NOs: 24 y 25), que oscilaban típicamente entre ¹⁰ y ^{0 , 0 0 2} nM, y ^{0 ,1} ng/ml de SEB, se añadieron a los pocillos respectivos. Las placas se cubrieron con un sellado permeable a los gases (4titude) y se incubaron a 37°C en una atmósfera humidificada con un 5% de CO² durante cuatro días. Posteriormente, se evaluaron los niveles de IL-2 en el material sobrenadante usando el kit DuoSet de IL-2 humana (R&D Systems) como se describe en los siguientes procedimientos.

Se recubrieron placas de 384 pocilios durante 2 horas a temperatura ambiente con 1 μg/ml de "anticuerpo de captura de IL-2 humana" en PBS. Posteriormente, los pocilios se lavaron 5 veces con 80 μL de PBS complementado con Tween al 0,05% (PBS-T). Después de 1 h de bloqueo en PBS-0,05% de T que contenía caseína al 1% (p/p), los materiales sobrenadantes del ensayo y una serie de concentraciones de patrón de IL-2 diluido en medio de cultivo, se transfirieron a los pocillos respectivos y se incubaron durante la noche a 4°C. Al día siguiente, se añadió una mezcla de 100 ng/mL de anticuerpo de detección de cabra anti-hlL-2-Bio (R&D Systems) y 1 μg/mL de estreptavidina marcada con Sulfotag (Mesoscale Discovery) en PBS-T que contenía 0,5% de caseína y se incubó a temperatura ambiente durante 1 h. Después del lavado, se añadieron 25 μL de tampón de lectura (Mesoscale Discovery) a cada pocillo y la señal de electroquimioluminiscencia (ECL) resultante fue detectada por un lector Mesoscale Discovery. El análisis y la cuantificación se realizaron utilizando el programa informático Mesoscale Discovery.

El resultado de un experimento representativo se representa en la Figura 9. Proteínas de fusión biespecíficas de SEQ ID NOs: 90 y 87, SEQ ID NOs: 86 y 91, SEQ ID NOs: 92 y 87, SEQ ID NOs: 86 y 93, SEQ ID NO: 94 y 87 y SEQ ID NOs: 90 y 91 son capaces de inducir la activación de linfocitos T, lo que se demuestra por el aumento de los niveles de secreción de IL-2 en comparación con el control de isotipo (hlgG4, Sigma). El aumento más fuerte en la secreción de IL-2 se observa en las proteínas de fusión tetravalentes para CD137 (SEQ ID NOs: 94 y 87 y SEQ ID NOs: 90 y 91), seguidas por la proteína de fusión bivalente para CD137 con la muteína de lipocalina fusionada con el extremo C-terminal del anticuerpo específico de PD-L1 (SEQ ID NOs: 90 y 87 y SEQ ID NOs: 86 y 91). El aumento más bajo se observa con las proteínas de fusión bivalentes para CD137 con la muteína de lipocalina fusionada con el extremo N-terminal del anticuerpo específico de PD-L1 (SEQ ID NOs: 92 y 87 y SEQ ID NOs: 86 y 93), sin embargo, todavía era comparable con la mezcla de un anticuerpo de CD137 de referencia (SEQ ID NOs: 28 y 29) y un anticuerpo de referencia de PD-L1 (SEQ ID NOs: 26 y 27). Todas las proteínas de fusión muestran niveles de secreción de IL-2 más altos que las unidades estructurales individuales, es decir, muteína de lipocalina específica de CD137-Fc (SEQ ID NO: 88 o SEQ ID NO: 89) o la unidad estructural mAb de PD-L1 (SEQ ID NOs: 86 y 87).

Ejemplo 12. Evaluación de la activación de linfocitos T en presencia de células tumorales que expresan diferentes niveles de PD-L1

Se empleó otro ensayo con linfocitos T para evaluar la capacidad de las proteínas de fusión para coestimular la activación de linfocitos T de una manera dependiente de la diana PD-L1. Las proteínas de fusión se aplicaron en diferentes concentraciones a linfocitos T estimulados con anti-CD3, en presencia de líneas celulares tumorales con diferentes niveles de expresión de PD-L1. Las líneas de células tumorales analizadas incluyen RKO (PD-L1 alto), HCC827 (PD-L1 moderado) y Hep-G2 (PD-L1 negativo). Los niveles de secreción de IL-2 se midieron en los materiales sobrenadantes.

Se aislaron PBMCs de donantes voluntarios sanos a partir de las capas leucocitarias como se ha descrito en el Ejemplo 11. Los linfocitos T se purificaron adicionalmente a partir de PBMCs mediante clasificación celular magnética usando un kit de purificación de linfocitos T de todos los tipos (Miltenyi Biotec GmbH) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los linfocitos T de todos los tipos purificados se resuspendieron en un tampón que consistía en FCS al 90% y DMSO al 10%, se congelaron inmediatamente y se almacenaron en nitrógeno líquido hasta un uso posterior.

Para el ensayo, los linfocitos T se descongelaron y reposaron en medios de cultivo (RPMI 1640, Life Technologies) complementados con FCS al 10% y penicilina-estreptomicina al 1% (Life Technologies) durante 16 h a 37°C en una atmósfera humidificada con un 5% de CO².

Se realizó el siguiente procedimiento por triplicado para cada condición experimental: las placas de cultivo de tejido de fondo plano se recubrieron previamente con 0,25 μg/mL de anticuerpo anti-CD3 durante 1 hora a 37°C y luego se lavaron dos veces con PBS. Las líneas de células tumorales RKO, HCC827 o Hep-G2 se trataron durante 30 min con 30 μg/ml de mitomicina C (Sigma Aldrich) para bloquear la proliferación. A continuación, las células tumorales tratadas con mitomicina se lavaron dos veces con PBS y se colocaron en placas a 2,5 x 104 células por pocillo en medio de cultivo para permitir la adhesión durante la noche a 37°C, en una atmósfera humidificada con un 5% de CO². Las células diana se habían cultivado previamente en condiciones estándar, se habían separado utilizando Accutase (PAA Laboratories) y se habían resuspendido en medio de cultivo.

Los días siguientes, después de lavar las placas dos veces con PBS, se añadieron 1,25 x 104 linfocitos T por pocillo a las células tumorales. Una serie de diluciones de las proteínas de fusión (SEQ ID NOs: 90 y 87, SEQ ID NOs: 86 y 91, SEQ ID NOs: 92 y 87 y SEQ ID NOs: 86 y 93), anticuerpo de PD-L1 de referencia (SeQ ID NOs: 26 y 27) y el anticuerpo de CD137 de referencia (SEQ ID NOs: 28 y 29) usados solos o en combinación, o un control del isotipo (SEQ ID NOs: 24 y 25), típicamente en un intervalo de 0,005 nM a 10 nM, se añadieron a los correspondientes pocillos Las placas se cubrieron con un sellado permeable a los gases y se incubaron a 37°C en una atmósfera humidificada con un 5% de CO² durante 3 días.

Después de 3 días de cocultivo, se evaluó el nivel de IL-2 en el material sobrenadante como se ha descrito en el Ejemplo 11.

Los datos ejemplares se muestran en la Figura 10. Un cocultivo de linfocitos T de todos los tipos con células RKO (PD-L1 alto) o HCC827 (PD-L1 moderado) en presencia de las proteínas de fusión con la muteína de lipocalina fusionada con el extremo C-terminal del anticuerpo específico de PD-L1 (SEQ ID NOs: 90 y 87 y SEQ ID NOs: 86 y 91), conduce a un claro aumento en la secreción de IL-2 en comparación con el control de isotipo hIgG4. El aumento de la secreción de IL-2 inducida por las proteínas de fusión con la muteína de lipocalina fusionada con el extremo N-terminal del anticuerpo específico de p D-L1 (SEQ ID NOs: 92 y 87 y SEQ ID NOs: 86 y 93) era más débil pero aún mayor que una mezcla de un anticuerpo de CD137 de referencia (SEQ ID NOs: 28 y 29) y un anticuerpo de referencia de PD-L1 (SEQ ID NOs: 26 y 27). No se observó un aumento de la secreción de IL-2 con una mezcla de unidades estructurales, muteína de lipocalina específica de CD137 (fusión de Fc, SEQ ID NO: 89) y anticuerpo de PD-L1 (SEQ ID NOs: 86 y 87). Además, el cocultivo con Hep-G2 (PD-L1 negativo) no aumentaba los niveles de secreción de IL-2 con ninguna proteína de fusión, pero si con la mezcla de un anticuerpo de CD137 de referencia (SEQ ID NOs: 28 y 29) y un anticuerpo de PD-L1 de referencia (SEQ ID NOs: 26 y 27).

Los datos indican que la actividad funcional de las proteínas de fusión, medida por su capacidad para activar los linfocitos T o aumentar la secreción de IL-2, depende de PD-L1. Por el contrario, la activación de linfocitos T o la secreción de IL-2 inducida por el anticuerpo de CD137 de referencia (SEQ ID NOs: 28 y 29), cuando se usa en combinación con el anticuerpo de PD-L1 de referencia (SEQ ID NOs: 26 y 27), no es necesariamente dependiente de PD-L1 y difícil de predecir. Además, los datos muestran que el formato biespecífico de direccionamiento a PD-L1 y CD137 es superior que el de una mezcla de dos moléculas distintas que se dirigen a CD137 y a PD-L1 en presencia de células diana que expresan PD-L1.

Ejemplo 13. Evaluación de la estabilidad en almacenamiento de las proteínas de fusión

Para evaluar la estabilidad en almacenamiento, proteínas de fusión ejemplares (SEQ ID NOs: 90 y 87, SEQ ID NOs: 86 y 91, SEQ ID NOs: 92 y 87, SEQ ID NOs: 86 y 93, SEQ ID NOs: 94 y 87, SEQ ID NO: 88 y SEQ ID NO: 89) se incubaron durante 1 semana a 37°C con una concentración de 1 mg/ml en PBS. Las proteínas de fusión monoméricas se determinaron posteriormente mediante exclusión por tamaño analítico mediante la aplicación de 20 μg de muestra en una columna Superdex 200, 3.2/300 Increase (GE Healthcare) con un caudal de 0,15 ml/min y PBS como tampón de ejecución. Todos los péptidos de fusión de la prueba eran estables después de una incubación de 1 semana en PBS a 37°C. Los resultados ejemplares se muestran en la Figura 11A.

Se realizaron evaluaciones adicionales de la estabilidad en almacenamiento para una proteína de fusión seleccionada de SEQ ID NOs: 90 y 87. Se incubaron 20 mg/ml de la proteína de fusión durante cuatro semanas a 40°C en histidina 25 mM, NaCl 60 mM, arginina 200 mM pH 6. El contenido en proteína de fusión funcional se midió en un entorno de ELISA cuantitativo, utilizando el ensayo de unión simultánea como se ha descrito en el Ejemplo 5. Los resultados ejemplares se muestran en la Figura 11B.

Ejemplo 14. Evaluación de una reacción de linfocitos mixtos (MLR) con linfocitos T CD4+

Se utilizó un ensayo de reacción de linfocitos mixtos (MLR) para evaluar la capacidad de una proteína de fusión ejemplar para inducir la activación de linfocitos T CD4+ en presencia de células presentadoras de antígenos. La proteína de fusión (SEQ ID NOs: 90 y 87) en varias concentraciones se analizó en presencia de células dendríticas derivadas de monocitos (moDCs) y linfocitos T CD4+ de donantes sanos no coincidentes. Después de 6 días de cultivo en presencia de las moléculas analizadas, se cuantificó la secreción de IL-2 e IFN-gamma en los materiales sobrenadantes.

Las PBMCs se purificaron a partir de una bolsa de sangre de aféresis de plaquetas utilizando una solución de Lymphoprep siguiendo las instrucciones del fabricante (StemCell). Los linfocitos T CD4+ totales se purificaron a partir de las PBMCs utilizando un kit Miltenyi y se congelaron en una solución de FBS al 90% y DMSO al 10%. Los monocitos CD14+ se purificaron usando el kit de perlas de CD14+ (Miltenyi) y se usaron frescos.

Las MoDCs se obtuvieron cultivando monocitos CD4+ en RPMI 1640 más FBS al 10% y Pen/Strep (LifeTech) en presencia de 50 ng/mL de IL-4 y 100 ng/mL de GMCSF (Miltenyi) durante 6 días a 2x106 células/mL. El día 3, se añadieron 10 ml de medio fresco que contenía citocinas. El fenotipo (CD14, CD1a, HLADR, PD-L1) se evaluó el día 7 de la diferenciación mediante FACS.

Se cultivaron 10000 moDCs en presencia de 50000 linfocitos T CD4+ en 96 pocillos de fondo en U en medio RPMI completo, en presencia de las moléculas analizadas durante 6 días en RPMI en pocillos por triplicado. Al final del cultivo, los materiales sobrenadantes se congelaron inmediatamente y se almacenaron para la cuantificación de citocinas.

El nivel de IL-2 se midió en los materiales sobrenadantes utilizando la tecnología Luminex y los datos ejemplares se muestran en la Figura 12. La Figura 12A muestra que la proteína de fusión (SEQ ID NOs: 90 y 87) era significativamente mejor en la inducción de IL-2 con 10 y 0,1 μg/mL, que en comparación con las unidades estructurales correspondientes (SEQ ID NO: 89 y SEQ ID NOs: 86 y 87) solas o un anticuerpo de CD137 o PD-L1 de referencia (SEQ ID NOs: 28 y 29 o SEQ ID NOs: 26 y 27) en varios conjuntos de experimentos de MLR (N = 8). La Figura 12B indica que la proteína de fusión (SEQ ID NOs: 90 y 87) inducía una secreción de IL-2 dependiente de la dosis en comparación con un control de isotipo de anticuerpo. Los niveles de IL-2 inducidos por la proteína de fusión SEQ ID NOs: 90 y 87 eran más altos que en comparación con las concentraciones equimolares de la mezcla de un anticuerpo de PD-L1 de referencia (SEQ ID NOs: 26 y 27) y un anticuerpo de CD137 de referencia (SEQ ID NOs: 28 y 29), sobre concentraciones que oscilaban desde 0,001 a 20 μg/mL.

Ejemplo 15. Evaluación de la reacción de linfocitos mixtos con linfocitos T CD8+

Dados los informes de expresión y actividad de CD137 en linfocitos T CD8+, la capacidad de una proteína de fusión ejemplar para inducir una activación de los linfocitos T CD8+ en presencia de células presentadoras de antígenos, se evaluó en un ensayo MLR. La proteína de fusión (SEQ ID NOs: 90 y 87) se analizó en presencia de moDCs y linfocitos T CD8+ totales de donantes sanos no coincidentes. Después de 6 días de cultivo en presencia de las moléculas analizadas, se cuantificó la secreción de IL-2 y moléculas efectoras CD8 (perforina, granzima B y granzima A) en los materiales sobrenadantes.

Las PBMCs se purificaron a partir de una bolsa de sangre de aféresis de plaquetas utilizando una solución de Lymphoprep siguiendo las instrucciones del fabricante (StemCell). Los linfocitos T CD8+ totales se purificaron a partir de las PBMCs usando un kit Miltenyi y se usaron frescos. Los monocitos positivos para CD14 se purificaron usando kit de perlas para CD14+ (Miltenyi) y se usaron frescos.

Las MoDCs se obtuvieron cultivando monocitos CD4+ en RPMI 1640 más FBS al 10% y Pen/Strep (LifeTech) en presencia de 50 ng/mL de IL-4 y 100 ng/mL de GMCSF (Miltenyi) durante 6 días a 2x106 células/mL. El día 3, se añadieron 10 mL de medio fresco que contenía citocinas. El fenotipo (CD14, CD1a, HLADR, PD-L1) se evaluó el día 7 de la diferenciación mediante FACS.

Se cultivaron 10000 moDCs en presencia de 50000 linfocitos T CD8+ en medio RPMI completo, en presencia de las moléculas analizadas durante 6 días en 96 pocillos de fondo en U (en pocillos por triplicado). Al final del cultivo, los materiales sobrenadantes se congelaron inmediatamente y se almacenaron para la cuantificación de citocinas.

IL-2, perforina, granzima A y granzima B se cuantificaron en los materiales sobrenadantes utilizando la tecnología Luminex. Los datos de ejemplo se muestran en la Figura 13.

La Figura 13 indica que la proteína de fusión (SEQ ID NOs: 90 y 87) mostraba un aumento en la secreción de IL-2, perforina, granzima B y granzima A en comparación con una concentración equimolar de un anticuerpo de PD-L1 de referencia (SEQ ID NOs: 26 y 27), un anticuerpo de CD137 de referencia (SEQ ID NOs: 28 y 29) o la mezcla de los dos a 10 μg/mL (N=4). Los datos sugieren además que la proteína de fusión (SEQ ID NOs: 90 y 87) tiene actividad sobre los linfocitos T CD8+ citotóxicos.

Ejemplo 16. Evaluación de la actividad funcional in vivo en un modelo de ratón con xenoinjerto implantado con PBMCs humanas

Para investigar la actividad in vivo de las proteínas de fusión proporcionadas, se utilizará un modelo de ratón con xenoinjerto obtenido de una línea celular. En consecuencia, se implantará una línea celular de cáncer humano por vía subcutánea en ratones NOG hembra inmunodeficientes, suministrada a la edad de 4 a 6 semanas con al menos 1 semana de cuarentena. Después de que los tumores han ido alcanzando volúmenes de aproximadamente 80-100 mm3, en los ratones se sustituyen con PBMCs humanas. Los compuestos de la prueba se inyectarán al menos tres veces y se medirá constantemente el crecimiento y la actividad del tumor. Al llegar al final del estudio, se sacrificarán los ratones. La infiltración intratumoral de células positivas para CD3, CD4 y CD8 se evaluará mediante inmunohistoquímica. Se llevará a cabo un RNAscopio de IFN-gamma como lectura adicional.

Ejemplo 17. Análisis de los epítopos de las proteínas de fusión

Para evaluar los epítopos que reconocen las proteínas de fusión y si son clínicamente relevantes, se utilizó un formato de ELISA competitivo para determinar la competencia entre las proteínas de fusión y un anticuerpo de CD137 de referencia.

Las placas de microtitulación se recubrieron con el anticuerpo de CD137 de referencia SEQ ID NOs: 28 y 29 en PBS (4 μg/mL) a 4°C durante la noche. Las placas se lavaron cinco veces después de cada etapa de incubación con 100 μL de PBS-0,05% de T (PBS complementado con Tween 20 al 0,05% (v/v)). Las placas se bloquearon con BSA al 2% (p/v) en PBS-0,1% de T (PBS complementado con Tween 20 al 0,1% (v/v)) durante 1 hora a temperatura ambiente y luego se lavaron nuevamente. Las proteínas de fusión (SEQ ID NOs: 90 y 87 y SEQ ID NOs: 86 y 91), la muteína de lipocalina específica de CD137 (SEQ ID NO: 42), el anticuerpo de CD137 de referencia (SEQ ID NOs: 28 y 29) y un anticuerpo de control (SEQ ID NOs: 86 y 87) a diferentes concentraciones, se mezclaron con 1 nM de la fusión Fc y CD137 humana biotinilada (huCD137-Fc-bio) como trazador y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Las mezclas de moléculas de la prueba y el trazador se añadieron a las placas y se incubaron durante 20 min a temperatura ambiente, seguido de cinco etapas de lavado con 100 μL de PBS-0,05% de T. Posteriormente, se añadió a los pocillos una dilución 1:5000 de ExtrAvidin-HRP (Sigma-Aldrich) en PBS-0,1% de T-2% de BSA y se incubó durante 1 h. Después de una etapa de lavado adicional, se añadió sustrato de HRP fluorogénico (QuantaBlu, Thermo) a cada pocillo y se detectó la intensidad de la fluorescencia utilizando un lector de microplacas de fluorescencia.

Los datos de la competencia para un experimento ejemplar se muestran en la Figura 14, en donde el eje x representa la concentración de la molécula de la prueba y el eje y representa la concentración de la molécula trazadora medida. Los datos se ajustaron a una curva sigmoidal 1:1, en donde el valor de CI₅₀ y la señal máxima eran parámetros libres, y la pendiente se fijó en la unidad. Los resultados demuestran que las proteínas de fusión ejemplares (SEQ ID NOs: 90 y 87 y SEQ ID NOs: 86 y 91) compiten con el anticuerpo de CD137 SEQ ID NOs: 28 y 29 para unirse a CD137, lo que sugiere que las proteínas de fusión se unen a epítopos que se solapan con el anticuerpo.

Tabla 10. Competencia de las proteínas de fusión

Ejemplo 18. Evaluación de la activación de linfocitos T usando un bioensayo de bloqueo de PD-1/PD-L1

El potencial de las proteínas de fusión seleccionadas para bloquear la supresión mediada por PD-1/PD-L1 se evaluó usando linfocitos T PD-1-NFAT-luc Jurkat (una línea de células Jurkat diseñada para expresar PD-1) y el gen luc (gen de la luciferasa de la luciérnaga) dirigidos por un elemento de respuesta NFAT (NFAT-RE)), se cocultivaron con células PD-L1 aAPC/CHO-K1 (células CHO-K1 que expresan PD-L1 humano y una proteína de la superficie celular diseñada para activar TCRs afines de manera independiente del antígeno). En este bioensayo, cuando se cocultivan los linfocitos T PD-1-NFAT-luc Jurkat y las células PD-L1 aAPC/CHO-K1, la interacción PD-1/PD-L1 inhibe la señalización de TCR y la luminiscencia mediada por NFAT-RE. La adición de un agente bloqueador de PD-1/PD-L1, como las proteínas de fusión específicas para CD137 y PD-L1 como se describen en este documento, libera la señal inhibidora y da como resultado la activación de TCR y la luminiscencia mediada por NFAT-RE.

Las células PD-L1 aAPC/CHO-K1 se cultivaron en medio de Ham F12 complementado con FCS al 10% y se extendieron en placas con 8,00 x 103 células por pocillo y se permitió la adherencia durante la noche a 37°C en una atmósfera humidificada con un 5% de CO². Al día siguiente se descartó el medio de cultivo. Se añadieron 1,00 x 104 linfocitos T PD-1-NFAT-luc Jurkat a cada pocillo, seguido de la adición de varias concentraciones, normalmente en el intervalo de 0,005 nM a 50 nM de una proteína de fusión (SEQ ID NOs: 90 y 87) o un anticuerpo de PD-L1 (SEQ ID NOs: 86 y 87 o SEQ ID NOs: 26 y 27). Las placas se cubrieron con un sellado permeable a los gases y se incubaron a 37°C en una atmósfera humidificada con un 5% de CO². Después de 6 h, se añadieron 30 μL de reactivo Bio-Glo™ a cada pocillo y se cuantificó la señal bioluminiscente utilizando un luminómetro. El análisis de la curva logística de cuatro parámetros se realizó con GraphPad Prism® para calcular los valores de CE₅₀ que se resumen en la Tabla 11. El ensayo se realizó por triplicado.

Los resultados de un experimento representativo se representan en la Figura 15. Los datos demuestran que la proteína de fusión analizada inhibe el bloqueo de PD-1/PD-L1 y activa los linfocitos T de forma dependiente de la dosis, con un valor de CE50 comparable al de un anticuerpo de PD-L1 (SEQ ID NOs: 86 y 87 o SEQ ⁱD NOs: 26 y 27). Como controles negativos, ni el anticuerpo de CD137 de referencia (SEQ ID NOs: 28 y 29) ni el anticuerpo de control de isotipo (SEQ ID NOs: 24 y 25) conducen a un aumento de la señal de luminiscencia.

Tabla 11. Evaluación de la activación de linfocitos T mediante un bioensayo de bloqueo de PD-1/PD-L1

Ejemplo 19. Evaluación de la activación de linfocitos T usando PBMCs humanas

Se empleó un ensayo de linfocitos T adicional para evaluar la capacidad de las proteínas de fusión seleccionadas para coestimular las respuestas de los linfocitos T, añadiendo proteínas de fusión con diferentes concentraciones a PBMCs humanas estimuladas con SEB y se incubaron durante 3 días a 37°C. Los niveles de secreción de IL-2 se midieron en los materiales sobrenadantes.

Las PBMCs de donantes voluntarios sanos se aislaron y se almacenaron como se describe en el Ejemplo 11. Para el ensayo, las PBMCs se descongelaron y se dejaron reposar en medio de cultivo (RPMI 1640, Life Technologies) complementado con FCS al 10% y penicilina-estreptomicina al 1% (Life Technologies) durante 24 h a 37°C en una atmósfera humidificada con un 5% de CO².

El siguiente procedimiento se realizó por triplicado para cada condición experimental: 2,5 x 104 PBMCs se incubaron en cada pocillo de placas de cultivo de tejido de fondo plano de 384 pocillos en medio de cultivo. Una serie de diluciones de una proteína de fusión seleccionada (SEQ ID NOs: 90 y 87), la unidad estructural del anticuerpo de PD-L1 (SEQ ID NOs: 86 y 87), un anticuerpo de CD137 de referencia (SEQ ID NOs: 28 y 29) usado solo o en combinación con un anticuerpo de PD-L1 de referencia (SEQ ID NOs: 26 y 27) o un control de isotipo (SEQ ID NOs: 24 y 25), que normalmente variaba de 0,0002 a 10 nM, y 0,1 ng/ml de SEB, se añadieron a los respectivos pocillos. Las placas se cubrieron con un sellado permeable a los gases (4titude) y se incubaron a 37°C en una atmósfera humidificada con un 5% de CO² durante tres días. Posteriormente, la IL-2 en el material sobrenadante se evaluó como se describe en el Ejemplo 11.

Los resultados de un experimento representativo se representan en la Figura 16. Los valores de CE₅₀ de las moléculas de la prueba para inducir la secreción de IL-2 se resumen en la Tabla 12. La proteína de fusión biespecífica de SEQ ID NOs: 90 y 87 induce un fuerte aumento dependiente de la dosis en la secreción de IL-2, hasta niveles más altos que en comparación con el anticuerpo de la unidad estructural de PD-L1, el anticuerpo de CD137 de referencia y la mezcla de anticuerpos de referencia de PD-L1 y CD137, así como disminuye el valor de CE₅₀ efectiva en relación con los anticuerpos de PD-L1 y CD137 usados solos o en combinación.

Tabla 12. Evaluación de la activación de linfocitos T utilizando PBMCs humanas

Ejemplo 20. Evaluación de la activación de linfocitos T dependiente de PD-L1 inducida por las proteínas de fusión

La coestimulación de linfocitos T dependiente de la diana PD-L1 por las proteínas de fusión se analizó adicionalmente usando un ensayo de activación de linfocitos T. Las proteínas de fusión se aplicaron con diferentes concentraciones a linfocitos T estimulados con anti-CD3, cocultivados con células Flp-In-CHO transfectadas con PD-L1 humano o transfectadas de forma simulada. Los niveles de secreción de IL-2 se midieron en los materiales sobrenadantes.

Se aislaron PBMCs de donantes voluntarios sanos a partir de capas leucocitarias como se ha descrito en el Ejemplo 11. Los linfocitos T se purificaron adicionalmente y se almacenaron como se ha descrito en el Ejemplo 12.

Para el ensayo, los linfocitos T se descongelaron y se dejaron reposar en medio de cultivo (RPMI 1640, Life Technologies) complementados con FCS al 10% y penicilina-estreptomicina al 1% (Life Technologies) durante la noche a 37°C en una atmósfera humidificada con un 5% de CO².

Se realizó el siguiente procedimiento por triplicado para cada condición experimental: las placas de cultivo de tejidos de fondo plano se recubrieron previamente con 0,25 μg/mL de anticuerpo anti-CD3 durante 2 horas a 37°C y luego se lavaron dos veces con PBS. Las células CHO, transfectadas con PD-L1 humano o transfectadas de forma simulada, se trataron durante 30 min con 30 μg/ml de mitomicina C (Sigma Aldrich) para bloquear la proliferación. Luego, las células tratadas con mitomicina se lavaron dos veces con PBS y se extendieron en placas con 1,0 x 107 células por pocillo en medio de cultivo, para permitir una adhesión durante la noche a 37°C en una atmósfera humidificada con un 5% de CO². Las células CHO se habían cultivado antes en condiciones estándar, se habían separado usando Accutase (PAA Laboratories) y se habían resuspendido en medio de cultivo.

Los días siguientes, se añadieron 8,33 x 103 linfocitos T por pocillo a las células CHO. Una serie de diluciones de una proteína de fusión ejemplar SEQ ID NOs: 90 y 87, la unidad estructural del anticuerpo de PD-L1 (SEQ ID NOs: 86 y 87), el anticuerpo de CD137 de referencia (SEQ ID NOs: 28 y 29) y una mezcla de anticuerpo de PD-L1 de referencia (^s E^q ID NOs: 26 y 27) y anticuerpo de referencia de CD137 (S^eQ ID NOs: 28 y 29), o un control de isotipo (SEQ ID NOs: 24 y 25), típicamente en un intervalo de 0,003 nM a 50 nM, se añadieron a los pocillos correspondientes. Las placas se cubrieron con un sellado permeable a los gases y se incubaron a 37°C en una atmósfera humidificada con un 5% de CO² durante 2 días.

Después de 2 días de cocultivo, se evaluaron los niveles de IL-2 en el material sobrenadante como se ha descrito en el Ejemplo 11.

Los datos ejemplares se muestran en la Figura 17. El cocultivo de linfocitos T de todos los tipos con células CHO transfectadas con PD-L1 humano en presencia de la proteína de fusión (SEQ ID NOs: 90 y 87 y SEQ ID NOs: 86 y 91) conducía a una fuerte secreción de IL-2 dependiente de la dosis, en comparación con el control de isotipo h IgG4 y es mucho más fuerte que en los anticuerpos de referencia en donde solo se observaba un ligero aumento de la secreción de IL-2 para el anticuerpo de CD137 de referencia o la mezcla del anticuerpo de CD137 de referencia y el anticuerpo de PD-L1 de referencia. Al cocultivar con células CHO transfectadas de forma simulada (PD-L1 negativo), solo el anticuerpo de CD137 de referencia y la mezcla del anticuerpo de CD137 de referencia y el anticuerpo de PD-L1 de referencia mostraban un ligero aumento dependiente de la dosis en la secreción de IL-2. Los resultados ilustran que la activación de los linfocitos T a través de las proteínas de fusión depende de PD-L1, frente al anticuerpo de CD137 de referencia (SEQ ID NOs: 28 y 29) que mostraba una coestimulación de los linfocitos T mediada por CD137, independientemente de la presencia o ausencia de las células diana.

Ejemplo 21. Farmacocinética de las proteínas de fusión en ratones

Un análisis de la farmacocinética de las proteínas de fusión representativas (SEQ ID NOs: 90 y 87, SEQ ID NOs: 86 y 91, SEQ ID NOs: 92 y 87, SEQ ID NOs: 86 y 93, SEQ ID NOs: 94 y 87 y SEQ ID NOs: 90 y 91) se realizó en ratones. A ratones macho CD-1 de aproximadamente 5 semanas de edad (3 ratones por punto de tiempo; Charles River Laboratories, Research Models and Services, Germany GmbH) se les inyectó en una vena de la cola una proteína de fusión con una dosis de 10 mg/kg. Los artículos del ensayo se administraron como un bolo utilizando un volumen de 5 ml/kg. Se obtuvieron muestras de plasma de los ratones en los puntos de tiempo de 5 min, 1 h, 4 h, 8 h, 24 h, 48 h, 4 d, 8 d, 14 d, 21 d y 28 d. Se recogió suficiente sangre completa, extraída bajo anestesia con isoflurano, para obtener al menos 100 μL de plasma con Li-heparina por animal y tiempo. Los niveles de fármaco se detectaron utilizando un ELISA de tipo sándwich que detectaba la estructura biespecífica completa a través de las dianas PD-L1 y CD137. Los datos se ajustaron utilizando un modelo de dos compartimentos utilizando el programa informático Prism GraphPad 5.

La Figura 18 muestra gráficos de la concentración en plasma a lo largo del tiempo para las proteínas de fusión SEQ ID NOs: 90 y 87, SEQ ID NOs: 86 y 91, SEQ ID NOs: 92 y 87, SEQ ID NOs: 86 y 93, SEQ ID NOs: 94 y 87 y SEQ ID NOs: 90 y 91, representados junto con los valores obtenidos para el anticuerpo de PD-L1 de la unidad estructural (SEQ ID NOs: 86 y 87) como referencia. La farmacocinética era similar en todos los casos. A partir de una concentración plasmática de alrededor de 200 μg/mL, los niveles plasmáticos caen a un nivel de alrededor de 50 μg/mL en 48 horas, y luego disminuyen aún más a un ritmo mucho más lento hasta un nivel de alrededor de 10 μg/mL al final del experimento después de 28 días. A estos datos se les aplicó un análisis no compartimental. Las semividas terminales se resumen en la Tabla 13.

Los datos demuestran que las proteínas de fusión tienen semividas terminales largas, similares a las de los anticuerpos, en ratones. Debido a que el ensayo empleado para determinar las concentraciones plasmáticas de las proteínas de fusión requiere una actividad retenida tanto frente a PD-L1 como frente a CD137, el resultado también demuestra que las moléculas biespecíficas permanecen intactas durante el transcurso de 28 días.

Tabla 13. Semividas terminales en ratones determinadas mediante un análisis no compartimental

Ejemplo 22. Farmacocinética de las proteínas de fusión en ratones

Se realizó un análisis de la farmacocinética de una proteína de fusión representativa SEQ ID NOs: 90 y 87 en ratones y se comparó con dos proteínas de fusión que se unen a CD137 y PD-L1 descritas previamente (SEQ ID NO: 147 y SEQ ID NO: 148). A ratones macho CD-1 de aproximadamente 5 semanas de edad (2 ratones por punto de tiempo; Charles River Laboratories, Research Models and Services, Germany GmbH) se les inyectó en una vena de la cola la molécula respectiva con una dosis de 2 mg/kg. Se obtuvieron muestras de plasma de los ratones en los puntos de tiempo de 5 min, 24 h, 168 h y 336 h. Se recogió suficiente sangre completa, extraída bajo anestesia con isoflurano, para obtener al menos 30-50 μL de plasma de Li-heparina por animal y tiempo.

A continuación, se analizaron los niveles de fármaco en plasma con ELISA. Se disolvió HuCD137-His (CD137 humano con un marcador de polihistidina C-terminal) en PBS (1 μg/mL) y se revistió durante la noche sobre placas de microtitulación a 4°C. La placa se lavó después de cada etapa de incubación con 80 μL de PBS complementado con Tween 20 al 0,05% (v/v) cinco veces. Las placas se bloquearon con PBS/BSNTween (PBS que contenía 2% de BSA (p/v) y 0,1% (v/v) de Tween 20) durante 1 h a temperatura ambiente y posteriormente se lavaron. Las muestras de plasma se diluyeron en PBS/BSNTween con una concentración de plasma del 20%, se añadieron a los pocillos y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Siguió otra etapa de lavado. Los agentes unidos en estudio se detectaron después de 1 h de incubación con una mezcla de 1 μg/mL de PD-L1 humano biotinilado y estreptavidina SULFOTAG (Mesoscale Discovery), cada uno diluido en PBS que contenía 2% de BSA (p/v) y 0,1% (v/v) de Tween 20.

Después de una etapa de lavado adicional, se añadieron 35 μL de tampón de lectura a cada pocilio y se leyó la señal electroquimioluminiscente (ECL) de cada pocillo utilizando un lector Mesoscale Discovery. Los datos se transfirieron a Excel para su análisis y cuantificación. Se preparó una curva de calibración con diluciones de proteína estándar.

La Figura 19 muestra gráficos de la concentración en plasma a lo largo del tiempo para SEQ ID NOs: 90 y 87, SEQ ID NO: 147 y SEQ ID NO: 148. SEQ ID NOs: 90 y 87 muestra un perfil farmacocinético favorable o una farmacocinética similar a la de un anticuerpo, mientras que SEQ ID NO: 147 y SEQ ID NO: 148 no lo hacen. Tal y como se describe en este documento, se puede considerar que se logra un perfil farmacocinético favorable o una farmacocinética similar a la de un anticuerpo si el % de cmáx era superior al 10% después de 336 h.

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Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Una proteína de fusión que es capaz de unirse tanto a CD137 como a PD-L1, en donde la proteína de fusión comprende dos subunidades, en donde la primera subunidad comprende una inmunoglobulina de longitud completa que es específica para PD-L1, y en donde la segunda subunidad comprende una muteína de lipocalina que es específico para CD137,

en donde la proteína de fusión comprende secuencias de aminoácidos que tienen al menos un 90% de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos mostradas en SEQ ID NOs: 90 y 87,

en donde la cadena pesada de la inmunoglobulina comprende el siguiente conjunto de secuencias CDRs: GFSLSNYD (HCDR1, SEQ ID NO: 60), IWTGGAT (HCDR2, SEQ ID NO: 61) y VRDSNYRYDEPFTY (HCDR3, SEQ ID NO: 62), y la cadena ligera de la inmunoglobulina comprende el siguiente conjunto de secuencias CDRs: QSIGTN (LCDR1, SEQ ID NO: 63), YAS (LCDR2) y QQSNSWPYT (LCDR3, SEQ ID NO: 64), y en donde la secuencia de aminoácidos de la muteína de lipocalina comprende el siguiente conjunto de residuos de aminoácidos mutados en comparación con la secuencia polipeptídica lineal de hNGAL madura como se muestra en SEQ ID NO: 2: Gln 28 ^ His; Leu 36 ^ Gln; Ala 40 ^ Ile; Ile 41 ^ Arg; Gln 49 ^ Ile; Tyr 52 ^ Met; Asn 65 ^ Asp; Ser 68 ^ Met; Leu 70 ^ Lys; Arg 72 ^ Asp; Lys 73 ^ Asp; Asp 77 ^ Met; Trp 79 ^ Asp; Arg 81 ^ Trp; Cys 87 ^ Ser; Asn 96 ^ Lys; Tyr 100 ^ Phe; Leu 103 ^ His; Tyr 106 ^ Ser; Lys 125 ^ Phe; Ser 127 ^ Phe; Tyr 132 ^ Glu; y Lys 134 ^ Tyr.

2. La proteína de fusión según la reivindicación 1, en la que la secuencia de aminoácidos de la muteína de lipocalina tiene al menos un 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 42.

3. La proteína de fusión según la reivindicación 1 o 2, en la que la secuencia de aminoácidos de la muteína de lipocalina comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 42.

4. La proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 1 -3, en la que la segunda subunidad está unida en el extremo N-terminal a través de un enlazador con el extremo C-terminal de cada región constante de cadena pesada (CH) de la primera subunidad, en donde el enlazador es preferentemente el enlazador de SEQ ID NO: 13.

5. La proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que la inmunoglobulina comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos que se muestran en SEQ ID NOs: 77 y 82.

6. La proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en la que la inmunoglobulina comprende una cadena pesada y una cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos que se muestran en SEQ ID NOs: 86 y 87.

7. La proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en la que la inmunoglobulina tiene una estructura principal de IgG4, en donde la estructura principal de IgG4 tiene preferiblemente una o más de las siguientes mutaciones: S228P, N297A, F234A, L235A, M428L, N434S, M252Y, S254^t y T256E, según el índice EU de Kabat.

8. La proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 o 7, en donde la proteína de fusión comprende secuencias de aminoácidos que tienen al menos un 92%, al menos un 95%, al menos un 97%, al menos un 98% o una identidad de secuencia superior con las secuencias de aminoácidos mostradas en SEQ ID NOs: 90 y 87.

9. La proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 1 -8, en donde la proteína de fusión comprende las secuencias de aminoácidos que se muestran en SEQ ID NOs: 90 y 87.

10. Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde preferiblemente

(i) la molécula de ácido nucleico está ligada funcionalmente a una secuencia reguladora para permitir la expresión de dicha molécula de ácido nucleico; o

(ii) la molécula de ácido nucleico está comprendida en un vector o en un vector fagémido.

11. Una célula hospedadora que contiene una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 10.

12. Un método para producir la proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde la proteína de fusión se produce partiendo del ácido nucleico que codifica la proteína de fusión, en donde la proteína de fusión se produce preferentemente en un organismo hospedador bacteriano o eucariota y se aísla a partir de ese organismo hospedador o de su cultivo.

13. Una composición farmacéutica que comprende una proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 1-9.

14. Una proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 1 -9, para uso en terapia.

15. La proteína de fusión para el uso según la reivindicación 14, en donde el uso es en el tratamiento del cáncer.