ES2710384T3 - Procedimientos para la prevención o el tratamiento de determinados trastornos mediante la inhibición de la unión de IL-4 y/o IL-13 a sus respectivos receptores - Google Patents

Abstract

Composición que comprende una muteína de lipocalina lacrimal humana o un fragmento de la misma o una proteína de fusión o un conjugado de la misma que es capaz de inhibir la unión de IL-4 y/o IL-13 a sus receptores respectivos, para uso en un procedimiento de tratamiento, mejora o prevención de un trastorno en un sujeto, en donde dicha muteína de lipocalina o fragmento es capaz de exhibir una actividad terapéutica in vivo en el sujeto y es capaz de inhibir in vivo el tránscrito Ccl11 inducido por IL-13 humana Ccl11 (eotaxina), en donde dicha muteína de lipocalina o fragmento tiene al menos un 75 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la lipocalina lacrimal humana madura (SEQ ID NO: 1), en donde dicha muteína de lipocalina o fragmento tiene los mismos aminoácidos que se exponen en SEQ ID NO: 6 en las posiciones de aminoácidos correspondientes a las posiciones 26, 27, 28, 30, 31, 32, 33, 34, 53, 55, 56, 57, 58, 61, 63, 64, 66, 80, 83, 104-106 y 108 de la secuencia polipeptídica lineal de la lipocalina lacrimal humana madura (SEQ ID NO: 1), y en donde el fragmento de la muteína de lipocalina carece de al menos uno de los aminoácidos N-terminales y/o C-terminales en comparación con dicha muteína de lipocalina.

Description

DESCRIPCION

Procedimientos para la prevencion o el tratamiento de determinados trastornos mediante la inhibicion de la union de IL-4 y/o IL-13 a sus respectivos receptores

Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a una composicion que comprende una mutelna de lipocalina lacrimal humana o un fragmento de la misma o una protelna de fusion o un conjugado de la misma que es capaz de inhibir la union de IL-4 y/o IL-13 a sus receptores respectivos, para su uso en un procedimiento de tratamiento, mejora o prevencion de un trastorno en un sujeto, en la que dicha mutelna de lipocalina o fragmento es capaz de mostrar una actividad ^terapeutica in vivo ^{en el sujeto y es capaz de inhibir el transcrito Ccl 11 inducido por IL-13 humana (eotaxina)} in vivo ^, en la que dicha mutelna de lipocalina o fragmento tiene al menos 75 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoacidos de la lipocalina lacrimal humana madura (SEQ ID NO: 1), en la que dicha mutelna de lipocalina o fragmento tiene los mismos aminoacidos que se exponen en SEQ ID NO: 6 en posiciones de aminoacidos correspondientes a las posiciones 26, 27, 28, 30, 31, 32, 33, 34, 53, 55, 56, 57, 58, 61, 63, 64, 66, 80, 83, 104-106 y 108 de la secuencia polipeptldica lineal de la lipocalina lacrimal humana madura (SEQ ID NO: 1), y en la que el fragmento de la mutelna de lipocalina carece de al menos uno de los aminoacidos N-terminales y/o C-terminales en comparacion con dicha mutelna de lipocalina.

En algunas realizaciones, el trastorno se asocia preferiblemente a un aumento de la respuesta inmune Th2. En algunas realizaciones, la administracion es preferiblemente de manera local al pulmon para tratar, mejorar o prevenir el asma alergica, la rinitis, la conjuntivitis, la fibrosis pulmonar, la fibrosis qulstica, la enfermedad pulmonar obstructiva cronica, la proteinosis alveolar pulmonar o el slndrome de dificultad respiratoria del adulto.

Antecedentes

Las protelnas que se unen selectivamente a objetivos seleccionados por medio de una interaccion no covalente desempenan un papel crucial como reactivos en la biotecnologla, la medicina, la bioanalltica, as! como en las ciencias biologicas y de la vida en general. Los anticuerpos, es decir, las inmunoglobulinas, son un ejemplo destacado de esta clase de protelnas. A pesar de las multiples necesidades de tales protelnas junto con el reconocimiento, la union y/o la separacion de ligandos/objetivos, en la actualidad se usan casi exclusivamente inmunoglobulinas.

Otras moleculas de union proteica que tienen funciones similares a las de los anticuerpos son los miembros de la familia de las lipocalinas, que han evolucionado naturalmente para unirse a ligandos. Las lipocalinas se encuentran en muchos organismos, incluyendo vertebrados, insectos, plantas y bacterias. Los miembros de la familia de las protelnas de la lipocalina (Pervaiz, S. y Brew, K. (1987) FASEB J. 1, 209-214) son generalmente protelnas secretadas pequenas y tienen una unica cadena polipeptldica. Se caracterizan por un rango de diferentes propiedades de reconocimiento molecular: su capacidad para unirse a varias moleculas, principalmente hidrofobas (tales como retinoides, acidos grasos, colesteroles, prostaglandinas, biliverdinas, feromonas, saborizantes y odorantes), su union a receptores especlficos de la superficie celular y su formacion de complejos macromoleculares. Aunque en el pasado se clasificaban principalmente como protelnas de transporte, ahora esta claro que las lipocalinas cumplen varias funciones fisiologicas. Estas incluyen roles en el transporte de retinol, la olfaccion, la senalizacion de feromonas y la slntesis de prostaglandinas. Las lipocalinas tambien se han implicado en la regulation de la respuesta inmune y en la mediation de la homeostasis celular (revisada, por ejemplo, en Flower, D.R. (1996) Biochem. J. 318, 1-14 y Flower, D.R. y col. (2000) Biochim. Biophys. Acta 1482, 9-24). Lofblom y col. Current Opinion in Biotechnology, 2011, 22: 843-848 divulga andamios proteicos no basados en inmunoglobulina como alternativas potenciales para los anticuerpos.

Las lipocalinas comparten niveles inusualmente bajos de conservation de secuencia global, a menudo con identidades de secuencia de menos del 20 %. En fuerte contraste, su patron de plegado general es altamente conservado. La parte central de la estructura de la lipocalina consiste en una unica lamina p antiparalela de ocho cadenas cerrada sobre si misma para formar un barril p continuamente unido por hidrogeno. Este barril p forma una cavidad central. Un extremo del barril esta bloqueado estericamente por el segmento peptldico N-terminal que se ejecuta en su parte inferior, as! como por tres bucles peptldicos que conectan las cadenas p. El otro extremo del barril p esta abierto al disolvente y abarca un sitio de union al objetivo, que esta formado por cuatro bucles peptldicos flexibles. Es esta diversidad de bucles en el andamio, por lo demas rlgido, de lipocalina lo que da lugar a varios modos de union diferentes, cada uno capaz de acomodar objetivos de diferente tamano, forma y caracter qulmico (revisado, por ejemplo, en Flower, D.R. (1996), supra; Flower, D.R. y col. (2000), supra, o Skerra, A. (2000) Biochim. Biophys. Acta 1482, 337-350).

Varias publicaciones de patentes del PCT (por ejemplo, los documentos WO 99/16873, WO 00/75308, WO 03/029463, WO 03/029471 y WO 2005/19256) divulgan como pueden construirse las mutelnas de varias lipocalinas (por ejemplo, lipocalina lacrimal y lipocalina hNGAL) para exhibir una alta afinidad y especificidad contra un objetivo que es diferente a un ligando natural de una lipocalina de tipo salvaje. Esto se puede hacer, por ejemplo, mutando una o mas posiciones de aminoacidos de al menos uno de los cuatro bucles peptldicos. Ademas, la publicacion de patente del PCT n.° WO 2008/015239 ensena mutelnas de lipocalina que se unen al receptor alfa de IL-4. Ademas, la publicacion de patente del PCT n.° WO 2011/154420 ensena uno o mas procedimientos de produccion de mutelnas de lipocalina, que se unen a la subunidad alfa del receptor de IL-4. Ademas, Holbaum y col., Inflammation Research, 2011 vol. 60, n.° Supl. 1, paginas 82-83, describe una mutelna de lipocalina lacrimal humana que se une a IL-4Ra.

Las citocinas Th2 IL-4 (oficialmente conocidas como Interleucina-4, Uniprot #P05112) e IL-13 (oficialmente conocidas como Interleucina-13, Uniprot #P35225) tienen funciones que se superponen en gran medida y promueven directamente varias caracterlsticas clave del asma, incluyendo la eosinofilia, la metaplasia de celulas caliciformes, la hiperrespuesta de las vlas respiratorias, el interruptor de inmunoglobulina IgE, la activacion de macrofagos alternativa, la remodelacion de celulas musculares lisas y la fibrosis subepitelial. Ademas, el polimorfismo genetico en los genes de IL-4, IL-13, IL-4RA (oficialmente conocida como subunidad alfa del receptor de Interleucina-4, Uniprot #P24394, SEQ ID NO: 12) y Stat6 estan relacionados con el asma. Esto es particularmente relevante, ya que la combination de la variante alelica de IL-4, IL-13, IL-4RA y Stat6 parece sinergica y el polimorfismo descrito en IL-4, IL-13 e IL-4RA mejora la produccion, funcion o actividad de serialization de las citocinas Th2 o la subunidad comun del receptor IL-4/IL-13 (Finkelman y col. JI, 2010, 184:1663-74). Recientemente, se han definido los endotipos o subfenotipos del asma por un mecanismo molecular o una respuesta al tratamiento. Woodruff y col., por ejemplo, definieron los fenotipos del asma en Th2-alto y Th2-bajo en funcion de la expresion epitelial pulmonar de los genes inducibles por IL-13 POSTN (periostin), CLCA1 (gob5) y SERPINB2 (Wooddruff PG y col. Genome-wide profiling identifies epithelial cell genes associated with asthma and with treatment response to corticosteroids PNAS, 2007, 104: 15858-63; Prescott G. Woodruff) (T-helper Type 2-driven inflammation defines major subphenotypes of Asthma, Am.J. Respir.Crti.Care Med., 2009, 180:388-395). Moore y col., Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2002, 282:L847-L835 divulgan que IL-13 e IL-4 causan la liberation de eotaxina en las celulas musculares lisas de las vlas respiratorias humanas. Fiset y col., J allergy Clin Immunol, 2003, 111 (3):580-586 divulgan la modulation de la respuesta alergica en la mucosa nasal por oligodesoxinucleotidos antisentido para IL-4. Walker y col., Immunology, 2009, 127:256-266, divulgan que el ARN de interferencia de STAT6 atenua los eventos en curso mediados por interleucina-13 en celulas epiteliales de pulmon. Terada y col., PNAS, 2006, 103(23):8816-8821 divulgan que IL-18 contribuye a la inflamacion de la piel tipo dermatitis atopica ^{inducida por el producto} Staphylococcus aureus ^{en ratones. Cowden y col., Respiratory Research, 2010, 11:86} divulgan que el antagonismo del receptor de histamina H4 disminuye la inflamacion y disfuncion de las vlas respiratorias existentes a traves de la modulacion de las citoquinas Th2.

Por lo tanto, serla deseable contar con procedimientos terapeuticos mejorados que involucren una cantidad terapeuticamente eficaz de una composition que comprenda mutelnas de lipocalina lacrimal humana, que se unan a IL-4RA con una alta afinidad de union y, por lo tanto, inhiban la union de IL-4 y/o la IL-13 a sus receptores ^{respectivos, que exhiban actividades terapeuticas} in vivo ^{en un sujeto que lo necesite. Cuando se usa en la presente} solicitud, un sujeto que lo necesite puede ser un mamlfero, tal como un ser humano, un perro, un raton, una rata, un cerdo, un simio como un cinomolgo, por citar solo algunos ejemplos ilustrativos, que necesiten un tratamiento o la prevention de un trastorno.

Sumario de la divulgacion

La presente divulgacion se refiere a una composicion que comprende una mutelna de lipocalina lacrimal humana o un fragmento de la misma o una protelna de fusion o un conjugado de la misma que es capaz de inhibir la union de IL-4 y/o IL-13 a sus receptores respectivos, para su uso en un procedimiento de tratamiento, mejora o prevencion de un trastorno en un sujeto, en el que dicha mutelna o fragmento de lipocalina es capaz de mostrar una actividad ^terapeutica in vivo ^{en el sujeto y es capaz de inhibir el transcrito Ccl 11 inducido por IL-13 humana (eotaxina)} in vivo ^, en la que dicha mutelna de lipocalina o fragmento tiene al menos un 75 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoacidos de la lipocalina lacrimal humana madura (SEQ ID NO: 1), en la que dicha mutelna de lipocalina o fragmento tiene los mismos aminoacidos que se exponen en la SEQ ID NO: 6 en posiciones de aminoacidos correspondientes a las posiciones 26, 27, 28, 30, 31, 32, 33, 34, 53, 55, 56, 57, 58, 61, 63, 64, 66, 80, 83, 104-106 y 108 de la secuencia polipeptldica lineal de la lipocalina lacrimal humana madura (SEQ. ID NO: 1), y en el que el fragmento de la mutelna de lipocalina carece de al menos uno de los aminoacidos N-terminales y/o C-terminales en comparacion con dicha mutelna de lipocalina.

En alguna realization adicional, la mutelna de lipocalina es capaz de interrumpir la senalizacion descendente y/o las respuestas celulares inducidas por IL-4 y/o IL-13. En diversas realizaciones, el trastorno es un trastorno en el que la via de IL4/IL13 contribuye a la patogenesis de la enfermedad. En varias realizaciones adicionales, la composicion puede administrarse localmente al pulmon. En diversas realizaciones preferidas, la composicion puede administrarse mediante inhalation de un aerosol. En algunas realizaciones preferidas, la composicion se administra a un sujeto que la necesita con una frecuencia seleccionada del grupo que consiste en: hasta cuatro veces al dla, hasta tres veces al dla, hasta dos veces al dla, hasta una vez al dla, hasta una vez cada dos dlas, hasta una vez cada tres dlas, hasta una vez cada semana y hasta una vez cada dos semanas.

En algunas realizaciones, cuando se usa en la presente solicitud, un sujeto que necesita tal composicion padece un trastorno en el que la expresion de IL-4 y/o la expresion de IL-13 contribuyen o estan relacionadas con la patogenesis o el empeoramiento de la enfermedad. En algunas realizaciones, el sujeto, que necesita tal composicion, sufre de un trastorno que puede aliviarse, mejorarse o inhibirse mediante la eliminacion, inhibition o reduction de la actividad de IL-4 y/o la actividad de IL-13. En algunas realizaciones adicionales, un sujeto que necesita tal composicion puede padecer uno o mas trastornos que incluyen, por ejemplo, inflamacion alergica, asma alergica, rinitis, conjuntivitis, fibrosis pulmonar, fibrosis qulstica, enfermedad pulmonar obstructiva cronica, proteinosis alveolar pulmonar o slndrome de dificultad respiratoria en adultos. Tambien se preve que la mutelna de lipocalina de la divulgation, en algunas realizaciones, se aplique para el tratamiento, la mejora o la prevention de la fibrosis tisular (vease Chiaramonte y col. (1999), J. Clin. Invest. 104(6), 777-785). La fibrosis puede resultar preferiblemente de la curacion de una herida, por ejemplo, una herida de una incision quirurgica. La fibrosis tisular afecta, por ejemplo, a un tejido seleccionado del grupo que consiste en hlgado, epidermis cutanea, endodermis cutanea, musculo, tendon, cartllago, tejido cardlaco, tejido pancreatico, tejido pulmonar, tejido uterino, tejido neural, testlculo, ovario, glandula suprarrenal, arteria, vena, colon, intestino delgado, tracto biliar y vlsceras, en particular, el tejido se selecciona de pulmon e hlgado.

Por ejemplo, un trastorno que puede tratarse, mejorarse o prevenirse preferiblemente mediante un procedimiento de la divulgacion esta asociado a un aumento de la respuesta inmune Th2.

En algunas realizaciones, el trastorno puede estar asociado a una reaction alergica o una inflamacion alergica, preferiblemente, la reaccion alergica es una alergia alimentaria, y preferiblemente, la inflamacion alergica esta asociada a asma alergica, rinitis, conjuntivitis o dermatitis. En diversas realizaciones preferidas, el asma alergica puede ser una inflamacion de las vlas respiratorias en la que la via IL4/IL13 contribuye a la patogenesis de la enfermedad.

En otras realizaciones preferidas, la composicion de la divulgacion comprende ademas un medicamento antialergico y/o un medicamento antialergico antiinflamatorio.

Otro trastorno, a modo de ejemplo, que puede tratarse, mejorarse o prevenirse preferiblemente mediante un procedimiento de la divulgacion se asocia a una production de moco o una secretion de moco.

En diversas realizaciones preferidas, el trastorno puede ser un trastorno pulmonar, y preferiblemente una enfermedad pulmonar obstructiva cronica (EPOC) o fibrosis qulstica (FQ).

Segun se describe en el presente documento, tal composicion se puede usar como un agente de terapia genica para diversos trastornos descritos.

Una mutelna de lipocalina de la divulgacion puede ser una mutelna de lipocalina lacrimal humana que tiene uno o mas aminoacidos en una position correspondiente a la position 27, 28, 30, 31, 33, 53, 57, 61, 64, 66, 80, 83, 104­ 106 y 108 de la secuencia polipeptldica lineal de la lipocalina lacrimal humana madura en un aminoacido mutado. Sin embargo, la mutelna de lipocalina de la divulgacion tambien puede ser una mutelna de una lipocalina distinta de la lipocalina lacrimal humana, tal como la lipocalina NGAL humana u otras lipocalinas descritas en el presente documento.

En varios ejemplos, la mutelna de lipocalina descrita en el presente documento tiene, en cualquiera de dos o mas aminoacidos en una posicion correspondiente a las posiciones 26, 32, 34, 55, 56, 58 y 63 de la secuencia polipeptldica lineal de la lipocalina lacrimal humana madura, un aminoacido mutado.

La mutelna de lipocalina descrita en el presente documento tiene en una realization particularmente preferida una identidad de al menos un 75 % de la secuencia de lipocalina lacrimal humana madura (SEQ ID NO: 1).

Una mutelna de lipocalina aplicada en los procedimientos de la presente divulgacion tiene preferiblemente reactividad cruzada con otras especies, por ejemplo, el IL-4RA de titl, que permite la prueba de la mutelna de lipocalina entonces candidata en monos titles que se parecen al organismo humano. La mutelna de lipocalina puede o no tener reactividad cruzada con IL-4RA de otras especies no humanas, tales como el IL-4RA de raton y/o IL-4RA de cinomolgo.

En general, se prefiere que la mutelna de lipocalina no tenga reactividad cruzada con una protelna relacionada o una protelna no relacionada. Dicha protelna relacionada es, por ejemplo, una cadena alfa del receptor IL-23 y/o un receptor de citoquinas tipo I con dominio de fibronectina tipo III, mientras que dicha protelna no relacionada es, por ejemplo, una cadena alfa de un receptor IL-6 y/o IL-18.

Descripcion de las figuras

La Figura 1 muestra la inhibicion de la fosforilacion de STAT 6 inducida por IL-4 e IL-13 humana (ensayo basado en FACS) en celulas TF-1 por una mutelna de lipocalina de la divulgacion.

La Figura 2 muestra la inhibicion de la fosforilacion de STAT 6 inducida por IL-4 humana (ensayo basado en FACS) en ratones doble knock-in de la cadena de IL-4RA/IL-13RA1 humana (conocida oficialmente como la subunidad alfa-1 del receptor de Interleucina-13, Uniprot # 78552, SEQ ID NO: 13) por una mutelna de lipocalina de la divulgacion.

La Figura 3 muestra la inhibicion de la eotaxina inducida por IL-13 humana en tejido pulmonar de ratones doble knock-in de la cadena 1 alfa del receptor de IL-4 humana/receptor de IL-13 humana por una mutelna de lipocalina de la divulgacion.

La Figura 4 muestra la inhibicion de la transcripcion de eotaxina inducida por IL-13 humana en ratones doble knock-in de la cadena 1 alfa del receptor de IL-4 humana/IL-13 humana por una mutelna de lipocalina de la divulgacion cuando se administra a diferentes intervalos de tiempo (Figura 4a) o diferentes dosis (Figura 4b), antes de la administracion de IL-13 humana, as! como en comparacion con un mutante de IL-4 a diferentes niveles de dosis (Figura 4c).

La Figura 5 muestra el analisis de una mutelna de lipocalina nebulizada por cromatografla de exclusion por tamano y difraccion laser.

La Figura 6 representa las propiedades farmacocineticas y la biodistribucion de una mutelna de lipocalina de la divulgacion en ratones doble knock-in de IL-4RA humana/receptor de IL-13 humana despues de la instilacion intratraqueal.

La Figura 7 muestra la inhibicion de la metaplasia de celulas caliciformes inducida por IL-13 en el sistema de cultivo de interfaz aire-llquido del epitelio de las vlas respiratorias humanas mediante una mutelna de lipocalina de la divulgacion.

Descripcion detallada

La presente divulgacion proporciona una composition que comprende una mutelna de lipocalina lacrimal humana o un fragmento de la misma o una protelna de fusion o un conjugado de la misma que es capaz de inhibir la union de IL-4 y/o IL-13 a sus receptores respectivos, para su uso en un procedimiento de tratamiento, mejora o prevention de ^{un trastorno en un sujeto, en la que tal mutelna de lipocalina es capaz de exhibir una actividad terapeutica} in vivo ^{en el sujeto y es capaz de inhibir el transcrito Ccl11 inducido por IL-13 humana (eotaxina)} in vivo, ^{en la que dicha} mutelna de lipocalina tiene al menos el 75 % de la secuencia de aminoacidos de la lipocalina (SEQ ID NO: 1), en la que dicha mutelna de lipocalina o fragmento tiene los mismos aminoacidos que la SEQ ID NO: 6 en posiciones de aminoacidos correspondientes a las posiciones 26, 27, 28, 30, 31, 32, 33, 34, 53, 55, 56, 57, 58, 61, 63, 64, 66, 80, 83, 104-106 y 108 de la secuencia polipeptldica lineal de la lipocalina lacrimal humana madura (SEQ ID NO: 1), y en la que el fragmento de la lipocalina es al menos uno de los aminoacidos N-terminales y/o C-terminales en comparacion con dicha mutelna de lipocalina.

Una mutelna de lipocalina para uso de acuerdo con la presente divulgacion puede unirse especlficamente a la cadena alfa del receptor de IL-4. Ventajosamente, estas mutelnas de lipocalina tienen una alta afinidad de union por la cadena alfa del receptor de IL-4. Tambien se ha demostrado que estas mutelnas de lipocalina proporcionan propiedades de union para el receptor alfa de IL-4 en relation con las mutelnas de lipocalina proporcionadas en el documento WO 2008/015239; en particular, tienen una mayor afinidad de union.

Los presentes inventores han demostrado que las mutelnas de lipocalina de la presente divulgacion, debido a su union de la cadena alfa del receptor de IL-4, interfieren con la interaction de los receptores de ligando afines, es ^{decir, la(s) citoquina(s) IL-4 y/o IL-13, de una forma tal que provocan una respuesta terapeutica} in vivo. ^{Por ejemplo,} datos de un modelo de raton transgenico, que se uso para investigar los efectos que las mutelnas de lipocalina de la invention pueden tener en la serialization mediada por IL-4 y/o IL-13, demuestran una interruption de la serialization descendente mediada por IL-4 e IL-13. El raton transgenico, que se asemeja a un humano en que los ratones portan genes que codifican la cadena alfa del receptor de IL-4 humana y la cadena alfa 1 del receptor de IL-13, son representativos del potencial terapeutico en humanos. Con este fin, los genes humanos se ubican en el locus correspondiente del cromosoma respectivo del raton, lo que hace que el raton sea un raton doble knock-in que expresa tanto el receptor tipo I como el receptor tipo II. Por lo tanto, cuando se usa en el presente documento, “cantidad terapeuticamente eficaz” es preferiblemente una cantidad de una mutelna de lipocalina de la presente divulgacion que es terapeuticamente eficaz en un ser humano.

En contraste con los Ejemplos de la divulgacion, el estado de la tecnica no ensena al experto en la materia si una mutelna de lipocalina de la divulgacion es capaz de interrumpir la senalizacion descendente o las respuestas ^{celulares inducidas por IL-4 y/o IL-13 en sujetos, y/o que puedan presentar actividad terapeuticas} in vivo ^{en sujetos} que padezcan uno o mas trastornos, tales como inflamacion alergica, asma alergica, rinitis, conjuntivitis, fibrosis pulmonar, fibrosis qulstica, enfermedad pulmonar obstructiva cronica, proteinosis alveolar pulmonar y slndrome de dificultad respiratoria en adultos. Tampoco se puede derivar del estado de la tecnica ninguna information sobre la eficacia de las mutelnas de lipocalina. En ausencia de evidencia de un efecto terapeutico de una mutelna de lipocalina contra trastornos, por ejemplo, asociados a un aumento de la respuesta inmune Th2 y/o con una reaccion alergica o una inflamacion alergica, no cabrla haber esperado de manera razonable tal efecto terapeutico ni los correspondientes procedimientos de tratamiento, prevencion o mejora.

^{De hecho, la presente divulgacion proporciona datos} in vivo ^{que muestran un efecto terapeutico de las mutelnas de} lipocalina descritas en el presente documento que ilustran, por ejemplo, el efecto antiinflamatorio de las mutelnas de lipocalina de la presente divulgacion. A este respecto, la presente divulgacion muestra, por primera vez, que una mutelna de lipocalina de la divulgacion (SEQ ID NO: 6) es capaz de inhibir con eficacia el transcrito Ccl 11 inducido ^{por IL-13 humana (eotaxina)} in vivo ^{y es mas potente que un mutante de IL-4 (la IL-4 (R121D, Y124D) en la Figura} 4c), segun medido por una prueba esencialmente descrita en el Ejemplo 5:

- preparar varios ratones knock-in de doble cadena del receptor alfa de IL-4 humana/receptor alfa 1 de IL-13 humana como se describe en el Ejemplo 4, con la excepcion de que se administraron 30 pl de IL-13 (Peprotech, 1 pg) por instilacion intratraqueal solo una vez,

- opcionalmente, establecer los parametros de prueba como se describe en el Ejemplo 5 y agrupar los ratones en consecuencia,

- aplicar la mutelna de lipocalina (SEQ ID NO: 6) mediante instilacion intratraqueal con un volumen de 30 pl a una dosis constante de 98 pg en diferentes momentos antes de la dosis de IL-13 o en diferentes cantidades 30 minutos antes de la dosis de IL-13,

- aplicar el mutante IL-4 (R121D, Y124D) tambien por instilacion intratraqueal con un volumen de 30 pl en diferentes cantidades 30 minutos antes de la dosis de IL-13,

- usar el modelo abreviado de inflamacion de las vlas respiratorias inducida por IL-13 (administracion intratraqueal con IL-13 unica) para evaluar la duracion de la respuesta farmacologica, la dependencia de la dosis y la potencia comparable.

El efecto terapeutico observado en el modelo animal murino aplicado en la presente divulgacion proporciona, por lo tanto, pruebas suficientes de una aplicacion terapeutica, dada la presencia de ortologos humanos y la ausencia de ortologos murinos. Sobre la base de este principio, es mas que razonable que, en ausencia de datos sobre ^{pacientes humanos, el experimento} in vivo ^{sea lo suficientemente predictivo de la actividad} in vivo, ^{por ejemplo, la actividad antiinflamatoria} in vivo ^{de las mutelnas de lipocalina descritas en el presente documento en humanos.} Ademas, la presente divulgacion demuestra que una mutelna de lipocalina de la divulgacion (SEQ ID NO: 6) es capaz de exhibir una actividad funcional tan buena como un anticuerpo monoclonal anti-IL-4RA (el mAb anti-IL4R en la Figura 7; la region variable de la cadena ligera y pesada que se muestra en SEQ ID NO: 14 y 15, respectivamente) descrita en el Ejemplo 8, segun medida por una prueba esencialmente descrita en el Ejemplo 8: - tratar MucilAir™ (un sistema de cultivo de interfaz aire-llquido con epitelio de las vlas respiratorias humanas ^{reconstituido} in vitro ^{utilizando celulas humanas primarias) cada dos dlas con IL-13 humana a aproximadamente} de 0,3 a 30 ng/ml,

^{- opcionalmente, realizar una tincion con azul Alcian} in situ ^{(tine mucopolisacaridos acidos y glicosaminoglicanos} de azul a verde azulado) y/o realizar un analisis histologico, con el fin de demostrar que MucilAir ™ exhibe una mayor densidad de celulas caliciformes despues de aproximadamente 14 dlas de tratamiento,

- probar el efecto inhibitorio de una mutelna de lipocalina en la metaplasia de las celulas caliciformes comparando la exposicion continua de MucilAir™ con aproximadamente 10 ng/ml de IL-13 humana durante 14 dlas como control positivo, con IL-13 mas diferentes concentraciones de una mutelna de lipocalina, con IL-13 mas diferentes concentraciones de dicho anticuerpo monoclonal anti-IL-4RA (las regiones variables de las cadenas ligera y pesada se muestran en SEQ ID NO: 14 y 15), y con MucilAir™ cultivado durante 14 dlas sin IL-13 como control negativo.

- realizar una tincion con azul de Alcian, por ejemplo, tincion con azul Alcian dd en la superficie apical para una ^tincion in situ y ^{tomar imagenes de celulas tenidas bajo un microscopio de contraste de fase para el analisis de} imagenes,

- cuantificar el porcentaje de celulas positivas de azul de Alcian por medio del programa de procesamiento de imagenes Java de dominio publico ImageJ y expresar su numero como relacion de area del area azul de Alcian/area de imagen total,

- opcionalmente, medir la eotaxina-3 (una quimiocina inducida por IL-13) en el medio basal en el dla 14 usando un kit de eotaxina-3 ultrasensible disponible comercialmente, por ejemplo, Meso Scale Discovery.

Dicho anticuerpo anti-IL-4RA tiene las regiones variables de cadena ligera y pesada de SEQ ID NO: 14 y 15, respectivamente, y fue desarrollado por Amgen (anteriormente Immunex) y se denomina AMG 317. Es un anticuerpo monoclonal completamente humano que estaba bajo investigacion por su capacidad para bloquear las acciones de la interleucina-4 y la interleucina-13 que desempenan un papel en el asma (en 2008, se completo un estudio de rango de dosis de fase 2 en asma moderada a grave). Un analisis intermedio mostro evidencia de actividad biologica; sin embargo, la eficacia cllnica general no cumplio con las expectativas. Por lo tanto, la mutelna de lipocalina de SEQ ID NO: 6 es capaz de inhibir la metaplasia de celulas caliciformes inducida por IL-13 tan bien como el anticuerpo monoclonal anti-IL-4RA descrito en el presente documento, cuando la comparacion de la mutelna de lipocalina con dicho anticuerpo anti-IL-4RA se realizo como se describe anteriormente. Por lo tanto, se prefiere en algunas realizaciones adicionales que una mutelna de lipocalina de la divulgacion tenga en las pruebas descritas anteriormente las mismas propiedades que la mutelna de lipocalina de SEQ ID NO: 6 con respecto a la inhibicion de la metaplasia de las celulas caliciformes.

El complejo IL-4/IL-4Ra puede dimerizarse con la cadena gamma comun (yc, CD132) o la subunidad IL-13Ralpha1 (IL-13Ra1), a traves de dominios en IL-4, para crear dos complejos de senalizacion diferentes, comunmente denominados receptores Tipo I y Tipo II, respectivamente. De manera alternativa, IL-13 puede unirse a IL-13Ra1 para formar un complejo IL-13/IL-13Ra1 que recluta a la subunidad IL-4Ra para formar un complejo receptor de Tipo Ii. Por lo tanto, IL-4Ra media las actividades biologicas de IL-4 e IL-13 (revisado por Gessner y col., Immunobiology, 201:285, 2000). Las mutelnas de lipocalina de la presente divulgacion interfieren ventajosamente con y/o bloquean la senalizacion a traves de los receptores de Tipo I y/o Tipo II, ya que estas mutelnas de lipocalina son capaces de unirse a la cadena alfa del receptor de IL-4.

^{Los estudios} in vitro ^{han demostrado que IL-4 e IL-13 activan las funciones efectoras en varios tipos de celulas, por} ejemplo, en celulas T, celulas B, eosinofilos, mastocitos, basofilos, celulas del musculo liso de las vlas respiratorias, celulas epiteliales respiratorias, fibroblastos de pulmon y celulas endoteliales (revisado por Steinke y col, Resp Res, 2:66, 2001, y por Willis-Karp, Immunol Rev, 202: 175, 2004). IL-4Ra se expresa en numeros bajos (100-5000 moleculas/celula) en varios tipos de celulas (Lowenthal y col., J Immunol, 140:456, 1988), por ejemplo, celulas T de sangre periferica, monocitos, celulas epiteliales de las vlas respiratorias, celulas B y fibroblastos de pulmon. El receptor tipo I predomina en las celulas hematopoyeticas, mientras que el receptor tipo II se expresa tanto en celulas hematopoyeticas como en celulas no hematopoyeticas.

Los receptores de la superficie celular y los complejos de receptores se unen a IL-4 y/o IL-13 con diferentes afinidades. Los componentes principales de los receptores y complejos de receptores que se unen a IL-4 y/o IL-13 son IL-4Ra, IL-13Ra1 e IL-13Ra2. Estas cadenas se expresan en la superficie de las celulas como monomeros o heterodlmeros de IL-4Ra/IL-13Ra1 o IL-4Ra/IL-13Ra2. El monomero de IL-4ra se une a IL-4, pero no a IL-13. Los monomeros de IL-13Ra1 e IL-13Ra2 se unen a IL-13, pero no se unen a IL-4. Los heterodlmeros de IL-4Ra/IL-13RaI e IL-4Ra/IL-13Ra2 se unen tanto a IL-4 como a IL-13. Dado el hecho de que el receptor alfa 2 de IL-13 (IL-13Ralpha2) se une a IL-13 con alta afinidad, pero es un receptor sin senalizacion que se considera un receptor senuelo para IL-13, se preve que las mutelnas de lipocalina de la presente divulgacion no se unen preferiblemente al receptor alfa 2 de IL-13.

Tal como se explico, tanto IL-4 como IL-13 envlan senales a traves de IL-4Ra, un componente de los receptores de tipo I (IL-4Ra y ^yc) y tipo II (IL-4Ra e IL-13Ra1). IL-4 emite senales a traves de las vlas de los receptores de tipo I y II, mientras que la IL-13 solo emite senales a traves del IL-4R tipo II. IL-13 tambien se une a la cadena IL-13Ra2, que no contiene un dominio de senalizacion transmembrana y se cree que actua como un receptor senuelo. ^yc activa la janus quinasa (JAK)3, mientras que IL-13Ra1 activa la 2 tirosina quinasa (TYK2) y JAK2. Las JAK activadas luego fosforilan STAT-6. El STAT-6 fosforilado se dimeriza, migra al nucleo y se une a los promotores de los genes que responden a IL-4 e IL-13, como aquellos asociados a la diferenciacion de celulas T-helper tipo 2 (Th2), la inflamacion de las vlas respiratorias, la hiperreactividad de las vlas respiratorias (AHR) y la produccion de moco.

Las respuestas inmunitarias de tipo Th2 promueven la produccion de anticuerpos y la inmunidad humoral, y se elaboran para combatir los patogenos extracelulares. Las celulas Th2 son mediadores de la produccion de Ig (inmunidad humoral) y producen IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10 e IL-13 (Tanaka y col., Cytokine Regulation of Humoral Immunity, 251-272, Snapper, ed., John Wiley and Sons, Nueva York (1996)). Las respuestas inmunitarias de tipo Th2 se caracterizan por la generacion de ciertas citoquinas (por ejemplo, IL-4, IL-13) y tipos especlficos de anticuerpos (IgE, IgG4) y son tlpicas de reacciones alergicas, que pueden provocar ojos llorosos y slntomas asmaticos, tales como la inflamacion de las vlas respiratorias y la contraccion de las celulas musculares de las vlas respiratorias en los pulmones.

Ademas, el trastorno que se trata, mejora o previene preferiblemente por los procedimientos de la presente divulgacion mediante la aplicacion de las lipocalinas tal como se describe en el presente documento, puede estar asociado a una reaccion alergica o inflamacion alergica.

En algunas realizaciones preferidas, el trastorno puede ser asma alergica, rinitis, conjuntivitis o dermatitis.

El asma es una enfermedad inflamatoria compleja y persistente caracterizada por la hipersensibilidad de las vlas respiratorias en asociacion con la inflamacion de las vlas respiratorias. Los estudios sugieren que el uso regular de corticosteroides inhalados en dosis altas y broncodilatadores de accion prolongada u omalizumab (un anticuerpo monoclonal humanizado que se une a la inmunoglobulina E y se usa a menudo como terapia de proximo paso) puede no ser suficiente para proporcionar un control del asma en todos los pacientes, lo que pone de manifiesto una importante necesidad no satisfecha. La interleucina-4, la interleucina-13 y el transductor de senales y el activador del factor de transcripcion 6 son componentes clave en el desarrollo de la inflamacion de las vlas respiratorias, la produccion de moco y la hipersensibilidad de las vlas respiratorias en el asma. Los compuestos biologicos dirigidos a estas moleculas pueden proporcionar una nueva modalidad terapeutica para pacientes con asma no controlada de moderada a grave. La presente divulgacion proporciona estos compuestos biologicos por medio de las mutelnas de lipocalina, tal como se describe en el presente documento.

En algunas realizaciones preferidas, el asma alergica es una inflamacion de las vlas respiratorias en la que la via IL4/IL13 contribuye a la patogenesis de la enfermedad.

Ademas, el trastorno que se trata, mejora o previene preferiblemente por los procedimientos de la presente divulgacion mediante la aplicacion de las lipocalinas tal como se describe en el presente documento, tambien puede ser trastornos pulmonares, por ejemplo, trastornos pulmonares en los que la via IL4/IL13 contribuye a la patogenia de la enfermedad. Dichos trastornos pulmonares incluyen, pero no se limitan a, fibrosis pulmonar, incluyendo la enfermedad pulmonar fibrotica cronica, otras afecciones caracterizadas por la proliferacion de fibroblastos inducida por IL-4 o la acumulacion de colageno en los pulmones, afecciones pulmonares en las que desempena un papel la respuesta inmune Th2, afecciones caracterizadas por la disminucion de la funcion de barrera en el pulmon (por ejemplo, como resultado del dano inducido por la IL-4 al epitelio), o las afecciones en las que la IL-4 desempena un papel en la respuesta inflamatoria.

De manera similar, la fibrosis qulstica (FQ) se caracteriza por la sobreproduccion de moco y el desarrollo de infecciones cronicas. La inhibicion de IL-4RA y la respuesta Th2 reduciran la produccion de moco y ayudaran a controlar infecciones tales como la aspergilosis broncopulmonar alergica (ABPA). La micosis broncopulmonar alergica se presenta principalmente en pacientes con fibrosis qulstica o asma, donde la respuesta inmune Th2 es dominante. La inhibicion de IL-4RA y la respuesta Th2 ayudaran a eliminar y controlar estas infecciones.

De manera similar, la enfermedad pulmonar obstructiva cronica (EPOC) se asocia a hipersecrecion de moco y fibrosis. La inhibicion de IL-4RA y la respuesta Th2 reduciran la produccion de moco y el desarrollo de fibrosis, mejorando as! la funcion respiratoria y retrasando la progresion de la enfermedad. La neumopatla y la fibrosis inducidas por bleomicina y la fibrosis pulmonar inducida por radiacion son trastornos caracterizados por fibrosis pulmonar que se manifiesta por la afluencia de celulas Th2, CD4.sup.+ y macrofagos, que producen IL-4 e IL-13 que, a su vez, median el desarrollo de la fibrosis. La inhibicion de IL-4RA y la respuesta Th2 reduciran o impediran el desarrollo de estos trastornos.

Ademas, IL-4 e IL-13 inducen la diferenciacion de las celulas epiteliales de pulmon en celulas caliciformes productoras de moco. Por lo tanto, IL-4 e IL-13 pueden contribuir a una mayor produccion de moco en subpoblaciones o en algunas situaciones. La produccion y secrecion de moco contribuye a la patogenesis de la enfermedad en la enfermedad pulmonar obstructiva cronica (EPOC) y la fibrosis qulstica (FQ). Por lo tanto, el trastorno, asociado a una produccion de moco o una secrecion de moco (por ejemplo, sobreproduccion o hipersecrecion), puede tratarse, mejorarse o prevenirse preferiblemente por los procedimientos de la presente divulgacion aplicando una mutelna de lipocalina tal como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones preferidas, el trastorno, asociado a una produccion de moco o una secrecion de moco, es preferiblemente una enfermedad pulmonar obstructiva cronica (EPOC) o una fibrosis qulstica (FQ). En otras realizaciones preferidas, la composicion de la divulgacion comprende ademas un medicamento mucolltico.

La proteinosis alveolar pulmonar se caracteriza por la interrupcion del aclaramiento de surfactante. IL-4 aumenta el producto surfactante. En algunas realizaciones adicionales, el uso de un antagonista de IL-4RA tal como una mutelna de lipocalina de la divulgacion para disminuir la produccion de surfactante y disminuir la necesidad de lavado de pulmon completo, tambien se contempla en el presente documento.

El slndrome de dificultad respiratoria del adulto (SDRA) puede atribuirse a una serie de factores, uno de los cuales es la exposicion a sustancias qulmicas toxicas. Por lo tanto, como ejemplo preferido, pero no limitativo, una poblacion de pacientes susceptibles al SDRA son los pacientes crlticamente enfermos que usan ventiladores, ya que el SDRA es una complicacion frecuente en tales pacientes. En algunas realizaciones adicionales, un antagonista de IL-4RA, tal como una mutelna de lipocalina de la divulgacion, se puede usar para aliviar, prevenir o tratar el SDRA reduciendo la inflamacion y las moleculas de adhesion.

La sarcoidosis se caracteriza por lesiones granulomatosas. En algunas realizaciones adicionales, el uso de un antagonista de IL-4RA tal como una mutelna de lipocalina de la divulgacion para tratar la sarcoidosis, particularmente la sarcoidosis pulmonar, tambien se contempla en el presente documento.

Las afecciones en las que la ruptura de la barrera inducida por IL-4 desempena un papel (por ejemplo, afecciones caracterizadas por una disminucion de la funcion de la barrera epitelial en el pulmon) pueden tratarse con antagonistas de IL-4RA. El dano a la barrera epitelial en los pulmones puede ser inducido por IL-4 y/o IL-13 directa o indirectamente. El epitelio en el pulmon funciona como una barrera selectiva que impide que los contenidos del lumen pulmonar entren en la submucosa. Una barrera danada o "permeable" permite que los antlgenos crucen la barrera, lo que a su vez provoca una respuesta inmune que puede causar un dano adicional al tejido pulmonar. Dicha respuesta inmune puede incluir el reclutamiento de eosinofilos o mastocitos, por ejemplo. Se puede administrar un antagonista de IL-4RA para inhibir dicha estimulacion indeseable de una respuesta inmune.

En este sentido, se puede emplear un antagonista de IL-4RA tal como una mutelna de lipocalina de la divulgacion para promover la curacion del epitelio pulmonar, por ejemplo, en asmaticos, restaurando as! la funcion de barrera, o alternativamente, administrada con fines profilacticos, para prevenir el dano inducido por IL-4 y/o IL-13 al epitelio pulmonar.

Debe observarse que los procedimientos para tratar una enfermedad o trastorno de acuerdo con la presente divulgacion no estan limitados por un mecanismo de accion particular. Por ejemplo, en algunas realizaciones adicionales, la mutelna de lipocalina de la divulgacion se puede utilizar como agentes de terapia genica en procedimientos descritos.

Tal como se usa en el presente documento, "tratamiento" se refiere a la intervencion cllnica en un intento de alterar el curso natural del sujeto o de la celula que se esta tratando, y puede realizarse antes o durante el curso de la patologla cllnica. Los efectos deseables del tratamiento incluyen la prevencion de la aparicion o de la recurrencia de una enfermedad o una afeccion o de un slntoma de la misma, el alivio de una afeccion o de un slntoma de la enfermedad, la disminucion de cualquier consecuencia patologica directa o indirecta de la enfermedad, la disminucion de la tasa de progresion de la enfermedad, la mejora o el paliativo del estado de la enfermedad y el logro de la remision o de un mejor pronostico. En algunas realizaciones, los procedimientos y las composiciones de la divulgacion son utiles en intentos de retrasar el desarrollo de una enfermedad o trastorno. El tratamiento es aplicable tanto a la terapia humana como a las aplicaciones veterinarias.

El termino “prevencion” indica que los trastornos (o los slntomas asociados a ellos) descritos en el presente documento pueden evitarse antes de que ocurran y/o que los trastornos no se repitan.

El termino “mejora” indica que los trastornos (o slntomas asociados a los mismos) descritos en el presente documento se alivian, disminuyen, aminoran y/o palian.

El termino "administrado" o "administrar" en todas sus formas gramaticales significa la administracion de una dosis terapeuticamente eficaz de la mutelna de lipocalina como unico agente terapeutico o en combinacion con otro agente terapeutico, tal como se describe en el presente documento, a un sujeto. Por lo tanto, se preve que una mutelna de lipocalina de la presente divulgacion este preferiblemente en forma de una composition, preferiblemente una composicion farmaceutica, que se pueda emplear preferiblemente en enfoques de terapia conjunta, es decir, en administracion conjunta con otros medicamentos o farmacos, por ejemplo, otros medicamentos para el tratamiento de un trastorno tal como se describe en el presente documento y/o cualquier otro agente terapeutico que podrla ser beneficioso en el contexto de los procedimientos de la presente divulgacion. Por lo tanto, se prefiere que una composicion que comprenda las mutelnas de lipocalina descritas en el presente documento comprenda ademas un medicamento antialergico y/o un medicamento antialergico antiinflamatorio.

La expresion "cantidad eficaz", tal como se usa en el presente documento, se refiere a una cantidad eficaz, en dosis y por perlodos de tiempo necesarios de una mutelna de lipocalina tal como se describe en el presente documento, para lograr el resultado terapeutico o profilactico deseado. La dosis exacta dependera del proposito del tratamiento, y un experto en la materia la podra determinar utilizando tecnicas conocidas.

Por "cantidad terapeuticamente eficaz" se entiende una dosis que produce los efectos para los que se administra. Una "cantidad terapeuticamente eficaz" de una mutelna de lipocalina tal como se describe en el presente documento puede variar de acuerdo con factores tales como la edad, el peso corporal, la salud general, el sexo, la dieta, el momento de la administracion, la interaction con otros farmacos y la gravedad de la afeccion, y se podra determinar con la experimentation de rutina por parte de los expertos en la materia. A veces, el termino "cantidad terapeuticamente eficaz" puede usarse indistintamente en el presente documento con el termino "cantidad farmaceuticamente eficaz":

Una cantidad terapeuticamente eficaz, cuando se usa en la presente solicitud, es tambien aquella en la que cualquier efecto toxico o perjudicial de la mutelna de lipocalina es superado por los efectos terapeuticamente beneficiosos. Una "cantidad profilacticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, en dosis y durante los perlodos de tiempo necesarios de una mutelna de lipocalina tal como se describe en el presente documento, para lograr el resultado profilactico deseado. Generalmente, pero no necesariamente, dado que se usa una dosis profilactica en sujetos antes de la enfermedad o en una etapa mas temprana de la misma, la cantidad profilacticamente eficaz sera menor que la cantidad terapeuticamente eficaz. La mutelna de lipocalina descrita en el presente documento que tiene la actividad terapeutica deseada puede administrarse en un vehlcuio fisiologicamente aceptable a un paciente, tal como se describe en el presente documento.

En algunas realizaciones, un "sujeto", cuando se usa en la presente solicitud, es un vertebrado. En ciertas realizaciones particulares, el vertebrado es un mamlfero. Los mamlferos incluyen, pero no se limitan a, primates (incluyendo primates humanos y no humanos) y roedores (por ejemplo, ratones y ratas). En ciertas realizaciones particulares, un sujeto mamlfero es un ser humano. En algunas realizaciones adicionales, un sujeto humano, sinonimo de un individuo, es un sujeto particularmente preferido. En algunas realizaciones adicionales, un sujeto humano que lo necesite, cuando se usa en la presente solicitud, es un paciente.

Una protelna de la divulgacion puede ser una mutelna de una lipocalina, preferiblemente una lipocalina seleccionada del grupo que consiste en protelna de union a retinol (RBP), protelna de union a bilina (BBP), apolipoprotelna D (APO D), lipocalina asociada a gelatinasa de neutrofilos (NGAL), lipocalina lacrimal (TLPC), protelna relacionada con la microglobulina a2 (A2m), 24p3/uterocalina (24p3), protelna 1 de la glandula de von Ebners (VEGP 1), protelna 2 de la glandula de von Ebners (VEGP 2) y precursor del alergeno mayoritario Can f1 (ALL-1), siendo NGAL humana la lipocalina preferida y la lipocalina lacrimal humana la lipocalina mas preferida. Tal como se usa en el presente documento, una "lipocalina" se define como una protelna monomerica de aproximadamente 18-20 kDA de peso, que tiene una region estructural supersecundaria de lamina plegada en forma cillndrica que comprende una pluralidad de (preferiblemente ocho) cadenas p conectadas por pares por una pluralidad de (preferiblemente cuatro) bucles en un extremo para definir as! un bolsillo de union. Es la diversidad de los bucles en el andamio rlgido de lipocalina lo que da lugar a varios modos de union diferentes entre los miembros de la familia de las lipocalinas, cada uno capaz de acomodar objetivos de diferente tamano, forma y caracter qulmico (revisado, por ejemplo, en Skerra, A. (2000) Biochim. Biophys. Acta 1482, 337-350). De hecho, la familia de protelnas de la lipocalina ha evolucionado naturalmente para unirse a un amplio espectro de ligandos, compartiendo niveles inusualmente bajos de conservacion de la secuencia global (a menudo con identidades de secuencia de menos del 20 %) pero conservando un patron de plegado general altamente conservado. La correspondencia entre las posiciones en diversas lipocalinas es bien conocida por los expertos la materia. Vease, por ejemplo, la patente de EE.UU. n.° 7.250.297.

En general, cuando se hace referencia en el presente documento de la divulgacion a una mutelna de lipocalina de la divulgacion, preferiblemente, es diferente de su contraparte de lipocalina natural en el sentido de que se diferencia en al menos un aminoacido de su contraparte de lipocalina natural. La diferencia podrla ser una sustitucion, eliminacion y/o adicion de aminoacidos, siendo preferida una sustitucion. Una "mutelna de una lipocalina" o "mutelna de lipocalina" puede ser, en particular, una "mutelna de lipocalina lacrimal humana" o "mutelna Tlc".

Una protelna de la divulgacion es una mutelna de lipocalina lacrimal humana (Tlc). El termino "lipocalina lacrimal humana", tal como se usa en el presente documento, se refiere a la lipocalina lacrimal humana madura con el numero de acceso al banco de datos SWISS-PROT P31025. La lipocalina lacrimal humana madura (aminoacidos 19-176 de la secuencia acida del numero de acceso P31025 de SWISS-PROT) (SEQ ID NO: 1) no incluye el peptido de senal N-terminal (aminoacidos 1-18) que se incluye en la secuencia de numero de acceso de SWISS-PROT de la secuencia acida P31025 utilizada como "referencia" o "secuencia de referencia" en diversas realizaciones descritas en el presente documento.

La prealbumina lacrimal humana, ahora llamada lipocalina lacrimal (TLPC o Tlc), se describio originalmente como una protelna principal del fluido lacrimal humano (aproximadamente un tercio del contenido total de protelna), pero recientemente tambien se ha identificado en varios otros tejidos secretores, incluyendo la prostata, la mucosa nasal y la mucosa traqueal. Se han encontrado protelnas homologas en ratas, cerdos, perros y caballos. La lipocalina lacrimal es un miembro inusual de la lipocalina debido a su alta promiscuidad para los llpidos insolubles relativos y a sus caracterlsticas de union que difieren de otros miembros de esta familia de protelnas (revisado en Redl, B. (2000) Biochim. Biophys. Acta 1482, 241-248). Un numero notable de compuestos lipofilos de diferentes clases qulmicas, tales como acidos grasos, alcoholes grasos, fosfollpidos, glicollpidos y colesterol, son ligandos endogenos de esta protelna. Curiosamente, a diferencia de otras lipocalinas, la fuerza de la union del ligando (objetivo) se correlaciona con la longitud de la cola del hidrocarburo tanto para las amidas de alquilo como para los acidos grasos. Por lo tanto, la lipocalina lacrimal se une mas fuertemente a los llpidos menos solubles (Glasgow, BJ. y col. (1995) Curr. Eye Res.

14, 363-372; Gasymov, O.K. y col. (1999) Biochim. Biophys. Acta 1433, 307-320)

Las mutelnas de lipocalina particularmente adecuadas para un uso terapeutico tal como se describe en el presente documento incluyen las lipocalinas establecidas en SEQ ID NO: 2-11. Estas moleculas exhiben una especificidad y ^{una alta afinidad por IL4Ra humano, pero antes de la presente descripcion no se han caracterizado con datos} in vivo terapeuticamente relevantes. Otras mutelnas de lipocalina que tambien son adecuadas para un uso terapeutico tal como se describe en el presente documento incluyen las lipocalinas establecidas en SEQ ID NO: 2-8 del documento WO 2008/015239. Otras mutelnas de lipocalina que tambien pueden ser adecuadas para un uso terapeutico tal como se describe en el presente documento incluyen las lipocalinas establecidas en SEQ ID NO: 2-11 del documento WO 2011/154420.

Tal como se usa en el presente documento, una "mutelna", una entidad "mutada" (ya sea protelna o acido nucleico) o "mutante" se refiere al intercambio (sustitucion), eliminacion o insercion de uno o mas nucleotidos o aminoacidos, respectivamente, en comparacion con el andamio de tipo natural (tipo salvaje) de acido nucleico o protelna "referenda". Se prefiere una sustitucion de un aminoacido del acido nucleico o protelna de origen natural (tipo salvaje). Los terminos "referenda", "secuencia de referenda" y "secuencia de tipo salvaje" se usan indistintamente en el presente documento.

La presente divulgacion tambien contempla variantes optimizadas de las mutelnas de lipocalina descritas especlficamente en el presente documento. Una vez que se ha seleccionado una mutelna de lipocalina con afinidad por un objetivo dado, es posible someter la mutelna a mutagenesis adicional para luego seleccionar variantes de afinidad aun mayor o variantes con propiedades mejoradas, tales como mayor termoestabilidad, mejor estabilidad del suero, mejor estabilidad termodinamica, solubilidad mejorada, comportamiento monomerico mejorado, resistencia mejorada contra la desnaturalizacion termica, desnaturalizacion qulmica, proteolisis o detergentes, etc. Esta mutagenesis adicional, que en caso de apuntar a una afinidad mas alta puede considerarse como "maduracion ^{de afinidad"} in vitro, ^{puede lograrse mediante una mutacion especlfica del sitio basada en un diseno racional o una} mutacion aleatoria. Otro posible enfoque para obtener una afinidad mas alta o propiedades mejoradas es el uso de PCR propensa a errores, que da lugar a mutaciones puntuales en un rango seleccionado de posiciones de secuencia de la mutelna de lipocalina. La PCR propensa a errores puede llevarse a cabo de acuerdo con cualquier protocolo conocido como el descrito por Zaccolo y col. (1996) J. Mol. Biol. 255, 589-603. Otros procedimientos de mutagenesis aleatoria adecuados para tales fines incluyen la mutagenesis de insercion/eliminacion aleatoria (RID), tal como se describe por Murakami, H y col. (2002) Nat. Biotecnol. 20, 76-81 o recombinacion aleatoria no homologa (NRR) segun lo descrito por Bittker, J. A y col. (2002) Nat. Biotecnol. 20,1024-1029. Si se desea, la maduracion de afinidad tambien puede llevarse a cabo de acuerdo con el procedimiento descrito en el documento WO 00/75308 o en Schlehuber, S. y col., (2000) J. Mol. Biol. 297, 1105-1120, en los que se obtuvieron mutelnas de la protelna de union a la bilina con alta afinidad a la digoxigenina.

Se puede usar una mutelna de lipocalina lacrimal para la formacion de complejos con el receptor alfa de IL 4. La mutelna tambien puede unirse a un fragmento inmunogenico del receptor alfa de IL 4. Un fragmento inmunogenico del receptor alfa de IL-4 es un fragmento que tiene uno o mas epltopos, mimotopos u otros determinantes antigenicos, y por lo tanto es capaz de inducir una respuesta inmune o contra la cual se puede producir un anticuerpo. El fragmento inmunogenico puede incluir un solo epltopo o puede tener una pluralidad de epltopos. Dado que un sistema de presentacion de antlgeno, por ejemplo, una protelna portadora, se puede usar para proporcionar el tamano requerido para el reconocimiento por parte de un sistema inmune, no se aplica ninguna limitacion de tamano particular al fragmento inmunogenico. Por lo tanto, el fragmento inmunogenico tambien puede ser un ^{"hapteno", es decir, un fragmento que no necesita ser antigenico} per se ^{o que puede tener baja inmunogenicidad, en} particular debido a su pequeno peso molecular y, por consiguiente, a su tamano. Generalmente, un fragmento inmunogenico puede, solo o cuando se presenta en un portador, estar unido por una inmunoglobulina o por un receptor de celulas T (TCR) si se presenta por moleculas MHC. Un fragmento inmunogenico es generalmente, solo o cuando se presenta en forma de sistema de presentacion de antlgeno, capaz de inducir una respuesta inmune humoral y/o una respuesta inmune celular que conduce, por ejemplo, a la activacion de linfocitos B y/o T.

Uno de los objetivos de la mutelna de lipocalina usada en la presente divulgacion es la cadena alfa del receptor de interleucina-4 (oficialmente conocida como subunidad alfa del receptor de interleucina-4, Uniprot # P24394, SEQ ID NO: 12), una protelna transmembrana, que contiene un dominio extracelular de 207 aminoacidos. Existe una forma secretada del dominio extracelular, el alfa sIL-4R, que tambien se conoce como CD124 y es capaz de bloquear las actividades de IL-4. Una mutelna de lipocalina de la divulgacion puede unirse al receptor alfa de sIL-4, as! como a cualquier parte del dominio extracelular del receptor alfa de IL-4.

La presente divulgacion tambien se refiere a moleculas de acido nucleico (ADN y ARN) que incluyen secuencias de nucleotidos que codifican mutelnas de lipocalina tal como se describe en el presente documento. Dado que la degeneracion del codigo genetico permite sustituciones de ciertos codones por otros codones que especifican el mismo aminoacido, la divulgacion no se limita a una molecula de acido nucleico especlfica que codifica una mutelna de lipocalina de la divulgacion, sino que abarca todas las moleculas de acido nucleico que incluyen secuencias de nucleotidos que codifican una mutelna funcional.

Las moleculas de acido nucleico divulgadas tambien pueden formar parte de un vector o de cualquier otro tipo de vehlculo de clonacion, tal como un plasmido, un fagemido, un fago, un baculovirus, un cosmido o un cromosoma artificial. En un ejemplo, la molecula de acido nucleico se incluye en un fasmido.

En algunas mutelnas de lipocalina lacrimal descritas, se elimina el enlace disulfuro que se produce naturalmente entre Cys 61 y Cys 153. Por consiguiente, tales mutelnas (o cualquier otra mutelna de lipocalina lacrimal que no incluya un enlace disulfuro intramolecular) se pueden producir en un compartimento celular que tenga un medio redox reductor, por ejemplo, en el citoplasma de bacterias gramnegativas. En caso de que la mutelna de lipocalina de la divulgacion incluya enlaces disulfuro intramoleculares, puede desearse dirigir el polipeptido naciente a un compartimento celular que tenga un medio redox oxidante usando una secuencia de senales apropiada. Un ^{periplasma de bacterias gramnegativas tales como} E. coli ^{puede proporcionar un ambiente oxidante de este tipo, en} el medio extracelular de las bacterias grampositivas o en el lumen del retlcuio endoplasmatico de las celulas eucariotas y generalmente favorece la formacion de enlaces disulfuro estructurales. Sin embargo, tambien es posible ^{producir una mutelna de lipocalina de la divulgacion en el citosol de una celula huesped, tal como} E. coli. ^{En este} caso, el polipeptido puede obtenerse directamente en un estado soluble y plegado o recuperarse en forma de ^{cuerpos de inclusion, seguido de renaturalizacion} in vitro. ^{Otra opcion es el uso de cepas huesped especlficas que} tengan un medio intracelular oxidante, lo que puede permitir la formacion de enlaces disulfuro en el citosol (Venturi M, y col. (2002) J. Mol. Biol. 315, 1-8).

La divulgacion tambien se refiere a una composicion, que incluye al menos una mutelna de lipocalina de la divulgacion o un fragmento o variante de la misma o una protelna de fusion o un conjugado de la misma, y a una formulacion farmaceuticamente aceptable (por ejemplo, combination de tampon/sal/excipiente), en la que dicha composicion puede administrarse a un sujeto que lo necesite a un nivel de dosificacion seleccionado del grupo que consiste en: 0,06-600 mg, 0,06-100 mg, 0,3-10 mg, 1-3 mg.

En algunas realizaciones, una composicion de la presente divulgacion se puede administrar a traves de cualquier via parenteral o no parenteral (enteral) que sea terapeuticamente eficaz para farmacos proteicos. Los procedimientos de aplicacion parenteral incluyen, por ejemplo, tecnicas de inyeccion e infusion intracutanea, subcutanea, intramuscular, intratraqueal, intranasal, intravltrea o intravenosa, por ejemplo, en forma de soluciones de inyeccion, soluciones de infusion o tinturas, as! como la instalacion e inhalation de aerosoles, por ejemplo, en forma de mezclas de aerosoles, pulverizadores, neblinas o polvos.

En algunas realizaciones, se prefiere la administration local de la composicion al pulmon. Una via preferida de administration local al pulmon es mediante inhalacion de aerosol. Patton, J.S., y col. (2004) Proc. Amer. Thoracic Soc., 1, 338-344, proporciona, por ejemplo, una description general sobre la administracion pulmonar de farmacos, es decir, mediante la inhalacion de aerosoles (que tambien se puede usar en la administracion intranasal) o la instilacion intratraqueal. Los modos de administracion no parenteral son, por ejemplo, orales, por ejemplo, en forma de plldoras, comprimidos, capsulas, soluciones o suspensiones, o por via rectal, por ejemplo, en forma de supositorios. En algunas realizaciones, una mutelna de lipocalina de la divulgacion tambien puede administrarse por via sistemica o topica en formulaciones que contienen excipientes o vehlculos, aditivos y vehlculos farmaceuticamente aceptables no toxicos convencionales, segun se desee. Para la administracion de una mutelna de lipocalina de la divulgacion por inhalacion, la mutelna puede estar presente en una formulacion en polvo junto con una fase adicional. El polvo micronizado de la mutelna de lipocalina se puede mezclar con un material portador, por ejemplo, lactosa, dextrosa, maltosa, trehalosa, tal como se describe en la especificacion de patente n.° WO96/02231, o el artlculo de P. Lucas, K. Anderson, JN Staniforth, Protein deposition from dry powder inhalers, Pharmaceutical Research, vol. 15 de abril de 1988, paginas 562-569. Alternativamente, para fines de inhalacion, se pueden usar preparaciones farmaceuticas solidas tal como se describe en las solicitudes de patente de EE.UU. n.° 2005/0014677 y n.° 2009/0142407.

Por lo tanto, una composicion de la divulgacion puede comprender una mutelna de lipocalina de la divulgacion, as! como una de las formulaciones descritas.

La dosis de la composicion aplicada puede variar dentro de amplios llmites para lograr el efecto preventivo o la respuesta terapeutica deseada. Dependera, por ejemplo, de la afinidad de la mutelna de lipocalina en su interior por ^{un ligando elegido, as! como de la vida media del complejo entre la mutelna de lipocalina y el ligando} in vivo. Ademas, la dosis optima dependera de la biodistribucion de la mutelna de lipocalina o un fragmento o variante de la misma o su protelna de fusion o su conjugado, el modo de administracion, la gravedad de la enfermedad/trastorno que se este tratando, as! como de la condition medica del paciente.

La presente divulgacion tambien proporciona un procedimiento para tratar a un sujeto que lo necesite, que comprende administrar a dicho sujeto una composicion farmaceutica mediante nebulizacion, en el que la composicion farmaceutica comprende al menos un antagonista de IL-4RA, o un fragmento o variante del mismo. una protelna de fusion o conjugado de la misma y una solution adecuada.

En diversas divulgaciones preferidas, una formulacion farmaceuticamente aceptable de la divulgacion puede ser una formulacion para nebulizacion, por ejemplo, una solucion que pueda mantener la integridad funcional y estructural del antagonista, o un fragmento o variante del mismo o una protelna de fusion o conjugado de la misma, en el momento de la nebulizacion y despues de la misma (por ejemplo, que se mantenga monomerica y completamente activa de manera funcional) y/o que, en combinacion con el nebulizador empleado, pueda generar gotas del rango de tamano deseado. A este respecto, como ejemplo ilustrativo, la presente divulgacion ensena: el antagonista, por ejemplo, una mutelna de lipocalina de la divulgacion, puede formularse como una solucion que comprende, por ejemplo, 0,01 mg a 100 mg del antagonista o un fragmento o variante del mismo o de una protelna de fusion o un conjugado del mismo por 1 ml de solucion salina con un pH ajustado entre 5,5 y 8,0, un valor de osmolalidad entre aproximadamente 150 y 550 mOsm/kg, una concentration de iones entre aproximadamente 31 y 300 mM de cloruro como anion permeante, y/o una viscosidad inferior a 1,5 cp. Preferiblemente, la solucion formulada tiene una concentracion del antagonista o un fragmento o variante del mismo o una protelna de fusion o un conjugado del mismo a un nivel seleccionado del grupo que consiste en: 0,05 mg/ml a 50 mg/ml, 0,1 mg/ml a 50 mg/ml, 0,05 mg/ml a 25 mg/ml, 0,1 mg/ml a 25 mg/ml, 0,05 mg/ml a 15 mg/ml, 0,1 mg/ml a 15 mg/ml, 0,05 mg/ml a 10 mg/ml y 0,1 mg/ml a 10 mg/ml. En una descripcion preferida adicional, la solucion salina descrita tiene un pH ajustado seleccionado del grupo que consiste de entre 5,5 y 8,0, entre 6,0 y 8,0, entre 6,0 y 7,5, entre 5,5 y 7,5, entre 6,0 y 7,0 y entre 6,5 y 7,5; y/o un valor de osmolalidad seleccionado del grupo que consiste en: entre aproximadamente 150 y 550 mOsm/L, entre aproximadamente 150 y 500 mOsm/L, entre aproximadamente 200 y 550 mOsm/L, entre aproximadamente 200 y 500 mOsm/L, entre aproximadamente 200 y 450 mOsm L y entre aproximadamente 150 y 450 mOsm/L, la osmolaridad es la medida de la concentracion de soluto, definida como el numero de osmoles (Osm) de soluto por litro (L) de solucion, por ejemplo osmol/L u Osm/L; y/o una concentracion ionica de cloruro como anion permeante del grupo que consiste de entre 31 y 300 mM, entre 50 y 200 mM, entre 50 y 300 mM, entre 50 y 150 mM, 100 y 200 mM, entre 100 y 300 mM, entre 100 y 250 mM, entre 150 y 250 mM, entre 150 y 300 mM y entre 200 y 300 mM.

Ademas, preferiblemente, la solucion salina descrita tiene una viscosidad seleccionada del grupo que consiste de entre 0 y 1,5 cp, entre 0 y 1,0 cp, 0 y 0,5 cp, entre 0,5 y 1,0 cp, entre 0,5 y 1,5 cp y entre 1,0 y 1,5 cp.

En algunas divulgaciones adicionales, la solucion acuosa del antagonista, por ejemplo, una mutelna de lipocalina de la divulgacion, puede ser nebulizada con un nebulizador electronico, de chorro, ultrasonico o de membrana perforada vibrante, por ejemplo, el nebulizador de malla vibrante PARI eFlow o Aeroneb. En una divulgacion preferida, la solucion se nebuliza en un aerosol que tiene un diametro aerodinamico medio de masa (MMAD) entre 1 pm y 10 pm, para un nebulizador electronico, de chorro, ultrasonico o de membrana perforada vibrante, 2 veces al dla, y dicho nebulizador es capaz de aerosolizar la solucion resultante en partlculas de tamanos requeridos (los aerosoles) en un perlodo de tiempo de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 minutos. En algunas divulgaciones adicionales, cualquiera de dichos aerosoles puede tener un diametro aerodinamico medio de masa (MMAD) seleccionado del grupo que consiste en entre 1 pm a 10 pm, entre 2 pm a 8 pm, entre 2 pm y 5 pm, entre 1,5 pm a 4 pm, entre 3 pm a 4,5 pm y entre 2,5 pm a 3,5 pm.

En algunas revelaciones, la divulgacion proporciona un procedimiento de administracion por inhalacion, en 1-3 minutos, preferiblemente 1-2 minutos, de una cantidad eficaz de una composicion farmaceutica de la divulgacion, que comprende una formulacion de nebulizacion descrita, a un sujeto que la necesita. En algunas descripciones adicionales, dicho suministro por inhalacion se realiza de manera local en el pulmon.

Por lo tanto, en algunas otras revelaciones, la divulgacion proporciona una solucion eficaz, segura, no irritante, fisiologicamente aceptable y compatible adecuada para su uso en un procedimiento de la divulgacion que comprende administrar una composicion farmaceutica descrita a un sujeto que lo necesite.

La divulgacion proporciona el uso de la solucion para administrar una composicion farmaceutica de la divulgacion a un sujeto que lo necesite como un aerosol, por ejemplo, por inhalacion.

Cuando se usa en el presente documento, la expresion “antagonista de IL-4RA" significa un polipeptido o protelna que se une a IL-4RA con afinidad de union detectable y/o que es capaz de inhibir la union de IL-4 y/o IL-13 a sus receptores respectivos. Tal como se usa en el presente documento, "afinidad detectable" significa la capacidad de unirse a un objetivo seleccionado con una constante de afinidad generalmente de al menos aproximadamente 10"5 M. Las afinidades mas bajas generalmente ya no se pueden medir por procedimientos comunes como ELISA y, por lo tanto, son de importancia secundaria. Por ejemplo, las afinidades de union de las mutelnas de acuerdo con la divulgacion pueden ser de un K^d inferior 800 nM, pueden ser de un K^d inferior a 30 nM y pueden ser de aproximadamente 50 picomolar (pM) o inferiores.

En algunas realizaciones, se puede usar una mutelna de lipocalina tal como se define en las reivindicaciones para tratar cualquier enfermedad o trastorno en el que la expresion de IL-4 y/o la expresion de IL-13 contribuyan o esten relacionadas con la patogenesis o la agravacion de la enfermedad. En algunas realizaciones, una mutelna de lipocalina tal como se define en las reivindicaciones puede usarse para tratar cualquier enfermedad o trastorno que se mejore, alivie o inhiba mediante la eliminacion, inhibicion o reduction de la actividad de IL-4 y/o la actividad de IL-13. Como ejemplo ilustrativo, la mutelna o composicion farmaceutica que contiene la misma puede usarse en un procedimiento de tratamiento de una enfermedad o trastorno asociado a un aumento de la respuesta inmune Th2. Dicha enfermedad o trastorno puede, por ejemplo, tambien estar asociado a una reaction alergica o una inflamacion alergica. En otras realizaciones, dicha enfermedad o trastorno puede ser asma alergica, rinitis, conjuntivitis o dermatitis (vease Hage y col. (1999) Cell, 97, 271-281, o Mueller y col. (2002) Biochemica et Biophysica Acta, 237­ 250).

El termino "fragmento", tal como se utiliza en la presente divulgacion en relation con las mutelnas de lipocalina lacrimal de la divulgacion, se refiere a protelnas o peptidos derivados de lipocalina lacrimal humana de longitud completa que se acortan en el extremo N y/o en el extremo C, es decir, que carecen de al menos uno de los aminoacidos N-terminales y/o C-terminales. Dichos fragmentos comprenden preferiblemente al menos 10, mas preferiblemente 20, mas preferiblemente 30 o mas aminoacidos consecutivos de la secuencia primaria de lipocalina lacrimal humana madura y normalmente son detectables en un inmunoensayo de lipocalina lacrimal humana madura.

El termino "variante", tal como se utiliza en la presente divulgacion, se refiere a derivados de una protelna o peptido (por ejemplo, una mutelna de lipocalina lacrimal de la divulgacion) que comprenden modificaciones de la secuencia de aminoacidos, por ejemplo, por sustitucion, eliminacion, insercion o modificacion qulmica. Preferiblemente, tales modificaciones no reducen la funcionalidad de la protelna o del peptido. Dichas variantes incluyen protelnas, en las que uno o mas aminoacidos han sido reemplazados por sus respectivos estereoisomeros D o por aminoacidos distintos a los 20 aminoacidos naturales, como, por ejemplo, ornitina, hidroxiprolina, citrulina, homoserina, hidroxilisina, norvalina. Sin embargo, tales sustituciones tambien pueden ser conservativas, es decir, un residuo de aminoacido se reemplaza con un residuo de aminoacido qulmicamente similar. Ejemplos de sustituciones conservativas son los reemplazos entre los miembros de los siguientes grupos: 1) alanina, serina y treonina; 2) acido aspartico y acido glutamico; 3) asparagina y glutamina; 4) arginina y lisina; 5) isoleucina, leucina, metionina y valina; y 6) fenilalanina, tirosina y triptofano.

El termino "posicion" cuando se usa de acuerdo con la divulgacion significa la posicion de un aminoacido dentro de una secuencia de aminoacidos representada en el presente documento o la posicion de un nucleotido dentro de una secuencia de acido nucleico representada en el presente documento. El termino "correspondiente" tal como se usa en el presente documento tambien incluye que una posicion no solo esta determinada por el numero de los nucleotidos/aminoacidos anteriores. Por consiguiente, la posicion de un aminoacido dado de acuerdo con la divulgacion que puede estar sustituida puede variar debido a la eliminacion o adicion de aminoacidos en cualquier otra parte de una lipocalina (mutante o de tipo salvaje). De manera similar, la posicion de un nucleotido dado de acuerdo con la presente divulgacion que puede estar sustituida puede variar debido a deleciones o nucleotidos adicionales en otra parte de una mutelna o region no traducida 5' (UTR) de lipocalina de tipo salvaje, incluyendo el promotor y/o cualquier otra secuencia reguladora o gen (incluyendo exones e intrones). Por lo tanto, en una "posicion correspondiente" de acuerdo con la divulgacion, debe entenderse preferiblemente en el sentido de que los nucleotidos/aminoacidos pueden diferir en el numero indicado, pero todavla pueden tener nucleotidos/aminoacidos vecinos similares. Dichos nucleotidos/aminoacidos que pueden intercambiarse, eliminarse o anadirse tambien estan comprendidos por el termino "posicion correspondiente". Especlficamente, para determinar si un residuo de aminoacido de la secuencia de aminoacidos de una lipocalina (mutelna) diferente de una lipocalina de tipo salvaje corresponde a una posicion determinada en la secuencia de aminoacidos de una lipocalina de tipo salvaje, un experto en la materia puede utilizar medios y procedimientos bien conocidos, por ejemplo, alineaciones, ya sea manualmente o usando programas informaticos como BLAST2.0, que significa Basic Local Alignment Search Tool, o ClustalW o cualquier otro programa adecuado para generar alineaciones de secuencias. Por consiguiente, una lipocalina de tipo salvaje puede servir como "secuencia de sujeto" o "secuencia de referenda", mientras que la secuencia de aminoacidos de una lipocalina diferente de la lipocalina de tipo salvaje descrita en el presente documento sirve como "secuencia de consulta". Los terminos "secuencia de referenda" y "secuencia de tipo salvaje" se usan indistintamente en el presente documento.

Tal como se usa en el presente documento, las formas singulares “un”, “uno”, “una” y “el”, “la”, incluyen referencias s plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Asl, por ejemplo, la referencia a "una mutelna de lipocalina" incluye una o mas mutelnas de lipocalina.

Salvo que se indique lo contrario, se entendera que el termino "al menos" que precede a una serie de elementos se refiere a cada elemento de la serie.

A lo largo de la presente memoria descriptiva y de las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto exija otra cosa, se entendera que la palabra "comprende" y las variaciones tales como "que comprende" y "comprendiendo" implican la inclusion de un numero entero o paso citado o grupo de numeros enteros o pasos, pero no la exclusion de ningun otro numero entero o paso o grupo de numeros enteros o pasos. Cuando se usa en el presente documento, el termino "que comprende" puede sustituirse por el termino "que contiene" o "que tiene".

Cuando se usa en el presente documento, "que consiste en" excluye cualquier elemento, paso o ingrediente no especificado en el elemento reivindicado. Cuando se usa en este documento, "que consiste esencialmente en" no excluye materiales o pasos que no afecten materialmente a las caracterlsticas basicas y novedosas de la reivindicacion.

Tal como se usa en el presente documento, el termino conjuntivo "y/o" entre multiples elementos citados se entiende que abarca tanto las opciones individuales como las combinadas. Por ejemplo, cuando dos elementos estan unidos por "y/o", una primera opcion se refiere a la aplicabilidad del primer elemento sin el segundo. Una segunda opcion se refiere a la aplicabilidad del segundo elemento sin el primero. Una tercera opcion se refiere a la aplicabilidad del primer y segundo elementos juntos. Se entiende que cualquiera de estas opciones esta dentro del significado y, por lo tanto, satisface el requisito del termino “y/o” tal como se usa en el presente documento. Tambien se entiende que la aplicabilidad concurrente de mas de una de las opciones esta comprendida en el significado y, por lo tanto, satisface el requisito del termino "y/o" tal como se usa en el presente documento.

Se citan varios documentos a lo largo del texto de la presente memoria descriptiva. Nada de lo expuesto en el presente documento debe interpretarse como una admision de que la divulgacion no tiene derecho preceder a dicha divulgacion en virtud de una divulgacion previa.

Ejemplos

Ejemplo 1: Inhibicion de la fosforilacion de Stat6 inducida por IL-4 e IL-13 en celulas TF-1 por un antagonista alfa del receptor de IL-4.

Se incubaron celulas TF-1 a 37 °C durante 30 minutos con un antagonista alfa del receptor de IL-4, una mutelna de lipocalina dirigida contra la cadena alfa del receptor de IL-4 humana (SEQ ID NO: 6), antes de anadir IL-13 10 nM (Figura 1a) o IL-4 0,1 nM (Figura 1b). Las celulas se fijaron despues de la incubacion durante 15 min a 37 °C con PFA al 1,6 % y se permeabilizaron con metanol al 100 % antes de la tincion intracelular de STAT6 con PE Mouse Anti-STAT6 (pY641) - BD 612701. El anticuerpo especlfico de IL-4RA MAB230 (sistemas R&D) y la IL-4 doble mutante de iL-4 (r 121D, Y124D) tal como se describe en Andrews y col. JI 2006 176:7456-7461 se utilizo como control positivo. Ademas, la lipocalina lacrimal humana (SEQ ID NO: 1) y un anticuerpo IgG2a de raton (mlgG2a, Ancell 281-010; Lot#171605) se usaron como controles negativos. Los resultados del ensayo de fosforilacion de Stat-6 de TF-1 se representan en la Figura 1 y muestran que la mutelna de lipocalina (SEQ ID NO: 6) es un potente antagonista de IL-4, as! como de IL-13, ya que se relaciona con la senalizacion descendente de IL-4RA. El anticuerpo especlfico contra IL-4RA MAB230 (R&D Systems) funciona igualmente bien. De manera sorprendente, el mutante de IL-4 es significativamente menos eficaz en la inhibicion de la fosforilacion de Stat6 inducida tanto por IL-4 como por IL-13 en celulas TF-1 aunque el antagonismo funcional se ha descrito previamente. La constante de velocidad de disociacion rapida (koff) del mutante IL-4 (R121D, Y124D) en comparacion con la mutelna de lipocalina (Tabla 1) puede ser la razon de esta diferencia funcional.

Tabla 1

Ejemplo 2: Construction de raton doble knock-in

Se generaron ratones knock-in de la cadena alfa del receptor de IL-4 humana y de la cadena alfa 1 del receptor de IL-13 reemplazando el gen de la cadena alfa del receptor de IL-4 y el gen de la cadena alfa 1 del receptor de IL-13 de raton por el ortologo humano respectivo. Por consiguiente, los ratones generados se denominan ratones doble knock-in de la cadena 1 alfa del receptor de IL-4 humana/receptor de IL-13 humana que albergan los genes humanos en vez de los de raton de la cadena 1 alfa del receptor de IL-4 y del receptor de IL-13 en el locus del gen ortologo de raton.

Los ratones se generaron de la siguiente manera: se elimino el gen IL-13RA1 de raton de 70 kb en el cromosoma X, lo que genero un alelo nulo en celulas madre embrionarias de raton. Se introdujo un segmento de ADN que portaba el gen IL-13RA1 humano en el locus eliminado. El gen humano consiste en un fragmento de 95,7 kb del cromosoma X humano que contiene no solo el gen IL13RA completo, sino tambien ~11 kb de ADN intergenico 5' y ~7 kb de ADN 3' de la 3'UTR. Impllcito en esto esta el conocimiento de que este fragmento de ADN dirigira la expresion del receptor humano. Los ratones portadores de esta alteration se generaron a partir de las celulas ES modificadas. En un experimento separado, el segmento de 39 kb de ADN que porta el gen IL-4RA de raton se intercambio con el segmento correspondiente de 63 kb de ADN que codifica el IL-4R humano, que se compone de IL-4R alfa y la cadena gamma comun, y de nuevo utilizando una llnea de raton generada a partir de las celulas modificadas. Las dos llneas de raton knock-in se entrecruzaron para establecer una llnea de raton homocigotica para el locus humanizado tanto en el locus IL-4R como en el locus IL-13RA. Los ratones expresan las protelnas humanas en ausencia de las protelnas de raton. La expresion adecuada de los receptores humanos de Tipo I y Tipo II se verifico demostrando la respuesta de las celulas inmunes a la IL4 humana y la respuesta de las celulas epiteliales de las vlas respiratorias a la IL-13.

^{Ejemplo 3: Analisis} ex vivo ^{de esplenocitos de raton doble knock-in para verificar la funcion de un antagonista alfa} del receptor de IL-4 en el receptor de IL-4 tipo I

Se aislaron esplenocitos a partir de ratones doble knock-in de la cadena 1 alfa del receptor de IL-4 humana/receptor de IL-13 humana por medios y procedimientos comunmente conocidos en la tecnica. Estos esplenocitos se estimularon con concentraciones crecientes de IL-4 humana, bien en ausencia o en presencia de un antagonista alfa del receptor de IL-4, una mutelna de lipocalina dirigida contra la cadena alfa del receptor de IL-4 humana (SEQ ID NO: 6). IL-4 efectua la fosforilacion de STAT6 a traves del complejo receptor de IL-4. Por lo tanto, la fosforilacion de STAT6 es una lectura de la union de IL-4 a su receptor. La lipocalina lacrimal humana (SEQ ID NO: 1) sirve como control negativo.

En la Figura 2, se muestra que la mutelna de lipocalina (SEQ ID NO: 6) disminuye y, por lo tanto, neutraliza, la action de la IL-4 sobre el receptor de IL-4 tipo I expresado en los esplenocitos, ya que la fosforilacion de STAT 6 en los esplenocitos estimulados con IL-4 fue igual al nivel de esplenocitos no estimulados.

Ejemplo 4: Administracion de un antagonista alfa del receptor de IL-4 para raton transgenico doble knock-in y analisis de los niveles de eotaxina

El modelo de inflamacion de las vlas respiratorias inducida por IL-13 proporcionado por Blanchard y col. (Clin Exp Allergy 2005, 35(8):1096-1103) se uso para investigar el efecto de un antagonista alfa del receptor IL-4, una mutelna de lipocalina dirigida contra la cadena alfa del receptor de IL-4 humana. En el modelo, 1 pg de IL-13 se administra tres veces cada 48 horas por instilacion intratraqueal.

Por consiguiente, tal como se muestra en la Figura 3, se administro un vehlculo (solucion salina tamponada con fosfato, posteriormente denominada "PBS") o IL-13 (hIL-13) a ratones transgenicos de doble knock-in, como grupo 1 (PBS) y grupo 2 (hIL-13), respectivamente, mientras que el grupo 3 (SEQ ID NO: 6/hIL-13) y el grupo 4 (TLPC/hIL-13) recibieron la mutelna de lipocalina (SEQ ID NO: 6) en una dosis de 57 pg o la lipocalina lacrimal humana (SEQ ID NO: 1) como control negativo a una dosis de 57 pg, respectivamente, ademas de haber recibido hIL-13.

Los grupos 2 y 3 contenlan 3 ratones, mientras que los grupos 1 y 4 contenlan 2 ratones. La dosificacion intratraqueal se realizo a 30 pl. IL-13, la mutelna de lipocalina (SEQ ID NO: 6) y el control negativo se administraron por via intratraqueal y se obtuvo homogeneizado de tejido pulmonar con el objetivo de medir los niveles de eotaxina. Cabe senalar que la mutelna de lipocalina y el control negativo se administraron 30 minutos antes de la administracion de IL-13.

Cuando se administra IL-13 en este modelo, los niveles de eotaxina aumentan, por ejemplo, 24 horas despues de la ultima dosis de IL-13 en el grupo 4 en comparacion con el grupo 1. La eotaxina es un potente quimioatrayente de eosinofilos y, por lo tanto, un marcador de inflamacion, en particular la inflamacion alergica. En la Figura 3 se muestra que la mutelna de lipocalina (SEQ ID NO: 6) en el grupo 4 neutraliza efectivamente la accion de IL-13 sobre la induccion de eotaxina en comparacion con el control negativo en el grupo 3 (vease tambien el grupo 1 de PBS y el grupo 2 de IL-13 sola).

Ejemplo 5: Administracion de un antagonista alfa del receptor de IL-4 para raton transgenico doble knock-in y analisis de la expresion de ARNm de Ccl11 (eotaxina).

La administracion de un antagonista alfa del receptor de IL-4, una mutelna de lipocalina dirigida contra la cadena alfa del receptor de IL-4 humana (SEQ ID NO: 6), a los ratones doble knock-in de la cadena 1 alfa del receptor de IL-4 humana/receptor de IL-13 humana se realizo tal como se describe en el Ejemplo 4, con la excepcion de que 30 pl de IL-13 (Peprotech, 1 pg) se administraron por instilacion intratraqueal solo una vez. Cada uno de los grupos contenla 3 ratones doble knock-in de la cadena 1 alfa del receptor de IL-4 humana/receptor de IL-13 humana. El ARN total se aislo de homogeneizados de pulmon 24 horas despues de la dosis de IL-13 y se analizo la expresion de eotaxina de raton mediante RT-PCR. La expresion de ARNm en tejido pulmonar despues de 24 horas se normalizo con ARNr 18S y el valor para 1 pg de ratones hIL13 se establecio en 1. La mutelna de lipocalina (SEQ ID NO: 6) tambien se aplico por instilacion intratraqueal con un volumen de 30 pl, bien a una dosis constante de 98 pg en diferentes momentos antes de la dosis de IL-13 o en diferentes cantidades 30 minutos antes de la dosis de IL-13. El mutante de IL-4 (R121D, Y124D) tambien se aplico por instilacion intratraqueal con un volumen de 30 pl en diferentes cantidades 30 minutos antes de la dosis de IL-13. Se uso el modelo abreviado de inflamacion de las vlas respiratorias inducida por IL-13 (administracion intratraqueal con IL-13 unica) para evaluar la duracion de la respuesta farmacologica, la dependencia de la dosis y la potencia comparable. En la Figura 4a se puede observar que la mutelna de lipocalina (SEQ ID NO: 6) inhibio el transcrito Ccl11 inducido por IL-13 humana (eotaxina) de manera eficaz durante un perlodo prolongado de tiempo (Figura 4a), mientras que tambien se demostro la dependencia de la dosis de la respuesta farmacologica, tal como se muestra en la Figura 4b. Ademas, como se puede ver en la Figura 4c, se mostro una potencia favorable de la mutelna de lipocalina (SEQ ID NO: 6) cuando se comparo lado a lado con el mutante IL-4 (Figura 4c).

Ejemplo 6: Identificacion de formulaciones adecuadas para nebulizar un antagonista alfa del receptor de IL-4 utilizando el nebulizador de malla vibrante Pari eFlow.

Se nebulizo un antagonista alfa del receptor de IL-4, una mutelna de lipocalina especlfica de IL-4RA (SEQ ID NO: 6) con un dispositivo Pari eFlow a una concentracion de 0,1 mg/ml en p Bs que contenla 0,01 o 0,05 polisorbato 20. El deposito del nebulizador se lleno con 6 ml de la formulacion y se hizo funcionar durante aproximadamente 15 minutos hasta que se nebulizo la mitad del deposito. Tal como se muestra en la Figura 5, la muestra nebulizada se recogio con un vial de vidrio ajustado a la boquilla del nebulizador y analizado por inspeccion visual para monitorear partlculas visibles, por oscurecimiento de la luz para monitorear partlculas subvisibles, por cromatografla de exclusion de tamano de alta presion (HP-SEC) para monitorear agregados solubles, por SEC de fase inversa para monitorear modificaciones qulmicas, por un ELISA de union a IL-4RA para monitorear la actividad funcional y por difraccion laser para medir el tamano de la gota. La nebulizacion de la mutelna de lipocalina (SEQ ID NO: 6) en la formulacion elegida no condujo a la generation de partlculas subvisibles y agregados visibles. Tanto la protelna nebulizada como la protelna que quedaba en el reservorio se mantuvieron monomericas y completamente activas de manera funciona. Las gotas con un tamano medio de 5,5 pm se generaron de acuerdo con las especificaciones del dispositivo. La concentracion de polisorbato 20 en la formulacion no parecio influir en la capacidad para nebulizar la mutelna, ya que ninguno de los parametros medidos fue identico en las formulaciones que contenlan 0,01 o 0,05 polisorbato 20.

Ejemplo 7: Propiedades farmacocineticas y biodistribucion de un antagonista alfa del receptor de IL-4 en ratones doble knock-in de IL-4RA humana/IL-13 humana despues de la instilacion intratraqueal.

Un antagonista alfa del receptor de IL-4, la mutelna de lipocalina (SEQ ID NO: 6) se administro por administracion intratraqueal de 30 pl (98 pg) a los ratones doble knock-in de la cadena 1 alfa del receptor de IL-4 humana/receptor de IL-13 humana. Veinte animales fueron dosificados y se sacrificaron grupos de 4 despues de 1, 4, 8, 16 y 24 horas. En el momento de sacrificarlos, los pulmones se lavaron con 2 x 1 ml de fluido FACSflow, se extrajeron muestras de plasma de heparina-Li y los pulmones se congelaron instantaneamente en nitrogeno llquido. El tejido pulmonar se homogeneizo en 1,5 ml de tampon de lisis (una tableta de comprimidos de cocteles mini inhibidores de la proteasa completos (Roche) / 10 ml de T-PER (Perbio)) utilizando un homogeneizador de tejidos IKA T10 basico Ultra-Turrax (S10N-5G) en 4 °C durante 55 segundos. El homogeneizado se incubo en hielo durante 30-60 minutos y se aclaro por centrifugacion con 10,000 g a 4 ° C durante 10 minutos. La concentracion de protelna total se determino con un kit de BCA (Pierce) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y las muestras se diluyeron con PBS hasta una concentracion de protelna final estandar de 1 mg/ml antes del almacenamiento de allcuotas a -80 °C. Se utilizo un ELISA basado en Meso Scale Discovery ("MSD") cuantitativo para medir las concentraciones activas de union de la mutelna de lipocalina (SEQ ID NO: 6) en el llquido de lavado, tejido pulmonar y plasma en los diferentes puntos temporales. En resumen, las placas de MSD se recubrieron con neutravidina, 5 pg/ml en PBS durante la noche a 4 °C, se lavaron con PBS/Tween20 al 0,05 % y se bloquearon con BSA al 3 %. Se anadio IL-4RA humana biotinilada a una concentracion de 2,5 pg/ml en PBS/Tween20 al 0,1 % para capturar la mutelna de lipocalina de las diferentes matrices y la mutelna unida se detecto con un anticuerpo policlonal de conejo especlfico de lipocalina lacrimal (preparacion: TLPC-Mix4666 Ab, Pieris, PL#684) y un anticuerpo IgG anti-conejo Sulfo-Tag (Meso Scale Discovery, 0,5 pg ml) en PBS/Tween20 al 0,5 %/BSA al 0,5 %. El ensayo exhibio en las tres matrices un rango lineal de 75 pg/ml a 6 ng/ml, mientras que las muestras de control de calidad tuvieron una recuperacion de entre 80­ 120 %. Para los calculos de concentraciones y cantidades totales, se asumio un volumen total de plasma de 900 pl por raton. El factor de dilucion usado para estandarizar el homogeneizado de pulmon a 1 mg/ml de concentracion de protelna total medida por el kit de BCA se tuvo en cuenta cuando la cantidad total de mutelna de lipocalina por pulmon se calculo en funcion de la concentracion medida en el homogeneizado de pulmon total estandarizado y su volumen de 1,5 ml de tampon de lisis y peso medido de los pulmones. La cantidad total de la mutelna de lipocalina en el fluido de lavado broncoalveolar (en adelante “BALF”) se baso en la cantidad recuperada en 2 ml de fluido de lavado.

En la Figura 6a se puede observar que el 43 % de la dosis administrada podrla recuperarse en el BALF, el 6 % en el tejido pulmonar y el 0,2 % en plasma 1 hora despues de la administracion intratraqueal. Se determino una vida media terminal de 3,7, 3,9 y 2,7 horas en BALF, tejido pulmonar y plasma, respectivamente. Ademas, se puede ver en la Figura 6b que las concentraciones calculadas de tejido pulmonar en ratones doble knock-in de IL-4RA humana/IL-13 humana se mantuvieron por encima de 0,7 pg/ml despues de la instilacion intratraqueal de 98 pg de la mutelna de lipocalina durante aproximadamente 20 horas, lo que esta en llnea con las observaciones mostradas en la Figura 4a. La concentracion de 0,7 pg/ml corresponde al valor IC90 mas alto de la mutelna de lipocalina ^{observada en diferentes ensayos de potencia} in vitro. ^{Ademas, la Figura 6b tambien muestra que las} concentraciones plasmaticas y, por lo tanto, la exposicion sistemica, fueron 100 veces mas bajas en comparacion con las concentraciones observadas en el tejido pulmonar.

Ejemplo 8: La inhibicion de la metaplasia de celulas caliciformes inducida por IL-13 en el sistema de cultivo de interfaz aire-llquido del epitelio de las vlas respiratorias humanas por un antagonista alfa del receptor de IL-4

La metaplasia de celulas caliciformes es una caracterlstica comun de varias enfermedades respiratorias, incluyendo el asma. Por lo tanto, se evaluo la capacidad de un antagonista alfa del receptor de IL-4, la mutelna de lipocalina ^{(SEQ ID NO: 6), para prevenir la metaplasia de las celulas en un modelo} in vitro ^{basado en MucilAir™ (Epithelix).} MucilAir™, un sistema de cultivo de interfaz aire-llquido del epitelio de las vlas respiratorias humanas reconstituido ^{en celulas humanas primarias} in vitro, ^{se trato cada dos dlas con IL-13 humana a una dosis de 0,3 a 30 ng/ml. Por medio de la tincion con azul de Alcian} in situ, ^{as! como el analisis histologico, se demostro que MucilAir™ exhibio un} aumento en la densidad de las celulas caliciformes despues de 14 dlas de tratamiento, de una manera dependiente de la dosis. Por lo tanto, el efecto inhibitorio de la mutelna de lipocalina en la metaplasia de las celulas caliciformes se probo comparando la exposicion continua de MucilAir ™ a 10 ng/ml de IL-13 humana durante 14 dlas como control positivo y a concentraciones diferentes de IL-13+ (como se muestra en la Figura 7a) de la mutelna de lipocalina (SEQ ID NO: 6), el mutante de IL-4 (R121D, Y124D) y un anticuerpo monoclonal anti-IL-4RA (la region variable de las cadenas ligera y pesada se muestra en SEQ ID NO: 14 y 15), respectivamente, y en comparacion con MucilAir™ cultivado durante 14 dlas sin IL-13 como control negativo. La mancha azul de Alcain, que tine mucopolisacaridos acidos y glicosaminoglicanos de azul a verde azulado, se anadio a la superficie apical para una ^mancha in situ ^{y se tomaron imagenes de celulas tenidas bajo un microscopio de contraste de fase para el analisis} de la imagen. El porcentaje de las celulas positivas al azul de Alcain se cuantifico mediante el programa de procesamiento de imagenes Java de dominio publico ImageJ y se expreso como relacion de area del area de azul de Alcain/area de imagen total. El analisis histologico se realizo mediante una plataforma en la Universidad de

Claims (18)

REIVINDICACIONES

1. Composicion que comprende una mutelna de lipocalina lacrimal humana o un fragmento de la misma o una protelna de fusion o un conjugado de la misma que es capaz de inhibir la union de IL-4 y/o IL-13 a sus receptores respectivos, para uso en un procedimiento de tratamiento, mejora o prevention de un trastorno en un sujeto, en ^{donde dicha mutelna de lipocalina o fragmento es capaz de exhibir una actividad terapeutica} in vivo ^{en el sujeto y es capaz de inhibir} in vivo ^{el transcrito Ccl11 inducido por IL-13 humana Ccl11 (eotaxina), en donde dicha mutelna de} lipocalina o fragmento tiene al menos un 75 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoacidos de la lipocalina lacrimal humana madura (SEQ ID NO: 1), en donde dicha mutelna de lipocalina o fragmento tiene los mismos aminoacidos que se exponen en SEQ ID NO: 6 en las posiciones de aminoacidos correspondientes a las posiciones 26, 27, 28, 30, 31, 32, 33, 34, 53, 55, 56, 57, 58, 61, 63, 64, 66, 80, 83, 104-106 y 108 de la secuencia polipeptldica lineal de la lipocalina lacrimal humana madura (SEQ ID NO: 1), y en donde el fragmento de la mutelna de lipocalina carece de al menos uno de los aminoacidos N-terminales y/o C-terminales en comparacion con dicha mutelna de lipocalina.

2. Composicion para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que dicha mutelna de lipocalina o fragmento es capaz de alterar la serialization descendente y/o las respuestas celulares inducidas por IL-4 y/o IL-13.

3. Composicion para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que dicha mutelna de lipocalina o fragmento es ^{mas potente que un mutante de IL-4 (R121D, Y124D) para inhibir} in vivo ^{el transcripto Ccl 11 inducido por IL-13} humana (eotaxina).

4. Composicion para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que dicha mutelna de lipocalina o fragmento es capaz de exhibir una actividad funcional tan buena como el anticuerpo monoclonal anti-IL-4RA AMG 317 (SEQ ID NO: 14 y 15).

5. Composicion para su uso de acuerdo con la reivindicacion 4, en la que dicha mutelna de lipocalina o fragmento es capaz de inhibir la metaplasia de las celulas calciformes inducida por IL-13 de una manera tan eficaz como el anticuerpo monoclonal anti-IL-4RA AMG 317 (SEQ ID NO: 14 y 15).

6. Composicion para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el sujeto padece un trastorno en el que la expresion de IL-4 y/o la expresion de IL-13 contribuyen o estan relacionadas con la patogenesis o el empeoramiento de una enfermedad.

7. Composicion para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha composicion se administra localmente al pulmon.

8. Composicion para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha composicion se administra mediante inhalation de un aerosol.

9. Composicion para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha composicion se administra a un sujeto que la necesita a una frecuencia seleccionada del grupo que consiste en: hasta cuatro veces al dla, hasta tres veces al dla, hasta dos veces al dla, hasta una vez al dla, hasta una vez cada dos dlas, hasta una vez cada tres dlas, hasta una vez por semana y hasta una vez cada dos semanas.

10. Composicion para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha composicion se administra a un sujeto que la necesita cada vez a un nivel de dosificacion seleccionado del grupo que consiste en: 0,06-600 mg, 0,06-100 mg, 0,3-10 mg y 1-3 mg.

11. Composicion para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho trastorno esta asociado a un aumento de la respuesta inmune Th2.

12. Composicion para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde dicho trastorno esta asociado a una reaction alergica o una inflamacion alergica.

13. Composicion para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en donde dicho trastorno es inflamacion alergica, asma alergica, rinitis, conjuntivitis, fibrosis pulmonar, fibrosis qulstica, enfermedad pulmonar obstructiva cronica, proteinosis alveolar pulmonar o slndrome de dificultad respiratoria en adultos.

14. Composicion para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en donde dicho trastorno es asma alergica, rinitis, conjuntivitis o dermatitis.

15. Composicion para su uso de acuerdo con la reivindicacion 12, en donde dicha composicion comprende ademas un medicamento antialergico y/o un medicamento antialergico antiinflamatorio.

16. Composicion para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha mutelna de lipocalina o fragmento no tienen esencialmente reactividad cruzada con la cadena alfa del receptor de IL-23, el receptor de citoquinas de tipo I con el dominio de tipo III de la fibronectina, el receptor de IL-6, o cadena alfa del receptor IL-18.

17. Composicion para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde dicho trastorno es un trastorno pulmonar.

18. Composicion para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha mutelna o fragmento de lipocalina se unen a la cadena alfa del receptor de IL-4.