JP6975535B2 - 薬物送達強化剤 - Google Patents
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Description
X4−X5−X6−X7−X8
式1(配列番号:1)
ここで:
X4は、負に荷電したアミノ酸残基、例えばpTyr、Asp又はGluであり;
X5は、小さな疎水性アミノ酸残基、例えばVal又はAlaであり;
X6は、正に荷電したアミノ酸残基、例えばLys又はArgであり;
X7は、親水性アミノ酸残基、例えばTyr、Phe、Thr又はSerであり;そして
X8は、負に荷電したアミノ酸残基、例えばpTyr、Asp又はGluである、
または、式2の配列を含むペプチド:
X5−X6−X7−X8
式2(配列番号:2)
ここで:
X5は、任意のアミノ酸残基であり;
X6は、Tyrであり;
X7は、Glnであり;そして
X8は、Tyrである、
または、全てのアミノ酸残基がD−配置であって、ペプチド配列の順序が逆である、式1又は式2の配列のレトロインベルソ形態を含むペプチド、
が提供される。
X4−X5−X6−X7−X8
式1(配列番号:1)
ここで:
X4は、負に荷電したアミノ酸残基、例えばpTyr、Asp又はGluであり;
X5は、小さな疎水性アミノ酸残基、例えばVal又はAlaであり;
X6は、正に荷電したアミノ酸残基、例えばLys又はArgであり;
X7は、親水性アミノ酸残基、例えばTyr、Phe、Thr又はSerであり;そして
X8は、負に荷電したアミノ酸残基、例えばpTyr、Asp又はGluである、
及び/又は、式2の配列を含むペプチド
X5−X6−X7−X8
式2(配列番号:2)
ここで:
X5は、任意のアミノ酸残基であり;
X6は、Tyrであり;
X7は、Glnであり;そして
X8は、Tyrである;
または、全てのアミノ酸残基がD−配置であって、ペプチド配列の順序が逆である、式1及び/又は式2の配列のレトロインベルソ配置であるペプチド、
並びに、薬学的に許容される担体、
を含む医薬組成物が提供される。
ポリペプチド:モノマーがアミド結合を介して一緒に結合しているアミノ酸残基であるポリマー。アミノ酸がα-アミノ酸である場合、L−光学異性体又はD−光学異性体のいずれかを使用することができる。本発明は、L−異性体及びD−異性体の両者に関する。好ましくは、本発明は、ペプチドが式1又は2に特定されたものと逆の配列を含む場合に、特に排他的ではないが、D−異性体に関する。このようなペプチドは、「レトロ−インベルソ」形態であると称される。本明細書で使用される「ポリペプチド」又は「タンパク質」という用語は、任意のアミノ酸配列を包含し、天然に存在するアミノ酸及び天然に存在しないアミノ酸を用いた糖タンパク質及び配列などの修飾された配列を含む。用語「ポリペプチド」は、天然に存在するタンパク質、並びに組換え又は合成によって産生されるもの、並びにポリペプチドの塩、溶媒和物及び誘導体を包含する。本発明のペプチドは、好ましくは、そのC末端がアミド化されている。
本発明のすべての側面に関連するペプチドは、好ましくは、細胞間隙輸送を増強する能力において活性である。これは、本明細書に詳述されている方法(特に実施例)の1つに従って測定することができる。
本発明による好適な塩としては、有機又は無機の酸又は塩基で形成された塩が包含される。薬学的に許容される酸付加塩としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、クエン酸、酒石酸、酢酸、リン酸、乳酸、ピルビン酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、コハク酸、過塩素酸、フマル酸、マレイン酸、グリコール酸、乳酸、サリチル酸、オキサロ酢酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、p−トルエンスルホン酸、ギ酸、安息香酸、マロン酸、ナフタレン−2−スルホン酸、ベンゼンスルホン酸、及びイセチオン酸で形成されるものが包含される。シュウ酸などの他の酸は、それ自体薬学的に許容されるものではないが、本発明の化合物およびその薬学的に許容される塩を得る際の中間体として有用であり得る。塩基を有する薬学的に許容される塩としては、アンモニウム塩、アルカリ金属塩、例えばカリウム塩及びナトリウム塩、アルカリ土類金属塩、例えばカルシウム塩及びマグネシウム塩、及び有機塩基を有する塩、例えばジシクロヘキシルアミン及びN−メチル−D−グルコミン(N-methyl-D-glucomine)が包含される。
本発明のペプチドは、例えば、個々のアミノ酸からの合成、特に自動ペプチド合成機を用いた段階的合成;天然ペプチドの修飾;又は組換え製造技術等の従来の方法を含むがこれに限定されない、ペプチドを作製するための任意の適切な技術によって作製することができる。
本発明に関連する医薬製剤は、経口、非経口吸入(種々のタイプの計量用量、加圧エアロゾル、ネブライザー又は吸入器によって生成され得る微粒子粉末又はミストを含む)、直腸及び局所(皮膚、経皮、経粘膜、頬側、舌下、及び眼内を含む)の投与のために適切な製剤を包含するが、最も適切な経路は、例えば、レシピエントの状態及び疾患に依存し得る。
本発明は、内因性制御機構を利用することによって、タイトジャンクションの動的な開閉を制御することによって、上皮内の隣接する細胞間の細胞間隙経路(paracellular route)を開くための方策の開発に基づいている。その方策は、特異的な細胞標的を標的とするために及びそれらの標的に対する特異的作用を有するために、新規に設計されたペプチド化合物の供給に関連する。
X4−X5−X6−X7−X8
式1(配列番号:1)
ここで:
X4は、負に荷電したアミノ酸残基、例えばpTyr、Asp又はGluであり;
X5は、小さな疎水性アミノ酸残基、例えばVal又はAlaであり;
X6は、正に荷電したアミノ酸残基、例えばLys又はArgであり;
X7は、親水性アミノ酸残基、例えばTyr、Phe、Thr又はSerであり;そして
X8は、負に荷電したアミノ酸残基、例えばpTyr、Asp又はGluである、
または、式2の配列を含むペプチド
X5−X6−X7−X8
式2(配列番号:2)
ここで:
X5は、任意のアミノ酸残基であり;
X6は、Tyrであり;
X7は、Glnであり;そして
X8は、Tyrである、
または、全てのアミノ酸残基がD−配置であって、ペプチド配列の順序が逆である、式1又は式2の配列のレトロインベルソ形態を含むペプチド、
が提供される。
式1によるペプチドは、PP1−CPI-17相互作用を阻害する。式1によって包含される配列による本発明の様々な側面のいくつかの実施態様によれば、
X4は、pTyr、Asp又はGluであり;
X5は、Val又はAlaであり;
X6は、Lys又はArgであり;
X7は、Tyr、Phe、Thr又はSerであり;そして
X8は、pTyr、Asp又はGluである。
X4は、Asp又はGluであり;
X5は、Val又はAlaであり;
X6は、Lys又はArgであり;
X7は、Tyr、Phe又はThrであり;そして
X8は、Asp又はGluである。
X4は、Asp又はGluであり;
X5は、Valであり;
X6は、Lysであり;
X7は、Tyrであり;そして
X8は、Asp又はGluである。
X4は、Gluであり;
X5は、Valであり;
X6は、Lysであり;
X7は、Tyrであり;そして
X8は、Aspである。
X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10(配列番号:5)、又は
X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10(配列番号:6)、又は
X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8(配列番号:7)、最も好ましくは
X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10(配列番号:5)(式1a)であり、
ここで:
X1は、10個までの正に荷電したアミノ酸残基であり;
X2は、正に荷電したアミノ酸残基であり;
X3は、欠失又は疎水性アミノ酸残基であり;
X4は、負に荷電したアミノ酸残基であり;
X5は、小さな疎水性アミノ酸残基であり;
X6は、正に荷電したアミノ酸残基であり;
X7は、疎水性アミノ酸残基であり;
X8は、負に荷電したアミノ酸残基であり;
X9は、正に荷電したアミノ酸残基であり;そして
X10は、10個までの正に荷電したアミノ酸残基であり;又は全てのアミノ酸残基がD−配置であって、ペプチド配列の順序が逆である。
X1は、10個までの正に荷電したアミノ酸残基であり;
X2は、正に荷電したアミノ酸残基であり;
X3は、Val、Ala、Leu又はIleであり;
X4は、pTyr、Asp又はGluであり;
X5は、Val又はArgであり;
X6は、Lys又はArgであり;
X7は、Tyr、Phe、Thr又はSerであり;
X8は、pTyr、Asp又はGluであり;
X9は、正に荷電したアミノ酸残基であり;そして
X10は、10個までの正に荷電したアミノ酸残基であり;又は全てのアミノ酸残基がD−配置であって、ペプチド配列の順序が逆である。
X1は、Lys又はArgの10残基までであり;
X2は、Lys又はArgであり;
X3は、Ala又はValであり;
X4は、pTyr、Asp又はGluであり;
X5は、Val又はArgであり;
X6は、Lys又はArgであり;
X7は、Tyr、Phe、Thr又はSerであり;
X8は、pTyr、Asp又はGluであり;
X9は、Lys又はArgであり;そして
X10は、Lys又はArgの10残基までである。
X1は、Lys又はArgであり;
X2は、Lys又はArgであり;
X3は、Ala又はValであり;
X4は、Asp又はGluであり;
X5は、Valであり;
X6は、Lysであり;
X7は、Tyrであり;
X8は、Asp又はGluであり;
X9は、Lys又はArgであり;そして
X10は、Lys又はArgである。
X1は、Lys又はArgであり;
X2は、Lys又はArgであり;
X3は、Valであり;
X4は、Gluであり;
X5は、Valであり;
X6は、Lysであり;
X7は、Tyrであり;
X8は、Aspであり;
X9は、Lys又はArgであり;そして
X10は、Lys又はArgである。
X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10は、
Arg1-Arg2-Val3-Glu4-Val5-Lys6-Tyr7-Asp8-Arg9-Arg10(配列番号:3)である。
式2によるペプチドは、PP1−MYPT1相互作用を阻害する。式2によって包含される配列による本発明の様々な側面のいくつかの実施態様によれば:
X5は、正に荷電したアミノ酸残基であり;
X6は、Tyrであり;
X7は、Glnであり;そして
X8は、Tyrである。
X5は、Lys又はArgであり;
X6は、Tyrであり;
X7は、Glnであり;そして
X8は、Tyrである。
X5は、Lysであり;
X6は、Tyrであり;
X7は、Glnであり;そして
X8は、Tyrである。
X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12(配列番号:9)、又は
X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9(配列番号:10)、又は
X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12(配列番号:11)、好ましくは
X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12(配列番号:9)式2aである。
ここで:
X1は、10個までの正に荷電したアミノ酸残基であり;
X2は、正に荷電したアミノ酸残基であり;
X3は、Ala又はValであり;
X4は、欠失又はAla又は1、2、3若しくは4個の正に荷電したアミノ酸残基であり;
X5は、正に荷電したアミノ酸残基であり;
X6は、Tyrであり;
X7は、Glnであり;
X8は、Tyrであり;
X9は、欠失又はAla又は1、2、3若しくは4個の正に荷電したアミノ酸残基であり;
X10は、正に荷電したアミノ酸残基であり;
X11は、正に荷電したアミノ酸残基であり;そして
X12は、10個までの正に荷電したアミノ酸残基であり;又は全てのアミノ酸残基がD−配置であって、配列の順序が逆である。
X1は、任意の組合せで、Lys及び/又はArgの10残基までであり;
X2は、Lys又はArgであり;
X3は、Ala又はValであり;
X4は、欠失、Ala、Lys又はArgであり;
X5は、Lys又はArgであり;
X6は、Tyrであり;
X7は、Glnであり;
X8は、Tyrであり;
X9は、Ala又はLys又はArgであり;
X10は、Lys又はArgであり;
X11は、Lys又はArgであり;そして
X12は、任意の組合せで、Lys及び/又はArgの10残基までであり;又は全てのアミノ酸残基がD−配置であり、配列の順序が逆である。
X1は、Lys又はArgであり;
X2は、Lys又はArgであり;
X5は、Alaであり;
X4は、欠失しており;
X5は、Lysであり;
X6は、Tyrであり;
X7は、Glnであり;
X8は、Tyrであり;
X9は、欠失しており;
X10は、Lys又はArgであり;
X11は、Lys又はArgであり;そして
X12は、Lys又はArgである。
X1は、Argであり;
X2は、Lysであり;
X3は、Alaであり;
X4は、欠失しており;
X5は、Lysであり;
X6は、Tyrであり;
X7は、Glnであり;
X8は、Tyrであり;
X9は、欠失しており;
X10は、Argであり;
X11は、Argであり;そして
X12は、Lysであり;
すなわち、配列は、Arg1-Lys2-Ala3-Lys5-Tyr6-Gln7-Tyr8-Arg10-Arg11-Lys12(配列番号:4)である。
式1及び式2の配列は、天然に存在する配列に由来する。それらが由来する天然に存在する配列は、L−立体配置のアミノ酸残基を有する。従って、このような状況では、いくつかの実施態様によれば、アミノ酸はL−配置である。
本発明の第2の側面によれば、本発明の第1の側面の様々な実施態様のいずれかによるペプチド及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物が提供される。
医薬組成物は、腸溶性コーティングを有する剤形を含み得る。腸溶性コーティングは、吸収が小腸で起こるように制御するために、経口医薬組成物、例えば錠剤、カプレット及びカプセルに適用されるコーティングである。腸溶性コーティングは、典型的には、それらが胃の高度に酸性のpHにおいて安定した表面を提供するが、小腸の比較的より塩基性の環境下において急速に崩壊するように、剤形の表面に適用される。腸溶性コーティングに使用される材料には、脂肪酸、ワックス、シェラック、プラスチック及び植物繊維が含まれる。
本発明のペプチド及び第2の治療剤に関連する本発明の様々な側面によれば、例えば本発明の第2の側面による医薬組成物によれば、2つの成分は、それらが同時に上皮表面に存在するように、好ましくは、例えば医薬組成物中で共混合される。本発明のペプチドは、広範囲の治療剤を送達するために使用され得る。それらは、小分子である治療剤の送達に対して、及びペプチド又はタンパク質又は核酸である治療剤の送達においても、特に適切であり得る。例えば、治療剤は、インスリン、副甲状腺ホルモン、カルシトニン、エリスロポエチン、GM−SF又は成長ホルモン、又はsiRNA若しくは遺伝子療法剤であり得る。本発明はまた、抗体又は抗体誘導体である治療剤の送達にも関連する。抗体分子全体が本発明に従って効果的に送達されるには大きすぎることが判明した場合、例えばscFv分子、ラクダ抗体、単一変化(single change)抗体のフラグメント及びドメインなどの抗体ベースの技術のより小さなバージョンが特に有用であり得る。本発明のペプチドによるタイトジャンクション開口に従い、これらの治療剤の全ては、単独で又は他の治療剤と組み合わせて投与することができる。例えば、インスリン及びGLP−1は、本発明のペプチドと同じ剤形で送達することができる。
医薬担体(又は「薬物担体」)は、薬物の送達、製剤、投与又は有効性を改善するために、又はその保存、混合、調製又は処理を助けるために、医薬組成物中に存在する物質である。
その様々な側面における本発明は、上皮(「上皮表面」)に関連する。これは、インビトロ又はインビボの表面であり得る。非限定的な例としては、大腸、小腸、直腸、肛門、子宮頸部、膣、気道(例えば、気管、細気管支、気管支梢又は喉頭)、鼻、口及び角膜の上皮が包含され、インビボ及びインビトロの両方に存在する。
本発明の第3の側面によれば、医薬(medicament)としての使用のための、本発明の第1の側面のペプチド又は本発明の第2の側面による医薬組成物が提供される。本発明の第3及び第4の側面の両方は、「医薬」を指す。 該医薬は、本発明のペプチドを、又は本発明のペプチドと本発明の他の側面に関連して本明細書に記載の第2の治療薬とを、含み得る。この第2の治療薬は、ペプチド、小分子実体(small molecular entity)、核酸又は他の化合物であってもよい。医薬は、本明細書の他の箇所に記載されている疾患障害又は非医学的状態(non-medical condition)の治療のための本発明の他の側面や本明細書の他の箇所に記載されている対象を参照して、本明細書に記載されているように処方することができる。
ある実施態様によれば、本発明は、すべての側面において、対象の治療に関連する。そのような対象は、タイトジャンクションを有する上皮を有する任意の種であり得る。ある好ましい実施態様によれば、本発明は、全ての側面において、哺乳動物対象の治療に関連する。最も好ましくは、本発明は、全ての側面において、両性別及び任意の年齢(例えば、出生から1歳、出生から5歳、出生から12歳、出生から60歳、出生から80歳、2〜60歳、5〜80歳、12〜80歳、又は16歳若しくは18歳以上)のヒトの治療に関連する。
第1の側面によるペプチド、第2の側面による医薬組成物、又は第3の側面による医薬は、疾患又は障害又は他の状態の治療用であり得る。ある実施態様によれば、疾患又は肺疾患は、本発明による低吸収性薬物の送達は、注射による投与と同様の効果を有し得る。重要なことに、治療剤を別個の上皮部位に送達する能力はまた、粘膜下腔への局所送達をもたらすであろう。これらの理由から、本発明は、全身状態及び疾患(例えば、関節炎、低身長など)の両者を、そして又治療剤(例えば、クローン病、喘息など)の局所的ターゲティングから利益を得る状態及び疾患を、治療するのに特に好適であり得る。
ある実施態様によれば、本発明の様々な側面は、美容的な皮膚状態などの状態の非治療的処置、又は医学的には肥満ではないが美容目的のために体重を減らす(又は健康な体重を維持する)ことを望む人の処置に、関連している。
医療方法が特許可能な主題を構成する管轄区域に関して、本発明は、本発明の第2の側面による医薬組成物を前記被験体に投与することを含む、被験体における疾患の治療方法を提供する。ここで、第2の治療剤は疾患の治療のためのものであり、本発明の第1の側面によるペプチドの医薬組成物中の存在が、第2の治療剤の被験体の上皮を横切る送達を改善する。本発明のこの側面のある好ましい実施態様によれば、対象、投与速度、医薬組成物の特徴、本発明のペプチド、第2の治療薬、又は治療される疾患は、本発明の他の側面に関連して本明細書に記載されている通りである。
本発明の第4の側面によれば、本発明の第1の側面によるペプチド又は本発明の第2の側面による医薬組成物の有効量を、上皮に投与することを含む、上皮表面のタイトジャンクションを開く方法が提供される。
本発明の第6の側面によれば、本発明の第1の側面によるペプチドと組み合わせて、又は本発明の第2の側面による医薬組成物の一部として、前記薬剤を投与することを含む、上皮表面を横切る薬剤の送達方法が提供される。
材料及び方法
ペプチド合成
ペプチドは、Sigma Aldrichから入手したイソロイシンを除いて、Nova Biochemから得た各アミノ酸を用いて、(Fmoc)-SPSS(ActivoSynペプチド合成機)によって、合成した。第1のアミノ酸を、N,N'−ジイソプロピルカルボジイミドを用いて、Rink Amide MBHA樹脂(100〜200メッシュ;Nova Biochem)にカップリングさせた。その後のカップリングは、PyBopを用いて、Activo P-11ペプチド合成機で行った。脱保護は、ジメチルホルムアミド中の20%ピペリジンを用いて行った。ペプチドは、トリフルオロ酢酸(TFA)、トリイソプロピルシラン及び水(95:2.5:2.5)の混合物を用いて、樹脂から切断し、次いでジエチルエーテル中で沈殿させた。粗生成物を、Phenomenex Gemini C18カラム(250×10mm、孔径5μm)を用い、流速2.5ml/分を用いる0.1%TFAを含む水及び0.1%TFAを含むアセトニトリルのグラジエント移動相を用いて、HPLCにより精製した。高分解能飛行時間型質量スペクトルは、Bruker Daltonics micrOTOF質量分析計で、エレクトロスプレーイオン化(ESI)を用いて得られ、ペプチドの同一性を確認した。精製ペプチドを凍結乾燥により乾燥させ、−80℃で保存した。
不死化ヒト腸上皮細胞株(Caco-2)を、10%FBS、2mM L−グルタミン(Gibco)、100U/mlペニシリン及び100μg/mlストレプトマイシン(Gibco)を補充したDMEM/F12培地(Gibco、Paisley、UK)中で、維持した。Caco-2細胞を、Transwell(登録商標)(Corning、NY)のポリエステルメンブランフィルター(直径12mm、孔径0.4μm)上に、7×104/ウェルの密度で播種した。2日毎に、DMEM(Life Technologies、Paisley、UK)による再摂取を行った。経上皮電気抵抗(TEER)>350Ω・cm2のCaco-2単層を、コンフルエントと見なし、輸送アッセイに使用した。固定パドル電極を用いてTEER(World Precision Instruments、UK)を測定した。
細胞間隙の透過性に対するPIPペプチドの影響を評価するために、50mg/mlの4kDaデキストラン又は50mg/mlの70kDaデキストラン(Sigma)のアピカルから基底へのフラックスを実施した。アピカル区画容積は200μlであった。設定時間毎に600μlの基底区画容量を収集し、新鮮なHBSSと交換した。アピカル及び基底区画(Apical and basal compartment)の蛍光は、Floustar Omegaマイクロプレートリーダー(BMG Labtech、Ortenburg、Germany)を用いて測定した。TEER測定は、HBSS置換直後の各ウェルについて行った。3時間後、アピカル区画のデキストラン及びペプチド溶液を除去し、PBSで置き換え、TEER値をさらに30分間記録して、単層回収を評価した。
氷冷PBSですすいだ後、Caco-2単層又は単離された腸組織由来の上皮細胞を、3μLのプロテアーゼ阻害剤カクテル及び200μLのRIRA緩衝液中で溶解し(lysed)、氷上に10分間放置した。単離された腸組織を、同様に氷冷PBS中に15分間置いた後、プロテアーゼ阻害剤カクテル及びRIPA緩衝液中での浸軟(maceration)を10分間氷上に放置した。すべての細胞及び組織の溶解物を、8000rpmで15分間遠心分離して上清を回収し、使用するまで−80℃で保存した。ウェスタンブロット分析のために、溶解物をSDS−PAGE(12%)により、220Vで40分間泳動させて分離し、XCellTM Blotモジュール(Invitrogen)を用いて30Vで70分間PDVFメンブレン上に電気的に転写した。膜を、TBS−T(2Mトリス、HCl、pH7.5、4M NaCl及び0.1%Tween 20)中の5%ウシ血清アルブミンを用いて、1時間ブロックした。メンブレンを水で洗浄し、一次抗体(抗ミオシン軽鎖(ホスホS20)抗体又は抗ミオシン軽鎖2)の抗体と共に、5℃で一夜インキュベートし、TBS−Tで3回洗浄し、次いで二次西洋ワサビペルオキシド(HRP)結合抗体と室温で1時間インキュベートした。TBS−Tで3回洗浄した後、HRP活性をECL(Santa Cruz)によって検出した。
MTTアッセイ:3−(4,5−ジメチルチアゾール−2−イル)−2,5−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド(MTT;Invitrogen、Paisley、UK)アッセイを用いて、細胞生存率を評価した。細胞をCPP複合体に72時間曝露した後、0.5mg/mlのMTTを培地に添加し、細胞と共に、さらに3時間インキュベートした。培地を除去し、DMSOで置換して細胞を溶解させた。次いで、吸光度を550nmで記録した。
ローダミン標識BSAと複合体を形成したCPPを添加する前に、ガラスカバースリップ上で細胞を培養した。細胞を複合体とともに2時間インキュベートした後、完全培地で数回洗浄して過剰の複合体を除去した後、4%パラホルムアルデヒドで固定した。標識BSAの細胞中への取り込みは、共焦点顕微鏡(Zeiss LSM 510)によって測定した。BSAエントリーのレベルは、視野内の細胞数に対するローダミン標識の平均蛍光強度の測定により、評価した。
屋内で飼育された雄性Wistarラットは、検討の際に225〜275g(約6〜8週齢)であった。ラットは、12/12時間の明/暗サイクルで、1ケージあたり3〜5匹のグループで収容した。すべての実験は明の相の間に行い、連続イソフルラン麻酔を用いた非回復プロトコルを用いて行った。空腸の中央部を小腸の初期回腸領域に曝露し、カニューレの挿入のための門脈へのアクセスを供給するために、4〜5cmの正中線の腹部切開を行った。インスリン(ヒト組換え体;Sigma)及びPIPペプチドの各溶液を、局所タンパク質分解を減少させるために10mMクエン酸を含む0.9%生理食塩水中で調製し、注射前に1:1で混合し、29ゲージの皮下注射針を用いて、200μL/kg(又は250gのラット当り〜50μL)の量で、注射した。注射部位には、永久マーカーが付けられた。切開部を手術用接着剤で閉じた。グルコース、血清インスリン及びエンドトキシンをモニターするために、血液引抜を、門脈及び全身循環から、次の2時間に渡って、行った。コントロールの処置群は、腸管腔内に送達されたインスリンのSC注射並びにインスリンを含まないPIPペプチドの腸内注入を含み、又はリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)中のインスリンのみの処方が、すべての群に使用された。検討の終わりに、マークされた辺りの腸のセグメントの3〜5mmの領域が分離された。この組織を、MLCのリン酸化状態の生化学的評価のために溶解し、又は固定化し、切片にし、ヘマトキシリン/エオシンで染色した後、認可された獣医病理学者によって分析した。皮下(SC)インスリン注射(20μl/kg)を肩甲骨中央部で行い、同様に血糖を測定した。全ての実験は、1986年の英国動物学(科学的手順)法、1986年の欧州共同体理事会指令(86/609/EEC)、及びバース大学の倫理的レビュー手順に従って行われた。
細胞損傷及び毒性を誘導する細胞浸透性ペプチドの作用の可能性があり得るため(Carter, 2013#109; Kilk, 2009#110)、初期段階の細胞中毒の尺度としてのアポトーシスの誘導を、カスパーゼ−3製造者の指示書(Millipore, Watford, UK)に従って、APT165市販キットを用いて、カスパーゼ−3の酵素活性を測定することによって、評価した。直接腸管管腔内注入によって投与された試験薬剤に曝露してから45分後に、腸組織を単離した。ハイグロマイシン(150μg/mL)をカスパーゼ−3活性化によりアポトーシスを誘発する陽性コントロールとして投与した。
PIPペプチド又はコントロール治療剤を除去するために氷冷PBSですすいだ後、単離した腸組織を氷冷PBSに15分間入れ、次いで、25μlのプロテアーゼ阻害剤カクテル(Fisher)、25μlのホスファターゼ阻害剤カクテル(Fisher)及び500μlのRIPA緩衝液(Sigma Aldrich)を加えた。氷上に置いて10分後、溶解物を8000rpmで15分間遠心分離して上清を回収し、使用するまで−80℃で保存した。ウェスタンブロット分析のために、溶解物をSDS−PAGE(12%)により、220Vで40分間泳動させて分離し、XCellTM Blotモジュール(Invitrogen)を用いて30Vで70分間PDVFメンブレン上に電気的に転写した。膜を、TBS−T(2Mトリス、HCl、pH7.5、4M NaCl及び0.1%Tween 20)中の5%ウシ血清アルブミンを用いて、1時間ブロックした。膜を水で洗浄し、一次抗体(抗ミオシン軽鎖(ホスホS19)抗体(Cell Signalling Technologies)又は抗ミオシン軽鎖2抗体(Abcam))と共に5℃で一夜インキュベートし、TBS−Tで3回洗浄し、次いで二次西洋ワサビペルオキシド(HRP)結合抗体と室温で1時間インキュベートした。TBS−Tで3回洗浄した後、HRP活性をECL(Santa Cruz)によって検出した。
初期段階の細胞中毒の尺度としてのアポトーシスの誘導を、カスパーゼ−3製造者の指示書(Millipore, Watford, UK)に従って、APT165市販キットを用いて、カスパーゼ−3の酵素活性を測定することによって、評価した。直接腸管管腔内注入によって投与された試験薬剤に曝露してから45分後に、腸組織を単離した。ハイグロマイシン(150μg/mL)をカスパーゼ−3活性化によりアポトーシスを誘発する陽性コントロールとして投与した。
PIPペプチド媒介性のCy3−標識インスリン(Nancocs)の取り込みをインビボで評価し、露出させた腸のセグメントを、顕微鏡分析のために、投与15分後に分離した。単離された組織を氷冷PBS中で短時間すすぎ、次いで氷上で4%パラホルムアルデヒドで固定した後、Zeiss LSM 510蛍光顕微鏡を用いて評価した。核染色剤として、DAPI(4',6−ジアミジノ−2−フェニルインドール)を用いた。
TEER値は、ブランクフィルターの読みを引いて計算し、その単層膜の初期TEER値のパーセンテージとして基準化した。細胞間隙の透過性を計算するために使用される蛍光デキストランフラックスは、前述のように実施した。血糖値は、各動物のベースライングルコースレベルのパーセンテージとして表した。データは、対になっていないスチューデントの両側T−検定を用いてコントロール値と比較した。0.05未満のp値は、有意差を示すと考えられた。
TJ構造は、健康及び疾患における上皮バリア特性を動的に調節するために収縮性及び足場要素と相互作用する不可欠な(integral)膜タンパク質から構成される(Turner(2009)Nat.Rev. Immunol. 9:799-809; Xiao et al.(2011)J. Aller. Clin. Immunol. 128:549-556)。生理的及び病理学的刺激は、プロテインキナーゼC(PKC)、プロテインキナーゼA、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ類、ホスホイノシチド3−キナーゼ等の多数のキナーゼ及びRhoシグナル伝達経路を介して、TJバリア特性を変化させる(Gonzalez-Mariscal(2008)Biochim. Biophys. Acta 1778:729-756)。このキナーゼクロストークの中心的要素は、ミオシン軽鎖(MLC)リン酸化の調節を含む(Woodsome et al.(2006)J. Cell Sci. 119:1769-1780);図1。MLCリン酸化の増加とTJバリア機能の低下との間に直接的な関連が存在する。炎症誘発性(pro-inflammatory)サイトカイン類は、MLCリン酸化を促進し、MLCキナーゼ(MLCK)が中心的な役割を果たすTJの開口をもたらすことができる。本発明者は、以前に、腸及び肺における炎症誘発性のTJバリア機能の低下を矯正することができる、PIK(図1の矢印)と呼ばれる膜透過性で安定なペプチドであるMLCK阻害剤を同定した(Clayburgh et al.(2005)J. Clin. Invest. 115:2702-2715; Mirzapoiazava et al.(2011)Am. J. Respir. Cell Molec. Biol. 44:40-52)。MLCK機能は、おそらくMLCホスファターゼ(MLCP)の作用によって、相殺される。このネットワーク内の標的に対する遺伝子ノックアウトを用いた研究は、バリア機能におけるそれらの役割についての洞察を提供することができるが、このネットワーク内の単一の標的を目標とする任意の分子による全システムに対する作用は、薬理学的研究によって決定されなければならない。これらのタンパク質表面接触部位は細胞内であり、これらの薬剤の関連試験のための主要部位は腸であり、好結果の阻害剤は、好ましくは、安定であり、膜透過性であるべきである。
本発明者は、以前に、炎症事象のために開位置にあるTJ構造を閉鎖するMLCKの9残基ペプチド(PIK)阻害剤を開発した。PIKは、MLCK機能にとって重要なタンパク質表面構造を模倣する。重要な界面接触の同定に続いて、このペプチドは、細胞透過性ペプチド(CPP)機能を可能にし、代謝安定性を増加させるアミノ酸を組み込むように改変された。これらの同じ設計原理を適用して、本発明の様々な側面による薬剤及び方法が開発されている。MLCPは、PP1アイソフォーム、ミオシン・ターゲティング・サブユニットMYCP1−CPI−17調節複合体、及び21kDaアクセサリーサブユニットからなる三量体タンパク質ホスファターゼ−1(PP1)ホロ酵素である。潜在的なペプチドMLCP阻害剤を同定するために、本発明者は、MYCP1又は17kDaタンパク質阻害剤CPI−17とMLCP機能を直接調節するPP1との相互作用に焦点を当てた(図3)。
CPI−17によるMLCPの阻害は、PKC刺激事象によって引き起こされ;CPI−17中の残基T38(pT38)のリン酸化は、MLCP阻害を、1000倍を超えて増強し;T38(24)を含むCPI−17内の最小阻害ドメインが同定され、PP1とのその相互作用に関与するCPI−17におけるR36VTVKYDRR44(配列番号:13)配列を模倣するペプチドの小さな構造(cadre)が合成された。最初のペプチドセットには、pT38(グルタミン酸;E)を模倣する改変、及び膜透過性を増強するためにCPP配列を模倣するためのさらなる塩基性アミノ酸の導入があった(表1)。
MLCP阻害は、残基T696及びT853でのMYPT1のRho−キナーゼ媒介リン酸化の後に起こる(Murthy et al.(2003)Biochem. J. 374:145-155)。MYPT1は、RVxF結合モチーフ、N末端アーム及びこのタンパク質のアンキリンリピートの第2群の3つの異なる領域を介して、PP1に結合する。T696及びT853の両方でのMYPT1のリン酸化がMLCP調節に関与すると思われるが、MYPT1の300残基N末端ドメイン内のKVKF配列は、そのPP1との会合を促進する(Peti et al.(2013)FEB S.J. 280:596-611)。PP1に結合したMYPTの構造解析は、PP1のE300〜E309がMYPTの2つのアンキリンリピートの間に位置することを示している。特に、アンキリンリピートはY305及びY307と結合し、PP1のC末端がアイソフォーム特異性を媒介する調節サブユニット相互作用に重要であることを示唆している。従って、この領域に対応するペプチドは、MYPTがPP1に結合するのを妨げ、よってMYPT/PP1複合体のミオシン特異性を減少させることができると推測された。
PIPペプチド250及び640を適切に比較するために、TEERに基づく応答に基づいて2つを調和させようと試みた。これは、2つのペプチドがそれらの作用に対して重要な異なる特性を有する可能性がありそうであるため、直接的な用量比較を不適切なものとするいくつかの不確実性のために行われた:その特性には、(CPP能力の違いによる)細胞内標的への接近可能性、それらのそれぞれのMLCP関連標的についての結合親和性、標的外の作用、及び細胞内の安定性が含まれる。我々は、20mMのペプチド250が10mMのペプチド640に非常に匹敵する応答を提供することを確認した(図6)。これらの2つのPIPペプチドのアピカル側用量を減少させることは、それぞれ発症率及び最大効果の両方に関してTEERにおける各用量依存性変化が誘導されることを示した(図6)。PIPペプチド暴露の180分後、新鮮な媒体のアピカル区画への置換は、これらのPIPペプチドの除去が、ペプチド250に曝露された細胞よりも、おそらく迅速に応答するペプチド640に暴露された細胞によりTEER低下の急速な逆転が開始されたことを示した(図6)。この観察は、ペプチド250によって誘発された細胞変化の回復が、ペプチド640によって影響された経路よりも動的ではないことを示唆している。ペプチド640は、MLCPのPKC媒介調節因子に影響を及ぼすように設計されており、ペプチド250は、MLCPのRho−キナーゼ媒介調節因子に影響を及ぼすように設計されているので、このような示唆は、TJ構造/機能の迅速でより耐久性のある変化において、PKC及びRho−キナーゼが果たすと認識されている役割と一致する。
我々の焦点は、胃酸及び膵酵素を迂回することに関連する製剤の課題に取り組む前に、腸上皮の輸送を調べることであった。そのような課題は、確立された錠剤又は錠剤技術によって解決することができるが、げっ歯類よりも高次の動物モデルを必要とする。現在、我々は、小さな(50μL)容量を小腸の管腔、特に遠位空腸から近位回腸に直接注入したラットモデルを使用した。我々は、インスリンの皮下(SC)注射による経口送達によって達成された応答を較正した;血糖値が用量依存的に低下して、約30分でその最下点に達し、約90分で回復し始めた。3IU/kgのSC注射は、血糖値の約50%の減少を生じた(図8a)。3IU/kgのラットの小腸(中間空腸から中間回腸)への直接管腔内注入は、血糖に影響を与えなかった(図8b)。しかし、3IU/kgインスリン+ 10mMペプチド250のILIは、3IUのインスリンのSC注射で観察されたものと同様の血糖降下及び回復プロファイルをもたらし、70〜80%の血糖回復が90分で達成されたことが分かった(図8a,b)。興味深いことに、ILIにより3IU/kgと共に投与した20mMペプチド250は、30分で40%の血糖値の低下をもたらし、実験の残りの間、このレベルのままであった(図8b)。10mMペプチド640と30IU/kgのインスリンの直接的なILIは、SC注射(図8a)又は10mMペプチド250(図8b)と比較して、血糖変化プロファイルにおいて、大きく遅れた低下をもたらした(図8c)。10mMペプチド250で観察されたのと同様の効果を生じるためには、20mMペプチド640のILIが必要であった。
これらのインビボ結果は、一般に、細胞間隙の透過性の動的変化を示唆するヒト腸管上皮細胞株Caco-2を用いて実施した我々のインビトロ研究と一致する(図6及び7)。予想されたように、インビボでのこれらのPIPペプチドの作用は一時的であり、それらの作用の持続時間及び開始時間は用量依存的であった。PIPペプチド250及び640の違いは、それらの絶対濃度及び曝露持続時間を制御できるインビトロで、直ぐに明らかであった。我々は、血糖値測定の時間経過の間、PIPペプチドの曝露部位から単離されたラットの腸組織における全MLCに対するMLCの位置19のホスホセリン(pMLC)の程度を比較して、MLCのリン酸化状態を決定することにより、インビボでのPIPペプチド250及び640の作用の開始及び持続時間を調べた(図8B及び8C)。
PIPペプチド及び10IUのインスリンのILI注入後の全MLC細胞含量に関連する血糖低下及びMLCリン酸化の変化をモニターする時間経過の検討は、約30〜60分のインビボ事象窓を示唆する。これをさらに調べるために、我々は、門静脈(図10A)及び尾静脈(図10B)からILI後5〜90分に採取した血液中の血清インスリン濃度を測定した。増加したインスリンレベルの発現及び門静脈におけるそれらの増加したレベルの持続期間は、ペプチド640が、ペプチド250と比較して、これらの2つのペプチドのリン酸化率変化の時間経過と一致して、作用のより迅速な開始及び作用持続時間の短縮を誘導することを示唆した(図9)。
Caco-2細胞を用いた最初のインビトロ研究では、TEER及び細胞間隙透過性を調節する濃度で試験したペプチド250及び640は、ミトコンドリア膜極性マーカーMTSによって評価される細胞生存率に影響しなかったことが示唆された。インビボでのPIP作用の一過性の性質のために、我々は、細胞生存率の減少と相関し得る早期の細胞変化をよりよく定義し得る細胞シグナルに焦点を当てた;カスパーゼ酵素カスケードの活性化は、上皮細胞におけるアポトーシス事象の初期段階である。我々は、血糖の低下(図8)、pMLCの程度の増加(図9)、及びインスリンの門静脈への取込みの増加(図10)が示された濃度で、ペプチド250又は640のアピカル曝露の60分後に単離したラット腸組織におけるカスパーゼ−3活性のレベルを測定した。腸組織は、20mMのPIPペプチド250又は640の同様のアピカル曝露後のカスパーゼ−3酵素活性の誘導を示さなかったが、一方、カスパーゼ−3の誘導のためのポジティブコントロールとして使用した、ILIによって投与されたハイグロマイシン(150mg/mL)は、この酵素活性の増加をもたらした(図11)。門静脈血中のエンドトキシン濃度を、インスリン及び20mMのPIPペプチド250又は640、又はインスリン単独を注入した後に測定した。これらの処理の間に差は認められなかった。
バイオ医薬品の経口送達を高める目的で、腸管細胞間隙のフラックスを増加させるために多くの薬剤が探索されている。キラヤ(quillaja)サポニン、グリチルリジン酸ジカリウム、18β−グリチルレチン酸、カプリン酸ナトリウム、タウリン、及びアルキルマルトシド類(alkylmaltosides)は、記載されている薬剤のうちのほんの一部に過ぎない。一般に、これらの薬剤は、典型的には、Caco-2単層又は単離された腸組織のようなインビトロ細胞系を用いてスクリーニングされる。パルミトイルカルニチンのようなこれらの薬剤のいくつかは、当初は有望であるが、最終的にはそれらの便益は細胞膜への溶解作用及び細胞生存率の低下と相関する。ヒト乳中に存在する中鎖脂肪酸であるカプリン酸ナトリウムは、直腸アンピシリン坐剤における吸収増強剤として承認されている。カプリン酸塩は、インビトロで細胞間隙透過性を高めるTJ拡張を引き起こすことが示されているが、ヒトでのその作用についてのインビボのカプリン酸塩の効能は、細胞間隙透過性改変よりも直腸粘膜に対する非特異的損傷と一層相関する。現在、経口送達後のバイオ医薬品の細胞間隙輸送を促進するように設計され、承認された薬剤は存在しない。
Claims (11)
- 全てのアミノ酸残基がD−配置であって、ペプチド配列の順序が逆である、式1aの配列のレトロインベルソ形態を含むペプチド:
X 1 −X 2 −X 3 −X 4 −X 5 −X 6 −X 7 −X 8 −X 9 −X 10
式1a(配列番号:5)
ここで:
X 1 は、Lys又はArgであり;
X 2 は、Lys又はArgであり;
X 3 は、Ala又はValであり;
X4は、Asp又はGluであり;
X5は、Valであり;
X6は、Lysであり;
X7は、Tyrであり;
X8は、Asp又はGluであり;
X 9 は、Lys又はArgであり;そして
X 10 は、Lys又はArgである。
- 配列 Arg-Arg-Val-Glu-Val-Lys-Tyr-Asp-Arg-Arg-NH2(配列番号:3)の全てのアミノ酸残基がD−配置であり、配列順序が逆である、配列 NH 2 -rrdykvevrr(配列番号:20)を与えるレトロインベルソ形態を有する請求項1に記載のペプチド。
- 請求項1又は2に記載のペプチド及び薬学的に許容される担体を含有する医薬組成物。
- 第2の治療剤をさらに含む、請求項3に記載の医薬組成物。
- 前記第2の治療薬が、インスリン、GLP−1又はそれらの誘導体、類似体又は模倣体である請求項4に記載の医薬組成物。
- 前記第2の治療薬が、核酸、副甲状腺ホルモン、カルシトニン、エリスロポエチン、GM−CSF、成長ホルモン、小分子治療剤、又はそれらの誘導体、類似体又は模倣体である請求項4に記載の医薬組成物。
- 前記組成物が、経口投与に適しており、任意に、前記ペプチド及び/又は前記第2の治療剤を胃における分解から保護するための腸溶コーティングを含む、請求項3〜6のいずれかに記載の医薬組成物。
- 医薬として使用するための、請求項1又は2に記載のペプチド又は請求項3〜7のいずれかに記載の医薬組成物。
- 医薬の製造のための、請求項1又は2に記載のペプチド又は請求項3〜7のいずれかに記載の医薬組成物の使用。
- 請求項1又は2に記載のペプチド又は請求項3〜6のいずれかに記載の医薬組成物の有効量を上皮に投与することを含む、上皮表面のタイトジャンクションを開く方法、ここで当該方法はインビトロで行われる。
- 請求項1又は2に記載のペプチドと共に、又は請求項3〜6のいずれかに記載の医薬組成物の一部として、前記薬剤を投与することを含む、薬剤を、上皮表面を横切って送達する方法、ここで当該方法はインビトロで行われる。
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