CN101311193A

CN101311193A - 以重组的三股螺旋支架为基础的复合物

Info

Publication number: CN101311193A
Application number: CNA2007101041598A
Authority: CN
Inventors: 周民元; 范佳玉; 黄娟娟; 李秀娟
Original assignee: Industrial Technology Research Institute ITRI
Current assignee: Industrial Technology Research Institute ITRI
Priority date: 2007-05-21
Filing date: 2007-05-21
Publication date: 2008-11-26

Abstract

本发明披露了一种蛋白质复合物，其包括形成三股螺旋卷曲的融合多肽链，每条链具有支架区和异源性区。本发明也披露了相关的分离的融合多肽、核酸、载体、宿主细胞及制备方法。

Description

以重组的三股螺旋支架为基础的复合物

技术领域

本发明涉及具有支架(scaffold)的蛋白质复合物(protein complex)，且特别涉及具有三股螺旋(triple-helix)支架的蛋白质复合物，其可用于抗肿瘤、感染性疾病与免疫调节(immunomodulatory)的用途。

背景技术

基于蛋白质的结合试剂在治疗或诊断应用上具有多种用途。抗体就是个极佳的范例，许多单克隆抗体(mAbs)(以下简称mAbs)已经成功地用于治疗癌症、感染性疾病和炎性疾病(inflammatory diseases)(Adams et al.，Nat.Biotechnol.2005 Sep；23(9)：1147-57.)。

通过重组DNA技术，包括嵌合化(chimerization)和人源化(humanization)，增强了鼠科动物mAbs的功效与安全性。然而使用CDR(互补决定区，以下简称CDR)移植来进行鼠科动物mAbs人源化时，通常使其结合亲和力低于鼠科动物的对应物(counterpart)。抗体的亲和力是抗体作为治疗剂成功与否的关键因素。具有高亲和力的抗体可使抗体与天然的配体对靶向受体有效地竞争以减少剂量、毒性与花费。亲和力也影响抗体的药物动力学，例如在靶向组织与宿主循环之内的分布与分泌。在体内有效的单克隆抗体的必要条件是对靶向抗原具有强的亲和力且对非相关蛋白质没有非特异性的结合。抗原结合位点的多聚化(multimerization)已被证实是增加抗体与抗原结合的整体强度的有效方式，其中抗体与抗原结合的整体强度被定义为抗体亲和力(antibody avidity)(功能性亲和力(functional affinity))(Miller et al.，JImmunol 170：4854-4861，2003；Rheinnecker et al.，J Immunol 157：2989-2997，1996；Shopes，J Immunol 148：2918-2922，1992；Shuford et al.，Science252：724-727，1991；Wolff et al.，J Immunol 148：2469-2474，1992)。在体内它们具有增强的抗肿瘤活性(Liu et al.，Int Immunopharmacol 6：791-799，2006；Wolff et al.，Cancer Res 53：2560-2565，1993)。由于免疫球蛋白G(IgG)(以下简称IgG)分子结构的二价性质，常用的和经过改造的IgG不能用来结合同时结合两个以上的不同抗原。因此需要多价或多特异性(multi-specific)的蛋白质结合试剂。

在一些实例中，为了减少促有丝分裂副作用(mitogenicity side-effect)，需要通过改造Fc区来避免效应功能(effector function)，例如依赖于抗体的细胞介导的细胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)以及依赖于补体的细胞毒性(complement dependent cytotoxicity，CDC)。例如，鼠科动物抗-人类CD3单克隆抗体(正纯种系(Orthoclone)OKT3，莫罗莫那-CD3(Muromonab-CD3))作为以人类T细胞上的T-细胞受体/CD3复合物为靶标的强有力免疫抑制试剂。它用来预防或治疗同种异体移植排斥(allograftrejection)已有二十年的时间(Cosimi et al.，N Engl J Med 305：308-314，1981；Group，N Engl J Med 313：337-342，1985；Kung et al.，Science 206：347-349，1979)。然而进行这种治疗的一个主要缺点是细胞因子，例如TNF-α、IL-2和IFN-γ的全身释放，其导致一系列有害的促有丝分裂作用(mitogeniceffects)，包括感冒样症状(flu-like symptoms)、呼吸窘迫(respiratory distress)、神经症状(neurological symptoms)和急性肾小管坏死(acute tubularnecrosis)(Abramowicz et al.，Transplantation 47：606-608，1989；Chatenoud et al.，N Engl J Med 320：1420-1421，1989；Goldman et al.，Transplantation 50：158-159，1990；Toussaint et al.，Transplantation 48：524-526，1989)。因为OKT3和其它抗-CD3mAbs的促有丝分裂作用依赖于与带有Fc受体的细胞(FcR-positivecell)(例如单核细胞)结合从而发生广泛的TCR/CD3交联(cross-linking)，因此最近有许多研究都希望通过改变与FcR的结合，来开发抗-CD3抗体的非促有丝分裂作用形式(nonmitogenic forms)。由以上说明可知，目前亟需一种具有高亲和力、低促有丝分裂作用和体内高稳定性的蛋白质结合试剂。

发明内容

本发明提供了具有高亲和力、低有丝分裂作用和体内高稳定性的以蛋白质复合物为基础的结合试剂(protein complex-based binding reagent)。本发明试剂也可为多价的(multi-valenyt)或多特异性的(multi-specific)。

在一方面，本发明涉及分离的重组蛋白质复合物，其包含第一融合多肽链，包含第一支架区和一该第一支架区一端框内(in-frame)融合的第一异源性(heterologous)区、第二融合多肽链，包含第二支架区，以及第三融合多肽链，包含第三支架区。上述第一、第二与第三支架区互相比对(align)以形成三股螺旋卷曲。而且上述第一支架区域与第一异源性区框内融合且在相同的多肽链上。

上述异源性区可包含酶促结构域或荧光蛋白质的序列。荧光蛋白质的例子包括GFP和dsRed及其变体(variant)。酶促结构域的例子包括谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase)、萤光素酶(luciferase)、β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)与β-内酰胺酶(β-lactamase)。

上述异源性区可包括与结合配偶体(binding partner)结合的结合区(例如，配体(ligand)结合区、配体、受体、亲和标记物或蛋白聚糖)。“结合配偶体”意指对于感兴趣的靶向化合物的一部分(例如，蛋白质)具有特异性的、共价或非共价的亲和性的任何分子。结合配偶体的例子包括抗原/抗体配对物、蛋白质/抑制物配对物、受体/配体配对物(例如，细胞表面或细胞核受体/配体配对物)、酶/底物配对物(例如，激酶(kinase)/底物配对物)、凝集素(lectin)/碳水化合物(carbohydrate)配对物、寡聚的(oligomeric)或异源寡聚的(heterooligomeric)蛋白质配对物、DNA结合蛋白/DNA结合位点的配对物和RNA/蛋白质配对物。结合区的例子也包括亲和标记物的序列，例如，组氨酸-标记物(histidine-tag)、myc标记物(myc tag)或血凝素标记物(hemagglutintag)。

上述第一异源性区可包含免疫球蛋白的一个或多个CDR。因此异源性区可包含抗体的抗原结合部分，例如V_H区和Fab。在实施例中第一异源性区包含抗原结合片段或单链抗体的序列，例如对簇命名3(Cluster Designation3，CD3)(以下简称CD3)或表皮生长因子受体(Epidermal Growth FactorReceptor，EGFR)(以下简称EGFR)特异的序列。上述第一多肽链还可包含与上述第一支架区另一端框内融合的第二异源性区。如上述第一支架区，第二异源性区也可包含与结合配偶体结合的结合区。第一和第二异源性区可彼此相同或不同。它们可与相同的结合配偶体或两个不同的结合配偶体结合。例如，第一异源性区和第二异源性区可分别包含第一单链抗体和第二单链抗体的序列，上述两抗体分别与CD3与EGFR特异性结合。

在上述蛋白质复合物中，第二融合多肽链可以包含与上述第二支架区一端框内融合的第三异源性区、框内融合至第二支架区另一端的第四异源性区或框内融合至该两端的两个区。同样地，前述第三融合多肽链可包含框内融合至第三支架区一端的第五异源性区或框内融合至第三支架区另一端的第六异源性区或两者皆有。如同上述第一和第二异源性区，其它四个异源性区中的每一个均可包含与结合配偶体结合的结合区。全部六个异源性区可彼此相同或不同。因此它们可与1、2、3、4、5或6个结合配偶体结合。换句话说，此蛋白质复合物可以是一、二、三、四、五或六价。

为了让第一、第二与第三支架区形成三股螺旋卷曲，三个支架区的每一个均包含一个或多个三股螺旋重复序列，每个重复序列包含下列式子的序列：(X1-X2-X3)n，其中X1是甘氨酸(Gly)残基，X2或X3是任何氨基酸残基，优选为亚氨基酸脯氨酸或羟脯氨酸(hydroxproline)；以及n大于或等于5。例如，第一、第二或第三支架区可包含(GPP)₁₀或人类补体Clq、胶原凝集素(collectin)或胶原蛋白多肽链的一个或多个三股螺旋重复序列。

在实施例中，前述第一、第二与第三融合多肽基本上相同，彼此具有至少75％(例如在75％与100％之间任何数量，包括75％与100％)的序列同一性。通过三个相同的融合多肽形成的复合物为同源三聚体(homotrimer)。上述三个融合多肽可以是“功能等同物(functional equivalent)”。“功能等同物”意指常见多肽的多肽衍生物，例如，具有一个或多个点突变、插入(insertion)、缺失(deletion)、截短(truncation)的蛋白质、其融合蛋白或上述的组合，并且其基本上保持形成三股螺旋的能力以及异源性区的活性，例如与配体结合。

异源性多肽、核酸或基因可源自不同物种，或者即使它们来自相同物种，它们也从在最初的形式上经过基本的修饰。两个融合区或序列彼此是异源的，即使在天然存在的蛋白质或核酸中它们也并不相互连接。例如并非是天然存在的人类迷你胶原蛋白(minicollagen)(第XXI型)、胶原凝集素家族蛋白或补体lq(Clq)一部分的多肽序列对于人类蛋白质的区而言是异源的。

本发明的另一特色是分离的重组融合多肽，其包括(i)用来形成三股螺旋卷曲的支架区和(ii)框内融合至上述支架区一端的第一异源性区或框内融合至上述支架区另一端的第二异源性区。所述支架区可以包含一个或多个前述三股螺旋重复序列，例如人类Clq或胶原蛋白多肽链的重复序列。异源性区可包含上述结合区之一并且可以通过许多本技术领域已知方法例如噬菌体展示筛选(phage display screening)来获得。

分离的多肽或蛋白质复合物意指基本上无自然相关的分子，即由干重计算具有至少75％(即在75％与100％之间的任何数量，包括75％与100％)的纯度的多肽或蛋白质复合物。纯度可用任何适当的标准方法，例如通过柱层析(column chromatography)、聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gelelectrophoresis)或高效液相层析(high performance liquid chromatography，HPLC)分析来测量。本发明的分离多肽或蛋白质复合物可由自然来源分离或用重组DNA技术制造。

本发明也涉及分离的核酸，此分离的核酸包含编码上文所述融合多肽的序列或此序列的互补序列。核酸指DNA分子(例如cDNA或基因组DNA)、RNA分子(例如mRNA)、或DNA或RNA的类似物。DNA或RNA的类似物可由核苷酸类似物合成。此核酸分子可以是单链或双链，但优选双链DNA。

“分离的核酸”是结构不与任何天然存在的核酸或任何天然存在的基因组核酸片段相同的核酸。因此该用语包含，例如(a)DNA，其具有天然存在的基因组DNA分子的一部分序列，但不与在生物体的基因组中天然存在于其两侧的编码序列邻接；(b)核酸，其以某种方式被引入载体(vector)或原核细胞或真核细胞的基因组中，由此所形成的分子不与任何天然存在的载体或基因组DNA相同；(c)分离的分子，例如cDNA、基因组片段、通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)所产生的片段或限制性片段(restriction fragment)；和(d)重组核苷酸序列，其为杂合基因(即编码融合蛋白质的基因)的一部分。上述核酸可用来表达本发明多肽。为此目的，可将上述核酸连接至适合的调控序列以产生表达载体。

载体是指核酸分子，其具有将另一核酸转移到其连接处的能力。载体具有自主性复制(autonomous replication)或整合入宿主DNA的能力。载体的例子包括质粒(plasimd)、噬菌粒(cosmid)或病毒载体。本发明载体包含核酸，其为适合于在宿主细胞内表达该核酸的形式。优选所述载体包含与待表达的核酸序列可操作连接的一个或多个调控序列，其。“调控序列”包括启动子(promoter)、增强子(enhancer)和其它表达控制元件(例如多腺苷酸化信号(polyadenylation signal))。调控序列包括那些指导核苷酸序列的组成型表达和组织特异性调控和/或可诱导的序列。对表达载体的设计可依据下列因素，如对被转染宿主细胞的选择、所需蛋白质表达的程度与诸如此类。可将表达载体引入宿主细胞以制造本发明多肽。包含上述核酸的宿主细胞也在本发明范围内。例子包括大肠杆菌(E.coli)细胞、昆虫细胞(例如使用果蝇(Drosophila)S2细胞或杆状病毒(baculovirus)细胞)、酵母细胞或哺乳动物细胞(例如小鼠骨髓瘤(myeloma)NS0细胞)。请参阅，例如Goeddel，(1990)Gene ExpressionTechnology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA。

为了制造本发明的融合多肽，在一定条件下在培养基中培养宿主细胞以表达本发明核酸所编码的多肽，并从被培养的细胞或该细胞的培养基中纯化上述多肽。或者，可在体外转录与翻译本发明的核酸，例如使用T7启动子调控序列和T7聚合酶。

为了制造本发明的蛋白质复合物，可一定条件下培养包含分别编码上述第一、第二与第三融合多肽的第一、第二与第三核酸的宿主细胞，以表达上述三个核酸所编码的多肽并且在所表达的多肽之间形成三股螺旋卷曲，以及从培养的细胞或该细胞的培养基中纯化上述蛋白质复合物。优选上述宿主细胞为真核细胞(eukaryotic cell)，其包含使脯氨酸残基羟基化(hydroxylate)的酶活性。

为了让本发明上述和其它的目的、特征、和优点能更明显易懂，下文特举优选实施例，并配合所附图示，作详细说明如下：

附图简述

图1显示蛋白质复合物，其具有来自人类XXI型胶原蛋白的迷你胶原蛋白三股螺旋卷曲支架。三股螺旋卷曲的六个末端分别框内融合至六个具有单链抗体(scFv)的V_L与V_H区的Fv片段区。

图2A显示具有三股螺旋卷曲支架的蛋白质复合物，其三个N末端分别与三个单链抗体：OKT3(抗-CD3)、528(抗-EGFR)和erb_scFv(抗-EGFR)框内融合，而第2B图显示该蛋白质复合物的Western印迹的照片。将稳定转染的果蝇S2细胞的培养基在非还原状态下进行SDS-PAGE电泳，之后以抗XXI型胶原蛋白(3E2)C末端的单克隆抗体作免疫印迹。T：键间双硫键三体；Mt：包含键间双硫键三体的单体。

图3显示具有三股螺旋卷曲支架的蛋白质复合物。上述三股螺旋卷曲支架的三个N末端与三个OKT3单链抗体框内融合；三个C末端与三个528单链抗体框内融合。

图4A和4B显示不同形式抗体的示意图：图4A显示胶原蛋白支架抗体：scFv-Col(左图)，其包含氨基末端scFv、人类IgG铰链(hinge)区、胶原蛋白区(GPP)₁₀和XXI型胶原蛋白羧基末端NC1区；NSPD-scFv(右图)，其包含表面活性蛋白D(surfactant protein D，SPD)、在羧基末端的胶原凝集素和scFv。图4B由左到右分别显示免疫球蛋白G(IgG)、嵌合的(scFv-Fc)和单链抗体(scFv)，以及它们各自的大致分子量。灰色区显示V_H与V_L片段；虚线：链间双硫键。

主要组件符号说明

101～迷你胶原蛋白

401～铰链区

403～(GPP)10的胶原蛋白区

405～胶原蛋白XXI型的NC1区或其它靶向的结合区

407～胶原凝集素的N端区

409～胶原凝集素的胶原蛋白样(collagen-like)区

411～胶原凝集素的α螺旋颈部区域

实施方式

本发明是因(至少一部分)意外发现与人类三股螺旋卷曲支架区域框内融合的异源性蛋白质结合区域保留了结合活性，并且所得的的融合多肽形成了三股螺旋卷曲。图1显示了本发明蛋白质复合物的例子。如该图所示，三股螺旋卷曲蛋白质复合物的六个末端分别与六个异源性蛋白质的结合区，即单链抗体(scFv)的Fv片段框内融合。

本发明的蛋白质复合物较常用抗体有许多优点。一方面而言，当上述六个区的两个或多个彼此相同时，蛋白质复合物可具有2-6个对结合配偶体(例如抗原)特异的结合区，而常用抗体只具有两个这种区。换句话说，不像常用抗体对于抗原只有二价，此蛋白质复合物可以是二、三、四、五或六价的。因而，可将其制造为具有各种比常用抗体高的亲和力。因为较高的亲和力，所以比起常用抗体而言，它比常用抗体需要较少量的蛋白质复合物及较短的反应时间来达到期望的目标，例如疗效(therapeutic effects)，由此降低治疗成本并减少副作用(例如，非期望的免疫反应)。在另一方面，当上述六个区的两个或多个互相不同时，本发明的蛋白质复合物可以具有2-6个对2-6个不同结合配偶体特异的结合区。将不同特异性的结合配偶体组合成为一个单元，具有将多种结合配偶体集合在一起的能力，因此用在治疗、组织重构(tissue reconstruction)和在纳米水平的活性蛋白质结构(active proteinmachinery)(例如多亚基酶)的装配上具有令人满意的应用。

为了在人体内使用，本发明的蛋白质复合物优选为人源(human origin)的。例如，其可包含人源化单链抗体序列，该序列与人源的螺旋卷曲支架的，如人类Clq、胶原凝集素家族蛋白质或胶原蛋白多肽链的螺旋卷曲支架框内融合。因为人类Clq与胶原蛋白两者在血液中都非常稳定，所以此蛋白质复合物比起一般治疗型鼠源抗体而言更加稳定。

胶原蛋白是在哺乳类动物中存在的最大量的蛋白质，其为包含重复的三联体的序列甘氨酸(Gly)-X1-X2的细胞外基质蛋白(extracellular matrixprotein)，这种三联体的出现允许三条胶原蛋白多肽链(α-链)折叠成三股螺旋构象。在三联体的序列甘氨酸-X1-X2中，X2位置的氨基酸常为脯氨酸，为了稳定胶原蛋白的三股螺旋结构，常通过胶原蛋白多肽链的翻译后修饰将脯氨酸4-羟基化(hydroxylated)。缺少脯氨酸羟基化，胶原蛋白的必需的三股螺旋构象在低于生理温度(physiological temperature)时是热不稳定的(thermallyunstable)(Berg and Prockop，Biochem Biophys Res Commun 52：115-120，1973；Rosenbloom et al.，Arch Biochem Biophys 158：478-484，1973)。许多具有胶原蛋白三股螺旋区(collagenous domain)的胶原蛋白样蛋白质出现于人类血清中，在防护传染性生物上扮演先天性免疫系统(innate immune system)的角色。这些包括补体蛋白质Clq、胶原凝集素家族蛋白质-甘露糖结合凝集素(mannose binding lectin，MBL)、表面活性蛋白(surfactant protein)A和D(SP-A和SP-D)。而这些胶原蛋白样蛋白质共同的结构特征为由胶原蛋白区的三股螺旋集合构成的多聚化(multimeric)蛋白质亚基(unit)，且三聚体分子互相堆集或链间形成二硫键交联。因此，这些“防御胶原蛋白”分子的结合区的功能性亲和力通过多聚化(multimerization)而大幅度增加。

本发明的蛋白质复合物或多肽可以通过重组技术获得。可将编码此复合物的多肽的核酸引入合适的宿主细胞中，并且在一定条件下表达由前述核酸编码的多肽，以允许表达该多肽以及在多肽间形成三股螺旋卷曲。为了促进三股螺旋卷曲支架的形成，可在宿主细胞中共表达(co-express)脯氨酰4-羟化酶(prolyl 4-hydroxylase，P4HA)，其为在胶原蛋白的生物合成中的关键酶。

异源蛋白质的结构域可包含抗体或其片段(例如其抗原结合片段)。在此处所使用“抗体”意指免疫球蛋白分子或其免疫活性部分，即抗原结合部分。其指包括最少一个优选两个重(heavy，H)链可变区(V_H)，以及至少一个优选两个轻(light，L)链可变区(V_L)的蛋白质。可将V_H和V_L区更进一步细分为超变区和较保守的散布区，前者称为“互补决定区(complementarity determiningregion)”“(CDR)”区，后者称为框架区(framework region)。已经明确定义互补决定区和框架区的范围(参阅Kabat et al.(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest，Fifth Edition，U.S.Department of Health and HumanServices，NIH Publication No.91-3242，and Chothia et al.(1987)J.Mol.Biol.196：901-917)。每个V_H和V_L由三个CDR和四个FR组成，从氨基末端到羧基末端的排列顺序为：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。

抗体还可包含重链和轻链的恒定区(constant region)，由此分别形成重链和轻链的免疫球蛋白链。重链恒定区包含三个结构域CH1、CH2和CH3。轻链恒定区包含结构域CL。重链和轻链的可变区包含与抗原反应的结合区。抗体的恒定区通常介导抗体与宿主组织或因子，包括免疫系统的多种细胞(例如效应细胞(effector cell))和经典补体系统的第一种组分Clq的结合。

此处使用的“免疫球蛋白”指由一个或多个多肽组成、基本上由免疫球蛋白基因编码的蛋白质。已知的人类免疫球蛋白基因包括κ、λ、α(IgA1和IgA2)、γ(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)、δ和μ的恒定区基因和无数的免疫球蛋白可变区基因。全长免疫球蛋白的“轻链”(约25KDa或214个氨基酸)由在NH₂末端的可变区基因(约110个氨基酸)和在COOH末端的κ或λ恒定区基因来编码。而全长免疫球蛋白的“重链”(约50KDa或446个氨基酸)相似地由可变区基因(约116个氨基酸)，及其它上述恒定区基因，例如γ(编码约330个氨基酸)来编码。

抗体的“抗原结合片段”(或“抗体部分”或“片段”)指全长抗体的一个或多个片段，其保留特异性结合至抗原(例如EGFR或CD3多肽或其片段)的能力。抗体的抗原结合片段包括，但不限于：(i)Fab片段，由V_L、V_H、C_L和C_H1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)₂片段，包含由二硫键在其铰链区(hingeregion)连结两个Fab片段的二价片段；(iii)由V_H和C_H1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂(single arm)的V_L和V_H结构域组成的Fv片段；(v)dAb片段(Ward et al.，(1989)Nature 341：544-546)，其包含V_H结构域；(vi)分离的互补决定区(CDR)以及(vii)V_L或V_H结构域。更进一步，虽然Fv片段的两个结构域V_L和V_H是由各自的基因编码的，但使用重组方法可将它们连接，通过人工接头可将它们制备成单链蛋白质，其中V_L与V_H区配对形成单价分子(称为单链Fv(scFv)，参阅，例如Bird et al.(1988)Science 242：423-426；and Hustonet al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)。此种单链抗体也包括在抗体的“抗原结合片段”范围内。这些抗体片段可用本技术领域常见的技术获得，并以与对完整抗体相同的方式来筛选应用。

适当的抗体可以是单克隆抗体。在其它实施例中，抗体可以重组制备，例如由噬菌体展示或组合方法(combinatorial method)来制备。产生抗体的噬菌体展示和组合方法是本技术领域已知的(参阅，例如Ladner et al.U.S.Patent No.5,223,409；Kang et al.International Publication No.WO 92/18619；Dower et al.International Publication No.WO 91/17271；Winter et al.International Publication WO 92/20791；Markland et al.International PublicationNo.WO 92/15679；Breitling et al.International Publication WO 93/01288；McCafferty et al.International Publication No.WO 92/01047；Garrard et al.International Publication No.WO 92/09690；Ladner et al.InternationalPublication No.WO 90/02809；Fuchs et al.(1991)Bio/Technology 9：1370-1372；Hay et al.(1992)Hum Antibod Hybridomas 3：81-85；Huse et al.(1989)Science246：1275-1281；Griffths et al.(1993)EMBO J 12：725-734；Hawkins et al.(1992)J Mol Biol 226：889-896；Clackson et al.(1991)Nature 352：624-628；Gram et al.(1992)PNAS 89：3576-3580；Garrad et al.(1991)Bio/Technology 9：1373-1377；Hoogenboom et al.(1991)Nuc Acid Res 19：4133-4137；和Barbas et al.(1991)PNAS 88：7978-7982)。

在一个实施例中，抗体是完全人类抗体(例如，在小鼠中制造的抗体，此小鼠经基因工程改造来制造源自人类免疫球蛋白序列的抗体)或非人类抗体，例如啮齿类动物(小鼠或大鼠)、山羊、灵长类动物(例如猴子)、骆驼(cameloid)的抗体。非人类抗体优选为啮齿类动物(小鼠或大鼠)的抗体。制造啮齿类动物抗体的方法已为本技术领域公知。

可以通过使用携带人类免疫球蛋白基因的转基因小鼠来制造人类单克隆抗体，而不是使用小鼠的系统。使用感兴趣的抗原免疫的这些转基因小鼠的脾细胞(splenocytes)被用来制造杂交瘤(hybridoma)，其分泌对人类蛋白质的表位(epitope)具有特异性亲和力的人类mAbs(参阅，例如Wood et al.International Application WO 91/00906，Kucherlapati et al.PCT publication WO91/10741；Lonberg et al.International Application WO 92/03918；Kay et al.International Application 92/03917；Lonberg，N.et al.1994 Nature 368：856-859；Green，L.L.et al.1994 Nature Genet.7：13-21；Morrison et al.1994 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855；Bruggeman et al.1993Year Immunol 7：33-40；Tuaillon et al.1993 PNAS 90：3720-3724；Bruggeman et al.1991 Eur J Immunol21：1323-1326)。

抗体的变异区或其一部分，例如CDR，可在非人类生物(例如，大鼠或小鼠)中产生。可使用嵌合的、CDR移植的和人源化的抗体。在本发明中包括在非人类生物(例如，大鼠或小鼠)中产生并经过修饰(例如在可变框架(variable framework)或恒定区)以降低在人类的抗原性(antigenicity)的抗体。

可用本发明技术领域公知的重组DNA技术来制造嵌合抗体(chimericantibody)。例如用限制性酶消化编码鼠(或其它物种)的单克隆抗体分子的Fc恒定区基因，将编码鼠Fc的区域移除，然后取代为编码人类Fc恒定区的基因的等同部分(见，Robinson et al.，International Patent PublicationPCT/US86/02269；Akira，et al.，European Patent Application 184，187；Taniguchi，M.，European Patent Application 171，496；Morrison et al.，European PatentApplication 173，494；Neuberger et al.，International Application WO 86/01533；Cabilly et al.U.S.Patent No.4,816,567；Cabilly et al.，European PatentApplication 125，023；Better et al.(1988 Science 240：1041-1043)；Liu et al.(1987)PNAS 84：3439-3443；Liu et al.，1987，J.Immunol.139：3521-3526；Sun et al.(1987)PNAS 84：214-218；Nishimura et al.，1987，Canc.Res.47：999-1005；Wood et al.et al(1985)Nature 314：446-449；and Shaw et al.，1988，J.NatlCancer Inst.80：1553-1559)。

人源化或CDR移植的抗体中(免疫球蛋白的重或轻链的)至少一个或两个但一般为全部三个接受者(recipient)CDR被供者CDR取代。抗体可被非人类CDR的至少一部分取代或只有CDR中的一些被非人类的CDR取代。只需取代结合人源化抗体或人源化抗体片段所需数量的CDR。优选的供者为啮齿类动物抗体，例如大鼠或小鼠的抗体，以及接受者为人类框架(framework)或人类共有框架(consensus framework)。一般而言，提供CDR的免疫球蛋白称为“供者”以及提供框架的免疫球蛋白称为“接受者(acceptor)”。在一个实施例中，供者免疫球蛋白是非人类(例如大鼠)的。接受者框架是天然存在(例如人类)或共有的框架，或有约85％或更高，优选90％、95％、99％或更高同一性的序列。此处所使用的“共有序列(consensus sequence)”指在相关序列的家族中最常出现的氨基酸(或核苷酸)所形成的序列(参阅，例如Winnaker，From Genes to Clones(Verlagsgesellschaft，Weinheim，Germany 1987)。在蛋白质家族中，在共有序列中的每个位置被此家族在那个位置最常出现的氨基酸所占据。若两个氨基酸出现的频率相同，两者中的任一个都可包含在共有序列中。“共有框架”指在共有免疫球蛋白序列中的框架区。

可通过本技术领域已知的方法将抗体进行人源化。通过取代不直接参与抗原结合的Fv可变区序列为来自人类Fv可变区的等同序列，可产生人源化抗体。用于产生人源化抗体的常用方法由Morrison，S.L.，1985，Science229：1202-1207、Oi et al.，1986，BioTechniques 4：214、Queen et al.US5,585,089、US 5,693,761和US 5,693,762提供，其内容引入本文作为参考。那些方法包括分离、操纵和表达核酸序列，其中所述核酸序列编码来自至少一条重链或轻链之一的免疫球蛋白Fv可变区的全部或一部分。此种核酸的来源在本技术领域中是众所周知的，以及例如可从杂交瘤中获得，其中此杂交瘤产生抗感兴趣的多肽或其片段的抗体。可克隆(clone)重组DNA至适当的表达载体，其中此重组DNA编码人源化抗体或其片段。

也可将人源化抗体融合至支架，在人源化抗体中，特定的氨基酸已被取代、缺失或增加。优选的人源化抗体在框架区中具有氨基酸取代，如为了改善与抗原的结合。例如人源化抗体具有框架残基，其与供者的框架残基或除了接受者的框架残基之外的其它氨基酸相同。为了产生此种抗体，人源化免疫球蛋白链的经过选择的少量受者框架残基可用对应的供者氨基酸取代。优选的取代位置包括邻接于CDR或能与CDR相互作用的氨基酸残基。从供者选择氨基酸的标准描述于US 5,585,089中，其内容引入本文作为参考。将抗体人源化的其它技术描述在Padlan et al.EP 519596 A1中。

本发明也包括核酸，其编码形成本发明的蛋白质复合物的融合多肽。可从噬菌体展示文库筛选出或从表达上述适合的抗体或抗体衍生物的细胞株中分离(例如RT-PCR)核酸。可将核酸与表达载体功能性连接。可使用经核酸或载体转化(transformed)的细胞来制备本发明的融合多肽或蛋白质复合物。用以制备抗体的有用的细胞包括昆虫细胞和哺乳动物细胞(例如，CHO或淋巴细胞(lymphatic cell))。

可将本发明的蛋白质复合物和有疗效的部分(therapeutic moiety)结合，所述有疗效的部分例如细胞毒素(cytotoxin)、治疗剂(therapeutic agent)或放射性离子(radioactive ion)。细胞毒素或细胞毒剂(cytotoxic agent)包括任何对细胞有害的试剂，例子包括紫杉醇(taxol)、细胞松弛素B(cytochalasin B)、短杆菌素D(gramicidin D)、溴化乙锭(ethidium bromide)、依米丁(emetine)、丝裂霉素(mitomycin)、鬼臼乙叉甙(etoposide)、鬼臼噻吩甙(tenoposide)、长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、秋水仙碱(colchicin)、阿霉素(doxorubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、二羟基蒽二酮(dihydroxy anthracindione)、盐酸米托蒽醌(mitoxantrone)、光神霉素(mithramycin)、放线菌素D(actinomycin D)、1-脱氢睾酮(1-dehydrotestosterone)、糖皮质素(glucocorticoids)、普鲁卡因(procaine)、丁卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛尔(propranolol)、嘌呤霉素(puromycin)、美登素(maytansinoids)，例如，美登醇(maytansinol)(见，US Patent No.5,208,020)、CC-1065(见US Patent Nos.5,475,092，5,585,499，5,846,545)与其类似物或同源物。治疗试剂包括但不限于，抗代谢剂(antimetabolites)(例如，氨甲蝶呤(methotrexate)、6-巯基嘌呤(6-mercaptopurine)、6-硫鸟嘌呤核苷(6-thioguanine)、阿糖胞苷(cytarabine)、5-氟尿嘧啶氨烯咪胺(5-fluorouracildecarbazine))、烷化剂(alkylating agents)(例如，氮芥(mechlorethamine)、硫喷妥苯丁酸氮芥(thioepa chlorambucil)、CC-1065、美法仑(melphalan)、卡莫司汀(carmustine，BSNU)与洛莫司汀(lomustine，CCNU)、cyclothosphamide、白消安(busulfan)、二溴甘露醇(dibromomannitol)、链脲菌素(streptozotocin)、丝裂霉素C(mitomycin C)与顺-二氯二氨铂(cis-dichlorodiamine platinum(II)(DDP)顺铂(cisplatin)))、蒽环类(anthracyclines)(例如，柔红霉素(daunorubicin)(之前称为道诺霉素(daunomycin)))、抗生素(例如，更生霉素(dactinomycin)(之前称为放线菌素)、博来霉素(bleomycin)、光神霉素与氨茴霉素(anthramycin，AMC))以及抗有丝分裂剂(anti-mitotic agents)(例如，长春新碱)、长春碱、紫杉醇与美登素。放射性离子包括但不限于碘(iodine)、钇(yttrium)与镨(praseodymium)。

可利用缀合物(conjugate)来修饰已知的生物反应，药物部分(drug moiety)不应限于常用的化疗试剂。例如，药物部分可以是具有所需生物活性的蛋白质或多肽。这种蛋白质可包括，例如毒素，如相思豆毒素(abrin)、蓖麻蛋白A(ricin A)、假单胞菌外毒素(pseudomonas exotoxin)或白喉毒素(diphtheriatoxin)；蛋白质，例如肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor)、α-干扰素(α-interferon)、β-干扰素(β-interferon)、神经生长因子(nerve growth factor)、血小板衍生的生长因子(platelet derived growth factor)、组织纤溶酶原激活物(tissue plasminogen activator)；或生物应答调节剂(biological responsemodifier)，例如，淋巴因子(lymphokines)、白细胞介素-1(interleukin-1，“IL-1”)、白细胞介素-2(interleukin-2，“IL-2”)、白细胞介素-6(interleukin-6，“IL-6”)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colony stimulatingfactor，“GM-CSF”’)、粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulatingfactor，“G-CSF”)或其它生长因子。

前述蛋白质与缀合物依据其异源性结合区的特异性，可用来治疗多种紊乱(disorder)，包括癌症、炎性疾病(inflammation disease)、代谢疾病(metabolismdisease)、纤维化疾病(fibrosis disease)和心血管疾病(cardiovascular disease)。因此本发明以治疗此种紊乱为特征，例如，通过把有效量(effective amount)的本发明蛋白质复合物施用给需要的受试者。可确定被治疗的患者具有以紊乱为特征的情况或是处于此风险中。此方法可单独进行或与其它药物或治疗联合。

因为本发明蛋白质复合物具有多特异性的特点，可以用其来连接在一般情况下并不互相结合的分子或细胞。此特征特别对于基于细胞的疗法(cell-based therapy)有用。在一个实施例中，蛋白质复合物中的异源性区通过与位于细胞毒性细胞(cytotoxic cell)上的效应抗原(effector antigen)特异性结合而能够活化细胞毒性细胞(例如细胞毒性T细胞(cytotoxic T cell))，而其它异源性区则特异性结合至位于将被破坏的病原体细胞(pathogen cell)或恶性细胞(malignant cell)上的靶向抗原。用这种方式，蛋白质复合物可用来治疗因病原体或有害细胞所导致的紊乱。

经由本发明蛋白质复合物与细胞毒素性细胞上作为效应抗原的CD3抗原结合，可活化细胞毒性细胞。其它淋巴样细胞(lymphoid cell)相关的效应抗原包括人类CD16抗原、NKG2D抗原、NKp46抗原、CD2抗原、CD28抗原、CD25抗原、CD64抗原和CD89抗原。与这些效应抗原结合会活化效应细胞，例如，单核细胞(monocyte)、嗜中性粒细胞(neutrophilic granulocyte)和树突细胞(dendritic cell)。这些被活化的细胞之后会给靶向细胞施加细胞毒性或细胞凋亡作用(apoptotic effect)。

靶向抗原是独特地表达在与疾病情况相关的靶向细胞上的抗原，但是它在细胞健康的情况下不表达或表达程度低或是不可检测。这些与恶性细胞相关的靶向抗原的例子包括EpCAM、CCR5、CD19、HER-2neu、HER-3、HER-4、EGFR、PSMA、CEA、MUC-1(粘液素(mucin))、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5.sub.AC、MUC5.sub.B、MUC7、.beta.hCG、Lewis-Y、CD20、CD33、CD30、神经节糖苷CD3(ganglioside GD3)、9-O-乙酰-GD3、GM2、Globo H、岩藻糖基GM1、Poly SA、GD2、碳酸酐酶(Carboanhydrase IX(MN/CA IX))、CD44v6、Sonic Hedgehog(Shh)、Wue-1、浆细胞抗原(Plasma Cell Antigen)、膜结合(membrane-bound)IgE、黑色素瘤硫酸蛋白多糖(Melanoma ChondroitinSulfate Proteoglycan(MCSP))、CCR8、TNF-α前体、STEAP、间皮素(mesothelin)、A33抗原、前列腺生殖细胞抗原(Prostate Stem Cell Antigen(PSCA))、Ly-6；桥粒核心糖蛋白4(desmoglein 4)、E-钙粘附素新表位(E-cadherin neoepitope)、胎儿乙酰胆碱受体(Fetal Acetylcholine Receptor)、CD25、CA19-9标志(marker)、CA-125标志和第II型缪勒管抑制物质受体(Muellerian Inhibitory Substance(MIS)Receptor type II)、sTn(唾液酸化Tn抗原(sialylated Tn antigen；TAG-72))、FAP(纤维母细胞活化抗原(fibroblastactivation antigen))、内皮唾(液)酸蛋白(endosialin)、EGFRvIII、LG、SAS和CD63。

“治疗”定义为将组合物施用于患者，其目的为治愈、减轻、缓和、治疗、预防或改善紊乱、紊乱的症状、继发于紊乱的疾病状态或易患疾病的诱因(predisposition)。“有效量”为能够例如上述在被治疗的受试者产生医疗满意结果的组合物的量。

在体内途径，将有疗效的组合物(例如，包含本发明蛋白质复合物的组合物)施用于受试者。一般而言，将复合物悬浮于可药用的(pharmaceuticallyacceptable)载体(carrier)(例如生理盐水)中，将其以口服、静脉内(intravenous)输注、或皮下(subcutaneous)、肌肉内(intramuscular)、蜘蛛膜下腔(intrathecal)、腹腔内(intraperitoneal)、直肠内(intrarectal)、阴道内(intravaginal)、鼻内(intranasal)、胃内(intragastrical)、气管内(intratracheal)或肺内(intrapulmonary)注射或植入的方式施用。

所需剂量取决于所选择的施用途径；配制剂的性质；受试者疾病的性质；受试者的体型、体重、表面积、年龄和性别；所施用的其它药物和主治医师的决定。适当的剂量范围在0.01-100.0mg/kg。基于现有组合物(composition)的多样化和多种施用途径有不同功效的观点，预期剂量需求是多样性的。例如，预期口服施用比静脉内注射施用需要较高的剂量。如本发明领域公知的，可利用标准经验程序(standard empirical routines)来调整这些剂量水平的多样性达到最佳。通过将组合物包裹(encapsulate)在常用的适当载体(vehicle)(例如多聚微粒(polymeric microparticles)或植入装置(implantable devices))中，可提高传送的效率，特别是对于口服传送而言。

本发明的范围也包括药学组合物，其包含可药用的载体和有效量的本发明蛋白质复合物。可使用此药学组合物来治疗上述的紊乱。可药用的载体包括溶剂、分散介质(dispersion medium)、包衣(coating)、抗菌剂与抗真菌剂、和等渗透压剂与延迟吸收(absorption delaying)剂。可利用常用方法将所述组合物配制成用于不同施用方式的剂型(dosage form)。

可在体内和体外评价本发明组合物的功效。对于在体内的研究，可注射组合物到动物(例如，小鼠模型)，以及之后记录其治疗功效。根据这个结果，可确定适当的剂量范围和施用方式。

下面的实施例仅仅是为了举例说明的目的，绝不是为了从任何角度限制本发明的其它公开。无需更多细节，可以相信本领域技术人员能够根据本文的公开，最大程度地实施本发明。所有引用的出版物都全文引入本文作为参考。

实施例1

对M13噬菌体展示文库(phage display library)进行筛选以鉴定与EGFR特异性结合的人类单链可变片段(scFv)。鉴定一些克隆(clone)。在通过Western印迹和酶联免疫分析(Enzyme-linked immunoassay，ELISA)(以下简称ELISA)确认后，选出一个克隆erb_scFv作进一步的实验。获得编码erb_scFv的cDNA，通过标准方法将其连接到表达载体。erb_scFv的多肽序列为序列识别号：1(SEQ ID NO：1)，编码该序列的核苷酸序列为序列识别号：2(SEQ ID NO：2)。

SEQ ID NO：1

MetAlaGluValGlnLeuLeuGluSerGlyGlyGlyLeuValGlnProGlyGlySerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheSerSerTyrAlaMetSerTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpValSerAspIleGlyAlaSerGlySerAlaThrSerTyrAlaAspSerValLysGlyArgPheThrIleSerArgAspAsnSerLysAsnThrLeuTyrLeuGlnMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCysAlaLysSerThrThrThrPheAspTyrTrpGlyGlnGlyThrLeuValThrValSerSerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerThrAspIleGlnMetThrGlnSerProSerSerLeuSerAlaSerValGlyAspArgValThrIleThrCysArgAlaSerGlnSerIleSerSerTyrLeuAsnTrpTyrGlnGlnLysProGlyLysAlaProLysLeuLeuIleTyrAspAlaSerAlaLeuGlnSerGlyValProSerArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrIleSerSerLeuGlnProGluAspPheAlaThrTyrTyrCysGlnGlnTyrAlaAspTyrProThrThrPheGlyGlnGlyThrLysValGluIleLysArg

SEQ ID NO：2

ATGGCCGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGATATTGGTGCTTCTGGTTCTGCTACATCTTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAATCTACTACTACTTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGGTCGACGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGATGCATCCGCTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGTATGCTGATTATCCTACTACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGG

之后将表达载体在昆虫细胞系果蝇S2(Drosophila S2)中表达。纯化抗-EGFR的erb_scFv并进行Western印迹分析和ELISA，来确认其抗EGFR的特异性。

进行RT-PCR来从杂交瘤细胞系中获得cDNA，所述cDNA编码抗-CD3单克隆抗体OKT3的重链可变区(V_H)和轻链可变区(V_L)。之后，将两个cDNA连接以产生编码OKT3的V_H-V_L融合蛋白质的融合序列。此融合蛋白质的序列为序列识别号：3(SEQ ID NO：3)，编码该序列的cDNA序列为序列识别号：4(SEQ ID NO：4)。

SEQ ID NO：3

ValGlnLeuGlnGlnSerGlyAlaGluLeuAlaArgProGlyAlaSerValLysMetSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrArgTyrThrMetHisTrpValLysGlnArgProGlyGlnGlyLeuGluTrpIleGlyTyrIleAsnProSerArgGlyTyrThrAsnTyrAsnGlnLysPheLysAspLysAlaThrLeuThrThrAspLysSerSerSerThrAlaTyrMetGlnLeuSerSerLeuThrSerGluAspSerAlaValTyrTyrCysAlaArgTyrTyrAspAspHisTyrCysLeuAspTyrTrpGlyGlnGlyThrThrValThrValSerSerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerAspIleValLeuThrGlnSerProAlaIleMetSerAlaSerProGlyGluLysValThrMetThrCysSerAlaSerSerSerValSerTyrMetAsnTrpTyrGlnGlnLysSerGlyThrSerProLysArgTrpIleTyrAspThrSerLysLeuAlaSerGlyValProAlaHisPheArgGlySerGlySerGlyThrSerTyrSerLeuThrIleSerGlyMetGluAlaGluAspAlaAlaThrTyrTyrCysGlnGlnTrpSerSerAsnProPheThrPheGlySerGlyThrLysLeuGluLeuLysArg

SEQ ID NO：4

GTCCAGCTGCAGCAGTCAGGGGCTGAACTGGCAAGACCTGGGGCCTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTTACTAGGTACACGATGCACTGGGTAAAACAGAGGCCTGGACAGGGTCTGGAATGGATTGGATACATTAATCCTAGCCGTGGTTATACTAATTACAATCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTACAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTGAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATATTATGATGATCATTACTGCCTTGACTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGACATTGTGCTAACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACCTCCCCCAAAAGATGGATTTATGACACATCCAAACTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCACTTCAGGGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCGGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTAGTAACCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGA

进行相同的步骤来获得编码抗-EGFR单克隆抗体528的V_H和V_L的cDNA，和编码抗-EGFR的抗体528的V_H-V_L融合蛋白质的融合序列。单克隆抗体528和EGFR在细胞膜上，例如在人的表皮样癌(epidermoidcarcinoma)A431细胞上结合。528单链抗体的多肽序列为序列识别号：5(SEQID NO：5)，编码该序列的cDNA序列为序列识别号：6(SEQ ID NO：6)。

SEQ ID NO：5

ValLysLeuGlnGluSerGlySerGluMetAlaArgProGlyAlaSerValLysLeuProCysLysAlaSerGlyAspThrPheThrSerTyrTrpMetHisTrpValLysGlnArgHisGlyHisGlyProGluTrpIleGlyAsnIleTyrProGlySerGlyGlyThrAsnTyrAlaGluLysPheLysAsnLysValThrLeuThrValAspArgSerSerArgThrValTyrMetHisLeuSerArgLeuThrSerGluAspPheAlaValTyrTyrCysThrArgSerGlyGlyProTyrPhePheAspTyrTrpGlyGlnGlyThrThrValThrValSerSerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerMetThrGlnThrProLeuSerLeuProValSerLeuGIyAspGlnAlaSerIleSerCysArgSerSerGlnAsnIleValHisAsnAsnGlyIleThrTyrLeuGluTrpTyrLeuGlnArgProGlyGlnSerProLysLeuLeuIleTyrLysValSerAspArgPheSerGlyValProAspArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspPheThrLeuLysIleSerArgValGluAlaGluAspLeuGlyIleTyrTyrCysPheGlnGlySerHisHisProProThrPheGlyGlyGlyThrLysLeuGlu

SEQ ID NO：6

GTCAAGCTGCAGGAGTCAGGGTCTGAGATGGCGAGGCCTGGAGCTTCAGTGAAGCTGCCCTGCAAGGCTTCTGGCGACACATTCACCAGTTACTGGATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCATGGACATGGCCCTGAGTGGATCGGAAATATTTATCCAGGTAGTGGTGGTACTAACTACGCTGAGAAGTTCAAGAACAAGGTCACTCTGACTGTAGACAGGTCCTCCCGCACAGTCTACATGCACCTCAGCAGGCTGACATCTGAGGACTTTGCGGTCTATTATTGTACAAGATCGGGGGGTCCCTACTTCTTTGACTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAACATTGTACATAATAATGGAATCACCTATTTAGAATGGTACCTGCAAAGGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCGACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTAGAGGCTGAGGATCTGGGAATTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACATCATCCTCCCACGTTCGGCGGGGGGACCAAGCTGGAA

编码上述抗-EGFR scFv03、OKT3V_H-V_L和抗-EGFR抗体528V_H-V_L的cDNA分别与人类迷你胶原蛋白XXI cDNA框内融合，所述cDNA在5’末端包含短铰链序列并在3’末端包含组氨酸标签序列。人类迷你胶原蛋白XXI的多肽及其cDNA序列分别为序列识别号：7(SEQ ID NO：7)和序列识别号：8(SEQ ID NO：8)。

SEQ ID NO：7

GlyGlyArgGluProLysSerCysAspLysThrHisThrCysProProCysProArgSerIleProGlyProProGlyProIleGlyProGluGlyProArgGlyLeuProGlyLeuProGlyArgAspGlyValProGlyLeuValGlyValProGlyArgProGlyValArgGlyLeuLysGlyLeuProGlyArgAsnGlyGluLysGlySerGlnGlyPheGlyTyrProGlyGluGlnGlyProProGlyProProGlyProGluGlyProProGlyIleSerLysGluGlyProProGlyAspProGlyLeuProGlyLysAspGlyAspHisGlyLysProGlyIleGlnGlyGlnProGlyProProGlyIleCysAspProSerLeuCysPheSerValIleAlaArgArgAspProPheArgLys GlyProAsnTyrS erLeuAspAsp S erS erHisHisHisHisHisHisSerSerGly

(注：Pro＝脯氨酸或羟基脯氨酸残基)

SEQ ID NO：8

GGCGGCCGCGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAAGATCTATTCCTGGGCCACCTGGTCCGATAGGCCCAGAGGGTCCCAGAGGATTACCTGGTTTGCCAGGAAGAGATGGTGTTCCTGGATTAGTGGGTGTCCCTGGACGTCCAGGTGTCAGAGGATTAAAAGGCCTACCAGGAAGAAATGGGGAAAAAGGGAGCCAAGGGTTTGGGTATCCTGGAGAACAAGGTCCTCCTGGTCCCCCAGGTCCAGAGGGCCCTCCTGGAATAAGCAAAGAAGGTCCTCCAGGAGACCCAGGTCTCCCTGGCAAAGATGGAGACCATGGAAAACCTGGAATCCAAGGGCAACCAGGCCCCCCAGGCATCTGCGACCCATCACTATGTTTTAGTGTAATTGCCAGAAGAGATCCGTTCAGAAAAGGACCAAACTATAGTCTAGACGACAGCAGCCATCATCACCATCACCATAGCAGCGGC

将产生的三个表达载体共转染(co-transfected)到果蝇S2(Drosophila S2)细胞中。在杀稻瘟菌素(blasticidin)存在时培养这些细胞，以筛选出抗杀稻瘟菌素的细胞。收集细胞培养上清并通过Western印迹和ELISA来筛选出有抗EGFR和CD3的活性的抗体。发现一些克隆的细胞稳定地表达三股螺旋复合物。这些三股螺旋复合物，如人类迷你胶原蛋白XXI是抵抗热与胃蛋白酶(pepsin)的。更重要的是，它们特异地与EGFR和CD3结合。

实施例2

在此实施例中，生成三个融合多肽：OKT3_scFv-Col、erb_scFv-Col和erb_NSPD-scFv。

噬菌体文库的筛选

通过筛选人类单折叠的(single fold)scFv噬菌体展示文库(Tomlinson I+J；由I.M.Tomlinson and G.Winter，MRC Laboratory of Molecular Biology，Cambridge，UK友情提供)，来分离erb噬菌粒(phagemid)，该erb噬菌粒包含结合表皮生长因子受体胞外区(epidermal growth factor receptor extracellulardomain，EGFR-ECD)的可变区片段(variable fragment)(scFv)。使用免疫管(immunotube)(Maxisorp；Nunc，Roskilde，Denmark)来进行筛选，其中所述免疫管用10μg经纯化的重组EGF受体(EGFR-ECD；Research Diagnostics，Inc.)的胞外区包被(coated)。根据制造商使用手册进行封闭(blocking)、淘选(panning)、清洗、洗脱(elution)和被洗脱的噬菌粒的再扩增(reamplification)。

重组质体的构建

从erb噬菌粒将编码erb的scFv的cDNA通过PCR进行扩增。通过来自OKT3杂交瘤(ATCC，CRL-8001)的逆转录产物，获得鼠的IgG2a抗-CD3mAb(Ortho Pharmaceutical Corporation)的编码序列。根据公开的核苷酸序列通过RT-PCR获得OKT3mAb的V_L和V_H的cDNA。通过用甘氨酸接头(glycine-linker)(GGGS)₃连接V_H和V_L链，来生成erb和OKT3的scFv PCR融合物。

为了生成scFv-Col，scFv-Col的编码区在N末端(N-terminal)包含scFv核苷酸序列并在C末端(C-terminal)包含合成胶原蛋白支架基因，该胶原蛋白支架基因编码EPKSCDKTHTCPPCPRSIP(GPP)₁₀GICDPSLCFSVIARRDPFRKGPNY的肽序列，其包含人类IgG的铰链区、胶原蛋白结构域(collageneousdomain)(用下划线标记)和XXI型胶原蛋白的NC1区。合成的胶原蛋白支架多肽及其cDNA的序列分别为序列识别号：9(SEQ ID NO：9)和序列识别号：10(SEQ ID NO：10)。

SEQ ID NO：9

GluProLysSerCysAspLysThrHisThrCysProProCysProArgSerIleProGl yProProGlyProProGlyProProGlyProProGlyProProGlyProProGlyProPr oGlyProProGlyProProGlyProProGlyIleCysAspProSerLeuCysPheSerValIleAlaArgArgAspProPheArgLysGlyProAsnTyr

SEQ ID NO：10

GAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAAGATCTATTCCTGGGCCACCTGGTCCCCCAGGTCCTCCAGGACCCCCAGGGCCCCCAGGCCCCCCCGGGCCGCCTGGACCCCCAGGGCCACCAGGCCCCCCAGGCATCTGCGACCCATCACTATGTTTTAGTGTAATTGCCAGAAGAGATCCGTTCAGAAAAGGACCAAACTAT

此合成的序列(SEQ ID NO：10)通过重叠的PCR以及将两侧具有NotI和XhoI位点的PCR产物克隆到表达载体pSecTag2/Hygro(Invitrogen)的相同位置来制备。将erb与OKT3的scFv在AscI与NotI位点框内克隆到包括上述C末端胶原蛋白支架的构建体(construct)中，以分别制备erb_scFv-Col和OKT3_scFv-Col的表达构建体(expression construct)。

之后生成erb_NSPD-scFv。NSPD-scFv的编码区包含人类表面活性蛋白质D(SPD)(胶原凝集素家族的成员)的N末端254个氨基酸和在C末端的scFv。人类表面活性蛋白质D多肽的N末端254个氨基酸与其cDNA序列分别为序列识别号：11(SEQ ID NO：11)与序列识别号：12(SEQ ID NO：12)

SEQ ID NO：11

MetLeuLeuPheLeuLeuS erAlaLeuValLeuLeuThrGlnProLeuGlyTyrLeuGluAlaGluMetLysThrTyrSerHisArgThrMetPro SerAlaCysThrLeuValMetCysSerSerValGluSerGlyLeuProGlyArgAspGlyArgAspGlyArgGluGlyProArgGlyGluLysGlyAspProGlyLeuProGlyAlaAlaGlyGlnAlaGlyMetProGlyGlnAlaGlyProValGlyProLysGlyAspAsnGlySerValGlyGluProGlyProLysGlyAspThrGlyProSerGlyProProGlyProProGlyValProGlyProAlaGlyArgGluGlyProLeuGlyLysGlnGlyAsnIleGlyProGlnGlyLysProGlyProLysGlyGluAlaGlyProLysGlyGluValGlyAlaProGlyMetGlnGlySerAlaGlyAlaArgGlyLeuAlaGlyProLysGlyGluArgGlyValProGlyGluArgGlyValProGlyAsnThrGlyAlaAlaGlySerAlaGlyAlaMetGlyProGlnGlySerProGlyAlaArgGlyProProGlyLeuLysGlyAspLysGlyIleProGlyAspLysGlyAlaLysGlyGluSerGlyLeuProAspValAlaSerLeuArgGlnGlnValGluAlaLeuGlnGlvGlnValGlnHisLeuGlnAlaAlaPheSerGlnTyrLysLvsValGluLeuPhe

SEQ ID NO：12

ATGCTGCTCTTCCTCCTCTCTGCACTGGTCCTGCTCACACAGCCCCTGGGCTACCTGGAAGCAGAAATGAAGACCTACTCCCACAGAACAATGCCCAGTGCTTGCACCCTGGTCATGTGTAGCTCAGTGGAGAGTGGCCTGCCTGGTCGCGATGGACGGGATGGGAGAGAGGGCCCTCGGGGCGAGAAGGGGGACCCAGGTTTGCCAGGAGCTGCAGGGCAAGCAGGGATGCCTGGACAAGCTGGCCCAGTTGGGCCCAAAGGGGACAATGGCTCTGTTGGAGAACCTGGACCAAAGGGAGACACTGGGCCAAGTGGACCTCCAGGACCTCCCGGTGTGCCTGGTCCAGCTGGAAGAGAAGGTCCCCTGGGGAAGCAGGGGAACATAGGACCTCAGGGCAAGCCAGGCCCAAAAGGAGAAGCTGGGCCCAAAGGAGAAGTAGGTGCCCCAGGCATGCAGGGCTCGGCAGGGGCAAGAGGCCTCGCAGGCCCTAAGGGAGAGCGAGGTGTCCCTGGTGAGCGTGGAGTCCCTGGAAACACAGGGGCAGCAGGGTCTGCTGGAGCCATGGGTCCCCAGGGAAGTCCAGGTGCCAGGGGACCCCCGGGATTGAAGGGGGACAAAGGCATTCCTGGAGACAAAGGAGCAAAGGGAGAAAGTGGGCTTCCAGATGTTGCTTCTCTGAGGCAGCAGGTTGAGGCCTTACAGGGACAAGTACAGCACCTCCAGGCTGCTTTCTCTCAGTATAAGAAAGTTGAGCTCTTC

将N末端SPD cDNA克隆到表达载体pSecTag2/Hygro(Invitrogen)的NheI和AscI位点之间。将erb的scFv框内克隆至包含上述N末端SPD的构建体的AscI和XhoI位点，以制备erb_NSPD-scFv的表达构建体。

每个erb_scFv-Col、erb_NSPD-scFv和OKT3_scFv-Col的开放读码框(open reading frame)包含编码N末端前导序列(leader sequence)和以分泌、检测和纯化为目的的C末端myc表位/多聚组氨酸(polyhistidine)标签的序列。表一为通过上述表达构建体编码的多种重组的蛋白质/抗体。

表1.本研究中使用的多种抗体分子的综述

¹胶原蛋白支架抗体

抗体的表达与纯化

为了生成重组的蛋白质复合物/抗体，根据制造商使用手册使用Effectene(Qiagen)将前述构建体转染到小鼠骨髓瘤(myeloma)NS0细胞。在用均霉素(hygromycin)(400μg/ml)选择4周后，将每个稳定的克隆在摇瓶(shaker flask)内以2×10⁵细胞/ml的起始接种密度在包含2％胎牛血清的化学确定的培养基(chemically-defined medium)HyQCDM4NS0(Hyclone)中培养。于37℃在150rpm维持培养5天。向那些带有编码蛋白质的表达构建体的细胞，每天将抗坏血酸钠(Sodium ascorbate)(80μg/ml)加入培养基中，其中上述蛋白质包含前述抗体区域与胶原蛋白支架区，即胶原蛋白支架抗体(CSA)。

为了纯化erb scFv、erb scFv-Fc、erb scFv-Col或OKT3 scFv-Col蛋白质或蛋白质复合物，将约2L的每种过滤细胞培养基以60ml/小时的流速上样至用50mM的Tris-HCl缓冲溶液(pH 8)平衡的T-凝胶柱(1.5×8cm，Pierce)。在以相同的缓冲溶液清洗后，以50mM的醋酸钠缓冲溶液(pH4)洗脱重组的蛋白质或蛋白质复合物。在280nm监测其UV吸收，并将其洗脱的高峰部分以60ml/小时的流速上样到硫酸锌-带电荷(charged)螯合的SepharoseHighTrap柱(1-ml柱床体积，GE Healthcare)，该柱用包含0.5M NaCl的50mM的Tris-HCl缓冲溶液(pH8)平衡。先以20mM的咪唑(imidazole)清洗，之后在相同的缓冲溶液中用0.25M的咪唑洗脱出结合的蛋白质或蛋白质复合物。最后的制备物用50mM，pH7.0的Hepes缓冲溶液进行透析。

之后使用具有MOPS的10％NuPAGE bis-Tris聚丙烯酰胺凝胶或7％SDS/Tris-醋酸聚丙烯酰胺凝胶、以醋酸钠作为电泳缓冲溶液(running buffer)(Invitrogen)进行SDS-PAGE。之后用考马斯亮蓝(Coomassie brilliantblue)R-250染色蛋白质。通过利用ChemiImager 5500(Alpha Innotech，SanLeandro，CA)及Alpha EaseFC(v.4.0；Alpha Innotech)软件的光密度测量法(densitometry)来定量蛋白质带(band)的密度。

为了验证三股螺旋的性质，将经纯化的erb_scFv-Col(1mg/ml)在DTT缺无或存在的情况下于37℃培养1小时。将来自经DTT处理过的样本的整分(aliquot)，进一步与50mM N-乙基顺丁烯二酰亚胺(N-ethyl-maleimide，NEM)于室温反应30分钟，以永久地防止游离巯基(sulfhydryl)和三聚体的再形成。取等量的每个样本的蛋白质在7％SDS/Tris-醋酸聚丙烯酰胺凝胶中、以醋酸钠作为电泳缓冲溶液进行电泳。用考马斯蓝(Coomassie blue)作凝胶染色。发现经纯化的CSA为同源三聚体(homotrimer)或链间二硫键六聚体(heximer)，在轻微的还原环境其可被分离成两个三聚体。

测试erb_scFv-Col的三聚体结构的热稳定性。在含有2M尿素(urea)的50mM Tris-HCl(pH8)中，经纯化的erb_scFv-Col于室温在缺无或存在10mM三(2-羧乙基)磷化氢(tris(2-carboxyethyl)phosphine，TCEP)时进行处理。于室温将还原的样本用50mM的NEM进行烷基化(alkylate)。与SDS凝胶上样缓冲溶液(loading buffer)混合之前将取等量蛋白质的每份样本于35、45、55、65、75与85℃加热10分钟。于非还原状态下将样本在10％NuPAGE bis-Tris聚丙烯酰胺凝胶并在MOPS缓冲溶液中进行电泳。以考马斯蓝(Coomassieblue)进行凝胶染色。结果显示erb_scFv-Col三聚体具有高度热稳定性。在经65℃处理10分钟之后仍然保留多于50％的三聚体。且发现了erb_scFv-Col胶原蛋白结构域的三聚体结构被脯氨酰羟基化(prolyl hydroxylate)。

结合研究

使用BIAcore X biosensor(BIACORE，Inc.，Uppsala，Sweden)于运行缓冲液(running buffer)HBS-EP(10mM HEPES，pH 7.4，150mM NaCl，3mMEDTA，0.005％表面活性剂P20)中测量erb抗体的变体对EGFR-ECD的结合动力学。简单来说，将EGFR-ECD经由胺缀合(amine coupling)固定于C1感应芯片达到1700应答单位(response units，RU)的程度，并且以10μl/分钟的流速注入不同浓度的纯化抗体。通过注入5μl 10mM甘氨酸-盐酸(glycine-HCl)(pH 3.5)再生(regenerate)表面。在每个浓度取得感应谱(sensorgram)并使用程序BIA Evaluation 3.2来洗脱感应谱。将结合数据填入1∶1 Langmuir结合模型来计算亲和力常数K_D，其被定义为分离率(dissociationrate)(k_diss)/结合率(association rate)(k_ass)的比值。结果显示于表2。

表2.erb抗体的多种形式与固定化的EGFR-ECD结合的结合动力学

如表2所示，erb_scFv_Col对EGFR-ECD的结合亲和力几乎分别为二价(erb_scFv-Fc)和一价(erb_scFv)mAb对应物(counterpart)的20和1000倍。

稳定性与药物动力学(Pharmacokinetic)分析

为了进行血清稳定性的分析，通过于37℃与人类血清温育来测量erb_scFv_Col、erb_scFv-Fc或erb_scFv的erb抗体的多种形式的稳定性。通过定量ELISA来测量在温育时间的不同时期之后保留的活化抗-EGFR的量。使用重组EGFR-ECD(作为捕捉试剂(capture reagent))和抗-c-myc的mAb(9E10，Sigma Chemical Co.)，之后再用HRP偶联的亲合纯化的多克隆山羊抗小鼠IgG和化学发光底物(chemiluminescent substrate)(PierceBiotechnology，Inc.)进行ELISA。为了作药物动力学分析，使用三只BALB/c裸鼠来分析erb_scFv_Col清除率(clearance)。简单而言，在事先采血之后，给每只小鼠皮下(subcutaneously，s.c.)注射25μg(2mg/体重Kg)的erb_scFv_Col。在接下来的70小时中，收集周期性的血液样本并通过ELISA来评估它们的erb_scFv_Col含量。结果发现此蛋白质相当稳定。

T细胞增殖(proliferation)分析与混合淋巴细胞反应(Mixed LymphocyteReaction)

进行5-溴-2-脱氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2′-deoxyuridine，BrdU)细胞增殖分析。简单地说，在96孔平底组织培养盘(flat bottom tissue culture plate)中，将人类外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell)以2×10⁵细胞/孔在100μl包含10％FBS的RPMI-1640培养基中，于37℃在存在10倍连续稀释的OKT3(eBioscience，Inc.)或OKT3scFv-Col时培养66小时。之后将细胞与10μM的BrdU脉冲6小时。在移除培养基后，固定细胞，并用FixDenat一步变性DNA。之后将细胞与过氧化物酶(peroxidase)标记的抗-BrdU抗体(anti-BrdU POD，Fab片段)在室温一起培养1.5小时。使用微滴板发光计(microplate-luminometer)(Hidex，CHAMELEON检测平台，Finland)来进行化学发光检测和定量。

用单向混合淋巴细胞反应如下评估T细胞增殖和免疫抑制(immunosuppression)。从两个健康的供者(刺激者(stimulator)和反应者(responder))获得人类外周血单个核细胞。于37℃在包含5％CO₂的潮湿空气中，用25μg/ml丝裂霉素C(Sigma-Aldrich)在完全培养基(RPMI 1640，补充了10％人类AB血清(human AB serum)、2mM谷氨酰胺(glutamine)、50nM2-硫基乙醇(2-mercaptoethanol)、和青霉素(penicillin)以及链霉素(streptomycin)各100单位/ml)处理刺激者或反应者的细胞30分钟，接着在RPMI 1640培养基中清洗三次。将反应者细胞单独培养或与经丝裂霉素C处理的刺激者或经丝裂霉素C处理的反应者的细胞以1∶1的比例混合，在200μl的完全培养基中以2×10⁵细胞/孔进行培养。在置入反应者细胞后，立即将纯化的OKT3_scFv-Col或OKT3以不同浓度加入培养基中。5天后将培养的细胞与10μM的BrdU脉冲，并在24小时后收获细胞。之后以上述方法进行细胞增殖分析。

结果发现，虽然表现出对刺激T细胞增殖上的可忽略的促有丝分裂活性，OKT3_scFv-Col对于免疫抑制性T细胞的增殖是较有效的。

细胞因子测量

将人类外周血单个核细胞在0.1ml包含10％FBS的RPMI-1640培养基中以2×10⁵细胞/孔，于37℃在10倍稀释的OKT3(eBioscience，Inc.)或OKT3_scFv-Col存在下进行培养。于不同的时间点收集上清，并使用人类细胞因子免疫分析试剂盒(eBioscience，Inc.)来测量多种细胞因子。结果表明，与鼠的OKT3mAb相较而言，OKT3_scFv-Col的施用导致可忽略的细胞因子释放。

抗体替代分析(replacement assay)

所有如下方法都在4℃进行。将人类T细胞以1×10⁶细胞/ml的密度悬浮于FCM缓冲溶液(磷酸盐缓冲盐水(phosphate-buffered saline)与2％FBS和0.1％叠氮化钠(sodium azide))中。用小鼠全IgG(total IgG)(2μg/ml，JacksonImmunoResearch Laboratories)处理细胞30分钟，之后与连续稀释的OKT3_scFv-Col或OKT3抗体一起温育1小时。直接加入固定饱和量(通过流式细胞术(cytometry)测定)的FITC-偶联的OKT3(0.25μg/ml，购自eBioscience，Inc.)。在温育1小时后，将细胞用FCM缓冲溶液清洗并通过流式细胞术在FACScan(Becton Dickinson，San Jose，CA)上进行免疫荧光分析。结果显示为最大荧光强度的抑制百分比，其定义为通过在缺乏封闭抗体(blocking antibodies)的情况下用OKT3-FITC染色T细胞所获得的平均荧光强度。

结果表明OKT3_scFv-Col与人类CD3⁺T细胞的结合强于天然的鼠的OKT mAb。

使用人类IgG作为标准品，通过Bradford分析(Coomassie plus试剂，来自Pierce Biotechnology，Inc.)来测量蛋白质浓度。对于氨基酸分析，将纯化的erb_scFv-Col用50mM醋酸进行透析，在6N HCl于110℃进行水解24小时之后，在Waters

系统内进行氨基酸分析。

这些结果证明胶原蛋白支架抗体在抗肿瘤与免疫调节(immunomodulatory)的应用上对于治疗性抗体的设计而言是理想的结构。

可以任何方式来组合本说明书公开的所有特征。本说明书公开的每项特征可以用其相同、等同或类似目的的特征来替代。因此，除非另外说明，所公开的每项特征都只是一系列等同或类似特征中的一个例子。

本发明虽然披露了如上的优选实施例，然而它们并非用于限制本发明，任何本领域技术人员，可作一些不背离本发明精神和范围的变动与修改。因此本发明的保护范围应以权利要求限定的范围为准。

序列表

<110>财团法人工业技术研究院(Industrial Technology Research Institute)

<120>以重组的三股螺旋支架为基础的复合物

<160>12

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>242

<212>PRT

<213>人

<400>1

Met Ala Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro

1 5 10 15

Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser

20 25 30

Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Val Ser Asp Ile Gly Ala Ser Gly Ser Ala Thr Ser Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Lys Ser Thr Thr Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Thr Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser

130 135 140

Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser

145 150 155 160

Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys

165 170 175

Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ala Leu Gln Ser Gly Val

180 185 190

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

195 200 205

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

210 215 220

Tyr Ala Asp Tyr Pro Thr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile

225 230 235 240

Lys Arg

<210>2

<211>726

<212>DNA

<213>人

<400>2

atggccgagg tgcagctgtt ggagtctggg ggaggcttgg tacagcctgg ggggtccctg 60

agactctcct gtgcagcctc tggattcacc tttagcagct atgccatgag ctgggtccgc 120

caggctccag ggaaggggct ggagtgggtc tcagatattg gtgcttctgg ttctgctaca 180

tcttacgcag actccgtgaa gggccggttc accatctcca gagacaattc caagaacacg 240

ctgtatctgc aaatgaacag cctgagagcc gaggacacgg ccgtatatta ctgtgcgaaa 300

tctactacta cttttgacta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc gagcggtgga 360

ggcggttcag gcggaggtgg cagcggcggt ggcgggtcga cggacatcca gatgacccag 420

tctccatcct ccctgtctgc atctgtagga gacagagtca ccatcacttg ccgggcaagt 480

cagagcatta gcagctattt aaattggtat cagcagaaac cagggaaagc ccctaagctc 540

ctgatctatg atgcatccgc tttgcaaagt ggggtcccat caaggttcag tggcagtgga 600

tctgggacag atttcactct caccatcagc agtctgcaac ctgaagattt tgcaacttac 660

tactgtcaac agtatgctga ttatcctact acgttcggcc aagggaccaa ggtggaaatc 720

aaacgg 726

<210>3

<211>240

<212>PRT

<213>人

<400>3

Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser

1 5 10 15

Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr

20 25 30

Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly

35 40 45

Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

50 55 60

Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met

65 70 75 80

Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met

130 135 140

Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser

145 150 155 160

Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro

165 170 175

Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala

180 185 190

His Phe Arg Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser

195 200 205

Gly Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser

210 215 220

Ser Asn Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg

225 230 235 240

<210>4

<211>720

<212>DNA

<213>人

<400>4

gtccagctgc agcagtcagg ggctgaactg gcaagacctg gggcctcagt gaagatgtcc 60

tgcaaggctt ctggctacac ctttactagg tacacgatgc actgggtaaa acagaggcct 120

ggacagggtc tggaatggat tggatacatt aatcctagcc gtggttatac taattacaat 180

cagaagttca aggacaaggc cacattgact acagacaaat cctccagcac agcctacatg 240

caactgagca gcctgacatc tgaggactct gcagtctatt actgtgcaag atattatgat 300

gatcattact gccttgacta ctggggccaa gggaccacgg tcaccgtctc ctcaggtgga 360

ggcggttcag gcggaggtgg ctctggcggt ggcggatcgg acattgtgct aacccagtct 420

ccagcaatca tgtctgcatc tccaggggag aaggtcacca tgacctgcag tgccagctca 480

agtgtaagtt acatgaactg gtaccagcag aagtcaggca cctcccccaa aagatggatt 540

tatgacacat ccaaactggc ttctggagtc cctgctcact tcaggggcag tgggtctggg 600

acctcttact ctctcacaat cagcggcatg gaggctgaag atgctgccac ttattactgc 660

cagcagtgga gtagtaaccc attcacgttc ggctcgggga ccaagctgga gctgaaacga 720

<210>5

<211>239

<212>PRT

<213>人

<400>5

Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Ser Glu Met Ala Arg Pro Gly Ala Ser

1 5 10 15

Val Lys Leu Pro Cys Lys Ala Ser Gly Asp Thr Phe Thr Ser Tyr Trp

20 25 30

Met His Trp Val Lys Gln Arg His Gly His Gly Pro Glu Trp Ile Gly

35 40 45

Asn Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Glu Lys Phe Lys

50 55 60

Asn Lys Val Thr Leu Thr Val Asp Arg Ser Ser Arg Thr Val Tyr Met

65 70 75 80

His Leu Ser Arg Leu Thr Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Thr

85 90 95

Arg Ser Gly Gly Pro Tyr Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu

130 135 140

Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His

145 150 155 160

Asn Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Arg Pro Gly Gln

165 170 175

Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asp Arg Phe Ser Gly Val

180 185 190

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys

195 200 205

Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Phe Gln

210 215 220

Gly Ser His His Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu

225 230 235

<210>6

<211>717

<212>DNA

<213>人

<400>6

gtcaagctgc aggagtcagg gtctgagatg gcgaggcctg gagcttcagt gaagctgccc 60

tgcaaggctt ctggcgacac attcaccagt tactggatgc actgggtgaa gcagaggcat 120

ggacatggcc ctgagtggat cggaaatatt tatccaggta gtggtggtac taactacgct 180

gagaagttca agaacaaggt cactctgact gtagacaggt cctcccgcac agtctacatg 240

cacctcagca ggctgacatc tgaggacttt gcggtctatt attgtacaag atcggggggt 300

ccctacttct ttgactactg gggccaaggg accacggtca ccgtctcctc aggtggaggc 360

ggttcaggcg gaggtggctc tggcggtggc ggatcgatga cccaaactcc actctccctg 420

cctgtcagtc ttggagatca agcctccatc tcttgcagat ctagtcagaa cattgtacat 480

aataatggaa tcacctattt agaatggtac ctgcaaaggc caggccagtc tccaaagctc 540

ctgatctaca aagtttccga ccgattttct ggggtcccag acaggttcag tggcagtgga 600

tcagggacag atttcacact caagatcagc agagtagagg ctgaggatct gggaatttat 660

tactgctttc aaggttcaca tcatcctccc acgttcggcg gggggaccaa gctggaa 717

<210>7

<211>164

<212>PRT

<213>人

<400>7

Gly Gly Arg Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro

1 5 10 15

Cys Pro Arg Ser Ile Pro Gly Pro Pro Gly Pro Ile Gly Pro Glu Gly

20 25 30

Pro Arg Gly Leu Pro Gly Leu Pro Gly Arg Asp Gly Val Pro Gly Leu

35 40 45

Val Gly Val Pro Gly Arg Pro Gly Val Arg Gly Leu Lys Gly Leu Pro

50 55 60

Gly Arg Asn Gly Glu Lys Gly Ser Gln Gly Phe Gly Tyr Pro Gly Glu

65 70 75 80

Gln Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Glu Gly Pro Pro Gly Ile Ser

85 90 95

Lys Glu Gly Pro Pro Gly Asp Pro Gly Leu Pro Gly Lys Asp Gly Asp

100 105 110

His Gly Lys Pro Gly Ile Gln Gly Gln Pro Gly Pro Pro Gly Ile Cys

115 120 125

Asp Pro Ser Leu Cys Phe Ser Val Ile Ala Arg Arg Asp Pro Phe Arg

130 135 140

Lys Gly Pro Asn Tyr Ser Leu Asp Asp Ser Ser His His His His His

145 150 155 160

His Ser Ser Gly

<210>8

<211>492

<212>DNA

<213>人

<400>8

ggcggccgcg agcccaaatc ttgtgacaaa actcacacat gcccaccgtg cccaagatct 60

attcctgggc cacctggtcc gataggccca gagggtccca gaggattacc tggtttgcca 120

ggaagagatg gtgttcctgg attagtgggt gtccctggac gtccaggtgt cagaggatta 180

aaaggcctac caggaagaaa tggggaaaaa gggagccaag ggtttgggta tcctggagaa 240

caaggtcctc ctggtccccc aggtccagag ggccctcctg gaataagcaa agaaggtcct 300

ccaggagacc caggtctccc tggcaaagat ggagaccatg gaaaacctgg aatccaaggg 360

caaccaggcc ccccaggcat ctgcgaccca tcactatgtt ttagtgtaat tgccagaaga 420

gatccgttca gaaaaggacc aaactatagt ctagacgaca gcagccatca tcaccatcac 480

catagcagcg gc 492

<210>9

<211>73

<212>PRT

<213>人工序列

<400>9

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Arg

1 5 10 15

Ser Ile Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly

20 25 30

Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro

35 40 45

Pro Gly Ile Cys Asp Pro Ser Leu Cys Phe Ser Val Ile Ala Arg Arg

50 55 60

Asp Pro Phe Arg Lys Gly Pro Asn Tyr

65 70

<210>10

<211>219

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccaagatc tattcctggg 60

ccacctggtc ccccaggtcc tccaggaccc ccagggcccc caggcccccc cgggccgcct 120

ggacccccag ggccaccagg ccccccaggc atctgcgacc catcactatg ttttagtgta 180

attgccagaa gagatccgtt cagaaaagga ccaaactat 219

<210>11

<211>254

<212>PRT

<213>人

<400>11

Met Leu Leu Phe Leu Leu Ser Ala Leu Val Leu Leu Thr Gln Pro Leu

1 5 10 15

Gly Tyr Leu Glu Ala Glu Met Lys Thr Tyr Ser His Arg Thr Met Pro

20 25 30

Ser Ala Cys Thr Leu Val Met Cys Ser Ser Val Glu Ser Gly Leu Pro

35 40 45

Gly Arg Asp Gly Arg Asp Gly Arg Glu Gly Pro Arg Gly Glu Lys Gly

50 55 60

Asp Pro Gly Leu Pro Gly Ala Ala Gly Gln Ala Gly Met Pro Gly Gln

65 70 75 80

Ala Gly Pro Val Gly Pro Lys Gly Asp Asn Gly Ser Val Gly Glu Pro

85 90 95

Gly Pro Lys Gly Asp Thr Gly Pro Ser Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly

100 105 110

Val Pro Gly Pro Ala Gly Arg Glu Gly Pro Leu Gly Lys Gln Gly Asn

115 120 125

Ile Gly Pro Gln Gly Lys Pro Gly Pro Lys Gly Glu Ala Gly Pro Lys

130 135 140

Gly Glu Val Gly Ala Pro Gly Met Gln Gly Ser Ala Gly Ala Arg Gly

145 150 155 160

Leu Ala Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly Val Pro Gly Glu Arg Gly Val

165 170 175

Pro Gly Asn Thr Gly Ala Ala Gly Ser Ala Gly Ala Met Gly Pro Gln

180 185 190

Gly Ser Pro Gly Ala Arg Gly Pro Pro Gly Leu Lys Gly Asp Lys Gly

195 200 205

Ile Pro Gly Asp Lys Gly Ala Lys Gly Glu Ser Gly Leu Pro Asp Val

210 215 220

Ala Ser Leu Arg Gln Gln Val Glu Ala Leu Gln Gly Gln Val Gln His

225 230 235 240

Leu Gln Ala Ala Phe Ser Gln Tyr Lys Lys Val Glu Leu Phe

245 250

<210>12

<211>762

<212>DNA

<213>人

<400>12

atgctgctct tcctcctctc tgcactggtc ctgctcacac agcccctggg ctacctggaa 60

gcagaaatga agacctactc ccacagaaca atgcccagtg cttgcaccct ggtcatgtgt 120

agctcagtgg agagtggcct gcctggtcgc gatggacggg atgggagaga gggccctcgg 180

ggcgagaagg gggacccagg tttgccagga gctgcagggc aagcagggat gcctggacaa 240

gctggcccag ttgggcccaa aggggacaat ggctctgttg gagaacctgg accaaaggga 300

gacactgggc caagtggacc tccaggacct cccggtgtgc ctggtccagc tggaagagaa 360

ggtcccctgg ggaagcaggg gaacatagga cctcagggca agccaggccc aaaaggagaa 420

gctgggccca aaggagaagt aggtgcccca ggcatgcagg gctcggcagg ggcaagaggc 480

ctcgcaggcc ctaagggaga gcgaggtgtc cctggtgagc gtggagtccc tggaaacaca 540

ggggcagcag ggtctgctgg agccatgggt ccccagggaa gtccaggtgc caggggaccc 600

ccgggattga agggggacaa aggcattcct ggagacaaag gagcaaaggg agaaagtggg 660

cttccagatg ttgcttctct gaggcagcag gttgaggcct tacagggaca agtacagcac 720

ctccaggctg ctttctctca gtataagaaa gttgagctct tc 762

Claims

1.重组蛋白质复合物，其包含：

第一融合多肽链，包含第一支架区和与该第一支架区一端融合的第一异源性区；

第二融合多肽链，包含第二支架区；以及

第三融合多肽链，包含第三支架区；

其中该第一、第二与第三支架区互相排列以形成三股螺旋卷曲。

2.如权利要求1所述的重组蛋白质复合物，其中该异源性区包含结合区。

3.如权利要求2所述的重组蛋白质复合物，其中该结合区包含配体结合区、配体、受体、亲和标记物或蛋白聚糖。

4.如权利要求2所述的重组蛋白质复合物，其中该结合区包含免疫球蛋白的一个或多个互补决定区。

5.如权利要求4所述的重组蛋白质复合物，其中该结合区包含抗原结合片段的序列。

6.如权利要求5所述的重组蛋白质复合物，其中该抗原结合片段与CD3或EGFR特异性结合。

7.如权利要求5所述的重组蛋白质复合物，其中该抗原结合片段包含单链抗体的序列。

8.如权利要求1所述的重组蛋白质复合物，其中该第一融合多肽链还包含与该第一支架区另一端融合的第二异源性区。

9.如权利要求8所述的重组蛋白质复合物，其中该第一异源性区包含第一单链抗体的序列，该第一单链抗体与CD3特异性结合。

10.如权利要求8所述的重组蛋白质复合物，其中该第二异源性区包含第二单链抗体的序列，该第二单链抗体与EGFR特异性结合。

11.如权利要求8所述的重组蛋白质复合物，其中该第二融合多肽链包含与该第二支架区一端融合的第三异源性区。

12.如权利要求11所述的重组蛋白质复合物，其中该第二融合多肽链还包含与该第二支架区另一端融合的第四异源性区。

13.如权利要求12所述的重组蛋白质复合物，其中该第三融合多肽链包含与该第三支架区一端融合的第五异源性区。

14.如权利要求13所述的重组蛋白质复合物，其中该第三融合多肽链包含与该第三支架区另一端融合的第六异源性区。

15.如权利要求1所述的重组蛋白质复合物，其中该第一、第二或第三支架区包含一个或多个三股螺旋重复序列，每个重复序列包含下式的序列：(X1-X2-X3)n，其中X1是Gly残基，X2或X3是任何氨基酸残基，n大于或等于5。

16.如权利要求15所述的重组蛋白质复合物，其中该第一、第二或第三支架区包含Clq、胶原凝集素或胶原蛋白多肽链的一个或多个三股螺旋重复序列。

17.如权利要求15所述的重组蛋白质复合物，其中X3是脯氨酸或羟脯氨酸残基。

18.如权利要求15所述的重组蛋白质复合物，其中每个重复序列都包含(GPP)₁₀的序列。

19.如权利要求1所述的重组蛋白质复合物，其中该异源性区包含酶区域或荧光蛋白质的序列。

20.如权利要求1所述的重组蛋白质复合物，其中该第一、第二与第三融合多肽基本相同。

21.重组融合多肽，其包含：

支架区，用于形成三股螺旋卷曲，和

与该支架区域一端融合的第一异源性区。

22.如权利要求21所述的重组融合多肽，其中该支架区包含一个或多个三股螺旋重复序列，每个重复序列包括下式的序列：(X1-X2-X3)n，其中X1是Gly残基，X2或X3是任何氨基酸残基，并且n大于或等于5。

23.如权利要求22所述的重组融合多肽，其中X3是脯氨酸或羟脯氨酸残基。

24.如权利要求21所述的重组融合多肽，其还包含与该支架区另一端融合的第二异源性区域。

25.如权利要求21所述的重组融合多肽，其中该支架区包含Clq、胶原凝集素或胶原蛋白多肽链的一个或多个三股螺旋重复序列。

26.如权利要求21所述的重组融合多肽，其中该异源性区包含配体结合区、配体、受体或多糖。

27.如权利要求21所述的重组融合多肽，其中所述异源性区通过噬菌体展示筛选获得。

28.分离的核酸，其包含编码权利要求21所述的融合多肽的序列或其互补序列。

29.宿主细胞，其包含权利要求28所述的核酸。

30.如权利要求29所述的宿主细胞，其中该细胞是哺乳动物或昆虫的细胞。

31.如权利要求30所述的宿主细胞，其中该哺乳动物的细胞为小鼠骨髓瘤NS0细胞。

32.表达载体，其包含权利要求28所述的核酸。

33.产生融合多肽的方法，其包括：

在允许多肽表达的情况下培养权利要求29所述的宿主细胞，其中该多肽由核酸编码，以及

从培养的细胞或该细胞的培养基中纯化该多肽。

34.产生权利要求1所述的蛋白质复合物的方法，包括：

在允许表达由三种核酸编码的多肽并在它们之间形成三股螺旋卷曲的情况下在培养基中培养宿主细胞，该宿主细胞包含：

编码第一融合多肽链的第一核酸，该第一融合多肽链包含第一支架区和与第一支架区的一端融合的第一异源性区域；

编码第二融合多肽链的第二核酸，该第二融合多肽链包含第二支架区；和

编码第三融合多肽链的第三核酸，该第三融合多肽链包含第三支架区；以及

从培养的细胞或该细胞的培养基中纯化该蛋白质复合物。

35.如权利要求34所述的产生蛋白质复合物的方法，其中该宿主细胞为真核细胞，其包含使脯氨酸残基羟基化的酶活性。