KR20210040103A

KR20210040103A - Cd137 및 pd-l1에 특이적인 신규한 융합 단백질

Info

Publication number: KR20210040103A
Application number: KR1020217006003A
Authority: KR
Inventors: 마리나 파블리도; 루시아 파타리니; 알릭스 슐러-다히렐; 크리스틴 로테; 쉐인 올윌; 라시다 벨 아이바; 말론 히너; 자넷 페퍼
Original assignee: 피어이스 파마슈티컬즈 게엠베하; 르 라보레또레 쎄르비에르
Priority date: 2018-07-31
Filing date: 2019-07-31
Publication date: 2021-04-12
Also published as: DK3830120T5; HRP20230590T2; EP3830120B1; RS64343B1; SG11202100989UA; LT3830120T; TW202019967A; HUE062320T2; AU2019315703A1; WO2020025659A1; MX2021000401A; ZA202100125B; JP2021533203A; CA3100119A1; DK3830120T3; RS64343B9; JP7482488B2; FI3830120T3; HRP20230590T1; EP4249064A3

Abstract

본 개시물은 CD137 및 PD-L1 둘 다에 특이적인 융합 단백질을 제공하며, 융합 단백질은 PD-L1-표적-의존적 방식으로 림프구 활성화를 보조-자극하는데 사용될 수 있다. 그러한 융합 단백질은 많은 약학적 적용, 예를 들어 다양한 종양과 같은 인간 질환의 치료 또는 예방을 위한 항암제 및/또는 면역조절제로서 사용될 수 있다. 본 개시물은 또한 본 명세서에서 기술된 융합 단백질 그리고 그러한 융합 단백질을 포함하는 조성물의 제조 방법에 관한 것이다. 본 개시물은 또한 그러한 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자 및 그러한 융합 단백질 및 핵산 분자의 생산 방법에 관한 것이다. 또한, 본 출원은 융합 단백질 그리고 그러한 융합 단백질을 포함하는 조성물의 치료 및/또는 진단적 용도를 개시한다.

Description

CD137 및 PD-L1에 특이적인 신규한 융합 단백질

Programmed death-ligand 1 또는 PD-L1(cluster of differentiation 274 또는 CD274 및 B7 homolog 1 또는 B7-H1라고도 알려짐)는 항원 제시의 보조-자극/보조-억제 분자의 B7 패밀리에 속하는 단일 통과형 I 막 단백질이다. PD-L1의 세포외 부분은 2개의 도메인, N-말단 IgV-형 도메인 및 IgC-형 도메인을 포함한다. PD-L1은 임의의 자명한 신호 전달 모티프가 없는 짧은 세포질성 도메인을 가지고 있으며, 이는 수용체로서 PD-L1에 의한 내인성 신호전달이 없다는 초기 믿음으로 이어졌다. 그러나, 최근 데이터는 PD-L1의 세포질성 도메인이 인터페론(IFN) 전달을 억제하고 IFN 세포독성으로부터 암 세포를 보호할 수 있는 비-고전적 보존된 신호 전달 모티프를 포함하고 있음을 보여준다(Gato-Canas et al., Cell Rep, 2017).

PD-L1은 임신 중 면역계의 억제, 만성 감염, 조직 동종이식, 자가면역질환 및 암에 중요한 역할을 담당한다. PD-L1은 B 세포, T 세포, 대식세포, 골수성 수지상세포, 비만세포, 상피 및 혈관 내피 세포를 포함한 다양한 세포 유형에서 발현된다. 또한, 흑색종, 폐암, 방광암, 대장암 및 유방암을 포함하나 이에 제한되지 않는 여러 암 유형에서 발현된다. 높은 PD-L1 발현 수준은 종양 침윤 T 세포의 고갈 및 무력감, 면역-억제 사이토카인의 분비 및 세포독성 T 세포에 의한 라이시스로부터의 보호를 매개하여 증가된 종양 공격성과 연관된다.

PD-L1은 활성화 T 세포 뿐만 아니라 B 세포 및 단핵세포를 포함한 면역계의 다른 세포에서도 주로 발현되는 주요 면역 체크포인트 억제성 수용체인 programmed death-ligand 1(PD-L1)의 리간드이다. PD-1은 IgV-유사 세포외 도메인, 막관통 도메인 및 ITIM(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif)과 ITSM(immunoreceptor tyrosine-based switch motif)를 갖는 세포질성 꼬리를 포함하는 면역글로불린 패밀리의 구성원이다. PD-L1에 의한 PD-1의 결합은 src 호몰로그 2 도메인-함유 티로신 포스파타아제 1 및 2(src homology 2 domain-containing tyrosine phosphatases 1 및 2(SHP 1 및 2))를 PD-1의 세포내 스위치 모티프에 동원하고 CBL 패밀리의 E3 유비퀴틴 리가아제의 발현을 유도한다. 이들 유비퀴틴 리가아제는 이어서 세포 표면으로부터 TCR의 제거를 유도하는 주요 TCR 신호 전달 매개체를 유비퀴틴화하고 비활성시킨다(Karwacz et al., EMBO Mol Med, 2011). SHP 1 및 SHP 2 포스파타아제는 ZAP70 및 PI3K 인산화를 종료함으로써 직접적으로 TCR 신호전달을 억제한다. 게다가, PD-L1이 결합된 PD-1은 CK2 및 시클린-의존성 키나아제(cyclin-dependent kinases(CDKs))의 발현 및 활성에 영향을 미침으로써 TCR 신호전달 경로를 억제할 수 있다(Arasanz et al., Oncotarget, 2017). 또한, PD-1 결합은 효과기 기능을 위한 에너지를 생산하는데 필요한 증가된 해당과정부터 장기 생존 세포와 관련된 지방산 산화까지 T 세포 대사의 리프로그래밍을 유도하는 것으로 나타났다. 이것은 또한 만성 감염 및 암 환자에서 높은 PD-1 발현 세포의 생존 및 지속성을 설명할 수 있다(Patsoukis et al., Nat Commun, 2015).

항-PD-1 또는 항-PD-L1 표적치료제에 의해 PD-1/PD-L1 상호작용을 차단함으로써 면역 체크포인트 기능을 역전시키고 T 세포 반응에 대한 제동을 해제할 수 있다. 현재 세 가지 PD-L1 항체, 아테졸리주맙(TECENTRIQ, MPDL3280A, RG7466), 아벨루맙(BAVENCIO, MSB0010718C) 및 두르발루맙(IMFINZI, MEDI4736)이 암 치료용으로 승인되었다. 이들 항체를 사용한 여러 성공적인 임상 시험은 방광암, 피부암 및 폐암에서 높은 객관적 반응율, 반응 지속성 또는 개선된 생존율을 보여주었다(Xu-Monette et al., Front Immunol, 2017).

Cluster of differentiation 137 또는 CD137(4-1BB 또는 TNFRS9로도 알려짐)은 보조-자극 면역 수용체 및 종양 괴사 인자 수용체(tumor necrosis factor receptor(TNFR)) 슈퍼-패밀리의 구성원이다. 주로 활성화 CD4+ 및 CD8+ T 세포, 활성화 B 세포 및 자연 살해(NK) 세포에서 발현되지만 휴지기 단핵세포 및 수지상세포(Li and Liu, Clin Pharmacol, 2013) 또는 내피세포(Snell et al., Immunol Rev, 2011)에서도 발견될 수 있다. CD137은 면역 반응의 조절에 중요한 역할을 담당하므로 암 면역치료를 위한 표적이다. CD137 리간드(CD137L)는 CD137의 유일한 알려진 천연 리간드이며, 활성화 B 세포, 단핵구 및 비장의 수지상세포와 같은 여러 유형의 항원 제시 세포에서 구성적으로 발현되며, T 림프구 상에 유도될 수 있다.

CD137L은 막-결합 형태 및 가용성 변이체로서 존재하는 삼합체 단백질이다. 그러나, 예를 들어 CD137-발현 림프구에서 CD137을 활성화하는 가용성 CD137L의 능력은 제한적이며, 효과를 이끌어내기 위해서는 큰 농도가 필요하다(Wyzgol et al., J Immunol, 2009). CD137의 자연스런 활성화 방식은 CD137-양성 세포와 CD137L-양성 세포의 결합을 통해서이다. 그 이후에 CD137 활성화는 반대 세포에서 CD137L을 통한 클러스터링에 의해 유도되어, TRAF1, 2 및 3을 통한 신호전달(Yao et al., Nat Rev Drug Discov, 2013, Snell et al., Immunol Rev, 2011) 및 CD137-양성 T 세포에서 추가로 수반되는 다운스트림 효과를 이끄는 것으로 생각된다. 그들의 각각의 동족 표적의 인식에 의해 활성화된 T 세포의 경우, CD137의 보조자극에 의해 유도되는 효과는 더욱 향상된 활성화, 향상된 생존 및 증식, 전-염증성 사이토카인의 생산 및 개선된 사멸 능력이다.

암 세포 제거를 위한 CD137 보조자극의 이점은 여러 인 비보 모델에서 입증되었다. 종양에서 CD137L의 강제 발현은 예를 들어 종양 거부를 유도한다(Melero et al., Eur J Immunol, 1998). 마찬가지로, 종양에서 항-CD137 scFv의 강제 발현은 종양의 CD4⁺ T-세포 및 NK-세포 의존적 제거를 유도한다(Yang et al., Cancer Res, 2007, Zhang et al., Mol Cancer Ther, 2006, Ye et al., Nat Med, 2002). 전신 투여된 항-CD137 항체는 또한 종양 성장의 지연을 유도하는 것으로 입증되었다(Martinet et al., Gene Ther, 2002).

CD137은 인간 종양에서 자연적으로 발생하는 종양-반응성 T 세포에 대한 우수한 마커이며(Ye et al., Clin Cancer Res, 2014), 항-CD137 항체는 입양 T 세포 요법에 적용하기 위한 CD8⁺ 흑색종 종양-침윤 림프구의 확장 및 활성을 개선하기 위해 사용할 수 있음이 밝혀졌다(Chacon et al., PLoS One, 2013).

CD137 보조자극의 잠재적 치료 이점에 대한 전임상 입증은 BMS-663513(미국 특허 제7,288,638호에 기술됨) 및 PF-05082566(Fisher et al., Cancer Immunol Immunother, 2012)를 포함하여 CD137을 표적으로 하는 치료 항체의 개발을 촉진하였다.

본 개시물은 무엇보다도 CD137에 대한 결합 특이성 및 PD-L1에 대한 결합 특이성의 특징을 갖는 하나 이상의 융합 단백질을 통해 CD137 및 PD-L1을 동시에 결합시키는 신규 접근법을 제공한다.

1. GATO-CANAS, M., ZUAZO, M., ARASANZ, H., IBANEZ-VEA, M., LORENZO, L., FERNANDEZ-HINOJAL, G., VERA, R., SMERDOU, C., MARTISOVA, E., AROZARENA, I., WELLBROCK, C., LLOPIZ, D., RUIZ, M., SAROBE, P., BRECKPOT, K., KOCHAN, G. & ESCORS, D. 2017. PDL1 Signals through Conserved Sequence Motifs to Overcome Interferon-Mediated Cytotoxicity. Cell Rep, 20, 1818-1829. 2. KARWACZ, K., BRICOGNE, C., MACDONALD, D., ARCE, F., BENNETT, C. L., COLLINS, M. & ESCORS, D. 2011. PD-L1 co-stimulation contributes to ligand-induced T cell receptor down-modulation on CD8+ T cells. EMBO Mol Med, 3, 581-92. 3. ARASANZ, H., GATO-CANAS, M., ZUAZO, M., IBANEZ-VEA, M., BRECKPOT, K., KOCHAN, G. & ESCORS, D. 2017. PD1 signal transduction pathways in T cells. Oncotarget, 8, 51936-51945. 4. PATSOUKIS, N., BARDHAN, K., CHATTERJEE, P., SARI, D., LIU, B., BELL, L. N., KAROLY, E. D., FREEMAN, G. J., PETKOVA, V., SETH, P., LI, L. & BOUSSIOTIS, V. A. 2015. PD-1 alters T-cell metabolic reprogramming by inhibiting glycolysis and promoting lipolysis and fatty acid oxidation. Nat Commun, 6, 6692. 5. XU-MONETTE, Z. Y., ZHANG, M., LI, J. & YOUNG, K. H. 2017. PD-1/PD-L1 Blockade: Have We Found the Key to Unleash the Antitumor Immune Response? Front Immunol, 8, 1597. 6. LI, S. Y. & LIU, Y. 2013. Immunotherapy of melanoma with the immune costimulatory monoclonal antibodies targeting CD137. Clin Pharmacol, 5, 47-53. 7. SNELL, L. M., LIN, G. H., MCPHERSON, A. J., MORAES, T. J. & WATTS, T. H. 2011. T-cell intrinsic effects of GITR and 4-1BB during viral infection and cancer immunotherapy. Immunol Rev, 244, 197-217. 8. WYZGOL, A., MULLER, N., FICK, A., MUNKEL, S., GRIGOLEIT, G. U., PFIZENMAIER, K. & WAJANT, H. 2009. Trimer stabilization, oligomerization, and antibody-mediated cell surface immobilization improve the activity of soluble trimers of CD27L, CD40L, 41BBL, and glucocorticoid-induced TNF receptor ligand. J Immunol, 183, 1851-61. 9. YAO, S., ZHU, Y. & CHEN, L. 2013. Advances in targeting cell surface signalling molecules for immune modulation. Nat Rev Drug Discov, 12, 130-46. 10. MELERO, I., BACH, N., HELLSTROM, K. E., ARUFFO, A., MITTLER, R. S. & CHEN, L. 1998. Amplification of tumor immunity by gene transfer of the co-stimulatory 4-1BB ligand: synergy with the CD28 co-stimulatory pathway. Eur J Immunol, 28, 1116-21. 11. YANG, Y., YANG, S., YE, Z., JAFFAR, J., ZHOU, Y., CUTTER, E., LIEBER, A., HELLSTROM, I. & HELLSTROM, K. E. 2007. Tumor cells expressing anti-CD137 scFv induce a tumor-destructive environment. Cancer Res, 67, 2339-44. 12. ZHANG, H., KNUTSON, K. L., HELLSTROM, K. E., DISIS, M. L. & HELLSTROM, I. 2006. Antitumor efficacy of CD137 ligation is maximized by the use of a CD137 single-chain Fv-expressing whole-cell tumor vaccine compared with CD137-specific monoclonal antibody infusion. Mol Cancer Ther, 5, 149-55. 13. YE, Z., HELLSTROM, I., HAYDEN-LEDBETTER, M., DAHLIN, A., LEDBETTER, J. A. & HELLSTROM, K. E. 2002. Gene therapy for cancer using single-chain Fv fragments specific for 4-1BB. Nat Med, 8, 343-8. 14. MARTINET, O., DIVINO, C. M., ZANG, Y., GAN, Y., MANDELI, J., THUNG, S., PAN, P. Y. & CHEN, S. H. 2002. T cell activation with systemic agonistic antibody versus local 4-1BB ligand gene delivery combined with interleukin-12 eradicate liver metastases of breast cancer. Gene Ther, 9, 786-92. 15. YE, Q., SONG, D. G., POUSSIN, M., YAMAMOTO, T., BEST, A., LI, C., COUKOS, G. & POWELL, D. J., JR. 2014. CD137 accurately identifies and enriches for naturally occurring tumor-reactive T cells in tumor. Clin Cancer Res, 20, 44-55. 16. CHACON, J. A., WU, R. C., SUKHUMALCHANDRA, P., MOLLDREM, J. J., SARNAIK, A., PILON-THOMAS, S., WEBER, J., HWU, P. & RADVANYI, L. 2013. Co-stimulation through 4-1BB/CD137 improves the expansion and function of CD8(+) melanoma tumor-infiltrating lymphocytes for adoptive T-cell therapy. PLoS One, 8, e60031. 17. FISHER, T. S., KAMPERSCHROER, C., OLIPHANT, T., LOVE, V. A., LIRA, P. D., DOYONNAS, R., BERGQVIST, S., BAXI, S. M., ROHNER, A., SHEN, A. C., HUANG, C., SOKOLOWSKI, S. A. & SHARP, L. L. 2012. Targeting of 4-1BB by monoclonal antibody PF-05082566 enhances T-cell function and promotes anti-tumor activity. Cancer Immunol Immunother, 61, 1721-33. 18. SKERRA, A. 2000. Lipocalins as a scaffold. Biochim Biophys Acta, 1482, 337-50. 19. FLOWER, D. R., NORTH, A. C. & SANSOM, C. E. 2000. The lipocalin protein family: structural and sequence overview. Biochim Biophys Acta, 1482, 9-24. 20. FLOWER, D. R. 1996. The lipocalin protein family: structure and function. Biochem J, 318( Pt 1), 1-14. 21. ALTSCHUL, S. F., MADDEN, T. L., SCHAFFER, A. A., ZHANG, J., ZHANG, Z., MILLER, W. & LIPMAN, D. J. 1997. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res, 25, 3389-402. 22. ALTSCHUL, S. F., GISH, W., MILLER, W., MYERS, E. W. & LIPMAN, D. J. 1990. Basic local alignment search tool. J Mol Biol, 215, 403-10. 23. SMITH, T. F. & WATERMAN, M. S. 1981. Identification of common molecular subsequences. J Mol Biol, 147, 195-7. 24. WARD, E. S., GUSSOW, D., GRIFFITHS, A. D., JONES, P. T. & WINTER, G. 1989. Binding activities of a repertoire of single immunoglobulin variable domains secreted from Escherichia coli. Nature, 341, 544-6. 25. HOLLIGER, P., PROSPERO, T. & WINTER, G. 1993. "Diabodies": small bivalent and bispecific antibody fragments. Proc Natl Acad Sci U S A, 90, 6444-8. 26. JOHNSON, G. & WU, T. T. 2000. Kabat database and its applications: 30 years after the first variability plot. Nucleic Acids Res, 28, 214-8. 27. EHRENMANN, F., KAAS, Q. & LEFRANC, M. P. 2010. IMGT/3Dstructure-DB and IMGT/DomainGapAlign: a database and a tool for immunoglobulins or antibodies, T cell receptors, MHC, IgSF and MhcSF. Nucleic Acids Res, 38, D301-7. 28. BULLIARD, Y., JOLICOEUR, R., ZHANG, J., DRANOFF, G., WILSON, N. S. & BROGDON, J. L. 2014. OX40 engagement depletes intratumoral Tregs via activating FcgammaRs, leading to antitumor efficacy. Immunol Cell Biol, 92, 475-80. 29. BULLIARD, Y., JOLICOEUR, R., WINDMAN, M., RUE, S. M., ETTENBERG, S., KNEE, D. A., WILSON, N. S., DRANOFF, G. & BROGDON, J. L. 2013. Activating Fc gamma receptors contribute to the antitumor activities of immunoregulatory receptor-targeting antibodies. J Exp Med, 210, 1685-93. 30. SILVA, J. P., VETTERLEIN, O., JOSE, J., PETERS, S. & KIRBY, H. 2015. The S228P mutation prevents in vivo and in vitro IgG4 Fab-arm exchange as demonstrated using a combination of novel quantitative immunoassays and physiological matrix preparation. J Biol Chem, 290, 5462-9. 31. GLAESNER, W., VICK, A. M., MILLICAN, R., ELLIS, B., TSCHANG, S. H., TIAN, Y., BOKVIST, K., BRENNER, M., KOESTER, A., PORKSEN, N., ETGEN, G. & BUMOL, T. 2010. Engineering and characterization of the long-acting glucagon-like peptide-1 analogue LY2189265, an Fc fusion protein. Diabetes Metab Res Rev, 26, 287-96. 32. DALL'ACQUA, W. F., KIENER, P. A. & WU, H. 2006. Properties of human IgG1s engineered for enhanced binding to the neonatal Fc receptor(FcRn). J Biol Chem, 281, 23514-24. 33. ZALEVSKY, J., CHAMBERLAIN, A. K., HORTON, H. M., KARKI, S., LEUNG, I. W., SPROULE, T. J., LAZAR, G. A., ROOPENIAN, D. C. & DESJARLAIS, J. R. 2010. Enhanced antibody half-life improves in vivo activity. Nat Biotechnol, 28, 157-9. 34. SHIELDS, R. L., NAMENUK, A. K., HONG, K., MENG, Y. G., RAE, J., BRIGGS, J., XIE, D., LAI, J., STADLEN, A., LI, B., FOX, J. A. & PRESTA, L. G. 2001. High resolution mapping of the binding site on human IgG1 for Fc gamma RI, Fc gamma RII, Fc gamma RIII, and FcRn and design of IgG1 variants with improved binding to the Fc gamma R. J Biol Chem, 276, 6591-604. 35. ALTSHULER, E. P., SEREBRYANAYA, D. V. & KATRUKHA, A. G. 2010. Generation of recombinant antibodies and means for increasing their affinity. Biochemistry(Mosc), 75, 1584-605. 36. HARLOW, E. & LANE, D. 1999. Using antibodies : a laboratory manual, Cold Spring Harbor, N.Y., Cold Spring Harbor Laboratory Press. 37. HARLOW, E. & LANE, D. 1988. Antibodies : a laboratory manual, Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor Laboratory. 38. LI, J., SAI, T., BERGER, M., CHAO, Q., DAVIDSON, D., DESHMUKH, G., DROZDOWSKI, B., EBEL, W., HARLEY, S., HENRY, M., JACOB, S., KLINE, B., LAZO, E., ROTELLA, F., ROUTHIER, E., RUDOLPH, K., SAGE, J., SIMON, P., YAO, J., ZHOU, Y., KAVURU, M., BONFIELD, T., THOMASSEN, M. J., SASS, P. M., NICOLAIDES, N. C. & GRASSO, L. 2006. Human antibodies for immunotherapy development generated via a human B cell hybridoma technology. Proc Natl Acad Sci U S A, 103, 3557-62. 39. KOZBOR, D. & RODER, J. C. 1983. The production of monoclonal antibodies from human lymphocytes. Immunol Today, 4, 72-9. 40. COLE, S. P., CAMPLING, B. G., LOUWMAN, I. H., KOZBOR, D. & RODER, J. C. 1984. A strategy for the production of human monoclonal antibodies reactive with lung tumor cell lines. Cancer Res, 44, 2750-3. 41. HOLLIGER, P. & HUDSON, P. J. 2005. Engineered antibody fragments and the rise of single domains. Nat Biotechnol, 23, 1126-36. 42. PERVAIZ, S. & BREW, K. 1987. Homology and structure-function correlations between alpha 1-acid glycoprotein and serum retinol-binding protein and its relatives. FASEB J, 1, 209-14. 43. SAMBROOK, J. & RUSSELL, D. W. 2001. Molecular cloning : a laboratory manual, Cold Spring Harbor, N.Y., Cold Spring Harbor Laboratory Press. 44. FLOWER, D. R. 2000. Beyond the superfamily: the lipocalin receptors. Biochim Biophys Acta, 1482, 327-36. 45. BREUSTEDT, D. A., KORNDORFER, I. P., REDL, B. & SKERRA, A. 2005. The 1.8-A crystal structure of human tear lipocalin reveals an extended branched cavity with capacity for multiple ligands. J Biol Chem, 280, 484-93. 46. SCHMIDT, T. G., KOEPKE, J., FRANK, R. & SKERRA, A. 1996. Molecular interaction between the Strep-tag affinity peptide and its cognate target, streptavidin. J Mol Biol, 255, 753-66. 47. VAJO, Z. & DUCKWORTH, W. C. 2000. Genetically engineered insulin analogs: diabetes in the new millenium. Pharmacol Rev, 52, 1-9. 48. FUERTGES, F. & ABUCHOWSKI, A. 1990. The clinical efficacy of poly(ethylene glycol)-modified proteins. Journal of Controlled Release, 11, 139-148. 49. DENNIS, M. S., ZHANG, M., MENG, Y. G., KADKHODAYAN, M., KIRCHHOFER, D., COMBS, D. & DAMICO, L. A. 2002. Albumin binding as a general strategy for improving the pharmacokinetics of proteins. J Biol Chem, 277, 35035-43. 50. KONIG, T. & SKERRA, A. 1998. Use of an albumin-binding domain for the selective immobilisation of recombinant capture antibody fragments on ELISA plates. J Immunol Methods, 218, 73-83. 51. OSBORN, B. L., OLSEN, H. S., NARDELLI, B., MURRAY, J. H., ZHOU, J. X., GARCIA, A., MOODY, G., ZARITSKAYA, L. S. & SUNG, C. 2002. Pharmacokinetic and pharmacodynamic studies of a human serum albumin-interferon-alpha fusion protein in cynomolgus monkeys. J Pharmacol Exp Ther, 303, 540-8. 52. LOWMAN, H. B. 1997. Bacteriophage display and discovery of peptide leads for drug development. Annu Rev Biophys Biomol Struct, 26, 401-24. 53. RODI, D. J. & MAKOWSKI, L. 1999. Phage-display technology--finding a needle in a vast molecular haystack. Curr Opin Biotechnol, 10, 87-93. 54. VENTURI, M., SEIFERT, C. & HUNTE, C. 2002. High level production of functional antibody Fab fragments in an oxidizing bacterial cytoplasm. J Mol Biol, 315, 1-8. 55. BRUCKDORFER, T., MARDER, O. & ALBERICIO, F. 2004. From production of peptides in milligram amounts for research to multi-tons quantities for drugs of the future. Curr Pharm Biotechnol, 5, 29-43.

하기 목록은 본 명세서 전반에 걸쳐 사용된 용어, 문구 및 약어를 정의한다. 본 명세서에서 나열 및 정의된 모든 용어는 모든 문법 형식을 포함하는 것으로 의도된다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 달리 명시되지 않는 한, "CD137"은 인간 CD137(huCD137)을 의미한다. 인간 CD137은 UniProt Q07011에 의해 정의된 전장 단백질, 이의 단편, 또는 이의 변이체를 의미한다. CD137은 또한 4-1BB, 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리 멤버 9(tumor necrosis factor receptor superfamily member 9(TNFRSF9)) 및 ILA(induced by lymphocyte activation)로도 알려져 있다. 일부 특정 구체예에서, 비-인간 종의 CD137, 예를 들어, 시아노몰거스(cynomolgus)의 CD137 및 마우스 CD137이 사용된다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 달리 명시되지 않는 한, "programmed death-ligand 1" 또는 "PD-L1"은 인간 PD-L1(huPD-L1)을 의미한다. 인간 PD-L1은 UniProt Q9NZQ7에 의해 정의된 전장 단백질, 이의 단편, 또는 이의 변이체를 의미한다. 인간 PD-L1은 CD274 유전자에 의해 인코딩된다. PD-L1은 cluster of differentiation　274(CD274) 또는 B7 homolog 1　(B7-H1)로도 알려져 있다. 일부 특정 구체예에서, 비-인간 종의 PD-L1, 예를 들어, 시아노몰거스 PD-L1 및 마우스 PD-L1이 사용된다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, "결합 친화성"은 선택된 표적과 결합하여 복합체를 형성하는 본 개시물의 생체분자(예를 들어, 폴리펩타이드 또는 단백질)(예를 들어, 리포칼린 뮤테인, 항체, 융합 단백질, 또는 임의의 다른 펩타이드 또는 단백질)의 능력을 기술한다. 결합 친화성은 형광 적정, 직접 및 경쟁적 ELISA를 포함하는 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)-기반 분석, 등온 적정 열량측정법(isothermal titration calorimetry, ITC)와 같은 열량측정법 및 표면 플라즈몬 공명(SPR)을 포함하나 이에 제한되지 않는 당업자에게 공지된 여러 방법에 의해 측정된다. 이들 방법은 당업계에 잘 확립되어 있으며, 그러한 방법의 일부 예시들이 추가로 본 명세서에 기술된다. 따라서, 결합 친화성은 이러한 방법들을 이용하여 측정된 해리 상수(K_D), 절반의 최대 유효 농도(EC₅₀) 또는 절반의 최대 억제 농도(IC₅₀)의 값으로 보고된다. K_D, EC₅₀ 또는 IC₅₀값이 더 낮을수록 더 나은(더 높은) 결합 능력(친화성)을 반영한다. 따라서, 선택된 표적에 대한 두 생체분자의 결합 친화성이 측정 및 비교될 수 있다. 선택된 표적에 대한 두 생체분자의 결합 친화성을 비교하는 경우, 용어 "거의 동일", "실질적으로 동일" 또는 "실질적으로 유사한"은 한 생체분자가 결합 친화성 측정의 실험적 다양성 내에서 다른 분자와 동일하거나 또는 유사한 K_D, EC₅₀ 또는 IC₅₀값으로 보고된 결합 친화성을 가짐을 의미한다. 결합 친화성 측정의 실험적 다양성은 사용된 특정 방법에 따라 다르며 당업자에게 공지되어 있다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "실질적으로"는 또한 관심의 특징 또는 특성의 전체 또는 거의 전체 범위 또는 정도를 나타내는 질적 상태를 지칭할 수 있다. 생물학 분야의 통상의 기술자는 생물학적 및 화학적 현상은 그런 경우가 있다고는 해도 완성하거나 및/또는 완성에 이르거나 또는 절대적인 결과를 달성하거나 회피하는 경우가 거의 없음을 이해할 것이다. 따라서, 용어 "실질적으로"는 본 명세서에서 많은 생물학적 및 화학적 현상에서 내재된 완전성의 잠재적 부족을 표현하기 위해 사용된다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "검출하다", "검출", "검출가능한" 또는 "검출하는"은 정량적 및 정성적 수준뿐만 아니라 이들의 조합으로 이해된다. 따라서, 그것은 본 개시물의 생체분자에 대해 수행된 정량적, 반-정량적 및 정성적 측정을 포함한다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, "검출가능한 친화성"은 일반적으로 K_D, EC₅₀ 또는 IC₅₀값으로 보고되는 생체분자 및 이의 표적 간의 결합 능력이 최대 약 10^-5 M 이하임을 의미한다. K_D, EC₅₀ 또는 IC₅₀값으로 보고되는 10^-5 M를 초과하는 결합 친화성은 일반적으로 ELISA 및 SPR과 같은 통상의 방법으로 더 이상 측정가능하지 않으므로 별로 중요하지 않다.

본 개시물의 생체분자 및 이의 표적 간의 복합체 형성은 각 표적의 농도, 경쟁자의 존재, pH 및 버퍼 시스템의 이온력, 결합 친화성의 측정에 사용된 실험 방법(예를 들어, 형광 적정, 경쟁적 ELISA(경쟁 ELISA로도 불림) 및 표면 플라즈몬 공명) 및 심지어 실험 데이터의 평가에 사용된 수학적 알고리즘과 같은 많은 상이한 인자들에 의해 영향을 받는다고 언급되어 있다. 따라서, K_D, EC₅₀ 또는 IC₅₀ 값으로 보고된 결합 친화성은 특정 실험 범위 내에서 방법 및 실험 설정에 따라 다양할 수 있음이 당업자에게 명백하다. 이는 측정된 K_D, EC₅₀ 또는 IC₅₀ 값에서의 약간의 편차 또는 예를 들어, 그러한 값들이 ELISA(직접 또는 경쟁 ELISA를 포함하여), SPR 또는 다른 방법에 의해 측정되는지에 따라 허용 오차 범위가 있을 수 있음을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, "특이적인", "특이 결합", "특이적으로 결합하다" 또는 "결합 특이성"은 원하는 표적(예를 들어, CD137 및 PD-L1) 및 하나 이상의 레퍼런스 표적(예를 들어, 호중구 젤라티네이즈-연관 리포칼린(neutrophil gelatinase-associated lipocalin)에 대한 세포성 수용체) 사이를 식별하는 생체분자의 능력에 관한 것이다. 그러한 특이성은 절대적인 것이 아니라 상대적인 특성이며, 예를 들어, SPR, 웨스턴 블랏, ELISA, 형광 활성화 세포 소팅(fluorescence activated cell sorting, FACS), 방사면역분석(radioimmunoassay, RIA), 전기화학발광(ECL), 면역방사계측 분석(immunoradiometric assay, IRMA), 면역조직화학(ImmunoHistoChemistry, IHC) 및 펩타이드 스캔에 따라 측정될 수 있는 것으로 이해된다.

CD137 및 PD-L1에 결합하는 본 개시물의 융합 단백질의 맥락에서 본 명세서에서 사용될 때, 용어 "특이적인", "특이 결합", "특이적으로 결합하다" 또는 "결합 특이성"은 본 명세서에서 기술된 바와 같이 융합 단백질이 CD137 및 PD-L1에 결합하거나, 반응하거나 또는 이들에게 안내되지만, 본질적으로 다른 단백질과는 결합하지 않는다는 것을 의미한다. 용어 "다른 단백질"은 CD137 또는 PD-L1이 아닌 임의의 단백질 또는 CD137 또는 PD-L1과 밀접하게 연관되거나 이들에 상동인 단백질을 포함한다. 그러나, 인간 이외의 종 유래의 CD137 또는 PD-L1 및 CD137 또는 PD-L1의 단편 및/또는 변이체는 용어 "다른 단백질"에서 제외되지는 않는다. 용어 "본질적으로 결합하지 않는다"는 본 개시물의 융합 단백질이 CD137 및/또는 PD-L1 보다 낮은 결합 친화성으로 다른 단백질과 결합하며, 즉, 30% 미만, 바람직하게는 20%, 보다 바람직하게는 10%, 특히 바람직하게는 9, 8, 7, 6 또는 5% 미만의 교차-반응성을 보여줌을 의미한다. 융합 단백질이 상기 본 명세서에서 정의된 바와 같이 특이적으로 반응하는지는 특히 본 개시물의 융합 단백질의 CD137 및/또는 PD-L1과의 반응 및 상기 융합 단백질과 다른 단백질(들)의 반응을 비교하여 쉽게 검사될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "리포칼린"은 일 말단에서 복수의(바람직하게는 4개) 루프에 의해 쌍으로 연결되어 리간드-결합 포켓을 포함하고 리간드-결합 포켓에 대한 입구를 정의하는 복수의 β-가닥(바람직하게는 A 내지 H로 지정된 8개의 β-가닥)을 포함하는 실린더형 β-병풍 구조(β-pleated sheet)의 초2차 구조 영역을 갖는 대략 18-20 kDa 중량의 단량체 단백질을 의미한다. 바람직하게는, 본 발명에서 사용된 리간드-결합 포켓을 포함하는 루프는 β-가닥 A와 B, C와 D, E와 F, 및 G와 H의 열린 말단을 연결하는 루프이고, 루프 AB, CD, EF 및 GH로 지정된다. 다른 견고한 리포칼린 스캐폴드에서 상기 루프의 다양성은 각각 상이한 크기, 형상 및 화학적 특성의 표적을 수용할 수 있는 리포칼린 패밀리 구성원들 중 다양한 상이한 결합 양식을 생성함이 잘 확립되어 있다(예를 들어, Skerra, Biochim Biophys Acta, 2000, Flower et al., Biochim Biophys Acta, 2000, Flower, Biochem J, 1996에서 검토할 것). 단백질의 리포칼린 패밀리는 폭넓은 리간드와 결합하기 위해 매우 낮은 수준의 전체 서열 보존(종종 20% 미만의 서열 동일성을 가짐)을 공유하나 고도로 보존된 전체 폴딩 패턴을 보유하면서 자연적으로 진화해 온 것으로 이해된다. 다양한 리포칼린에서 위치들 간의 대응은 또한 당업자에게 잘 알려져 있다(예를 들어, 미국 특허 제7,250,297호를 볼 것). 본 명세서에서 사용된 바와 같은 "리포칼린"의 정의에 속하는 단백질은 눈물 리포칼린(Tlc, Lcn1), 리포칼린-2(Lcn2) 또는 호중구 젤라티네이즈-연관 리포칼린(NGAL), 아포리포프로테인 D(ApoD), 아포리포프로테인 M, α₁-산 당단백질 1(α₁-acid glycoprotein 1), α₁-산 당단백질 2(α₁-acid glycoprotein 2), α₁-마이크로글로불린, 보체 성분 8γ, 레티놀-결합 단백질(RBP), 부고환 레티노산-결합 단백질, 글리코델린, 방취제-결합 단백질 IIa(odorant-binding protein IIa), 방취제-결합 단백질 IIb(odorant-binding protein IIb), 리포칼린-15(Lcn15) 및 프로스타글란딘 D 합성효소(prostaglandin D synthase)를 포함하는 인간 리포칼린을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 달리 명시되지 않은 한, "눈물 리포칼린"은 인간 눈물 리포칼린(hTlc)을 지칭하며, 추가로 성숙한 인간 눈물 리포칼린을 지칭한다. 단백질을 특성규명하는데 사용되는 경우 용어 "성숙한"은 본질적으로 신호 펩타이드로부터 유리된 단백질을 의미한다. 본 개시물의 "성숙한 hTlc"는 신호 펩타이드로부터 유리된 인간 눈물 리포칼린의 성숙한 형태를 지칭한다. 성숙한 hTlc는 수탁번호 P31025로 SWISS-PROT Data Bank에 기탁된 서열의 잔기 19-176에 기술되며, 그 아미노산은 SEQ ID NO: 1에 표시된다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, "리포칼린-2" 또는 "호중구 젤라티네이즈-연관 리포칼린"은 인간 리포칼린-2(hLcn2) 또는 인간 호중구 젤라티네이즈-연관 리포칼린(hNGAL)을 지칭하며, 추가로 성숙한 인간 리포칼린-2 또는 성숙한 인간 호중구 젤라티네이즈-ddus관된 리포칼린을 지칭한다. 용어 "성숙한"은 단백질을 특성규명하는데 사용되는 경우, 본질적으로 신호 펩타이드로부터 유리된 단백질을 의미한다. 본 개시물의 "성숙한 hNGAL"은 신호 펩타이드로부터 유리된 인간 호중구 젤라티네이즈-연관 리포칼린의 성숙한 형태를 지칭한다. 성숙한 hNGAL은 수탁번호 P80188로 SWISS-PROT Data Bank에 기탁된 서열의 잔기 21-198에 기술되며, 그 아미노산은 SEQ ID NO:2로 표시된다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, "천연 서열"은 이의 제조 방식과는 상관없이 자연에서 발생하는 서열을 갖거나 또는 야생형 서열을 갖는 서열을 갖는 단백질 또는 폴리펩타이드를 지칭한다. 그러한 천연 서열 단백질 또는 폴리펩타이드는 자연에서 분리될 수 있거나, 또는 다른 수단들, 예컨대 재조합 또는 합성 방법에 의해 생산될 수 있다.

"천연 서열 리포칼린"은 자연에서 유래된 상응하는 폴리펩타이드와 같은 아미노산 서열을 갖는 리포칼린을 지칭한다. 따라서, 천연 서열 리포칼린은 임의의 생물, 특히, 포유동물로부터 각각 자연적으로-발생하는(야생형) 리포칼린의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 용어 "천연 서열"은 리포칼린의 맥락에서 사용되는 경우, 특히 리포칼린의 자연적으로-발생하는 끝이 절단된 또는 분비된 형태, 대안으로 접합된(spliced) 형태와 같은 자연적으로-발생하는 변이체 형태 및 리포칼린의 자연적으로-발생하는 대립형질 변이체를 포함한다. 용어 "천연 서열 리포칼린" 및 "야생형 리포칼린"은 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, "뮤테인", "돌연변이 된" 실체(단백질 또는 핵산), 또는 "돌연변이체"는 자연적으로-발생하는(야생형) 단백질 또는 핵산과 비교하여 하나 이상의 아미노산 또는 뉴클레오티드의 교환, 결실 또는 삽입을 지칭한다. 상기 용어는 또한 본 명세서에서 기술된 바와 같은 뮤테인의 단편을 포함한다. 본 개시물은 본 명세서에서 기술된 바와 같이, 일 말단에 4개의 루프에 의해 쌍으로 연결되어 리간드-결합 포켓을 포함하고 리간드-결합 포켓의 입구를 정의하는 실린더형 β-병풍 구조의 초2차 구조 영역을 갖는 리포칼린 뮤테인을 명시적으로 포함하되, 천연 서열의 리포칼린과 비교하였을 때 상기 4개 루프 중 적어도 3개 각각의 적어도 하나의 아미노산이 돌연변이되어 있다. 본 발명의 리포칼린 뮤테인은 바람직하게는 본 명세서에서 기술된 바와 같은 CD137과 결합하는 기능을 갖는다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "단편"은 본 개시물의 리포칼린 뮤테인과 관련하여, 전장의 성숙한 hT1c 또는 hNGAL 또는 N-말단 및/또는 C-말단이 잘린, 즉, N-말단 및/또는 C-말단의 아미노산의 적어도 하나가 없는 리포칼린 뮤테인에서 유래된 단백질 또는 폴리펩타이드를 지칭한다. 그러한 단편은 그것이 유래된 성숙한 hT1c 또는 hNGAL 또는 리포칼린 뮤테인의 초기 서열의 적어도 10 이상, 예컨대 20 또는 30 이상의 연속적인 아미노산을 포함할 수 있고 보통 성숙한 hT1c 또는 hNGAL의 면역분석에서 검출될 수 있다. 그러한 단편은 N-말단 및/또는 C-말단 아미노산의 2까지, 3까지, 4까지, 5까지, 10까지, 15까지, 20까지, 25까지 또는 30까지(그 사이에 있는 모든 숫자들을 포함하여) 결핍될 수 있다. 설명적 예시로서, 그러한 단편은 성숙한 hT1c의 1, 2, 3 또는 4의 N-말단(His-His-Leu-Leu) 및/또는 1 또는 2의 C-말단 아미노산(Ser-Asp)이 결핍될 수 있다. 단편은 바람직하게는 그것이 유래된 성숙한 hT1c 또는 hNGAL 또는 리포칼린 뮤테인의 기능적 단편인 것으로 이해되며, 그것은 바람직하게는 그것이 유래된 성숙한 hT1c/hNGAL 또는 리포칼린 뮤테인의 CD137과의 결합 특이성을 보유한 것을 의미한다. 설명적 예시로서, 그러한 기능적 단편은 성숙한 hT1c의 선형 폴리펩타이드 서열에 상응하는 5-153, 5-150, 9-148, 12-140, 20-135 또는 26-133 위치에서 적어도 아미노산들을 포함할 수 있다. 다른 설명적 예시로서, 그러한 기능적 단편은 성숙한 hNGAL의 선형 폴리펩타이드 서열에 상응하는 13-157, 15-150, 18-141, 20-134, 25-134 또는 28-134 위치에서 적어도 아미노산들을 포함할 수 있다.

본 개시물의 융합 단백질의 상응하는 표적 CD137 또는 PD-L1에 관하여 "단편"은 N-말단 및/또는 C-말단이 절단된 CD137 또는 PD-L1 또는 CD137 또는 PD-L1의 단백질 도메인을 지칭한다. 본 명세서에서 기술된 바와 같은 CD137의 단편 또는 PD-L1의 단편은 본 개시물의 융합 단백질에 의해 인식 및/또는 결합되는 전장 CD137 또는 PD-L1의 능력을 보유한다. 설명적 예시로서, 단편은 CD137 또는 PD-L1의 세포외 도메인일 수 있다. 설명적 예시로서, 그러한 세포외 도메인은 CD137의 세포외 서브도메인의 아미노산, 예컨대 도메인 1(UniProt Q07011의 잔기 24-45), 도메인 2(잔기 46-86), 도메인 3(87-118) 및 도메인 4(잔기 119-159)의 각각의 또는 병합된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 다른 설명적 예시로서, 그러한 세포외 도메인은 UniProt Q9NZQ7의 아미노산 잔기 19-238을 포함할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "변이체"는 예를 들어, 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열의 치환, 결실, 삽입 및/또는 화학적 변형에 의한 돌연변이를 포함하는 단백질 또는 폴리펩타이드의 유도체에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 그러한 돌연변이 및/또는 화학적 변형은 단백질 또는 펩타이드의 기능성을 감소시키지 않는다. 그러한 치환은 보존적일 수 있으며, 즉 아미노산 잔기가 화학적으로 유사한 아미노산으로 치환되는 것이다. 보존적 치환의 예시는 하기 그룹의 구성원들 중에서의 대체이다: 1) 알라닌, 세린, 트레오닌 및 발린; 2) 아스파르트산, 글루탐산, 글루타민 및 아스파라긴 및 히스티딘; 3) 아르기닌, 리신, 글루타민, 아스파라긴 및 히스티딘; 4) 이소루신, 루신, 메티오닌, 발린, 알라닌, 페닐알라닌, 트레오닌 및 프롤린; 및 5) 이소루신, 루신, 메티오닌, 페닐알라린, 티로신 및 트립토판. 그러한 변이체는 하나 이상의 아미노산이 자연적으로 발생하는 20개의 아미노산 외에 그들의 각각의 D-이성질체에 의해 또는 아미노산, 예컨대, 오르니틴, 하이드록시프롤린, 시트룰린, 호모세린, 하이드록시리신, 노르발린에 의해 치환되어 있는 단백질 또는 폴리펩타이드를 포함한다. 그러한 변이체는 또한 예를 들어, 하나 이상의 아미노산 잔기가 N- 및/또는 C-말단에 부가 또는 결실된 단백질 또는 폴리펩타이드를 포함한다. 일반적으로, 변이체는 천연 서열 단백질 또는 폴리펩타이드와 적어도 약 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95% 또는 적어도 약 98% 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 변이체는 바람직하게는 그것이 유래된 단백질 또는 폴리펩타이드의 생물학적 활성, 예를 들어 같은 표적과의 결합을 보유한다.

본 개시물의 융합 단백질의 상응하는 단백질 리간드 CD137 또는 PD-L1에 관하여 본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "변이체"는 CD137 또는 PD-L1의 천연 서열(야생형 CD137 또는 PD-L1), 예컨대, 본 명세서에서 기술된 바와 같이 UniProt Q07011로 기탁된 CD137 또는 UniProt Q9NZQ7로 기탁된 PD-L1과 비교하여 하나 이상, 예컨대 1, 2, 3, 4 ,5 ,6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 40, 50, 60, 70, 80 이상의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖는 CD137 또는 PD-L1 또는 이의 각각의 단편에 관한 것이다. CD137 변이체 또는 PD-L1 변이체 각각은 바람직하게는 야생형 CD137 또는 PD-L1과 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% 또는 95%의 아미노산 동일성을 갖는다. 본 명세서에서 기술된 바와 같은 CD137 변이체 또는 PD-L1 변이체는 바람직하게는 본 발명에서 개시된 CD137 및 PD-L1에 특이적인 융합 단백질과 결합하는 능력을 보유한다.

리포칼린 뮤테인에 관하여 본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "변이체"는 본 개시물의 리포칼린 뮤테인 또는 이의 단편에 관한 것으로, 서열은 치환, 결실 및 삽입을 포함하여 돌연변이 및/또는 화학적 변형을 갖는다. 본 명세서에서 기술된 바와 같은 리포칼린 뮤테인의 변이체는 그것이 유래된 리포칼린 뮤테인의 생물학적 활성, 예를 들어, CD137과의 결합을 보유한다. 일반적으로, 리포칼린 뮤테인 변이체는 그것이 유래된 리포칼린 뮤테인과 적어도 약 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 98% 아미노산 서열 동일성을 갖는다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "돌연변이유발"은 폴리뉴클레오티드 또는 아미노산 서열로의 돌연변이 도입을 지칭한다. 돌연변이는 바람직하게는 실험 조건 하에서 도입되어 단백질 또는 폴리펩타이드 서열의 주어진 위치에서 자연적으로 발생하는 아미노산이 적어도 하나의 아미노산에 의해 변경, 예를 들어 치환될 수 있다. 용어 "돌연변이유발"은 또한 하나 이상의 아미노산의 결실 또는 삽입에 의해 서열 세크먼트의 길이의 (부가적인) 변형을 포함한다. 따라서, 예를 들어 선택된 서열에서 하나의 아미노산이 3개의 아미노산 스트레치로 대체되어 천연 단백질 또는 폴리펩타이드 아미노산 서열의 각각의 세그먼트의 길이와 비교하여 2개의 아미노산 잔기가 부가되는 것은 본 개시물의 범위 내에 있다. 그러한 삽입 또는 결실은 본 개시물에서 돌연변이유발을 적용받을 수 있는 임의의 서열 세그먼트에서 서로 독립적으로 도입될 수 있다. 본 개시물의 일 예시적인 구체예에서, 삽입은 천연 리포칼린의 루프 AB에 상응하는 아미노산 서열 세그먼트에 도입될 수 있다(국제 공개 특허 제WO2005/019256호 참조, 이의 전체는 본 명세서에 참조로 포함되어 있다).

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "무작위 돌연변이유발"은 미리 예정된 돌연변이(아미노산의 변경)가 특정 서열 위치에 존재하지 않지만 적어도 2개의 아미노산이 돌연변이유발 동안 미리 결정된 서열에서 특정 확률로 편입될 수 있음을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "서열 동일성" 또는 "동일성"은 그들의 유사성 또는 관계를 측정하는 서열의 특성을 나타낸다. 본 개시물에서 사용된 바와 같은 용어 "서열 동일성" 또는 "동일성"은 본 개시물의 단백질 또는 폴리펩타이드의 서열을 해당 서열과 정렬시킨 후(상동) 이들 두 서열 중 더 긴 잔기의 수에 대해 쌍으로 동일한 잔기의 비율을 의미한다. 서열 동일성은 동일한 아미노산 잔기의 수를 총 잔기의 수로 나누고 그 값에 100을 곱하여 측정된다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "서열 상동성" 또는 "상동성"은 이의 일반적인 의미를 가지며, 상동의 아미노산은 동일한 아미노산 뿐만 아니라 본 개시물의 단백질 또는 폴리펩타이드(예를 들어, 본 개시물의 임의의 융합 단백질 또는 리포칼린 뮤테인)의 선형 아미노산 서열에서 동등한 위치에서의 보존적 치환인 것으로 간주되는 아미노산을 포함한다.

당업자는 이용 가능한 컴퓨터 프로그램, 예를 들어, 표준 매개 변수를 이용한 서열 상동성 또는 서열 동일성을 측정하기 위한 BLAST(Altschul et al., Nucleic Acids Res, 1997), BLAST2(Altschul et al., J Mol Biol, 1990) 및Smith-Waterman(Smith and Waterman, J Mol Biol, 1981)을 알고 있다. 서열 상동성 또는 서열 동일성의 비율은 예를 들어, 프로그램 BLASTP, version 2.2.5(November 16, 2002;(Altschul et al., Nucleic Acids Res, 1997)를 이용하여 본 명세서에서 측정될 수 있다. 이 구체예에서, 상동성의 비율은 바람직하게는 쌍대 비교에서 레퍼런스로서 야생형 단백질 스캐폴드를 이용하는 프로펩타이드 서열을 포함하는 전체 단백질 또는 폴리펩타이드 서열의 정렬에 기초한다(매트릭스: BLOSUM 62; 갭 코스트: 11.1; 컷오프 값은 10^-3로 설정됨). 그것은 BLASTP 프로그램 출력 결과를 정렬용 프로그램에 의해 선택된 총 아미노산의 수로 나누었을 때 나타난 "양성"의 수의 비율(상동성 아미노산)로 계산된다.

구체적으로, 리포칼린 뮤테인의 아미노산 서열의 아미노산 잔기가 야생형 리포칼린의 아미노산 서열에서 특정 위치에 상응하는 야생형 리포칼린과 상이한 지를 측정하기 위해, 당업자는 당업계에서 잘-알려진 수단 및 방법들, 예를 들어, 수동으로 또는 BLAST 2.0(Basic Local Alignment Search Tool), 또는 ClustalW과 같은 컴퓨터 프로그램을 이용한 정렬, 또는 서열 정렬을 생성하기에 적당한 임의의 다른 적당한 프로그램을 이용할 수 있다. 따라서, 리포칼린의 야생형 서열은 "대상 서열" 또는 "레퍼런스 서열"로 제공할 수 있으며, 본 명세서에서 기술된 야생형 리포칼린과 상이한 리포칼린 뮤테인의 아미노산 서열은 "쿼리 서열"로 제공한다. 용어 "야생형 서열", "레퍼런스 서열" 및 "대상 서열"은 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다. 리포칼린의 바람직한 야생형 서열은 SEQ ID NO: 1에 도시된 바와 같이 hTLc 또는 SEQ ID NO: 2에 도시된 바와 같은 hNGAL이다.

"갭"은 정렬 시 아미노산의 부가 또는 결실의 결과인 공간이다. 따라서, 정확히 같은 서열의 2 카피는 100% 동일성을 갖지만, 덜 보존되고 결실, 부가 또는 대체를 갖는 서열은 더 낮은 정도의 서열 동일성을 가질 수 있다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "위치"는 본 명세서에서 묘사된 아미노산 서열 내 아미노산의 위치 또는 본 명세서에서 묘사된 핵산 서열 내 뉴클레오티드의 위치 중 하나를 의미한다. 하나 이상의 리포칼린 뮤테인의 아미노산 서열의 맥락에서 본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "상응하다" 또는 "상응하는"의 경우, 상응하는 위치는 이전의 뉴클레오티드 또는 아미노산의 수로만 측정되는 것은 아님을 이해해야 한다. 따라서, 본 개시물에 따른 주어진 아미노산의 절대 위치는(돌연변이 또는 야생형) 리포칼린의 다른 곳에서 아미노산의 결실 또는 부가로 인해 상응하는 위치와 다를 수 있다. 유사하게, 본 개시물에 따른 주어진 뉴클레오티드의 절대 위치는 프로모터 및/또는 임의의 다른 조절 서열 또는 유전자(엑손 및 인트론을 포함하여)를 포함하는 뮤테인 또는 야생형 리포칼린의 5'-비번역된 영역(UTR)의 다른 곳에서 결실 또는 부가된 뉴클레오티드로 인해 상응하는 위치와 다를 수 있다.

본 개시물에 따른 "상응하는 위치"는 본 개시물에 따른 쌍 또는 다수의 서열 정렬에서 그것이 상응하는 서열 위치에 정렬하는 서열 위치일 수 있다. 바람직하게는 본 개시물에 따른 "상응하는 위치"의 경우, 뉴클레오티드 또는 아미노산의 절대 위치는 인접한 뉴클레오티드 또는 아미노산과 상이하지만 교환, 결실 또는 부가될 수 있는 상기 인접한 뉴클레오티드 또는 아미노산은 동일한 하나 이상의 "상응하는 위치"에 포함될 수 있는 것으로 이해해야 한다.

게다가, 본 개시물에 따른 레퍼런스 서열에 기초한 리포칼린 뮤테인 내 상응하는 위치의 경우, 리포칼린 중에서 고도로-보존된 전체 폴딩 패턴에 비추어 당업자에 의해 평가될 때, 비록 그들이 절대 위치 수에서 상이하더라도, 바람직하게는 리포칼린 뮤테인의 뉴클레오티드 또는 아미노산의 위치는 레퍼런스 리포칼린(야생형 리포칼린) 또는 다른 리포칼린 뮤테인의 다른 위치에 구조적으로 상응할 수 있는 것으로 이해해야 한다.

본 명세서에서 상호교환적으로 사용된 바와 같이, 용어 "컨쥬게이트", "컨쥬게이션", "융합하다", "융합" 또는 "연결된"은 둘 이상의 서브유닛을 공유 또는 비공유 결합의 모든 형태를 통해 유전자 융합, 화학적 컨쥬게이션, 링커 또는 가교제를 통한 커플링 및 비-공유 결합을 포함하나 이에 제한되지 않는 수단에 의해 함께 결합시키는 것을 지칭한다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "융합 폴리펩타이드" 또는 "융합 단백질"은 둘 이상의 서브유닛을 포함하는 폴리펩타이드 또는 단백질을 지칭한다. 일부 구체예에서, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 융합 단백질은 둘 이상의 서브유닛, CD137에 특이적으로 결합할 수 있는 이들 서브유닛의 적어도 하나 및 PD-L1에 특이적으로 결합할 수 있는 추가의 서브유닛을 포함한다. 융합 단백질 내에서, 이들 서브유닛은 공유 또는 비-공유 결합에 의해 결합될 수 있다. 바람직하게는, 융합 단백질은 둘 이상의 서브유닛 간의 번역적 융합이다. 번역적 융합은 리딩 프레임 내 하나의 서브유닛에 대한 코딩 서열을 추가의 서브유닛의 코딩 서열과 함께 유전적으로 조작하여 생성될 수 있다. 두 서브유닛은 링커를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 의해 배치될 수 있다. 그러나, 본 개시물의 융합 단백질의 서브유닛은 또한 화학적 컨쥬게이션을 통해 결합될 수 있다. 융합 단백질을 형성하는 서브유닛은 전형적으로 서로 하나의 서브유닛의 C-말단이 다른 서브유닛의 N-말단에, 또는 하나의 서브유닛의 C-말단이 다른 서브유닛의 C-말단에, 또는 하나의 서브유닛의 N-말단이 다른 서브유닛의 N-말단에, 또는 하나의 서브유닛의 N-말단이 다른 서브유닛의 C-말단에 결합된다. 융합 단백질의 서브유닛은 임의의 순서로 결합될 수 있으며, 임의의 구성 서브유닛 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 하나 이상의 서브유닛이 하나 이상의 폴리펩타이드 사슬로 구성된 단백질(복합체)의 일부인 경우, 용어 "융합 단백질"은 또한 단백질(복합체)의 융합된 서열 및 모든 다른 폴리펩타이드 서열(들)을 포함하는 단백질을 지칭한다. 설명적 예시로서, 전장 면역글로불린이 면역글로불린의 중쇄 또는 경쇄에 의해 리포칼린 뮤테인에 융합되는 곳에서, 용어 "융합 단백질"은 리포칼린 뮤테인을 포함하는 단일 폴리펩타이드 사슬 및 면역글로불린의 중쇄 또는 경쇄를 지칭한다. 용어 "융합 단백질"은 또한 전체 면역글로불린(경쇄 및 중쇄 둘 다) 및 이의 중쇄 및/또는 경쇄 중 하나 또는 둘 다에 융합된 리포칼린 뮤테인을 지칭할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 본 명세서에서 개시된 융합 단백질의 용어 "서브유닛"은 그 자체로 안정한 폴딩 구조를 형성하고 표적에 대해 결합 모티프를 제공하는 독특한 기능을 정의할 수 있는 단일 단백질 또는 별개의 폴리펩타이드 사슬을 지칭한다. 일부 구체예에서, 본 개시물의 바람직한 서브유닛은 리포칼린 뮤테인이다. 일부 다른 구체예에서, 본 개시물의 바람직한 서브유닛은 전장 면역글로불린 또는 이의 항원-결합 도메인이다.

본 개시물의 융합 단백질에 의해 포함될 수 있는 "링커"는 본 명세서에서 기술된 바와 같은 융합 단백질의 둘 이상의 서브유닛을 함께 결합시킨다. 결합은 공유 또는 비-공유일 수 있다. 바람직한 공유 결합은 펩타이드 결합, 예컨대 아미노산 간의 펩타이드 결합에 의해서이다. 바람직한 링커는 펩타이드 링커이다. 따라서, 바람직한 구체예에서, 상기 링커는 하나 이상의 아미노산, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 이상의 아미노산을 포함한다. 바람직한 펩타이드 링커는 본 명세서에서 기술되며, 글리신-세린(GS) 링커, 글리코실화 된 GS 링커 및 프롤린-알라닌-세린 폴리머(PAS) 링커를 포함한다. 일부 바람직한 구체예에서, GS 링커는 SEQ ID NO: 13에 기술된 바와 같은 (G₄S)₃ 이며, 융합 단백질의 서브유닛을 함께 결합하는데 사용된다. 다른 바람직한 링커는 화학적 링커를 포함한다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "알부민"은 인간 혈청 알부민 또는 소 혈청 알부민 또는 흰쥐 혈청 알부민과 같은 모든 포유동물 알부민을 포함한다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "유기 분자" 또는 "유기 저분자"는 적어도 둘, 바람직하게는 7 이하의 탄소 원자 또는 12의 회전가능한 탄소 결합을 포함하고, 분자량이 100 내지 2,000 달톤, 바람직하게는 100 내지 1,000 달톤의 범위이며, 선택적으로 하나 또는 둘의 금속 원자를 포함하는 유기 분자를 뜻한다.

"샘플"은 임의의 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플로서 정의된다. 생물학적 샘플은 혈액, 혈청, 오줌, 대소변, 정액 또는 종양 조직을 포함한 조직을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

"대상체"는 척추동물, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간이다. 용어 "포유동물"은 몇 가지 설명적 예시들을 거론하기 위해 인간, 가축 및 농장 동물 및 동물원, 스포츠 또는 애완동물, 예컨대 양, 개, 말, 고양이, 소, 흰쥐, 돼지, 시아노몰거스와 같은 영장류를 포함하나, 이에 제한되지 않는 포유동물로서 분류된 임의의 동물을 지칭하기 위해 본 명세서에서 사용된다. 바람직하게는, 본 명세서에서 사용된 "포유동물"은 인간이다.

"유효량"은 유익하거나 바람직한 결과를 산출하기에 충분한 양이다. 유효량은 1회 이상의 개별 투여 또는 용량으로 투여될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, "항체"는 전체 항체 또는 임의의 항원 결합 단편(즉, "항원-결합 부분") 또는 이의 단일 쇄를 포함한다. 전체 항체는 이황화 결합에 의해 서로 연결된 적어도 2개의 중쇄(HC) 및 2개의 경쇄(LC)를 포함하는 당단백질을 지칭한다. 각 중쇄는 중쇄 가변 도메인(V_H 또는 HCVR) 및 중쇄 불변 영역(C_H)으로 이루어진다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, C_H1, C_H2 및 C_H3로 이루어진다. 각 경쇄는 경쇄 가변 도메인(V_L 또는 LCVR) 및 경쇄 불변 영역(C_L)으로 이루어진다. 경쇄 불변 영역은 1개의 도메인, C_L으로 이루어진다. V_H 및 V_L 영역은 훨씬 보존된 영역, 일명 프레임워크 영역(FR)이 배치된 과변이 영역, 일명 상보성 결정 영역(CDR)으로 세분될 수 있다. 각각의 V_H 및 V_L은 아미노-말단에서 카르복시-말단까지 하기의 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원(예를 들어, PD-L1)과 상호작용하는 결합 도메인을 포함한다. 항체의 불변 영역은 선택적으로 면역글로불린의 면역계의 다양한 세포(예를 들어, 효과기 세포) 및 고전적인 보체계의 제1 성분(C1q)을 포함하여 숙주 조직 또는 인자들과의 결합을 매개할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 항체의 "항원 결합 단편"은 항원(예를 들어, PD-L1)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유한 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있는 것으로 나타났다. 용어, 항체의 "항원-결합 단편" 내에 포함된 결합 단편의 예시들은 (i) V_H, V_L, C_L 및 C_H1 도메인으로 구성된 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 이황화 브릿지에 의해 결합된 2개의 Fab 단편을 포함하는 F(ab)₂; (iii) V_H, V_L, C_L 및 C_H1 도메인과 C_H1 및 C_H2 도메인 사이의 영역으로 구성된 Fab' 단편; (iv) V_H 및 C_H1도메인으로 구성된 Fd 단편; (v) 항체의 단일 암의 V_H 및 V_L 도메인으로 구성된 단일-쇄 Fv 단편; (vi) V_H 도메인으로 구성된 dAb 단편(Ward et al., Nature, 1989); 및 (vii) 분리된 상보성 결정 영역(CDR) 또는 선택적으로 합성 링커에 의해 결합될 수 있는 둘 이상의 분리된 CDRs의 조합; (viii) 짧은 링커를 사용하여 같은 폴리펩타이드 사슬에서 연결된 V_H 및 V_L를 포함하는 "항체"(예를 들어, 특허 문헌 EP404,097; WO 93/11161; 및 Holliger et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 1993); (ix) 일부 예시에서 둘 이상의 V_H영역이 공유적으로 결합되는 V_H또는 V_L만 포함하는 "도메인 항체 단편"을 포함한다.

항체는 다클론 또는 단클론일 수 있다; 이종 개체, 동종 개체 또는 동계 개체; 또는 이의 변형된 형태(예를 들어, 인간화, 키메릭 또는 다중특이적). 항체는 또한 전적으로 인간일 수 있다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, "프레임워크" 또는 "FR"은 초변이 영역(CDR) 잔기 이외의 다른 가변 도메인 잔기를 지칭한다.

"단편 결정화 가능 영역(Fragment crystallizable region)" 또는 "Fc 영역"은 천연-서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함하여 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 지칭한다. 면역글로불린 중쇄의 Fc 영역의 경계가 다양하긴 하나, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 보통 Kabat의 EU 인덱스에 따른 넘버링 Cys226 위치에서 또는 Pro230으로부터의 아미노산 잔기로부터 이의 카르복시-말단까지로 정의된다(Johnson and Wu, Nucleic Acids Res, 2000). Fc 영역의 C-말단의 리신(Kabat의 EU 인덱스에 따른 잔기 447)은 예를 들어 항체의 생산 또는 정제 동안, 또는 항체의 중쇄 인코딩 핵산을 재조합으로 조작하여 제거될 수 있다. 따라서, 온전한 항체의 조성은 모든 K447 잔기가 제거된 항체 집단, K447 잔기가 제거되지 않은 항체 집단 및 K447 잔기가 있거나 없는 항체의 혼합물을 갖는 항체 집단을 포함할 수 있다. 본 발명의 항체에서 사용하기 위한 적당한 천연-서열 Fc 영역은 인간 IgG1, IgG2(IgG2A, IgG2B), IgG3 및 IgG4를 포함한다.

"Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 지칭한다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, "분리된 항체"는 이의 자연 환경이 실질적으로 없는 항체를 지칭한다. 예를 들어, 분리된 항체는 그것이 유래된 세포 또는 조직 공급원으로부터의 세포성 물질 및 다른 단백질이 실질적으로 없다. "분리된 항체"는 또한 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 지칭한다. 본 경우에서, PD-L1에 특이적으로 결합하는 분리된 항체는 PD-L1 이외의 항원과 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없다. 그러나, PD-L1과 특이적으로 결합하는 분리된 항체는 다른 항원, 예컨대 다른 종으로부터의 PD-L1에 대해 교차-반응성을 가질 수 있다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, "단클론 항체"는 단일 분자 조성의 항체 분자의 제제를 지칭한다. 단클론 항체 조성은 특정 에피토프에 대한 단일 결합 특이성 및 친화성을 나타낸다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, "인간화 항체"는 인간 이외의 포유동물에서 유래된 항체의 CDR 및 인간 항체 또는 인간 항체에서 유래된 FR 영역 및 불변 영역으로 구성된 항체를 지칭한다. 일부 구체예에서, 인간화 항체는 Ehrenmann et al.(2010)에 기술된 바와 같이, Immunogenetics Information System(IMGT) DomainGapAlign tool을 이용하여 평가될 때 전체적으로 분석된 다른 종보다는 인간에 더 가까운 가변 영역 아미노산 서열을 갖는 가변성 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, 인간화 항체는 감소된 항원성으로 인해 치료제에서 유효성분으로서 유용할 것이다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이 용어 "치료제" 또는 "치료적 활성제"는 치료적으로 유용한 약제를 지칭한다. 치료제는 질환, 생리적 상태, 징후의 예방, 개선 또는 치료를 위한, 또는 이의 평가 또는 진단을 위한 임의의 약제일 수 있다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, "인간 항체"는 프레임워크 및 CDR 영역 둘 다 인간 생식세포 면역글로불린 서열에서 유래된 가변 영역을 갖는 항체를 포함한다. 더욱이, 항체가 불변 영역을 포함하는 경우, 불변 영역은 또한 인간 생식세포 면역글로불린 서열에서 유래된다. 본 발명의 인간 항체는 인간 생식세포 면역글로불린 서열에 의해 인코딩되지 않는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다(예를 들어, 인 비트로에서 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발 또는 인 비보에서 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이). 그러나, 본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "인간화 항체"는 마우스와 같은 다른 포유동물 종의 생식세포에서 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열로 이식된 항체를 포함하도록 의도되지는 않는다.

도 1은 표적 CD137 및 PD-L1에 이중특이적인 이 출원에서 기술된 대표적인 융합 단백질의 디자인에 대한 개요를 제공한다. 대표적인 융합 단백질은 PD-L1에 특이적인 항체(예를 들어, 중쇄는 SEQ ID NO: 86에 의해 제공되고, 또는 SEQ ID NO: 77의 중쇄 가변성 도메인을 포함하고, 또는 GFSLSNYD(HCDR1, SEQ ID NO: 60), IWTGGAT(HCDR2, SEQ ID NO: 61) 및 VRDSNYRYDEPFTY(HCDR3; SEQ ID NO: 62)의 CDR 서열을 포함하고, 및 경쇄는 SEQ ID NO: 87에 의해 제공되며, 또는 SEQ ID NO: 82의 중쇄 가변성 도메인을 포함하고, 또는 QSIGTN(LCDR1, SEQ ID NO: 63), YAS(LCDR2) 및 QQSNSWPYT(LCDR3; SEQ ID NO: 64)의 CDR 서열을 포함하는 항체) 및 CD137에 대해 특이적인 하나 이상의 리포칼린 뮤테인(예를 들어, SEQ ID NO: 42의 리포칼린 뮤테인)을 기반으로 하여 제조되었다. 하나 이상의 리포칼린 뮤테인은 도 1A-1I에 묘사된 바와 같은 PD-L1 특이적인 항체의 중쇄 또는 경쇄의 C- 및/또는 N-말단에 유전적으로 융합되어 융합 단백질, 예를 들어, SEQ ID NOs: 90 및 87, SEQ ID NOs: 86 및 91, SEQ ID NOs: 92 및 87, SEQ ID NOs: 86 및 93, SEQ ID NOs: 94 및 87, 및 SEQ ID NOs: 90 및 91을 생성하였다. 생성된 융합 단백질은 CD137에 대해 2가(예를 들어, 도 1A-1D에서 묘사된 바와 같이), 또는 CD137에 대해 4가(예를 들어, 도 1E-1H에서 묘사된 바와 같이), 또는 CD137에 대해 훨씬 더 높은 결합가를 가질 수 있다(도 1I에서 묘사된 바와 같이). 추가의 단일특이적인 융합 단백질은 하나 이상의 CD137 특이적인 리포칼린 뮤테인(예를 들어, 도 1J-1K에서 묘사된 바와 같이)을 펩타이드 링커를 통해 본 명세서에서 기술된 바와 같은 제공된 항체의 Fc 영역의 C-말단에 융합시켜 생성되었다. 생성된 단일특이적인 융합 단백질은 예를 들어, SEQ ID NO: 88 및 SEQ ID NO: 89에서 제공된다.
도 2는 대표적인 융합 단백질의 PD-L1 또는 CD137과의 결합이 실시예 4에서 기술된 바와 같이 측정되는 ELISA 실험 결과를 도시한다. PD-L1 또는 CD137(C-말단 His 또는 Fc tag를 갖는)은 마이크로타이터 플레이트 상에 코팅되고, 시험 물질은 100 nM의 최대 농도에서 시작하여 적정되었다. 연구 하에서 결합된 물질은 각각 항-인간 IgG Fc-HRP 또는 항-NGAL-HRP를 통해 검출되었다. 데이터는 EC₅₀ 값 및 최대 신호를 자유 매개 변수로 하고, 1로 고정된 기울기를 갖는 1:1 결합 모델에 적용되었다. 생성된 EC₅₀ 값은 표 4에서 제공된다.
도 3은 두 표적 PD-L1 및 CD137과 동시에 결합하는 대표적인 융합 단백질의 능력이 실시예 5에서 기술된 바와 같이 측정된 ELISA 실험 결과를 도시한다. 재조합 huPD-L1-His 또는 huCD137-His는 마이크로타이터 플레이트 상에 코팅되고, 이어서, 100 nM의 최대 농도에서 시작하는 융합 단백질의 적정을 수행하였다. 이후에, 각각 비오틴화 된 huCD137-His 또는 비오틴화 된 huPD-L1-His의 일정 농도를 첨가하고, ExtrAvidin-Peroxidase를 통해 검출되었다.
도 4는 실시예 6에서 기술된 바와 같은 인간 또는 시아노몰거스 CD137(도 4A-4B) 그리고 인간 또는 시아노몰거스 PD-L1(도 4C-4D)을 발현하는 Flp-In-CHO 세포를 이용하여 플로우 사이토메트리에 의한 융합 단백질의 표적 결합의 평가 결과를 도시한다. mock 형질감염된 Flp-In-CHO 세포를 이용한 경우 결합이 관찰되지 않았다(도 4E). 형광 강도의 기하학적 평균은 비선형 회귀를 이용하여 EC₅₀ 값을 계산하는데 사용되었다(공유 바닥(shared bottom), 기울기=1). EC₅₀ 값은 표 6에서 제공된다.
도 5는 실시예 7에서 기술된 바와 같이 RKO 세포 및 융합 단백질을 인큐베이션함으로써 플로우 사이토메트리를 이용하여 평가된 융합 단백질의 PD-L1-양성 종양 세포와의 결합을 도시한다.
도 6은 실시예 8에서 기술된 바와 같이, 융합 단백질의 CD137과의 상호작용이 CD137L의 CD137과의 결합에 의해 방해를 받는지를 조사하기 위해 설계된 다중-결합 SPR-기반 실험의 예시를 제공한다. 이는 SPR 센서 칩상에서 huCD137(C-말단 Fc 융합) 및 huCD137L(C-말단 His tag을 갖는)의 복합체를 생성하고, 융합 단백질이 여전히 huCD137 및 CD137L의 복합체와 결합할 수 있는지를 점검하여 평가된다. 레퍼런스로서, huCD137L의 부재 하에서 huCD137을 또한 시험된 융합 단백질과 인큐베이션 한다. 각각의 융합 단백질의 huCD137 단독과의 결합에 대한 SPR 추적은 실선 화살표로 표시된다. huCD137L이 포화되어 있는 huCD137에 대한 각각의 융합 단백질의 결합에 대한 SPR 추적은 점선 화살표로 표시된다. 대조군으로, 융합 단백질이 없이 빈 주사가 사용되었다. 실험은 모든 시험된 융합 단백질이 CD137L의 존재 하에서 CD137과 결합할 수 있음을 보여준다.
도 7은 실시예 9에서 기술된 바와 같은 경쟁적 ELISA 연구에서 묘사된 PD-1과의 결합을 위해 융합 단백질이 PD-L1과 경쟁함을 보여준다. 일정 농도의 huPD-1-His가 마이크로타이터 플레이트 상에 코팅되고, 이어서 상이한 농도의 시험 분자 및 고정된 농도의 추적자 huPD-L1-Fc의 혼합물을 첨가하였다. 결합된 추적자는 HRP-표지된 항-IgG Fc 항체를 이용하여 검출되었다. CD137 및 PD-L1 이중특이적인 융합 단백질 또는 PD-L1 특이적인 항체에 의한 PD-1에 대한 huPD-L1-Fc 결합의 농도 의존적 억제가 관찰되었다.
도 8은 CD137 생물학적 검정을 이용하여 평가된 PD-L1-표적-의존적 방식으로 T-세포 활성화를 보조-자극하는 대표적인 융합 단백질의 잠재력이다. NF-κB-luc2/CD137 Jurkat 세포를 다양한 농도의 융합 단백질 또는 대조군의 존재 하에서 PD-L1 발현 종양 세포주 RKO와 공-배양하였다. 4h 후, 루시퍼레이즈 분석 시약을 첨가하고 발광 신호를 측정하였다. GraphPad Prism^®으로 4개의 매개 변수 로지스틱 곡선 분석을 수행하여 EC₅₀값을 계산하였다(표 9 참조). 융합 단백질은 단지 PD-L1의 존재 하에서 T-세포 활성화를 보조-자극하지만(도 8A 및 8C), PD-L1의 부재 하에서는 그렇지 않는다(도 8B 및 8D). 대조적으로, 레퍼런스 항-CD137 mAb(SEQ ID NOs: 28 및 29)는 PD-L1 양성 RKO 세포의 존재 및 부재 하에서 유사한 활성화를 나타낸다.
도 9는 T-세포 활성화를 유도하는 선택된 융합 단백질의 능력이 조사된 대표적인 실험 결과를 도시한다. 각각의 PD-L1 항체 빌딩 블록을 포함하는 PD-L1 항체들, Fc 융합으로서 CD137 결합 리포칼린 뮤테인, 및 항-CD137 벤치마크 항체는 단독으로 및 항-PD-L1/항-CD137 칵테일로서 조합하여 시험되었다. 실험에서, 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 융합 단백질, 항체, 리포칼린 뮤테인 Fc 융합, 칵테일 또는 대조군과 1 ng/mL의 스타필로코컬 엔테로톡신 B(SEB)의 존재 하에서 인큐베이션 하였다. 실시예 11에 기술된 바와 같이, T-세포 활성화를 반영하는 분비된 인터루킨 2(IL-2)의 수준은 T-세포 활성화에 대한 판독으로서 전기화학발광-기반 분석에 의해 측정되고, 상응하는 IgG4 대조군의 수준으로 정규화된다. 모든 융합 단백질은 T-세포 활성화를 유도할 수 있고, 단일 빌딩 블록 또는 벤치마크 항-PD-L1/항-CD137 항체의 칵테일에 더 강하거나 또는 적어도 필적할만하다.
도 10은 PD-L1-표적-의존적 방식으로 T-세포 활성화를 보조-자극하는 대표적인 융합 단백질의 능력을 도시한다. 각 PD-L1 항체 빌딩 블록을 포함하는 PD-L1 항체들, Fc 융합으로서 CD137 결합 리포칼린 뮤테인 및 항-CD137 벤치마크 항체는 단독으로 또는 항-PD-L1/항-CD137 칵테일로서 조합하여 시험되었다. 상이한 수준의 PD-L1(고: RKO; 적당: HCC827; 음성: HepG)을 발현하는 다양한 종양 세포주를 항-인간 CD3이 코팅된 플레이트에 씨딩하였다. Pan T 세포 및 다양한 농도의 융합 단백질과 단일 빌딩 블록을 첨가하고, 3일 동안 인큐베이션 하였다. 분비된 IL-2의 수준은 전기화학발광-기반 분석에 의해 실시예 12에 기술된 바와 같이 측정되었다. 모든 융합 단백질은 PD-L1 의존적 방식으로 IL-2 분비를 증가할 수 있다.
도 11은 37℃ 또는 40℃에서 1 mg/mL 또는 20 mg/mL의 농도로 1, 2, 3 또는 4주 인큐베이션 후 PBS에서 또는 25 mM 히스티딘, 60 mM NaCl, 200 mM 아르기닌 pH 6에서의 융합 단백질의 저장 안정성을 예시한다. 안정성은 실시예 12에서 기술된 바와 같이, 분석 크기 배제로부터 단량체의 회수 또는 정량적 ELISA로부터 기능성 단백질의 회수에 의해 평가되었다.
도 12는 CD4⁺ T 세포를 이용한 혼합 림프구 반응(mixed lymphocyte reaction, MLR)에서 IL-2 분비를 자극하는 대표적인 융합 단백질(SEQ ID NOs: 90 및 87)의 안정성을 도시한다. 융합 단백질, PD-L1 항체 빌딩 블록(SEQ ID NOs: 86 및 87), Fc 융합으로서 CD137 결합 리포칼린 뮤테인(SEQ ID NO: 89) 및 항-CD137 벤치마크 항체 또는 항-PD-L1 벤치마크 항체 단독 또는 항-PL-L1/항-CD137 칵테일로서 조합하여 실시예 14에서 기술된 바와 같이 동일한 몰 농도로 시험되었다. IL-2 분비는 상이한 건강한 기증자에서 얻은 총 인간 CD4⁺ T 세포 및 단핵구 유래의 수지상세포(moDCs)를 인큐베이션 6일 후 상등액에서 측정되었다. 도 12A는 융합 단백질 SEQ ID NOs: 90 및 87이 빌딩 블록 단독(PD-L1 항체 SEQ ID NOs: 90 및 87 또는 CD137 특이 리포칼린 뮤테인 SEQ ID NOs: 89) 및 레퍼런스 항-PD-L1 또는 항-CD137 항체(각각 SEQ ID NOs: 26 및 27 또는 SEQ ID NOs: 28 및 29)과 비교하여 동일한 몰 농도에서(10 또는 0.1 ㎍/mL의 시험된 융합 단백질) IL-2 분비에서의 유의한 증가를 나타냄을 예시한다. 8회 독립적인 실험에서 얻은 데이터가 도시된다. 도 12B는 융합 단백질 SEQ ID NOs: 90 및 87이 0.001 내지 20 ㎍/mL의 농도에서 IL-2의 농도-의존적인 분비를 유도할 수 있음을 도시한다. 융합 단백질에 의해 유도된 IL-2 수준은 레퍼런스 항-PD-L1 항체(SEQ ID NOs: 26 및 27) 및 레퍼런스 항-CD137 항체(SEQ ID NOs: 28 및 29)의 칵테일의 동일한 몰 농도와 비교하여 더 높았다. 대표 기증자에서 얻은 데이터가 도시된다.
도 13은 CD8⁺ T-세포 효과기 분자의 분비를 유도하는 예시적인 융합 단백질(SEQ ID NOs: 90 및 87)의 능력을 도시한다. 융합 단백질은 상등액 내 IL-2 및 CD8⁺ T-세포 효과기 분자의 분비를 실시예 15에서 기술된 바와 같이 Luminex 분석을 이용하여 정량한 후 6일 동안 불일치하는 건강한 기증자에서 얻은 moDCs 및 CD8⁺ T 세포와 배양되었다. 융합 단백질 SEQ ID NOs: 90 및 87은 단독 또는 칵테일로서 사용될 때 10 ㎍/mL에서 레퍼런스 항-PD-L1 항체(SEQ ID NOs: 26 및 27) 및 레퍼런스 항-CD137 항체(SEQ ID NOs: 28 및 29)와 비교하여 IL-2 및 세포독성 인자(퍼포린, 그랜자임 B 및 그랜자임 A)의 분비에서의 증가를 보여주었다.
도 14는 융합 단백질이 실시예 17에서 기술된 바와 같은 경쟁적 ELISA 연구에서 묘사된 임상적으로 활성이 있는 CD137 항체(SEQ ID NOs: 28 및 29)와 중첩되는 에피토프에서 결합함을 도시한다. 일정 농도의 SEQ ID NOs: 28 및 29를 마이크로타이터 플레이트 상에 코팅하고, 이어서 상이한 농도의 시험 물질 및 고정된 농도의 비오틴화 된 huCD137-Fc의 추적자의 혼합물을 첨가하였다. 결합된 추적자는 ExtrAvidin-Peroxidase를 통해 검출되었다. 융합 단백질은 CD137 결합에 대해 CD137 항체와 경쟁한다.
도 15는 실시예 18에 기술된 바와 같은 PD-1/PD-L1 억제 생물학적 검정을 이용하여 평가되는 PD-1/PD-L1에 의해 매개된 억제 신호를 차단하는 대표적인 융합 단백질의 잠재력을 도시한다. PD-1-NFAT-luc Jurkat T 세포(PD-1 및 NFAT 프로모터 조절 하에서 NFAT-매개 루시퍼레이즈 유전자를 발현하는 Jurkat 세포주)를 다양한 농도의 시험 물질의 존재 하에서 PD-L1 aAPC/CHO-K1 세포와 공-배양하였다. 6시간 후 루시퍼레이즈 분석 시약을 첨가하고 발광 신호를 측정하였다. 배경 신호는 PD-L1 aAPC/CHO-K1 세포 단독과 공동-배양된 PD-1-NFAT-luc Jurkat T 세포이다. SEQ ID NOs: 90 및 87의 융합 단백질은 SEQ ID NOs: 86 및 87에 도시된 빌딩 블록 PD-L1 항체 및 SEQ ID NOs: 26 및 27에 도시된 레퍼런스 PD-L1 항체를 포함하는 시험된 PD-L1 항체들과 비교하여 PD-1/PD-L1 경로를 차단한다.
도 16은 T-세포 활성화를 유도하는 대표적인 융합 단백질의 능력을 도시한다. PD-L1 항체 빌딩 블록 및 레퍼런스 CD137 항체는 마찬가지로 단독으로 및 PD-L1 항체와 조합하여 사용되는 경우를 시험하였다. 실험에서, 인간 PBMC를 0.1 ng/mL의 SEB 존재 하에서 융합 단백질, 항체, 칵테일 또는 대조군과 인큐베이션 하였다. 분비된 IL-2의 수준은 실시예 19에서 기술되고, 도 16A에서 묘사된 바와 같이 T-세포 활성화에 대한 판독으로서 전기화학발광-기반 분석에 의해 측정되었다. 도 16B는 배경 IL-2 분비 수준(임의의 시험 물질이 없이 0.1 ng/mL의 SEB로 자극된 PBMC)과 비교할 때 시험 물질에 의해 유도된 IL-2 분비 수준의 배 증가를 나타낸다. 융합 단백질은 IL-2 분비에서 농도-의존적 증가를 유도하며, 이는 PD-L1 항체 또는 CD137 항체 단독 또는 조합보다 더 강하다.
도 17은 PD-L1의 존재 하에서 T-세포 활성화를 보조-자극하는 대표적인 융합 단백질의 능력을 입증한다. PD-L1 항체 빌딩 블록, 레퍼런스 CD137 항체 및 CD137 항체와 레퍼런스 PD-L1 항체의 칵테일이 병행하여 시험되었다. 인간 PD-L1(도 17A) 또는 mock(인간 PD-L1 음성, 도 17B) 형질감염된 CHO 세포를 항-인간 항-CD3이 코팅된 플레이트에 씨딩하였다. Pan T 세포 그리고 다양한 농도의 시험 물질을 첨가하고 2일 동안 인큐베이션 하였다. 상등액 중 분비된 IL-2의 수준은 실시예 20에서 기술된 바와 같이 전기화학발광-기반 분석에 의해 측정되었다. IL-2 분비 수준은 배경 수준(판 T 세포 + 항-CD3 + CHO 세포)으로 정규화되어 인간 PD-L1 발현 CHO 세포(도 17C) 또는 mock 형질감염된 CHO 세포(도 17D)의 존재 하에서 IL-2 수준의 배 증가를 묘사하였다. 융합 단백질은 레퍼런스 CD137 항체 단독 또는 레퍼런스 PD-L1 항체와 조합한 것 보다 더 강하게 PD-L1의 존재 하에서만 IL-2 분비에서 강한 농도-의존적 증가를 유도한다.
도 18은 실시예 21에서 기술된 바와 같이, 마우스에서 이중특이적인 융합 단백질 및 빌딩 블록 PD-L1 항체(SEQ ID NOs: 86 및 87)의 약동학적 분석 결과를 제공한다. 수컷 CD-1 마우스(시간대 별로 3 마리)에 10 mg/kg의 용량으로 융합 단백질을 정맥주사하였다. 약물 수준은 표적 PD-L1 및 CD137을 통해 전체 분자를 검출하는 샌드위치 ELISA를 이용하여 검출하였다. 항-PD-L1 항체 혈장 수준은 표적 PD-L1 및 인간 Fc를 이용하여 샌드위치 ELISA를 이용하여 측정하였다.
도 19는 실시예 22에서 기술된 바와 같이 마우스에서 이전에 기술된 2개의 CD137- 및 PD-L1-결합 융합 단백질(SEQ ID NO: 147 및 SEQ ID NO: 148)과 비교하여 대표적인 융합 단백질(SEQ ID NOs: 90 및 87)의 약동학적 분석 결과를 제공한다. 수컷 CD-1 마우스(시간대 별로 2 마리)에 2 mg/kg의 용량으로 시험 물질을 정맥주사하였다. 약물 수준은 지정된 시간 대에서 ELISA를 사용하여 검출하였다. 데이터는 시간 대 농도 그래프로 나타내었다. SEQ ID NO: 147 또는 SEQ ID NO: 148은 제외하고 본 명세서에서 기술된 SEQ ID NOs: 90 및 87은 유리한 약동학적 프로파일 또는 항체와 유사한 약동학을 나타낸다.

본 명세서에서 기술된 바와 같이, 본 개시물은 항체와 같은 2가의 CD137-바인더가 T 세포 또는 NK 세포에서 클러스터 CD137에 대해 그 자체로 충분하지 않을 수 있으며, 3가의 가용성 CD137L의 활성 부족과 유사한 효과적인 활성화를 유발할 수 있다는 인식을 포함한다. 전임상 마우스 모델을 이용한 최근 간행물에서, 인 비보 증거는 다른 항-TNFR 항체의 작용 방식이 Fc-감마-수용체 발현 세포에서 Fc-감마 수용체와 그들의 Fc-부분을 통해 항체와의 상호작용을 요구한다고 제시한 바 있다(Bulliard et al., Immunol Cell Biol, 2014, Bulliard et al., J Exp Med, 2013). 따라서, 이들 항-TNFR 항체의 작용 방식은 Fc-감마-발현 세포의 존재에 따라 Fc-감마 수용체를 통한 표적 없는 클러스터링이 지배적일 수 있으며, 이는 정상 조직과 비교하여 표적으로 삼은 종양 미세환경에서 반드시 과발현되지 않을 수 있다.

따라서, 특이적인 종양 표적 작용 방식으로 CD137을 클러스터링하고 활성화하는 치료제의 생산에 대한 충족되지 않는 요구가 있다.

이 충족되지 않는 요구를 충족시키기 위해, 본 개시물은 무엇보다도 CD137에 대한 결합 특이성 및 PD-L1에 대한 결합 특이성을 갖는 하나 이상의 융합 단백질을 통해 CD137 및 PD-L1을 동시에 결합시키기 위한 새로운 접근법을 제공한다. 제공된 융합 단백질은 종양 미세환경에서 발현된 PD-L1을 CD137-양성 T 세포에 연결함으로써 CD137 클러스터링을 촉진하도록 설계된다. 그러한 이중특이적인 분자는 항-PD-L1 매개된 면역 체크포인트 억제를 CD137에 의해 유도된 T 세포 활성화 및 확장과 연합할 수 있어 단일 약제 치료법의 특정 한계를 극복하고, 예를 들어 내성 또는 비-반응성 환자들에게 잇점을 제공할 수 있다. 융합 단백질은 또한 하나의 분자에서 병용요법의 잠재력을 제공하고, 동시에 종양 미세환경에서 항원-특이적인 T 세포의 국소화 유도를 허용하여 잠재적으로 말초 독성을 줄이도록 설계된다.

일부 양태에서, 본 개시물은 CD137 및 PD-L1과 결합하는 융합 단백질, 그리고 이의 제조방법 및 유용한 적용을 제공한다. 본 개시물은 또한 본 명세서에서 기술된 CD137 및 PD-L1 결합 융합 단백질의 제조방법 그리고 그러한 단백질을 포함하는 조성물을 제공한다. 본 개시물의 CD137 및 PD-L1 결합 융합 단백질 그리고 이의 조성물은 샘플에서 CD137 및/또는 PD-L1을 검출하는 방법, 대상체에서 CD137 및/또는 PD-L1의 결합 방법, 또는 대상체에서 면역 반응 조절 방법에서 사용될 수 있다. 본 개시물에 의해 제공된 용도에 수반하는 이들 특징들을 갖는 그러한 융합 단백질이 이전에는 기술된 바 없었다. 본 명세서에서 제공된 융합 단백질과는 대조적으로, CD137 및 PD-L1 둘 다를 표적으로 하는 이전에 공지된 융합 단백질은 하나 이상의 빈약한 약동학, 허용치를 벗어난 정도의 표적외 결합, 특정 융합 단백질의 하나 또는 두 개의 표적들(예를 들어, PD-L1 및/또는 CD137)과 결합하는 능력이 감소되거나 그렇지 않으면 분해되고, 및/또는 예를 들어 면역계의 허용치를 벗어난 정도의 비-특이적인(예를 들어, PD-L1 독립적인) 활성화를 겪었다.

A. 본 개시물의 CD137 및 PD-L1에 특이적인 예시 융합 단백질

일부 구체예에서, 제공된 융합 단백질은 적어도 두 개의 서브유닛을 임의의 순서로 포함한다: (1) PD-L1에 특이적인 전장 면역글로불린 또는 이의 항원-결합 도메인을 포함하는 제1 서브유닛 및 (2) CD137에 특이적인 리포칼린 뮤테인을 포함하는 제2 서브유닛.

일부 구체예에서, 제공된 융합 단백질은 또한 적어도 하나의 부가적인 서브유닛, 예를 들어, 제3 서브유닛을 포함할 수 있다. 예를 들어, 융합 단백질은 CD137에 특이적인 제3 서브유닛을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 제3 서브유닛은 CD137에 특이적인 리포칼린 뮤테인이거나 또는 이를 포함할 수 있다. 예를 들어, 두 개의 리포칼린 뮤테인은 제1 면역글로불린 서브유닛에 대해 하나는 C-말단에서 그리고 하나는 면역글로불린의 N-말단에서 융합될 수 있다. 일부 구체예에서, 리포칼린 뮤테인은 면역글로불린의 중쇄 또는 경쇄에 융합될 수 있다.

일부 구체예에서, 제공된 융합 단백질은 하나 이상의 부가적인 서브유닛(예를 들어, 제4, 제5 또는 제6 서브유닛)을 포함할 수 있다.

일부 구체예에서, 적어도 하나의 서브유닛은 이의 N-말단 및/또는 이의 C-말단에서 다른 서브유닛에 융합될 수 있다.

일부 구체예에서, 적어도 하나의 서브유닛은 링커를 통해 다른 서브유닛에 연결될 수 있다. 일부 또 다른 구체예에서, 링커는 펩타이드 링커, 예를 들어, 비-구조적인 글리신-세린(GS) 링커, 글리코실화 된 GS 링커, 또는 프롤린-알라닌-세린 중합체(PAS) 링커이다. 일부 구체예에서, GS 링커는 SEQ ID NO: 13에 도시된 바와 같은 (Gly₄Ser)₃ 링커((G₄S)₃)이다. 다른 예시 링커들은 SEQ ID NOs: 14-23에 도시된다. 일부 구체예에서, 펩타이드 링커는 1 내지 50 아미노산, 예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50 아미노산을 가질 수 있다. 예를 들어, 제1 서브유닛이 전장 면역글로불린을 포함하는 경우, 제2 서브유닛은 제2 서브유닛의 N-말단 및 상기 면역글로불린의 중쇄 불변 영역(CH)의 C-말단 사이에서 펩타이드 링커를 통해 연결될 수 있다. 일부 또 다른 구체예에서, 제3 서브유닛은 제3 서브유닛의 N-말단 및 상기 면역글로불린의 경쇄 불변 영역(CL)의 C-말단 사이에서 펩타이드 링커를 통해 연결될 수 있다.

일부 구체예에서, 하나의 서브유닛은 도 1에서 본질적으로 기술된 바와 같이 다른 서브유닛에 연결될 수 있다. 일반적으로, 하나의 서브유닛은 이의 N-말단 및/또는 이의 C-말단에서 다른 서브유닛에 융합될 수 있다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 리포칼린 뮤테인 서브유닛은 이의 N-말단 및/또는 이의 C-말단에서 면역글로불린 서브유닛에 융합될 수 있다. 또 다른 예시에서, 하나의 리포칼린 뮤테인은 바람직하게는 펩타이드 결합을 통해 면역글로불린 중쇄 도메인(HC)의 C-말단, HC의 N-말단, 면역글로불린 경쇄(LC)의 C-말단 및/또는 LC의 N-말단에 연결될 수 있다(도 1A-1D).

일부 구체예에서, 리포칼린 뮤테인 서브유닛은 이의 N-말단 및/또는 이의 C-말단에서 면역글로불린 단편에 융합될 수 있다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 리포칼린 뮤테인은 바람직하게는 펩타이드 링커를 통해 중쇄 불변 영역(CH)의 C-말단 또는 면역글로불린의 경쇄 불변 영역(CL)의 C-말단에서 연결될 수 있다.

일부 구체예에서, 하나의 서브유닛이 전장 면역글로불린을 포함하는 경우, 제2 서브유닛은 제2 서브유닛의 N-말단 및 상기 면역글로불린의 중쇄 불변 영역(CH)의 C-말단 사이에서 연결될 수 있다.

일부 구체예에서, 제3 서브유닛은 제3 서브유닛의 N-말단 및 상기 면역글로불린의 경쇄 불변 영역(CL)의 C-말단 사이에서 연결될 수 있다.

일부 구체예에서, 본 개시물의 융합 단백질과 관련하여, 적어도 하나의 서브유닛은 전장 면역글로불린이거나 또는 이를 포함할 수 있으며, Fc 수용체-양성 세포에 대한 전장 면역글로불린의 Fc 영역의 Fc 기능은 동시에 보존되는 한편, 융합 단백질은 CD137 및 PD-L1과 동시에 결합한다.

일부 구체예에서, 제공된 융합 단백질의 적어도 하나의 서브유닛은 전장 면역글로불린이거나 또는 이를 포함할 수 있으며, Fc 수용체-양성 세포에 대한 전장 면역글로불린의 Fc 영역의 Fc 기능은 단백질 조작에 의해 감소 또는 완전히 억제되는 한편, 융합 단백질은 CD137 및 PD-L1과 동시에 결합한다. 일부 구체예에서, 이것은 예를 들어 IgG4가 IgG1과 비교하여 감소된 Fc-감마 수용체 상호작용을 나타내는 것으로 알려져 있으므로 IgG1 백본에서 IgG4로 전환함으로써 달성될 수 있다. 일부 구체예에서, Fc-감마 수용체와의 잔여 결합을 추가로 감소시키기 위해, IgG4 백본에 F234A 및 L235A와 같은 돌연변이가 도입될 수 있다. 일부 구체예에서, IgG4 반-항체의 교환을 최소화하기 위해 IgG4 백본에 S228P 돌연변이가 또한 도입될 수 있다(Silva et al., J Biol Chem, 2015). 일부 구체예에서, 감소된 ADCC 및 ADCP를 위해(Glaesner et al., Diabetes Metab Res Rev, 2010) F234A 및 L235A 돌연변이 및/또는 연장된 혈청 반감기를 위해(Dall'Acqua et al., J Biol Chem, 2006, Zalevsky et al., Nat Biotechnol, 2010) M428L 및 N434S 돌연변이 또는 M252Y, S254T, 및 T256E 돌연변이가 도입될 수 있다. 일부 구체예에서, 부가적인 N297A 돌연변이는 천연 글리코실화 모티프를 제거하기 위해 융합 단백질의 면역글로불린 중쇄에 존재할 수 있다.

일부 구체예에서, 본 개시물의 융합 단백질에 포함된 면역글로불린의 Fc 부분은 융합 단백질의 혈청 수준을 유지하는데 기여할 수 있다. 예를 들어, Fc 부분이 내피세포 및 식세포의 Fc 수용체에 결합하는 경우, 융합 단백질은 생체 내 이의 반감기를 향상시키면서 혈류로 내재화 및 재순환될 수 있다.

일 양태에서, 본 개시물의 융합 단백질은 높은 친화성으로 CD137과 결합한다. 다른 양태에서, 제공된 융합 단백질은 높은 친화성으로 PD-L1과 결합한다. 일부 바람직한 구체예에서, 제공된 융합 단백질은 CD137 및 PD-L1과 동시에 결합한다. 일부 구체예에서, CD137 및 PD-L1과의 동시 결합은 제공된 융합 단백질이 장기간 항-종양 또는 항-감염 반응을 나타내도록 한다.

일부 구체예에서, 본 개시물의 융합 단백질은 PD-L1과 최대 약 2 nM 이하, 예컨대 약 1.5 nM 이하, 약 1 nM 이하, 약 0.6 nM 이하, 또는 약 0.4 nM 이하의 K_D 값으로 결합할 수 있다. 일부 구체예에서, 본 개시물의 융합 단백질은 SEQ ID NOs: 86 및 87에 의해 제공된 중쇄 및 경쇄를 갖는 항체와 같은 그러한 융합 단백질에 포함되는 경우 PD-L1에 특이적인 면역글로불린의 K_D 값에 필적하거나 또는 더 낮은 K_D 값으로 PD-L1과 결합할 수 있다. 제공된 융합 단백질의 K_D 값은 예를 들어 실시예 3에서 본질적으로 기술된 바와 같은 SPR 분석과 같이 표면-플라즈몬-공명(SPR) 분석에서 측정될 수 있다.

일부 구체예에서, 본 개시물의 융합 단백질은 최대 약 10 nM 이하, 예컨대, 약 7 nM, 약 6 nM, 또는 약 5 nM, 약 4 nM, 약 3 nM, 약 2 nM 이하의 K_D 값으로 CD137과 결합할 수 있다. 일부 구체예에서, 본 개시물의 융합 단백질은 특정 융합 단백질, 예컨대 SEQ ID NO: 42 또는 항체의 Fc 영역에 융합된 리포칼린 뮤테인, 예컨대, SEQ ID NO: 89에 포함된 CD137에 특이적인 리포칼린 뮤테인의 K_D값에 필적하거나 또는 더 낮은 K_D 값으로 CD137과 결합할 수 있다. 제공된 융합 단백질의 K_D 값은 실시예 3에서 본질적으로 기술된 바와 같은 SPR 분석과 같은 SPR 분석에서 측정될 수 있다.

일부 구체예에서, 본 개시물의 융합 단백질은 최대 약 0.5 nM 이하, 예컨대 약 0.3 nM 이하, 약 0.2 nM 이하, 약 0.15 nM 이하 또는 약 0.1 nM 이하의 EC₅₀값으로 PD-L1과 결합할 수 있다. 일부 구체예에서, 본 개시물의 융합 단백질은 특정 융합 단백질, 예컨대 SEQ ID NOs: 86 및 87에 의해 제공된 중쇄 및 경쇄를 갖는 항체에 포함된 PD-L1에 특이적인 면역글로불린의 EC₅₀에 필적할만 하거나 또는 더 낮은 EC₅₀값으로 PD-L1과 결합할 수 있다. 제공된 융합 단백질의 EC₅₀ 값은 실시예 4에서 본질적으로 기술된 바와 같은 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 분석과 같은 ELISA 분석에서 측정될 수 있다.

일부 구체예에서, 본 개시물의 융합 단백질은 최대 약 0.6 nM 이하, 예컨대 약 0.5 nM 이하, 약 0.2 nM 이하, 약 0.15 nM 이하, 또는 약 0.1 nM 이하의 EC₅₀ 값으로 CD137과 결합할 수 있다. 일부 구체예에서, 본 개시물의 융합 단백질은 특정 융합 단백질, 예컨대 SEQ ID NO: 42, 또는 항체의 Fc 영역에 융합된 리포칼린 뮤테인, 예컨대 SEQ ID NO: 89에 포함된 CD137에 특이적인 리포칼린 뮤테인의 EC₅₀ 값에 필적할만하거나 또는 더 낮은 EC₅₀ 값으로 CD137과 결합할 수 있다. 제공된 융합 단백질의 EC₅₀값은 예를 들어 실시예 4에서 본질적으로 기술된 바와 같은 ELISA 분석과 같은 ELISA 분석에서 측정될 수 있다.

일부 구체예에서, 본 개시물의 융합 단백질은 시아노몰거스의 PD-L1과 교차-반응한다. 일부 구체예에서, 제공된 융합 단백질은 최대 약 0.5 nM 이하, 예컨대 약 0.2 nM 이하, 약 0.1 nM 이하, 또는 약 0.05 nM 이하의 EC₅₀ 값으로 시아노몰거스의 PD-L1과 결합할 수 있다. 제공된 융합 단백질의 EC₅₀ 값은 예를 들어 실시예 4에서 본질적으로 기술된 바와 같은 ELISA 분석과 같은 ELISA 분석에서 측정될 수 있다.

일부 구체예에서, 본 개시물의 융합 단백질은 시아노몰거스의 CD137과 교차-반응한다. 일부 구체예에서, 제공된 융합 단백질은 최대 약 15 nM 이하, 예컨대, 약 10 nM 이하, 약 8 nM 이하, 약 6 nM 이하, 약 3 nM 이하, 약 1 nM 이하, 약 0.5 nM 이하, 약 3 nM 이하, 또는 약 0.1 nM 이하의 EC₅₀ 값으로 시아노몰거스의 CD137과 결합할 수 있다. 제공된 융합 단백질의 EC₅₀ 값은 예를 들어 실시예 4에서 본질적으로 기술된 바와 같은 ELISA 분석과 같은 ELISA 분석에서 측정될 수 있다. 일부 구체예에서, 제공된 융합 단백질의 시아노몰거스의 CD137과의 결합은 실시예 22에서 기술된 바와 같은 친화력 효과에 의해 향상될 수 있다.

일부 구체예에서, 본 개시물의 융합 단백질은 CD137 및 PD-L1과 동시에 결합할 수 있다. 일부 구체예에서, 제공된 융합 단백질은 최대 약 1 nM 이하, 예컨대 0.8 nM 이하, 0.6 nM 이하, 또는 0.4 nM 이하의 EC₅₀값으로 CD137 및 PD-L1과 동시에 결합할 수 있다. 일부 다른 구체예에서, 제공된 융합 단백질은 최대 약 10 nM 이하, 예컨대, 8 nM 이하, 6 nM 이하, 3 nM 이하, 또는 2 nM 이하의 EC₅₀ 값으로 CD137 및 PD-L1과 동시에 결합할 수 있다. 동시 결합은 예를 들어 실시예 5에서 본질적으로 기술된 바와 같은 ELISA 분석과 같은 ELISA 분석에서 측정될 수 있다.

일부 구체예에서, 본 개시물의 융합 단백질은 최대 약 60 nM 이하, 예컨대 약 50 nM 이하, 약 40 nM 이하, 약 30 nM 이하, 약 10 nM 이하, 약 7 nM 이하, 약 5 nM 이하, 약 3 nM 이하, 또는 약 1 nM 이하의 EC₅₀값으로 세포상에 발현된 CD137과 결합할 수 있다. 제공된 융합 단백질의 EC₅₀ 값은 예를 들어 실시예 6에서 본질적으로 기술된 바와 같은 플로우 사이토메트리 분석에서 측정될 수 있다. CD137을 발현하는 세포는 예를 들어 인간 CD137 또는 시아노몰거스의 CD137로 형질감염된 CHO 세포일 수 있다.

일부 구체예에서, 본 개시물의 융합 단백질은 최대 약 10 nM 이하, 예컨대 약 8 nM 이하, 약 6 nM 이하, 약 4 nM 이하, 약 2 nM 이하, 또는 1 nM 이하의 EC₅₀ 값으로 세포상에서 발현된 PD-L1과 결합할 수 있다. 제공된 융합 단백질의 EC₅₀ 값은 예를 들어 실시예 6에서 본질적으로 기술된 바와 같은 플로우 사이토메트리 분석에서 측정될 수 있다. PD-L1을 발현하는 세포는 예를 들어 인간 PD-L1 또는 시아노몰거스의 PD-L1으로 형질감염된 CHO 세포일 수 있다.

일부 구체예에서, 본 개시물의 융합 단백질은 종양 세포 상에서 발현되는 PD-L1과 결합할 수 있다. 일부 구체예에서, 제공된 융합 단백질은 최대 약 2 nM 이하, 예컨대 약 1.5 nM 이하, 약 1 nM 이하, 약 0.6 nM 이하 또는 0.3 nM 이하의 EC₅₀ 값으로 종양 세포 상에서 발현된 PD-L2과 결합할 수 있다. PD-L1을 발현하는 종양 세포와 결합하는 융합 단백질의 EC₅₀ 값은 예를 들어 실시예 7에서 본질적으로 기술된 바와 같은 플로우 사이토메트리 분석에서 측정될 수 있다. PD-L1을 발현하는 종양 세포는 예를 들어 RKO 세포일 수 있다.

일부 구체예에서, 본 개시물의 융합 단백질은 CD137L에 대한 CD137의 결합에 본질적으로 영향을 주지 않는다. 일부 구체예에서, 본 개시물의 융합 단백질은 CD137L과 복합체로 있을 때 CD137과 결합할 수 있다. 일부 구체예에서, 본 개시물의 융합 단백질은 SEQ ID NO: 28 및 29에 의해 제공된 중쇄 및 경쇄를 갖는 항-CD137 항체와 유사한 방식으로 CD137과 결합할 수 있다. 융합 단백질의 CD137과의 결합 방식은 예를 들어 실시예 8에서 본질적으로 기술된 바와 같은 SPR 분석과 같은 SPR 분석에 의해 측정될 수 있다.

일부 구체예에서, 본 개시물의 융합 단백질은 PD-L1과의 결합을 위해 PD-1과 경쟁할 수 있다. 일부 구체예에서, 제공된 융합 단백질은 PD-L1과의 결합을 위해 최대 약 5 nM 이하, 예컨대 약 3 nM 이하, 약 2 nM 이하 또는 약 1 nM 이하의 IC₅₀ 값으로 PD-1과 경쟁할 수 있다. 억제 작용 방식은 예를 들어 실시예 9에서 본질적으로 기술된 바와 같은 ELISA 분석과 같은 ELISA 분석에 의해 측정될 수 있다.

일부 구체예에서, 본 개시물의 융합 단백질은 CD137과의 결합을 위해 SEQ ID NOs: 28 및 29에 도시된 항-CD137 항체와 경쟁할 수 있다. 그러한 경쟁은 실시예 17에서 본질적으로 기술된 ELISA 분석에 의해 평가될 수 있다. 일부 구체예에서, 제공된 융합 단백질은 SEQ ID NOs: 28 및 29에 도시된 항-CD137 항체와 중첩되는 에피토프를 가질 수 있다.

일부 구체예에서, 본 개시물의 융합 단백질은 T-세포 반응을 보조-자극할 수 있다. 일부 구체예에서, 제공된 융합 단백질은 빌딩 블록 PD-L1 항체 SEQ ID NOs: 86 및 87 또는 레퍼런스 PD-L1 항체 SEQ ID NOs: 26 및 27과 같은 PD-L1 항체, 또는 레퍼런스 항체 SEQ ID NOs: 28 및 29와 같은 CD137 항체와 비교하여 필적할만한 또는 더 강한 T-세포 활성화를 유도한다. 일부 구체예에서, 제공된 융합 단백질은 항-PD-L1 항체 및 항-CD137 항체 또는 이전에 공지된 CD137-특이적인 리포칼린 뮤테인과 같은 CD137-표적 분자의 조합과 비교하여 필적할만한 또는 더 나은 효능으로 T-세포 활성화를 유도한다. 자극된 T-세포 반응 또는 T-세포 활성화는 예를 들어 실시예 10에서 본질적으로 기술된 바와 같은 CD137 생물학적 검정에서, 실시예 18에서 기술된 바와 같은 PD-1/PD-L1 억제 생물학적 검정, 또는 실시예 11, 실시예 12, 실시예 19 및 실시예 20에서 본질적으로 기술된 바와 같은 기능적 T-세포 활성화 분석에서 측정될 수 있다.

일부 구체예에서, 본 개시물의 융합 단백질은 증가된 IL-2 분비를 유도할 수 있다. 일부 바람직한 구체예에서, 제공된 융합 단백질은 농도-의존적 IL-2 분비를 유도하고 및/또는 더 높은 농도, 바람직하게는 코팅 농도에서 향상된 IL-2 분비를 유도하는 경향을 입증할 수 있다. 일부 구체예에서, 제공된 융합 단백질은 항-PD-L1 항체 및 항-CD137 항체 또는 이전에 공지된 CD137-특이 리포칼린 뮤테인과 같은 CD13-표적 분자의 조합과 비교하여 필적할만한 또는 더 나은 효능으로 증가된 IL-2 분비를 유도할 수 있다. IL-2 분비는 예를 들어 실시예 11 및 실시예 19에서 본질적으로 기술된 바와 같은 기능적 T-세포 활성화 분석에서 측정될 수 있다.

일부 구체예에서, 본 개시물의 융합 단백질은 PD-L1 의존적 방식으로 T-세포 반응을 보조-자극할 수 있다. 일부 구체예에서, 제공된 융합 단백질은 PD-L1-양성세포, 예컨대 PD-L1 형질감염된 세포 또는 PD-L1 양성 종양 세포의 주변에서 T-세포에 의한 IL-2 생산의 국소 유도를 유발할 수 있다. "PD-L1-양성 세포의 주변에서"는 본 명세서에서 사용되는 경우 CD137 및 PD-1과 동시에 결합하는 제공된 융합 단백질을 통해 서로 근접하게 되는 T-세포 및 PD-L1-양성 세포를 지칭한다. 제공된 융합 단백질에 의한 T-세포의 PD-L1 의존적 활성화는 예를 들어 실시예 10에서 본질적으로 기술된 CD137 생물학적 검정에서, 실시예 18에서 본질적으로 기술된 PD-1/PD-L1 억제 생물학적 검정에서, 또는 실시예 12 및 실시예 20에서 본질적으로 기술된 기능적 T-세포 활성화 분석에서 측정될 수 있다.

일부 바람직한 구체예에서, 제공된 융합 단백질은 PD-L1을 발현하는 종양 세포의 존재 하에서 및/또는 종양 미세환경에서 T-세포 반응을 보조-자극할 수 있다. 일부 구체예에서, 제공된 융합 단백질은 PD-L1-양성 종양 세포의 존재 하에서 약 1 nM 이하, 약 0.5 nM 이하, 약 0.3 nM 이하, 약 0.1 nM 이하 또는 약 0.05 nM 이하의 EC₅₀ 값으로 T-세포 반응을 보조-자극할 수 있다. PD-L1을 발현하는 종양 세포의 존재 하에서 및/또는 종양 미세환경에서 제공된 융합 단백질에 의한 T-세포 활성화는 예를 들어, 실시예 10에서 본질적으로 기술된 CD137-생물학적 검정에서, 또는 실시예 12에서 본질적으로 기술된 기능적 T-세포 활성화 분석에서 평가될 수 있다.

일부 구체예에서, 제공된 융합 단백질은 PD-L1의 부재 하에서 T-세포 반응을 보조-자극할 수 없다. 일부 구체예에서, 제공된 융합 단백질은 PD-L1 발현 세포의 부재 하에서 T-세포 반응을 보조-자극할 수 없다. 일부 구체예에서, 제공된 융합 단백질은 PD-L1의 존재를 식별할 수 있으며, SEQ ID NOs: 28 및 29에서 도시된 CD137 항체보다 더 많이 상응하는 T-세포 활성화를 유발할 수 있다. 융합 단백질의 PD-L1 의존적 방식은 예를 들어 실시예 10에서 본질적으로 기술된 CD137 생물학적 검정에서, 실시예18에서 본질적으로 기술된 PD-1/PD-L1 억제 생물학적 검정에서, 또는 실시예 12 및 실시예 20에서 본질적으로 기술된 기능적 T-세포 활성화 분석에서 측정될 수 있다.

일부 구체예에서, 제공된 융합 단백질은 PD-1의 PD-L1과의 결합에 의해 매개된 억제성 신호를 차단할 수 있다. 일부 구체예에서, 제공된 융합 단백질은 T-세포 활성화에 대한 제동을 해제하거나 또는 PD-1/PD-L1 상호작용을 차단하여 성공적인 T-세포 활성화를 유발할 수 있다. PD-1 억제성 신호의 억제는 예를 들어 실시예 18에서 기술된 바와 같은 PD-1/PD-L1 억제 생물학적 검정에서 측정될 수 있다.

일부 구체예에서, 본 개시물의 융합 단백질은 T 세포 증식 및/또는 활성화를 자극할 수 있다. 일부 구체예에서, 제공된 융합 단백질은 CD4⁺ T 세포 증식 및/또는 활성화를 자극할 수 있다. 일부 구체예에서, 제공된 융합 단백질은 IL-2 분비, 바람직하게는 농도-의존적 IL-2 분비를 유도할 수 있다. 일부 구체예에서, 제공된 융합 단백질은 항-PD-L1 항체 및 항-CD137 항체 또는 이전에 공지된 CD137-특이 리포칼린 뮤테인과 같은 CD137-표적 분자의 조합과 비교하여 더 높은 IL-2 분비를 유도할 수 있다. 본 명세서에서 사용될 때 IL-2 분비는 T-세포 활성화의 측정일 수 있다. 제공된 융합 단백질에 의해 자극된 CD4⁺ T 세포 증식 및/또는 활성화는 예를 들어 실시예 14에서 본질적으로 기술된 바와 같은 혼합된 림프구 반응(MLR) 분석에 의해 평가될 수 있다.

일부 구체예에서, 본 개시물의 융합 단백질은 CD8⁺ T 세포 증식 및/또는 활성화를 자극할 수 있다. 일부 구체예에서, 제공된 융합 단백질은 IL-2 및 퍼포린, 그랜자임 A 및 그랜자임 B와 같은 효과기 분자들의 생산을 유도할 수 있다. 일부 구체예에서, 제공된 융합 단백질은 항-PD-L1 항체 및 항-CD137 항체 또는 이전에 공지된 CD137-특이 리포칼린 뮤테인과 같은 CD137-표적 분자의 조합과 비교하여 IL-2 및 퍼포린, 그랜자임 B 및 그랜자임 A와 같은 세포독성 인자들의 증가된 생산을 유도할 수 있다. 제공된 융합 단백질에 의해 자극된 CD8⁺ T 세포 증식 및/또는 활성화는 예를 들어 실시예 15에서 본질적으로 기술된 바와 같은 MLR 분석에 의해 평가될 수 있다.

일부 구체예에서, 제공된 융합 단백질은 유리한 안정성 및 약동학 프로파일을 가진다. 일부 구체예에서, 제공된 융합 단백질은 빌딩 블록 항체 SEQ ID NOs: 86 및 87과 필적할만한 약동학 프로파일을 가진다. 일부 구체예에서, 제공된 융합 단백질은 항체와 유사한 약동학을 가진다. 일부 구체예에서, 제공된 융합 단백질은 약 200 시간 이상, 약 250 시간 이상, 약 300 시간 이상, 약 350 시간 이상, 약 400 시간 이상 또는 그 이상의 최종 반감기를 가진다. 일부 구체예에서, 제공된 융합 단백질은 SEQ ID NO: 147 보다 더 유리한 약동학 프로파일을 가진다. 일부 구체예에서, 제공된 융합 단백질은 SEQ ID NO: 148 보다 더 유리한 약동학 프로파일을 가진다. 제공된 융합 단백질의 약동학 프로파일은 실시예 21 및 실시예22에서 기술된 바와 같이 분석될 수 있다. 일부 구체예에서, 유리한 약동학 프로파일 또는 항체와 유사한 약동학은 c_max의 %이 336 시간 후 10% 이상이면 달성되는 것으로 간주될 수 있다.

일부 구체예에서, 제공된 융합 단백질은 SEQ ID NOs: 88-94 중 어느 하나에서 도시된 아미노산 서열을 포함한다.

일부 구체예에서, 제공된 융합 단백질은 SEQ ID NOs: 88-94 중 어느 하나에서 도시된 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

일부 구체예에서, 제공된 융합 단백질은 SEQ ID NOs: 90 및 87, SEQ ID NOs: 86 및 91, SEQ ID NOs: 92 및 87, SEQ ID NOs: 86 및 93, SEQ ID NOs: 94 및 87, 또는 SEQ ID NOs: 90 및 91에서 도시된 아미노산 서열을 포함한다.

일부 구체예에서, 제공된 융합 단백질은 SEQ ID NOs: 90 및 87, SEQ ID NOs: 86 및 91, SEQ ID NOs: 92 및 87, SEQ ID NOs: 86 및 93, SEQ ID NOs: 94 및 87, 또는 SEQ ID NOs: 90 및 91에서 도시된 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

B. 융합 단백질에 포함되는 예시 면역글로불린

일부 구체예에서, 제공된 융합 단백질과 관련하여, 제1 서브유닛은 PD-L1에 특이적인 전장 면역글로불린 또는 이의 항원-결합 도메인이거나 또는 이를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 면역글로불린은 예를 들어 gG1, IgG2 또는 IgG4일 수 있다. 일부 구체예에서, 면역글로불린은 IgG4이거나 또는 이를 포함한다. 일부 구체예에서, 면역글로불린은 PD-L1에 대한 단클론 항체이다.

본 개시물의 PD-L1-결합 항체의 설명적 예시들은 아테졸리주맙(atezolizumab)(MPDL3280A 또는 RG7446로도 알려짐, 상표명 Tecentriq^®), 아벨루맙(avelumab)(MSB0010718C로도 알려짐, 상표명　Bavencio^®), 더발루맙(durvalumab)(이전에 MEDI4736로도 알려짐, 상표명 Imfinzi^®) 및 BMS-936559(MDX-1105로도 알려짐), 5C10(인간화 5C10을 포함), 5F10(인간화 5F10를 포함) 및 9F6(인간화 9F6을 포함)과 같은 공지된 항체의 중쇄 가변 도메인(V_H) 및 경쇄 가변 도메인(V_L) 영역을 포함하는 PD-L1-결합 항체와 동일한 에피토프를 교차-차단하거나 또는 이에 결합하는 항원-결합 영역을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 본 개시물의 PD-L1-결합 항체는 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, BMS-936559, 5C10, 5F10 및 9F6으로 구성된 군에서 선택된 항체로부터의 3개의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR)(HCDR1, HCDR2 및 HCDR3) 및 3개의 경쇄 CDR(LCDR1, LCDR2 및 LCDR3) 중 어느 하나와 같은 항원-결합 영역을 포함할 수 있다.

일부 구체예에서, 제공된 PD-L1 항체 또는 이의 항원-결합 도메인은 SEQ ID NOs: 75-79로 구성된 군에서 선택된 중쇄 가변 영역(HCVR) 및/또는 SEQ ID NOs: 80-84로 구성된 군에서 선택된 경쇄 가변 영역(LCVR)을 가질 수 있다.

일부 구체예에서, 제공된 PD-L1 항체 또는 이의 항원-결합 도메인은 SEQ ID NOs: 85-86 중 어느 하나인 중쇄 및/또는 SEQ ID NO: 87인 경쇄를 가질 수 있다.

일부 구체예에서, 제공된 PD-L1 항체 또는 이의 항원-결합 도메인의 중쇄 및 경쇄 쌍은 각각 하기과 같은 HCVR 및 LCVR이거나 또는 이를 포함한다: SEQ ID NOs: 75 및 80, SEQ ID NOs: 76 및 81, SEQ ID NOs: 77 및 82, SEQ ID NOs: 78 및 83, 또는 SEQ ID NOs:79 및 84.

일부 구체예에서, 제공된 PD-L1 항체의 중쇄 및 경쇄 쌍은 SEQ ID NOs: 85 및 87 또는 SEQ ID NO: 86 및 87에서 도시된 바와 같은 아미노산 서열이거나 또는 이를 포함한다.

일부 구체예에서, 제공된 PD-L1 항체 또는 이의 항원-결합 도메인은 SEQ ID NOs: 75-79로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95% 적어도 97%, 적어도 98% 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖는 HCVR, 및/또는 SEQ ID NOs: 80-84로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95% 적어도 97%, 적어도 98% 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖는 LCVR을 가질 수 있다. 다른 구체예에서, 제공된 PD-L1 항체 또는 이의 항원-결합 도메인은 SEQ ID NOs: 85-86으로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95% 적어도 97%, 적어도 98% 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄, 및/또는 SEQ ID NO: 87의 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95% 적어도 97%, 적어도 98% 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄를 가질 수 있다.

일부 구체예에서, 제공된 PD-L1 항체의 중쇄 가변 영역 또는 이의 항원-결합 도메인은 하기의 서열을 갖는 3개의 CDR을 가질 수 있다: GFSLSNYD(HCDR1, SEQ ID NO: 60), IWTGGAT(HCDR2, SEQ ID NO: 61), VRDSNYRYDEPFTY(HCDR3; SEQ ID NO: 62). 일부 구체예에서, 제공된 PD-L1 항체의 중쇄 가변 영역 또는 이의 항원-결합 도메인은 하기의 서열을 갖는 3개의 CDR을 가질 수 있다: GFDIKDTY(HCDR1, SEQ ID NO: 65), IDPADGNT(HCDR2, SEQ ID NO: 66), ARGLGAWFAS(HCDR3; SEQ ID NO: 67). 일부 구체예에서 제공된 PD-L 항체의 중쇄 가변 영역 또는 이의 항원-결합 도메인은 하기의 서열을 갖는 3개의 CDR을 가질 수 있다: GFNIKDTY(HCDR1, SEQ ID NO: 70), IDPANGNT(HCDR2, SEQ ID NO: 71), SRGPPGGIGEYIYAMDY(HCDR3; SEQ ID NO: 72).

일부 구체예에서, 제공된 PD-L1 항체의 경쇄 가변 영역 또는 이의 항원-결합 도메인은 하기의 서열을 갖는 3개의 CDR을 가질 수 있다: QSIGTN(LCDR1, SEQ ID NO: 63), YAS(LCDR2), QQSNSWPYT(LCDR3; SEQ ID NO: 64). 일부 구체예에서, 제공된 PD-L1 항체의 경쇄 가변 영역 또는 이의 항원-결합 도메인은 하기의 서열을 갖는 3개의 CDR을 가질 수 있다: QDITNS(LCDR1, SEQ ID NO: 68), YTS(LCDR2), QQGHTLPPT(LCDR3; SEQ ID NO: 69). 일부 구체예에서, 제공된 PD-L1 항체의 경쇄 가변 영역 또는 이의 항원-결합 도메인은 하기의 서열을 갖는 3개의 CDR을 가질 수 있다: SSVSSSY(LCDR1, SEQ ID NO: 73), STS(LCDR2), HQYHRSPPT(LCDR3; SEQ ID NO: 74).

일부 구체예에서, 제공된 PD-L1 항체 또는 이의 항원-결합 도메인은 하기의 서열을 갖는 3개의 CDR을 갖는 중쇄 가변 영역[GFSLSNYD(HCDR1, SEQ ID NO: 60), IWTGGAT(HCDR2, SEQ ID NO: 61), VRDSNYRYDEPFTY(HCDR3; SEQ ID NO: 62)] 및 하기의 서열을 갖는 3개의 CDR을 갖는 경쇄 가변 영역[QSIGTN(LCDR1, SEQ ID NO: 63), YAS(LCDR2), QQSNSWPYT(LCDR3; SEQ ID NO: 64)]을 포함한다. 일부 구체예에서, 제공된 PD-L1 항체 또는 이의 항원-결합 도메인은 하기의 서열을 갖는 3개의 CDR을 갖는 중쇄 가변 영역[GFDIKDTY(HCDR1, SEQ ID NO: 65), IDPADGNT(HCDR2, SEQ ID NO: 66), ARGLGAWFAS(HCDR3; SEQ ID NO: 67)] 및 하기의 서열을 갖는 3개의 CDR을 갖는 경쇄 가변 영역[QDITNS(LCDR1, SEQ ID NO: 68), YTS(LCDR2), QQGHTLPPT(LCDR3; SEQ ID NO: 69)]을 포함한다. 일부 구체예에서, 제공된 PD-L1 항체 또는 이의 항원-결합 도메인은 하기의 서열을 갖는 3개의 CDR을 갖는 중쇄 가변 영역[GFNIKDTY(HCDR1, SEQ ID NO: 70), IDPANGNT(HCDR2, SEQ ID NO: 71), SRGPPGGIGEYIYAMDY(HCDR3; SEQ ID NO: 72)] 및 하기의 서열을 갖는 3개의 CDR을 갖는 경쇄 가변 영역[SSVSSSY(LCDR1, SEQ ID NO: 73), STS(LCDR2), HQYHRSPPT(LCDR3; SEQ ID NO: 74)]을 포함한다.

달리 명시되지 않는 한, 본 명세서에서 기술된 모든 CDR 서열은 Lefranc, M.-P., The Immunologist, 7, 132-136(1999)에서 기술된 바와 같은 IMGT 방법에 따라 정의된다. CDR1은 27 내지 38 위치로 구성되고, CDR2는 56 내지 65 위치로 구성되며, 생식세포 V-유전자를 위한 CDR3은 105 내지 116 위치로 구성되고, 재배열된 V-J-유전자 또는 V-D-J-유전자를 위한 CDR3은 13 미만의 아미노산을 갖는 재배열된 CDR3-IMGT를 위한 루프의 꼭대기에 갭을 갖거나, 또는 13 이상의 아미노산을 갖는 재배열된 CDR3-IMGT를 위한 추가 위치 112.1, 111.1, 112.2, 111.2 등을 갖는 105 내지 117 위치(이전의 J-PHE 또는 J-TRP 118 위치)로 구성된다. 이 단락에서 제공된 위치들은 Lefranc, M.-P., The Immunologist, 7, 132-136(1999)에 기술된 IMGT 넘버링에 따른다.

본 개시물의 융합 단백질에 포함되는 PD-L1에 특이적으로 결합하는 항체들은 본 개시물의 이중특이적인 결합 분자의 인 비보 반감기를 연장할 수 있게 하는 Fc 부분을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 그러한 Fc 부분은 바람직하게는 인간 기원, 보다 바람직하게는 IgG1 또는 IgG4 항체의 인간 Fc 부분, 훨씬 더 바람직하게는 효과기 기능을 활성화 또는 침묵시키는 IgG1 또는 IgG4의 조작된 인간 Fc 부분에서 유래된다. 일부 구체예에서, 효과기 기능을 침묵시키는 것이 효과기 기능을 활성화시키는 것보다 바람직할 수 있다. 일부 구체예에서, 그러한 Fc 부분은 효과기 기능을 침묵시키기 위해 Kabat EU 지수에 따른 넘버링인 234 및/또는 235 위치에서 돌연변이(들)로 조작된다(Johnson and Wu, Nucleic Acids Res, 2000). 일부 구체예에서, 제공된 항-PD-L1 항체의 F234 및 L235 위치에서 돌연변이가 도입되어 효과기 기능을 침묵시킬 수 있다. 다른 구체예에서, 제공된 항-PD-L1 항체의 D265 및 P329 위치에서 돌연변이가 도입되어 효과기 기능을 침묵시킬 수 있다. 이들 잠재적 돌연변이의 두 세트에 대한 넘버링은 Kabat의 EU 지수를 따른다(Shields et al., J Biol Chem, 2001).

항체 및 이의 단편을 생산하기 위한 다양한 기술은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 Altshuler et al.(2010)에서 기술된다. 따라서, 예를 들어, 다클론 항체는 동물의 혈액을 첨가제 및 어쥬번트와 함께 혼합물로 항원과 함께 면역화시켜 얻을 수 있으며, 단클론 항체는 세포주 연속 배양에 의해 생산된 항체를 제공하는 임의의 기술에 의해 생산될 수 있다. 그러한 기술의 예시는 예를 들어, Harlow and Lane(1999),(1988)에서 기술되며, Kohler and Milstein, 1975에 의해 원천적으로 기술된 하이브리도마 기술, 트리오마 기술, 인간 B 세포 하이브리도마 기술(예를 들어, Li et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 2006, Kozbor and Roder, Immunol Today, 1983 참조) 및 인간 단클론 항체를 생산하기 위한 EBV-하이브리도마 기술(Cole et al., Cancer Res, 1984)을 포함한다. 더욱이, 재조합 항체들은 단클론 항체들로부터 얻거나 또는 파지, 리보좀, mRNA 또는 세포 디스플레이와 같은 다양한 디스플레이 방법을 이용하여 드 노보에서 제조될 수 있다. 일부 구체예에서, 재조합(인간화) 항체 또는 이의 단편을 발현하기 위한 적당한 시스템은 예를 들어, 세균, 효모, 곤충, 포유동물 세포주 또는 형질전환 동물 또는 식물(예를 들어, 미국 특허 제6,080,560호; Holliger and Hudson, Nat Biotechnol, 2005 참조)로부터 선택될 수 있다. 추가로, 단일쇄 항체를 생산하기 위해 기술된 기술들(특히 미국 특허 제4,946,778호 참조)은 이 발명의 표적에 특이적인 단일쇄 항체를 생산하기 위해 적용될 수 있다. BIAcore 시스템에서 사용된 표면 플라즈몬 공명을 이용하여 파지 항체들의 효율을 증가시켰다.

C. 본 개시물의 예시 리포칼린 뮤테인

리포칼린은 리간드와 결합하는 자연적으로 진화된 단백질계 결합 분자이다. 리포칼린은 척추동물, 곤충, 식물 및 세균을 포함한 많은 생물에서 나타난다. 리포칼린 단백질 패밀리의 구성원(Pervaiz and Brew, FASEB J, 1987)은 전형적으로 작은 분비 단백질이며, 단일 폴리펩타이드 사슬을 갖는다. 그들은 상이한 분자-인식 특성이 특징이다: 다양한, 주로 소수성 저분자(예컨대, 레티노이드, 지방산, 콜레스테롤, 프로스타글란딘, 빌리베르딘, 페로몬, 미각원(tastant) 및 방취제)와의 결합, 세포 표면 수용체에 특이적으로 결합 및 거대분자 복합체의 형성. 과거에는 그들이 주로 수송 단백질로 분류되었지만, 지금은 리포칼린이 다양한 생리학적 기능들을 수행함이 명백하다. 여기에는 레티놀 수송, 후각, 페로몬 신호전달 및 프로스타글란딘의 합성이 포함된다. 리포칼린은 또한 면역 반응 조절 및 세포 항상성 매개와 관련이 있다(예를 들어, Flower et al., Biochim Biophys Acta, 2000, Flower, Biochem J, 1996에서 검토됨).

리포칼린은 전체 서열 보존이 보통 20% 미만의 서열 동일성으로 매우 낮은 수준을 공유한다. 대조적으로 그들의 전체 폴딩 패턴은 매우 보존되어 있다. 리포칼린 구조의 중앙 부분은 그 자체로 닫힌 8-가닥의 역-평행 β-시트로 구성되어 연속적으로 수소-결합된 파이-배럴을 형성한다. 이 파이-배럴은 중앙 공동을 형성한다. 배럴의 일 말단은 바닥을 가로지르는 N-말단 펩타이드 세그먼트 그리고 β-가닥을 연결하는 3개의 펩타이드 루프에 의해 입체적으로 차단되어 있다. 파이 배럴의 다른 말단은 용매에 열리며, 4개의 유연한 펩타이드 루프(AB, CD, EF, 및 GH)에 의해 형성된 표적-결합 부위를 포함한다. 이것은 상이한 크기, 형상 및 화학적 특성의 표적을 수용할 수 있는 다양한 서로 다른 결합 모드를 각각 발생시키는 다른 견고한 리포칼린 스캐폴드에서의 루프의 다양성이다(예를 들어, Skerra, Biochim Biophys Acta, 2000, Flower et al., Biochim Biophys Acta, 2000, Flower, Biochem J, 1996에서 검토됨).

본 개시물에 따른 리포칼린 뮤테인은 임의의 리포칼린의 뮤테인일 수 있다. 뮤테인이 사용될 수 있는 적당한 리포칼린의 예시(때때로 "레퍼런스 리포칼린", "야생형 리포칼린", "레퍼런스 단백질 스캐폴드" 또는 간단히 "스캐폴드"로도 불림)는 눈물 리포칼린(리포칼린-1, Tlc, 또는 폰 에브너 샘 단백질), 레티놀 결합 단백질, 호중구 리포칼린-형 프로스타글란딘 D-합성효소(neutrophil lipocalin-type prostaglandin D-synthase), β-락토글로불린, 빌린-결합 단백질(bilin-binding protein, BBP), 아포리포프로테인 D(APOD), 호중구 젤라티네이즈-관련 리포칼린(neutrophil gelatinase-associated lipocalin, NGAL), α2-마이크로글로불린-관련단백질(α2-microglobulin-related protein, A2m), 24p3/유테로칼린(24p3/uterocalin, 24p3), 반 에브너 샘 단백질 1(von Ebner's gland protein 1(VEGP 1) 및 Major allergen Can f 1(ALL-1)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 관련된 구체예에서, 리포칼린 뮤테인은 인간 눈물 리포칼린(hTlc), 인간 호중구 젤라티네이즈-관련 리포칼린(hNGAL), 인간 아포리포칼린 D(hAPOD) 및 피에리스 브라시캐(Pieris brassicae)의 빌린-결합 단백질로 구성된 리포칼린 그룹에서 유래된다.

본 개시물에 따른 리포칼린 뮤테인의 아미노산 서열은 다른 리포칼린과 서열 동일성을 비교할 때(또한 상기 참조), 예를 들어, hTlc 또는 hNGAL에서 유래된 레퍼런스(또는 야생형) 리포칼린과 비교하여 높은 서열 동일성을 가질 수 있다. 이 일반적인 맥락에서, 본 개시물에 따른 리포칼린 뮤테인의 아미노산 서열은 상응하는 레퍼런스(야생형) 리포칼린의 아미노산 서열과 적어도 실질적으로 유사하며, 단, 아미노산의 부가 또는 결실의 결과인 정렬에서 갭(본 명세서에서 정의된 바와 같은)이 있을 수 있다. 상응하는 레퍼런스(야생형) 리포칼린의 서열과 실질적으로 유사한 본 개시물의 리포칼린 뮤테인의 각 서열은 일부 구체예에서 상응하는 리포칼린의 서열과 적어도 95% 동일성을 포함하여 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 82%, 적어도 85%, 적어도 87%, 적어도 90% 동일성을 갖는다. 이와 관련하여, 본 개시물의 리포칼린 뮤테인은 물론 CD137에 결합할 수 있는 리포칼린 뮤테인을 제공하는 본 명세서에서 기술된 바와 같은 치환을 포함할 수 있다.

전형적으로, 리포칼린 뮤테인은 야생형 또는 레퍼런스 리포칼린, 예를 들어 hTlc 및 hNGAL의 아미노산 서열과 비교하여 리간드-결합 포켓을 포함하고 리간드-결합 포켓의 입구로 정의된 열린 말단에서 4개의 루프 내에 하나 이상의 돌연변이 된 아미노산 잔기를 포함한다(상기 참조). 상기 설명된 바와 같이, 이들 영역은 원하는 표적에 대해 리포칼린 뮤테인의 결합 특이성을 결정하는데 필수적이다. 일부 구체예에서, 본 개시물의 리포칼린 뮤테인은 또한 4개의 루프 외에 돌연변이 된 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 본 개시물의 리포칼린 뮤테인은 리포칼린의 닫힌 말단에서 β-가닥을 연결하는 3개의 펩타이드 루프(BC, DE, 및 FG로 명명됨) 중 하나 이상에서 하나 이상의 돌연변이 된 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 눈물 리포칼린, NGAL 리포칼린에서 유래된 뮤테인 또는 이의 호몰로그는 N-말단 영역 및/또는 천연 리포칼린 결합 포켓과 반대 위치에 있는 파이 배럴 구조의 말단에 배열된 3개의 펩타이드 루프 BC, DE 및 FG에서 임의의 서열 위치에 1, 2, 3, 4 이상의 돌연변이 된 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 일부 구체예에서, 눈물 리포칼린, NGAL 리포칼린에서 유래된 뮤테인 또는 이의 호몰로그는 눈물 리포칼린의 야생형 서열과 비교하여 파이 배럴 구조의 말단에 배열된 펩타이드 루프 DE에서 돌연변이 된 아미노산 잔기를 가지지 않을 수 있다.

일부 구체예에서, 본 개시물에 따른 리포칼린 뮤테인은 상응하는 레퍼런스(야생형) 리포칼린의 아미노산 서열과 비교하여 하나 이상, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 그 이상의 돌연변이 된 아미노산 잔기를 포함할 수 있으며, 단, 그러한 리포칼린은 CD137에 결합할 수 있어야 한다. 일부 구체예에서, 본 개시물의 리포칼린 뮤테인은 상응하는 레퍼런스(야생형) 리포칼린의 천연 아미노산 잔기가 아르기닌 잔기로 치환되는 곳에서 2, 3, 4, 5, 또는 그 이상을 포함하여 적어도 2개의 돌연변이 된 아미노산 잔기를 포함한다.

제공된 리포칼린 뮤테인이 CD137에 결합하는 능력을 보유하고, 및/또는 그것이 레퍼런스(야생형) 리포칼린, 예를 들어, 성숙한 hTlc 또는 성숙한 hNGAL의 아미노산 서열과 적어도 60%, 예컨대 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85% 또는 그 이상의 서열 동일성을 가지는 한 치환, 결실 및 삽입을 포함하여 돌연변이의 임의의 타입 및 수가 예상된다.

일부 구체예에서, 치환은 보존적 치환이다. 일부 구체예에서, 치환은 비-보존적 치환이거나 또는 아래의 예시 치환으로부터 하나 이상이다.

구체적으로, 리포칼린 뮤테인의 아미노산 서열의 아미노산 잔기가 레퍼런스(야생형) 리포칼린의 아미노산 서열에서 특정 위치에 상응하는 레퍼런스(야생형) 리포칼린과 상이하도록 당업자는 당업계에 잘 알려진 수단 및 방법, 예를 들어, 수동으로 또는 Basic Local Alignment Search Tool 또는 ClustalW을 나타내는 BLAST2.0 또는 서열 정렬을 생성하기에 적당한 임의의 다른 적당한 프로그램과 같은 컴퓨터 프로그램을 이용한 정렬을 이용할 수 있다. 따라서, 레퍼런스(야생형) 리포칼린의 아미노산 서열은 "대상 서열" 또는 "레퍼런스 서열"로 제공하는 한편, 리포칼린 뮤테인의 아미노산 서열은 "퀴어리 서열"로 제공할 수 있다(또한 상기 참조).

보존적 치환은 일반적으로 돌연변이 될 아미노산에 따라 나열된 하기의 치환이며, 각각 보존적인 것으로 간주될 수 있는 하나 이상의 대체(들)이 이어진다:

Ala → Ser, Thr, 또는 Val; Arg → Lys, Gln, Asn, 또는 His; Asn → Gln, Glu, Asp, 또는 His; Asp → Glu, Gln, Asn, 또는 His; Gln → Asn, Asp, Glu, 또는 His; Glu → Asp, Asn, Gln, 또는 His; His → Arg, Lys, Asn, Gln, Asp, 또는 Glu; Ile → Thr, Leu, Met, Phe, Val, Trp, Tyr, Ala, 또는 Pro; Leu → Thr, Ile,Val, Met, Ala, Phe, Pro, Tyr, 또는 Trp; Lys → Arg, His, Gln, 또는 Asn; Met → Thr, Leu, Tyr, Ile, Phe, Val, Ala, Pro, 또는 Trp; Phe → Thr, Met, Leu, Tyr, Ile, Pro, Trp, Val, 또는 Ala; Ser → Thr, Ala, 또는 Val; Thr → Ser, Ala, Val, Ile, Met, Val, Phe, Pro, 또는 Leu; Trp → Tyr, Phe, Met, Ile, 또는 Leu; Tyr → Trp, Phe, Ile, Leu, 또는 Met; Val → Thr, Ile, Leu, Met, Phe, Ala, Ser, 또는 Pro. 다른 치환들 역시 허용되며, 경험적으로 또는 다른 공지의 보존적 또는 비-보존적 치환에 따라 결정될 수 있다. 추가의 방향으로서, 하기의 그룹들은 각각 전형적으로 서로 보존적 치환을 정의하는데 사용될 수 있는 아미노산을 포함한다:

(a) 알라닌(Ala), 세린(Ser), 트레오닌(Thr), 발린(Val)

(b) 아스파르트산(Asp), 글루탐산(Glu), 글루타민(Gln), 아스파라긴(Asn), 히스티딘(His)

(c) 아르기닌(Arg), 리신(Lys), 글루타민(Gln), 아스파라긴(Asn), 히스티딘(His)

(d) 이소루신(Ile), 루신(Leu), 메티오닌(Met), 발린(Val), 알라닌(Ala), 페닐알라닌(Phe), 트레오닌(Thr), 프롤린(Pro)

(e) 이소루신(Ile), 루신(Leu), 메티오닌(Met), 페닐알라닌(Phe), 티로신(Tyr), 트립토판(Trp)

그러한 보존적 치환이 생물학적 활성의 변화를 초래하는 경우, 하기와 같은, 또는 아미노산 부류에 대한 레퍼런스에서 추가로 하기 기술된 바와 같은 보다 실질적인 변화가 도입될 수 있으며, 원하는 특성에 대해 산물을 스크리닝할 수 있다. 그러한 보다 실질적인 변화의 예시는 Ala → Leu 또는 Phe; Arg → Glu; Asn → Ile, Val, 또는 Trp; Asp → Met; Cys → Pro; Gln → Phe; Glu → Arg; His → Gly; Ile → Lys, Glu, 또는 Gln; Leu → Lys 또는 Ser; Lys → Tyr; Met → Glu; Phe → Glu, Gln, 또는 Asp; Trp → Cys; Tyr → Glu 또는 Asp; Val → Lys, Arg, His이다.

일부 구체예에서, 리포칼린(뮤테인)의 물리적 및 생물학적 특성들에서의 실질적인 변형은 (a) 예를 들어 시트 또는 나선 구조로서 치환 지역에서 폴리펩타이드 백본의 구조, (b) 표적 부위에서 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 거대한 측쇄 유지에 미치는 그들의 영향에서 유의적으로 상이한 치환을 선택함으로써 달성된다.

자연적으로 발생하는 잔기들은 공통의 측쇄 특성들을 기반으로 하여 그룹으로 나뉜다: (1) 소수성: 메티오닌, 알라닌, 발린, 루신, 이소-루신; (2) 중성 친수성: 시스테인, 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민; (3) 산성: 아스파르트산, 글루탐산; (4) 염기성: 히스티딘, 리신, 아르기닌; (5) 사슬 방향에 영향을 주는 잔기: 글리신, 프롤린; 및 (6) 방향족: 트립토판, 티로신, 페닐알라닌. 일부 구체예에서, 치환은 이들 부류 중 하나의 구성원을 다른 부류로 교환하는 것을 수반할 수 있다.

각각의 리포칼린의 적당한 구조를 유지하는데 관련되지 않은 임의의 시스테인 잔기는 또한 일반적으로 세린으로 치환되어 분자의 산화 안정성을 개선하고, 비정상적인 가교를 방지한다. 반대로, 시스테인 결합(들)은 리포칼린에 추가되어 이의 안정성을 개선할 수 있다.

D. 본 개시물의 예시적인 CD137-특이 리포칼린 뮤테인

상기에서 지적된 바와 같이, 리포칼린은 일 말단에 4개의 루프에 의해 쌍으로 연결되어 결합 포켓으로 정의하는 8개의 β-가닥을 포함하는 이의 초2차 구조, 일명 실린더형 β-병풍 구조의 초2차 구조 영역으로 정의된 폴리펩타이드이다. 본 개시물은 본 명세서에서 상세하게 개시된 리포칼린 뮤테인에 한정되지 않는다. 이와 관련하여, 본 개시물은 일 말단에 4개의 루프에 의해 쌍으로 연결되어 결합 포켓으로 정의하는 8개의 β-가닥을 포함하는 실린더형 β-병풍 구조의 초2차 구조 영역을 갖는 리포칼린 뮤테인에 관한 것으로, 단, 상기 4개의 루프 중 적어도 3개 각각의 적어도 하나의 아미노산은 돌연변이 되어 있으며, 상기 리포칼린은 CD137에 검출가능한 친화성으로 결합하는데 효과적이다.

일부 구체예에서, 본 명세서에서 개시된 리포칼린 뮤테인은 성숙한 인간 눈물 리포칼린(hTlc)의 뮤테인이거나 또는 이를 포함할 수 있다. 성숙한 hTlc의 뮤테인은 본 명세서에서 "hTlc 뮤테인"으로 명명된다. 일부 다른 구체예에서, 본 명세서에서 개시된 리포칼린 뮤테인은 성숙한 인간 호중구 젤라티네이즈-관련된 리포칼린(hNGAL)의 뮤테인이다. 성숙한 hNGAL의 뮤테인은 본 명세서에서 'hNGAL 뮤테인"으로 명명된다.

일 양태에서, 본 개시물은 검출가능한 친화성으로 CD137과 결합하는 레퍼런스(야생형) 리포칼린에서 유래된, 바람직하게는 성숙한 hTlc 또는 성숙한 hNGAL에서 유래된 임의의 수의 리포칼린 뮤테인을 포함한다. 관련된 양태에서, 본 개시물은 CD137에 결합하여 CD137의 다운스트림 신호전달 경로를 활성화할 수 있는 다양한 리포칼린 뮤테인을 포함한다. 이러한 의미에서, CD137은 레퍼런스(야생형) 리포칼린, 바람직하게는 hTlc 또는 hNGAL의 비-천연 표적으로 간주될 수 있으며, 여기서, "비-천연 표적"은 생리적 조건 하에서 레퍼런스(야생형) 리포칼린에 결합하지 않는 물질을 지칭한다. 특정 서열 위치에서 하나 이상의 돌연변이를 갖는 레퍼런스(야생형) 리포칼린을 조작함으로써, 본 발명자들은 비-천연 표적, CD137에 대해 높은 친화성 및 높은 특이성이 가능함을 입증하였다. 일부 구체예에서, 야생형 리포칼린 상에서 특정 서열 위치를 인코딩하는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 그 이상의 뉴클레오티드 삼중항(들)에서, CD137과 결합할 수 있는 리포칼린 뮤테인을 생성할 목적으로 뉴클레오티드 삼중항의 서브세트에 의해 이들 위치에서 치환을 통해 무작위 돌연변이유발이 시행될 수 있다.

일부 구체예에서, 본 개시물의 리포칼린 뮤테인은 레퍼런스 리포칼린, 바람직하게는, hTlc 또는 hNGAL의 선형 폴리펩타이드 서열에 상응하는 하나 이상의 위치에서 치환, 결실 및 삽입을 포함하여 아미노산 잔기(들)이 돌연변이될 수 있다. 일부 구체예에서, 레퍼런스 리포칼린, 바람직하게는 hTlc 또는 hNGAL의 아미노산 서열과 비교하여 돌연변이 되는 본 개시물의 리포칼린 뮤테인의 아미노산 잔기들의 수는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 그 이상, 예컨대, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50, 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11 및 보다 더 바람직하게는 9, 10 또는 11이다. 그러나, 본 개시물의 리포칼린 뮤테인은 여전히 CD137과 결합할 수 있는 것이 바람직하다.

일부 구체예에서, 본 개시물의 리포칼린 뮤테인은 각 레퍼런스(야생형) 리포칼린과 비교하여 이의 N-말단에서 1, 2, 3, 4 또는 그 이상의 아미노산 및/또는 이의 C-말단에서 1, 2 또는 그 이상의 아미노산이 결핍될 수 있다; 예를 들어, SEQ ID NOs: 34-40. 일부 구체예에서, 본 개시물은 상기에서 정의된 바와 같은 hTlc 뮤테인을 포함하며, 성숙한 hTlc 서열의 처음 4개의 1, 2, 3, 또는 N-말단 아미노산 잔기(His-His-Leu-Leu; 위치 1-4) 및/또는 성숙한 hTlc의 선형 폴리펩타이드 서열의 마지막 1 또는 2, C-말단 아미노산 잔기(Ser-Asp; 위치 157-158)가 결실되어 있다(예를 들어, SEQ ID NOs: 34-40). 일부 구체예에서, 본 개시물은 상기에서 정의된 바와 같이 hNGAL 뮤테인을 포함하며, 성숙한 hNGAL의 선형 폴리펩타이드 서열의 아미노산 잔기(Lys-Asp-Pro, 위치 46-48)가 결실되어 있다(SEQ ID NO: 45). 또한, 본 개시물의 리포칼린 뮤테인은 돌연변이 된 아미노산 서열 위치 외에 레퍼런스(야생형) 리포칼린, 바람직하게는 hTlc 또는 hNGAL의 야생형(천연) 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

일부 구체예에서, 본 개시물의 리포칼린 뮤테인에 편입된 하나 이상의 돌연변이 된 아미노산 잔기는 지명된 표적과의 결합 활성 및 뮤테인의 폴딩을 실질적으로 방해 또는 간섭하지 않는다. 치환, 결실 및 삽입을 포함하여 그러한 돌연변이는 확립된 표준 방법들을 이용하여 DNA 수준에서 달성될 수 있다(Sambrook and Russell, 2001, Molecular cloning: a laboratory manual). 일부 구체예에서, 레퍼런스(야생형) 리포칼린, 바람직하게는 레퍼런스 리포칼린의 상응하는 서열 위치를 인코딩하는 뉴클레오티드 삼중항(들)이 뉴클레오티드 삼중항의 서브세트로 치환되어 무작위 돌연변이유발을 통해 hTlc 또는 hNGAL의 선형 폴리펩타이드 서열에 상응하는 하나 이상의 서열 위치에서 돌연변이 된 아미노산 잔기(들)이 도입된다.

일부 구체예에서, 검출가능한 친화성으로 CD137과 결합하는 제공된 리포칼린 뮤테인은 천연 시스테인 잔기의 다른 아미노산 예를 들어 세린 잔기로의 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 검출가능한 친화성으로 CD137과 결합하는 리포칼린 뮤테인은 레퍼런스(야생형) 리포칼린, 바람직하게는 hTlc 또는 hNGAL의 하나 이상의 아미노산을 치환하는 하나 이상의 비-천연 시스테인 잔기를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 본 개시물에 따른 리포칼린 뮤테인은 천연 아미노산의 시스테인 잔기로의 적어도 2개의 아미노산 치환을 통해 하나 이상의 시스테인 브릿지를 형성하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 시스테인 브릿지는 적어도 2개의 루프 영역을 연결할 수 있다. 이들 영역의 정의는(Biochim Biophys Acta, 2000), Flower(1996) and Breustedt et al.(2005)에 따라 본 명세서에서 사용된다.

일반적으로, 본 개시물의 리포칼린 뮤테인은 성숙한 hTlc(SEQ ID NO: 1) 또는 성숙한 hNGAL(SEQ ID NO: 2)의 아미노산 서열과 약 적어도 80%, 예컨대 적어도 약 85%을 포함하여 약 적어도 70% 아미노산 서열 동일성을 가질 수 있다.

일부 양태에서, 본 개시물은 CD137-결합 hTlc 뮤테인을 제공한다. 이와 관련하여, 본 개시물은 약 300 nM, 200 nM, 150 nM, 100 nM 이하의 K_D로 측정된 친화성으로 CD137과 결합할 수 있는 하나 이상의 hTlc 뮤테인을 제공한다. 일부 구체예에서, 제공된 hTlc 뮤테인은 약 250 nM, 150 nM, 100 nM, 50 nM, 20 nM 이하의 EC₅₀ 값으로 CD137과 결합할 수 있다. 일부 다른 구체예에서, CD137-결합 hTlc 뮤테인은 시아노몰거스 CD137(cyCD137)과 교차-반응할 수 있다.

일부 구체예에서, 본 개시물의 hTlc 뮤테인은 CD137에 대한 CD137L의 결합을 간섭할 수 있다.

일부 구체예에서, 제공된 hTlc 뮤테인은 성숙한 hTlc의 선형 폴리펩타이드 서열(SEQ ID NO: 1)의 5, 26-31, 33-34, 42, 46, 52, 56, 58, 60-61, 65, 71, 85, 94, 101, 104-106, 108, 111, 114, 121, 133, 148, 150 및 153 위치에 상응하는 하나 이상의 위치에서 돌연변이 된 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.

일부 구체예에서, 제공된 hTlc 뮤테인은 성숙한 hTlc의 선형 폴리펩타이드 서열(SEQ ID NO: 1)의 26-34, 55-58, 60-61, 65, 104-106 및 108 위치에 상응하는 하나 이상의 위치에서 돌연변이 된 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.

일부 구체예에서, 제공된 hTlc 뮤테인은 성숙한 hTlc의 선형 폴리펩타이드 서열(SEQ ID NO: 1)의 101, 111, 114 및 153 위치에 상응하는 하나 이상의 위치에서 돌연변이 된 아미노산 잔기를 더 포함할 수 있다.

일부 구체예에서, 제공된 hTlc 뮤테인은 성숙한 hTlc의 선형 폴리펩타이드 서열(SEQ ID NO: 1)의 5, 26-31, 33-34, 42, 46, 52, 56, 58, 60-61, 65, 71, 85, 94, 101, 104-106, 108, 111, 114, 121, 133, 148, 150 및 153 위치에 상응하는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 또는 그 이상의 위치에서 돌연변이 된 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 일부 바람직한 구체예에서, 제공된 hTlc 뮤테인은 CD137, 특히 인간 CD137과 결합할 수 있다.

일부 구체예에서, 제공된 hTlc 뮤테인은 성숙한 hTlc의 선형 폴리펩타이드 서열(SEQ ID NO: 1)의 26-34, 55-58, 60-61, 65, 104-106 및 108 위치에 상응하는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 그 이상의 위치에서 돌연변이 된 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 일부 바람직한 구체예에서, 제공된 hTlc 뮤테인은 CD137, 특히 인간 CD137과 결합할 수 있다.

일부 구체예에서, 본 개시물에 따른 리포칼린 뮤테인은 천연 시스테인 잔기의 예를 들어 세린 잔기로의 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 본 개시물에 따른 hTlc 뮤테인은 성숙한 hTlc의 선형 폴리펩타이드 서열(SEQ ID NO:1)의 61 및/또는 153 위치에 상응하는 위치에서 천연의 시스테인 잔기의 다른 아미노산, 예컨대 세린 잔기로의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 이 문맥에서, 시스테인 잔기 61 및 153에 의해 형성된 야생형 hTlc의 구조적 이황화 결합(각각의 나이브 핵산 라이브러리의 수준에서)의 제거(Breustedt et al., J Biol Chem, 2005 참고)는 안정하게 폴딩될 뿐만 아니라 높은 친화성으로 주어진 비-천연 표적과 결합할 수 있는 hTlc 뮤테인을 제공할 수 있음이 밝혀졌다는 점에 주목한다. 일부 구체예에서, 구조적 이황화 결합의 제거는 또한 본 개시물의 뮤테인에 비-천연 이황화 결합의 도입을 생성 또는 숙고함으로써 뮤테인의 안정성을 증가시키는 추가의 장점을 제공할 수 있다. 그러나, CD137과 결합하고 Cys 61 및 Cys 153 사이에 형성된 이황화 브릿지를 갖는 hTlc 뮤테인 역시 본 개시물의 일부이다.

일부 특정 구체예에서, 본 개시물의 hTlc 뮤테인은 성숙한 hTlc의 선형 폴리펩타이드 서열(SEQ ID NO:1)의 61 및/또는 153 위치에 상응하는 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환 Cys 61 → Ala, Phe, Lys, Arg, Thr, Asn, Gly, Gln, Asp, Asn, Leu, Tyr, Met, Ser, Pro 또는 Trp 및/또는 Cys 153 → Ser 또는 Ala를 포함할 수 있다.

일부 구체예에서, 성숙한 hTlc의 선형 폴리펩타이드 서열(SEQ ID NO:1)의 61, 101 및 153 위치에 상응하는 위치에서 시스테인 코돈 중 2 또는 3 모두 다른 아미노산의 코돈으로 대체된다. 또한, 일부 구체예에서, 본 개시물의 hTlc 뮤테인은 성숙한 hTlc의 선형 폴리펩타이드 서열(SEQ ID NO:1)의 101 위치에 상응하는 위치에서 천연 시스테인 잔기의 세린 잔기 또는 히스티딘 잔기로의 아미노산 치환을 포함한다.

일부 구체예에서, 본 개시물에 따른 뮤테인은 성숙한 hTlc의 선형 폴리펩타이드 서열(SEQ ID NO:1)의 28 또는 105 위치에 상응하는 위치에서 천연의 아미노산의 시스테인 잔기로의 아미노산 치환을 포함한다. 또한, 일부 구체예에서, 본 개시물에 따른 뮤테인은 성숙한 hTlc의 선형 폴리펩타이드 서열(SEQ ID NO:1)의 111 위치에 상응하는 위치에서 천연 아르기닌 잔기의 프롤린 잔기로의 아미노산 치환을 포함한다. 또한, 일부 구체예에서, 본 개시물에 따른 뮤테인은 성숙한 hTlc의 선형 폴리펩타이드 서열(SEQ ID NO:1)의 114 위치에 상응하는 위치에서 천연 리신 잔기의 트립토판 잔기 또는 글루탐산으로의 아미노산 치환을 포함한다.

일부 구체예에서, 제공된 CD137-결합 hTlc 뮤테인은 성숙한 hTlc의 선형 폴리펩타이드 서열(SEQ ID NO:1)의 5, 26-31, 33-34, 42, 46, 52, 56, 58, 60-61, 65, 71, 85, 94, 101, 104-106, 108, 111, 114, 121, 133, 148, 150 및 153 위치에 상응하는 하나 이상의 위치에서 하나 이상의 하기의 돌연변이 된 아미노산 잔기를 포함할 수 있다: Ala 5 → Val 또는 Thr; Arg 26 → Glu; Glu 27 → Gly; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Arg; Glu 30 → Pro; Met 31 → Trp; Leu 33 → Ile; Glu 34 → Phe; Thr 42 → Ser; Gly 46 → Asp; Lys 52 → Glu; Leu 56 → Ala; Ser 58 → Asp; Arg 60 → Pro; Cys 61 → Ala; Lys 65 → Arg 또는 Asn; Thr 71 → Ala; Val 85 → Asp; Lys 94 → Arg 또는 Glu; Cys 101 → Ser; Glu 104 → Val; Leu 105 → Cys; His 106 → Asp; Lys 108 → Ser; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Lys 121 → Glu; Ala 133 → Thr; Arg 148 → Ser; Ser 150 → Ile; 및 Cys 153 → Ser. 일부 구체예에서, 성숙한 hTlc의 이들 서열(SEQ ID NO:1)에서 둘 이상, 예컨대 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 또는 그 이상, 또는 심지어 모든 돌연변이 된 아미노산 잔기를 포함한다.

일부 구체예에서, 제공된 CD137-결합 hTlc 뮤테인은 성숙한 hTlc의 선형 폴리펩타이드 서열(SEQ ID NO: 1)과 비교하여 돌연변이 된 아미노산 잔기의 하기의 세트 중 하나를 포함할 수 있다:

(a) Arg 26 → Glu; Glu 27 → Gly; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Arg; Glu 30 → Pro; Met 31 → Trp; Leu 33 → Ile; Glu 34 → Phe; Leu 56 → Ala; Ser 58 → Asp; Arg 60 → Pro; Cys 61 → Ala; Cys 101 → Ser; Glu 104 → Val; Leu 105 → Cys; His 106 → Asp; Lys 108 → Ser; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; 및 Cys 153 → Ser;

(b) Ala 5 → Thr; Arg 26 → Glu; Glu 27 → Gly; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Arg; Glu 30 → Pro; Met 31 → Trp; Leu 33 → Ile; Glu 34 → Phe; Leu 56 → Ala; Ser 58 → Asp; Arg 60 → Pro; Cys 61 → Ala; Lys 65 → Arg; Val 85 → Asp; Cys 101 → Ser; Glu 104 → Val; Leu 105 → Cys; His 106 → Asp; Lys 108 → Ser; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Lys 121 → Glu; Ala 133 → Thr; 및 Cys 153 → Ser;

(c) Arg 26 → Glu; Glu 27 → Gly; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Arg; Glu 30 → Pro; Met 31 → Trp; Leu 33 → Ile; Glu 34 → Phe; Leu 56 → Ala; Ser 58 → Asp; Arg 60 → Pro; Cys 61 → Ala; Lys 65 → Asn; Lys 94 → Arg; Cys 101 → Ser; Glu 104 → Val; Leu 105 → Cys; His 106 → Asp; Lys 108 → Ser; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Lys 121 → Glu; Ala 133 → Thr; 및 Cys 153 → Ser;

(d) Ala 5 → Val; Arg 26 → Glu; Glu 27 → Gly; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Arg; Glu 30 → Pro; Met 31 → Trp; Leu 33 → Ile; Glu 34 → Phe; Leu 56 → Ala; Ser 58 → Asp; Arg 60 → Pro; Cys 61 → Ala; Lys 65 → Arg; Lys 94 → Glu; Cys 101 → Ser; Glu 104 → Val; Leu 105 → Cys; His 106 → Asp; Lys 108 → Ser; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Lys 121 → Glu; Ala 133 → Thr; 및 Cys 153 → Ser;

(e) Arg 26 → Glu; Glu 27 → Gly; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Arg; Glu 30 → Pro; Met 31 → Trp; Leu 33 → Ile; Glu 34 → Phe; Thr 42 → Ser; Leu 56 → Ala; Ser 58 → Asp; Arg 60 → Pro; Cys 61 → Ala; Cys 101 → Ser; Glu 104 → Val; Leu 105 → Cys; His 106 → Asp; Lys 108 → Ser; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Ser 150 → Ile; 및 Cys 153 → Ser;

(f) Arg 26 → Glu; Glu 27 → Gly; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Arg; Glu 30 → Pro; Met 31 → Trp; Leu 33 → Ile; Glu 34 → Phe; Lys 52 → Glu; Leu 56 → Ala; Ser 58 → Asp; Arg 60 → Pro; Cys 61 → Ala; Thr 71 → Ala; Cys 101 → Ser; Glu 104 → Val; Leu 105 → Cys; His 106 → Asp; Lys 108 → Ser; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Ala 133 → Thr; Arg 148 → Ser; Ser 150 → Ile; 및 Cys 153 → Ser; 및

(g) Ala 5 → Thr; Arg 26 → Glu; Glu 27 → Gly; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Arg; Glu 30 → Pro; Met 31 → Trp; Leu 33 → Ile; Glu 34 → Phe; Gly 46 → Asp; Leu 56 → Ala; Ser 58 → Asp; Arg 60 → Pro; Cys 61 → Ala; Thr 71 → Ala; Cys 101 → Ser; Glu 104 → Val; Leu 105 → Cys; His 106 → Asp; Lys 108 → Ser; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Ser 150 → Ile; 및 Cys 153 → Ser.

일부 구체예에서, 나머지 영역, 즉, 본 개시물의 hTlc 뮤테인의 성숙한 hTlc의 선형 폴리펩타이드 서열(SEQ ID NO: 1)의 5, 26-31, 33-34, 42, 46, 52, 56, 58, 60-61, 65, 71, 85, 94, 101, 104-106, 108, 111, 114, 121, 133, 148, 150, 및 153 위치에 상응하는 위치와 상이한 영역은 돌연변이 된 아미노산 서열 위치 외에 성숙한 hTlc의 선형 폴리펩타이드 서열의 야생형(자연의) 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

일부 구체예에서, 본 개시물의 hTlc 뮤테인은 성숙한 hTlc의 서열(SEQ ID NO: 1)과 적어도 70% 서열 동일성 또는 적어도 70% 서열 상동성을 가진다. 설명적 예시로서, SEQ ID NO: 34의 뮤테인은 성숙한 hTlc의 아미노산 서열과 대략 84%의 아미노산 서열 동일성 또는 서열 상동성을 가진다.

일부 구체예에서, 본 개시물의 hTlc 뮤테인은 SEQ ID NOs: 34-40 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함한다.

일부 구체예에서, 본 개시물의 hTlc 뮤테인은 SEQ ID NOs: 34-40으로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 그 이상의 서열 동일성을 가진다.

본 개시물은 또한 SEQ ID NOs:　34-40으로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 hTlc 뮤테인의 구조적 호몰로그를 포함하며, 구조적 호몰로그들은 상기 hTlc 뮤테인과 비교하여 약 60% 이상, 바람직하게는 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 92% 이상 및 보다 바람직하게는 95% 이상의 아미노산 서열 상동성 또는 서열 동일성을 가진다.

일부 양태에서, 본 개시물은 CD137-결합 hNGAL 뮤테인을 제공한다. 이와 관련하여, 본 개시물은 약 800 nM, 700 nM, 200 nM, 140 nM, 100 nM 이하, 바람직하게는 약 70 nM, 50 nM, 30 nM, 10 nM, 5 nM, 2 nM 이하의 K_D로 측정된 친화성으로 CD137과 결합할 수 있는 하나 이상의 hNGAL 뮤테인을 제공한다. 일부 바람직하게는, 제공된 hNGAL 뮤테인은 약 1000 nM, 500 nM, 100 nM, 80 nM, 50 nM, 25 nM, 18 nM, 15 nM, 10 nM, 5 nM 이하의 EC₅₀ 값으로 CD137과 결합할 수 있다.

일부 구체예에서, 제공된 CD137-결합 hNGAL 뮤테인은 시아노몰거스 CD137과 교차-반응할 수 있다. 일부 구체예에서, 제공된 hNGAL 뮤테인은 약 50 nM, 20 nM, 10 nM, 5 nM, 2 nM 이하의 K_D로 측정된 친화성으로 시아노몰거스 CD137과 결합할 수 있다. 일부 구체예에서, 제공된 hNGAL 뮤테인은 약 100 nM, 80 nM, 50 nM, 30 nM 이하의 EC₅₀ 값으로 시아노몰거스 CD137과 결합할 수 있다.

일부 구체예에서, 본 개시물의 hNGAL 뮤테인은 CD137과의 CD137L의 결합을 간섭 또는 경쟁할 수 있다. 일부 다른 구체예에서, 본 개시물의 hNGAL 뮤테인은 CD137L의 존재 하에서 CD137과 결합 및/또는 CD137/CD137L 복합체와 결합할 수 있다.

일부 구체에에서, 제공된 hNGAL 뮤테인은 성숙한 hNGAL의 선형 폴리펩타이드 서열(SEQ ID NO: 2)의 28, 36, 40-41, 49, 52, 65, 68, 70, 72-73, 77, 79, 81, 83, 87, 94, 96, 100, 103, 106, 125, 127, 132 및 134 위치에 상응하는 하나 이상의 위치에서 돌연변이 된 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.

일부 구체예에서, 제공된 hNGAL 뮤테인은 성숙한 hNGAL의 선형 폴리펩타이드 서열(SEQ ID NO: 2)의 28, 36, 40-41, 49, 52, 65, 68, 70, 72-73, 77, 79, 81, 83, 87, 94, 96, 100, 103, 106, 125, 127, 132 및 134 위치에 상응하는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 또는 그 이상의 위치에서 돌연변이 된 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 일부 바람직한 구체예에서, 제공된 hNGAL 뮤테인은 CD137, 특히 인간 CD137과 결합할 수 있다.

일부 구체예에서, 제공된 hNGAL 뮤테인은 성숙한 hNGAL의 선형 폴리펩타이드 서열(SEQ ID NO: 2)의 28, 36, 40-41, 49, 52, 65, 68, 70, 72-73, 77, 79, 81, 87, 96, 100, 103, 106, 125, 127, 132 및 134 위치에 상응하는 하나 이상의 위치에서 돌연변이 된 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 일부 바람직한 구체예에서, 제공된 hNGAL 뮤테인은 CD137, 특히 인간 CD137과 결합할 수 있다.

일부 구체예에서, 제공된 hNGAL 뮤테인은 성숙한 hNGAL의 선형 폴리펩타이드 서열(SEQ ID NO: 2)의 36, 87 및 96 위치에 상응하는 하나 이상의 위치에서 및 성숙한 hNGAL의 선형 폴리펩타이드 서열(SEQ ID NO: 2)의 28, 40-41, 49, 52, 65, 68, 70, 72-73, 77, 79, 81, 83, 94, 100, 103, 106, 125, 127, 132 및 134 위치에 상응하는 하나 이상의 위치에서 돌연변이 된 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.

다른 일부 구체예에서, 제공된 hNGAL 뮤테인은 성숙한 hNGAL의 선형 폴리펩타이드 서열(SEQ ID NO: 2)의 20, 25, 28, 33, 36, 40-41, 44, 49, 52, 59, 68, 70-73, 77-82, 87, 92, 96, 98, 100, 101, 103, 122, 125, 127, 132 및 134 위치에 상응하는 하나 이상의 위치에서 돌연변이 된 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.

다른 구체예에서, 제공된 hNGAL 뮤테인은 성숙한 hNGAL의 선형 폴리펩타이드 서열(SEQ ID NO: 2)의 36, 40, 41, 49, 52, 68, 70, 72, 73, 77, 79, 81, 96, 100, 103, 125, 127, 132 및 134 위치에 상응하는 하나 이상의 위치에서 및 성숙한 hNGAL의 선형 폴리펩타이드 서열(SEQ ID NO: 2)의 20, 25, 33, 44, 59, 71, 78, 80, 82, 87, 92, 98, 101 및 122 위치에 상응하는 하나 이상의 위치에서 돌연변이 된 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.

일부 구체예에서, 본 개시물에 따른 리포칼린 뮤테인은 예를 들어 세린 잔기에 의한 천연 시스테인 잔기의 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 본 개시물에 따른 hNGAL 뮤테인은 성숙한 hNGAL의 선형 폴리펩타이드 서열(SEQ ID NO: 2)의 76 및/또는 175 위치에 상응하는 위치에서 세린 잔기와 같은 다른 아미노산에 의한 천연 시스테인 잔기의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 이 맥락에서, 시스테인 잔기 76 및 175에 의해 형성된 야생형 hNGAL의 구조적 이황화 결합의 제거(각각의 나이브 핵산 라이브러리의 수준에서)(Breustedt et al., J Biol Chem, 2005 참조)는 안정적으로 폴딩될 뿐만 아니라 높은 친화성으로 주어진 비-천연 표적과 결합할 수 있는 hNGAL 뮤테인을 제공할 수 있음이 밝혀졌다는 점이 주목된다. 일부 구체예에서, 구조적 이황화 결합의 제거는 비-천연 이황화 결합의 본 개시물의 뮤테인으로의 도입을 생성 또는 숙고하게 하여 뮤테인의 안정성을 증가시키는 추가의 장점을 제공할 수 있다. 그러나, CD137과 결합하고, Cys 76 및 Cys 175 사이에 형성된 이황화 브릿지를 갖는 hNGAL 뮤테인 역시 본 개시물의 일부이다.

일부 구체예에서, 제공된 CD137-결합 hNGAL 뮤테인은 성숙한 hNGAL의 선형 폴리펩타이드 서열(SEQ ID NO: 2)의 28, 36, 40-41, 49, 52, 65, 68, 70, 72-73, 77, 79, 81, 83, 87, 94, 96, 100, 103, 106, 125, 127, 132 및 134 위치에 상응하는 하나 이상의 위치에서 하나 이상의 하기의 돌연변이 된 아미노산 잔기를 포함할 수 있다: Gln 28 → His; Leu 36 → Gln; Ala 40 → Ile; Ile 41 → Arg 또는 Lys; Gln 49 → Val, Ile, His, Ser 또는 Asn; Tyr 52 → Met; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Met, Ala 또는 Gly; Leu 70 → Ala, Lys, Ser 또는 Thr; Arg 72 → Asp; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Met, Arg, Thr 또는 Asn; Trp 79 → Ala 또는 Asp; Arg 81 → Met, Trp 또는 Ser; Phe 83 → Leu; Cys 87 → Ser; Leu 94 → Phe; Asn 96 → Lys; Tyr 100 → Phe; Leu 103 → His; Tyr 106 → Ser; Lys 125 → Phe; Ser 127 → Phe; Tyr 132 → Glu 및 Lys 134 → Tyr. 일부 구체예에서, 본 개시물의 hNGAL 뮤테인은 성숙한 hNGAL의 이들 서열 위치에서(SEQ ID NO: 2) 둘 이상, 예컨대 , 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 그 이상, 예컨대 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 모두 돌연변이 된 아미노산 잔기를 포함한다.

일부 구체예에서, 제공된 CD137-결합 hNGAL 뮤테인은 성숙한 hNGAL의 선형 폴리펩타이드 서열(SEQ ID NO: 2)의 20, 25, 28, 33, 36, 40-41, 44, 49, 52, 59, 68, 70-73, 77-82, 87, 92, 96, 98, 100, 101, 103, 122, 125, 127, 132 및 134 위치에 상등하는 하나 이상의 위치에서 하나 이상의 하기의 돌연변이 된 아미노산 잔기를 포함할 수 있다: Gln 20 → Arg; Asn 25 → Tyr 또는 Asp; Gln 28 → His; Val 33 → Ile; Leu 36 →Met; Ala 40 → Asn; Ile 41 → Leu; Glu 44 → Val 또는 Asp; Gln 49 → His; Tyr 52 →Ser 또는 Gly; Lys 59 → Asn; Ser 68 → Asp; Leu 70 → Met; Phe 71 → Leu; Arg 72 → Leu; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Gln 또는 His; Tyr 78 → His; Trp 79 → Ile; Ile 80 → Asn; Arg 81 → Trp 또는 Gln; Thr 82 → Pro; Cys 87 → Ser; Phe 92 → Leu 또는 Ser; Asn 96 → Phe; Lys 98 → Arg; Tyr 100 → Asp; Pro 101 → Leu; Leu 103 → His 또는 Pro; Phe 122 → Tyr; Lys 125 → Ser; Ser 127 → Ile; Tyr 132 → Trp; 및 Lys 134 → Gly.

일부 구체예에서, 제공된 CD137-결합 hNGAL 뮤테인은 성숙한 hNGAL의 선형 폴리펩타이드 서열(SEQ ID NO: 2)의 36, 40, 41, 49, 52, 68, 70, 72, 73, 77, 79, 81, 96, 100, 103, 125, 127, 132 및 134 위치에 상응하는 하나 이상의 위치에서 하나 이상의 하기의 돌연변이 된 아미노산 잔기를 포함할 수 있다: Leu 36 →Met; Ala 40 → Asn; Ile 41 → Leu; Gln 49 → His; Tyr 52 →Ser 또는 Gly; Ser 68 → Asp; Leu 70 → Met; Arg 72 → Leu; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Gln 또는 His; Trp 79 → Ile; Arg 81 → Trp 또는 Gln; Asn 96 → Phe; Tyr 100 → Asp; Leu 103 → His 또는 Pro; Lys 125 → Ser; Ser 127 → Ile; Tyr 132 → Trp; 및 Lys 134 → Gly. 일부 구체예에서, 제공된 CD137-결합 hNGAL 뮤테인은 성숙한 hNGAL의 선형 폴리펩타이드 서열(SEQ ID NO: 2)의 20, 25, 33, 44, 59, 71, 78, 80, 82, 87, 92, 98, 101 및 122 위치에 상응하는 하나 이상의 위치에서 하나 이상의 하기의 돌연변이 된 아미노산 잔기를 추가로 포함할 수 있다: Gln 20 → Arg; Asn 25 → Tyr 또는 Asp; Val 33 → Ile; Glu 44 → Val 또는 Asp; Lys 59 → Asn; Phe 71 → Leu; Tyr 78 → His; Ile 80 → Asn; Thr 82 → Pro; Phe 92 → Leu 또는 Ser; Lys 98 → Arg; Pro 101 → Leu; 및 Phe 122 → Tyr.

일부 구체예에서, 제공된 CD137-결합 hNGAL 뮤테인은 성숙한 hNGAL의 선형 폴리펩타이드 서열(SEQ ID NO: 2)과 비교하여 돌연변이 된 아미노산 잔기의 하기의 세트 중 하나를 포함할 수 있다:

(a) Gln 28 → His; Leu 36 → Gln; Ala 40 → Ile; Ile 41 → Lys; Gln 49 → Asn; Tyr 52 → Met; Ser 68 → Gly; Leu 70 → Thr; Arg 72 → Asp; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Thr; Trp 79 → Ala; Arg 81 → Ser; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Lys; Tyr 100 → Phe; Leu 103 → His; Tyr 106 → Ser; Lys 125 → Phe; Ser 127 → Phe; Tyr 132 → Glu; 및 Lys 134 → Tyr;

(b) Gln 28 → His; Leu 36 → Gln; Ala 40 → Ile; Ile 41 → Arg; Gln 49 → Ile; Tyr 52 → Met; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Met; Leu 70 → Lys; Arg 72 → Asp; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Met; Trp 79 → Asp; Arg 81 → Trp; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Lys; Tyr 100 → Phe; Leu 103 → His; Tyr 106 → Ser; Lys 125 → Phe; Ser 127 → Phe; Tyr 132 → Glu; 및 Lys 134 → Tyr;

(c) Gln 28 → His; Leu 36 → Gln; Ala 40 → Ile; Ile 41 → Arg; Gln 49 → Asn; Tyr 52 → Met; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Ala; Leu 70 → Ala; Arg 72 → Asp; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Thr; Trp 79 → Asp; Arg 81 → Trp; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Lys; Tyr 100 → Phe; Leu 103 → His; Tyr 106 → Ser; Lys 125 → Phe; Ser 127 → Phe; Tyr 132 → Glu; 및 Lys 134 → Tyr;

(d) Gln 28 → His; Leu 36 → Gln; Ala 40 → Ile; Ile 41 → Lys; Gln 49 → Asn; Tyr 52 → Met; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Ala; Leu 70 → Ala; Arg 72 → Asp; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Thr; Trp 79 → Asp; Arg 81 → Trp; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Lys; Tyr 100 → Phe; Leu 103 → His; Tyr 106 → Ser; Lys 125 → Phe; Ser 127 → Phe; Tyr 132 → Glu; 및 Lys 134 → Tyr;

(e) Gln 28 → His; Leu 36 → Gln; Ala 40 → Ile; Ile 41 → Lys; Gln 49 → Ser; Tyr 52 → Met; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Gly; Leu 70 → Ser; Arg 72 → Asp; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Thr; Trp 79 → Ala; Arg 81 → Met; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Lys; Tyr 100 → Phe; Leu 103 → His; Tyr 106 → Ser; Lys 125 → Phe; Ser 127 → Phe; Tyr 132 → Glu; 및 Lys 134 → Tyr;

(f) Gln 28 → His; Leu 36 → Gln; Ala 40 → Ile; Ile 41 → Lys; Gln 49 → Val; Tyr 52 → Met; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Gly; Leu 70 → Thr; Arg 72 → Asp; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Arg; Trp 79 → Asp; Arg 81 → Ser; Cys 87 → Ser; Leu 94 → Phe; Asn 96 → Lys; Tyr 100 → Phe; Leu 103 → His; Tyr 106 → Ser; Lys 125 → Phe; Ser 127 → Phe; Tyr 132 → Glu; 및 Lys 134 → Tyr;

(g) Gln 28 → His; Leu 36 → Gln; Ala 40 → Ile; Ile 41 → Arg; Gln 49 → His; Tyr 52 → Met; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Gly; Leu 70 → Thr; Arg 72 → Asp; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Thr; Trp 79 → Ala; Arg 81 → Ser; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Lys; Tyr 100 → Phe; Leu 103 → His; Tyr 106 → Ser; Lys 125 → Phe; Ser 127 → Phe; Tyr 132 → Glu; 및 Lys 134 → Tyr;

(h) Gln 28 → His; Leu 36 → Gln; Ala 40 → Ile; Ile 41 → Lys; Gln 49 → Asn; Tyr 52 → Met; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Gly; Leu 70 → Thr; Arg 72 → Asp; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Thr; Trp 79 → Ala; Arg 81 → Ser; Phe 83 → Leu; Cys 87 → Ser; Leu 94 → Phe; Asn 96 → Lys; Tyr 100 → Phe; Leu 103 → His; Tyr 106 → Ser; Lys 125 → Phe; Ser 127 → Phe; Tyr 132 → Glu; 및 Lys 134 → Tyr; 또는

(i) Gln 28 → His; Leu 36 → Gln; Ala 40 → Ile; Ile 41 → Arg; Gln 49 → Ser; Tyr 52 → Met; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Ala; Leu 70 → Thr; Arg 72 → Asp; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Asn; Trp 79 → Ala; Arg 81 → Ser; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Lys; Tyr 100 → Phe; Leu 103 → His; Tyr 106 → Ser; Lys 125 → Phe; Ser 127 → Phe; Tyr 132 → Glu; 및 Lys 134 → Tyr.

일부 다른 구체예에서, 나머지 영역, 즉, 성숙한 hNGAL의 선형 폴리펩타이드 서열(SEQ ID NO: 2)의 28, 36, 40-41, 49, 52, 65, 68, 70, 72-73, 77, 79, 81, 83, 87, 94, 96, 100, 103, 106, 125, 127, 132 및 134 위치와는 다른 영역에서, 본 개시물의 hNGAL 뮤테인은 돌연변이 된 아미노산 서열 위치 외에 성숙한 hNGAL의 야생형(천연) 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

일부 다른 구체예에서, 제공된 CD137-결합 hNGAL 뮤테인은 성숙한 hNGAL의 선형 폴리펩타이드 서열(SEQ ID NO: 2)과 비교하여 돌연변이 된 아미노산 잔기의 하기의 세트 중 하나를 포함할 수 있다:

(a) Leu 36 → Met; Ala 40 → Asn; Ile 41 → Leu; Gln 49 → His; Tyr 52 → Ser; Ser 68 → Asp; Leu 70 → Met; Arg 72 → Leu; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Gln; Trp 79 → Ile; Arg 81 → Trp; Asn 96 → Phe; Tyr 100 → Asp; Leu 103 → His; Lys 125 → Ser; Ser 127 → Ile; Tyr 132 → Trp; 및 Lys 134 → Gly;

(b) Leu 36 → Met; Ala 40 → Asn; Ile 41 → Leu; Gln 49 → His; Tyr 52 → Ser; Ser 68 → Asp; Leu 70 → Met; Arg 72 → Leu; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Gln; Trp 79 → Ile; Arg 81 → Trp; Phe 92 → Leu; Asn 96 → Phe; Lys 98 → Arg; Tyr 100 → Asp; Pro 101 → Leu; Leu 103 → His; Lys 125 → Ser; Ser 127 → Ile; Tyr 132 → Trp; 및 Lys 134 → Gly;

(c) Asn 25 → Tyr; Leu 36 → Met; Ala 40 → Asn; Ile 41 → Leu; Gln 49 → His; Tyr 52 → Gly; Ser 68 → Asp; Leu 70 → Met; Phe 71 → Leu; Arg 72 → Leu; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Gln; Trp 79 → Ile; Arg 81 → Gln; Phe 92 → Ser; Asn 96 → Phe; Tyr 100 → Asp; Leu 103 → His; Lys 125 → Ser; Ser 127 → Ile; Tyr 132 → Trp; 및 Lys 134 → Gly;

(d) Leu 36 → Met; Ala 40 → Asn; Ile 41 → Leu; Gln 49 → His; Tyr 52 → Gly; Ser 68 → Asp; Leu 70 → Met; Arg 72 → Leu; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Gln; Tyr 78 → His; Trp 79 → Ile; Arg 81 → Trp; Phe 92 → Leu; Asn 96 → Phe; Tyr 100 → Asp; Leu 103 → His; Lys 125 → Ser; Ser 127 → Ile; Tyr 132 → Trp; 및 Lys 134 → Gly;

(e) Asn 25 → Asp; Leu 36 → Met; Ala 40 → Asn; Ile 41 → Leu; Gln 49 → His; Tyr 52 → Gly; Ser 68 → Asp; Leu 70 → Met; Arg 72 → Leu; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Gln; Trp 79 → Ile; Arg 81 → Trp; Phe 92 → Leu; Asn 96 → Phe; Tyr 100 → Asp; Leu 103 → His; Lys 125 → Ser; Ser 127 → Ile; Tyr 132 → Trp; 및 Lys 134 → Gly;

(f) Val 33 → Ile; Leu 36 → Met; Ala 40 → Asn; Ile 41 → Leu; Gln 49 → His; Tyr 52 → Gly; Ser 68 → Asp; Leu 70 → Met; Arg 72 → Leu; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Gln; Trp 79 → Ile; Arg 81 → Trp; Phe 92 → Leu; Asn 96 → Phe; Tyr 100 → Asp; Leu 103 → His; Lys 125 → Ser; Ser 127 → Ile; Tyr 132 → Trp; 및 Lys 134 → Gly;

(g) Gln 20 → Arg; Leu 36 → Met; Ala 40 → Asn; Ile 41 → Leu; Glu 44 → Val; Gln 49 → His; Tyr 52 → Gly; Ser 68 → Asp; Leu 70 → Met; Arg 72 → Leu; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Gln; Trp 79 → Ile; Arg 81 → Trp; Phe 92 → Leu; Asn 96 → Phe; Tyr 100 → Asp; Leu 103 → His; Phe 122 → Tyr; Lys 125 → Ser; Ser 127 → Ile; Tyr 132 → Trp; 및 Lys 134 → Gly;

(h) Leu 36 → Met; Ala 40 → Asn; Ile 41 → Leu; Gln 49 → His; Tyr 52 → Ser; Ser 68 → Asp; Leu 70 → Met; Arg 72 → Leu; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Gln; Trp 79 → Ile; Ile 80 → Asn; Arg 81 → Trp; Thr 82 → Pro; Asn 96 → Phe; Tyr 100 → Asp; Pro 101 → Leu; Leu 103 → Pro; Lys 125 → Ser; Ser 127 → Ile; Tyr 132 → Trp; 및 Lys 134 → Gly;

(i) Leu 36 → Met; Ala 40 → Asn; Ile 41 → Leu; Gln 49 → His; Tyr 52 → Gly; Lys 59 → Asn; Ser 68 → Asp; Leu 70 → Met; Arg 72 → Leu; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Gln; Trp 79 → Ile; Arg 81 → Trp; Phe 92 → Leu; Asn 96 → Phe; Tyr 100 → Asp; Leu 103 → His; Lys 125 → Ser; Ser 127 → Ile; Tyr 132 → Trp; 및 Lys 134 → Gly; 및

(j) Leu 36 → Met; Ala 40 → Asn; Ile 41 → Leu; Glu 44 → Asp; Gln 49 → His; Tyr 52 → Ser; Ser 68 → Asp; Leu 70 → Met; Phe 71 → Leu; Arg 72 → Leu; Lys 73 → Asp; Asp 77 → His; Trp 79 → Ile; Arg 81 → Trp; Phe 92 → Leu; Asn 96 → Phe; Tyr 100 → Asp; Leu 103 → His; Lys 125 → Ser; Ser 127 → Ile; Tyr 132 → Trp; 및 Lys 134 → Gly.

일부 구체예에서, 본 개시물의 hNGAL 뮤테인의 나머지 영역, 즉, 성숙한 hNGAL의 선형 폴리펩타이드 서열(SEQ ID NO: 2)의 20, 25, 28, 33, 36, 40-41, 44, 49, 52, 59, 68, 70-73, 77-82, 87, 92, 96, 98, 100, 101, 103, 122, 125, 127, 132 및 134 위치와 상이한 영역에서, 돌연변이 된 아미노산 서열 위치 외에 성숙한 hNGAL의 야생형(천연의) 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

일부 구체예에서, 본 개시물의 hNGAL 뮤테인은 성숙한 hNGAL의 서열(SEQ ID NO: 2)과 적어도 70% 서열 동일성 또는 적어도 70% 서열 상동성을 가진다. 설명적 예시로서, SEQ ID NO: 42의 뮤테인은 성숙한 hNGAL의 아미노산 서열과 대략 87%의 아미노산 서열 동일성 또는 서열 상동성을 가진다.

일부 구체예에서, 본 개시물의 hNGAL 뮤테인은 SEQ ID NOs: 41-59 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함한다.

일부 구체예에서, 본 개시물의 hNGAL 뮤테인의 SEQ ID NOs: 41-59로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 그 이상의 서열 동일성을 가진다.

본 개시물은 또한 SEQ ID NOs: 41-59로 구성된 군에서 선택된 아미노산을 갖는 hNGAL 뮤테인의 구조적 호몰로그를 포함하며, 구조적 호몰로그는 상기 hNGAL 뮤테인과 비교하여 약 60% 이상, 바람직하게는 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 92% 이상 및 가장 바람직하게는 95% 이상의 아미노산 서열 상동성 또는 서열 동일성을 가진다.

일부 구체예에서, 본 개시물은 약 5 nM 이하의 K_D로 측정된 친화성으로 CD137과 결합하는 리포칼린 뮤테인을 제공하되, 리포칼린 뮤테인은 SEQ ID NO: 42의 아미노산 서열과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 그 이상의 서열 동일성을 가진다.

일부 구체예에서, 본 개시물의 리포칼린 뮤테인은 리포칼린 뮤테인의 생물학적 활성(이의 표적, 예를 들어, CD137과의 결합)에 영향을 주지 않으면서 이의 N- 또는 C-말단, 바람직하게는 C-말단에 이종 아미노산 서열, 예를 들어, Strep II tag(SEQ ID NO: 12) 또는 특정 제한 효소를 위한 절단 부위 서열을 포함할 수 있다.

일부 구체예에서, 뮤테인의 일부 특징들을 조정하기 위해, 예컨대, 폴딩 안정성, 혈청 안정성, 단백질 내성 또는 수용성을 개선 또는 응집 경향을 감소, 또는 새로운 특성을 뮤테인에 도입하기 위해 리포칼린 뮤테인의 추가 변형이 도입될 수 있다. 일부 구체예에서, 변형(들)은 조정되는 제공된 뮤테인의 둘 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10)의 특성들을 초래할 수 있다.

예를 들어, 새로운 반응기를 도입하기 위해, 예를 들어, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 히드록시에틸 스타치(HES), 비오틴, 펩타이드 또는 단백질과 같은 다른 화합물과의 컨쥬게이션, 또는 비-자연적으로 발생하는 이황화 결합의 형성을 위해 리포칼린 뮤테인의 하나 이상의 아미노산 위치를 돌연변이시키는 것이 가능하다. 컨쥬게이트 되는 화합물, 예를 들어, PEG 및 HES는 일부 경우에서 상응하는 리포칼린 뮤테인의 혈청 반감기를 증가시킬 수 있다.

일부 구체예에서, 리포칼린 뮤테인의 반응기는 상기 아미노산 서열에서 자연적으로 발생하는 시스테인 잔기와 같이 이의 아미노산 서열에서 자연적으로 발생할 수 있다. 일부 다른 구체예에서, 그러한 반응기는 돌연변이유발을 통해 도입될 수 있다. 반응기가 돌연변이유발을 통해 도입되는 경우, 한 가지 가능성은 시스테인 잔기에 의한 적당한 위치에서의 아미노산의 돌연변이이다. 시스테인 잔기를 hTlc 뮤테인의 아미노산 서열에 도입하는 그러한 돌연변이의 예시적 가능성은 hTlc의 야생형 서열(SEQ ID NO: 1)의 Thr 40→ Cys, Glu 73→ Cys, Arg 90→ Cys, Asp 95→ Cys 및 Glu 131→ Cys 치환을 포함한다. 시스테인 잔기를 hNGAL 뮤테인의 아미노산 서열에 도입하는 그러한 돌연변이의 예시적 가능성은 hNGAL의 야생형 서열(SEQ ID NO: 2)의 14, 21, 60, 84, 88, 116, 141, 145, 143, 146 또는 158 서열 위치에 상응하는 하나 이상의 서열 위치에서 시스테인 잔기의 도입을 포함한다. 생성된 티올 모이어티는 예를 들어, 각각의 리포칼린 뮤테인의 혈청 반감기를 증가시키기 위해 뮤테인을 페길화 또는 헤실화하는데 사용될 수 있다.

일부 구체예에서, 상기 화합물 중 하나를 리포칼린 뮤테인에 컨쥬게이트하기 위한 새로운 반응기로서 적당한 아미노산 측쇄를 제공하기 위해, 리포칼린 뮤테인의 아미노산 서열에 인공 아미노산이 도입될 수 있다. 일반적으로, 그러한 인공 아미노산은 더 반응성이 있도록 설계되므로, 원하는 화합물과의 컨쥬게이션을 촉진한다. 그러한 인공 아미노산은 예를 들어, 인공 tRNA를 이용한 돌연변이유발에 의해 도입될 수 있으며, 파라-아세틸-페닐알라닌이다.

일부 구체예에서, 본 개시물의 리포칼린 뮤테인은 이의 N-말단 또는 이의 C-말단에서 단백질, 펩타이드 도메인 또는 펩타이드, 예를 들어, 항체, 신호 서열 및/또는 친화성 태그에 융합된다. 일부 다른 구체예에서, 본 개시물의 리포칼린 뮤테인은 이의 N-말단 또는 이의 C-말단에서 단백질, 단백질 도메인 또는 펩타이드; 예를 들어, 항체, 신호 서열 및/또는 친화성 태그인 파트너에 컨쥬게이트 된다.

재조합 단백질의 쉬운 검출 및/또는 정제를 가능케 하는 Strep-tag 또는 Strep-tag II(Schmidt et al., J Mol Biol, 1996), c-myc-tag, FLAG-tag, His-tag 또는 HA-tag와 같은 친화성 태그, 글루타티온-S-트랜스퍼레이즈와 같은 단백질은 적당한 융합 파트너의 예시들이다. 녹색 형광 단백질(GFP) 또는 황색 형광 단백질(YFP)과 같은 발색 또는 형광 특성들을 갖는 단백질 또한 본 개시물의 리포칼린 뮤테인을 위한 적당한 융합 파트너들이다. 일반적으로, 임의의 적당한 화학물질 또는 효소로 본 개시물의 리포칼린 뮤테인을 표지함으로써 직접적으로 또는 간접적으로 화학적, 물리적, 광학적, 또는 효소적 반응으로 검출가능한 화합물 또는 신호를 생성하는 것이 가능하다. 예를 들어, 형광 또는 방사성 표지는 리포칼린 뮤테인에 컨쥬게이트되어 검출가능한 신호로서 형광 또는 x-선을 생성할 수 있다. 알칼라인 포스파테이즈, 호스래디쉬 페록시데이즈 및 β-갈락토시데이즈는 발색 반응 산물의 형성을 촉매하는 효소 표지(및 동시에 광학 표지)의 예시들이다. 일반적으로, 항체에 공통적으로 사용되는 모든 표지(면역글로불린의 Fc 부분에서 당 모이어티가 배타적으로 사용되는 것들은 제외)는 또한 본 개시물의 리포칼린 뮤테인과의 컨쥬게이션에 사용될 수 있다.

일부 구체예에서, 본 개시물의 리포칼린 뮤테인은 뮤테인의 혈청 반감기를 연장하는 모이어티와 융합 또는 컨쥬게이트될 수 있다(이와 관련하여, 또한, 그러한 전략이 CTLA-4에 대해 결합 친화성을 갖는 인간 호중구 젤라티네이즈-관련 리포칼린(hNGAL)의 뮤테인에 대해 참조로 기술되어 있는 국제특허공개 제WO2006/056464호를 참조). 혈청 반감기를 연장하는 모이어티는 몇 가지만 말해보면, PEG 분자, HES 분자, 지방산 분자, 예컨대, 팔미트산(Vajo and Duckworth, Pharmacol Rev, 2000), 면역글로불린의 Fc 부분, 면역글로불린의 C_H3 도메인, 면역글로불린의 C_H4 도메인, 알부민 결합 펩타이드, 알부민 결합 단백질, 또는 트랜스페린일 수 있다.

일부 구체예에서, PEG가 컨쥬게이션 파트너로 사용되는 경우, PEG 분자는 치환, 비치환, 선형 또는 분지형일 수 있다. 또한, 활성화된 폴리에틸렌 유도체일 수 있다. 적당한 화합물의 예시는 인터페론과 관련하여 국제공개특허 제WO 1999/64016호, 미국 특허 제6,177,074호 또는 미국 특허 제6,403,564호에서 기술된 바와 같은 또는 PEG-변형된 아스파라기네이즈, PEG-아데노신 디아미네이즈(PEG-ADA) 또는 PEG-슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈와 같은 다른 단백질에 대해 기술된 바와 같은(Fuertges and Abuchowski, Journal of Controlled Release, 1990) PEG 분자이다. 그러한 고분자, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜의 분자량은 예를 들어 약 10,000, 약 20,000, 약 30,000, 또는 약 40,000 달톤의 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜을 포함하여 약 300 내지 약 70,000 달톤 범위일 수 있다. 더욱이, 예를 들어, 미국 특허 제6,500,930호 또는 제6,620,413호에서 기술된 바와 같이, 탄수화물 올리고머 및 HES와 같은 폴리머는 혈청 반감기 연장의 목적을 위해 본 개시물의 뮤테인에 컨쥬게이트 될 수 있다.

일부 구체예에서, 면역글로불린의 Fc 부분이 본 개시물의 리포칼린 뮤테인의 혈청 반감기를 연장하기 위한 목적을 위해 사용되는 경우, Syntonix Pharmaceuticals, Inc.(MA, USA)로부터 상업적으로 이용가능한 SynFusion™ 기술이 사용될 수 있다. 이 Fc-융합 기술의 사용은 더 오래 지속되는 바이오약품을 만들 수 있으며, 예를 들어 항체의 Fc 영역에 연결된 2 카피의 뮤테인으로 구성되어 약동학, 가용성 및 생산 효율을 개선할 수 있다.

리포칼린 뮤테인의 혈청 반감기를 연장하는데 사용될 수 있는 알부민 결합 펩타이드의 예시는 예를 들어, 미국 공개특허 제20030069395호 또는 Dennis et al.(2002)에 기술된 바와 같이 Cys-Xaa₁-Xaa₂-Xaa₃-Xaa₄-Cys 공통 서열(consensus sequence)을 갖는 것들이며, Xaa₁는 Asp, Asn, Ser, Thr 또는 Trp이고; Xaa₂는 Asn, Gln, His, Ile, Leu, 또는 Lys이며; Xaa₃는 Ala, Asp, Phe, Trp 또는 Tyr이고; 및 Xaa₄는 Asp, Gly, Leu, Phe, Ser 또는 Thr이다. 혈청 반감기를 연장하기 위해 리포칼린 뮤테인에 융합 또는 컨쥬게이트 된 알부민 결합 단백질은 세균성 알부민 결합 단백질, 항체, 도메인 항체를 포함하는 항체 단편(예를 들어, 미국 특허 제6,696,245호 참조), 또는 알부민에 대해 결합 활성을 갖는 리포칼린 뮤테인일 수 있다. 세균성 알부민 결합 단백질의 예시는 스트렙토코컬 단백질 G를 포함한다(Konig and Skerra, J Immunol Methods, 1998).

일부 구체예에서, 알부민-결합 단백질이 항체 단편인 경우, 그것은 도메인 항체일 수 있다. 도메인 항체(dAbs)는 생물리학적 특성 및 인 비보 반감기에 대한 정밀한 제어를 허용하도록 조작되어 최적의 안전성 및 효능 제품 프로파일을 생성한다. 도메인 항체는 예를 들어, Domantis Ltd.(Cambridge, UK, and MA, USA)로부터 상업적으로 이용할 수 있다.

일부 구체예에서, 알부민 자체(Osborn et al., J Pharmacol Exp Ther, 2002) 또는 알부민의 생물학적 활성 단편이 본 개시물의 리포칼린 뮤테인의 파트너로서 사용되어 혈청 반감기를 연장할 수 있다. 용어 "알부민"은 인간 혈청 알부민 또는 소 혈청 알부민 또는 랫트 알부민과 같은 모든 포유동물 알부민을 포함한다. 알부민 또는 이의 단편은 미국 특허 제5,728,553호 또는 유럽 공개특허 제EP0330451호 및 제EP0361991호에 기술된 바와 같이 재조합으로 생산될 수 있다. 따라서, 재조합 인간 알부민(예를 들어, Recombumin®, Novozymes Delta Ltd., Nottingham, UK)은 본 개시물의 리포칼린 뮤테인에 컨쥬게이트 또는 융합될 수 있다.

일부 구체예에서, 트랜스페린이 본 개시물의 리포칼린 뮤테인의 혈청 반감기를 연장하기 위한 파트너로서 사용되는 경우, 뮤테인은 비-글리코실화된 트랜스페린의 N 또는 C 말단 또는 둘 다에 유전적으로 융합될 수 있다. 비-글리코실화된 트랜스페린은 14-17일의 반감기를 가지며, 트랜스페린 융합 단백질은 유사하게 연장된 반감기를 가질 것이다. 트랜스페린 담체 또한 높은 생체이용가능성, 생체내분포 및 순환 안정성을 제공한다. 이 기술은 BioRexis(BioRexis Pharmaceutical Corporation, PA, USA)로부터 상업적으로 이용가능하다. 단백질 안정화제/반감기 연장 파트너로 사용하기 위한 재조합 인간 트랜스페린(DeltaFerrin™)은 또한 Novozymes Delta Ltd.(Nottingham, UK)으로부터 상업적으로 이용할 수 있다.

본 개시물의 리포칼린 뮤테인의 반감기를 연장하기 위한 또 다른 대안으로 뮤테인의 N- 또는 C-말단에 길고 비구조적인 유연한 글리신-풍부 서열(예를 들어, 약 20 내지 80의 연속적인 글리신 잔기를 갖는 폴리-글리신)을 융합하는 것이다. 예를 들어, 국제공개특허 제WO2007/038619호에 개시된 이 접근법은 "rPEG"(재조합 PEG)라 부른다.

E. CD137 및 PD-L1에 특이적인 융합 단백질의 예시 용도 및 적용

일부 구체예에서, 본 개시물의 융합 단백질은 CD137 및 PD-L1의 이중-표적화를 통해 상승적 효과를 생성할 수 있다. 일부 구체예에서, 본 개시물의 융합 단백질은 C137 보조-자극 및 PD-1/PD-L1 경로 억제를 통해 상승적 효과를 생성할 수 있다. 일부 구체예에서, 본 개시물의 융합 단백질은 CD137 및 PD-L1의 이중-표적화를 통해 국소화 항-종양 효과를 생성할 수 있다. 따라서, 본 개시물의 융합 단백질에 대한 수많은 가능한 적용이 의약에 존재한다.

일부 구체예에서, 본 개시물은 CD137 및 PD-L1의 동시 결합을 위해 본 명세서에서 개시된 하나 이상의 융합 단백질 또는 그러한 융합 단백질을 포함하는 하나 이상의 조성물의 용도를 포함한다.

본 개시물은 또한 CD137 및/또는 PD-L1과의 복합체 형성에 대해 기술된 바와 같은 하나 이상의 융합 단백질의 용도에 관한 것이다.

따라서, 본 개시물의 일 양태에서, 제공된 융합 단백질은 CD137 및 PD-L1의 검출을 위해 사용될 수 있다. 그러한 용도는 적당한 조건 하에서 CD137 및/또는 PD-L1을 포함하는 것으로 의심되는 샘플을 하나 이상의 상기 융합 단백질과 접촉시켜 융합 단백질과 CD137 및/또는 PD-L1 사이에 복합체가 형성되도록 하는 단계, 및 적당한 신호에 의해 복합체를 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 검출가능한 신호는 상기 설명된 바와 같이, 표지, 또는 결합, 즉 복합체 형성 그 자체로 인한 물리적 특성들의 변화에 의해 초래될 수 있다. 일 예시는 표면 플라즈몬 공명이며, 그 값은 금박과 같은 표면에 고정된 결합 파트너의 결합 동안 변화된다.

본 개시물의 융합 단백질은 또한 CD137 및/또는 PD-L1의 분리에 사용될 수 있다. 그러한 용도는 적당한 조건 하에서 CD137 및/또는 PD-L1을 포함하는 것으로 추정되는 샘플을 하나 이상의 상기 융합 단백질과 접촉시켜 융합 단백질과 CD137 및/또는 PD-L1 사이에 복합체가 형성되도록 하는 단계, 및 샘플로부터 복합체를 분리하는 단계를 포함할 수 있다.

일부 양태에서, 본 개시물은 본 개시물에 따른 하나 이상의 융합 단백질을 포함하는 진단 및/또는 분석 키트를 제공한다.

진단에서의 그들의 용도 외에, 또 다른 양태에서, 본 개시물은 본 개시물의 하나 이상의 융합 단백질 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물을 고려한다.

또한, 일부 구체예에서, 본 개시물은 항-종양제 및/또는 항-감염제 및 면역 조절제처럼 사용하기 위한 CD137 및/또는 PD-L1과 동시에 결합하는 융합 단백질을 제공한다. 일부 구체예에서, 본 개시물의 융합 단백질은 인간 질환, 예를 들어 PD-L1-양성 암을 포함하여 다양한 암의 예방, 개선 또는 치료 방법에 사용되는 것이 예상된다. 따라서, 또한 치료적 유효량의 본 개시물의 하나 이상의 융합 단백질을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 이를 필요로 하는 대상체에서 PD-L1-양성 암을 포함하여 다양한 암과 같은 인간 질환을 예방, 개선 또는 치료하는 방법이 제공된다.

본 개시물의 융합 단백질을 이용하여 치료될 수 있는 암의 예시는 간암, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 유방암, 폐암, 피부 또는 안구내 악성 흑색종, 신장암, 자궁암, 난소암, 대장암, 결장암, 직장암, 항문 부위의 암, 위암, 고환암, 자궁암, 나팔관의 암종, 자궁내막의 암종, 자궁경부의 암종, 질의 암종, 외음부의 암종, 비-호지킨 림프종, 식도암, 소장암, 내분비계암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연부조직의 육종, 요도암, 음경암, 소아 고형 종양, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 요관의 암, 신우 암종, 중추신경계(CNS)의 신생물, 원발성 CNS 림프종, 종양 혈관형성, 척추 축 종양, 뇌 줄기 신경아교종, 뇌하수체 선종, 카포시 육종, 유표피암, 편평세포 암, 석면에 의해 유도된 것들을 포함한 환경적으로 유도된 암, 예를 들어 다발성 골수종을 포함하는 혈액암, B 세포 림프종, 호지킨 림프종/원발성 종격 B-세포 림프종, 비-호지킨 림프종, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 림프모구 백혈병, 소포 림프종, 미만성 거대 B-세포 림프종, 버킷 림프종, 면역아세포 거대세포 림프종, 전구체 B-림프구성 림프종, 외투세포 림프종, 급성 림프구성 림프종, 균상식 육종(mycosis fungoides), 역형성 대세포 림프종, T 세포 림프종 및 전구체 T-림프구성 림프종 및 상기 암의 임의의 조합을 포함한다. 일부 구체예에서, 본 발명은 전이암의 치료에도 적용할 수 있다.

일부 구체예에서, 본 개시물의 융합 단백질은 PD-L1이 발현되는 종양 세포를 표적으로 하고 및 그러한 종양 세포 주변에 있는 숙주 면역계의 림프구를 동시에 활성화할 수 있다. 일부 구체예에서, 본 개시물의 융합 단백질은 표적으로 하는 항-종양 T 세포 활성을 증가시키고, 항-종양 면역을 향상시키며, 및/또는 종양 성장에 직접적인 억제 효과를 가지고 있어 상승적 항-종양 결과를 생성할 수 있다. 일부 구체예에서, 본 개시물의 융합 단백질은 종양 미세환경에서 면역 반응을 활성화시킬 수 있다. 일부 구체예에서, 본 개시물의 융합 단백질은 건강한 세포에 대한 효과기 림프구의 부작용, 즉, 예를 들어 종양유전자 활성을 국소적으로 억제하고 림프구 활성화를 유도함으로써 표적외 독성을 줄일 수 있다.

일부 구체예에서, 본 개시물은 PD-L1-양성 종양 세포의 주변에서 국소화 림프구 반응을 유도하기 위한 본 개시물의 융합 단백질 또는 제공된 융합 단백질을 포함하는 조성물의 용도를 포함한다. 따라서, 일부 구체예에서, 본 개시물은 본 개시물의 하나 이상의 융합 단백질 또는 그러한 융합 단백질을 포함하는 하나 이상의 조성물을 적용하는 것을 포함하는 PD-L1-양성 종양 세포의 주변에서 국소화 림프구 반응을 유도하는 방법을 제공한다. "국소화"는 CD137을 통해 T-세포와 결합하고 동시에 PD-L1-양성 종양 세포와 결합할 때, T-세포는 PD-L1-양성 세포의 주변에서 사이토카인, 특히 IL-2 및/또는 IFN 감마를 생성함을 의미한다. 그러한 사이토카인은 T-세포의 활성화를 초래하고 나서 다른 살해 세포, 예컨대 T-세포 또는 NK 세포를 끌어당겨 직접적으로 또는 간접적으로 PD-L1-양성 세포를 죽일 수 있다.

일부 구체예에서, 본 개시물은 T-세포를 보조자극하고, 및/또는 CD137의 다운스트림 신호전달 경로를 활성화하기 위한 본 개시물의 융합 단백질 또는 그러한 융합 단백질을 포함하는 조성물의 용도를 포함한다. 바람직하게는, 제공된 융합 단백질은 PD-L1이 발현되는 종양 세포와 결합하는 경우 T-세포를 보조-자극하고, 및/또는 CD137의 다운스트림 신호전달 경로를 활성화시킨다. 따라서, 본 개시물은 본 개시물의 하나 이상의 융합 단백질 및/또는 그러한 융합 단백질을 포함하는 하나 이상의 조성물을 적용하는 것을 포함하는 바람직하게는 PD-L1이 발현되는 종양 세포와 결합하는 경우 T 림프구 증식을 유도 및/또는 CD137의 다운스트림 신호전달 경로를 활성화하는 방법을 제공한다.

일부 구체예에서, 본 개시물은 CD137 클러스터링 및 T-세포에 대한 활성화를 유도하고, PD-L1이 발현된 종양 세포에 그러한 T 세포를 인도하기 위한 본 개시물의 융합 단백질 또는 그러한 융합 단백질을 포함하는 조성물의 용도를 포함한다.

이 개시물의 추가의 목적, 단점 및 특징들은 하기의 실시예 및 첨부된 이의 도면들의 조사 시 당업자에게 명백할 것이며, 제한하려는 의도는 아니다. 따라서, 본 개시물이 예시 구체예 및 선택적 특징들에 의해 상세하게 개시된다고 할지라도, 본 명세서에서 개시된 여기에서 구체화된 본 개시물의 변형 및 변이는 당업자에 의해 좌우될 수 있으며, 그러한 변형 및 변이는 이 개시물의 범위 내에 있다고 간주되는 것으로 이해되어야 한다.

F. CD137 및 PD-L1에 특이적인 제공된 예시 융합 단백질의 생성

일부 구체예에서, 본 개시물은 제공된 융합 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자(DNA 및 RNA)를 제공한다. 일부 구체예에서, 본 개시물은 제공된 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포를 포함한다. 유전자 코드의 축퇴는 특정 코돈의 같은 아미노산을 특정하는 다른 코돈으로의 치환을 허용하므로, 본 개시물은 본 명세서에서 기술된 바와 같은 융합 단백질을 인코딩하는 특정 핵산 분자에 제한되는 것이 아니라, 오히려 기능적 융합 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 모든 핵산 분자를 포함한다. 이와 관련하여, 본 개시물은 또한 제공된 융합 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 관한 것이다.

핵산 분자, 예컨대 DNA는 만약 그것이 전사 및/또는 번역 조절에 관한 정보를 포함하는 서열 요소들을 포함하는 경우, "핵산 분자를 발현할 수 있는" 또는 "뉴클레오티드 서열의 발현을 가능하게 할 수 있는"으로서 지칭되며, 그러한 서열은 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 "작동가능하게 연결된"다. 작동가능한 연결은 조절 서열 요소 및 발현되는 서열이 유전자를 발현할 수 있는 방식으로 연결되는 결합이다. 유전자 발현에 필수적인 조절 영역의 정확한 본성은 종 사이에 다양할 수 있으나, 일반적으로, 이들 영역은 원핵생물에서 프로모터 그 자체 즉, 전사의 개시를 인도하는 DNA 요소들, 그리고 RNA로 전사될 때 번역의 개시를 알리는 DNA 요소들 둘 다를 포함하는 프로모터를 포함한다. 그러한 프로모터 영역은 보통 전사 및 번역의 개시에 관련된 5' 비-코딩 서열, 예컨대 원핵생물에서 -35/-10 박스 및 샤인-달가노 요소, 진핵생물에서 TATA 박스, CAAT 서열 및 5'-캡핑 요소들을 포함한다. 이들 영역은 또한 인핸서 또는 리프레서 요소들, 그리고 숙주 세포의 특정 구획에 천연 단백질을 표적으로 삼기 위한 번역된 신호 및 리더 서열을 포함할 수 있다.

게다가, 3' 비-코딩 서열은 전사 종결, 폴리아데닐화 등에 관련된 조절 요소들을 포함할 수 있다. 그러나, 이들 종결 서열이 특정 숙주 세포에서 만족할만하지 않는다면, 그들은 그 세포에서 기능적 신호로 치환될 수 있다.

따라서, 본 개시물의 핵산 분자는 하나 이상의 조절 서열, 예컨대 프로모터 서열에 "작동가능하게 연결"되어 이 핵산 분자의 발현을 가능케 할 수 있다. 일부 구체예에서, 본 개시물의 핵산 분자는 프로모터 서열 및 전사 종결 서열을 포함한다. 적당한 진핵생물의 프로모터는 예를 들어 tet 프로모터, lacUV5 프로모터 또는 T7 프로모터이다. 진핵세포에서 발현에 유용한 프로모터의 예시는 SV40 프로모터 또는 CMV 프로모터이다.

일부 구체예에서, 이 출원에서 개시된 리포칼린 뮤테인을 인코딩하는 핵산 분자는 본 개시물의 면역글로불린을 인코딩하는 다른 핵산 분자에 "작동가능하게 연결"되어 본 명세서에서 개시된 융합 단백질의 발현을 가능케할 수 있다.

일부 구체예에서, 제공된 방법은 hTlc의 선형 폴리펩타이드 서열(SEQ ID NO: 1)의 5, 26-31, 33-34, 42, 46, 52, 56, 58, 60-61, 65, 71, 85, 94, 101, 104-106, 108, 111, 114, 121, 133, 148, 150 및 153 위치에 상응하는 하나 이상의 위치를 코딩하는 뉴클레오티드 삼중항에서 성숙한 hTlc를 인코딩하는 적어도 하나의 핵산 분자에 돌연변이유발을 적용하여 제공된 융합 단백질에 포함되는 리포칼린 뮤테인을 얻는 것을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 제공된 방법은 hNGAL의 선형 폴리펩타이드 서열(SEQ ID NO: 2)의 28, 36, 40-41, 49, 52, 65, 68, 70, 72-73, 77, 79, 81, 83, 87, 94, 96, 100, 103, 106, 125, 127, 132 및 134 위치에 상응하는 하나 이상의 위치를 코딩하는 뉴클레오티드 삼중항에서 성숙한 hNGAL을 인코딩하는 적어도 하나의 핵산 분자에 돌연변이유발을 적용하여 제공된 융합 단백질에 포함되는 리포칼린 뮤테인을 얻는 것을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 제공된 방법은 hNGAL의 선형 폴리펩타이드 서열(SEQ ID NO: 2)의 20, 25, 28, 33, 36, 40-41, 44, 49, 52, 59, 68, 70-73, 77-82, 87, 92, 96, 98, 100, 101, 103, 122, 125, 127, 132 및 134 위치에 상응하는 하나 이상의 위치에 대해 코딩하는 뉴클레오티드 삼중항에서 성숙한 hNGAL을 인코딩하는 적어도 하나의 핵산 분자에 돌연변이유발을 적용하여 제공된 융합 단백질에 포함되는 리포칼린 뮤테인을 얻는 것을 포함할 수 있다.

게다가, 융합 단백질에 포함되는 본 개시물의 hTlc 뮤테인 또는 hNGAL 뮤테인과 관련하여, 일부 구체예에서, Cys 61 및 Cys 153, 또는 Cys 76 및 Cys 175 사이에 각각 자연적으로 발생하는 이황화 결합이 제거될 수 있다. 따라서, 그러한 뮤테인은 예를 들어 그람-음성 세균의 세포질에서 환원하는 레독스 환경(reducing redox milieu)을 갖는 세포 구획에서 생성될 수 있다.

융합 단백질에 포함되는 본 개시물의 제공된 hTlc 뮤테인 또는 hNGAL 뮤테인과 추가로 관련하여, 본 개시물은 또한 일부 구체예에서 실험적 돌연변이유발의 지정된 서열 위치 외에 하나 이상의 추가 돌연변이를 포함할 수 있는 그러한 뮤테인을 인코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 그러한 돌연변이는 종종 내성을 갖게 되거나, 또는 심지어 예를 들어 그들이 리포칼린 뮤테인 및/또는 융합 단백질의 개선된 폴딩 효율, 혈청 안정성, 열적 안정성 또는 리간드 결합 친화성에 기여하는 경우, 장점이 있는 것으로 입증할 수 있다.

일부 구체예에서, 제공된 핵산 분자는 또한 벡터 또는 임의의 다른 종류의 클로닝 비히클, 예컨대 플라스미드, 파지미드, 파지, 배큘로바이러스, 코스미드 또는 인공 염색체일 수 있다.

일부 구체예에서, 제공된 핵산 분자는 파지미드에 포함될 수 있다. 이 맥락에서 사용된 바와 같이, 파지미드 벡터는 주형 파지의 유전자사이(intergenic) 지역을 인코딩하는 벡터, 예컨대 M13 또는 f1, 목적 cDNA에 융합된 이의 기능성 부분을 나타낸다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 제공된 파지미드 벡터 및 적당한 헬퍼 파지(예를 들어, M13K07, VCS-M13 또는 R408)로 세균성 숙주 세포의 초감염 후 온전한 파지 입자가 생성되어 파지 표면에 디스플레이된 이의 상응하는 폴리펩타이드에 대한 인코딩된 이종 cDNA의 물리적 커플링이 가능하다(Lowman, Annu Rev Biophys Biomol Struct, 1997, Rodi and Makowski, Curr Opin Biotechnol, 1999).

다양한 구체예에 따라, 클로닝 비히클은 상기 기술된 조절 서열 및 본 명세서에서 기술된 바와 같은 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 서열 외에 발현 그리고 형질전환되거나 또는 형질감염된 세포 상에 선별가능한 표현형을 주는 선별 마커에 사용되는 숙주 세포에 필적할만한 종 유래의 복제 및 제어 서열을 포함할 수 있다. 많은 수의 적당한 클로닝 벡터가 당업계에 공지되어 있으며, 상업적으로 이용가능하다.

본 개시물은 또한 일부 구체예에서, 유전공학을 이용하여 여기에서 융합 단백질 또는 임의의 서브유닛을 코딩하는 핵산에서 출발하는 본 개시물의 융합 단백질의 생산 방법에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 제공된 방법은 인 비보에서 시행될 수 있으며, 제공된 융합 단백질은 예를 들어 세균 또는 진핵 숙주 생물에서 생산되고 나서 이 숙주 생물 또는 이의 배양물로부터 분리된다. 예를 들어, 인 비트로 번역 시스템을 이용하여 인 비트로에서 본 개시물의 융합 단백질을 생산하는 것 또한 가능하다.

인 비보에서 융합 단백질을 생산하는 경우, 그러한 융합 단백질을 인코딩하는 핵산은 당업계에 잘 알려진 재조합 DNA 기술을 이용하여 적당한 세균 또는 진핵 숙주 생물에 도입될 수 있다. 일부 구체예에서, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 융합 단백질을 인코딩하는 DNA 분자(예를 들어, SEQ ID NOs: 138-144) 및 특히 그러한 융합 단백질의 코딩 서열을 포함하는 클로닝 벡터는 유전자를 발현할 수 있는 숙주 세포에 형질전환될 수 있다. 형질전환은 표준 기술을 이용하여 수행될 수 있다. 따라서, 본 개시물은 본 명세서에서 개시된 바와 같은 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.

일부 구체예에서, 형질전환된 숙주 세포는 본 개시물의 융합 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 발현에 적당한 조건 하에서 배양될 수 있다. 일부 구체예에서, 숙주 세포는 원핵생물, 예컨대 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli(E. coli)) 또는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 또는 진핵생물, 예컨대 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), SF9 또는 High5 곤충 세포, 불멸화 포유동물 세포주(예를 들어, HeLa 세포 또는 CHO 세포) 또는 프라이머리 포유동물 세포일 수 있다.

일부 구체예에서, 본 명세서에서 개시된 융합 단백질에 포함되는 본 개시물의 리포칼린 뮤테인은 분자내 이황화 결합을 포함하는 곳에서, 적당한 신호 서열을 이용하여 산화하는 레독스 환경(oxidizing redox milieu)을 갖는 세포 구획에 초기의 단백질을 인도하는 것이 바람직할 수 있다. 그러한 산화하는 환경은 그람-양성 세균의 세포외 공간 또는 진핵세포의 소포체의 루멘에서 대장균(E. coli)과 같은 그람-음성 세균의 페리플라즘에 의해 제공될 수 있으며, 보통 구조적 이황화 결합의 형성을 선호한다.

일부 구체예에서, 또한, 숙주 세포, 바람직하게는 대장균(E.coli)의 세포질에서 본 개시물의 융합 단백질을 생산하는 것이 가능하다. 이 경우에서, 제공된 융합 단백질은 가용성의 폴딩 상태로 직접적으로 얻거나, 또는 봉입체의 형태로 회수되어 인 비트로에서 복원될 수 있다. 다른 선택은 산화하는 세포내 환경을 갖는 특정 숙주 균주를 사용하여 세포질에서 이황화 결합을 형성하도록 하는 것이다(Venturi et al., J Mol Biol, 2002).

일부 구체예에서, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 본 개시물의 융합 단백질은 유전공학을 이용하여 반드시 전체로 또는 부분으로 생성 또는 생산되지는 않을 수 있다. 오히려, 그러한 단백질은 또한 많은 전통적이고 잘 알려진 기술 예컨대 단순한 유기 합성 전략, 고체상-지원 합성 기술, 상업적으로 이용가능한 자동화 합성기 중 임의의 하나에 의해, 또는 인 비트로 전사 및 번역에 의해 얻을 수 있다. 예를 들어, 그러한 융합 단백질에 포함되는 전도유망한 융합 단백질 또는 리포칼린 뮤테인은 분자 모델링을 이용하여 확인되고, 인 비트로에서 합성되며, 및 목적하는 표적(들)에 대한 결합 활성에 대해 조사하는 것이 가능하다. 단백질의 고체상 및/또는 용액상 합성 방법은 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, Bruckdorfer et al., Curr Pharm Biotechnol, 2004 참조).

일부 구체예에서, 본 개시물의 융합 단백질은 당업자에게 공지된 잘-확립된 방법들을 사용하여 인 비트로 전사/번역에 의해 생산될 수 있다.

일부 추가의 구체예에서, 본 명세서에서 개시된 바와 같은 융합 단백질은 또한 전통적인 재조합 기술을 단독으로 또는 전통적인 합성 기술과 조합하여 제조될 수 있다.

더욱이, 일부 구체예에서, 본 개시물에 따른 융합 단백질은 개개의 서브유닛, 예를 들어, 면역글로불린과 융합 단백질에 포함되는 뮤테인을 컨쥬게이션 하여 얻을 수 있다. 그러한 컨쥬게이션은 예를 들어 전통적인 방법을 이용하여 공유 또는 비-공유 결합의 모든 형태를 통해 달성될 수 있다.

숙련된 작업자는 본 개시물에 의해 고려되나 그 단백질 또는 핵산 서열이 본 명세서에서 명시적으로 개시되지 않는 융합 단백질을 제조하는데 유용한 방법을 이해할 것이다. 개요로서, 아미노산 서열의 그러한 변형은 예를 들어, 특정 제한효소를 위한 절단 부위를 편입함으로써 단백질 유전자 또는 이의 일부의 서브-클로닝을 단순화하는 단일 아미노산 위치의 직접 돌연변이유발을 포함한다. 또한, 이들 돌연변이는 이의 표적(예를 들어, CD137 및 PD-L1)에 대한 융합 단백질의 친화성을 추가로 개선하기 위해 포함될 수 있다. 더욱이, 돌연변이는 필요하다면, 폴딩 안정성, 혈청 안정성, 단백질 내성 또는 수용성을 개선하거나 또는 응집 경향을 줄이는 것과 같은 단백질의 하나 이상의 특징들을 조정하기 위해 도입될 수 있다.

V. 실시예

실시예 1: 대표적인 융합 단백질의 발현 및 분석

이 실시예에서, 대표적인 항체-리포칼린 뮤테인 융합 단백질은 SEQ ID NO: 86에 의해 제공된 중쇄를 갖거나, 또는 SEQ ID NO: 77의 중쇄 가변 도메인을 포함하거나, GFSLSNYD(HCDR1, SEQ ID NO: 60), IWTGGAT(HCDR2, SEQ ID NO: 61), VRDSNYRYDEPFTY(HCDR3; SEQ ID NO: 62)의 CDR을 포함하고 및 SEQ ID NO: 87에 의해 제공된 경쇄, 또는 SEQ ID NO: 82의 중쇄 가변 도메인을 포함하거나, 또는 QSIGTN(LCDR1, SEQ ID NO: 63), YAS(LCDR2), QQSNSWPYT(LCDR3; SEQ ID NO: 64)의 CDR을 포함하는 PD-L1 특이 항체와, SEQ ID NO: 42의 CD137-특이 리포칼린 뮤테인을 링커, 예컨대, SEQ ID NO: 13의 비구조화 (G₄S)₃링커를 통해 융합하여 PD-L1 및 CD137을 동시에 결합함으로써 생성된다. 생성되는 상이한 포맷은 도 1에 묘사된다. 예를 들어, 그러한 융합 단백질, 예를 들어, SEQ ID NOs: 90 및 87, SEQ ID NOs: 86 및 91, SEQ ID NOs: 92 및 87, SEQ ID NOs: 86 및 93, SEQ ID NOs: 94 및 87, 및 SEQ ID NOs: 90 및 91은 SEQ ID NO: 42의 리포칼린 뮤테인 중 하나 이상을 SEQ ID NO: 86에 의해 제공된 중쇄에 의해 제공된 중쇄, 또는 SEQ ID NO: 77의 중쇄 가변 도메인을 포함하거나, 또는 GFSLSNYD(HCDR1, SEQ ID NO: 60), IWTGGAT(HCDR2, SEQ ID NO: 61), VRDSNYRYDEPFTY(HCDR3; SEQ ID NO: 62)의 CDR을 포함하고, 및 SEQ ID NO: 87에 의해 제공된 경쇄, 또는 SEQ ID NO: 82의 중쇄 가변 도메인을 포함하거나, 또는 QSIGTN(LCDR1, SEQ ID NO: 63), YAS(LCDR2), QQSNSWPYT(LCDR3; SEQ ID NO: 64)의 CDR을 포함하는 항체의 4개의 말단 중 하나 이상에 융합함으로써 생성될 수 있다. 생성된 융합 단백질은 CD137에 대해 2가(예를 들어, 도 1A-1D에 묘사된 바와 같이), CD137에 대해 4가(예를 들어, 도 1E-1H에 묘사된 바와 같이), 또는 CD137에 훨씬 더 높은 결합가(예를 들어, 도 1I에 묘사된 바와 같이)일 수 있다.

PD-L1 특이적인 항체 그리고 본 실시예에서 기술된 모든 항체 리포칼린 뮤테인 융합 단백질은 S228P 돌연변이가 포함되어 인 비트로 및 인 비보에서 IgG4 반-항체 교환을 최소화하는 조작된 IgG4 백본을 가지고 있다(Silva et al., J Biol Chem, 2015). IgG4 백본에서 추가의 돌연변이 역시 모든 항체에서 존재할 수 있으며, 임의의 하나 이상의 돌연변이 F234A, L235A, M428L, N434S, M252Y, S254T, 및 T256E. F234A 및 L235A 돌연변이를 포함하는 본 명세서에서 기술된 융합 단백질이 도입되어 ADCC 및 ADCP를 줄일 수 있다(Glaesner et al., Diabetes Metab Res Rev, 2010). M428L 및 N434S 돌연변이 또는 M252Y, S254T 및 T256E 돌연변이는 연장된 혈청 반감기를 위해 도입될 수 있다(Dall'Acqua et al., J Biol Chem, 2006, Zalevsky et al., Nat Biotechnol, 2010). 모든 항체들은 이질성(heterogeneity)을 피하기 위해 카르복시-말단 리신이 없이 발현되었다.

또한, 단일특이적인 리포칼린 뮤테인 Fc 융합은 도 1J-1K에서 묘사된 바와 같은 링커, 예를 들어, SEQ ID NO: 13의 비구조화 (G4S)3 링커를 통해 SEQ ID NO: 42의 CD137 특이적인 리포칼린 뮤테인 중 하나 이상을 SEQ ID NO: 30에서 제공된 항체의 Fc 영역의 C-말단에 융합시켜 생성되었다. 생성된 구조물은 SEQ ID NOs: 88-89에서 제공된다.

본 발명은 또한 비대칭 항체-리포칼린 뮤테인 융합 포맷을 구현하며, 예를 들어, 항체 중 하나의 경쇄는 리포칼린 뮤테인과 융합될 수 있으나, 다른 하나는 그렇지 않다.

융합 단백질의 구조물은 유전자 합성에 의해 생성되며 포유동물 발현 벡터에 클로닝된다. 그리고 나서 그들은 Expi293FTM 세포(Life Technologies)에서 일시적으로 발현된다. 세포 배양 배지에서 융합 단백질의 농도는 POROS® protein A affinity column(Applied Biosystems)를 사용하는 HPLC(Agilent Technologies)에 의해 측정되었다. 융합 단백질의 역가는 표 1에 요약되었다.

융합 단백질은 단백질 A 크로마토그래피(Protein A chromatography)에 이어 인산염 완충 생리식염수(phosphate-buffered saline, PBS)에서 크기-배제 크로마토그래피(SEC)를 이용하여 정제되었다. SEC 정제 후, 단량체 단백질을 포함하는 분획을 모으고, 분석적 SEC를 사용하여 다시 분석하였다.

일시적인 발현 역가

SEQ ID NO	발현 역가 [mg/mL]
SEQ ID NOs: 90 및 87	0.05
SEQ ID NOs: 86 및 91	0.07
SEQ ID NOs: 92 및 87	0.06
SEQ ID NOs: 86 및 93	0.09
SEQ ID NOs: 94 및 87	0.06
SEQ ID NOs: 90 및 91	0.10
SEQ ID NO: 88	0.24
SEQ ID NOs: 86 및87	0.07

실시예 2: 융합 단백질의 발현

예시 융합 단백질의 구조물은 코돈 최적화를 포함하는 유전자 합성에 의해 생성되며, 포유동물 발현 벡터에 클로닝되었다. 그리고 나서 그들은 차이니즈 햄스터 오바리(CHO) 세포에서 안정적으로 발현되었다. 세포 배양 배지에서 융합 단백질의 농도는 단백질 A 센서(Protein-A sensors)가 있는 Octet(ForteBio, Pall Corp.)를 사용하여 측정되었고, 인간 IgG1 표준물질을 사용하여 정량되었다. 융합 단백질의 역가는 표 2에 요약되었다. 데이터는 융합 단백질의 기하학이 생산 수율 및 세포 생산성에 영향을 줄 수 있음을 제안한다.

안정한 발현 역가

SEQ ID NO	발현 역가 [mg/mL]
SEQ ID NOs: 90 및 87	1.423
SEQ ID NOs: 86 및 91	1.502
SEQ ID NOs: 92 및 87	0.456
SEQ ID NOs: 86 및 93	0.294
SEQ ID NOs: 94 및 87	0.293
SEQ ID NOs: 90 및 91	1.297
SEQ ID NO: 88	0.150
SEQ ID NOs: 86 및 87	1.018

실시예 3: 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 측정된 PD-L1 또는 CD137에 대한 융합 단백질의 결합

huPD-L1-His 또는 huCD137-His(C-말단에 폴리히스티딘 태그가 있는 인간 PD-L1 또는 인간 CD137, R&D Systems)에 대한 예시 융합 단백질의 결합 키네틱스 및 친화성은 Biacore 8K 또는 a Biacore T200(GE Healthcare)를 사용한 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 측정되었다.

항-인간 IgG Fc 항체(GE Healthcare)는 표준 아민 화학을 이용하여 CM5 센서 칩 상에 고정되었다: 칩 상의 카르복실기는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-ㅋ카카르보디이미드(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide)(EDC) 및 N-히드록시석신이미드(N-hydroxysuccinimide(NHS))를 이용하여 활성화되었다. 이어서, 10 mM 소듐 아세테이트(pH 5.0)에서 25 ㎍/mL 농도의 항-인간 IgG Fc 항체 용액(GE Healthcare)을 5 ㎕/min의 유속으로 6000-10000 공명 단위(RU)의 고정 수준이 도달될 때까지 적용하였다. 남아있는 반응하지 않은 NHS-에스테르는 1M 에탄올아민 용액을 표면을 가로질러 통과시킴으로써 차단되었다. 레퍼런스 채널은 아날로그 방식으로 처리되었다. 이어서, HBS-EP+ 버퍼 중 0.25 ㎍/mL 또는 0.5 ㎍/mL의 시험 융합 단백질(SEQ ID NOs: 90 및 87, SEQ ID NOs: 86 및 91, SEQ ID NOs: 92 및 87, SEQ ID NOs: 86 및 93, SEQ ID NOs: 94 및 87, SEQ ID NOs: 90 및 91, SEQ ID NO: 88, 및 SEQ ID NO: 89)은 칩 표면에서 항-인간 IgG-Fc 항체에 의해 180초 동안 10 ㎕/min의 유속으로 포획되었다. 각 포획 단계 이후, 바늘을 세척하였다. 레퍼런스 항체(SEQ ID NOs: 26 및 27) 및 융합 단백질(SEQ ID NOs: 86 및 87)에 포함된 항체를 포함하여 항-PD-L1 항체들 및 레퍼런스 항-CD137 항체(SEQ ID NOs: 28 및 29) 또한 대조군으로 시험되었다.

친화성 측정을 위해, huPD-L1-His(10 nM, 5 nM 및 2.5 nM) 또는 huCD137-His(900 nM, 300 nM, 및 100 nM)의 희석액을 HBS-EP+ 버퍼에서 제조하고, 제조된 칩 표면에 적용하였다. 결합 분석은 180초의 접촉 시간, 900초의 해리 시간 및 30 ㎕/min의 유속으로 시행되었다. 모든 측정은 25℃에서 수행되었다. 칩 표면의 재생은 3 M MgCl₂를 120초 동안 주입하여 달성되었다. 단백질 측정 전에, 컨디셔닝 목적을 위해 3개의 스타트업 사이클을 수행하였다. 데이터는 Biacore T200 Evaluation software(v2.0) 또는 Biacore 8K Evaluation software(V1.1.1)로 평가되었다. 이중 레퍼런싱이 사용되었고, 1:1 결합 모델을 사용하여 로우 데이터를 맞추었다.

대표적인 융합 단백질에 대한 k_on, k_off 및 생성된 평형 해리 상수(K_D)에 대해 측정된 값은 표 3에 요약되었다. 모든 이중특이적인 융합 단백질(SEQ ID NOs: 90 및 87, SEQ ID NOs: 86 및 91, SEQ ID NOs: 92 및 87, SEQ ID NOs: 86 및 93, SEQ ID NOs: 94 및 87, 및 SEQ ID NOs: 90 및 91)은 PD-L1 그리고 CD137과 서브나노몰에서 낮은 나노몰 친화성으로 결합한다. 단일특이적인 CD137-특이적인 리포칼린 뮤테인-Fc 융합(SEQ ID NO: 88 및 SEQ ID NO: 89)은 단지 낮은 나노몰 친화성으로 CD137과 결합한다.

SPR에 의해 측정된 융합 단백질의 키네틱스 상수 및 친화성

SEQ ID NO	huPD-L1			huCD137
SEQ ID NO	k _on [M ^-1 x s ^-1 ]	k _off [s ^-1 ]	K _D [nM]	k _on [M ^-1 x s ^-1 ]	k _off [s ^-1 ]	K _D [nM]
90 및 87	1.30E+06	7.69E-04	0.592	3.93E+04	2.55E-04	6.484
86 및 91	1.32E+06	7.48E-04	0.568	3.42E+04	1.75E-04	5.106
92 및 87	7.87E+05	8.03E-04	1.021	3.48E+04	2.08E-04	5.966
86 및 93	5.46E+05	7.54E-04	1.381	3.68E+04	1.30E-04	3.548
94 및 87	1.51E+06	9.16E-04	0.608	4.07E+04	2.24E-04	5.504
90 및 91	1.60E+06	8.61E-04	0.537	3.91E+04	2.24E-04	5.726
88	N.A.	N.A.	N.A.	3.94E+04	1.63E-04	4.155
86 및 87	1.09E+06	6.49E-04	0.593	N.A.	N.A.	N.A.
89	N.A.	N.A.	N.A.	3.66E+04	1.32E-04	3.595
26 및 27	6.38E+05	2.01E-04	0.314	N.A.	N.A.	N.A.
28 및 29	N.A.	N.A.	N.A.	4.72E+05	2.94E-03	6.237

실시예 4: ELISA에서 PD-L1 또는 CD137에 대한 융합 단백질의 결합

ELISA를 사용하여 인간 PD-L1 및 시아노몰거스 PD-L1과의 예시 융합 단백질의 결합 성향을 측정하였다.

PBS에서 1 ㎍/mL 농도의 재조합 huPD-L1-His 또는 cyPD-L1-His(C-말단에 폴리히스티딘 태그가 있는 인간 또는 시아노몰거스 PD-L1, R&D Systems 또는 Sino Biologics)는 4℃에서 오버나이트동안 마이크로타이터 플레이트 상에 코팅되었다. PBS-0.05%T(0.05%(v/v) 트윈 20이 보충된 PBS)로 세척한 후, PBS-0.1%T(0.1%(v/v) Tween 20이 보충된 PBS) 중의 2% BSA(w/v)로 실온에서 1시간 동안 플레이트를 차단하였다. 100 ㎕의 PBS-0.05%T로 5회 세척한 후, 상이한 농도의 예시 융합 단백질(SEQ ID NOs: 90 및 87, SEQ ID NOs: 86 및 91, SEQ ID NOs: 92 및 87, SEQ ID NOs: 86 및 93, SEQ ID NOs: 94 및 87, SEQ ID NOs: 90 및 91), Fc 융합 CD137-특이적인 리포칼린 뮤테인(SEQ ID NOs: 88 및 SEQ ID NO: 89) 및 항-PD-L1 항체(SEQ ID NOs: 26 및 27, SEQ ID NOs: 86 및 87)를 웰에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 추가의 세척 단계를 거쳤다. 연구 중 결합된 분자들은 PBS-0.1%T-2%BSA에서 1:5000 희석된 항-인간 IgG Fc-HRP(Jackson Laboratory)와 인큐베이션 하여 검출하였다. 추가의 세척 단계 후, 형광 HRP 기질(QuantaBlu, Thermo)을 각 웰에 첨가하고, 형광 마이크로플레이트 리더를 사용하여 형광 강도를 측정하였다.

또한, 같은 ELISA 설정을 사용하여 CD137에 대한 융합 단백질의 결합 잠재력을 측정하였으며, huCD137-His(C-말단에 폴리히스티딘 태그를 갖는 인간 CD137, R&D Systems) 또는 cyCD137-Fc(C-말단에 Fc가 융합된 시아노몰거스 CD137)가 마이크로타이터 플레이트 상에 대신 코팅되었다. 시험 시약은 유사하게 적정되었고, 결합 시약은 항-NGAL-HRP를 통해 검출되었다.

예시적인 실험의 결과는 1:1 결합 S자형 핏에서 생성된 핏 곡선과 함께 도 2A-2D에 묘사되었으며, EC₅₀ 값 및 최대 신호는 자유 매개 변수이며, 기울기는 1로 고정되었다. 생성된 EC₅₀ 값은 표 4에서 제공된다.

제공된 융합 단백질(SEQ ID NOs: 90 및 87, SEQ ID NOs: 86 및 91, SEQ ID NOs: 92 및 87, SEQ ID NOs: 86 및 93, SEQ ID NOs: 94 및 87, SEQ ID NOs: 90 및 91, SEQ ID NO: 88, 및 SEQ ID NO: 89)의 2개의 인간 표적에 대해 관찰된 EC₅₀ 값은 시험된 PD-L1 항체들(융합 단백질에 포함되는 SEQ ID NOs: 26 및 27의 레퍼런스 PD-L1 항체 및 SEQ ID NOs: 86 및 87의 PD-L1 항체) 및/또는 융합 단백질에 포함되는 CD137-특이적인 리포칼린 뮤테인(SEQ ID NO: 42)과 유사하거나 또는 필적할 만 하였다.

모든 시험된 융합 단백질은 레퍼런스 PD-L1 항체(SEQ ID NOs: 26 및 27) 또는 융합 단백질에 포함되는 PD-L1 항체(SEQ ID NOs: 86 및 87)와 필적할만한 EC₅₀ 값을 가지고 시아노몰거스 PD-L1에 교차-반응성을 나타냈다. CD137에 대해 4가인 융합 단백질(SEQ ID NOs: 94 및 87, SEQ ID NOs: 90 및 91, 및 SEQ ID NO: 88) 만이 인간 CD137에 필적할 만한 수준으로 시아노몰거스 CD137에 교차-반응성을 나타낸다. 즉, 인간 CD137에 대해 상응하는 EC₅₀과 동일한 범위의 EC₅₀값으로 시아노몰거스 CD137과 결합한다.

PD-L1 또는 CD137 결합에 대한 ELISA 데이터

SEQ ID NO	EC ₅₀ [nM] huPD-L1와 결합	EC ₅₀ [nM] cyPD-L1과 결합	EC ₅₀ [nM] huCD137과 결합	EC ₅₀ [nM] cyCD137과 결합
90 및 87	0.15	0.13	0.28	5.9
86 및 91	0.23	0.18	0.57	13
92 및 87	0.16	0.15	0.41	9.8
86 및 93	0.19	0.17	0.35	8.1
94 및 87	0.18	0.15	0.16	0.19
90 및 91	0.20	0.17	0.14	0.21
88	N.A.	N.A.	0.15	0.12
86 및 87	0.12	0.1	N.A.	N.A.
89	N.A.	N.A.	0.29	0.82
26 및 27	0.09	0.09	N.A.	N.A.
42	N.A.	N.A.	0.27	N.A.

실시예 5: ELISA에서 PD-L1 및 CD137에 대한 융합 단백질의 동시 결합

PD-L1 및 CD137과의 예시 융합 단백질의 동시 결합을 입증하기 위해 이중-결합 ELISA 포맷을 사용하였다.

PBS 중 재조합 huPD-L1-His(R&D Systems)(1 ㎍/mL)는 4℃에서 오버나이트 동안 마이크로타이터 플레이트 상에 코팅하였다. 각 인큐베이션 단계 후 플레이트는 100 ㎕의 PBS-0.1%T로 5회 세척하였다. 플레이트는 PBS-0.1%T 중 2% BSA(w/v)로 실온에서 1시간 동안 차단하고, 이어서 다시 세척하였다. 상이한 농도의 시험된 융합 단백질을 웰에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션 하며, 이어서 세척단계를 수행하였다. 이후에, 비오틴화된 huCD137-His(huCD137-His-Bio, Sino Biological)를 PBS-0.1%T-2%BSA에서 1 ㎍/mL의 일정 농도로 1시간 동안 첨가하였다. 세척 후, PBS-0.1%T-2%BSA에서 ExtrAvidin-HRP(Sigma-Aldrich)의 1:5000 희석액을 웰에 첨가하고 1시간 동안 인큐베이션 하였다. 추가의 세척 단계 후, 형광 HRP 기질(QuantaBlu, Thermo)을 각 웰에 첨가하고 형광 마이크로플레이트 리더를 사용하여 형광 강도를 검출하였다.

또한, 예시 융합 단백질의 이중 결합은 재조합 1 ㎍/mL의 huCD137-His(R&D Systems)이 마이크로타이터 플레이트 상에 코팅된 곳에서 역설정하여 시험하고, 결합된 융합 단백질은 비오틴화된 huPD-L1-His(R&D Systems)의 추가를 통해 검출되었다.

융합 단백질(SEQ ID NOs: 90 및 87, SEQ ID NOs: 86 및 91, SEQ ID NOs: 92 및 87, SEQ ID NOs: 86 및 93, SEQ ID NOs: 94 및 87, 및 SEQ ID NOs: 90 및 91)의 이중 결합 데이터는 1:1 S자형 결합 핏으로부터 생성된 핏 곡선과 함께 도 3A 및 3B에 나타내며, EC₅₀값 및 최대 신호는 자유 매개 변수이며, 기울기는 1로 고정되었다. EC₅₀값은 표 5에 요약되었다. 모든 이중특이적인 융합 단백질은 명백한 결합 신호를 나타내며, 이는 융합 단백질이 PD-L1 및 CD137과 동시에 결합할 수 있음을 입증하는 것이다. 추가로 데이터는 PD-L1 특이적인 항체의 C-말단에 CD137 특이적인 리포칼린 뮤테인을 융합하는 것은 N-말단보다 훨씬 더 이점이 있을 수 있음을 제안하였다.

PD-L1 및 CD137 둘 다의 표적의 동시 결합에 대한 ELISA 데이터

SEQ ID NO	EC ₅₀ [nM] PD-L1 캡쳐_CD137 검출	EC ₅₀ [nM] CD137 캡쳐_PD-L1 검출
90 및 87	0.58	2.9
86 및 91	0.59	3.3
92 및 87	1.2	7.2
86 및 93	0.74	6.7
94 및 87	0.48	2.6
90 및 91	0.49	2.3

실시예 6: 인간 및 시아노몰거스 CD137 및 PD-L1을 발현하는 세포에 대한 융합 단백질 결합의 플로우 사이토메트리 분석

인간 및 시아노몰거스 PD-L1 발현 세포 및 인간 및 시아노몰거스 CD137 발현 세포에 대한 융합 단백질의 표적 특이적인 결합은 플로우 사이토메트리에 의해 평가되었다.

제조업체의 설명서에 따라 Flp-In 시스템(Life technologies)을 이용하여 CHO 세포에 인간 PD-L1, 시아노몰거스 PD-L1, 인간 CD137, 시아노몰거스 CD137 또는 mock 대조군을 안정적으로 형질감염시켰다.

형질감염된 CHO 세포는 10% 우태아혈청(FCS, Biochrom) 및 500 ㎍/mL의 하이그로마이신 B(Roth)가 보충된 Ham's F12 medium(Life technologies)에서 유지되었다. 제조업체의 설명서에 따라 세포 배양 플라스크에서 세포를 배양하였다(37℃, 5% CO₂ 대기).

플로우 사이토메트리 분석을 위해, 각 세포주를 융합 단백질(SEQ ID NOs: 90 및 87, SEQ ID NOs: 86 및 91, SEQ ID NOs: 92 및 87, SEQ ID NOs: 86 및 93, SEQ ID NOs: 94 및 87, SEQ ID NOs: 90 및 91, SEQ ID NO: 88, 및 SEQ ID NO: 89)과 인큐베이션 하고, 하기에서 기술된 바와 같은 FACS 분석에서 형광 표지된 항-인간 IgG 항체를 사용하여 검출하였다:

웰당 5×10⁴ 세포를 5% 우태아혈청(PBS-FCS)를 포함하는 아이스-콜드 PBS에서 1시간 동안 인큐베이션 하였다. 융합 단백질과 대조군 항체들의 희석 시리즈를 세포에 첨가하고 아이스에서 1시간 동안 인큐베이션 하였다. PBS로 2회 세포를 세척하고, 염소 항-hIgG Alexa647-표지된 항체와 아이스에서 30분 동안 인큐베이션 하였다. 이어서 세포를 세척하고 iQue Flow cytometer(Intellicyte Screener)를 사용하여 분석하였다. 평균 기하학 형광 신호를 기입하고, 비선형 회귀(공유 ㅂ바닥, 기울기=1)를 사용하여 Graphpad software로 조정하였다.

인간 및 시아노몰거스 PD-L1 및 CD137과 결합하는 융합 단백질의 능력은 도 4에 묘사된다. 인간 및 시아노몰거스 PD-L1 발현 세포에 대한 이중특이적인 융합 단백질(SEQ ID NOs: 90 및 87, SEQ ID NOs: 86 및 91, SEQ ID NOs: 92 및 87, SEQ ID NOs: 86 및 93, SEQ ID NOs: 94 및 87, 및 SEQ ID NOs: 90 및 91)의 결합 친화성(EC₅₀s)은 한자리 나노몰 범위에 있으며, 이는 전적으로 시아노-교차반응성을 입증하는 것이다(표 6에서 요약됨). 인간 CD137 발현 세포에 대한 융합 단백질의 결합 친화성은 낮은 나노몰 범위에 있다. 시험된 융합 단백질은 전적으로 시아노몰거스 CD137(SEQ ID NOs: 94 및 87, SEQ ID NOs: 90 및 91, 및 SEQ ID NO: 88)에 교차-반응하며, 인간 CD137(SEQ ID NOs: 90 및 87, SEQ ID NOs: 86 및 91, 및 SEQ ID NO: 89)에 대한 상응하는 결합 친화성과 비교하여 6-13배 감소된 친화성으로 시아노몰거스 CD137과 결합하거나, 시아노몰거스 CD137(SEQ ID NO: 92 및 87 및 86 및 93)과 결합하지 않는다. mock 형질감염된 세포와 결합하는 융합 단백질은 없다.

인간 및 시아노몰거스 PD-L1 또는 CD137을 발현하는 세포에 대한 융합 단백질의 결합 친화성

SEQ ID NO	EC ₅₀ [nM] Flp-In-CHO::huCD137	EC ₅₀ [nM] Flp-In-CHO::cynoCD137	EC ₅₀ [nM] Flp-In-CHO::huPDL-1	EC ₅₀ [nM] Flp-In-CHO::cynoPDL-1
90 및 87	3.74	51.35	3.64	4.48
86 및 91	6.48	39.15	1.43	1.41
92 및 87	11.91	--	2.95	2.03
86 및 93	12.73	--	4.63	2.03
94 및 87	4.15	6.92	6.99	5.89
90 및 91	4.69	3.66	4.09	3.37
86 및 87	--	--	2.96	3.55
89	5.74	26.70	--	--
88	4.33	3.81	--	--
28 및 29	1.31	--	--	--

실시예 7: PD-L1 양성 종양 세포에 대한 융합 단백질의 결합 친화성

PD-L1을 발현하는 종양 세포에 대한 융합 단백질의 결합은 플로우 사이토메트리에 의해 평가되었다.

PD-L1을 발현하는 직장암 세포주 RKO는 37℃, 가습된 5% CO₂ 대기 하에서 10% FCS가 보충된 RPMI1640(Life technologies)에서 유지되었다.

플로우 사이토메트리 분석을 위해, RKO 세포를 융합 단백질과 인큐베이션하고, 실시예 6에서 기술된 바와 같은 형광 표지된 항-인간 IgG 항체를 사용하여 검출하였다.

PD-L1 양성 종양 세포와 결합하는 융합 단백질(SEQ ID NOs: 90 및 87, SEQ ID NOs: 86 및 91, SEQ ID NOs: 92 및 87, SEQ ID NOs: 86 및 93, SEQ ID NOs: 94 및 87, 및 SEQ ID NOs: 90 및 91)의 능력은 도 5에 묘사되며, 상응하는 결합 친화성(EC₅₀s)은 표 7에 요약된다. 융합 단백질의 PD-L1 발현 RKO 세포에 대한 결합 친화성은 융합 단백질에 포함된 PD-L1 항체(SEQ ID NOs: 86 및 87)에 필적하는 낮은 나노몰 또는 서브나노몰 범위에 있었다.

PD-L1 양성 종양 세포에 대한 융합 단백질의 결합 친화성

SEQ ID NO	EC ₅₀ [nM] RKO
90 및 87	0.51
86 및 91	0.45
92 및 87	1.00
86 및 93	1.38
94 및 87	0.69
90 및 91	0.53
86 및 87	0.32

실시예 8: SPR에 의한 CD137과의 결합에서 CD137L 및 융합 단백질 간의 경쟁 측정

SPR 분석을 사용하여 인간 CD137에 대한 인간 CD137L(huCD137L-His, R&D Systems) 및 예시 융합 단백질 간의 경쟁을 조사하였다. 경쟁 분석은 Biacore T200 장치(GE Healthcare)에서 25℃에서 수행되었다.

BiotinCAPture 시약(GE Healthcare)은 CAP 센서 칩 상에서 50 ㎍/mL의 농도 및 2 ㎕/min의 유속으로 300초 동안 고정되었다. 레퍼런스 채널은 아날로그 방식으로 처리되었다. 비오틴화된 huCD137-Fc(R&D systems)는 칩 표면에서 1 ㎍/mL의 농도 및 5 ㎕/min의 유속으로 300초 동안 포획되었다.

시험 융합 단백질(SEQ ID NOs: 90 및 87, SEQ ID NOs: 86 및 91, SEQ ID NOs: 92 및 87, SEQ ID NOs: 86 및 93, SEQ ID NOs: 90 및 91, SEQ ID NO: 88, 및 SEQ ID NO: 89)이 CD137과 결합하기 위해 CD137L과 경쟁하는지를 분석하기 위해, 러닝 버퍼(HBS-EP+ buffer) 또는 500 nM huCD137L-His를 칩 표면에 30 ㎕/min의 유속으로 180초 동안 적용하였다. 이어서, 시험 융합 단백질은 HBS-EP+ 버퍼에서 1 μM의 고정된 농도로 제조된 칩 표면에 적용하였다. 결합 분석은 180초의 접촉 시간, 15초의 해리 시간 및 30 ㎕/min의 유속에서 시행되었다. 대조군으로서, 동일한 매개 변수를 사용하여 버퍼 주입이 포함되었다. 칩 표면의 재생은 120초 동안 10 ㎕/min의 유속에서 6M Gua-HCl, 0,25M NaOH를 주입하고 이어서 H₂O(120초, 10 ㎕/min)로 추가의 세척 단계를 수행하였다.

생성된 센서그램의 관련 세그먼트에 대한 대표적인 예시는 SEQ ID NOs: 90 및 87, SEQ ID NOs: 86 및 91, SEQ ID NOs: 92 및 87, SEQ ID NOs: 86 및 93, SEQ ID NOs: 90 및 91, SEQ ID NO: 88, 및 SEQ ID NO: 89의 융합 단백질에 대해 도 6에서 제공된다. huCD137-Fc 단독에 대한 각 융합 단백질의 결합에 대한 SPR 추적은 실선 화살표로 표시된다. huCD137L-His이 포화된 huCD137-Fc에 대한 융합 단백질의 결합에 대한 SPR 추적은 점선 화살표로 표시된다. 데이터는 모든 융합 단백질이 huCD137L의 존재 하에서 huCD137과 결합하지만, CD137L 부재 시 CD137과의 그들의 결합과 비교하여 약간 감소된 신호를 가짐을 보인다. 이는 시험된 융합 단백질들이 어느 정도 CD137과의 CD137L의 결합에 의해 입체적으로 방해받을 수 있음을 제안한다. 이 융합 단백질(SEQ ID NOs: 90 및 87, SEQ ID NOs: 86 및 91, SEQ ID NOs: 92 및 87, SEQ ID NOs: 86 및 93, SEQ ID NOs: 90 및 91, SEQ ID NO: 88, 및 SEQ ID NO: 89)의 결합 거동은 항-CD137 항체 SEQ ID NOs: 28 및 29와 유사하다.

실시예 9: ELISA를 이용하여 측정된 PD-1과의 결합에서 PD-L1과 융합 단백질의 경쟁

PD-1 및 PD-L1 간의 상호작용을 억제하는 융합 단백질의 능력을 입증하기 위해, 경쟁적 ELISA 포맷을 사용하였다.

PBS에서 재조합 huPD-1-His(Acrobiosystems)(1 ㎍/mL)는 4℃에서 오버나이트동안 마이크로타이터 플레이트 상에 코팅되었다. 각 인큐베이션 후, 100 ㎕의 PBS-0.1%T(0.1%(v/v) 트윈 20이 보충된 PBS)로 5회 플레이트를 세척하였다. PBS-0.1%T(0.1%(v/v) 트윈 20이 보충된 PBS)에서 2% BSA(w/v)로 실온에서 1시간 동안 플레이트를 차단하고, 이어서 다시 세척하였다. 상이한 농도의 융합 단백질을 추적자로서 15 nM의 재조합 huPD-L1-Fc(R&D systems)와 혼합하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션 하였다. 융합 단백질 및 추적자의 혼합물을 플레이트에 첨가하고, 실온에서 20분간 인큐베이션하고, 이어서 100 ㎕의 PBS-0.05%T로 5회 세척 단계를 수행하였다. 이어서, 염소-항 인간 IgG-Fc HRP(Jackson)의 1:5000 희석액을 웰에 첨가하고 1시간 동안 인큐베이션 하였다. 추가의 세척 단계 후, 형광 HRP 기질(QuantaBlu, Thermo)을 각 웰에 첨가하고, 형광 마이크로플레이트 리더를 사용하여 형광 강도를 검출하였다.

예시 융합 단백질(SEQ ID NOs: 90 및 87, SEQ ID NOs: 86 및 91, SEQ ID NOs: 92 및 87, SEQ ID NOs: 86 및 93, 및 SEQ ID NOs: 90 및 91)의 경쟁 데이터는 1:1 S자형 결합 핏으로부터 생성된 핏 곡선과 함께 도 7에 도시되며, IC₅₀ 값 및 최대 신호는 자유 매개 변수이며, 기울기는 1로 고정되었다. IC₅₀ 값은 표 9에 요약된다. 모든 이중특이적인 융합 단백질은 항체 빌딩 블록(SEQ ID NOs: 86 및 87) 및 레퍼런스 PD-L1 항체(SEQ ID NOs: 26 및 27)에 필적할만한 IC₅₀ 값으로 PD-1/PD-L1 상호작용의 명백한 억제를 보여주었다.

PD-1과의 결합에 대한 융합 단백질과 PD-L1의 경쟁

SEQ ID NO	IC ₅₀ [nM]
90 및 87	2.3
86 및 91	3.0
92 및 87	3.4
86 및 93	3.2
94 및 87	2.4
90 및 91	2.8
86 및 87	3.5
26 및 27	3.8

실시예 10: CD137 생물학적 검정을 이용한 PD-L1 의존적 T-세포 보조-자극

PD-L1의 존재 하에서 CD137 신호전달 경로의 활성화를 유도하는 선택된 융합 단백질의 잠재력은 상업적으로 이용가능한 CD137 및 luc2 유전자(반딧불이 루시퍼레이즈의 인간화 버전)를 발현하는 안정한 이중 형질감염된 Jurkat 세포주를 이용하여 평가하는 한편, luc2 발현은 NFκB-반응 요소에 의해 구동된다. 이 생물학적 검정에서, CD137 결합은 CD137 세포내 신호전달을 초래하여 NFκB-매개 발광을 유발한다.

PD-L1을 발현하는 대장암 세포주 RKO는 실시예 7에서 기술된 바와 같이 배양되었다. 분석 하루 전, RKO 세포를 웰당 1.25×10⁴ 세포로 플레이팅하고, 37℃, 가습된 5% CO₂ 대기 하에서 오버나이트동안 부착되게 하였다.

다음날, 3.75×10⁴NFκB-Luc2/CD137 Jurkat 세포를 각 웰에 첨가한 후 다양한 농도, 전형적으로 0.001 nM 내지 5 nM의 융합 단백질 또는 레퍼런스 CD137 항체(SEQ ID NOs: 28 및 29)를 추가하였다. 가스 투과성 씰로 플레이트를 덮고, 37℃, 가습된 5% CO₂ 대기 하에서 인큐베이션 하였다. 4시간 후, 30 ㎕의 Bio-Glo™Reagent를 각 웰에 첨가하고 luminometer(PHERAstar)를 사용하여 생물발광 신호를 정량하였다. GraphPad Prism^®으로 4개의 매개 변수 로지스틱 곡선 분석을 수행하여 EC₅₀값을 계산하여 표 9에 요약하였다(공유 바닥, 고정된 기울기). 융합 단백질에 의한 CD137 결합의 PD-L1 의존성을 입증하기 위해, 같은 실험을 RKO 세포의 부재 하에서 나란히 수행하였다. 분석은 3반복으로 수행하였다.

대표적인 실험의 결과는 도 8A-8D에 묘사된다. 데이터는 모든 시험된 융합 단백질(SEQ ID NOs: 90 및 87, SEQ ID NOs: 86 및 91, SEQ ID NOs: 92 및 87, 및 SEQ ID NOs: 86 및 93)이 강한 CD137 매개된 T-세포 보조-자극을 유도하였음을 입증한다. 도 8B 및 8D는 NF-κB-Luc2/CD137 Jurkat 세포의 활성화가 PD-L1을 발현하는 종양 세포의 부재 하에서는 검출되지 않아 융합 단백질에 의한 CD137의 활성화가 PD-L1 의존적임을 보여준다. 대조적으로, 레퍼런스 항-CD137 mAb(SEQ ID NOs: 28 및 29)는 표적 세포의 여부에 상관없이 CD137 매개 T-세포 보조-자극을 보여주었다.

CD137 생물학적 검정을 이용한 T-세포 활성화의 평가

SEQ ID NO	EC ₅₀ [nM] RKO 세포 이용
90 및 87	0.0809
86 및 91	0.0889
92 및 87	0.1811
86 및 93	0.2636
28 및 29	0.8135

실시예 11: 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 이용한 T-세포 활성화 평가

T 세포 분석을 이용하여 T-세포 반응을 보조자극하고 뿐만 아니라 PD-1에 대한 PD-L1의 결합에 의해 매개되는 보조-억제를 방해하는 선택된 융합 단백질의 능력을 평가하였다. 이 목적을 위해, 상이한 농도의 융합 단백질을 스타필로코컬 엔테로톡신 B(SEB)로 자극된 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에 첨가하고 37℃에서 4일 동안 인큐베이션 하였다. IL-2 분비 수준은 상등액에서 측정하였다.

건강한 자원 기증자로부터의 PBMC는 Biochrom's 프로토콜에 따라 폴리수크로스 밀도 구배(Biocoll, 1.077 g/mL, Biochrom)를 통해 원심분리에 의해 버피 코트로부터 분리되었다. 정제된 PBMC는 90% FCS 및 10% DMSO로 구성된 버퍼에서 재현탁되고, 즉시 냉동되어 추가 사용 전까지 액체 질소에 저장되었다. 분석을 위해, PBMC를 해동하고 10% FCS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(Life Technologies)이 보충된 배양 배지(RPMI 1640, Life Technologies)에 37℃, 가습된 5% CO₂ 대기 하에서 16시간 동안 정치하였다.

하기 절차는 각 실험 조건에 대해 3반복을 사용하여 수행하였다: 2.5×10⁴ PBMC를 384 웰의 바닥이 편평한 배양 플레이트의 각 웰 내 배양 배지에서 인큐베이션 하였다. 전형적으로 10 내지 0.002 nM 범위의 융합 단백질(SEQ ID NOs: 90 및 87, SEQ ID NOs: 86 및 91, SEQ ID NOs: 92 및 87, SEQ ID NOs: 86 및 93, SEQ ID NOs: 94 및 87, 및 SEQ ID NOs: 90 및 91), 빌딩 블록 PD-L1 항체(SEQ ID NOs: 86 및 87), 레퍼런스 PD-L1 항체(SEQ ID NOs: 26 및 27), 레퍼런스 CD137 항체(SEQ ID NO: 28 및 29), 레퍼런스 CD137 항체(SEQ ID NOs: 28 및 29) 및 PD-L1 항체(SEQ ID NOs: 86 및 87 또는 SEQ ID NOs: 26 및 27)의 칵테일, 또는 이소타입 대조군(SEQ ID NOs: 24 및 25)의 희석 시리즈, 및 0.1 ng/mL의 SEB를 각 웰에 첨가하였다. 가스 투과성 씰(4titude)로 플레이트를 덮고, 37℃, 가습된 5% CO₂ 대기 하에서 4일 동안 인큐베이션 하였다. 이어서, 하기의 절차에서 기술된 바와 같은 인간 IL-2 DuoSet kit(R&D Systems)를 이용하여 상등액에서 IL-2 수준을 평가하였다.

384 웰 플레이트는 PBS 중 1 ㎕/mL의 "인간 IL-2 캡쳐 항체"로 실온에서 2시간 동안 코팅되었다. 이어서, 웰은 80 ㎕의 0.05 % Tween(PBS-T)이 보충된 PBS로 5회 세척되었다. 1% 카제인(w/w)을 포함하는 PBS-0.05%T에서 1시간 동안 차단 후, 어세이 상등액 및 배양 배지에서 희석된 IL-2 표준물질의 농도 시리즈를 각 웰에 옮기고, 4℃에서 오버나이트 동안 인큐베이션 하였다. 다음날, 0.5% 카제인을 포함하는 PBS-T에서 100 ng/mL의 염소 항-hIL-2-Bio 검출 항체(R&D Systems) 및 1㎍/mL의 설포태그(Sulfotag)-표지된 스트렙타비딘(Mesoscale Discovery)의 혼합물을 첨가하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션 하였다. 세척 후, 25 ㎕의 리딩 버퍼(Mesoscale Discovery)를 각 웰에 첨가하고, 생성된 전기화학발광(ECL) 신호는 메조스케일 디스커버리 리더(Mesoscale Discovery reader)에 의해 검출되었다. 분석 및 정량화는 메조스케일 디스커버리 소프트웨어를 이용하여 수행되었다.

대표적인 실험의 결과는 도 9에 묘사된다. SEQ ID NOs: 90 및 87, SEQ ID NOs: 86 및 91, SEQ ID NOs: 92 및 87, SEQ ID NOs: 86 및 93, SEQ ID NOs: 94 및 87, 및 SEQ ID NOs: 90 및 91의 이중특이적인 융합 단백질은 T-세포 활성화를 유도할 수 있으며, 이는 이소타입 대조군(hIgG4, Sigma)과 비교하여 증가된 IL-2 분비 수준에 의해 입증된다. IL-2 분비에서 가장 강력한 증가는 CD137(SEQ ID NOs: 94 및 87 및 SEQ ID NOs: 90 및 91)에 대해 4가의 융합 단백질에 의해, 다음으로 PD-L1-특이 항체(SEQ ID NOs: 90 및 87 및 SEQ ID NOs: 86 및 91)의 C-말단에 융합된 리포칼린 뮤테인을 갖는 CD137에 대해 2가의 융합 단백질에 의해 관찰된다. 가장 낮은 증가는 PD-L1-특이 항체(SEQ ID NOs: 92 및 87 및 SEQ ID NOs: 86 및 93)의 N-말단에 융합된 리포칼린 뮤테인을 갖는 CD137에 대해 2가의 융합 단백질에 의해 관찰되나, 여전히 레퍼런스 CD137 항체(SEQ ID NOs: 28 및 29) 및 레퍼런스 PD-L1 항체(SEQ ID NOs: 26 및 27)의 칵테일에 필적할 만하다. 모든 융합 단백질은 단일 빌딩 블록, 즉, CD137-특이 리포칼린 뮤테인-Fc(SEQ ID NO: 88 또는 SEQ ID NO: 89) 또는 빌딩 블록 PD-L1 mAb(SEQ ID NOs: 86 및 87)보다 더 높은 IL-2 분비 수준을 나타낸다.

실시예 12: PD-L1의 상이한 수준을 발현하는 종양 세포의 존재 하에서 T-세포 활성화의 평가

추가의 T 세포 분석을 사용하여 PD-L1 표적 의존적 방식에서 T-세포 활성화를 보조-자극하는 융합 단백질의 능력을 평가하였다. 융합 단백질은 상이한 PD-L1 발현 수준을 갖는 종양 세포주의 존재 하에서 항-CD3 자극된 T 세포에 대해 상이한 농도로 적용되었다. 시험된 종양 세포주는 RKO(PD-L1 고발현), HCC827(PD-L1 중간 발현) 및 Hep-G2(PD-L1 음성)를 포함한다. IL-2 분비 수준은 상등액에서 측정되었다.

건강한 자원 기증자로부터의 PBMC는 실시예 11에서 기술된 바와 같은 버피 코트로부터 분리되었다. T 림프구는 제조업체의 설명서에 따라 Pan T 세포 정제 키트(Miltenyi Biotec GmbH)를 사용하여 자성 세포 소팅에 의해 PBMC로부터 추가로 정제되었다. 정제된 Pan T 세포는 90% FCS 및 10% DMSO로 구성된 버퍼에서 재현탁되고, 즉시 냉동되어 추가 사용 전까지 액체 질소에서 저장되었다.

분석을 위해, T 세포를 해동하고, 10% FCS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(Life Technologies)이 보충된 배양 배지(RPMI 1640, Life Technologies)에서 37℃, 가습된 5% CO₂ 대기 하에서 16시간 동안 정치되었다.

하기의 절차는 각 실험 조건에 대해 3반복을 사용하여 수행되었다: 바닥이 편평한 조직 배양 플레이트를 0.25 ㎍/mL의 항-CD3 항체로 37℃에서 1시간 동안 전-코팅하고 나서 PBS로 2회 세척하였다. 종양 세포주 RKO, HCC827 또는 Hep-G2는 증식을 차단하기 위해 30 ㎍/mL의 마이토마이신 C(Sigma Aldrich)로 30분 동안 처리되었다. 그리고 나서, 마이토마이신 처리된 종양 세포는 PBS로 2회 세척되었으며, 배양 배지에서 웰당 2.5×10⁴세포로 플레이팅하여 37℃, 가습된 5% CO₂ 대기 하에서 오버나이트 동안 부착되었다. 그 전에 표적 세포는 표준 조건 하에서 성장되었고, Accutase(PAA Laboratories)를 사용하여 탈착되며 배양 배지에서 재현탁되었다.

다음날, PBS로 2회 플레이트를 세척한 후, 웰당 1.25×10⁴ T 세포를 종양 세포에 첨가하였다. 전형적으로 0.005 nM 내지 10nM 범위의 단독 또는 조합으로 사용된 융합 단백질(SEQ ID NOs: 90 및 87, SEQ ID NOs: 86 및 91, SEQ ID NOs: 92 및 87, 및 SEQ ID NOs: 86 및 93), 레퍼런스 PD-L1 항체(SEQ ID NOs: 26 및 27) 및 레퍼런스 CD137 항체(SEQ ID NO: 28 및 29) 또는 이소타입 대조군(SEQ ID NOs: 24 및 25)의 희석 시리즈를 상응하는 웰에 첨가하였다. 가스 투과성 씰로 플레이트를 덮고, 37℃, 가습된 5% CO₂대기 하에서 3일 동안 인큐베이션 하였다.

공-배양 3일 후, 상등액에서 IL-2 수준을 실시예 11에서 기술된 바와 같이 평가하였다.

예시 데이터는 도 10에 도시된다. PD-L1 특이 항체의 C-말단에 융합된 리포칼린 뮤테인을 갖는 융합 단백질(SEQ ID NOs: 90 및 87 및 SEQ ID NOs: 86 및 91)의 존재 하에서 Pan T 세포와 RKO 세포(PD-L1 고발현) 또는 HCC827(PD-L1 중간 발현)의 공-배양은 hIgG4 이소타입 대조군과 비교하여 IL-2 분비에서 명백한 증가를 유발한다. PD-L1-특이 항체의 N-말단에 융합된 리포칼린 뮤테인을 갖는 융합 단백질(SEQ ID NOs: 92 및 87 및 SEQ ID NOs: 86 및 93)에 의해 유도된 IL-2 분비의 증가는 더 약하나 레퍼런스 CD137 항체(SEQ ID NOs: 28 및 29) 및 레퍼런스 PD-L1 항체(SEQ ID NO: 26 및 27)의 칵테일보다는 여전히 더 높았다. 빌딩 블록, CD137-특이 리포칼린 뮤테인(Fc 융합, SEQ ID NO: 89) 및 PD-L1 항체(SEQ ID NO: 86 및 87)의 칵테일에서 IL-2 분비 증가는 관찰되지 않았다. 추가로, Hep-G2(PD-L1 음성)와의 공배양은 임의의 융합 단백질로 IL-2 분비 수준을 증가시키지 않았으나, 레퍼런스 CD137 항체(SEQ ID NO: 28 및 29) 및 레퍼런스 PD-L1 항체(SEQ ID NO: 26 및 27)는 그렇지 않았다.

데이터는 T 세포를 활성화하거나 또는 IL-2 분비를 증가시키는 능력에 의해 측정된 융합 단백질의 기능적 활성이 PD-L1 의존적임을 나타낸다. 대조적으로, 레퍼런스 CD137 항체(SEQ ID NOs: 28 및 29)에 의해 유도된 T-세포 활성화 또는 IL-2 분비는 레퍼런스 PD-L1 항체(SEQ ID NOs: 26 및 27)와 조합하여 사용될 때, 반드시 PD-L1 의존적인 것은 아니며 예상하기 어렵다. 더욱이, 데이터는 PD-L1 및 CD137을 표적으로 하는 이중특이적인 포맷이 PD-L1을 발현하는 표적 세포의 존재 하에서 CD137 및 PD-L1을 표적으로 하는 2개의 개별 분자들의 칵테일보다 우위에 있음을 보여준다.

실시예 13: 융합 단백질의 저장 안정성 평가

저장 안정성을 평가하기 위해, 예시 융합 단백질(SEQ ID NOs: 90 및 87, SEQ ID NOs: 86 및 91, SEQ ID NOs: 92 및 87, SEQ ID NOs: 86 및 93, SEQ ID NOs: 94 및 87, SEQ ID NO: 88, 및 SEQ ID NO: 89)을 PBS에서 1 mg/mL의 농도로 37℃에서 1주일 동안 인큐베이션 하였다. 이어서, 단량체 융합 단백질은 20 ㎍의 샘플을 Superdex×200, 3.2/300 Increase(GE Healthcare) 컬럼에 0.15 mL/min의 유속으로 적용하고, 러닝 버퍼로 PBS를 사용하여 분석적인 크기 배제를 사용하여 측정하였다. 모든 시험 융합 단백질은 PBS에서 37℃에서 1주일 간 인큐베이션 후 안정하였다. 예시적인 결과는 도 11A에 도시된다.

추가의 저장 안정성 평가는 SEQ ID NOs: 90 및 87의 선택된 융합 단백질에 대해 수행되었다. 20 mg/mL의 융합 단백질을 25 mM 히스티딘, 60 mM NaCl, 200 mM 아르기닌, pH 6에서 40℃에서 4주 동안 인큐베이션 하였다. 기능적 융합 단백질 함량은 실시예 5에 기술된 바와 같은 동시 결합 분석을 사용하여 정량적 ELISA 세팅에서 측정되었다. 예시적인 결과는 도 11B에서 도시된다.

실시예 14: CD4 ⁺ T 세포를 이용한 혼합 림프구 반응(MLR) 평가

혼합 림프구 반응(MLR) 분석을 사용하여 항원 제시 세포의 존재 하에서 CD4⁺ T-세포 활성화를 유도하는 예시 융합 단백질의 능력을 평가하였다. 다양한 농도의 융합 단백질(SEQ ID NOs: 90 및 87)은 단핵구 유래 수지상세포(moDCs) 및 미스매칭 건강한 기증자로부터의 CD4⁺ T 세포의 존재 하에서 시험되었다. 시험 물질의 존재 하에서 배양 후 6일에, IL-2 및 IFN-감마의 분비를 상등액에서 정량하였다.

PBMC는 제조업체 설명서에 따라 림포프랩(Lymphoprep) 용액을 이용하여 혈소판 채취 혈액 팩으로부터 정제하였다. 총 CD4⁺ T 림프구는 밀테니이 키트(Miltenyi kit)를 이용하여 PBMC로부터 정제하고, 90% FBS 10% DMSO의 용액에서 냉동하였다. CD14⁺ 단핵구는 CD14⁺ 비드 키트(Miltenyi)를 이용하여 정제하고, 신선하게 사용하였다.

MoDC는 50 ng/mL의 IL-4 및 100 ng/mL의 GMCSF(Miltenyi)의 존재 하에서 RPMI1640+10% FBS 및 Pen/Strep(LifeTech)에서 2×10⁶ cells/mL의 CD14⁺ 단핵구를 6일 동안 배양하여 수득하였다. 3일에, 사이토카인을 함유한 10 mL의 신선 배지를 첨가하였다. 표현형(CD14, CD1a, HLADR, PD-L1)은 FACS에 의해 분화 7일에 평가하였다.

10000 moDC는 시험 물질의 존재 하에서 RPMI에서 6일 동안 트리플렛 웰에서, U자 바닥인 96 웰에서 50000 CD4 T⁺ 세포의 존재 하에서 완전 RPMI 배지에서 배양되었다. 배양 말기에, 상등액을 즉시 냉동하고 사이토카인 정량화를 위해 저장하였다.

IL-2 수준은 Luminex 기술을 이용하여 상등액에서 측정하였고, 도 12에 도시된다. 도 12A는 융합 단백질(SEQ ID NOs: 90 및 87)은 MLR 실험의 몇 세트(N=8)에서 상응하는 빌딩 블록(SEQ ID NO: 89 및 SEQ ID NOs: 86 및 87) 단독 또는 레퍼런스 CD137 또는 PD-L1 항체(SEQ ID NOs: 28 및 29 또는 SEQ ID NOs: 26 및 27)과 비교하여 유의적으로 더 나음을 보여준다. 도 12B는 융합 단백질(SEQ ID NOs: 90 및 87)이 이소타입 항체 대조군과 비교하여 IL-2의 농도-의존적 분비를 유도하였음을 나타낸다. 융합 단백질 SEQ ID NOs: 90 및 87에 의해 유도된 IL-2 수준은 0.001 내지 20 ㎍/mL 범위의 농도에 걸쳐 레퍼런스 PD-L1 항체(SEQ ID NOs: 26 및 27) 및 레퍼런스 CD137 항체(SEQ ID NOs: 28 및 29)의 칵테일의 동량의 몰 농도와 비교하여 더 높았다.

실시예 15: CD8 ⁺ T 세포를 이용한 혼합 림프구 반응 평가

인간 CD8⁺ T 세포에서 CD137 발현 및 활성에 대한 보고가 제공되면, 항원 제시 세포의 존재 하에서 CD8⁺ T 세포 활성화를 유도하는 예시 융합 단백질의 능력을 MLR 분석에서 평가하였다. 융합 단백질(SEQ ID NOs: 90 및 87)은 미스매칭 건강한 기증자로부터의 moDCs 및 총 CD8⁺ T 세포의 존재 하에서 시험되었다. 시험 물질의 존재 하에서 배양 6일 후, IL-2 및 CD8 효과기 분자(퍼포린, 그랜자임 B 및 그랜자임 A)의 분비는 상등액에서 정량되었다.

PBMC는 제조업체의 설명서(StemCell)에 따라 림포프렙 용액을 사용하여 혈소판 채취 혈액 팩으로부터 정제되었다. 총 CD8⁺ T 림프구는 Miltenyi kit를 사용하여 PBMC로부터 정제하고 신선하게 사용하였다. CD14 양성 단핵구는 CD14⁺ 비드 키트(Miltenyi)를 사용하여 정제하고 신선하게 사용하였다.

MoDC는 50 ng/mL의 IL-4 및 100 ng/mL의 GMCSF(Miltenyi)의 존재 하에서 RPMI1640 + 10% FBS 및 Pen/Strep(LifeTech)에서 2×10⁶ cells/mL의 CD14⁺ 단핵구를 6일 동안 배양하여 수득하였다. 3일에, 사이토카인을 함유한 10 mL의 신선 배지를 첨가하였다. 표현형(CD14, CD1a, HLADR, PD-L1)은 FACS에 의해 분화 7일에 평가하였다.

10000 moDC를 U자 바닥의 96 웰(트리플렛 웰)에서 완전 RPMI 배지에서 시험 물질의 존재 하에서 50000 CD8⁺ T 세포와 함께 6일 동안 배양하였다. 배양 말기에, 상등액을 즉시 냉동하고, 분비된 인자 정량화를 위해 저장하였다.

IL-2, 퍼포린, 그랜자임 A, 및 그랜자임 B는 Luminex 기술을 이용하여 상등액에서 정량하였다. 예시적인 데이터는 도 13에 도시된다.

도 13은 융합 단백질(SEQ ID NOs: 90 및 87)이 레퍼런스 PD-L1 항체(SEQ ID NOs: 26 및 27), 레퍼런스 CD137 항체(SEQ ID NOs: 28 및 29) 또는 둘의 칵테일의 동량의 몰 농도와 비교하여 10 ㎍/mL(N=4)에서 IL-2, 퍼포린, 그랜자임 B 및 그랜자임 A의 분비에서 증가를 보여주었음을 나타낸다. 데이터는 또한 융합 단백질(SEQ ID NOs: 90 및 87)이 세포독성 CD8⁺ T 세포에 대해 활성을 가짐을 제안한다.

실시예 16: 인간 PBMC가 주입된 이종이식 마우스 모델에서 기능적 인 비보 활성의 평가

제공된 융합 단백질의 인 비보 활성을 조사하기 위해, 세포주-유래 이종이식 마우스 모델을 사용할 것이다. 따라서, 인간 암 세포주는 적어도 1주 격리된 4-6주령에서 배달된 면역 결핍 암컷 NOG 마우스에서 피하 이식될 것이다. 종양이 대략 80-100 mm³의 체적에 도달한 후, 마우스는 인간 PBMC로 치환될 것이다. 시험 화합물을 적어도 3회 주사하고, 종양 생장 및 활성을 일정하게 측정할 것이다. 연구 말기에 도달한 후, 마우스를 희생시킬 것이다. CD3-, CD4- 및 CD8-양성 세포의 종양내 침윤은 면역조직화학을 통해 평가될 것이다. IFN-감마 RNAscope는 추가 판독으로 수행될 것이다.

실시예 17: 융합 단백질의 에피토프 분석

융합 단백질이 인식하는 에피토프 및 그들이 임상적으로 연관이 있는지를 평가하기 위해, 경쟁적 ELISA 포맷을 사용하여 융합 단백질과 레퍼런스 CD137 항체 간의 경쟁을 측정하였다.

마이크로타이터 플레이트는 PBS(4 ㎍/mL) 중의 레퍼런스 CD137 항체 SEQ ID NOs: 28 및 29로 4℃에서 오버나이트 동안 코팅되었다. 각 인큐베이션 단계 후, 100 ㎕의 PBS-0.05%T(0.05%(v/v) 트윈 20이 보충된 PBS)로 플레이트를 5회 세척하였다. 플레이트는 PBS-0.1%T(0.1%(v/v) 트윈 20이 보충된 PBS) 중 2% BSA(w/v)로 실온에서 1시간 동안 차단하고, 이어서 다시 세척하였다. 상이한 농도의 융합 단백질(SEQ ID NOs: 90 및 87 및 SEQ ID NOs: 86 및 91), CD137 특이 리포칼린 뮤테인(SEQ ID NO: 42), 레퍼런스 CD137 항체(SEQ ID NOs: 28 및 29) 및 대조군 항체(SEQ ID NOs: 86 및 87)를 추적자로서 1 nM의 비오틴화된 인간 CD137 Fc 융합(huCD137-Fc-bio)과 혼합하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션 하였다. 시험 물질 및 추적자의 혼합물을 플레이트에 첨가하고, 실온에서 20분 동안 인큐베이션 후 100 ㎕의 PBS-0.05%T로 5회 세척 단계를 수행하였다. 이어서, PBS-0.1%T-2%BSA에서 ExtrAvidin-HRP(Sigma-Aldrich)의 1:5000 희석을 웰에 첨가하고 1시간 동안 인큐베이션 하였다. 추가 세척 단계 후, 형광 HRP 기질(QuantaBlu, Thermo)을 각 웰에 첨가하고, 형광 마이크로플레이트 리더를 사용하여 형광 강도를 검출하였다.

예시 실험에 대한 경쟁 데이터는 도 14에 도시되며, x-축은 시험 물질의 농도를 나타내고, y-축은 측정된 추적 분자의 농도를 나타낸다. 데이터는 1:1 S자형 곡선에 맞추며, IC₅₀ 값 및 최대 신호는 자유 매개변수이며, 기울기는 1로 고정되었다. 결과는 예시 융합 단백질(SEQ ID NOs: 90 및 87 및 SEQ ID NOs: 86 및 91)이 CD137과의 결합에 대해 CD137 항체 SEQ ID NOs: 28 및 29와 경쟁함을 입증하여, 융합 단백질은 항체와 중첩되는 에피토프에서 결합함을 제안한다.

융합 단백질의 경쟁

SEQ ID NO	IC ₅₀ [nM]
90 및 87	1.10
86 및 91	0.99
28 및 29	0.20
42	2.60

실시예 18: PD-1/PD-L1 억제 생물학적 검정을 이용한 T 세포 활성화의 평가

PD-1/PD-L1 매개된 억제를 차단하는 선택된 융합 단백질의 잠재력은 PD-L1 aAPC/CHO-K1 세포(인간 PD-L1을 발현하는 CHO-K1 세포 및 항원-독립적인 방식으로 동족의 TCR을 활성화하도록 설계된 가공된 세포 표면 단백질)와 공배양된 PD-1-NFAT-luc Jurkat T 세포(NFAT 반응 요소(NFAT-RE)에 의해 구동되는 PD-1 및 luc 유전자(반딧불이 루시퍼레이즈 유전자)를 발현하도록 조작된 Jurkat 세포주)를 이용하여 평가되었다. 이 생물학적 검정에서, PD-1-NFAT-luc Jurkat T 세포 및 PD-L1 aAPC/CHO-K1 세포가 공배양될 때, PD-1/PD-L1 상호작용은 TCR 신호전달 및 NFAT-RE-매개된 발광을 억제한다. PD-1/PD-L1 차단제, 예컨대, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 CD137 및 PD-L1에 특이적인 융합 단백질의 추가는 억제 신호를 방출하여 TCR 활성화 및 NFAT-RE-매개된 발광을 초래한다.

PD-L1 aAPC/CHO-K1 세포는 10% FCS이 보충된 Ham's F12 배지에서 성장하고, 웰당 8.00×10³ 세포로 플레이팅되어 37℃, 가습된 5% CO₂ 대기 하에서 오버나이트 동안 부착되었다. 다음날, 배양 배지를 버렸다. 1.00×10⁴ PD-1-NFAT-luc Jurkat T 세포를 각 웰에 첨가하고 난 후, 전형적으로 0.005 nM 내지 50 nM의 다양한 농도의 융합 단백질(SEQ ID NOs: 90 및 87) 또는 PD-L1 항체(SEQ ID NOs: 86 및 87 또는 SEQ ID NOs: 26 및 27)을 첨가하였다. 가스 투과성 씰로 플레이트를 덮고, 37℃, 가습된 5% CO₂ 대기 하에서 인큐베이션 하였다. 6시간 후, 30 ㎕의 Bio-Glo™Reagent를 각 웰에 첨가하고, 생체발광 신호를 루미노미터를 사용하여 정량하였다. GraphPad Prism®를 사용하여 4개의 매개변수 로지스틱 곡선 분석을 수행하여 표 11에 요약된 EC₅₀ 값을 계산하였다. 분석은 3반복으로 수행하였다.

대표적인 실험의 결과는 도 15에 묘사된다. 데이터는 시험된 융합 단백질이 PD-L1 항체(SEQ ID NOs: 86 및 87 또는 SEQ ID NOs: 26 및 27)에 필적할 만한 EC₅₀값으로 PD-1/PD-L1 억제를 억제하고 농도-의존적 방식으로 T 세포를 활성화시킴을 입증한다. 음성 대조군으로서, 레퍼런스 CD137 항체(SEQ ID NOs: 28 및 29) 또는 이소타입 대조군 항체(SEQ ID NOs: 24 및 25)는 발광 신호에서의 증가를 유발한다.

PD-1/PD-L1 억제 생물학적 검정을 이용한 T 세포 활성화의 평가

SEQ ID NO	EC ₅₀ [nM]
90 및 87	0.49
86 및 91	0.58
28 및 29	0.46

실시예 19: 인간 PBMC를 이용한 T 세포 활성화의 평가

추가의 T 세포 분석을 사용하여 T 세포 반응을 보조-자극하는 선택된 융합 단백질의 능력을 평가하였고, 상이한 농도의 융합 단백질은 SEB 자극된 인간 PBMC에 첨가되었으며, 37℃에서 3일 동안 인큐베이션 되었다. IL-2 분비 수준은 상등액에서 측정되었다.

건강한 자원 기증자로부터의 PBMC를 분리하고 실시예 11에서 기술된 바와 같이 저장하였다. 분석을 위해, PBMC를 해동하고, 10% FCS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(Life Technologies)이 보충된 배양 배지(RPMI 1640, Life Technologies)에서 37℃, 가습된 5% CO₂ 대기 하에서 24시간 동안 정치되었다.

하기 절차는 각 실험 조건에 대해 3반복으로 수행되었다: 2.5×10⁴ PBMC를 384 웰의 바닥이 편평한 조직 배양 플레이트의 각 웰에서 배양 배지에서 인큐베이션 하였다. 전형적으로 0.0002 내지 10 nM 범위의 단독으로 또는 레퍼런스 PD-L1 antibody(SEQ ID NOs: 26 및 27)와 조합으로 사용된 선택된 융합 단백질(SEQ ID NOs: 90 및 87), 빌딩 블록 PD-L1 항체(SEQ ID NOs: 86 및 87), 레퍼런스 CD137 항체(SEQ ID NO: 28 및 29), 또는 이소타입 대조군(SEQ ID NOs: 24 및 25) 및 0.1 ng/mL SEB를 각 웰에 첨가하였다. 가스 투과성 씰(4titude)로 플레이트를 덮고 37℃, 가습된 5% CO₂ 대기 하에서 3일 동안 인큐베이션 하였다. 이어서, 상등액 중 IL-2는 실시예 11에서 기술된 바와 같이 평가되었다.

대표적인 실험의 결과는 도 16에 묘사된다. IL-2 분비를 유도하는 시험 물질의 EC₅₀ 값은 표 12에 요약된다. SEQ ID NOs: 90 및 87의 이중특이적인 융합 단백질은 IL-2 분비에서 빌딩 블록 PD-L1 항체, 레퍼런스 CD137 항체 및 레퍼런스 PD-L1 및 CD137 항체의 칵테일과 비교하여 더 높은 수준으로 강한 농도-의존적 증가를 유도하며, 뿐만 아니라 단독으로 또는 조합으로 사용된 PD-L1 및 CD137 항체에 비해 유효한 EC₅₀ 값을 감소시킨다.

인간 PBMC를 이용한 T-세포 활성화의 평가

Donor	EC ₅₀ [nM]
Donor	SEQ ID NOs: 90 및 87	SEQ ID NOs: 86 및 87	SEQ ID NOs: 26 및 27	SEQ ID NOs: 28 및 29 + SEQ ID NOs: 86 및 87
#1	0.019	0.061	0.250	0.279
#2	0.026	0.057	0.134	0.089

실시예 20: 융합 단백질에 의해 유도된 PD-L1 의존적 T 세포 활성화의 평가

융합 단백질에 의한 PD-L1 표적 의존적 T 세포 보조자극은 T-세포 활성화 분석을 이용하여 추가로 분석되었다. 융합 단백질은 상이한 농도로 항-CD3 자극된 T 세포에 적용되고, 인간 PD-L1 형질감염되거나 또는 mock 형질감염된 Flp-In-CHO 세포와 공배양되었다. IL-2 분비 수준은 상등액에서 측정되었다.

건강한 자원 기증자로부터의 PBMC는 실시예 11에서 기술된 바와 같은 버피 코트로부터 분리되었다. T 림프구는 실시예 12에서 기술된 바와 같이 추가로 정제되었고 저장되었다.

분석을 위해, T 세포를 해동하고, 10% FCS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(Life Technologies)이 보충된 배양 배지(RPMI 1640, Life Technologies)에서 37℃, 가습된 5% CO₂ 대기 하에서 오버나이트동안 정치되었다.

하기 절차는 각 실험 조건에 대해 3반복을 사용하여 수행되었다: 바닥이 편평한 조직 배양 플레이트를 0.25 ㎍/mL 항-CD3 항체로 37℃에서 2시간 동안 전-코팅하고, PBS로 2회 세척하였다. 증식을 차단하기 위해 인간 PD-L1 또는 mock 형질감염된 CHO 세포에 30 ㎍/mL의 마이토마이신 C(Sigma Aldrich)를 30분 동안 처리하였다. 그리고 나서 마이토마이신 처리된 세포는 PBS로 2회 세척하고, 웰당 1.0×10⁷ 세포로 배양 배지에서 플레이팅되어 37℃, 가습된 5% CO₂ 대기 하에서 오버나이트 동안 부착되었다. CHO 세포는 표준 조건 하에서 성장하기 전에 Accutase(PAA Laboratories)를 이용하여 탈착되었으며, 배양 배지로 재현탁하였다.

다음날, 웰당 8.33×10³ T 세포를 CHO 세포에 첨가하였다. 전형적으로 0.003 nM 내지 50nM 범위의 예시 융합 단백질 SEQ ID NOs: 90 및 87, 빌딩 블록 PD-L1 항체(SEQ ID NOs: 86 및 87), 레퍼런스 CD137 항체(SEQ ID NOs: 28 및 29), 및 레퍼런스 CD137 항체(SEQ ID NOs: 28 및 29), 레퍼런스 PD-L1 항체(SEQ ID NOs: 26 및 27) 및 레퍼런스 CD137 항체(SEQ ID NO: 28 및 29)의 칵테일 또는 이소타입 대조군(SEQ ID NOs: 24 및 25)의 희석 시리즈를 상응하는 웰에 첨가하였다. 가스 투과성 씰로 플레이트를 덮고, 37℃, 가습된 5% CO₂ 대기 하에서 2일 동안 인큐베이션 하였다.

공배양 2일 후, 상등액 중 IL-2 수준은 실시예 11에서 기술된 바와 같이 평가되었다.

예시 데이터는 도 17에 도시된다. 융합 단백질(SEQ ID NOs: 90 및 87 및 SEQ ID NOs: 86 및 91)의 존재 하에서 Pan T 세포와 인간 PD-L1이 형질감염된 CHO 세포의 공배양은 hIgG4 이소타입 대조군과 비교하여 강한 농도-의존적 IL-2 분비를 유발하며, 레퍼런스 CD137 항체 또는 레퍼런스 CD137 항체와 레퍼런스 PD-L1 항체의 칵테일에 대해 단지 약간의 IL-2 분비 증가가 관찰되는 레퍼런스 항체에 비해 훨씬 더 강하다. mock-형질감염된 CHO 세포(PD-L1 음성)와 공배양할 때, 레퍼런스 CD137 항체 및 레퍼런스 CD137 항체와 레퍼런스 PD-L1 항체의 칵테일 만이 IL-2 분비에서 약간 농도-의조적 증가를 보여준다. 결과는 레퍼런스 CD137 항체(SEQ ID NOs: 28 및 29)가 표적 세포의 존재 여부와 상관없이 CD137 매개된 T 세포 보조-자극을 보여주는 것에 비해 융합 단백질에 의한 T 세포의 활성화가 PD-L1 의존적임을 나타낸다.

실시예 21: 마우스에서 융합 단백질의 약동학

대표적인 융합 단백질(SEQ ID NOs: 90 및 87, SEQ ID NOs: 86 및 91, SEQ ID NOs: 92 및 87, SEQ ID NOs: 86 및 93, SEQ ID NOs: 94 및 87, 및 SEQ ID NOs: 90 및 91)의 약동학 분석은 마우스에서 수행되었다. 대략 5주령의 수컷 CD-1 마우스(시간대별로 3 마리; Charles River Laboratories, Research Models 및 Services, Germany GmbH)의 꼬리 정맥에 10 mg/kg의 용량의 융합 단백질을 주사하였다. 5 mL/kg의 부피를 사용하여 시험 물품을 볼루스로서 투여하였다. 마우스로부터의 혈장 샘플을 5 min, 1 h, 4 h, 8 h, 24 h, 48 h, 4 d, 8 d, 14 d, 21 d, 및 28 d의 시점에서 수득하였다. 이소플루란 마취 하에서 얻은 충분한 전혈을 수집하여 동물 및 시간당 적어도 100 ㎕의 Li-Heparin 혈장을 수득하였다. 약물 수준은 표적 PD-L1 및 CD137을 통해 전체 이중특이적인 구조물을 검출하는 샌드위치 ELISA를 이용하여 검출하였다. 데이터는 Prism GraphPad 5 소프트웨어를 이용하여 2-구획 모형을 이용하여 맞추었다.

도 18은 레퍼런스로서 빌딩 블록 PD-L1 항체(SEQ ID NOs: 86 및 87)에 대해 얻은 값이 함께 표시된 융합 단백질 SEQ ID NOs: 90 및 87, SEQ ID NOs: 86 및 91, SEQ ID NOs: 92 및 87, SEQ ID NOs: 86 및 93, SEQ ID NOs: 94 및 87, 및 SEQ ID NOs: 90 및 91에 대한 시간대별 혈장 농도의 곡선을 도시한다. 약동학은 모든 경우에서 유사한 것으로 보인다. 약 200 ㎍/mL의 혈장 농도에서 출발하여, 48시간 이내에 약 50 ㎍/mL의 수준으로 혈장 수준이 떨어지고 나서, 추가로 28일 후 실험 말기에는 약 10 ㎍/mL의 수준으로 훨썬 느린 속도로 감소하였다. 비-구획 분석을 이 데이터에 적용하였다. 최종 반감기는 표 13에 요약된다.

데이터는 융합 단백질이 마우스에서 긴 항체와 같은 최종 반감기를 가짐을 입증한다. 융합 단백질 혈장 농도를 측정하기 위해 사용된 분석은 PD-L1 및 CD137 둘 다에 대해 유지된 활성을 요구하므로, 결과는 또한 이중특이적인 분자가 28일의 시간 과정에 걸쳐 온전히 유지함을 입증한다.

비-구획 분석을 이용하여 측정된 마우스에서 최종 반감기

SEQ ID NO	최종 반감기 [h]
90 및 87	295
92 및 87	346
86 및 93	332
94 및 87	209
90 및 91	250
86 및 87	390

실시예 22: 마우스에서 융합 단백질의 약동학

대표적인 융합 단백질 SEQ ID NOs: 90 및 87의 약동학 분석은 마우스에서 수행되며, 이전에 기술된 2개의 CD137- 및 PD-L1-결합 융합 단백질(SEQ ID NO: 147 및 SEQ ID NO: 148)과 비교하였다. 대략 5주령의 수컷 CD-1 마우스(시간대별로 2 마리; Charles River Laboratories, Research Models and Services, Germany GmbH)의 꼬리 정맥에 2　mg/kg 용량의 각 분자를 주사하였다. 마우스로부터의 혈장 샘플은 5 min, 24 h, 168 h, 및 336 h의 시간대에서 수득하였다. 이소플루란 마취 하에서 얻은 충분한 전혈을 수집하여 동물 및 시간 당 적어도 30-50 ㎕의 Li-Heparin 혈장을 수득하였다.

그리고 나서, 혈장 약물 수준은 ELISA로 분석하였다. HuCD137-His(C-말단에 폴리히스티딘 태그가 있는 인간 CD137)를 PBS(1　㎍/mL)에서 녹이고, 4℃에서 오버나이트 동안 마이크로타이터 플레이트 상에 코팅되었다. 각 인큐베이션 단계 후, 0.05%(v/v) 트윈 20이 보충된 PBS 80 ㎕로 5회 플레이트를 세척하였다. 플레이트를 PBS/BSA/Tween(2% BSA(w/v) 및 0.1%(v/v) 트윈 20을 함유하는 PBS)로 실온에서 1시간 동안 차단하고, 이어서 세척하였다. 혈장 샘플은 PBS/BSA/Tween으로 20% 혈장 농도로 희석하고, 웰에 첨가하여, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션 하였다. 이어서 추가의 세척 단계를 수행하였다. 본 연구 하에서 결합된 시약은 인큐베이션 1시간 후 2% BSA(w/v) 및 0.1%(v/v) 트윈 20을 함유한 PBS에서 각각 희석된 1 ㎍/mL의 비오틴화된 인간 PD-L1 및 스트렙타비딘 SULFO-TAG(Mesoscale Discovery)의 혼합물로 검출하였다. 추가의 세척 단계 후, 35 ㎕의 리딩 버퍼를 각 웰에 첨가하고, 모든 웰의 전기화학발광(ECL) 신호는 메조스케일 디스커버리 리더를 사용하여 판독하였다. 데이터는 분석 및 정량을 위해 엑셀로 옮겼다. 표준 단백질 희석을 이용한 검정 곡선을 제작하였다.

도 19는 SEQ ID NOs: 90 및 87, SEQ ID NO: 147, 및 SEQ ID NO: 148에 대해 시간별 혈장 농도의 플롯을 도시한다. SEQ ID NOs: 90 및 87은 유리한 약동학 프로파일 또는 항체와 유사한 약동학을 나타내나, SEQ ID NO: 147 및 SEQ ID NO: 148은 그렇지 않는다. 본 명세서에서 기술된 바와 같이, 유리한 약동학 프로파일 또는 항체와 유사한 약동학은 1%의 c_max이 336시간 이후 10%를 초과하는 경우 달성되는 것으로 간주될 수 있다.

본 명세서에서 설명적으로 기술된 구체예들은 본 명세서에서 구체적으로 개시되지 않은 임의의 요소 또는 요소들, 한계 또는 한계들의 부재 하에서 적당히 실행될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 용어 "포함하는(comprising)", "함유하는(including)", "함유하는(containing)" 등은 광범위하게 그리고 제한 없이 읽혀야 한다. 추가로, 본 명세서에서 사용된 용어 및 표현은 제한이 아닌 설명의 용어로 사용되었으며, 도시되고 기술된 특징들 또는 이의 일부의 임의의 등가물을 배제하는 그러한 용어 및 표현들을 사용하고자 하는 의도는 없지만, 다양한 변형은 청구된 본 발명의 범주 내에서 가능한 것으로 인식된다. 따라서, 본 구체예들이 바람직한 구체예들 및 선택적 특징들에 의해 구체적으로 개시되었을지라도, 이의 변형 및 변이는 당업자에게 의존될 수 있으며, 그러한 변형 및 변이는 이 발명의 범주 내에 있는 것으로 간주된다. 그리하여 본 명세서에서 기술된 모든 특허, 특허 출원, 교재 및 학계에 검증된 간행물들은 그들의 전체가 참고로 포함되어 있다. 게다가, 본 명세서에서 참고로 포함된 참고문헌 내 용어의 정의 또는 사용은 본 명세서에서 제공된 그 용어의 정의와 일치하지 않거나 또는 반대인 경우, 본 명세서에서 제공된 그 용어의 정의를 적용하며, 참고문헌 내 그 용어의 정의는 적용하지 않는다. 일반 개시물에 속하는 각각의 더 좁은 종 및 하위 그룹도 본 발명의 일부를 형성한다. 이는 절단된 물질이 본 명세서에서 구체적으로 언급되는지 여부에 관계없이 속(genus)으로부터 임의의 요지를 제거하는 조건적 또는 부정적 제한과 함께 본 발명의 일반적인 설명을 포함한다. 또한, 특징이 마쿠쉬 그룹의 관점에서 설명되는 경우, 당업자는 본 개시물이 마쿠쉬 그룹의 구성원의 임의의 개별 구성원 또는 하위 그룹의 관점에서도 설명된다는 것을 인식할 것이다. 추가 구체예는 하기의 청구 범위로부터 명백해질 것이다.

등가물: 당업자는 단지 일상적인 실험을 사용하여 본 명세서에서 기술된 본 발명의 특정 구체예에 대한 많은 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 하기의 청구 범위에 포함되도록 의도된다. 본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 구체적으로 그리고 개별적으로 본 명세서에 참조로 포함되도록 지시된 것과 동일한 정도로 본 명세서에 참고로 포함된다.

SEQUENCE LISTING <110> Pieris Pharmaceuticals GmbH LES LABORATOIRES SERVIER <120> Novel fusion protein specific for CD137 and PD-L1 <130> PIE16305PCT <150> EP18186445.5 <151> 2018-07-31 <150> EP18204548.4 <151> 2018-11-06 <160> 148 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 158 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 His His Leu Leu Ala Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr 1 5 10 15 Trp Tyr Leu Lys Ala Met Thr Val Asp Arg Glu Phe Pro Glu Met Asn 20 25 30 Leu Glu Ser Val Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Gly Gly Asn 35 40 45 Leu Glu Ala Lys Val Thr Met Leu Ile Ser Gly Arg Cys Gln Glu Val 50 55 60 Lys Ala Val Leu Glu Lys Thr Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Asp 65 70 75 80 Gly Gly Lys His Val Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Lys Asp His 85 90 95 Tyr Ile Phe Tyr Cys Glu Gly Glu Leu His Gly Lys Pro Val Arg Gly 100 105 110 Val Lys Leu Val Gly Arg Asp Pro Lys Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu 115 120 125 Asp Phe Glu Lys Ala Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile 130 135 140 Leu Ile Pro Arg Gln Ser Glu Thr Cys Ser Pro Gly Ser Asp 145 150 155 <210> 2 <211> 178 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val 1 5 10 15 Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr 20 25 30 Val Val Gly Leu Ala Gly Asn Ala Ile Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro 35 40 45 Gln Lys Met Tyr Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr 50 55 60 Asn Val Thr Ser Val Leu Phe Arg Lys Lys Lys Cys Asp Tyr Trp Ile 65 70 75 80 Arg Thr Phe Val Pro Gly Cys Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Asn 85 90 95 Ile Lys Ser Tyr Pro Gly Leu Thr Ser Tyr Leu Val Arg Val Val Ser 100 105 110 Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Lys Val Ser Gln 115 120 125 Asn Arg Glu Tyr Phe Lys Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu 130 135 140 Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly 145 150 155 160 Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile 165 170 175 Asp Gly <210> 3 <211> 178 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 3 Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val 1 5 10 15 Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr 20 25 30 Val Val Gly Leu Ala Gly Asn Ala Ile Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro 35 40 45 Gln Lys Met Tyr Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr 50 55 60 Asn Val Thr Ser Val Leu Phe Arg Lys Lys Lys Cys Asp Tyr Trp Ile 65 70 75 80 Arg Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Asn 85 90 95 Ile Lys Ser Tyr Pro Gly Leu Thr Ser Tyr Leu Val Arg Val Val Ser 100 105 110 Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Lys Val Ser Gln 115 120 125 Asn Arg Glu Tyr Phe Lys Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu 130 135 140 Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly 145 150 155 160 Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile 165 170 175 Asp Gly <210> 4 <211> 152 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 4 Ala Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys 1 5 10 15 Ala Met Thr Val Asp Arg Glu Cys Pro Glu Met Asn Leu Glu Ser Val 20 25 30 Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Gly Gly Asn Leu Glu Ala Lys 35 40 45 Val Thr Met Leu Ile Ser Gly Arg Ser Gln Glu Val Lys Ala Val Leu 50 55 60 Glu Lys Thr Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Asp Gly Gly Lys His 65 70 75 80 Val Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Lys Asp His Tyr Ile Phe Tyr 85 90 95 Ser Glu Gly Glu Cys His Gly Lys Pro Val Pro Gly Val Trp Leu Val 100 105 110 Gly Arg Asp Pro Lys Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys 115 120 125 Ala Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg 130 135 140 Gln Ser Glu Thr Ser Ser Pro Gly 145 150 <210> 5 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 His His Leu Leu 1 <210> 6 <211> 272 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr Gly Ser 1 5 10 15 Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu Asp Leu 20 25 30 Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile Ile Gln 35 40 45 Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser Tyr Arg 50 55 60 Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn Ala Ala 65 70 75 80 Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr Arg Cys 85 90 95 Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val Lys Val 100 105 110 Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val Asp Pro 115 120 125 Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr Pro Lys 130 135 140 Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser Gly Lys 145 150 155 160 Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn Val Thr 165 170 175 Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr Cys Thr 180 185 190 Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu Val Ile 195 200 205 Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Thr His Leu Val 210 215 220 Ile Leu Gly Ala Ile Leu Leu Cys Leu Gly Val Ala Leu Thr Phe Ile 225 230 235 240 Phe Arg Leu Arg Lys Gly Arg Met Met Asp Val Lys Lys Cys Gly Ile 245 250 255 Gln Asp Thr Asn Ser Lys Lys Gln Ser Asp Thr His Leu Glu Glu Thr 260 265 270 <210> 7 <211> 232 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn 1 5 10 15 Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser 20 25 30 Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val 35 40 45 Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp 50 55 60 Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu 65 70 75 80 Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp 85 90 95 Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro 100 105 110 Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys Ser Val Leu Val Asn Gly Thr 115 120 125 Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro 130 135 140 Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala Pro Ala Arg Glu Pro Gly His 145 150 155 160 Ser Pro Gln Ile Ile Ser Phe Phe Leu Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu 165 170 175 Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu Arg Phe Ser Val Val Lys Arg 180 185 190 Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro 195 200 205 Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu 210 215 220 Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 225 230 <210> 8 <211> 272 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <400> 8 Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr Gly Ser 1 5 10 15 Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu Asp Leu 20 25 30 Thr Ser Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile Ile Gln 35 40 45 Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Asn Tyr Arg 50 55 60 Gln Arg Ala Gln Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn Ala Ala 65 70 75 80 Leu Arg Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr Arg Cys 85 90 95 Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val Lys Val 100 105 110 Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val Asp Pro 115 120 125 Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr Pro Lys 130 135 140 Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser Gly Lys 145 150 155 160 Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Leu Asn Val Thr 165 170 175 Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Ala Asn Glu Ile Phe Tyr Cys Ile 180 185 190 Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu Val Ile 195 200 205 Pro Glu Leu Pro Leu Ala Leu Pro Pro Asn Glu Arg Thr His Leu Val 210 215 220 Ile Leu Gly Ala Ile Phe Leu Leu Leu Gly Val Ala Leu Thr Phe Ile 225 230 235 240 Phe Tyr Leu Arg Lys Gly Arg Met Met Asp Met Lys Lys Ser Gly Ile 245 250 255 Arg Val Thr Asn Ser Lys Lys Gln Arg Asp Thr Gln Leu Glu Glu Thr 260 265 270 <210> 9 <211> 231 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <400> 9 Leu Gln Asp Leu Cys Ser Asn Cys Pro Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn 1 5 10 15 Asn Arg Ser Gln Ile Cys Ser Pro Cys Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser 20 25 30 Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val 35 40 45 Phe Lys Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp 50 55 60 Cys Ile Ser Gly Tyr His Cys Leu Gly Ala Glu Cys Ser Met Cys Glu 65 70 75 80 Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp 85 90 95 Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro 100 105 110 Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys Ser Val Leu Val Asn Gly Thr 115 120 125 Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro 130 135 140 Gly Ala Ser Ser Ala Thr Pro Pro Ala Pro Ala Arg Glu Pro Gly His 145 150 155 160 Ser Pro Gln Ile Ile Phe Phe Leu Ala Leu Thr Ser Thr Val Val Leu 165 170 175 Phe Leu Leu Phe Phe Leu Val Leu Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Ser 180 185 190 Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val 195 200 205 Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu 210 215 220 Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 225 230 <210> 10 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cleavage site <400> 10 Ile Glu Gly Arg 1 <210> 11 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion peptide <400> 11 Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys 1 5 10 <210> 12 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Step-Tag II peptide <400> 12 Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys 1 5 <210> 13 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 13 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 14 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 14 Pro Ser Thr Pro Pro Thr Asn Ser Ser Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser 1 5 10 15 Pro Ser <210> 15 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 15 Gly Gly Ser Gly Asn Ser Ser Gly Ser Gly Gly Ser Pro Val 1 5 10 <210> 16 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 16 Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro 1 5 10 15 Ser Ala Pro Ala 20 <210> 17 <211> 66 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 17 Ala Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Pro Val Pro Ser 1 5 10 15 Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser 20 25 30 Gly Gly Ser Gly Asn Ser Ser Gly Ser Gly Gly Ser Pro Val Pro Ser 35 40 45 Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser 50 55 60 Ala Ser 65 <210> 18 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 18 Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser 1 5 10 15 Pro Ser Gly Gly Ser Gly Asn Ser Ser Gly Ser Gly Gly Ser Pro Val 20 25 30 <210> 19 <211> 74 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 19 Ala Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Pro Val Pro Ser 1 5 10 15 Thr Pro Pro Thr Asn Ser Ser Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser 20 25 30 Pro Val Pro Ser Thr Pro Pro Thr Asn Ser Ser Ser Thr Pro Pro Thr 35 40 45 Pro Ser Pro Ser Pro Val Pro Ser Thr Pro Pro Thr Asn Ser Ser Ser 50 55 60 Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser Ala Ser 65 70 <210> 20 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 20 Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro 1 5 10 15 Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala 20 25 30 Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala 35 40 <210> 21 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 21 Val Asp Asp Ile Glu Gly Arg Met Asp Glu 1 5 10 <210> 22 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 22 Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Arg Met Asp Glu 1 5 10 <210> 23 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 23 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 24 <211> 327 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320 Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 <210> 25 <211> 214 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 26 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antibody heavy chain <400> 26 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser 20 25 30 Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 27 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antibody light chain <400> 27 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 28 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antibody heavy chain <400> 28 Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asn His Gly Gly Tyr Val Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Glu 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Tyr Gly Pro Gly Asn Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly 100 105 110 Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly 210 215 220 Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 445 <210> 29 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antibody light chain <400> 29 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro 85 90 95 Ala Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val 100 105 110 Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys 115 120 125 Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg 130 135 140 Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn 145 150 155 160 Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser 165 170 175 Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys 180 185 190 Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr 195 200 205 Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 30 <211> 228 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antibody fragment <400> 30 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala 1 5 10 15 Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 20 25 30 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 35 40 45 Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 50 55 60 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser 65 70 75 80 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 85 90 95 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser 100 105 110 Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 115 120 125 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 130 135 140 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 145 150 155 160 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 165 170 175 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu 180 185 190 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 195 200 205 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 210 215 220 Leu Ser Leu Gly 225 <210> 31 <211> 228 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antibody fragment <400> 31 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe 1 5 10 15 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 20 25 30 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 35 40 45 Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 50 55 60 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser 65 70 75 80 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 85 90 95 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser 100 105 110 Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 115 120 125 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 130 135 140 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 145 150 155 160 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 165 170 175 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu 180 185 190 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 195 200 205 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 210 215 220 Leu Ser Leu Gly 225 <210> 32 <211> 228 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antibody fragment <400> 32 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe 1 5 10 15 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 20 25 30 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 35 40 45 Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 50 55 60 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser 65 70 75 80 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 85 90 95 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser 100 105 110 Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 115 120 125 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 130 135 140 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 145 150 155 160 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 165 170 175 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu 180 185 190 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 195 200 205 Val Leu His Glu Ala Leu His Ser His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 210 215 220 Leu Ser Leu Gly 225 <210> 33 <211> 228 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antibody fragment <400> 33 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe 1 5 10 15 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 20 25 30 Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 35 40 45 Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 50 55 60 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser 65 70 75 80 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 85 90 95 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser 100 105 110 Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 115 120 125 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 130 135 140 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 145 150 155 160 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 165 170 175 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu 180 185 190 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 195 200 205 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 210 215 220 Leu Ser Leu Gly 225 <210> 34 <211> 152 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 34 Ala Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys 1 5 10 15 Ala Met Thr Val Asp Glu Gly Cys Arg Pro Trp Asn Ile Phe Ser Val 20 25 30 Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Gly Gly Asn Leu Glu Ala Lys 35 40 45 Val Thr Met Ala Ile Asp Gly Pro Ala Gln Glu Val Lys Ala Val Leu 50 55 60 Glu Lys Thr Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Asp Gly Gly Lys His 65 70 75 80 Val Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Lys Asp His Tyr Ile Phe Tyr 85 90 95 Ser Glu Gly Val Cys Asp Gly Ser Pro Val Pro Gly Val Trp Leu Val 100 105 110 Gly Arg Asp Pro Lys Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys 115 120 125 Ala Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg 130 135 140 Gln Ser Glu Thr Ser Ser Pro Gly 145 150 <210> 35 <211> 152 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 35 Thr Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys 1 5 10 15 Ala Met Thr Val Asp Glu Gly Cys Arg Pro Trp Asn Ile Phe Ser Val 20 25 30 Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Gly Gly Asn Leu Glu Ala Lys 35 40 45 Val Thr Met Ala Ile Asp Gly Pro Ala Gln Glu Val Arg Ala Val Leu 50 55 60 Glu Lys Thr Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Asp Gly Gly Lys His 65 70 75 80 Asp Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Lys Asp His Tyr Ile Phe Tyr 85 90 95 Ser Glu Gly Val Cys Asp Gly Ser Pro Val Pro Gly Val Trp Leu Val 100 105 110 Gly Arg Asp Pro Glu Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys 115 120 125 Thr Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg 130 135 140 Gln Ser Glu Thr Ser Ser Pro Gly 145 150 <210> 36 <211> 152 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 36 Ala Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys 1 5 10 15 Ala Met Thr Val Asp Glu Gly Cys Arg Pro Trp Asn Ile Phe Ser Val 20 25 30 Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Gly Gly Asn Leu Glu Ala Lys 35 40 45 Val Thr Met Ala Ile Asp Gly Pro Ala Gln Glu Val Asn Ala Val Leu 50 55 60 Glu Lys Thr Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Asp Gly Gly Lys His 65 70 75 80 Val Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Arg Asp His Tyr Ile Phe Tyr 85 90 95 Ser Glu Gly Val Cys Asp Gly Ser Pro Val Pro Gly Val Trp Leu Val 100 105 110 Gly Arg Asp Pro Glu Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys 115 120 125 Thr Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg 130 135 140 Gln Ser Glu Thr Ser Ser Pro Gly 145 150 <210> 37 <211> 152 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 37 Val Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys 1 5 10 15 Ala Met Thr Val Asp Glu Gly Cys Arg Pro Trp Asn Ile Phe Ser Val 20 25 30 Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Gly Gly Asn Leu Glu Ala Lys 35 40 45 Val Thr Met Ala Ile Asp Gly Pro Ala Gln Glu Val Arg Ala Val Leu 50 55 60 Glu Lys Thr Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Asp Gly Gly Lys His 65 70 75 80 Val Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Glu Asp His Tyr Ile Phe Tyr 85 90 95 Ser Glu Gly Val Cys Asp Gly Ser Pro Val Pro Gly Val Trp Leu Val 100 105 110 Gly Arg Asp Pro Glu Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys 115 120 125 Thr Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg 130 135 140 Gln Ser Glu Thr Ser Ser Pro Gly 145 150 <210> 38 <211> 152 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 38 Ala Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys 1 5 10 15 Ala Met Thr Val Asp Glu Gly Cys Arg Pro Trp Asn Ile Phe Ser Val 20 25 30 Thr Pro Met Thr Leu Ser Thr Leu Glu Gly Gly Asn Leu Glu Ala Lys 35 40 45 Val Thr Met Ala Ile Asp Gly Pro Ala Gln Glu Val Lys Ala Val Leu 50 55 60 Glu Lys Thr Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Asp Gly Gly Lys His 65 70 75 80 Val Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Lys Asp His Tyr Ile Phe Tyr 85 90 95 Ser Glu Gly Val Cys Asp Gly Ser Pro Val Pro Gly Val Trp Leu Val 100 105 110 Gly Arg Asp Pro Lys Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys 115 120 125 Ala Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg 130 135 140 Gln Ile Glu Thr Ser Ser Pro Gly 145 150 <210> 39 <211> 152 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 39 Ala Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys 1 5 10 15 Ala Met Thr Val Asp Glu Gly Cys Arg Pro Trp Asn Ile Phe Ser Val 20 25 30 Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Gly Gly Asn Leu Glu Ala Glu 35 40 45 Val Thr Met Ala Ile Asp Gly Pro Ala Gln Glu Val Lys Ala Val Leu 50 55 60 Glu Lys Ala Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Asp Gly Gly Lys His 65 70 75 80 Val Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Lys Asp His Tyr Ile Phe Tyr 85 90 95 Ser Glu Gly Val Cys Asp Gly Ser Pro Val Pro Gly Val Trp Leu Val 100 105 110 Gly Arg Asp Pro Lys Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys 115 120 125 Thr Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Ser 130 135 140 Gln Ile Glu Thr Ser Ser Pro Gly 145 150 <210> 40 <211> 152 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 40 Thr Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys 1 5 10 15 Ala Met Thr Val Asp Glu Gly Cys Arg Pro Trp Asn Ile Phe Ser Val 20 25 30 Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Asp Gly Asn Leu Glu Ala Lys 35 40 45 Val Thr Met Ala Ile Asp Gly Pro Ala Gln Glu Val Lys Ala Val Leu 50 55 60 Glu Lys Ala Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Asp Gly Gly Lys His 65 70 75 80 Val Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Lys Asp His Tyr Ile Phe Tyr 85 90 95 Ser Glu Gly Val Cys Asp Gly Ser Pro Val Pro Gly Val Trp Leu Val 100 105 110 Gly Arg Asp Pro Lys Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys 115 120 125 Ala Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg 130 135 140 Gln Ile Glu Thr Ser Ser Pro Gly 145 150 <210> 41 <211> 178 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 41 Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val 1 5 10 15 Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr 20 25 30 Val Val Gly Gln Ala Gly Asn Ile Lys Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro 35 40 45 Asn Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr 50 55 60 Asn Val Thr Gly Val Thr Phe Asp Asp Lys Lys Cys Thr Tyr Ala Ile 65 70 75 80 Ser Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Lys 85 90 95 Ile Lys Ser Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Arg Val Val Ser 100 105 110 Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val Phe Gln 115 120 125 Asn Arg Glu Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu 130 135 140 Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly 145 150 155 160 Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile 165 170 175 Asp Gly <210> 42 <211> 178 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 42 Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val 1 5 10 15 Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr 20 25 30 Val Val Gly Gln Ala Gly Asn Ile Arg Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro 35 40 45 Ile Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr 50 55 60 Asp Val Thr Met Val Lys Phe Asp Asp Lys Lys Cys Met Tyr Asp Ile 65 70 75 80 Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Lys 85 90 95 Ile Lys Ser Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Arg Val Val Ser 100 105 110 Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val Phe Gln 115 120 125 Asn Arg Glu Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu 130 135 140 Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly 145 150 155 160 Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile 165 170 175 Asp Gly <210> 43 <211> 178 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 43 Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val 1 5 10 15 Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr 20 25 30 Val Val Gly Gln Ala Gly Asn Ile Arg Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro 35 40 45 Asn Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr 50 55 60 Asp Val Thr Ala Val Ala Phe Asp Asp Lys Lys Cys Thr Tyr Asp Ile 65 70 75 80 Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Lys 85 90 95 Ile Lys Ser Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Arg Val Val Ser 100 105 110 Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val Phe Gln 115 120 125 Asn Arg Glu Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu 130 135 140 Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly 145 150 155 160 Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile 165 170 175 Asp Gly <210> 44 <211> 178 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 44 Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val 1 5 10 15 Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr 20 25 30 Val Val Gly Gln Ala Gly Asn Ile Lys Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro 35 40 45 Asn Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr 50 55 60 Asp Val Thr Ala Val Ala Phe Asp Asp Lys Lys Cys Thr Tyr Asp Ile 65 70 75 80 Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Lys 85 90 95 Ile Lys Ser Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Arg Val Val Ser 100 105 110 Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val Phe Gln 115 120 125 Asn Arg Glu Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu 130 135 140 Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly 145 150 155 160 Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile 165 170 175 Asp Gly <210> 45 <211> 175 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 45 Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val 1 5 10 15 Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr 20 25 30 Val Val Gly Gln Ala Gly Asn Ile Lys Leu Arg Glu Asp Ser Lys Met 35 40 45 Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr Asp Val Thr 50 55 60 Gly Val Ser Phe Asp Asp Lys Lys Cys Thr Tyr Ala Ile Met Thr Phe 65 70 75 80 Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Lys Ile Lys Ser 85 90 95 Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Arg Val Val Ser Thr Asn Tyr 100 105 110 Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val Phe Gln Asn Arg Glu 115 120 125 Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Thr Ser Glu 130 135 140 Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Leu Pro Glu 145 150 155 160 Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Asp Gly 165 170 175 <210> 46 <211> 178 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 46 Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val 1 5 10 15 Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr 20 25 30 Val Val Gly Gln Ala Gly Asn Ile Lys Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro 35 40 45 Val Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr 50 55 60 Asp Val Thr Gly Val Thr Phe Asp Asp Lys Lys Cys Arg Tyr Asp Ile 65 70 75 80 Ser Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Phe Gly Lys 85 90 95 Ile Lys Ser Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Arg Val Val Ser 100 105 110 Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val Phe Gln 115 120 125 Asn Arg Glu Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu 130 135 140 Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly 145 150 155 160 Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile 165 170 175 Asp Gly <210> 47 <211> 178 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 47 Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val 1 5 10 15 Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr 20 25 30 Val Val Gly Gln Ala Gly Asn Ile Arg Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro 35 40 45 His Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr 50 55 60 Asp Val Thr Gly Val Thr Phe Asp Asp Lys Lys Cys Thr Tyr Ala Ile 65 70 75 80 Ser Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Lys 85 90 95 Ile Lys Ser Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Arg Val Val Ser 100 105 110 Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val Phe Gln 115 120 125 Asn Arg Glu Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu 130 135 140 Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly 145 150 155 160 Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile 165 170 175 Asp Gly <210> 48 <211> 178 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 48 Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val 1 5 10 15 Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr 20 25 30 Val Val Gly Gln Ala Gly Asn Ile Lys Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro 35 40 45 Asn Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr 50 55 60 Asp Val Thr Gly Val Thr Phe Asp Asp Lys Lys Cys Thr Tyr Ala Ile 65 70 75 80 Ser Thr Leu Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Phe Gly Lys 85 90 95 Ile Lys Ser Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Arg Val Val Ser 100 105 110 Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val Phe Gln 115 120 125 Asn Arg Glu Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu 130 135 140 Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly 145 150 155 160 Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile 165 170 175 Asp Gly <210> 49 <211> 178 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 49 Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val 1 5 10 15 Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr 20 25 30 Val Val Gly Gln Ala Gly Asn Ile Arg Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro 35 40 45 Ser Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr 50 55 60 Asp Val Thr Ala Val Thr Phe Asp Asp Lys Lys Cys Asn Tyr Ala Ile 65 70 75 80 Ser Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Lys 85 90 95 Ile Lys Ser Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Arg Val Val Ser 100 105 110 Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val Phe Gln 115 120 125 Asn Arg Glu Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu 130 135 140 Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly 145 150 155 160 Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile 165 170 175 Asp Gly <210> 50 <211> 178 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 50 Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val 1 5 10 15 Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr 20 25 30 Val Val Gly Met Ala Gly Asn Asn Leu Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro 35 40 45 His Lys Met Ser Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr 50 55 60 Asn Val Thr Asp Val Met Phe Leu Asp Lys Lys Cys Gln Tyr Ile Ile 65 70 75 80 Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Phe 85 90 95 Ile Lys Ser Asp Pro Gly His Thr Ser Tyr Leu Val Arg Val Val Ser 100 105 110 Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Ser Val Ile Gln 115 120 125 Asn Arg Glu Trp Phe Gly Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu 130 135 140 Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly 145 150 155 160 Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile 165 170 175 Asp Gly <210> 51 <211> 178 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 51 Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val 1 5 10 15 Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr 20 25 30 Val Val Gly Met Ala Gly Asn Asn Leu Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro 35 40 45 His Lys Met Ser Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr 50 55 60 Asn Val Thr Asp Val Met Phe Leu Asp Lys Lys Cys Gln Tyr Ile Ile 65 70 75 80 Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Leu Thr Leu Gly Phe 85 90 95 Ile Arg Ser Asp Leu Gly His Thr Ser Tyr Leu Val Arg Val Val Ser 100 105 110 Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Ser Val Ile Gln 115 120 125 Asn Arg Glu Trp Phe Gly Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu 130 135 140 Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly 145 150 155 160 Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile 165 170 175 Asp Gly <210> 52 <211> 178 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 52 Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val 1 5 10 15 Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Tyr Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr 20 25 30 Val Val Gly Met Ala Gly Asn Asn Leu Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro 35 40 45 His Lys Met Gly Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr 50 55 60 Asn Val Thr Asp Val Met Leu Leu Asp Lys Lys Cys Gln Tyr Ile Ile 65 70 75 80 Gln Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Ser Thr Leu Gly Phe 85 90 95 Ile Lys Ser Asp Pro Gly His Thr Ser Tyr Leu Val Arg Val Val Ser 100 105 110 Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Ser Val Ile Gln 115 120 125 Asn Arg Glu Trp Phe Gly Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu 130 135 140 Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly 145 150 155 160 Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile 165 170 175 Asp Gly <210> 53 <211> 178 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 53 Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val 1 5 10 15 Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr 20 25 30 Val Val Gly Met Ala Gly Asn Asn Leu Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro 35 40 45 His Lys Met Gly Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr 50 55 60 Asn Val Thr Asp Val Met Phe Leu Asp Lys Lys Cys Gln His Ile Ile 65 70 75 80 Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Leu Thr Leu Gly Phe 85 90 95 Ile Lys Ser Asp Pro Gly His Thr Ser Tyr Leu Val Arg Val Val Ser 100 105 110 Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Ser Val Ile Gln 115 120 125 Asn Arg Glu Trp Phe Gly Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu 130 135 140 Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly 145 150 155 160 Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile 165 170 175 Asp Gly <210> 54 <211> 178 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 54 Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val 1 5 10 15 Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asp Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr 20 25 30 Val Val Gly Met Ala Gly Asn Asn Leu Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro 35 40 45 His Lys Met Gly Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr 50 55 60 Asn Val Thr Asp Val Met Phe Leu Asp Lys Lys Cys Gln Tyr Ile Ile 65 70 75 80 Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Leu Thr Leu Gly Phe 85 90 95 Ile Lys Ser Asp Pro Gly His Thr Ser Tyr Leu Val Arg Val Val Ser 100 105 110 Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Ser Val Ile Gln 115 120 125 Asn Arg Glu Trp Phe Gly Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu 130 135 140 Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly 145 150 155 160 Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile 165 170 175 Asp Gly <210> 55 <211> 178 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 55 Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val 1 5 10 15 Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr 20 25 30 Ile Val Gly Met Ala Gly Asn Asn Leu Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro 35 40 45 His Lys Met Gly Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr 50 55 60 Asn Val Thr Asp Val Met Phe Leu Asp Lys Lys Cys Gln Tyr Ile Ile 65 70 75 80 Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Leu Thr Leu Gly Phe 85 90 95 Ile Lys Ser Asp Pro Gly His Thr Ser Tyr Leu Val Arg Val Val Ser 100 105 110 Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Ser Val Ile Gln 115 120 125 Asn Arg Glu Trp Phe Gly Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu 130 135 140 Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly 145 150 155 160 Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile 165 170 175 Asp Gly <210> 56 <211> 178 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 56 Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val 1 5 10 15 Pro Leu Gln Arg Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr 20 25 30 Val Val Gly Met Ala Gly Asn Asn Leu Leu Arg Val Asp Lys Asp Pro 35 40 45 His Lys Met Gly Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr 50 55 60 Asn Val Thr Asp Val Met Phe Leu Asp Lys Lys Cys Gln Tyr Ile Ile 65 70 75 80 Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Leu Thr Leu Gly Phe 85 90 95 Ile Lys Ser Asp Pro Gly His Thr Ser Tyr Leu Val Arg Val Val Ser 100 105 110 Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Tyr Phe Lys Ser Val Ile Gln 115 120 125 Asn Arg Glu Trp Phe Gly Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu 130 135 140 Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly 145 150 155 160 Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile 165 170 175 Asp Gly <210> 57 <211> 178 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 57 Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val 1 5 10 15 Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr 20 25 30 Val Val Gly Met Ala Gly Asn Asn Leu Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro 35 40 45 His Lys Met Ser Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr 50 55 60 Asn Val Thr Asp Val Met Phe Leu Asp Lys Lys Cys Gln Tyr Ile Asn 65 70 75 80 Trp Pro Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Phe 85 90 95 Ile Lys Ser Asp Leu Gly Pro Thr Ser Tyr Leu Val Arg Val Val Ser 100 105 110 Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Ser Val Ile Gln 115 120 125 Asn Arg Glu Trp Phe Gly Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu 130 135 140 Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly 145 150 155 160 Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile 165 170 175 Asp Gly <210> 58 <211> 178 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 58 Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val 1 5 10 15 Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr 20 25 30 Val Val Gly Met Ala Gly Asn Asn Leu Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro 35 40 45 His Lys Met Gly Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Asn Glu Asp Lys Ser Tyr 50 55 60 Asn Val Thr Asp Val Met Phe Leu Asp Lys Lys Cys Gln Tyr Ile Ile 65 70 75 80 Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Leu Thr Leu Gly Phe 85 90 95 Ile Lys Ser Asp Pro Gly His Thr Ser Tyr Leu Val Arg Val Val Ser 100 105 110 Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Ser Val Ile Gln 115 120 125 Asn Arg Glu Trp Phe Gly Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu 130 135 140 Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly 145 150 155 160 Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile 165 170 175 Asp Gly <210> 59 <211> 178 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 59 Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val 1 5 10 15 Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr 20 25 30 Val Val Gly Met Ala Gly Asn Asn Leu Leu Arg Asp Asp Lys Asp Pro 35 40 45 His Lys Met Ser Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr 50 55 60 Asn Val Thr Asp Val Met Leu Leu Asp Lys Lys Cys His Tyr Ile Ile 65 70 75 80 Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Leu Thr Leu Gly Phe 85 90 95 Ile Lys Ser Asp Pro Gly His Thr Ser Tyr Leu Val Arg Val Val Ser 100 105 110 Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Ser Val Ile Gln 115 120 125 Asn Arg Glu Trp Phe Gly Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu 130 135 140 Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly 145 150 155 160 Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile 165 170 175 Asp Gly <210> 60 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antibody heavy chain CDR1 <400> 60 Gly Phe Ser Leu Ser Asn Tyr Asp 1 5 <210> 61 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antibody heavy chain CDR2 <400> 61 Ile Trp Thr Gly Gly Ala Thr 1 5 <210> 62 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antibody heavy chain CDR3 <400> 62 Val Arg Asp Ser Asn Tyr Arg Tyr Asp Glu Pro Phe Thr Tyr 1 5 10 <210> 63 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antibody light chain CDR1 <400> 63 Gln Ser Ile Gly Thr Asn 1 5 <210> 64 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antibody light chain CDR3 <400> 64 Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Tyr Thr 1 5 <210> 65 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antibody heavy chain CDR1 <400> 65 Gly Phe Asp Ile Lys Asp Thr Tyr 1 5 <210> 66 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antibody heavy chain CDR2 <400> 66 Ile Asp Pro Ala Asp Gly Asn Thr 1 5 <210> 67 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antibody heavy chain CDR3 <400> 67 Ala Arg Gly Leu Gly Ala Trp Phe Ala Ser 1 5 10 <210> 68 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antibody light chain CDR1 <400> 68 Gln Asp Ile Thr Asn Ser 1 5 <210> 69 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antibody light chain CDR3 <400> 69 Gln Gln Gly His Thr Leu Pro Pro Thr 1 5 <210> 70 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antibody heavy chain CDR1 <400> 70 Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr 1 5 <210> 71 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antibody heavy chain CDR2 <400> 71 Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr 1 5 <210> 72 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antibody heavy chain CDR3 <400> 72 Ser Arg Gly Pro Pro Gly Gly Ile Gly Glu Tyr Ile Tyr Ala Met Asp 1 5 10 15 Tyr <210> 73 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antibody light chain CDR1 <400> 73 Ser Ser Val Ser Ser Ser Tyr 1 5 <210> 74 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antibody light chain CDR3 <400> 74 His Gln Tyr His Arg Ser Pro Pro Thr 1 5 <210> 75 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antibody heavy chain variable region <400> 75 Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15 Asn Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asn Tyr 20 25 30 Asp Ile Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Thr Gly Gly Ala Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Phe Met 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Val 85 90 95 Arg Asp Ser Asn Tyr Arg Tyr Asp Glu Pro Phe Thr Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 <210> 76 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antibody heavy chain variable region <400> 76 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Asn Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asn Tyr 20 25 30 Asp Ile Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Thr Gly Gly Ala Thr Asn Tyr Asn Pro Ala Phe Lys 50 55 60 Ser Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Ser Leu 65 70 75 80 Lys Met Ser Ser Leu Gln Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val 85 90 95 Arg Asp Ser Asn Tyr Arg Tyr Asp Glu Pro Phe Thr Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 77 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antibody heavy chain variable region <400> 77 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asn Tyr 20 25 30 Asp Ile Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Thr Gly Gly Ala Thr Asn Tyr Asn Pro Ala Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu 65 70 75 80 Lys Met Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val 85 90 95 Arg Asp Ser Asn Tyr Arg Tyr Asp Glu Pro Phe Thr Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 78 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antibody heavy chain variable region <400> 78 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asp Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asp Gly Asn Thr Arg Tyr Asp Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Asp Lys Thr Thr Ile Thr Thr Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala His 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Leu Gly Ala Trp Phe Ala Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 79 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antibody heavy chain variable region <400> 79 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Met Tyr Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ala Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Gly Pro Pro Gly Gly Ile Gly Glu Tyr Ile Tyr Ala Met Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 80 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antibody light chain variable region <400> 80 Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn 20 25 30 Ile His Trp Phe Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 <210> 81 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antibody light chain variable region <400> 81 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Thr Leu Ser Val Thr Pro Lys 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn 20 25 30 Ile His Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Val Glu Ala 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 82 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antibody light chain variable region <400> 82 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Thr Leu Ser Val Thr Pro Lys 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn 20 25 30 Ile His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Val Glu Ala 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 83 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antibody light chain variable region <400> 83 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Thr Asn Ser 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 His Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly His Thr Leu Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 <210> 84 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antibody light chain variable region <400> 84 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp 35 40 45 Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu 65 70 75 80 Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr His Arg Ser Pro 85 90 95 Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 <210> 85 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antibody heavy chain <400> 85 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asn Tyr 20 25 30 Asp Ile Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Thr Gly Gly Ala Thr Asn Tyr Asn Pro Ala Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu 65 70 75 80 Lys Met Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val 85 90 95 Arg Asp Ser Asn Tyr Arg Tyr Asp Glu Pro Phe Thr Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 86 <211> 446 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antibody heavy chain <400> 86 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asn Tyr 20 25 30 Asp Ile Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Thr Gly Gly Ala Thr Asn Tyr Asn Pro Ala Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu 65 70 75 80 Lys Met Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val 85 90 95 Arg Asp Ser Asn Tyr Arg Tyr Asp Glu Pro Phe Thr Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro 210 215 220 Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly 435 440 445 <210> 87 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antibody light chain <400> 87 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Thr Leu Ser Val Thr Pro Lys 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn 20 25 30 Ile His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Val Glu Ala 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 88 <211> 614 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion protein <400> 88 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala 1 5 10 15 Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 20 25 30 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 35 40 45 Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 50 55 60 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser 65 70 75 80 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 85 90 95 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser 100 105 110 Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 115 120 125 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 130 135 140 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 145 150 155 160 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 165 170 175 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu 180 185 190 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 195 200 205 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 210 215 220 Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 225 230 235 240 Gly Gly Ser Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu 245 250 255 Ser Lys Val Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly 260 265 270 Lys Trp Tyr Val Val Gly Gln Ala Gly Asn Ile Arg Leu Arg Glu Asp 275 280 285 Lys Asp Pro Ile Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp 290 295 300 Lys Ser Tyr Asp Val Thr Met Val Lys Phe Asp Asp Lys Lys Cys Met 305 310 315 320 Tyr Asp Ile Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr 325 330 335 Leu Gly Lys Ile Lys Ser Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Arg 340 345 350 Val Val Ser Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe 355 360 365 Val Phe Gln Asn Arg Glu Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr 370 375 380 Lys Glu Leu Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys 385 390 395 400 Ser Leu Gly Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp 405 410 415 Gln Cys Ile Asp Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 420 425 430 Gly Gly Gly Ser Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro 435 440 445 Leu Ser Lys Val Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His 450 455 460 Gly Lys Trp Tyr Val Val Gly Gln Ala Gly Asn Ile Arg Leu Arg Glu 465 470 475 480 Asp Lys Asp Pro Ile Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu 485 490 495 Asp Lys Ser Tyr Asp Val Thr Met Val Lys Phe Asp Asp Lys Lys Cys 500 505 510 Met Tyr Asp Ile Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe 515 520 525 Thr Leu Gly Lys Ile Lys Ser Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val 530 535 540 Arg Val Val Ser Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys 545 550 555 560 Phe Val Phe Gln Asn Arg Glu Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg 565 570 575 Thr Lys Glu Leu Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser 580 585 590 Lys Ser Leu Gly Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile 595 600 605 Asp Gln Cys Ile Asp Gly 610 <210> 89 <211> 422 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion protein <400> 89 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala 1 5 10 15 Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 20 25 30 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 35 40 45 Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 50 55 60 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser 65 70 75 80 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 85 90 95 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser 100 105 110 Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 115 120 125 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 130 135 140 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 145 150 155 160 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 165 170 175 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu 180 185 190 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 195 200 205 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 210 215 220 Leu Ser Leu Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 225 230 235 240 Gly Gly Gly Ser Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro 245 250 255 Leu Ser Lys Val Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His 260 265 270 Gly Lys Trp Tyr Val Val Gly Gln Ala Gly Asn Ile Arg Leu Arg Glu 275 280 285 Asp Lys Asp Pro Ile Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu 290 295 300 Asp Lys Ser Tyr Asp Val Thr Met Val Lys Phe Asp Asp Lys Lys Cys 305 310 315 320 Met Tyr Asp Ile Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe 325 330 335 Thr Leu Gly Lys Ile Lys Ser Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val 340 345 350 Arg Val Val Ser Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys 355 360 365 Phe Val Phe Gln Asn Arg Glu Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg 370 375 380 Thr Lys Glu Leu Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser 385 390 395 400 Lys Ser Leu Gly Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile 405 410 415 Asp Gln Cys Ile Asp Gly 420 <210> 90 <211> 639 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion protein <400> 90 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asn Tyr 20 25 30 Asp Ile Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Thr Gly Gly Ala Thr Asn Tyr Asn Pro Ala Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu 65 70 75 80 Lys Met Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val 85 90 95 Arg Asp Ser Asn Tyr Arg Tyr Asp Glu Pro Phe Thr Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro 210 215 220 Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly 435 440 445 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Asp Ser 450 455 460 Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val Pro Leu Gln 465 470 475 480 Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr Val Val Gly 485 490 495 Gln Ala Gly Asn Ile Arg Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro Ile Lys Met 500 505 510 Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr Asp Val Thr 515 520 525 Met Val Lys Phe Asp Asp Lys Lys Cys Met Tyr Asp Ile Trp Thr Phe 530 535 540 Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Lys Ile Lys Ser 545 550 555 560 Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Arg Val Val Ser Thr Asn Tyr 565 570 575 Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val Phe Gln Asn Arg Glu 580 585 590 Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Thr Ser Glu 595 600 605 Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Leu Pro Glu 610 615 620 Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Asp Gly 625 630 635 <210> 91 <211> 407 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion protein <400> 91 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Thr Leu Ser Val Thr Pro Lys 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn 20 25 30 Ile His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Val Glu Ala 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 210 215 220 Gly Gly Gly Gly Ser Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro 225 230 235 240 Pro Leu Ser Lys Val Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe 245 250 255 His Gly Lys Trp Tyr Val Val Gly Gln Ala Gly Asn Ile Arg Leu Arg 260 265 270 Glu Asp Lys Asp Pro Ile Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys 275 280 285 Glu Asp Lys Ser Tyr Asp Val Thr Met Val Lys Phe Asp Asp Lys Lys 290 295 300 Cys Met Tyr Asp Ile Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu 305 310 315 320 Phe Thr Leu Gly Lys Ile Lys Ser Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu 325 330 335 Val Arg Val Val Ser Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe 340 345 350 Lys Phe Val Phe Gln Asn Arg Glu Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly 355 360 365 Arg Thr Lys Glu Leu Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe 370 375 380 Ser Lys Ser Leu Gly Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro 385 390 395 400 Ile Asp Gln Cys Ile Asp Gly 405 <210> 92 <211> 639 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion protein <400> 92 Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val 1 5 10 15 Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr 20 25 30 Val Val Gly Gln Ala Gly Asn Ile Arg Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro 35 40 45 Ile Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr 50 55 60 Asp Val Thr Met Val Lys Phe Asp Asp Lys Lys Cys Met Tyr Asp Ile 65 70 75 80 Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Lys 85 90 95 Ile Lys Ser Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Arg Val Val Ser 100 105 110 Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val Phe Gln 115 120 125 Asn Arg Glu Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu 130 135 140 Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly 145 150 155 160 Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile 165 170 175 Asp Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 180 185 190 Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser 195 200 205 Glu Thr Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asn 210 215 220 Tyr Asp Ile Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 225 230 235 240 Leu Gly Val Ile Trp Thr Gly Gly Ala Thr Asn Tyr Asn Pro Ala Leu 245 250 255 Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser 260 265 270 Leu Lys Met Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 275 280 285 Val Arg Asp Ser Asn Tyr Arg Tyr Asp Glu Pro Phe Thr Tyr Trp Gly 290 295 300 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 305 310 315 320 Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala 325 330 335 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 340 345 350 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 355 360 365 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 370 375 380 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His 385 390 395 400 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly 405 410 415 Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser 420 425 430 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 435 440 445 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro 450 455 460 Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 465 470 475 480 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 485 490 495 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 500 505 510 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr 515 520 525 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 530 535 540 Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 545 550 555 560 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 565 570 575 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 580 585 590 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser 595 600 605 Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 610 615 620 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly 625 630 635 <210> 93 <211> 407 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion protein <400> 93 Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val 1 5 10 15 Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr 20 25 30 Val Val Gly Gln Ala Gly Asn Ile Arg Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro 35 40 45 Ile Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr 50 55 60 Asp Val Thr Met Val Lys Phe Asp Asp Lys Lys Cys Met Tyr Asp Ile 65 70 75 80 Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Lys 85 90 95 Ile Lys Ser Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Arg Val Val Ser 100 105 110 Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val Phe Gln 115 120 125 Asn Arg Glu Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu 130 135 140 Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly 145 150 155 160 Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile 165 170 175 Asp Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 180 185 190 Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Thr Leu Ser Val Thr Pro 195 200 205 Lys Glu Lys Val Thr Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr 210 215 220 Asn Ile His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu 225 230 235 240 Ile Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 245 250 255 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Val Glu 260 265 270 Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro 275 280 285 Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 290 295 300 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 305 310 315 320 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 325 330 335 Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 340 345 350 Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 355 360 365 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 370 375 380 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 385 390 395 400 Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 405 <210> 94 <211> 832 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion protein <400> 94 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asn Tyr 20 25 30 Asp Ile Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Thr Gly Gly Ala Thr Asn Tyr Asn Pro Ala Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu 65 70 75 80 Lys Met Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val 85 90 95 Arg Asp Ser Asn Tyr Arg Tyr Asp Glu Pro Phe Thr Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro 210 215 220 Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly 435 440 445 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Asp Ser 450 455 460 Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val Pro Leu Gln 465 470 475 480 Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr Val Val Gly 485 490 495 Gln Ala Gly Asn Ile Arg Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro Ile Lys Met 500 505 510 Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr Asp Val Thr 515 520 525 Met Val Lys Phe Asp Asp Lys Lys Cys Met Tyr Asp Ile Trp Thr Phe 530 535 540 Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Lys Ile Lys Ser 545 550 555 560 Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Arg Val Val Ser Thr Asn Tyr 565 570 575 Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val Phe Gln Asn Arg Glu 580 585 590 Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Thr Ser Glu 595 600 605 Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Leu Pro Glu 610 615 620 Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Asp Gly Gly 625 630 635 640 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Asp 645 650 655 Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val Pro Leu 660 665 670 Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr Val Val 675 680 685 Gly Gln Ala Gly Asn Ile Arg Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro Ile Lys 690 695 700 Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr Asp Val 705 710 715 720 Thr Met Val Lys Phe Asp Asp Lys Lys Cys Met Tyr Asp Ile Trp Thr 725 730 735 Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Lys Ile Lys 740 745 750 Ser Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Arg Val Val Ser Thr Asn 755 760 765 Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val Phe Gln Asn Arg 770 775 780 Glu Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Thr Ser 785 790 795 800 Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Leu Pro 805 810 815 Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Asp Gly 820 825 830 <210> 95 <211> 474 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 95 catcatctgc tggcctctga cgaagagatc caggatgtgt ccggcacctg gtatctgaag 60 gccatgaccg tggaccgcga gttccctgag atgaacctgg aaagcgtgac ccctatgaca 120 ctgaccacac tggaaggcgg caacctggaa gccaaagtga ccatgctgat ctccggccgg 180 tgccaagaag tgaaggccgt cctggaaaag accgacgagc ctggcaagta caccgctgat 240 ggcggcaagc acgtggccta catcatcaga tcccacgtga aggaccacta catcttctac 300 tgcgagggcg agctgcacgg aaagcctgtt agaggcgtga agctcgtggg cagagatccc 360 aagaacaatc tggaagccct ggaagatttc gagaaggccg ctggcgctag aggcctgtcc 420 acagagtcta tcctgattcc tcggcagtcc gagacatgct cccctggctc tgat 474 <210> 96 <211> 534 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 96 caggatagca ccagcgatct gattccggcg ccgccgctga gcaaagtgcc gctgcagcag 60 aactttcagg ataaccagtt tcagggcaaa tggtatgtgg tgggcctggc gggcaacgcg 120 attctgcgcg aagataaaga tccgcagaaa atgtatgcga ccatttatga actgaaagaa 180 gataaaagct ataacgtgac cagcgtgctg tttcgcaaaa aaaaatgcga ttattggatt 240 cgcacctttg tgccgggctg ccagccgggc gaatttaccc tgggcaacat taaaagctat 300 ccgggcctga ccagctatct ggtgcgcgtg gtgagcacca actataacca gcatgcgatg 360 gtgtttttta aaaaagtgag ccagaaccgc gaatatttta aaattaccct gtatggccgc 420 accaaagaac tgaccagcga actgaaagaa aactttattc gctttagcaa aagcctgggc 480 ctgccggaaa accatattgt gtttccggtg ccgattgatc agtgcattga tggc 534 <210> 97 <211> 534 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 97 caggatagca ccagcgatct gattccggcg ccgccgctga gcaaagtgcc gctgcagcag 60 aactttcagg ataaccagtt tcatggcaaa tggtatgtgg tgggcctggc gggcaacgcg 120 attctgcgcg aagataaaga tccgcagaaa atgtatgcga ccatttatga actgaaagaa 180 gataaaagct ataacgtgac cagcgtgctg tttcgcaaaa aaaaatgcga ttattggatt 240 cgcacctttg tgccgggcag ccagccgggc gaatttaccc tgggcaacat taaaagctat 300 ccgggcctga ccagctatct ggtgcgcgtg gtgagcacca actataacca gcatgcgatg 360 gtgtttttta aaaaagtgag ccagaaccgc gaatatttta aaattaccct gtatggccgc 420 accaaagaac tgaccagcga actgaaagaa aactttattc gctttagcaa aagcctgggc 480 ctgccggaaa accatattgt gtttccggtg ccgattgatc agtgcattga tggc 534 <210> 98 <211> 534 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 98 caggatagca ccagcgatct gattccggcg ccgccgctga gcaaagtgcc gctgcagcag 60 aactttcagg ataaccagtt tcatggcaaa tggtatgtgg tgggcctggc gggcaacgcg 120 attctgcgcg aagataaaga tccgcagaaa atgtatgcga ccatttatga actgaaagaa 180 gataaaagct ataacgtgac cagcgtgctg tttcgcaaaa aaaaatgcga ttattggatt 240 cgcacctttg tgccgggcag ccagccgggc gaatttaccc tgggcaacat taaaagctat 300 ccgggcctga ccagctatct ggtgcgcgtg gtgagcacca actataacca gcatgcgatg 360 gtgtttttta aaaaagtgag ccagaaccgc gaatatttta aaattaccct gtatggccgc 420 accaaagaac tgaccagcga actgaaagaa aactttattc gctttagcaa aagcctgggc 480 ctgccggaaa accatattgt gtttccggtg ccgattgatc agtgcattga tggc 534 <210> 99 <211> 456 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 99 gcctcagacg aggagattca ggatgtgtca gggacgtggt atctgaaggc catgacggtg 60 gatgaggggt gtcgtccttg gaatatattt tcagttacgc caatgactct gactaccctt 120 gaaggcggca atctggaggc taaggtcacc atggcaatag atgggccggc acaggaggtg 180 aaagcagtgt tagagaagac agatgaaccg ggtaaatata cggccgatgg cggtaaacat 240 gttgcctata tcattcgcag ccatgtgaaa gatcattaca tcttttatag cgagggcgtg 300 tgcgatgggt ctcctgttcc aggggtgtgg ctcgtgggca gagaccccaa gaacaacctg 360 gaagccttgg aggactttga gaaagccgca ggagcccgcg gactcagcac ggagagcatc 420 ctcatcccca ggcagagcga aaccagctct ccaggg 456 <210> 100 <211> 456 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 100 acctcagacg aggagattca ggatgtgtca gggacgtggt atctgaaggc gatgacggtg 60 gatgaggggt gtcgtccttg gaatatattt tcagttacgc caatgactct gactaccctt 120 gaaggcggca atctggaggc taaggtcacc atggcaatag atgggccggc acaggaggtg 180 agagcagtgt tagagaagac agatgaaccg ggtaaatata cggccgacgg cggtaaacat 240 gatgcctata tcattcgcag ccatgtgaaa gatcattaca tcttttatag cgagggcgtg 300 tgcgatgggt ctcctgttcc gggggtgtgg ctcgtgggca gagaccccga gaacaacctg 360 gaagccttgg aggactttga gaaaaccgca ggagcccgcg gactcagcac ggagagcatc 420 ctcatcccca ggcagagcga aaccagctct ccaggg 456 <210> 101 <211> 456 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 101 gcctcagacg aggagattca ggatgtgtca gggacgtggt atctgaaggc gatgacggtg 60 gatgaggggt gtcgtccttg gaatatattt tcagttacgc caatgactct gactaccctt 120 gaaggcggca atctggaggc taaggtcacc atggcaatag atgggccggc acaggaggtg 180 aacgcagtgt tagagaagac agatgaaccg ggtaaatata cggccgatgg cggtaaacat 240 gttgcctata tcattcgcag ccatgtgaga gatcattaca tcttttatag cgagggcgtg 300 tgcgatgggt ctcctgttcc gggggtgtgg ctcgtgggca gggaccccga gaacaacctg 360 gaagccttgg aggactttga gaaaaccgca ggagcccgcg gactcagcac ggagagcatt 420 ctcattccca ggcagagcga aaccagctct ccaggg 456 <210> 102 <211> 456 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 102 gtctcagacg aggagattca ggatgtgtca gggacgtggt atctgaaggc gatgacggtg 60 gatgaggggt gtcgtccttg gaatatattt tcagttacgc caatgactct gactaccctt 120 gaaggcggca atctggaggc taaggtcacc atggcaatag atgggccggc acaggaggtg 180 agagcagtgt tagagaagac agatgaaccg ggtaaatata cggccgatgg cggtaaacat 240 gttgcctata tcattcgcag ccatgtggaa gatcattaca tcttttatag cgagggcgtg 300 tgcgatgggt ctcctgttcc gggggtgtgg ctcgtgggca gagaccccga gaacaacctg 360 gaagccttgg aggactttga gaaaaccgca ggagcccgcg gactcagcac ggagagcatc 420 ctcatcccca ggcagagcga aaccagctct ccaggg 456 <210> 103 <211> 456 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 103 gcctcagacg aggagattca ggatgtgtca gggacgtggt atctgaaggc gatgacggtg 60 gatgaggggt gtcgtccttg gaatatattt tcagttacgc caatgactct gtctaccctt 120 gaaggcggca atctggaggc taaggtcacc atggcaatag atgggccggc acaggaggtg 180 aaagcagtgt tagagaagac agatgaaccg ggtaaatata cggccgatgg cggtaaacat 240 gttgcctata tcattcgcag ccatgtgaaa gatcattaca tcttttatag cgagggcgtg 300 tgcgatgggt ctcctgttcc gggggtgtgg ctcgtgggca gagaccccaa gaacaacctg 360 gaagccttgg aggactttga gaaagccgca ggagcccgcg gactcagcac ggagagcatc 420 ctcatcccca ggcagatcga aaccagctct ccaggg 456 <210> 104 <211> 456 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 104 gcctcagacg aggagattca ggatgtgtca gggacgtggt atctgaaggc gatgacggtg 60 gatgaggggt gtcgtccttg gaatatattt tcagttacgc caatgactct gactaccctt 120 gaaggcggca atctggaggc tgaggtcacc atggcaatag atgggccggc acaggaggtg 180 aaagcagtgt tagagaaggc agatgaaccg ggtaaatata cggccgatgg cggtaaacat 240 gttgcctata tcattcgcag ccatgtgaaa gatcattaca tcttttatag cgagggcgtg 300 tgcgatgggt ctcctgttcc gggggtgtgg ctcgtgggca gagaccccaa gaacaacctg 360 gaagccttgg aggactttga gaaaaccgca ggagcccgcg gactcagcac ggagagcatc 420 ctcatcccca gtcagatcga aaccagctct ccaggg 456 <210> 105 <211> 456 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 105 acctcagacg aggagattca ggatgtgtca gggacgtggt atctgaaggc gatgacggtg 60 gatgaggggt gtcgtccttg gaatatattt tcagttacgc caatgactct gactaccctt 120 gaagacggca atctggaggc taaggtcacc atggcaatag atgggccggc acaggaggtg 180 aaagcagtgt tagagaaggc agatgaaccg ggtaaatata cggccgatgg cggtaaacat 240 gttgcctata tcattcgcag ccatgtgaaa gatcattaca tcttttatag cgagggcgtg 300 tgcgatgggt ctcctgttcc gggggtgtgg ctcgtgggca gagaccccaa gaacaacctg 360 gaagccttgg aggactttga gaaagccgca ggagcccgcg gactcagcac ggagagcatc 420 ctcatcccca ggcagatcga aaccagctct ccaggg 456 <210> 106 <211> 534 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 106 caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60 aacttccagg acaaccaatt ccatgggaag tggtatgtgg taggtcaggc agggaatatc 120 aaactcagag aagacaaaga cccgaacaag atgatggcca ccatctatga gctgaaagaa 180 gacaagagct acaatgtcac cggtgtcact tttgacgaca agaagtgtac ttacgctatc 240 tctacttttg ttccaggttc ccagccaggc gagttcacgc tgggcaaaat taagagtttc 300 cctggacata cgagttctct cgtccgagtg gtgagcacca actacaacca gcatgctatg 360 gtgttcttca agttcgtttt ccaaaacagg gaggaattct acatcaccct ctacgggaga 420 accaaggagc tgacttcgga actaaaggag aacttcatcc gcttctccaa atctctgggc 480 ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534 <210> 107 <211> 534 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 107 caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60 aacttccagg acaaccaatt ccatgggaaa tggtacgttg tcgggcaggc cggaaatatt 120 aggctgcgtg aggataagga tccgattaaa atgatggcga ccatttacga gttgaaagaa 180 gataaatcat atgacgtcac catggtgaag tttgatgata agaaatgcat gtacgatatt 240 tggacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggcaagat taaaagtttt 300 ccgggccata catcatcgtt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360 gtgttcttca agtttgtgtt tcagaaccgc gaggagtttt atatcacact gtacgggcgc 420 acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480 ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534 <210> 108 <211> 534 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 108 caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60 aacttccagg acaaccaatt ccatgggaaa tggtacgttg tcgggcaggc cggaaatatt 120 aggctgcgtg aggataagga tccgaataaa atgatggcga ccatttacga gttgaaagaa 180 gataaatcat atgacgtcac cgcggtggcg tttgatgata agaaatgcac gtacgatatt 240 tggacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggcaagat taaaagtttt 300 ccgggccata catcatcgtt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360 gtgttcttca agtttgtgtt tcagaaccgc gaggagtttt atatcacact gtacgggcgc 420 acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480 ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534 <210> 109 <211> 534 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 109 caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60 aacttccagg acaaccaatt ccatgggaaa tggtacgttg tcgggcaggc cggaaatatt 120 aagctgcgtg aggataagga tccgaataaa atgatggcga ccatttacga gttgaaagaa 180 gataaatcat atgacgtcac cgcggtggcg tttgatgata agaaatgcac gtacgatatt 240 tggacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggcaagat taaaagtttt 300 ccgggccata catcatcttt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360 gtgttcttca agtttgtgtt tcagaaccgc gaggagtttt atatcacact gtacgggcgc 420 acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480 ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534 <210> 110 <211> 525 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 110 caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60 aacttccagg acaaccaatt ccatgggaaa tggtacgttg tcgggcaggc cggaaatatt 120 aagctgcgtg aggatagtaa aatgatggcg accatttacg agttgaaaga agataaatca 180 tatgacgtca ccggtgtgag ttttgatgat aagaaatgca cgtacgctat tatgaccttt 240 gtgccgggga gccagccggg cgagtttact ttaggcaaga ttaaaagttt tccgggccat 300 acatcatcgt tggtccgcgt cgtgagcacc aactacaacc agcatgccat ggtgttcttc 360 aagtttgtgt ttcagaaccg cgaggagttt tatatcacac tgtacgggcg cacgaaagaa 420 ctgacaagcg agctgaagga aaattttatc cgcttttcca aatctctggg cctccctgaa 480 aaccacatcg tcttccctgt cccaatcgac cagtgtatcg acggc 525 <210> 111 <211> 534 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 111 caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60 aacttccagg acaaccaatt ccatgggaaa tggtacgttg tcgggcaggc cggaaatatt 120 aagctgcgtg aggataagga tccggttaaa atgatggcga ccatttacga gttgaaagaa 180 gataaatcat atgacgtcac cggggtgacg tttgatgata agaaatgcag gtacgatatt 240 tcgacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt ttggcaagat taaaagtttt 300 ccgggccata catcatcgtt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360 gtgttcttca agtttgtgtt tcagaaccgc gaggagtttt atatcacact gtacgggcgc 420 acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480 ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534 <210> 112 <211> 534 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 112 caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60 aacttccagg acaaccaatt ccatgggaaa tggtacgttg tcgggcaggc cggaaatatt 120 aggctgcgtg aggataagga tccgcataaa atgatggcga ccatttacga gttgaaagaa 180 gataaatcat atgacgtcac cggggtgact tttgatgata agaaatgcac gtacgctatt 240 tcgacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggcaagat taaaagtttt 300 ccgggccata catcatcttt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360 gtgttcttca agtttgtgtt tcagaaccgc gaggagtttt atatcacact gtacgggcgc 420 acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480 ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534 <210> 113 <211> 534 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 113 caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60 aacttccagg acaaccaatt ccatgggaaa tggtacgttg tcgggcaggc cggaaatatt 120 aagctgcgtg aggataagga tccgaataaa atgatggcga ccatttacga gttgaaagaa 180 gataaatcat atgacgtcac cggggtgact tttgatgata agaaatgcac gtacgctatt 240 tctacccttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt ttggcaagat taaaagtttt 300 ccgggccata catcatcgtt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360 gtgttcttca agtttgtgtt tcagaaccgc gaggagtttt atatcacact gtacgggcgc 420 acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480 ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534 <210> 114 <211> 534 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 114 caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60 aacttccagg acaaccaatt ccatgggaaa tggtacgttg tcgggcaggc cggaaatatt 120 aggctgcgtg aggataagga tccgtctaaa atgatggcga ccatttacga gttgaaagaa 180 gataaatcat atgacgtcac cgctgtgacg tttgatgata agaaatgcaa ttacgctatt 240 tctacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggcaagat taaaagtttt 300 ccgggccata catcatcgtt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360 gtgttcttca agtttgtgtt tcagaaccgc gaggagtttt atatcacact gtacgggcgc 420 acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480 ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534 <210> 115 <211> 534 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 115 caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60 aacttccagg acaaccaatt ccatgggaaa tggtatgtcg tgggcatggc cggaaataat 120 ctgctgcgtg aggataagga tccgcacaaa atgagcgcga ccatttacga gttgaaagaa 180 gataaatcat ataacgtcac cgacgtgatg tttctggaca agaaatgcca atacatcatt 240 tggacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggcttcat taaaagtgac 300 ccgggccaca catcatactt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360 gtgttcttca agagcgtgat ccagaaccgc gagtggtttg gaatcacact gtacgggcgc 420 acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480 ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534 <210> 116 <211> 535 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 116 caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60 aacttccagg acaaccaatt ccaagggaaa tggtatgtcg tgggcatggc cggaaataat 120 ctgctgcgtg aggataagga tccgcacaaa atgagcgcga ccatttacga gttgaaagaa 180 gataaatcat ataacgtcac cgacgtgatg tttctggaca agaaatgcca atacatcatt 240 tggacctttg tgccggggag ccagccgggc gagcttactt taggcttcat tagaagtgac 300 ctgggccaca catcatactt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360 gtgttcttca agagcgtgat ccagaaccgc gagtggtttg gaatcacact gtacgggcgc 420 acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480 ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggca 535 <210> 117 <211> 535 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 117 caggactcca cctcagacct gatccctgcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60 aacttccagg actaccaatt ccaagggaaa tggtatgtcg tgggcatggc cggaaataat 120 ctgctgcgtg aggataagga tccgcacaaa atgggcgcga ccatttacga gttgaaagaa 180 gataaatcat ataacgtcac cgacgtgatg cttctggaca agaaatgcca atacatcatt 240 cagacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtctactt taggcttcat taaaagtgac 300 ccgggccaca catcatactt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360 gtgttcttca agagcgtgat ccagaaccgc gagtggtttg gaatcacact gtacgggcgc 420 acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480 ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggca 535 <210> 118 <211> 535 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 118 caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60 aacttccagg acaaccaatt ccaagggaaa tggtatgtcg tgggcatggc cggaaataat 120 ctgctgcgtg aggataagga tccgcacaaa atgggcgcga ccatttacga gttgaaagaa 180 gataaatcat ataacgtcac cgacgtgatg tttctggaca agaaatgcca acacatcata 240 tggacctttg tgccggggag ccagccgggc gagttaactt taggcttcat taaaagtgac 300 ccgggccaca catcatactt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360 gtgttcttca agagcgtgat ccagaaccgc gagtggtttg gaatcacact gtacgggcgc 420 acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480 ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggca 535 <210> 119 <211> 535 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 119 caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60 aacttccagg acgaccaatt ccaagggaaa tggtatgtcg tgggcatggc cggaaataat 120 ctgttgcgtg aggataagga tccgcacaaa atgggcgcga ccatttacga gttgaaagaa 180 gataaatcat ataacgtcac cgacgtgatg tttctggaca agaaatgcca atacatcatt 240 tggacctttg tgccggggag ccagccgggc gagttgactt taggcttcat taaaagtgac 300 ccgggccaca catcatactt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360 gtgttcttca agagcgtgat ccagaaccgc gagtggtttg gaatcacact gtacgggcgc 420 acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480 ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggca 535 <210> 120 <211> 535 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 120 caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60 aacttccagg acaaccaatt ccaagggaaa tggtatatcg tgggcatggc cggaaataat 120 ctgctgcgtg aggataagga tccgcacaaa atgggcgcga ccatttacga gttgaaagaa 180 gataaatcat ataacgtcac cgacgtgatg tttctggaca agaaatgcca atacatcatt 240 tggacctttg tgccggggag ccagccgggc gagcttactt taggcttcat taaaagtgac 300 ccgggccaca catcatactt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360 gtgttcttca agagcgtgat ccagaaccgc gagtggtttg gaatcacact gtacgggcgc 420 acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480 ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggca 535 <210> 121 <211> 535 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 121 caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcgg 60 aacttccagg acaaccaatt ccaagggaag tggtatgtcg tgggcatggc cggaaataat 120 ctgctgcgtg tggataagga tccgcacaaa atgggcgcga ccatttacga gttgaaagaa 180 gataaatcat ataacgtcac cgacgtgatg tttctggaca agaaatgcca atacatcatt 240 tggacctttg tgccggggag ccagccgggc gagttaactt taggcttcat taaaagtgac 300 ccgggccaca catcatactt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360 gtgtacttca agagcgtgat ccagaaccgc gagtggtttg gaatcacact gtacgggcgc 420 acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480 ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggca 535 <210> 122 <211> 535 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 122 caggactcca cctcagatct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60 aacttccagg acaaccaatt ccaagggaaa tggtatgtcg tgggcatggc cggaaataat 120 ctgctgcgtg aggataagga tccgcacaaa atgagcgcga ccatttacga gttgaaagaa 180 gataaatcat ataacgtcac cgacgtgatg tttctggaca agaaatgcca atacatcaat 240 tggccctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggcttcat taaaagtgac 300 ctgggcccca catcatactt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360 gtgttcttca agagcgtgat ccagaaccgc gagtggtttg gaatcacact gtacgggcgc 420 acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480 ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggca 535 <210> 123 <211> 535 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 123 caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60 aacttccagg acaaccaatt ccaagggaaa tggtatgtcg tgggcatggc cggaaataat 120 ctgctgcgtg aggataagga tccgcacaaa atgggtgcga ccatttacga gttgaatgaa 180 gataaatcat ataacgtcac cgacgtgatg tttctggaca agaaatgcca atacatcatt 240 tggacctttg tgccggggag ccagccgggc gagcttactt taggcttcat taaaagtgac 300 ccgggccaca catcatactt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360 gtgttcttca agagcgtgat ccagaaccgc gagtggtttg gaatcacact gtacgggcgc 420 acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480 ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggca 535 <210> 124 <211> 535 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lipocalin mutein <400> 124 caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60 aacttccagg acaaccaatt ccaagggaaa tggtatgtcg tgggcatggc cggaaataat 120 ctgctgcgtg atgataagga tccgcacaaa atgagcgcta ccatttacga gttgaaagaa 180 gataaatcat ataacgtcac cgacgtgatg ttactggaca agaaatgcca ttacatcatt 240 tggacctttg tgccggggag ccagccgggc gagcttactt taggcttcat taaaagtgac 300 ccgggccaca catcatactt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360 gtgttcttca aaagcgtgat ccagaaccgc gagtggtttg gaatcacact gtacgggcgc 420 acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480 ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggca 535 <210> 125 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antibody heavy chain variable region <400> 125 caggtgcaac tgaaggagtc aggacctggc ctggtggcgc cctcacagaa cctgtccatt 60 acctgcactg tctctgggtt ctcattaagc aactatgata taagctggat tcgccagcca 120 ccaggaaagg gtctggagtg gctcggagta atatggactg gtggagccac aaattataat 180 tcagctttca tgtccagact gagcatcagt agggacaact ccaagagcca agttttctta 240 aaaatgaaca gtctgcaaac tgatgacaca gccatatatt actgtgtgag agattcgaac 300 tataggtacg acgagccgtt tacttactgg ggccaaggga ctctggtcac tgtctctgca 360 <210> 126 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antibody heavy chain variable region <400> 126 caggtccagc tgcaggagtc aggccccggc ctggtgaagc ccagtgagaa cctgtcaatc 60 acctgcacag tctctggctt ctcactgagc aattacgaca tcagttggat tcgacagccc 120 cctggaaagg gcctggaatg gctgggcgtg atctggacag gcggggcaac taactataat 180 ccagccttta aaagccggct gaccatttcc agagacaact ccaagtctca ggtgtctctg 240 aaaatgagct ccctgcaggc cgctgatacc gctgtgtact attgtgtcag ggacagcaat 300 taccgctatg atgagccctt cacatactgg gggcagggaa ctctggtgac cgtctctagt 360 <210> 127 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antibody heavy chain variable region <400> 127 caggtccagc tgcaggagtc cggccccggc ctggtgaagc cctccgagac actgtctatc 60 acctgcacag tcagcggctt ctcactgagc aactacgaca tctcctggat tcgacagccc 120 cctggaaagg gcctggaatg gctgggcgtg atctggacag gcggggcaac taactataat 180 ccagccctga aatctcggct gactattagt agagacaact caaagaatca ggtgtccctg 240 aaaatgagct ccgtcaccgc cgctgataca gctgtgtact attgtgtcag ggacagcaat 300 taccgctatg atgagccctt tacctactgg gggcagggaa ctctggtgac cgtctctagt 360 <210> 128 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antibody heavy chain variable region <400> 128 gaggttcagc tgcagcagtc tggggcagag cttgtgaagc caggggcctc agtcaagttg 60 tcctgcacag cttctggctt cgacattaaa gacacctata tccactgggt gaagcagagg 120 cctgaacagg gcctggagtg gattggaagg attgatcctg cggacggtaa tactaggtat 180 gacccgaagt tccaggacaa gaccactata acaaccgaca catcctccaa cacagcccac 240 ctgcagctca gcagcctgac atctgaggac actgccgtct attactgtgc tagaggcctc 300 ggagcttggt ttgcttcctg gggccaaggg actctggtca ctgtctctgc a 351 <210> 129 <211> 372 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antibody heavy chain variable region <400> 129 gaggttcagc tgcagcagtc tggggcagag cttgtgaagc caggggcctc agtcaagttg 60 tcctgcacag cttctggctt caacattaaa gacacctata tgtactgggt gaagcagagg 120 cctgaacagg gcctggagtg gattggaagg attgatcctg cgaatggtaa tactaaatat 180 gacccgaagt tccagggcaa ggccactata acagcagaca catccgccaa cacagcctac 240 ctgcagctca gcagcctgac atctgaggac actgccgtct attactgttc tagaggccct 300 ccaggaggta tcggcgagta tatctatgct atggactact ggggtcaagg aacctcagtc 360 accgtctcct ca 372 <210> 130 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antibody light chain variable region <400> 130 gacatcttgc tgactcagtc tccagccatc ctgtctgtga gtccaggaga aagagtcagt 60 ctctcctgca gggccagtca gagcattggc acaaacatac actggtttca gcaaagaaca 120 aatggttctc caaggcttct cataaagtat gcttctgagt ctatctctgg gatcccttcc 180 aggtttagtg gcagtggatc agggacagat tttactctta gcatcaacag tgtggagtct 240 gaagatattg cagattacta ctgtcaacaa agtaatagct ggccgtacac gttcggaggg 300 gggaccaagc tggaaata 318 <210> 131 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antibody light chain variable region <400> 131 gaaatcgtgc tgacacagag ccctgacaca ctgagcgtga ctcccaagga gaaagtcacc 60 ctgacatgcc gggcatcaca gagcatcgga acaaacattc actggttcca gcagagacca 120 ggccagagcc ccaagctgct gatcaaatac gcctccgaat ctatcagtgg cattccttcc 180 cgattctcag gcagcgggtc cggaaccgac tttactctga ccattaactc tgtggaggct 240 gaagatgccg ctacatacta ttgccagcag tctaatagtt ggccttatac cttcggccag 300 gggacaaagc tggagatcaa a 321 <210> 132 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antibody light chain variable region <400> 132 gaaatcgtgc tgacacagtc tcctgatacc ctgagcgtga ctcccaagga gaaagtcacc 60 ctgacatgca gggcatcaca gagcatcgga acaaacattc actggttcca gcagaagcca 120 ggccagagcc ccaagctgct gatcaaatac gcctccgaat ctattagtgg agtgccttcc 180 cgcttctcag gcagcgggtc cggaaccgac tttactctga ccatcaactc tgtggaggct 240 gaagatgccg ctacatacta ttgccagcag tctaatagtt ggccttatac cttcggccag 300 gggacaaagc tggagatcaa a 321 <210> 133 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antibody light chain variable region <400> 133 gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60 atcagttgca gggcaagtca ggacattacc aattccttaa actggtatca gcagaaacca 120 gatggaactg ttaaactcct gatccactac acatcaagat tacactcagg agtcccatca 180 aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa 240 gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggtcatacgc ttcctccgac gttcggtgga 300 ggcaccaagc tggaaatc 318 <210> 134 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antibody light chain variable region <400> 134 caaattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctctagggga acgggtcacc 60 atgacctgca ctgccagctc aagtgtaagt tccagttact tgcactggta ccagcagaag 120 ccaggatcct cccccaaact ctggatttat agcacatcca acctggcttc tggagtccca 180 gctcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc tcttactctc tcacaatcag cagcatggag 240 gctgaagatg ctgccactta ttactgccac cagtatcatc gttccccacc cacgttcggt 300 ggaggcacca agctggaaat c 321 <210> 135 <211> 1350 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antibody heavy chain <400> 135 caggtccagc tgcaagagtc tggccctgga ctggtcaagc cttccgagac actgtccatc 60 acctgtaccg tgtccggctt ctccctgtcc aactacgaca tctcctggat cagacagcct 120 cctggcaaag gcctggaatg gctgggagtg atttggaccg gcggagccac caactacaac 180 cccgctctga agtcccggct gaccatctcc agagacaact ccaagaacca ggtgtccctg 240 aagatgtcct ccgtgaccgc tgctgatacc gccgtgtact actgcgtgcg ggactccaac 300 tacagatacg acgagccctt cacctactgg ggccagggaa cactggtcac cgtgtcctct 360 gcttccacca agggaccctc tgtgttccct ctggctcctt ccagcaagtc tacctctggc 420 ggaacagctg ctctgggctg cctggtcaag gactactttc ctgagccagt gaccgtgtct 480 tggaactctg gcgctctgac atccggcgtg cacacctttc cagctgtgct gcaatcctcc 540 ggcctgtact ctctgtccag cgtcgtgacc gtgccttcta gctctctggg cacccagacc 600 tacatctgca atgtgaacca caagcctagc aacaccaagg tggacaagaa ggtggaaccc 660 aagtcctgcg acaagaccca cacctgtcct ccatgtcctg ctccagaagc tgctggcgcc 720 ccttccgtgt ttctgttccc tccaaagcct aaggacaccc tgatgatctc tcggacccct 780 gaagtgacct gcgtggtggt ggatgtgtct cacgaggatc ccgaagtgaa gttcaattgg 840 tacgtggacg gcgtggaagt gcacaacgcc aagaccaagc ctagagagga acagtacaac 900 agcacctaca gagtggtgtc cgtgctgacc gtgctgcacc aggattggct gaacggcaaa 960 gagtacaagt gcaaggtgtc caacaaggcc ctgcctgctc ctatcgaaaa gaccatcagc 1020 aaggccaagg gccagcctag ggaaccccag gtttacacct tgcctccatc tcgggacgag 1080 ctgacaaaaa atcaggtttc cctgacctgc ctcgtgaagg gattctaccc ctccgatatc 1140 gccgtggaat gggagtctaa tggccagcct gagaacaact acaagacaac ccctcctgtg 1200 ctggactccg acggctcatt cttcctgtac tccaagctga cagtggacaa gtccagatgg 1260 cagcagggca acgtgttctc ctgctccgtg atgcacgagg ccctgcacaa tcactacacc 1320 cagaagtccc tgtctctgtc ccctggcaaa 1350 <210> 136 <211> 1338 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antibody heavy chain <400> 136 caggtccagc tgcaagagtc tggccctgga ctggtcaagc cttccgagac actgtccatc 60 acctgtaccg tgtccggctt ctccctgtcc aactacgaca tctcctggat cagacagcct 120 cctggcaaag gcctggaatg gctgggagtg atttggaccg gcggagccac caactacaac 180 cccgctctga agtcccggct gaccatctcc agagacaact ccaagaacca ggtgtccctg 240 aagatgtcct ccgtgaccgc tgctgatacc gccgtgtact actgcgtgcg ggactccaac 300 tacagatacg acgagccctt cacctactgg ggccagggaa cactggtcac cgtgtcctct 360 gctagcacca aagggccgtc cgtcttcccc ctggccccct gcagccggtc gacgtccgag 420 tccaccgccg ccctcgggtg cctggtcaag gactacttcc cggagccggt aaccgtgagc 480 tggaactccg gcgcgctgac ctccggcgtg cacacgttcc ccgccgtcct gcagtcctcc 540 ggcctctact ccctctcgtc cgtcgtcacc gtcccgagca gttccctggg caccaagacc 600 tacacgtgca acgtcgacca caagccctcc aacaccaagg tagacaagcg cgtcgagtcc 660 aaatacggcc ccccgtgccc gccctgtccg gcccccgagg ccgcgggcgg cccctcagtg 720 ttcctgttcc cgccgaagcc caaggacacc ctgatgatct cgcgcacgcc cgaggtcacg 780 tgcgtggtcg tcgacgtctc acaggaagac cccgaggtgc agttcaactg gtatgtcgac 840 ggcgtggagg ttcacaacgc gaagaccaag ccccgggagg agcagttcaa cagcacatac 900 cgggtggtgt cggtcctcac cgtgctgcat caggactggc tgaacggtaa ggagtacaag 960 tgcaaggtgt ccaacaaggg cctcccgagc agcatagaga agaccatctc caaggcgaag 1020 ggtcagcccc gcgaaccgca ggtgtacacc ctgccgccga gccaggagga gatgacgaag 1080 aaccaggtct ccctgacgtg cctggtgaag ggtttctacc cctcggacat cgcggtcgaa 1140 tgggaatcga acgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgccgccggt cctggactcc 1200 gacgggtcct tcttcctgta ctcccggctg accgtagaca agtcgcgctg gcaggagggt 1260 aacgtgttca gctgcagcgt gatgcacgag gccctccaca accactacac gcaaaagtcg 1320 ctctccctgt ccctgggc 1338 <210> 137 <211> 642 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antibody light chain <400> 137 gaaattgtgc tgacccagtc tcctgacaca ctgagcgtga cccctaaaga aaaagtgacc 60 ctgacctgcc gggccagcca gtctatcggc accaacatcc actggttcca gcagaagcct 120 ggccagtctc caaagctgct gattaagtac gcctccgagt ccatctccgg cgtgccctct 180 agattttccg gctctggctc tggcaccgac ttcaccctga ccatcaactc cgtggaagcc 240 gaggatgccg ctacctacta ctgccagcag tccaactcct ggccttacac ctttggccag 300 ggcaccaagc tggaaatcaa gcggacagtg gccgctcctt ccgtgttcat cttcccacct 360 tccgacgagc agctgaagtc cggcacagct tctgtcgtgt gcctgctgaa caacttctac 420 cctcgggaag ccaaggtgca gtggaaggtg gacaatgccc tgcagtccgg caactcccaa 480 gagtctgtga ccgagcagga ctccaaggac agcacctaca gcctgtcctc cacactgacc 540 ctgtccaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaagtgac ccatcagggc 600 ctgtctagcc ctgtgaccaa gtctttcaac cggggcgagt gt 642 <210> 138 <211> 1842 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion protein <400> 138 gagtccaaat acggcccccc gtgcccgccc tgtccggccc ccgaggccgc gggcggcccc 60 tcagtgttcc tgttcccgcc gaagcccaag gacaccctga tgatctcgcg cacgcccgag 120 gtcacgtgcg tggtcgtcga cgtctcacag gaagaccccg aggtgcagtt caactggtat 180 gtcgacggcg tggaggttca caacgcgaag accaagcccc gggaggagca gttcaacagc 240 acataccggg tggtgtcggt cctcaccgtg ctgcatcagg actggctgaa cggtaaggag 300 tacaagtgca aggtgtccaa caagggcctc ccgagcagca tagagaagac catctccaag 360 gcgaagggtc agccccgcga accgcaggtg tacaccctgc cgccgagcca ggaggagatg 420 acgaagaacc aggtctccct gacgtgcctg gtgaagggtt tctacccctc ggacatcgcg 480 gtcgaatggg aatcgaacgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc gccggtcctg 540 gactccgacg ggtccttctt cctgtactcc cggctgaccg tagacaagtc gcgctggcag 600 gagggtaacg tgttcagctg cagcgtgatg cacgaggccc tccacaacca ctacacgcaa 660 aagtcgctct ccctgtccct gggcggaggc ggaggatctg gtggtggtgg atctggcggc 720 ggaggttctc aggactctac ctccgatctg atccccgctc ctccactgtc taaggtgcca 780 ctgcagcaga acttccagga caaccagttc cacggcaagt ggtacgtcgt cggccaggcc 840 ggaaacatca gactgagaga ggacaaggac cccatcaaga tgatggctac catctacgag 900 ctgaaagagg ataagtccta cgacgtcacc atggtcaagt tcgacgacaa aaagtgtatg 960 tacgacatct ggaccttcgt gcccggctct cagcctggcg agtttaccct gggcaagatc 1020 aagagcttcc ccggccacac ctcttctctc gtgcgtgtgg tgtccaccaa ctacaaccag 1080 cacgccatgg tgttcttcaa gttcgtgttc cagaaccggg aagagttcta catcaccctg 1140 tacggccgga ccaaagagct gacctccgaa ctgaaagaga acttcatccg gttctccaag 1200 agcctgggcc tgccagagaa ccacatcgtg tttccagtgc ctatcgacca gtgcatcgat 1260 ggcggaggcg gaggatctgg tggtggtgga tctggcggcg gaggttctca ggactctacc 1320 tccgatctga tccccgctcc tccactgtct aaggtgccac tgcagcagaa cttccaggac 1380 aaccagttcc acggcaagtg gtacgtcgtc ggccaggccg gaaacatcag actgagagag 1440 gacaaggacc ccatcaagat gatggctacc atctacgagc tgaaagagga taagtcctac 1500 gacgtcacca tggtcaagtt cgacgacaaa aagtgtatgt acgacatctg gaccttcgtg 1560 cccggctctc agcctggcga gtttaccctg ggcaagatca agagcttccc cggccacacc 1620 tcttctctcg tgcgtgtggt gtccaccaac tacaaccagc acgccatggt gttcttcaag 1680 ttcgtgttcc agaaccggga agagttctac atcaccctgt acggccggac caaagagctg 1740 acctccgaac tgaaagagaa cttcatccgg ttctccaaga gcctgggcct gccagagaac 1800 cacatcgtgt tccctgtgcc tatcgatcag tgtatcgacg gc 1842 <210> 139 <211> 1266 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion protein <400> 139 gagagcaagt acggccctcc ctgccccccc tgccctgccc ctgaagccgc gggcggacct 60 tccgtgtttc tgttcccccc gaagcccaag gacaccctga tgatctcccg gacccccgaa 120 gtgacctgcg tggtggtgga cgtgtcccag gaagatccag aggtgcagtt caactggtat 180 gttgacggcg tggaagtgca caacgccaag accaagccca gagaggaaca gttcaactcc 240 acctaccggg tggtgtccgt gctgaccgtg ctgcaccagg actggctgaa cggcaaagag 300 tacaagtgca aggtgtccaa caagggcctg ccctccagca tcgaaaagac catctccaag 360 gccaagggcc agccccgcga gccccaggtg tacaccctgc cccctagcca ggaagagatg 420 accaagaacc aggtgtccct gacctgtctg gtgaaaggct tctacccctc cgacattgcc 480 gtggaatggg agtccaacgg ccagcccgag aacaactaca agaccacccc ccctgtgctg 540 gactccgacg gctccttctt cctgtactct cggctgacag tggataagtc ccggtggcag 600 gaaggcaatg tgttctcctg cagcgtgatg cacgaggccc tgcacaacca ctatacccag 660 aagtccctgt ccctgagcct gggcaagggc ggcggcggat ccggcggcgg cggctctggc 720 ggcggcggct ctcaggactc tacatccgat ctgatccccg ctcctccact gtccaaggtg 780 cctctgcaac agaactttca ggacaaccag tttcatggca agtggtatgt ggtgggccag 840 gctggcaata tcagactgag ggaggataag gaccctatca agatgatggc cacaatctac 900 gagctgaagg aggacaagtc ttacgatgtg acaatggtga agttcgacga caagaagtgc 960 atgtacgaca tctggacatt cgtgccaggc tcccagcctg gcgagtttac actgggcaag 1020 atcaagtcct tcccaggcca tacctccagc ctggtgcggg tggtgtccac aaactataac 1080 cagcatgcta tggtgttttt caagttcgtg ttccagaatc gggaggagtt ctacatcacc 1140 ctgtacggcc ggaccaagga gctgacatct gagctgaagg agaacttcat cagattttcc 1200 aagagcctgg gcctgcctga gaaccacatc gtgtttcccg tgccaatcga tcagtgtatc 1260 gacggc 1266 <210> 140 <211> 1917 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion protein <400> 140 caggtccagc tgcaagagtc tggccctgga ctggtcaagc cttccgagac actgtccatc 60 acctgtaccg tgtccggctt ctccctgtcc aactacgaca tctcctggat cagacagcct 120 cctggcaaag gcctggaatg gctgggagtg atttggaccg gcggagccac caactacaac 180 cccgctctga agtcccggct gaccatctcc agagacaact ccaagaacca ggtgtccctg 240 aagatgtcct ccgtgaccgc tgctgatacc gccgtgtact actgcgtgcg ggactccaac 300 tacagatacg acgagccctt cacctactgg ggccagggaa cactggtcac cgtgtcctct 360 gctagcacca aagggccgtc cgtcttcccc ctggccccct gcagccggtc gacgtccgag 420 tccaccgccg ccctcgggtg cctggtcaag gactacttcc cggagccggt aaccgtgagc 480 tggaactccg gcgcgctgac ctccggcgtg cacacgttcc ccgccgtcct gcagtcctcc 540 ggcctctact ccctctcgtc cgtcgtcacc gtcccgagca gttccctggg caccaagacc 600 tacacgtgca acgtcgacca caagccctcc aacaccaagg tagacaagcg cgtcgagtcc 660 aaatacggcc ccccgtgccc gccctgtccg gcccccgagg ccgcgggcgg cccctcagtg 720 ttcctgttcc cgccgaagcc caaggacacc ctgatgatct cgcgcacgcc cgaggtcacg 780 tgcgtggtcg tcgacgtctc acaggaagac cccgaggtgc agttcaactg gtatgtcgac 840 ggcgtggagg ttcacaacgc gaagaccaag ccccgggagg agcagttcaa cagcacatac 900 cgggtggtgt cggtcctcac cgtgctgcat caggactggc tgaacggtaa ggagtacaag 960 tgcaaggtgt ccaacaaggg cctcccgagc agcatagaga agaccatctc caaggcgaag 1020 ggtcagcccc gcgaaccgca ggtgtacacc ctgccgccga gccaggagga gatgacgaag 1080 aaccaggtct ccctgacgtg cctggtgaag ggtttctacc cctcggacat cgcggtcgaa 1140 tgggaatcga acgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgccgccggt cctggactcc 1200 gacgggtcct tcttcctgta ctcccggctg accgtagaca agtcgcgctg gcaggagggt 1260 aacgtgttca gctgcagcgt gatgcacgag gccctccaca accactacac gcaaaagtcg 1320 ctctccctgt ccctgggcgg aggcggagga tctggtggtg gtggatctgg cggcggaggt 1380 tctcaggact ctacctccga tctgatcccc gctcctccac tgtctaaggt gccactgcag 1440 cagaacttcc aggacaacca gttccacggc aagtggtacg tcgtcggcca ggccggaaac 1500 atcagactga gagaggacaa ggaccccatc aagatgatgg ctaccatcta cgagctgaaa 1560 gaggataagt cctacgacgt caccatggtc aagttcgacg acaaaaagtg tatgtacgac 1620 atctggacct tcgtgcccgg ctctcagcct ggcgagttta ccctgggcaa gatcaagagc 1680 ttccccggcc acacctcttc tctcgtgcgt gtggtgtcca ccaactacaa ccagcacgcc 1740 atggtgttct tcaagttcgt gttccagaac cgggaagagt tctacatcac cctgtacggc 1800 cggaccaaag agctgacctc cgaactgaaa gagaacttca tccggttctc caagagcctg 1860 ggcctgccag agaaccacat cgtgttccct gtgcctatcg accagtgcat cgatggc 1917 <210> 141 <211> 1221 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion protein <400> 141 gaaattgtgc tgacccagtc tcctgacaca ctgagcgtga cccctaaaga aaaagtgacc 60 ctgacctgcc gggccagcca gtctatcggc accaacatcc actggttcca gcagaagcct 120 ggccagtctc caaagctgct gattaagtac gcctccgagt ccatctccgg cgtgccctct 180 agattttccg gctctggctc tggcaccgac ttcaccctga ccatcaactc cgtggaagcc 240 gaggatgccg ctacctacta ctgccagcag tccaactcct ggccttacac ctttggccag 300 ggcaccaagc tggaaatcaa gcggacagtg gccgctcctt ccgtgttcat cttcccacct 360 tccgacgagc agctgaagtc cggcacagct tctgtcgtgt gcctgctgaa caacttctac 420 cctcgggaag ccaaggtgca gtggaaggtg gacaatgccc tgcagtccgg caactcccaa 480 gagtctgtga ccgagcagga ctccaaggac agcacctaca gcctgtcctc cacactgacc 540 ctgtccaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaagtgac ccatcagggc 600 ctgtctagcc ctgtgaccaa gtctttcaac cggggcgagt gtggtggcgg aggatctggc 660 ggaggtggaa gcggcggagg cggatctcaa gactctacct ccgatctgat ccccgctcct 720 ccactgtcta aggtgccact gcagcagaac ttccaggaca accagttcca cggcaagtgg 780 tacgtcgtcg gccaggccgg aaacatcaga ctgagagagg acaaggaccc catcaagatg 840 atggctacca tctacgagct gaaagaggat aagtcctacg acgtcaccat ggtcaagttc 900 gacgacaaaa agtgtatgta cgacatctgg accttcgtgc ccggctctca gcctggcgag 960 tttaccctgg gcaagatcaa gagcttcccc ggccacacct cttctctcgt gcgtgtggtg 1020 tccaccaact acaaccagca cgccatggtg ttcttcaagt tcgtgttcca gaaccgggaa 1080 gagttctaca tcaccctgta cggccggacc aaagagctga cctccgaact gaaagagaac 1140 ttcatccggt tctccaagag cctgggcctg cctgagaacc acatcgtgtt ccctgtgcct 1200 atcgaccagt gcatcgatgg c 1221 <210> 142 <211> 1917 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion protein <400> 142 caggactcca cctccgatct gatccctgct cctccactgt ctaaggtgcc cctgcagcag 60 aacttccagg acaaccagtt ccacggcaag tggtacgtcg tcggccaggc cggaaacatc 120 agactgagag aggacaagga ccccatcaag atgatggcta ccatctacga gctgaaagag 180 gataagtcct acgacgtcac catggtcaag ttcgacgaca aaaagtgtat gtacgacatc 240 tggaccttcg tgcccggctc tcagcctggc gagtttaccc tgggcaagat caagagcttc 300 cccggccaca cctcttctct cgtgcgtgtg gtgtccacca actacaacca gcacgccatg 360 gtgttcttca agttcgtgtt ccagaaccgg gaagagttct acatcaccct gtacggccgg 420 accaaagagc tgacctccga actgaaagag aacttcatcc ggttctccaa gagcctgggc 480 ctgcctgaga accacatcgt gttccctgtg cctatcgacc agtgcatcga tggcggaggc 540 ggaggatctg gtggtggtgg atctggcggc ggaggttctc aggtccagct gcaagagtct 600 ggccctggac tggtcaagcc ttccgagaca ctgtccatca cctgtaccgt gtccggcttc 660 tccctgtcca actacgacat ctcctggatc agacagcctc ctggcaaagg cctggaatgg 720 ctgggagtga tttggaccgg cggagccacc aactacaacc ccgctctgaa gtcccggctg 780 accatctcca gagacaactc caagaaccag gtgtccctga agatgtcctc cgtgaccgct 840 gctgataccg ccgtgtacta ctgcgtgcgg gactccaact acagatacga cgagcccttc 900 acctactggg gccagggaac actggtcacc gtgtcctctg ctagcaccaa agggccgtcc 960 gtcttccccc tggccccctg cagccggtcg acgtccgagt ccaccgccgc cctcgggtgc 1020 ctggtcaagg actacttccc ggagccggta accgtgagct ggaactccgg cgcgctgacc 1080 tccggcgtgc acacgttccc cgccgtcctg cagtcctccg gcctctactc cctctcgtcc 1140 gtcgtcaccg tcccgagcag ttccctgggc accaagacct acacgtgcaa cgtcgaccac 1200 aagccctcca acaccaaggt agacaagcgc gtcgagtcca aatacggccc cccgtgcccg 1260 ccctgtccgg cccccgaggc cgcgggcggc ccctcagtgt tcctgttccc gccgaagccc 1320 aaggacaccc tgatgatctc gcgcacgccc gaggtcacgt gcgtggtcgt cgacgtctca 1380 caggaagacc ccgaggtgca gttcaactgg tatgtcgacg gcgtggaggt tcacaacgcg 1440 aagaccaagc cccgggagga gcagttcaac agcacatacc gggtggtgtc ggtcctcacc 1500 gtgctgcatc aggactggct gaacggtaag gagtacaagt gcaaggtgtc caacaagggc 1560 ctcccgagca gcatagagaa gaccatctcc aaggcgaagg gtcagccccg cgaaccgcag 1620 gtgtacaccc tgccgccgag ccaggaggag atgacgaaga accaggtctc cctgacgtgc 1680 ctggtgaagg gtttctaccc ctcggacatc gcggtcgaat gggaatcgaa cgggcagccg 1740 gagaacaact acaagaccac gccgccggtc ctggactccg acgggtcctt cttcctgtac 1800 tcccggctga ccgtagacaa gtcgcgctgg caggagggta acgtgttcag ctgcagcgtg 1860 atgcacgagg ccctccacaa ccactacacg caaaagtcgc tctccctgtc cctgggc 1917 <210> 143 <211> 1221 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion protein <400> 143 caggattcta cctccgatct gatccccgct cctccactgt ctaaggtgcc cctgcagcag 60 aacttccagg acaaccagtt ccacggcaag tggtacgtcg tcggccaggc cggaaacatc 120 agactgagag aggacaagga ccccatcaag atgatggcta ccatctacga gctgaaagag 180 gataagtcct acgacgtcac catggtcaag ttcgacgaca aaaagtgtat gtacgacatc 240 tggaccttcg tgcccggctc tcagcctggc gagtttaccc tgggcaagat caagagcttc 300 cccggccaca cctcttctct cgtgcgtgtg gtgtccacca actacaacca gcacgccatg 360 gtgttcttca agttcgtgtt ccagaaccgg gaagagttct acatcaccct gtacggccgg 420 accaaagagc tgacctccga actgaaagag aacttcatcc ggttctccaa gagcctgggc 480 ctgcctgaga accacatcgt gttccctgtg cctatcgacc agtgcatcga tggcggaggc 540 ggaggatctg gcggaggtgg aagcggaggc ggtggatctg aaattgtgct gacccagtct 600 cctgacacac tgagcgtgac ccctaaagaa aaagtgaccc tgacctgccg ggccagccag 660 tctatcggca ccaacatcca ctggttccag cagaagcctg gccagtctcc aaagctgctg 720 attaagtacg cctccgagtc catctccggc gtgccctcta gattttccgg ctctggctct 780 ggcaccgact tcaccctgac catcaactcc gtggaagccg aggatgccgc tacctactac 840 tgccagcagt ccaactcctg gccttacacc tttggccagg gcaccaagct ggaaatcaag 900 cggacagtgg ccgctccttc cgtgttcatc ttcccacctt ccgacgagca gctgaagtcc 960 ggcacagctt ctgtcgtgtg cctgctgaac aacttctacc ctcgggaagc caaggtgcag 1020 tggaaggtgg acaatgccct gcagtccggc aactcccaag agtctgtgac cgagcaggac 1080 tccaaggaca gcacctacag cctgtcctcc acactgaccc tgtccaaggc cgactacgag 1140 aagcacaagg tgtacgcctg cgaagtgacc catcagggcc tgtctagccc tgtgaccaag 1200 tctttcaacc ggggcgagtg t 1221 <210> 144 <211> 2496 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion protein <400> 144 caggtccagc tgcaagagtc tggccctgga ctggtcaagc cttccgagac actgtccatc 60 acctgtaccg tgtccggctt ctccctgtcc aactacgaca tctcctggat cagacagcct 120 cctggcaaag gcctggaatg gctgggagtg atttggaccg gcggagccac caactacaac 180 cccgctctga agtcccggct gaccatctcc agagacaact ccaagaacca ggtgtccctg 240 aagatgtcct ccgtgaccgc tgctgatacc gccgtgtact actgcgtgcg ggactccaac 300 tacagatacg acgagccctt cacctactgg ggccagggaa cactggtcac cgtgtcctct 360 gctagcacca aagggccgtc cgtcttcccc ctggccccct gcagccggtc gacgtccgag 420 tccaccgccg ccctcgggtg cctggtcaag gactacttcc cggagccggt aaccgtgagc 480 tggaactccg gcgcgctgac ctccggcgtg cacacgttcc ccgccgtcct gcagtcctcc 540 ggcctctact ccctctcgtc cgtcgtcacc gtcccgagca gttccctggg caccaagacc 600 tacacgtgca acgtcgacca caagccctcc aacaccaagg tagacaagcg cgtcgagtcc 660 aaatacggcc ccccgtgccc gccctgtccg gcccccgagg ccgcgggcgg cccctcagtg 720 ttcctgttcc cgccgaagcc caaggacacc ctgatgatct cgcgcacgcc cgaggtcacg 780 tgcgtggtcg tcgacgtctc acaggaagac cccgaggtgc agttcaactg gtatgtcgac 840 ggcgtggagg ttcacaacgc gaagaccaag ccccgggagg agcagttcaa cagcacatac 900 cgggtggtgt cggtcctcac cgtgctgcat caggactggc tgaacggtaa ggagtacaag 960 tgcaaggtgt ccaacaaggg cctcccgagc agcatagaga agaccatctc caaggcgaag 1020 ggtcagcccc gcgaaccgca ggtgtacacc ctgccgccga gccaggagga gatgacgaag 1080 aaccaggtct ccctgacgtg cctggtgaag ggtttctacc cctcggacat cgcggtcgaa 1140 tgggaatcga acgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgccgccggt cctggactcc 1200 gacgggtcct tcttcctgta ctcccggctg accgtagaca agtcgcgctg gcaggagggt 1260 aacgtgttca gctgcagcgt gatgcacgag gccctccaca accactacac gcaaaagtcg 1320 ctctccctgt ccctgggcgg aggcggagga tctggtggtg gtggatctgg cggcggaggt 1380 tctcaggact ctacctccga tctgatcccc gctcctccac tgtctaaggt gccactgcag 1440 cagaacttcc aggacaacca gttccacggc aagtggtacg tcgtcggcca ggccggaaac 1500 atcagactga gagaggacaa ggaccccatc aagatgatgg ctaccatcta cgagctgaaa 1560 gaggataagt cctacgacgt caccatggtc aagttcgacg acaaaaagtg tatgtacgac 1620 atctggacct tcgtgcccgg ctctcagcct ggcgagttta ccctgggcaa gatcaagagc 1680 ttccccggcc acacctcttc tctcgtgcgt gtggtgtcca ccaactacaa ccagcacgcc 1740 atggtgttct tcaagttcgt gttccagaac cgggaagagt tctacatcac cctgtacggc 1800 cggaccaaag agctgacctc cgaactgaaa gagaacttca tccggttctc caagagcctg 1860 ggcctgccag agaaccacat cgtgtttcca gtgcctatcg accagtgcat cgatggcgga 1920 ggcggaggat ctggtggtgg tggatctggc ggcggaggtt ctcaggactc tacctccgat 1980 ctgatccccg ctcctccact gtctaaggtg ccactgcagc agaacttcca ggacaaccag 2040 ttccacggca agtggtacgt cgtcggccag gccggaaaca tcagactgag agaggacaag 2100 gaccccatca agatgatggc taccatctac gagctgaaag aggataagtc ctacgacgtc 2160 accatggtca agttcgacga caaaaagtgt atgtacgaca tctggacctt cgtgcccggc 2220 tctcagcctg gcgagtttac cctgggcaag atcaagagct tccccggcca cacctcttct 2280 ctcgtgcgtg tggtgtccac caactacaac cagcacgcca tggtgttctt caagttcgtg 2340 ttccagaacc gggaagagtt ctacatcacc ctgtacggcc ggaccaaaga gctgacctcc 2400 gaactgaaag agaacttcat ccggttctcc aagagcctgg gcctgccaga gaaccacatc 2460 gtgttccctg tgcctatcga tcagtgtatc gacggc 2496 <210> 145 <211> 442 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antibody heavy chain <400> 145 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Lys Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Tyr Gly Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 115 120 125 Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 130 135 140 Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 145 150 155 160 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser 165 170 175 Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe 180 185 190 Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr 195 200 205 Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro 210 215 220 Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 225 230 235 240 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 245 250 255 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp 260 265 270 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 275 280 285 Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val 290 295 300 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 305 310 315 320 Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly 325 330 335 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 340 345 350 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 355 360 365 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 370 375 380 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 385 390 395 400 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 405 410 415 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 420 425 430 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 <210> 146 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antibody light chain <400> 146 Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Asn Ile Gly Asp Gln Tyr Ala 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Gln Asp Lys Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Tyr Thr Gly Phe Gly Ser Leu 85 90 95 Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys 100 105 110 Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln 115 120 125 Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly 130 135 140 Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly 145 150 155 160 Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala 165 170 175 Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser 180 185 190 Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val 195 200 205 Ala Pro Thr Glu Cys Ser 210 <210> 147 <211> 472 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion protein <400> 147 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Glu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Ile Phe Ala Ile Lys 20 25 30 Pro Ile Ser Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Thr Thr Ser Ser Gly Ala Thr Asn Tyr Ala Glu Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn 85 90 95 Val Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Lys Pro Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Gly 115 120 125 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 130 135 140 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 145 150 155 160 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 165 170 175 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 180 185 190 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 195 200 205 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 210 215 220 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 225 230 235 240 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 245 250 255 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 260 265 270 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 275 280 285 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 290 295 300 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 305 310 315 320 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 325 330 335 Pro Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln 340 345 350 Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Glu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg 355 360 365 Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ile Asn Ala Met Gly 370 375 380 Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile 385 390 395 400 Glu Ser Gly Arg Asn Thr Val Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly Arg Phe 405 410 415 Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Ser 420 425 430 Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Gly Leu Leu Lys 435 440 445 Gly Asn Arg Val Val Ser Pro Ser Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 450 455 460 Leu Val Thr Val Lys Pro Gly Gly 465 470 <210> 148 <211> 466 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion protein <400> 148 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Glu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Ile Phe Ala Ile Lys 20 25 30 Pro Ile Ser Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Thr Thr Ser Ser Gly Ala Thr Asn Tyr Ala Glu Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn 85 90 95 Val Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Lys Pro Gly 100 105 110 Gly Ser Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Glu 115 120 125 Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe 130 135 140 Ser Phe Ser Ile Asn Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys 145 150 155 160 Arg Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Glu Ser Gly Arg Asn Thr Val Tyr 165 170 175 Ala Glu Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys 180 185 190 Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala 195 200 205 Val Tyr Tyr Cys Gly Leu Leu Lys Gly Asn Arg Val Val Ser Pro Ser 210 215 220 Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Lys Pro Gly Gly 225 230 235 240 Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Gly Gly 245 250 255 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 260 265 270 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 275 280 285 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 290 295 300 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 305 310 315 320 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 325 330 335 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 340 345 350 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 355 360 365 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 370 375 380 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 385 390 395 400 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 405 410 415 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 420 425 430 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 435 440 445 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 450 455 460 Gly Lys 465

Claims

적어도 두 개의 서브유닛을 임의의 순서로 포함하되, 제1 서브유닛은 전장의 면역글로불린 또는 이의 항원-결합 도메인을 포함하고 PD-L1에 특이적이며, 제2 서브유닛은 리포칼린 뮤테인을 포함하고 CD137에 특이적인
CD137 및 PD-L1 둘 다 결합할 수 있는 융합 단백질.
제1항에 있어서,
제3 서브유닛을 더 포함하되, 제3 서브유닛은 CD137에 특이적인 리포칼린 뮤테인을 포함하는 융합 단백질.
제1항 또는 제2항에 있어서,
융합 단백질은 최대 약 2 nM 또는 제1 서브유닛 단독에 포함된 면역글로불린 또는 이의 항원-결합 도메인의 K_D값에 필적하거나 또는 더 낮은 K_D값으로 PD-L1과 결합할 수 있는 융합 단백질.
제1항 또는 제2항에 있어서,
융합 단백질은 최대 약 7 nM 또는 제2 서브유닛 단독에 포함된 CD137에 특이적인 리포칼린 뮤테인의 K_D값에 필적하거나 또는 더 낮은 K_D값으로 CD137과 결합할 수 있는 융합 단백질.
제3항 또는 제4항에 있어서,
K_D값은 표면-플라즈몬-공명(SPR) 분석에 의해 측정되는 융합 단백질.
제1항 또는 제2항에 있어서,
융합 단백질은 최대 약 0.5 nM 또는 제1 서브유닛 단독에 포함된 면역글로불린 또는 이의 항원-결합 도메인의 EC₅₀ 값에 필적하거나 또는 더 낮은 EC₅₀ 값으로 PD-L1과 결합할 수 있는 융합 단백질.
제1항 또는 제2항에 있어서,
융합 단백질은 최대 약 0.6 nM 또는 제2 서브유닛 단독에 포함된 CD137에 특이적인 리포칼린 뮤테인의 EC₅₀ 값에 필적하거나 또는 더 낮은 EC₅₀ 값으로 CD137과 결합할 수 있는 융합 단백질.
제6항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
EC₅₀ 값은 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 분석에 의해 측정되는 융합 단백질.
제1항 또는 제2항에 있어서,
융합 단백질은 시아노몰거스(cynomolgus)의 PD-L1과 교차-반응하는 융합 단백질.
제1항 또는 제2항에 있어서,
융합 단백질은 시아노몰거스(cynomolgus)의 CD137과 교차-반응하는 융합 단백질.
제1항 또는 제2항에 있어서,
융합 단백질은 상기 융합 단백질이 ELISA 분석에서 측정되는 경우 최대 약 10 nM의 EC₅₀ 값으로 CD137 및 PD-L1과 동시에 결합할 수 있는 융합 단백질.
제1항 또는 제2항에 있어서,
융합 단백질은 최대 약 60 nM의 EC₅₀ 값으로 세포에서 발현된 CD137과 결합할 수 있는 융합 단백질.
제1항 또는 제2항에 있어서,
융합 단백질은 상기 융합 단백질이 플로우 사이토메트리 분석에서 측정되는 경우 최대 약 10 nM의 EC₅₀ 값으로 세포에서 발현된 PD-L1과 결합할 수 있는 융합 단백질.
제1항 또는 제2항에 있어서,
융합 단백질은 PD-L1을 발현하는 종양 세포와 결합할 수 있는 융합 단백질.
제1항 또는 제2항에 있어서,
융합 단백질은 CD137 리간드의 존재 하에서 CD137과 결합할 수 있는 융합 단백질.
제1항 또는 제2항에 있어서,
융합 단백질은 PD-L1과의 결합에 대해 PD-1과 경쟁할 수 있는 융합 단백질.
제1항 또는 제2항에 있어서,
융합 단백질은 CD137과의 결합에 대해 SEQ ID NOs: 28 및 29에 도시된 항체와 경쟁할 수 있는 융합 단백질.
제1항 또는 제2항에 있어서,
융합 단백질은 SEQ ID NOs: 28 및 29에 도시된 항체와 중첩된 CD137-결합 에피토프를 갖는 융합 단백질.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
융합 단백질은 T-세포 증식 및/또는 반응을 자극할 수 있는 융합 단백질.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
융합 단백질은 CD4+ 및/또는 CD8+ T-세포 증식을 자극할 수 있는 융합 단백질.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
융합 단백질은 IL-2 및/또는 IFN-감마의 증가된 분비를 유도할 수 있는 융합 단백질.
제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
융합 단백질은 세포독성 인자의 증가된 분비를 유도할 수 있는 융합 단백질.
제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
융합 단백질은 PD-L1 의존적 방식으로 T-세포 반응을 보조-자극할 수 있는 융합 단백질.
제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
융합 단백질은 종양 미세환경에서 T-세포 반응을 보조-자극할 수 있는 융합 단백질.
제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
융합 단백질은 PD-L1의 부재 하에서 T-세포 반응을 보조-자극하지 않는 융합 단백질.
제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
융합 단백질은 PD-1의 억제 신호를 차단할 수 있는 융합 단백질.
제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
융합 단백질은 항체와 유사한 약동학 프로파일을 갖는 융합 단백질.
제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
융합 단백질은 SEQ ID NO: 147 또는 SEQ ID NO: 148보다 더 좋은 약동학 프로파일을 갖는 융합 단백질.
제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
리포칼린 뮤테인은 성숙한 인간 눈물 리포칼린의 선형 폴리펩타이드 서열(SEQ ID NO: 1)의 5, 26-31, 33-34, 42, 46, 52, 56, 58, 60-61, 65, 71, 85, 94, 101, 104-106, 108, 111, 114, 121, 133, 148, 150 및 153 위치에 상응하는 위치에서 하나 이상의 돌연변이 된 아미노산 잔기를 포함하는 융합 단백질.
제29항에 있어서,
리포칼린 뮤테인의 아미노산 서열은 성숙한 hTlc의 선형 폴리펩타이드 서열(SEQ ID NO: 1)의 5, 26-31, 33-34, 42, 46, 52, 56, 58, 60-61, 65, 71, 85, 94, 101, 104-106, 108, 111, 114, 121, 133, 148, 150 및 153 위치에 상응하는 하나 이상의 위치에서 하나 이상의 하기의 돌연변이 된 아미노산 잔기를 포함하는 융합 단백질:
Ala 5 → Val 또는 Thr; Arg 26 → Glu; Glu 27 → Gly; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Arg; Glu 30 → Pro; Met 31 → Trp; Leu 33 → Ile; Glu 34 → Phe; Thr 42 → Ser; Gly 46 → Asp; Lys 52 → Glu; Leu 56 → Ala; Ser 58 → Asp; Arg 60 → Pro; Cys 61 → Ala; Lys 65 → Arg 또는 Asn; Thr 71 → Ala; Val 85 → Asp; Lys 94 → Arg 또는 Glu; Cys 101 → Ser; Glu 104 → Val; Leu 105 → Cys; His 106 → Asp; Lys 108 → Ser; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Lys 121 → Glu; Ala 133 → Thr; Arg 148 → Ser; Ser 150 → Ile 및 Cys 153 → Ser.
제29항 또는 30항에 있어서,
리포칼린 뮤테인의 아미노산 서열은 성숙한 인간 눈물 리포칼린의 선형 폴리펩타이드 서열(SEQ ID NO: 1)과 비교하여 돌연변이 된 아미노산 잔기의 하기 세트 중 하나를 포함하는 융합 단백질:
(a) Arg 26 → Glu; Glu 27 → Gly; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Arg; Glu 30 → Pro; Met 31 → Trp; Leu 33 → Ile; Glu 34 → Phe; Leu 56 → Ala; Ser 58 → Asp; Arg 60 → Pro; Cys 61 → Ala; Cys 101 → Ser; Glu 104 → Val; Leu 105 → Cys; His 106 → Asp; Lys 108 → Ser; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; 및 Cys 153 → Ser;
(b) Ala 5 → Thr; Arg 26 → Glu; Glu 27 → Gly; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Arg; Glu 30 → Pro; Met 31 → Trp; Leu 33 → Ile; Glu 34 → Phe; Leu 56 → Ala; Ser 58 → Asp; Arg 60 → Pro; Cys 61 → Ala; Lys 65 → Arg; Val 85 → Asp; Cys 101 → Ser; Glu 104 → Val; Leu 105 → Cys; His 106 → Asp; Lys 108 → Ser; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Lys 121 → Glu; Ala 133 → Thr; 및 Cys 153 → Ser;
(c) Arg 26 → Glu; Glu 27 → Gly; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Arg; Glu 30 → Pro; Met 31 → Trp; Leu 33 → Ile; Glu 34 → Phe; Leu 56 → Ala; Ser 58 → Asp; Arg 60 → Pro; Cys 61 → Ala; Lys 65 → Asn; Lys 94 → Arg; Cys 101 → Ser; Glu 104 → Val; Leu 105 → Cys; His 106 → Asp; Lys 108 → Ser; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Lys 121 → Glu; Ala 133 → Thr; 및 Cys 153 → Ser;
(d) Ala 5 → Val; Arg 26 → Glu; Glu 27 → Gly; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Arg; Glu 30 → Pro; Met 31 → Trp; Leu 33 → Ile; Glu 34 → Phe; Leu 56 → Ala; Ser 58 → Asp; Arg 60 → Pro; Cys 61 → Ala; Lys 65 → Arg; Lys 94 → Glu; Cys 101 → Ser; Glu 104 → Val; Leu 105 → Cys; His 106 → Asp; Lys 108 → Ser; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Lys 121 → Glu; Ala 133 → Thr; 및 Cys 153 → Ser;
(e) Arg 26 → Glu; Glu 27 → Gly; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Arg; Glu 30 → Pro; Met 31 → Trp; Leu 33 → Ile; Glu 34 → Phe; Thr 42 → Ser; Leu 56 → Ala; Ser 58 → Asp; Arg 60 → Pro; Cys 61 → Ala; Cys 101 → Ser; Glu 104 → Val; Leu 105 → Cys; His 106 → Asp; Lys 108 → Ser; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Ser 150 → Ile; 및 Cys 153 → Ser;
(f) Arg 26 → Glu; Glu 27 → Gly; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Arg; Glu 30 → Pro; Met 31 → Trp; Leu 33 → Ile; Glu 34 → Phe; Lys 52 → Glu; Leu 56 → Ala; Ser 58 → Asp; Arg 60 → Pro; Cys 61 → Ala; Thr 71 → Ala; Cys 101 → Ser; Glu 104 → Val; Leu 105 → Cys; His 106 → Asp; Lys 108 → Ser; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Ala 133 → Thr; Arg 148 → Ser; Ser 150 → Ile; 및 Cys 153 → Ser; 및
(g) Ala 5 → Thr; Arg 26 → Glu; Glu 27 → Gly; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Arg; Glu 30 → Pro; Met 31 → Trp; Leu 33 → Ile; Glu 34 → Phe; Gly 46 → Asp; Leu 56 → Ala; Ser 58 → Asp; Arg 60 → Pro; Cys 61 → Ala; Thr 71 → Ala; Cys 101 → Ser; Glu 104 → Val; Leu 105 → Cys; His 106 → Asp; Lys 108 → Ser; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Ser 150 → Ile; 및 Cys 153 → Ser.
제29항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
리포칼린 뮤테인의 아미노산 서열은 SEQ ID NOs: 34-40으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는 융합 단백질.
제29항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
리포칼린 뮤테인의 아미노산 서열은 SEQ ID NOs: 34-40으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 융합 단백질.
제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
리포칼린 뮤테인은 성숙한 인간 호중구 젤라티네이즈-연관 리포칼린(hNGAL)의 선형 폴리펩타이드 서열(SEQ ID NO: 2)의 28, 36, 40-41, 49, 52, 65, 68, 70, 72-73, 77, 79, 81, 83, 87, 94, 96, 100, 103, 106, 125, 127, 132 및 134 위치에 상응하는 위치에서 하나 이상의 돌연변이 된 아미노산 잔기를 포함하는 융합 단백질.
제34항에 있어서,
리포칼린 뮤테인의 아미노산 서열은 성숙한 인간 호중구 젤라티네이즈-연관 리포칼린(hNGAL)의 선형 폴리펩타이드 서열(SEQ ID NO: 2)의 28, 36, 40-41, 49, 52, 65, 68, 70, 72-73, 77, 79, 81, 83, 87, 94, 96, 100, 103, 106, 125, 127, 132 및 134 위치에 상응하는 위치에서 하나 이상의 하기의 돌연변이 된 아미노산 잔기를 포함하는 융합 단백질:
Gln 28 → His; Leu 36 → Gln; Ala 40 → Ile; Ile 41 → Arg 또는 Lys; Gln 49 → Val, Ile, His, Ser 또는 Asn; Tyr 52 → Met; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Met, Ala 또는 Gly; Leu 70 → Ala, Lys, Ser 또는 Thr; Arg 72 → Asp; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Met, Arg, Thr 또는 Asn; Trp 79 → Ala 또는 Asp; Arg 81 → Met, Trp 또는 Ser; Phe 83 → Leu; Cys 87 → Ser; Leu 94 → Phe; Asn 96 → Lys; Tyr 100 → Phe; Leu 103 → His; Tyr 106 → Ser; Lys 125 → Phe; Ser 127 → Phe; Tyr 132 → Glu 및 Lys 134 → Tyr.
제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
리포칼린 뮤테인은 성숙한 인간 호중구 젤라티네이즈-연관 리포칼린(hNGAL)의 선형 폴리펩타이드 서열(SEQ ID NO: 2)의 20, 25, 28, 33, 36, 40-41, 44, 49, 52, 59, 68, 70-73, 77-82, 87, 92, 96, 98, 100, 101, 103, 122, 125, 127, 132 및 134 위치에 상응하는 위치에서 하나 이상의 돌연변이 된 아미노산 잔기를 포함하는 융합 단백질.
제36항에 있어서,
리포칼린 뮤테인의 아미노산 서열은 성숙한 hNGAL의 선형 폴리펩타이드 서열(SEQ ID NO: 2)의 20, 25, 28, 33, 36, 40-41, 44, 49, 52, 59, 68, 70-73, 77-82, 87, 92, 96, 98, 100, 101, 103, 122, 125, 127, 132 및 134 위치에 상응하는 위치에서 하나 이상의 하기의 돌연변이 된 아미노산 잔기를 포함하는 융합 단백질:
Gln 20 → Arg; Asn 25 → Tyr 또는 Asp; Gln 28 → His; Val 33 → Ile; Leu 36 →Met; Ala 40 → Asn; Ile 41 → Leu; Glu 44 → Val 또는 Asp; Gln 49 → His; Tyr 52 →Ser 또는 Gly; Lys 59 → Asn; Ser 68 → Asp; Leu 70 → Met; Phe 71 → Leu; Arg 72 → Leu; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Gln 또는 His; Tyr 78 → His; Trp 79 → Ile; Ile 80 → Asn; Arg 81 → Trp 또는 Gln; Thr 82 → Pro; Cys 87 → Ser; Phe 92 → Leu 또는 Ser; Asn 96 → Phe; Lys 98 → Arg; Tyr 100 → Asp; Pro 101 → Leu; Leu 103 → His 또는 Pro; Phe 122 → Tyr; Lys 125 → Ser; Ser 127 → Ile; Tyr 132 → Trp; 및 Lys 134 → Gly.
제34항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서,
리포칼린 뮤테인의 아미노산 서열은 성숙한 hNGAL의 선형 폴리펩타이드 서열(SEQ ID NO: 2)과 비교하여 돌연변이 된 아미노산 잔기의 하기 세트 중 하나를 포함하는 융합 단백질:
(a) Gln 28 → His; Leu 36 → Gln; Ala 40 → Ile; Ile 41 → Lys; Gln 49 → Asn; Tyr 52 → Met; Ser 68 → Gly; Leu 70 → Thr; Arg 72 → Asp; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Thr; Trp 79 → Ala; Arg 81 → Ser; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Lys; Tyr 100 → Phe; Leu 103 → His; Tyr 106 → Ser; Lys 125 → Phe; Ser 127 → Phe; Tyr 132 → Glu; 및 Lys 134 → Tyr;
(b) Gln 28 → His; Leu 36 → Gln; Ala 40 → Ile; Ile 41 → Arg; Gln 49 → Ile; Tyr 52 → Met; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Met; Leu 70 → Lys; Arg 72 → Asp; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Met; Trp 79 → Asp; Arg 81 → Trp; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Lys; Tyr 100 → Phe; Leu 103 → His; Tyr 106 → Ser; Lys 125 → Phe; Ser 127 → Phe; Tyr 132 → Glu; 및 Lys 134 → Tyr;
(c) Gln 28 → His; Leu 36 → Gln; Ala 40 → Ile; Ile 41 → Arg; Gln 49 → Asn; Tyr 52 → Met; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Ala; Leu 70 → Ala; Arg 72 → Asp; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Thr; Trp 79 → Asp; Arg 81 → Trp; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Lys; Tyr 100 → Phe; Leu 103 → His; Tyr 106 → Ser; Lys 125 → Phe; Ser 127 → Phe; Tyr 132 → Glu; 및 Lys 134 → Tyr;
(d) Gln 28 → His; Leu 36 → Gln; Ala 40 → Ile; Ile 41 → Lys; Gln 49 → Asn; Tyr 52 → Met; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Ala; Leu 70 → Ala; Arg 72 → Asp; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Thr; Trp 79 → Asp; Arg 81 → Trp; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Lys; Tyr 100 → Phe; Leu 103 → His; Tyr 106 → Ser; Lys 125 → Phe; Ser 127 → Phe; Tyr 132 → Glu; 및 Lys 134 → Tyr;
(e) Gln 28 → His; Leu 36 → Gln; Ala 40 → Ile; Ile 41 → Lys; Gln 49 → Ser; Tyr 52 → Met; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Gly; Leu 70 → Ser; Arg 72 → Asp; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Thr; Trp 79 → Ala; Arg 81 → Met; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Lys; Tyr 100 → Phe; Leu 103 → His; Tyr 106 → Ser; Lys 125 → Phe; Ser 127 → Phe; Tyr 132 → Glu; 및 Lys 134 → Tyr;
(f) Gln 28 → His; Leu 36 → Gln; Ala 40 → Ile; Ile 41 → Lys; Gln 49 → Val; Tyr 52 → Met; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Gly; Leu 70 → Thr; Arg 72 → Asp; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Arg; Trp 79 → Asp; Arg 81 → Ser; Cys 87 → Ser; Leu 94 → Phe; Asn 96 → Lys; Tyr 100 → Phe; Leu 103 → His; Tyr 106 → Ser; Lys 125 → Phe; Ser 127 → Phe; Tyr 132 → Glu; 및 Lys 134 → Tyr;
(g) Gln 28 → His; Leu 36 → Gln; Ala 40 → Ile; Ile 41 → Arg; Gln 49 → His; Tyr 52 → Met; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Gly; Leu 70 → Thr; Arg 72 → Asp; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Thr; Trp 79 → Ala; Arg 81 → Ser; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Lys; Tyr 100 → Phe; Leu 103 → His; Tyr 106 → Ser; Lys 125 → Phe; Ser 127 → Phe; Tyr 132 → Glu; 및 Lys 134 → Tyr;
(h) Gln 28 → His; Leu 36 → Gln; Ala 40 → Ile; Ile 41 → Lys; Gln 49 → Asn; Tyr 52 → Met; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Gly; Leu 70 → Thr; Arg 72 → Asp; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Thr; Trp 79 → Ala; Arg 81 → Ser; Phe 83 → Leu; Cys 87 → Ser; Leu 94 → Phe; Asn 96 → Lys; Tyr 100 → Phe; Leu 103 → His; Tyr 106 → Ser; Lys 125 → Phe; Ser 127 → Phe; Tyr 132 → Glu; 및 Lys 134 → Tyr;
(i) Gln 28 → His; Leu 36 → Gln; Ala 40 → Ile; Ile 41 → Arg; Gln 49 → Ser; Tyr 52 → Met; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Ala; Leu 70 → Thr; Arg 72 → Asp; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Asn; Trp 79 → Ala; Arg 81 → Ser; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Lys; Tyr 100 → Phe; Leu 103 → His; Tyr 106 → Ser; Lys 125 → Phe; Ser 127 → Phe; Tyr 132 → Glu; 및 Lys 134 → Tyr.
(j) Leu 36 → Met; Ala 40 → Asn; Ile 41 → Leu; Gln 49 → His; Tyr 52 → Ser; Ser 68 → Asp; Leu 70 → Met; Arg 72 → Leu; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Gln; Trp 79 → Ile; Arg 81 → Trp; Asn 96 → Phe; Tyr 100 → Asp; Leu 103 → His; Lys 125 → Ser; Ser 127 → Ile; Tyr 132 → Trp; 및 Lys 134 → Gly;
(k) Leu 36 → Met; Ala 40 → Asn; Ile 41 → Leu; Gln 49 → His; Tyr 52 → Ser; Ser 68 → Asp; Leu 70 → Met; Arg 72 → Leu; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Gln; Trp 79 → Ile; Arg 81 → Trp; Phe 92 → Leu; Asn 96 → Phe; Lys 98 → Arg; Tyr 100 → Asp; Pro 101 → Leu; Leu 103 → His; Lys 125 → Ser; Ser 127 → Ile; Tyr 132 → Trp; 및 Lys 134 → Gly;
(l) Asn 25 → Tyr; Leu 36 → Met; Ala 40 → Asn; Ile 41 → Leu; Gln 49 → His; Tyr 52 → Gly; Ser 68 → Asp; Leu 70 → Met; Phe 71 → Leu; Arg 72 → Leu; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Gln; Trp 79 → Ile; Arg 81 → Gln; Phe 92 → Ser; Asn 96 → Phe; Tyr 100 → Asp; Leu 103 → His; Lys 125 → Ser; Ser 127 → Ile; Tyr 132 → Trp; 및 Lys 134 → Gly;
(m) Leu 36 → Met; Ala 40 → Asn; Ile 41 → Leu; Gln 49 → His; Tyr 52 → Gly; Ser 68 → Asp; Leu 70 → Met; Arg 72 → Leu; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Gln; Tyr 78 → His; Trp 79 → Ile; Arg 81 → Trp; Phe 92 → Leu; Asn 96 → Phe; Tyr 100 → Asp; Leu 103 → His; Lys 125 → Ser; Ser 127 → Ile; Tyr 132 → Trp; 및 Lys 134 → Gly;
(n) Asn 25 → Asp; Leu 36 → Met; Ala 40 → Asn; Ile 41 → Leu; Gln 49 → His; Tyr 52 → Gly; Ser 68 → Asp; Leu 70 → Met; Arg 72 → Leu; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Gln; Trp 79 → Ile; Arg 81 → Trp; Phe 92 → Leu; Asn 96 → Phe; Tyr 100 → Asp; Leu 103 → His; Lys 125 → Ser; Ser 127 → Ile; Tyr 132 → Trp; 및 Lys 134 → Gly;
(o) Val 33 → Ile; Leu 36 → Met; Ala 40 → Asn; Ile 41 → Leu; Gln 49 → His; Tyr 52 → Gly; Ser 68 → Asp; Leu 70 → Met; Arg 72 → Leu; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Gln; Trp 79 → Ile; Arg 81 → Trp; Phe 92 → Leu; Asn 96 → Phe; Tyr 100 → Asp; Leu 103 → His; Lys 125 → Ser; Ser 127 → Ile; Tyr 132 → Trp; 및 Lys 134 → Gly;
(p) Gln 20 → Arg; Leu 36 → Met; Ala 40 → Asn; Ile 41 → Leu; Glu 44 → Val; Gln 49 → His; Tyr 52 → Gly; Ser 68 → Asp; Leu 70 → Met; Arg 72 → Leu; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Gln; Trp 79 → Ile; Arg 81 → Trp; Phe 92 → Leu; Asn 96 → Phe; Tyr 100 → Asp; Leu 103 → His; Phe 122 → Tyr; Lys 125 → Ser; Ser 127 → Ile; Tyr 132 → Trp; 및 Lys 134 → Gly;
(q) Leu 36 → Met; Ala 40 → Asn; Ile 41 → Leu; Gln 49 → His; Tyr 52 → Ser; Ser 68 → Asp; Leu 70 → Met; Arg 72 → Leu; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Gln; Trp 79 → Ile; Ile 80 → Asn; Arg 81 → Trp; Thr 82 → Pro; Asn 96 → Phe; Tyr 100 → Asp; Pro 101 → Leu; Leu 103 → Pro; Lys 125 → Ser; Ser 127 → Ile; Tyr 132 → Trp; 및 Lys 134 → Gly;
(r) Leu 36 → Met; Ala 40 → Asn; Ile 41 → Leu; Gln 49 → His; Tyr 52 → Gly; Lys 59 → Asn; Ser 68 → Asp; Leu 70 → Met; Arg 72 → Leu; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Gln; Trp 79 → Ile; Arg 81 → Trp; Phe 92 → Leu; Asn 96 → Phe; Tyr 100 → Asp; Leu 103 → His; Lys 125 → Ser; Ser 127 → Ile; Tyr 132 → Trp; 및 Lys 134 → Gly; 및
(s) Leu 36 → Met; Ala 40 → Asn; Ile 41 → Leu; Glu 44 → Asp; Gln 49 → His; Tyr 52 → Ser; Ser 68 → Asp; Leu 70 → Met; Phe 71 → Leu; Arg 72 → Leu; Lys 73 → Asp; Asp 77 → His; Trp 79 → Ile; Arg 81 → Trp; Phe 92 → Leu; Asn 96 → Phe; Tyr 100 → Asp; Leu 103 → His; Lys 125 → Ser; Ser 127 → Ile; Tyr 132 → Trp; 및 Lys 134 → Gly.
제34항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서,
리포칼린 뮤테인의 아미노산 서열은 SEQ ID NOs: 41-59로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는 융합 단백질.
제34항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서,
리포칼린 뮤테인의 아미노산 서열은 SEQ ID NOs: 41-59로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 융합 단백질.
제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서,
하나의 서브유닛은 링커를 통해 다른 서브유닛에 연결되는 융합 단백질.
제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서,
제2 서브유닛은 링커를 통해 N-말단에서 제1 서브유닛의 각 중쇄 불변 영역(CH)의 N- 또는 C-말단 또는 제1 서브유닛의 각 경쇄 불변 영역(CL)의 N- 또는 C-말단에 연결되는 융합 단백질.
제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서,
제3 서브유닛은 링커를 통해 N-말단에서 제1 서브유닛의 각 중쇄 불변 영역(CH)의 N- 또는 C-말단, 각 제1 서브유닛의 각 경쇄 불변 영역(CL)의 N- 또는 C-말단, 또는 각 제2 서브유닛의 C-말단에 연결되는 융합 단백질.
제41항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서,
링커는 비구조화 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)₃ 링커(SEQ ID NO: 13)인 융합 단백질.
제41항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서,
링커는 비구조화 글리신-세린 링커, 폴리프롤린 링커, 프롤린-알라닌-세린 중합체 또는 SEQ ID NOs: 13-23으로 구성된 군에서 선택되는 링커인 융합 단백질.
제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서,
제1 서브유닛은 항체인 융합 단백질.
제46항에 있어서,
항체의 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NOs: 75-79로 구성된 군에서 선택되고, 단클론 항체의 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NOs: 80-84로 구성된 군에서 선택되는 융합 단백질.
제46항에 있어서,
항체는 SEQ ID NOs: 85-86 중 어느 하나인 중쇄 및 SEQ ID NO: 87의 경쇄를 포함하는 융합 단백질.
제46항에 있어서,
항체는 각각 하기와 같이 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 융합 단백질:
SEQ ID NOs: 75 및 80, SEQ ID NOs: 76 및 81, SEQ ID NOs: 77 및 82, SEQ ID NOs: 78 및 83 또는 SEQ ID NOs:79 및 84.
제46항에 있어서,
항체는 각각 하기와 같이 중쇄 및 경쇄를 포함하는 융합 단백질:
SEQ ID NOs: 85 및 87 및 SEQ ID NOs: 86 및 87.
제46항에 있어서,
항체의 중쇄는 CDR 서열의 하기 세트 중 하나를 포함하는 융합 단백질:
(a) GFSLSNYD(HCDR1, SEQ ID NO: 59), IWTGGAT(HCDR2, SEQ ID NO: 60), VRDSNYRYDEPFTY(HCDR3; SEQ ID NO: 61);
(b)GFDIKDTY(HCDR1, SEQ ID NO: 65), IDPADGNT(HCDR2, SEQ ID NO: 66), ARGLGAWFAS(HCDR3; SEQ ID NO: 67); 및
(c) GFNIKDTY(HCDR1, SEQ ID NO: 70), IDPANGNT(HCDR2, SEQ ID NO: 71), SRGPPGGIGEYIYAMDY(HCDR3; SEQ ID NO: 72).
제46항에 있어서,
항체의 경쇄는 CDR 서열의 하기 세트 중 하나를 포함하는 융합 단백질:
(a) QSIGTN(LCDR1, SEQ ID NO: 63), YAS(LCDR2), QQSNSWPYT(LCDR3; SEQ ID NO: 64);
(b) QDITNS(LCDR1, SEQ ID NO: 68), YTS(LCDR2), QQGHTLPPT(LCDR3; SEQ ID NO: 69); 및
(c) SSVSSSY(LCDR1, SEQ ID NO: 73), STS(LCDR2), HQYHRSPPT(LCDR3; SEQ ID NO: 74).
제46항에 있어서,
항체의 중쇄는 CDR 서열의 하기 세트, GFSLSNYD(HCDR1, SEQ ID NO: 59), IWTGGAT(HCDR2, SEQ ID NO: 60) 및 VRDSNYRYDEPFTY(HCDR3; SEQ ID NO: 61)를 포함하고, 항체의 경쇄는 CDR 서열의 하기 세트, QSIGTN(LCDR1, SEQ ID NO: 62), YAS(LCDR2) 및 QQSNSWPYT(LCDR3; SEQ ID NO: 63)를 포함하는 융합 단백질.
제46항에 있어서,
단클론 항체는 IgG4 백본을 갖는 융합 단백질.
제54항에 있어서,
IgG4 백본은 하나 이상의 하기의 돌연변이를 갖는 융합 단백질:
S228P, N297A, F234A, L235A, M428L, N434S, M252Y, S254T 및 T256E.
제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서,
융합 단백질은 SEQ ID NOs: 86-94 중 어느 하나에 도시된 아미노산 서열을 포함하고, 또는 융합 단백질은 SEQ ID NOs: 86-94 중 어느 하나에 도시된 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질.
제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서,
융합 단백질은 SEQ ID NOs: 90 및 87에 도시된 아미노산 서열, SEQ ID NOs: 86 및 91에 도시된 아미노산 서열, SEQ ID NOs: 92 및 87에 도시된 아미노산 서열, SEQ ID NOs: 86 및 93에 도시된 아미노산 서열, SEQ ID NOs: 94 및 87에 도시된 아미노산 서열 또는 SEQ ID NOs: 90 및 91에 도시된 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질.
제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서,
융합 단백질은 SEQ ID NOs: 90 및 87, SEQ ID NOs: 86 및 91, SEQ ID NOs: 92 및 87, SEQ ID NOs: 86 및 93, SEQ ID NOs: 94 및 87 또는 SEQ ID NOs: 90 및 91에 도시된 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질.
제1항 내지 제58항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자.
제59항에 있어서,
핵산 분자는 조절 서열에 작동 가능하게 연결되어 상기 핵산 분자의 발현을 허용하는 핵산 분자.
제59항 또는 제60항에 있어서,
핵산 분자는 벡터 또는 파지미드 벡터에 포함되는 핵산 분자.
제58항 내지 제60항 중 어느 한 항의 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포.
융합 단백질을 코딩하는 핵산으로부터 출발하여 생산되는 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질의 생산 방법.
제63항에 있어서,
융합 단백질은 세균 또는 진핵 숙주 생물에서 생산되고, 이 숙주 생물 또는 이의 배양물로부터 분리되는 방법.
CD137의 다운스트림 신호전달 경로를 활성화하고 동시에 PD-L1-양성 종양 세포와 결합하기 위한 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질 또는 그러한 융합 단백질을 포함하는 조성물의 용도.
제1항 내지 제58항 중 어느 한 항의 하나 이상의 융합 단백질 또는 그러한 융합 단백질을 포함하는 하나 이상의 조성물을 종양을 포함하는 조직에 적용하는 것을 포함하는 CD137의 다운스트림 신호전달 경로를 활성화하고 동시에 PD-L1-양성 종양 세포와 결합하는 방법.
제1항 내지 제58항 중 어느 한 항의 하나 이상의 융합 단백질 또는 그러한 융합 단백질을 포함하는 하나 이상의 조성물을 종양을 포함하는 조직에 적용하는 것을 포함하는 T-세포를 보조-자극하고 동시에 PD-L1-양성 종양 세포와 결합하는 방법.
제1항 내지 제58항 중 어느 한 항의 하나 이상의 융합 단백질 또는 그러한 융합 단백질을 포함하는 하나 이상의 조성물을 종양을 포함하는 조직에 적용하는 것을 포함하는 림프구 활성을 유도하고 동시에 PD-L1-양성 종양 세포와 결합하는 방법.
제1항 내지 제58항 중 어느 한 항의 하나 이상의 융합 단백질 또는 그러한 융합 단백질을 포함하는 하나 이상의 조성물을 종양을 포함하는 조직에 적용하는 것을 포함하는 T-세포에서 CD137 클러스터링 및 활성화의 유도 및 상기 T 세포를 PD-L1-양성 종양 세포로 인도하는 방법.
제1항 내지 제58항 중 어느 한 항의 하나 이상의 융합 단백질 또는 그러한 융합 단백질을 포함하는 하나 이상의 조성물을 종양을 포함하는 조직에 적용하는 것을 포함하는 PD-L1-양성 종양 세포의 주변에서 국소화 림프구 반응을 유도하는 방법.
제1항 내지 제58항 중 어느 한 항의 하나 이상의 융합 단백질 또는 그러한 융합 단백질을 포함하는 하나 이상의 조성물을 종양을 포함하는 조직에 적용하는 것을 포함하는 PD-L1-양성 종양 세포의 주변에서 T-세포에 의한 IL-2 및/또는 세포독성 인자의 증가된 분비를 유도하는 방법.
제71항에 있어서,
세포독성 인자는 퍼포린, 그랜자임 B 및 그랜자임 A로 구성된 군에서 선택되는 방법.
제1항 내지 제58항 중 어느 한 항의 하나 이상의 융합 단백질 또는 그러한 융합 단백질을 포함하는 하나 이상의 조성물을 종양을 포함하는 조직에 적용하는 것을 포함하는 PD-L1-양성 종양 세포의 주변에서 T-세포에 의한 세포독성 인자의 증가된 분비를 유도하는 방법.
제1항 내지 제58항 중 어느 한 항의 하나 이상의 융합 단백질을 포함하는 약학적 조성물.
제1항 내지 제58항 중 어느 한 항의 하나 이상의 융합 단백질 또는 그러한 융합 단백질을 포함하는 하나 이상의 조성물을 종양을 포함하는 조직에 적용하는 것을 포함하는 PD-L1-양성 암의 예방, 개선 또는 치료 방법.
치료에 사용하기 위한 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항의 융합 단백질.
제70항에 있어서,
용도는 암의 치료에 있는 융합 단백질.
의약의 제조를 위한 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항의 융합 단백질의 용도.
제78항에 있어서,
의약은 암 치료용인 용도.