CN101445559A - 三聚体可溶抗体与其产生及使用的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及胶原蛋白支架，其中此支架包含可自我形成三聚体化(self－trimerization)的胶原蛋白(collagenous)区或胶原蛋白样(collagen－like)区。当一个或多个异源(heterologous)区，例如抗体区，与此胶原蛋白支架相互融合成一蛋白质复合物(complex)，该胶原蛋白支架可驱动异源区的三聚体化。本发明亦揭露产生与利用此蛋白质复合物的方法。

Description

三聚体可溶抗体与其产生及使用的方法
技术领域
本发明涉及一种具有胶原蛋白支架区的抗体，并且特别涉及一种三聚体可溶抗体。
背景技术
基于蛋白质的结合试剂(protein-based binding reagent)在治疗或诊断应用上具有多种用途。抗体就是个极佳的范例，许多单克隆抗体(monoclonalantibodies，mAbs)(以下简称mAbs)已经成功地用来治疗癌症、感染性疾病与炎性疾病(inflammatory diseases)(Adams et al.，Nat.Biotechnol.2005Sep；23(9)：1147-57.)。
抗体的亲合力是试剂成功与否的关键因素。具有高亲合力的抗体可与天然的配体(ligand)为了目标受体(targeted receptor)有效地竞争以减少剂量、毒性与花费。抗原结合部位(antigen binding site)的多聚化(multimerization)已被证实是增加抗体对抗原结合的整体强度的有效方式，其中将抗体对抗原结合的整体强度定义为抗体亲合力(antibody avidity)(功能性亲和力(functional affinity))(Miller et al.，J Immunol 170：4854-4861，2003；Rheinnecker et al.，J Immunol157：2989-2997，1996；Shopes，J Immunol 148：2918-2922，1992；Shuford et al.，Science 252：724-727，1991；Wolff et al.，J Immunol 148：2469-2474，1992)。由于免疫球蛋白G(immnoglobin G，IgG)(以下简称IgG)分子结构的二价(bivalent)的本质，不能用来同时结合多于两个以上不同的抗原。因此需要多价(multi-valent)或多重特异性(multi-specific)蛋白质结合试剂。在一些实例中，为了减少刺激细胞分裂副作用(mitogenicity side-effect)，必须藉由设计Fc区域来避免效应子功能(effector function)，例如抗体依赖型细胞介导的细胞毒性作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)以及补体依赖型细胞毒性作用(complement dependent cytotoxicity，CDC)。例如，鼠科动物抗-人类CD3单克隆抗体(正纯种系(Orthoclone)OKT3，莫罗单抗-CD3(Muromonab-CD3))是以人类T细胞上的T-细胞受体/CD3复合物(T-cellreceptor(TCR)/CD3 complex)为标靶的强而有力的免疫抑制剂，已有二十年的时间。其用来预防或治疗器官同种异体移植排斥(allograft rejection)(Cosimi etal.，N Engl J Med 305：308-314，1981；Group，N Engl J Med 313：337-342，1985；Kung et al.，Science 206：347-349，1979)。然而使用这种治疗的一个主要缺点是细胞因子(cytokine)，例如TNF-α、IL-2与IFN-γ的全身性释放，其导致一系列有害的促有丝分裂作用(mitogenic effects)，包括感冒样症状(flu-likesymptoms)、呼吸窘迫(respiratory distress)、神经症状(neurological symptoms)与急性肾小管坏死(acute tubular necrosis)(Abramowicz et al.，Transplantation47：606-608，1989；Chatenoud et al.，N Engl J Med 320：1420-1421，1989；Goldman et al.，Transplantation 50：158-159，1990；Toussaint et al.，Transplantation 48：524-526，1989)。因为OKT3与其它抗-CD3mAbs的促有丝分裂作用依赖于通过与带有Fc受体的细胞(FcR-positive cell)(例如单核细胞(monocyte))的大量的TCR/CD3交联(cross-linking)，因此最近有许多研究都希望藉由改变与FcR的结合，发展抗-CD3抗体的非促有丝分裂作用型(nonmitogenic forms)。由以上说明可知，目前亟需一种具有高亲合力、低促有丝分裂作用和体内高稳定性的蛋白质结合试剂。
胶原蛋白是存在于哺乳动物中最充足的蛋白质。其为一种细胞外基质蛋白(extracellular matrix protein)，包括一个或多个三重螺旋区(胶原蛋白区)，具有三个一组重复的序列甘氨酸(Gly)-X-Y，其中X与Y通常为脯氨酸(proline)(氨基酸密码为P或Pro)与羟脯氨酸(hydroxyproline)(氨基酸密码为O或Hyp)。这种三个一组的存在形式允许三个胶原蛋白多肽链(α-链)折叠成一个三重螺旋构造。许多具有胶原蛋白三重螺旋区域(collagenous domain)的胶原蛋白样蛋白存在于人类血清中，在保护防止其它感染性生物上扮演先天性免疫系统(innate immune system)的角色。这些包括补体蛋白质Clq、巨噬细胞受体(macrophage receptor)、胶凝素家族蛋白质-甘露糖结合凝集素(mannose bindinglectin，MBL)、纤维胶凝蛋白(ficolin)、表面活性蛋白质(surfactant protein)A与D(SP-A与SP-D)。而这些“防御胶原蛋白”共同的结构特征为多蛋白质单位，具有在C端的目标结合区。因此多聚化(multimerization)显著增加这些防御胶原蛋白分子的结合区的功能性亲合力。
通过使用同源或异源三聚体化区融合至胶原蛋白区以驱使胶原蛋白的三重结构形成，已经实现了包含胶原蛋白区的异源融合蛋白质的三聚体化。三聚体化区的例子包括原胶原蛋白(procollagen)的C前肽(propeptide)、凝集素家族蛋白质的卷曲螺旋颈区(coiled-coil neck domain)、FasL的C端部分与噬菌体T4 fibritin折叠区(Frank et al.，(2001)J Mol Biol 308：1081-1089；Holler et al.，(2003)Mol Cell Biol 23：1428-1440；Noppe et al.，(1994)FEBS Lett344：191-195)。
纤维状胶原蛋白(I、II、III、IV、V与XI型)与凝集素家族蛋白质的三聚体配装分别藉由其大的球状C端区(C前肽，约250个氨基酸)与C端卷曲螺旋颈区(约35个氨基酸)，且以类似拉链的方式(zipper-like fashion)从C端至N端产生胶原蛋白区的延伸(Bachinger et al.，(1980)Eur J Biochem 106：619：632；Hakansson et al.，(1999)Structure 7：255-264；Hakansson and Reid，(2000)Protein Sci 9：1607-1617；Prockop and Kivirikko，(1995)Annu Rev Biochem64：403-434；Sheriff et al.，(1994)Nat Struct Biol 1：789-794；Weis and Drickamer，(1994)Structure 2：1227-1240)。
Gly-Pro-Hyp序列是胶原蛋白中最稳定的序列，一般情况下三个为一组，并且肽(Gly-Pro-Hyp)10可自身结合成高度稳定的三重螺旋结构(Chopra andAnanthanarayanan，(1982)Proc Natl Acad Sci USA 79：7180-7184；Engel et al.，(1977)Biopolymers 16：601-622；Sakakibara et al.，(1973)Biochim Biophys Aeta303：198-202；Yang et al.，(1997)J Biol Chem 272：28837-28840)。与化学合成的(Gly-Pro-Hyp)10肽相比，在生理环境下(Gly-Pro-Pro)10肽不会自身配装成稳定的三重螺旋结构(Engel et al.，(1977)Biopolymers 16：601-622)。为了获得热稳定(Gly-Pro-Pro)10三重螺旋体，有两种方法已被描述。第一，在20℃下，藉由体外第III型胶原蛋白的C端或N端邻接的胶原蛋白样肽的二硫键的氧化还原改组(redox shuffling)制程获得链内二硫键结合的(Gly-Pro-Pro)10三重螺旋体(Boudko et al.；(2002)J Mol Biol 317：459-470；Frank et al.，(2003)J Biol Chem278：7747-7750)。第二，将衍生自噬菌体T4 fibritin的稳定异源三聚体化折叠区融合至(Gly-Pro-Pro)10肽的C端以驱使在缺乏脯氨酸-4-羟化酶(prolyl-4-hydroxylase，P4H)的大肠杆菌(E.coli)表达系统中的三聚体化与正确折叠(Frank et al.，(2001)J Mol Biol 308：1081-1089)。许多研究已对G-X-Y重复序列进行了熔点与稳定性实验(Frank et al.，(2001)；Persikov et al.，(2000)Biochemistry 39，14960-14967；Persikov et al.，(2004)Protein Sci.13：893-902；and Mohs et al.，(2007)J Biol.Chem.282：29757-29765)。根据这些研究，可预测多种重复结构的稳定性。
上述的方法在使用上有其限制，因为其可能不支持异源多肽的三聚体化与折叠，且其可能引入与免疫反应风险相关的异源抗原片段，而此异源抗原片段会严重限制潜在的治疗应用。因此目前所需的是一种体内表达系统，其具有形成热稳定三重螺旋结构的能力，而此热稳定三重螺旋结构驱动三聚体融合蛋白的形成，以及需要使这种三聚体化多肽在体外与体内皆可使用。
具有功能性三重螺旋结构的胶原蛋白与含羟脯氨酸的肽的重组表达需要特定的翻译后酶，特别是脯氨酸-4-羟化酶(Prockop and Kivirikko，(1995)AnnuRev Biochem 64：403-434)。一般藉由脯氨酸-4-羟化酶将位于胶原蛋白的Gly-X-Y区Y位置的脯氨酸转录后修饰成4-羟脯氨酸以稳定胶原蛋白的三重螺旋结构。在缺乏脯氨酸羟基化的情况下。胶原蛋白所必须的三重螺旋结构在生理温度下为热不稳定(Berg and Prockop，(1973)Biochem Biophys ResCommun.52：115-120；Rosenbloom.et al.，(1973)Arch Biochem Biophys158：478-484)。原核细胞不会产生任何脯氨酸-4-羟化酶活性。酵母与昆虫细胞所具有的酶活性对于达到表达重组的胶原蛋白而言并不充足，除非同时引入外源性脯氨酸-4-羟化酶的基因以形成活化的α2β2四聚体。
非纤维状具有中断的三重螺旋的原纤维伴随性胶原蛋白(fibril-associatedcollagen with interrupted triple-helices，FACIT)(IX、XII、XIV、XVI、XIX、XX、XXI与XXII型)为胶原蛋白家族中的亚组(subgroup)。它的存在是为了连接纤维状胶原蛋白与其它基质成分或细胞(Shaw and Olsen，(1991)TrendsBiochem Sci 16：191-194)。在非纤维状具有中断的三重螺旋的原纤维伴随性胶原蛋白中，由四个氨基酸分开的保守的半胱氨酸位于C端胶原蛋白(C-terminalcollagenous，COL1)与非胶原蛋白(noncollagenous，NC1)区的接合点，且其负责三个聚集的胶原蛋白链的链内二硫键键合(Mazzorana et al.，(2001)J BiolChem 276：27989-27998)。
包括末端C端胶原蛋白与非胶原蛋白区的XII与XXI型迷你胶原蛋白(minicollagen)与人类脯氨酸-4-羟化酶的基因的两个亚单位一起分别被共表达于经杆状病毒(baculovirus)感染的甘蓝尺蠖(Trichoplusia ni)与果蝇(Drosophila)S2昆虫细胞中(Mazzorana et al.，(2001)J Biol Chem 276：27989-27998；Li et al.，(2005)Biochem Biophys Res Commun 336：375-385)。第XII与XXI型迷你胶原蛋白三重螺旋的折叠优先于二硫键连接的形成。在第XXI型迷你胶原蛋白中不充足的羟脯氨酸化将导致链内二硫键连接的二聚体与链间二硫键连接的单体的产生(Li et al.，(2005)Biochem Biophys Res Commun 336：375：385)。Mazzorana等已显示包含鸡胶原蛋白XII完整的NC1区与COL1区的仅5个末端G-X-Y重复序列的构建体不可形成三聚体。COL1的5个额外的C端G-X-Y重复序列的存在使三聚体可以形成。Mazzorana所使用的构建体包括作为标记的人类c-myc蛋白质的片段。就其本身而论，Mazzorana并未提出具有这些序列的三聚体化对于附加分子(attached molecule)的折叠或功能的影响，或者高分子量附加分子(诸如蛋白质分子)对于自身三聚体化的影响。
发明内容
本发明揭露与三聚体抗体有关的组合物、方法与试剂盒。此抗体具有高亲合力、低有丝分裂的作用(mitogenic effects)与高体内稳定性等特性。并且，此抗体可为多价或多重特异性(multi-specific)。
本发明揭露由三条多肽所组成的三聚体可溶抗体。其中，每条多肽包括由至少10个G-X-Y氨基酸重复序列所组成的胶原蛋白支架区(G为甘氨酸，X与Y则可为任何氨基酸)；此10个G-X-Y重复序列的组成可为G-P-P或G-P-O，且至少6个G-X-Y重复序列可由G-P-O所构成(P为脯氨酸，而O为羟脯氨酸)。除了胶原蛋白支架区，上述多肽还包含抗体区。所述三条多肽的胶原蛋白样支架区可交互作用而形成三聚体可溶抗体，此三聚体可溶抗体以至少107M-1(以平衡结合常数(equilibrium association constant)KA表示)的亲合力，特异性结合至配体。
本发明也包括一种三聚体可溶抗体，其包括三条多肽，其中各多肽包括：胶原蛋白支架区，包括至少10个G-X-Y氨基酸重复序列(其中G为甘氨酸，X与Y可为任何氨基酸)；在一实施例中，至少6个Y是由羟脯氨酸所构成。除了胶原蛋白支架区，上述多肽还包含抗体区。所述三条多肽的胶原蛋白支架区可交互作用而形成三聚体可溶抗体，此三聚体可溶抗体以至少107M-1的亲合力，特异性结合至配体。
本发明也包括一种三聚体可溶抗体，其包括三条多肽，其中各多肽包括：胶原蛋白支架区，由至少6、7或8个G-P-O氨基酸重复序列所构成。除了胶原蛋白支架区，上述多肽还包含抗体区。所述三条多肽的胶原蛋白支架区可交互作用而形成三聚体可溶抗体，此三聚体可溶抗体以至少107M-1的亲合力，特异性结合至配体。
在某些实施例中，该三聚体可溶抗体以至少108M-1或109M-1的亲合力，特异性结合至配体。
在某些实施例中，可与该三聚体可溶抗体相结合的配体为：人类上皮生长因子受体、人类CD3、人类HER2/neu、或人类TNF-α。
三聚体可溶抗体更可包含标记多肽的编码序列。在一优选实施例中，此标记多肽为荧光酶多肽。在另一优选实施例中，标记多肽为绿色荧光多肽。
在一实施例中，胶原蛋白样区包括(G-P-P/O)10的序列。在一实施例中，各多肽包括少于13个G-X-Y重复序列。在一实施例中，各多肽包括少于20个G-X-Y重复序列。在一实施例中，各多肽包括少于30个G-X-Y重复序列。在一实施例中，各多肽包括少于50个G-X-Y重复序列。
在一实施例中，各多肽不包括胶原蛋白NC1区。在一实施例中，各多肽不包括二硫键结(disulfide knot)。在一实施例中，各多肽不包括噬菌体T4fibritin折叠区。
在一实施例中，各多肽的分子量小于42kD。在一实施例中，三聚体可溶抗体的分子量小于130kD。
在一实施例中，1/3以上的G-X-Y重复序列为G-P-P或G-P-O。在一实施例中，1/2以上的G-X-Y重复序列为G-P-P或G-P-O。在一实施例中，2/3以上的G-X-Y重复序列为G-P-P或G-P-O。在一实施例中，3/4以上的G-X-Y重复序列为G-P-P或G-P-O。在一实施例中，所有的G-X-Y重复序列为G-P-P或G-P-O。在一实施例中，胶原蛋白样区包括由(G-P-P/O)5GKPGKP(G-P-P/O)6构成的序列。
本发明包括可制造出三聚体可溶抗体的核酸序列。本发明进一步包括用以表达该三聚体可溶抗体的载体，当该载体被引入宿主细胞时，可在细胞内表达该三聚体可溶抗体。本发明也包括宿主细胞，其包含可表达上述三聚体可溶抗体的载体。
本发明包括产生三聚体抗体的方法与试剂盒，其中该方法或试剂盒包含：将可表达胶原蛋白支架区的核酸序列，读框融合(in-frame fusion)至可表达抗体区的核酸序列，其中该胶原蛋白支架区包括10-30个G-X-Y氨基酸重复序列(G为甘氨酸，X与Y可为任何氨基酸)，且至少10个G-X-Y重复序列为G-P-P。读框融合两段核酸序列后，利用细胞将该融合序列所对应的多肽表达出来，其中在该多肽链中至少有6个G-X-Y重复序列(G为甘氨酸，X与Y可为任何氨基酸)的Y位置是被羟脯氨酸化的。上述三条多肽，其经羟脯氨酸化的胶原蛋白支架区，可交互反应而形成三聚体可溶抗体，此抗体可以至少107M-1的亲合力，特异性结合至配体。
本发明揭露一种调节(即抑制或提高)配体的生物活性的方法与试剂盒，包括将三聚体可溶抗体与该配体一起培养，而该三聚体可溶抗体包括三条多肽，其中各多肽包括：胶原蛋白支架区，包括至少10个G-X-Y重复序列(G为甘氨酸，X与Y可为任何氨基酸)，其中至少10个G-X-Y重复序列可为G-P-P或G-P-O，且至少6个G-X-Y重复序列可为G-P-O(P为脯氨酸，O为羟脯氨酸)；除了胶原蛋白支架区，上述多肽还包含抗体区。所述三条多肽的羟脯氨酸化的胶原蛋白支架区，可互相作用而形成三聚体可溶抗体，此三聚体可溶抗体以至少107M-1的亲合力，特异性结合至配体。藉由该三聚体可溶抗体与该配体的相互结合，可抑制该配体的生物活性。
本发明包括一种检测配体的方法与试剂盒，包括：1)将三聚体可溶抗体与配体一起培养，其中该三聚体可溶抗体由三条多肽所构成，且各多肽包括胶原蛋白支架区，由至少10个G-X-Y重复序列(G为甘氨酸，X与Y可为任何氨基酸)所构成，其中至少10个G-X-Y重复序列为G-P-P或G-P-O，且至少6个G-X-Y重复序列为G-P-O(P为脯氨酸，O为羟脯氨酸)，除了胶原蛋白支架区，上述多肽还包含抗体区，所述三条多肽的羟脯氨酸化的胶原蛋白支架区，可交互作用而形成三聚体可溶抗体，此三聚体可溶抗体可以至少107M-1的亲合力，特异性结合至配体；以及2)检测该三聚体可溶抗体对该配体的结合。
在一些实施例中，三聚体可溶抗体包括荧光素酶多肽或绿色荧光多肽。
为了让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举优选实施例，并配合所附图示，作详细说明如下：
附图说明
图1显示蛋白质复合物，其具有自身配装三重螺旋胶原蛋白支架区，例如源自人类迷你胶原蛋白XXI型或胶原蛋白样区的(GPP)10，以及异源区。
图2A与2B分别为(A)三聚体胶原蛋白支架抗体(CSA)，其包括源自OKT3(抗CD3)、528(抗EGFR)或erb(抗EGFR)的氨基端scFv，其分别读框融合至人类IgG的铰链区、人类迷你胶原蛋白XXI型，跟随着组氨酸标记。虚线：链内二硫键；(B)蛋白质复合物的Western印迹的结果图。OKT3mC21包括源自OKT3IgG的氨基端抗CD3、人类IgG的铰链区、人类迷你胶原蛋白XXI型多肽，跟随着组氨酸标记；OKT3mC21fd包括源自OKT3 IgG的氨基端抗CD3、人类IgG的铰链区、人类迷你胶原蛋白XXI型多肽，跟随着T4 fibrtin折叠区与组氨酸标记。将培养稳定转染的果蝇S2细胞的培养基在非还原环境下于SDS-PAGE上进行电泳之后，并以对胶原蛋白XXI型C端的单克隆抗体，3E2，进行免疫印迹。T：链内二硫键连接的三聚体；Mt：包含分子间二硫键连接的三聚体的单体。
图3显示双重特异性的三聚体胶原蛋白支架抗体，包括氨基端OKT3单链抗体(OKT3_scFv)、人类IgG的铰链区、人类迷你胶原蛋白XXI型，跟随着C端528单链抗体(528_scFv)。
图4A(a-e)与4B(a-c)为不同形式的抗体的图式：(A)三聚体胶原蛋白支架抗体：scFv-Col(a)包括氨基端scFv、人类IgG的铰链区、胶原蛋白样区(GPP)10与胶原蛋白XXI型的羧基端NC1区；scFv-GPP10(b)包括氨基端scFv与胶原蛋白样区GSP(GPP)10GPS；Col-scFv(c)包括氨基端二硫键结(TCPPCPRSIP)、胶原蛋白样区(GPP)10，跟随着源自胶原蛋白XXI型的NC1区的羧基端二硫键结(GICDPSLC)与scFv；BiscFv-Col(d)包括氨基端scFv1、人类IgG的铰链区、胶原蛋白样区(GPP)10，跟随着羧基端二硫键结(GICDPSLC)与scFv2；scFv-Col-Lue(e)包括氨基端scFv、人类IgG的铰链区、胶原蛋白样区(GPP)10，跟随着羧基端二硫键结(GICDPSLC)与荧光酶；(B)从左至右：(a)免疫球蛋白G(IgG)，(b)嵌合(scFv-Fc)与(c)单链抗体(scFv，灰色区域)。虚线：链内二硫键。
图5A-B显示在哺乳动物细胞中，各种抗体分子的纯化与结构特征。(A)显示的抗体于哺乳动物细胞中被稳定地表达，且藉由柱层析将其从细胞培养基中纯化。将样本于具有MOPS缓冲溶液的10％ SDS/Bis-Tris聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel)进行电泳，在非还原环境下(第1-5泳道)与还原环境下，而在还原环境下样本于70℃下以50mM DTT处理10分钟(第6-10泳道)。(B)藉由两个三聚体分子的链内二硫键合形成erb_scFv-Col六聚体。将纯化的erb_scFv-Col(1mg/ml)于37℃下，缺乏(第1泳道)或存在(第3泳道)10mMDTT的情形下培养1小时。将经DTT处理的样本进一步与50mM N-乙基顺丁烯二酰亚胺(N-ethyl-maleimide)于室温反应30分钟(第2泳道)。将育有相同蛋白质量的样本于7％ SDS/Bis-Tris聚丙烯酰胺凝胶进行电泳以醋酸钠作为电泳缓冲液。将凝胶以考马斯蓝进行染色。“M”为分子量标准品。
图6A-B显示erb_scFv-Col的三聚体结构的热稳定性。(A)将于包含2M尿素的50mM Tris-HCl(pH8)中的纯化erb_scFv-Col在室温下以缺乏(第1-3泳道)或存在(第4-9泳道)10mM TEPC进行处理。在室温下以50mM N-乙基顺丁烯二酰亚胺烷基化还原的样本。所有具有相同蛋白质量的样本在指定温度下热处理10分钟，之后立即加入SDS加样缓冲溶液。在非还原环境下，将样本于具有MOPS缓冲溶液的10％ SDS/Bis-Tris聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。将凝胶以考马斯蓝进行染色。(B)在于(a)中的不同温度下定量还原/烷基化的erb_scFv-Col三聚体的水平(第4-9条)。使用密度计(densitometer)来对蛋白质条带的密度进行定量。在各温度点的三聚体或单体的总量标准化(normalized)为100。
图7显示在酸水解后erb_scFv-Col的苯氨基硫甲酰基(phenylthiocarbamyl，PITC)氨基酸衍生物的HPLC洗提量变曲线。在酸水解后，erb_scFv-Col的苯氨基硫甲酰基衍生氨基酸被分离于逆相C18硅柱且在254nm检测到PTC色基(chromophores)。羟脯氨酸衍生物的波峰位置以箭号指示。
图8A-C显示EGFR的细胞外区与erb_scFv-Col(A)、erb_scFv-Fc(B)或erb_scFv(C)之间互相作用的表面等离振子共振分析。各抗体于指定浓度被注入且流动于在涂布有固定化的EGFR细胞外区的芯片上，以10μl/分钟的流速。
图9显示OKT3置换分析。将人类CD3(+)T细胞与连续稀释的OKT3_scFv-Col或OKT3 IgG一起培养1小时。加入饱和量的OKT3-FITC额外培养1小时。清洗细胞并将其固定；藉由流式细胞技术将OKT3-FITC进行定量。当藉由加入无先前阻碍的抗体的OKT3-FITC来测量时，以最大荧光的百分比抑制来表达数值。
图10A-B显示胶原蛋白支架抗体分子的稳定性。(A)于人类血清中各种形式的erb抗体的稳定性。藉由培养在37℃下人类血清中来测定erb_scFv-Col、erb_scFc-Fv或erb_scFv的稳定性。使用抗c-myc mAb藉由ELISA来测定在各种时间培养后所保留的活化抗EGFR的量。(B)于小鼠中的erb_scFv-Col的药物动力学。以2mg/Kg的erb_scFv-Col对雄性C57BL/6小鼠进行静脉内注射。在不同时间点取出血液样本，使用结合HRP的兔抗c-myc抗体藉由ELISA来测定erb_scFv-Col于血浆中的水平。在各时间点的结果为取自于三只动物的平均，而误差棒(error bar)则代表标准差。
图11A-B OKT3衍生胶原蛋白支架抗体为非有丝分裂的，具有有效免疫抑制活性。(A)T细胞增殖对OKT3 IgG与OKT3_scFv-Col的反应。从三位健康正常的捐献者收集人类外周血单核细胞，且将其单独于连续对数稀释的OKT3 IgG或OKT3_scFv-Col培养72小时，加上10μM BrdU再额外培养8小时。藉由BrdU-ELISA使用化学发光(chemiluminescence)免疫分析来测量细胞增殖以定量在DNA合成期间的BrdU合并。各点以三个捐献者的平均值±标准差来表示。(B)藉由OKT3 IgG与OKT3_scFv-Col抑制混合淋巴球反应。将反应者外周血单核细胞与丝裂霉素C处理的刺激者在不同浓度的OKT3IgG(实心圆)与OKT3_scFv-Col(空心圆)存在的情况下共培养五天，再加上BrdU额外处理16小时。以BrdU-ELISA测量细胞增殖。将反应者外周血单核细胞与丝裂霉素C处理的刺激者在缺乏抗体存在的情况下共培养五天，分别以实心方框与实心三角表示。在缺乏抗体的条件下，未处理刺激者PBMC的细胞增殖以空心方框表示。
图12A-F显示藉由OKT3 IgG与OKT3_scFv-Col诱发的细胞因子释放。自健康正常的捐献者收集人类外周血单核细胞，并且单独与连续对数稀释的OKT3 IgG(实心圆)或OKT3_scFv-Col(空心圆)一起培养。于细胞培养悬浮液中，IL-2与其它细胞因子的浓度分别在24与72小时两个时间点以ELISA测量。各点以三个捐献者的平均值±标准差显示。
图13A-B显示Col-erb_scFv的纯化。(A)胶原蛋白支架抗体，Col-erb_scFv的图式，Col-erb_scFv包括氨基端二硫键结(TCPPCPRSIP)、胶原蛋白样区(GPP)10，被C端二硫键结(GICDPSLC)源自XXI型胶原蛋白的NC1区以及erb_scFv(抗EGFR)跟随着。(B)Col-erb_scFv的纯化。藉由柱层析从细胞培养基中纯化于小鼠骨髓瘤NS0细胞中稳定表达重组的Col-erb_scFv。将样本于具有MOPS缓冲溶液的10％ SDS/Bis-Tris聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，在非还原环境下(第1泳道)与还原环境下，而在还原环境下样本于70℃下以50mMDTT处理10分钟(第2泳道)。以ImperialTM蛋白质染色溶液(PierceBiotechnology，Inc.)对凝胶进行染色。
图14A-C显示胶原蛋白支架抗体的胶原蛋白支架肽，包括(GPP)10藉由其自身可驱动热稳定非共价键合三聚体融合蛋白质的形成。(A)胶原蛋白支架抗体，erb_scFv-GPP10的图式，erb_scFv-GPP10包括氨基端erb_scFv(抗EGFR)以及胶原蛋白样区GSP(GPP)10GSP。(B)erb_scFv-GPP10的三聚体结构的热稳定。将于包含2M尿素的50mM Tris-HCl(pH8)中的纯化erb_scFv-GPP10在室温下以缺乏(第1-3泳道)或存在(第4-9泳道)10mM TEPC进行处理。所有具有相同蛋白质量的样本在指定温度下以热处理10分钟，之后立即加入SDS加样缓冲溶液。在非还原环境下，将样本于具有MOPS缓冲溶液的10％SDS/Bis-Tris聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。将凝胶以ImperialTM蛋白质染色溶液(Pierce Biotechnology，Inc.)进行染色。(C)藉由ELISA测定erb_scFv-GPP10对EGFR-ECD的结合。将96孔微量测试板用1μg/ml EGFR-ECD涂布，之后与各种浓度纯化的erb_scFv-GPP10与HRP连结抗c-myc抗体一起培养。于450nm测量吸收。
图15A-C显示763_scFv-Col的纯化与特征。(A)胶原蛋白支架抗体，763_scFv-Col的图式，763_scFv-Col包括氨基端763_scFv(抗EGFR)、突变的人类IgG铰链区、胶原蛋白样区(GPP)10，被XXI型胶原蛋白的C端二硫键结(GICDPSLC)跟随着。(B)藉由柱层析从细胞培养基中纯化于小鼠骨髓瘤NS0细胞中稳定表达重组的763_scFv-Col。将样本于具有MOPS缓冲溶液的10％SDS/Bis-Tris聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，在非还原环境下(第1泳道)与还原环境下(第2泳道)。(C)藉由763_scFv-Col抑制EGFR的EGF诱发酪氨酸磷酸化(tyrosine phosphorylation)。在缺乏或存在763_scFv-Col(0.2-150nM)的条件下，将A431细胞与或不与16nM EGF一起培养30分钟。在还原环境下，细胞溶解物(cell lysate)于具有MOPS缓冲溶液的10％SDS/Bis-Tris聚丙烯酰胺凝胶进行分离。将从不同细胞溶解物提取出的等量总蛋白质加样至各泳道中。使用抗磷酸化酪氨酸(phosphotyrosine)mAb藉由Western印迹检测。于细胞溶解物中的EGFR酪氨酸磷酸化。使用抗β肌动蛋白(β-actin)作为加样对照组。在缺乏抗体的条件下，将EGF诱发EGFR酪氨酸磷酸化指定为100％。
图16A-C显示763_CSA2的纯化与特征。胶原蛋白支架抗体，763_CSA2的图式，763_CSA2包括氨基端氨基端763_scFv(抗EGFR)、突变的人类IgG铰链区、胶原蛋白样区(GPP)5GKPGKP(GPP)6，被XXI型胶原蛋白的C端二硫键结(GICDPSLC)跟随着。(B)三聚体的确认。将样本于具有MOPS缓冲溶液的10％SDS/Bis-Tris聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，在非还原环境下(第2泳道)。第1泳道为分子量标准品。(C)藉由ELISA测定763_CSA2对EGFR的结合。将96孔微量测试板用1μg/ml EGFR涂布，且之后与各种浓度纯化的763_CSA2与HRP连结抗c-myc抗体一起培养。于450nm测量吸收。
图17A-C显示双重特异性CSA，763CSAOKT3的纯化与特征。(A)胶原蛋白支架抗体，763CSAOKT3的图式，763CSAOKT3包括氨基端氨基端763_scFv(抗EGFR)、突变的人类IgG铰链区、胶原蛋白样区(GPP)10，被XXI型胶原蛋白的C端二硫键结(GICDPSLC)与C端OKT3_scFv(抗CD3)跟随着。(B)包含重组的双重特异性763CSAOKT3抗体的细胞培养基的Western印迹分析。从四个不同的稳定复制(号码从1-4)而来的各20μl的细胞培养基，在非还原与还原环境下，于具有MOPS缓冲溶液的10％ SDS/Bis-Tris聚丙烯酰胺凝胶进行分离，且之后以抗c-myc mAb进行免疫印迹分析。以过氧化酶(peroxidase)连结抗小鼠二次抗体检测固定的抗体。(C)763CSAOKT3的纯化。藉由柱层析从细胞培养基中纯化于小鼠骨髓瘤NS0细胞中稳定表达重组的763CSAOKT3。将样本于具有MOPS缓冲溶液的10％ SDS/Bis-Tris聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，在非还原环境下(第1泳道)与还原环境下，而在还原环境下样本于70℃下以50mM DTT处理10分钟(第2泳道)。以ImperialTM蛋白质染色溶液(Pierce Biotechnolo gy，Inc.)对凝胶进行染色。
图18显示双重特异性CSA，763CSAOKT3，交联A431(具有EGFR)与人类CD3(+)T细胞的流式细胞分析。于缺乏(A)或存在1:4(B)；1:2(C)稀释的包含重组的763CSAOKT3抗体的培养基中，混合等量(1×106细胞)的PKH-67标记的A431细胞与PKH-26标记的人类CD3(+)T。
图19A-C显示双功能CSA，h4D5CSA-Luc的纯化与特征。(A)胶原蛋白支架抗体，h4D5CSA-Luc的图式，h4D5CSA-Luc包括氨基端氨基端h4D5_scFv(抗HER2/neu)、突变的人类IgG铰链区、胶原蛋白样区(GPP)10，被XXI型胶原蛋白的C端二硫键结(GICDPSLC)与C端Gaussia荧光酶跟随着。(B)h4D5CSA-Luc的纯化。藉由柱层析从细胞培养基中纯化于小鼠骨髓瘤NS0细胞中稳定表达重组的h4D5CSA-Luc。将样本于具有MOPS缓冲溶液的10％SDS/Bis-Tris聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，在非还原环境下(第2泳道)与还原环境下，而在还原环境下样本于70℃下以50mM DTT处理10分钟(第3泳道)。以ImperialTM蛋白质染色溶液(Pierce Biotechnology，Inc.)对凝胶进行染色。第1泳道为分子量标准品。(C)藉由ELISA测定h4D5CSA-Luc对HER2/neu过量表达的SKOV-3细胞的结合。96孔微量测试板被5×104细胞涂布且与两倍连续稀释的纯化h4D5CSA-Luc一起培养。在以PBS/1％BSA清洗测试板后，藉由化学发光与生物荧光的附加来检测固定的抗体，以微盘式光度计(microplate luminometer)来获得数值。分析样本三次。
图20A-B显示357_scFv-Col的纯化与特征。(A)藉由柱层析从细胞培养基中纯化于小鼠骨髓瘤NS0细胞中稳定表达重组的抗体。将样本于具有MOPS缓冲溶液的10％ SDS/Bis-Tris聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，在非还原环境(第1泳道)与还原环境(第2泳道)下。藉由357_scFv-Col与357IgG中和L929细胞的TNF-α诱发细胞凋亡。将L929小鼠纤成纤维细胞(fibroblast)(5×103细胞)与包含2μg/ml放线菌素D与10ng/ml人类重组TNF-α的357_scFv-Col或357IgG一起培养24小时。藉由MTT分析测定TNF-α诱发的细胞毒性。藉由在460nm测量光学密度来测定可见细胞的数目。使用公式来计算藉由抗体TNF-α的中和：％中和＝100×(细胞毒性对照-细胞毒性Ab)/细胞毒性对照；％细胞毒性＝100×(A对照-A检测)/A对照，其中A对照为在对照组孔的吸收(不具TNF-α)，而A检测为在具有TNF-α(细胞毒性对照)或具有TNF-α的抗体(细胞毒性Ab)的孔的吸收。
主要附图标记说明
101～异源区；
103～支架区
201～OKT3、528或erb的scFv
203、303、403、1503、1603、1703、1903～IgG铰链区
205、305～人类XXI型迷你胶原蛋白
301、1707～OKT3_scFv(抗CD3)
307～528_scFv
401～scFv
405～胶原蛋白支架区
407～XXI型胶原蛋白的NC1区
409、1301～N端二硫群
411、1305、1505、1605、1705、1905～二硫群
413～scFv 1
415～scFv 2
417、1907～荧光酶
1303、1403、1507、1709、1909～(GPP)10
1307、1401～erb_scFv
1501、1601、1701～763_scFv(抗EGFR)
1607～(GPP)5GKPGKP(GPP)6
1901～h4D5_scFv(抗HER2/neu)
发明详述
本发明根据(至少一部份根据)一个实验发现而来——当抗体区读框(in-frame)融合至胶原蛋白支架区时，支架区的三聚体化可催生三聚体抗体。此抗体的结合亲合力，与二价IgG及单价scFv相比，要来得优异。根据本发明而制造出的三聚体抗体对其配体的亲合力可大于109M-1。
在一实施例中，融合多肽(fusion polypeptide)中的胶原蛋白支架区，可以读框融合的方式结合至结合蛋白(binding protein)，其中该胶原蛋白支架区具有驱动融合多肽形成三聚体化的能力。上述融合多肽经三聚体化后，仍保有结合至其配体的能力。结合区可为，例如细胞因子(cytokine)区、细胞因子受体区或抗体区。在一实施例中，细胞因子为TNF-α。在一实施例中，可将胶原蛋白支架区读框融合至抗体区，以产生三聚体抗体。在一优选实施例中，上述三聚体抗体为可溶抗体。可溶抗体在生理环境下为可溶。在一优选实施例中，上述可溶三聚体抗体为分泌抗体。分泌抗体是由细胞所分泌。由于包含抗体区的多肽上具有信号序列(signal sequence)，可将抗体的分泌作为目标。
在一实施例中，可溶三聚体抗体对其配体的亲合力大于107M-1。在一实施例中，可溶三聚体抗体对其配体的亲合力大于108M-1。在一实施例中，可溶三聚体抗体对其配体的亲合力大于109M-1。在某些实施例中，可溶三聚体抗体对其配体的亲合力是107M-1至1010M-1、107M-1至109M-1、107M-1至108M-1、108M-1至1010M-1、108M-1至109M-1，以及109M-1至1010M-1。
在一实施例中，藉由在具有充足脯氨酸-4-羟化酶(prolyl-4-hydroxylase，P4H)活性的系统中表达融合构建体(fusion construct)，以热稳定短胶原蛋白样肽，例如(Gly-Pro-Pro)作为支架区，来驱使抗体的三聚体化。
此方法促使稳定的三重螺旋结构的采用，其在体内影响蛋白质价数(valency)、稳定性与功能。
本发明包含使用胶原蛋白序列，例如迷你胶原蛋白XII或XXI型，或胶原蛋白样序列，例如(Gly-Pro-Pro)10或(GPP)5GKPGKP(GPP)6做为胶原蛋白支架区，具有不论从C端或N端方向将异源融合蛋白自身成核(self-nucleation)与自身延展(self-propagation)的能力。本发明不需任何其它三聚体化结构区。
藉由在包含脯氨酸-4-羟化酶的系统中表达融合构建体，胶原蛋白支架区融合蛋白形成热稳定三重螺旋结构。此外，本发明的自身三聚体化胶原蛋白支架允许在任一末端或是同时两个末端附加融合配偶体(fusion partners)。这具有重要的结果，如可使用自身三聚体化胶原蛋白支架来构建可同时与两个庞大的结合配偶体互相作用(各末端具有至多3或6的结合价)的分子。本发明也证明三聚体化抗体正确折叠且显示出高溶解度、亲合力与稳定性。
此处使用的“胶原蛋白支架区”为胶原蛋白或胶原蛋白样区，其允许藉由其本身形成三重螺旋结构，其中“三重螺旋结构”为三个亚单位共价或非共价结合的复合物。此处使用的“胶原蛋白支架区”指胶原蛋白或胶原蛋白样区其驱动支架区的自身三聚体化。
此处使用的“胶原蛋白支架区”并非指原胶原蛋白(procollagen)的C-前肽(propeptide)、胶原凝集素(collectin)或纤维胶凝蛋白家族蛋白质(ficolin familyprotein)的卷曲螺旋颈区(coiled-coil neck domain)、β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)三聚体化区、GCN4亮氨酸拉链(leucine zipper)突变体的三个卷曲螺旋的螺旋结构(Harbury et al.，(1993)Science 262：1401-1407)、Clq与TNF超级家族蛋白质的Clq与TNF区与噬菌体T4 fibritin折叠区。
“胶原蛋白支架抗体(collagen scaffold antibody)”或“CSA”是这样一种抗体，其包括胶原蛋白区，其融合至抗体区。胶原蛋白支架抗体与其编码序列可包括下述序列的任何结合。上述各结合经过特别地考虑。例如，胶原蛋白支架抗体可包括SEQ ID NO：1、3、5与9中的一个或多个。
因此，在一方面本发明的特征为分离的重组蛋白复合物，其包括：第一融合多肽链，包括第一胶原蛋白支架区与第一抗体区读框(in-frame)融合至该第一胶原蛋白支架区的一端；第二融合多肽链，包括第二胶原蛋白支架区；以及第三融合多肽链，包括第三胶原蛋白支架区。上述第一、第二与第三胶原蛋白支架域互相排列以形成三重螺旋线圈。并且上述第一胶原蛋白支架区与第一抗体区被读框融合且在相同的肽链上。
融合多肽链可包括酶区或荧光蛋白质。荧光蛋白质的例子可包括绿色荧光蛋白质(green fluorescent protein，GFP)、珊瑚红荧光蛋白(dsRed)与其变体。酶区的例子包括谷氨基硫转移酶(glutathione S-transferase)、荧光素酶(luciferase)、β-半乳糖苷酶与β-内酰胺酶(β-lactamase)。
为了检测或纯化本发明的融合蛋白，融合多肽链可包括或不包括亲合标记(affinity tag)。亲合标记的例子包括多组氨酸-标记(polyhistidine-tag)、myc-标记、Strep-标记、FLAG、E-标记、血球凝集素标记(hemagglutin tag)、T7、S-标记、HSV、VSV-G、抗-Xpress(anti-Xpress)与VS-标记。
“抗体区”包括一个或多个免疫球蛋白(immunoglobulin)的互补决定区(complementary-determining region)。因此，抗体区可包括抗体的抗原结合部分，例如VH与Fab。在一实施例中，第一抗体区包括抗原结合片段或单链抗体的序列，抗原结合片段或单链抗体对例如串命名法3(Cluster Designation 3，CD3)、上皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR)、HER2/neu或肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)有特异性。第一多肽链可更包括第二抗体区读框融合至第一支架区的另一端。
在一实施例中，第二融合多肽链包括第二抗体区。在一优选实施例中，第一与第二抗体区彼此相同。第一与第二抗体结合区可结合至相同的结合配偶体或结合至两个不同的结合配偶体。例如，第一抗体区与第二抗体区可包括第一单链抗体与第二单链抗体的序列，其中第一单链抗体与第二单链抗体可分别与CD3与EGFR结合。在一实施例中，第一与第二融合多肽皆包含上述第一与第二抗体的结合区。
第二融合多肽链可包括第三抗体区读框融合至第二支架区的一端、第四抗体区读框融合至第二支架区的另一端或两抗体区读框融合至第二支架区的两端。相似地，第三融合多肽链可包括第五抗体区读框融合至第二支架区的一端、第六抗体区读框融合至第二支架区的另一端或两抗体区读框融合至第二支架区的两端。因此其可与一、二、三、四、五或六个结合配偶体结合。换言之，蛋白质复合物可为单、双、三、四、五或六价。
第一、第二与第三支架区形成三重螺旋，所知如胶原蛋白或胶原蛋白样区，而三支架区的每个包括一个或多个三重螺旋重复序列，各重复序列包括(G-X-Y)n序列，其中G为甘氨酸，X与Y可为任何氨基酸，优选为脯氨酸或羟脯氨酸，而且n大于等于5。此处所使用的“重复”指两个或多个连续的G-X-Y序列。
胶原蛋白支架区并非一定由连续的完美G-X-Y重复序列所构成。试举许多天然胶原蛋白或包含胶原蛋白样的蛋白质为例，常见两个G-X-Y重复序列之间掺插少了第一个G或第三个Y的序列片段(亦即G-X-Y-X-Y-G-X-Y或G-X-Y-G-X-G-X-Y)。本发明中由人类第XXI型迷你胶原蛋白所构成的胶原蛋白支架区，即包含两个不完美的序列片段GF与KE。
在某些实施例中，胶原蛋白支架区为包含至少8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个G-X-Y重复序列的胶原蛋白支架，其中G为甘氨酸，X与Y可为任何氨基酸。在某些实施例中，至少5个、6个、7个、8个、9个或10个G-X-Y重复序列为G-P-P或G-P-O。在某些实施例中，至少5个、6个、7个、8个、9个或10个G-X-Y重复序列为G-P-O，其中P为脯氨酸，O为羟脯氨酸。胶原蛋白支架区可驱动自身三聚体化的形成。
在一实施例中，胶原蛋白支架区包括(G-P-P/O)10的序列。在一实施例中，胶原蛋白支架区包括10个G-X-Y重复序列。在某些实施例中，胶原蛋白支架区包括少于10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、25、27、30、35、40、45或50个G-X-Y重复序列。在某些实施例中，胶原蛋白支架的长度短于150、125、100、90、80、70、60、50或40个氨基酸。在一实施例中，胶原蛋白支架含有可驱动自身形成三聚体化的10-30个G-X-Y重复序列。
在一实施例中，多于1/3的G-X-Y重复序列为G-P-P或G-P-O。在一实施例中，多于1/2的G-X-Y重复序列为G-P-P或G-P-O。在一实施例中，多于2/3的G-X-Y重复序列为G-P-P或G-P-O。在一实施例中，多于3/4的G-X-Y重复序列为G-P-P或G-P-O。在一实施例中，所有的G-X-Y重复序列为G-P-P或G-P-O。在一实施例中，支架区包括(G-P-P/O)5GKPGKP(G-P-P/O)6的序列。在一实施例中，支架区包括(G-P-P/O)10，其中P/O指在Y位置的氨基酸为P或O。
在一优选实施例中，胶原蛋白支架包括至少10个G-X-Y重复序列，其中至少5、6、7、8、9或10个Y为羟脯氨酸。此胶原蛋白支架可驱动驱动自身三聚体化的形成。
在一优选实施例中，胶原蛋白支架包括至少5、6、7、8、9或10个G-P-O重复序列与抗体区，其中该胶原蛋白支架的三条多肽可交互作用而形成三聚体可溶抗体，此三聚体可溶抗体以至少107M-1的亲合力，特异性结合至配体。在一优选实施例中，胶原蛋白支架含有6或7个G-P-O重复序列，且此些G-P-O重复序列彼此的间可紧邻或不紧邻。例如，G-P-P重复序列可被分开成两个读框氨基酸序列，其包括藉由1、2、3、4或5个G-X-Y重复序列来分离的3、4或5个G-P-O重复序列。在一实施例中，胶原蛋白支架包括(G-P-O)3GXY(G-P-O)4。
在一实施例中，胶原蛋白支架为非纤维状具有中断的三重螺旋的原纤维伴随性胶原蛋白(fibril-associated collagen with interrupted triple-helices，以下称FACIT)的胶原蛋白(COL1)区。在优选的情况下，三聚体抗体含有FACIT的COL1区，但不含非胶原蛋白(noncollagenous，NC1)区。在一优选实施例中，COL1可源自第IX、XII、XIV、XVI、XIX、XX、XXI或XXII型胶原蛋白。在一优选实施例中，三聚体抗体包括SEQ ID NO：7。
在一实施例中，胶原蛋白支架至少与源自第IX、XII、XIV、XVI、XIX、XX、XXI或XXII型胶原蛋白的COL1区具有75％、80％、85％、90％或95％的相同度。在一实施例中，胶原蛋白支架至少与从第IX、XII、XIV、XVI、XIX、XX、XXI或XXII型胶原蛋白而来的COL1区的G-X-Y重复序列具有75％、80％、85％、90％或95％的同一性。
在一优选实施例中，胶原蛋白支架区至少与源自第IX、XII、XIV、XVI、XIX、XX、XXI或XXII型胶原蛋白的COL1区的10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或30个G-X-Y重复序列具有75％、80％、85％、90％或95％的同一性。在一特别优选实施例中，胶原蛋白支架至少与源自第XXII型胶原蛋白的COL1区的10个G-X-Y重复序列具有75％、80％、85％、90％或95％的同一性。
在一优选实施例中，胶原蛋白支架区的G-X-Y重复序列，包括至少5、6、7、8、9或10个Y位置被羟脯氨酸化的G-X-Y重复序列。
上述的序列同一性，可藉由得自威斯康星州大学遗传计算机小组(University of Wisconsin Genetics Computer Group，UWGCG)的GAP计算机程序(版本6.0，Devereux等人发表于Nucl.Acids Res.12：387，1984)来判定。GAP计算机程序利用经由Smith与Waterman(Adv.Appl.Math 2：482，1981)所修订的Needleman与Wunsch的比对方法(J.Mol.Biol.48：443，1970)。GAP程序的预定参数包括：(1)对于核苷酸的比较矩阵(包括对于相同位置为1的值与对于不同位置为0的值)与经Schwartz与Dayhoff，eds(Atlas of Protein Sequenceand Structure，National Biomedical Research Foundation，pp.353-358，1979)所叙述的Gribskov与Burgess的加权比较矩阵(weighted comparison matrix)(Nucl.Acids Res.14：6745，1986)；(2)每个缺口罚分3.0且各缺口延伸罚分0.10；与(3)末端缺口不罚分。
在一实施例中，上述的第一、第二与第三融合多肽本质上是相同的，彼此具有至少75％(即任何介于75％与100％之间的数字，包括75％与100％)的序列同一性。由三个相同的融合多肽形成的复合物为同源三聚体(homotrimer)。三个融合多肽可为功能性等同的多肽。“功能性等同”指一个共同多肽的多肽衍生物，即一个蛋白质具有一个或多个点突变、插入、缺失、截断、融合蛋白质或上述的组合，且其实质上维持形成三重螺旋的能力与异源区的亲合力，例如与配体结合。
异源多肽、核酸或基因为多肽、核酸或基因其与其它多肽、核酸或基因连结，且其并非自然连结。两个融合区或序列若在天然存在的蛋白质或核酸中并非为邻接，则彼此为异源。
本发明也包括分离(isolated)的重组融合多肽(即单条融合多肽)，其包括：(i)用以形成三重螺旋之一的胶原蛋白支架区；与(ii)读框融合至胶原蛋白区其中一端之一的第一异源区，或读框融合至胶原蛋白区另一端之一的第二异源区。异源区可为前述提及的具有抗体-抗原结合特性的任何形式之一，且此异源区可藉由各种为本领域技术人员已知的方法获得，例如噬菌体展示筛选(phage display screening)。
分离的多肽或蛋白质复合物意指该多肽或蛋白质复合物实质上由天然相关的分子分离，即由干重计算具有至少75％的纯度(任何介于75％与100％之间的数字，包括75％与100％)。纯度可藉由任何适当的方法测量，例如藉由柱层析(column chromatography)、聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gelelectrophoresis)或高效能液相层析法(high performance liquid chromatography，HPLC)分析。本发明的分离的多肽或蛋白质复合物可由天然来源分离或藉由重组DNA技术制造。
在一优选实施例中，用以形成三聚体抗体的三条多肽为非连续的(non-contiguous)。在另一实施例中，这三条多肽为连续的，即翻译成一个单一的翻译产物。在本实施例中，三条多肽之间可藉由两个或多个弹性铰链区(flexible hinge regions)而予以连结。
本发明还涉及分离的核酸，所述分离的核酸包括编码前段所述的融合多肽的序列或该序列的互补序列。核酸指DNA分子(例如cDNA或基因组DNA)、RNA分子(例如mRNA)或者DNA或RNA类似物。DNA或RNA类似物可由核苷酸类似物合成。这种核酸分子可以是单链或双链的，但优选双链DNA。“分离的核酸”是其结构不与任何天然存在的核酸或任何天然存在的基因组核酸片段相同的核酸。因此该用语包含，例如(a)DNA，其具有天然存在的基因组DNA分子的一部分序列，但不与在生物体的基因组中天然存在于其两侧的编码序列邻接；(b)将核酸在某种程度上并入载体(vector)或原核细胞或真核细胞的基因组中，由此所形成的分子不与任何天然存在的载体或基因组DNA相同；(c)分离的分子，例如cDNA、基因组片段、藉由聚合酶连锁反应(polymerase chain reaction，PCR)所产生的片段或限制片段(restrictionfragment)；与(d)重组核苷酸序列，其为杂交基因(即编码融合蛋白的基因)的一部份。上述核酸可用来表达本发明的多肽。为达此目的，可将上述核酸连接至适合的调控序列以产生表达载体。
载体指是一种核酸分子，其具有转移另一核酸至其连接处的能力。载体具有自主性复制(autonomous replication)或插入至宿主DNA的能力。载体的例子包括质粒(plasimd)、粘粒(cosmid)或病毒载体(viral vector)。本发明的载体包括核酸，其处在适合于在宿主细胞内表达的形式。优选地载体包括一个或多个调控序列，其与被表达核酸序列连接。“调控序列”包括启动子(promoter)、增强子(enhancer)和其它表达控制元件(例如加A信号(polyadenylation signal))。调控序列包括那些指导核苷酸序列的基本表达与组织特异性调控和/或可诱导的序列。表达载体的设计可依据下列因素，如待转化的宿主细胞的选择、需要的蛋白质表达水平等。可引入表达载体至宿主细胞以制造本发明的多肽。包括上述核酸的宿主细胞也在本发明的范围内。实例包括大肠杆菌(E.coli)细胞、昆虫细胞(例如使用果蝇(Drosophila)S2细胞或杆状病毒(baculovirus)细胞)、酵母细胞或哺乳类细胞(例如小鼠骨髓瘤(myeloma)NS0细胞)。请参阅，例如Goeddel，(1990)Gene ExpressionTechnology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA.。
为了制造本发明的融合多肽，在准许多肽表达的情况下将宿主细胞于培养基中培养，其中上述多肽是藉由本发明核酸所编码的多肽，以及从培养的细胞或该细胞的培养基中纯化上述多肽。或者，可于体外转录与翻译本发明的核酸，例如使用T7启动子调控序列与T7聚合酶。
为了制造本发明的蛋白质复合物，可于准许多肽表达与三重螺旋线圈形成的情况下培养宿主细胞，宿主细胞包括第一、第二与第三核酸，其分别编码出上述第一、第二与第三融合多肽，其中上述多肽是藉由所述三个核酸所编码，以及从培养的细胞或该细胞的培养基中纯化上述蛋白质复合物。而优选的是上述宿主细胞为真核细胞(eukaryotic cell)，其包括使脯氨酸残基羟基化(hydroxylate)的酶活性。
本发明的一个或多个实施例的细节在附图与以下的叙述中提出。本发明的其它特征、目的与优点将可从本发明的叙述、附图与权利要求书中显示。
本发明的可溶三聚体抗体相较于一般抗体有许多优点。一方面而言，当上述六个区域的两个或多个彼此相同时，蛋白质复合物可具有2-6个对结合配偶提(例如抗原)具有特异性的结合区域，与之相比，一般抗体只具有两个这种区域。换句话说，不像一般抗体对于抗原只具二价，这种蛋白质复合物可以是双、三、四、五或六价。因而，可将其制造为具有各种亲合力，且亲合力高于一般抗体。因为具有较高的亲合力，所以比起一般抗体而言，达成期望的目标需要的蛋白质复合物的量较少且反应时间较短。所述期望的目标例如疗效(therapeutic effects)，由此降低治疗成本和缩小副作用(例如，非期望的免疫反应)。
在另一方面，当上述六个区域的两个或多个互不相同时，本发明的蛋白质复合物可以具有2-6个结合区域，这些结合区域对2-6个不同的结合配偶体具有特异性。联合不同特异性的结合配偶体位成为一个单元，使其具有将多种结合配偶体集合在一起的能力，并因此具有令人满意的使用于治疗、组织重建(tissue reconstruction)和在纳米层次活性蛋白质机械(active proteinmachinery)(例如一多亚单位酶)的集合。
为了在人类体内使用，本发明的三聚体抗体优选为人源(human origin)。例如，其可包括人源化单链抗体序列，该序列读框融合至人源的胶原蛋白支架。由于许多具有胶原蛋白区的胶原蛋白样蛋白在血液中相当稳定，支架区融合蛋白同样也应该能够在血液中保持结构完整。
序列Gly-Pro-Hyp对于形成和稳定三重螺旋结构贡献良多，且Gly-Pro-Hyp三肽重复序列可自身配装(self-assemble)成高稳定性的三重螺旋结构。因此，本发明以呈热稳定的短链胶原蛋白样肽(Gly-Pro-Pro)10，取代迷你胶原蛋白第XXI型的胶原蛋白区，由此作为此处叙述的胶原蛋白支架抗体的支架模版。上述的稳定三重螺旋结构，可透过具有充足脯氨酸-4-羟化酶(prolyl-4-hydroxylase，P4H)活性的哺乳动物系统所取得。的确，根据这样的方式，erb_scFv-Col与OKT3_scFv-Col皆可被配装成为三聚体的结构，且erb_scFv-Col可能藉由在两个三聚体中的两个C端半胱氨酸残基的链内二硫键交联(interchain disulfide crosslinking)，更进一步聚合(oligomerized)成为六聚体。将erb_scFv-Col从三聚体变为六聚体的过程为细胞内步骤，由于在浓度超过一般存在的erb_scFv-Col六聚体形式时，浓度减低的三聚体结构并不会配装成较高阶的结构。
小鼠骨髓瘤(myeloma)NS0细胞对于重组的胶原蛋白或胶原蛋白样蛋白质的制备是一个良好的表达系统。在重组erb_scFv-Col中，在胶原蛋白GXY三个为一组的(Gly-Pro-Pro)10序列的Y位置中的脯氨酸总数的近61％为被羟基化。因此在此系统中，至少6个Gly-Pro-Pro重复序列被羟基化。丙烷基羟基化的(Gly-Pro-Pro)10对于胶原蛋白支架抗体分子的三聚体化配装的贡献显著，因为藉由Western印迹(Western blot)分析，几乎没有单体形式的胶原蛋白支架抗体存在于培养基中。从图6B与14B所显示的消失的单体水平来判断，在经纯化的胶原蛋白支架抗体样本中，2M的尿素于高至45℃的温度下，于加入2％ SDS加样缓冲溶液(loading buffer)后，对于分离胶原蛋白支架抗体的三聚体形式而言并不够强。在血清稳定性测定中，将各种erb抗体形式在37℃培养于人类血清中达7天后，进行酶联免疫吸附测定(enzyme-linkedimmunosorbent assay，ELISA)，相对于二价erb_scFv-Fv的亚微摩尔浓度(sub-micromolar)与单价erb_scFv的微摩尔浓度(micromolar)，erb_scFv-Col的抗体浓度为在纳摩尔浓度(nanomolar)nM范围。因此，胶原蛋白支架抗体在生理环境下可保持其多价标的结合形式。
胶原蛋白支架抗体的热稳定三聚体结构符合未来在体内使用的多目的多聚体化系统(multi-purpose multimerizing system)。许多具有胶原蛋白区的胶原蛋白样蛋白质表达于人类血清中，并且在保护人体免遭感染性生物体的过程中扮演先天免疫系统的作用。这些蛋白包括补体蛋白Clq、凝集素家族、胶凝素家族蛋白质-甘露糖结合凝集素(mannose binding lectin，MBL)、纤维胶凝蛋白(ficolin)、表面活性蛋白质(surfactant protein)A与D(SP-A与SP-D)。而这些“防御胶原蛋白”共同的结构特征为多蛋白质单位，具有在C端的目标结合区。形成这些多三聚体化结构的驱动力与形成纤维状胶原蛋白的驱动力相似。首先以三多肽链的卷曲螺旋颈区将此三多肽链三聚体化，卷曲螺旋颈区为紧邻着目标结合区的N端，在最后以此三多肽链的N端半胱氨酸残基堆栈或链内二硫键交联三聚体分子前，从C到N端以一种类似于拉链的方式(zipper-like fashion)将卷曲螺旋颈区进行三重螺旋折叠(Hakansson et al.，(1999)Structure 7：255-264；Hakansson and Reid，(2000)Protein Sci 9：1607-1617；Sheriff et al.，(1994)Nat Struct Biol 1：789-794；Weis and Drickamer，(1994)Structure 2：1227-1240)。因此多聚体化显著增加这些防御胶原蛋白的结合区的功能性亲合力。
当藉由表面等离振子共振(surface plasmon resonance，SPR)和竞争流式细胞仪(competition flow cytometry)来分析比较各种erb和OKT3抗体时，目标结合亲合力的改变显得显著。结合亲合力的数据证明，当胶原蛋白支架抗体分子的价数增加时，会增进抗体与目标之间的标靶(targeting)强度与特异性。在混合淋巴细胞反应中，三价OKT3胶原蛋白支架抗体的免疫抑制T细胞活化的有效剂量小于OKT3 IgG。
在人类外周血单核细胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中OKT3_scFv-Col不会诱导T-细胞增殖或IL-2产生，大量减少OKT3第一剂量症状的影响是由于短暂的T细胞活化产生的细胞因子(cytokine)释放。这种新的抗-CD3形式可提供强而有力免疫抑制药物，其具有减低的剂量、毒性与治疗花费。藉由具有或不具有结构设计的CDR嫁接以从鼠科至人源转移CDR的鼠科mAb抗体的人源化通常导致结合亲合力的降低或损失(Queen et al.，(1989)Proc Natl Acad Sci USA 86：10029-10033；Riechmann et al.；(1988)Nature 332：323-327)。在一优选实施例中，三聚体可溶抗体不包括Fc区。
藉由使用噬菌体展示scFv文库(Phage display scFv library)筛选高亲合力结合物的链改组(chain-shuffling)的亲合力熟成是一个冗长的步骤；然而改善亲合力的结果并不确定。因此，人源化后对于目标抗原的低亲合力会妨碍许多治疗性的抗体。在一些例子中，应进一步推敲抗体的特征。抗原结合配偶体的多聚体化明显增加了在非常接近目标细胞时结合至特定相同的配体群组的可得性。可提议不同的方法以获得多价分子以改善功能性亲合力。包括设计替代结合蛋白质，其根据具有免疫球蛋白的支架(Holliger and Hudson，(2005)Nat Biorechnol 23：1126-1136)或根据完全不同的蛋白质拓扑学(topology)(Binzet al.，(2005)Nat Biotechnol 23：1257-1268)。例如，已报导了使用与蛋白质A Fc结合区的Fv片段(Ito and Kurosawa，(1993)J Biol Chem 268：20668-20675)、用以形成四聚合体复合物的核心链霉抗生物素蛋白(core-streptavidin)(Dubel etal.，(1995)J Immunol Methods 178：201-209)或转录因子p53的人类四聚体化区(Rheinnecker et al.，(1996)J Immunol 157：2989-2997)。最近已采用非IgG蛋白质支架片段，例如“抗运载蛋白(anticalin)”(Skerra，(2000)Biochim Biophys Acta1482：337-350)、“锚蛋白重复序列(ankyrin repeat)”(Binz et al.，(2904)NatBiotechnoil 22：575-582)、“亲和体(affibody)分子”(Nord et al.，(1997)NatBiotechnol 15：772-777)与四结合素(tetranectin)的C型类凝集素区(Christian etal.International Publication No.WO98/56906；Graversen et al.，(2000)J BiolChem 275：37390-37396)来增加目标结合亲合力、热稳定性与敏感度。然而这些分子中的一些为异抗原片段或非血浆的天然成分且与免疫反应的风险相关，其严重限制了潜在治疗性应用。
用以形成热稳定多价蛋白质结合物的三重体形式(triplex-forming)胶原蛋白样肽融合支架，在此被用于证明胶原蛋白支架抗体为一个新的平台，可改善治疗性抗体的功能性亲合力与有丝分裂性(mitogenicity)。更重要的是，已证明scFv与胶原蛋白支架抗体中的胶原蛋白样支架区的融合使各区正确折叠，而不损害目标结合的活性或三重螺旋结构的三聚体配装。此三重体形式的胶原蛋白样区，可做为现存的支架或新的蛋白质药物，藉由在融合蛋白质接近的情况下，对以下物质进行三聚体化(甚或寡聚化(oligomerizing)，其中这种寡聚化由胶原蛋白纤维间的堆栈或三聚体分子间的链间二硫键交联而来)：活性蛋白质，所述活性蛋白质包括蛋白质激素、细胞因子、淋巴因子(lymphokine)、生长因子、凝集素、酶与可溶受体片段；或粘着分子(adhesionmolecule)，例如选择素(selectin)与整联蛋白(integrin)。
可藉由重组技术获得本发明的蛋白质复合物或多肽。可将编码复合物的多肽的核酸引入适合的宿主细胞中，并且在允许表达藉由上述核酸编码的多肽并在多肽间形成三重螺旋的条件下来表达上述多肽。为了促进三重螺旋支架的形成，可在宿主细胞中共表达脯氨酸-4-羟化酶，其为在生物合成胶原蛋白过程中的关键酶。
异源性蛋白质区域可包括“结合区”，其包括但不限于抗体或其片段(例如其抗原结合片段)。在此处所使用“抗体”意指免疫球蛋白分子或其免疫活性部分，即抗原结合部分。其指蛋白质包括最少一个，优选为两个重(heavy，H)链可变区域(VH)，以及至少一个，优选为两个轻(light，L)链可变区域(VL)。因此，在此处所使用的“抗体区”指抗体或抗体的抗原结合部分，且包括VH、VL或Fab区、单链抗体(single-chain antibody，scFv)的Fv片段与VHH区(参见WO 94/4678)。
可将VH与VL区域更进一步细分为超变区，称为“互补决定区(complementarity determining region)”“(CDR)”；和散布区域，其较保守，称为框架区域(framework region)。已经确定了互补决定区与框架区域的范围(参阅Kabat et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，FifthEdition，U.S.Department of Health and Human Services，NIH Publication No.91-3242，and Chothia et al.(1987)J.Mol.Biol.196：901-917)。每个VH与VL一般由三个CDR与四个FR(framework region)组成，从氨基端到羧基端排列的顺序为：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。抗体可进一步包括重链和轻链恒定区域(constant region)，由此分别形成重链和轻链免疫球蛋白链。重链恒定区域包括三个区域，CH1、CH2与CH3。轻链恒定区域包括一个区域，CL。重链和轻链的可变区域包括结合区域，其与抗原反应。抗体的恒定区域通常协调抗体结合至宿主组织或因子，所述因子包括免疫系统的多种细胞(例如效应细胞(effector cell))和典型补体系统的第一补体Clq。
此处使用的“免疫球蛋白”指一种蛋白质，其包括一个或多个肽，其本质上是由免疫球蛋白基因所编码。经认可的人类免疫球蛋白基因包括κ、λ、α(IgA1和IgA2)、γ(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)、δ和μ恒定区域基因和无数的免疫球蛋白可变区域基因。全长免疫球蛋白“轻链”(约25KDa或214个氨基酸)在NH2端(约110个氨基酸)藉由可变区域基因所编码，并在COOH端藉由K或λ恒定区域基因所编码。而全长免疫球蛋白“重链”(约50KDa或446个氨基酸)相似地藉由可变区域基因(约116个氨基酸)，和其它上述的恒定区域基因，例如γ(编码出约330个氨基酸)所编码。
抗体(或“抗体部分”或“片段”)的“抗原结合片段”指全长抗体的一个或多个片段，其保留特异性结合至其配体或抗原(例如EGFR或CD3多肽或其片段)的能力。
抗体的抗原结合片段的例子包括，但不限于：(i)Fab片段，其是一种单价片段，包括VL、VH、CL和CH1区域；(ii)F(ab’)2片段，其是一种二价片段，包括藉由二硫键桥在其铰链区域(hinge region)连结的两个Fab片段；(iii)Fd片段，其包括VH和CH1区域；(iv)Fv片段，其包括抗体单股的VL和VH区域；(v)dAb片段(Ward et al.，(1989)Nature 341：544-546)，其包括VH区域；(vi)分离的CDR以及(vii)VL或VH区域。更进一步，虽然Fv片段的两个区域VL和VH是由分开的基因所编码，但使用重组方法可将它们连接，藉由人造接头可将它们制成一个单链蛋白质，其中VL和VH区域配对形成一个单价分子(已知如单链Fv(scFv)，参阅，例如Bird et al.(1988)Science 242：423-426；and Hustonet al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)。这种单链抗体也包含在抗体的“抗原结合片段”。这些抗体片段可藉由本技术领域常见的技术获得，并以与完整抗体相同的方式来筛选应用。
抗体可以是单克隆抗体。在一实施例中，抗体可以以重组方法制备，例如藉由噬菌体展示或组合方法(combinatorial method)来制造。以噬菌体展示和组合方法产生抗体为本技术领域所熟知(参阅，例如Ladner et al.美国专利No.5,223,409；Kang et al.International Publication No.WO 92/18619；Dower et al.International Publication No.WO 91/17271；Winter et al.International PublicationWO 92/20791；Markland et al.International Publication No.WO 92/15679；Breitling et al.International Publication WO 93/01288；McCafferty et al.International Publication No.WO 92/01047；Garrard et al.InternationalPublication No.WO 92/09690；Ladner et al.International Publication No.WO90/02809；Fuchs et al.(1991)Bio/Technology 9：1370-1372；Hay et al.(1992)Hum Antibod Hybridomas 3：81-85；Huse et al.(1989)Science 246：1275-1281；Griffths et al.(1993)EMBO J 12：725-734；Hawkins et al.(1992)J Mol Biol226：889-896；Clackson et al.(1991)Nature 352：624-628；Gram et al.(1992)PNAS 89：3576-3580；Garrad et al.(1991)Bio/Technology 9：1373-1377；Hoogenboom et al.(1991)Nuc Acid Res 19：4133-4137；和Barbas et al.(1991)PNAS 88：7978-7982)。
在一实施例中，抗体为完全人类抗体(例如，在经遗传工程改造的小鼠中制备的源自人类免疫球蛋白序列的抗体)或非人类抗体，例如啮齿类动物(小鼠或大鼠)、山羊、灵长类动物(例如猴子)、骆驼抗体。非人类抗体优选为啮齿类动物(小鼠或大鼠抗体)抗体。制备啮齿类动物抗体的方法已为本技术领域所熟知。
可以藉由使用遗传工程小鼠执行人类基因来制造人类单克隆抗体，而不是使用小鼠的系统。使用经过感兴趣的抗原免疫的遗传工程的小鼠脾细胞(splenocytes)来制备杂交瘤(hybridoma)，其分泌对人类蛋白质的抗原决定位(epitope)具有特异性亲合力的mAbs(参阅，例如Wood et al.InternationalApplication WO 91/00906，Kucherlapati et al.PCT publication WO 91/10741；Lonberg et al.International Application WO 92/03918；Kay et al.InternationalApplication 92/03917；Lonberg，N.et al.1994 Nature 368：856-859；Green，L.L.etal.1994 Nature Genet.7：13-21；Morrison et al.1994 Proc.Natl.Acad.Sci.USA81：6851-6855；Bruggeman et al.1993 Year Immunol 7：33-40；Tuaillon et al.1993PNAS 90：3720-3724；Bruggeman et al.1991 Eur J Immunol 21：1323-1326)。
抗体的可变区域或其部份，例如CDR，可在非人类物种(例如，大鼠或小鼠)中产生。可使用嵌合、CDR移植和人源化抗体。本发明中对于在非人类物种(例如，大鼠或小鼠)中产生的抗体进行修饰(例如在可变框架(variableframework)或恒定区域)，以降低在人体内的抗原性(antigenicity)。
可藉由本发明技术领域公知的基因重组DNA技术来制备嵌合抗体(chimeric antibody)。例如这样一种基因，其编码鼠科动物(或其它物种)单克隆抗体分子的Fc恒定区域，以限制酶将其编码鼠科动物Fc的区域移除，然后在相同位置以编码人类Fc恒定区域的基因取代(见，Robinson et al.，International Patent Publication PCT/US86/02269；Akira，et al.，European PatentApplication 184，187；Taniguchi，M.，European Patent Application 171，496；Morrison et al.，European Patent Application 173，494；Neuberger et al.，International Application WO 86/01533；Cabilly et al.美国专利No.4,816,567；Cabilly et al.，European Patent Application 125，023；Better et al.(1988Science240：1041-1043)；Liu et al.(1987)PNAS 84：3439-3443；Liu et al.，1987，J.Immunol.139：3521-3526；Sun et al.(1987)PNAS 84：214-218；Nishimura et al.，1987，Canc.Res.47：999-1005；Wood et al.et al(1985)Nature 314：446-449；和Shaw et al.，1988，J.Natl Cancer Inst.80：1553-1559)。
人源化或CDR移植抗体具有至少一个或两个但一般为全部三个受体(recipient)CDR(免疫球蛋白重链或轻链)被以供体CDR取代。抗体可由至少一部份的非人类CDR取代或只有CDR中的一些由非人类的CDR取代。只需取代对于人源化抗体或人源化抗体片段的结合所需数量的CDR。优选的供体为啮齿类动物抗体，例如大鼠或小鼠抗体，并且受体为人类框架(framework)或人类共有框架(consensus framework)。一般而言，提供CDR的免疫球蛋白称为“供体”而提供框架的免疫球蛋白称为“受体(acceptor)”。在一实施例中，供体免疫球蛋白是非人类(例如大鼠)免疫球蛋白。受体框架是天然存在(例如人类)或共有框架，或依序列约85％或更高，优选为90％、95％、99％或更高相同程度。此处所使用的“共有序列(consensus sequence)”指这样一种序列，其从相关序列的家族中最常存在的氨基酸(或核苷酸)形成(参阅，例如Winnaker，From Genes to Clones(Verlagsgesellschaft，Weinheim，Germany1987)。在蛋白质家族中，在共有序列中的每个位置，由此家族中在那个位置最常存在的氨基酸所占据。若两个氨基酸发生的频率相同，两者中的任一个皆可包含于共有序列。“共有框架”指框架区域在共有免疫球蛋白序列之中。
可藉由本技术领域已知的方法将抗体进行人源化。藉由取代Fv可变区域的序列可产生人源化抗体，其中Fv可变区域不直接包含于抗原与人类Fv可变区域的相同序列结合的作用中。对于产生人源化抗体的方法由Morrison，S.L.，1985，Science 229：1202-1207、Oi et al.，1986，BioTechniques 4：214、Queen etal.US5,585,089、US5,693,761和US5,693,762所提供。那些方法包括分离、操作和表达核酸序列，其中核酸序列从至少重链或轻链之一编码免疫球蛋白Fv可变区域的全部或部份。此种核酸的来源是本技术领域中众所周知的，并且例如可从杂交瘤中获得，其中此杂交瘤产生抗体抵抗感兴趣的多肽或其片段。可重组DNA克隆(clone)至适当的表达载体，其中此重组DNA编码人源化抗体或其片段。
可将人源化抗体融合至支架，在所述人源化抗体中，已将特定氨基酸取代、缺失或增加。优选的人化抗体具有在框架区域中具有氨基酸取代，由此来改善对抗原的结合。例如这样一种人源化抗体，其具有框架残基相同于供体的框架残基或其它氨基酸，除了受体的框架残基。为了产生此种抗体，藉由对应的供体氨基酸可取代经过选择的少数受体人源化免疫球蛋白链的框架残基。优选的取代位置包括邻接于CDR的氨基酸残基或其具有与CDR反应的能力。从供体选择氨基酸的标准叙述于US 5,585,089。将抗体人源化的其它技术叙述于Padlan et al.EP 519596 A1。
在一实施例中，三聚体可溶抗体的各多肽不包括胶原蛋白NC1区。在一实施例中，三聚体可溶抗体的各多肽不包括二硫键结(disulfide knot)。在一实施例中，三聚体可溶抗体的各多肽不包括噬菌体T4 fibritin折叠区。
优选三聚体抗体的支架大小为最小。在一实施例中，胶原蛋白样区包括(G-P-P/O)10的序列。在一实施例中，各多肽包括少于13个G-X-Y重复序列。在某些实施例中，三聚体抗体包括少于11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、25、27、30、35、40、45或50个G-X-Y重复序列。在某些实施例中，三聚体抗体的各多肽的分子量小于35、37、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50kD。在一实施例中，三聚体可溶抗体的分子量小于105、110、115、120、125、130、135、140、145或150kD。
在一优选实施例中，三聚体可溶抗体包括三条多肽，其中各多肽包括：胶原蛋白支架区，其包括至少10个G-X-Y重复序列，且至少5、6、7、8、9或10个Y为羟脯氨酸；以及抗体区，其中所述三条多肽的胶原蛋白样支架区互相作用以形成三聚体可溶抗体，该三聚体可溶抗体以至少107M-1的亲合力特异性结合至配体。
本发明也包括核酸，其编码融合多肽形成本发明的蛋白质复合物。核酸可从噬菌体展示筛选获得或从表达上述适合的抗体或抗体衍生物的细胞株中分离(例如RT-PCR)。可将核酸功能性连接至表达载体。可使用经核酸或载体转化的细胞来制备本发明的融合多肽或蛋白质复合物。用以制备抗体的有用的细胞包括昆虫细胞和哺乳类动物细胞。这些细胞包括，但不限于骨髓瘤NS0细胞、CHO细胞或淋巴细胞(lymphatic cell)。
本发明包括产生三聚体可溶抗体的方法，其藉由将编码胶原蛋白支架区的核酸与包括抗体区的核酸连结，例如使用一般分子技术。可直接将胶原蛋白支架区与抗体区连接，或可藉由额外的序列将其分离，例如编码铰链(hinge)区的核苷酸序列。可在允许羟脯氨酸化的细胞系统中表达上述核酸，例如NS0细胞。
在一实施例中，本发明包括产生三聚体可溶抗体的方法，其藉由将编码胶原蛋白样区的核酸与编码抗体区的核酸读框连结。在一优选实施例中，胶原蛋白样区包括大于10个G-X-Y重复序列。在一实施例中，胶原蛋白样区包括10-30个G-X-Y重复序列，G为甘氨酸，X为任何氨基酸且Y为任何氨基酸，且至少10个G-X-Y重复序列为G-P-P。在一实施例中，胶原蛋白样区的核酸与编码对应于配体的抗体的核酸读框连结；以及将上述编码的多肽于细胞中表达，其中至少5、6、7、8、9或10个G-P-P重复序列的Y位置经羟脯氨酸化；其中三条多肽的羟脯氨酸化的胶原蛋白支架区互相反应以形成三聚体可溶抗体，该三聚体可溶抗体以至少107M-1的亲合力特异性结合至配体。
在一实施例中，可溶三聚体抗体对其配体的亲合力大于107M-1。在一实施例中，可溶三聚体抗体对其配体的亲合力大于108M-1。在一实施例中，可溶三聚体抗体对其配体的亲合力大于109M-1。在某些实施例中，可溶三聚体抗体对其配体的亲合力为107M-1至1010M-1、107M-1至109M-1、107M-1至108M-1、108M-1至1010M-1、108M-1至109M-1，以及109M-1至1010M-1。
在一实施例中，三聚体可溶抗体所对应的配体为人类上皮生长因子受体。在一实施例中，三聚体可溶抗体所对应的配体为人类CD3。在一实施例中，三聚体可溶抗体所对应的配体为人类HER2/neu。在一实施例中，三聚体可溶抗体所对应的配体为人类TNF-α。
可从包括编码出本发明多肽的核酸的载体，优选为表达载体来表达支架区蛋白质和支架区融合蛋白质。此处所使用的“载体”指核酸分子，其具有克隆另一核酸至其连接处的能力，可包括质粒(plasimd)、粘粒(cosmid)或病毒载体(viral vector)。载体具有自主性复制(autonomous replication)或插入至宿主DNA的能力。病毒载体包括复制有缺陷的反转录病毒(retroviruses)、腺病毒(adenovirus)和腺相关病毒(adeno-associated virus)。在原核细胞中的蛋白质表达最通常在具有载体的大肠杆菌中执行，而此载体包括基本的或可诱导的启动子，其驱动融合或非融合蛋白的表达。
融合载体可将一些氨基酸加入至在其中编码的蛋白质，通常加入至重组蛋白的氨基端。此种融合载体提供三种用途：1)增加重组蛋白的表达；2)增加重组蛋白的稳定性和；3)在亲合性纯化中，藉由作为配体来帮助重组蛋白的纯化。通常在融合部分和重组蛋白的交接处引入蛋白质切割位点以使重组蛋白在融合蛋白纯化之后可从融合部分分离。此种酶和其同源识别的序列，包括因子Xa、凝血酶(thrombin)和肠激酶(enterokinase)。
一般融合表达载体包括pGEX(Pharmacia Biotech Inc；Smith，D.B.andJohnson，K.S.(1988)Gene 67：31-40)、pMAL(New England Biolabs，Beverly，Mass.)和pRIT5(Pharmacia，Piscataway，N.J.)，其对目标融合蛋白分别融合了谷胱甘肽S转移酶(glutathione S-transferase，GST)、麦芽糖E结合蛋白(maltoseE binding protein)或蛋白质A。
在大肠杆菌中将重组蛋白的表达最大化是在宿主细菌中表达蛋白质，而此宿主细菌的蛋白质裂解重组蛋白的能力受损(Gottesman，S.，(1990)GeneExpression Technology：Method in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，Calif.119 128)。另一策略为，在将核酸插入表达载体之前，改变此核酸的序列，使后续制备出来的氨基酸，会为大肠杆菌所优先使用(Wada et al.，(1992)Nucleic Acids Res.20：2111-2118)。本发明此种核酸序列的改变可藉由标准DNA合成技术实行。
宿主细胞可为任何原核细胞或真核细胞。可将本发明的蛋白质表达于细菌细胞(例如大肠杆菌)、昆虫细胞、酵母或哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cells，CHO cell))或COS细胞(非洲绿猴肾细胞CV-1起源的SV40细胞；Gluzman(1981)Cell 23：175 182))中。其它适合的细胞为本技术领域的人士所周知。
经由一般转化(transformation)或转染(transfection)技术可将载体DNA引入宿主细胞中。此处所使用的“转化”和“转染”指各种本技术领域中所认定用来将外源核酸(例如DNA)引入宿主细胞中的过程，包括磷酸钙或氯化钙共沈淀法(co-precipitation)、DEAE-葡聚糖介导的转染法(DEAE-dextran-mediated transfection)、脂质转染法(lipofection)或电穿孔(electroporation)。
本发明包括一种抑制配体的生物活性的方法，包括将三聚体可溶抗体和该配体一起培养，并且所述三聚体可溶抗体包括三条多肽，其中该三聚体可溶抗体结合至该配体，抑制了该配体的生物活性。在一优选实施例中，各多肽包括胶原蛋白支架区，其包括至少10个G-X-Y重复序列，其中G为甘氨酸，X为任何氨基酸且Y为任何氨基酸，其中至少10个G-X-Y重复序列为G-P-P或G-P-O，至少5、6、7、8、9或10个G-X-Y重复序列为G-P-O和其中P为脯氨酸而O为羟脯氨酸；以及抗体区，其中所述三条多肽的羟脯氨酸化的胶原蛋白支架区互相反应以形成三聚体可溶抗体，该三聚体可溶抗体以至少107M-1的亲合力特异性结合至配体。
在一实施例中，可溶三聚体抗体对其配体的亲合力大于107M-1。在一实施例中，可溶三聚体抗体对其配体的亲合力大于108M-1。在一实施例中，可溶三聚体抗体对其配体的亲合力大于109M-1。在某些实施例中，可溶三聚体抗体对其配体的亲合力介于107M-1至1010M-1的间、107M-1至109M-1的间、107M-1至108M-1的间、108M-1至1010M-1的间、108M-1至109M-1的间，以及109M-1至1010M-1的间。
在一实施例中，三聚体可溶抗体所对应的配体为人类上皮生长因子受体、人类CD3、人类HER2/neu或人类TNF-α。
可将本发明的蛋白质复合物和具疗效成分(therapeutic moiety)进行结合，例如细胞毒素(cytotoxin)、治疗试剂或放射性离子(radioactive ion)。细胞毒素或细胞毒性试剂包括任何对细胞有害的试剂。实例包括太平洋紫杉醇(taxol)、细胞松弛素B(cytochalasin B)、短杆菌素D(gramicidin D)、溴化乙锭(ethidiumbromide)、吐根碱(emetine)、丝裂霉素(mitomycin)、灭必治(etoposide)、鬼臼噻吩甙(tenoposide)、维克思丁(vincristine)、敏伯斯登(vinblastine)、秋水仙碱(colchicin)、阿霉素多柔比星(doxorubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、(dihydroxyanthracin dione)、米托(mitoxantrone)、普卡霉素(mithramycin)、放线菌素D(actinomycin D)、去氢睾丸素(1-dehydrotestosterone)、糖皮质素(glucocorticoids)、普鲁卡因(procaine)、得特卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、恩特来(propranolol)、嘌呤霉素核苷酸(puromycin)、美登素(maytansinoids)，例如，美登醇(maytansinol)(见，美国专利No.5,208,020)、CC-1065(见美国专利Nos.5,475,092，5,585,499，5,846,545)和其类似物或同源物。治疗试剂包括，但不限于，抗代谢剂(antimetabolites)(例如，灭杀除癌(methotrexate)、巯嘌呤(6-mercaptopurine)、6-硫鸟嘌呤核苷(6-thioguanine)、赛达命(cytarabine)、5-氟尿嘧啶氨烯咪胺(5-fluorouracil decarbazine))、烷化基药剂(alkylating agents)(例如，氮芥气(mechlorethamine)、thioepa chlorambucil、CC-1065、美法仑(melphalan)、卡莫司汀(carmustine，BSNU)和洛莫司汀(lomustine，CCNU)、(cyclothosphamide)、补束克(busulfan)、二溴甘露醇(dibromomannitol)、链脲佐菌素(streptozotocin)、丝裂霉素C(mitomycin C)和顺铂帝尔(cis-dichlorodiamine platinum(II)(DDP)cisplatin))、四环霉素(anthracyclines)(例如，柔红霉素(daunorubicin)(的前称为daunomycin))、抗生素(例如，可美净(dactinomycin)(之前称为放线菌素(actinomycin))、扑类恶(bleomycin)、普卡霉素(mithramycin)和氨茴霉素(anthramycin，AMC))以及抗有丝分裂剂(anti-mitotic agents)(例如，维克思丁(vincristine)、敏伯斯登(vinblastine)、太平洋紫杉醇(taxol)和美登素(maytansinoids))。
本发明实施例中预期的放射性离子包括但不限于111铟、113铟、99铼、105铼、101铼、99锝(technetium)、121碲(tellurium)、122碲、125碲、165铥、167铥、168铥、123碘、125碘、126碘、131碘、133碘、81氪、33氙、90钇、213铋、77溴、18氟、95钌、97钌、103钌、105钌、107汞、203汞、67镓、68镓、35硫和14碳。
藉由上述的结合物，可修饰宿主体内的已知生物反应。不将药物部分(drugmoiety)设计限制为典型化学治疗试剂。例如，药物部分可以是具有生物活性的蛋白质或多肽。这种蛋白质可包括，例如毒素，如鸡母珠毒蛋白(abrin)、蓖麻蛋白A(ricin A)、绿脓杆菌外毒素(pseudomonas exotoxin)或白喉毒素(diphtheria toxin)；蛋白质，例如肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor)、α-干扰素.(α-interferon)、β-干扰素.(β-interferon)、神经生长因子(nerve growth factor)、血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor)、组织胞浆素原激活素(tissue plasminogen activator)；或生物反应调节剂(biological response modifier)，例如，淋巴因子(lymphokines)、细胞白介素-1(interleukin-1，＂IL-1＂)、细胞白介素-2(interleukin-2，＂IL-2＂)，细胞白介素-6(interleukin-6，＂IL-6＂)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colony stimulating factor，＂GM-CSF＂)、粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor，＂G-CSF＂)或其它生长因子。
在本发明更进一步的实施例中，可将支架融合蛋白与聚合物结合。此种聚合物包括，但不限于，聚乙二醇(polyethylene glycol)、聚丙二醇(polypropyleneglycol)和聚羟乙烯聚酯多元醇(polyoxyethylated polyol)。
前述蛋白质和结合依据其异源性区域的特异性，可用来治疗多种失调，包括癌症、炎性疾病(inflammation disease)、代谢疾病(metabolism disease)、纤维化疾病(fibrosis disease)和心血管循环器官疾病(cardiovascular disease)。因此本发明以治疗此种失调为特征，例如，藉由把本发明蛋白质复合物之一以有效量(effective amount)给予需要的病患以治疗失调。可认定被治疗的病患具有以失调为特征的情况或是处于此风险中。此方法可单独表达或与其它药物或治疗结合。
因为本发明蛋白质复合物具有多重特异性的特色，可以使用其来连接在一般情况下并不互相结合的分子或细胞。此特征对于细胞疗法(cell-basedtherapy)特别有用。在一实施例中，蛋白质复合物中的异源性区域具有活化细胞毒素性细胞(cytotoxic cell)(例如毒杀性T细胞(cytotoxic T cell))的能力，藉由与位于细胞毒素性细胞上的反应因子抗原(effector antigen)特异性结合，而其它异源性区域则特异性结合至位于将被破坏的病原体或有害细胞的目标抗原。在此方法中，蛋白质复合物可用来治疗因病原体或有害细胞所导致的失调。
“治疗”定义为将组合物给予病患，以治愈、减轻、缓和、治疗、避免或改善失调、失调的症状、对于失调的疾病状态第二期或倾向于疾病的体质为目的。“有效量”为具有产生医药上令人满意的结果的组合物的量，例如上述于被治疗的病患产生医药上令人满意的结果的量。
经由本发明蛋白质复合物与细胞毒素性细胞上当作反应因子抗原的CD3抗原结合，可活化细胞毒素性细胞。其它淋巴样细胞(lymphoid cell)相关的反应因子抗原包括人类CD16抗原、NKG2D抗原、NKp46抗原、CD2抗原、CD28抗原、CD25抗原、CD64抗原和CD89抗原。与这些反应因子抗原结合使效应细胞活化，效应细胞例如，单核细胞(monocyte)、嗜中性粒细胞(neutrophilic granulocyte)和树突细胞(dendritic cell)。这些被活化的细胞之后会对目标细胞施加细胞毒性或细胞凋亡影响(apoptotic effect)。
目标抗原为这样一种抗原，其独特地表达于与死亡情况相关的细胞上，但是其不表达于或以低水平表达于或是不可达到于细胞健康的情况下。这些与有害细胞相关的目标抗原的例子包括EpCAM、CCR5、CD19、HER2/neu、HER3、HER4、EGFR、PSMA、CEA、MUC-1(黏液素(mucin))、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5.sub.AC、MUC5.sub.B、MUC7、beta.hCG、Lewis-Y、CD20、CD33、CD30、神经节苷脂CD3(ganglioside GD3)、9-O-Acetyl-GD3、GM2、Globo H、fucosyl GM1、Poly SA、GD2、碳脱水酶(Carboanhydrase IX(MN/CAIX))、CD44v6、音速小子(Sonic Hedgehog(Shh))、Wue-1、浆细胞抗体(PlasmaCell Antigen)、膜结合(membrane-bound)IgE、黑色素细胞瘤硫化软骨蛋白多糖(Melanoma Chondroitin Sulfate Proteoglycan(MC SP))、CCR8、TNF-alpha前驱物、STEAP、间皮素(mesothelin)、A33抗原、前列腺干细胞抗原(Prostate StemCell Antigen(PSCA))、Ly-6、第四型固定胶(desmoglein 4)、钙黏附素E新表位(E-cadherin neoepitope)、胎儿乙酰胆碱受体(Fetal Acetylcholine Receptor)、CD25、CA19-9标志(marker)、CA-125标志和米勒抑制受质受体第II型(Muellerian Inhibitory Substance(MIS)Receptor type II)、sTn(唾液酸化Tn抗原(sialylated Tn antigen；TAG-72))、FAP(纤维组织母细胞活化抗原(fibroblastactivation antigen))、内皮唾(液)酸蛋白(endosialin)、EGFRvIII、LG、SAS和CD63。
体内的方式为将一有疗效的组合物(例如，包含本发明蛋白质复合物的组合物)给予病患。一般而言，将复合物悬浮于一药学上可接受的载体(carrier)(例如生理食盐水)和将其以口服给药或藉由静脉内(intravenous)注入或注射或灌入皮下(subcutaneous)、肌肉内(intramuscular)、鞘内(intrathecal)、腹腔内(intraperitoneal)、直肠内(intrarectal)、阴道内(intravaginal)、鼻内(intranasal)、胃内(intragastrical)、气管内(intratracheal)或肺内(intrapulmonary)。
剂量要求是依据所选择的给药途径；配方性质；病患疾病的性质；病患体型、体重、表面积、年纪和性别；病患被给予的其它药物和主治医师的判断。适当的剂量范围在0.01-100.0mg/kg，更明确为0.1-100、0.1-75、0.1-50、0.1-25、0.1-10、0.5-100、0.5-75、0.5-50、0.5-25、0.5-10、1-100、1-75、1-50或1-25mg/kg。优选剂量包括1-10、10-100、10-75、10-50、10-25、25-50、50-75、25-100、50-100或75-100mg/kg。剂量范围为1-2、3-4、5-6、7-8或9-10mg/kg更佳。本发明的治疗性组合物在1-10个星期，优选为2-8星期，更优选为3-7星期，甚至更优选为45或6星期间被每天、一次、两次、三次或每星期给予。在可得成分的多样化和多种给药途径的不同功效的观点下，剂量需求的多样性是可以预期的。例如，预期口服给药比静脉内注射给药需要更高的剂量。可利用标准经验程序(standard empirical routines)调整这些剂量程度的多样性以将其最佳化，而此为本发明领域所公知。概括成分于适当的递送运载体(vehicle)(例如聚合微粒(polymeric microparticles)或可植入装置(implantable devices))，可增加递送的效率，特别是对于口服递送而言。
药学上可接受的载体包括溶剂、分散媒(dispersion medium)、涂层(coating)、抗菌和抗真菌试剂和等渗透压和吸收延迟(absorption delaying)试剂。具体而言，这些试剂可包括生理盐水(saline solution)、不挥发油(fixed oil)、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌试剂，例如苯甲醇(benzyl alcohol)或苯甲酸甲脂(methyl paraben)；抗氧化剂，例如抗坏血酸(ascorbic acid)或亚硫酸氢钠(sodium bisulfite)；螯合剂(chelating agent)，例如乙烯二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid)；缓冲溶液，例如醋酸、柠檬酸或磷酸；调整张力的试剂，例如氯化钠或葡萄糖(dextrose)。药学组成物的pH可以用酸或碱来调整，例如盐酸或氢氧化钠。
本发明范围亦涵盖药学组合物，其包括药学上可接受的载体和有效量的本发明蛋白质复合物。可使用此药学组合物来治疗上文所列症状。药学上可接受的载体包括溶剂、分散媒、涂层、抗菌和抗真菌试剂和等渗透压和吸收延迟试剂。对于不同的给药方式，可利用一般方法将要学组合物配置成剂型(dosage form)。
可鉴定本发明组合物于体内和体外两者的功效。对于体内的研究，可向动物注射组合物(例如，小鼠模型)，以及之后记录其治疗功效。根据这个结果，可决定适当的剂量范围和给药方式。
此处所使用的“对应于(directed against)”和“特异性结合至”指抗体或抗体的片段以至少10-6M结合至其配体。
在一实施例中，第一支架融合蛋白质为(GPP)10融合至对应于EGFR的抗体。在本发明更进一步的实施例中，胶原蛋白支架区融合蛋白质为(GPP)10融合至对应于EGFR的抗体片段，其中此片段可为，但不限于一scFv、VL、VH或Fab片段。
在本发明另一实施例中，第一胶原蛋白支架区融合蛋白质为(GPP)10融合至对应于CD3的抗体。在本发明更进一步的实施例中，胶原蛋白支架区融合蛋白质为(GPP)10融合至对应于CD3的抗体片段，其中此片段可为，但不限于scFv、VL、VH或Fab片段。
在本发明又另一实施例中，第一胶原蛋白支架区融合蛋白质为(GPP)10的双重特异性融合蛋白质，其具有对应于EGFR的抗体或抗体片段和对应于CD3的抗体或融合蛋白质。对应于EGFR的抗体或抗体片段可与(GPP)10的N端融合，而对应于CD3的抗体或抗体片段可与(GPP)10的C端融合。此实施例包括，但不限于双重特异性胶原蛋白区融合蛋白质763CSAOKT3。在本发明另一实施例中，对应于CD3的抗体或抗体片段可和(GPP)10的N端融合，而对应于EGFR的抗体或抗体片段可和(GPP)10的C端融合。
在本发明又另一实施例中，第一胶原蛋白支架区融合蛋白质是介于(GPP)10和对应于EGFR的抗体或抗体片端的融合，其中抗体或抗体片段融合至(GPP)10的N端或C端。第二胶原蛋白支架区融合蛋白质可为介于(GPP)10和对应于CD3的抗体或抗体片端的融合，其中抗体或抗体片段融合至(GPP)10的N端或C端。
在本发明一实施例中，抗EGFR scFv胶原蛋白支架区为763_scFv-Col。
在本发明一实施例中，抗CD3scFv胶原蛋白支架区为OKT3_scFv-Col。
在本发明另一实施例中，第一胶原蛋白支架区融合蛋白质为(GPP)10融合至对应于TNF-α的抗体。在本发明更进一步的实施例中，胶原蛋白支架区融合蛋白质为(GPP)10融合至对应于TNF-α的抗体片段，其中此片段可为，但不限于scFv、VL、VH或Fab片段。
在本发明一实施例中，抗TNF-α scFv胶原蛋白支架为区蛋白质为357_scFv-Col。
在本发明又另一实施例中，第一胶原蛋白支架区融合蛋白质为(GPP)10的双重特异性融合蛋白质，其具有对应于TNF-α、EGFR的抗体或抗体片段和对应于CD3的抗体或融合蛋白质。对应于TNF-α、EGFR的抗体或抗体片段可与(GPP)10的N端融合，而对应于CD3的抗体或抗体片段可与(GPP)10的C端融合。在本发明另一实施例中，对应于CD3的抗体或抗体片段可与(GPP)10的N端融合，而对应于TNF-α、EGFR的抗体或抗体片段可与(GPP)10的C端融合。
在本发明又另一实施例中，其中的胶原蛋白支架区融合蛋白质为(GPP)10和对应于TNF-α的抗体或抗体片端的融合，其中抗体或抗体片段融合至(GPP)10的N端或C端。另一胶原蛋白支架区融合蛋白质可为介于(GPP)10和对应于CD3的抗体或抗体片端的融合，其中抗体或抗体片段融合至(GPP)10的N端或C端。
在本发明又另一实施例中，第一胶原蛋白支架区融合蛋白质为(GPP)10的双重特异性融合蛋白质，其具有对应于EGFR的抗体或抗体片段和对应于CD3的抗体或融合蛋白质。对应于EGFR的抗体或抗体片段可与(GPP)10的N端融合，而对应于CD3的抗体或抗体片段可与(GPP)10的C端融合。在本发明另一实施例中，对应于CD3的抗体或抗体片段可与(GPP)10的N端融合，而对应于EGFR的抗体或抗体片段可与(GPP)10的C端融合。
在本发明又另一实施例中，第一胶原蛋白支架区融合蛋白质为介于(GPP)10和对应于EGFR的抗体或抗体片端的融合，其中抗体或抗体片段融合至(GPP)10的N端或C端。第二胶原蛋白支架区融合蛋白质可为介于(GPP)10和对应于CD3的抗体或抗体片端的融合，其中抗体或抗体片段融合至(GPP)10的N端或C端。
在本发明更进一步的实施例中，胶原蛋白支架区融合蛋白质可包括融合标志蛋白质。标志蛋白质包括，但不限于荧光酶、绿色荧光蛋白质或增强的绿色荧光蛋白质。这些实施例包括，但不限于h4D5CSA-Luc，其对应于HER2/neu。
可使用包括标志蛋白质的胶原蛋白区融合蛋白质用于诊断和分子造影中。在本发明实施例中，可将包括标志蛋白质或放射性离子或其它融合部分的胶原蛋白支架区蛋白质包装于试剂盒中，此试剂盒包括支架区融合蛋白和对于特定分子造影所需的其它试剂。这些试剂包括，但不限于用于制备生物材料的试剂和显像(visualization)标志蛋白质的试剂。
本发明包括一种检测配体的方法，包括：将三聚体可溶抗体和该配体一起培养以及检测该三聚体可溶抗体对该配体的结合，其中该三聚体可溶抗体包括三条多肽。在一优选实施例中，各多肽包括：胶原蛋白支架区，其包括至少10个G-X-Y重复序列，其中G为甘氨酸，X为任何氨基酸且Y为任何氨基酸，其中至少10个G-X-Y重复序列为G-P-P或G-P-O，其中至少5、6、7、8、9或10个G-X-Y重复序列为G-P-O并且其中P为脯氨酸而O为羟脯氨酸；以及抗体区，其中三条多肽的羟脯氨酸化的胶原蛋白支架区互相反应以形成该三聚体可溶抗体，以至少107M-1的亲合力特异性结合至配体。在一优选实施例中，各多肽包括：胶原蛋白支架区，其包括至少10个G-X-Y重复序列，其中G为甘氨酸，X为任何氨基酸且Y为任何氨基酸，其中至少10个G-X-Y重复序列为G-P-P或G-P-O，其中至少5、6、7、8、9或10个G-X-Y重复序列为G-X-O并且其中O为羟脯氨酸；以及抗体区，其中三条多肽的羟脯氨酸化的胶原蛋白支架区互相反应以形成该三聚体可溶抗体，以至少107M-1的亲合力特异性结合至配体。
在一实施例中，可溶三聚体抗体对其配体的亲合力大于107M-1。在一实施例中，可溶三聚体抗体对其配体的亲合力大于108M-1。在一实施例中，可溶三聚体抗体对其配体的亲合力大于109M-1。在某些实施例中，可溶三聚体抗体对其配体的亲合力是107M-1至1010M-1、107M-1至109M-1、107M-1至108M-1、108M-1至1010M-1、108M-1至109M-1，以及109M-1至1010M-1。
在某些实施例中，可溶三聚体抗体包括荧光酶多肽。
本发明实施例包括重组蛋白质复合物，其包括：第一融合多肽链，其包括第一胶原蛋白支架区和融合至第一支架区的一端的第一异源区；第二融合多肽链，其包括第二胶原蛋白支架区；以及第三融合多肽链，其包括第三支架区，其中第一第二和第三支架区对齐以形成三重螺旋。
在更进一步的实施例中，本发明提供蛋白质复合物，其中第一融合多肽链更包括第二异源区融合至第一支架区的另一端。本发明其它实施例包括蛋白质复合物，其中第一异源区包括特异性结合CD3的第一单链抗体的序列或第二异源区包括特异性结合EGFR的第二单链抗体的序列。
在本发明更进一步的实施例中，蛋白质复合物包括第二融合多肽链，其包括第三异源区融合至第二支架区的一端，且第二融合多肽链包括第四异源区融合至第二支架区的另一端，第三融合多肽链包括第五异源区融合至第三支架区的一端和第四异源区融合至第三支架区的另一端，其中各重复序列包括(GPP)10的序列。
实施例
实施例1
对于抗EGFR抗体区的噬菌体展示文库(phage display library)的筛选
藉由筛选人类单一折叠scFv噬菌体展示文库(phage display library)来分离erb噬菌粒phagemid)，其包括结合各种片段(scFv)的EGFR细胞外区(EGFR-ECD)(Tomlinson I+J；kindly provided by I.M.Tomlinson and G.Winter，MRC Laboratory of Molecular Biology，Cambridge，UK)。使用涂布有10μg的经纯化的EGFR细胞外区(EGFR-ECD；Research Diagnostics，Inc.)的免疫试管(immunotube)(Maxisorp；Nunc，Roskilde，Denmark)来执行筛选。根据操作手册执行经洗提的噬菌体的封闭(blocking)、淘洗、清洗、洗提和再扩增(reamplification)。鉴定了一些复制子。在藉由Western印迹和ELISA确认后，选出复制子，erb_scFv进行更进一步的实验。获得编码erb_scFv的cDNA，并将藉由标准方法其连接至表达载体。erb_scFv的多肽序列示于SEQ ID NO：1，其编码核苷酸序列示于SEQ ID NO：2。
之后在昆虫细胞株果蝇(Drosophila S2)中表达该表达载体。纯化抗EGFRerb_scFv且将其进行Western印迹和ELISA以确认其对EGFR的特异性。
实施例2
CD3抗体区
实施RT-PCR以从杂交瘤细胞株获得cDNA，其编码出抗CD3单克隆抗体OKT3的重链可变区(heavy chain variable reagion，VH)和轻链可变区(lightchain variable reagion，VL)。之后连接两种cDNA以产生融合序列，其编码OKT3的VH-VL的融合蛋白质。该融合蛋白质的多肽序列示于SEQ ID NO：3，其编码cDNA序列示于SEQ ID NO：4。
实施例3
EGFR抗体区
执行相同的步骤以获得编码抗EGFR单克隆抗体528的VH和VL的cDNA以及融合序列，所述融合序列编码抗EGFR528的VH-VL的融合蛋白质。528单克隆抗体与细胞膜上的EGFR结合，例如于人类表皮样癌(human epidermoidcarcinoma)A431细胞。此单链抗体的多肽序列示于SEQ ID NO：5，其编码cDNA序列示于SEQ ID NO：6。
实施例4
抗体区和人类迷你胶原蛋白XXI的融合
分别将编码上述抗EGFR erb OKT3VH-VL和抗EGFR 528VH-VL读框融合至人类迷你胶原蛋白XXI cDNA，其包括于5’端的人类IgG的铰链区，EPKSCDKTHTCPPCPRSIP，以及于3’端的组氨酸标记。人类迷你胶原蛋白XXI的多肽和cDNA序列分别示于SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8，注意在SEQ ID NO：7中，Pro为脯氨酸或羟脯氨酸。
构建体包括衍生于OKT3 IgG的氨基端抗CD3 scFv、人类IgG2的铰链区、人类迷你胶原蛋白XXI多肽，且伴随着T4 fibritin折叠区和组氨酸标记的OKT3mC21fd。噬菌体T4 fibritin折叠区具有充分的驱动胶原蛋白区三聚体化和正确折叠的能力，且其包括27个氨基酸，NH2-GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL-COOH，并形成具有疏水内部的类β螺旋结构(Frank et al.，(2001)J Mol Biol 308：1081-1089)。
将对于OKT3mC21和OKT3mC21fd两者所产生的表达载体分别转染进入果蝇S2细胞，果蝇S2细胞带有稳定表达的脯氨酸-4-羟化酶基因。于杀稻瘟菌素(blasticidin)存在的条件下培养细胞以选出抗杀稻瘟菌素的细胞。收集细胞培养悬浮物，且藉由以单克隆抗体3E2进行的Western印迹来分析，单克隆抗体3E2辨认α1(XXI)胶原蛋白的C端NC1区。如图2所示，在非还原环境下，OKTmC21和OKT3mC21fd皆形成三重结构(如T所示)。也在OKTmC21和OKT3mC21fd两者内皆检测到分子间二硫键三聚体(如M所示)。此结果证明OKT3_scFv的异源性融合蛋白质并不影响迷你胶原蛋白XXI的支架区的三聚体化，且甚至不需任何三聚体结构，例如T4 fibritin折叠区。
实施例5
抗体区和胶原蛋白样区的融合
以热稳定的短胶原蛋白样肽(Gly-Pro-Pro)10取代迷你胶原蛋白XXI的胶原蛋白区作为胶原蛋白支架抗体的支架模板。产生八个融合多肽：erb_scFv-Col、OKT3_scFv-Col、763_scFv-Col、357_scFv-Col、erb_scFv-GPP10、Col-erb_scFv、763CSA-OKT3和h4D5CSA-Luc。对于763_CSA2的构建而言，其它胶原蛋白样肽，(GPP)5GKPGKP(GPP)6，被用来当作三聚体支架。在小鼠骨髓瘤NS0细胞中稳定表达这些支架区融合蛋白为可溶性分泌蛋白。
重组质粒的构建
通过PCR从erb噬质粒扩增编码erb的scFV的cDNA。藉由从OKT杂交瘤(ATCC，CRL-8001)反转录产物获得编码鼠科IgG2a抗CD3mAbOKT3的序列(Ortho Pharmaceutical Coroporation)。依据公开的核苷酸序列，藉由RT-PCR获得OKT3的VH和VL的cDNA。藉由以甘氨酸接头(GGGGS)3连接VH和VL产生erb和OKT3的scFv PCR融合。
使用衍生自panitumumab(Vectibix，Amgen，Inc.)的cDNA的引物试剂盒PCR扩增编码mAb 763的VH和VL的cDNA，panitumumab的cDNA是根据公开的核苷酸序列(美国专利No.6,235,883)。藉由以甘氨酸接头(GGGGS)3连接VH和VL产生763的scFv PCR融合。
实施RT-PCR以从杂交瘤357-101-4细胞株(ECACC No.92030603)获得编码抗TNF-α单克隆抗体357的重链可变区(heavy chain variable reagion，VH)和轻链可变区(light chain variable reagion，VL)的cDNA，小鼠抗人类TNF-α mAb具有强效中和活性。之后以甘氨酸接头(GGGGS)3(SEQ ID NO：9中的氨基酸107-121)连接两种cDNA以产生融合序列，其编码357 scFv的融合蛋白质。此融合蛋白质的多肽序列示于SEQ ID NO：9，其编码cDNA序列示于SEQ IDNO：10。
为了产生scFv-Col，其编码区包括N端scFv核苷酸序列和C端基因，其编码EPKSCDKTHTCPPCPRSIP(GPP)10GICDPSLCFSVIARRDPFRKGPNY(SEQ ID NO：11)，其编码人类IgG的铰链区(斜体显示)、胶原蛋白样支架区(以粗体显示)和XXI型胶原蛋白的NC1区。以下显示合成的包含胶原蛋白支架的多肽(SEQ ID NO：11)，其cDNA序列示于SEQ ID NO：12。
SEQ ID NO：11
GluProLysSerCysAspLysThrHisThrCysProProCysProArgSerIleProGlyProProGly
ProProGlyProProGlyProProGlyProProGlyProProGlyProProGlyProProGlyP
roProGlyProProGlyIleCysAspProSerLeuCysPheSerValIleAlaArgArgAspProPhe
ArgLysGlyProAsnTyr
藉由重叠PCR(overlapping PCR)制备合成序列(SEQ ID NO：12)且将在两侧具有NotI和XhoI位点的PCR产物复制进入表达载体pSecTag2/Hygro(Invitrogen)的相同位置。之后将erb、OKT3、763和357的scFv读框复制至上述包含C端胶原蛋白支架的构建体中的AscI和NotI位点以分别制备erb_scFv-Col、OKT3_scFv-Col、763_scFv-Col和357_scFv-Col的表达构建体。
接着产生erb_scFv-GPP10以证明胶原蛋白支架抗体的胶原蛋白支架肽，(GPP)10，其可自身驱动非共价键合三聚体融合蛋白质，不需存在于胶原蛋白样区中或两侧的键内交联氨基酸残基的帮助(例如半胱氨酸或赖氨酸)。erb_scFv-GPP10的编码区包括erb_scFv的N端核苷酸序列和C端合成基因，其编码GSP(GPP)10GPSSGG的肽序列，此序列包括胶原蛋白样支架区(粗体显示)。这种包含合成胶原蛋白支架的多肽和cDNA序列分别示于SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14，注意在SEQ ID NO：13中，Pro为脯氨酸或羟脯氨酸。
由重叠PCR将erb_scFv的cDNA读框复制至上述C端胶原蛋白支架序列，且将在两侧具有AscI和AgeI位点的PCR产物复制进入表达载体pSecTag2/Hygro(Invitrogen)以制备erb_scFv-GPP10的表达构建体。
接着制备Col-erb_scFv。Col-erb_scFv的胶原蛋白支架区包括TCPPCPRSIP(GPP)10GICDPSLC的肽序列，其包括胶原蛋白样区(GPP)10，其具有两个位于两侧的二硫键结(disulfide knot)TCPPCPRSIP和GICDPSLC。这种包含合成胶原蛋白支架的多肽和cDNA序列分别示于SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16，注意在SEQ ID NO：15中，Pro为脯氨酸或羟脯氨酸。。
由重叠PCR将erb_scFv的cDNA读框复制至上述N端胶原蛋白支架序列(SEQ ID NO：16)，且将在两侧具有BamHI和AgeI位点的PCR产物复制进入表达载体pSecTag2/Hygro(Invitrogen)以制备Col-erb_scFv的表达构建体。
接着制备763CSA2。763CSA2的编码区包括氨基端763_scFv(抗EGFR)和C端合成胶原蛋白支架基因，其编码EPKSGDKTHTCPPCPRSIP(GPP)5GKPGKP(GPP)6GICDPSLC的肽序列，此序列包括突变的人类IgG铰链区(斜体显示)、胶原蛋白样区(粗体显示)和XXI型胶原蛋白的二硫键结(GICDPSLC)。以下显示包含合成胶原蛋白支架的多肽(SEQ ID NO：17)，其cDNA序列示于SEQ ID NO：18。
SEQ ID NO：17
GluProLysSerGlyAspLysThrHisThrCysProProCysProArgSerIleProGlyProProGly
ProProGlyProProGlyProProGlyProProGlyLysProGlyLysProGlyProProGlyP
roProGlyProProGlyProProGlyProProGlyProProGlyIleCysAspProSerLeuCys
(注意Pro为脯氨酸或羟脯氨酸)
藉由重叠PCR制备合成序列(SEQ ID NO：17)，且将在两侧具有NotI和XhoI位点的PCR产物复制进入表达载体pSecTag2/Hygro(Invitrogen)中的相同位点。之后将763的scFv读框复制至上述包含C端胶原蛋白支架的构建体中的AscI和NotI位点以制备763CSA2的表达构建体。
之后产生双重特异性胶原蛋白支架抗体，763CSAOKT3。将OKT3的scFv的读框复制至763_scFv-Col的C端于AgeI和BamHI位点以制备763CSAOKT3的表达构建体，其中将763的抗EGFR置于N端，且跟随着胶原蛋白支架多肽(SEQ ID NO：11)和C端的O KT3的抗CD3scFv。
之后构建其它双功能结合配偶体，h4D5CSA-Luc。藉由将氨基端的h4D5_scFv融合至在构建763CSA的段落所述的包含C端胶原蛋白支架的表达载体，其中氨基端的h4D5_scFv源自人源化抗HER2/neu IgG(Carter et al.(1992)Proc Natl Acad Sci USA 89,4285-4289)。之后将Gaussia荧光酶(美国专利No.6,232,107)读框融合至h4D5_scFv-Col中的AgeI和BamHI位点。
各种scFv、scFv-Fc和CSA分子的各开放读码框(open reading frame)包括这样的序列，其编码N端前导序列(leader sequence)以及以分泌、检测和纯化为目的的C端myc抗原决定位/聚组氨酸(polyhistidine)标记。
表1为藉由上述表达建构载体所编码的各种重组蛋白质/抗体之相关信息。
表1、本研究中使用的各种抗体
Figure A200810181271D00491
1胶原蛋白支架抗体
实施例6
重组蛋白质的表达
为了生成重组蛋白质/抗体，根据制备商使用手册使用Effectene(Qiagen)将前述scFv、scFv-Fc和CSA构建体克隆至小鼠骨髓瘤(myeloma)NS0细胞。在以潮霉素(hygromycin)筛选4周后，将每个稳定的克隆(clone)培养于一震荡烧瓶内以起始接种密度为5×105细胞/ml于包括2％胎牛血清的化学限定培养基(chemically-defined medium)HyQCDM4NS0(Hyclone)中。培养维持在150rpm5天于37℃。为了使那些带有表达载体的细胞编码蛋白质，每天加入维生素C(Sodium ascorbate)(80μg/ml)于培养基中，其中上述蛋白质包含前述抗体区域和胶原蛋白支架区域，即胶原蛋白支架抗体(CSA)。
实施例7
重组蛋白质的纯化
为了纯化表1所列的CSA蛋白质，提供每种过滤细胞培养基约2L至T-凝胶柱(1.5×8cm，Pierce)，以包含0.5M KCl的50mM的Tris-HCl作为缓冲溶液(pH8)，以60ml/小时的流速。在以相同的缓冲溶液清洗后，以50mM的醋酸钠缓冲溶液(pH4)洗提出蛋白质或蛋白质复合物。在280nm监测其UV吸收，并将其提供高峰部分置于硫酸锌螯合Sepharose HighTrap柱(柱床体积中为1-ml，GE Healthcare)，在60ml/小时的流速下以包含0.5M NaCl的50mM的Tris-HCl缓冲溶液(pH8)平衡。先以20mM的咪唑(imidazole)清洗，之后以0.25M的咪唑于相同的缓冲溶液洗提出键合的蛋白质。最后的制备为以50mM，pH7.0的Hepes缓冲溶液进行透析。之后使用具有MOPS的10％NuPAGEbis-Tris聚丙烯酰胺凝胶或7％ SDS/Tris-醋酸聚丙烯酰胺凝胶以醋酸钠作为电泳运行缓冲溶液(running buffer)(Invitrogen)执行SDS-PAGE。之后将蛋白质以考马斯亮蓝(Coomassie brilliant blue)R-250进行染色。藉由密度仪利用ChemiImager 5500(Alpha Inn8)来定量蛋白质条带(band)的密度。
三聚体化研究
为了验证三重螺旋的本质，将经纯化的erb_scFv-Col(1mg/ml)置于37℃，在DTT缺少或存在的情况下培养1小时。一份经DTT处理过的样本，更进一步与50mM N-乙基顺丁烯二酰亚胺(N-ethyl-maleimide，NEM)于室温下反应30分钟，以永久地妨碍自由巯基(sulfhydryl)和三聚体的再形成。将每个样本的蛋白质取等量于7％ SDS/Tris-醋酸聚丙烯酰胺凝胶以醋酸钠作为电泳缓冲溶液进行电泳。以考马斯蓝(Coomassie blue)进行凝胶染色。发现经纯化的CSA为同源三聚体(homotrimer)或链内二硫键六聚体(hexamer)，在轻微的还原环境下其可被分离成两个三聚体。
测试erb_scFv-Col的三聚体结构的热稳定性。在含有2M尿素(urea)的50mM Tris-HCl(pH8)中，经纯化的erb_scFv-Col于室温下以缺少或存在10mMtris(2-carboxyethyl)phosphine(TCEP)进行处理。于室温将还原的样本以50mM的NEM进行烷化(alkylate)。与SDS加样缓冲溶液(loading buffer)混合之前将每个样本取等量蛋白质于35、45、55、65、75和85℃下加热10分钟。于非还原状态下将样本在10％NuPAGE bis-Tris聚丙烯酰胺凝胶和MOPS缓冲溶液进行电泳。以考马斯蓝(Coomassie blue)进行凝胶染色。结果显示erb_scFv-Col三聚体具有高热稳定性。在经65℃处理10分钟之后仍然保留多于50％的三聚体。且发现了erb_scFv-Col胶原蛋白样区域的三聚体结构被羟脯氨酸化(prolyl hydroxylate)。
erb_scFv-Col或OKT3_scFv-Col的主要结构包括人类或小鼠的单链Fv处理区、人类IgG1铰链区、(Gly-Pro-Pro)10胶原蛋白样肽和XXI型胶原蛋白的NC1区。
于小鼠骨髓瘤NS0细胞中表达erb_scFv-Col、OKT3_scFv-Col、erb_scFv-Fc和erb_scFv的重组抗体为可溶性分泌蛋白质，且藉由先前提到的柱层析将其各别从培养基中纯化。图5A显示这些纯化抗体的SDS-PAGE分析。在非还原情况下，两主要条带被分解于erb_scFv-Col中(第2泳道)，而在OKT3_scFv-Col只有观察到一个单一主要条带(第3泳道)。erb_scFv-Col和OKT3_scFv-Col两者的较低条带迁移至125kD的位置，十分符合两者scFv-Col单体(41kD)的三聚体形式所计算出的分子量。于erb_scFv-Col中(第2泳道)中显现的上方条带为三聚体的链内二硫键合形成的二聚体。
藉由将样本培养于轻微还原的环境可证实此发现，如图5B所示：erb_scFv-Col的链内二硫键合六聚体(250kD)被分离成两个三聚体(125kD)。在图5A中，在还原环境下以50mM的DTT在70℃处理样本10分钟，而将erb_scFv-Col的链内二硫键合六聚体完全还原成三聚体形式，而只有一些erb_scFv-Col三聚体被更进一步分离成单体(第7泳道)。有趣的是，OKT3_scFv-Col的三聚体结构在这些还原环境下能不被分离成单体形式(第8泳道)。在非还原环境下，erb抗体的二价相似物(bivalent counterpart)，erb_scFv-Fc移动成二聚体，其明确分子量为125kD(第4泳道)，而在链内二硫键被还原之后，则展现近乎单体的形式，具有明确的分子量57kD(第9泳道)。
这些结果意味着在erb_scFv-Col和OKT3_scFv-Col的胶原蛋白支架抗体分子中的胶原蛋白样肽(Gly-Pro-Pro)10可配装成热稳定的三聚体结构(参见下方)。在非还原或还原环境下，erb抗体的单价相似物，erb_scFv移动成单一条带，具有明确的分子量28kD。可以显示于图5中的erb_scFv-Col的链内二硫键合形式的六聚体和三聚体结构为特征以进一步确定其三重螺旋的热稳定性。为了排除链内二硫键对于胶原蛋白支架抗体三聚体化配装的贡献，首先使用还原剂TCEP于室温将erb_scFv-Col中的半胱氨酸残基完全还原，之后将其以NEM烷基化(alkylated)以避免二硫键再形成。将等量的非还原或还原/烷基化培养于包含2M尿素的Tris-HCl(50mM，pH8)中，于指示温度下，且于非还原环境下藉由SDS-PAGE分析三重螺旋的分离，以评估胶原蛋白三重螺旋的热稳定性。如预期，于35℃链内二硫键合六聚体形式立即被分离成三聚体(图6A，比较第1泳道和第4泳道)。当培养温度升高时，三聚体显著分离成单体(图6A，第4-9泳道)。在2M尿素下，于还原/烷基化之后，测定erb_scFv-Col的中点转换温度(midpoint transition temperature，Tm)为66℃，在此温度下一半的三聚体未经折叠为单体(图6A)。虽然erb_scFv-Col于高的培养温度下部分降解，在非还原环境下的相同实验(图6第1-3泳道)并没有显示六聚体或三聚体结构的任何改变。
此现象于其它实验一致，证明包含GPP的肽在于90℃加热下敏感，且部分降解，且引入2.5M的guanidium HCl减低Tm27℃。
羟脯氨酸对于胶原蛋白三重螺旋结构的稳定性是重要的。于纯化的样本实行氨基酸组成分析以调查于erb_scFv-Col中羟脯氨酸的存在。将经纯化的erb_scFv-Col以50mM醋酸进行透析、在6N HCl，110℃进行水解24小时的后以Waters Pico·Tag
Figure A200810181271D0052152050QIETU
 system进行氨基酸分析。在erb_scFv-Col的测定的氨基酸组成和根据演绎的cDNA序列的预测资料间，观察到接近的配对(表2)。此外，羟脯氨酸衍生物的波峰位置于高效液相层析(High-Performance LiquidChromatograph，HPLC)洗提数据图表中被检测到，暗示于(Gly-Pro-Pro)10中的胶原蛋白Gly-X-Y三个为一组的Y位置的脯氨酸受到羟基化(第7图)。
根据(Gly-Pro-Pro)10中的十个完全羟基化的脯氨酸，erb_scFv-Col中的羟脯氨酸化程度被判定为61％(参见表2的Hyp残基)。结果显示在胶原蛋白支架抗体分子中的(Gly-Pro-Pro)10对于脯氨酸-4-羟化酶而言为一种好的受质，且对于胶原蛋白分子的生物合成而言，小鼠骨髓瘤NS0细胞具有充足的脯氨酸羟化酶活性。
表2、表达于NS0细胞中的纯化的erb_scFv-Col的氨基酸分析
a经计算的氨基酸残基为根据在移除信号序列后的erb_scFv-Col的演绎的氨基酸序列。
b所显现的数值为平均值±标准差，n＝3。
c当脯氨酸残基于胶原蛋白GXY三个为一组的序列的Y位置时的预测值。
在培养基悬浮物中的三聚体可溶抗体的高程度存在指可将包括抗体区和支架区的单体三聚体化和进行分泌。在相同的多肽如支架区中的抗体区的存在不能阻止三聚体化，不能阻止可溶抗体的形成，也不能阻止分泌抗体和培养基中。因此本发明允许抗体三聚体化、形成可溶性抗体并且分泌可溶性三聚体抗体。
实施例9
结合研究
使用BIAcore X生物传感器(BIACORE，Inc.，Uppsala，Sweden)于缓冲液HBS-EP(10mM HEPES，pH 7.4，150mM NaCl，3mM EDTA，0.005％surfactant P20)中测量erb抗体的变体对EGFR-ECD的结合动力学。简单来说，将EGFR-ECD固定于C1感应芯片经由胺(amine)连结至1700反应单位(response units，RU)的程度以及在10μl/分钟的流速下注入不同浓度的经纯化的抗体。藉由注入5μl 10mM甘氨酸-盐酸(glycine-HCl)(pH3.5)复原表面。在每个浓度取得感应谱(sensorgram)并使用程序BIA Evaluation 3.2来洗提感应谱。结合数据与1:1 Langmuir结合模型配合来计算平衡结合常数KD，其被定义为解离率(dissociation rate)(koff)/结合率(association rate)(kon)的比值。结果显示于表3。
表3、erb抗体的各种形式与固定化的EGFR-ECD结合的结合动力学
Figure A200810181271D00541
如表3所示，erb_scFv-Col对EGFR-ECD的结合亲合力分别几乎为二价(erb_scFv-Fc)和单价(erb_scFv)mAb的20和1000倍。
抗体结合分析证明胶原蛋白支架抗体分子的结构设计不改变scFv区的结合活性。使用表面等离振子共振技术(surface plasmon resonance)和细胞流式仪来检查scFv结合活性是否分别保留于erb_scFv-Col和OKT3_scFv-Col。因此，藉由胶原蛋白支架抗体分子中的三价scFv而增加的抗原结合亲合力和藉由其的二价和单价相似物而增加的抗原结合亲合力进行比较。三个erb抗体变形，erb_scFv-Col、erb_scFv-Fc和erb_scFv对EGFR-ECD的互相影响以表面等离子共振技术进行研究，而平衡结合常数KD则被测定为分离和结合率常数的比值(koff/kon)。单价erb_scFv结合EGFR-ECD配体的KD为10-6M的等级，而二价erb_scFv-Fc和三价erb_scFv-Col结合EGFR-ECD配体的KD分别为10-7M和10-9的等级(图8和表3)。三价erb胶原蛋白支架抗体的亲合力增加分别超过其二价和单价相似物近乎20和1000倍。尤其是，erb_scFv-Col的解离率常数(koff)为8.22×10-4s-1，而erb_scFv-Fc的解离率常数(koff)为94.4×10-4s-1，代表于三价形式对解离率显示出11倍的改善。藉由流式仪分析，使用抗体置换分析(antibody displacement assay)以饱和浓度的OKT3-FITC(0.25μg/ml)作为竞争者，来测定对于和人类CD3(+)T细胞细胞表面上CD3结合的OKT3_scFv-Col和OKT3 IgG的功能亲合力。所有下述的步骤皆在4℃下实施。将人类T细胞于1×106细胞/ml的密度悬浮于FCM缓冲溶液中(包含具有2％胎牛血清和0.1％叠氮化钠(sodium azide)磷酸缓冲生理食盐水)。以小鼠总IgGs(total IgGs)(2μg/ml，Jackson ImmunoResearchLaboratories)处理细胞30分钟，之后将细胞和连续稀释的OKT3_scFv或OKT3抗体一起培养1小时。直接加入固定饱和量的FITC-连结的OKT3(0.25μg/ml，purchased from eBioscience，Inc.)的固定饱和量。在培养1小时后，将细胞以FCM缓冲溶液清洗以及藉由流式细胞仪于FACScan(Becton Dickinson，SanJose，CA)上进行免疫荧光分析。结果显示为最大荧光强度的抑制百分比，其被定义为藉由将具有OKT3-FITC的T细胞进行染色于缺少阻断抗体(blockingantibodies)的情况下，所获得的平均荧光强度。计算出各mAb抑制一半的最高荧光强度(IC50)所需的浓度。
评估OKT3 IgG和OKT3_scFv-Col对人类CD3(+)T细胞的结合亲合力为OKT3IgG为1.33nM，OKT3_scFv-Col为0.45nM。因此IC50值指三价OKT3IgG对于CD3(+)T细胞的亲合力，为约大于二价OKT3 IgG三倍(图9)。此结果指出OKT3_scFv-Col结合至人类CD3强于天然的鼠科OKT3 mAb。
因此，使用表面等离子共振技术获得的结合分析结果和细胞结合分析展现和二价相似物相比，三价erb和OKT3 CSA显著改善了结合亲合力。结合分析也显示在纳摩尔(nanomolar)的范围中，本发明三价可溶抗体可显现出结合亲合力。
因此，以本发明可达成对于配体具有高亲合力的可溶三聚抗体。
实施例10
稳定性和药物动力学(Pharmacokinetic)分析
为了血清稳定性分析，藉由培养人类血清于37℃来测量erb_scFv_Col、erb_scFv-Fc或erb_scFv的多种形式的稳定性。藉由定量EILSA来测量在培养时间的不同时期之后存留的活化抗-EGFR的量。以使用重组EGFR-ECD(当作捕捉试剂(capture reagent))和抗-c-myc mAb(9E10，Sigma Chemical Co.)，之后再以HRP结合的亲合力纯化的多株山羊抗小鼠IgG和化学发光受质(chemiluminescent substrate)(Pierce Biotechnolo gy，Inc.)来执行ELISA。为了药物动力学分析，使用三只BALB/c裸鼠来分析erb_scFv_Col清除(clearance)。简单而言，在事先采血之后，对每只小鼠皮下(subcutaneously，s.c.)注射25μg(2mg/体重Kg)的erb_scFv-Col。在接下来的70小时中，收集周期性的血液样本并且藉由EILSA来评估它们erb_scFv_Col的含量。
胶原蛋白区的三重螺旋结构通常使胶原蛋白抵抗无特异性的蛋白分解酵。研究并且将erb_scFv-Col的稳定性和erb_scFv-Fc和erb_scFv的稳定性进行比较，藉由于37℃在人类血清中各自培养其各纯化抗体的变异型于各种时间。藉由ELISA测定各种erb抗体的免疫反应性(immunoreactivity)。如图10A所示，erb_scFv-Col比erb_scFv-Fc更稳定，于生理温度下的人类血清中培养72小时内，仍保留其起始结合活性的60％。erb_scFv-Fc于人类血清中快速降解，在培养1小时内只保留少于其起始活性的40％。结果指出erb_scFv-Col的三重螺旋胶原蛋白样肽和erb_scFv-Fc的Fc区比起erb_scFv更能抵抗血清蛋白质分解酶的降解。因此，本发明的可溶三聚体抗体比起单体或二聚体抗体具有更高的血清稳定性。
图10B显示erb_scFv-Col于小鼠中的药物动力学的图式。在单一静脉内给予2mg/kg的erb_scFv-Col后，测定两间隔的模型的动力学。免疫反应性的血浆浓度(plasma level)以0.21小时的分布期半衰期(t1/2α)和4.78小时的末端排除期(terminal elimination phase)半衰期(t1/2β)双形式(biphasically)降解。
T细胞增殖(proliferation)分析和混合淋巴细胞反应(Mixed LymphocyteReaction)
实行溴化脱氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2＇-deoxyuridine，BrdU)细胞增殖分析。简单地说，将人类外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell)置于黑色96孔平底组织培养板(flat bottom tissue culture plate)中，在100μl包括10％FBS的RPMI-1640培养基中具有2×105细胞/孔，于37℃在10倍连续稀释的OKT3(eBioscience，Inc.)或OKT3_scFv-Col存在下培养66小时。之后将细胞以10μM的BrdU进行脉冲6小时。在移除培养基后，以FixDenat混合细胞和将DNA变性于一个步骤。之后将细胞和过氧化酶(peroxidase)标定抗-BrdU抗体(anti-BrdU POD，Fabfragments)于室温一起培养1.5小时。使用微盘式发光仪(microplate-luminometer)(Hidex，CHAMELEON detection platform，Finland)来进行化学发光检测和定量。
于单向混合淋巴细胞反应评估T细胞增殖和免疫抑制(immunosuppression)，如下。从两个健康的捐献者(刺激者(stimulator)和反应者(responder))获得人类外周血单核细胞。于37℃在包含5％CO2的潮湿的空气中，以25μg/ml丝裂霉素C(Sigma-Aldrich)于完全培养基(RPMI 1640补充10％人类AB血清(human AB serum)、2mM谷氨酰胺(glutamine)、50nM2-硫醇乙醇(2-mercaptoethanol)和青霉素(penicillin)和链霉素(streptomycin)各100单位/ml)处理刺激者或反应者细胞30分钟，接着在RPMI 1640中清洗三次。将反应者细胞单独培养或和经丝裂霉素C处理的刺激者或丝裂霉素C反应者细胞以1:1的比例混合，以200μl的完全培养基中具有2×105细胞/孔进行培养。在反应者细胞置入后，立即以不同浓度加入经纯化的OKT3_scFv-Col或OKT3于培养基中。5天后将细胞以10μM的BrdU进行脉冲和在24小时后收取细胞。之后以上述方法进行细胞增殖分析。
为了确认是否OKT3_scFv-Col靠增加对于CD3(+)T细胞可存在大于其所源自的OKT3 IgG的免疫抑制活性，OKT3_scFv-Col和OKT3 IgG皆对T细胞有分裂活性处理于单方向混合淋巴细胞反应中。在混合的外周血单核细胞细胞培养中(丝裂霉素C处理的刺激者和反应者)，培养5天而没有抗体处理，混合淋巴细胞反应发展如同种异体(allogeneic)刺激的T细胞活化(图11B，实心方框)。以OKT3 IgG处理混合的外周血单核细胞细胞培养，更进一步刺激了T细胞的增殖(图11B，实心圆)。相对的，OKT3_scFv-Col在一剂量依据方法中抑制混合淋巴细胞反应，在100ng/ml的浓度达到背景程度(图11B，空心圆)。这些结果指出OKT3_scFv-Col，当体外存在减低的有丝分裂，OKT3_scFv-Col为T细胞增殖的的有效的免疫抑制剂。
细胞因子测量
藉由外延的T细胞受体(TCR)-CD3经由结合具有FcR的细胞交联而引起鼠科OKT3的有丝分裂。因此，最近已努力发展非有丝分裂形式的抗-CD3，藉由改变对Fc受体的结合。如胶原蛋白支架抗体分子的模型，藉由以胶原蛋白样肽取代OKT3 IgG的Fc区产生OKT3_scFv-Col以测试是否其为非有丝分裂。将人类外周血单核细胞以在0.1ml包括10％FBS的RPMI-1640培养基中具有2×105细胞/孔，于37℃在10倍稀释的OKT3(eBioscience，Inc.)或OKT3_scFv-Col存在下进行培养。收集悬浮物于不同的时间点，以及使用人类细胞因子免疫分析试剂盒(eBioscience，Inc.)来测量多种细胞因子。
测量OKT3 IgG和OKT3_scFv-Col激发T细胞增殖和释放发炎和其它细胞因子(IL-2、IFN-α和TNF-α)的能力。如预期，OKT3 IgG在非常低的剂量即诱发T细胞增殖或细胞因子产生，但甚至高浓度OKT3_scFv-Col仍无诱发可检测的T细胞增殖或细胞因子产生(图11A和12)。因此这些结果证明，不像OKT3 IgG，OKT3_scFv-Col不具有T细胞活化特性。结果指出和鼠科OKT3IgG相比，给予OKT3_scFv-Col则产生可忽略的细胞因子释放。
这些结果证明于刺激T细胞增殖中，当具有可忽略的有丝分裂活性时，OKT3_scFv-Col在免疫抑制T细胞增殖为更有效。因此本发明的三聚体可溶抗体具有减低的有丝分裂。通常，在抗癌和免疫调节应用中，胶原蛋白支架抗体对于治疗性抗体设计而言为理想的结构。
实施例11
异源区对C端支架区的附着
较早的研究报导可藉由体外20℃下，III型胶原蛋白C端或N端邻接至胶原蛋白样肽的二硫群的氧化还原移动步骤(redox-shuffling process)获得链内二硫键合(Gly-Pro-Pro)10三重螺旋(Frank et al.，(2003)J Biol Chem 278：7747-7750)。为了调查是否(Gly-Pro-Pro)10可体内驱动C端融合配偶体的三聚体化，产生胶原蛋白支架抗体分子，Col-erb_scFv，其由N端合成胶原蛋白支架基因编码序列为TCPPCPRSIP(GPP)10GICDPSLC的肽和C端erb_scFv所组成(图13A)。结果显示纯化的Col-erb_scFv具有依结构特征，和在erb_scFv-Col中观察到的相似，除了在Col-erb_scFv中的六聚体，少于erb_scFv-Col之外(图13B)。因此(Gly-Pro-Pro)10肽可藉由自身驱动scFv的N端或C端配偶体三聚体化。
实施例12
驱动胶原蛋白支架抗体的需求
产生胶原蛋白支架抗体分子，erb_scFv-GPP10以证明胶原蛋白样肽，包括(GPP)10，藉由其可驱动非共价键合三聚体融合蛋白质的形成，而不需其它任何三聚体化区或链内交联氨基酸残基(例如半胱氨酸和赖氨酸)的表达于其中的帮助或胶原蛋白样区位于侧边。erb_scFv-GPP10的编码区包括erb_scFv的N端核苷酸序列和C端合成胶原蛋白基因，其编码的序列为GSP(GPP)10GPSSGG的肽(第14A图)。如图14B所示，erb_scFv-GPP10形成热稳定三聚体，具有和erb_scFv-Col的还原/烷基化链内二硫键合结构相似的熔点(图6A)。其间，erb_scFv-GPP10保持对于EGFR-ECD的强的亲合力，意指erb_scFv为正确地被折叠(图14C)。
实施例13
具有不同胶原蛋白样肽作为胶原蛋白区的胶原蛋白支架抗体分子的制备
使用源自于Vectibix(panitumumab；Amgen，Thousand Oaks，CA，USA)的scFv，一种治疗性全人类抗EGFR mAb来构建两种不同形式的胶原蛋白支架抗体：763_scFv-Col和763CSA2，其分别具有不同的胶原蛋白样肽，(GPP)10(图15A)和(GPP)5GKPGKP(GPP)6(图16A)做为支架区。由SDS-PAGE分析得知两种胶原蛋白支架抗体皆配装为三聚体(图15B和16B)。在浓度和亲源panitumumab相等时，763_scFv-Col有效阻止EGFR传送信号(图15C)。其间，763CSA2保持对EGFR(由人类表皮癌A431细胞株纯化)的强亲合力，意指erb_scFv被正确地折叠(第16C图)。
实施例14
双重特异性胶原蛋白支架抗体分子的制备
产生双重特异性胶原蛋白支架抗体分子，763CSAOKT3以证明自身三聚体化胶原蛋白支架为更多方面适用，其允许融合配偶体同时附着于两端(图17A)。藉由Western印迹检验包含分泌的763CSAOKT3的培养基，763CSAOKT3来自四种不同的稳定复制。763CSAOKT3分子被配装成三聚体结构，且其可更进一步被聚合成六聚体，推测其藉由于两个三聚体中的C端半胱氨酸的间的链内二硫键交联(图17B)。在纯化的后，于非还原环境下，763CSAOKT3的主要形式为三聚体(图17C，第1泳道)。
上述结果具有一个重要后果，如可展开自身三聚体化胶原蛋白支架以构建可同时和两个庞大配偶体互相作用(每端具有结合数价至3或6)。如图18所示，双重特异性763CSAOKT3可与A431(具有EGFR)和人类CD3(+)T细胞交联。因此，763CSAOKT3可作为T细胞衔接器(engager)，重新指导(redirecting)T细胞细胞毒性以抵抗各种EGFR表达的癌细胞。
实施例15
双功能胶原蛋白支架抗体分子的制备
产生双功能胶原蛋白支架抗体分子，h4D5CSA-Luc，如图19A所示。藉由层析纯化包含分泌的h4D5CSA-Luc的培养基。h4D5CSA-Luc分子被配装成三聚体结构，且其可更进一步被聚合成六聚体，推测其藉由于两个三聚体中的C端半胱氨酸的间的链内二硫键交联(图19B)。执行生物荧光ELISA以证明h4D5CSA-Luc保持HER2/neu结合和生物荧光活性两者。如图19C所示，纯化的h4D5CSA-Luc留存于以HER2/neu涂布的孔中，HER2/neu过量表达人类卵巢SKOV-3癌细胞在浓度依据方法中保持活性以催化荧光素(coelenterazine)和发出光线。
上述结果具有一个重要后果，如可展开自身三聚体化胶原蛋白支架以构建可与结合配偶体互相作用(每端具有结合数价至3或6)，且此相互作用可直接藉由将双功能胶原蛋白支架抗体的C端荧光酶区和生物荧光受质一起培养来检测。h4D5CSA-Luc可作为分子诊断或光学造影的试剂。
实施例16
抗TNF-α胶原蛋白支架抗体的制备
将源自于杂交瘤357-101-4细胞株(ECACC No.92030603)的scFv，具有前中和活性的小鼠抗人类TNF-αmAb用于构建胶原蛋白支架抗体分子，357scFv-Col。纯化的357_scFv-Col具有和于scFv-Col观察到的相似结构特征(图20)。比较357_scFv-Col和357IgG中和L929细胞的TNF-α诱发细胞凋亡(apoptosis)的程度。如图20所示，357_scFv-Col具有的中和性约强于二价357IgG4倍。
虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明，任何本领域的技术人员在不脱离本发明的精神和范围内，可对本发明进行些许的更动和润饰，因此本发明的保护范围当视所附权利要求书所界定者为准。
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序列表
<110>财团法人工业技术研究院
<120>三聚体可溶抗体与其产生及使用的方法
<160>18
<210>1
<211>242
<212>蛋白质
<213>人工序列(artificial sequence)
<400>1
<210>2
<211>726
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
Figure A200810181271D00662
Figure A200810181271D00671
<210>3
<211>240
<212>蛋白质
<213>人工序列
<400>3
<210>4
<211>720
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
Figure A200810181271D00673
<210>5
<211>239
<212>蛋白质
<213>人工序列
<400>5
<210>6
<211>717
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
Figure A200810181271D00682
<210>7
<211>150
<212>蛋白质
<213>人工序列
<400>7
Figure A200810181271D00691
<210>8
<211>450
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
Figure A200810181271D00692
<210>9
<211>234
<212>蛋白质
<213>人工序列
<400>9
Figure A200810181271D00693
<210>10
<211>702
<212>DNA
<213>人工序列
<400>10
<210>11
<211>73
<212>蛋白质
<213>人工序列
<400>11
Figure A200810181271D00702
<210>12
<211>219
<212>DNA
<213>人工序列
<400>12
Figure A200810181271D00703
Figure A200810181271D00711
<210>13
<211>39
<212>蛋白质
<213>人工序列
<400>13
Figure A200810181271D00712
<210>14
<211>117
<212>DNA
<213>人工序列
<400>14
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<210>15
<211>48
<212>蛋白质
<213>人工序列
<400>15
<210>16
<211>144
<212>DNA
<213>人工序列
<400>16
Figure A200810181271D00715
<210>17
<211>66
<212>蛋白质
<213>人工序列
<400>17
Figure A200810181271D00722
<210>18
<211>198
<212>DNA
<213>人工序列
<400>18
Figure A200810181271D00723

Claims (33)

1.一种三聚体可溶抗体，至少包含三条多肽，其中各条多肽至少包括：
(a)由至少10个G-X-Y重复序列所构成的胶原蛋白支架区；
其中G为甘氨酸，X与Y为任意氨基酸，
其中至少10个G-X-Y重复序列为G-P-P或G-P-O，
其中至少6个G-X-Y重复序列为G-P-O，并且
其中P为脯氨酸而O为羟脯氨酸；以及
(b)抗体区；
其中所述三条多肽的胶原蛋白支架区互相作用而形成该三聚体可溶抗体，该三聚体可溶抗体以至少107M-1的亲合力，特异性结合至配体。
2.根据权利要求1所述的三聚体可溶抗体，其中该配体为人类上皮生长因子受体。
3.根据权利要求1所述的三聚体可溶抗体，其中该配体为人类CD3。
4.根据权利要求1所述的三聚体可溶抗体，其中该配体为人类TNF-α。
5.根据权利要求3所述的三聚体可溶抗体，其中该三聚体可溶抗体具有双重特异性，并以至少107M-1的亲合力，特异性结合至该人类CD3。
6.根据权利要求1所述的三聚体可溶抗体，其中该多肽还包括标记多肽的编码序列。
7.根据权利要求6所述的三聚体可溶抗体，其中该标记多肽为荧光酶多肽或绿色荧光多肽。
8.根据权利要求1所述的三聚体可溶抗体，其中该胶原蛋白支架区包括(G-P-P/O)10的序列。
9.根据权利要求1所述的三聚体可溶抗体，其中所有G-X-Y重复序列为G-P-P或G-P-O。
10.根据权利要求1所述的三聚体可溶抗体，其中该胶原蛋白区包括(G-P-P/O)5GKPGKP(G-P-P/O)6的序列。
11.根据权利要求1所述的三聚体可溶抗体，其中该各条多肽包括两个抗体区。
12.一种核酸，含有可产生根据权利要求1所述的三聚体可溶抗体的基因编码。
13.一种表达载体，当将其并入宿主细胞时，表达根据权利要求1所述的三聚体可溶抗体。
14.一种宿主细胞，包括根据权利要求13所述的表达载体。
15.一种产生三聚体可溶抗体的方法，包括：
(a)将含有胶原蛋白支架区基因码的第一核酸，读框融合(in-frame fusion)至含有抗体区基因码的第二核酸，其中该胶原蛋白支架区包括10-30个G-X-Y重复序列(G为甘氨酸，X与Y则为任意氨基酸)，且至少10个G-X-Y重复序列为G-P-P；以及
(b)利用细胞表达由该胶原蛋白支架区与该抗体区所构成的重组蛋白复合物，该细胞可将至少6个G-P-P中位于Y位置的P予以羟脯氨酸化；
其中，所述三条多肽上经羟脯氨酸化后的胶原蛋白支架区，彼此交互反应形成三聚体可溶抗体，该三聚体可溶抗体以至少107M-1的亲合力，特异性结合至配体。
16.根据权利要求15所述的产生三聚体可溶抗体的方法，其中该配体为人类上皮生长因子受体、人类CD3或人类TNF-α。
17.一种调节配体的生物活性的方法，包括将三聚体可溶抗体与该配体一起培养，而该三聚体可溶抗体包括三条多肽，其中各条多肽包括：
(a)胶原蛋白支架区，包括至少10个G-X-Y重复序列；
其中G为甘氨酸，X与Y为任意氨基酸，
其中至少10个G-X-Y重复序列为G-P-P或G-P-O，
其中至少6个G-X-Y重复序列为G-P-O，并且
其中P为脯氨酸，而O为羟脯氨酸；以及
(b)抗体区，
其中所述三条多肽的胶原蛋白支架区相互作用而形成三聚体可溶抗体，该三聚体可溶抗体以至少107M-1的亲合力特异性结合至配体，其中该特异性结合调节了该配体的生物活性。
18.根据权利要求17所述的调节配体的生物活性的方法，其中该配体为人类上皮生长因子受体、人类CD3或人类TNF-α。
19.一种检测配体的方法，包括：
(1)将三聚体可溶抗体与该配体一起培养，该三聚体可溶抗体包括三条多肽，其中各条多肽包括：
(a)胶原蛋白支架区，包括至少10个G-X-Y重复序列；
其中G为甘氨酸，X与Y为任意氨基酸，
其中至少10个G-X-Y重复序列为G-P-P或G-P-O，
其中至少6个G-X-Y重复序列为G-P-O，并且
其中P为脯氨酸，而O为羟脯氨酸；以及
(b)抗体区，
其中所述三条多肽的胶原蛋白支架区互相作用而形成三聚体可溶抗体，该三聚体可溶抗体以至少107M-1的亲合力特异性结合至配体；以及
(2)检测该三聚体可溶抗体对该配体的结合。
20.根据权利要求19所述的检测配体的方法，其中所述各条多肽包括荧光酶多肽或绿色荧光多肽。
21.一种三聚体可溶抗体，包括三条多肽，其中各条多肽包括：
(a)胶原蛋白支架区，包括至少10个G-X-Y重复序列；
其中G为甘氨酸，X与Y为任何氨基酸，
其中至少6个位于Y位置的氨基酸为羟脯氨酸；以及
(b)抗体区，
其中所述三条多肽的胶原蛋白支架区互相作用而形成三聚体可溶抗体，该三聚体可溶抗体以至少107M-1的亲合力特异性结合至配体。
22.根据权利要求21所述的三聚体可溶抗体，其中该配体为人类上皮生长因子受体。
23.根据权利要求21所述的三聚体可溶抗体，其中该配体为人类CD3。
24.根据权利要求21所述的三聚体可溶抗体，其中该配体为人类TNF-α。
25.根据权利要求21所述的三聚体可溶抗体，其中该多肽还包括标记蛋白的序列。
26.根据权利要求25所述的三聚体可溶抗体，其中该标记蛋白为荧光酶多肽或绿色荧光多肽。
27.根据权利要求25所述的三聚体可溶抗体，其中该三聚体可溶抗体包括SEQ ID NO：7。
28.一种三聚体可溶抗体，包括三条多肽，其中各条多肽包括：
(a)胶原蛋白支架区，包括至少6个G-P-O重复序列；
其中G为甘氨酸，P为脯氨酸，而O为羟脯氨酸；以及
(b)抗体区，
其中所述三条多肽的胶原蛋白支架区互相作用而形成三聚体可溶抗体，该三聚体可溶抗体以至少107M-1的亲合力特异性结合至配体。
29.根据权利要求28所述的三聚体可溶抗体，其中该配体为人类上皮生长因子受体。
30.根据权利要求28所述的三聚体可溶抗体，其中该配体为人类CD3。
31.根据权利要求28所述的三聚体可溶抗体，其中该配体为人类TNF-α。
32.根据权利要求28所述的三聚体可溶抗体，其中该多肽还包括标记蛋白的序列。
33.根据权利要求32所述的三聚体可溶抗体，其中该标记蛋白为荧光酶多肽或绿色荧光多肽。
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