CN105377893A - 三聚体抗原结合分子 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含三个融合多肽的三聚体抗原结合分子，每个融合多肽包含与衍生自人软骨基质蛋白的三聚化结构域融合的至少一个抗原结合部分。此外，本发明涉及编码这类三聚体抗原结合分子的多核苷酸以及包含这类多核苷酸的载体和宿主细胞。本发明还涉及用于产生本发明三聚体抗原结合分子的方法，和在治疗疾病中使用这些三聚体抗原结合分子的方法。

Description

三聚体抗原结合分子
发明领域
本发明涉及三聚体抗原结合分子，其组合物和其作为药物的用途，所述三聚体抗原结合分子包含三个融合多肽，每个融合多肽包含与衍生自人软骨基质蛋白的三聚化结构域融合的至少一个抗原结合部分。
背景
已经描述几种方案以产生具有确定化学计量的重组抗体或其他蛋白质的人工寡聚体。这是需要的，因为可以通过多聚化增加给定的蛋白质对其靶的结合亲和力，或因为某些生物学效果仅可以用某种寡聚化级别活性化合物获得(Crothers,D.M.和Metzger,H.(1972).Theinfluenceofpolyvalencyonthebindingpropertiesofantibodies.Immunochemistry,9,341–357)。另一个更新的述评描述了因优化的分子量，价态不仅对功能性亲和力，还对药代动力学的影响(DeyevS.M.和LebedenkoE.N.2008,BioEssays30:904–918)。
Shu和合作者已经生成GCN4亮氨酸拉链的变体，所述变体天然地是二聚体，但是在工程化形态下形成三聚体卷曲螺旋结构，并且使用它分析HIV-1蛋白gp41的三聚体装配物的性质(Chemistry.1999Apr27；38(17):5378-85)。
Wyzgol和合作者描述利用来自鸡蛋白质生腱蛋白的三聚化结构域(氨基酸110-139，UniProt条目：P10039.JImmunol2009；183:1851-1861)用于TNF受体超家族配体的人工三聚化。对于其实例中的某些，可以强烈地增强生物活性。
具有或没有基于T4噬菌体fibritin天然三聚化结构域的羧基端三聚化结构域的分泌型血凝素由Krammer和合作者表达(PLOSONE2012,第7卷,第8期,e43603)。他们显示该抗原通过这种三聚化而维持天然样结构并且由一些表位特异性抗体识别。
二聚体抗体或三聚体抗体的首个例子是双体抗体或三体抗体(Kortt和合作者综述于BiomolEng.2001Oct15；18(3):95-108中)。这些装配物基本上由scFv片段组成，其中结构域间接头缩短使得来自一个多肽的VH结构域不能与来自相同多肽的VL结构域形成有功能的Fv，而以链间方式形成有功能的Fv。
Plückthun和同事的早期评述总结了产生二聚或四聚scFv抗体片段融合物的不同方案(Immunotechnology3(1997)83–105)。这里，作者使用是卷曲螺旋亮氨酸拉链结构域或衍生自人p53肿瘤抑制蛋白的四聚化结构域的寡聚体结构域。还对通过所给定的结合结构域的多聚化增强结合强度给出了定量估计。为了在丝状噬菌体上产生抗体片段的双价展示，Lee和同事使相似的同型二聚的亮氨酸拉链。通过在Fab和M13基因-3小外壳蛋白C末端结构域之间插入由IgG1铰链区和同型二聚的GCN4亮氨酸拉链组成的二聚化结构域，首次实现双价展示。通过来自铰链区的二硫键获得两个拉链结构域的共价连接，并且将它展示在噬菌体上以筛选抗体文库(JImmunolMethods.2004Jan；284(1-2):119-32)。
Cuesta和合作者描述利用胶原蛋白XV或胶原蛋白XVIII的三聚化结构域产生三聚体scFv分子，命名为三聚抗体(trimerbody)(2012,mAbs4:2,226-232)。与相同特异性的单价scFv相比，三聚化构建体显示功能性亲和力增长几乎100倍。两种三聚化结构域形成非共价三聚体(Boudko等人,J.Mol.Biol.(2009)392,787–802，和Wirz等人,MatrixBiology30(2011)9–15)。
三聚体形式的配体或抗体对某种受体的结合可以具有胜过单体或二聚体模块(如IgG)的结合的明显优点。特别地，在靶细胞中诱导的三聚化后诱导凋亡的TNFR家族受体结合可能产生治疗益处。Allen和合作者基于四连蛋白C型凝集素结构域产生死亡受体4的结合物(MolCancerTher2012；11:2087-2095)。这种结合结构域通过获自相同四连蛋白的卷曲螺旋基序三聚化。这种蛋白质形成非共价同型三聚体。这些三聚体分子之一在表达DR4的细胞中诱导凋亡，类似于天然三聚体TRAIL配体。这个新类别的分子由作者命名为atrimer(MolCancerTher2012；11:2087-2095)。
使用衍生自人转录因子ATFα或CREBPa的多聚化结构域，将抗ICAM-1抗体的Fab片段装配成二聚体、三聚体或四聚体形式(Charles等人,JournalofImmunologicalMethods284(2004)119–132)。这里所用的寡聚化结构域均共享卷曲螺旋基序，并且在不形成共价寡聚体的情况下装配。这些蛋白质成功地在体外阻断鼻病毒感染，效率从单体至二聚体、三聚体和四聚体渐增。
所谓“肽体(peptabody)由Terskikh和同事生成(ProcNatlAcadSciUSA.1997Mar4；94(5):1663-8)。短肽配体经由半刚性铰链区与软骨寡聚体基质蛋白(COMP)的卷曲螺旋装配结构域融合，产生五聚体多价结合分子。
通过古细菌RNA结合蛋白Sm1的七聚化结构域经柔性铰链肽生成来自蛋白质Z的结合结构域的七聚化(Kim等人,PLoSOne.2012；7(8):e43077)。表面等离子体共振(SPR)分析显示七聚抗EGFR和抗HER2结合物均对其靶受体具有显著增强的结合强度，相对于单体配体增长接近100倍至1000倍。
产生多价态的另一个方案由Li等人描述并命名为“化学自装配抗体纳米环(CSANs”(J.AM.CHEM.SOC.2010,132,17247–17257)。作者如此设计其从而每个纳米环亚基由多个大肠杆菌DHFR的人工二聚体组成，所述大肠杆菌DHFR的人工二聚体装配成环样结构当添加二聚体形式的甲氨蝶呤(命名为：MTX2-C9)时。
就工程化抗体的新应用而言，双特异性抗体展示独特的机会。但是，设计理想的双特异性抗体仍是一项挑战。
Fick和合作者给出了生产不同双特异性试剂的总结，所述双特异性试剂包含与生腱蛋白的三聚化结构域融合的scFv片段，所述生腱蛋白的三聚化结构域与TNF家族的配体融合(PatrickChames(编著)，AntibodyEngineering:MethodsandProtocols,第2版,MethodsinMolecularBiology,第907卷,597-609)。三聚化由天然存在的链间二硫键稳定化。这些分子可用于靶向方法其中活性三聚体凋亡诱导物借助scFv片段的抗肿瘤结合能力递送至肿瘤细胞。
Stone和合作者了描述新双特异性抗体模型，其中5个单结构域抗体(sdAb)经接头序列与vero细胞毒素B(VTB)亚基(五聚化结构域)的N末端融合，并且5个sdAb经接头序列与VTBC末端融合(JournalofImmunologicalMethods,(2007)318(1-2)第88-94页)。构建并且表征了这类十价双特异性分子的几种，称作decabody。尽管是有意义的概念，但这些些分子的物理-化学特性仍待优化。
Kashentseva和合作者使用噬菌体T4的fibritin结构域产生应当使腺病毒重定向至肿瘤细胞的双特异性三聚体融合蛋白(CancerResJanuary15,200262；609)。
本文中提供包含衍生自人软骨基质蛋白的三聚化结构域的新三聚体抗原结合分子。由于该三聚化结构域衍生自人源蛋白质，与具有非人源的聚合结构域的分子相比，三聚体抗原结合分子具有较低的免疫原性可能性。此外，衍生自人软骨基质蛋白的三聚化结构域通过天然存在的二硫键三聚化成卷曲螺旋结构，所述卷曲螺旋结构导致可以单特异性形式和以双特异性形式使用的稳定的三聚体抗原结合分子。
发明简述
在第一方面本发明提供包含三个融合多肽的三聚体抗原结合分子，每个融合多肽包含与衍生自人软骨基质蛋白(CMP，SEQIDNO:1)的三聚化结构域融合的至少一个抗原结合部分，其中所述三聚化结构域能够介导三聚体抗原结合分子的稳定缔合。
在一个实施方案中，三聚体抗原结合分子的三聚化结构域包含与SEQIDNO:2具有至少95％同一性的序列。在一个实施方案中，三聚体抗原结合分子的三聚化结构域包含SEQIDNO:2的序列。
在一个实施方案中，三聚体抗原结合分子的三个融合多肽由二硫键连接。在一个实施方案中，抗原结合部分是抗体或抗体片段。在一个实施方案中，抗原结合部分是选自Fab分子、交叉Fab分子、单链Fab分子、Fv分子、scFv分子和单结构域抗体的抗体片段。
在一个实施方案中，三聚体抗原结合分子的三个融合多肽各自包含一个抗原结合部分。在一个实施方案中，所述抗原结合部分是Fab分子。在一个实施方案中，其中所述Fab分子在Fab重链的C末端氨基酸与所述三聚化结构域的N末端氨基酸融合，任选地通过肽接头融合。在一个实施方案中，抗原结合部分能够与细胞表面抗原特异性结合。在一个实施方案中，所述细胞表面抗原是肿瘤细胞抗原。
在一个实施方案中，三聚体抗原结合分子的三个融合多肽各自包含两个抗原结合部分。在这样一个实施方案中，第一抗原结合部分与所述三聚化结构域的N末端氨基酸融合，任选地通过肽接头融合，并且第二抗原结合部分与所述三聚化结构域的C末端氨基酸融合，任选地通过肽接头融合。
在一个实施方案中，所述第一抗原结合部分是Fab分子并且所述第二抗原结合部分是scFv分子或交叉Fab分子。
在一个实施方案中，所述第一抗原结合部分是Fab分子，所述Fab分子在Fab重链的N末端氨基酸与所述三聚化结构域的C末端氨基酸融合，任选地通过肽接头融合。
在一个实施方案中，所述第一或第二抗原结合部分能够与细胞表面抗原特异性结合。
在一个实施方案中，所述第一或第二抗原结合部分能够与半抗原特异性结合。
在一个实施方案中，提供三聚体抗原结合分子，其基本上由三个融合多肽组成，所述三个融合多肽各自由与所述三聚化结构域融合、任选地通过肽接头与之融合的抗原结合部分组成。
在一个实施方案中，提供三聚体抗原结合分子，其基本上由三个融合多肽组成，所述三个融合多肽各自由与所述三聚化结构域融合、任选地通过肽接头与之融合的第一和第二抗原结合部分组成。
在一个实施方案中，以上任一实施方案的所述三个融合多肽是相同的。
在一个实施方案中，提供融合多肽，其包含与衍生自人软骨基质蛋白(CMP，SEQIDNO:1)的三聚化结构域融合的抗原结合部分，其中所述三聚化结构域能够介导所述融合多肽与两个其他这类融合多肽的稳定缔合。
根据本发明的另一个方面，提供分离的多核苷酸，其编码本发明的三聚体抗原结合分子或其片段。本发明还涵盖由本发明多核苷酸编码的多肽。本发明还提供包含本发明的分离多核苷酸的表达载体，和包含本发明的分离多核苷酸或表达载体的宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是真核细胞，尤其哺乳动物细胞。
在另一个方面，提供产生本发明的三聚体抗原结合分子的方法，所述方法包括步骤a)在适于表达三聚体抗原结合分子的条件下培养本发明的宿主细胞和b)回收三聚体抗原结合分子。本发明还涵盖通过本发明方法产生的三聚体抗原结合分子。
本发明还提供包含本发明的三聚体抗原结合分子和可药用载体的药物组合物。
本发明还涵盖了使用本发明的三聚体抗原结合分子和药物组合物的方法。在一个方面，本发明提供用作药物的本发明的三聚体抗原结合分子或药物组合物。在一个方面提供根据用于治疗有需求的对象中的疾病的本发明的三聚体抗原结合分子或药物组合物。在具体实施方案中，疾病是癌症。
还提供本发明的三聚体抗原结合分子用于制造用于治疗有需求的个体中疾病的药物的用途；以及在治疗个体中疾病的方法中的用途，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含处于可药用形式的本发明三聚体抗原结合分子。在具体实施方案中，疾病是癌症。在以上实施方案的任一者中，个体优选地是哺乳动物，尤其是人。
附图简述
图1：a)如通过与CMP肽结合的Fab臂所例举的三聚体单特异性抗原结合分子的示意图；b)如通过处于CrossMab形式的Fab片段与Fab-CMP融合物融合所例举的双特异性六价抗原结合分子的示意图。
图2：SDS-PAGE。a)三聚化的huCMP抗DR5(5E11)Fab，b)三聚化的huCMP抗DR5(2A11)Fab。1：分子量标记物；2：非还原样品；3：还原样品。
图3：CE-SDS分析。作为三聚化的huCMP抗DR5(5E11)Fab和三聚化的huCMP抗DR5(2A11)的SDS-Page所显示的电泳图。
图4：TagLite。在过量表达DR5的靶细胞上比较三聚化的抗DR5Fab5E11与双价IgG形式下相同结合物的竞争。将荧光标记的5E11IgG添加至细胞，并且滴定未标记的二聚体(IgG)或三聚体5E11抗体以竞争荧光信号。三聚体构建体在低于IgG构建体约10倍的浓度显示50％竞争。
图5：对MDA-MB-231乳腺癌细胞诱导凋亡，如通过细胞死亡检测ELISA中的DNA片段化所测定。该测定法在不存在或存在表达FAP的成纤维细胞(GM05389)下就三聚体分子的超交联进行。
发明详述
定义
除非下文中另外定义，否则术语如本领域通常所用那样在本文使用。
如本文所用，术语“抗原结合分子”在其最广意义上指特异性结合抗原决定簇的分子。抗原结合分子的例子是免疫球蛋白和衍生物，例如其片段。
术语“CMP”或“软骨基质蛋白”指也称作matrilin-1的蛋白质。MATN1同义词例如Uniprot条目P21941中所述的CMP、CRTM。
术语“CMP三聚化结构域”或“衍生自人软骨基质蛋白(CMP)的三聚化结构域”在本文中互换使用并且指能够与两个相似或相同多肽缔合以形成稳定三聚体的多肽结构。三聚化由多肽链的毗邻带电荷氨基酸之间形成的离子键和其他非共价键介导。CMP三聚化结构域已经例如在Beck等人,J.Mol.Biol.(1996)256,909–923中描述。本文中可用的CMP三聚化结构域已经衍生自人软骨蛋白(SEQIDNo.1)并且在一个实施方案中包含与SEQIDNO2具有至少95％同一性和最优选地至少98％同一性的序列。在一个实施方案中，所述三聚化结构域包含SEQIDNO.2的序列。
如本文所用，术语“单特异性”抗体指具有一个或多个结合位点的抗体，所述位点的每一个与相同抗原的相同表位结合。本发明的三聚体抗原结合分子通常是单特异性的，但也可以是双特异性的。
术语“双特异性”意指抗原结合分子能够与至少两个不同的抗原决定簇特异性结合。一般，双特异性抗原结合分子包含两个抗原结合位点，每个抗原结合位点对不同的抗原决定簇特异。在某些实施方案中，双特异性抗原结合分子能够同时结合两个抗原决定簇，尤其两种不同细胞上表达的两个抗原决定簇。本发明的三聚体抗原结合分子可以是双特异的。
如本申请中所用，术语“价”指抗体分子中存在指定数目的结合位点。就这一点而论，术语“双价”、“四价”和“六价”指抗体分子中分别存在两个结合位点、4个结合位点和六个结合位点。根据本发明的三聚体抗原结合分子是至少“三价的”和可以是“六价的”。
“抗原结合位点”指位点，即抗原结合分子中提供与抗原相互作用的一个或多个氨基酸残基。例如，抗体的抗原结合位点包含来自互补决定区(CDR)的氨基酸残基。天然免疫球蛋白分子通常具有两个抗原结合位点，Fab分子通常具有单个抗原结合位点。
如本文所用，术语“抗原结合部分”指与抗原决定簇特异性结合的多肽分子。在一个实施方案中抗原结合部分能够通过其靶抗原激活信号传导。在一个实施方案中，抗原结合部分能够将与之附着的实体(例如第二抗原结合部分)引向靶部位，例如引向携带抗原决定簇的特定类型的肿瘤细胞或肿瘤基质。抗原结合部分包含抗体及其片段如本文进一步限定。此外，抗原结合部分包括结合结构域，所述结合结构域是基于设计的重复蛋白或设计的重复结构域(参见例如WO2002/020565)。
如本文所用，术语“抗原决定簇”同义于“抗原”和“表位”并且指多肽大分子上与抗原结合部分结合，形成抗原结合部分-抗原复合物的位点(例如一段连续氨基酸或由不同区域的不连续氨基酸构成的构象构型)。可用的抗原决定簇可以存在于例如肿瘤细胞表面上、病毒感染的细胞表面上、其他患病的细胞表面上、免疫细胞表面上找到、游离于血清中，和/或在胞外基质(ECM)中。可用作本文的抗原的蛋白质可以是来自任何脊椎动物来源的任何天然形式的蛋白质，包括哺乳动物如灵长类(例如人)和啮齿类(例如小鼠和大鼠)，除非另外说明。在特别实施方案中，抗原是人蛋白质。在提到本文中具体蛋白质的情况下，本术语涵盖“全长”、未加工的蛋白质以及因细胞中加工产生的任何形式的蛋白质。本术语还涵盖天然存在的蛋白质变体，例如，剪接变体或等位变体。
“特异性结合”意指结合对抗原具有选择性并且可以与不想要的或非特异性的相互作用区别。抗原结合部分与特定抗原决定簇结合的能力可以通过酶联免疫吸附测定(ELISA)或本领域技术人员熟悉的其他技术，例如表面等离子体共振(SPR)技术(在BIAcore仪上分析)(Liljeblad等人,GlycoJ17,323-329(2000))和常规结合测定法(Heeley，EndocrRes28,217-229(2002))测量。在一个实施方案中，抗原结合部分与不相关蛋白质结合的程度少于抗原结合部分与抗原结合的程度约10％，如通过SPR测量。在某些实施方案中，与抗原结合的抗原结合部分或包含该抗原结合部分的抗原结合分子具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10-8M或更少，例如从10-8M至10-13M，例如，从10-9M至10-13M)的解离常数(KD)。
“亲和力”指分子(例如，受体)的单一结合位点及其结合配偶物(例如，配体)之间非共价相互作用的强度总和。除非另外指出，否则如本文所用，“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如，抗原结合部分和抗原，或受体和其配体)之间1:1相互作用的固有结合亲和力。分子X对其配偶物Y的亲和力可以通常由解离常数(KD)代表，解离常数是解离速率常数和缔合速率常数(分别是koff和kon)的比例。因此，等同亲和力可以包含不同的速率常数，只要速率常数的比例保持相同。亲和力可以由本领域已知的既定方法测量，包括本文所述的那些方法。用于测量亲和力的具体方法是表面等离子体共振法(SPR)。
“减少的结合”，例如减少的Fc受体结合，指相应相互作用的亲和力下降，如通过例如SPR测量。为清晰起见，该术语还包括亲和力减少到零(或低于分析方法的检测限)，即相互作用完全消除。相反，“增加的结合”指相应相互作用的结合亲和力增加。
如本文所用，“靶细胞抗原”指呈递在靶细胞(例如肿瘤中的细胞，如癌细胞或肿瘤基质的细胞)表面上的抗原决定簇。
如本文所用，当每种类型的部分多于一个时，对于抗原结合部分等而言，使用术语“第一和第二”以便于区分。除非明确地如此陈述，否则使用这些术语不意在赋予三聚体抗原结合分子的具体顺序或定向。
“Fab分子”或“Fab片段”指由免疫球蛋白重链(“Fab重链”)的VH结构域和CH1结构域及轻链(“Fab轻链”)的VL结构域和CL结构域组成的蛋白质。
“融合的”或“连接的”意指组分(例如Fab分子和CMP三聚化结构域)直接或经由一个或多个肽接头由肽键连接。
术语“免疫球蛋白分子”指具有天然存在抗体的结构的蛋白质。例如，IgG类免疫球蛋白是由二硫键结合的两条轻链和两条重链组成的约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白。从N末端至C末端，每条重链具有可变区(VH)，也称作可变重结构域或重链可变结构域，随后是三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)，也称作重链恒定区。类似地，从N末端至C末端，每条轻链具有可变区(VL)，也称作可变轻结构域或轻链可变结构域，随后是恒定轻(CL)结构域，也称作轻链恒定区。免疫球蛋白的重链可以归属5个类型之一，称作α(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)或μ(IgM)，其中一些类型可以划分成亚型，例如γ1(IgG1)、γ2(IgG2)、γ3(IgG3)、γ4(IgG4)、α1(IgA1)和α2(IgA2)。免疫球蛋白的轻链可以基于其恒定结构域的氨基酸序列而划分成两种类型之一，称作κ(κ)和λ(λ)。免疫球蛋白基本上由经由免疫球蛋白铰链区连接的两个Fab分子和Fc结构域组成。
术语“抗体”在本文中以最广意义使用并且涵盖多种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体和抗体片段，只要它们显示出所需的抗原结合活性。
“抗体片段”指不是完整抗体的分子，所述分子包括完整抗体的一部分，该部分结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')2、双体抗体、线性抗体、单链抗体分子(例如scFv)和单一结构域抗体。关于某些抗体片段的综述，参见Hudson等人,NatMed9,129-134(2003)。关于scFv片段的综述，参见例如Plückthun,引自ThePharmacologyofMonoclonalAntibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编著,Springer-Verlag,NewYork,第269-315页(1994)；还参见WO93/16185；和美国专利号5,571,894和5,587,458。关于包含救援受体结合表位残基和具有增加的体内半寿期的Fab和F(ab')2片段的讨论，见美国专利号5,869,046。双体抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，所述两个抗原结合位点可以是双价或双特异性的。参见例如，EP404,097；WO1993/01161；Hudson等人,NatMed9,129-134(2003)；和Hollinger等人,ProcNatlAcadSciUSA90,6444-6448(1993)。三体抗体和四体抗体还在Hudson等人,NatMed9,129-134(2003)中描述。单结构域抗体是包含抗体的全部或一部分重链可变结构域或全部或一部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施方案中，单结构域抗体是人单结构域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,MA；参见例如美国专利号6,248,516B1)。可以通过多种技术产生抗体片段，所述多种技术包括但不限于蛋白酶解消化完整抗体以及由重组宿主细胞产生(例如，大肠杆菌或噬菌体)，如本文所述。
术语“抗原结合结构域”指抗体的部分，所述部分包含与抗原的部分或全部特异性结合并且与之互补的区域。抗原结合结构域可以由例如一个或多个抗体可变结构域(也称作抗体可变区)提供。特别地，抗原结合结构域包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。
术语“可变区”或“可变结构域”指抗体重链或轻链的参与抗体结合至抗原的结构域。天然抗体重链和轻链的可变结构域(分别是VH和VL)通常具有相似的结构，每种结构域包含四个保守的框架区(FR)和三个高变区(HVR)。参见，例如，Kindt等人，KubyImmunology，第6版，W.H.Freeman和Co.，第91页(2007)。单个VH结构域或VL结构域可足以赋予抗原结合特异性。
如本文中使用的，术语“超变区”或“HVR”指抗体可变结构域中序列高度变化和/或形成结构确定的环(“超变环”)的每个区域。通常，天然4链抗体包含六个HVR；VH中三个(H1、H2、H3)和VL中三个(L1、L2、L3)。HVR通常包含来自高变环和/或来自互补决定区(CDR)的氨基酸残基，后者具有最高序列变异性和/或参与抗原识别。除了VH中的CDR1外，CDR通常包含形成高变环的氨基酸残基。高变区(HVR)也称作“互补决定区”(CDR)，并且指向可变区的形成抗原结合区的部分时，这些术语在本文中可互换地使用。这种特定区域已经由描述Kabat等人,美国卫生和公众服务部(U.S.Dept.ofHealthandHumanServices)，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest(1983)并且由Chothia等人,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)描述，其中所述定义包括彼此比较时氨基酸残基的重叠或子集。然而，谈及抗体或其变体的CDR的任一个定义的应用意在处于如本文中定义和使用的术语范围内。涵盖如上文所引用的每篇参考文献所定义的CDR的适宜的氨基酸残基在下文表A中示出作为对比。涵盖特定CDR的确切残基数目将根据该CDR的序列和大小变动。根据抗体的可变区氨基酸序列，本领域技术人员可以常规地确定哪种残基包含特定CDR。
表A.CDR定义1
CDR Kabat Chothia
VH CDR1 31-35 26-32
VH CDR2 50-65 52-58
VH CDR3 95-102 95-102
VL CDR1 24-34 26-32
VL CDR2 50-56 50-52
VL CDR3 89-97 91-96
1根据Kabat等人(见下文)所述的编号惯例对表A中全部CDR定义编号
Kabat等人还定义了适用于任何抗体的可变区序列编号体系。本领域普通技术人员可以毫无疑义地将这种Kabat编号体系应用至任何可变区序列，不依赖于除序列本身之外的任何实验数据。如本文所用，“Kabat编号”指Kabat等人,美国卫生和公众服务部(U.S.Dept.ofHealthandHumanServices)，"SequencesofProteinsofImmunologicalInterest(目的免疫蛋白质的序列)"(1983)所述的编号体系。除非另外说明，否则根据Kabat编号体系提及抗体可变区中特定氨基酸残基位置的编号。
没有根据Kabat编号系统对序列表的多肽序列编号。然而，将序列表的序列的编号转化成Kabat编号完全处于本领域普通技术人员的能力范围内。
“框架”或“FR”指除高变区(HVR)之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由以下4个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR序列和FR序列通常按以下序列出现在VH(或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
如本文所用，术语“工程化、工程化的、工程化”视为包含对肽主链的任何操作或对天然存在的或重组的多肽或其片段的翻译后修饰。工程化包括修饰氨基酸序列、糖基化模式或个别氨基酸的侧链基团，以及这些方案的组合。
如本文所用的术语“氨基酸突变”意在涵盖氨基酸置换、缺失、插入和修饰。可以进行置换，缺失，插入，和修饰的任何组合以达到最终构建体，前提是最终构建体拥有所需的特征，例如，三聚体抗原结合分子的增加的稳定性。氨基酸序列缺失和插入包括氨基端和/或羧基端缺失及插入氨基酸。特定的氨基酸突变是氨基酸置换。出于改变的目的，例如三聚体抗原结合分子的稳定性，非保守性氨基酸置换，即用具有不同结构和/或化学特性的另一种氨基酸替换一个氨基酸，是特别优选的。氨基酸置换包括由非天然存在的氨基酸替换或由20种标准氨基酸的天然存在的氨基酸衍生物(例如4-羟脯氨酸、3-甲基组氨酸、鸟氨酸、高丝氨酸、5-羟赖氨酸)替换。可以使用本领域熟知的遗传方法或化学方法产生氨基酸突变。遗传方法可以包括位点定向诱变、PCR、基因合成等。构思了也可以使用通过除基因工程之外的方法(如化学修饰法)改变氨基酸侧链基团的方法。多种名称可以在本文中用来指示相同的氨基酸突变。
如本文所用，术语“多肽”指由酰胺键(也称作肽键)线性连接的单体(氨基酸)组成的分子。术语“多肽”指两个或更多个氨基酸的任何链，并且不指产物的特定长度。因此，在“多肽”的定义内包含肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”或用来指具有两个或更多个氨基酸的链的任何其他术语，并且可以使用术语“多肽”替代这些术语的任一个或与之互换使用。术语“多肽”还意在指该多肽的表达后修饰的产物、所述表达后修饰包括而不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护基团/封闭基团衍生化、蛋白酶剪切、或由非天然存在的氨基酸修饰。多肽可以衍生自天然生物来源或通过重组技术产生，但是不必然地从所指定的核酸序列翻译而来。它可以按任何方式产生，包括通过化学合成产生。本发明多肽可以具有约3个或更多个、5个或更多个、10个或更多个、20个或更多个、25个或更多个、50个或更多个、75个或更多个、100个或更多个、200个或更多个、500个或更多个、1,000个或更多个、或2,000个或更多个氨基酸的大小。多肽可以具有确定的三维结构，尽管它们并不必然地具有这种结构。将具有确定三维结构的多肽称作折叠的，并且将不具备确定三维结构，但是反而可以采取众多不同构象的多肽称作解折叠的。
如本文所用的“融合多肽”指由至少一个与CMP三聚化结构域融合的抗原结合部分组成的多肽。该融合可以通过将抗原结合部分的N或C末端氨基酸经肽键直接连接至CMP三聚化结构域的C或N末端氨基酸而发生。在其他实施方案中，可以通过肽接头实现融合。
“分离”的多肽或变体或其衍生物意指不处于其天然环境的多肽。不要求特定水平的纯化。例如，分离的多肽可以从其天生或天然环境取出。出于本发明的目的，将宿主细胞中表达的重组产生的多肽和蛋白质视为分离的，已经通过任何合适技术分离、分级或部分或基本上纯化的天然或重组多肽也是如此。
相对于参考多肽序列，将“氨基酸序列同一性百分数(％)”定义为比对序列并根据需要引入空位以实现最大序列同源性百分数并且不考虑任何保守性置换作为序列同一性的部分之后，候选序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分数。为了确定氨基酸序列同一性百分数的比对可以按本领域能力范围内的多种方式实现，例如，使用可公开获得的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN、SAWI或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适宜参数，包括为实现正在比较的全长序列范围内最大比对所需要的任何算法。然而，出于本文目的，使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生氨基酸序列同一性％值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech,Inc.授权，并且源代码已经随用户文档提交至华盛顿特区20559的美国版权局，在那里它以美国版权登记号TXU510087登记。ALIGN-2程序从Genentech,Inc.,SouthSanFrancisco,加利福尼亚州可公开获得或可以从源代码汇编。应当将ALIGN-2程序汇编在UNIX操作系统(包括数字式UNIXV4.0D)上使用。全部序列比较参数由ALIGN-2程序设定并且不变动。在使用ALIGN-2比较氨基酸序列的情况下，如下计算给定氨基酸序列A与给定氨基酸序列B、同给定氨基酸序列B或针对给定氨基酸序列B(这可以备选地描述为与给定氨基酸序列B、同给定氨基酸序列B或针对给定氨基酸序列B具有或包含某个氨基酸序列同一性％的给定氨基酸序列A)的氨基酸序列同一性％：
100乘以分数X/Y
在X是由序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对结果中评定为相同匹配的氨基酸残基的数目，并且其中Y是B中氨基酸残基的总数。将可以理解在氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度时，A相对于B的氨基酸序列同一性％将不等于B相对于A的氨基酸序列同一性％。除非另外特别声明，否则本文所用的全部氨基酸序列同一性值％如紧接前段中所述那样使用ALIGN-2计算机程序获得。
术语“多核苷酸”指分离的核酸分子或构建体，例如信使RNA(mRNA)、病毒衍生的RNA或质粒DNA(pDNA)。多核苷酸可以包含常规磷酸二酯键或非常规键(例如酰胺键，如肽核酸(PNA)中存在那样。术语“核酸分子”指多核苷酸中存在的任一个或多个核酸区段，例如DNA或RNA片段。
“分离”的核酸分子或多核苷酸意指已经从其天然环境取出的核酸分子、DNA或RNA。例如，出于本发明目的，将载体中所含的编码多肽的重组多核苷酸视为分离的。分离的多核苷酸的其他例子包括在异源宿主细胞中维持的重组多核苷酸或溶液中(部分或基本上)纯化的多核苷酸。分离的多核苷酸包括含于细胞内的多核苷酸分子，所述细胞通常含有该多核苷酸分子，但是该多核苷酸分子存在于染色体外或与其天然染色体位置不同的染色体位置处。分离的RNA分子包括本发明的体内或体外RNA转录物，以及正链和负链形式，和双链形式。本发明的分离的多核苷酸或核酸还包括合成产生的这类分子。此外，多核苷酸或核酸可以是或可以包含调节元件如启动子、核糖体结合位点或转录终止子。
就核酸或多核苷酸具有与本发明的参考核苷酸序列至少例如95％“相同”的核苷酸序列而言，它意指除了该多核苷酸序列可以包括参考核苷酸序列的每100个核苷酸至多5个点突变之外，该多核苷酸的核苷酸序列与参考序列相同。换而言之，为了获得具有与参考核苷酸序列至少95％相同的核苷酸序列的多核苷酸，可以将参考序列中至多5％的核苷酸缺失或用另一个核苷酸置换，或可以将参考序列中多个核苷酸直至5％的总核苷酸插入参考序列中。参考序列的这些改变可以在参考核苷酸序列的5’或3’端位置出现或在这些末端位置之间任何位置出现，个别间插在参考序列中的残基之间或间插在参考序列内部的一个或多个连续群组中。实际来看，可以常规地使用已知的计算机程序，如上文对多肽讨论的那种(例如ALIGN-2)，确定任何特定多核苷酸序列是否与本发明的核苷酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
如本文中所用，术语“表达盒”指重组或合成地产生的多核苷酸，其具有一系列允许特定核酸在靶细胞中转录的指定核酸元件。重组表达盒可以并入质粒、染色体、线粒体DNA、质体DNA、病毒或核酸片段。一般而言，表达载体的重组表达盒部分包括待转录的核酸序列和启动子，连同其他序列。在某些实施方案中，本发明的表达盒包含编码本发明的双特异性抗原结合分子或其片段的多核苷酸序列。
术语“载体”或“表达载体”同义于“表达构建体”并且指用来在靶细胞中引入与之有效结合的特定基因并指导其表达的DNA分子。该术语包括作为自我复制型核酸结构的载体以及并入已经将该载体引入其中的宿主细胞的基因组内的载体。本发明的表达载体包含表达盒。表达载体允许转录大量的稳定mRNA。一旦表达载体处靶细胞内部，通过细胞转录和/或翻译装置产生基因编码的核糖核酸分子或蛋白质。在一个实施方案中，本发明的表达载体包含表达盒，所述表达盒包含编码本发明的双特异性抗原结合分子或其片段的多核苷酸序列。
术语“”宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”互换使用并且指已经向其中引入外源核酸的细胞，包括这类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，其包括原代转化细胞和从其衍生的后代，而无论传代次数是多少。后代可以在核酸内含方面不与亲本细胞完全相同，反而可以含有突变。本文包括具有与最初转化的细胞中所筛选或选择的相同功能或生物活性的突变后代。宿主细胞是可以用来产生本发明的双特异性抗原结合分子的任何类型的细胞系统。宿主细胞包括培养的细胞、例如培养的哺乳动物细胞、如CHO细胞、BHK细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、YO骨髓瘤细胞、P3X63小鼠骨髓瘤细胞、PER细胞、PER.C6细胞或杂交瘤细胞、酵母细胞、昆虫细胞和植物细胞、仅提到数种、还包括了含于转基因动物、转基因植物或培养的植物组织或动物组织内部的细胞。
活性剂的“有效量”指在对其施用该药物的细胞或组织中产生生理变化所需的量。
活性剂(例如，药物组合物)的“治疗有效量”指在必要的剂量和时间段下，有效实现所需治疗性或预防性结果的量。活性剂的治疗有效量例如消除、减少、延迟、最小化或防止疾病的不良作用。
“个体”或“对象”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯化动物(例如，奶牛、羊、猫、犬和马)、灵长类(例如，人和非人灵长类如猴)、兔和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)。特别地，个体或对象是人。
术语“药物组合物”指一种制备物，所述制备物处于这类形式从而允许其中所含的有效成分的生物活性有效，并且不含有对于将会施用该制剂的对象不可接受地有毒的额外组分。
“可药用载体”指药物组合物中除有效成分之外的对对象无毒的成分。可药用载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
如本文所用，“治疗”(和其语法变型如“治疗”或“治疗”)指意欲改变正在接受治疗的个体中疾病之天然过程的临床介入，并且可以旨在预防或在临床病理学过程期间实施。想要的治疗效果包括，但不限于防止疾病出现或复发、减轻症状、减小疾病的任何直接或间接病理学后果、防止转移、降低病情进展速率、改善或缓和疾病状态，以及缓解或预后改善。在一些实施方案中，本发明的三聚体结合分子用来延缓疾病发展或用来减慢疾病的进展。
术语“包装说明书”用来指治疗产品的商业包装中习惯性包括的说明书，所述说明书含有关于适应症、用法、剂量、施用、联合疗法、禁忌症和/或涉及此类治疗产品用途之警告的信息。
实施方案的详述
本发明的目的提供包含至少三个抗原结合部分的新的三聚体抗原结合分子。
本发明涉及包含三个融合多肽的三聚体抗原结合分子，每个融合多肽包含与衍生自人软骨基质蛋白(CMP，SEQIDNO:1)的三聚化结构域融合的至少一个抗原结合部分，其中所述三聚化结构域能够介导三聚体抗原结合分子的稳定缔合。这三个融合多肽通过离子键和其他非共价键彼此结合并且因此形成具有至少三个抗原结合部分的三聚体分子。三聚化后，融合多肽形成稳定的卷曲螺旋结构，所述卷曲螺旋结构向三聚体抗原结合分子提供稳定性。
在本发明的一个实施方案中，三个毗邻的融合多肽经由三聚化结构域之间的链间二硫键与三聚体缔合。在本申请的背景下，术语“链间二硫键”意指两个融合多肽通过融合多肽的氨基酸序列中两个半胱氨酸残基之间形成的二硫键彼此连接。因此，三聚体抗原结合分子的三个融合多肽形成三个二硫键，每个键连接两个三聚化结构域。这类链间二硫键通常天然存在在于衍生自人软骨基质蛋白的三聚化结构域中，或可以将它们备选地或额外地引入三聚体结合分子。可以通过在衍生自人软骨基质蛋白的三聚化结构域的氨基酸序列N末端和/或C末端处添加半胱氨酸、优选地添加至N末端，产生额外的二硫键。也可以通过用半胱氨酸置换三聚化结构域中的一个或多个氨基酸残基引入额外的二硫键。额外的二硫键可以导致三聚体结合分子的增加的稳定性。
衍生自人软骨基质蛋白(CMP)的三聚化结构域包含SEQIDNO.:1的至少一部分。在一个实施方案中，三聚化结构域包含与SEQIDNO.:2具有至少95％同一性和最优选地至少98％同一性的序列。在一个实施方案中，所述三聚化结构域包含SEQIDNO.:2的序列。其中衍生自人软骨基质蛋白(CMP)的三聚化结构域进一步又称作“CMP三聚化结构域”。
在本发明的一个实施方案中，CMP三聚化结构域包含来自Uniprot条目P21941的人CMP的氨基酸454至496。在另一个实施方案中，CMP三聚化结构域衍生自选自普通狨(Callithrixjacchus)(参考：XP_002750612,1)、猕猴(Macacamulatta)(参考：XP_001094970.1)和小家鼠(Musmusculus)(基因ID：17180Matn1)群组的软骨基质蛋白。
在一个实施方案中，融合多肽各自包含与CMP三聚化结构域融合的一个抗原结合部分。三个融合多肽的三聚化导致装配成具有三个抗原结合部分的三聚体抗原结合分子。三聚体抗原结合分子因此是三价抗原结合分子。在一个实施方案中，三个抗原结合部分各自对相同的抗原特异，即三聚体抗原结合分子是单特异的和三价的。
由于每个三聚体抗原结合分子中存在三个抗原结合部分，每个抗原结合部分对其靶的协同亲和力增加。
因此，与基于常规双价IgG的抗体相比，三聚体抗原结合分子以更高亲合力与抗原结合。因此，与基于常规IgG的抗体相比，三聚体结合分子将在更低的浓度有效地结合。这种允许使用广泛类型的抗原结合部分，包括对抗原具有低亲和力的抗原结合部分。此外，抗原结合部分对其靶的多聚体结合还可以导致增强的信号传导。重组抗体至多价形式的转换通过降低从细胞表面解离的速率潜在地优化生物分布。
小尺寸抗体片段，例如，约25kDa大小的scFv，对于其中需要长血清半寿期的应用并非最佳，因为它们显示相对快的肾清除率。清除蛋白质分子的半寿期时间与蛋白质分子的大小相关；肾小球过滤的阈值估计是60–65kDa(在Trejtnar等人,2002,QJNuclMed46:181–194中综述)。这类小结构域的寡聚化可以因此增加质量高于肾小球过滤的临界阈值并因此增加血清半寿期。
在一个实施方案中，三聚体抗原结合分子的抗原结合部分能够与细胞表面抗原特异性结合。在一个实施方案中，所述细胞表面抗原是肿瘤细胞抗原。
在一个实施方案中，融合多肽各自包含与CMP三聚化结构域融合的两个抗原结合部分。在一个实施方案中，三聚体抗原结合分子包含三个融合多肽，其中第一抗原结合部分与CMP三聚化结构域的N末端融合并且第二抗原结合部分与CMP三聚化结构域的C末端融合。三个融合多肽的三聚化导致装配成在每个末端上具有三个抗原结合部分的三聚体抗原结合分子。三聚体抗原结合分子因此是六价抗原结合分子。在一个实施方案中，与N末端融合的三个抗原结合部分各自对相同的抗原特异，并且与C末端融合的三个抗原结合部分各自对另一种不同抗原特异；即三聚体抗原结合分子是双特异的并且对每种特异性是三价的。如上文概述的，三价态导致每个抗原结合部分的协同亲和力，导致三聚体抗原结合分子的增加的亲合力。因此，与基于常规IgG的双特异性抗体相比，双特异性三聚体抗原分子以高亲和力均与两种抗原结合。
在一个实施方案中，双特异性三聚体抗原结合分子能够以第一抗原结合部分与第一细胞表面抗原结合并且能够以第二抗原结合部分与第二种不同细胞表面抗原结合。在一个实施方案中细胞表面抗原中的至少一个是肿瘤细胞抗原。在一个实施方案中，双特异性三聚体抗原结合分子能够以第一抗原结合部分与细胞表面抗原结合并且能够以第二抗原结合部分与半抗原结合。因此，双特异性三聚体抗原结合分子能够将与第二抗原结合部分结合的半抗原指引至靶部位，例如指引至特定类型的肿瘤细胞或携带抗原决定簇的肿瘤基质。半抗原可以经荧光标记或另外标记以允许跟踪双特异性三聚体抗原结合分子至靶细胞。因此，双特异性三聚体抗原结合分子可以用来在体外和在体内诊断或鉴定肿瘤细胞。
可用于此背景中的半抗原是洋地黄毒苷(DIG)、生物素或二硝基酚。
本发明的三聚体抗原结合分子包含三个融合多肽，每个融合多肽包含与衍生自人软骨基质蛋白的三聚化结构域融合的至少一个抗原结合部分。融合可以是三聚化结构域和(一个或多个)抗原结合部分之间的直接键，或三聚化结构域和(一个或多个)抗原结合部分可以通过接头连接。在优选实施方案中，三聚化结构域和(一个或多个)抗原结合部分通过肽接头连接。
如本文所用的术语“接头”指肽接头并且优选地是具有至少5个氨基酸长度、优选地具有5至100个、更优选地10至50个氨基酸长度的氨基酸序列的肽。在一个实施方案中，所述肽接头是(GxS)n或(GxS)nGm，其中G＝甘氨酸，S＝丝氨酸并且(x＝3，n＝3、4、5或6，以及m＝0、1、2或3)或(x＝4，n＝2、3、4或5和m＝0、1、2或3)，优选地x＝4并且n＝2或3，更优选地其中x＝4，n＝2。在一个实施方案中，所述肽接头是(G4S)2。
本发明的抗原结合部分可以是抗体或抗体片段。
在一个实施方案中，所述抗原结合部分是选自Fab分子、交叉Fab分子、单链Fab分子、Fv分子、scFv分子和单结构域抗体的抗体片段。
在一个实施方案中，抗原结合部分在其C末端氨基酸处与所述三聚化结构域的N末端氨基酸融合，任选地通过肽接头融合。
在一个实施方案中，三聚体抗原结合分子的至少一个抗原结合部分是Fab分子。如本文所用，“Fab分子”或“Fab片段”指包含轻链片段的抗体片段，所述轻链片段包含轻链的VL结构域和(CL)恒定结构域以及重链的VH结构域和第一恒定结构域(CH1)。在一个实施方案中，三个融合多肽各自包含CMP三聚化结构域和至少一个Fab分子。在一个实施方案中，三个融合多肽各自包含CMP三聚化结构域和一个Fab分子。Fab分子可以与CMP三聚化结构域的N末端或C末端融合。Fab分子可以在其重链或轻链处与CMP三聚化结构域融合。在一个实施方案中，Fab分子通过肽接头与CMP三聚化结构域融合。在一个实施方案中，Fab分子在其Fab重链的C末端或N末端氨基酸与CMP三聚化结构域的N末端氨基酸融合，任选地通过肽接头融合。所产生的融合多肽分别具有以下结构(CMP三聚化结构域)-(CH1VH)或(CMP三聚化结构域)-(VHCH1)。在一个实施方案中，所述Fab分子通过接头与CMP三聚化结构域融合，并且融合多肽分别具有以下结构(CMP三聚化结构域)-接头-(CH1VH)或(CMP三聚化结构域)-接头-(VHCH1)。在一个实施方案中，三聚体抗原结合分子包含如上文所述的三个融合多肽和与融合多肽的重链VHCH1配对的Fab分子的三个轻链(VLCL)。
在本发明的一个实施方案中，三聚体抗原结合分子的至少一个抗原结合部分是Fab分子，其中交换重链和轻链的可变区或恒定区。由于可变区或恒定区的交换，所述Fab分子也称作“cross-Fab分子”或“xFab分子”或“交叉(crossover)Fab分子”。交叉Fab分子的两种不同链组成是可能的并且包含于可用于本发明三聚体抗原结合分子中的抗原结合部分中：在一方面，交换Fab重链和轻链的可变区，即交叉Fab分子包含由轻链可变区(VL)和重链恒定区(CH1)组成的肽链，和由重链可变区(VH)和轻链恒定区(CL)组成的肽链。这种交叉Fab分子也称作CrossFab(VLVH)。在另一方面，当Fab重链和轻链的恒定区交换时，交叉Fab分子包含由重链可变区(VH)和轻链恒定区(CL)组成的肽链，和由轻链可变区(VL)和重链恒定区(CH1)组成的肽链。这种交叉Fab分子是也称作CrossFab(CLCH1)。为了清晰，在其中Fab轻链和Fab重链的可变区交换的交叉Fab分子(即，CrossFab(VLVH))中，包含重链恒定区的肽链在本文中称作交叉Fab分子的“重链”。相反，在其中Fab轻链和Fab重链的恒定区交换的交叉Fab分子(即，CrossFab(CLCH1))中，包含重链可变区的肽链在本文中称作交叉Fab分子的“重链”。
在一个实施方案中，三个融合多肽各自包含CMP三聚化结构域和至少一个cross-Fab分子。在一个实施方案中，三个融合多肽各自包含CMP三聚化结构域和一个cross-Fab分子。cross-Fab分子可以与CMP三聚化结构域的N末端或C末端融合。cross-Fab分子可以在其重链或轻链处与CMP三聚化结构域融合。在一个实施方案中，cross-Fab分子通过肽接头与CMP三聚化结构域融合。在一个实施方案中，cross-Fab分子在其cross-Fab重链的C末端或N末端氨基酸与CMP三聚化结构域的N末端氨基酸融合，任选地通过肽接头融合。在CrossFab(VLVH)的情况下，所产生的融合多肽分别具有以下结构(CMP三聚化结构域)-(VLCH1)或(CMP三聚化结构域)-(CH1VL)。在一个实施方案中，所述Fab分子通过接头与CMP三聚化结构域融合，并且融合多肽分别具有以下结构(CMP三聚化结构域)-接头-(VLCH1)或(CMP三聚化结构域)-接头-(CH1VL)。
在一个实施方案中，三聚体抗原结合分子包含如上文所述的三个融合多肽和与融合多肽的重链VLCH1配对的CrossFab(VLVH)分子的三个轻链(VHCL)。
在CrossFab(CLCH1)的情况下，所产生的融合多肽分别具有以下结构(CMP三聚化结构域)-(VHCL)或(CMP三聚化结构域)-(CLVH)。在一个实施方案中，所述Fab分子通过接头与CMP三聚化结构域融合，并且融合多肽分别具有以下结构(CMP三聚化结构域)-接头-(VHCL)或(CMP三聚化结构域)-接头-(CLVH)。
在一个实施方案中，三聚体抗原结合分子包含如上文所述的三个融合多肽和与融合多肽的重链VHCL配对的CrossFab(CLCH1)分子的三个轻链(VLCH1)。
在本发明的一个实施方案中，三聚体抗原结合分子的至少一个抗原结合部分是单链Fab分子。“单链Fab分子”或“scFab”是由抗体重链可变结构域(VH)、抗体恒定结构域1(CH1)、抗体轻链可变结构域(VL)、抗体轻链恒定结构域(CL)和接头组成的多肽，其中所述抗体结构域和所述接头按N末端至C末端方向具有以下顺序之一：
a)VH-CH1-接头-VL-CL，b)VL-CL-接头-VH-CH1，c)VH-CL-接头-VL-CH1或d)VL-CH1-接头-VH-CL；并且其中所述接头是至少30个氨基酸、优选地32个氨基酸和50个氨基酸之间的多肽所述单链Fab分子a)VH-CH1-接头-VL-CL、b)VL-CL-接头-VH-CH1、c)VH-CL-接头-VL-CH1和d)VL-CH1-接头-VH-CL，经由CL结构域和CH1结构域之间的天然二硫键稳定化。此外，这些单链Fab分子可通过经由插入半胱氨酸残基(例如根据Kabat编号可变重链中的位置44和可变轻链中的位置100)产生链间二硫键进一步稳定化。术语“N末端”指氨基酸序列的N末端的最末氨基酸。术语“C末端”指氨基酸序列的C末端的最末氨基酸。
在一个实施方案中，三个融合多肽各自包含CMP三聚化结构域和至少一个单链Fab分子。在一个实施方案中，三个融合多肽各自包含CMP三聚化结构域和一个单链Fab分子。单链Fab分子可以与CMP三聚化结构域的N末端或C末端融合。在一个实施方案中，单链Fab分子通过肽接头与CMP三聚化结构域融合。在一个实施方案中，Fab分子在其Fab重链的C末端或N末端氨基酸与CMP三聚化结构域的N末端氨基酸融合，任选地通过肽接头融合。所产生的融合多肽分别具有以下结构a)(CMP三聚化结构域)-(VH-CH1-接头-VL-CL)或b)(CMP三聚化结构域)-(VL-CL-接头-VH-CH1)或c)(CMP三聚化结构域)-(VH-CL-接头-VL-CH1)或d)(CMP三聚化结构域)-(VL-CH1-接头-VH-CL)。在一个实施方案中，所述Fab分子通过接头与CMP三聚化结构域融合，并且融合多肽分别具有以下结构：a)(CMP三聚化结构域)-接头-(VH-CH1-接头-VL-CL)或b)(CMP三聚化结构域)-接头-(VL-CL-接头-VH-CH1)或c)(CMP三聚化结构域)-接头-(VH-CL-接头-VL-CH1)或d)(CMP三聚化结构域)-接头-(VL-CH1-接头-VH-CL)。
在本发明的一个实施方案中，三聚体抗原结合分子的至少一个抗原结合部分是Fv分子。
在本发明的一个实施方案中，三聚体抗原结合分子的至少一个抗原结合部分是单链Fv分子。
除上文所概述的抗体片段之外，仅由重链组成的抗原结合部分还可能用于本发明的三聚体抗原结合分子中。这些不寻常重链抗体的抗原结合位点仅由称作VHH或aVH(自发可变重链)或单结构域可变重链的单结构域形成。单结构域可变重链作为重组蛋白容易地产生。单结构域可变重链的其他有利特征包括它们的尺寸小、溶解度高、热稳定性、再折叠能力和组织渗透作用良好。单结构域抗体例如在Wesolowski等人,MedMicrobiolImmunol(2009)198:157–174中描述。产生单结构域可变重链抗体的方法例如在通过引用方式完整并入本文的WO2012152823和WO2012056000中描述。
这些单结构域可变重链抗体缺少轻链并且还能够缺少CH1结构域。因此，单结构域可变重链抗体的抗原结合位点仅由单结构域形成。
在本发明的一个实施方案中，三聚体抗原结合分子的至少一个抗原结合部分是单结构域抗体。
除抗体之外，还存在可以用来特异性结合靶分子的其他结合蛋白或结合结构域(例如Binz,H.K.,Amstutz,P.和Pluckthun,A.,Nat.Biotechnol.23,1257-1268,2005)。这样一个新类别的结合蛋白或结合结构域以设计的重复蛋白或设计的重复结构域为基础(WO2002/020565；Binz,H.K.,Amstutz,P.,Kohl,A.,Stumpp,M.T.,Briand,C,Forrer,P.,Grutter,M.G.和Pluckthun,A.,Nat.Biotechnol.22,575-582,2004；Stumpp,M.T.,Binz,H.K和Amstutz,P.,DrugDiscov.Today13,695-701,2008)。
锚蛋白重复蛋白质已经在1987年通过酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)和秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)中这样四种蛋白质之间的序列比较鉴定。Breeden和Nasmyth报道了swi6p、cdcl0p、notch和lin-12的序列中大约33个残基的重复单元的多个拷贝(Breeden和Nasmyth，1987)。后续在锚蛋白中发现这个重复单元的24个拷贝导致将这种重复单元命名为锚蛋白重复(Lux等人,1990)。稍后，已经在不同生物和病毒的数百种蛋白质中鉴定到这种重复单元(Bork,1993；SMART数据库,Schultz等人,2000)。这些蛋白质位于胞核、细胞质或胞外空间。这与如下事实一致：这些蛋白质的锚蛋白重复结构域不依赖于二硫桥并且因此与环境的氧化状态无关。每蛋白质的重复单元数目从两个变动到多于20个(SMART数据库，Schultz等人,2000)。似乎要求最低的重复单元数目以形成稳定的折叠的结构域(Zhang和Peng，2000)。在另一方面，还有一个折叠的结构域中存在上限为六个重复单元的某种证据(Michaely和Bennet,1993)。
WO2002/020565描述了怎样可以构建锚蛋白重复蛋白的庞大文库和它们的一般应用。这些设计的重复结构域利用重复蛋白的模块性质并拥有N末端和C末端加帽模块以通过遮蔽该结构域的疏水核心，防止设计的重复结构域聚集(Forrer,P.,Stumpp,M.T.,Binz,H.K.和Pluckthun,A.,FEBSletters539,2-6,2003)。WO2012069655描述了通过改善设计的锚蛋白重复结构域的C末端或N末端加帽模块或C末端或N末端加帽重复的优化的重复蛋白。
在本发明的一个实施方案中，三聚体抗原结合分子的至少一个抗原结合部分是包含至少一个锚蛋白重复基序的结合蛋白。
在一个实施方案中，三聚体抗原结合分子包含三个融合多肽，所述融合多肽各自包含与CMP三聚化结构域融合的两个抗原结合部分。在一个实施方案中，三聚体抗原结合分子包含三个融合肽其中第一抗原结合部分在N末端上与CMP三聚化结构域融合并且第二抗原结合部分与CMP三聚化结构域的C末端融合。第二抗原结合部分可以是抗体或抗体片段。在一个实施方案中，所述第二抗原结合部分是选自Fab分子、交叉Fab分子、单链Fab分子、Fv分子、scFv分子和单结构域抗体的抗体片段。在一个实施方案中，所述第一抗原结合部分是抗体片段并且所述第二抗原结合部分是抗体片段。优选地，第二抗原结合部分是与第一抗原结合部分不同的抗体片段。
在一个实施方案中所述第一抗原结合部分是Fab分子并且所述第二抗原结合部分是单链Fv分子。
在一个实施方案中，三聚体抗原结合分子包含三个融合多肽，所述融合多肽各自包含能够与第一抗原特异性结合的Fab分子和能够与第二抗原特异性结合的单链Fv分子。
在一个实施方案中，每个融合多肽包含在Fab重链的C末端与CMP三聚化结构域的N末端融合、任选地经由肽接头融合的Fab分子，和在其N末端与CMP三聚化结构域的C末端融合、任选地经由肽接头融合的单链Fv分子。因此，三个融合多肽各自可例如具有以下结构：(VHCH1)-(CMP三聚化结构域)-scFv。在其中抗原结合结构域经由肽接头与CMP三聚化结构域融合的实施方案中，融合多肽可例如具有以下结构：(VHCH1)-接头-(CMP三聚化结构域)-接头-scFv。在其他实施方案中，仅Fab分子经由肽接头与CMP三聚化结构域融合，并且scFv分子与CMP三聚化结构域直接融合，或反之亦然。在一个实施方案中，三聚体抗原结合分子包含如上文所述的三个融合多肽和与融合多肽的重链(VHCH1)配对的三个轻链(VLCL)。
在一个实施方案中，每个融合多肽包含在Fab轻链的C末端与CMP三聚化结构域的N末端融合、任选地经由肽接头融合的Fab分子，和在其N末端与CMP三聚化结构域的C末端融合、任选地经由肽接头融合的单链Fv分子。因此，三个融合多肽各自可例如具有以下结构：(VLCL)-(CMP三聚化结构域)-scFv。在其中抗原结合结构域经由肽接头与CMP三聚化结构域融合的实施方案中，融合多肽可例如具有以下结构：(VLCL)-接头-(CMP三聚化结构域)-接头-scFv。在其他实施方案中，仅Fab分子经由肽接头与CMP三聚化结构域融合，并且scFv分子与CMP三聚化结构域直接融合，或反之亦然。在一个实施方案中，三聚体抗原结合分子包含如上文所述的三个融合多肽和与融合多肽的轻(VLCL)链配对的三个重(VHCH1)链。
在一个实施方案中，三聚体抗原结合分子包含三个融合多肽，所述融合多肽各自包含能够与第一抗原特异性结合的Fab分子和能够与第二抗原特异性结合的crossFab分子。
在一个实施方案中，每个融合多肽包含在Fab重链的C末端与CMP三聚化结构域的N末端融合、任选地经由肽接头融合的Fab分子，和与CMP三聚化结构域的C末端融合、任选地经由肽接头融合的crossFab分子。
因此，三个融合多肽各自可例如具有以下结构：(VHCH1)-(CMP三聚化结构域)-(VLCH1)或(VHCH1)-(CMP三聚化结构域)-(CLVH)。在其中抗原结合结构域经由肽接头与CMP三聚化结构域融合的实施方案中，融合多肽可例如具有以下结构：(VHCH1)-接头-(CMP三聚化结构域)-接头-(VLCH1)或(VHCH1)-接头-(CMP三聚化结构域)-接头-(CLVH)。在其他实施方案中，仅Fab分子经由肽接头与CMP三聚化结构域融合，并且cross-Fab分子与CMP三聚化结构域直接融合，或反之亦然。在一个实施方案中，三聚体抗原结合分子包含如上文所述的三个融合多肽、与融合多肽的重(VHCH1)链配对的三个轻(VLCL)链和与融合多肽的Crossfab部分配对的三个(CLVH)或(VHCH1)链。
在一个实施方案中，每个融合多肽包含在Fab轻链的C末端与CMP三聚化结构域的N末端融合、任选地经由肽接头融合的Fab分子，和与CMP三聚化结构域的C末端融合、任选地经由肽接头融合的cross-Fab分子。因此，三个融合多肽各自可例如具有以下结构：(VLCL)-(CMP三聚化结构域)-(VLCH1)或(VLCL)-(CMP三聚化结构域)-(VHCL)。在其中抗原结合结构域经由肽接头与CMP三聚化结构域融合的实施方案中，融合多肽可例如具有以下结构：(VLCL)-接头-(CMP三聚化结构域)-接头-(VLCH1)或(VLCL)-接头-(CMP三聚化结构域)-接头-(VHCL)。在其他实施方案中，仅Fab分子经由肽接头与CMP三聚化结构域融合，并且cross-Fab分子与CMP三聚化结构域直接融合，或反之亦然。在一个实施方案中，三聚体抗原结合分子包含如上文所述的三个融合多肽、与融合多肽的轻(VLCL)链配对的三个重(VHCH1)链和与融合多肽的Crossfab部分配对的三个(CLVH)或(VHCH1)链。
在一个实施方案中，三聚体抗原结合分子包含三个融合多肽，所述融合多肽包含SEQIDNO.:4和SEQIDNO.:9的序列。
在一个实施方案中，三聚体抗原结合分子包含三个融合多肽，所述融合多肽包含SEQIDNO.:5、SEQIDNO.:9和SEQIDNo.:10的序列。
在一个实施方案中，三聚体抗原结合分子包含三个融合多肽，所述融合多肽包含SEQIDNO.:6和SEQIDNo.:9的序列。
在一个实施方案中，三聚体抗原结合分子包含三个融合多肽，所述融合多肽包含SEQIDNO.:19和SEQIDNo.:20的序列。
重组方法
本发明的三聚体抗原结合分子可以例如通过固态肽合成(例如Merrifield固相合成)或重组生产获得。为了重组生产，将编码三聚体抗原结合分子(片段)的一个或多个多核苷酸(例如，如上文所述)分离并插入一个或多个载体中以便进一步在宿主细胞中克隆和/或表达。使用常规方法，可以轻易地分离这种多核苷酸并将其测序。在一个实施方案中，提供包含本发明的一种或多种多核苷酸的载体，优选地表达载体。本领域技术人员熟知的方法可以用来构建表达载体，所述表达载体含有三聚体抗原结合分子(片段)的编码序列，连同适宜的转录/翻译控制信号。这些方法包括体外重组DNA技术，合成技术和体内重组/遗传重组。参见，例如在Maniatis等人,MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,N.Y.(1989)和Ausubel等人,CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingAssociatesandWileyInterscience,N.Y(1989)中描述的技术。表达载体可以是质粒、病毒的部分，或可以是核酸片段。表达载体包括将编码三聚体抗原结合分子(片段)的多核苷酸(即编码区)以与启动子和/或其他转录或翻译控制元件有效连接的方式克隆的表达盒。如本文所用，“编码区”是由翻译成氨基酸的密码子组成的核酸的一部分。虽然“终止密码子”(TAG、TGA或TAA)不翻译成氨基酸，但是如果存在的话，可以将它视为编码区的部分，但是任何侧翼序列，例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子、5'和3'非翻译区等，均不是编码区的部分。两个或更多个编码区可以存在于单一多核苷酸构建体中，例如存在于单一载体上或存在于独立的多核苷酸构建体中，例如存在于独立(不同)的载体上。另外，任何载体可以含有单个编码区，或可以包含两个或更多个编码区，例如，本发明的载体可以编码一种或多种多肽，所述多肽经由蛋白酶切割以翻译后方式或以共翻译方式分离成最终的蛋白质。此外，本发明的载体、多核苷酸或核酸可以编码异源编码区，所述异源编码区与编码本发明三聚体抗原结合分子(片段)的多核苷酸或变体或其衍生物融合或不融合。异源编码区包括但不限于专用元件或基序，如分泌信号肽或异源功能性结构域。有效连接是以下情况，此时基因产物(例如多肽)的编码区与一种或多种调节序列以如此方式连接，从而将基因产物的表达置于(一种或多种)调节序列的影响或控制下。如果启动子功能的诱导导致编码所需基因产物的mRNA转录并且如果两个DNA片段之间连接的性质不干扰表达调节序列指导基因产物表达的能力或不干扰DNA模板被转录的能力，则这两个DNA片段(如多肽编码区和与之连接的启动子)是“有效连接”的。因而，如果启动子能够实现编码多肽的核酸的转录，则该启动子区与该核酸有效连接。启动子可以是指导DNA仅在预定细胞中大量转录的细胞特异性启动子。除启动子之外的其他转录控制元件，例如增强子、操纵基因、阻遏蛋白和转录终止信号，可以与多核苷酸有效连接以指导细胞特异转录。本文中公开了合适的启动子和其他转录控制区。多种转录控制区是本领域技术人员已知的。这些包括但不限于，在脊椎动物细胞中发挥功能的转录控制区，例如，但不限于，来自巨细胞病毒(例如立即早期启动子，连同内含子-A一起)、猴病毒40(例如早期启动子)和逆转录病毒(如，例如劳斯肉瘤病毒)的启动子和增强子区段。其他转录控制区包括源自脊椎动物基因如肌动蛋白、热休克蛋白、牛生长激素和兔α-球蛋白的那些，以及能够控制真核细胞中基因表达的其他序列。额外的合适转录控制区包括组织特异性启动子和增强子以及诱导型启动子(例如四环素诱导型启动子)。类似地，多种翻译控制元件是本领域普通技术人员已知的。这些包括但不限于核糖体结合位点、翻译起始和终止密码子和源自病毒系统的元件(特别是内部核糖体进入位点，或IRES，也称作CITE序列)。表达盒也可以包括其他特征如复制起点，和/或染色体整合元件如逆转录病毒长末端重复序列(LTR)或腺联病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)。
本发明的多核苷酸和核酸编码区可以与编码分泌肽或信号肽的额外编码区连接，所述分泌肽或信号肽指导由本发明多核苷酸编码的多肽分泌。例如，如果需要分泌三聚体抗原结合分子，则可以将编码信号序列的DNA置于编码本发明三聚体抗原结合分子或其片段的核酸上游。根据信号假设，由哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有一旦已经启动正在增长的蛋白质链跨糙面内质网输出则从成熟蛋白切下的信号肽或分泌前导序列。本领域普通技术人员知晓由脊椎动物细胞分泌的多肽一般具有与多肽N末端融合的信号肽，所述信号肽从翻译的多肽被切下以产生分泌或“成熟”形式的多肽。在某些实施方案中，使用天然信号肽，例如免疫球蛋白重链或轻链的信号肽，或该序列的功能衍生物，所述功能衍生物保留指导与该序列有效连接的多肽分泌的能力。备选地，可以使用异源哺乳动物信号肽或其功能衍生物。例如，野生型前导序列可以用人组织纤维蛋白溶酶原激活物(TPA)或小鼠β-葡糖醛酸糖苷酶的前导序列替换。
可以在编码三聚体抗原结合分子(片段)的多核苷酸的内部或末端处包含编码短蛋白质序列的DNA，所述短蛋白质序列可以用来促进稍后的纯化(例如组氨酸标签)或辅助标记三聚体抗原结合分子。
在又一个实施方案中，提供了包含一种或多种本发明多核苷酸的宿主细胞。在某些实施方案中，提供了包含本发明的一种或多种载体的宿主细胞。多核苷酸和载体可以分别相对于多核苷酸和载体，单独或以组合方式合并本文中所述的任一特征。在一个这样的实施方案中，宿主细胞包含载体(例如已经用所述载体转化或转染)，所述载体包含编码本发明的三聚体抗原结合分子(其部分)的多核苷酸。如本文所用，术语“宿主细胞”指可以工程化以产生本发明三聚体抗原结合分子或其片段的任何种类的细胞系统。适于复制和支持三聚体抗原结合分子表达的宿主细胞是本领域熟知的。根据需要，这类细胞可以用特定表达载体转染或转导，并且可以培育大量含有载体的细胞用于接种大规模发酵器以获得足够量的三聚体抗原结合分子用于临床应用。合适的宿主细胞包括原核微生物，如大肠杆菌，或多种真核细胞，如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、昆虫细胞等。例如，可以在细菌中产生多肽，特别是当不需要糖基化时可以在细菌中产生多肽。在表达后，可以将多肽在可溶性级分中从细菌细胞糊状物分离并且可以进一步纯化多肽。除原核生物之外，真核微生物如丝状真菌或酵母是编码多肽的载体的合适克隆宿主或表达宿主，包括其糖基化途径已经“人源化”的真菌和酵母菌株，导致产生具有部分或完全人类糖基化模式的多肽。见Gerngross,NatBiotech22,1409-1414(2004)和Li等人,NatBiotech24,210-215(2006)。用于表达(糖基化)多肽的合适宿主细胞还源自多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的例子包括植物细胞和昆虫细胞。已经鉴定了可以与昆虫细胞一起使用、尤其用于转染草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞的许多杆状病毒毒株。也可以利用植物细胞培养物作为宿主。见，例如美国专利号5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429(描述在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIESTM技术)。也可以使用脊椎动物细胞作为宿主。例如，适应于悬浮培育的哺乳动物细胞系可以是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他例子是由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(293或293T细胞，如Graham等人,JGenVirol36,59(1977)中所述那样)、幼仓鼠肾细胞(BHK)、小鼠支持细胞(TM4细胞如在例如Mather,BiolReprod23,243-251(1980)中所述那样)、猴肾细胞(CV1)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76)、人宫颈癌细胞(HELA)、犬肾细胞(MDCK)、布法罗大鼠肝脏细胞(BRL3A)、人肺细胞(W138)、人肝脏细胞(HepG2)、小鼠乳腺瘤细胞(MMT060562)、TRI细胞(如在例如Mather等人,AnnalsN.Y.AcadSci383,44-68(1982中所述那样))、MRC5细胞和FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括dhfr-CHO细胞(Urlaub等人,ProcNatlAcadSciUSA77,4216(1980))；和骨髓瘤细胞系如YO、NS0、P3X63和Sp2/0。关于适于产生蛋白质的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见，例如，Yazaki和Wu，MethodsinMolecularBiology，第248卷(B.K.C.Lo编著，HumanaPress，Totowa，NJ)，第255-268页(2003)。宿主细胞包括培养的细胞，例如，培养的哺乳动物细胞、酵母细胞、昆虫细胞、细菌细胞和植物细胞，仅提到数种，还包括含于转基因动物、转基因植物或培养的植物组织或动物组织内部的细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是真核细胞，优选地是哺乳动物细胞，如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚肾(HEK)细胞或淋巴样细胞(例如，Y0、NS0、Sp20细胞)。
本领域已知在这些系统中表达外来基因的标准技术。表达包含抗原结合结构域的重链或轻链的多肽(如抗体)的细胞可以如此工程化，从而还表达抗体的其他链，从而表达产物是均具有重链和轻链的抗体。
在一个实施方案中，提供了产生本发明三聚体抗原结合分子的方法，其中所述方法包括在适于表达三聚体抗原结合分子的条件下培养如本文中提供的宿主细胞，所述宿主细胞包含编码三聚体抗原结合分子的多核苷酸，并且从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收三聚体抗原结合分子。
三聚体抗原结合分子的组分以遗传方式彼此融合。可以如此设计三聚体抗原结合分子，从而其组分彼此直接融合或通过接头序列间接融合。接头的组成和长度可以根据本领域熟知的方法确定并且可以就功效进行测试。三聚体抗原结合分子的不同组分之间接头序列的例子存在于本文提供的序列中。如果需要，也可以包括额外的序列以并入切割位点以便分隔融合物的个体组分，例如内肽酶识别序列。
在某些实施方案中，三聚体抗原结合分子的一个或多个抗原结合部分至少包含能够结合抗原决定簇的抗体可变区。可变区可以形成天然或非天然存在的抗体及其片段的部分，并且可变区可以衍生自天然或非天然存在的抗体及其片段。产生多克隆抗体和单克隆抗体的方法是本领域熟知的(见例如Harlow和Lane，"Antibodies,alaboratorymanual",ColdSpringHarborLaboratory,1988)。非天然存在的抗体可以使用固相肽合成法构建，可以重组产生(例如，如美国专利号4,186,567中所述)，或可以例如通过筛选包含可变重链和可变轻链的组合文库获得(见例如McCafferty的美国专利号5,969,108)。
任何动物种类的抗体、抗体片段、抗原结合结构域或可变区可以用于本发明的三聚体抗原结合分子中。可用于本发明中的非限制性抗体、抗体片段、抗原结合结构域或可变区可以是鼠源、灵长类源或人源的。如果三聚体抗原结合分子意欲用于人类，则可以使用嵌合形式的抗体，其中该抗体的恒定区来自人类。也可以根据本领域熟知的方法制备人源化或完全人形式的抗体(见例如Winter的美国专利号5,565,332)。人源化可以通过各种方法实现，所述方法包括但不限于(a)将非人类(例如，供体抗体)CDR移植到人类(例如受体抗体)框架和恒定区上而保留或不保留关键框架残基(例如对保留良好抗原结合亲和力或抗体功能重要的那些残基)，(b)仅将非人类特异性决定区(SDR或a-CDR；对抗体-抗原相互作用至关重要的残基)移植到人框架和恒定区上，或(c)移植整个非人类可变结构域，但是通过更换表面残基用人样部分“掩蔽”它们。人源化抗体和制造它们的方法例如在Almagro和Fransson,FrontBiosci13,1619-1633(2008)中综述，并且例如还在Riechmann等人,Nature332,323-329(1988)；Queen等人,ProcNatlAcadSciUSA86,10029-10033(1989)；美国专利号5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；Jones等人,Nature321,522-525(1986)；Morrison等人,ProcNatlAcadSci81,6851-6855(1984)；Morrison和Oi,AdvImmunol44,65-92(1988)；Verhoeyen等人,Science239,1534-1536(1988)；Padlan,MolecImmun31(3),169-217(1994)；Kashmiri等人,Methods36,25-34(2005)(描述SDR(a-CDR移植)；Padlan,MolImmunol28,489-498(1991)(描述“表面重塑”)；Dall'Acqua等人,Methods36,43-60(2005)(描述“FR改组”)；和Osbourn等人,Methods36,61-68(2005)和Klimka等人,BrJCancer83,252-260(2000)(描述针对FR改组的“导向选择”方案)中描述。人抗体和人可变区可以使用本领域已知的多种技术产生。人抗体在vanDijk和vandeWinkel,CurrOpinPharmacol5,368-74(2001)和Lonberg,CurrOpinImmunol20,450-459(2008)中一般地描述。人可变区可以形成通过杂交瘤方法产生的人单克隆抗体的部分，并且人可变区可以衍生自所述人单克隆抗体(见例如MonoclonalAntibodyProductionTechniquesandApplications(单克隆抗体生产技术及应用)，第51-63页(MarcelDekker,Inc.,NewYork,1987))。人抗体和人可变区也可以通过施用免疫原至转基因动物制备，其中所述转基因动物已经被修饰以应答于抗原攻击而产生完整人抗体或具有人可变区的完整抗体(见例如Lonberg，NatBiotech23,1117-1125(2005)。也可以通过分离从人衍生的噬菌体展示文库中选择的Fv克隆可变结构域序列产生人抗体和人可变区(见例如，Hoogenboom等人,引自MethodsinMolecularBiology178，1-37(O'Brien等人编著,HumanPress,Totowa,NJ,2001)；和McCafferty等人,Nature348,552-554；Clackson等人,Nature352,624-628(1991))。噬菌体通常将抗体片段展示为单链Fv(scFv)片段或展示为Fab片段。
在某些实施方案中，根据例如在美国专利申请公开号2004/0132066(所述文献的完整内容因而通过引用的方式并入)中公开的方法，将用于本发明中的抗原结合部分工程化以具有增强的结合亲和力。可以通过酶联免疫吸附测定(ELISA)或本领域技术人员熟悉的其他技术，例如表面等离子体共振技术(在BIACORET100系统上分析)(Liljeblad等人,GlycoJ17,323-329(2000))和传统结合测定法(Heeley，EndocrRes28,217-229(2002))，测量本发明的三聚体抗原结合分子与特异性抗原决定簇结合的能力。竞争测定法可以用来鉴定与参考抗体竞争结合至特定抗原的抗体、抗体片段、抗原结合结构域或可变结构域，例如，与V9抗体竞争结合至CD3的抗体。在某些实施方案中，这种竞争性抗体与参考抗体结合的相同表位(例如线性表位或构象表位)结合。用于与抗体结合的表位作图的详细示例性方法在Morris(1996)“EpitopeMappingProtocols”,引自MethodsinMolecularBiology第66卷(HumanaPress,Totowa,NJ)中提供。在示例性竞争测定法中，将固定的抗原(例如CD3)在溶液中孵育，所述溶液包含与该抗原结合的第一标记抗体(例如V9抗体)和正在测试与第一抗体竞争结合至该抗原的能力的第二未标记抗体。第二抗体可以存在于杂交瘤上清液中。作为对照，将固定的抗原在包含第一标记抗体但是不包含第二未标记抗体的溶液中孵育。在允许第一抗体与该抗原结合的条件下孵育后，移除过量的未结合的抗体，并且测量与固定的抗原结合的标记物的量。如果与固定的抗原结合的标记物的量在测试样品中相对于对照样品实质降低，则这表示第二抗体与第一抗体竞争结合抗原。参见Harlow和Lane(1988)Antibodies:ALaboratoryManual第14章(ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor，NY)。
如本文所述那样制备的T细胞活化性双特异性抗原结合分子可以通过现有已知的技术如高效液相色谱、离子交换层析、凝胶电泳、亲和层析、大小排阻层析等纯化。用来纯化特定蛋白质的实际条件将部分取决于因素如净电荷、疏水性、亲水性等，并且将是本领域技术人员显而易见的。对于亲和层析纯化，可以使用与三聚体抗原结合分子结合的抗体、配体、受体或抗原。例如，对于本发明的三聚体抗原结合分子的亲和层析纯化，可以使用具有蛋白A或蛋白G的基质。基本上如实施例中所述，顺序蛋白A或G亲和层析和大小排阻层析可以用来分离三聚体抗原结合分子。三聚体抗原结合分子的纯度可以由多种熟知分析方法的任一种方法确定，所述熟知分析方法包括凝胶电泳、高压液相色谱等。例如，显示如实施例中所述那样表达的重链融合蛋白是完整的并且正确装配，如还原性SDS-PAGE所展示。在大约Mr25,000、Mr50,000和Mr75,000处分辨出三个条带，对应于三聚体抗原结合分子轻链，重链和重链/轻链融合蛋白的预测分子量。
测定法
可以通过本领域已知的多种测定法，鉴定、筛选或表征本文提供的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的物理/化学特性和/或生物学活性。
亲和力测定法
可以根据实施例中所述的方法，通过表面等离子体共振(SPR)，使用标准仪器如BIAcore仪(GEHealthcare)确定三聚体抗原结合分子对Fc受体或靶抗原的亲和力，并且例如可以通过重组表达获得受体或靶蛋白。备选地，三聚体抗原结合分子对不同受体或靶抗原的结合可以使用表达特定受体或靶抗原的细胞系，例如通过流式细胞术(FACS)评价。在下文及在下文实施例中描述用于测量结合亲和力的具体说明性和示例性实施方案。
根据一个实施方案，使用仪(GEHealthcare)在25℃通过表面等离子体共振法测量KD。
为了分析Fc-部分和Fc受体之间的相互作用，加His标签的重组Fc-受体由CM5芯片上固定的抗五His抗体(Qiagen)捕获并且使用特异性构建体作为分析物。简而言之，根据供应商说明书，用盐酸N-乙基-N'-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化葡聚糖生物传感器芯片(CM5,GEHealthcare)。将抗五His抗体用10mM乙酸钠，pH5.0稀释至40μg/ml，随后以5μl/min的流速注射以实现所偶联蛋白的大约6500个响应单位(RU)。注射配体后，注入1M乙醇胺以封闭未反应的基团。随后，在4或10nM捕获Fc-受体60秒。对于动力学测量，将双特异性构建体的4倍连续稀释物(范围在500nM和4000nM之间)在HBS-EP(GEHealthcare，10mMHEPES，150mMNaCl，3mMEDTA，0.05％表面活性剂P20，pH7.4)中于25℃以30μl/min流速注射120秒。
为了确定对靶抗原的亲和力，如对抗五His抗体所述那样，通过活化的CM5传感芯片表面上固定的抗人Fab特异性抗体(GEHealthcare)捕获双特异性构建体。偶联的蛋白质的最终量是大约12000RU。在300nM捕获双特异性构建体90秒。使靶抗原以从250nM至1000nM的浓度范围穿过流动池持续180秒，流速30μl/分钟。监测解离过程180秒。
通过扣除在参比流动池上获得的响应，修正本体折射率差异。通过Langmuir结合等温线的非线性曲线拟合，将稳态响应用来导出解离常数KD。使用简单一对一Langmuir结合模型(评价软件1.1.1版)，通过同时拟合缔合和解离传感图计算缔合速率(kon)和解离速率(koff)。将平衡解离常数(KD)计算为koff/kon比。参见，例如，Chen等人,JMolBiol293,865-881(1999)。
活性测定法
可以通过如实施例中所述的多种测定法测量本发明的三聚体抗原结合分子的生物活性。生物活性可以例如包括诱导靶细胞(如肿瘤细胞)裂解和诱导肿瘤消退和/或改善存活。
组合物、制剂和施用途径
在又一个方面，本发明提供了包含本文提供的任何三聚体抗原结合分子的药物组合物，例如，用于下述任一种治疗方法中。在一个实施方案中，药物组合物包含本文提供的任何三聚体抗原结合分子和可药用载体。在另一个实施方案中，药物组合物包含本文提供的任何三聚体结合分子和至少一种额外治疗剂，例如，如下文描述。
还提供产生处于适于体内施用形式的本发明的三聚体抗原结合分子的方法，所述方法包括(a)获得本发明的三聚体抗原结合分子，和(b)将三聚体抗原结合分子与至少一种可药用载体配制，从而配制了用于体内施用的三聚体抗原结合分子制剂。
本发明的药物组合物包含治疗有效量的溶解或分散于可药用载体中的一种或多种三聚体抗原结合分子。短语“可药用或药理学可接受的”指在使用的剂量和浓度通常对接受者无毒，即施用至动物(如果适宜，例如人)时不产生不良、变应性或其他不利反应的分子实体和组合物。根据本公开，制备含有至少一种三聚体抗原结合分子并任选地含有额外有效成分的药物组合物将是本领域技术人员已知的，如Remington'sPharmaceuticalSciences,第18版,MackPrintingCompany,1990所例举，所述文献通过引用方式并入本文。另外，对于动物(例如，人类)施用，应当理解制品应当满足如FDA生物学标准办公室或其他国家的相应权力机关所要求的无菌性、致热原性、总体安全性和纯度标准。优选的组合物是冻干制剂或水溶液剂。如本文所用，“可药用载体”包括任何和全部溶剂、缓冲剂、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如，抗菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、抗氧化剂、蛋白质、药物、药物稳定剂、聚合物、凝胶、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、矫味剂、染料、这类相似材料及其组合，如本领域普通技术人员将已知(见例如，Remington'sPharmaceuticalSciences,第18版,MackPrintingCompany,1990,第1289-1329页，所述文献通过引用方式并入本文)。除了任何常规载体与有效成分不相容的情况下之外，构思了所述载体在治疗组合物或药物组合物中的用途。
该组合物可以包含不同类型的载体，这取决于它是否将以固态、液态或气溶胶形式施用及对作为注射剂这类施用途径而言它是否需要是无菌的。可以将本发明的三聚体抗原结合分子(和任何额外治疗药)按静脉内、皮肤内、动脉内、腹腔内、病灶内、颅内、关节内、前列腺内、脾内、肾内、胸膜内、气管内、鼻内、玻璃体内、阴道内地、直肠内、瘤内、肌内、腹腔内、皮下、结膜下的、囊内、粘膜、心包内、脐内、眼球内、口服、局部、局部方式、通过吸入(例如气溶胶吸入)、注射、输注、连续输注、直接局部化的灌流浸浴靶细胞、通过导管、通过灌洗、在乳中、在脂质组合物(例如脂质体)中或通过其他方法或前述方法的任何组合施用，如本领域普通技术人员将会已知(参见，例如Remington'sPharmaceuticalSciences，第18版，MackPrintingCompany，1990，通过引用方式并入本文)。肠胃外施用，尤其静脉内注射，最常使用于施用多肽分子，如本发明的三聚体抗原结合分子。
肠胃外组合物包含设计成通过注射例如皮下、皮肤内、病灶内、静脉内、动脉内肌内、鞘内或腹膜内注射施用的那些组合物。对于注射，可以将本发明的三聚体抗原结合分子在水溶液中、优选地在生理相容性缓冲液如Hank溶液、Ringer溶液或生理盐水中配制。溶液可以含有配制剂如助悬剂、稳定剂和/或分散剂。备选地，三聚体抗原结合分子可以处于粉剂形式，用于使用前与合适载体(例如，无菌无热原水)构成。通过以下方式制备无菌可注射溶液剂：将本发明的三聚体抗原结合分子按要求的量，根据需要连同下文列举的多种其他成分一起并入适宜的溶剂中。可以例如通过借助无菌滤膜过滤轻易地实现无菌性。通常，通过将多种消毒的有效成分并入无菌溶媒中来制备分散体，所述无菌溶媒含有基础分散介质和和/或其他成分。在用于制备无菌可注射溶液剂、混悬剂或乳剂的无菌粉末情况下，优选的制备方法是真空干燥或冷冻干燥技术，所述技术产生有效成分的粉末，外加来自其事先无菌过滤的液体介质中的任何额外所需成分。如果需要，应当合适地缓冲液体介质并且首先用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂在注射之前等渗。组合物必须在制造和储存条件下是稳定的，并受到保护免遭免微生物如细菌和真菌的污染。可以理解应当最小地保持内毒素污染处于安全水平，例如，小于0.5ng/mg蛋白质。合适的可药用载体包括但不限于：缓冲剂如磷酸、柠檬酸和其他有机酸；抗氧化剂(包括抗坏血酸和甲硫氨酸)；防腐剂(如十八烷基苄基二甲基氯化铵；六甲氯铵；苯扎氯铵、苯扎溴铵；苯酚、丁醇或苄醇；烷基尼泊金酯如尼泊金甲酯或丙酯；儿茶酚；雷琐辛；环己醇；3-戊醇和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他糖包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖如蔗糖、甘露糖、海藻糖或山梨糖；形成盐的反离子如钠；金属复合物(例如，Zn-蛋白质复合物)和/或非离子表面活性剂如聚乙二醇(PEG)。水性注射混悬剂可以含有增加混悬剂黏度的化合物，如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖等。任选地，混悬剂也可以含有合适的稳定剂或增加化合物的溶解度以允许制备高度浓缩的溶液剂的物质。另外，活性化合物的混悬剂可以制备为适宜的油性注射混悬剂。合适的亲脂溶剂或运载体包括脂肪油如芝麻油，或合成性脂肪酸酯，如油酸乙酯或甘油三酯，或脂质体。
活性成分可以分别包埋于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊(例如，羟甲基纤维素微胶囊或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、胶态药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球体、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)或粗乳液中。这类技术在Remington'sPharmaceuticalSciences(第18版,MackPrintingCompany,1990)中公开。可以制备持续释放制品。持续释放制品的合适例子包括含有多肽的固态疏水性聚合物的半通透性基质，所述基质处于成型制品(例如，薄膜或微胶囊)形式。在具体的实施方案中，可以通过在组合物中使用延迟吸收的物质，例如单硬脂酸铝、明胶或其组合，引起可注射组合物的吸收延长。
除先前所述的组合物之外，也可以将三聚体抗原结合分子配制为贮库配制品。这种长效制剂可以通过(例如皮下或肌内)植入或通过肌内注射施用。因此，例如，可以将三聚体抗原结合分子用合适的聚合材料和疏水材料(例如作为可接受油中的乳液)或离子交换树脂配制或配制为微溶性衍生物，例如微溶性盐。
包含本发明的三聚体抗原结合分子的药物组合物可以按本领域已知的任何方式制造，例如，通过常规混合、溶解、乳化、囊化、包埋或冻干法制造。药物组合物可以使用一种或多种促进蛋白质加工成可以按药学方式使用的制品的生理可接受载体、稀释剂、赋形剂或辅助剂以常规方式配制。正确的制剂取决于所选的施用途径。
可以将三聚体抗原结合分子以游离酸或碱、中性盐或盐形式配制到组合物中。可药用盐是基本上保留游离酸或碱的生物活性的盐。这些盐包括酸加成盐，例如，与蛋白质组合物的游离氨基形成的或与无机酸例如氢氯酸或磷酸或这类有机酸如乙酸、草酸、酒石酸或扁桃酸形成的那些盐。与游离羧基形成的盐也可以源自无机碱例如，氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁或这类有机碱如异丙胺、三甲胺、组氨酸或普鲁卡因。药用盐将在含水溶剂和其他质子溶剂中比相应游离碱形式溶解性更高。
治疗方法和组合物
本文提供的任何三聚体抗原结合分子可以用于治疗方法中。本发明的三聚体抗原结合分子可以用作免疫治疗剂，例如用于治疗癌症。
为了用于治疗方法中，本发明的三聚体抗原结合分子将以符合良好医学实践的方式配制、投予和施用。在这种情况下考虑的因素包括正在治疗的具体病症、正在治疗的具体哺乳动物、个体患者的临床状况、病症原因、送递药物的部位、施用方法、施用计划和医疗执业者已知的其他因素。
在一个方面，提供用作药物的本发明的三聚体抗原结合分子。在其他方面，提供用于治疗疾病的本发明的三聚体抗原结合分子。在某些实施方案中，提供用于治疗方法中的本发明的三聚体抗原结合分子。在一个实施方案中，本发明提供用于治疗有需求的个体中的疾病的如本文所述的三聚体抗原结合分子。在某些实施方案中，本发明提供用于治疗患有疾病的个体的方法中的三聚体抗原结合分子，所述方法包括向该个体施用治疗有效量的三聚体抗原结合分子。在某些实施方案中，待治疗疾病是增殖性病症。在具体实施方案中，疾病是癌症。在某些实施方案中，该方法还包括向个体施用治疗有效量的至少一种额外的治疗剂，例如，如果待治疗疾病是癌症，施用抗癌剂。在其他实施方案中，本发明提供用于诱导靶细胞裂解、尤其肿瘤细胞裂解的如本文所述的三聚体抗原结合分子。在某些实施方案中，本发明提供用于诱导个体中的靶细胞裂解、尤其肿瘤细胞裂解的方法的三聚体抗原结合分子，所述方法包括向个体施用有效量的三聚体抗原结合分子以诱导靶细胞裂解。根据以上任一个实施方案的“个体”是哺乳动物，优选地是人类。
在又一个方面，本发明提供本发明的三聚体抗原结合分子在制造或制备药物中的用途。在一个实施方案中，该药物用于治疗有需求的个体中的疾病。在又一个实施方案中，该药物用于治疗疾病的方法中，所述方法包括向患有疾病的个体施用治疗有效量的药物。在某些实施方案中，待治疗疾病是增殖性病症。在具体实施方案中，疾病是癌症。在一个实施方案中，方法还包括向个体施用治疗有效量的至少一种额外的治疗剂，例如，如果待治疗疾病是癌症，则施用抗癌剂。在又一个实施方案中，药物用于诱导靶细胞裂解、尤其肿瘤细胞裂解。在仍然又一个实施方案中，药物用于诱导个体中靶细胞裂解、尤其肿瘤细胞裂解的方法，所述方法包括向个体施用有效量的药物以诱导靶细胞裂解。根据以上实施方案中任一个实施方案的“个体”可以是哺乳动物，优选地是人。
在又一个方面，本发明提供用于治疗疾病的方法。在一个实施方案中，方法包括向患有这种疾病的个体施用治疗有效量的本发明的三聚体抗原结合分子。在一个实施方案中，将组合物施用至所述个体，所述组合物包含处于可药用形式的本发明的三聚体抗原结合分子。在某些实施方案中，待治疗疾病是增殖性病症。在具体实施方案中，疾病是癌症。在某些实施方案中，方法还包括向个体施用治疗有效量的至少一种额外的治疗剂，例如，如果待治疗疾病是癌症，施用抗癌剂。根据以上实施方案中任一个实施方案的“个体”可以是哺乳动物，优选地是人。
在某些实施方案中，待治疗疾病是增殖性病症，特别是癌症。癌症的非限制性例子包括膀胱癌、脑癌、头和颈癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、子宫内膜癌、食管癌、结肠癌、结直肠癌、直肠癌、胃癌、前列腺癌、血癌、皮肤癌、鳞状细胞癌、骨癌和肾癌。可以使用本发明的三聚体抗原结合分子治疗的其他细胞增殖病症包括但不限于位于以下部位的肿瘤：腹部、骨、乳腺、消化系统、肝、胰、腹膜、内分泌腺(肾上腺、甲状旁腺、垂体、睾丸、卵巢、胸腺、甲状腺)、眼部、头部和颈部、(中枢和外周)神经系统、淋巴系统、盆腔、皮肤、软组织、脾、胸部和泌尿生殖系统。还包括癌前病状或损害和癌症转移。在某些实施方案中，癌症选自肾细胞癌、皮肤癌、肺癌、结直肠癌、乳腺癌、脑癌、头颈癌。技术人员轻易地认识到，在许多情况下三聚体抗原结合分子可以不提供治愈，而仅可以提供部分益处。在一些实施方案中，具有某些益处的生理变化也视为治疗性有益的。因此，在一些实施方案中，将引起生理变化的三聚体抗原结合分子的量视为“有效量”或“治疗有效量”。需要治疗的对象、患者或个体通常是哺乳动物、更具体地是人。
在一些实施方案中，将有效量的本发明三聚体抗原结合分子施用至细胞。在其他实施方案中，将治疗有效量的本发明三聚体抗原结合分子施用至个体以治疗疾病。
对于预防或治疗疾病，本发明三聚体抗原结合分子的适宜剂量(当单独或与一种或多种其他额外治疗剂组合使用时)将取决于待治疗疾病的类型、施用途径、患者体重、三聚体抗原结合分子的类型、疾病的严重程度和过程、三聚体抗原结合分子是否出于预防或治疗目的施用、既往或伴同治疗性介入、患者的临床史和对三聚体抗原结合分子的反应以及主治医师的决定。在任何情况下，负责施用的执业者将决定用于个体对象的组合物中的活性成分浓度及适宜剂量。本文中构思了多种给药方案，包括但不限于单次或在多个时间点多次施用、推注施用和脉冲输注。
将三聚体抗原结合分子适当地按一次或经过一系列治疗施用至患者。取决于疾病的类型和严重性，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)三聚体抗原结合分子可以是向患者施用的初始候选剂量，无论是否例如通过一次或多次单独施用或通过连续输注来施用。取决于上文提到的因素，一个常见的每日剂量可能是从约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于在几日或更长时间范围内重复施用，取决于病状，治疗通常将持续直至对疾病症状的所需抑制作用出现。三聚体抗原结合分子的一个示例性剂量将处于约0.005mg/kg至约10mg/kg范围内。在其他非限制性例子中，剂量还可以包含每次施用约1微克/kg体重、约5微克/kg体重、约10微克/kg体重、约50微克/kg体重、约100微克/kg体重、约200微克/kg体重、约350微克/kg体重、约500微克/kg体重、约1毫克/kg体重、约5毫克/kg体重、约10毫克/kg体重、约50毫克/kg体重、约100毫克/kg体重、约200毫克/kg体重、约350毫克/kg体重、约500毫克/kg体重至约1000mg/kg体重或或更多，和其中可推导的任何范围。在从本文所列数值可推导的范围的非限制性例子中，基于上文描述的数值，可以施用约5mg/kg体重至约100mg/kg体重、约5毫克/kg体重至约500毫克/kg体重等的范围。因此，可以向患者施用约0.5mg/kg、2.0mg/kg、5.0mg/kg或10mg/kg的一种或多种剂量(或其任意组合)。这类剂量可以间歇地施用，例如，每周或每3周(例如，使得患者接受从约2个至约20个或例如约6个剂量的三聚体抗原结合分子)。可以施用较高的初始负荷剂量，随后是一个或多个较低剂量。然而，可以使用其他剂量方案。通过常规技术和测定法容易地监测这种疗法的进程。
本发明的三聚体抗原结合分子通常将按有效实现预期目的的量使用。为了用来治疗或预防病况，以治疗有效量施用或施加本发明的三聚体抗原结合分子或其药物组合物。确定治疗有效量完全处于本领域技术人员的能力范围内，尤其是根据本文所提供的详细公开内容。
对于全身性施用，可以从体外测定法初步估计治疗有效剂量，如细胞培养测定法。可以在动物模型中配制某个剂量以实现包括IC50的循环浓度范围，如细胞培养物中所测定。这种信息可以用来更精确地确定用于人类中的剂量。
也可以使用本领域熟知的技术，从体内数据(如动物模型)估计初始剂量。本领域普通技术人员可以基于动物数据轻易地优化对人类施用。
可以单独调整剂量数量和间隔以提供足以维持治疗效果的三聚体抗原结合分子的血浆水平。注射施用的患者常规剂量是约0.1至50mg/kg/日，一般从约0.5至1mg/kg/日。治疗有效的血浆水平可以通过每日施用多个剂量实现。可以测量血浆中的水平，例如，通过HPLC测量。
在局部施用或选择性摄入的情况下，三聚体结合分子的有效局部浓度可以与血浆浓度不相关。本领域技术人员将能够在无需过多实验的情况下优化治疗有效的局部剂量。
本文所述的三聚体抗原结合分子的治疗有效剂量通常将提供治疗益处而不造成明显毒性。可以通过标准药学流程在细胞培养物或实验动物中确定三聚体抗原结合分子的毒性和治疗功效。细胞培养测定法和动物研究可以用来测定LD50(对50％群体致死的剂量)和ED50(50％群体中治疗有效的剂量)。毒性作用和治疗作用之间的剂量比是治疗指数，它可以表述为LD50/ED50比。优选显示出巨大治疗指数的三聚体抗原结合分子。在一个实施方案中，本发明的三聚体抗原结合分子显示出高治疗指数。从细胞培养物测定法和动物研究中获得的数据可以在配制适用于人类中的剂量范围时使用。剂量优选地位于毒性低或无毒性情况下包括ED50的一系列循环浓度范围内。剂量可以在这个范围内部变动，这取决于多种因素，例如，所用的剂型、所用的施用途径、对象状况等。确切制剂、施用途径和剂量可以由各个医师根据患者的状况选择(参见，例如Fingl等人,1975,引自：ThePharmacologicalBasisofTherapeutics,第1章,第1页，所述文献通过引用方式完整并入本文)。
用本发明三聚体抗原结合分子治疗的患者的主治医生将知道如何和何时因毒性、器官功能障碍等而终止、中断或调节施用。反过来，如果临床反应不充分(不包括毒性)，主治医师也会知道将治疗调整到更高的水平。管理目的病状时所施用剂量的大小将随待治疗病状的严重性、随施用途径等变动。病状的严重性可以例如部分地通过标准预后评价方法进行评价。另外，剂量和或许给药频率也将根据各个患者的年龄、体重和反应而变动。
其他活性剂和治疗
本发明的三聚体抗原结合分子可以在疗法中与一种或多种其他活性剂组合施用。例如，本发明的三聚体抗原结合分子可以与至少一种额外的治疗剂共同施用。术语“治疗剂”涵盖为了治疗需要这种治疗的个体中的症状或疾病所施用的任何活性剂。这类额外治疗剂可以包括适于正在治疗的特定适应症的任何活性成分，优选地具有彼此无不利影响的互补活性的那些。在某些实施方案中，额外的治疗剂是免疫调节剂、细胞抑制剂、细胞黏附抑制剂、细胞毒性剂、细胞凋亡激活物、或增加细胞对凋亡诱导物的敏感性的药物。在具体实施方案中，额外治疗剂是抗癌剂，例如微管破坏剂、抗代谢物、拓扑异构酶抑制剂、DNA嵌入剂、烷基化剂、激素治疗药、激酶抑制剂、受体拮抗剂、肿瘤细胞凋亡激活物或抗血管生成剂。
此类其他活性剂适当地以有效用于预期目的的量存在。这类其他活性剂的有效量取决于所用三聚体抗原结合分子的量、疾病或疗法类型，和上文讨论的其他因素。三聚体抗原结合分子通常以与如本文所述相同的剂量并且采用与本文所述相同的施用途径使用，或以约1％至99％的本文所述剂量使用，或以经验地/临床上确定适宜的任何剂量和任何途径使用。
上文所示的这类联合疗法涵盖联合施用(其中在相同或独立的组合物中包含两种或更多种治疗剂)，和独立施用，在后一情况下，本发明三聚体抗原结合分子的施用可以在施用额外的治疗剂和/或佐剂之前、同时和/或之后进行。本发明的三聚体抗原结合分子也可以与放射疗法组合使用。
制造物
在本发明的另一个方面，提供制造物，所述制造物含有可用于治疗、预防和/或诊断上文描述的病症的物质。制造物包含容器和在该容器上或与之结合的标签或包装说明书。合适的容器包括例如瓶、小药瓶、注射器、静脉内输液袋等。容器可以从多种材料如玻璃或塑料形成。容器容纳了本身或与另一种组合物组合时有效治疗、预防和/或诊断病症的组合物并且可以具有无菌接入口(例如容器可以是静脉内输液袋或是具有皮下注射针头可穿透的瓶塞的小药瓶)。组合物中的至少一种活性剂是本发明的三聚体抗原结合分子。标签或包装说明书提示组合物用于治疗选择的病状。此外，制造物可以包含(a)其中含有组合物的第一容器，其中组合物包含本发明的三聚体抗原结合分子；和(b)其中含有组合物的第二容器，其中组合物包含其他细胞毒性剂或治疗剂。在本发明的这个实施方案中制造物还可以包含指示组合物可以用来治疗特定病状的包装说明书。备选或额外地，该制造物可以还包含第二(或第三)容器，其包含可药用缓冲剂，如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、Ringer’s溶液和葡萄糖溶液。它可以还包括从商业和用户观点看受欢迎的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、滤器、针头和注射器。
实施例
以下是本发明方法和组合物的例子。应当理解，鉴于上文提供的一般性描述，可以实施多种其他实施方案。
一般方法
重组DNA技术
如Sambrook等人,Molecularcloning:Alaboratorymanual；ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork,1989中所述的标准方法用来操作DNA。根据制造商的说明书使用分子生物学试剂。关于人免疫球蛋白轻链和重链的核苷酸序列的一般信息在Kabat,E.A.等人,(1991)SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，第5版，NIH出版编号91-3242中给出。
DNA测序
通过双脱氧测序法测定DNA序列。
基因合成
在需要的情况下，使用适宜的模板通过PCR产生目的基因区段，或由GeneartAG(Regensburg，德国)从合成的寡核苷酸和PCR产物，通过自动化基因合成法合成目的基因区段。在精确基因序列不可获得的情况下，基于来自最接近同源物的序列设计寡核苷酸引物并且通过RT-PCR从源自适宜组织的RNA分离基因。将旁侧为单一限制性核酸内切酶切割位点的基因区段克隆至标准克隆/测序载体中。从转化的细菌纯化出质粒DNA并且通过紫外光谱法测定浓度。通过DNA测序证实亚克隆基因片段的DNA序列。基因区段设计成具有合适的限制性位点以允许亚克隆至相应的表达载体中。全部构建体均设计成具有编码前导肽的5'末端DNA序列，所述前导肽在真核细胞中将蛋白质靶向分泌。
实施例1:包含CMP衍生的三聚化结构域的三聚体单特异性抗原结合分子的产生和纯化
为了增强Fab分子与特异性靶(尤其对TNFR-超家族成员)的结合并因而增强这些受体的交联，生成了靶向人死亡受体5(DR5，TRAIL-R2)的三聚化Fab分子。通过标准重组DNA技术，将Fab基因(VHCH1)与衍生自人CMP的短三聚化结构域(Uniprot登录号：P21941；残基454至496，SEQIDNO.:2)融合。在位置458和460处形成链间二硫键桥的半胱氨酸残基与包含残基467至495的螺旋卷曲结构域一起使用。
这个结构域下游添加短FLAG标签序列以更容易检测该蛋白质。常见(Gly4Ser)2接头用来将Fab分子与三聚化结构域连接。图1a)中显示这个设计的示意图。
VHCH1–CMP–FLAG序列(和Fab的相应VLCL序列)与重组嵌合MPSV启动子可操作地融合用于哺乳动物细胞中表达。所用的表达载体还含有oriP序列用于在提供EpsteinBarr大核抗原(EBNA)的细胞中稳定维持质粒。此外，合成的polyA信号序列位于CDS的3'末端。
全部抗体表达载体均使用如Sambrook,J.等人,Molecularcloning:Alaboratorymanual；ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork,1989中所述的标准重组DNA技术生成。根据制造商的推荐使用分子生物学试剂。基因或基因片段通过聚合酶链反应(PCR)扩增或通过自动化基因合成法在GeneartAG(Regensburg，德国)从合成的寡核苷酸生成。通过DNA测序(SynergeneGmbH，瑞士)证实PCR扩增的或亚克隆的DNA片段。将质粒DNA转化至合适的大肠杆菌宿主菌株中并在其中扩增用于使用标准Maxiprep试剂盒(Qiagen)制备转染级质粒DNA。为了产生三聚体分子，使用基于聚乙烯亚胺(PEI)的方法，将HEK293EBNA细胞用编码相应基因的质粒转染。所用的两种表达载体的质粒比例是1:1。将转染的细胞培育7天，之后收获上清液以纯化。为了在500ml摇瓶中生产，在转染之前24小时接种四亿个HEK293EBNA细胞。为了转染，将细胞以210xg离心5分钟，并且将上清液更换为预温的CDCHO培养基。将表达载体混于20mlCDCHO培养基中至最终量200μgDNA。在添加540μlPEI后，将溶液涡旋混合15秒并在室温孵育10分钟。随后，将细胞与DNA/PEI溶液混合，转移至500ml摇瓶并在37℃在具有5％CO2气氛的增湿培养箱中孵育3小时。在孵育时间后，添加160mlF17培养基并且将细胞培育24小时。生产培养基补充有5μM几夫碱。在转染后1日添加1mM丙戊酸并且添加7％Feed1(Lonza)。在培养7天后，收集上清液用于通过在210g离心15分钟纯化。将溶液无菌过滤(0.22μm滤器)，补充叠氮钠至终浓度0.01％w/v，并在4℃保存。
首先通过亲和层析，借助人IgG抗体的CH1结构域，从细胞培养上清液纯化分泌的蛋白。第二个层析步骤是大小排阻层析。对于亲和层析，将上清液加载于柱上，所述柱用CaptureSelectIgG-CH1基质(柱体积＝1ml；BAC，荷兰)装填并用5ml50mM三(羟甲基)-氨基甲烷(TRIS)，100mM甘氨酸，150mM氯化钠，pH8.0平衡。通过用至少10个柱体积50mMTRIS，100mM甘氨酸，150mM氯化钠，pH8.0洗涤移除未结合的蛋白质。将靶蛋白以线性pH梯度经20个柱体积从50mMTRIS，100mM甘氨酸，150mM氯化钠，pH8.0至pH2.0洗脱。随后将柱用10个柱体积50mMTRIS，100mM甘氨酸，150mM氯化钠，pH2.0洗涤。
浓缩步骤后，通过添加1/40(v/v)2MTris，pH8.0中和蛋白质溶液。最后，将蛋白质过滤，之后加载到用pH6.0的20mM组氨酸，140mM氯化钠、0.01％(v/v)Tween-20溶液平衡的HiLoadSuperdex200柱(GEHealthcare)上。
实施例2：包含CMP衍生的三聚化结构域的三聚体单特异性抗原结合分子的表征
使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数，通过在280nm处测量光密度(OD)确定纯化的huCMP融合蛋白的蛋白质浓度。
在还原剂(5mM1,4-二硫苏糖醇；DTT)存在和不存在下通过SDS-PAGE并用考马斯(来自Invitrogen的SimpleBlueTMSafeStain；图2)染色，分析含有huCMP的构建体的纯度和分子量。根据制造商的说明书使用预制凝胶系统(Invitrogen，美国)(4-12％Tris-乙酸盐凝胶或4-12％Bis-Tris)。使用LabChipGXII(Caliper)，在还原剂(Invitrogen)存在和不存在下还通过CE-SDS分析含有huCMP的构建体的纯度和分子量(图3)。
在25℃使用在25mMK2HPO4、125mMNaCl、200mML-精氨酸单盐酸盐、0.02％(w/v)NaN3，pH6.7运行缓冲液中平衡的TSKgelG3000SWXL分析性大小排阻柱(Tosoh)上分析样品的聚集物含量。
使用与TOF6441质谱仪(Agilent)偶联的AgilentHPLC1200，在非还原性和还原条件下通过LC-MS测定含有huCMP的构建体的分子量。为了在还原条件下分析，将样品在37℃在10μl8M胍-HCl和稀释于4M胍-HCl中的10μl0.5mMTCEP中孵育30分钟。未还原的样品直接用于LC-MS分析。使用在表1中所示的程序，在MachereyNagel聚苯乙烯柱；RP1000-8(8μm粒度，4.6x250mm；目录号719510)上进行层析分离。洗脱剂A是在水中的5％乙腈和0.05％(v/v)甲酸，洗脱剂B是95％乙腈、5％水和0.05％甲酸。分离在40℃以流速1ml/分钟进行并且注射7μg(15μl)的样品。
在前4分钟期间，将洗脱物引入废弃物以防止质谱仪遭受盐污染。ESI源以干燥气流12l/分钟，温度350℃和雾化压力60psi运行。使用碎裂电压350V和质量范围700至3200m/z以正离子模式获得MS谱。从4分钟至17分钟通过仪器软件获得MS数据。
时间(分钟) ％B
0.5 15
10 60
12.5 100
14.5 100
14.6 15
16 15
16.1 100
表1:HPLC色谱中用于分离各个化合物用于质谱分析的溶剂混合物。溶剂A是在水中的5％乙腈和0.05％(v/v)甲酸，并且溶剂B是95％乙腈、5％水和0.05％甲酸。
所用的全部分析方法均证实三聚化的分子的均匀制备。表2显示含有huCMP的构建体的纯度，及最终单体含量和质量。表3显示与含有双特异性huCMP构建体相比的产率和热稳定性。
表2：含有单特异性huCMP的构建体的生物化学分析。
通过大小排阻层析(SEC)或通过SDS凝胶中的毛细管电泳法(CESDS)测定纯化的分子的三聚体含量。在层析分离各种组分后，质谱法(LC/MS)测定分子的质量。
实施例3：三聚体单特异性抗原结合分子的结合作用
使用基于细胞的FRET(荧光共振能量转移)测定法(TagLite)确定三聚化的抗DR5Fab的结合能力评定结果。为了制备表达huDR5的细胞，使用lipofectamine，用含有PDGFR跨膜结构域的huDR5-SNAP构建体转染贴壁的HEK293EBNA细胞。转染前一日，将4x106个细胞接种在T75瓶中并在增湿培养箱中在5％CO2气氛下在37℃培育过夜。为了转染，将2μg质粒DNA与30μlLipofectamine2000(Invitrogen，目录号11668-019)和4mlOptiMEM培养基(Gibco)混合并在室温孵育20分钟。将细胞用D-PBS(Gibco)洗涤1次并将转染混合物连同6ml培养基(含有Glutamax、10％FCS和NEAA的DMEM)一起添加至细胞。在37℃在增湿培养箱中伴以5℃CO2气氛孵育20小时后，通过将细胞在37℃在培养箱中与1xTagLite缓冲液(Cisbio)中的100nMLumi4-Tb(Cisbio)孵育1小时，用FRET供体标记表达的抗原。采用TagLite缓冲液的4个洗涤步骤后，利用细胞解离缓冲液使细胞脱离，在TagLite缓冲液中洗涤，并且在Victor3荧光读数仪中在620nm测量384孔平板中来自10000个细胞/孔的Tb的发射。激发波长是343nm。将细胞等分并在-80℃贮藏于冷冻培养基(补充有10％DMSO的培养基)中。为了进行测定法，细胞不得不解冻，用TagLite缓冲液洗涤1次，重悬于TagLite缓冲液中至适宜的细胞数目并直接吸入分析孔中。
为了进行竞争测定法，使用d2标记试剂盒(Cisbio)根据制造商手册，用FRET受体(d2)标记DR5结合物(作为IgG)。
以384孔模式实施通过以下方式进行竞争测定法：添加25nM终浓度的d2标记的抗DR5至1000个表达DR5-Tb的HEK293EBNA细胞/孔，随后在孔中按1:2稀释度从750nM至最终5.8nM添加未标记的抗DR5或抗DR5三聚化的Fab。细胞仅充当空白对照。全部样品均一式两份分析。将平板在室温孵育2小时并且使用TecanInfinite200(Tecan)在620nm处测量Tb的发射信号并在665nm处测量d2的发射信号。来自每个孔的665nm信号对来自相同孔的620nm信号归一化并扣除空白对照。
竞争测定法显示，三聚化的Fab对标记的IgG与细胞上的huDR5的结合的竞争比对未标记的IgG与细胞上的huDR5的结合的竞争强得多，证实构建体是有功能的三聚体形式(图4)。
实施例4：包含胶原蛋白XV衍生的三聚化结构域的三聚体单特异性抗原结合分子的产生和纯化
与通过CMP结构域实验地解决三聚化的同时，使用胶原蛋白XV三聚化结构域，我们测试Fab的三聚化(Cuesta等人,2012,mAbs,第4卷,第2期,226-232)。该设计基本上与CMP相同并且在后接FLAG标签的三聚化结构域之前使N末端处的Fab后接短Gly-Ser接头。表达如上文所述在HEK293-EBNA细胞中进行。不幸地，产率十分低并且产物主要由聚集物组成(数据未显示)。
实施例5：用于DR5的靶向交联的双特异性六价DR5-FAP分子的产生和纯化
为了评价DR5经由第二个三聚体靶向部分的超交联，将FAP(成纤维细胞活化蛋白)特异性结合物在三聚化的DR5Fab(5E11)构建体的C末端融合。图1b)中显示这个设计的示意图。使用相同的FAP抗体(28H1)，生成两种不同分子，作为经(G4S)4接头与三聚体DR5VHCH1链融合的CrossFab(VHCL)或二硫键稳定化的dscFv(H44/L100)。所述分子在HEK293EBNA细胞中瞬时产生(400ml规模，基于PEI转染)并如下纯化：在CaptureSelectIgGCH1柱后，洗脱的抗体进一步通过大小排阻层析(Superose610/300GL)纯化。还在HEK293EBNA细胞中产生包含与CMP三聚化结构域的C末端融合的三聚体FAP(28H1)CrossFab的对照分子。全部分子均如实施例2中所述就产物产率、质量和活性进行表征。表3中显示结果。
表3：单或双特异性三聚体分子的分析
通过动态光散射(DLS)实验分析分子的热稳定性，提示与单特异性分子相比，双特异性分子的稳定性轻微下降。简言之，将30μg蛋白质浓度为1mg/ml的经过滤的蛋白质样品一式两份施加至Dynapro平板读数仪(WyattTechnologyCorporation；美国)。以0.05℃/分钟从25℃至75℃倾斜升温，采集半径和总散射强度。
实施例6：单特异性和双特异性三聚体抗原结合分子的基于细胞的靶结合
为了评价不同分子的基于细胞的靶结合，使用FRET测定法(TagLite，CisBio)，其中表达具有SNAP标签和PDGFR跨膜区(TM)用于胞外展示的DR5或FAP。与标记的抗DR5或抗FAPIgG竞争造成FRET信号减少而测定结合。DR5特异性双价IgG抗体(“5E11IgG”)和具有对DR5特异的两个结合位点、在C末端融合了对FAP特异的两个交叉Fab片段的IgG抗体(5E11_28H1(2+2))充当对照分子。如表4中汇总，如预期那样，5E11IgG和5E11_28H1双特异性分子(2+2样式)显示相似的竞争行为。在另一方面，含有scFv的三聚体5E11Fab和双特异性DR5-FAP三聚体还显示非常相似的竞争结果，但是抗体浓度已经低得多，这表明这些分子以更高亲合力与DR5结合。与之相反，双特异性三聚体Crossfab分子显示在这两个组之间某处的竞争行为，这表明其以比具有双价DR5结合的分子更高的亲和力结合，但以比三聚体构建体更低的亲和力结合。
表4：DR5结合的EC50值
为了评价双特异性三聚化的DR5-FAP分子的功能活性，在共培养测定法中以表达FAP的成纤维细胞细胞系GM05389测定MDA-MB-231乳腺癌细胞凋亡诱导作用。靶细胞凋亡由死亡受体DR5的交联诱导并且可以通过激动性DR5抗体实现。由于凋亡程度直接依赖于DR5的超交联，所以假定与第二细胞(在这种情况下是成纤维细胞细胞系)上表达的各自处于三价形式的DR5和抗原结合将显著增加凋亡诱导作用。图5总结了就凋亡活性而言DR5-FAP双特异性二聚体分子与双特异性三聚体分子的比较。作为对照分子，使用相应的单特异性三聚体DR5和FAP结合物。将成纤维细胞细胞系GM05389以密度104个细胞/孔接种并孵育过夜，之后添加不同浓度的双特异性构建体(和对照分子)。对所述构建体额外孵育10分钟以与FAP结合后，添加104个MDA-MB-231细胞并孵育24小时，之后使用细胞死亡检测ELISA测定法测定凋亡。在表达FAP的成纤维细胞存在或不存在下测定构建体。2+2样式的DR5-FAP双特异性分子仅在成纤维细胞存在下才在宽浓度范围(7.0–0.07nM)显示相当好的凋亡诱导活性，活性在0.007nM处明显降低。与之相反，在高浓度，双特异性三聚体分子(二者均具有与DR5三聚体融合的CrossFab或scFve)在表达FAP的GM05389不存在情况下已经显示明显的凋亡活性。借助成纤维细胞进一步交联显著地增加凋亡诱导并且甚至在最低的浓度(0.007nM)，与DR5和FAP结合的三聚化构建体仍显示极高的活性。对照分子(三聚体5E11和三聚体28H1)分别显示仅低凋亡活性和无凋亡活性。
实施例7：三聚体抗原结合分子在诊断环境下的用途
通过在CMP三聚化结构域的N末端融合与洋地黄毒苷结合的Fab片段，生成另一种三聚化分子(由Metz等人,2011,ProcNatlAcadSciUSA.108(20):8194-8199描述)。在其C末端处，能够与CEA(癌胚抗原)特异性结合的scFv分子用于靶向肿瘤。所产生的分子具有SEQIDNO19和20。最终分子仅由两条链组成并且不需要实施例6那样引入并优化CrossMab技术。这种分子如上文所述克隆、表达和纯化。表5显示纯化后分析性SEC的结果。可以清晰看到，>98％的物质属于单体级分，并且仅<2％是某些寡聚物种类。这显示CMP结构域也可以用来产生Fab-CMP-scFv样式的稳定六价构建体。
表5：抗洋地黄毒苷(Fab-HC)-CMP-抗CEA(scFv)洋地黄毒苷的分析性SEC
以下序列是包含于本发明抗原结合分子中的氨基酸序列。
以下序列是编码包含于本发明抗原结合分子中的氨基酸序列的本发明的多核苷酸。
虽然已经出于清晰理解的目的，以说明和举例方式某种程度地详细描述前述发明，但是这些说明和例子不应当解释为限制本发明的范围。本文中援引的全部专利和科学文献的公开内容通过引用方式明确地完整并入。

Claims (30)

1.三聚体抗原结合分子，包含三个融合多肽，每个融合多肽包含与衍生自人软骨基质蛋白(CMP，SEQIDNO.:1)的三聚化结构域融合的至少一个抗原结合部分，其中所述三聚化结构域能够介导三聚体抗原结合分子的稳定缔合。
2.权利要求1的三聚体抗原结合分子，其中所述三聚化结构域包含与SEQIDNO.:2具有至少95％同一性的序列。
3.权利要求1或2的三聚体抗原结合分子，其中所述三聚化结构域包含SEQIDNO.:2的序列。
4.前述权利要求中任一项的三聚体抗原结合分子，其中三个融合多肽由二硫键连接。
5.前述权利要求中任一项的三聚体抗原结合分子，其中所述抗原结合部分是抗体或抗体片段。
6.前述权利要求中任一项的三聚体抗原结合分子，其中所述抗原结合部分是选自Fab分子、交叉Fab分子、单链Fab分子、Fv分子、scFv分子和单结构域抗体组成的组的抗体片段。
7.前述权利要求中任一项的三聚体抗原结合分子，其中所述融合多肽各自包含与所述三聚化结构域融合的一个抗原结合部分。
8.权利要求7的三聚体抗原结合分子，其中所述抗原结合部分是Fab分子。
9.权利要求8的三聚体抗原结合分子，其中所述Fab分子在Fab重链的C末端氨基酸与所述三聚化结构域的N末端氨基酸融合，任选地通过肽接头融合。
10.权利要求7至9中任一项的三聚体抗原结合分子，其中所述抗原结合部分能够与细胞表面抗原特异性结合。
11.权利要求10的三聚体抗原结合分子，其中所述细胞表面抗原是肿瘤细胞抗原。
12.权利要求1至6的三聚体抗原结合分子，其中每个所述融合多肽包含与所述三聚化结构域融合的两个抗原结合部分。
13.权利要求12的三聚体抗原结合分子，其中第一抗原结合部分与所述三聚化结构域的N末端氨基酸融合，任选地通过肽接头融合，并且其中第二抗原结合部分与所述三聚化结构域的C末端氨基酸融合，任选地通过肽接头融合。
14.权利要求12或13的三聚体抗原结合分子，其中第一抗原结合部分是Fab分子并且第二抗原结合部分是scFv分子或交叉Fab分子。
15.权利要求14的三聚体抗原结合分子，其中所述Fab分子在Fab重链的N末端氨基酸与所述三聚化结构域的C末端氨基酸融合，任选地通过肽接头融合。
16.权利要求12至15中任一项的三聚体抗原结合分子，其中第一或第二抗原结合部分能够与细胞表面抗原特异性结合。
17.权利要求12至15中任一项的三聚体抗原结合分子，其中第一或第二抗原结合部分能够与半抗原特异性结合。
18.权利要求7-11中任一项的三聚体抗原结合分子，基本上由三个融合多肽组成，所述三个融合多肽各自由与所述三聚化结构域融合、任选地通过肽接头融合的抗原结合部分组成。
19.权利要求12-18中任一项的三聚体抗原结合分子，基本上由三个融合多肽组成，所述三个融合多肽各自由与所述三聚化结构域融合、任选地通过肽接头融合的第一和第二抗原结合部分组成。
20.前述权利要求中任一项的三聚体抗原结合分子，其中所述三个融合多肽是相同的。
21.融合多肽，包含与衍生自人软骨基质蛋白(CMP，SEQIDNO:1)的三聚化结构域融合的抗原结合部分，其中所述三聚化结构域能够介导所述融合多肽与两个其他这类融合多肽的稳定缔合。
22.多核苷酸，编码权利要求1-20中任一项的三聚体抗原结合分子或权利要求21的融合多肽。
23.表达载体，包含权利要求22的多核苷酸。
24.宿主细胞，包含权利要求22的多核苷酸或权利要求23的表达载体。
25.产生三聚体抗原结合分子的方法，所述方法包括在适于表达所述三聚体抗原结合分子的条件下培养权利要求24的宿主细胞并且分离所述三聚体抗原结合分子。
26.三聚体抗原结合分子，通过权利要求25的方法产生。
27.药物组合物，包含权利要求1-20或26中任一项的三聚体抗原结合分子和可药用载体。
28.权利要求1-20或26中任一项的三聚体抗原结合分子，或权利要求27的药物组合物，其用作药物。
29.权利要求1-20或26中任一项的三聚体抗原结合分子，或权利要求27的药物组合物，其用于治疗癌症。
30.如上文所述的本发明。
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